KR101050385B1 - 헵토글로빈 면역검출키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 헵토글로빈의 α및 β단량체에 각각 특이적인 항체를 포함하는 헵토글로빈 면역검출키트 및 전기 키트를 이용하여 혈장내 헵토글로빈의 수준을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 헵토글로빈 면역검출키트는 헵토글로빈의 α단량체 또는 β단량체인 제 1항원과 특이적으로 결합할 수 있는 제 1항체가 표면에 고정된 고정기판; 헵토글로빈의 α단량체와 β단량체 중, 전기 제 1항원이 아닌 다른 단량체인 제 2항원과 특이적으로 결합할 수 있는 제 2항체를 포함하는 반응시약; 전기 반응시약에 포함된 제 2항체와 결합할 수 있는 2차 항체; 및, 전기 2차 항체를 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다. 본 발명의 헵토글로빈 면역검출키트를 이용할 경우, 단량체 헵토글로빈 또는 파괴된 헵토글로빈의 절편의 수준은 측정되지 않기 때문에, 보다 정확한 헵토글로빈의 수준을 측정할 수 있으므로, 적혈구에 영향을 미치는 질병의 조기 진단 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
헵토글로빈, α단량체, β단량체, 면역검출키트

Description

헵토글로빈 면역검출키트{Kit for Immuno-detection of Heptoglobin}
도 1은 정상인의 혈장 단백질 패턴을 나타내는 전기영동사진이다.
도 2는 말라리아 환자의 혈장 단백질 패턴을 나타내는 전기영동사진이다.
본 발명은 헵토글로빈 면역검출키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 헵토글로빈의 α및 β단량체에 각각 특이적인 항체를 포함하는 헵토글로빈 면역검출키트 및 전기 키트를 이용하여 혈장내 헵토글로빈의 수준을 측정하는 방법에 관한 것이다.
정상적인 경우 적혈구는 120일이 되면 노화되어, 골수, 간, 이자에서 분해된다. 그러나, 말라리아와 같은 질병에 걸렸거나 자가면역 같은 질병으로 인하여 적혈구가 파괴되어 헤모글로빈이 혈액내로 유출될 수 있다. 헤모글로빈은 적혈구 내에 가장 많은 단백질이며 온몸에 산소를 공급하는 기능적으로 매우 중요한 단백질 이나, 헤모글로빈이 적혈구 밖으로 유출이 되었을 때는 철이온을 함유한 헴그룹이 세포에게 해를 입힐수 있는 활성 산소(reactive oxygen species)를 형성할 수 있기 때문에, 인체에 악영향을 미치게 된다. 이처럼 비정상적으로 헤모글로빈이 유출되는 경우, 헵토글로빈(heptoglobin) 이라는 단백질에 의하여, 헤모글로빈이 분해된다.
햅토글로빈은 포유동물의 혈장내에 존재하는 단백질로서, 이황화결합에 의하여 α-사슬과 β-사슬이 결합된 이량체의 구조를 갖고, 헤모글로빈과 특이적으로 결합하여 결합체(Hb-Hp)를 형성하고, 형성된 결합체는 백혈구에 의하여 분해된다. 헵토글로빈은 단일 사슬로 합성되었다가 아미노 말단부분의 α사슬과 카르복시 말단부분의 β사슬로 분리된다. 헵토글로빈의 α사슬은 분자량 9kDa 정도의 83아미노산과 분자량 16.5kDa정도의 142아미노산으로 구성될 수 있는 폴리펩타이드의 대립유전자가 있으며, β사슬은 40kDa 정도의 245아미노산으로 구성된다. 분리된 α사슬과 β사슬은 이중 황화결합(disulfide bond)에 의하여 이량체를 형성하는데, 대부분의 포유동물에서 헵토글로빈은 이러한 기본구조를 공통적으로 가지고 있다.
말라리아와 같은 특정한 원인에 의하여 혈액내의 적혈구가 파괴되면, 적혈구내에 존재하는 헤모글로빈이 혈장내로 노출되고, 노출된 헤모글로빈은 햅토글로빈과 결합한 후, 백혈구에 의하여 분해되므로, 적혈구의 파괴가 지속된다면, 혈장내의 헵토글로빈은 고갈되게 된다. 말라리아의 감염초기에는 외부적인 증상이 거의 나타나지 않기 때문에, 환자의 혈액을 검사하는 방법을 사용하고 있으나, 혈장내로 유출될 헤모글로빈은 헵토글로빈에 의하여 신속하게 제거되기 때문에, 현재로 서는 적혈구의 수를 측정하는 방법이 사용되고 있을 뿐이다. 그러나, 사람의 혈액에 존재하는 적혈구의 수는 오차범위가 비교적 크기 때문에, 적혈구를 계수하는 것만으로는 정상인과 말라리아 환자를 정확히 구별할 수 없다는 문제점이 해결되지 않고있다.
이러한 문제점을 해결하기 위한 하나의 방법으로서, 환자의 혈장내에서 헵토글로빈의 양을 측정하는 방법을 사용할 경우, 적혈구에 직접적으로 영향을 미치는 질병의 진단 및 예후 등을 확인할 수 있을 것으로 기대되었다. 실제로, 말라리아에 감염된 환자의 혈장에서는 정상인보다 낮은 수준의 헵토글로빈이 검출된다.
그러나, 현재까지는 혈장내 헵토글로빈의 수준을 헵토글로빈의 다클론 항체를 이용하여 측정하는데, 이러한 방법을 이용할 경우, 이량체 헵토글로빈 뿐만 아니라, 단량체 헵토글로빈이나 파괴된 헵토글로빈의 절편까지 한번에 검출되기 때문에, 적혈구를 계수하는 방법보다도 광범위한 오차범위를 나타내어, 실질적으로는 사용되지 못하고 있는 실정이다.
만일, 정상적인 헵토글로빈의 수준만을 선별적으로 측정할 수 있다면, 직접적으로 적혈구를 손상시키는 질병의 진단에 획기적인 전기를 마련할 수 있을 것으로 예측되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과를 얻지 못하고 있는 실정이다.
따라서, 혈장내 정상적인 헵토글로빈의 수준을 측정할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 혈장내 정상적인 헵토글로빈의 수준을 측정할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 이량체 헵토글로빈의 α및 β 단량체에 특이적으로 결합할 수 있는 각 단클론항체를 포함하는 면역검출키트를 이용할 경우, 혈장내 정상적인 헵토글로빈의 수준을 측정할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명은 헵토글로빈의 α및 β 단량체에 특이적으로 결합할 수 있는 각 단클론항체를 포함하는 면역검출키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 키트를 이용하여 혈장내 정상적인 헵토글로빈의 수준을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 헵토글로빈 면역검출키트는 (ⅰ) 헵토글로빈의 α단량체 또는 β단량체인 제 1항원과 특이적으로 결합할 수 있는 제 1항체가 표면에 고정된 고정기판; (ⅱ) 헵토글로빈의 α단량체와 β단량체 중, 전기 제 1항원이 아닌 다른 단량체인 제 2항원과 특이적으로 결합할 수 있는 제 2항체를 포함하는 반응시약; (ⅲ) 전기 반응시약에 포함된 제 2항체와 결합할 수 있는 2차 항체; 및, (ⅳ) 전기 2차 항체를 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다: 이때, 고정기판은 특별히 이에 제한되지 않으나, 유리판, 플라스틱판 등을 사용함이 바람직하고, 2차 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바이오틴, 페록시다아제 증을 사용함이 바람직하며, 검출수단은 특별히 이에 제한되지 않으나, 과산화수소수, 스트렙타비딘 등을 사용함이 바람직하다.
본 발명자들은 말라리아 환자와 정상인으로부터 얻은 혈장을 2차원 전기영동하여 혈장단백질의 패턴을 비교한 결과, 정상인의 혈장에 비하여 말라리아 환자의 혈장에는 헤모글로빈의 수준이 증가하고, 헵토글로빈의 수준이 감소함을 확인할 수 있었다.
이에, 본 발명자들은 이량체 헵토글로빈의 수준을 선별적으로 측정할 수 있는 방법을 모색한 결과, 헵토글로빈의 α단량체에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체와 β단량체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 조합하여 사용할 경우, 이량체 헵토글로빈의 수준을 선별적으로 측정할 수 있음을 확인하고, 이를 위한 헵토글로빈 면역검출키트를 제조하게 되었다.
전기 헵토글로빈 면역검출키트를 이용하여, 이량체 헵토글로빈의 수준을 선별적으로 측정하는 방법은 (ⅰ) 적혈구에 영향을 미치는 질병이 발병된 환자로 의심되는 피검자와 정상인으로부터 각각 혈청을 수득하는 단계; (ⅱ) 전기 수득한 각각의 혈청을 전기 면역검출키트의 고정기판에 가하여, 전기 고정기판에 구비된 제 1항체와 항원항체반응을 수행하는 단계; (ⅲ) 전기 고정기판으로부터 혈청을 제거하고, 전기 면역검출키트에 포함된 반응시약을 고정기판에 가하여, 항원항체반응을 수행하는 단계; (ⅳ) 전기 고정기판에서 전기 반응시약을 제거하고, 전기 면역검출키트에 포함된 2차항체를 가하여, 항원항체반응을 수행하는 단계; (ⅴ) 전기 고정기판에서 전기 2차항체를 제거하고 전기 면역검출키트에 포함된 검출수단을 가하여 반응시켜서, 각각의 검출결과를 수득하는 단계; 및, (ⅵ) 전기 수득한 각 검출결과를 비교하여, 이량체 헵토글로빈의 상대적인 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 헵토글로빈 면역검출키트를 이용할 경우, 단량체 헵토글로빈 또는 파괴된 헵토글로빈의 절편의 수준은 측정되지 않기 때문에, 보다 정확한 헵토글로빈의 수준을 측정할 수 있으므로, 적혈구에 영향을 미치는 질병의 조기 진단 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 아들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예 1: 정상인과 말라리안 환자의 혈장내 단백질 패턴 비교
말라리아 환자와 정상인에게서 각각 혈장을 수득하고, 혈장 단백질 150㎍과 SDS/DTT 용해용액(0.3% SDS, 3% DTT(dithiothreitol), 50mM 트리스/HCl, pH 8.0) 50㎕를 혼합하여 95℃에서 5분간 반응시켰다. 이어, 용해 촉진용액(enhanced solublising solution, 7M 유레아, 2M 티오유레아, 4% CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propan-sulfonate), 40mM 트리스/HCl, 0.002% 브로모페놀블루, 2mM 트리부틸포스핀) 500㎕를 가하고, 17,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 전기 상층액 500㎕를 IPG 건조 스트립(immobiline pH gradient dry strip) 재팽창 트레이에 넣고, pH 3 내지 10의 선형 IPG 건조 스트립(18cm)을 용액 위에 덮어 놓고 16시간 동안 재수화(rehydration)시켰다. 재수화된 스트립을 멀티포어(Multiphor, Amersham-Pharmacia Biotech, Sweden)에서 100,000V의 전기를 걸어 IEF(isoelectric focusing)를 수행하여, 혈청내의 단백질들이 등전점(pI value)에 해당하는 pH 부분으로 이동할 수 있도록 하였다.
한편, 5 X 트리스/HCl(1.875M, pH 8.8) 90ml, 40% 아크릴아마이드용액 90ml, 10% SDS 4.5ml, 100mM 소듐티오설페이트 90㎕, 10% 암모늄퍼설페이트(ammonium persulfate) 740㎕, TEMED 74㎕, 증류수 270ml를 혼합하여 8%의 아크릴아마이드 겔 용액을 제조하고, 5 X 트리스/HCl(pH 8.8) 90ml, 40% 아크릴아마이드용액 180ml, 50% 글리세롤 90ml, 10% SDS 4.5ml, 100mM 소듐티오설페이트 90㎕, 10% 암모늄퍼설페이트 740㎕, TEMED 74㎕, 증류수 90ml를 혼합하여 16%의 아크릴아마이드 겔 용액을 제조하였다. 위와 같이 만든 겔 용액으로 두께 1.5mm, 가로 18cm의 8% 내지 16% 농도구배 SDS-PAGE 겔을 작제하였다.
전기 IEF가 종료된 스트립에 TBP 평형 완충액(0.2mM 트리부틸포스핀 (tributyl phosphine), 6M 유레아, 2% SDS, 375mM 트리스 완충액(pH 8.8), 20% 글리세롤 및 2.5% 아크릴아마이드) 10ml을 넣고 15분간 가볍게 교반하면서 평형시켰다. 만들어진 겔 위에 평형시킨 스트립을 올리고, 아가로스 엠베딩 용액(아가로스, 1% 브로모페놀블루, 1 X SDS 전개 완충액)을 유리판 위 부분까지 부어 스트립이 겔에 고정되도록 하였다. 스트립이 고정된 8% 내지 16% 농도구배 겔을 글리신, SDS, 트리스베이스를 혼합하여 만든 SDS-PAGE 전개 완충액이 들어 있는 통에 넣어 200mA의 전류로 12시간동안 전기영동시키고, 전기영동이 종료된 후, 전기 겔을 염색하고, 말라리아 환자의 혈장 단백질 패턴과 정상인의 혈장 단백질 패턴을 비교하였다(참조: 도 1 및 도 2). 도 1은 정상인의 혈장 단백질 패턴을 나타내는 전기영동사진이고, 도 2는 말라리아 환자의 혈장 단백질 패턴을 나타내는 전기영동사진이다. 도 1 및 도 2에서 보듯이, Area 1 과 Area 2의 단백질은 말라리아 환자의 혈장에서 현저히 감소하였고, Area 3 과 Area 4의 단백질은 말라리아 환자의 혈장에서 현저히 증가됨을 확인할 수 있었다.
전기 Area 1과 Area 2의 단백질을 분리하여 트립신으로 가수분해하고, MALDI-TOF 분석을 수행한 결과. 전기 단백질은 모두 햅토글로빈임을 확인할 수 있었고, 전기 Area 3과 Area 4의 단백질을 분리하여 트립신으로 가수분해하고, MALDI-TOF 분석을 수행한 결과. 전기 단백질은 모두 헤모글로빈임을 확인할 수 있었는 바, 말라리아 환자의 혈장에는 정상인에 비하여, 헵토글로빈의 수준이 낮음을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 헵토글로빈 면역검출키트의 제조
헵토글로빈의 α단량체와 β단량체를 각각 수득하고, 이에 대한 각각의 항체를 작제한 다음, 이를 이용하여, 헵토글로빈 면역검출키트를 제조하였다.
실시예 2-1: 헵토글로빈의 α단량체와 β단량체에 대한 항체의 수득
헵토글로빈의 α단량체 2㎖(10㎎/㎖)과 애주번트 2㎖을 혼합하고, 전기 혼합물을 7주령 웅성 토끼에 1주간 격으로 3회 주사한 다음, 2주간격으로 2회 주사하였다. 이어, 토끼의 혈액을 일부 채취하여, α단량체에 대한 역가를 측정한 다음, 심장천공법을 이용하여 토끼의 혈액을 모두 채취하였다. 전기 채취한 혈액은 상온에서 24시간 동안 방치하여, 상층액인 혈장부분만을 수득하였다. 이어, 전기 혈장을 12% 아크릴아미드 겔을 이용한 전기영동법에 적용하여, 전기영동하고, 헵토글로빈의 α단량체를 이용한 웨스턴 블롯을 수행하여, 항체부분의 분자량을 확인하였다.
전기 확인된 분자량을 분리할 수 있는 젤여과 크로마토그래피에 전기 혈장을 적용하여, 활성분획을 수득하여, 헵토글로빈의 α단량체에 대한 항체를 수득하였다.
또한, 상기 헵토글로빈의 α단량체 대신에 헵토글로빈의 β단량체를 이용한 것을 제외하고는, 상술한 방법과 동일한 방법을 이용하여 헵토글로빈의 β단량체에 대한 항체를 수득하였다.
실시예 2-2: 헵토글로빈 면역검출키트의 제조
헵토글로빈의 α단량체를 유리판재질의 고정기판위에 고정시키고, 헵토글로빈의 β단량체 용액 100㎕와 50%(v/v) 글리세롤이 함유된 트리스 완충용액(50mM 트리스/HCl, pH 8.0) 900㎕를 혼합하여 제 2항체를 제조하였으며, 페록시다아제와 과산화수소수를 별도로 준비하여, 헵토글로빈 면역검출키트를 제조하였다.
실시예 3: 헵토글로빈 면역검출키트를 이용한 정상인과 말라리안 환자의 헵토글로빈 수준의 비교
전기 실시예 1에서 준비된 정상인과 말라리아 환자의 혈장을 전기 실시예 2에서 제조된 헵토글로빈 면역검출키트의 고정기판에 가하고, 상온에서 2시간 동안 반응시킨 다음, 고정기판에서 혈장을 제거하고, PBS를 이용하여 고정기판을 세척하였다. 이어, 고정기판에 제 2항체를 가하고, 상온에서 2시간 동안 반응시킨 다음, 고정기판에서 제 2항체를 제거하고, PBS를 이용하여 고정기판을 세척하였다. 다음으로, 전기 고정기판에 2차 항체인 페록시다아제를 가하여 30분동안 상온에서 반응시킨 후, 다시 과산화수소수를 가하고, ELISA 판독기에서 이의 흡광도를 측정하였다.
비교실시예 1: 헵토글로빈 항체를 이용한 정상인과 말라리안 환자의 헵토글로빈 수준의 비교
헵토글로빈의 α단량체와 β단량체에 대한 각각의 항체를 조합하여 사용하지 않고, 단순히 헵토글로빈의 항체를 이용하여 헵토글로빈의 수준을 측정하였다.
즉, 헵토글로빈의 α단량체 대신에 헵토글로빈을 사용한 것을 제외하고는, 전기 실시예 2-1과 동일한 방법을 이용하여, 헵토글로빈 항체를 수득하고, 이를 유리기판에 고정시켰다. 그런 다음, 정상인과 말라리아 환자의 혈장을 전기 실시예 2-2에서 제조된 헵토글로빈 면역검출키트의 고정기판에 가하고, 상온에서 2시간 동안 반응시킨 다음, 고정기판에서 혈장을 제거하고, PBS를 이용하여 고정기판을 세척하였다. 이어, 고정기판에 전기 수득한 헵토글로빈 항체를 가하고, 상온에서 2시간 동안 반응시킨 다음, 고정기판에서 항체를 제거하고, PBS를 이용하여 고정기판을 세척하였다. 다음으로, 전기 고정기판에 2차 항체인 페록시다아제를 가하여 30분동안 상온에서 반응시킨 후, 다시 과산화수소수를 가하고, ELISA 판독기에서 이의 흡광도를 측정하고, 이를 전기 실시예 3의 결과와 비교하였다(참조: 표 1).
정상인과 말라리안 환자의 헵토글로빈 수준의 비교
흡광도 정상인 혈장 말라리아 환자 혈장
실시예 3 1.25 0.12
비교실시예 2.01 0.94

상기 표 1에서 보듯이, 헵토글로빈의 항원을 이용한 경우(비교실시예)보다, 헵토글로빈의 α단량체와 β단량체에 대한 각각의 항체를 조합하여 사용한 경우(실시예 3)에, 전체적으로 낮은 수준의 흡광도가 나타나게 되었다.
상기 결과는 헵토글로빈의 항원을 이용한 경우(비교실시예)에는 이량체 헵토글로빈, 단량체 헵토글로빈 및 파괴된 헵토글로빈의 양을 모두 합한 수준이 측정되었으나, 헵토글로빈의 α단량체와 β단량체에 대한 각각의 항체를 조합하여 사용한 경우(실시예 3)에는 이량체 헵토글로빈의 수준만이 측정되었기 때문으로 유추할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 헵토글로빈 면역검출키트를 이용할 경우, 보다 정확한 헵토글로빈의 수준을 측정할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 헵토글로빈의 α및 β단량체에 각각 특이적인 항체를 포함하는 헵토글로빈 면역검출키트 및 전기 키트를 이용하여 혈장내 헵토글로빈의 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 헵토글로빈 면역검출키트를 이용할 경우, 단량체 헵토글로빈 또는 파괴된 헵토글로빈의 절편의 수준은 측정되지 않기 때문에, 보다 정확한 헵토글로빈의 수준을 측정할 수 있으므로, 적혈구에 영향을 미치는 질병의 조기 진단 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims (5)

  1. (ⅰ) 헵토글로빈의 α단량체 또는 β단량체인 제 1항원과 특이적으로 결합할 수 있는 제 1항체가 표면에 고정된 고정기판;
    (ⅱ) 헵토글로빈의 α단량체와 β단량체 중, 전기 제 1항원이 아닌 다른 단량체인 제 2항원과 특이적으로 결합할 수 있는 제 2항체를 포함하는 반응시약;
    (ⅲ) 전기 반응시약에 포함된 제 2항체와 결합할 수 있는 2차 항체; 및,
    (ⅳ) 전기 2차 항체를 검출할 수 있는 검출수단을 포함하는, 헵토글로빈 면역검출키트.
  2. 제 1항에 있어서,
    고정기판은 유리판 또는 플라스틱판인 것을 특징으로 하는
    헵토글로빈 면역검출키트.
  3. 제 1항에 있어서,
    2차 항체는 바이오틴 또는 페록시다아제인 것을 특징으로 하는
    헵토글로빈 면역검출키트.
  4. 제 1항에 있어서,
    검출수단은 과산화수소수 또는 스트렙타비딘인 것을 특징으로 하는
    헵토글로빈 면역검출키트.
  5. (ⅰ) 적혈구에 영향을 미치는 질병이 발병된 환자로 의심되는 피검자와 정상인으로부터 각각 혈청을 수득하는 단계;
    (ⅱ) 전기 수득한 각각의 혈청을 제 1항의 면역검출키트의 고정기판에 가하여, 전기 고정기판에 구비된 제 1항체와 항원항체반응을 수행하는 단계;
    (ⅲ) 전기 고정기판으로부터 혈청을 제거하고, 제 1항의 면역검출키트에 포함된 반응시약을 고정기판에 가하여, 항원항체반응을 수행하는 단계;
    (ⅳ) 전기 고정기판에서 전기 반응시약을 제거하고, 제 1항의 면역검출키트에 포함된 2차항체를 가하여, 항원항체반응을 수행하는 단계;
    (ⅴ) 전기 고정기판에서 전기 2차항체를 제거하고 제 1항의 면역검출키트에 포함된 검출수단을 가하여 반응시켜서, 각각의 검출결과를 수득하는 단계; 및,
    (ⅵ) 전기 수득한 각 검출결과를 비교하여, 이량체 헵토글로빈의 상대적인 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 제 1항의 헵토글로빈 면역검출키트를 이용한 이량체 헵토글로빈의 수준 측정방법.
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