ES2564169T3 - Dispositivo y método para la detección de analitos - Google Patents

Dispositivo y método para la detección de analitos

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ES2564169T3
ES2564169T3 ES05852268.1T ES05852268T ES2564169T3 ES 2564169 T3 ES2564169 T3 ES 2564169T3 ES 05852268 T ES05852268 T ES 05852268T ES 2564169 T3 ES2564169 T3 ES 2564169T3
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James H. Boone
David M. Lyerly
Tracy D. Wilkins
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Abstract

Un método de detección de por lo menos una sustancia de interés en una muestra líquida, comprendiendo dicho método: disponer una muestra líquida que comprende, o se sospecha que comprende la sustancia o sustancias de interés; aplicar la muestra líquida a un material poroso en una cantidad suficiente para humedecer por lo menos parcialmente el material poroso, poner el material poroso y la membrana porosa en contacto físico sobre una zona de contacto, comprendiendo la membrana porosa por lo menos un elemento de par de unión específico que se puede unir, ya sea directa o indirectamente, a la sustancia o sustancias de interés, donde uno o varios del elemento o elementos de par de unión específicos es un anticuerpo, mantener el material poroso humedecido y la membrana porosa en contacto durante una cantidad de tiempo suficiente para que la membrana porosa se humedezca, por lo menos, en el área que comprende el elemento o elementos de par de unión específicos y para que el líquido presente en el material poroso se difunda hacia arriba en la membrana porosa que comprende el elemento o elementos de par de unión específicos, donde el material poroso está en contacto físico con un lado inferior de la membrana porosa, estando situado el elemento o elementos de par de unión específicos sobre el material poroso al que se ha aplicado la muestra líquida, estando la membrana porosa en contacto directo con el material poroso en una posición en la que está situado el elemento o elementos de par de unión específicos, aplicándose la muestra líquida a un área del material poroso diferente a la zona de contacto, en el que la difusión del líquido a la membrana porosa tiene como resultado que la sustancia o sustancias de interés, si están presentes, se unen, ya sea directa o indirectamente, al elemento o elementos de par de unión específicos; y detectar la presencia o ausencia de un complejo que comprende el elemento o elementos de par de unión específicos y la sustancia o sustancias de interés, en el que la presencia de por lo menos un complejo indica la presencia de por lo menos una de las sustancias de interés en la muestra líquida.

Description

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DESCRIPCION
Dispositivo y metodo para la deteccion de analitos ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Campo tecnico de la Invention
La presente invencion se refiere a metodos para detectar sustancias que estan presentes en llquidos. En particular, la invencion se refiere a metodos para detectar moleculas pequenas, tales como productos qulmicos o biologicos, que estan presentes en muestras llquidas obtenidas de tejidos corporales o del entorno.
Description de la tecnica relacionada
Existen diversos tipos de dispositivos y metodos disponibles en la tecnica para detectar sustancias en muestras. Gran parte del sector utiliza moleculas unidas a una membrana, que se unen especlficamente a la sustancia de interes o a una molecula que esta unida a la sustancia de interes. Los dos tipos principales de dispositivos y metodos se denominan, en general, de flujo lateral y de flujo paralelo. Estas pruebas son generalmente relativamente rapidas (menos de 1 hora para detectar una sustancia) y sensibles (en el intervalo de ng/ml).
En un dispositivo de flujo paralelo, una muestra se hace pasar por una membrana por capilaridad y la sustancia (analito, antlgeno, etc.) es retenida en la membrana al unirse a un anticuerpo, receptor, peptido, etc., especlfico. La union se detecta mediante la union de un segundo anticuerpo u otra molecula que se acopla a cualquiera de una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante), una partlcula coloidal (por ejemplo, oro coloidal) o algunos otros marcadores y partlculas (por ejemplo, marcadores fluorescentes, microesferas paramagneticas). La union se produce muy rapidamente dado que se hace pasar la muestra por la membrana, y a continuation se lava la membrana (se hace pasar un tampon qulmico por la membrana), y se anade el reactivo de deteccion. El resultado es una senal detectable, tal como un punto de color, una llnea, un signo mas, etc.
En un dispositivo de flujo lateral, la muestra se infiltra por capilaridad a traves de una membrana delgada y fluye a traves de una llnea de un reactivo, tal como un anticuerpo u otro componente de union (peptidos de union, receptores, etc.). En ciertas versiones, al analito se ha unido ya un anticuerpo con una partlcula coloreada acoplada (por ejemplo, oro coloidal, microesferas Blue Dextran, etc.). Este complejo de antlgeno y anticuerpo-oro es ligado por la llnea del reactivo y aparece una llnea coloreada. No hay lavado involucrado y no se utilizan reactivos llquidos, excepto porque la muestra puede ser diluida en una solution tamponada antes de ser colocada en la placa del conjugado, que contiene anticuerpo-oro coloidal como un reactivo seco.
En otras versiones del dispositivo de flujo lateral, la muestra se mezcla normalmente con un tampon que contiene un conjugado anticuerpo-enzima. Esta se coloca sobre la membrana y se produce infiltration por flujo lateral a lo largo de la membrana delgada. La llnea no es visible inmediatamente debido a que es necesario anadir un reactivo. Normalmente, se trata de una sustancia qulmica incolora que es transformada por la enzima en un precipitado coloreado insoluble (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante, etc.). Esta version requiere lavado para filtrar la enzima no unida, de manera que hay una placa absorbente en cada extremo de la membrana, y la membrana es habitualmente mas porosa de la que se utiliza para el flujo lateral de oro coloidal (esto facilita el lavado). La memoria WO 94/06012 da a conocer un aparato de pruebas anallticas con un control de negativos y positivos incorporado. La memoria US 5 232 663 da a conocer un soporte de pruebas para determination analltica, que tiene una capa de fijacion muy eficaz para la separation unido/libre en flujo paralelo. La memoria US 5 770 460 da a conocer un ensayo no absorbente de flujo lateral de una etapa. La memoria US 5 037 736 da a conocer un proceso y un soporte de pruebas para la determinacion de un analito. La memoria WO 00/20862 dar a conocer un proceso y un aparato para la deteccion in vitro de multiples analitos. Se conoce asimismo la memoria US 5 211 914 y da a conocer un soporte de pruebas para la determinacion de iones.
Si bien los dispositivos y metodos disponibles actualmente para detectar sustancias en muestras llquidas son adecuados y eficaces para detectar la mayorla de las sustancias de interes, existe la necesidad de nuevos dispositivos y metodos que tengan una velocidad, una sensibilidad y una facilidad de uso mejoradas.
COMPENDIO DE LA INVENCION
La presente invencion trata las necesidades de la tecnica dando a conocer un metodo para detectar rapidamente sustancias en muestras llquidas, que es sensible y facil de utilizar. La patente describe asimismo un dispositivo para detectar rapidamente sustancias en muestras llquidas, que es sensible y facil de utilizar. Los presentes dispositivo y metodo permiten al personal cllnico detectar rapidamente organismos, productos biologicos tales como toxinas u otros materiales biologicos tales como protelnas, acidos nucleicos (ADN, ARN) y polisacaridos, y farmacos u otros qulmicos fabricados por el hombre, en muestras de tejido. Por muestras de tejido se entiende cualquier composition que contenga material biologico que se origina en una o varias celulas animales o tejidos (incluyendo el aparato circulatorio), incluyendo, de forma no limitativa, tejidos (por ejemplo, sangre total o fracciones de la misma; tejido tumoral, orina, excrementos o productos de excretion, tales como heces, diarrea) de humanos y animales (por ejemplo, muestras veterinarias de animales de granja o de animales de companla, carne destinada al consumo humano, tal como hamburguesas, filetes, beicon, huevos, alimentos preparados). Estas incluyen por lo tanto
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muestras llquidas o semillquidas de materiales biologicos que no requieren dilucion antes de su utilizacion en el metodo de la invencion. Esto permite asimismo la deteccion de sustancias biologicas o qulmicas en muestras ambientales, incluyendo el suelo superficial, el subsuelo, rocas y agua, y agua superficial. Ademas, pueden ser utilizados para detectar sustancias aerotransportadas cuando dichas sustancias son capturadas y disueltas en un llquido. Por ejemplo, los aerosoles se pueden solubilizar o combinar de otro modo con un llquido para crear una composicion llquida, que puede ser utilizada como una muestra para la deteccion de una sustancia de interes.
En general, el metodo de la invencion utiliza la difusion de una sustancia a traves de una membrana para permitir la deteccion, ya sea directa o indirectamente, de dicha sustancia mediante un elemento de par de union especlfico. A diferencia de los metodos de deteccion actualmente en uso, que dependen del paso, de manera unidireccional, de una sustancia sobre, o a traves de una membrana que contiene un elemento de par de union especlfico para la sustancia, los presentes metodos no dependen de dicho paso unidireccional de la sustancia sobre, o a traves de una membrana. Por el contrario, los presentes metodos dependen de la simple difusion de una sustancia por medio de, alrededor de, sobre, a traves y en torno a una membrana para detectar la sustancia, sin que sea necesaria ninguna direccionalidad uniforme del movimiento con respecto a la membrana. Sorprendentemente, se ha descubierto que la simple difusion por medio de, alrededor de, sobre, a traves y/o en torno a una membrana que contiene un elemento de par de union especlfico para una sustancia de interes es suficiente para la deteccion rapida y sensible de la sustancia.
La invencion da a conocer un metodo segun la reivindicacion 1.
En terminos generales, el dispositivo descrito en la patente comprende cualquier configuracion de componentes que permita practicar el metodo de la invencion. Mas especlficamente, el dispositivo descrito en la patente comprende cualquier configuracion de componentes que permita que una muestra llquida que contiene, o se sospecha que contiene, una sustancia de interes sea retenida en un area o zona predefinida del dispositivo, donde el area o zona comprende una membrana porosa que comprende un elemento de par de union especlfico que es especlfico, ya sea directa o indirectamente, para la sustancia. En el interior de este area, la muestra se puede difundir a traves de, por, etc., la membrana.
En su forma mas basica, el dispositivo descrito en la patente comprende (a) un receptaculo que comprende un material poroso o placa que puede absorber y transmitir un llquido, y (b) una membrana porosa que comprende un elemento de par de union especlfico, que es especlfico para la sustancia a detectar. El receptaculo y la membrana porosa estan conformados cada uno para permitir que la membrana porosa este en contacto directo con el material poroso, sobre por lo menos una parte de la membrana porosa que comprende el elemento de par de union especlfico. En algunas realizaciones, la placa y la membrana estan en contacto directo entre si sobre por lo menos una parte de la membrana porosa que comprende el elemento de par de union especlfico. El dispositivo puede comprender un recipiente que contiene el receptaculo. El dispositivo puede comprender un soporte para la membrana porosa. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende el recipiente y el soporte en contacto entre si, haciendo el contacto entre los dos elementos que la membrana porosa y el material poroso esten en contacto directo entre si sobre por lo menos una parte de la membrana porosa que comprende el elemento de par de union especlfico. Ademas, el dispositivo puede comprender una placa de aplicacion de la muestra y una placa de recepcion de la solucion de lavado.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Las figuras adjuntas, que se incorporan a esta memoria y forman parte de la misma, muestran varias realizaciones de la invencion y junto con la descripcion escrita, sirven para explicar ciertos principios de la invencion. Las figuras proporcionan detalles de ciertas realizaciones de la invencion para ayudar a explicar mejor diversas caracterlsticas de las realizaciones descritas. Debido a que las figuras representan solamente realizaciones a modo de ejemplo de la invencion, no se debe interpretar que limitan el alcance de la invencion a los detalles particulares descritos en las mismas.
La figura 1 es una vista en perspectiva de una configuracion basica de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, que comprende una membrana porosa y un receptaculo.
La figura 2 es una vista en perspectiva de una configuracion del dispositivo representado en la figura 1, en la que la membrana porosa esta en contacto directo con el material poroso.
La figura 3 es una vista lateral en seccion transversal de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, que comprende un recipiente y un soporte conectados directamente entre si por medio de una articulacion flexible.
La figura 4A es una vista lateral en seccion transversal de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en la que una placa de recepcion de la solucion de lavado esta conectada a una placa de recepcion de la muestra y de reaccion.
La figura 4B es una vista lateral en seccion transversal de una configuracion alternativa del dispositivo representado en la figura 4A, en la que la placa de recepcion de la solucion de lavado esta situada por debajo de la placa de recepcion de la muestra y de reaccion.
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La figura 4C es una vista lateral en seccion transversal de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invention, en la que una barrera extralble impermeable a los llquidos esta situada entre una placa de reception de la muestra y de reaction, y una placa de reception de la solution de lavado.
La figura 5 representa una vista lateral de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en la que la placa de recepcion de la muestra y de reaccion se extienden mas alla del area de reaccion, para formar una unidad que comprende un area de recepcion de la muestra y un area de reaccion independientes.
La figura 6 representa una vista lateral en seccion transversal del dispositivo representado en la figura 5, contenido en el interior de un recipiente que comprende un orificio de aplicacion de muestras y una ventana de visualization.
La figura 7 representa una vista lateral en seccion transversal de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion que comprende un orificio de aplicacion de muestras y una ventana de visualizacion.
La figura 8 representa una vista lateral en seccion transversal de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en la que el soporte para la membrana porosa ejerce una presion
sobre la placa de reaccion en la position de la membrana para provocar la compresion de la placa en este
area.
La figura 9 representa una vista lateral en seccion transversal de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en la que el recipiente ejerce presion sobre la placa de reaccion
desde debajo de la posicion de la membrana para provocar la compresion de la placa en este area.
La figura l0 representa una vista superior de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, que muestra un orificio de aplicacion de muestras y una ventana de visualizacion.
La figura 11 representa una vista superior de una configuracion alternativa de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, que muestra un orificio de aplicacion de muestras y una ventana de visualizacion.
La figura 12 representa una vista superior del dispositivo representado en la figura 11, con areas que comprenden elementos de par de union especlficos y/o moleculas de control en la membrana en el interior del area definida por la ventana de visualizacion.
La figura 13 representa una vista superior en seccion transversal de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, que muestra una sola placa de aplicacion de la muestra que se bifurca en dos placas de reaccion y membranas porosas independientes, que estan conectadas a dos placas de recepcion de la solucion de lavado independientes.
La figura 14A representa una vista superior de una configuracion de dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en el que la placa de aplicacion de la muestra se extiende mas alla del area definida por el recipiente.
La figura 14B representa una vista lateral en seccion transversal de una realization de la configuracion del dispositivo representado en la figura 14A.
La figura 14C representa una vista lateral en seccion transversal de una realizacion de la configuracion del dispositivo representado en la figura 14A.
La figura 15A es una vista lateral de la configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en la que se utiliza un recipiente de "concha de almeja".
La figura 15B es una vista superior de la mitad inferior del dispositivo representado en la figura 15A.
La figura 15C es una seccion transversal desde el lateral del dispositivo representado en la figura 15A, en la que la mitad superior esta situada sobre, pero no en contacto con la mitad inferior, y donde se ha retirado la articulation para permitir el alineamiento de las mitades superior e inferior con propositos descriptivos.
La figura 15D es una seccion transversal desde el lateral del dispositivo representado en la figura 15A, en la que la mitad superior y la mitad inferior estan unidas mediante ajuste por friction.
La figura 16 representa una vista lateral en seccion transversal de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en la que el dispositivo comprende dos secciones conectadas por una articulacion.
La figura 17 representa una seccion lateral de una configuracion de un dispositivo que se describe como util para llevar a cabo un metodo no abarcado por la invencion, en el que el dispositivo comprende una barrera impermeable.
La figura 18 representa una seccion lateral de una configuracion del dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en la que el dispositivo comprende una barrera impermeable.
La figura 19 representa una seccion lateral de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en la que el dispositivo comprende una articulacion que conecta las mitades superior e inferior. El panel A representa el dispositivo en una posicion cerrada para la aplicacion y union de las muestras. El panel B representa el dispositivo en una posicion abierta para leer los resultados de la reaccion. La figura 20 representa una seccion lateral de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en la que el dispositivo comprende un orificio de aplicacion en la parte inferior del dispositivo y una placa de recepcion de la solucion de lavado en el lateral.
La figura 21a representa una vista superior de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, con el aspecto que tendrla detectandose una muestra positiva.
La figura 21B representa una vista superior de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, con el aspecto que tendrla detectandose una muestra negativa.
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La figura 21C representa una vista superior de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, cuando el dispositivo y/o el metodo han fallado.
La figura 21D representa una vista superior de una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, cuando el dispositivo y/o el metodo han fallado.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Antes de proceder con una description de la invencion y de diversas realizaciones, se definiran en este momento ciertos terminos utilizados en la presente memoria. Otros terminos utilizados en la presente memoria se utilizan de acuerdo con su definition normal en la tecnica o se definen en algun otro lugar en la presente memoria.
Tal como se utiliza en la presente memoria, una sustancia es cualquier cosa, lo que incluye, pero no necesariamente se limita a, moleculas organicas naturales, simples, tales como azucares y acidos de cadena corta; moleculas biologicas complejas tales como peptidos, acidos nucleicos (por ejemplo ADN, ARN, APN) y polisacaridos; y moleculas sinteticas (ya sea mediante la manipulation de procesos biologicos o mediante slntesis qulmica) tales como farmacos, agentes industriales, pesticidas y defoliantes. Por lo canto, una sustancia puede ser un farmaco, una hormona (tal como una presente durante el embarazo o en la ovulation), una protelna (incluyendo anticuerpos), una toxina, ADN (incluyendo ADN monocatenario), ARN (incluyendo ARN bicatenario), un virus o una protelna viral o un acido nucleico viral, una bacteria o una protelna bacteriana o un acido nucleico bacteriano, un polisacarido, un contaminante y similares. Por lo tanto, puede ser un patogeno bacteriano o viral, o un parasito procariotico o eucariotico.
Por ejemplo, la sustancia puede ser un organismo vivo o un virus, o cualquier parte de los mismos, incluyendo, de forma no limitativa, macromoleculas. Por lo tanto, la sustancia puede ser un organismo procariotico Gram positivo o de Gram negativo, tal como Eubacterium o Archaea. Ejemplos no limitativos de organismos bacterianos incluyen una especie de Clostridium, tal como C. difficile, C. tetani, C. botulinum y C. perfringens; Escherichia coli; una especie de Salmonella, tal como Salmonella typhimurium y Salmonella typhi; una especie de Bacillus, tal como Bacillus anthracis y B. cereus; una especie de Staphylococcus, tal como S. aureus y S. epidermidis; una especie de Streptococcus, tal como S. pyogenes, S. mutans y S. pneumoniae; una especie de Neisseria, tal como N. meningitidis y N. gonorrhoeae; una especie de Haemophilus, tal como H. influenzae; una especie de Bordetella, tal como B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica, una especie de Listeria, tal como L. monocytogenes; una especie de Cognebacterium, tal como C. diphtheriae y C. pseudotuberculosis; una especie de Mycobacterium, tal como M. tuberculosis, M. bovis, M. scrofulaceum, M. avium-intracelular y M. leprae; una especie de actinomiceto; una especie de Klebsiella, tal como K. pneumoniae; una especie de Serratia, tal como S. marcescens; una especie de Proteus, tal como P. mirabilis y P. vulgaris; una especie de Shigella, tal como S. flexneri; una especie de Vibrio, tal como V. cholerae; una especie de Pseudomonas, tal como P. aeruginosa; una especie de Yersinia, tal como Y. pestis; una especie de Francisella, tal como F. tularensis; una especie de Brucella, tal como B. abortus, B. suis y B. canis; una especie de Treponema, tal como T. pallidum; una especie de Borrelia, tal como B. burgdorferi; una especie de Campylobacter, tal como C. jejuni y C. fetus; una especie de Legionella, tal como L. pneumophila; una especie de Rickettsiae; una especie de Chlanzydia, tal como C. trachomatis y C. psittaci; y una especie de Mycoplasma o una especie de Acholeplasma.
Por supuesto, la sustancia puede ser un virus o cualquier parte del mismo. Ejemplos no limitativos de virus incluyen virus de inmunodeficiencia, tales como virus de inmunodeficiencia humana (por ejemplo, HIV-1, HIV-2, HIV-O); virus de la hepatitis, tales como virus de hepatitis C (HCV), y virus de hepatitis B (hBv); virus de papiloma; tales como virus de papiloma humano (HPV); y cualquier otro virus asociado con enfermedades humanas o animales.
Dado que la sustancia puede ser cualquier parte de un organismo vivo o no vivo, la sustancia puede ser una protelna o una parte de la misma asociada con una enfermedad neurodegenerativa, tal como la enfermedad de Alzheimer o una encefalopatla espongiforme transmisible, tal como una enfermedad prionica. Por lo tanto, la sustancia puede ser una protelna prionica o una parte de la misma.
Otros ejemplos no limitativos de sustancias incluyen parasitos o cualquier parte de los mismos. Por lo tanto, las sustancias pueden ser la totalidad o parte de una especie de Giardia, una especie de Cryptosporidium o una especie de Entamoeba.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un elemento de par de union especlfico es una sustancia que se une especlficamente, ya sea directa o indirectamente, a otra sustancia. Por lo tanto, conjuntamente, el elemento de par de union especlfico y la otra sustancia crean un par de sustancias. Debido a que las dos sustancias se unen especlficamente entre si, ambas pueden ser consideradas elementos de par de union especlficos entre ellas. Sin embargo, para mayor claridad, una se denominara el elemento de par de union especlfico y la otra la sustancia a la que este se une. En la invencion, uno o varios del elemento o elementos de par de union especlficos es un anticuerpo. Los elementos de par de union especlficos pueden incluir pares anticuerpo-antlgeno (que incluyen, de forma no limitativa, pares anticuerpo-anticuerpo donde un anticuerpo se une especlficamente a otro anticuerpo) o anticuerpos artificiales (por ejemplo, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos recombinantes, anticuerpos que contienen exactamente la zona de union del antlgeno, anticuerpos producidos de manera bacteriana o partes de anticuerpos). La invencion esta dirigida a la detection de sustancias en una muestra. Sin embargo, no se deberla
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asumir que la sustancia es necesariamente uno de los elementos de par de union especificos. Por el contrario, un elemento de par de union especlfico puede ser una sustancia que reacciona especlficamente con otro elemento de par de union especlfico, y al mismo tiempo se une a una sustancia de interes en la muestra (por ejemplo, un anticuerpo que se une a una sustancia de interes y al cual se une al mismo tiempo especlficamente otro anticuerpo). Tal como se utiliza en la presente memoria, la descripcion de un elemento de par de union especlfico que se une a una sustancia de interes en una muestra incluye no solo la union del elemento de par de union especlfico a la sustancia particular, sino a otro elemento de par de union especlfico que esta unido a la sustancia.
Los dispositivos y metodos de pruebas rapidas utilizados actualmente en la tecnica funcionan debido a que fuerzan la reunion de una sustancia (por ejemplo, un antlgeno) y un elemento de par de union especlfico, ya sea aspirando la muestra por una membrana recubierta con el anticuerpo (dispositivos y metodos de flujo paralelo) o haciendo que la misma pase por capilaridad por una membrana (dispositivos y metodos de flujo lateral). La presente invencion no depende de ninguno de estos principios. De acuerdo con la presente invencion, una membrana porosa que comprende el elemento de par de union especlfico simplemente tiene que contactar con un material poroso (por ejemplo, una placa) que contiene la sustancia. La simple difusion entrando y saliendo del material poroso y de la membrana hace que la sustancia y el elemento de par de union especlfico entren en contacto. Que la presente invencion de a conocer una prueba rapida y sensible para sustancias en muestras es sorprendente debido a que se considera generalizadamente que la simple difusion no es suficiente para la deteccion de una sustancia, mucho menos para la deteccion con alta sensibilidad por medio de la union de un elemento de par de union especlfico asociado con un soporte solido, tal como una membrana. Sin duda, la presente invencion da a conocer una deteccion excepcionalmente sensible de sustancias, a veces comparable a la utilizada por los dispositivos y metodos de flujo lateral o de flujo paralelo. Dado que no es necesario aplicar directamente la muestra a la membrana que comprende el elemento de par de union especlfico, y que no necesariamente fluye directamente a traves de la misma, la prueba puede ser utilizada asimismo en muestras que obstruyen las membranas de otras pruebas rapidas.
En un primer aspecto, la presente invencion da a conocer un metodo para la deteccion de una sustancia que esta presente en una muestra llquida. El metodo de la invencion utiliza la difusion pasiva de una sustancia desde un receptaculo que comprende un material poroso, tal como una placa, a una membrana porosa. Dicha difusion permite la deteccion, ya sea directa o indirectamente, de la sustancia mediante un elemento de par de union especlfico asociado con la membrana porosa. A diferencia de los metodos comunes de deteccion actualmente en uso, que dependen del paso, de manera unidireccional, de una sustancia a traves de, o por una membrana que contiene un elemento de par de union especlfico para la sustancia, los presentes metodos no dependen de dicho movimiento unidireccional de la sustancia. Por el contrario, los presentes metodos dependen de la simple difusion de una sustancia por, alrededor de, sobre, a traves y/o en torno a una membrana para detectar la sustancia, sin que sea necesaria ninguna direccionalidad unica del movimiento con respecto a la membrana. Sorprendentemente, se ha descubierto que la simple difusion por, alrededor de, sobre, a traves y en torno a una membrana que contiene un elemento de par de union especlfico para una sustancia de interes es suficiente para la deteccion rapida y sensible de la sustancia.
El metodo de la invencion se da a conocer en la reivindicacion 1.
El llquido que comprende, o se sospecha que comprende, una sustancia de interes se puede proporcionar de muchas maneras. Por ejemplo, se puede proporcionar en la forma en que esta aislado de su entorno natural (por ejemplo, sangre total, orina, heces diarreicas y agua corriente, de rlo o de lago pueden ser utilizados directamente estando aislados). Por lo tanto, puede ser una muestra no diluida. Alternativamente, se puede proporcionar en una forma despues de haber sido tratada para eliminar uno o varios componentes (por ejemplo, puede ser utilizada la parte llquida de la sangre y de las heces despues del centrifugado, filtracion o precipitacion de materia solida). Ademas, cuando la muestra original es solida o sustancialmente solida, se puede anadir a la muestra un llquido, tal como agua, para proporcionar caracterlsticas llquidas. Se puede llevar a cabo otro tratamiento o manipulation del llquido antes de, o en el momento de la provision de llquido. Se puede utilizar cualquier tratamiento o manipulacion siempre que no incapacite a la muestra para ser utilizada en el metodo de la invencion o en el dispositivo de la invencion.
El llquido puede ser cualquier llquido incluyendo, de forma no limitativa, agua o composiciones que contengan agua, tales como tejidos biologicos, extractos de tejidos biologicos, y excreciones biologicas, solventes organicos o composiciones que contengan solventes organicos, y combinaciones de agua y solventes organicos o combinaciones de composiciones acuosas y/o de solventes organicos. Por ejemplo, el llquido puede ser un fluido biologico, tal como sangre o una parte de la sangre, orina, heces, saliva, esputos, mucosa, semen o tejido homogeneizado. Por lo tanto, puede ser una muestra homogeneizada de tejido humano o animal, tal como carne homogeneizada (por ejemplo, hamburguesa, cordero, cerdo, pollo, pescado, huevos). Puede ser asimismo un extracto de un especimen solido, tal como un extracto acuoso de una muestra fecal o de una muestra de carne consumible. Cuando el tejido a analizar no es adecuado para su licuefaccion aislado, se puede anadir agua u otro llquido al tejido para proporcionar caracterlsticas llquidas adecuadas. Dado que la presente invencion es adecuada para la deteccion de sustancias en llquidos que tienen una amplia gama de viscosidades, el presente metodo es adecuado para detectar sustancias presentes en composiciones llquidas o semillquidas.
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Cuando sea necesario, se puede ajustar la cantidad o la concentracion de la sustancia a detectar en el llquido, si esta presente, para conseguir una deteccion satisfactoria. El ajuste se puede conseguir mediante la dilucion de un llquido que sea compatible con la muestra llquida y los componentes del dispositivo de la invencion, o se puede conseguir mediante la concentracion de la sustancia dentro de la muestra llquida utilizando cualquier tecnica de concentracion adecuada que incluye, pero sin limitarse a, centrifugado, filtracion, evaporacion, purificacion por afinidad o similares. En general, la sustancia a detectar esta presente en la muestra en cantidades de nanogramos (ng) a microgramos (ug).
Se pueden anadir asimismo componentes adicionales al llquido antes, o en el momento de la aplicacion del llquido al material poroso. Se puede anadir al llquido cualquier cosa que no interfiera sustancialmente con la capacidad del elemento de par de union especlfico para formar un complejo especlficamente con la sustancia o con un elemento de par de union especlfico que se una a la sustancia. En algunas realizaciones, un marcador que interactue especlficamente con la sustancia, si esta presente, se anade al llquido antes, o en el momento de la aplicacion del llquido al material poroso. Por ejemplo, se puede anadir al llquido antes de la aplicacion del llquido al material poroso un anticuerpo que se una especlficamente con la sustancia de interes. El anticuerpo se puede marcar con una fraccion que pueda ser detectada, ya sea directamente o mediante la utilization de materiales auxiliares. Fracciones a modo de ejemplo incluyen, de forma no limitativa, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabano picante, compuestos fluorescentes, microesferas paramagneticas, oro u otros metales, microesferas de latex, avidina (estreptavidina), y biotina. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un conjugado del anticuerpo, que se une especlficamente a la sustancia de interes, se anade a la muestra llquida antes, o en el momento de la aplicacion de la muestra llquida al material poroso/placa.
El llquido se aplica al material poroso en una cantidad suficiente para humedecer, por lo menos parcialmente, el material poroso. Es preferible que se aplique una cantidad suficiente de llquido para humedecer la portion del material poroso que esta en contacto con la membrana porosa en la zona en la que esta situado el elemento de par de union especlfico. En realizaciones preferidas, se humedece todo el material poroso o sustancialmente todo el material poroso. En realizaciones en las que el material poroso se extiende mas alla del area cubierta por la membrana porosa, se aplica una cantidad suficiente de llquido para humedecer la membrana porosa por lo menos en la zona en la que esta situado el elemento de par de union especlfico.
La aplicacion se puede conseguir mediante cualquier tecnica adecuada, que incluye, de forma no limitativa, sumergir el material poroso en el llquido, verter el llquido sobre el material poroso, colocar el material poroso en la trayectoria de un flujo de llquido (por ejemplo, sumergirlo en el caudal de un rlo, introducirlo en un flujo de orina), dejar caer el llquido sobre el material poroso (por ejemplo, con un cuentagotas o una pipeta) y untar una muestra semillquida sobre el material poroso. La aplicacion se puede conseguir mediante la aplicacion directa al material poroso, o mediante otro material poroso en contacto con el material poroso. Analogamente, se puede conseguir mediante la aplicacion a un area del material poroso que esta flsicamente alejada de otra position, y permitiendo que llquido migre a traves del material poroso hasta la otra posicion.
En la practica de la invencion, por lo menos una parte del llquido que se aplica deberla estar presente en una posicion directamente en contacto con una parte de la membrana que comprenda un elemento de par de union especlfico. Por lo tanto, el llquido se puede aplicar a una parte del material poroso adyacente al area en la que la membrana porosa esta en contacto con el material poroso, o se preve este en contacto con el material poroso (por ejemplo, en el area de la placa de reaction, que incluye la posicion o area de deteccion) o se puede aplicar en una posicion distal respecto del area de la placa de reaccion, y permitir que migre a dicha area. Cuando se aplica en una posicion distal, debido a la porosidad del material, el llquido se desplazara a traves del material poroso desde la posicion de aplicacion hasta la posicion de deteccion de la presencia de la sustancia (es decir, hasta la posicion en el material poroso con la que la membrana porosa esta en contacto).
Aplicar el llquido en una posicion alejada de la posicion de deteccion puede permitir la filtracion del llquido antes de la deteccion de la sustancia. Es decir, el material poroso puede actuar no solo para transportar el llquido y sus componentes a la posicion de deteccion, sino que pueda actuar asimismo para bloquear o retardar la migration de ciertos componentes presentes en la muestra, actuando por lo tanto de manera efectiva como un sistema de filtracion que permite que solo las sustancias de cierto tamano migren al area de deteccion. Estan disponibles muchos materiales porosos diferentes, que tienen varios tamanos de poro diferentes, y se puede seleccionar el material y el tamano de poro adecuados para filtrar de manera efectiva componentes no deseados en el llquido. Por ejemplo, cuando se aplica un llquido que comprende heces, se puede desear filtrar las partlculas grandes, tales como bacterias o alimentos no digeridos o digeridos parcialmente. En esta situation, se puede seleccionar un material poroso que tenga un tamano de poro que bloquee o retarde significativamente la migracion de estos componentes relativamente grandes, permitiendo al mismo tiempo que los componentes menores, tales como protelnas bacterianas, acidos nucleicos, protelnas extracelulares de la sangre o similares, migren esencialmente sin impedimento a traves del material.
El metodo de la invencion comprende asimismo poner en contacto el material poroso con una membrana porosa que comprende un elemento de par de union especlfico que se puede unir, ya sea directa o indirectamente, a la
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sustancia de interes. Poner en contacto el material poroso y la membrana porosa se puede producir antes o despues de aplicar el liquido al material poroso. Ademas, no es relevante si para efectuar el contacto se hace que se mueva el material o la membrana. La puesta en contacto comprende desplazamiento fisico de uno o ambos del material poroso y de la membrana porosa para conseguir el contacto.
Aunque no es necesario, cuando el liquido se va a aplicar a un material poroso en una posicion alejada de la posicion de deteccion de la presencia de la sustancia, habitualmente el material poroso y la membrana porosa se ponen en contacto entre si antes de la aplicacion del liquido. Por otra parte, cuando el liquido se aplica al material poroso muy cerca de la posicion en la que el material poroso y la membrana porosa entran en contacto, el liquido se aplica habitualmente antes de que la membrana y el material entren en contacto.
Se ha descubierto que el contacto directo de la membrana en la posicion en la que esta situado el elemento de par de union especifico, con un material poroso a traves del cual se puede desplazar una sustancia de interes, mejora la sensibilidad y la velocidad del metodo de la invencion. Por lo tanto, la membrana porosa y el material poroso estan en contacto en esta posicion, o por lo menos sobre una parte de esta posicion. El contacto entre el material poroso y la membrana porosa deberia ser un contacto continuo sobre, por lo menos, la parte de la membrana en la que esta situado el elemento de par de union especifico, o sobre una parte suficiente de la membrana en la posicion en la que esta situado el elemento de par de union especifico, de tal modo que se pueda identificar una senal detectable si la sustancia de interes esta presente en el liquido. Es decir, en algunas realizaciones, el area en la que el elemento de par de union especifico se une a la membrana porosa puede exceder el area de contacto directo con el material poroso, pero se realizara una cantidad de contacto suficiente de manera que se pueda detectar la presencia del sustrato en el liquido.
Es preferible el contacto directo de la membrana y del material; sin embargo, se pueden interponer uno o varios materiales porosos intermedios, sustancialmente hidrofilos, entre el material poroso y la membrana porosa. En esta situacion, los materiales porosos intermedios actuan de manera efectiva como materiales porosos secundarios, y por lo tanto, para los propositos de la presente invencion, se puede considerar que son un material poroso o una placa. Por lo tanto, la utilizacion de los terminos material poroso o placa abarca multiples materiales que proporcionan la misma, o esencialmente la misma funcion.
En algunas realizaciones, la puesta en contacto del material y la membrana comprende ejercer presion sobre la membrana y el material para asegurar un contacto completo, o esencialmente completo de los dos sobre, por lo menos, una parte del area en la que esta situado el elemento de par de union especifico. Aunque no es necesario, se ha descubierto que, en ciertas circunstancias, la presion en este area puede mejorar el rendimiento del metodo. Por ejemplo, esta puede mejorar la sensibilidad y la fiabilidad del metodo. Puede mejorar asimismo las caracteristicas de infiltracion del material poroso, lo que puede aumentar la cantidad de muestra en el area de reaccion. La presion pueda aumentar ademas la cantidad de contacto entre el material poroso y la membrana porosa. Es decir, en realizaciones en las que el material poroso comprende tanto una posicion de aplicacion de la muestra como una posicion de reaccion, se ha descubierto que la compresion del material poroso en la posicion de reaccion puede mejorar la sensibilidad del dispositivo, y por lo tanto el ensayo o el metodo de la invencion. Sin desear limitarse a ninguna teoria particular de funcionamiento, se cree que, ademas de mejorar el contacto entre la membrana y el material, la compresion del area de reaccion del material poroso mejora la migracion del liquido al area del material en contacto con la membrana, y en particular a la parte de la membrana que comprende el elemento de par de union especifico, e impide la migracion de liquido fuera del area. En efecto, la compresion provoca que el liquido se reuna en el area de compresion. La migracion mejorada hacia, pero no fuera del area provoca un aumento en la cantidad de sustancia en el area (en comparacion con un material no comprimido) y mejora la difusion de la sustancia (si esta presente) a la membrana porosa.
De acuerdo con el metodo de la invencion, el material poroso humedecido y la membrana porosa se mantienen en contacto durante una cantidad de tiempo suficiente para que la membrana porosa se humedezca, por lo menos, en una parte del area que comprende el elemento de par de union especifico. A hacerlo se permite que la sustancia, si esta presente en la muestra, se difunda por, sobre, alrededor y/o en torno a la membrana y entre en contacto con el elemento de par de union especifico asociado con la membrana. Aunque la cantidad de tiempo proporcionado variara en funcion de la cantidad de sustancia en la muestra, de la porosidad del material poroso y de la membrana, de la cantidad de elemento de par de union especifico asociado con la membrana, de la especificidad y fortaleza de la union del elemento de par de union especifico con la sustancia, de la temperatura y de otros factores (la totalidad de los cuales pueden ser seleccionados por los expertos en la materia sin experimentacion innecesaria basandose en tiempos, concentraciones, temperaturas, etc., utilizadas generalmente en la tecnica para las pruebas rapidas), habitualmente, la humectacion suficiente de la membrana se deberia producir dentro de un minuto. En realizaciones preferidas, la membrana y el material se mantienen en contacto durante por lo menos treinta segundos, tal como aproximada o precisamente treinta segundos, aproximada o precisamente un minuto, aproximada o precisamente 2 minutos, aproximada o precisamente 3 minutos, aproximada o precisamente 5 minutos, aproximada o precisamente 10 minutos, aproximada o precisamente 15 minutos, aproximada o precisamente 20 minutos, aproximada o precisamente 25 minutos, o aproximada o precisamente 30 minutos. Tal como se utilizan en la presente memoria, salvo que se indique lo contrario, los tiempos, las temperaturas y otros valores numericos indicados incluyen un
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intervalo en torno al numero indicado del 5 % a ambos lados del numero indicado. Es decir, la indicacion de "60 segundos" incluye cualquier cantidad de tiempo comprendida entre 57 segundos y 63 segundos.
El mantenimiento en contacto de la membrana y del material se puede llevar a cabo a cualquier temperatura. Sin embargo, es preferible utilizar temperaturas por debajo de 100 ° C, tales como la temperatura ambiente (20 ° C a 25 ° C), 30 ° C, 37 ° C, 40 ° C o 50 ° C. De hecho, se ha descubierto de manera sorprendente que el presente metodo puede proporcionar sensibilidades mayores que las pruebas ELISA utilizando los mismos elemento de par de union especlfico y sustancia, realizandose a temperatura ambiente en lugar de a 37 ° C (tal como se requiere para ELISA).
Analogamente, puede ser utilizada cualquier combinacion o cantidad adecuada de elemento de par de union especlfico y sustancia. En la tecnica se conocen cantidades generales de diversos elementos de par de union especlficos a utilizar para la deteccion de contrapartes de la union mediante su union a una membrana. Por ejemplo, el elemento de par de union especlfico puede estar presente en la membrana en una cantidad de aproximadamente 0,5 ng a aproximadamente 1000 ug, y sobre un area desde aproximadamente 0,5 mm cuadrados hasta aproximadamente 100 mm cuadrados o mas. Las cantidades a unir a la membrana se pueden seleccionar en base a la cantidad de sustancia a detectar, a la cantidad/intensidad de la senal producida intrlnsecamente por el marcador seleccionado y el sistema de generacion de la senal, y al tamano del area en la que se une el elemento de par de union especlfico. Estos parametros pueden ser seleccionados y ajustados por los expertos en la materia en base a caracterlsticas bien conocidas de cada sistema de generacion de senal.
En algunas realizaciones, la aplicacion de llquido se lleva a cabo antes de la puesta en contacto del material poroso con la membrana porosa. En otras realizaciones, la aplicacion del llquido se lleva a cabo despues de la puesta en contacto del material poroso con la membrana porosa. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el material poroso y la membrana porosa estan en contacto entre si antes de que se aplique el llquido. En general, no es importante si el contacto entre el material poroso y la membrana porosa se produce antes o despues de la aplicacion de la muestra. El momento en el que se realiza el contacto se selecciona habitualmente junto con la configuracion del dispositivo utilizado para un ensayo particular, y la facilidad de utilizacion del dispositivo.
El metodo comprende ademas detectar la presencia o ausencia de un complejo que comprende el elemento de par de union especlfico y la sustancia de interes, donde la presencia de dicho complejo indica la presencia de la sustancia en el llquido. De acuerdo con la invencion, si una muestra comprende una sustancia de interes, la difusion de la muestra entre el material poroso (es decir, la placa de reaccion) y la membrana porosa permitira que la sustancia entre en contacto con el elemento de par de union especlfico, que esta unido a la membrana. El metodo de la invencion detecta el complejo formado por el elemento de par de union especlfico y la sustancia, mediante cualquiera de una serie de esquemas de deteccion aceptados en la tecnica. Por ejemplo, un anticuerpo (diferente al elemento de par de union especlfico unido a la membrana) que es especlfico para la sustancia puede ser expuesto la sustancia, ya sea antes de que la sustancia se exponga al elemento de par de union especlfico (por ejemplo, antes de que se aplique la muestra al material poroso, mientras la muestra esta migrando a traves del material poroso, etc.) o despues de que se haya proporcionado el tiempo suficiente para que entren en contacto la sustancia y el elemento de par de union especlfico. En algunas situaciones, el anticuerpo estara marcado con una fraccion detectable, tal como con un marcador que pueda ser detectado directamente (por ejemplo, una solucion metalica, tal como oro coloidal; una solucion colorante; una partlcula coloreada, tal como latex); una microesfera paramagnetica; y un compuesto fluorescente. Este se puede marcar asimismo con un marcador indirecto, tal como una enzima que produzca una senal detectable cuando se expone a un sustrato (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina). En otras situaciones, el anticuerpo servira como un elemento de par de union especlfico para un marcador, tal como mediante la union del marcador a la parte Fc del anticuerpo. Los marcadores pueden incluir asimismo pares de union especlficos en los que uno o ambos elementos contienen una fraccion detectable, o una sustancia que puede generar una fraccion detectable, tal como un par avidina (estreptavidina)/biotina o cualquiera de sus equivalentes funcionales.
Tal como se ha mencionado en el parrafo anterior, el marcador para la sustancia de interes se puede proporcionar como un componente del material poroso. Por ejemplo, se puede impregnar (como una sustancia seca o como una solucion llquida a la que se permite secar en el material poroso) en la zona de reaccion, la zona de aplicacion de la muestra o la zona de migracion de la muestra (situada entre la zona de aplicacion de la muestra y la zona de reaccion, en ciertas realizaciones). Cuando la muestra llquida migra al material poroso y a traves del mismo, el marcador se disuelve en el llquido y migra junto con el llquido a la posicion de reaccion y, finalmente, a la membrana. Durante el proceso de migracion o durante el proceso de reaccion, el marcador se une especlficamente con la sustancia (si esta presente), teniendo como resultado finalmente un complejo unido a la membrana, que comprende el elemento de par de union especlfico, la sustancia de interes y el marcador. En realizaciones en las que el marcador esta incluido en el material poroso, la seleccion del tamano de poro del material dependera, por lo menos en parte, de las caracterlsticas de migracion del marcador o del complejo sustancia-marcador.
La deteccion de la sustancia puede proporcionar informacion cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa sobre la sustancia en la muestra. La deteccion cualitativa proporciona informacion que informa al facultativo de la presencia, pero no necesariamente de la cantidad, de la sustancia en la muestra. Sin embargo, colocando una cantidad conocida de elemento de par de union especlfico en la membrana, conociendo la cantidad de sustancia que se
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puede unir al elemento de par de union especlfico y conociendo la cantidad de complejo sustancia-marcador que tiene que estar presente para la deteccion, se puede proporcionar un metodo de detection de una sustancia que es semicuantitativo. Mas especlficamente, conociendo estas cantidades, y obteniendo una senal detectable, el facultativo sabra que la sustancia no solo esta presente en la muestra, sino que la sustancia esta presente, como mlnimo, en una magnitud necesaria para producir la senal detectable. Si se desea, se puede obtener una medicion cuantitativa de la cantidad de muestra comparando la intensidad de la senal de la muestra de prueba con una curva estandar de intensidades de senal obtenidas a partir de muestras que contienen cantidades conocidas de sustancia. En la tecnica se conocen varias maneras de disenar ensayos semicuantitativos y cuantitativos, y cualquiera que sea adecuada puede ser utilizada en esta invention.
La deteccion puede consistir asimismo en la ausencia de una senal detectable, o en la disminucion de una senal que de lo contrario se generarla en ausencia de la sustancia o de alguna otra sustancia que sea indicativa de la presencia de la sustancia. Por lo tanto, los metodos de la invencion abarcan todos los tipos de inmunoensayos (incluyendo tanto ensayos de tipo sandwich como ensayos competitivos) y cualesquiera otros ensayos que dependan de la deteccion, o de la no deteccion de la union de, por lo menos, un elemento de par de union especlfico con una sustancia de interes.
El metodo de la invencion puede comprender muchas otras etapas, que incluyen, de forma no limitativa, disponer una o varias reacciones de control para determinar si se han llevado a cabo satisfactoriamente una o varias etapas del metodo, determinar si uno o varios reactivos estan funcionando segun lo previsto o determinar si las sustancias que interfieren con la capacidad del metodo para generar resultados fiables estan presentes en la muestra. Sustancias que pueden ser utilizadas como reactivos de control incluyen, de forma no limitativa, la sustancia a detectar o un analogo estructural, un anticuerpo que reacciona especlficamente con otro anticuerpo, o cualquier otra cosa que se pueda unir especlficamente a la sustancia de interes o a algun otro reactivo utilizado en el ensayo. Por consiguiente, el metodo de la invencion puede incluir anadir una sustancia conocida, que incluye la sustancia a detectar, para determinar si una o varias etapas del metodo estan funcionando segun lo previsto. Dichas reacciones de control son bien conocidas por los expertos en la materia, y no es necesario detallar su diseno e implementation en la presente memoria. Una reaction de control comun comprende disponer una segunda area, ya sea en la membrana porosa que se une especlficamente a la sustancia marcada o en una segunda membrana porosa, para mostrar no solo que el marcador esta presente y es funcional, sino para mostrar que el marcador ha tenido el tiempo suficiente para contactar con cualquier contraparte de union asociada con la membrana. Por supuesto, se pueden disponer multiples llneas en varias orientaciones, proporcionando cada una information repetitiva o diferente acerca de varios aspectos del metodo.
Ademas, el metodo de la invencion puede detectar una o varias sustancias en la muestra, ademas de la sustancia de interes principal. La otra sustancia o sustancias pueden ser otras sustancias que se produzcan naturalmente en la muestra a prueba, o pueden ser sustancias que se anadan intencionadamente a la muestra para servir como controles positivos, marcadores, competidores y similares. Por lo tanto, los metodos de la invencion pueden detectar dos o mas sustancias en una muestra. Al hacerlo asl, las multiples sustancias se pueden detectar en la misma membrana porosa, o se pueden disponer multiples membranas, ya sea en el mismo dispositivo o en dos dispositivos identicos (con la exception de la identidad de la sustancia o sustancias unidas a la membrana).
El metodo de la invencion puede comprender una o varias etapas de lavado. Aunque no se limita a ningun metodo en particular, se utiliza habitualmente lavado en realizaciones en las que se utilizan marcadores indirectos para detectar la sustancia. Por ejemplo, cuando se utiliza un marcador que usa un sustrato para generar una senal (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante), el marcador estara presente habitualmente en la mezcla de reaccion en exceso sobre la sustancia. Ademas, es posible que el complejo sustancia-marcador pueda estar presente en exceso sobre el elemento de par de union especlfico unido a la membrana. En cualquiera de estas situaciones, si se permite que el exceso de marcador permanezca en la membrana que comprende el elemento de par de union especlfico y en torno a la misma, reaccionara con el sustrato del marcador para producir una senal, que representarla una senal no especlfica o ruido de fondo. Para reducir este ruido de fondo, la membrana se puede lavar con un volumen apropiado de una solucion de lavado apropiada. La solucion de lavado se puede aplicar una o mas veces, dependiendo de la cantidad utilizada y de la cantidad de marcador no unido presente. Analogamente, se pueden incluir otras etapas de lavado en otros puntos del metodo. En algunas realizaciones, la etapa de lavado se utiliza para limpiar la membrana de conjugado no unido, con el fin de mejorar la sensibilidad de la deteccion. Los expertos en la materia son muy conscientes de las ventajas y desventajas de llevar a cabo o no etapas de lavado en varios puntos durante reacciones de union especlficas, y por lo tanto pueden seleccionar el tipo y la cantidad etapas de lavado, asl como las soluciones de lavado a utilizar para cada realization particular de la invencion. Dicha selection puede llevarse a cabo sin experimentation innecesaria.
La patente describe asimismo un dispositivo para practicar el metodo de la invencion. En terminos generales, este dispositivo comprende cualquier configuration de componentes que permitan la practica del metodo de la invencion. Mas especlficamente, este dispositivo comprende cualquier cantidad y configuracion de componentes o elementos que permitan que una muestra llquida que contiene, o se sospecha que contiene una sustancia de interes se pueda retener en un area o region predefinida del dispositivo, donde el area o region comprende una membrana porosa
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que comprende un elemento de par de union especlfico que es especifico, ya sea directa o indirectamente, para la sustancia.
La patente describe un dispositivo que comprende, en su forma mas basica, (a) un receptaculo que comprende un material poroso que puede absorber y transmitir un llquido y (b) una membrana porosa que comprende un elemento de par de union especlfico que es especlfico para una sustancia a detectar (ya sea esta la sustancia en la muestra o una sustancia que se une a dicha sustancia), donde cada uno del receptaculo y la membrana porosa estan conformados para permitir que la membrana porosa este en contacto directo con el material poroso sobre por lo menos una parte de la membrana porosa que comprende el elemento de par de union especlfico. El dispositivo puede comprender ademas un recipiente que contiene el receptaculo o una parte del receptaculo. El dispositivo puede comprender ademas un soporte para la membrana porosa. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende el recipiente y el soporte en contacto entre si, haciendo el contacto entre los dos elementos que la membrana porosa y el material poroso esten en contacto directo entre si sobre por lo menos una parte de la membrana porosa que comprende el elemento de par de union especlfico.
El receptaculo es una unidad flsica y funcional del dispositivo. Este proporciona un area y un volumen para llquidos que contienen, o se sospecha que contienen una sustancia de interes a retener. Este proporciona asimismo un deposito para que el llquido se difunda entrando y saliendo de la membrana porosa que comprende el elemento de par de union especlfico, que en la presente memoria se denomina una zona o placa de reaccion. El receptaculo puede adoptar cualquier forma y tamano, y fabricarse de cualquier material adecuado. El receptaculo comprende por lo menos un material poroso, denominado asimismo una placa en la presente memoria. Sin embargo, se debe observar que el material poroso no esta necesariamente limitado en tamano al area definida por el receptaculo. Es decir, un unico material poroso o una combinacion de materiales porosos pueden estar limitados en tamano al area del receptaculo o se pueden extender mas alla del area del receptaculo hasta el area de aplicacion de la muestra y/o el area de lavado, o cualquier otra area presente en una configuracion particular del dispositivo.
El material poroso (denominado asimismo "placa" en la presente memoria) se puede fabricar de cualquier material que tenga poros, aberturas o espacios a traves de los cuales puedan pasar uno o varios llquidos. Por lo tanto, es cualquier material que sea absorbente. Ejemplos no limitativos de materiales porosos incluyen, de forma no limitativa, productos de papel, tales como papel absorbente o de filtracion (por ejemplo papel de 3 mm Whatman®, y productos Filtrona®), materiales polimericos sinteticos (por ejemplo, nitrocelulosa, nailon), plasticos y esferas de plastico (por ejemplo, microesferas de plastico Porex®; materiales utilizados en la fabricacion de bollgrafos), tales como los fabricados de polipropileno, polietileno, fluoruro de polivinilideno, etilvinilacetato, acronitrilo y politetrafluoretileno. Otros ejemplos no limitativos incluyen nanopartlculas/esferas/tubos.
El tamano de poro del material se puede seleccionar en base a las caracterlsticas deseadas. Estan disponibles numerosas porosidades para los diversos tipos de materiales de los que se puede fabricar el material poroso. Por ejemplo, si una muestra a aplicar contiene particulados o solidos (por ejemplo, heces, tierra), se puede elegir un tamano de poro que excluya o reduzca significativamente la migracion de estos materiales particulados o solidos. Analogamente, si la muestra comprende sangre, se puede elegir un tamano de poro que excluya o reduzca significativamente la migracion de celulas de sangre y plaquetas. Alternativamente, si la muestra no contiene ninguna sustancia no deseable en la posicion de detection (por ejemplo, una muestra que ha sido purificada previamente en alguna medida), el tamano de poro del material se puede seleccionar independientemente de las caracterlsticas de la filtracion. En general, el tamano de poro variara desde aproximadamente 0,05 micrometres hasta aproximadamente 0,5 micrometres.
El material poroso se puede fabricar de un unico material o puede comprender multiples materiales porosos diferentes. Los diferentes materiales individuales se pueden configurar en cualquier configuracion adecuada, tal como superponiendo unos sobre otros, poniendo en contacto los dos materiales extremo a extremo, o cualquier otra configuracion que permita que un llquido fluya de un area del material a otra, tal como desde la posicion de aplicacion de un llquido hasta la posicion de deteccion de la membrana porosa, cuando esta en contacto con el material poroso. Por ejemplo, el material poroso puede comprender un tamano de poro y un material de un tipo en la posicion de aplicacion del llquido (la zona de aplicacion), un segundo tamano de poro y/o material en la posicion de deteccion (la zona de deteccion) y un tercer tamano de poro y/o material (que puede ser el mismo que el primero) en una tercera area distal (con respecto a la posicion de aplicacion del llquido) a la posicion de deteccion, funcionando la tercera posicion como una posicion de reception de la solution de lavado (la zona de reception de lavado). Los tamanos de poro y los materiales, y las combinaciones de los mismos, se pueden seleccionar para adecuarse a necesidades individuales en base a las diversas caracterlsticas de la muestra, la sustancia a detectar, la configuracion del dispositivo o cualquier otra consideration. El material poroso puede contener sustancias que se consideran utiles en la practica de la invention incluyendo, de forma no limitativa, marcadores para la sustancia, carbon vegetal activado, resinas de intercambio ionico y agentes tensoactivos. Ademas, los materiales porosos pueden estar separados de cualesquiera otros materiales menos porosos, no porosos o impermeables, tales como membranas hidrofobas. Estas membranas pueden ser extraldas en algun momento durante la practica de un metodo de la invencion, para permitir el flujo de llquidos desde uno o varios materiales hacia uno o varios otros materiales. Por ejemplo, los dos materiales porosos pueden estar separados por un material no poroso acoplado a
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una lengueta de traccion. Al tirar de la lengueta se extraen los materiales no porosos y se permite el flujo de llquidos, tal como una solucion de lavado, a un material poroso (por ejemplo, una placa de lavado).
La membrana porosa es una membrana fabricada de cualquier material adecuado que permite que fluyan a su traves llquidos y sustancias suspendidas de tamano predeterminado. Habitualmente, la membrana esta fabricada de materiales que se sabe en la tecnica que son adecuados para la deteccion de sustancias de interes mediante la union especlfica de una molecula unida a la membrana, a una sustancia. Los ejemplos incluyen membranas de nailon, membranas de nitrocelulosa, membranas de polivinilpirrolidona, fibras de vidrio y similares.
La membrana porosa comprende por lo menos un elemento de par de union especlfico. El elemento de par de union especlfico esta asociado con la membrana de tal modo que permanece asociado con la membrana en las condiciones de fabricacion y utilizacion del dispositivo. Habitualmente, el elemento de par de union especlfico esta unido a la membrana mediante enlaces covalentes, ionicos o hidrofobos. La membrana se puede tratar antes de la union para reforzar la union. Analogamente, la membrana se puede tratar despues de la union para reforzar la union o para reducir la union de otras sustancias a lugares de la membrana diferentes a la posicion en la que se une el elemento de par de union especlfico. El elemento de par de union especlfico se puede unir a la membrana utilizando cualquier tecnica conocida. Ademas, se puede unir a la membrana en cualquier forma, diseno, patron, direccion, etc., deseado (por ejemplo una llnea, una cruz, un punto, un clrculo) y en cualquier tamano deseado (por ejemplo, un punto de 0,1mm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, etc., de diametro; una llnea de 1 mm de grosor y 5 mm de longitud, de 2 mm de grosor y 1 cm de longitud, etc.). En realizaciones preferidas, la forma de deteccion ventajosa y conveniente se proporciona en forma de llnea. En algunas realizaciones, la membrana porosa comprende dos o mas areas diferentes que contienen un elemento de par de union especlfico. En ciertas realizaciones, dos o mas areas comprenden el mismo elemento de par de union especlfico. En otras realizaciones, cada area comprende un elemento de par de union especlfico diferente. Los elementos de par de union especlficos diferentes pueden ser especlficos para la misma sustancia (para proporcionar un control interno de reproducibilidad), o pueden ser especlficos para sustancias diferentes (por ejemplo, uno es especlfico para una sustancia de interes, mientras que otro u otros son especlficos para otras sustancias de interes o para reactivos utilizados en el metodo de la invencion).
Por lo tanto, la membrana porosa puede comprender otros componentes ademas del elemento de par de union especlfico. Por ejemplo, puede comprender una molecula a utilizar como un control para el comportamiento del metodo de la invencion, tal como un anticuerpo que se una especlficamente al marcador utilizado para detectar la sustancia de interes en la muestra. Puede comprender asimismo un segundo elemento de par de union especlfico, siendo especlfico el segundo elemento de par de union especlfico para una segunda sustancia de interes en la muestra (que incluye una sustancia que se anade intencionadamente a la muestra para servir como control positivo). El elemento de par de union especlfico puede ser un antlgeno o un anticuerpo en un par de union, un receptor o un ligando en un par de union, o ambos componentes de un par de union.
En algunas realizaciones, la membrana porosa esta en contacto con un soporte. El soporte puede mantener la membrana en posicion de tal modo que la membrana permanezca en contacto con la placa de reaccion sobre por lo menos una parte de la membrana. Puede mantener asimismo la membrana en una posicion de tal modo que se pueda poner en contacto con la placa de reaccion, si se desea. Por ejemplo, el soporte puede ser un anillo, un cuadrado, etc., de plastico que contacta con la membrana. El contacto puede retener la membrana en el soporte, o simplemente retener la membrana en contacto con la placa de reaccion. El soporte puede ser un componente flsico independiente del dispositivo o puede estar fabricado como una parte integral del dispositivo, por ejemplo como una parte integral del recipiente del dispositivo.
El receptaculo puede estar situado en el interior de un recipiente. El recipiente puede estar fabricado de cualquier material adecuado, pero habitualmente esta fabricado de plastico. El recipiente proporciona al dispositivo descrito en la patente una resistencia estructural considerable y una impermeabilidad a los llquidos considerable, y puede proporcionar asimismo otras funciones. En una configuracion basica del dispositivo descrito en la patente, el recipiente contiene la placa de reaccion, y comprende la membrana. La membrana puede estar dispuesta de cualquier forma adecuada que permita el contacto de la membrana con la placa de reaccion. Por ejemplo, la membrana puede estar unida a un soporte que esta conectado al recipiente por medio de una articulacion. Alternativamente, la membrana puede estar unida a un soporte que es integral con el recipiente, donde el recipiente esta fabricado de dos mitades que encajan juntas de manera que la membrana contacta con la placa de reaccion. Resultaran evidentes para los expertos en la materia otras configuraciones adecuadas, y la totalidad de dichas configuraciones son utiles para llevar a cabo el metodo de la invencion.
El dispositivo descrito en la patente puede comprender ademas un area o zona de aplicacion de muestras (denominada asimismo la placa de aplicacion de la muestra en la presente memoria) que comprende un material poroso. Tal como se ha descrito anteriormente, la muestra se puede aplicar al receptaculo o a la placa de reaccion. Sin embargo, en algunas realizaciones, la muestra se anade a una posicion distante del receptaculo y de la placa de reaccion. En dichas realizaciones, la muestra se anade a la placa de aplicacion de la muestra, que comprende un material poroso. El material poroso de la placa de aplicacion de la muestra puede ser el mismo material que se utiliza en la placa de reaccion (es decir, puede ser flsicamente el mismo elemento o pueden ser dos elementos
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independientes fabricados del mismo material). Alternativamente, puede ser un material diferente, en el que los dos materiales se ponen en contacto entre si de tal modo que el llquido procedente de la placa de aplicacion puede pasar a la placa de reaccion.
El tamano de la zona de aplicacion de muestras no es crltico. Sin embargo, es preferible que la zona de aplicacion de muestras y la zona de reaccion tengan conjuntamente la suficiente capacidad absorbente para absorber toda la muestra que esta siendo aplicada. Ademas, la zona de aplicacion de muestras puede comprender un area abierta que no contenga la placa de aplicacion, estando definida habitualmente el area mediante el borde de la placa de aplicacion y el lateral del recipiente. Esta area abierta puede estar disenada para aceptar, ya sea directamente o por desbordamiento, la muestra que se esta anadiendo, y puede servir para ayudar a filtrar y retener solidos y partlculas grandes presentes en la muestra.
El dispositivo puede comprender ademas una zona o area de recepcion de la solucion de lavado (denominada asimismo en la presente memoria una placa de recepcion de la solucion de lavado) que comprende un material poroso. El material poroso de la placa de recepcion de la solucion de lavado puede ser el mismo material que se utiliza en la placa de reaccion y/o en la placa de aplicacion de la muestra (es decir, puede ser flsicamente el mismo elemento que las placas de reaccion y aplicacion de la muestra, o puede ser un elemento independiente fabricado del mismo material que una o ambas de las otras placas). Alternativamente, puede ser un material que sea diferente a una o ambas de la placa de reaccion y la placa de aplicacion de la muestra. En esta situacion, la placa de recepcion de la solucion de lavado se pone en contacto con la placa de reaccion, la placa de aplicacion, o ambas, de tal modo que el llquido de lavado procedente de la membrana (que fluye a traves de la placa de reaccion) puede pasar a la placa de llquido de lavado.
En algunas realizaciones, esta interpuesta una barrera impermeable o semipermeable al llquido, extralble, entre la placa de recepcion de la solucion de lavado y una o varias de las otras placas del dispositivo. La barrera esta presente en realizaciones para garantizar que no entra llquido de la placa de reaccion o la placa de aplicacion a la placa de recepcion de la solucion de lavado hasta que se anade la solucion de lavado al dispositivo. Si bien habitualmente no es necesaria debido a las caracterlsticas del flujo de llquido y de la retencion de la placa de reaccion, la barrera se puede incluir en el dispositivo para mayor seguridad, para aumentar la cantidad de llquido presente en la placa de reaccion o por cualquier otra razon. En otras realizaciones, pueden estar incluidas una o varias barreras impermeables al llquido entre una o varias de las diversas placas presentes en el dispositivo.
El dispositivo puede comprender una zona o placa de filtracion entre la zona o placa de aplicacion de la muestra y la zona o placa de reaccion. Si bien la placa de aplicacion de la muestra y la placa de reaccion pueden proporcionar una filtracion adecuada de la muestra, en ocasiones es deseable tener una filtracion adicional de la muestra antes de la exposicion de la muestra la membrana. En estas situaciones, se puede disponer una placa de filtracion. En algunas realizaciones, la placa de filtracion es simplemente una extension de la placa de reaccion mas alla del area cubierta por la membrana. Alternativamente, puede ser simplemente una extension de la placa de aplicacion de la muestra que se extiende mas alla del area en la que se aplica la muestra. En algunas realizaciones, la placa de aplicacion de la muestra, la placa de filtracion y la placa de reaccion son el mismo elemento, estando disenadas las diversas "placas" (o denominadas "zonas") en base a su funcion y posicion en el interior del dispositivo y no a otras caracterlsticas flsicas. La funcion principal de la placa de filtracion es bloquear o retardar la migracion de ciertas sustancias a la placa de reaccion. Dicha filtracion puede beneficiar la deteccion de la sustancia de interes retardando compuestos coloreados, retardando partlculas grandes que podrlan provocar ruido de fondo y similares.
Tal como se puede ver por la descripcion anterior, la placa de reaccion, la placa de aplicacion de la muestra y la placa de filtracion pueden estar fabricadas todas ellas de un material poroso (ya sea del mismo material o de materiales diferentes). Analogamente, la placa de recepcion de la solucion de lavado puede estar fabricada de un material poroso. El material poroso sirve para diversas funciones, pero en general puede servir para extraer llquido a traves del material, de tal modo que este pasa a otro material. Por ejemplo, las placas de aplicacion de la muestra, de filtracion y de reaccion permiten que el llquido se desplace desde la posicion de aplicacion hasta la posicion de deteccion (es decir, la membrana), mientras filtran simultaneamente diversos solidos y partlculas, materiales coloreados u otras sustancias. La placa de recepcion de la solucion de lavado puede extraer llquido de la placa de reaccion cuando se anade solucion de lavado a la membrana, permitiendo por lo tanto que la solucion de lavado se lleve sustancias no deseadas que pueden interferir con la deteccion especlfica de la sustancia en la membrana.
El material poroso sirve para diversas funciones dentro de cada area o zona, y estas funciones coinciden significativamente con las funciones que pueden ser proporcionadas en otras areas del dispositivo que comprende un material poroso. Para facilitar la descripcion, muchas de las funciones se han descrito con respecto a cada area particular del dispositivo; sin embargo, no se debera considerar que las caracterlsticas estan limitadas solamente a las areas para las que se han descrito dichas caracterlsticas. La posicion flsica particular del material poroso en diferentes realizaciones sera evidente para los expertos en la materia, y las funciones particulares del material poroso en cada area seran igualmente evidentes. No se deberla considerar que las caracterlsticas se limitan a dicha area. Por ejemplo, en la zona del receptaculo, las funciones principales del material poroso son proporcionar un area o un volumen para llquidos que contienen, o se sospecha que contienen una sustancia de interes a retener, proporcionar un deposito para difundir llquido hacia y desde la membrana porosa que comprende el elemento de par
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de union especlfico, y extraer llquido al area de reaccion. Por lo tanto, el material poroso en esta zona se denomina en ocasiones la "placa de reaccion" en la presente memoria. Sin embargo, en ciertas realizaciones, la placa de reaccion es asimismo el area de recepcion de la muestra, y por lo tanto sirve tambien para recibir, y habitualmente filtrar la muestra. Ademas, debido a la colocacion de la membrana en contacto con la placa de reaccion, la placa de reaccion sirve como el receptor inicial para la solucion de lavado en realizaciones en las que se lava la membrana. Por consiguiente, la placa de reaccion sirve asimismo como una placa de recepcion de la solucion de lavado inicial.
Por supuesto, se pueden incluir otros elementos en el dispositivo descrito en la patente con el fin de proporcionar diversas ventajas. Se debe entender que la totalidad de dichos elementos adicionales son utiles para llevar a cabo el metodo de la presente invencion. Ademas, se pueden incluir etapas de metodo adicionales que proporcionan ventajas adicionales, y estan abarcadas por la invencion. Los expertos en la materia pueden incluir dichos elementos y etapas de metodos sin experimentacion innecesaria y sin apartarse del alcance completo y el esplritu de la invencion.
En algunas realizaciones, el dispositivo se dispone en un kit. El kit puede comprender solamente el dispositivo, en una o varias copias del mismo o en multiples configuraciones diferentes. Alternativamente, el kit puede comprender otros materiales, tales como parte o la totalidad de los materiales, reactivos y equipo necesarios para practicar por lo menos una realizacion del metodo de la invencion.
Los propios kits se pueden fabricar de cualquier material adecuado, tal como carton, plastico, metal o vidrio. El carton y plastico son los materiales preferibles para los kits. Los kits estan fabricados para contener adecuadamente la totalidad de los componentes proporcionados por el kit. Por lo tanto, estan disenados para ser del tamano, de la forma y de la resistencia adecuadas para contener los diversos componentes seleccionados a proporcionar por el kit.
Los componentes proporcionados por los kits pueden estar en uno o varios recipientes. Los recipientes del dispositivo descrito en la patente se han descrito anteriormente, y pueden estar fabricados de cualquier material adecuado, incluyendo cualquiera de los diversos materiales plasticos cuya utilidad es conocida en la fabricacion de dispositivos de esta naturaleza. Los recipientes para otros componentes pueden estar fabricados de cualquier material adecuado incluyendo, de forma no imitativa, plastico (por ejemplo, un material polimerico), vidrio, metal y caucho. Los recipientes pueden tener cualquier perfil o forma, y por lo tanto pueden ser, por ejemplo, botellas, viales, botes, jarras o bolsas, tal como las fabricadas de metal, plastico, caucho, vidrio o tejido. Los recipientes son preferentemente recerrables o de cierre automatico para conservar despues de la apertura inicial el contenido no utilizado.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, los kits comprenden uno o varios dispositivos (por ejemplo, 10, 20, 25, 30, 50, 100) y por lo menos un recipiente que contiene un componente que es util para practicar por lo menos una realizacion de la invencion. Por ejemplo, un kit puede comprender 25 dispositivos, cerrados independientemente, o dos o mas juntos, en bolsas recerrables. Opcionalmente, las bolsas pueden contener un desecante para mantener un contenido bajo de humedad durante el almacenamiento. El kit puede comprender asimismo uno o varios de los componentes siguientes, en cualquier recipiente o recipientes y cantidades/volumenes adecuados: un diluyente (preferentemente acuoso) para diluir una muestra original; tampon de lavado (preferentemente acuoso); un elemento de par de union especlfico (por ejemplo, un conjugado para la union a la sustancia de interes en la muestra, y al que se puede unir un anticuerpo incluido en la membrana porosa del dispositivo); un sustrato (por ejemplo, un sustrato para una reaccion enzimatica o para producir de otro modo una senal detectable); un control positivo (por ejemplo, un antlgeno de identidad conocida que se une, con una afinidad conocida, con un anticuerpo que esta incluido en una membrana porosa del dispositivo); una pipeta (por ejemplo, pipetas desechables para anadir uno o varios reactivos, etc., a la muestra o al dispositivo); un tubo de ensayo, guantes, una varilla de aplicacion, puntas de pipeta. Los expertos en la materia pueden concebir otros componentes opcionales de los kits, y la totalidad de dichos otros componentes son utiles para llevar a cabo el metodo de la invencion.
Preferentemente, por lo menos parte de los dispositivos se esterilizan antes, durante o despues de su introduction en los kits. Preferentemente uno, algunos o la totalidad de los componentes se esterilizan antes, durante o despues de su introduccion en el kit. En realizaciones muy preferidas, cada componente en el kit es esteril o ha sido esterilizado, ya sea independientemente de uno o varios de los otros componentes, o conjuntamente en el kit. La esterilizacion se puede conseguir por cualquier medio conocido que incluye, de forma no imitativa, filtration de llquidos, irradiation mediante radiation electromagnetica (por ejemplo, irradiation UV, gamma), esterilizacion qulmica (por ejemplo, limpieza con un desinfectante tal como alcohol) y similares.
Las instrucciones para la utilization de uno o varios componentes del kit, o para practicar los metodos de la invencion, pueden estar incluidas en el kit. Las instrucciones se pueden proporcionar como un componente independiente, tal como material impreso en un papel, una tarjeta, una hoja de plastico o similares. Alternativamente, las instrucciones se pueden proporcionar en el propio kit, por ejemplo, en un lado o en la parte superior o inferior del kit. Alternativamente, las instrucciones se pueden proporcionar en un recipiente para un componente del kit.
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Pasando a continuacion a las figuras, que describen varios dispositivos especificos no limitativos utiles para llevar a cabo metodos de la invencion, los elementos descritos anteriormente se describen en varias relaciones espaciales entre si, y se describe la utilizacion de varias configuraciones del dispositivo para llevar a cabo el metodo de la invencion. Se debe entender que cualesquiera dimensiones proporcionadas en las figuras se proporcionan solamente como ejemplos, y que los tamanos y las formas reales del dispositivo no estan limitados a los proporcionados en las figuras. Por ejemplo, los tamanos pueden ser mayores o menores que los ejemplificados en las figuras, en un orden de magnitud o mas. Ademas, se debe entender que las figuras no representan necesariamente todos los elementos a escala real entre si, estando algunos exagerados con propositos de claridad o por otras razones.
La figura 1 representa, en general, una configuracion basica del dispositivo 1 util para llevar a cabo un metodo segun la presente invencion. El dispositivo representado en la figura 1 comprende un receptaculo 100 que comprende un material poroso en la forma de una placa 110 (denominada asimismo en la presente memoria la "placa de la camara de reaccion"). El dispositivo comprende ademas una membrana porosa 120 que comprende un elemento de par de union especlfico 130 para una sustancia de interes que esta acoplada, mediante enlace covalente, hidrofobo o de enlace ionico, a lo largo de una llnea unica en el centro de una membrana. Practicando la invencion con esta configuracion del dispositivo, una muestra llquida que contiene, o se sospecha que contiene una sustancia de interes, se aplica al receptaculo 100 en cualquier area. A continuacion, la membrana porosa 120 se pone en contacto directo con el material poroso 110 del receptaculo 100 de tal modo que la membrana 120 y el material 110 forman una superficie de contacto continua sobre por lo menos el area de la membrana 120 donde esta situado el elemento de par de union especlfico 130. A continuacion, se permite que el llquido presente en el material poroso 110 se difunda entrando, saliendo, atravesando y rodeando la membrana 120, permitiendo que la sustancia, si esta presente, entre en contacto con el elemento de par de union especlfico 130 y pase a unirse especlficamente a este. En realizaciones en las que la sustancia ya se ha marcado, la deteccion de la union se puede conseguir en este momento. En realizaciones en las que todavla no se ha asociado el marcador con la sustancia, el complejo elemento de par de union especlfico-sustancia se puede marcar y a continuacion detectar. En algunas realizaciones, se incluye una etapa de lavado para reducir la senal de fondo. Cuando se lleva a cabo una etapa de lavado, se aplica la solucion de lavado a la membrana 120 y se permite que empape el material poroso 110, eliminando de ese modo materiales que no se unen a la membrana 120 y mejorando la relacion senal/ruido. En algunas realizaciones, la sustancia en la muestra se une primero mediante un elemento de union especlfico que se une especlficamente a uno asociado con la membrana (por ejemplo, un conjugado), y se da tiempo para que reaccionen los dos elementos de par de union especificos.
El dispositivo 1 de la figura 1 se denomina asimismo en varios lugares a continuacion una "camara de reaccion" cuando se utiliza junto con los otros elementos.
Con respecto a la figura 2, se representa un dispositivo 2 util para llevar a cabo un metodo de la invencion, que comprende un receptaculo 200 que comprende un material poroso 210. En esta realization, la membrana porosa 220 esta en contacto con el material poroso 210 de tal modo que existe un contacto continuo entre la membrana porosa 220 y el material poroso 210 en el area del elemento de par de union especlfico 230. En la practica del metodo de la invencion con esta configuracion del dispositivo, se aplica una muestra llquida que contiene, o se sospecha que contiene una sustancia de interes al receptaculo en cualquier area diferente al area en contacto con la membrana porosa 220. Se permite que el llquido presente en el material poroso se difunda entrando, saliendo, atravesando y rodeando la membrana 220, permitiendo que la sustancia, si esta presente, entre en contacto con el elemento de par de union especlfico 230 y pase a unirse especlficamente a este. En realizaciones en las que la sustancia ya se ha marcado, la deteccion de la union se puede conseguir en este momento. En realizaciones en las que todavia no se ha asociado el marcador con la sustancia, el complejo elemento de par de union especlfico- sustancia se puede marcar y a continuacion detectar. En algunas realizaciones, se incluye una etapa de lavado para reducir el fondo. Cuando se lleva a cabo un lavado, se aplica la solucion de lavado a la membrana 220 y se permite que empape el material poroso 210, eliminando de ese modo materiales que no se unen a la membrana 220 y mejorando la relacion senal/ruido.
La figura 3 representa otra realizacion del dispositivo 3 util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en la que el receptaculo 300 que comprende el material poroso 310 esta contenido en el recipiente 335, y en la que la membrana porosa 320 esta soportada por el soporte 336. En esta realizacion, el soporte 336 y el recipiente 335 estan fabricados de plastico. El soporte 336 es integral con el recipiente 335, estando los dos conectados mediante una parte relativamente flexible del plastico en la articulation 338. En otras realizaciones, se utilizan otros materiales y/u otras estructuras incluyendo, de forma no limitativa, para proporcionar la funcion de articulacion.
En la practica del metodo de la invencion con esta configuracion del dispositivo, se aplica una muestra llquida que contiene, o se sospecha que contiene una sustancia de interes al receptaculo 300 en cualquier area del material poroso 310, ya sea directamente o por medio del espacio presente entre el receptaculo 300 y el recipiente 335, tal como en el area 331. A continuacion el soporte 336 que comprende la membrana 320 se balancea hacia abajo por medio del articulacion 338, de tal modo que la membrana 320 esta en contacto con el material poroso 310, por lo menos en una parte de la membrana 320 en la que esta presente el elemento de par de union especlfico (no representado). Una sujecion o borde 337 acopla el soporte 336 para mantener la membrana 320 en contacto con el
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material 310, tal como se ha descrito anteriormente. A continuacion, se permite que el llquido presente en el material poroso 310 se difunda entrando y saliendo de la membrana 320, permitiendo que la sustancia, si esta presente, contacte con el elemento de par de union especlfico (no representado) presente en la membrana 320 y pase a unirse especlficamente a la misma. En realizaciones en las que la sustancia ya se ha marcado, la deteccion de la union se puede conseguir en este momento. En realizaciones en las que todavla no se ha asociado el marcador con la sustancia, el complejo elemento de par de union especlfico-sustancia se puede marcar y a continuacion detectar. En algunas realizaciones, se incluye una etapa de lavado para reducir el fondo. Cuando se lleva a cabo un lavado, se aplica la solucion de lavado a la membrana 320 y se permite que empape el material poroso 310, eliminando de ese modo materiales que no se unen a la membrana 320 y mejorando la relacion senal/ruido.
La figura 4A representa un dispositivo 4 util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en el que el dispositivo 3 de la figura 3 esta modificado para incluir una placa de recepcion de la solucion de lavado 440 situada en contacto con el material poroso 410. La placa de recepcion de la solucion de lavado 440 esta fabricada de un material poroso que puede ser el mismo de la placa de reaccion 410 u otro diferente. En esta realization, la placa de recepcion de la solucion de lavado 440 es una placa independiente respecto de la placa de reaccion 410; sin embargo, en otras realizaciones la placa de reaccion 410 y la placa de recepcion de la solucion de lavado 440 son el mismo elemento, basandose la diferenciacion principalmente en la funcion.
Mas especlficamente, el receptaculo 400 que comprende la placa de reaccion 410 esta contenido en el recipiente 435, que contiene no solo el receptaculo 400 sino asimismo la placa de recepcion de la solucion de lavado 440. La membrana porosa 420 es mantenida por el soporte 436. En esta realizacion, el soporte 436 y el recipiente 435 estan fabricados de plastico, y el soporte 436 es integral con el recipiente 435, estando los dos conectados mediante una parte relativamente flexible del plastico en la articulation 438. En otras realizaciones, se utilizan otros materiales y/o estructuras, para proporcionar la funcion de articulacion.
En la practica del metodo de la invencion con esta configuration del dispositivo, se aplica una muestra llquida que contiene, o se sospecha que contiene una sustancia de interes al receptaculo 400 en cualquier area de la placa de reaccion 410, ya sea directamente o por medio del espacio presente entre el receptaculo 400 y el recipiente 435, tal como en el area 431. A continuacion el soporte 436 que comprende la membrana 420 se balancea hacia abajo por medio del articulacion 438, de tal modo que la membrana 420 esta en contacto con la placa de reaccion 410, por lo menos en una parte de la membrana 420 en la que esta presente el elemento de par de union especlfico (no representado). Una sujecion o borde 437 acopla con el soporte 436 para mantener la membrana 420 en contacto con la placa de reaccion 410, tal como se ha descrito anteriormente. A continuacion, se permite que el llquido presente en la placa de reaccion 410 se difunda entrando y saliendo de la membrana 420, permitiendo que la sustancia, si esta presente, contacte con el elemento de par de union especlfico (no representado) presente en la membrana 420 y pase a unirse especlficamente a la misma. En realizaciones en las que la sustancia ya se ha marcado, la deteccion de la union se puede conseguir en este momento. En realizaciones en las que todavla no se ha asociado el marcador con la sustancia, el complejo elemento de par de union especlfico-sustancia se puede marcar y a continuacion detectar.
En algunas realizaciones, se incluye una etapa de lavado para reducir el fondo. Cuando se lleva a cabo un lavado, se aplica la solucion de lavado a la membrana 420 y se permite que empape la placa de reaccion 410, eliminando de ese modo materiales que no se unen a la membrana 420 y mejorando la relacion senal/ruido. Habitualmente, la cantidad de solucion de lavado aplicada a la membrana 420 excede la capacidad de contention de la placa 410, que ha sido ya humedecida (por lo menos parcialmente) con el llquido que contiene la sustancia de interes. En esta situation, el exceso de solucion de lavado (y alguna muestra llquida original) se desplaza a traves de la placa de reaccion 410 a la placa de recepcion de la solucion de lavado 440.
La figura 4B representa una configuracion alternativa del dispositivo 4 representado en la figura 4A, en el que la placa de recepcion de la solucion de lavado 440 esta situada por debajo de la placa de reaccion 410. El principio de funcionamiento del dispositivo es el mismo que se ha descrito con respecto a la figura 4A. Sin embargo, en esta configuracion, no es preferible que el llquido se aplique en el espacio entre la placa de reaccion 410 y el recipiente 435. En esta figura, todos los elementos tienen la misma identidad que los de la figura 4A.
La figura 4C representa una configuracion alternativa del dispositivo representado en la figura 4A, en la que la placa de recepcion de la solucion de lavado 440 y la placa de reaccion 410 estan separadas mediante una barrera extralble 445 impermeable al llquido. En esta configuracion, la barrera impermeable 445 se interpone entre la placa de recepcion de la solucion de lavado 440 y la placa de reaccion 410, y se extiende al exterior del recipiente 435 a traves de la ranura 446 para dejar al descubierto la lengueta 447. La practica del metodo de la invencion con esta configuracion es similar a la descrita anteriormente con respecto a la figura 4A. Sin embargo, debido a que la barrera impermeable 445 bloquea la migration de llquidos hacia la placa de recepcion de la solucion de lavado 440, la barrera impermeable 445 se extrae habitualmente despues del contacto de la membrana 420 y la placa de reaccion 410, y antes de la aplicacion de la solucion de lavado a la membrana 420. Esta forma de utilization limita asimismo el flujo de la muestra original desde la aplicacion/placa de reaccion 410 a la placa de recepcion de la solucion de lavado 440 hasta despues de que se haya producido durante una cantidad de tiempo deseada la difusion de la
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muestra entrando y saliendo de la membrana 420. Todos los demas elementos representados en este panel son iguales a los descritos en relacion con la figura 4A.
En otra configuracion del dispositivo, representada en la figura 5, el diseno basico representado en la figura 1 se modifica para producir un dispositivo 5, de manera que el material poroso 510 del receptaculo 500 se extiende mas alla de la camara de reaccion (es decir, es mas largo que el area de la membrana porosa 520) para proporcionar una zona 550 de aplicacion de la muestra llquida que comprende una placa de aplicacion de la muestra 551. En la realizacion representada, la placa de aplicacion de la muestra 551 y la placa de reaccion 510 son la misma. Sin embargo, en otras realizaciones, estos dos elementos son independientes, y estan dispuestos de tal modo que estan en contacto flsico entre si de manera que puede fluir llquido de uno a otro. En la practica de la invencion con esta configuracion del dispositivo, una muestra llquida que contiene, o se sospecha que contiene una sustancia de interes se aplica a la placa de aplicacion de la muestra 551 en cualquier area en el interior de la zona 550 de aplicacion de la muestra. Debido a su naturaleza porosa, la placa de aplicacion de la muestra 551 hace que por lo menos una parte de la muestra aplicada migre a la placa de reaccion 510, de donde puede migrar a continuacion, por difusion pasiva, entrando y saliendo de la membrana porosa 520, y permite que la sustancia de interes, si esta presente, contacte, y se una con el elemento de par de union especlfico (no representado) en la membrana porosa 520. Si se desea, se puede llevar a cabo la deteccion y el lavado tal como se ha descrito anteriormente.
La figura 6 representa un dispositivo 6, que es una configuracion del dispositivo representado en la figura 5, pero modificado para incluir un recipiente 635 para la placa de aplicacion de la muestra 651 y la placa de reaccion 610, y para incluir un soporte 636 para la membrana porosa 620. En esta realizacion particular, el recipiente 635 comprende una abertura o un orificio 655 que permite la aplicacion de la muestra llquida a la placa de aplicacion 651. La utilizacion de esta realizacion del dispositivo puede proceder tal como se ha explicado anteriormente.
La figura 7 representa el dispositivo 7, que es una configuracion del dispositivo representado en la figura 6, en el que esta dispuesta una placa de recepcion de la solucion de lavado 740 junto a la placa de reaccion 710 y en contacto con la misma. En la practica de la invencion con esta configuracion del dispositivo, despues de la aplicacion de la muestra a la placa de aplicacion de la muestra 751, de la migracion de llquido a la placa de reaccion 710 y de la difusion del llquido entrando y saliendo de la membrana porosa 720, se anade una solucion de lavado a la membrana 720 y el exceso de solucion de lavado (junto con una parte de la muestra llquida original) fluye a traves de la placa de reaccion 710 hacia la placa de recepcion de la solucion de lavado 740. Todos los elementos representados en esta figura, aparte de los mencionados especlficamente, son iguales que los de la figura 6 y/o la figura 5, donde los elementos similares representados son el mismo elemento en una y otra figura.
La figura 8 representa el dispositivo 8, que es una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en la que la placa de reaccion 810 se fabrica del mismo material que la placa de aplicacion de la muestra llquida 851 y la placa de recepcion de la solucion de lavado 840, pero se comprime, en comparacion con la placa de aplicacion de la muestra 851 y la placa de recepcion de la solucion de lavado 840, mediante presion ejercida por el soporte 836. En esta realizacion preferida del dispositivo util para llevar a cabo el metodo de la invencion, se ejerce presion sobre la membrana 820, lo que provoca la compresion de la placa de reaccion 810. Esta compresion mejora la retention de la muestra en la placa de reaccion 810, y fomenta la difusion de la muestra entre la placa de reaccion 810 y la membrana 820. Todos los elementos representados en esta figura, aparte de los mencionados especlficamente, son iguales que los de la figura 7, la figura 6 y/o la figura 5, donde los elementos similares representados son el mismo elemento en cada figura.
La figura 9 representa el dispositivo 9, que es una configuracion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en la que la placa de reaccion 910 esta fabricada del mismo material que la placa de aplicacion de la muestra llquida 951 y la placa de recepcion de la solucion de lavado 940, pero se comprime, en comparacion con la placa de aplicacion de la muestra 951 y la placa de recepcion de la solucion de lavado 940, mediante presion ejercida desde debajo (con respecto a la membrana porosa 920) por el recipiente 935. En la figura, la compresion es producida por el recipiente 935, que esta moldeado en una forma que proporciona este efecto. Sin embargo, en otras realizaciones equivalentes, el recipiente 935 comprende un elemento adicional que proporciona la presion en la placa de reaccion 910. La presion ejercida por el recipiente 935 proporciona los mismos beneficios descritos anteriormente con respecto a la figura 8 y tal como se ha explicado en otros lugares de la description. Todos los elementos representados en esta figura diferentes a los mencionados especlficamente son iguales que los de la figura 8, la figura 7, la figura 6 y/o la figura 5, donde los elementos similares estan representados y/o numerados de igual manera en cada figura.
La figura 10 muestra una configuracion de un dispositivo 10 util para llevar a cabo un metodo de la invencion, mirando al exterior del dispositivo 10 desde arriba. En esta figura, el orificio 1055 de aplicacion de muestras esta situado en un extremo del dispositivo 10, y una abertura en el dispositivo 10 sobre la membrana porosa 1020 proporciona una ventana de deteccion 1060 a cuyo traves se puede observar la deteccion de la presencia de la sustancia de interes (y, opcionalmente, una o varias reacciones de control). El orificio 1055 y la ventana 1060 estan situados en el recipiente 1035. En la practica del metodo utilizando esta realizacion del dispositivo, se anade la muestra a una placa de aplicacion o a una placa de reaccion por debajo, o cerca del orificio 1055, ya sea directamente a la placa o a un espacio situado entre la placa y el recipiente 1035. La muestra, o parte de la misma,
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se desplaza a lo largo de la placa por lo menos hasta que entra en contacto con la membrana 1020, a traves de una placa de reaccion (no representada) debajo de la membrana 1020. La difusion de la muestra entrando, saliendo, a traves y sobre la membrana 1020 permite el contacto entre la sustancia de interes en la muestra y un elemento de par de union especlfico (no representado) asociado con la membrana 1020. La deteccion de la sustancia unida al elemento de par de union especlfico en la membrana se puede producir observando la membrana a traves de la ventana 1060.
La figura 11 muestra una configuration alternativa del dispositivo 11 representado en la figura 10. En esta configuration, el orificio 1155 de aplicacion de la muestra esta situado en una esquina del dispositivo 11, y la ventana de deteccion 1160 y la membrana 1120 estan situadas centralmente. En la practica del metodo de la invention con esta realization del dispositivo, se anade una muestra a una placa de aplicacion o a una placa de reaccion (no representada) por debajo del orificio 1155 o cerca del mismo, ya sea directamente a la placa o a un espacio entre la placa y el recipiente 1135. La muestra, o una parte de la misma, se desplaza a lo largo de la placa, por lo menos, hasta que entra en contacto con la membrana 1120. La difusion de la muestra entrando, saliendo, a traves y sobre la membrana 1120 permite el contacto entre la sustancia de interes en la muestra y un elemento de par de union especlfico asociado con la membrana 1120. La deteccion de la sustancia unida al elemento de par de union especlfico en la membrana se puede producir observando la membrana a traves de la ventana 1160.
La figura 12 muestra una vista superior de una configuracion del dispositivo 12 que es util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en la que la membrana porosa 1220 comprende un elemento de par de union especlfico 1230, que es especlfico para la sustancia de interes, y un control positivo 1270. En esta configuracion, ambos elementos estan situados en la membrana 1220 de tal modo que estan dentro del area definida por la ventana de deteccion 1260. Todos los elementos representados en la figura 12 que no se explican especlficamente son iguales a los representados en la figura 11, y tienen todos la misma funcion. La practica del metodo de la invencion procede segun la description anterior. La practica del metodo utilizando esta realizacion del dispositivo permite probar en una unica muestra una sustancia desconocida proporcionando al mismo tiempo un control positivo para el comportamiento del dispositivo y el metodo.
La figura 13 muestra una configuracion de un dispositivo 13 util para llevar a cabo un metodo de la invencion, en el que una unica placa de aplicacion de la muestra 1351 en el interior del recipiente 1335 se bifurca para conectarse a dos placas de reaccion independientes 1310a y 1310b, cada una de las cuales esta, por lo menos parcialmente, por debajo de, y en contacto con una membrana porosa diferente 1320a y 1320b y una placa de reception de la solution de lavado diferente 1340a y 1340b. Las membranas porosas 1320a y 1320b comprenden elementos de par de union especlficos 1330a y 1330b, cada uno de los cuales son especlficos para una sustancia diferente. En esta configuracion del dispositivo, el metodo de la invencion puede ser utilizado para detectar dos sustancias diferentes en una unica muestra llquida. En algunas realizaciones, se sabe que una de las sustancias esta presente en la muestra (ya sea naturalmente o como componente anadido), y por lo menos una membrana (ya sea 1320a o 1320b) actua como un control positivo para el dispositivo y el metodo.
La figura 14A representa una configuracion de un dispositivo 14 util para llevar a cabo un metodo de la presente invencion, en el que la placa de aplicacion de la muestra 1451 se extiende mas alla del area interior del dispositivo 14 definida por el recipiente 1435. La placa de aplicacion 1451 de muestras es integral con la placa de filtration 1470, la placa de reaccion 1410 y la placa de recepcion de la solucion de lavado 1440. La placa de aplicacion 1410 esta, por lo menos parcialmente por debajo, y en contacto directo con la membrana 1420, que comprende el elemento de par de union especlfico 1430. En la practica de la invencion utilizando esta configuracion del dispositivo, la placa de aplicacion 1451 contacta con una muestra llquida por inmersion en el llquido, introduction en un flujo del llquido (por ejemplo, un flujo de orina), aplicacion de la muestra a la placa mediante pipeteo, o similares. La muestra llquida pasa a traves de la placa de aplicacion 1451 a la placa de filtracion 1470. En algunas realizaciones, un marcador (no representado) que se une a la sustancia de interes esta presente en la placa de filtracion 1470 y es solubilizado por el llquido. El marcador se une a la sustancia que esta presente en la muestra durante su paso a traves de la placa de filtracion 1470 (y/o en un momento posterior durante el ensayo). La muestra llquida pasa a continuation a la placa de reaccion 1410 y se difunde entrando, atravesando, saliendo de, y rodeando la membrana 1420. En algunas realizaciones, un marcador que se une a la sustancia de interes esta presente en, y/o sobre la superficie de la placa de reaccion 1410 y es solubilizado por el llquido. El marcador se une a la sustancia que esta presente en la muestra durante su paso a traves de la placa de reaccion 1410 (y/o en un momento posterior durante el ensayo). La difusion desde la placa de reaccion 1410 entrando, atravesando, saliendo de, y rodeando la membrana 1420 permite el contacto de la sustancia de interes (si esta presente) o del complejo sustrato-marcador con el elemento de par de union especlfico 1430. En realizaciones en las que se utiliza un marcador directo, este se puede unir a la sustancia en un momento previo (tal como se acaba de describir) o se puede unir a la sustancia en el mismo momento, o despues de la union de la sustancia al elemento de par de union especlfico. Con la formation de un complejo elemento de par de union especlfico-sustancia-marcador, se detecta la presencia de la sustancia. En realizaciones en las que se utiliza un marcador indirecto, el marcador se puede anadir en cualquiera de los momentos descritos anteriormente. Con la formacion de un complejo elemento de par de union especlfico-sustancia- marcador, cualquier exceso del marcador y otras sustancias que puedan estar presentes en la membrana se puede lavar aplicando una solucion de lavado a la membrana 1420. La solucion de lavado pasa por la membrana 1420 y entra a la placa de reaccion 1410. Debido a que existe un exceso de solucion de lavado mas alla de la capacidad de
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transporte de la placa de reaccion 1410, el llquido es conducido a la placa de recepcion de la solucion de lavado 1440, a la placa de filtracion 1470 o a ambas. Dado que la placa de recepcion de la solucion de lavado 1440 esta habitualmente seca o sustancialmente seca (debido a la seleccion de la magnitud apropiada de volumen a anadir a la zona de aplicacion 1451) mientras que la placa de filtracion 1470 esta por lo menos parcialmente humeda, la placa de recepcion de la solucion de lavado 1440 absorbe habitualmente la mayorla de la solucion de lavado aplicada a la membrana. El lavado se puede repetir tantas veces como sea necesario para conseguir una relacion senal/ruido adecuada. Despues del lavado, se puede anadir el sustrato para el marcador indirecto, y se puede llevar a cabo otra lavado, si se desea, para reducir la senal de fondo. La deteccion de una senal especlfica indica la presencia de la sustancia de interes en la muestra original.
La figura 14B representa otra realizacion del dispositivo 14 representado en la figura 14A. En el dispositivo de la figura 14B, la placa aplicadora 1451 comprende un material plastico absorbente sobre el que se aplica directamente una muestra, tal como orina, que comprende un conjugado de enzima que se une a la sustancia de interes. La muestra mas el conjugado de enzima se desplaza por la placa de filtracion 1470, que es unitaria con la placa de aplicacion 1451, y entra al recipiente 1435 a traves de la placa de filtracion 1470, que ha sido comprimida por el recipiente 1435. La muestra mas el conjugado de enzima se desplaza a traves de la placa de filtracion 1470 a la placa de reaccion 1410, que es unitaria con la placa de filtracion 1470 y es comprimida por el recipiente 1435, de manera similar a la placa de filtracion 1470. Si esta presente una sustancia de interes, esta reaccionara con el conjugado de enzima tras la mezcla antes de la aplicacion, durante el paso a traves de la placa de aplicacion de la muestra 1451, la placa de filtracion 1470 o la placa de reaccion 1410. Se permite que la muestra contacte con la membrana 1420 durante una cantidad de tiempo suficiente para que la sustancia (o el complejo sustancia-conjugado marcador) se difunda entrando, saliendo y a traves de la membrana 1420 y contacte con el elemento de par de union especlfico 1430 (no mostrado) y forme un complejo. A continuacion se aplica una solucion de lavado a la membrana 1420 y el exceso de solucion de lavado se desplaza por la membrana 1420 y entra, por lo menos, a la placa de recepcion de la solucion de lavado 1440. La deteccion de la presencia o ausencia de la sustancia en la muestra se produce detectando una senal producida por la membrana 1420 en, o cerca del elemento de par de union especlfico 1430 (no mostrado).
La figura 14C muestra una configuration mas del dispositivo 14 representado en las figuras 14A y 14B. En esta configuration, la placa de aplicacion de la muestra 1451, la placa de filtracion 1470, la placa de reaccion 1410 o una combination de dos o todas las anteriores comprende un conjugado de oro. El conjugado de oro, que se une especlficamente a la sustancia de interes, se disuelve mediante la muestra llquida aplicada a medida que atraviesa las placas, y se une a la sustancia, si esta presente. Tras el contacto del llquido (ahora filtrado) con la membrana 1420 mediante la difusion entrando, saliendo, atravesando y rodeando la membrana 1420, el conjugado sustancia- oro se une al elemento de par de union especlfico 1430 (no mostrado), lo que tiene como resultado la generation de una senal detectable en, o cerca del elemento de par de union especlfico 1430 dentro de aproximadamente 30 segundos o mas de contacto del llquido con la membrana 1420. La presencia de la sustancia en el llquido se determina mediante la deteccion de una senal (habitualmente por simple observation) en la ventana de deteccion 1460 sin la necesidad de una etapa de lavado.
La figura 15 representa una configuracion del dispositivo 15 util para llevar a cabo un metodo de la presente invention. Tal como se muestra en la figura 15A, el recipiente 1535 es un recipiente de tipo "concha de almeja" en el que una mitad superior 1535a y una mitad inferior 1535b estan acopladas entre si a lo largo de un borde mediante una articulation flexible 1580.
Aunque no se representa en la figura, en algunas realizaciones, un soporte para una membrana es integral con la mitad superior 1535a y define los bordes de una ventana de deteccion. Un orificio de carga de la muestra es integral asimismo con la mitad superior 1535a y esta definido por una abertura en la mitad superior 1535a en una position sobre una placa de aplicacion. La mitad superior 1535a comprende asimismo una o varias espigas o rebajes para alojar espigas, donde el acoplamiento de las espigas con los rebajes provoca un ajuste por friction que mantiene juntas la mitad superior 1535a y la mitad inferior 1535b.
En las realizaciones habituales, la mitad inferior 1535b contiene una placa de aplicacion de la muestra, una placa de filtracion, una placa de reaccion y una placa de recepcion de la solucion de lavado. Comprende asimismo habitualmente uno o varios rebajes para alojar espigas, o una o varias espigas, donde el acoplamiento de los rebajes con las espigas provoca un ajuste por friccion que mantiene juntas la mitad superior 1535a y la mitad inferior 1535b.
La figura 15B representa una vista superior de la mitad inferior de una realizacion del dispositivo 15 representado en la figura 15A. En la figura, la placa de aplicacion de la muestra 1551 es integral con la placa de filtracion 1570, la placa de reaccion 1510 y la placa de recepcion de la solucion de lavado 1540, todas las cuales tienen una anchura de 2,2 cm. La placa de reaccion 1510 es 0,3 cm mas ancha que la placa de aplicacion de la muestra 1551, la placa de filtracion 1570, la placa de reaccion 1510 y la placa de recepcion de la solucion de lavado (0,15 cm a cada lado) para soportar completamente la membrana 1520 (no representada), que mide 0,75 cm de longitud por 2,5 cm de anchura. Estan presentes rebajes 1581 para postes de alineamiento de ajuste por friccion, como parte del recipiente 1535b, as! como postes 1582 de sujecion.
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La figura 15C muestra una seccion transversal desde el lateral del dispositivo 15 representado en la figura 15A y/o en la figura 15B, donde la mitad superior 1535a esta situada sobre, pero no en contacto con la mitad inferior 1535b, y donde la articulacion esta retirada para permitir el alineamiento de las mitades superior e inferior con propositos descriptivos. La figura indica la colocacion del orificio 1555 de aplicacion de la muestra, y la ventana de visualizacion o deteccion 1560.
La figura 15D es una seccion transversal desde el lateral del dispositivo 15 representado en la figura 15A, 15B y/o 15C, en el que la mitad superior y la mitad inferior estan unidas mediante ajuste por friccion. Tal como se puede ver por la figura, en esta realizacion, la conexion de la mitad superior 1535a con la mitad inferior 1535b tiene como resultado la compresion de la placa de reaccion 1510 en, y cerca del area donde la membrana 1520 esta en contacto con la placa de reaccion 1510.
La figura 16 representa otra realizacion del dispositivo util para llevar a cabo el metodo de la invencion. En la figura 16A, el dispositivo se representa en su estado cerrado. En la figura 16B, el dispositivo se representa en su estado abierto. En esta realizacion, el dispositivo 16 comprende un recipiente de plastico articulado que comprende una mitad superior 1635a y una mitad inferior 1635b. La mitad inferior 1635b comprende un orificio 1655 de carga de muestras, y contiene una combinacion unitaria de la placa 1651 de carga de aplicacion de la muestra llquida, la placa de filtracion 1670 y la placa de reaccion 1610. La mitad superior 1635a esta acoplada a la mitad inferior 1635b mediante una articulacion flexible 1680, que esta fabricada del mismo material de plastico que el resto del recipiente 1635. La mitad superior 1635a contiene la placa de recepcion de la solucion de lavado 1640 y la membrana porosa 1620. La membrana porosa 1620 comprende por lo menos un elemento de par de union especlfico (no representado).
Cuando esta en su posicion cerrada, la membrana 1620 esta intercalada entre la placa de reaccion 1610 y la placa de recepcion de la solucion de lavado 1640, y esta en contacto con ambas placas, realizandose el contacto entre la placa de reaccion 1610 y la membrana 1620 por lo menos sobre una parte de la membrana 1620 que comprende por lo menos un elemento de par de union especlfico (no representado). La muestra se aplica a la placa de aplicacion 1651 a traves del orificio de aplicacion 1655, y la muestra se desplaza a traves de la placa de aplicacion 1651 y de la placa de filtracion 1670 a la placa de reaccion 1610. La parte de la muestra presente en la placa de reaccion 1610 se difunde entrando y saliendo de la membrana 1620, y contacta con el elemento o elementos de par de union especlficos, donde la sustancia de interes, si esta presente, se une al elemento o elementos de par de union especlficos y es retenida en la membrana 1620.
Despues de una cantidad de tiempo suficiente para la reaccion de la sustancia con el elemento o elementos de par de union especlficos, la mitad superior 1635a y la mitad inferior 1635b se separan mediante el movimiento de las dos alrededor de la articulacion 1680. Si se utiliza un marcador directo, puede ser anadido en este momento, o puede haber estado presente en la placa de reaccion 1610, la placa de filtracion 1670 o la placa de aplicacion 1651, y haberse unido ya a la sustancia de interes. Cuando se utiliza un marcador directo, la deteccion de la presencia de la sustancia se puede realizar en este momento, o se puede lavar la membrana 1620 para mejorar la relacion senal/ruido. Si se lleva a cabo un lavado, se anade la solucion de lavado a la membrana 1620, y la solucion de lavado es absorbida (despues de fluir por la membrana 1620) por la placa de recepcion de la solucion de lavado 1640. Si se utiliza un marcador indirecto, el marcador (o el sustrato para el marcador, si el marcador ha sido incorporado a la placa de aplicacion 1651, la placa de filtracion 1670 o la placa de reaccion 1610) se aplica a la membrana 1620 despues de la separacion de la mitad superior 1635a y la mitad inferior 1635b, y se deja que permanezca en contacto con la membrana 1620 durante una cantidad de tiempo suficiente para reaccionar con la sustancia unida al elemento de par de union especlfico. A continuacion se aplica una solucion de lavado a la membrana 1620, tal como se ha descrito anteriormente. Cuando es necesario, el sustrato para el marcador indirecto se aplica a continuacion a la membrana 1620 y se deja que permanezca en contacto durante una cantidad de tiempo suficiente para que se forme un complejo entre el marcador y el sustrato del marcador, o para que se genere una senal detectable.
La figura 17 representa un dispositivo 17 en el que esta colocada una membrana de plastico 1745 impermeable al llquido, entre la placa de reaccion 1710 y la placa de recepcion de la solucion de lavado 1740 en el interior del recipiente 1735. En esta realizacion, se aplica a la membrana 1720 una muestra llquida que se ha aclarado para eliminar material particulado grande, y a la que se ha anadido el conjugado, y se deja que fluya a la placa de reaccion 1710, que esta en contacto con la membrana 1720. Se proporciona el tiempo suficiente para la difusion de la muestra entre la placa de reaccion 1710 y la membrana 1720, de tal modo que la sustancia de interes, si esta presente, se une por lo menos a un elemento de par de union especlfico (no representado). Despues del transcurso de una cantidad de tiempo suficiente, se extrae la barrera impermeable 1745 tirando de la lengueta 1747. Se aplica la solucion de lavado a la membrana 1720, y se lava en la membrana 1720 el exceso de solucion de lavado y de sustrato no unido, de conjugado y de complejo conjugado-sustrato, haciendo que pase a la placa de reaccion 1710 y a continuacion a la placa de recepcion de la solucion de lavado 1740. A continuacion, se obtiene la deteccion de la presencia de la sustancia mediante la deteccion directa de una senal desde el elemento o elementos de par de union especlficos (no representados) o el entorno de los mismos, o mediante la adicion de sustrato para el marcador. En este momento se pueden realizar uno o varios lavados adicionales.
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La figura 18 representa otra configuration del dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invention. En esta configuration, el dispositivo 18 comprende el recipiente 1835, que comprende un orificio 1855 para muestras y la placa de aplicacion de la muestra 1851, que estan dispuestos junto a, y conectados a la placa de reaction 1810 y a la membrana 1820. La placa de reception de la solution de lavado 1840 esta situada debajo de la placa de reaccion 1810 y esta separada de la placa de reaccion 1810 mediante una membrana impermeable 1845. La extraction de la membrana impermeable 1845 tirando de la lengueta 1847 permite que la placa de recepcion de la solucion de lavado 1840 y la placa de reaccion 1810 entren en contacto directo, y proporciona un flujo continuo desde la membrana 1820 a la placa de recepcion de la solucion de lavado 1840. En la practica, esta configuracion del dispositivo se utiliza de manera similar a la descrita con respecto a la figura 17, con la exception de que la muestra se anade en el orificio 1855 de aplicacion de muestras en lugar de a traves de la membrana 1820.
La figura 19 representa una realization de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion similar al representado en la figura 16. La figura 19A representa el dispositivo en una position cerrada. La figura 19B representa el dispositivo en una posicion abierta. Tal como se puede ver en la figura 19A, el dispositivo 19 comprende un recipiente que comprende una mitad superior 1935a y una mitad inferior 1935b, conectadas mediante una articulation 1980. La mitad superior 1935a comprende la placa de reaccion 1910, que es integral con la placa de aplicacion de la muestra 1951, y que se mantiene en posicion mediante el soporte 1936. La membrana 1920 esta situada entre la placa de reaccion 1910 y la placa de recepcion de la solucion de lavado 1940, en contacto flsico directo con ambas mediante la presion ejercida sobre la membrana 1920 por el soporte 1936. La mitad inferior 1935b comprende la placa de recepcion de la solucion de lavado 1940, en contacto flsico directo con la membrana 1920. En la practica de una realizacion del metodo de la invencion con esta configuracion del dispositivo, tal como se representa en la combination de la figura 19A y la figura 19B, la muestra (a la que se ha anadido un conjugado marcador) se aplica a la placa de aplicacion 1951 (que es integral con la placa de reaccion 1910 y la placa de filtration 1970), y se permite que el llquido de la muestra se desplace a la placa de reaccion 1910 y se difunda entrando y saliendo de la membrana 1920. La solucion de lavado se anade a la placa de aplicacion de la muestra 1951 y se extrae a traves de la placa de reaccion 1910 y de la membrana 1920, extrayendo el llquido hacia la placa de recepcion de la solucion de lavado 1940 como resultado de estar este seco. A continuation se aplica el sustrato para el conjugado marcador a la membrana 1920, y las dos mitades 1935a y 1935b se separan por rotation en torno a la articulacion 1980, dejando por lo tanto al descubierto la membrana 1920. La presencia de la sustancia se detecta mediante metodos de detection visual o no visual, evaluando la senal emitida desde, o desde la cercanla de por lo menos un elemento de par de union especlfico (no representado) incorporado en la membrana 1920.
La figura 20 es una configuracion del dispositivo 20 util para llevar a cabo un metodo de la invencion que comprende el recipiente 2035, y en el que la placa de aplicacion 2051 es integral con la placa de reaccion 2010, y en el que el orificio de aplicacion 2055 esta situado por encima/debajo y en el lado opuesto de la membrana 2020 y la ventana de deteccion 2060. La placa de recepcion de la solucion de lavado 2040 esta en contacto directo con la placa de aplicacion 2051 y la placa de reaccion 2010, y esta situada en el lateral de estas placas, con respecto al orificio de aplicacion 2055 y la ventana de deteccion 2060. En la practica de una realizacion del metodo de la invencion con esta configuracion del dispositivo, la muestra (a la que se ha anadido el conjugado) se aplica a la placa de aplicacion 2051 a traves del orificio de aplicacion 2055, y se permite que la muestra atraviese la placa de reaccion 2010, y se difunda entre la placa de reaccion 2010 y la membrana 2020, que comprende por lo menos un elemento de par de union especlfico (no representado). El dispositivo 20 se invierte despues de que la muestra llquida se ha extraldo del todo, o sustancialmente del todo por la placa de aplicacion 2051 y la placa de reaccion 2010, y se ha producido una cantidad de difusion deseada entre la placa 2010 y la membrana 2020. Se aplica la solucion de lavado a la membrana 2020, y se extrae a traves de la placa de reaccion 2010 y de la placa de aplicacion 2055 a la placa de recepcion de la solucion de lavado 2040. Se anade el sustrato para el conjugado y se lleva a cabo la deteccion de la presencia de la sustancia de interes en el llquido, de acuerdo con metodos conocidos y con la description anterior. Igual que en todas las demas realizaciones en las que se utiliza un marcador indirecto, es preferible la incubation del sustrato y del marcador para obtener una intensidad de senal optima.
La figura 21 representa una realizacion de un dispositivo util para llevar a cabo un metodo de la invencion, al que se hace referencia asimismo en un ejemplo mas adelante. En general, la realizacion comprende los elementos explicados anteriormente con respecto a otras realizaciones. En una realizacion particular del dispositivo representado en la figura 21, el dispositivo comprende una abertura de la ventana de reaccion sobre una membrana porosa que comprende dos llneas de anticuerpos inmovilizados incorporados en las mismas. Por ejemplo, esta puede contener una llnea de prueba (o llnea "T"), que tiene anticuerpos contra la toxina A, la toxina B o ambas, de toxina C. difficile. Puede contener asimismo una segunda llnea (o llnea "C") que actua como control interno, que tiene por ejemplo anticuerpos anti-IgG u otros anticuerpos especlficos para otros antlgenos. En uso, el dispositivo puede detectar la presencia de una sustancia de interes, tal como la toxina A y/o B, en una muestra. Por ejemplo, se puede anadir una muestra a un tubo que contiene una mezcla de un diluyente (por ejemplo, una solucion de protelna tamponada que contiene el 0,02% de timerosal) y un conjugado (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de raton especlfico para la toxina A acoplado a peroxidasa de rabano picante y un anticuerpo policlonal de cabra especlfico para la toxina B acoplado a peroxidasa de rabano picante en una solucion de protelna tamponada que contiene el 0,02% de timerosal). La mezcla muestra-conjugado diluida se puede anadir a continuacion a un pozo de muestras, que es una abertura en la carcasa del dispositivo, y que se abre en un material poroso (placa de filtro) en un area
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para recibir la muestra, que no es la ventana de reaccion. Despues de anadir la muestra diluida al material poroso a traves del pozo de muestras, el dispositivo se puede incubar a una temperatura adecuada, por ejemplo a temperatura ambiente, durante una cantidad de tiempo suficiente, por ejemplo 15 minutos. Durante este periodo de incubacion, la sustancia de interes (por ejemplo, la toxina A y/o B), si esta presente en la muestra, se une al conjugado (por ejemplo, conjugado anticuerpo anti-toxina-peroxidasa). Despues de la aplicacion de la muestra al dispositivo, los complejos sustancia-conjugado (por ejemplo, toxina-anticuerpo), si estan presentes, migran a traves de, por lo menos, un material poroso a la membrana porosa que contiene los anticuerpos inmovilizados. Se dispone una cantidad de tiempo suficiente (por ejemplo, un minuto) para la difusion de los complejos entrando y saliendo de la membrana porosa. Los complejos, si estan presentes, son capturados por los anticuerpos inmovilizados en la llnea o llneas. La membrana porosa, por lo menos en el area que comprende una parte de las llneas, se puede a continuacion lavar opcionalmente con un tampon de lavado (por ejemplo, una solucion tamponada que contiene el 0,02% de timerosal). El dispositivo se puede desarrollar a continuacion con la adicion de un sustrato (por ejemplo, una solucion que comprende tetrametilbencidina). Despues de un periodo de incubacion (por ejemplo, 10 minutos), la presencia de un complejo en la llnea de prueba se puede determinar, por ejemplo, examinando visualmente el aspecto de una llnea (por ejemplo, una llnea azul) en el area en que esta presente la llnea "T" en la membrana porosa bajo la ventana de reaccion. Una llnea en este area indica una prueba positiva. Cuando hay una llnea (por ejemplo, llnea azul) en el area "C" de la membrana porosa bajo la ventana de reaccion, se ha producido una reaccion de control positiva, que indica que el dispositivo y el metodo estan funcionando adecuadamente, y que los resultados (presencia o ausencia de la sustancia de interes) son validos. Cuando se realiza un control, el control puede incluir un antlgeno adecuado para un anticuerpo incorporado en la membrana en la llnea "C", tal como un antlgeno en una solucion acuosa tamponada. Las figuras 21A-D representan a las llneas descritas en la presente memoria, e indican diversos resultados posibles.
Por lo tanto, la invencion da a conocer un metodo segun la reivindicacion 1. En algunas realizaciones, el metodo puede comprender ademas un dispositivo que comprende el material poroso y la membrana porosa. En algunas realizaciones, el material poroso filtra la muestra llquida para eliminar sustancias que tengan un tamano mayor de un valor predeterminado. En algunas realizaciones, el filtrado se realiza por medio de la infiltracion discontinua de llquido desde la muestra llquida a traves del material poroso. En algunas realizaciones, el metodo puede ser utilizado junto con un llquido que comprende dos o mas sustancias de interes, y una, dos o mas de estas sustancias pueden ser detectadas utilizando un unico dispositivo y/o una unica practica del metodo de la invencion. Por lo tanto, en ciertas realizaciones del metodo, cada sustancia de interes es diferente de cada una de las otras sustancias de interes, y el metodo detecta una, dos o mas de las mismas. El metodo se puede practicar sobre muestras llquidas que contienen heces, sangre, un alimento, o en una muestra ambiental (por ejemplo, una sustancia toxica en aguas subterraneas). En realizaciones a modo de ejemplo, el metodo detecta una o ambas de toxina A de Clostridium difficile y toxina B de Clostridium difficile. En algunas realizaciones, la sustancia de interes consiste en una o varias toxinas, bacterias, virus, productos bacterianos, enzimas (por ejemplo, procarioticos, eucarioticos) o parasitos. En algunas realizaciones, la sustancia de interes es glutamato deshidrogenasa. Puede ser asimismo un producto animal o humano, un anticuerpo o una lactoferrina.
El metodo se puede practicar utilizando uno o varios elementos de par de union especlficos. Uno o varios del elemento o elementos de par de union especlficos son un anticuerpo, y cuando se utilizan una serie de anticuerpos como elementos de par de union especlficos, cada uno de los anticuerpos puede ser diferente o el mismo que uno u otros anticuerpos.
El metodo general puede comprender ademas el lavado de la membrana antes de la deteccion de la presencia de un complejo.
La aplicacion de la muestra llquida al material poroso comprende aplicar la muestra llquida en una posicion en el material poroso que esta separada especialmente de la membrana porosa, por lo que por lo menos el llquido de la muestra llquida se desplaza al material poroso y a continuacion a la membrana porosa. En ciertas realizaciones, la muestra llquida que se aplica en un sector de una zona de carga de muestras que es distante de una zona de deteccion se desplaza a traves del material poroso hasta la membrana porosa por medio de un proceso de infiltracion. En algunas realizaciones, se aplica una fuerza flsica a la membrana, al material poroso o ambos, y dicha fuerza mejora la sensibilidad del dispositivo y del metodo de la invencion.
El metodo de la invencion comprende detectar una senal para determinar la presencia de una sustancia de interes. En algunas realizaciones, la deteccion comprende observar una senal emitida desde un marcador unido a la sustancia de interes. En realizaciones particulares, la senal es producida por un producto de precipitacion coloreado que se forma en, o alrededor del elemento de par de union especlfico. Por lo tanto, la deteccion puede ser por medio de la deteccion de un complejo. Por lo tanto, el metodo puede comprender la combination de un conjugado marcado con la muestra llquida, antes de la aplicacion de la muestra llquida al material poroso. El conjugado marcado puede comprender una microesfera de latex u otra partlcula coloreada, una partlcula de oro coloidal o una sustancia reactiva que se una a una sustancia para crear una senal detectable. En algunas realizaciones, la senal es una senal no visual.
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La patente describe asimismo un dispositivo para detectar por lo menos una sustancia de interes en una muestra llquida. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende: (a) un receptaculo que comprende un material poroso para recibir una muestra llquida, donde el material poroso puede absorber y transmitir por lo menos una parte de la muestra llquida, y (b) una membrana porosa que comprende un elemento de par de union especlfico que es especlfico para la sustancia de interes o para una sustancia unida a la sustancia de interes, donde el receptaculo y la membrana porosa estan cada uno conformados para permitir que la membrana porosa este en contacto directo con el material poroso sobre por lo menos una parte de la membrana porosa que comprende el elemento de par de union especlfico. El dispositivo puede comprender un recipiente que contiene el receptaculo, un soporte para la membrana porosa, una placa de recepcion de la solucion de lavado, una placa de aplicacion de la muestra llquida, una placa de filtracion o dos o mas de estos elementos. Cada elemento puede estar subdividido en dos o mas zonas funcionales que, si bien estan fabricadas opcionalmente del mismo material, se pueden fabricar de materiales diferentes respecto de una o varias de las otras zonas.
En algunas realizaciones, el dispositivo comprende un recipiente que contiene una placa de reaccion que comprende el material poroso y la membrana porosa, comprendiendo el recipiente un soporte para la membrana porosa, donde el recipiente hace que se ejerza presion sobre la membrana porosa y/o el material poroso de tal modo que por lo menos una parte del material poroso se comprime. Por supuesto, el recipiente puede contener otros elementos, tal como se ha explicado anteriormente. La compresion del material poroso puede hacer que la membrana porosa y el material poroso esten en contacto directo sobre por lo menos una parte de la membrana porosa, y puede mejorar la funcion del dispositivo y del metodo de la invention. Por ejemplo, la presion puede permitir que uno o varios llquidos pasen entre la membrana porosa y el material poroso por difusion pasiva.
La patente describe asimismo un dispositivo para detectar por lo menos una sustancia de interes en una muestra llquida, donde el dispositivo comprende: (a) un receptaculo que comprende un material poroso para recibir la muestra llquida, donde el material poroso puede absorber y transmitir por lo menos una parte de la muestra llquida, y (b) una membrana porosa que comprende un elemento de par de union especlfico que es especlfico para la sustancia de interes o para una sustancia unida a la sustancia de interes, donde el receptaculo y la membrana porosa estan conformados cada uno para permitir que la membrana porosa este en contacto directo con el material poroso sobre por lo menos una parte de la membrana porosa que comprende el elemento de par de union especlfico, donde la membrana porosa y el material poroso son elementos diferentes que tienen una constitution qulmica diferente. En algunas realizaciones, la membrana porosa y el material poroso estan en contacto flsico de tal modo que la muestra llquida aplicada al material poroso se difunde entrando, saliendo, atravesando y rodeando la membrana porosa. Ademas, el dispositivo puede estar construido de tal modo que se crea el contacto flsico entre la membrana porosa y el material poroso de manera que se mejora la sensibilidad del dispositivo. El dispositivo puede estar configurado de tal modo que el material poroso y la membrana porosa esten en contacto entre si de manera que la sustancia de interes no tenga que atravesar la membrana porosa de manera unidireccional para que el dispositivo detecte la sustancia de interes. En realizaciones a modo de ejemplo, el material poroso y la membrana porosa estan en contacto entre si de manera que permiten que se produzca una difusion simple, no direccional, de un llquido entre los dos.
La patente describe asimismo un dispositivo para la detection de la presencia o de una cantidad de una sustancia de interes en una muestra llquida, donde el dispositivo comprende: una zona de recepcion de la muestra para recibir la muestra llquida, donde la zona de recepcion de la muestra esta presente en un material poroso; una zona de filtro de la muestra para filtrar la muestra llquida recibida en la zona de recepcion de la muestra, donde la zona de filtrado de la muestra esta presente en un material poroso; una membrana porosa que comprende un elemento de union especlfico en una zona de deteccion, que se une especlficamente a la sustancia de interes o a una sustancia unida a la sustancia de interes, donde la membrana porosa no es el mismo elemento que cualquiera de los materiales porosos, y donde el material poroso y la membrana porosa estan en contacto flsico sobre por lo menos un area que comprende una parte de la zona de detention, y donde el material poroso y la membrana porosa estan en contacto flsico en una configuration que permite que el llquido presente en la muestra llquida se difunda entrando, saliendo, atravesando y rodeando la membrana porosa de manera sustancialmente aleatoria, no direccional, en un area que comprende por lo menos una parte de la zona de deteccion. Por supuesto, pueden estar presentes una o varias zonas en un unico material poroso o en dos o mas materiales diferentes. Analogamente, estas pueden estar presentes en dos o mas materiales diferentes, seleccionados cada uno independientemente para que tengan una composition igual o diferente a uno o varios de los otros. Tal como se ha mencionado anteriormente, el dispositivo puede comprender un recipiente que contenga por lo menos una parte del material o materiales porosos y de la membrana porosa. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende un material poroso que comprende una zona de recepcion de la solucion de lavado.
En los ejemplos que siguen se proporcionan otras realizaciones a modo de ejemplo del dispositivo, y de la utilization del dispositivo en la practica del metodo de la invencion, y otras resultaran evidentes a partir de la description y de los dibujos.
EJEMPLOS
La invencion se explicara ademas mediante los ejemplos siguientes, que estan destinados a ser tan solo ejemplares de la invencion, y no se debera considerar que limitan la invencion en modo alguno.
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Ejemplo 1: realization del metodo de la invention
Este ejemplo detalla una utilization in vitro tlpica y orientaciones para la utilization in vitro de una realization del metodo de la invention, en una realization del dispositivo descrita en la patente, que se representa en las figuras 21A-D, en el que se detectan toxinas A y B de Clostridium difficile. El protocolo sigue, en general, el protocolo dado a conocer en el kit TOX A/B QUIK CHEK™ (TechLab, Blacksburg, VA; art. num. T5033). Salvo que se indique lo contrario, en los ejemplos se utilizo el protocolo dado a conocer en el kit TOX A/B QUIK CHEK™. Se proporcionan orientaciones generales en este ejemplo y en el kit TechLab, pero no son necesariamente aplicables a otras realizaciones del metodo de la invencion.
RECOGIDA Y MANIPULACION DE ESPECIMENES FECALES
Los metodos estandar utilizados para la recogida y manipulation de especlmenes fecales son adecuados. Los especlmenes se deberan almacenar entre 2° C y 8° C. Es preferible realizar la prueba en especlmenes que tienen menos de 24 horas. Es preferible almacenar especlmenes congelados (a -10° C o menos) si la prueba no se puede llevar a cabo en las 72 horas siguientes a la recogida. Aunque los datos muestran que un ciclo de congelacion- descongelacion no perjudica la muestra para su utilization con toxinas A y B de C. difficile, se debe observar que la congelation y descongelacion de un especimen, especialmente multiples veces, puede tener como resultado una perdida de actividad debido a la degradation de las toxinas. Los especlmenes fecales que se han conservado en Formalin al 10%, MF, SAF, o PVA, o los especlmenes que estan en medios de transporte tales como Cary Blair o C&S no proporcionan habitualmente resultados tan optimos como las muestras frescas o las conservadas en otras composiciones.
Los especlmenes deberlan ser mezclados minuciosamente (por ejemplo, agitados) antes de llevar a cabo el ensayo. No se recomienda el almacenamiento de especlmenes fecales en el diluyente. Es preferible llevar a cabo inmediatamente la prueba en la muestra una vez que el especimen fecal se ha diluido en el diluyente. Se pueden utilizar pipetas desechables graduadas a 50, 100, 200 y 300 pl.
PREPARACION DE LA MUESTRA
- opcionalmente, poner todos los reactivos y dispositivos a temperatura ambiente antes de su utilization.
- Preparar un casete (dispositivo) para cada especimen a probar.
- Anadir de 0,4 a 0,6 ml (por ejemplo, 0,425 ml o 0,5 ml) de diluyente a cada tubo de dilution utilizando un cuentagotas de plastico.
- Suspender homogeneamente (por ejemplo, agitar) los especlmenes antes de su transferencia. Para especlmenes llquidos/semisolidos, extraer el especimen a la mitad del recorrido hasta la primera marca desde el extremo (25 pl). Administrar el especimen al diluyente. Utilizar la misma pipeta para mezclar el especimen diluido aspirando suavemente, administrando a continuation la mezcla varias veces. Para especlmenes formados/solidos, mezclar minuciosamente el especimen. Utilizando una varilla de aplicacion de madera, transferir una pequena parte (de aproximadamente 2 mm de diametro) del especimen al diluyente. Emulsionar el especimen utilizando la varilla de aplicacion. A modo de control opcional, anadir 1 gota de control positivo o control negativo (diluyente del especimen) a tubos que contienen 0,4 ml de diluyente.
- Anadir 1 gota de conjugado al especimen diluido y mezclar los contenidos del tubo agitando.
METODO DE LA PRUEBA
- Obtener el numero requerido de casetes, una por especimen, y una por control positivo o negativo. Marcar adecuadamente los casetes de membrana.
- Obtener las muestras preparadas. Utilizando una pipeta de transferencia desechable, transferir de 300 a 400 pl de la mezcla muestra diluida-conjugado en el orificio de muestras del casete e incubar el casete a temperatura ambiente durante 15 minutos. En la ventana de resultados sera visible un area humeda creciente. Si no aparece un area humeda en la ventana de resultados, anadir 100 pl de diluyente al orificio de la muestra y esperar 5 minutos adicionales.
- Despues de 15 minutos, anadir 300 pl de tampon de lavado al orificio de reaction. Dejar que el tampon de lavado entre por completo en el orificio de reaction.
- Anadir 2 gotas de sustrato al orificio de reaction y dejar el casete incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos. A la finalization de los 10 minutos, leer los resultados en la ventana de detection. Observar la aparicion de una llnea coloreada (por ejemplo, azul) que representa la llnea de control (ver la figura 21A). Las llneas se pueden presentar de un color de debil a oscuro.
INTERPRETACION DE RESULTADOS
Resultado positivo (figura 21A): son visibles dos llneas, una en la parte inferior del orificio de reaction (llnea de control) y una en la parte superior del orificio de reaction (llnea de prueba). Un resultado positivo indica la presencia de toxina C. difficile y un control reactivo adecuado.
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Resultado negativo (figura 21B): solamente es visible una llnea de control en la parte inferior del orificio de reaccion. No es visible ninguna llnea de prueba en la parte superior del orificio de reaccion. Un resultado negativo indica la ausencia de toxina C. difficile pero un control reactivo adecuado.
Resultado invalido (figuras 21C y 21D): todas las reacciones completadas deberlan tener una llnea de control visible en la parte inferior del orificio de reaccion. La prueba no es valida si no hay presente una llnea de control en el casete finalizado.
Ejemplo 2: comparacion de la deteccion de toxina mas A y B de Clostridium difficile utilizando el metodo de la invencion y cultivo de tejidos.
Se utilizo una realizacion del dispositivo que se describe en la patente, para detectar una combinacion de toxina A y toxina B de C. difficile en 50 muestras fecales, y los resultados se compararon con resultados obtenidos para las mismas muestras utilizando metodos de cultivo de tejidos. La deteccion por cultivo de tejidos de la toxina C. difficile en muestras fecales es el ensayo elegido reconocido en la tecnica, debido a que se considera que es el metodo mas sensible para la deteccion de toxinas. Se utilizo el metodo descrito en el ejemplo 1 para detectar las toxinas.
La prueba por cultivo de tejidos fue el kit de prueba C. difficile Tox-B fabricado por TechLab, Inc. (art. num. T5003), y el metodo fue el que se describe en el prospecto del producto. En resumen, se diluyeron muestras fecales en proporcion 1:10 en el diluyente y se filtraron por medio de un filtro esteril de 0,45 micras. Se anadio cada muestra fecal (50 microlitros) a cada uno de los dos pozos de cultivo de tejidos. Un pozo recibio 50 microlitros de antitoxina para neutralizar toxinas A y B de C. difficile y el otro pozo recibio 50 microlitros solamente de tampon fosfato salino. Las celulas de tejido cultivado de prepucio humano se incubaron a 37° C durante 24 horas y a continuacion se examino la redondez de las celulas, y se volvieron a examinar 48 horas despues. Se consideraron positivos los pozos en los que mas del 50 % de las celulas eran redondeadas. Para una reaccion global positiva, el pozo que contenla antitoxina tenia que ser normal mientras que el pozo sin antitoxina tenia que mostrar redondez de las celulas.
La tabla 1 muestra los resultados de los ensayos, y compara los resultados del metodo de la presente invencion con el ensayo de cultivo de tejidos.
Tabla 1:
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A/B invencion pos. A/B invencion neg.
Cult. de tej. pos.
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Cult. de tej. neg.
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Sensibilidad
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Especificidad
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Val. pos. pred.
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Val. neg. pred.
97,6
Correlacion
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Los resultados indican que un metodo de la presente invencion se comporta de manera casi identica a un cultivo de tejidos.
Ejemplo 3: comparacion de deteccion de toxinas A y B de Clostridium difficile utilizando el metodo de la invencion y ELISA.
Se utilizo un dispositivo como el descrito en la patente para detectar una combinacion de toxina A y toxina B de C. difficile en 50 muestras fecales, y los resultados se compararon con los resultados obtenidos para las mismas muestras utilizando ELISA. Se utilizo el metodo descrito en el ejemplo 1 para detectar las toxinas.
En este experimento se utilizo el kit TechLab Inc. Tox A/B Test segun las directrices del prospecto del producto. En resumen, se diluyeron heces en concentracion 1:5 en un diluyente de la muestra y se anadieron 100 microlitros a los pozos en una placa de pozos ELISA 96. A continuacion se anadio a cada pozo 50 microlitros de solucion de conjugado (que contiene anticuerpos de las toxinas A y B de C. difficile que se conjugaron con peroxidasa de rabano picante). Se incubaron los pozos durante 50 minutos a 37° C y a continuacion se lavaron los pozos para eliminar el conjugado de peroxidasa de rabano picante que no se unio a las toxinas (que se unio a los anticuerpos que recubrlan los pozos). El sandwich de anticuerpos y de enzimas se detecto a continuacion anadiendo 100 microlitros de solucion de sustrato con una incubacion de 10 minutos seguida por la adicion de 50 microlitros de acido diluido para detener la reaccion. Las reacciones positivas fueron aquellos pozos con una densidad optica a 450 nm de mas de 0,12.
La tabla 2 muestra los resultados de los ensayos, y compara los resultados del metodo de la presente invention con el ensayo ELISA.
5
Tabla 2:
N=50
A/B invencion pos. A/B invencion neg.
C. DIFF NB II pos
8 1
C. DIFF A/B II neg
1 40
Sensibilidad
88,9
Especificidad
97,6
Val. pos. pred.
88,9
Val. neg. pred.
97,6
Correlation
96,0
Los resultados indican que el metodo de la presente invencion produce resultados que son comparables con el metodo ELISA sensible utilizado.
10
Ejemplo 4: investigation de la sensibilidad relativa de un metodo de la invencion
Se determino la sensibilidad de un metodo de la invencion. El metodo utilizado fue el de la prueba TOX A/B QUIK CHEK™ para toxinas A y B (TechLab, Inc.). En resumen, se determino la sensibilidad del dispositivo y del metodo utilizando diluciones dobles en serie de toxinas A y B muy purificadas.
15
La prueba fue sistematicamente positiva a una concentration de 0,63 ng/ml para la toxina A y de 1,25 ng/ml para la toxina B. En las tablas siguientes se muestran los resultados de seis pruebas independientes (pruebas 1 a 6) con toxina A o toxina B diluidas en serie para la prueba.
20 Tabla 3: reaction de toxina A muy purificada en la prueba TOX A/B QUIK CHEK™
Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3 Prueba 4 Prueba 5 Prueba 6
Conc. (ng/ml)
1,25
+ + + + + +
0,63
+ + + + + +
0,32
+ + - + +/- +/-
0,16
- - +/- - - -
0,08
- - - - - -
25
Tabla 4: reaccion de toxina A muy purificada en la prueba TOX A/B QUIK CHEK™
Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3 Prueba 4 Prueba 5 Prueba 6
Conc. (ng/ml)
1,25
+ + + + + +
0,63
- - - - + +
0,32
- - - - - -
0,16
- - - - - -
0,08
- - - - - -
Los datos presentados en las tablas 3 y 4 son representativos de los resultados particulares obtenidos en las series de pruebas particulares llevadas a cabo. En otras pruebas, se ha observado a menudo una sensibilidad de 0,16 para 30 la toxina A y de 0,32 a 0,63 para la toxina B.
Ejemplo 5: reproducibilidad y precision de un metodo de la invencion
Para determinar la reproducibilidad y la precision de los metodos de la invencion, una realization del dispositivo 35 descrito en la patente, que se representa en la figura 21, se probo utilizando una realizacion del metodo de la invencion, de acuerdo con un protocolo suministrado por la prueba TOX A/B QUIK CHEK™ de TechLab. Mas especlficamente, se probaron un total de 8 especlmenes fecales, 6 positivos y 2 negativos, en tres diferentes laboratorios utilizando la prueba a TOXA/B QUIK CHEK™ A (TechLab art. num. T5033) segun las instrucciones del fabricante. Para probar el llmite, se incluyeron en los 6 especlmenes positivos 2 especlmenes debilmente positivos 40 que proporcionaron llneas debiles cuando fueron analizados por los inventores. Todos los especlmenes se clasificaron mediante un dispositivo probado, la prueba de C. difficile TOX A/B II™ (TechLab, art. num. T5003), que esta aceptada ampliamente como una prueba muy sensible y precisa para la presencia de toxinas A y B de C.
26
difficile. Todos los especlmenes se mantuvieron congelados a -10° C hasta que se llevo a cabo el ensayo. Cada uno de los laboratorios sometio a prueba los especlmenes en 3 dlas diferentes. Los resultados de cada laboratorio se presentaron a continuacion a los inventores y se compararon con los propios resultados de los inventores. Los resultados, mostrados a continuacion, fueron consistentes entre los diferentes emplazamientos, y presentaron una 5 correlacion del 100%. Los especlmenes positivos se confirmaron como positivos y los especlmenes negativos se confirmaron como negativos en todos los emplazamientos utilizando la prueba TOX A/B QUIK CHEK™.
10
Tabla 5: prueba de reproducibilidad/precision por los inventores, de muestras fecales utilizando un metodo segun la
invencion.
Codigo de especimen (n=8)
TOX A/B II™ ELISA Dla 1 Dla 2 Dla 3
TL001
+ + + +
TL002
+ + + +
TL003
+ + + +
TL004
+ + + +
TL005
+ + + +
TL006
+ + + +
TL007
- - - -
TL008
- - - -
Porcentaje de correlacion
N/A 100 100 100
Tabla 6: prueba de reproducibilidad externa/precision de muestras fecales utilizando un metodo segun la invencion
Codigo de especimen (n=8)
TOX AB II™ ELISA Dla 1 Dla 2 Dla 3
TL001
+ + + +
TL002
+ + + +
TL003
+ + + +
TL004
+ + + +
TL005
+ + + +
TL006
+ + + +
TL007
- - - -
TL008
- - - -
Porcentaje de correlacion
N/A 100 100 100
15 Tabla 7: prueba de reproducibilidad externa/precision de muestras fecales utilizando un metodo segun la invencion
Codigo de especimen (n=8)
TOX AB II™ ELISA Dla 1 Dla 2 Dla 3
TL001
+ + + +
TL002
+ + + +
TL003
+ + + +
TL004
+ + + +
TL005
+ + + +
TL006
+ + + +
TL007
- - - -
TL008
- - - -
Porcentaje de correlacion
N/A 100 100 100
Tabla 8: prueba de reproducibilidad externa/precision de muestras fecales utilizando un metodo segun la invencion
Codigo de especimen
TOX A/B Dla 1 Dla 2 Dla 3
(n=8)
II™ ELISA
TL001
+ + + +
TL002
+ + + +
TL003
+ + + +
TL004
+ + + +
TL005
+ + + +
TL006
+ + + +
TL007
- - - -
TL008
- - - -
Porcentaje de correlacion
N/A 100 100 100
5
10
15
20
25
30
35
40
Como se puede observar, el dispositivo y el metodo funcionaron bien en manos de cuatro facultativos diferentes. Eiemolo 6: efecto de la congelacion-descongelacion sobre los especlmenes
Para caracterizar mas los metodos segun la invencion, se utilizo una realizacion del dispositivo descrito en la patente junto con un metodo segun la invencion, para determinar la idoneidad de cada uno de los especlmenes que hablan sido sometidos, por lo menos, a un ciclo de congelacion-descongelacion.
Se sometio a prueba un total de ocho especlmenes fecales, consistentes en 6 especlmenes positivos y 2 negativos, utilizando una realizacion del dispositivo descrito en la patente, que se representa en la figura 21, y una realizacion del metodo de la invencion, que estan ambas disponibles en la prueba a TOX A/B QUIK CHEKT™ de TechLab, Inc. (art. num. T5033), antes y despues de un unico ciclo de congelacion-descongelacion. Anteriormente, se habla sometido a prueba la presencia o ausencia de toxinas A y B en los especlmenes, en la prueba C. DIFFICILE TOX A/B II™ (TechLab, Inc.; art. num. T5003). Los resultados se muestran en la tabla siguiente. Se incluye la reactividad residual en la prueba C. DIFFICILE TOX A/B II™ despues del ciclo de congelacion-descongelacion. Los resultados mostraron que los especlmenes positivos siguieron siendo positivos despues del ciclo de congelacion- descongelacion y los especlmenes negativos siguieron siendo negativos. La no conversion de positivo a negativo o de negativo a positivo se observo en cualquiera de los especlmenes.
Tabla 9: efecto del ciclo de congelacion-descongelacion sobre el metodo de la invencion
Codigo de especimen (n=8)
TOX A/B II™ ELISA (antes de la congelacion) INVENCION (antes de la congelacion) TOX AJB IIIM ELISA (despues de la congelacion) INVENCION (despues de la congelacion)
TL001
+ + + +
TL002
+ + + +
TL003
+ + + +
TL004
+ + + +
TL005
+ + + +
TL006
+ + + +
TL007
- - - -
TL008
- - - -
Eiemplo 7: efecto del almacenamiento de especlmenes entre 2° y 8° C durante 72 horas
Para seguir investigando la utilizacion del metodo de la invencion para la deteccion de sustancias de interes en muestras, se sometieron a prueba seis especlmenes fecales positivos y dos negativos (con respecto a las toxinas A y B de C. difficile) en tiempos de 24, 48 y 72 horas utilizando metodos segun la presente invencion, especlficamente en la prueba TOX A/B QUIK CHEK™ (TechLab, Inc.; art. num. T5033) segun las instrucciones del fabricante, para evaluar la estabilidad de las toxinas en las muestras fecales. Los resultados, mostrados a continuacion, demuestran que el dispositivo y el metodo funcionaron de manera consistente en cada intervalo de tiempo. Ademas, muestran que las toxinas C. difficile son estables durante por lo menos 72 horas en estas condiciones de prueba. Todos los especlmenes positivos siguieron siendo positivos y los especlmenes negativos siguieron siendo negativos en cada periodo de tiempo.
Tabla 10: efecto del almacenamiento de especlmenes entre 2° y 8° C durante 72 horas
Especlmenes (n = 8)
Dla 1 ensayo de C. difficile TOX A/B II™ de 20 minutos Dla 1 TOX A/B QUIK CHEK™ Dla 2 C. difficile TOX A/B II™ Dla 2 TOX A/B QUIK CHEK™ Dla 3 ensayo de C. difficile TOX A/B II™ de 20 minutos Dla 3 TOX A/B QUIK CHEK™
TL001
+ + + + + +
TL002
+ + + + + +
TL003
+ + + + + +
TL004
+ + + + + +
TL005
+ + + + + +
TL006
+ + + + + +
TL007
- - - - - -
TL008
- - - - - -
5
10
15
20
25
30
35
Ejemplo 8: utilizacion de un metodo y un aparato para probar muestras cifnicas en un laboratorio clfnico
Se utilizo el metodo y el aparato utilizados en los anteriores ejemplos 4 a 7, para analizar muestras clfnicas que sospechaba contenfan toxinas A y/o B de C. difficile. Mas especfficamente, los inventores compararon una realization del dispositivo descrito en la patente, acoplada con una realization del metodo de la invention, vendidas juntas por TechLab, Inc. con la marca registrada TOX A/B QUIK CHEK™ (TechLab; art. num. T5033) con ensayos de cultivo de tejidos en 3 laboratorios clfnicos comerciales. Los emplazamientos del estudio y los investigadores, junto con el numero y la fuente de los especfmenes, se presentan en la tabla siguiente. El metodo de la invencion se comparo con el ensayo de cultivo de tejidos, debido a que el ensayo de cultivo de tejidos se considera como el "estandar de oro" para detectar la toxina C. difficile en muestras fecales. Los resultados discrepantes se analizaron utilizando la prueba de C. DIFFICILE TOX A/B II™ o bien la prueba de Meridian Premier™ Toxins A&B, siendo ambas ELISAs de microvaloracion para detectar toxinas A y B en especfmenes fecales. Para los estudios llevados a cabo por los inventores en este ejemplo, se llevo a cabo un ensayo de cultivo de tejidos utilizando el ensayo de C. DIFFICILE TOX-B TEST de TechLab, Inc.
Cuando se comparo el metodo de la invencion con el ensayo de cultivo de tejidos, se determino la sensibilidad, la especificidad, los valores predictivos positivos y negativos, y el porcentaje de correlation. Se determinaron asimismo intervalos de confianza del 95 % para el analisis frente al ensayo de cultivo de tejidos.
Estuvo disponible la identification de genero para 294 pacientes. Habfa 177 mujeres (60,2%) y 117 hombres (39,8%) La information de edad estaba disponible para 613 pacientes. La edad variaba desde aproximadamente 1 ano a 95 anos, con la distribution mostrada en la tabla siguiente. El numero debajo de cada barra en la tabla representa el numero de pacientes que habfa en el grupo de edad especffico.
Tabla 11: distribucion de edades para el estudio clfnico
imagen1
Distribucion de edades
1-oQ 51 -GO 61-70
Grupos de edades
81-90 91+
Las tablas siguientes muestran un resumen del comportamiento clfnico del metodo de la invencion. Se incluyen en el resumen los resultados de la totalidad de los 5 estudios clfnicos llevados a cabo. Los resultados del metodo de la invencion se compararon con el ensayo de cultivo de tejidos y los resultados discrepantes fueron analizados por la prueba C. difficile TOX A/B™ (el dispositivo y el metodo de la invencion explicados aquf) o bien por la prueba Meridian Premier™ Toxins A&B. Los resultados muestran que la prueba de tOx A/B QUIK CHEK™ presento una sensibilidad y una especificidad del 90,2% y el 99,7%, respectivamente, en comparacion con el ensayo de cultivo de tejidos. Los valores predictivos positivos y negativos fueron del 98,6% y el 97,9%, respectivamente, y la correlacion fue del 98,0%.
Tabla 12: resumen del comportamiento clfnico de un metodo de la invencion
n=842
Muestras positivas de cultivo de tejidos Muestras negativas de cultivo de tejidos
TOX A/B QUIK CHEK™ positivo
138 2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
TOX A/B QUIK CHEK™ negativo
15 687
Intervalo de confianza del 95 %
Sensibilidad
90,2 84,1 - 94,2
Especificidad
99,7 98,8 - 99,9
Valor positivo predictivo
98,6 94,4 - 99,8
Valor negativo predictivo
97,9 96,4 - 98,7
Correlation
98,0 97,8 - 98,2
De las 2 muestras cultivo de tejidos-negativa/TOXA/B QUIK CHEK™-positiva, 1 fue negativa en la prueba TOX A/B II™. De los 15 especlmenes que fueron cultivo de tejidos-positivo/TOXA/B QUIK CHEK™- negativo, 12 fueron negativos en la prueba C. DIFFICILE TOX A/B II™ o en la prueba Meridian Premier™ Toxins A&B.
Ejemplo 9: efecto de la consistencia de los especlmenes fecales.
Para seguir caracterizando el metodo de la invencion, se probo una realization de un dispositivo descrito en la patente, con una realizacion del metodo de la invencion, para determinar el efecto de la consistencia de los especlmenes fecales sobre el comportamiento del dispositivo y del metodo.
La reaction de los especlmenes fecales de consistencias variables en la prueba de TOX A/B QUIK CHEK™ se muestra en la tabla siguiente. Se incluyeron en el analisis un total de 805 muestras fecales de consistencia conocida. Los porcentajes de reacciones positivas utilizando cualquiera del ensayo de cultivo de tejidos o la prueba TOX A/B QUIK CHEK™ fueron similares en todos los tres tipos de especlmenes fecales (llquidos, semisolidos y solidos). Se presentaron todos los especlmenes a la prueba de C. difficile. La base para la presentation fue la historia cllnica del paciente y no la consistencia del especimen. Los resultados muestran que la prueba de TOX A/B QUIK CHEK™ se comporto de manera similar al ensayo de cultivo de tejidos cuando se prueban muestras de consistencias diferentes.
Tabla 13: reaccion de especlmenes fecales de consistencias variables en la prueba TOX A/B QUIK CHEK™.
# de especlmenes (n=805)
Especlmenes llquidos (n=487) Especlmenes semisolidos (n=294) Especlmenes solidos (n=24)
Positivo mediante ensayo de cultivo de tejidos
87 (17,9%) 56 (19,0%) 3 (12,5%)
Positivo mediante TOX A/B QUIK CHEK™
76 (15,6%) 50 (17%) 3 (12,5%)
Ejemplo 10: comparacion de la detection de glutamato deshidrogenasa de Clostridium difficile utilizando el metodo de la invencion y ELISA.
Se utilizo el metodo de la invencion para detectar el antlgeno de glutamato deshidrogenasa de C. difficile en 49 muestras fecales, y los resultados se compararon con los obtenidos con un metodo ELISA. Se utilizo el metodo descrito en el ejemplo 1 para detectar las toxinas, con las modificaciones siguientes.
Las muestras fecales para utilizar en el dispositivo se diluyeron tal como se especifica en el ejemplo 1, con diluyente de la muestra que contiene anticuerpos (en este caso, especlficos para la enzima de glutamato deshidrogenasa de C. difficile) que se han conjugado qulmicamente con enzima de deteccion de peroxidasa de rabano picante (conjugado). La muestra mezclada (300 microlitros) se aplico a continuation a la placa de aplicacion (placa de infiltration) a traves de la abertura en el dispositivo (orificio de aplicacion) y despues de 15 minutos a temperatura ambiente, se anadio solution de lavado (mezcla de suero salino/detergente) a la parte superior de la membrana, seguida por la solucion de sustrato qulmico. Los resultados se leyeron visualmente tal como se especifica en el ejemplo 1.
Se utilizo ELISA Tox AB de TechLab Inc. tal como se especifica en el prospecto del producto del fabricante. En resumen, la muestra fecal se diluyo a una concentration de 1:5 en diluyente de la muestra y se mezclo por agitation. Cada pozo de la placa ELISA recibio 50 microlitros de solucion de conjugado que contiene anticuerpos especlficos para glutamato deshidrogenasa acoplado a peroxidasa de rabano picante, y a continuacion se anadieron a cada pozo 100 microlitros de una muestra mezclada. La placa se incubo a continuacion a 37° C durante 50 minutos para permitir que los anticuerpos acoplados a los micropozos y el anticuerpo en la solucion de conjugado se unieran al glutamato deshidrogenasa. Los pozos se lavaron minuciosamente a continuacion para eliminar la peroxidasa de rabano picante no unida. Se anadieron cien microlitros de solucion de sustrato a cada pozo, se incubaron durante 5 minutos, y a continuacion se detuvo la reaccion anadiendo 50 microlitros de solucion de acido diluido. Los resultados se leyeron a 450 nm en un lector ELISA. Las muestras positivas tuvieron una densidad optica mayor de 0,12.
5
10
15
La tabla 14 muestra los resultados de los ensayos, y compara los resultados del metodo de la presente invencion
con el ensayo ELISA.
Tabla 14: comparacion del metodo de la invencion con un metodo ELISA
N=49
Ag. invencion pos. Ag. invencion neg.
Chek. C. cliff. pos.
9 0
Chek. C. cliff. neg.
0 40
Sensibilidad
100,0
Especificidad
100,0
Valor positivo predicho
100,0
Valor negativo predicho
100,0
Correlacion
100,0
Los resultados indican que el metodo de la presente invencion produce resultados que son identicos al metodo ELISA sensible utilizado. Por lo tanto, los metodos de la invencion son adecuados para la deteccion de numerosas sustancias de interes.
Resultaran evidentes para los expertos en la materia otras realizaciones de la invencion a partir de la consideracion de la memoria, y de la practica de la invencion. Se preve que la memoria y los ejemplos se consideren solamente a modo de ejemplo.

Claims (19)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de deteccion de por lo menos una sustancia de interes en una muestra llquida, comprendiendo dicho metodo:
    disponer una muestra llquida que comprende, o se sospecha que comprende la sustancia o sustancias de interes;
    aplicar la muestra llquida a un material poroso en una cantidad suficiente para humedecer por lo menos parcialmente el material poroso,
    poner el material poroso y la membrana porosa en contacto flsico sobre una zona de contacto, comprendiendo la membrana porosa por lo menos un elemento de par de union especlfico que se puede unir, ya sea directa o indirectamente, a la sustancia o sustancias de interes, donde uno o varios del elemento o elementos de par de union especlficos es un anticuerpo,
    mantener el material poroso humedecido y la membrana porosa en contacto durante una cantidad de tiempo suficiente para que la membrana porosa se humedezca, por lo menos, en el area que comprende el elemento o elementos de par de union especlficos y para que el llquido presente en el material poroso se difunda hacia arriba en la membrana porosa que comprende el elemento o elementos de par de union especlficos, donde el material poroso esta en contacto flsico con un lado inferior de la membrana porosa, estando situado el elemento o elementos de par de union especlficos sobre el material poroso al que se ha aplicado la muestra llquida, estando la membrana porosa en contacto directo con el material poroso en una posicion en la que esta situado el elemento o elementos de par de union especlficos, aplicandose la muestra llquida a un area del material poroso diferente a la zona de contacto,
    en el que la difusion del llquido a la membrana porosa tiene como resultado que la sustancia o sustancias de interes, si estan presentes, se unen, ya sea directa o indirectamente, al elemento o elementos de par de union especlficos; y
    detectar la presencia o ausencia de un complejo que comprende el elemento o elementos de par de union especlficos y la sustancia o sustancias de interes,
    en el que la presencia de por lo menos un complejo indica la presencia de por lo menos una de las sustancias de interes en la muestra llquida.
  2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas:
    disponer un dispositivo que comprende el material poroso y la membrana porosa.
  3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el material poroso filtra la muestra llquida para eliminar sustancias que tienen un tamano mayor que un valor predeterminado.
  4. 4. El metodo segun la reivindicacion 3, en el que el filtrado se realiza por medio de una infiltracion discontinua de llquido procedente de la muestra llquida a traves del material poroso.
  5. 5. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el llquido comprende dos o mas sustancias de interes.
  6. 6. El metodo segun la reivindicacion 5, en el que cada sustancia de interes es diferente de cada una de las otras sustancias de interes.
  7. 7. El metodo segun la reivindicacion 5, en el que el llquido comprende heces, sangre, un alimento o una muestra ambiental.
  8. 8. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la sustancia o sustancias de interes son toxina A de Clostridium difficile, toxina B de Clostridium difficile o ambas.
  9. 9. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la sustancia o sustancias de interes son una o varias toxinas, bacterias, virus, productos bacterianos, enzimas o parasitos.
  10. 10. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la sustancia o sustancias de interes son glutamato deshidrogenasa.
  11. 11. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la sustancia es un producto animal o humano.
  12. 12. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la sustancia es un anticuerpo o lactoferrina.
  13. 13. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas lavar la membrana antes de la deteccion de la presencia del complejo.
  14. 14. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la muestra llquida se desplaza por el material poroso a la membrana porosa mediante un proceso de infiltracion.
  15. 15. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas aplicar una fuerza flsica a la membrana, al material poroso o ambos.
    5 16. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la deteccion comprende observar una senal emitida desde un
    marcador unido a una sustancia de interes.
  16. 17. El metodo segun la reivindicacion 16, en el que la senal esta producida mediante un producto de precipitacion coloreado que se forma en, o alrededor del elemento de par de union especlfico.
    10
  17. 18. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas combinar un conjugado marcado con la muestra llquida antes de la aplicacion de la muestra llquida al material poroso.
  18. 19. El metodo segun la reivindicacion 18, en el que el conjugado marcado comprende una microesfera de latex u 15 otra partlcula coloreada, una partlcula de oro coloidal o una sustancia reactiva que se une a un sustrato para crear
    una senal detectable.
  19. 20. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el metodo detecta uno o varios acidos nucleicos, o en el que uno o varios acidos nucleicos son elementos de par de union especlficos.
    20
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