KR101962052B1 - 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그 및 동결 보존 방법 - Google Patents

세포 또는 조직의 동결 보존용 지그 및 동결 보존 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 세포 또는 조직을 올려 놓는 재치부의 최표면에, 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 가지는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그, 및 이것을 이용한 동결 보존 방법에 관한 것이다.

Description

세포 또는 조직의 동결 보존용 지그 및 동결 보존 방법{TOOL FOR CRYOPRESERVATION OF CELL OR TISSUE AND CRYOPRESERVATION METHOD}
본 발명은, 세포 또는 조직 등을 동결 보존할 때에 사용하는 동결 보존용 지그, 및 이것을 이용한 동결 보존 방법에 관한 것이다.
세포 또는 조직의 우수한 보존 기술은, 다양한 산업 분야에서 요구되고 있다. 예를 들면, 소의 배이식 기술에 있어서는, 배를 동결 보존하여, 수배우(受胚牛)의 발정 주기에 맞추어 배를 융해하여, 이식하는 것이 행해지고 있다. 또, 인간의 불임 치료에 있어서는, 모체로부터 난자 또는 난소를 채취 후, 이식에 적합한 타이밍에 맞추기 위해 동결 보존해 두고, 이식 시에 융해하여 이용하는 것이 이루어지고 있다.
일반적으로, 생체 내로부터 채취된 세포 또는 조직은, 비록 배양액 중이어도, 점차 활성이 소실되어 가기 때문에, 생체 밖에서의 세포 또는 조직의 장기간의 배양은 바람직하지 않다. 그 때문에, 생체 활성을 소실시키지 않고 장기간 보존하기 위한 기술이 중요하다. 우수한 보존 기술에 의해, 채취된 세포 또는 조직을 보다 정확하게 분석하는 것이 가능해진다. 또 우수한 보존 기술에 의해, 보다 높은 생체 활성을 유지한 채로 세포 또는 조직을 이식에 이용하는 것이 가능해져, 이식 후의 생착율이 향상되는 것을 기대할 수 있다. 또한, 생체 밖에서 배양한 배양 피부, 생체 밖에서 구축한 이른바 세포 시트와 같은 이식을 위한 인공의 조직을, 순차 생산하여 보존해 두고, 필요한 때에 사용하는 것도 가능해져, 의료면 뿐만 아니라, 산업면에 있어서도 큰 메리트를 기대할 수 있다.
세포 또는 조직의 보존 방법으로서, 예를 들면 완만 동결법이 알려져 있다. 이 방법에서는, 우선, 예를 들면 인산 완충 생리 식염수 등의 생리적 용액에 내동제를 함유시킴으로써 얻어진 보존액에, 세포 또는 조직을 침지한다. 상기 내동제로서는, 글리세롤, 에틸렌글리콜 등의 화합물이 이용된다. 상기 보존액에, 세포 또는 조직을 침지 후, 비교적 느린 냉각 속도(예를 들면 0.3~0.5℃／분의 속도)로, -30~-35℃까지 냉각함으로써, 세포 내외 또는 조직 내외의 용액이 충분히 냉각되어, 점성이 높아진다. 이러한 상태에서, 상기 보존액 중의 세포 또는 조직을 더 액체 질소의 온도(-196℃)까지 냉각하면, 세포 내 또는 조직 내와 그 외의 주위의 미소 용액이 모두 비결정인 채로 고체가 되는 유리화가 일어난다. 유리화에 의해, 세포 내외 또는 조직 내외가 고체화되면, 실질적으로 분자의 움직임이 없어지므로, 유리화된 세포 또는 조직을 액체 질소 중에 보존함으로써, 반영구적으로 보존할 수 있다고 생각할 수 있다.
그러나, 상기 완만 동결법에서는, 비교적 느린 냉각 속도로 냉각할 필요가 있기 때문에, 동결 보존을 위한 조작에 시간을 필요로 한다. 또, 온도 제어를 하기 위한 장치 또는 지그를 필요로 하는 문제가 있다. 이에 더하여, 상기 완만 동결법에서는, 세포 외 또는 조직 외의 보존액 중에 빙정이 형성되므로, 세포 또는 조직이 상기 빙정에 의해 물리적으로 손해를 받을 우려가 있다.
상기 완만 동결법에서의 문제점을 해결하기 위한 방법으로서, 유리화 보존법이 제안되어 있다. 유리화 보존법이란, 글리세롤, 에틸렌글리콜, DMSO(디메틸설폭시드) 등의 내동제를 다량으로 포함하는 수용액의 응고점 강하에 의해, 빙점 하이어도 빙정이 생기기 어려워지는 원리를 이용한 것이다. 이 수용액을 급속히 액체 질소 중에서 냉각시키면 빙정을 일으키지 않는 채로 고체화시킬 수 있다. 이와 같이 고체화하는 것을 유리화 동결이라고 한다. 또, 내동제를 다량으로 포함하는 수용액을 유리화액이라고 한다.
상기 유리화법의 구체적인 조작으로서는, 유리화액에 세포 또는 조직을 침지시키고, 그 후, 액체 질소의 온도(-196℃)로 냉각한다. 유리화법은, 이러한 간편하고 신속한 공정이기 때문에, 동결 보존을 위한 조작에 긴 시간을 필요로 하지 않는 것 외에는, 온도 제어를 하기 위한 장치 또는 지그를 필요로 하지 않는다는 이점이 있다.
유리화 보존법을 이용하면, 세포 내외 중 어느 것에도 빙정이 생기지 않기 때문에 동결 시 및 융해 시의 세포로의 물리적 장해(동해)를 회피할 수 있지만, 유리화액에 포함되는 고농도의 내동제에는 화학적 독성이 있다. 이 때문에, 세포 또는 조직의 동결 보존 시에는 세포 또는 조직 주위에 존재하는 유리화액이 적은 것이 바람직하고, 세포가 유리화액에 폭로되는 시간, 요컨데 동결까지의 시간이 단시간인 것이 바람직하다. 또한, 해동 후 즉시 유리화액을 희석할 필요가 있다.
유리화 보존법을 이용한 세포 또는 조직의 동결 보존에 대해서는, 다양한 방법으로, 다양한 종류의 세포 또는 조직을 이용한 예가 나타나 있다. 예를 들면, 특허 문헌 1에서는, 동물 또는 인간의 생식 세포 또는 체세포로의 유리화 보존법의 적용이 동결 보존 및 융해 후의 생존률의 점에서, 극히 유용하다는 것이 나타나 있다.
유리화 보존법은, 주로 인간의 생식 세포를 이용하여 발전해 온 기술이지만, 최근에는, iPS 세포나 ES세포로의 응용도 널리 검토되고 있다. 또, 비특허 문헌 1에서는, 초파리의 배의 보존에 유리화 보존법이 유효했던 것이 나타나 있다. 또한, 특허 문헌 2에서는, 식물 배양 세포나 조직의 보존에 있어서, 유리화 보존법이 유효하다는 것이 나타나 있다. 이와 같이, 유리화법은 널리 다양한 종의 세포 및 조직의 보존에 유용하다는 것이 알려져 있다.
특허 문헌 3, 특허 문헌 4에서는, 인간의 불임 치료 분야에서 사용되고 있는 이른바 크라이오탑법이라는 방법으로, 난(卵)부착 유지용 스트립으로서 긴 직사각형 형상의 가요성 또한 무색 투명한 필름을 사용한 난동결 보존용구를 사용하여, 현미경 관찰 하에서 상기 필름 상에 극소량의 유리화액과 함께 난자 또는 배를 올려 놓고, 동결 보존하는 방법이 제안되어 있다.
특허 문헌 5에서는, 난자 또는 배를 유리화액과 함께 유리화 보존액 제거재 상에 올려 놓고, 하부로부터 흡인함으로써 난자 또는 배의 주위에 부착된 여분의 유리화액을 제거하여, 우수한 생존률로 동결 보존시키는 방법이 제안되어 있다. 또한, 유리화 보존액 제거재로서는, 철망, 종이 등의 천연물이나 합성 수지로 이루어지는 필름 형상물이며 관통 구멍을 가진 것이 기재되어 있다. 또 여분의 유리화액을 제거하고, 또 세포를 올려 놓을 때의 작업성을 향상시키는 것이 가능한 동결 보존용 지그로서, 예를 들면, 특정의 헤이즈값을 가지는 유리화액 흡수체를 가지는 유리화 동결 보존용 지그가 특허 문헌 6에 기재되어 있다.
한편, 특허 문헌 7에는 세포를 배지와 함께 보존할 때에 이용되는 세포 보존 용기에 관한 것이며, 상기 용기의 내면이, 세포가 부착되기 어려운 재료로 형성된 용기, 구체적으로는 용기의 내면에 친수성 재료나 소수성 재료 등이 결합 또는 피복된 용기에 의해, 보존 중에 있어서의 용기 벽면으로의 세포의 접착을 방지할 수 있는 것이 기재되며, 친수성 재료로서 아크릴 아미드계 집합체나 폴리비닐알코올 등이 예시되고, 소수성 재료로서 불소 수지나 실리콘 수지가 예시되어 있다.
일본국 특허 제3044323호 공보 일본국 특허공개 2008-5846호 공보 일본국 특허공개 2002-315573호 공보 일본국 특허공개 2006-271395호 공보 국제 공개 제2011/070973호 일본국 특허공개 2014-183757호 공보 일본국 특허공개 2004-18504호 공보
Steponkus et al., Nature 345：170-172(1990)
특허 문헌 3, 특허 문헌 4에서는, 난자 또는 배를 올려 놓는 필름의 폭을 제한함으로써, 적은 양의 유리화액과 함께 난자 또는 배를 동결 보존하여, 우수한 생존률을 얻는 방법이 제안되어 있다. 그러나, 이 방법에서는, 작업자의 조작에 의해, 극소량의 유리화액과 함께 난자 또는 배를 필름 상에 올려 놓을 때에, 조작의 난도가 높다는 문제가 있었다. 또, 이 방법을 기초로 한 크라이오탑법에서는, 보다 적은 양의 유리화액과 함께 난자 또는 배를 동결 보존하기 위해, 한 번 유리화액과 함께 난자 또는 배를 필름 상에 올려 놓은 후에, 여분의 유리화액을 흡인하여 필름 상으로부터 제거한다는 번잡한 조작이 되는 경우도 있다. 또한, 난자 또는 배를 동결 후에 융해할 때에, 종종 필름 상의 난자 또는 배가 필름 상에 고착되어 버려, 이들을 회수할 때에도 높은 기량이 요구된다는 문제도 있다.
특허 문헌 5에서는, 난자 또는 배의 주위에 부착된 여분의 유리화액을 제거함으로써, 우수한 생존률로 이들 생식 세포를 동결 보존시키는 방법이 제안되어 있다. 그러나, 상기 공보 기재의 방법에서는, 여분의 유리화액을 제거할 때에, 하부로부터의 흡인 조작을 필요로 하기 때문에, 번잡한 조작이 되어, 단시간에 유리화 동결 보존 조작을 행하는 경우에는 적합하지 않다. 또한, 하부로부터의 흡인이 불충분하면 여분의 유리화액이 잔존하는 문제가 있다. 또, 특허 문헌 3, 특허 문헌 4와 마찬가지로, 동결 후에 융해할 때, 난자 또는 배가 필름 상에 고착되어 버려, 회수할 때에도 높은 기량이 요구된다는 문제도 있다. 특허 문헌 6에서는, 난자 또는 배의 주위에 부착된 여분의 유리화액을 작업자가 제거할 필요는 없어, 양호한 작업성을 얻을 수 있지만, 유리화액 흡수체가 유리화액을 흡수할 때에, 난자 또는 배는, 유리화액 흡수체에 특히 강고하게 고착되기 때문에, 난자 또는 배를 회수할 때에 특히 높은 기량이 요구된다는 문제가 있었다.
본 발명은, 세포 또는 조직의 동결 보존 작업을 용이하게 또한 확실히 행하는 것이 가능한, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그를 제공하는 것을 주된 과제로 한다. 보다 구체적으로는, 세포 또는 조직을 유리화액 등의 보존액에 침지하고, 세포 또는 조직을 보존액과 함께 상기 동결 보존용 지그에 올려 놓고 동결 보존한 후, 상기 세포 또는 조직을 융해할 때에, 세포 또는 조직을 용이하게 박리, 회수할 수 있는 동결 보존용 지그를 제공하는 것을 제1의 과제로 한다. 또, 상기한 세포 또는 조직을 용이하게 회수할 수 있는 것에 더하여, 유리화액 등의 보존액의 우수한 흡수성을 가지는 동결 보존용 지그를 제공하는 것을 제2의 과제로 한다. 또한, 동결 보존 후의 세포 또는 조직을 용이하게 박리, 회수할 수 있는 동결 보존 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 이하의 구성을 가지는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그(본 명세서 중, 「세포 또는 조직의 동결 보존용 지그」를, 간단히 「동결 보존용 지그」라고도 한다)에 의해, 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 찾아냈다.
(1) 세포 또는 조직을 올려 놓는 재치부(載置部)의 최표면에, 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 가지는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
(2) 상기 수용성 고분자 화합물이, 에탄디올기를 가지는 폴리비닐알코올 및 에틸렌옥사이드기를 가지는 폴리비닐알코올로부터 선택되는 적어도 1종류인 것을 특징으로 하는, 상기 (1)에 기재된 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
(3) 상기 수용성 고분자 화합물이, 비누화도가 94mol% 이하인 폴리비닐알코올인 것을 특징으로 하는, 상기 (1)에 기재된 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
(4) 상기 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층이 무기 미립자를 더 함유하는 것을 특징으로 하는, 상기 (1)~(3) 중 어느 한 항에 기재된 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
(5) 상기 재치부가 보존액 흡수체를 가지며, 상기 보존액 흡수체 상에 상기 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 가지는 것을 특징으로 하는, 상기 (1)~(4) 중 어느 한 항에 기재된 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
(6) 상기 (1)~(5) 중 어느 한 항에 기재된 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 재치부 상에, 보존액에 침지한 세포 또는 조직을 보존액과 함께 올려 놓고, 세포 또는 조직을 재치부에 유지한 상태로 동결 보존용 지그를 액체 질소 중에 침지함으로써 세포 또는 조직을 동결하는 것을 특징으로 하는, 세포 또는 조직의 동결 보존 방법.
(7) 상기 보존액이, 보존액의 전체 질량에 대해 10질량% 이상의 내동제를 포함하는 유리화액인 것을 특징으로 하는, 상기 (6)에 기재된 세포 또는 조직의 동결 보존 방법.
상기 (1)의 발명에 의하면, 세포 또는 조직의 동결 보존 작업에 있어서, 동결한 세포 또는 조직을 융해할 때에, 세포 또는 조직을 용이하게 회수할 수 있는 동결 보존용 지그를 제공할 수 있다. 상기 (2)~(4)의 발명에 의하면, 동결한 세포 또는 조직을 융해할 때에, 세포 또는 조직을 특히 용이하게 회수할 수 있는 동결 보존용 지그를 제공할 수 있다. 상기 (5)의 발명에 의하면, 상기한 효과에 더하여, 세포 또는 조직을 동결 보존용 지그의 재치부에 올려 놓을 때, 세포 또는 조직의 외주에 부착된 여분의 보존액을 보존액 흡수체가 흡수하기 때문에, 여분의 보존액을 제거하기 위한 그 외의 조작(예를 들면, 보존액 흡수체 하부로부터의 흡인 제거 조작이나, 마이크로 피펫 등을 이용한 세포 또는 조직 주위로부터의 직접적인 흡인 제거 조작)을 특별히 필요로 하지 않아, 세포 또는 조직의 동결 보존 작업을 용이하고 또한 간편하게 행하는 것이 가능한, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그를 제공할 수 있다. 상기 (6) 및 (7)의 발명에 의하면, 동결 보존 후의 세포 또는 조직을 용이하게 박리, 회수할 수 있는 동결 보존 방법을 제공할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 일례를 나타내는 전체도이다.
도 2는, 도 1 중의 재치부의 일례의 단면 구조 개략도이다.
도 3은, 도 1에 나타낸 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 경우의 일례를 나타내는 단면 구조 개략도이다.
도 4는, 도 1에 나타낸 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 경우의 다른 일례를 나타내는 단면 구조 개략도이다.
도 5는, 도 1에 나타낸 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 경우의 다른 일례를 나타내는 단면 구조 개략도이다.
도 6은, 재치부의 표면층이 무기 미립자를 함유하는 경우의 단면 구조 개략도의 일례이다.
도 7은, 재치부의 표면층이 무기 미립자를 함유하는 경우의 단면 구조 개략도의 다른 일례이다.
도 8은, 재치부가 보존액 흡수체를 가지며, 표면층이 무기 미립자를 함유하는 경우의 일례를 나타내는 단면 구조 개략도이다.
도 9는, 재치부가 보존액 흡수체를 가지며, 표면층이 무기 미립자를 함유하는 경우의 다른 일례를 나타내는 단면 구조 개략도이다.
도 10은 실시예 24의 동결 보존용 지그의 재치부 표면의 주사형 전자 현미경 관찰 화상이다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직을 동결 보존할 때에 이용되는 것이다. 본 명세서 중에서 세포란, 단일의 세포 뿐만 아니라, 복수의 세포로 이루어지는 생물의 세포 집단을 포함하는 것이다. 복수의 세포로 이루어지는 세포 집단이란 단일의 종류의 세포로 구성되는 세포 집단이어도 되고, 복수의 종류의 세포로 구성되는 세포 집단이어도 된다. 또, 조직이란, 단일의 종류의 세포로 구성되는 조직이어도 되고, 복수의 종류의 세포로 구성되는 조직이어도 되고, 세포 이외에 세포 외 매트릭스와 같은 비세포성의 물질을 포함하는 것이어도 된다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 동결 보존 조작에 이용하는 것이며, 바람직하게는 유리화 동결 보존 조작에 이용하는 것이다. 이 때문에 본 발명의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그로서 적합하게 사용된다. 상세하게는, 본 발명의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직이 올려 놓아진 동결 보존용 지그를 액체 질소 등의 냉각 용매에 침지하여 동결시키기 위한 것이다. 또 동결 보존용 지그 상에 올려 놓아진 세포 또는 조직을 융해할 때에는, 세포 또는 조직을 동결 보존용 지그와 함께 냉각 매체로부터 취출하여, 융해액 중에 침지시켜 융해한다. 본 발명의 동결 보존용 지그를 이용하여 동결 보존 조작을 행하는 경우, 세포 또는 조직은, 통상, 보존액과 함께 재치부의 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층 상에 올려 놓아진다. 본 발명의 동결 보존용 지그를 이용하면, 세포 또는 조직을 올려 놓았을 때에 이것을 확실히 유지할 수 있으며, 또 융해 시에는 용이하게 세포 또는 조직을 회수할 수 있기 때문에, 세포 또는 조직의 동결 보존에 걸리는 작업을 용이하게 또한 확실히 행할 수 있다. 본 발명의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직의 동결 보존용구, 세포 또는 조직의 보존용구, 세포 또는 조직의 동결 보존 기구, 세포 또는 조직의 보존용 기구로 바꿔 말할 수 있다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직을 올려 놓는 재치부의 최표면에, 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층(이하, 본 발명에 있어서의 표면층 혹은 간단히 표면층이라고도 기재)를 가진다. 이와 같은 표면층은 융해액에 대해 가용성인 것이 바람직하다. 여기서 가용성이란 25℃의 융해액에 대한 표면층의 용해도가 0.2질량% 이상인 것을 의미한다. 본 발명의 동결 보존용 지그는 상술한 대로, 동결 조작 시에, 세포 또는 조직을 보존액과 함께 동결 보존용 지그의 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층 상에 올려 놓은 후에, 냉매(예를 들면 액체 질소)에 침지, 동결하고, 융해 시에는, 동결한 세포 또는 조직을 동결 보존용 지그와 함께 취출하여, 융해액 중에 침지하여 융해하는 것이지만, 세포 또는 조직을 융해할 때에, 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층의 전체 또는 일부가 융해액 중에 용해됨으로써, 세포 또는 조직이 동결 보존용 지그의 재치부에 고착되지 않아, 용이하게 박리·회수하는 것이 가능해진다.
본 발명에 있어서는, 상기 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 것이 바람직하고, 상기 보존액 흡수체 상에 상기 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층(표면층)을 가지는 것이 바람직하다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 재치부가 보존액 흡수체를 가지며, 또한 상기 재치부의 최표면에 본 발명에 있어서의 표면층을 가지는 경우에는, 상기 효과에 더하여, 상기 보존액 흡수체가 여분의 보존액을 흡수하므로, 여분의 보존액을 제거하기 위한 그 외의 조작을 특별히 필요로 하지 않아, 작업성이 현격히 향상된다. 또, 그와 같이 조작된 세포 또는 조직은 극소량의 보존액에 덮여 있어, 동결 작업하는 경우여도 신속하게 동결 상태로 할 수 있다. 또한, 상기한 유리화 동결법에 있어서는, 보존액이 다량의 내동제를 함유하는 것에 의한 화학적 독성이 문제가 되지만, 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 동결 보존용 지그에 의하면, 올려 놓아진 세포 또는 조직 주변의 유리화액이 극소량이 됨으로써, 세포 또는 조직의 생존률의 향상을 기대할 수 있다. 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 경우, 보존액 흡수체와 표면층 사이에, 다른 층을 갖지 않는 것이 바람직하다.
이하에, 본 발명의 동결 보존용 지그의 구성을 설명한다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직을 올려 놓는 재치부의 최표면에, 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 가진다. 여기서 세포 또는 조직을 올려 놓는 재치부의 최표면이란, 세포 또는 조직이 보존액과 함께 올려 놓아지는 표면 부분에 상당한다. 본 발명에 있어서 재치부는, 본 발명에 있어서의 표면층을, 각종 수지 필름, 금속, 유리, 고무 등의 비흡수성 지지체 상이나, 보존액 흡수체 상에 가지는 것이 바람직하고, 특히 보존액 흡수체 상에 본 발명에 있어서의 표면층을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서 상기 표면층은, 세포 또는 조직을 올려 놓는 재치부 전체에 있어서 균일한 층을 형성하고 있지 않아도 되고, 예를 들면 해도 형상이나 스트라이프 형상의 층이어도 된다. 즉, 본 발명에 있어서의 표면층은, 세포 또는 조직을 보존액과 함께 올려 놓는 개소의 최표면에 존재하는 것이 중요하고, 세포 또는 조직이 올려 놓아지지 않는 개소에 있어서는, 상기 표면층이 존재하고 있어도 되고, 존재하고 있지 않아도 된다. 이와 같이 재치부는, 표면층을 그 최표면 전체에 가져도 되고, 최표면의 일부에 가져도 된다.
본 발명에 있어서 표면층이 함유하는 수용성 고분자 화합물로서는, 예를 들면, 히드록시에틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체, 전분 및 그 유도체, 젤라틴, 카제인, 알긴산 및 그 염, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 스티렌·말레산 공중합체염, 스티렌·아크릴산 공중합체염 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 알긴산 및 그 염이나 젤라틴은 보존액에 대한 용해성과 적당한 피막 형성 작용이 얻어지기 때문에 바람직하고, 폴리비닐알코올은, 비생물 유래 소재이며, 또한 세포 또는 조직에 대해서도 저독성이기 때문에, 특히 바람직하다. 이러한 수용성 고분자 화합물은, 단독으로 이용해도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다. 또 표면층은, 융해액에 대한 용해도가 10질량%를 밑돌지 않는 범위에서, 가교제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 수용성 고분자 화합물의 수용성이란, 25℃에 있어서의 물에 대한 용해량이 적어도 0.5질량% 이상인 것을 의미하며, 보다 바람직하게는 5질량% 이상이다.
표면층이 함유하는 수용성 고분자 화합물의 고형분량은, 0.01~100g/m2인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.1~10g/m2이다. 수용성 고분자 화합물의 고형분량이 100g/m2를 넘는 경우에는, 융해액 중으로의 수용성 고분자 화합물의 용출·혼입이 많아져, 바람직하지 않다. 한편, 수용성 고분자 화합물의 고형분량이 0.01g/m2를 밑도는 경우에는, 융해할 때에, 세포 또는 조직을 용이하게 박리할 수 없는 경우가 있다.
본 발명에 있어서 표면층은, 수용성 고분자 화합물로서 에탄디올기를 가지는 폴리비닐알코올 및 에틸렌옥사이드기를 가지는 폴리비닐알코올로부터 선택되는 적어도 1종류를 함유하는 것이 바람직하다. 에탄디올기를 가지는 폴리비닐알코올 및 에틸렌옥사이드기를 가지는 폴리비닐알코올은, 그 피막의 우수한 친수성, 적당한 강도, 적당한 용해성이 효과를 발휘하여, 융해 작업 시에, 세포 또는 조직이 재치부에 고착되지 않아, 특히 용이하게 박리·회수되는 것이 가능해진다. 에탄디올기를 가지는 폴리비닐알코올 및 에틸렌옥사이드기를 가지는 폴리비닐알코올은, 다양한 비누화도의 상기 폴리비닐알코올을 이용할 수 있지만, 세포 또는 조직의 양호한 박리성을 얻을 수 있는 관점에서, 이들 폴리비닐알코올의 비누화도는 94mol% 이하인 것이 바람직하다. 또, 이러한 상기 폴리비닐알코올은, 단독으로 이용해도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다. 에탄디올기를 가지는 폴리비닐알코올 및 에틸렌옥사이드기를 가지는 폴리비닐알코올은, 예를 들면 일본 합성 화학 공업(주)로부터 시판되는 것을 입수하여, 사용할 수 있다.
표면층이, 에탄디올기를 가지는 폴리비닐알코올 및 에틸렌옥사이드기를 가지는 폴리비닐알코올로부터 선택되는 적어도 1종류의 폴리비닐알코올을 함유하는 경우, 이와 같은 표면층은, 그 외의 수용성 고분자 화합물을 1 또는 2종류 이상 함유할 수 있다. 상기 수용성 고분자 화합물로서는, 예를 들면, 히드록시에틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체, 전분 및 그 유도체, 젤라틴, 카제인, 알긴산 및 그 염, 에탄디올기 및 에틸렌옥사이드기를 갖지 않는 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 스티렌·말레산 공중합체염, 스티렌·아크릴산 공중합체염 등을 들 수 있다. 그 외의 수용성 고분자 화합물의 함유량은, 에탄디올기를 가지는 폴리비닐알코올 및 에틸렌옥사이드기를 가지는 폴리비닐알코올로부터 선택되는 적어도 1종류의 폴리비닐알코올의 고형분량에 대해, 50질량% 이하인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 표면층은, 수용성 고분자 화합물로서 비누화도가 94mol% 이하인 폴리비닐알코올을 함유하는 것이 바람직하다. 비누화도가 94mol% 이하인 폴리비닐알코올의 피막을 표면층으로서 이용함으로써, 우수한 세포 또는 조직의 박리성을 얻을 수 있기 때문에, 융해 작업 시에, 세포 또는 조직이 재치부에 고착되지 않아, 용이하게 회수하는 것이 가능해진다. 또한, 비누화도가 81mol% 이하인 폴리비닐알코올을 선택함으로써, 혹은 비누화도가 94mol% 이하이며 또한, 중합도가 400 이하인 폴리비닐알코올을 선택함으로써, 세포 또는 조직의 박리성에 특히 우수한 동결 보존용 지그를 얻을 수 있다. 이러한 상기 폴리비닐알코올은, 단독으로 이용해도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다.
표면층이, 비누화도가 94mol% 이하인 폴리비닐알코올 함유하는 경우, 이와 같은 표면층은, 그 외의 수용성 고분자 화합물을 1 또는 2종류 이상 함유할 수 있다. 상기 수용성 고분자 화합물로서는, 예를 들면, 히드록시에틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체, 전분 및 그 유도체, 젤라틴, 카제인, 알긴산 및 그 염, 비누화도가 94mol%를 넘는 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 스티렌·말레산 공중합체염, 스티렌·아크릴산 공중합체염 등을 들 수 있다. 그 외의 수용성 고분자 화합물의 함유량은, 비누화도가 94mol% 이하인 폴리비닐알코올의 고형분량에 대해, 50질량% 이하인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 표면층은, 상기한 수용성 고분자 화합물에 더하여, 무기 미립자를 더 함유하는 것이 바람직하다. 무기 미립자는 표면층의 친수성을 저하시키지 않고, 또 표면층에 미세한 요철을 형성하여 재치부와 세포 또는 조직의 접촉 면적을 저하시키는 것이 가능해지기 때문에, 세포 또는 조직이 동결 보존용 지그의 재치부에 고착되지 않아, 보다 용이하게 박리·회수하는 것이 가능해진다.
이와 같은 무기 미립자로서는, 예를 들면 경질 탄산칼슘, 중질 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 카올린, 이산화 티탄, 산화 아연, 수산화 아연, 규산 칼슘, 규산 마그네슘, 비정질 합성 실리카, 알루미나, 알루미나 수화물, 수산화 마그네슘 등을 들 수 있다. 이와 같은 무기 미립자의 평균 입자 직경(1차 입자가 응집하여 2차 응집체를 형성하고 있는 무기 미립자에서는 평균 2차 입자 직경, 2차 입자를 형성하지 않는 무기 미립자에 있어서는 평균 1차 입자 직경)은 1μm 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 600nm 이하이다. 무기 미립자의 평균 입자 직경의 하한은 특별히 한정되지 않지만, 6nm 이상인 것이 바람직하다. 평균 입자 직경은, 예를 들면, 1차 입자가 응집하여 2차 응집체를 형성하고 있는 무기 미립자이면, 레이저 산란식의 입도 분포계(예를 들면, 호리바 제작소사제, LA910)를 이용하여 개수 메디안 직경으로서 구할 수 있다. 또 2차 입자를 형성하지 않는 무기 미립자이면, 1차 입자 직경을 판별할 수 있을 때까지 분산된 입자의 전자 현미경 사진으로부터 일정 면적 내에 존재하는 100개의 입자의 평균 입자 직경으로서 구할 수 있다. 그 중에서도 1차 입자끼리는 응집하지 않고, 2차 입자를 형성하지 않는 무기 미립자(이하, 단일 입자 분산성의 무기 미립자라고 한다.)는, 재치부에 있어서의 세포 또는 조직과의 접촉 면적이 비교적 작아지기 때문에 바람직하다. 이러한 관점에서, 콜로이달 실리카가 적합하다. 콜로이달 실리카는, 예를 들면 닛산 화학공업(주)에서 스노우텍스(등록상표)로서 시판되고 있다. 또, GE 헬스케어·재팬(주)로부터 시판되고 있는 퍼콜(상품명)과 같은, 폴리비닐피롤리돈을 입자 표면에 피복한 콜로이달 실리카도 바람직하게 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 재치부가 후술하는 보존액 흡수체를 가지는 경우에는, 상기 보존액 흡수체가 가지는 미세구멍을 무기 미립자가 폐색하지 않아, 재치부의 최표면에 수용성 고분자 화합물 및 무기 미립자를 함유하는 층을 설치하는 것이 바람직하다. 이 때문에 무기 미립자의 입자 직경은 보존액 흡수체가 가지는 미세구멍 직경보다 크게 할 수도 있고, 또 보존액 흡수체의 흡수성이 현저하게 감소하지 않는 범위이면, 보존액 흡수체의 미세구멍 내부에, 무기 미립자가 존재하는 것도 가능하다.
본 발명의 동결 보존용 지그가 가지는 무기 미립자의 고형분량으로서는, 0.01~100g/m2인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.1~10g/m2이다. 무기 미립자의 고형분량이 100g/m2를 넘는 경우에는, 융해액 중으로의 무기 미립자의 용출·혼입이 많아져, 바람직하지 않다. 한편, 무기 미립자의 고형분량이 0.01g/m2를 밑도는 경우에는, 융해할 때에, 세포 또는 조직을 용이하게 박리할 수 없는 경우가 있다.
본 발명에 있어서 표면층이 상기한 수용성 고분자 화합물에 더하여 무기 미립자를 더 함유하는 경우, 수용성 고분자 화합물에 대한 무기 미립자의 함유 비율(무기 미립자의 합계 질량/수용성 고분자 화합물의 합계 질량)은 1~100인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 1.67~50이다. 수용성 고분자 화합물에 대한 무기 미립자의 함유 비율을 이러한 범위로 함으로써, 재치부의 표면(상기 표면층)은 적당한 요철을 유지할 수 있어, 융해 작업 시에 용이하게 세포 또는 조직을 회수할 수 있다. 또, 예를 들면, 동결 보존용 지그 사용 전의 무기 미립자의 탈락(가루 떨어짐)이나, 동결 작업 시에 유리화액을 적하했을 때의 무기 미립자의 의도하지 않는 탈락을 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서 재치부는, 세포 또는 조직을 동결 보존할 때에, 이들을 지지하는 목적으로 지지체를 가지며, 상기 지지체 상에 표면층을 가지는 것이 바람직하다. 이와 같은 지지체(비흡수성 지지체)로서는, 예를 들면, 각종 수지 필름, 금속, 유리, 고무 등을 들 수 있다. 이러한 지지체는 1종류의 소재로 이루어지는 것이어도 되고, 2종류 이상의 소재로 이루어지는 것이어도 된다. 그 중에서도 수지 필름은, 취급의 관점에서 적합하게 이용된다. 수지 필름의 구체예로서는, 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET)나 폴리에틸렌나프탈레이트(PEN) 등의 폴리에스테르 수지, 아크릴 수지, 에폭시 수지, 실리콘 수지, 폴리카보네이트 수지, 디아세테이트 수지, 트리아세테이트 수지, 폴리아크릴레이트 수지, 폴리염화비닐수지, 폴리설폰 수지, 폴리에테르설폰 수지, 폴리이미드 수지, 폴리아미드 수지, 폴리올레핀 수지, 환상 폴리올레핀 수지 등으로 이루어지는 수지 필름을 들 수 있다. 또 지지체의 전체 광선 투과율이 80% 이상이면, 재치부에 올려 놓은 세포 또는 조직을 투과형 현미경을 이용하여 용이하게 확인할 수 있기 때문에 바람직하다. 또한, 온도 전도성이 우수하여, 급속한 동결을 가능하게 한다는 관점에서 금속제 지지체도 적합하게 이용할 수 있다. 금속제 지지체의 구체예로서는, 구리, 구리 합금, 알루미늄, 알루미늄 합금, 금, 금 합금, 은, 은 합금, 철, 스테인리스 등을 들 수 있다. 상기한 지지체의 두께는 10μm~10mm인 것이 바람직하다. 또, 목적에 따라, 지지체의 표면을 코로나 방전 처리와 같은 전기적인 방법이나, 화학적인 방법에 의해 용이 접착 처리할 수도 있으며, 또한 조면화할 수도 있다. 또한, 지지체와 표면층의 사이에 다른 층을 하나 또는 복수 가지고 있어도 되고, 지지체의 표측에 표면층을 가지며, 이측에, 다른 층을 하나 또는 복수 가지고 있어도 된다. 또, 표면층을 지지체의 표리에 설치할 수도 있다. 지지체는 후술하는 보존액 흡수체여도 된다.
다음에, 본 발명의 동결 보존용 지그가 보존액 흡수체 상에 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 가지는 경우에 대해서 설명한다.
상술한 대로, 본 발명의 세포 또는 조직의 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 경우, 세포 또는 조직에 부착된 보존액의 양이 많아도 보존액 흡수체가 보존액을 제거할 수 있기 때문에, 보존액의 제거 조작이 불필요해져 작업성이 현격히 향상된다. 또 그와 같이 조작된 세포 또는 조직은 극소량의 보존액에 덮여 있어, 동결 조작하는 경우여도 신속하게 동결 상태로 할 수 있다. 또한, 상기한 유리화 동결법에 있어서는 글리세롤, 에틸렌글리콜, DMSO(디메틸설폭시드) 등의 내동제를 다량으로 포함하는 수용액이 보존액으로서 이용되고, 이 보존액에는 다량의 내동제에 의한 화학적 독성이 존재하지만, 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 동결 보존용 지그에 의하면, 올려 놓아진 세포 또는 조직 주변의 유리화액이 극소량이 됨으로써, 세포 또는 조직의 생존률의 향상을 기대할 수 있다. 따라서 재치부가 보존액 흡수체 상에 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 가지는 동결 보존용 지그는, 유리화 동결 보존용 지그로서 적합하다.
본 발명에 있어서, 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 경우에는, 상기 보존액 흡수체가 가지는 미세구멍을 폐색하지 않아, 재치부의 최표면에 표면층을 설치하는 것이 바람직하다. 또, 보존액 흡수체의 흡수성이 현저하게 저하되지 않는 범위이면, 보존액 흡수체의 미세구멍 내부에, 표면층이 존재하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 경우에는, 표면층의 고형분량이 많아질수록, 보존액 흡수체가 가지는 미세구멍이 좁아지기 때문에, 보존액의 흡수성은 저하되는 경향이 있다. 한편, 융해 작업 시의 세포 또는 조직의 박리성은, 표면층의 고형분량이 많아질수록 우위이다. 이용하는 보존액 흡수체의 두께, 미세구멍 직경, 공극율에 의존하지만, 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 경우에 있어서의 표면층의 고형분량은, 상기 성능의 밸런스를 생각해, 적당히 조정할 수 있으며, 바람직하게는 0.1~5g/m2이다.
본 발명의 동결 보존용 지그가 가지는 보존액 흡수체로서는, 섬유로 이루어지는 시트, 다공성 수지 시트, 다공성 금속 시트, 및 다공성 금속 산화물 시트 등의 각종 시트를 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 「다공성」이란, 상기한 시트가 표면에 기공(미세구멍)을 가지는 구조체인 것을 의미하며, 시트 표면 및 내부에 연속적인 기공을 가지는 구조체인 것이 보다 바람직하다. 또 보존액 흡수체(상기한 각종 시트)의 두께는 10μm~5mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20μm~2.5mm이다. 보존액 흡수체가, 얇은 시트인 경우에는, 보강 부재로서 상기한 비흡수성 지지체를 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 보존액 흡수체로서 이용하는 섬유로 이루어지는 시트로서는, 종이 또는 부직포가 예시되며, 종이는 바인더 등의 결착제 성분이 종이 전체에서 차지하는 비율이 10질량% 이하인 종이가 바람직하고, 보다 바람직하게는 5질량% 이하이며, 또한 3질량% 이하인 종이가 바람직하다. 이것에 의해 우수한 보존액의 흡수성을 얻을 수 있다. 또, 상기 종이에 포함되는 제지용 약품이 종이 전체에서 차지하는 비율은 1질량% 이하인 것이 바람직하다. 통상 종이에 포함되어 있는 제지용 약품 중, 예를 들면 형광 증백제나 염료, 카티온계의 사이즈제 등에는 세포에 대한 영향이 염려되는 경우가 있다.
섬유로 이루어지는 시트가 종이인 경우, 밀도가 0.1~0.6g/cm3이며, 평량이 10~130g/m2의 종이인 것이 바람직하다. 특히 밀도가 0.12~0.3g/cm3이며, 평량이 10~100g/m2인 종이는, 보존액의 흡수성이 우수하며, 또, 투과형 현미경을 이용하여 재치부 상에 올려 놓은 세포 또는 조직을 관찰할 수 있는, 세포 또는 조직의 시인성이 우수한 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지기 때문에 바람직하다.
섬유로 이루어지는 시트가 부직포인 경우, 상기 부직포가 함유하는 섬유로서는, 셀룰로오스 섬유, 셀룰로오스 섬유로 이루어지는 재생 섬유인 레이온 섬유나 큐프라 섬유, 또한 셀룰로오스 섬유로부터의 반합성 섬유인 아세테이트 섬유, 폴리에스테르 섬유, 나일론 섬유, 아크릴 섬유, 폴리프로필렌 섬유, 폴리에틸렌 섬유, 폴리염화비닐 섬유, 비닐리덴 섬유, 폴리우레탄 섬유, 비닐론 섬유, 유리 섬유, 견섬유 등을 들 수 있으며, 이들 섬유를 각종 혼합한 부직포도 이용할 수 있다. 그 중에서도 셀룰로오스 섬유, 셀룰로오스 섬유 유래의 섬유로 셀룰로오스 재생 섬유인 레이온 섬유나 큐프라 섬유, 또한 셀룰로오스 섬유로부터의 반합성 섬유인 아세테이트 섬유가 바람직하다.
섬유로 이루어지는 시트가 부직포인 경우, 밀도가 0.1~0.4g/cm3이며, 평량이 10~130g/m2의 부직포인 것이 바람직하다. 특히 밀도가 0.12~0.3g/cm3이며, 평량이 10~100g/m2인 부직포는, 보존액의 흡수성이 우수하며, 또 세포 또는 조직의 시인성이 우수한 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지기 때문에 바람직하다.
보존액 흡수체로서 이용되는 부직포에 있어서도 상기한 종이와 마찬가지로, 바인더 등의 결착제 성분이 부직포에서 차지하는 비율이 10질량% 이하인 부직포가 바람직하고, 보다 바람직하게는 5질량% 이하이며, 3질량% 이하인 부직포가 더 바람직하다. 특히 결착제를 함유하지 않는 부직포가 바람직하다.
부직포는 종이와 달리 다양한 제조 방법이 있지만, 상기한 결착제 성분이 저감된 부직포로서는, 스판본드법, 멜트블로우법으로 제조된 부직포, 또한 습식법 또는 건식법으로 섬유를 늘어놓은 후, 수류교락법 또는 니들펀치법으로 제조된 부직포가 적합하게 사용될 수 있다. 또 상기한 대로, 본 발명에 있어서 부직포가 함유하는 바람직한 섬유로서는, 셀룰로오스 섬유, 셀룰로오스 섬유 유래의 섬유로 셀룰로오스 재생 섬유인 레이온 섬유나 큐프라 섬유, 또한 셀룰로오스 섬유로부터의 반합성 섬유인 아세테이트 섬유를 들 수 있지만, 이들 섬유를 이용하여 제조하는 경우는, 습식법, 건식법에 상관없이 수류교락법 또는 니들펀치법으로의 제조 방법이 적합하다.
본 발명에 있어서, 보존액 흡수체로서 이용하는 다공성 수지 시트로서는, 예를 들면 특허 공고 소42-13560호 공보나, 일본국 특허공개 평08-283447호 공보에 기재되는, 적어도 1축 방향으로 연신하여, 수지의 융점 이상으로 가열하여 소결함으로써 얻은 미세 섬유 형상 구조에 의해 다공질 구조를 형성한 수지 시트, 일본국 특허공개 2009-235417호 공보에 기재되는, 유화 중합 또는 분쇄 등의 방법에 의해 얻어진 열가소성 수지의 고체 분말을 금형에 충전하고, 가열, 소결하여 분말 입자 표면을 융착시켜 냉각함으로써, 다공질 구조를 형성한 수지 시트 등을 들 수 있다. 다공성 수지 시트를 보존액 흡수체로서 이용한 경우, 보존액의 흡수성이 우수하며, 또 세포 또는 조직의 시인성이 우수한 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지기 때문에, 바람직하다.
상기한 다공성 수지 시트를 형성하는 수지로서는, 저밀도 폴리에틸렌, 고밀도 폴리에틸렌, 초고분자 폴리에틸렌 등의 각종 폴리에틸렌이나 폴리프로필렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리테트라플루오로에틸렌이나 폴리비닐리덴디플로라이드 등의 불소 수지, 에틸렌-아세트산 비닐 공중합체, 폴리아미드, 스티렌-아크릴로니트릴 공중합체, 스티렌-부타디엔-아크릴로니트릴 삼원 공중합체, 폴리카보네이트, 폴리염화비닐 등을 들 수 있다. 그 중에서도 폴리테트라플루오로에틸렌이나 폴리비닐리덴디플로라이드 등의 불소 수지는, 세포 또는 조직을 유리화액 등의 보존액과 함께 재치부에 올려 놓은 경우, 상기 다공성 수지 시트의 투명성이 높아져, 투과 현미경 관찰 하에서의 세포 또는 조직의 시인성이 비약적으로 높아져, 세포 또는 조직의 시인성에 특히 우수한 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지기 때문에 적합하다. 또 다공성 수지 시트로서는, 이화학 실험 용도나 연구 용도로서 시판되고 있는, 여과용의 멘브렌 필터도 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 보존액 흡수체로서 이용하는 다공성 금속 시트로서는, 구리, 구리 합금, 알루미늄, 알루미늄 합금, 금, 금 합금, 은, 은 합금, 주석, 아연, 납, 티탄, 니켈, 스테인리스 등의 금속으로 이루어지는 다공성 금속 시트를 들 수 있다. 또 다공성 금속 산화물 시트로서는, 실리카, 알루미나, 지르코늄, 석영 유리 등의 금속 산화물로 이루어지는 다공성 금속 산화물 시트를 바람직하게 이용할 수 있다. 또 다공성 금속 시트 및 다공성 금속 산화물 시트는, 상기한 금속 및 금속 산화물을 각각 2종류 이상 함유하는 다공성 시트여도 된다. 그 중에서도 다공성 금속 산화물 시트는, 세포 또는 조직의 시인성이 우수한 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지기 때문에, 바람직하다.
본 발명에 있어서, 보존액 흡수체로서 이용하는 다공성 금속 시트, 및 다공성 금속 산화물 시트의 제조 방법으로서는, 일반적으로 알려진 방법을 사용할 수 있다. 유리화액 흡수체가 다공성 금속 시트인 경우에는, 분말 야금법, 스페이서법 등의 방법을 사용할 수 있다. 또, 수지 사출 성형과 분말 야금법을 조합한 소위 파우더 스페이스 홀더법도 바람직하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 국제 공개 제2006/041118호나 일본국 특허 제4578062호 공보에 기재된 방법 등을 이용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 금속 분말과 스페이서가 되는 수지를 혼합한 후, 압력을 가하여 성형한 후, 고온 환경 하에서 소성함으로써, 금속 분말을 구워 굳히고, 스페이서가 되는 수지를 기화시켜, 다공성 금속 시트를 얻을 수 있다. 파우더 스페이스 홀더법 등을 이용하는 경우에는, 금속 분말과 스페이서가 되는 수지에 더하여, 수지의 바인더를 혼합할 수 있다. 또, 금속 분말을 고온으로 가열한 후에, 가스를 주입하여 공극을 제작하는 발포 용융법, 가스 팽창법 등의 금속 다공질체의 제조 방법도 사용할 수 있다. 또한, 발포제를 이용하여 금속 다공질체를 제조하는 슬러리 발포법과 같은 제조 방법도 사용할 수 있다. 보존액 흡수체가 다공성 금속 산화물 시트인 경우에는, 예를 들면, 일본국 특허공개 2009-29692호 공보나 일본국 특허공개 2002-160930호 공보에 기재된 방법 등을 이용할 수 있다.
상기한 다공성 수지 시트, 다공성 금속 시트, 및 다공성 금속 산화물 시트 등의 다공질체의 표면은, 표면층과의 친화성을 높이기 위해, 친수화 처리할 수도 있다. 친수화 처리의 방법으로서는, 그라프트 개질법, 비용출성의 친수성 물질을 도포하는 것에 의한 코팅법, 코로나 방전, 플라즈마 처리, 엑시머 레이저 등의 각종 에너지를 이용한 일반적인 표면 개질 방법을 사용할 수 있다.
보존액 흡수체가, 상기한 다공성 수지 시트, 다공성 금속 시트, 및 다공성 금속 산화물 시트 등의 다공질체인 경우에는, 상기 다공질체의 미세구멍 직경은, 0.02~130μm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.05~60μm이다. 미세구멍 직경이 0.02μm 미만인 범위에서는, 보존액의 적하 시에 보존액의 흡수 성능이 충분하지 않은 경우가 있다. 또, 다공성 시트의 제조가 어렵다는 문제가 있다. 한편, 미세구멍 직경이 130μm를 넘는 범위에서는, 보존액의 흡수 성능이 충분하지 않은 경우가 있다. 또한, 다공질체의 미세구멍 직경은, 다공성 수지 시트의 경우에는, 버블 포인트 시험에 의해 측정되는 가장 큰 미세구멍의 직경이다. 또 다공성 금속 시트 및 다공성 금속 산화물 시트의 경우에는, 상기 다공질체의 표면 및 단면의 화상 관찰로부터 측정한 평균 미세구멍 직경이다.
보존액 흡수체의 공극율은 20용량% 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 30용량% 이상이다. 또 보존액 흡수체가, 상기한 다공성 수지 시트, 다공성 금속 시트, 및 다공성 금속 산화물 시트 등의 다공질체인 경우, 다공질체의 내부의 기공은, 두께 방향 뿐만 아니라, 두께 방향에 대해 수직인 방향에 대해서도 연속적인 구조인 것이 바람직하다. 이러한 구조를 가지면, 다공질체 내부의 기공을 유효하게 이용할 수 있기 때문에, 보존액의 높은 흡수 성능을 얻을 수 있다. 보존액 흡수체의 두께, 다공질체의 공극율은, 이용하는 세포 또는 조직의 종류나 세포 또는 조직과 함께 적하되는 보존액의 적하량 등에 따라, 적당히 선택할 수 있다.
상기한 공극율이란, 이하의 식으로 정의된다. 여기서 공극 용량 V는 수은 포로시미터(측정기 명칭 Autopore II 9220 제조자 micromeritics instrument corporation)를 이용하여 측정·처리된, 보존액 흡수체에 있어서의 미세구멍 반경 3nm에서 400nm까지의 누적 미세구멍 용적(ml/g)에, 보존액 흡수체의 건조 고형분량(g/평방 미터)을 곱함으로써, 단위면적(평방 미터)당 수치로서 구할 수 있다. 또 보존액 흡수체의 두께 T는 보존액 흡수체의 단면을 전자 현미경으로 촬영해 측장함으로써 얻을 수 있다.
P=(V/T)×100(%)
P：공극율(%)
V：공극 용량(ml/m2)
T：두께(μm)
재치부가 보존액 흡수체에 더하여 보강 부재로서 비흡수성 지지체를 가지는 경우에는, 보존액 흡수체와 비흡수성 지지체 사이에, 접착층을 설치할 수 있다. 접착층으로서는, 습기 경화성의 접착 물질로 대표되는 순간 접착 조성물, 핫멜트 접착 조성물, 광경화성 접착 조성물 등을 함유하는 것이 가능하고, 예를 들면, 폴리비닐알코올, 히드록시셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 전분 풀과 같은 수용성 고분자 화합물, 아세트산 비닐계 수지, 아크릴계 수지, 에폭시계 수지, 우레탄계 수지, 엘라스토머계 수지, 시아노아크릴레이트계 수지, 불소계 수지, 실리콘계 수지, 니트로셀루로스계 수지, 니트릴고무계 수지, 스티렌-부타디엔계 수지, 유리아계 수지, 스티렌계 수지, 페놀계 수지, 폴리이미드계 수지, 폴리아미드계 수지, 폴리에스테르계 수지, 비스말레이미드계 수지, 올레핀계 수지, EVA계 수지 등의 비수용성 수지를 함유하는 조성물이 바람직하게 이용될 수 있다. 접착층은, 한 종류의 수지를 함유해도 되고, 복수 종류의 수지를 함유해도 된다. 접착층의 고형분량은, 0.01~100g/m2의 범위가 바람직하고, 0.1~50g/m2의 범위가 보다 더 바람직하다.
본 발명의 동결 보존용 지그가 가지는 재치부의 면적은, 세포 또는 조직과 함께 적하되는 보존액의 적하량 등에 따라 적당히 설정하면 되고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 적하하는 보존액 1μL당 1mm2 이상으로 하는 것이 바람직하고, 2~400mm2로 하는 것이보다 바람직하다. 또, 동일한 동결 보존용 지그에 있어서, 재치부가, 비흡수성 지지체 상에 보존액 흡수체를 복수 가지는 형태인 경우에는, 연속하고 있는 1개의 보존액 흡수체 부분이 상기한 면적인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 재치부의 제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 지지체 상 또는 보존액 흡수체 상에 표면층을 가지는 재치부는, 지지체 상 또는 보존액 흡수체 상에 표면층을 형성함으로써 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서의 표면층의 형성 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 수용성 고분자를 함유하는 도포액을 지지체 또는 보존액 흡수체에 도포한 후, 그 후에 건조를 행함으로써, 지지체 상 또는 보존액 흡수체 상에 표면층을 형성할 수 있다. 표면층이 무기 미립자를 포함하는 경우에는, 수용성 고분자 및 무기 미립자를 함유하는 도포액을 이용하여 표면층을 형성하면 된다. 도포액은, 물, 유기용매 등의 용제 등을 포함해도 된다. 도포액을 도포하는 방법도 특별히 한정되지 않으며, 적당히 선택하면 된다.
이상, 본 발명의 동결 보존용 지그의 재치부에 대해서 설명해 왔다. 본 발명의 동결 보존용 지그는, 재치부와 함께 파지부를 가지고 있어도 된다. 파지부를 가지면, 동결 보존 작업 시 및 융해 작업 시의 작업성이 양호해지기 때문에, 바람직하다.
도 1은 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 일례를 나타내는 전체도이다. 도 1에 있어서 동결 보존용 지그(7)는, 파지부(1)와 재치부(2)로 구성된다.
파지부는 내액체 질소 소재인 것이 바람직하다. 이러한 소재로서는, 예를 들면 알루미늄, 철, 구리, 스테인리스 합금 등의 각종 금속, ABS 수지, 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌수지, 불소계 수지나 각종 엔지니어 플라스틱, 또한 유리 등을 적합하게 이용할 수 있다. 도 1 중, 파지부(1)는 원기둥형이지만, 그 형상은 임의이다. 또, 후술하는 바와 같이, 세포 또는 조직을 직접 액체 질소에 접촉시키지 않는 것을 목적으로, 동결 전에 세포 또는 조직을 부착시킨 재치부(2)에 캡을 씌우는 경우가 있지만, 이 경우, 파지부(1)를, 재치부(2)를 갖지 않는 측으로부터, 재치부(2)를 가지는 측을 향해, 원기둥의 직경이 연속적으로 작아지는 형상으로 함으로써, 캡을 씌울 때의 작업성을 향상시키는 것도 가능하다. 재치부(2)의 형상은, 핸들링 상, 긴 직사각형 형상 또는 시트 형상인 것이 바람직하다.
도 1의 파지부(1)와 재치부(2)의 접속 방법에 대해서 설명한다. 파지부(1)가 수지인 경우, 예를 들면, 성형 가공할 때에 인서트 성형에 의해 재치부(2)를 파지부(1)에 접속할 수 있다. 또한, 파지부(1)에 나타내지 않는 구조체 삽입부를 제작하여 접착제로 재치부(2)를 접속할 수 있다. 접착제는 다양한 것을 사용할 수 있지만, 저온에 강한 실리콘계나 불소계의 접착제를 적합하게 이용할 수 있다.
도 2는, 도 1 중의 재치부의 일례의 단면 구조 개략도이다. 도 2 중, 재치부(2a)는, 지지체(4) 상에 표면층(3)을 가지는 구조이다. 이러한 구조의 재치부(2a)를 얻기 위해서는, 예를 들면, 지지체 상에 수용성 고분자 화합물을 함유하는 도포액을 슬라이드 호퍼 방식으로 도포하는 방법이나, 딥 코팅으로 도포하는 방법 등의 제조 방법을 이용할 수 있다.
도 3~5는, 재치부가 보존액 흡수체를 가지며, 상기 보존액 흡수체 상에 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 가지는 동결 보존용 지그의 일례를 나타내는 단면 구조 개략도이다. 도 3~5에 나타내는 보존액 흡수체(5)는, 미세구멍(9)(기공)을 가지는 구조체이다. 도 3~5에 나타내는 보존액 흡수체(5)의 단면 구조는 일례이며, 이들에 한정되지 않는다.
도 3은, 도 1에 나타낸 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 경우의 일례를 나타내는 단면 구조 개략도이다. 도 3 중, 재치부(2b)는, 보존액 흡수체(5)와 보존액 흡수체(5) 상에 표면층(3)을 가지는 구조이다. 이러한 구조의 재치부(2b)를 얻기 위해서는, 예를 들면, 상기한 도포액을, 보존액 흡수체에 슬라이드 호퍼 방식으로 도포하는 제조 방법을 이용할 수 있다.
도 4는, 도 1에 나타낸 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 경우의 다른 일례를 나타내는 단면 구조 개략도이다. 도 4 중, 재치부(2c)는, 보존액 흡수체(5)의 다공질체 전체에 걸쳐 표면층(3)을 가지는 구조이다. 이와 같이, 보존액 흡수체 상에 표면층이 존재하는 경우, 표면층은 보존액 흡수체 표면에 있어서 연속한 층을 형성할 필요는 없고, 보존액 흡수체의 구멍 표면에 존재해도 된다. 이 구조는, 다공질체의 미세구멍을 폐색하지 않기 때문에, 동결 시의 유리화액의 흡수성과 융해 시의 세포 또는 조직의 박리성을 양립시킬 수 있기 때문에 바람직하다. 이 양태에 있어서도, 미시적으로는 재치부의 최표면에는 본 발명에 있어서의 표면층이 존재하므로, 도 4는 본 발명의 일례를 나타내는 것이라고 할 수 있다. 이러한 구조의 재치부(2c)를 얻기 위해서는, 예를 들면, 상기한 도포액을 딥 코팅으로 도포하는 제조 방법을 이용할 수 있다.
도 5는, 도 1에 나타낸 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 경우의 다른 일례를 나타내는 단면 구조 개략도이다. 도 5 중, 재치부(2d)는, 보존액 흡수체(5)의 다공질체 전체에 걸쳐 표면층(3)을 가지는 도 4의 형태에 더하여, 지지체(4)와 접착층(6)을 가진다. 이 구조의 경우, 예를 들면 보존액 흡수체(5)에 이용하는 다공질체가 자립성이 부족한 경우여도, 동결 시·융해 시의 조작을 보다 확실히 행할 수 있다.
도 6은, 재치부의 표면층이 무기 미립자를 함유하는 경우의 단면 구조 개략도의 일례이다. 도 6 중, 재치부(2e)는, 지지체(4) 상에 층형상으로 배치된 무기 미립자(8)를 가지는 구조를 가진다. 이러한 구조의 재치부(2e)를 얻기 위해서는, 예를 들면, 지지체 상에 수용성 고분자 화합물 및 무기 미립자를 함유하는 도포액을 슬라이드 호퍼 방식으로 도포하는 방법이나, 딥 코팅 방식으로 도포하는 방법 등의 제조 방법을 이용할 수 있다.
도 7은, 재치부의 표면층이 무기 미립자를 함유하는 경우의 단면 구조 개략도의 다른 일례이다. 도 7 중, 재치부(2f)는, 지지체(4) 상에 무기 미립자(8)가 점재한 구조이다.
도 8은, 재치부가 보존액 흡수체를 가지며, 표면층이 무기 미립자를 함유하는 경우의 일례를 나타내는 단면 구조 개략도이다. 도 8 중, 재치부(2g)는, 보존액 흡수체(5)의 표면 상에, 무기 미립자(8)를 가진다. 이러한 구조의 재치부(2g)를 얻기 위해서는, 보존액 흡수체(5)의 미세구멍 직경보다 입자 직경이 큰 무기 미립자(8)를 이용하여, 상기 무기 미립자(8)와 수용성 고분자 화합물을 함유하는 도포액을, 상기한 슬라이드 호퍼 방식이나, 딥 코팅 방식 등의 도포 방법으로 도포하면 된다.
도 9는, 재치부가 보존액 흡수체를 가지며, 표면층이 무기 미립자를 함유하는 경우의 다른 일례를 나타내는 단면 구조 개략도이다. 도 9 중, 재치부(2h)는, 보존액 흡수체(5)의 최표면에 무기 미립자(8)를 함유함과 함께, 보존액 흡수체(5)의 미세구멍 내부에도, 무기 미립자(8)를 가진다. 이러한 구조의 재치부(2h)를 얻기 위해서는, 보존액 흡수체(5)의 미세구멍 직경보다 입자 직경이 작은 무기 미립자(8)를 이용하여, 상기 무기 미립자(8)와 수용성 고분자 화합물을 함유하는 도포액을, 상기한 슬라이드 호퍼 방식이나, 딥 코팅 방식 등의 도포 방법으로 도포하면 된다. 또 보존액 흡수체(5)의 미세구멍 직경보다 입자 직경이 작은 무기 미립자(8)를 이용한 경우여도, 상기 무기 미립자(8)가 미세구멍 내부에 들어감으로써 미세구멍 직경이 작아지기 때문에, 도 9에서 나타낸 바와 같이, 보존액 흡수체(5)의 표면 상에, 층형상으로 무기 미립자가 배치되는 경우도 있다. 도 6~도 9에 나타내는 재치부의 단면 개략도는, 최표면에, 수용성 고분자 화합물 및 무기 미립자 화합물을 함유하는 층을 가지는 재치부의 일례를 나타내는 단면 개략도이다. 또한, 상기한 도 6에서 도 9에 있어서는, 표면층(3)(수용성 고분자 화합물)을 생략하고, 무기 미립자(8) 만을 기재했다.
본 발명의, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 의해, 세포 또는 조직을 장기 동결 보존하는 경우, 상술한 대로, 세포 또는 조직을 외계와 차단하기 위해 캡을 씌우거나, 또는 상기 동결 보존용 지그를 임의의 형상의 용기에 넣어 밀폐하는 것도 가능하다. 액체 질소가 멸균되어 있지 않고, 세포 또는 조직을 직접 액체 질소에 접촉시켜 동결시키는 경우에 있어서는, 동결 보존용 지그가 멸균되어 있어도 멸균 상태를 보증할 수 없는 경우가 있다. 따라서 동결 전에 세포 또는 조직을 부착시킨 재치부에 캡을 하거나, 또는 동결 보존용 지그를 용기 중에 밀폐하고, 세포 또는 조직을 직접 액체 질소에 접촉시키지 않고 동결시키는 경우가 있다. 또, 유럽 등 해외 선진국에서는 상기와 같이 액체 질소에 직접 접촉시키지 않는 동결 방법이 주류이다. 이러한 이유로부터 캡 및 용기는 내액체 질소성이 있는 소재인 각종 금속, 각종 수지, 유리, 세라믹 등으로 제작하는 것이 바람직하다. 형상으로서는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 캡은, 연필용의 캡과 같은 반방추(半紡錘) 형상 또는 돔 형상 등의 캡, 원기둥 형상의 스트로 캡 등 본체부와 접촉하지 않고, 세포 또는 조직을 외계와 차단할 수 있는 형상이라면 어떠한 형상이어도 된다. 용기는, 올려 놓아진 세포 또는 조직에 접촉하지 않고, 동결 보존용 지그를 피포 또는 수납하여 밀폐할 수 있는 것이면 되며, 그 형상은 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서는, 본 발명의 효과를 해치지 않는 한, 동결 보존용 지그를 이러한 재치부 상의 세포 또는 조직을 외계와 차단할 수 있는 캡 또는 용기와 조합하여 사용할 수 있다. 또, 이러한 캡 또는 용기와 조합하여 사용되는 동결 보존용 지그도, 본 발명에 포함된다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 예를 들면, 크라이오탑법에 있어서 적합하게 이용되는 것이다. 또, 종래의 크라이오탑법은, 통상, 단일의 세포 또는 10개 미만의 소수의 세포의 보존에 이용되지만, 본 발명의 동결 보존용 지그는, 보다 많은 세포의 보존(예를 들면, 10~1000000개의 세포의 보존)에 있어서도 적합하게 이용할 수 있다. 또한, 복수의 세포로 이루어지는 시트 형상의 세포(이른바 세포 시트)의 보존에도 적합하게 이용할 수 있다. 본 발명의 동결 보존용 지그를 이용하면, 세포 또는 조직의 동결 보존 작업에 있어서, 세포 또는 조직을 동결 후에 융해할 때에, 세포 또는 조직을 용이하게 회수할 수 있다. 또, 재치부가 보존액 흡수체를 가짐으로써, 상기한 효과에 더하여, 세포 또는 조직을 동결할 때에, 세포 또는 조직의 외주에 부착된 여분의 유리화액을 흡수하기 때문에, 세포 또는 조직의 동결 시 및 융해 시에 세포 외의 유리화액에 의한 손상을 받기 어려워, 세포 또는 조직을 우수한 생존률로 동결 보존할 수 있다.
본 발명의 동결 보존용 지그를 이용하여 세포 또는 조직을 동결 보존하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 우선 보존액에 침지한 세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치부 상에 적하하고, 상기 세포 또는 상기 조직의 주위에 부착되어 있는 여분의 보존액을 피펫 등을 이용하여 가능한 한 제거하는 것이 바람직하다. 이 때, 상기 동결 보존용 지그의 재치부가 보존액 흡수체를 가지는 경우에는, 상기 조작은 필요없고, 자동적으로 여분의 보존액이 제거된다. 다음에, 상기 세포 또는 상기 조직을 재치부에 유지한 상태로 동결 보존용 지그를 액체 질소 등 중에 침지함으로써, 세포 또는 조직을 동결할 수 있다. 이 때, 상기한 재치부 상의 세포 또는 조직을 외계와 차단할 수 있는 캡을 재치부에 장착하거나, 또는 동결 보존용 지그를 상기한 용기에 밀폐하여, 액체 질소 등 중에 침지할 수도 있다.
이와 같이, 상기 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 재치부 상에, 보존액에 침지한 세포 또는 조직을 보존액과 함께 올려 놓고, 세포 또는 조직을 재치부에 유지한 상태로 동결 보존용 지그를 액체 질소 중에 침지함으로써 세포 또는 조직을 동결하는 세포 또는 조직을 동결 보존하는 방법도, 본 발명의 하나이다.
보존액은, 통상 난자, 배 등의 세포의 동결을 위해 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 상술한 인산 완충 생리 식염수 등의 생리적 용액에 내동제(글리세롤, 에틸렌글리콜 등)를 함유시킴으로써 얻어진 보존액이나, 글리세롤이나 에틸렌글리콜, DMSO(디메틸설폭시드) 등의 각종 내동제를 다량으로(적어도 보존액의 전체 질량에 대해 10질량% 이상, 보다 바람직하게는 20질량% 이상) 포함하는 유리화액을 사용할 수 있다. 그 중에서도, 보존액으로서는, 보존액의 전체 질량에 대해 10질량% 이상의 내동제를 포함하는 유리화액이 바람직하다. 융해 작업 시에는, 액체 질소 등의 냉각 용매 중으로부터, 상기 동결 보존용 지그를 취출하고, 동결된 세포 또는 조직을 올려 놓은 재치부를 융해액 중에 침지시키고, 그 후, 세포 또는 조직을 회수한다.
본 발명의 동결 보존용 지그를 이용하여 동결 보존할 수 있는 세포로서, 예를 들면, 포유류(예를 들면, 사람(인간), 소, 돼지, 말, 토끼, 래트, 마우스 등)의 난자, 배, 정자 등의 생식 세포； 인공 다능성 간세포(iPS 세포), 배성 간세포(ES세포) 등의 다능성 간세포를 들 수 있다. 또, 초대 배양 세포, 계대 배양 세포, 및 세포주 세포 등의 배양 세포를 들 수 있다. 또, 세포는, 하나 또는 복수의 실시 형태에 있어서, 섬유 아세포, 췌장암·간암 세포 등의 암 유래 세포, 상피 세포, 혈관 내피 세포, 임파관 내피 세포, 신경세포, 연골 세포, 조직 간세포, 및 면역 세포 등의 접착성 세포를 들 수 있다. 또한, 동결 보존할 수 있는 조직으로서, 동종 또는 이종의 세포로 이루어지는 조직, 예를 들면, 난소, 피부, 각막 상피, 치근막, 심근 등의 조직을 들 수 있다. 본 발명은, 특히 시트 형상 구조를 가지는 조직(예를 들면, 세포 시트, 피부 조직 등)의 동결 보존에 적합하다. 본 발명의 동결 보존용 지그는, 직접 생체로부터 채취한 조직 뿐만이 아니라, 예를 들면, 생체 밖에서 배양하여 증식시킨 배양 피부, 생체 밖에서 구축한 이른바 세포 시트, 일본국 특허공개 2012-205516호 공보에서 제안되어 있는 삼차원 구조를 가지는 조직 모델과 같은 인공의 조직의 동결 보존에 대해서도, 적합하게 이용할 수 있다. 본 발명의 동결 보존용 지그는, 상기와 같은 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그로서 적합하게 이용된다.
[실시예]
이하에 본 발명을 실시예에 의해 더 상세하게 나타내고, 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
지지체로서 용이 접착 처리된 투명 PET 필름(전체 광선 투과율 91%, 헤이즈값 5.5%)를 이용하고, 상기 지지체 상에, 일본 합성 화학 공업(주)제의 고순도 폴리비닐알코올 EG-05P(비누화도 86.5~89mol%)의 5질량% 수용액을 건조 시의 고형분량이 5g/m2가 되도록, 슬라이드 호퍼 방식으로 도포하고, 실온 건조시켜, 도 2에 나타내는 형태의 재치부를 제작했다. 이 재치부를 2mm×20mm의 크기(40mm2)로 재단하고, ABS 수지제의 파지부와 접합시켜, 도 1에 나타내는 형태로 실시예 1의 동결 보존용 지그를 제작했다.
(비교예 1)
실시예 1의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 투명 PET 필름을 그대로 이용하여 재치부로 한 것 이외에는 동일하게 하여, 비교예 1의 동결 보존용 지그를 제작했다.
＜마우스 난자의 동결 조작＞
채취한 마우스 난자를 pH 지시약으로서 극저농도의 페놀레드가 포함되는 수정 인산 완충액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.9mM CaCl2·2H2O, 0.5mM MgCl2·6H2O, 1.5mM KH2PO4, 8mM Na2HPO4, 5.6mM 글루코오스, 0.3mM 피르빈산 Na, 65μg/ml 황산 디베카신, 1mg/ml 폴리비닐피롤리돈, 14.8mM L-proline, 200mM 트레할로스)에, 15℃의 환경 하에서 10분간 침지시켰다. 그 후, 마우스 난자를 일단 취출하고, 다음에 이 마우스 난자를 온도 15℃의 평형액(7용량% 에틸렌글리콜, 0.5용량% 글리세롤, 92.5용량% 상기 수정 인산 완충액)에 5분간 침지시켰다. 다음에, 평형액으로부터 취출한 마우스 난자를 온도 4℃의 유리화액(30용량% 에틸렌글리콜, 0.5용량% 글리세롤, 69.5% 상기 수정 인산 완충액, 0.5M 스크로스)에 침지시켰다. 30초 간의 유리화액으로의 침지 후, 마우스 난자를 실시예 1 또는 비교예 1의 동결 보존용 지그의 재치부 상에 올려 놓고, 투과형 현미경 관찰 하에서, 피펫을 이용하여 마우스 난자 주변의 여분의 유리화액을 가능한 한 제거했다. 그 후, 액체 질소 중에 침지하고, 유리화 동결시켰다. 동결시킨 동결 보존용 지그는, 융해할 때까지, 액체 질소 보존 용기 중에서 보관했다.
＜마우스 난자의 융해 조작과 박리성의 평가＞
마우스 난자를 올려 놓은 실시예 1 또는 비교예 1의 동결 보존용 지그를 액체 질소 중으로부터 취출하여, 온도 37℃의 융해액(상기 수정 인산 완충액에 1M 스크로스를 첨가한 용액)에 침지시켰다. 침지 후의 마우스 난자의 모습을 투과형 광학 현미경으로 관찰하여, 융해 시의 마우스 난자의 박리성에 대해서 이하의 기준으로 평가했다. 이러한 결과를 표 1의 「융해 시의 박리성」의 항목에 나타낸다.
융해 시의 박리성은 이하의 기준으로 평가했다.
◎ ：동결 보존용 지그를 융해액에 침지했을 때에, 파지부를 미소하게 진동시키는 정도로 마우스 난자를 박리할 수 있다(박리에 필요로 하는 시간은 1분 이내).
○ ：동결 보존용 지그를 융해액에 침지했을 때에, 파지부를 상하 좌우로 흔듦으로써 마우스 난자를 박리할 수 있다(박리에 필요로 하는 시간은 1분 이내).
×：파지부를 상하 좌우로 흔드는 것은, 1분 이내에 마우스 난자를 박리할 수 없었다.
Figure 112017047448739-pct00001
표 1의 결과로부터, 본 발명의 동결 보존용 지그는, 융해 시에 우수한 박리성을 나타내는 것을 알 수 있다.
(실시예 2)
지지체로서 용이 접착 처리된 투명 PET 필름(전체 광선 투과율 91%, 헤이즈값 5.5%)를 이용하고, 상기 지지체 상에 접착층으로서, 헨켈 재팬(주)제의 핫멜트 우레탄 수지 Purmelt QR 170-7141P를 건조 시의 고형분량 30g/m2가 되도록 도포했다. 접착층이 완전 경화되기 전에, 보존액 흡수체로서, 어드밴텍 토요(주)제의 친수화 처리된 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체(미세구멍 직경 0.2μm, 공극율 71%, 두께 35μm)를 붙였다. 이와 같이 하여 얻어진 적층체를, 일본 합성 화학 공업사제의 고순도 폴리비닐알코올 EG-05P(비누화도 86.5~89mol%)의 2질량% 수용액에 침지함으로써, 딥 코팅하고, 실온 건조시켜, 도 5에 나타내는 형태의 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 가지는 재치부를 제작했다. 또한, 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층의 도포량은, 건조 시의 고형분량으로 1.6g/m2였다. 실시예 1과 마찬가지로, 이 재치부를 2mm×20mm의 크기로 재단하고, 그 후 ABS 수지제의 파지부와 접합시켜, 도 1에 나타내는 형태로 실시예 2의 동결 보존용 지그를 제작했다.
(실시예 3)
폴리비닐알코올 EG-05P의 수용액의 농도를 1질량%로 한 것 이외에는, 실시예 2와 동일하게 하여, 실시예 3의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 실시예 3의 동결 보존용 지그가 가지는 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층의 도포량은, 건조 시의 고형분량으로 0.5g/m2였다.
(실시예 4)
폴리비닐알코올 EG-05P의 수용액의 농도를 0.2질량%로 한 것 이외에는, 실시예 2와 동일하게 하여, 실시예 4의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 실시예 4의 동결 보존용 지그가 가지는 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층의 도포량은, 건조 시의 고형분량으로 0.1g/m2였다.
(실시예 5)
다른 폴리비닐알코올인 (주)쿠라레제 PVA103(비누화도 98~99mol%)의 1질량% 수용액에 적층체를 침지시켜 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 설치한 것 이외에는, 실시예 2와 동일하게 하여, 실시예 5의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 실시예 5의 동결 보존용 지그가 가지는 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층의 도포량은, 건조 시의 고형분량으로 0.5g/m2였다.
(실시예 6)
폴리비닐알코올 대신에, 젤라틴인 제라이스(주)제 PN505의 1질량% 수용액에 적층체를 침지시켜 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 설치한 것 이외에는, 실시예 2와 동일하게 하여, 실시예 6의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 실시예 6의 동결 보존용 지그가 가지는 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층의 도포량은, 건조 시의 고형분량으로 0.5g/m2였다.
(실시예 7)
테이세이 공업(주)제의 친수화 처리된 스테인리스 다공질체(미세구멍 직경 1.5μm, 공극율 65%, 두께 1mm)를 보존액 흡수체로 하고, 폴리비닐알코올 EG-05P의 1질량% 수용액에 침지함으로써, 딥 코팅하고, 실온 건조시켜, 도 4에 나타내는 형태의 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 가지는 재치부를 제작했다. 또한, 실시예 7의 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층의 도포량은, 건조 시의 고형분량으로 0.4g/m2였다. 실시예 1과 마찬가지로, 이 재치부를 ABS 수지제의 파지부와 접합시켜, 도 1에 나타내는 형태로 실시예 7의 동결 보존용 지그를 제작했다.
(비교예 2)
실시예 2의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 수용액으로의 침지를 행하지 않는 것 이외에는 실시예 2와 동일하게 하여, 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 갖지 않는 비교예 2의 동결 보존용 지그를 제작했다. 즉 상기 동결 보존용 지그는, 용이 접착 처리된 투명 PET 필름(전체 광선 투과율 91%, 헤이즈값 5.5%) 상에, 접착층(헨켈 재팬(주)제의 핫멜트 우레탄 수지 Purmelt QR 170-7141P)을 통하여, 친수화 처리된 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체(미세구멍 직경 0.2μm, 공극율 71%, 두께 35μm)가 붙여진 것이다.
(비교예 3)
실시예 7의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 수용액으로의 침지를 행하지 않는 것 이외에는 실시예 7과 동일하게 하여, 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 갖지 않는 비교예 3의 동결 보존용 지그를 제작했다.
＜유리화액의 흡수성의 평가＞
앞의 실시예 1, 비교예 1에서의 동결 조작과 동일한 방법으로, 수정 인산 완충액, 평형액, 유리화액에 순서대로 침지시킨 마우스 난자를 0.4μL의 유리화액과 함께, 실시예 2~7, 및 비교예 2, 비교예 3의 동결 보존용 지그가 가지는 재치부 상에 오리지오사제 스트리퍼 피펫터를 이용하여 적하했다. 실시예 2~6 및 비교예 2에 대해서는 투과형 광학 현미경을 이용하고, 실시예 7과 비교예 3에 대해서는 반사형 광학 현미경을 이용하여 관찰하면서, 적하 후의 유리화액의 흡수의 모습을 이하의 기준으로 평가했다. 이러한 결과를 표 2의 「유리화액의 흡수성」의 항목에 나타낸다.
유리화액의 흡수성은 이하의 기준으로 평가했다.
◎ ：유리화액을 적하한 후, 마우스 난자 주변의 여분의 유리화액이 흡수되어, 보이지 않게 될 때까지, 6초 미만이었다.
○ ：유리화액을 적하한 후, 마우스 난자 주변의 여분의 유리화액이 흡수되어, 보이지 않게 될 때까지 6~30초였다.
×：유리화액을 적하한 후, 30초의 시점에서, 마우스 난자 주변의 여분의 유리화액이 잔존하고 있었다.
＜마우스 난자의 융해 조작과 박리성의 평가＞
실시예 2~7, 및 비교예 2, 비교예 3의 동결 보존용 지그를 이용한 융해 조작과 박리성의 평가는, 앞의 실시예 1, 비교예 1의 각 동결 보존용 지그와 동일한 방법으로 평가했다. 단, 실시예 7과 비교예 3의 평가에 있어서는, 투과형 광학 현미경 대신에 반사형 광학 현미경을 이용했다. 이 결과를 표 2의 「융해 시의 박리성」의 항목에 나타낸다.
Figure 112017047448739-pct00002
표 2의 결과로부터, 본 발명의 동결 보존용 지그에 의해, 융해 시에 우수한 박리성에 더하여, 유리화액의 우수한 흡수성을 얻을 수 있는 것을 알 수 있다.
(실시예 8)
지지체로서 용이 접착 처리된 투명 PET 필름(전체 광선 투과율 91%, 헤이즈값 5.5%)를 이용하고, 상기 지지체 상에, 에틸렌옥사이드기를 가지는 폴리비닐알코올인 일본 합성 화학 공업(주)제의 고세넥스 WO-320R(비누화도 88.3mol%)의 5질량% 수용액을 건조 시의 고형분량이 5g/m2가 되도록, 슬라이드 호퍼 방식으로 도포하고, 실온 건조 후, 120℃에서 40시간 가열 처리를 행하여, 지지체 상에 표면층을 가지는 도 2에 나타내는 형태의 재치부를 제작했다. 이 재치부를 2mm×20mm의 크기(40mm2)로 재단하고, ABS 수지제의 파지부와 접합시켜, 도 1에 나타내는 형태로 실시예 8의 동결 보존용 지그를 제작했다.
또, 상기 실시예 8의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 투명 PET 필름을 그대로 이용하여 재치부로 한 것 이외에는 동일하게 하여, 동결 보존용 지그를 제작했다. 따라서 상기 동결 보존용 지그는 앞서 기재한 비교예 1과 동일하게 때문에, 후술하는 표 3 중, 상기 동결 보존용 지그를 비교예 1로서 기재했다.
＜마우스배의 동결 작업＞
채취한 마우스 배반포기배를 pH 지시약으로서 극저농도의 페놀레드가 포함되는 수정 인산 완충액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.9mM CaCl2·2H2O, 0.5mM MgCl2·6H2O, 1.5mM KH2PO4, 8mM Na2HPO4, 5.6mM 글루코오스, 0.3mM 피르빈산 Na, 65μg/ml 황산 디베카신, 1mg/ml 폴리비닐피롤리돈, 14.8mM L-proline, 200mM 트레할로스)에, 15℃의 환경 하에서 10분간 침지시켰다. 그 후, 마우스배를 일단 취출하고, 다음에 이 마우스배를 온도 15℃의 평형액(7.5용량% DMSO(디메틸설폭시드), 7.5용량% 에틸렌글리콜, 17용량% 소태아 혈청, 68용량% 상기 수정 인산 완충액)에 5분간 침지시켰다. 다음에, 평형액으로부터 취출한 마우스배를 온도 4℃의 유리화액(15용량% DMSO(디메틸설폭시드), 15용량% 에틸렌글리콜, 14용량% 소태아 혈청, 56용량% 상기 수정 인산 완충액, 0.5M 스크로스)에 침지시켰다. 30초 간의 유리화액으로의 침지 후, 마우스배를 실시예 8 또는 비교예 1의 동결 보존용 지그의 재치부 상에 올려 놓고, 투과형 현미경 관찰 하에서, 피펫을 이용하여 마우스배 주변의 여분의 유리화액을 가능한 한 제거했다. 그 후, 액체 질소 중에 침지하고, 유리화 동결시켰다. 동결시킨 동결 보존용 지그는, 융해할 때까지, 액체 질소 보존 용기 중에서 보관했다.
＜마우스배의 융해 작업과 박리성의 평가＞
마우스배를 올려 놓은 실시예 8 또는 상술한 비교예 1의 동결 보존용 지그를 액체 질소 중으로부터 취출하여, 온도 37℃의 융해액(상기 수정 인산 완충액에 1M 스크로스를 첨가한 용액)에 침지시켰다. 침지 후의 마우스배의 모습을 투과형 광학 현미경으로 관찰하여, 융해 시의 마우스배의 박리성에 대해서 이하의 기준으로 평가했다. 이러한 결과를 표 3의 「세포 또는 조직의 박리성」의 항목에 나타낸다. 또한 표 3 중에 기재되는 비교예 1은, 먼저 나타낸 바와 같이, 용이 접착 처리된 투명 PET 필름을 그대로 이용하여 재치부로 한 동결 보존용 지그이다.
세포 또는 조직의 박리성은 이하의 기준으로 평가했다.
◎ ：동결 보존용 지그를 융해액에 침지했을 때에, 파지부를 흔드면서 마우스배를 박리할 수 있었다(박리에 필요로 한 시간은 20초 미만).
○ ：동결 보존용 지그를 융해액에 침지했을 때에, 파지부를 흔드면서 마우스배를 박리할 수 있었다(박리에 필요로 한 시간은 20초 이상 40초 미만).
△ ：동결 보존용 지그를 융해액에 침지했을 때에, 파지부를 흔드면서 마우스배를 박리하는데, 40~60초를 필요로 했다.
×：파지부를 흔드는 것은, 60초 이내에 마우스배를 박리할 수 없었다.
Figure 112017047448739-pct00003
표 3의 결과로부터, 본 발명의 동결 보존용 지그는, 융해 시에 우수한 박리성을 나타내는 것을 알 수 있다.
(실시예 9)
지지체로서 용이 접착 처리된 투명 PET 필름(전체 광선 투과율 91%, 헤이즈값 5.5%)를 이용하고, 상기 지지체 상에 접착층으로서, 헨켈 재팬(주)제의 핫멜트 우레탄 수지 Purmelt QR 170-7141P를 건조 시의 고형분량 30g/m2가 되도록 도포했다. 접착층이 완전 경화되기 전에, 보존액 흡수체로서, 어드밴텍 토요(주)제의 친수화 처리된 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체(미세구멍 직경 0.2μm, 공극율 71%, 두께 35μm)를 붙였다. 이와 같이 하여 얻어진 적층체를, 에탄디올기를 가지는 폴리비닐알코올인 일본 합성 화학 공업(주)제의 Nichigo-G polymer AZF8035W(비누화도 98.4mol%)의 2질량% 수용액에 침지함으로써, 딥 코팅하고, 실온 건조 후, 120℃에서 40시간 가열 처리를 행하여, 도 5에 나타내는 형태의 표면층을 가지는 재치부를 제작했다. 또한, 표면층의 고형분량은, 1.6g/m2였다. 실시예 8과 마찬가지로, 이 재치부를 2mm×20mm의 크기로 재단하고, 그 후 ABS 수지제의 파지부와 접합시켜, 도 1에 나타내는 형태로 실시예 9의 동결 보존용 지그를 제작했다.
(실시예 10)
에탄디올기를 가지는 폴리비닐알코올인 일본 합성 화학 공업(주)제의 Nichigo-G polymer OKS-8041(비누화도 88.9mol%)의 2질량% 수용액을 이용하여 딥 코팅을 행한 것 이외에는, 실시예 9와 동일하게 하여, 실시예 10의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 실시예 10의 동결 보존용 지그가 가지는 표면층의 고형분량은, 1.6g/m2였다.
(실시예 11)
에틸렌옥사이드기를 가지는 폴리비닐알코올인 고세넥스 WO-320R(비누화도 88.3mol%)의 2질량% 수용액을 이용하여 딥 코팅을 행한 것 이외에는, 실시예 9와 동일하게 하여, 실시예 11의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 실시예 11의 동결 보존용 지그가 가지는 표면층의 고형분량은, 1.6g/m2였다.
(실시예 12)
고세넥스 WO-320R의 수용액의 농도를 0.5질량%로 한 것 이외에는, 실시예 11과 동일하게 하여, 실시예 12의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 실시예 12의 동결 보존용 지그가 가지는 표면층의 고형분량은, 0.5g/m2였다.
(실시예 13)
에틸렌옥사이드기를 가지는 폴리비닐알코올인 일본 합성 화학 공업(주)제의 고세넥스 WO-320N(비누화도 99mol%)의 2질량% 수용액을 이용하여 딥 코팅을 행한 것 이외에는, 실시예 9와 동일하게 하여, 실시예 13의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 실시예 13의 동결 보존용 지그가 가지는 표면층의 고형분량은, 1.6g/m2였다.
(실시예 14)
폴리비닐알코올인 (주)쿠라레제의 PVA103(비누화도 98.5mol%)의 2질량% 수용액을 이용하여 딥 코팅을 행한 것 이외에는, 실시예 9와 동일하게 하여, 실시예 14의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 실시예 14의 동결 보존용 지그가 가지는 표면층의 고형분량은, 1.6g/m2였다.
또 비교예로서, 상술한 실시예 9의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 수용액으로의 침지를 행하지 않는 것 이외에는 실시예 9와 마찬가지로 상기 표면층을 갖지 않는 동결 보존용 지그도 제작했다. 이 동결 보존용 지그는, 용이 접착 처리된 투명 PET 필름(전체 광선 투과율 91%, 헤이즈값 5.5%) 상에, 접착층(헨켈 재팬(주)제의 핫멜트 우레탄 수지 Purmelt QR 170-7141P)을 통하여, 친수화 처리된 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체(미세구멍 직경 0.2μm, 공극율 71%, 두께 35μm)가 붙여진 것이며, 상술한 비교예 2와 동일하다. 따라서 후술하는 표 4 중, 상기 동결 보존용 지그를 비교예 2로서 기재했다.
＜보존액의 흡수성의 평가＞
앞의 실시예 8, 비교예 1에서의 동결 작업과 동일한 방법으로, 수정 인산 완충액, 평형액, 유리화액에 순서대로 침지시킨 마우스배를 0.3μL의 유리화액과 함께, 실시예 9~14, 및 비교예 2의 동결 보존용 지그가 가지는 재치부 상에 오리지오사제 스트리퍼 피펫터를 이용하여 적하했다. 적하 후의 유리화액의 흡수의 모습을 반사형 광학 현미경을 이용하여 관찰하면서, 이하의 기준으로 평가했다. 이러한 결과를 표 4의 「보존액의 흡수성」의 항목에 나타낸다.
보존액의 흡수성은 이하의 기준으로 평가했다.
◎ ：유리화액을 적하한 후, 마우스배 주변의 여분의 유리화액이 흡수되어 보이지 않게 될 때까지, 6초 미만이었다.
○ ：유리화액을 적하한 후, 마우스배 주변의 여분의 유리화액이 흡수되어 보이지 않게 될 때까지 6~30초였다.
×：유리화액을 적하한 후, 30초의 시점에서, 마우스배 주변의 여분의 유리화액이 잔존하고 있었다.
＜마우스배의 융해 작업과 박리성의 평가＞
실시예 9~14, 및 비교예 2의 동결 보존용 지그를 이용한 융해 작업과 박리성의 평가는, 앞의 실시예 8, 비교예 1의 각 동결 보존용 지그와 동일한 방법으로 평가했다. 이 결과를 표 4의 「세포 또는 조직의 박리성」의 항목에 나타낸다.
Figure 112017047448739-pct00004
표 4의 결과로부터, 본 발명의 동결 보존용 지그에 의해, 융해 시에 우수한 박리성에 더하여, 유리화액의 우수한 흡수성을 얻을 수 있는 것을 알 수 있다.
(실시예 15)
지지체로서 용이 접착 처리된 투명 PET 필름(전체 광선 투과율 91%, 헤이즈값 5.5%)를 이용하고, 상기 지지체 상에, 비누화도가 94mol% 이하인 폴리비닐알코올인 (주)쿠라레제의 PVA505(비누화도 73.5mol%, 중합도 500)의 5질량% 수용액을 건조 시의 고형분량이 5g/m2가 되도록, 슬라이드 호퍼 방식으로 도포하고, 실온 건조 후, 120℃에서 40시간 가열 처리를 행하여, 지지체 상에 표면층을 가지는 도 2에 나타내는 형태의 재치부를 제작했다. 이 재치부를 2mm×20mm의 크기(40mm2)로 재단하고, ABS 수지제의 파지부와 접합시켜, 도 1에 나타내는 형태로 실시예 15의 동결 보존용 지그를 제작했다.
또, 상기 실시예 15의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 투명 PET 필름을 그대로 이용하여 재치부로 한 것 이외에는 동일하게 하여, 동결 보존용 지그를 제작했다. 따라서 상기 동결 보존용 지그는 먼저 기재한 비교예 1과 동일하게 때문에, 후술하는 표 5 중, 상기 동결 보존용 지그를 비교예 1로서 기재했다.
＜마우스배의 동결 작업＞
동결 보존용 지그로서, 실시예 15 및 비교예 1의 동결 보존용 지그를 각각 사용한 것 이외에는, 상술한 실시예 8의 동결 보존용 지그를 이용한 마우스배의 동결 작업과 동일한 방법으로, 마우스배를 유리화 동결시켰다. 동결시킨 동결 보존용 지그는, 융해할 때까지, 액체 질소 보존 용기 중에서 보관했다.
＜마우스배의 융해 작업과 박리성의 평가＞
마우스배를 올려 놓은 실시예 15 또는 상술한 비교예 1의 동결 보존용 지그를 액체 질소 중으로부터 취출하여, 온도 37℃의 융해액(상기 수정 인산 완충액에 1M 스크로스를 첨가한 용액)에 침지시켰다. 침지 후, 마우스배의 모습을 투과형 광학 현미경으로 관찰하면서, 융해 작업을 행했다. 융해 작업 시, 동결 보존용 지그 상의 마우스배를 융해액에 침지시킨 직후부터 30초 간은, 동결 보존용 지그 상으로부터 마우스배를 회수하는 조작은 행하지 않고, 동결 보존용 지그 상의 마우스배를 조용히 융해액 중에 침지시켰다. 30초 경과 후, 동결 보존용 지그의 파지부를 흔듦으로써, 재치부에 진동을 부여하거나, 피펫을 이용하여 흡인압을 부여함으로써, 마우스배의 융해액 침지 후부터 60초가 경과할 때까지 회수 조작을 행했다. 상기 융해 작업 시의 마우스배의 박리성에 대해서 이하의 기준으로 평가했다. 이러한 결과를 표 5의 「세포 또는 조직의 박리성」의 항목에 나타낸다.
세포 또는 조직의 박리성은 이하의 기준으로 평가했다.
◎ ：융해 작업 시에, 재치부 상의 마우스배를 박리하기 쉬웠다(파지부를 상하 좌우로 흔드는 조작 만으로 비교적 양호하게 박리했다).
○ ：융해 작업 시에, 재치부 상의 마우스배를 박리할 수 있었다(파지부를 상하 좌우로 흔드는 조작 만으로 박리할 수 있었다).
△ ：융해 작업 시에, 재치부 상의 마우스배를 박리할 수 있었지만, 약간 박리하기 어려웠다.
×：60초 이내에 마우스배를 박리할 수 없었다.
Figure 112017047448739-pct00005
표 5의 결과로부터, 본 발명의 동결 보존용 지그는, 융해 시에 우수한 박리성을 나타내는 것을 알 수 있다.
(실시예 16)
지지체로서 용이 접착 처리된 투명 PET 필름(전체 광선 투과율 91%, 헤이즈값 5.5%)를 이용하고, 상기 지지체 상에 접착층으로서, 헨켈 재팬(주)제의 핫멜트 우레탄 수지 Purmelt QR 170-7141P를 건조 시의 고형분량 30g/m2가 되도록 도포했다. 접착층이 완전 경화되기 전에, 보존액 흡수체로서, 어드밴텍 토요(주)제의 친수화 처리된 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체(미세구멍 직경 0.2μm, 공극율 71%, 두께 35μm)를 붙였다. 이와 같이 하여 얻어진 적층체를, 비누화도가 94mol% 이하인 폴리비닐알코올인 PVA505(비누화도 73.5mol%, 중합도 500)의 2질량% 수용액에 침지함으로써, 딥 코팅하고, 실온 건조 후, 120℃에서 40시간 가열 처리를 행하여, 도 5에 나타내는 형태의 표면층을 가지는 재치부를 제작했다. 또한, 표면층의 고형분량은, 1.6g/m2였다. 실시예 15와 마찬가지로, 이 재치부를 2mm×20mm의 크기로 재단하고, 그 후 ABS 수지제의 파지부와 접합시켜, 도 1에 나타내는 형태로 실시예 16의 동결 보존용 지그를 제작했다.
(실시예 17)
비누화도가 94mol% 이하인 폴리비닐알코올인 (주)쿠라레제의 PVA217(비누화도 88mol%, 중합도 1700)의 2질량% 수용액을 이용하여 딥 코팅을 행한 것 이외에는, 실시예 16과 동일하게 하여, 실시예 17의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 실시예 17의 동결 보존용 지그가 가지는 표면층의 고형분량은, 1.6g/m2였다.
(실시예 18)
비누화도가 94mol% 이하인 폴리비닐알코올인 (주)쿠라레제의 PVA205(비누화도 88mol%, 중합도 500)의 2질량% 수용액을 이용하여 딥 코팅을 행한 것 이외에는, 실시예 16과 동일하게 하여, 실시예 18의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 실시예 18의 동결 보존용 지그가 가지는 표면층의 고형분량은, 1.6g/m2였다.
(실시예 19)
비누화도가 94mol% 이하인 폴리비닐알코올인 일본 합성 화학 공업(주)제의 고세놀 EG03P(비누화도 88mol%, 중합도 300)의 2질량% 수용액을 이용하여 딥 코팅을 행한 것 이외에는, 실시예 16과 동일하게 하여, 실시예 19의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 실시예 19의 동결 보존용 지그가 가지는 표면층의 고형분량은, 1.6g/m2였다.
(실시예 20)
폴리비닐알코올인 (주)쿠라레제의 PVA105(비누화도 98.5mol%, 중합도 500)의 2질량% 수용액을 이용하여 행한 것 이외에는, 실시예 16과 동일하게 하여, 실시예 20의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 실시예 20의 동결 보존용 지그가 가지는 표면층의 고형분량은, 1.6g/m2였다.
또 비교예로서, 상술한 실시예 16의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 수용액으로의 침지를 행하지 않는 것 이외에는 실시예 16과 마찬가지로 상기 표면층을 갖지 않는 동결 보존용 지그도 제작했다. 이 동결 보존용 지그는, 용이 접착 처리된 투명 PET 필름(전체 광선 투과율 91%, 헤이즈값 5.5%) 상에, 접착층(헨켈 재팬(주)제의 핫멜트 우레탄 수지 Purmelt QR 170-7141P)을 통하여, 친수화 처리된 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체(미세구멍 직경 0.2μm, 공극율 71%, 두께 35μm)가 붙여진 것이며, 상술한 비교예 2와 동일하다. 따라서 후술하는 표 6 중, 상기 동결 보존용 지그를 비교예 2로서 기재했다.
＜보존액의 흡수성의 평가＞
앞의 실시예 15, 비교예 1에서의 동결 작업과 동일한 방법으로, 수정 인산 완충액, 평형액, 유리화액에 순서대로 침지시킨 마우스배를 0.4μL의 유리화액과 함께, 실시예 16~20, 및 비교예 2의 동결 보존용 지그가 가지는 재치부 상에 오리지오사제 스트리퍼 피펫터를 이용하여 적하했다. 적하 후의 유리화액의 흡수의 모습을 반사형 광학 현미경을 이용하여 관찰하면서, 이하의 기준으로 평가했다. 이러한 결과를 표 6의 「보존액의 흡수성」의 항목에 나타낸다.
보존액의 흡수성은 이하의 기준으로 평가했다.
○ ：유리화액을 적하한 후, 30초 이내에, 마우스배 주변의 여분의 유리화액이 흡수되었다.
×：유리화액을 적하한 후, 30초의 시점에서, 마우스배 주변의 여분의 유리화액이 잔존하고 있었다.
＜마우스배의 융해 작업과 박리성의 평가＞
실시예 16~20, 및 비교예 2의 동결 보존용 지그를 이용한 융해 작업과 박리성의 평가는, 앞의 실시예 15, 비교예 1의 각 동결 보존용 지그와 동일한 방법으로 평가했다. 이 결과를 표 6의 「세포 또는 조직의 박리성」의 항목에 나타낸다.
Figure 112017047448739-pct00006
표 6의 결과로부터, 본 발명의 동결 보존용 지그에 의해, 융해 시에 우수한 박리성에 더하여, 유리화액의 우수한 흡수성을 얻을 수 있는 것을 알 수 있다.
(실시예 21)
지지체로서 용이 접착 처리된 투명 PET 필름(전체 광선 투과율 91%, 헤이즈값 5.5%)를 이용하고, 상기 지지체 상에 접착층으로서, 헨켈 재팬사제의 핫멜트 우레탄 수지 Purmelt QR 170-7141P를 건조 시의 고형분량 30g/m2가 되도록 도포했다. 접착층이 완전 경화되기 전에, 보존액 흡수체로서, 어드밴텍 토요(주)제의 셀룰로오스 혼합 에스테르 다공체(미세구멍 직경 0.2μm, 공극율 73%, 두께 133μm)를 붙였다. 이와 같이 하여 얻어진 적층체를, 닛산 화학 공업사제의 콜로이달 실리카인 ST-ZL(평균 입자 직경 85nm)를 실리카 농도로서 20질량%, 일본 합성 화학 공업사제의 고순도 폴리비닐알코올 EG-05P(비누화도 86.5~89mol%)를 상기 폴리비닐알코올의 고형분 농도로서 1질량% 포함하는 수용액(도포액)에 침지함으로써, 딥 코팅하고, 실온 건조시킨 후에, 또한 120℃에서 1일간 가열 처리를 행하여, 표면에 수용성 고분자 화합물과 무기 미립자를 가지는 재치부를 제작했다. 또한, 이 때의 무기 미립자의 고형분 도포량은, 3g/m2였다. 이 재치부를 2mm×20mm의 크기(40mm2)로 재단하고, 그 후 ABS 수지제의 파지부와 접합시켜, 도 1에 나타내는 형태로 실시예 21의 동결 보존용 지그를 제작했다.
(실시예 22)
＜기상법 실리카 분산액의 제작＞
물 430부
변성 에탄올 22부
카티온성 폴리머 3부
(디메틸디알릴암모늄클로라이드호모폴리머, 다이이치 공업 제약사제, 샤롤 DC902P, 평균 분자량 9000)
기상법 실리카 100부
(평균 1차 입자 직경 7nm, BET법에 의한 비표면적 300m2/g)
분산매의 물과 변성 에탄올 중에 디메틸디알릴암모늄클로라이드호모폴리머를 첨가하고, 다음에 기상법 실리카를 첨가하여 예비 분산하여 조(粗)분산액을 제작했다. 다음에 이 조분산액을 고압 호모지나이저로 2회 처리하여, 실리카 농도가 20질량%의 기상법 실리카의 분산액을 제작했다. 기상법 실리카의 평균 입자 직경은 100nm였다.
실시예 21의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 상기 기상법 실리카 분산액을 실리카 농도로서 10질량%, 폴리비닐알코올 EG-05P를 상기 폴리비닐알코올의 고형분 농도로서 1질량% 포함하는 수용액을 이용한 것 이외에는 실시예 21과 동일하게 하여, 실시예 22의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 이 때의 무기 미립자의 고형분 도포량은, 3g/m2였다.
(실시예 23)
실시예 21의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 접착층을 통하여 지지체에 붙이는 보존액 흡수체로서, 셀룰로오스 혼합 에스테르 다공체 대신에, 어드밴텍 토요(주)제의 친수화 처리된 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체(미세구멍 직경 0.2μm, 공극율 71%, 두께 35μm)를 이용한 것 이외에는 실시예 21과 동일하게 하여, 실시예 23의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 이 때의 무기 미립자의 고형분 도포량은, 3g/m2였다.
(실시예 24)
실시예 23의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 적층체의 딥 코팅에 이용하는 도포액으로서, 닛산 화학 공업사제의 콜로이달 실리카인 MP-4540(평균 입자 직경 450nm)을 실리카 농도로서 5질량%, 폴리비닐알코올 EG-05P를 상기 폴리비닐알코올의 고형분 농도로서 2질량% 포함하는 수용액을 이용한 것 이외에는 실시예 23과 동일하게 하여, 실시예 24의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 이 때의 무기 미립자의 고형분 도포량은, 1g/m2였다.
실시예 24의 동결 보존용 지그의 재치부의 표면을, 주사형 전자 현미경을 이용하여 관찰했더니, 도 10과 같은 현미경 관찰 이미지가 관찰되었다. 도 10 중, 스케일 바는 5μm이다.
(실시예 25)
실시예 23의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 적층체의 딥 코팅에 이용하는 도포액으로서, GE 헬스케어·재팬사제의 콜로이달 실리카인 퍼콜(평균 입자 직경 30nm)을 실리카 농도로서 20질량%, 폴리비닐알코올 EG-05P를 상기 폴리비닐알코올의 고형분 농도로서 1질량% 포함하는 수용액을 이용한 것 이외에는, 실시예 23과 동일하게 하여 실시예 25의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 이 때의 무기 미립자의 고형분 도포량은, 1g/m2였다.
(실시예 26)
실시예 21의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 지지체로서 용이 접착 처리된 투명 PET 필름(전체 광선 투과율 91%, 헤이즈값 5.5%)를 이용하고, 상기 지지체 상을, 실시예 21과 동일한 도포액에 침지함으로써 딥 코팅하고, 실온 건조시킨 것 이외에는 실시예 21과 동일하게 하여, 실시예 26의 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 이 때의 무기 미립자의 고형분량은, 3g/m2였다.
(비교예 4)
실시예 21의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 보존액 흡수체로서 셀룰로오스 혼합 에스테르 다공체를 가지는 적층체를, 딥 코팅하지 않고 그대로 이용하여 재치부로 한 것 이외에는 동일하게 하여, 비교예 4의 동결 보존용 지그를 제작했다.
실시예 21의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 투명 PET 필름을 그대로 이용하여 재치부로 한 것 이외에는 동일하게 하여, 동결 보존용 지그를 제작했다. 따라서 상기 동결 보존용 지그는 먼저 기재한 비교예 1과 동일하게 때문에, 후술하는 표 7 중, 상기 동결 보존용 지그를 비교예 1로서 기재했다.
또한 상술한 실시예 23의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체를 포함하는 적층체를, 딥 코팅하지 않고 그대로 이용하여 재치부로 한 것 이외에는 동일하게 하여 동결 보존용 지그를 제작했다. 이 동결 보존용 지그는, 용이 접착 처리된 투명 PET 필름(전체 광선 투과율 91%, 헤이즈값 5.5%) 상에, 접착층(헨켈 재팬(주)제의 핫멜트 우레탄 수지 Purmelt QR 170-7141P)을 통하여, 친수화 처리된 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체(미세구멍 직경 0.2μm, 공극율 71%, 두께 35μm)가 붙여진 것이며, 상술한 비교예 2와 동일하다. 따라서 후술하는 표 7 중, 상기 동결 보존용 지그를 비교예 2로서 기재했다.
＜인간 간세포 스페로이드의 제작＞
인간 간세포 스페로이드는, 스미토모 베이크라이트사제의 PrimeSurface(등록상표) 96U 플레이트를 이용하여 제작했다. 샬레 상에, 10%의 혈청을 첨가한 이글 최소 필수 배지(EMEM)에서 증식시킨 HepG2 세포를 트립신 처리에 의해 샬레로부터 박리·회수한 후에, 1웰당 50cell의 세포 농도로 PrimeSurface 96U 플레이트 상에 파종했다. 37℃, 2% CO2의 조건 하에 있어서, 플레이트 상에서 3일간 배양한 후에, 스페로이드의 형성을 확인했다. 스페로이드 중에서, 형상이 구형에 가까우며, 또한 직경이 100μm에 가까운 것을 선택하여, 이후의 평가 시험에 이용했다.
＜스페로이드의 동결 작업＞
스페로이드 1개를 유리화액(30용량% 에틸렌글리콜, 0.5용량% 글리세롤, 69.5% 하기 수정 인산 완충액, 0.5M 스크로스)에 침지시킨 후에, 유리화액과 함께, 실시예 21~26 및 비교예 1, 비교예 2, 비교예 4의 동결 보존용 지그의 재치부 상에 올려 놓았다. 동결 작업에 있어서는, 실시예 23~26, 비교예 1, 비교예 2에 대해서는, 종래의 일반적인 조작대로, 투과형 현미경 하에서 관찰하면서 작업을 행했다. 실시예 21, 실시예 22, 및 비교예 4의 경우에는, 재치부의 광투과성이 낮기 때문에, 반사형 현미경을 이용하여 관찰하면서 작업을 행했다. 또, 실시예 26과 비교예 1 이외의 보존액 흡수체를 가지는 동결 보존용 지그에 대해서는, 투과형 현미경 또는 반사형 현미경 하에서, 스페로이드 주변의 유리화액이 충분히 제거된 것을 확인한 후, 액체 질소에 침지하여 동결했다. 실시예 26과 비교예 1의 동결 보존용 지그에 대해서는, 투과형 현미경 하에서, 피펫을 이용하여, 스페로이드 주변의 유리화액을 가능한 한 충분히 제거한 후에, 액체 질소에 침지하여 동결했다.
＜융해 작업과 박리성의 평가＞
스페로이드를 올려 놓은 실시예 21~26 및 비교예 1, 비교예 2, 비교예 4의 동결 보존용 지그를 액체 질소 중으로부터 취출하여, 온도 37℃의 융해액(수정 인산 완충액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.9mM CaCl2·2H2O, 0.5mM MgCl2·6H2O, 1.5mM KH2PO4, 8mM Na2HPO4, 5.6mM 글루코오스, 0.3mM 피르빈산 Na, 65μg/ml 황산 디베카신, 1mg/ml 폴리비닐피롤리돈, 14.8mM L-proline, 200mM 트레할로스)에 1M 스크로스를 첨가한 용액)에 침지시켰다. 침지 후의 스페로이드의 모습을 투과형 광학 현미경 또는 반사형 현미경으로 관찰하면서, 피펫을 이용하여, 재치부로부터의 스페로이드의 회수 조작을 행하여, 융해 시의 스페로이드의 박리성에 대해서 이하의 기준으로 평가했다. 이러한 결과를 표 7의 「세포 또는 조직의 박리성」의 항목에 나타낸다.
◎ ：동결 보존용 지그를 융해액에 침지했을 때에, 파지부를 상하 좌우로 흔들거나, 피펫팅함으로써, 디바이스로부터 스페로이드를 30초 이내에 박리할 수 있었다.
○：동결 보존용 지그를 융해액에 침지했을 때에, 파지부를 상하 좌우로 흔들거나, 피펫팅하여, 디바이스로부터의 스페로이드의 박리에 30초~1분을 필요로 했다.
×：1분 이내에 스페로이드를 박리할 수 없었다.
Figure 112017047448739-pct00007
＜보존액의 흡수성＞
스페로이드 1개를 유리화액(30용량% 에틸렌글리콜, 0.5용량% 글리세롤, 69.5% 상기 수정 인산 완충액, 0.5M 스크로스)에 침지시킨 후에, 유리화액과 함께, 동결 보존용 지그의 재치부 상에 올려 놓았을 때에, 보존액의 흡수성을 평가했다. 보존액 흡수체를 가지는 실시예 21~25의 동결 보존용 지그는, 양호한 흡수성을 가지며, 피펫 등을 이용하여 여분의 유리화액을 제거한 조작을 필요로 하지 않았다. 특히, 실시예 24는 우수한 흡수성을 나타내고, 10초 이내에 여분의 유리화액이 흡수·제거되었다.
＜세포 또는 조직의 시인성＞
스페로이드 1개를 유리화액(30용량% 에틸렌글리콜, 0.5용량% 글리세롤, 69.5% 상기 수정 인산 완충액, 0.5M 스크로스)에 침지시킨 후에, 유리화액과 함께, 동결 보존용 지그의 재치부 상에 올려 놓았을 때에, 투과형 현미경 하에서 스페로이드를 관찰했을 때의 작업성을, 세포 또는 조직의 시인성으로서 평가했다. 실시예 21, 실시예 22의 동결 보존용 지그와 비교하여, 실시예 23~26의 동결 보존용 지그는, 보다 명료하게 올려 놓아진 스페로이드의 형태를 관찰하는 것이 가능했다.
<산업상의 이용 가능성>
본 발명은, 소 등의 가축이나 동물의 배이식이나 인공 수정, 인간으로의 인공 수정 등 외에, iPS 세포, ES세포, 일반적으로 이용되고 있는 배양 세포, 생체로부터 채취한 검사용 또는 이식용의 세포 또는 조직, 생체 밖에서 배양한 세포 또는 조직 등의 동결 보존에 이용할 수 있다.
1 파지부 2, 2a~2h 재치부
3 표면층 4 지지체
5 보존액 흡수체 6 접착층
7 동결 보존용 지그 8 무기 미립자
9 미세구멍(기공)

Claims (7)

  1. 세포 또는 조직을 올려놓는 재치부(載置部)의 최표면에, 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 가지고, 상기 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층은 융해액에 대해 가용성이고, 또한 건조된 층인 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 수용성 고분자 화합물이, 에탄디올기를 가지는 폴리비닐알코올 및 에틸렌옥사이드기를 가지는 폴리비닐알코올로부터 선택되는 적어도 1종류인 것을 특징으로 하는, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 수용성 고분자 화합물이, 비누화도가 94mol% 이하인 폴리비닐알코올인 것을 특징으로 하는, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층이 무기 미립자를 더 함유하는 것을 특징으로 하는, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 재치부가 보존액 흡수체를 가지며, 그 보존액 흡수체 상에 상기 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 가지는 것을 특징으로 하는, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 기재된 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 재치부 상에, 보존액에 침지한 세포 또는 조직을 보존액과 함께 올려 놓고, 세포 또는 조직을 재치부에 유지한 상태로 동결 보존용 지그를 액체 질소 중에 침지함으로써 세포 또는 조직을 동결하는 것을 특징으로 하는, 세포 또는 조직의 동결 보존 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 보존액이, 보존액의 전체 질량에 대해 10질량% 이상의 내동제를 포함하는 유리화액인 것을 특징으로 하는, 세포 또는 조직의 동결 보존 방법.
KR1020177013508A 2014-10-23 2015-10-16 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그 및 동결 보존 방법 KR101962052B1 (ko)

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JP2014216350 2014-10-23
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