KR102288612B1 - 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 세포 또는 조직의 동결 보존 작업을 용이하고 또한 확실하게 행하는 것이 가능한, 동결 보존용 지그를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치하는 재치부를 갖는 동결 보존용 지그로서, 그 재치부 표면이, 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와, 보존액을 저류하는 오목부를 갖는 것을 특징으로 한다.

Description

세포 또는 조직의 동결 보존용 지그
본 발명은, 세포 또는 조직을 동결 보존할 때에 사용하는, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 관한 것이다.
세포 또는 조직의 우수한 보존 기술은, 다양한 산업 분야에서 요구되고 있다. 예를 들면, 소의 배이식 기술에 있어서는, 배를 동결 보존하여, 수배(受胚) 소의 발정 주기에 맞추어 배를 융해하여, 이식하는 것이 행해지고 있다. 또, 사람의 불임 치료에 있어서는, 모체로부터 난자 또는 난소를 채취 후, 이식에 적합한 타이밍에 맞추기 위해 동결 보존해 두고, 이식 시에 융해하여 이용하는 것이 이루어지고 있다.
일반적으로, 생체 내에서 채취된 세포 또는 조직은, 가령 배양액 중이어도, 점차 활성이 소실되어 가므로, 생체 외에서의 세포 또는 조직의 장기간의 배양은 바람직하지 않다. 그 때문에, 생체 활성을 소실시키지 않고 장기간 보존하기 위한 기술이 중요하다. 우수한 보존 기술에 의해, 채취된 세포 또는 조직을 보다 정확하게 분석하는 것이 가능해진다. 또 우수한 보존 기술에 의해, 보다 높은 생체 활성을 유지한 채로 세포 또는 조직을 이식에 이용하는 것이 가능해져, 이식 후의 생착률이 향상되는 것이 기대된다. 또한, 생체 외에서 배양한 배양 피부, 생체 외에서 구축한 이른바 세포 시트와 같은 이식을 위한 인공의 조직을, 순차적으로 생산하여 보존해 두고, 필요 시에 사용하는 것도 가능해져, 의료적인 면뿐만 아니라, 산업면에 있어서도 큰 메리트를 기대할 수 있다.
세포 또는 조직의 보존 방법으로서, 예를 들면 완만 동결법이 알려져 있다. 이 방법에서는, 우선, 예를 들면 인산 완충 생리 식염수 등의 생리적 용액에 내동제를 함유시킴으로써 얻어진 보존액에, 세포 또는 조직을 침지한다. 그 내동제로서는, 글리세롤, 에틸렌글리콜 등의 화합물이 이용된다. 그 보존액에, 세포 또는 조직을 침지 후, 비교적 느린 냉각 속도(예를 들면 0.3~0.5℃/분의 속도)로, -30~-35℃까지 냉각함으로써, 세포 내외 또는 조직 내외의 용액이 충분히 냉각되어, 점성이 높아진다. 이러한 상태로, 그 보존액 중의 세포 또는 조직을 추가로 액체 질소의 온도(-196℃)까지 냉각하면, 세포 내 또는 조직 내와 그 바깥 주위의 미소 용액이 모두 비결정인 채로 고체가 되는, 유리화가 일어난다. 유리화에 의해, 세포 내외 또는 조직 내외가 고화되면, 실질적으로 분자의 움직임이 없어지므로, 유리화된 세포 또는 조직을 액체 질소 중에 보존함으로써, 반영구적으로 보존할 수 있다고 생각된다.
그러나, 상기한 완만 동결법에서는, 비교적 느린 냉각 속도로 냉각할 필요가 있으므로, 동결 보존을 위한 조작에 시간을 요한다. 또, 냉각 속도를 제어하기 위한 장치 또는 지그를 필요로 하는 문제가 있다. 또한 완만 동결법에서는, 세포 바깥 또는 조직 바깥의 보존액 중에 빙정이 형성되므로, 세포 또는 조직이 그 빙정에 의해 물리적으로 손해를 받을 우려가 있다.
완만 동결법에서의 문제점을 해결하기 위한 방법으로서, 유리화 동결법이 제안되어 있다. 유리화 동결법이란, 글리세롤, 에틸렌글리콜, DMSO(디메틸술폭시드) 등의 내동제를 다량으로 포함하는 보존액의 응고점 강하에 의해, 빙점하에서도 빙정이 생기기 어려워지는 원리를 이용한 것이다. 이 보존액을 급속히 액체 질소 중에서 냉각시키면, 빙정을 발생시키지 않은 채로 고체화시킬 수 있다. 이와 같이 고체화하는 것을 유리화 동결이라고 한다. 또, 내동제를 다량으로 포함하는 보존액은 유리화액이라고 호칭된다.
상기한 유리화 동결법의 구체적인 조작으로서는, 내동제를 다량으로 포함하는 보존액에 세포 또는 조직을 침지하고, 그 후, 액체 질소의 온도(-196℃)로 냉각한다. 유리화 동결법은, 이러한 간편하고 또한 신속한 공정이므로, 동결 보존을 위한 조작에 긴 시간을 필요로 하지 않는 것 외에, 온도 제어를 하기 위한 장치 또는 지그를 필요로 하지 않는다는 이점이 있다.
유리화 동결법을 이용하면, 원리적으로는, 세포 또는 조직의 내외의 어느 것에도 빙정이 생기지 않으므로 동결 시 및 융해 시의 세포 또는 조직에 대한 물리적 장해(동해(凍害))를 회피할 수 있지만, 적절한 유리화 동결을 이루기 위해서는, 유리화에 이용하는 보존액에 함유되는 내동제의 농도를 높은 것으로 해야 한다. 한편, 보존액에 포함되는 고농도의 내동제는 세포 또는 조직에 있어서 화학적 독성이 높은 것이 알려져 있다.
상기한 배경으로부터, 세포 또는 조직의 동결 보존에 있어서는, 세포 또는 조직이 보존액에 폭로되는 시간(요컨대 동결될 때까지의 시간)은 단시간인 것이 바람직하다. 또, 동결 속도를 빠르게 하는 관점에서, 세포 또는 조직의 동결 보존 시에는 세포 또는 조직 주위에 존재하는 보존액이 적은 편이 바람직하다. 세포 또는 조직 주위에 존재하는 보존액이 적을수록, 동결 대상의 열용량이 적어지고, 세포 또는 조직의 동결 속도가 빨라져, 유리화 동결에 있어서는 바람직하다고 할 수 있다. 또한, 세포 또는 조직 주위에 존재하는 보존액이 적은 것은, 동결 후의 융해 시에 있어서도, 보존액이 신속하게 융해액 중에 희석되어, 세포 또는 조직 중으로의 재빙정 형성을 억제하는 관점에서 바람직하다. 또 세포 또는 조직 주위에 존재하는 보존액이 적은 것은, 융해 시에 융해액 중에 혼입되는 내동제의 농도를 낮게 할 수 있으므로, 내동제에 유래하는 독성을 경감하는 관점에서도 바람직하다.
유리화 동결법을 이용한 세포 또는 조직의 동결 보존에 대해서는, 다양한 방법으로, 다양한 종류의 세포 또는 조직을 이용한 예가 나타나 있다. 예를 들면, 특허문헌 1에서는, 동물 또는 사람의 생식 세포 또는 체세포에 대한 유리화 동결법의 적용이, 동결 보존 및 융해 후의 생존율의 점에서, 극히 유용하다는 것이 나타나 있다.
유리화 동결법은, 주로 사람의 생식 세포를 이용하여 발전해 온 기술이지만, 최근에는, iPS 세포나 ES 세포로의 응용도 널리 검토되고 있다. 또, 비특허문헌 1에서는, 초파리의 배의 보존에 유리화 동결법이 유효한 것이 나타나 있다. 또한, 특허문헌 2에서는, 식물 배양 세포나 조직의 보존에 있어서, 유리화 동결법이 유효한 것이 나타나 있다. 이와 같이, 유리화 동결법은 널리 다양한 종의 세포 및 조직의 보존에 유용한 것이 알려져 있다.
특허문헌 3 및 특허문헌 4에서는, 사람의 불임 치료 분야에서 사용되고 있는 이른바 크리오톱법이라고 하는 방법으로, 난(卵)부착 유지용 스트립으로서 장방형의 가요성 또한 무색 투명한 필름을 사용한 난(卵)동결 보존 용구를 사용하여, 현미경 관찰하에서 그 필름 상에 극소량의 보존액과 함께 난자 또는 배를 재치(載置)하고, 동결 보존하는 방법이 제안되어 있다.
특허문헌 5 및 특허문헌 6에는, 가늘고 긴 생체 세포 부착 유지부의 길이 방향으로 형성된 세포 수납용 오목부를 갖는 동결 보존용 지그가 기재되어 있다.
특허문헌 7에서는, 난자 또는 배를, 내동제를 다량으로 포함하는 보존액과 함께 보존액 제거재 상에 재치하고, 하부로부터 흡인함으로써 난자 또는 배의 주위에 부착된 여분의 보존액을 제거하여, 동결 보존시키는 방법이 제안되어 있다. 또한, 보존액 제거재로서는, 철망, 종이 등의 천연물이나 합성 수지로 이루어지는 필름상물로 관통구멍을 가진 것이 기재되어 있다. 또 여분의 보존액을 제거하고, 또 세포를 재치할 때의 작업성을 향상시키는 것이 가능한 동결 보존용 지그로서, 예를 들면, 특정 헤이즈값을 갖는 보존액 흡수체가 특허문헌 8에 기재되며, 또한 특허문헌 9, 특허문헌 10 등에는, 보존액 흡수체로서 다공질 소결 형성체나 특정 굴절률을 갖는 소재로 형성된 다공질 구조체를 갖는 유리화 동결 보존용 지그가 기재되어 있다.
세포 또는 조직을 재치할 때의 작업성을 향상시키는 것이 가능한 동결 보존용 지그에 대한 기재는 상술한 바와 같지만, 세포 또는 조직을 박리할 때의 작업성을 향상시키는 것이 가능한 동결 보존용 지그로서, 예를 들면, 세포 또는 조직을 재치하는 재치부의 최표면에 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 갖는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그가, 특허문헌 11에 기재되어 있다. 또 특허문헌 12에는, 용기의 내면에 세포가 접착되지 않는 것을 목적으로, 미세 돌기가 형성된 내면을 갖는 세포 용기가 기재되어 있다.
일본국 특허 제3044323호 공보 일본국 특허공개 2008-5846호 공보 일본국 특허공개 2002-315573호 공보 일본국 특허공개 2006-271395호 공보 일본국 특허 제5781621호 공보 일본국 특허 제5798633호 공보 국제 공개 제2011/070973호 일본국 특허공개 2014-183757호 공보 일본국 특허공개 2015-142523호 공보 국제 공개 제2015/064380호 일본국 특허공개 2017-60457호 공보 일본국 특허공개 2015-226497호 공보
Steponkus et al., Nature 345 : 170-172(1990)
특허문헌 3 및 특허문헌 4에서는, 난자 또는 배를 재치하는 필름의 폭을 제한함으로써, 적은 양의 보존액과 함께 난자 또는 배를 동결 보존하여, 우수한 생존율을 얻는 방법이 제안되어 있다. 그러나, 난자 또는 배를 동결 후에 융해할 때, 동결 대상의 상태 등에 따라, 자주 필름 상의 난자 또는 배가 필름 표면에 고착되어 버려, 이들을 회수할 때에 높은 기량이 요구된다는 문제가 있었다. 또한, 작업자가 보다 소량의 보존액으로 난자 또는 배를 동결 보존할수록, 동결 후에 융해할 때에 난자 또는 배가 필름 표면에 강고하게 고착되어 버린다는 문제가 있었다.
특허문헌 5 및 특허문헌 6에서는, 세포의 부착 유지부에 세포가 수납되는 오목부를 형성함으로써, 동결 작업 시의 세포의 탈락을 개선하는 방법이 제안되어 있지만, 여전히, 상기한 특허문헌 3이나 특허문헌 4와 동일하게, 회수할 때에 높은 기량이 요구되는 문제를 갖고 있다.
특허문헌 7에서는, 난자 또는 배의 주위에 부착된 여분의 보존액을, 보존액 제거재의 하부로부터 흡인하여 제거함으로써, 이들 생식 세포를 동결 보존시키는 방법이 제안되어 있다. 그러나, 특허문헌 3 및 특허문헌 4와 동일하게, 동결 후에 융해할 때, 난자 또는 배가 보존액 제거재 상에 고착되어 버려, 이들을 회수할 때에 높은 기량이 요구된다는 문제가 있었다. 특허문헌 8~10에서는, 전술한 특허문헌 7 등과 같이, 난자 또는 배의 주위에 부착된 여분의 보존액을 작업자가 제거할 필요는 없으며, 양호한 작업성이 얻어지지만, 보존액 흡수체가 보존액을 흡수할 때에, 난자 또는 배가 보존액 흡수체에 특히 강고하게 고착되므로, 난자 또는 배를 회수할 때에 특히 높은 기량이 요구된다는 문제가 있었다.
특허문헌 11에서는, 세포 또는 조직을 동결 후에 융해할 때에, 세포 또는 조직이 동결 보존용 지그의 재치부 상에 고착되는 것을 회피하기 위해, 그 재치부 상에 수용성 고분자 화합물을 함유하는 층을 형성하는 방법이 제안되어 있지만, 동결 융해 시의 세포 또는 조직의 회수성의 향상은 항구의 과제이며, 바람직하게는 더 나은 개선이 요망되고 있었다.
특허문헌 12에서는, 소위 세포의 보존 바이알과 같은, 세포를 보존액과 함께 충전하는 세포 용기에 있어서, 세포 용기의 내면에 미세 돌기 형상을 형성함으로써, 세포 용기 내면으로의 세포의 부착을 억제하는 방법이 제안되어 있다. 그러나, 상기의 기술은, 부착을 억제하는 것이며, 보존을 목적으로 하여 부착된 세포를 적극적으로 박리하여, 사용하는 기술은 아니다. 극소수(대부분의 경우 1~3개 정도)의 세포 또는 조직을 극소량의 보존액과 함께 재치하는 소위 크리오톱법에 있어서는, 융해 시에 세포가 강고하게 고착되지 않고 매끄럽게 회수될 뿐만 아니라, 동결 보존 시에는 세포 또는 조직이 동결 보존 지그 상에 확실하게 유지되는 것도 요구된다.
본 발명은, 세포 또는 조직의 동결 보존 작업을 용이하고 또한 확실하게 행하는 것이 가능한, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그를 제공하는 것을 주된 과제로 한다. 보다 구체적으로는, 세포 또는 조직을 보존액에 침지하여, 동결 보존용 지그의 재치부에 재치하여 동결 보존할 때에, 세포 또는 조직이 재치부 표면에 확실하게 유지됨과 더불어, 재치된 세포 또는 조직 외주의 여분의 보존액을 줄일 수 있으며, 또한, 동결 융해 시에 세포 또는 조직을 신속하게 회수할 수 있는 동결 보존용 지그를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 이하의 구성을 갖는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그(본 명세서 중, 「세포 또는 조직의 동결 보존용 지그」를, 간단히 「동결 보존용 지그」라고도 한다)에 의해, 상기한 과제를 해결할 수 있는 것을 알아내었다.
(1) 세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치하는 재치부를 갖는 동결 보존용 지그로서, 그 재치부 표면이 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와, 보존액을 저류 하는 오목부를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
(2) 상기한 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부의 높이가, 세포 또는 조직의 평균 직경의 1/100 이상 1/2 미만인 것을 특징으로 하는, 상기 (1)에 기재된 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
(3) 상기한 세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치하는 재치부 표면의 산술 평균 거칠기 Ra가 1.0μm 이상인 것을 특징으로 하는, 상기 (1)에 기재된 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
(4) 상기한 재치부가 보존액 흡수체를 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
상기의 발명에 의하면, 동결 작업에 있어서, 세포 또는 조직을 재치부 상에 적하 부착할 때에, 세포 또는 조직 주변의 여분의 보존액을 제거하는 작업이 용이하고, 세포 또는 조직을 재치부 표면에 확실하게 유지할 수 있으며, 또한, 융해 작업에 있어서, 세포 또는 조직을 신속하게 회수할 수 있는 동결 보존용 지그를 제공할 수 있다. 본 발명의 동결 보존용 지그를 사용하면, 세포 또는 조직의 동결 보존 작업을 용이하고 또한 확실하게 행하는 것이 가능해진다.
도 1은, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 일례를 나타낸 전체도이다.
도 2는, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 다른 일례를 나타낸 전체도이다.
도 3은, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 다른 일례를 나타낸 전체도이다.
도 4는, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 있어서의 재치부의 일례를 나타낸 단면 구조 개략도이다.
도 5는, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 있어서의 재치부의 다른 일례를 나타낸 단면 구조 개략도이다.
도 6은, 도 4에 나타낸 재치부에 있어서, 세포 및 보존액을 적하 부착했을 때의 모델도이다.
도 7은, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 있어서의 재치부의 일례를 나타낸 사시도이다.
도 8은, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 있어서의 재치부의 다른 일례를 나타낸 사시도이다.
도 9는, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 있어서의 재치부의 다른 일례를 나타낸 사시도이다.
도 10은, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 있어서의 재치부의 다른 일례를 나타낸 사시도이다.
도 11은, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 있어서의 재치부의 다른 일례를 나타낸 사시도이다.
도 12는, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그가, 보존액 흡수체를 갖는 경우에 있어서의 재치부의 일례를 나타낸 단면 구조도이다.
도 13은, 도 12에 나타낸 재치부에 있어서, 세포 및 보존액을 적하 부착했을 때의 모델도이다.
도 14는, 실시예에서 사용한 금형의 일례를 나타낸 도면이다.
도 15는, 실시예에서 사용한 금형의 다른 일례를 나타낸 도면이다.
도 16은, 실시예에서 사용한 금형의 다른 일례를 나타낸 도면이다.
도 17은, 실시예에서 사용한 금형의 다른 일례를 나타낸 도면이다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직을 동결 보존할 때에 이용되는 것이다. 본 명세서 중에서 세포란, 단일 세포뿐만 아니라, 복수의 세포로 이루어지는 생물의 세포 집단을 포함하는 것이다. 복수의 세포로 이루어지는 세포 집단이란 단일 종류의 세포로 구성되는 세포 집단이어도 되고, 복수 종류의 세포로 구성되는 세포 집단이어도 된다. 또, 조직이란, 단일 종류의 세포로 구성되는 조직이어도 되고, 복수 종류의 세포로 구성되는 조직이어도 되며, 세포 이외에 세포 바깥 매트릭스와 같은 비세포성의 물질을 포함하는 것이어도 된다.
본 명세서 중의 동결 보존 작업은, 세포 또는 조직을 극저온의 냉매를 이용하여 동결시키는 동결 작업, 세포 또는 조직을 극저온의 냉매 중에서 저장하는 보관 작업, 세포 또는 조직을 융해액 중에서 해동하는 융해 작업의 일련의 작업을 포함하는 것으로 한다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 동결 보존 작업에 이용하는 것이며, 바람직하게는 유리화 동결 보존 작업에 이용하는 것이다. 상세하게는, 본 발명의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직이 재치된 재치부를 갖는 동결 보존용 지그를 액체 질소 등의 냉각 용매에 침지하여 동결시키기 위한 것이다. 또, 그 재치부 상에 재치된 세포 또는 조직을 융해할 때에는, 세포 또는 조직을 동결 보존용 지그와 함께 냉각 매체로부터 빼내어, 융해액 중에 침지시켜 융해하기 위한 것이다.
본 발명의 동결 보존용 지그를 이용하면, 동결 보존할 때에, 세포 또는 조직을 재치부 표면에 확실하게 유지할 수 있다. 또, 세포 또는 조직과 함께 적하한 보존액이, 재치한 세포 또는 조직의 하부에 저류되므로, 세포 또는 조직 외주의 여분의 보존액이 적어져, 세포 또는 조직을 양호한 생존율로 동결 보존할 수 있다. 또한, 동결 보존 후에 세포 또는 조직을 융해할 때에는, 재치부 상에 재치된 세포 또는 조직과 재치부 표면의 사이에 저류된 보존액이 존재하므로, 보존액이 유리화 상태로부터 융해되어, 유동성을 신속하게 되찾아, 융해액에 희석됨에 따라, 세포 또는 조직을 용이하게 재치부 표면으로부터 박리 및 회수할 수 있다. 요컨대 본 발명의 동결 보존용 지그를 이용하면, 세포 또는 조직의 동결 보존에 걸리는 작업을 용이하고 또한 확실하게 행할 수 있다. 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직의 보존 용구, 세포 또는 조직의 동결 보존 기구, 세포 또는 조직의 보존용 기구로 환언할 수 있다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직을 재치하는 재치부 표면이, 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와, 보존액을 저류하는 오목부를 갖는다. 동결 조작에 있어서, 세포 또는 조직과 보존액을 재치부 표면에 적하 부착시키면, 그 재치부 표면의 요철 형상이 보존액의 확산을 억제한다. 이 때문에 재치한 세포 또는 조직의 위치가 크게 이동하지 않고, 피펫 등을 이용한 적하 부착의 작업이 용이하다. 또, 재치부 표면의 볼록부는 세포 또는 조직을 확실하게 유지할 수 있다. 또한, 재치한 세포 또는 조직의 하부에 형성된 오목부에, 세포 또는 조직과 함께 적하 부착된 보존액이 저류됨으로써, 세포 또는 조직 외주의 여분의 보존액을 줄일 수 있으므로, 급속한 유리화 동결이 가능해진다. 한편, 융해 조작에 있어서는, 세포 또는 조직을 융해할 때에는, 세포 또는 조직과 재치부 표면의 사이에 저류된(동결된) 보존액이 존재하므로, 유리화 상태로부터 융해되어, 유동성을 되찾은 보존액이 융해액에 희석됨에 따라, 세포 또는 조직을 용이하게 재치부 표면으로부터 박리 및 회수할 수 있다.
또, 본 발명의 동결 보존용 지그가 갖는 재치부가 보존액 흡수체를 가지며, 그 표면에 본 발명의 표면 형상인 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와, 보존액을 저류하는 오목부를 갖는 경우에는, 상기 효과에 더하여, 그 보존액 흡수체가 여분의 보존액을 흡수하므로, 여분의 보존액을 제거하기 위한 그 밖의 조작을 특별히 필요로 하지 않으며, 작업성이 현격히 향상된다. 또, 그와 같이 조작된 세포 또는 조직은 극소량의 보존액에 덮여 있어, 동결 작업하는 경우여도 신속하게 동결 상태로 할 수 있다. 또한, 상기한 유리화 동결법에 있어서는, 보존액이 다량의 내동제를 함유하는 것에 의한 화학적 독성이 문제가 되지만, 재치부가 보존액 흡수체를 갖는 동결 보존용 지그에 의하면, 재치된 세포 또는 조직 주변의 보존액이 극소량이 됨으로써, 세포 또는 조직의 생존율의 향상을 기대할 수 있다.
이하에, 본 발명의 동결 보존용 지그의 구성을 설명한다.
본 발명의 동결 보존용 지그에서는, 세포 또는 조직을 재치하는 재치부 표면이, 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와, 보존액을 저류하는 오목부를 갖는다. 여기서, 세포 또는 조직을 재치하는 재치부 표면이란, 실제로, 세포 또는 조직이 보존액과 함께 재치되는 표면 부분에 상당한다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직을 재치하는 재치부의 형상은, 세포 또는 조직을 재치 가능한 형상이면 되며, 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 재치부는 대략 시트상의 형상이다. 대략 시트상의 재치부를 갖는 동결 보존용 지그는, 본 발명의 바람직한 실시양태의 하나이다. 본 발명에 있어서의 대략 시트상이란, 매크로인 시점에서 평면을 갖는 형상인 것을 의미하며, 평면 시트상, 곡률을 갖는 시트상, 파형 시트상, V자형 시트상 등의 형상이 예시된다.
본 발명에 있어서 재치부가 갖는 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부는, 재치하는 세포 또는 조직과 접하는 구조 부분에 상당한다. 그 볼록부는, 재치되는 세포 또는 조직에 대해, 적어도 1개 이상이면 되고, 복수여도 된다. 재치하는 1개의 세포 또는 조직에 대해, 2개 이상의 볼록부를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 그 볼록부는 재치하는 세포 또는 조직을 유지하는 목적의 구조이므로, 그 볼록부 표면이 세포 또는 조직과 직접 접하지 않고, 예를 들면 세포 주위의 보존액을 통해 세포를 유지하고 있어도 된다.
본 발명에 있어서 재치부가 갖는 보존액을 저류하는 오목부는, 그 표면이 재치하는 세포와 접하지 않고, 보존액을 저류하는 것이 바람직하다. 그 오목부는, 재치하는 세포에 대해, 적어도 1개 이상이면 되고, 복수여도 된다. 또, 복수의 재치부를 갖는 경우에, 각 재치부의 보존액을 저류하는 오목부가 연결되어 있어도 된다.
상기한 볼록부는, 세포 또는 조직(이하, 재치 대상물이라고도 기재)을 보존액과 함께 재치하는 개소에 존재하는 것이 중요하다. 따라서, 복수의 볼록부를 갖는 집합부는 1개소에 존재하고 있어도 되고, 복수의 볼록부를 갖는 집합부가 복수 개소에 존재해도 되지만, 재치 대상물인 세포 또는 조직을 볼록부가 확실하게 유지 가능하도록, 복수의 볼록부에 의해 재치 대상물을 유지하는 상태, 즉, 볼록부 간의 패턴 피치가, 재치 대상물의 평균 직경의 95% 이하인 것이 바람직하다. 볼록부 간의 패턴 피치는, 상면에서 봤을 때에, 가장 가까운 볼록부의 중심 간의 거리이다. 세포 또는 조직이 재치되지 않는 개소에 있어서는, 그 볼록부가 존재하고 있어도 되고, 존재하고 있지 않아도 된다.
본 발명에 있어서 재치부가 갖는 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부의 높이(즉 오목부의 깊이)는, 재치하는 세포 또는 조직의 크기에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 100nm 이상인 것이 바람직하다. 볼록부의 높이가 100nm를 밑도는 경우에는, 오목부에 저류되는 보존액의 양이 불충분하며, 발휘하는 효과가 얻어지지 않는 경우가 있다.
또, 본 발명에 있어서 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부의 높이는, 재치되는 세포 또는 조직의 평균 직경의 1/100 이상 1/2 미만인 것이 바람직하다. 이에 따라 융해 조작 시에 세포 또는 조직을 박리, 회수하는 것이 보다 용이해진다. 본 발명에 있어서 세포 또는 조직의 재치부의 표면에 형성된 볼록부는, 재치부와 재치 대상물의 접촉 면적을 줄임으로써, 융해 조작 시에 재치 대상물이 동결 보존용 지그의 재치부로부터 박리되는 것을 촉진할 수 있는데, 이러한 효과는 그 볼록부의 높이를, 세포 또는 조직의 평균 직경의 1/100 이상으로 한 경우에 있어서, 특히 현저하게 나타난다. 본 발명에 있어서, 세포 또는 조직의 평균 직경은, 등체적 구 환산의 직경의 평균이다. 등체적 구 환산의 직경이란, 세포 또는 조직이 구상인 경우에는, 그 직경을 가리킨다. 재치되는 세포 또는 조직이 구상이 아닌 경우, 그 세포 또는 조직의 체적으로부터 구상당의 직경을 구하고, 이 값을 등체적 구 환산의 직경으로서 채용하는 것으로 한다. 재치되는 세포 또는 조직이 1개인 경우는, 그 세포 또는 조직의 상기 등체적 구 환산의 직경을, 평균 직경으로 한다.
한 양태에 있어서, 본 발명의 동결 보존용 지그는, 바람직하게는 평균 직경이 1~500μm인 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그로서 적합하게 사용된다.
한편, 볼록부의 높이가 세포 또는 조직의 평균 직경의 1/2 이상인 경우, 융해 조작 시에 있어서 재치 대상물이 동결 보존용 지그로부터 용이하게 박리되는 것이 곤란해지는 경우가 있다. 이 이유는 확실치 않지만, 일반적으로 세포 또는 조직은, 내동제의 화학적 독성을 저감하기 위해, 배양사의 손재주에 따라 소량의 보존액과 함께 재치부에 재치된다. 이 때문에 볼록부의 높이가 세포 또는 조직의 평균 직경의 1/2 이상인 경우에는, 볼록부와 세포 또는 조직의 사이에 적당한 액막이 형성된 상태로 동결하는 것이 어려워져, 양호한 융해 박리성이 얻어지기 어려운 경우가 있다. 또한, 이러한 동결 보존용 지그를 이용한 경우, 본 발명의 실시형태는, 세포 또는 조직을 동결 보존용 지그에 재치하여 동결 보존하는 동결 보존 방법으로서, 그 동결 보존용 지그가 세포 또는 조직을 재치하는 재치부를 가지며, 그 재치부 표면은 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와, 보존액을 저류하는 오목부를 갖고, 그 볼록부의 높이가 상기한 세포 또는 조직의 평균 직경의 1/100 이상 1/2 미만인 동결 보존 방법이 된다.
또 본 발명의 다른 형태에 의하면, 상기한 재치부 표면의 산술 평균 거칠기 Ra가 1.0μm 이상인 것이 바람직하다. 이에 따라 세포 또는 조직을 융해할 때에, 세포 또는 조직을, 보다 용이하게 박리, 회수하는 것이 가능한 동결 보존용 지그를 제공할 수 있다. 그 산술 평균 거칠기 Ra는, 측정한 거칠기 곡선의 일부를 기준 길이로 추출하여, 그 구간의 요철 상태를 평균치로 나타낸 값이다. 또한, 본 발명 에 있어서 산술 평균 거칠기 Ra는, 촉침식 표면 거칠기 측정기를 사용하여 측정할 수 있으며, 그 때의 컷오프값은 0.8mm, 기준 길이는 4.0mm이다. 또한 산술 평균 거칠기 Ra의 상한치는, 10μm 이하인 것이 바람직하다. 재치부 표면의 산술 평균 거칠기 Ra는, 보다 바람직하게는 1.0~5μm이며, 더욱 바람직하게는 1.5~3.5μm이다. 재치부 표면의 산술 평균 거칠기 Ra가 상기 범위이면, 상술한 본 발명의 효과를 보다 충분히 발휘할 수 있다.
본 발명의 동결 보존용 지그가 갖는 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와 보존액을 저류하는 오목부는 규칙적이고 또한 균일한 패턴을 갖고 있어도 되며, 규칙적이고 또한 균일하지 않은 즉 랜덤인 패턴이어도 된다. 본 발명의 동결 보존용 지그가 갖는 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와 보존액을 저류하는 오목부로 이루어지는 표면 형상의 패턴은, 필러형상, 블록형상, 스트라이프형상, 홀형상, 추형상 등의 원하는 패턴을 이용할 수 있다.
본 발명의 동결 보존용 지그가 갖는 재치부는, 보존액을 흡수하지 않는 비흡수체로 이루어지는 것이어도 되고, 보존액을 흡수하는 보존액 흡수체를 갖는 것이어도 된다.
우선, 본 발명의 동결 보존용 지그가 갖는 세포 또는 조직을 재치하는 재치부가 비흡수체로 이루어지는 경우에 대해 설명한다.
본 발명의 동결 보존용 지그가 갖는 세포 또는 조직을 재치하는 재치부가, 비흡수체인 경우에는, 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET)나 폴리에틸렌나프탈레이트(PEN) 등의 폴리에스테르 수지, 아크릴 수지, 에폭시 수지, 실리콘 수지, 폴리카보네이트 수지, 디아세테이트 수지, 트리아세테이트 수지, 폴리아릴레이트 수지, 폴리염화비닐, 폴리술폰 수지, 폴리에테르술폰 수지, 폴리이미드 수지, 폴리아미드 수지, 폴리올레핀 수지, 환상 폴리올레핀 수지, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 등의 불소 수지 등으로 이루어지는 각종 수지, 알루미늄이나 알루미늄 합금, 금, 금 합금, 은, 은 합금, 철, 구리, 구리 합금, 스테인리스 등의 각종 금속, 유리, 고무 등을 이용할 수 있다.
다음에, 본 발명의 동결 보존용 지그가 갖는 세포 또는 조직의 재치부에 있어서의 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와 보존액을 저류하는 오목부의 형성 방법에 대해 설명한다.
본 발명의 동결 보존용 지그가 갖는 재치부 표면에는, 소재에 따른 다양한 방법으로 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와 보존액을 저류하는 오목부를 형성할 수 있다. 구체적으로는, PET와 같은 수지를 재치부의 소재로서 이용한 경우는, 절삭 가공이나 표면 연마, 금형의 압열 전사 등의 방법에 의해 재치부 표면에 원하는 볼록부와 오목부를 형성하는 것이 가능하다. 금속을 재치부의 소재로서 이용한 경우는, 절삭 가공이나 표면 연마, 숏피닝 등의 방법에 의해, 재치부 표면에 원하는 볼록부와 오목부를 형성하는 것이 가능하다. 유리를 재치부의 소재로서 이용한 경우는, 에칭이나 미세 연마 등의 방법에 의해, 재치부 표면에 원하는 볼록부와 오목부를 형성할 수 있다.
다음에, 본 발명의 동결 보존용 지그가 갖는 재치부가, 보존액 흡수체를 갖는 경우에 대해 설명한다.
본 발명의 동결 보존용 지그가 갖는 세포 또는 조직의 재치부가 보존액 흡수체를 갖는 경우에는, 여분의 보존액을 세포 또는 조직의 주위로부터 제거할 수 있으며, 내동제의 화학적 독성을 경감하는 관점에서 바람직하다. 세포 또는 조직의 재치부가 보존액 흡수체를 갖는 경우에는, 특히 유리화 동결 보존법에 있어서 필요한 여분의 유리화액을 제거하는 공정이 불필요해짐과 더불어, 세포 또는 조직 주변의 보존액이 극소량이 됨으로써, 세포 또는 조직의 생존율의 향상을 기대할 수 있다.
본 발명의 동결 보존용 지그가 갖는 세포 또는 조직의 재치부가 보존액 흡수체를 갖는 경우에는, 보존액 흡수체로서, 섬유로 이루어지는 다공성 구조체, 수지로 이루어지는 다공성 구조체, 금속으로 이루어지는 다공성 구조체, 금속 산화물로 이루어지는 다공성 구조체를 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서의 「다공성」이란, 상기한 흡수체가 표면에 기공(세공)을 갖는 구조체인 것을 의미하며, 그 흡수 체 표면 및 내부에 연속적인 기공을 갖는 구조체인 것이 보다 바람직하다. 또 보존액 흡수체(상기한 각종 다공성 구조체)의 두께는 10μm~5mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20μm~2.5mm이다. 보존액 흡수체가, 얇은 시트인 경우에는, 보강 부재로서 상기한 비흡수체를 지지체로서 조합하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 보존액 흡수체로서 이용하는 섬유로 이루어지는 다공성 구조체로서는, 종이 또는 부직포가 예시되며, 종이는 바인더 등의 결착제 성분의 종이 전체에 차지하는 비율이 10질량% 이하인 종이가 바람직하고, 보다 바람직하게는 5질량% 이하이며, 3질량% 이하인 종이가 더욱 바람직하다. 이에 따라 우수한 보존액의 흡수성이 얻어진다. 또, 그 종이에 포함되는 제지용 약품의 종이 전체에 차지하는 비율은 1질량% 이하인 것이 바람직하다. 통상 종이에 포함되어 있는 제지용 약품 중, 예를 들면 형광 증백제나 염료, 양이온계의 사이즈제 등에는 세포에 대한 영향이 염려되는 경우가 있다.
섬유로 이루어지는 다공성 구조체가 종이인 경우, 밀도가 0.1~0.6g/cm3이며, 평량이 10~130g/m2인 종이인 것이 바람직하다. 특히 밀도가 0.12~0.3g/cm3이며, 평량이 10~100g/m2인 종이는, 보존액의 흡수성이 우수하며, 또한, 투과형 현미경을 이용하여 재치부 상에 재치한 세포 또는 조직을 관찰할 수 있는, 세포 또는 조직의 시인성이 우수한 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지므로 바람직하다.
섬유로 이루어지는 다공성 구조체가 부직포인 경우, 그 부직포가 함유하는 섬유로서는, 셀룰로오스 섬유, 셀룰로오스 섬유로 이루어지는 재생 섬유인 레이온 섬유나 큐프라 섬유, 또한 셀룰로오스 섬유로부터의 반합성 섬유인 아세테이트 섬유, 폴리에스테르 섬유, 나일론 섬유, 아크릴 섬유, 폴리프로필렌 섬유, 폴리에틸렌 섬유, 폴리염화비닐 섬유, 비닐리덴 섬유, 폴리우레탄 섬유, 비닐론 섬유, 유리 섬유, 견 섬유 등을 들 수 있으며, 이들 섬유를 각종 혼합한 부직포도 이용할 수 있다. 그 중에서도 셀룰로오스 섬유, 셀룰로오스 섬유 유래의 섬유로 셀룰로오스 재생 섬유인 레이온 섬유나 큐프라 섬유, 셀룰로오스 섬유로부터의 반합성 섬유인 아세테이트 섬유가 더욱 바람직하다.
섬유로 이루어지는 다공성 구조체가 부직포인 경우, 밀도가 0.1~0.4g/cm3이며, 평량이 10~130g/m2인 부직포인 것이 바람직하다. 특히 밀도가 0.12~0.3g/cm3이며, 평량이 10~100g/m2인 부직포는, 보존액의 흡수성이 우수하며, 또한 세포 또는 조직의 시인성이 우수한 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지므로 바람직하다.
보존액 흡수체로서 이용되는 부직포에 있어서도 상기한 종이와 동일하게, 바인더 등의 결착제 성분의 부직포에 차지하는 비율이 10질량% 이하인 부직포가 바람직하고, 보다 바람직하게는 5질량% 이하이며, 3질량% 이하인 부직포가 더욱 바람직하다. 특히 결착제를 함유하지 않는 부직포가 바람직하다.
부직포는 종이와 달리 다양한 제조 방법이 있는데, 상기한 결착제 성분이 저감된 부직포로서는, 스펀 본드법, 멜트 블로우법으로 제조된 부직포, 또한 습식법 또는 건식법으로 섬유를 나열한 후, 수류 교락법 또는 니들 펀치법으로 제조된 부직포를 적합하게 사용할 수 있다. 또 상기한 바와 같이, 본 발명에 있어서 부직포가 함유하는 바람직한 섬유로서는, 셀룰로오스 섬유, 셀룰로오스 섬유 유래의 섬유로 셀룰로오스 재생 섬유인 레이온 섬유나 큐프라 섬유, 또한 셀룰로오스 섬유로부터의 반합성 섬유인 아세테이트 섬유를 들 수 있는데, 이들 섬유를 이용하여 제조하는 경우는, 습식법, 건식법에 상관없이 수류 교락법 또는 니들 펀치법으로의 제조 방법이 적합하다.
본 발명에 있어서 보존액 흡수체로서 이용하는 수지로 이루어지는 다공성 구조체로서는, 예를 들면 일본국 특허공고 소42-13560호 공보나, 일본국 특허공개 평08-283447호 공보에 기재되는, 적어도 1축 방향으로 연신하여, 수지의 융점 이상으로 가열하여 소결함으로써 얻은 미세 섬유상 구조에 의해 다공질 구조를 형성한 다공성 구조체, 일본국 특허공개 2009-235417호 공보에 기재되는, 유화 중합 또는 분쇄 등의 방법에 의해 얻어진 열가소성 수지의 고체 분말을 금형에 충전하여, 가열, 소결하여 분말 입자 표면을 융착시켜 냉각함으로써, 다공질 구조를 형성한 다공성 구조체 등을 들 수 있다. 다공성 구조체를 보존액 흡수체로서 이용한 경우, 보존액의 흡수성이 우수하며, 또한 세포 또는 조직의 시인성이 우수한 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지므로, 바람직하다.
상기한 수지로 이루어지는 다공성 구조체(다공성 수지 시트)를 형성하는 수지로서는, 저밀도 폴리에틸렌, 고밀도 폴리에틸렌, 초고분자 폴리에틸렌 등의 각종 폴리에틸렌이나 폴리프로필렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리테트라플루오로에틸렌이나 폴리비닐디플루오라이드 등의 불소 수지, 에틸렌-아세트산 비닐 공중합체, 폴리아미드, 스티렌-아크릴로니트릴 공중합체, 스티렌-부타디엔-아크릴로니트릴 3원 공중합체, 폴리카보네이트, 폴리염화비닐 등을 들 수 있다. 그 중에서도 폴리테트라플루오로에틸렌이나 폴리비닐리덴디플루오라이드 등의 불소 수지를 이용한 다공성 수지 시트는, 세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치부에 재치한 경우, 투과형 현미경 관찰하에서의 세포 또는 조직의 시인성이 비약적으로 높아져, 세포 또는 조직의 시인성이 특히 우수한 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지므로 적합하다. 또 다공성 수지 시트로서는, 이화학 실험 용도나 연구 용도로서 시판되고 있는, 여과용의 멤브레인 필터도 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 보존액 흡수체로서 이용하는 금속으로 이루어지는 다공성 구조체로서는, 구리, 구리 합금, 알루미늄, 알루미늄 합금, 금, 금 합금, 은, 은 금, 주석, 아연, 납, 티탄, 니켈, 스테인리스 등의 금속으로 이루어지는 다공성 금속 시트를 들 수 있다. 또, 금속 산화물로 이루어지는 다공성 구조체로서는, 실리카, 알루미나, 지르코니아, 석영 유리 등의 금속 산화물로 이루어지는 다공성 구조체를 바람직하게 이용할 수 있다. 또한, 금속으로 이루어지는 다공성 구조체 및 금속 산화물로 이루어지는 다공성 구조체는, 상기한 금속 및 금속 산화물을 각각 2종류 이상 함유하는 다공성 구조체여도 된다. 그 중에서도 금속 산화물로 이루어지는 다공성 구조체는, 투과형 현미경 관찰하에서의 세포 또는 조직의 시인성이 우수한 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지므로, 바람직하다.
본 발명에 있어서, 보존액 흡수체로서 이용하는 금속으로 이루어지는 다공성 구조체, 금속 산화물로 이루어지는 다공성 구조체의 제조 방법으로서는, 일반적으로 알려진 방법을 사용할 수 있다. 보존액 흡수체가 금속으로 이루어지는 다공성 구조체인 경우에는, 분말 야금법, 스페이서법 등의 방법을 사용할 수 있다. 또, 수지 사출 성형과 분말 야금법을 조합한 소위 파우더 스페이스 홀더법도 바람직하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 국제 공개 제2006/041118호나 일본국 특허 제4578062호 공보에 기재된 방법 등을 이용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 금속 분말과 스페이서가 되는 수지를 혼합 후, 압력을 가하여 성형하고, 고온 환경하에서 소성함으로써, 금속 분말을 굳히고, 스페이서가 되는 수지를 기화시켜, 다공성 금속 시트를 얻을 수 있다. 파우더 스페이스 홀더법 등을 이용하는 경우에는, 금속 분말과 스페이서가 되는 수지에 더하여, 수지의 바인더를 혼합할 수 있다. 또, 금속 분말을 고온에서 가열한 후에, 가스를 주입하여 공극을 제작하는 발포 용융법, 가스 팽창법 등의 금속 다공질체의 제조 방법도 사용할 수 있다. 또한, 발포제를 이용하여 금속 다공질체를 제조하는 슬러리 발포법과 같은 제조 방법도 사용할 수 있다. 보존액 흡수체가 금속 산화물로 이루어지는 다공성 구조체인 경우에는, 예를 들면, 일본국 특허공개 2009-29692호 공보나 일본국 특허공개 2002-160930호 공보에 기재된 방법 등을 이용할 수 있다.
보존액 흡수체가, 상기한 수지로 이루어지는 다공성 구조체, 금속으로 이루어지는 다공성 구조체 및 금속 산화물로 이루어지는 다공성 구조체의 다공질체인 경우에는, 그 다공질체의 세공 직경은, 0.02~50μm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.05~25μm이다. 세공 직경이 0.02μm 미만인 경우, 보존액의 적하 시에 보존액의 흡수 성능이 충분하지 않은 경우가 있다. 또, 다공성 구조체의 제조가 어렵다는 문제가 있다. 한편, 세공 직경이 50μm를 초과하는 경우, 본 발명의 동결 보존용 지그의 재치부가 갖는 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와 보존액을 저류하는 오목부의 구조를 형성하는 것이 어려운 경우가 있다. 또 세공 직경이 25μm를 초과하는 경우, 투과형 현미경 관찰하에 있어서, 세포 또는 조직의 시인성이 저하하는 경우가 있다. 또한, 다공질체의 세공 직경은, 수지로 이루어지는 다공성 구조체의 경우에는, 버블 포인트 시험에 의해 측정되는 가장 큰 세공의 직경이다. 또 금속으로 이루어지는 다공성 구조체 및 금속 산화물로 이루어지는 다공성 구조체의 경우에는, 그 다공질체의 표면 및 단면의 화상 관찰로부터 측정한 평균 세공 직경이다.
보존액 흡수체의 공극률은 20용량% 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 30용량% 이상이다. 또 보존액 흡수체가, 상기한 수지로 이루어지는 다공성 구조체, 금속으로 이루어지는 다공성 구조체, 및 금속 산화물로 이루어지는 다공성 구조체 등의 다공질체인 경우, 다공질체의 내부의 기공은, 두께 방향뿐만 아니라, 두께 방향에 대해 수직인 방향에 대해서도 연속적인 구조인 것이 바람직하다. 이러한 구조를 가지면, 다공질체 내부의 기공을 유효하게 이용할 수 있으므로, 보존액의 높은 흡수 성능이 얻어진다. 보존액 흡수체의 두께, 다공질체의 공극률은, 이용하는 세포 또는 조직의 종류나 세포 또는 조직과 함께 적하되는 보존액의 적하량 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기한 공극률이란, 이하의 식으로 정의된다. 여기서 공극 용량 V는 수은 포로시미터(측정기 명칭 Autopore II 9220 제조자 micromeritics instrument corporation)를 이용하여 측정·처리된, 보존액 흡수체에 있어서의 세공반경 3nm에서 400nm까지의 누적 세공 용적(ml/g)에, 보존액 흡수체의 건조 고형분량(g/평방미터)을 곱함으로써, 단위면적(평방미터)당 수치로서 구할 수 있다. 또 보존액 흡수체의 두께 T는 보존액 흡수체의 단면을 전자 현미경으로 촬영하여 측장함으로써 얻을 수 있다.
P=(V/T)×100(%)
P : 공극률(%)
V : 공극 용량(ml/m2)
T : 두께(μm)
본 발명의 동결 보존용 지그의 세포 또는 조직을 재치하는 재치부가 보존액 흡수체를 갖는 경우에 있어서도, 전술한 바와 같이, 소재에 따른 다양한 방법으로 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와 보존액을 저류하는 오목부를 형성할 수 있다. 구체적으로는, 보존액 흡수체로서, 섬유로 이루어지는 다공성 구조체나, 폴리테트라플루오로에틸렌과 같은 수지로 이루어지는 다공성 구조체를 사용한 경우에는, 금형의 압열 전사 등의 방법에 의해, 재치부에 이용하는 보존액 흡수체 표면에 원하는 볼록부와 오목부를 형성하는 것이 가능하다. 보존액 흡수체로서, 금속으로 이루어지는 다공성 구조체를 이용한 경우에는, 에칭 처리나, 숏피닝, 표면 연마 등의 방법에 의해 그 보존액 흡수체 표면에 원하는 볼록부와 오목부를 형성하는 것이 가능하다. 또한, 보존액 흡수체가 세공을 갖는 경우에는, 그 보존액 흡수체가 갖는 세공을 폐색하지 않고, 보존액 흡수체 표면에 원하는 볼록부와 오목부를 형성하는 것이 바람직하다. 보존액 흡수체를 갖는 재치부는, 그 보존액 흡수체 표면의 볼록부 및 오목부를, 재치부 표면의 볼록부 및 오목부로서 갖는 것임이 바람직하다.
상술한 방법에 의해, 재치부 상에 형성한 볼록부의 높이는, 공초점 현미경에 의한 형상 측정에 의해 구할 수 있다. 재치부에 형성한 볼록부의 높이를 구하는 다른 방법으로서는, 예를 들면, (주) 키엔스제의 디지털 마이크로 스코프 VHX-5000의 심도 합성 기능을 이용하여 해석하는 방법, (주) 키엔스제의 형상 해석 레이저 현미경 VK-X1000에 의해 해석하는 방법, 전자 현미경에 의해 재치부의 단면을 관찰하는 방법 등을 들 수 있다. 또, 상술한 볼록부의 패턴 피치도 동일한 방법으로 구하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 재치부가 보존액 흡수체에 더하여 보강 부재로서 전술한 비흡수체를 갖는 경우에는, 보존액 흡수체와 비흡수체의 사이에, 접착층을 형성할 수 있다. 접착층으로서는, 습기 경화성의 접착 물질로 대표되는 순간 접착 조성물, 핫멜트 접착 조성물, 광경화성 접착 조성물 등을 함유하는 것이 가능하고, 예를 들면, 폴리비닐알코올, 히드록시셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 전분풀과 같은 수용성 고분자 화합물, 아세트산비닐계 수지, 아크릴계 수지, 에폭시계 수지, 우레탄계 수지, 엘라스토머계 수지, 시아노아크릴레이트계 수지, 불소계 수지, 실리콘계 수지, 니트로셀룰로오스계 수지, 니트릴 고무계 수지, 스티렌-부타디엔계 수지, 요소계 수지, 스티렌계 수지, 페놀계 수지, 폴리이미드계 수지, 폴리아미드계 수지, 폴리에스테르계 수지, 비스말레이미드계 수지, 올레핀계 수지, EVA계 수지 등의 비수용성 수지를 함유하는 조성물을 바람직하게 이용할 수 있다. 접착층은, 한 종류의 수지를 함유해도 되고, 복수 종류의 수지를 함유해도 된다. 접착층의 고형분량은, 0.01~100g/m2의 범위가 바람직하고, 또한 0.1~50g/m2의 범위가 보다 바람직하다.
본 발명의 동결 보존용 지그가 갖는 재치부의 면적은, 세포 또는 조직과 함께 적하되는 보존액의 적하량 등에 따라 적절히 설정하면 되고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 적하하는 보존액 1μL에 대해 1mm2 이상으로 하는 것이 바람직하고, 2~400mm2로 하는 것이 보다 바람직하다. 또, 동일한 동결 보존용 지그에 있어서, 재치부가, 비흡수성 지지체 상에 보존액 흡수체를 복수 갖는 형태인 경우에는, 연속되어 있는 1개의 보존액 흡수체 부분이 상기한 면적인 것이 바람직하다.
본 발명의 동결 보존용 지그의 세포 또는 조직을 재치하는 재치부의 최표면에는, 수용성 고분자 화합물을 함유하는 가용성층을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 동결 보존용 지그는 상술한 바와 같이, 동결 조작 시에, 세포 또는 조직을 보존액과 함께 동결 보존용 지그의 재치부에 재치한 후에, 냉매(예를 들면 액체 질소)에 침지, 동결하고, 융해 시에는, 동결된 세포 또는 조직을 동결 보존용 지그와 함께 빼내어, 융해액 중에 침지하여 융해하는 것이다. 가용성층이 재치부의 최표면에 존재하는 경우, 세포 또는 조직을 융해할 때에, 그 가용성층의 전체 또는 일부가 융해액 중에 용해됨으로써, 전술한 재치부 표면에 원하는 볼록부와 오목부를 형성하는 효과와 더불어 세포 또는 조직의 박리성이 상승적으로 향상된다.
본 발명에 있어서, 가용성층이 함유하는 수용성 고분자 화합물로서는, 예를 들면, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체, 전분 및 그 유도체, 젤라틴, 카세인, 알긴산 및 그 염, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 스티렌-말레산 공중합체염, 스티렌-아크릴산 공중합체염 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 알긴산 및 그 염이나 젤라틴은 보존액에 대한 용해성과 적당한 피막 형성 작용이 얻어지므로 바람직하고, 폴리비닐알코올은, 비생물 유래 소재이며, 또한 세포 또는 조직에 대해서도 저독성이므로, 특히 바람직하다. 이들 수용성 고분자 화합물은, 단독으로 이용해도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다. 또 가용성층은, 융해액에 대한 용해도가 10질량%를 밑돌지 않는 범위에서, 가교제를 함유할 수 있다.
본 발명에 있어서, 재치부가 보존액 흡수체를 갖는 경우에는, 그 보존액 흡수체가 갖는 세공을 폐색하지 않고, 재치부에 원하는 볼록부와 오목부를 형성하는 것이 바람직하다. 보존액 흡수체의 흡수성이 현저하게 저하하지 않는 범위이면, 보존액 흡수체 상에, 가용성층을 형성하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 동결 보존용 지그가, 보존액 흡수체 상에 가용성층을 갖는 경우에는, 가용성층의 고형분량이 많아질수록, 보존액 흡수체가 갖는 세공이 좁아지므로, 보존액의 흡수성은 저하하는 경향이 있다. 한편, 융해 작업 시의 세포 또는 조직의 박리성은, 가용성층의 고형분량이 많아질수록 우위이다. 이러한 이유로부터, 가용성층이 함유하는 수용성 고분자 화합물의 고형분량은, 0.01~100g/m2인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.1~10g/m2이다.
본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 의해, 세포 또는 조직을 장기 동결 보존하는 경우, 세포 또는 조직을 외계와 차단하기 위해 캡을 씌우거나, 또는 그 동결 보존용 지그를 임의 형상의 용기에 넣어 밀폐하는 것이 가능하다. 액체 질소가 멸균되어 있지 않고, 세포 또는 조직을 직접 액체 질소에 접촉시켜 동결시키는 경우에 있어서는, 동결 보존용 지그가 멸균되어 있어도 멸균 상태를 보증할 수 없는 경우가 있다. 따라서, 동결 전에 세포 또는 조직을 부착시킨 재치부에 캡을 씌우거나, 또는 동결 보존용 지그를 용기 중에 밀폐하여, 세포 또는 조직을 직접 액체 질소에 접촉시키지 않고 동결시키는 경우가 있다. 유럽 등 해외 선진국에서는 상기와 같이 액체 질소에 직접 접촉시키지 않는 동결 방법이 주류이다. 또, 세포 또는 조직을 직접 액체 질소에 접촉시켜 동결시키는 경우에 있어서도, 저장하는 액체 질소 탱크 중에서의 물리적 충격 등으로부터, 동결 보존용 지그 상에 재치된 세포 또는 조직을 보호하는 것을 목적으로 하여, 재치부에 캡을 씌우는 경우가 있다. 이러한 이유로부터 캡 및 용기는 내액체 질소성이 있는 소재인 각종 금속, 각종 수지, 유리, 세라믹 등으로 제작하는 것이 바람직하다. 형상으로서는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 캡은, 연필용의 캡과 같은 반방추상 또는 돔상 등의 캡, 원주상의 스트로 캡 등 본체부와 접촉하지 않고, 세포 또는 조직을 외계와 차단할 수 있는 형상이라면 어떠한 형상이어도 된다. 용기는, 재치된 세포 또는 조직에 접촉하지 않고, 동결 보존용 지그를 피포 또는 수납하여 밀폐할 수 있는 것이면 되며, 그 형상은 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서는, 본 발명의 효과를 해치지 않는 한, 동결 보존용 지그를 이러한 재치부 상의 세포 또는 조직을 외계와 차단할 수 있는 캡 또는 용기와 조합하여 사용할 수 있다. 또, 이러한 캡 또는 용기와 조합하여 사용되는 동결 보존용 지그도, 본 발명에 포함된다.
본 발명의 동결 보존용 지그는, 예를 들면, 크리오톱법에 있어서 적합하게 이용되는 것이다. 또, 종래의 크리오톱법은, 배 또는 난자의 동결 보존에 일반적으로 이용되며, 통상, 단일 세포 또는 10개 미만의 소수의 세포의 보존에 이용되는데, 본 발명의 동결 보존용 지그는, 보다 많은 세포의 보존(예를 들면, 10~1000000개의 세포의 보존)에 있어서도 적합하게 이용할 수 있다. 또한, 복수의 세포로 이루어지는 시트상의 세포(소위 세포 시트)의 보존에도 적합하게 이용할 수 있다. 본 발명의 동결 보존용 지그를 이용하면, 세포 또는 조직의 동결 보존 작업에 있어서, 세포 또는 조직을 확실하게 유지할 수 있음과 더불어, 재치하는 세포 또는 조직 외주의 보존액을 적은 상태로 동결 보존할 수 있다. 또, 세포 또는 조직을 동결 후에 융해할 때에, 세포 또는 조직을 용이하게 박리, 회수할 수 있다. 또, 재치부가 보존액 흡수체를 가짐으로써, 상기한 효과에 더하여, 세포 또는 조직을 동결할 때에, 세포 또는 조직의 외주에 부착된 여분의 보존액을 흡수하므로, 세포 또는 조직의 동결 시 및 융해 시에 세포 바깥의 보존액에 의한 손상을 받기 어렵고, 세포 또는 조직을 우수한 생존율로 동결 보존할 수 있다.
본 발명의 동결 보존용 지그를 이용하여 세포 또는 조직을 동결 보존하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 우선 보존액에 침지한 세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치부 상에 적하하고, 필요에 따라, 그 세포 또는 그 조직의 주위에 부착되어 있는 여분의 보존액을 피펫 등에 의해 가능한 한 제거한다. 이 때, 그 동결 보존용 지그의 재치부가 보존액 흡수체를 갖는 경우에는, 상기 조작은 필요치 않으며, 자동적으로 여분의 보존액이 제거된다. 다음으로, 상기 세포 또는 상기 조직을 재치부에 유지시킨 채로 액체 질소 등 중에 침지함으로써, 세포 또는 조직을 동결할 수 있다. 이 때, 상기한 재치부 상의 세포 또는 조직을 외계와 차단할 수 있는 캡을 재치부에 장착하거나, 또는 동결 보존용 지그를 상기한 용기에 밀폐하여, 액체 질소 등 중에 침지할 수도 있다. 보존액은, 통상 난자, 배 등의 세포의 동결을 위해 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 상술한 인산 완충 생리 식염수 등의 생리적 용액에 내동제(글리세롤, 에틸렌글리콜 등)를 함유시킴으로써 얻어진 보존액이나, 글리세롤이나 에틸렌글리콜, DMSO(디메틸술폭시드) 등의 각종 내동제를 다량으로(적어도 보존액의 전 질량에 대해 10질량% 이상, 보다 바람직하게는 20질량% 이상) 포함하는 보존액을 사용할 수 있다. 융해 작업 시는, 액체 질소 등의 냉각 용매 중으로부터, 그 동결 보존용 지그를 빼내어, 동결된 세포 또는 조직을 올려놓은 재치부를 융해액 중에 침지시키고, 그 후, 세포 또는 조직을 회수한다.
본 발명의 동결 보존용 지그를 이용하여 동결 보존할 수 있는 세포로서, 예를 들면, 포유류(예를 들면, 사람, 소, 돼지, 말, 토끼, 랫트, 쥐 등)의 난자, 배, 정자 등의 생식 세포 ; 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 배성 줄기 세포(ES 세포) 등의 다능성 줄기 세포를 들 수 있다. 또, 초대 배양 세포, 계대 배양 세포, 및 세포주 세포 등의 배양 세포를 들 수 있다. 또, 세포는, 하나 또는 복수의 실시형태에 있어서, 섬유아세포, 췌장암·간암세포 등의 암 유래 세포, 상피세포, 혈관 내피세포, 림프관 내피세포, 신경세포, 연골세포, 조직 줄기 세포, 및 면역세포 등의 접착성 세포를 들 수 있다. 또한, 동결 보존할 수 있는 조직으로서, 동종 또는 이종의 세포로 이루어지는 조직, 예를 들면, 난소, 피부, 각막 상피, 치근막, 심근 등의 조직을 들 수 있다. 본 발명은, 특히 시트상 구조를 갖는 조직(예를 들면, 세포 시트, 피부 조직 등)의 동결 보존에 적합하다. 본 발명의 동결 보존용 지그는, 직접 생체에서 채취한 조직뿐만 아니라, 예를 들면, 생체 바깥에서 배양하여 증식시킨 배양 피부, 생체 바깥에서 구축한 이른바 세포 시트, 일본국 특허공개 2012-205516호 공보에서 제안되어 있는 삼차원 구조를 갖는 조직 모델과 같은 인공 조직의 동결 보존에 대해서도 적합하게 이용할 수 있다. 본 발명의 동결 보존용 지그는, 상기와 같은 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그로서 적합하게 이용된다.
이상, 본 발명의 동결 보존용 지그의 재치부에 대해 설명해 왔다. 본 발명의 동결 보존용 지그는, 재치부와 함께 파지부를 갖고 있어도 된다. 파지부를 가지면, 동결 보존 작업 시 및 융해 작업 시의 작업성이 양호해지므로 바람직하다.
도 1은 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 일례를 나타낸 전체 도이다. 도 1에 있어서 동결 보존용 지그(9a)는, 파지부(1)와 평면 시트상의 지지체(2) 상에 형성된 평면 시트상의 재치부(3)를 갖는다.
파지부(1)는 내액체 질소 소재인 것이 바람직하다. 이러한 소재로서는, 예를 들면 알루미늄, 철, 구리, 스테인리스 합금 등의 각종 금속, ABS 수지, 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌 수지, 불소계 수지나 각종 엔지니어 플라스틱, 또한 유리 등을 적합하게 이용할 수 있다. 도 1 중, 파지부(1)는 원주형이지만, 그 형상은 임의이다. 또, 후술하는 바와 같이, 세포 또는 조직을 직접 액체 질소에 접촉시키지 않거나, 또는 보호를 목적으로, 재치부(3)에 캡을 씌우는 경우가 있는데, 이 경우, 파지부(1)를, 재치부(3)를 갖지 않는 쪽으로부터, 재치부(3)를 갖는 쪽을 향해, 원기둥의 직경이 연속적으로 작아지는 형상으로 함으로써, 캡을 씌울 때의 작업성을 향상시키는 것도 가능하다.
도 1의 파지부(1)와 지지체(2)의 접속 방법에 대해 설명한다. 파지부(1)가 수지인 경우, 예를 들면, 성형 가공할 때에 인서트 성형에 의해 지지체(2)를 파지부(1)에 접속할 수 있다. 또한, 파지부(1)에 도시 생략의 구조체 삽입부를 제작하여 접착제로 지지체(2)를 접속할 수 있다. 접착제는 다양한 것을 사용할 수 있는데, 저온에 강한 실리콘계나 불소계의 접착제를 적합하게 이용할 수 있다.
도 2는, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 다른 일례를 나타낸 전체도이다. 도 2에 있어서 동결 보존용 지그(9b)는, 파지부(1)와 V자형 시트 상의 지지체(2), 또한 지지체(2) 상에 형성된 V자형 시트상의 재치부(3)를 갖는다. V자형 시트상의 재치부의 중심에 세포 또는 조직 및 보존액을 적하 부착함으로써, 피펫 등으로 여분의 보존액을 제거할 때의 작업성이 향상된다.
도 3은, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그의 다른 일례를 나타낸 전체도이다. 도 3에 있어서 동결 보존용 지그(9c)는, 파지부(1)와 곡률을 갖는 시트상의 지지체(2), 또한 지지체(2) 상에 형성된 곡률을 갖는 시트상의 재치부(3)를 갖는다. 도 2의 동결 보존용 지그와 동일하게, 곡률을 갖는 시트상의 재치부(3)의 중심에 세포 또는 조직 및 보존액을 적하 부착함으로써, 피펫 등으로 여분의 보존액을 제거할 때의 작업성이 향상된다.
도 4는, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 있어서의 재치부의 일례를 나타낸 단면 구조 개략도이다. 도 4 중의 재치부(3a)는, 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부(4)와, 보존액을 저류하는 오목부(5)를 갖는다.
도 5는, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 있어서의 재치부의 다른 일례를 나타낸 단면 구조 개략도이다. 도 5 중의 재치부(3b)는, 정점부가 평탄 형상인 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부(4)와, 보존액을 저류하는 오목부(5)를 갖는다. 이러한 구조에 있어서는, 재치하는 세포 또는 조직과의 접촉 면적이 증가하므로, 보다 확실하게 세포 또는 조직을 유지할 수 있다.
도 6은, 도 4에 나타낸 재치부에 있어서, 세포 및 보존액을 적하 부착했을 때의 모델도이다. 도 6 중, 재치부(3a)는 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부(4)와, 보존액을 저류하는 오목부(5)를 갖는다. 도 6 중에 나타낸 세포(6)는, 보존액(7)과 함께 재치부(3a) 상에 재치된다. 이 때, 세포(6)는 보존액(7)이 그 외주를 둘러싸고 있으며, 보존액(7)을 통해, 볼록부(4)에 의해 확실하게 유지된다. 또, 세포(6)의 외주에, 약간의 보존액(7)을 남긴 채로, 그 밖의 여분의 유리화액은 오목부(5)에 저류되어 있다.
도 7은, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 있어서의 재치부의 일례를 나타낸 사시도이다. 도 7에 나타낸 재치부(3c)는, 정점부가 평탄 형상인 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부(4)와, 보존액을 저류하는 오목부(5)를 갖는다. 재치부 전체적으로는, 라인 앤드 스페이스 형상(소위 스트라이프 형상)의 균일한 패턴을 갖고 있다.
도 8은, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 있어서의 재치부의 다른 일례를 나타낸 사시도이다. 도 8에 나타낸 재치부(3d)는, 재치부 전체적으로, 원기둥 형상(소위 필러 형상)의 구조체를 균일한 패턴으로서 갖는 구조이다. 정점부가 평탄 형상인 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부(4)와, 보존액을 저류하는 오목부(5)를 갖는다. 또한, 재치부 전체에서, 오목부(5)는 연결된 구조로 되어 있으며, 보다 많은 여분의 보존액을 저류할 수 있으므로, 동결 조작 시에, 세포 또는 조직을 재치부 상에 적하 부착할 때에, 보다 많은 보존액을 적하 부착하는 경우에도 대응할 수 있다.
도 9는, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 있어서의 재치부의 다른 일례를 나타낸 사시도이다. 도 9에 나타낸 재치부(3e)는, 재치부의 상면(세포 또는 조직을 재치하는 쪽)을 향해, 정상부를 갖는 대략 사각뿔 형상의 구조체를 재치부 전체에 균일한 패턴으로서 갖는 구조이다. 대략 사각뿔 형상의 볼록부(4)와, 보존액을 저류하는 오목부(5)를 갖는다. 1개의 볼록부 당, 세포 또는 조직이 접하는 면적이 작아지므로, 동결 후의 세포 또는 조직을 융해할 때에, 용이한 박리 및 회수가 가능해진다.
도 10은, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 있어서의 재치부의 다른 일례를 나타낸 사시도이다. 도 10에 나타낸 재치부(3f)는, 도 9와 동일하게, 재치부의 상면(세포 또는 조직을 재치하는 쪽)을 향해, 정상부를 갖는 대략 사각뿔 형상의 구조체를 재치부 전체에 균일한 패턴으로서 갖는 구조이며, 대략 사각뿔 형상의 볼록부(4)와, 보존액을 저류하는 오목부(5)를 갖는데, 도 9와 비교하여, 대략 사각뿔 형상의 구조체의 밀도가 낮아지고 있다. 이러한 구조이면, 도 9와 비교하여, 오목부(5)가 보다 많은 보존액을 저류할 수 있으므로, 동결 조작 시에, 세포 또는 조직을 재치부 상에 적하 부착할 때에, 보다 많은 보존액을 적하 부착하는 경우에도 대응할 수 있다.
도 11은, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 있어서의 재치부의 다른 일례를 나타낸 사시도이다. 도 11에 나타낸 재치부(3g)는, 원기둥 형상의 구조체를 가지며, 원기둥 형상의 볼록부(4)와, 보존액을 저류하는 오목부(5)를 갖는다. 원기둥 형상의 구조체는, 재치부의 영역마다 불균일한 패턴(랜덤인 패턴)을 갖는 일례이다.
도 12는, 본 발명의 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그가, 보존액 흡수체를 갖는 경우에 있어서의 재치부의 일례를 나타낸 단면 구조도이다. 도 12에 있어서 재치부(3h)는, 지지체(2) 상에 보존액 흡수체(8)를 갖는다. 그 보존액 흡수체(8)는, 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부(4)와, 보존액을 저류하는 오목부(5)를 갖는다. 재치부(3h)는, 동결 조작 시에, 세포 또는 조직을 보존액과 함께 적하 부착하면, 볼록부(4)에 의해 세포 또는 조직이 확실하게 유지되고, 오목부(5)에 보존액이 저류됨과 더불어, 세포 또는 조직 외주의 여분의 보존액이 보존액 흡수체(8)에 의해 제거되므로, 피펫 등으로의 여분의 보존액을 제거하는 조작을 필요로 하지 않으며, 급속한 유리화 동결을 행할 수 있다.
도 13은, 도 12 중에 나타낸 재치부에 있어서, 세포 및 보존액을 적하 부착했을 때의 모델도이다. 도 13 중, 보존액 흡수체(8)는 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부(4)와, 보존액을 저류하는 오목부(5)를 갖는다. 도 13 중에 나타낸 세포(6)는, 보존액(7)과 함께 보존액 흡수체(8) 상에 재치된다. 이 때, 세포(6)는 보존액(7)이 그 외주를 둘러싸고 있으며, 보존액(7)을 통해, 볼록부(4)에 의해 확실하게 유지된다. 또, 세포(6)의 외주에, 유리화 동결에 필수인 극히 약간의 보존액(7)을 남긴 채로, 그 밖의 여분의 보존액은 오목부(5)에 저류되는데, 보존액 흡수체(8)가 여분의 보존액(7)을 흡수하므로, 피펫 등으로의 여분의 보존액을 제거하는 조작을 필요로 하지 않으며, 급속한 유리화 동결을 행할 수 있다. 또한, 여분의 보존액을 보다 확실하게 제거할 수 있다.
[실시예]
이하에 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 나타내며, 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예에 있어서, 재치부에 형성한 볼록부의 높이 및 패턴 피치는, 레이저텍(주)제, 공초점 현미경 옵테릭스(등록 상표) C130를 사용하여 측정하였다.
(실시예 1)
비흡수체인 투명 PET 필름의 특정 영역에, 엠보스 프레스기에 의한 압열 전사 가공에 의해, 높이 5μm, 패턴 피치가 50μm인 사각뿔 형상이 균일하게 배치된 구조체를 제작하여, 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와 보존액을 저류하는 오목부를 갖는 재치부를 얻었다. 제작한 재치부의 영역을 포함하는 투명 PET 필름을 1.5mm×20mm의 장방형으로 재단하고, ABS제 파지부와 접합하여, 실시예 1의 동결 보존용 지그를 제작하였다.
(실시예 2)
비흡수체인 투명 PET 필름의 특정 영역에, 엠보스 프레스기에 의한 압열 전사 가공에 의해, 높이 1μm, 패턴 피치가 10μm인 육각기둥 형상이 균일하게 배치된 구조체를 제작하여, 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와 보존액을 저류하는 오목부를 갖는 재치부를 얻었다. 그 후, 실시예 1과 동일하게 하여, ABS제 파지부와 접합하여, 실시예 2의 동결 보존용 지그를 제작하였다.
(실시예 3)
보존액 흡수체로서, 어드밴텍 토요사제의 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체(세공 직경 0.2μm, 공극률 71%, 두께 35μm)를 이용하여, 그 보존액 흡수체 상에, 압열 전사 가공에 의해, 높이 5μm, 패턴 피치가 50μm인 사각뿔 형상이 균일하게 배치된 구조체를 제작하여, 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와 보존액을 저류하는 오목부를 갖는 재치부를 얻었다. 또, 지지체로서 투명 PET 필름을 이용하여, 그 지지체 상에, 접착층으로서, 헨켈 재팬사제의 핫멜트 우레탄 수지 Purmelt(등록 상표) QR 170-7141P를 건조 시의 고형분량이 30g/m2가 되도록 도포하였다. 접착층이 완전 경화되기 전에, 상기의 방법으로 압열 전사 가공이 이루어진 보존액 흡수체를, 그 보존액 흡수체의 표면 구조체를 갖지 않는 쪽의 면을, 지지체와 붙였다. 그 후, 제작한 재치부의 영역을 포함하는 보존액 흡수체와 지지체의 접합물을 1.5mm×20mm의 장방형으로 재단하고, ABS제 파지부와 접합하여, 실시예 3의 동결 보존용 지그를 제작하였다.
(실시예 4)
상기한 실시예 3과 동일하게 하여, 볼록부와 오목부로 이루어지는 구조체를 재치부 상에 갖는 보존액 흡수체와 지지체의 접합물을 얻었다. 그 후, 그 접합물에 대해, 수용성 고분자인 에틸렌옥사이드기를 갖는 폴리비닐알코올인 고세넥스(등록 상표) WO-320R의 2질량% 수용액을 딥 코팅하여, 실온 건조 후, 추가로 120℃로 40시간 가열 건조를 행하였다. 또한, 그 수용성 고분자의 도포량은 1.6g/m2였다. 그 후는, 수용성 고분자를 도포한 접합물을, 실시예 1과 동일하게 하여, 1.5mm×20mm의 장방형으로 재단하고, ABS제 파지부와 접합하여, 실시예 4의 동결 보존용 지그를 제작하였다.
(실시예 5)
압열 전사 가공에 의해, 높이 1μm, 패턴 피치가 50μm인 사각뿔 형상이 균일하게 배치된 구조체를 제작한 것 이외는, 실시예 4와 동일하게 하여, 실시예 5의 동결 보존용 지그를 제작하였다.
(비교예 1)
비흡수체인 투명 PET 필름에 대해 표면 가공을 행하지 않은 것 이외는, 실시예 1과 동일하게 하여, 비교예 1의 동결 보존용 지그를 제작하였다.
(비교예 2)
폴리테트라플루오로에틸렌 다공체에 대해 표면 가공을 행하지 않은 것 이외는, 실시예 3과 동일하게 하여, 비교예 2의 동결 보존용 지그를 제작하였다.
＜스피어의 조제＞
세포 또는 조직의 박리성의 평가에 이용하는 스피어는 이하와 같이 조제하였다. 쥐 배성 섬유아세포를 배양 샬레 상에서 배양 후, 트립신 처리에 의해 박리, 회수하였다. 그 후, 스미토모 베이크라이트(주)제 Prime Surface(등록 상표) 96U 플레이트에 50세포/웰의 세포수로 파종하여, 부유 배양함으로써 스피어 형성을 유도하였다. 배양 3일 후에 직경 약 100μm의 스피어를 얻었다.
＜스피어의 동결 작업과 동결 작업에 있어서의 조작성의 평가＞
상기 방법에 의해 조제한 스피어를 회수하여, 평형화액(7.5용량% 디메틸술폭시드, 7.5용량% 에틸렌글리콜, 85용량% 199배지(Medium199(GE 헬스케어사)))에 침지시켰다. 그 후, 스피어를 평형화액으로부터 회수하여, 유리화 보존액(상기 199배지를 기초액으로 하고, 그 기초액의 조성에 더하여, 15용량% 디메틸술폭시드, 15 용량% 에틸렌글리콜, 14용량% 소태아혈청, 0.5M 수크로오스를 함유시킨 용액)으로 옮긴 후에, 30초간 침지시켰다. 그 후, 스트리퍼 피페터(오리지오 재팬사)를 이용하여, 미량의 유리화 보존액(대략 0.4μl)과 함께 스피어를 회수하여, 실시예 1~5 및 비교예 1의 동결 보존용 지그의 재치부 상에 각각 적하 부착시켰다. 보존액 흡수체를 갖지 않는 실시예 1, 2 및 비교예 1의 동결 보존용 지그에 있어서는, 1개의 스피어를 미량의 유리화 보존액과 함께 재치부 상에 적하 부착시킨 후에, 투과형 현미경 관찰하에서, 스트리퍼 피페터를 이용하여, 스피어 주변으로부터 여분의 유리화 보존액을 가능한 한 제거하고, 그 후, 액체 질소 중에 침지하여, 재치부 상의 스피어를 유리화 동결시켰다. 한편, 보존액 흡수체를 갖는 실시예 3~5 및 비교예 2의 동결 보존용 지그에 있어서는, 1개의 스피어를 미량의 유리화 보존액과 함께 적하 부착시킨 후에, 투과형 현미경으로, 여분의 유리화 보존액이 자발적으로 흡수되는 상태를 관찰하면서, 스피어의 주변으로부터 여분의 유리화액이 제거된 것을 확인하고, 액체 질소 중에 침지하여, 재치부 상의 스피어를 유리화 동결시켰다. 동결시킨 동결 보존용 지그는, 융해할 때까지, 액체 질소 보존 용기 중에서 보관하였다.
상기 동결 작업 시의 조작성은 이하와 같았다. 보존액 흡수체를 갖지 않는 실시예 1 및 2의 동결 보존용 지그에 있어서는, 비교예 1과 비교하여, 스피어를 미량의 유리화 보존액과 함께 재치부 상에 적하 부착할 때에, 재치부 표면에, 유리화 보존액 및 스피어가 부착되기 쉽고, 스피어를 재치부 상에 적하 부착하는 작업이 용이하였다. 또, 여분의 유리화 보존액을 제거하는 작업에 있어서도, 실시예 1과 실시예 2의 동결 보존용 지그는, 재치부 상의 오목부에 유리화 보존액이 저류되어, 재치부 표면에 유리화 보존액이 부착되기 쉬우므로, 피펫 선단으로 여분의 유리화액을 늘이기 쉽고, 여분의 유리화액을 제거하는 것이 용이하였다. 한편, 보존액 흡수체를 갖는 실시예 3~5의 동결 보존용 지그에 있어서는, 비교예 2와 동일하게, 적하 부착할 때에는, 보존액 흡수체에 유리화 보존액이 흡수되므로, 재치부 표면으로의 부착 작업은 한결같이 용이하며, 또한, 피펫 등을 이용한 여분의 보존액을 제거하는 작업도 필요치 않아, 동결 작업에 있어서의 조작성은 한결같이 양호하였다.
＜스피어의 융해 작업과 박리성의 평가＞
스피어를 재치한 실시예 1~5 및 비교예 1, 2의 동결 보존용 지그를 액체 질소 중에서 빼내어, 온도 37℃의 융해액(상기 199배지를 기초액으로 하고, 그 기초액의 조성에 더하여, 1M 수크로오스를 함유시킨 용액)에 침지시켰다. 침지 후의 스피어의 상태를 투과형 광학 현미경으로 관찰하여, 스피어의 박리성에 대해 이하의 기준으로 평가하였다. 이들 결과를 표 1의 「세포 또는 조직의 박리성」의 항목에 나타낸다.
세포 또는 조직의 박리성은 이하의 기준으로 평가하였다.
◎ : 동결 보존용 지그를 융해액에 침지한 후, 파지부를 천천히 흔드는 정도로, 30초 미만에서, 스피어를 박리할 수 있었다.
○ : 동결 보존용 지그를 융해액에 침지한 후, 파지부를 천천히 흔드는 정도로, 30초~60초에서, 스피어를 박리할 수 있었다.
△ : 파지부를 천천히 흔드는 정도로는, 60초 이내에 스피어를 박리할 수 없었으므로, 파지부를 약간 강하게 흔들어, 스피어를 박리할 수 있었다.
× : 파지부를 천천히 흔드는 정도로는, 60초 이내에 스피어를 박리할 수 없으며, 그 후, 파지부를 약간 강하게 흔드는 조작에 있어서도, 스피어를 박리할 수 없었다.
[표 1]
Figure 112019124869914-pct00001
상기의 결과로부터, 본 발명의 동결 보존용 지그는, 동결 작업에 있어서, 세포 또는 조직을 재치부 상에 적하 부착할 때에, 세포 또는 조직 주변의 여분의 보존액을 제거하는 작업이 용이하고, 세포 또는 조직을 재치부 표면에 확실하게 유지할 수 있으며, 또한, 융해 작업에 있어서, 세포 또는 조직을 신속하게 회수할 수 있는 것을 알 수 있다.
(실시예 6)
폴리에틸렌테레프탈레이트 필름으로서, 도레이(주)제의 루미러(등록 상표) T60(두께 188μm, 전광선 투과율 91%)에, 도 14에 나타낸, 한 변의 길이가 50μm, 높이 30μm인 사각뿔 형상이 연속되어 형성된 암금형(13×12cm, 전체 두께 130μm)을, 사이토 엔지니어즈(주)제의 롤식 엠보싱 가공기, EMBOSTAR(상표 등록)를 이용하여 프레스 가공함으로써, 폴리에틸렌테레프탈레이트 필름의 한쪽의 면에 볼록부를 형성하였다. 이 기계는 갭을 조정 가능한 2개의 롤 간에 가공 대상물을 통과시킴으로써, 요철 가공을 실시하는 엠보싱 가공기이며, 롤 간 갭이나 가공 온도의 조정에 의해 대상물에 대한 가공 심도를 조정하는 것이 가능하다. 실시예 6에서는, 롤 간 갭을 320μm로 하였다. 또, 가공 시의 온도(롤 최표면, 접촉식의 온도계에 의해 측정)는 240℃으로 하였다. 상기의 조건으로 가공한 폴리에틸렌테레프탈레이트 필름 상에 형성한 볼록부의 높이는 5μm, 볼록부의 패턴 피치는 50μm였다. 얻어진 요철 가공 폴리에틸렌테레프탈레이트 필름을, 단변 1.5mm×장변 25.0mm의 장방형으로 재단하고, ABS 수지제의 파지부와 접합시켜, 도 1에 나타낸 형태로 실시예 6의 동결 보존용 지그를 제작하였다.
(실시예 7)
실시예 6에 있어서, 롤 간 갭을 310μm로 하여 프레스 가공한 것 이외는 동일한 방법으로, 실시예 7의 동결 보존용 지그를 제작하였다. 또한, 실시예 7에 있어서, 폴리에틸렌테레프탈레이트 필름 상에 형성한 볼록부의 높이는 14μm, 볼록부의 패턴 피치는 50μm였다.
(실시예 8)
실시예 6에 있어서, 롤 간 갭을 300μm로 하여 프레스 가공한 것 이외는 동일한 방법으로, 실시예 8의 동결 보존용 지그를 제작하였다. 또한, 실시예 8에 있어서, 폴리에틸렌테레프탈레이트 필름 상에 형성한 볼록부의 높이는 22μm, 볼록부의 패턴 피치는 50μm였다.
(실시예 9)
실시예 6에 있어서, 롤 간 갭을 290μm로 하여 프레스 가공한 것 이외는 동일한 방법으로, 실시예 9의 동결 보존용 지그를 제작하였다. 또한, 실시예 9에 있어서, 폴리에틸렌테레프탈레이트 필름 상에 형성한 볼록부의 높이는 27μm, 볼록부의 패턴 피치는 50μm였다.
(실시예 10)
도 15에 나타낸, 한 변의 길이가 50μm, 높이 60μm인 사각뿔 형상이 연속되어 형성된 암금형(13×12cm, 전체 두께 300μm)을 이용하여, 롤 간 갭을 450μm로 하여 프레스 가공한 것 이외는, 실시예 6과 동일한 방법으로, 실시예 10의 동결 보존용 지그를 제작하였다. 또한, 실시예 10에 있어서, 폴리에틸렌테레프탈레이트 필름 상에 형성한 볼록부의 높이는 46μm, 볼록부의 패턴 피치는 50μm였다.
(비교예 3)
폴리에틸렌테레프탈레이트 필름으로서, 도레이(주)제의 루미러(등록 상표) T60(두께 188μm)을 단변 1.5mm×장변 25.0mm의 장방형으로 재단하고, ABS 수지제의 파지부와 접합시켜, 도 1에 나타낸 형태로 비교예 3의 동결 보존용 지그를 제작하였다.
＜쥐 난자의 동결 조작＞
직경이 100μm인 쥐 난자를, 액체의 온도가 15℃인 Irvine Scientific사제 Vit Kit 평형액에 침지시켰다. 다음으로, 평형액 침지 후의 쥐 난자를, 액체의 온도가 4℃인 Irvine Scientific사제 Vit Kit 유리화액에 침지시켰다. 90초간 유리화액에 침지 후, 쥐 난자 1개를 투과형 현미경 관찰하에서, 동결 보존용 지그(실시예 6~10, 비교예 3)의 재치부 상에, 피펫을 이용하여 재치하였다. 이 때, 재치부에 존재하는 여분의 유리화액은, 피펫 조작에 의해 제거하였다. 그 후, 액체 질소 중에 상기 동결 보존용 지그를 침지하여, 유리화 동결시켰다. 동결 후의 동결 보존용 지그는, 액체 질소 보존 용기 중에서 보관하였다.
＜쥐 난자의 융해 작업과 박리성의 평가＞
쥐 난자를 재치한 동결 보존용 지그(실시예 6~10, 비교예 3)를, 액체 질소 중에서 빼내어, 온도 37℃의 Irvine Scientific사제 Vit Kit 융해액에 침지시켰다. 융해액 중에서, 쥐 난자가 동결 보존용 지그의 재치부로부터 박리되는 상태를, 투과형 광학 현미경으로 관찰하여, 이하의 기준으로 평가하였다. 이들 평가 결과를 표 2에 나타낸다.
◎ : 동결 보존용 지그를 융해액에 침지했을 때에, 파지부를 천천히 흔들면 30초 미만에서 쥐 난자를 박리할 수 있었다.
○ : 동결 보존용 지그를 융해액에 침지했을 때에, 파지부를 천천히 흔들면 30~60초의 사이에 쥐 난자를 박리할 수 있었다.
△ : 동결 보존용 지그를 융해액에 침지했을 때에, 파지부를 천천히 흔들어도 박리할 수 없으며, 강하게 흔들면 쥐 난자를 박리할 수 있었다.
× : 동결 보존용 지그를 융해액에 침지했을 때에, 파지부를 천천히 흔들어도, 강하게 흔들어도 쥐 난자를 박리할 수 없었다.
[표 2]
Figure 112019124869914-pct00002
＜스피어의 조제＞
세포 또는 조직의 박리성의 평가에 이용하는 스피어는 이하와 같이 조제하였다. 쥐 배성 섬유아세포를 배양 샬레 상에서 배양 후, 트립신 처리에 의해 박리, 회수하였다. 그 후, 스미토모 베이크라이트(주)제 Prime Surface(등록 상표) 96U 플레이트에 50세포/웰의 세포수로 파종하여, 부유 배양함으로써 스피어 형성을 유도하였다. 배양 약 40시간 후에 직경 50μm의 스피어를 얻었다.
＜스피어의 동결 작업＞
직경이 50μm인 스피어를, 액체의 온도가 15℃인 Irvine Scientific사제 Vit Kit 평형액에 침지시켰다. 다음으로, 평형액 침지 후의 스피어를, 액체의 온도가 4℃인 Irvine Scientific사제 Vit Kit(상표 등록) 유리화액에 침지시켰다. 90초간 유리화액에 침지 후, 1개의 스피어를 투과형 현미경 관찰하에서, 동결 보존용 지그(실시예 6~10, 비교예 3)의 재치부 상에, 피펫을 이용하여 재치하였다. 이 때, 재치부에 존재하는 여분의 유리화액은, 피펫 조작에 의해 제거하였다. 그 후, 액체 질소 중에 상기 동결 보존용 지그를 침지하여, 유리화 동결시켰다. 동결 후의 동결 보존용 지그는, 액체 질소 보존 용기 중에서 보관하였다.
＜스피어의 융해 작업과 박리성의 평가＞
스피어를 재치한 동결 보존용 지그(실시예 6~10, 비교예 3)를, 액체 질소 중에서 빼내어, 온도 37℃의 Irvine Scientific사제 Vit Kit 융해액에 침지시켰다. 융해액 중에서, 스피어가 동결 보존용 지그로부터 박리되는 상태를, 투과형 광학 현미경으로 관찰하여, 앞서 기재한 박리성 평가와 동일한 기준으로 평가하였다. 이들 평가 결과를 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure 112019124869914-pct00003
(실시예 11)
어드밴텍 토요(주)제의 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체(세공 직경 0.2μm, 공극률 71%, 두께 35μm)를 20cm×10cm의 장방형으로 작두 커터를 이용하여 재단하고, 다음으로, 재단 후의 다공체를, 두께 300μm의 폴리카보네이트 필름 상에 재치하였다. 폴리카보네이트 필름 상에 재치한 다공체 상에, 도 14에 나타낸, 한 변의 길이가 50μm, 높이 30μm인 사각뿔 형상이 연속되어 형성된 암금형(13×12cm, 전체 두께 130μm)을 재치하고, 롤 간 갭 510μm, 가공 시의 온도 40℃의 조건으로, 다공체에 요철 가공을 실시하였다. 한편으로, 지지체로서, 이(易)접착 처리된 폴리에틸렌테레프탈레이트 필름인 도레이(주)제의 루미러(등록 상표) T60(두께 188μm)에 접착층으로서, 헨켈 재팬(주)제의 핫멜트 우레탄 수지 Purmelt(등록 상표) QR 170-7141P를, 건조 시의 고형분량이 30g/m2가 되도록 도포하였다. 그 후, 요철 가공한 다공체로부터 폴리카보네이트 필름, 금형을 제거하고, 다공체의 비요철 가공면을, 폴리에틸렌테레프탈레이트 필름의 접착층 도포면과, 접착층이 완전 경화되기 전에 붙였다. 얻어진 접합체를, 단변 1.5mm×장변 25.0mm의 장방형으로 재단하고, ABS 수지제의 파지부와 접합시켜, 실시예 11의 동결 보존용 지그를 제작하였다. 또한, 실시예 11에 있어서, 다공체 상에 형성한 볼록부의 높이는 3μm, 볼록부의 패턴 피치는 50μm였다.
(실시예 12)
실시예 11에 있어서, 롤 간 갭을 490μm로 하여 프레스 가공한 것 이외는 동일한 방법으로, 실시예 12의 동결 보존용 지그를 제작하였다. 또한, 실시예 12에 있어서, 다공체 상에 형성한 볼록부의 높이는 5μm, 볼록부의 패턴 피치는 50μm였다.
(실시예 13)
실시예 11에 있어서, 롤 간 갭을 470μm로 하여 프레스 가공한 것 이외는 동일한 방법으로, 실시예 13의 동결 보존용 지그를 제작하였다. 또한, 실시예 13에 있어서, 다공체 상에 형성한 볼록부의 높이는 9μm, 볼록부의 패턴 피치는 50μm였다.
(실시예 14)
실시예 11에 있어서, 롤 간 갭을 450μm로 하여 프레스 가공한 것 이외는 동일한 방법으로, 실시예 14의 동결 보존용 지그를 제작하였다. 또한, 실시예 14에 있어서, 다공체 상에 형성한 볼록부의 높이는 12μm, 볼록부의 패턴 피치는 50μm였다.
(실시예 15)
실시예 11에 있어서, 롤 간 갭을 430μm로 하여 프레스 가공한 것 이외는 동일한 방법으로, 실시예 15의 동결 보존용 지그를 제작하였다. 또한, 실시예 15에 있어서, 다공체 상에 형성한 볼록부의 높이를 전자 현미경에 의해 관찰한 바, 볼록부의 높이는 16μm, 볼록부의 패턴 피치는 50μm였다.
(실시예 16)
실시예 11에 있어서, 도 16에 나타낸 직경 1.4~2.0μm의 원기둥 형상이, 패턴 피치 2.7~3.3μm로 연속되어 형성된 암금형(외형 13×13cm(패턴 형성부의 면적 7×7cm), 전체 두께 190μm)을 이용하여, 롤 간 갭을 540μm로 하여 프레스 가공한 것 이외는 동일한 가공을 행하여, 실시예 16의 동결 보존용 지그를 제작하였다. 또한, 실시예 16에 있어서, 다공체 상에 형성한 볼록부의 높이는 1.2μm, 볼록부의 패턴 피치는 3.0μm였다.
(실시예 17)
실시예 16에 있어서, 도 16에 나타낸 암금형을 대신하여, 도 17에 나타낸, 직경 1.4~2.0μm의 원기둥 형상이, 패턴 피치 2.7~3.3μm로 연속되어 형성된 수금형(외형 13×13cm(패턴 형성부의 면적 7×7cm), 전체 두께 190μm)을 이용하여, 프레스 가공한 것 이외는 동일한 가공을 행하여, 실시예 17의 동결 보존용 지그를 제작하였다. 또한, 실시예 17에 있어서, 다공체 상에 형성한 볼록부의 높이는 1.1μm, 볼록부의 패턴 피치는 3.0μm였다.
(실시예 18)
실시예 11에서 얻은 동결 보존용 지그의 재치부에, 가용성층을 형성하는 것 이외는 동일한 방법으로, 실시예 18의 동결 보존용 지그를 제작하였다. 또한, 가용성층은, 접합체를 일본 합성화학공업(주)제의 고세넥스(등록 상표) WO-320R(비누화도 88.3mol%)의 2질량% 수용액에 딥 코팅하여, 실온 건조 후, 120℃로 40시간 가열 처리를 행함으로써 형성하였다. 또한, 실시예 18에 있어서, 다공체 상에 형성한 볼록부의 높이는 2.9μm, 볼록부의 패턴 피치는 50μm였다.
(실시예 19)
실시예 18과 동일하게 하여, 실시예 12에서 얻은 동결 보존용 지그의 재치부에 가용성층을 형성하여, 실시예 19의 동결 보존용 지그를 제작하였다. 또한, 실시예 19에 있어서, 다공체 상에 형성한 볼록부의 높이는 4.9μm, 볼록부의 패턴 피치는 50μm였다.
(비교예 4)
볼록부를 형성하고 있지 않은 어드밴텍 토요(주)제의 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체를 재치부로서 이용하는 것 이외는, 실시예 11과 동일하게 하여, 비교예 4의 동결 보존용 지그를 제작하였다.
앞서 기재한, 직경이 100μm인 쥐 난자를 이용한 세포 또는 조직의 박리성 평가와 동일한 방법 및 기준으로, 세포 또는 조직의 박리성을 평가하였다. 이 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure 112019124869914-pct00004
표 2~4의 결과로부터, 본 발명에 의해, 융해 조작 시에 세포 또는 조직을 용이하게 박리하는 것이 가능한 우수한 박리성이 얻어지는 것을 알 수 있다.
(실시예 20)
지지체로서 이접착 처리된 투명 PET 필름(전광선 투과율 91%, 헤이즈값 5.5%)을 이용하여, 그 지지체 상에 접착층으로서, 헨켈 재팬(주)제의 핫멜트 우레탄 수지 Purmelt(등록 상표) QR 170-7141P를 건조 시의 고형분량이 30g/m2가 되도록 도포하였다. 접착층이 완전 경화되기 전에, 하기의 방법으로 한쪽 면을 조면화한 보존액 흡수체의 조면화되어 있지 않은 쪽의 면을, 그 접착층에 붙였다.
한쪽 면을 조면화한 보존액 흡수체는, 어드밴텍 토요(주)사제의 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체(세공 직경 0.2μm, 공극률 71%, 두께 35μm)에 대해, 한 변의 길이가 50μm이고, 높이가 25μm인 사각뿔이 격자형으로 배치된 표면을 갖는 미세 금형을, 4cm×8cm의 범위에 있어서, 면압 1.64kN, 온도 120℃, 가압 및 가온 시간 2분간의 조건으로, 엠보싱 프레스기에 의해 압열 전사 가공함으로써 얻었다. 얻어진 볼록부와 오목부를 갖는 보존액 흡수체의 표면에, (주)쿠라레제의 PVA103(비누화도 98.5mol%)의 2질량% 수용액을 딥 코팅하여, 실온 건조 후, 120℃로 40시간 가열 처리를 행하여 가용성층을 형성하였다. 재치부 표면의 Ra를, (주)도쿄 정밀제의 서프컴(등록 상표) 1400D에 의해 측정한 바, 1.69μm였다. 또, 가용성층의 고형분량은, 1.6g/m2였다. 또한, 지지체 상에 형성된 재치부의 크기는 1.5mm×5mm이며, 그 후 ABS 수지제의 파지부와 지지체와 접합시켜, 도 1에 나타낸 형태로 실시예 20의 동결 보존용 지그를 제작하였다.
(실시예 21)
실시예 20의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 조면화한 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체 상에 가용성층을 형성하지 않은 것 이외는 실시예 20과 동일하게 하여, 실시예 21의 동결 보존용 지그를 제작하였다. 또한, 재치부 표면의 Ra를 (주)토쿄 정밀제의 서프컴(등록 상표) 1400D에 의해 측정한 바, 2.20μm였다.
(실시예 22)
실시예 20의 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 압열 전사 시의 면압을 2.87kN으로 높여 동결 보존용 지그를 제작하여, 실시예 22로 하였다. 또한, 재치부 표면의 Ra를 (주)토쿄 정밀제의 서프컴(등록 상표) 1400D에 의해 측정한 바, 3.12μm였다.
＜쥐 배의 동결 작업＞
직경이 약 100μm인 쥐 배를 액체의 온도가 4℃인 보존액(15용량% DMSO(디메틸술폭시드), 15용량% 에틸렌글리콜, 14용량% 소태아혈청, 56용량% 수정 인산 완충액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.9mM CaCl2·H2O, 0.5mM MgCl2·6H2O, 1.5mM KH2PO4, 8mM Na2HPO4, 5.6mM 글루코오스, 0.3mM 피루브산 Na, 65μg/ml 황산디베카신, 1mg/ml 폴리비닐피롤리돈, 14.8mM L-proline, 200mM 트레할로오스, 0.5M 수크로오스)에 침지시켰다. 30초간의 보존액으로의 침지 후, 1개의 쥐 배를, 제작한 동결 보존용 지그의 재치부 상에 재치하고, 투과형 현미경 관찰하에서, 피펫을 이용하여 쥐 배 주변의 여분의 보존액을 가능한 한 제거하였다. 그 후, 액체 질소 중에 침지하여, 유리화 동결시켰다. 동결시킨 동결 보존용 지그는, 융해할 때까지, 액체 질소 보존 용기 중에서 보관하였다.
＜쥐 배의 융해 작업과 박리성의 평가＞
쥐 배를 재치한 동결 보존용 지그를 액체 질소 중에서 빼내어, 온도 37℃의 융해액(상기 수정 인산 완충액에 1M 수크로오스를 첨가한 용액)에 침지시켰다. 침지 후의 쥐 배의 상태를 투과형 광학 현미경으로 관찰하여, 융해 시의 쥐 배의 박리성에 대해 이하의 기준으로 평가하였다. 이들 결과를 표 5의 「세포 또는 조직의 박리성」의 항목에 나타낸다.
또한, 상기한 쥐 배의 동결 작업, 및 상기한 쥐 배의 융해 작업과 박리성의 평가에 사용한 동결 보존용 지그의 재치부 상에 형성된 볼록부의 피치는, 실시예 20~22의 어느 것에 있어서나 50μm였다.
세포 또는 조직의 박리성은 이하의 기준으로 평가하였다.
◎ : 동결 보존용 지그를 융해액에 침지했을 때에, 파지부를 흔들면서 쥐 배를 박리할 수 있었다(박리에 요한 시간은 20초 미만).
○ : 동결 보존용 지그를 융해액에 침지했을 때에, 파지부를 흔들면서 쥐 배를 박리할 수 있었다(박리에 요한 시간은 20초 이상 40초 미만).
△ : 동결 보존용 지그를 융해액에 침지했을 때에, 파지부를 흔들면서 쥐 배를 박리하는데, 40초 이상~60초 미만을 요하였다.
× : 파지부를 흔드는 것으로는, 60초 이내에 쥐 배를 박리할 수 없었다.
[표 5]
Figure 112019124869914-pct00005
표 5의 결과로부터, 본 발명의 동결 보존용 지그는 융해 시에 우수한 박리성을 나타내는 것을 알 수 있다.
[산업상의 이용 가능성]
본 발명은, 소 등의 가축이나 동물의 배 이식이나 인공 수정, 사람으로의 인공 수정 등 외에, iPS 세포, ES 세포, 일반적으로 이용되고 있는 배양 세포, 배 또는 난자를 포함하는 생체에서 채취한 검사용 또는 이식용의 세포 또는 조직, 생체 바깥에서 배양한 세포 또는 조직 등의 동결 보존에 이용할 수 있다.
1 : 파지부
2 : 지지체
3, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 3h : 재치부
4 : 볼록부
5 : 오목부
6 : 세포
7 : 보존액
8 : 보존액 흡수체
9, 9a, 9b, 9c : 동결 보존용 지그

Claims (4)

  1. 세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치(載置)하는 재치부를 갖는 동결 보존용 지그로서, 그 재치부 표면이 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와, 보존액을 저류 하는 오목부를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기한 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부의 높이가, 세포 또는 조직의 평균 직경의 1/100 이상 1/2 미만인 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기한 세포 또는 조직을 보존액과 함께 재치하는 재치부 표면의 산술 평균 거칠기 Ra가 1.0μm 이상인 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기한 재치부가 보존액 흡수체를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그.
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