KR101988140B1 - 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 세포 또는 조직의 유리화 동결 작업을 용이하게 또한 확실하게 행하는 것이 가능한, 유리화 동결 보존용 지그를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그는, 지지체 상에, 접착층과 유리화액 흡수층을 적어도 이 순서대로 갖는 유리화액 흡수체를 갖고, 상기 유리화액 흡수층의 세포 또는 조직을 올려놓는 부분과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분을 갖는 것을 특징으로 한다.

Description

세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그{JIG FOR VITRIFICATION PRESERVATION OF CELLS OR TISSUES}
본 발명은, 생물의 세포 또는 조직 등을 동결 보존할 때에 사용하는 유리화 동결 보존용 지그에 관한 것이다.
생물의 세포 또는 조직의 뛰어난 보존 기술은, 다양한 산업 분야에서 요구되고 있다. 예를 들면, 소의 배아 이식 기술에 이용되는 배아는, 대리모 소의 발정 주기에 맞춰 이식이 행해지고 있고, 발정 주기에 배아의 이식을 맞추기 위해서, 배아를 동결 보존해, 발정 주기에 맞춰 배아를 융해하여 이식하는 것이 행해지고 있다. 또, 인간의 불임 치료에 있어서는, 모체로부터 난자 또는 난소를 채취 후, 이식에 적합한 타이밍에 맞추기 위해서 동결 보존해두고, 이식시에 융해하여 이용하는 것이 이루어지고 있다.
일반적으로, 생체 내로부터 채취된 세포 또는 조직은, 설령 배양액 중이어도, 차츰 활성이 사라져가므로, 생체 외에서의 세포 또는 조직의 장기간의 배양은 바람직하지 않다. 그 때문에, 생체 활성을 사라지게 하지 않고 장기간 보존하기 위한 기술이 중요하다. 뛰어난 보존 기술에 의해서, 채취된 세포 또는 조직을 보다 정확하게 분석하는 것이 가능해진다. 또 뛰어난 보존 기술에 의해서, 보다 높은 생체 활성을 유지한 채로 세포 또는 조직을 이식에 이용하는 것이 가능해져, 이식 후의 생착률이 향상되는 것을 기대할 수 있다. 또한, 생체 외에서 배양한 배양 피부, 생체 외에서 구축한, 소위 세포 시트와 같은 이식을 위한 인공 조직을, 순차적으로 생산하여 보존해두고, 필요시에 사용하는 일도 가능해져, 의료면뿐만 아니라, 산업면에 있어서도 큰 이점을 기대할 수 있다.
세포 또는 조직의 보존 방법으로서, 예를 들면 완만 동결법이 알려져 있다. 이 방법에서는, 우선, 예를 들면 인산 완충 생리 식염수 등의 생리적 용액에 내동제를 함유시킴으로써 얻어진 보존액에, 세포 또는 조직을 침지한다. 상기 내동제로는, 글리세롤, 에틸렌글리콜 등의 화합물이 이용된다. 상기 보존액에, 세포 또는 조직을 침지 후, 비교적 늦은 냉각 속도(예를 들면 0.3~0.5℃／분의 속도)로, -30~-35℃까지 냉각함으로써, 세포 내외 또는 조직 내외의 용액이 충분히 냉각되어, 점성이 높아진다. 이러한 상태에서, 상기 보존액 중의 세포 또는 조직을 또한 액체질소의 온도(-196℃)까지 냉각하면, 세포 내 또는 조직 내와 그 밖의 주위의 미소 용액이 모두 비결정인 채로 고체가 되는 유리화가 일어난다. 유리화에 의해, 세포 내외 또는 조직 내외가 고체화되면, 실질적으로 분자의 움직임이 없어지므로, 유리화된 세포 또는 조직을 액체질소 중에 보존함으로써, 반영구적으로 보존할 수 있다고 생각된다.
그러나, 상기 완만 동결법에서는, 비교적 늦은 냉각 속도로 냉각할 필요가 있기 때문에, 동결 보존을 위한 조작에 시간을 필요로 한다. 또, 온도 제어를 하기 위한 장치 또는 지그를 필요로 하는 문제가 있다. 게다가, 상기 완만 동결법에서는, 세포 외 또는 조직 외의 보존액 중에 빙정이 형성되므로, 세포 또는 조직이 그 빙정에 의해 물리적으로 손해를 받을 우려가 있다.
상기 완만 동결법에서의 문제점을 해결하기 위한 방법으로서, 유리화 보존법이 제안되고 있다. 유리화 보존법이란, 글리세롤, 에틸렌글리콜, DMSO(디메틸술폭시드) 등의 내동제를 다량으로 포함하는 수용액의 응고점 강하에 의해, 빙정하에서도 빙정이 생기기 어려워지는 원리를 이용한 것이다. 이 수용액을 급속하게 액체질소 중에서 냉각시키면 빙정을 생기게끔 하지 않은 채로 고체화시킬 수 있다. 이와 같이 고체화하는 것을 유리화 동결이라고 한다. 또, 내동제를 다량으로 포함하는 수용액을 유리화액이라고 한다.
상기 유리화법의 구체적인 조작으로는, 유리화액에 세포 또는 조직을 침지시키고, 그 후, 액체질소의 온도(-196℃)에서 냉각한다. 유리화법은, 이와 같이 간편하고 또한 신속한 공정이므로, 동결 보존을 위한 조작에 긴 시간을 필요로 하지 않는 것 외에, 온도 제어를 하기 위한 장치 또는 지그를 필요로 하지 않는다는 이점이 있다.
유리화 보존법을 이용하면, 세포 내외의 어디에도 빙정이 생기지 않기 때문에 동결시 및 융해시의 세포로의 물리적 장해(동해)를 회피할 수 있지만, 유리화액에 포함되는 고농도의 내동제에는 화학적 독성이 있다. 이 때문에, 세포 또는 조직의 동결 보존시에는 세포 또는 조직 주위에 존재하는 유리화액이 적은 것이 바람직하고, 세포가 유리화액에 폭로되는 시간, 요컨대 동결까지의 시간이 단시간인 것이 바람직하다. 또한, 해동 후 즉시 유리화액을 희석할 필요가 있다.
유리화 보존법을 이용한 세포 또는 조직의 동결 보존에 대해서는, 다양한 방법으로, 다양한 종류의 세포 또는 조직을 이용한 예가 나타나 있다. 예를 들면, 특허 문헌 1에서는, 동물 또는 인간의 생식 세포 또는 체세포로의 유리화 보존법의 적용이 동결 보존 및 융해 후의 생존률의 점에서, 매우 유용하다고 나타나 있다.
유리화 보존법은, 주로 인간의 생식 세포를 이용하여 발전해 온 기술이지만, 최근에는, iPS 세포나 ES 세포로의 응용도 널리 검토되고 있다. 또, 비특허 문헌 1에서는, 초파리의 배아의 보존에 유리화 보존법이 유효했음이 나타나 있다. 또한, 특허 문헌 2에서는, 식물 배양 세포나 조직의 보존에 있어서, 유리화 보존법이 유효하다고 나타나 있다. 이와 같이, 유리화법은 널리 다양한 종의 세포 및 조직의 보존에 유용하다고 알려져 있다.
유리화 보존법을 보다 효율적으로 행하기 위한 지그 및 조작 방법으로는, 특허 문헌 3 등에서는, 스트로에 유리화액을 충만시킨 가운데 난자 또는 배아를 유리화 동결 보존시키고, 해동시에 재빠르게 희석액과 접촉시켜 재생률을 향상시키는 시도가 이루어지고 있다.
특허 문헌 4에서는, 난자 또는 배아를 유리화액과 함께 유리화 보존용 제거재 위에 올려놓고, 하부로부터 흡인함으로써 난자 또는 배아의 주위에 부착된 여분의 유리화액을 제거해, 뛰어난 생존율로 동결 보존시키는 방법이 제안되어 있다. 또한, 유리화 보존용 제거재로는, 금망, 종이 등의 천연물이나 합성 수지로 이루어지는 필름형상물이며 관통 구멍을 가진 것이 기재되어 있다.
특허 문헌 5에서는 난자 또는 배아의 주위에 부착된 여분의 유리화액을 여과지 등의 흡수체에 의해 흡수시킴으로써, 뛰어난 생존률로 동결 보존시키는 방법이 제안되어 있다.
특허 문헌 6, 특허 문헌 7에서는, 인간의 불임 치료 분야에서 사용되고 있는 소위 Cryotop법이라는 방법으로, 난자 부착 유지용 스트립으로서 직사각형의 가요성 또한 무색 투명한 필름을 사용한 난자 동결 보존 용구를 사용하여, 상기 필름 상에 극소량의 유리화액과 함께 난자 또는 배아를 현미경하에서 부착시키고, 동결 보존하는 방법이 제안되고 있다.
특허 문헌 8에서는, 유리화법에 의한 동결 세포 시트의 제조 방법이 제안되어 있고, 메시 형상의 그물 등으로 이루어지는 베이스 위에, 운반 보조막(재질이 주로 셀룰로오스로 이루어지는 시트인 CellSeed Inc.사 제조 Cell Shifter 또는 PVDF막)과 함께 세포 시트를 올려놓고, 여분의 유리화액을 빨아들이거나 혹은 떨어뜨린 후에, 세포 시트를 동결 보존하는 방법이 기재되어 있다.
일본국 특허 제3044323호 공보 일본국 특허 공개 2008-5846호 공보 일본국 특허 공개 평10-248860호 공보 국제 공개 제2011/070973호 팜플렛 일본국 특허 공개 2005-40073호 공보 일본국 특허 공개 2002-315573호 공보 일본국 특허 공개 2006-271395호 공보 일본국 특허 공개 2013-111017호 공보
Steponkus et al., Nature 345:170~172(1990)
특허 문헌 3에서 제안되어 있는 방법은, 스트로 안에 유리화액을 충만시키기 때문에, 동결까지의 시간이 길다는 문제가 있다. 또, 동결 보존할 수 있는 세포 또는 조직의 크기는 스트로의 내경에 제한되기 때문에, 다수의 세포나 세포 시트와 같은 시트 형상의 조직을 보존하는 것은 곤란하다.
특허 문헌 4에서 제안되고 있는 방법은, 난자 또는 배아의 주위에 부착된 여분의 유리화액을 제거함으로써, 뛰어난 생존률로 이들 생식 세포를 동결 보존 시키는 방법을 제안하고 있다. 그러나, 상기 공보에 기재된 방법에서는, 여분의 유리화액을 제거할 때, 하부로부터의 흡인 조작을 필요로 하므로, 번잡한 조작이 되어, 단시간에 유리화 동결 보존 조작을 행하는 경우에는 적합하지 않다. 또한, 하부로부터의 흡인이 불충분하면 여분의 유리화액이 잔존하는 문제가 있다.
특허 문헌 5에서는, 난자 또는 배아의 주위에 부착된 여분의 유리화액을 여과지 등의 흡수체에 흡수시킴으로써, 뛰어난 생존률로 이들 생식 세포를 동결 보존시키는 방법을 제안하고 있다. 그러나, 세포들이 겹쳐지는 세포의 집단이나 조직의 유리화 보존에 이용하는 경우, 비교적 다량의 유리화액이 사용되기 때문에, 흡수체의 강도가 부족해, 자립성이 부족하고 작업성이 현저하게 저하되는 문제가 있다.
특허 문헌 6, 특허 문헌 7에서 제안되고 있는 방법에서는, 난자 또는 배아를 올려놓는 필름의 폭을 제한함으로써, 적은 양의 유리화액과 함께 난자 또는 배아를 동결 보존하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법에서는, 작업자의 조작에 의해서, 극소량의 유리화액과 함께, 난자 또는 배아를 필름 상에 올려놓는데, 조작의 난이도가 높다는 문제가 있었다. 이 방법을 기초로 한 cryotop법에서는, 보다 적은 양의 유리화액과 함께 난자 또는 배아를 동결 보존하기 위해서, 한번 유리화액과 함께 난자 또는 배아를 필름 상에 올려놓은 후에, 여분의 유리화액을 흡인하여 필름 상으로부터 제거한다는 번잡한 조작이 되기도 한다. 또, 예를 들면, 세포 시트와 같은 시트 형상으로 대면적을 갖는 조직의 동결 보존에 대한 적용에는 적합하지 않다.
특허 문헌 8에는, 예를 들면, 유리판, 금속판, 메시 형상의 그물, 부직포 등의 베이스 위에, 운반 보조막(CellSeed Inc.사 제조 Cell Shifter 또는 폴리불화비닐리덴(PVDF)막)과 함께 세포 시트를 올려놓고, 여분의 유리화액을 빨아들이거나 혹은 떨어뜨린 후에, 동결 보존하는 방법이 기재되어 있는데, 세포 또는 조직과 함께 떨어뜨려지는 유리화액의 양이 많은 경우에는, 유리화액의 흡수 속도가 충분하지 않기 때문에, 여분의 유리화액이 잔존하는 문제가 있다. 또한, 통상, Cell Shifter나 PVDF막은, 막형상의 구조체이며, 자립성이 부족하므로, 동결 조작, 융해 조작을 용이하게 하는 것이 곤란하다.
본 발명은, 세포 또는 조직의 동결 보존 작업을 용이하게 또한 확실하게 행하는 것이 가능한, 유리화 동결 보존용 지그를 제공하는 것을 주된 과제로 한다. 보다 구체적으로는, 세포 또는 조직을 유리화액에 침지하고, 세포 또는 조직을 유리화액과 함께 상기 유리화 동결 보존용 지그에 올려놓을 때에, 여분의 유리화액을 흡수하기 위한 뛰어난 흡수 성능을 구비한 유리화 동결 보존용 지그를 제공하는 것을 첫번째 과제로 한다. 또, 상기한 유리화액의 뛰어난 흡수 성능에 추가해, 또한 유리화액과 함께 상기 유리화 동결 보존용 지그에 올려놓아진 세포 또는 조직을 투과형의 현미경으로 관찰할 수 있는, 뛰어난 시인성(視認性)을 갖는 유리화 동결 보존용 지그를 제공하는 것을 두번째 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 이하의 구성을 갖는 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그(본 명세서 중, 「세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그」를, 단순히 「유리화 동결 보존용 지그」라고도 한다)에 의해서, 상기 과제를 해결할 수 있음을 발견했다.
(1) 지지체 상에, 접착층과 유리화액 흡수층을 적어도 이 순서대로 갖는 유리화액 흡수체를 갖고, 상기 유리화액 흡수층의 세포 또는 조직을 올려놓는 부분과 지지체 사이에, 접착층이 존재하지 않는 부분을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그.
(2) 상기 지지체가 광투과성 지지체이며, 상기 유리화액 흡수층이, 다공성 수지 시트, 다공성 금속 산화물 시트, 및, 밀도가 0.12~0.3g/cm3이며 평량이 10~100g/m2인 종이 또는 부직포 중에서 선택되는 어느 1종인 것을 특징으로 하는 (1)에 기재된 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그.
상기 (1)의 발명에 의하면, 유리화액에 침지시킨 세포 또는 조직을 유리화액과 함께 유리화액 흡수체 상에 올려놓을 때, 유리화액 흡수체가 세포 또는 조직의 외주에 부착된 여분의 유리화액을 흡수하므로, 여분의 유리화액을 제거하기 위한 그 밖의 조작(예를 들면, 유리화액 흡수체 하부로부터의 흡인 제거 조작이나, 마이크로피펫 등을 이용한 세포 또는 조직 주위로부터의 직접적인 흡인 제거 조작)을 특별히 필요로 하지 않고, 세포 또는 조직의 동결 보존 작업이 용이하고 또한 간편하게 행하는 것이 가능한, 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그를 제공할 수 있다. 또, 상기 (2)의 발명에 의하면, 상기한 효과에 추가해, 또한 세포 또는 조직의 시인성이 뛰어난 유리화 동결 보존용 지그를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 유리화 동결 보존용 지그를 이용하면, 세포 또는 조직의 유리화 동결 작업 및 융해 작업을 효율적으로 행할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그의 일례를 나타내는 전체도이다.
도 2는, 도 1 중의 파지부를 제외한 유리화액 흡수체의 확대도이다.
도 3은, 도 2에 나타낸 유리화액 흡수체에 있어서의, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)의 단면 구조 개략도이다.
도 4는, 세포 또는 조직을 올려놓는 부분을 포함한 유리화액 흡수체의 구조를 나타내는 개략도이다.
도 5는, 본 발명에 있어서의 유리화액 흡수체의 다른 일례를 나타내는 개략도이다.
도 6은, 본 발명에 있어서의 유리화액 흡수체의 다른 일례를 나타내는 개략도이다.
도 7은, 본 발명에 있어서의 유리화액 흡수체의 다른 일례를 나타내는 개략도이다.
본 발명의 유리화 동결 보존용 지그는, 생물의 세포 또는 조직을 동결 보존할 때에 이용되는 것이다. 본 명세서 중에서 세포란, 단일 세포뿐만 아니라, 복수의 세포로 이루어지는 세포 집단을 포함하는 것이다. 복수의 세포로 이루어지는 세포 집단은 단일 종류의 세포로 구성되는 세포 집단이어도 되고, 복수 종류의 세포로 구성되는 세포 집단이어도 된다. 또, 조직은, 단일 종류의 세포로 구성되는 조직이어도 되고, 복수 종류의 세포로 구성되는 조직이어도 되고, 세포 이외에 세포 외 매트릭스와 같은 비세포성의 물질을 포함하는 것이어도 된다.
본 발명의 유리화 동결 보존용 지그는, 바람직하게는, 유리화액 흡수체에 세포 또는 조직을 유리화액과 함께 올려놓고, 세포 또는 조직을 올려놓은 지그를 액체질소 등의 냉각 용매에 침지해 동결시키기 위한 것이다. 상기 유리화액 흡수체를 갖음으로써, 세포 또는 조직을 유리화액과 함께 용이하게 유지할 수 있고, 또한 동결시 또는 해동시여도 세포 및 조직을 확실히 유지할 수 있으므로, 세포 또는 조직의 액체질소로의 침지 작업을 용이하게 행할 수 있다. 또, 본 발명의 유리화 동결 보존용 지그에 의하면, 세포 또는 조직이 뛰어난 시인성이 얻어지므로, 유리화액 흡수체 상에 올려놓아진 세포 또는 조직을, 용이하게 관찰할 수 있다. 이 때문에 본 발명의 유리화 동결 보존용 지그를 이용하면, 세포 또는 조직의 동결 보존을 위한 작업을 용이하게 또한 확실하게 행할 수 있다. 본 발명의 유리화 동결 보존용 지그는, 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그, 세포 또는 조직의 유리화 보존용 지그, 세포 또는 조직의 동결 보존용 기구, 세포 또는 조직의 유리화 보존용 기구라고 바꿔말할 수 있다.
본 발명의 유리화 동결 보존용 지그는 유리화액 흡수체를 갖고, 상기 유리화액 흡수체가 여분의 유리화액을 흡수하므로, 유리화액에 침지한 세포 또는 조직을, 유리화액과 함께 상기 유리화액 흡수체 상에 올려놓을 때에, 세포 또는 조직에 부착된 유리화액의 양이 많아도 안정된 세포 또는 조직의 생존율을 기대할 수 있다. 또한, 그와 같이 조작된 세포 또는 조직은 극소량의 유리화액에 덮여 있고, 동결 조작하는 경우에도 신속하게 동결 상태로 할 수 있다. 또한 동결 보존한 세포 또는 조직을 해동 후 바로 유리화액을 희석할 수 있다.
이하에, 본 발명의 유리화 동결 보존용 지그의 구성을 설명한다.
본 발명의 유리화 동결 보존용 지그는, 지지체 상에, 접착층과 유리화액 흡수층을 적어도 이 순서대로 갖는 유리화액 흡수체를 갖는 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그로서, 상기 유리화액 흡수층의 세포 또는 조직을 올려놓는 부분과 지지체 사이에, 접착층이 존재하지 않는 부분을 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 명세서에 있어서, 유리화액 흡수층의 세포 또는 조직을 올려놓는 부분이란, 유리화액 흡수층에 있어서, 유리화액과 함께 세포 또는 조직을 유리화액 흡수층에 떨어뜨려 부착시켰 때에, 세포 또는 조직이 유리화액 흡수층과 접하는 부분을 가리킨다. 본 발명의 유리화 동결 보존용 지그는, 유리화액 흡수층의 세포 또는 조직을 올려놓는 부분에 있어서, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에는 접착층을 갖지 않는 것이 가장 바람직하지만, 세포 또는 조직을 올려놓는 부분의 면적에서 차지하는 접착층의 면적의 비율이 20%를 초과하지 않는 범위, 보다 바람직하게는 접착층의 면적의 비율이 10%를 초과하지 않는 범위이면, 세포 또는 조직을 올려놓는 부분이어도 접착층을 갖고 있어도 된다. 본 발명의 유리화 동결 보존용 지그는, 유리화액 흡수체만으로 이루어지는 것이어도 되고, 본 발명의 효과를 해치지 않는 한, 유리화액 흡수체와 함께 후술하는 파지부 등을 가져도 된다.
본 발명의 유리화액 흡수체가 갖는 유리화액 흡수층으로는, 섬유로 이루어지는 시트, 다공성 수지 시트, 다공성 금속 시트, 및 다공성 금속 산화물 시트 등의 각종 시트를 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 「다공성」이란, 상기한 시트가 표면에 기공(세공)을 갖는 구조체인 것을 의미하며, 시트 표면 및 내부에 연속적인 기공을 갖는 구조체인 것이 보다 바람직하다. 또 유리화액 흡수층(상기한 각종 시트)의 두께는 10μm~5mm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20μm~2.5mm이다.
세포 또는 조직을 동결 보존할 때, 극저온의 냉각 용매(예를 들면 -196℃의 액체질소)에 세포 또는 조직을 신속하게 또한 용이하게 침지시키기 위해서는, 유리화액 흡수체는 지지체를 갖는 것이 바람직하다. 이에 의해 유리화액 흡수체의 자립성 또는 강도를 높이는 것이 가능해져, 작업성이 향상된다. 그러나 유리화액 흡수층을 지지체 상에 접착층을 통해 설치한 유리화 동결 보존용 지그에 있어서는, 유리화액 흡수층의 공극 중에 접착층의 일부가 들어가, 유리화액의 흡수 성능이 저하되는 문제가 있었다. 본 발명은 이러한 과제를, 유리화액 흡수층의 세포 또는 조직을 올려놓는 부분과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분을 갖는 유리화 동결 보존용 지그에 의해, 해결하는 것이다.
본 발명에 있어서, 유리화액 흡수층으로서 이용하는 섬유로 이루어지는 시트로는, 종이 또는 부직포가 예시된다.
종이는, 바인더 등의 결착제 성분의 종이 전체에서 차지하는 비율이 10질량% 이하인 종이가 바람직하고, 보다 바람직하게는 5질량% 이하이며, 또한 3질량% 이하인 종이가 바람직하다. 이에 의해 뛰어난 유리화액의 흡수성이 얻어진다. 또, 상기 유리화액 흡수층에 포함되는 제지용 약품의 종이 전체에서 차지하는 비율은 1질량% 이하인 것이 바람직하다. 통상 종이에 포함되어 있는 제지용 약품 중, 예를 들면 형광 증백제나 염료, 양이온계의 사이즈제 등에는 세포에 대한 영향이 우려되는 경우가 있다.
섬유로 이루어지는 시트가 종이인 경우, 밀도가 0.1~0.6g/cm3이며, 평량이 10~130g/m2인 종이인 것이 바람직하다. 특히 밀도가 0.12~0.3g/cm3이며, 평량이 10~100g/m2인 종이는, 유리화액의 흡수성이 뛰어나고, 또한 세포 또는 조직의 시인성이 뛰어난 유리화 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지므로 바람직하다.
섬유로 이루어지는 시트가 부직포인 경우, 상기 부직포가 함유하는 섬유로는, 셀룰로오스 섬유, 셀룰로오스 섬유로 이루어지는 재생 섬유인 레이온 섬유나 큐프라 섬유, 또한 셀룰로오스 섬유로부터의 반합성 섬유인 아세테이트 섬유, 폴리에스테르 섬유, 나일론 섬유, 아크릴 섬유, 폴리프로필렌 섬유, 폴리에틸렌 섬유, 폴리염화비닐 섬유, 비닐리덴 섬유, 폴리우레탄 섬유, 비닐론 섬유, 유리 섬유, 비단 섬유 등을 들 수 있고, 이들 섬유를 각종 혼합한 부직포도 이용할 수 있다. 그 중에서도 셀룰로오스 섬유, 셀룰로오스 섬유 유래의 섬유이며 셀룰로오스 재생 섬유인 레이온 섬유나 큐프라 섬유, 또한 셀룰로오스 섬유로부터의 반합성 섬유인 아세테이트 섬유가 바람직하다.
섬유로 이루어지는 시트가 부직포인 경우, 밀도가 0.1~0.4g/cm3이며, 평량이 10~130g/m2인 부직포인 것이 바람직하다. 특히 밀도가 0.12~0.3g/cm3이며, 평량이 10~100g/m2인 부직포는, 유리화액의 흡수성이 뛰어나고, 또한 세포 또는 조직의 시인성이 뛰어난 유리화 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지므로 바람직하다.
유리화액 흡수층으로서 이용되는 부직포에 있어서도 종이와 마찬가지로, 바인더 등의 결착제 성분의 부직포에서 차지하는 비율이 10질량% 이하인 부직포가 바람직하고, 보다 바람직하게는 5질량% 이하이며, 또한 3질량% 이하인 부직포가 바람직하다. 특히 결착제를 함유하지 않는 부직포가 바람직하다.
부직포는 종이와 달리 다양한 제조 방법이 있는데, 상기한 결착제 성분이 저감된 부직포로는, 스판본드법, 멜트블로우법으로 제조된 부직포, 또한 습식법 또는 건식법으로 섬유를 늘어놓은 후, 수류교락법 또는 니들펀치법으로 제조된 부직포를 적합하게 사용할 수 있다. 또 상기한 바와 같이, 본 발명에 있어서 부직포가 함유하는 바람직한 섬유로는, 셀룰로오스 섬유, 셀룰로오스 섬유 유래의 섬유이며 셀룰로오스 재생 섬유인 레이온 섬유나 큐프라 섬유, 또한 셀룰로오스 섬유로부터의 반합성 섬유인 아세테이트 섬유를 들 수 있는데, 이들 섬유를 이용하여 제조하는 경우에는, 습식법, 건식법에 관계없이 수류교락법 또는 니들펀치법으로의 제조 방법이 적합하다.
본 발명에 있어서, 유리화액 흡수층으로서 이용하는 다공성 수지 시트로는, 예를 들면 일본국 특허 공고 소 42-13560호 공보나, 일본국 특허 공개 평 08-283447호 공보에 기재된, 적어도 1축방향으로 연신하고, 수지의 융점 이상으로 가열해 소결함으로써 얻은 미세 섬유상 구조에 의해 다공질 구조를 형성한 수지 시트, 일본국 특허 공개 2009-235417호 공보에 기재된, 유화 중합 또는 분쇄 등의 방법에 의해 얻어진 열가소성 수지의 고체 분말을 금형에 충전하고, 가열, 소결하여 분말 입자 표면을 융착시켜 냉각함으로써, 다공질 구조를 형성한 수지 시트 등을 들 수 있다. 다공성 수지 시트를 유리화액 흡수층으로서 이용한 경우, 유리화액의 흡수성이 뛰어나고, 또한 세포 또는 조직의 시인성이 뛰어난 유리화 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지므로 바람직하다.
상기한 다공성 수지 시트를 형성하는 수지로는, 저밀도 폴리에틸렌, 고밀도 폴리에틸렌, 초고분자 폴리에틸렌 등의 각종 폴리에틸렌이나 폴리프로필렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리테트라플루오로에틸렌이나 폴리비닐리덴디플로라이드 등의 불소 수지, 에틸렌-아세트산 비닐 공중합체, 폴리아미드, 스티렌-아크릴로니트릴 공중합체, 스티렌-부타디엔-아크릴로니트릴 3원공중합체, 폴리카보네이트, 폴리염화비닐 등을 들 수 있다. 그 중에서도 폴리테트라플루오로에틸렌이나 폴리비닐리덴디플로라이드 등의 불소 수지는, 세포 또는 조직의 시인성이 특히 뛰어난 유리화 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지므로, 적합하다. 또 다공성 수지 시트로는, 이화학 실험 용도나 연구 용도로서 시판되고 있는, 여과용 멤브레인 필터도 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 유리화액 흡수층으로서 이용하는 다공성 금속 시트로는, 구리, 구리 합금, 알루미늄, 알루미늄 합금, 금, 금 합금, 은, 은 합금, 주석, 아연, 납, 티탄, 니켈, 스테인리스 등의 금속으로 이루어지는 다공성 금속 시트를 들 수 있다. 또 다공성 금속 산화물 시트로는, 실리카, 알루미나, 지르코늄, 석영 유리등의 금속 산화물로 이루어지는 다공성 금속 산화물 시트를 바람직하게 이용할 수 있다. 또 다공성 금속 시트 및 다공성 금속 산화물 시트는, 상기한 금속 및 금속 산화물을 각각 2종류 이상 함유하는 다공성 시트여도 된다. 그 중에서도 다공성 금속 산화물 시트는, 세포 또는 조직의 시인성이 뛰어난 유리화 동결 보존용 지그를 제공하는 것이 가능해지므로, 바람직하다.
본 발명에 있어서, 유리화액 흡수층으로서 이용하는 다공성 금속 시트, 및 다공성 금속 산화물 시트의 제조 방법으로는, 일반적으로 알려진 방법을 사용할 수 있다. 유리화액 흡수층이 다공성 금속 시트인 경우에는, 분말 야금법, 스페이서법 등의 방법을 사용할 수 있다. 또, 수지 사출 성형과 분말 야금법을 조합한 소위 파우더 스페이스 홀더법도 바람직하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 국제 공개 제2006/041118호 팜플렛이나 일본국 특허 제4578062호 공보에 기재된 방법 등을 이용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 금속 분말과 스페이서가 되는 수지를 혼합 후, 압력을 가해 성형한 후, 고온 환경하에서 소성함으로써, 금속 분말을 굳혀, 스페이서가 되는 수지를 기화시켜, 다공성 금속 시트를 얻을 수 있다. 파우더 스페이스 홀더법 등을 이용하는 경우에는, 금속 분말과 스페이서가 되는 수지에 추가해, 수지의 바인더를 혼합할 수 있다. 또, 금속 분말을 고온에서 가열한 후에, 가스를 주입하여 공극을 제작하는 발포 용융법, 가스 팽창법 등의 금속 다공질체의 제조 방법도 사용할 수 있다. 또한, 발포제를 이용하여 금속 다공질체를 제조하는 슬러리 발포법과 같은 제조 방법도 사용할 수 있다. 유리화액 흡수층이 다공성 금속 산화물 시트인 경우에는, 예를 들면, 일본국 특허 공개 2009-29692호 공보나 일본국 특허 공개 2002-160930호 공보에 기재된 방법 등을 이용할 수 있다.
상기한 다공성 수지 시트, 다공성 금속 시트, 및 다공성 금속 산화물 시트 등의 다공질체의 표면은, 유리화액 흡수 성능을 높이기 위해서, 친수화 처리할 수도 있다. 친수화 처리의 방법으로는, 그래프트 개질법, 친수성 고분자 화합물 등을 이용한 코팅법, 코로나 방전, 플라즈마 처리, 엑시머 레이저 등의 각종 에너지를 이용한 일반적인 표면 개질 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 유리화액 흡수층이, 상기한 다공성 수지 시트, 다공성 금속 시트, 및 다공성 금속 산화물 시트 등의 다공질체인 경우에는, 상기 다공질체의 세공 직경은, 0.02~130μm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.05~60μm이다. 세공 직경이 0.02μm 미만인 범위에서는, 유리화액을 떨어뜨릴 때 유리화액의 흡수 성능이 충분하지 않은 경우가 있다. 또, 다공성 시트의 제조가 어렵다는 문제가 있다. 한편, 세공 직경이 130μm를 초과하는 범위에서는, 세포 또는 조직이 세공 중에 트랩되어, 융해 작업시에, 세포가 유리화액 흡수체 상으로부터 유리되기 어려워지는 경우가 있다. 또, 유리화액의 흡수 성능이 충분하지 않은 경우가 있다. 또한, 다공질체의 세공 직경은, 다공성 수지 시트의 경우에는, 버블 포인트 시험에 의해 측정되는 가장 큰 세공의 직경이다. 또 다공성 금속 시트 및 다공성 금속 산화물 시트의 경우에는, 상기 다공질체의 표면 및 단면의 화상 관찰로부터 측정한 평균 세공 직경이다.
유리화액 흡수층의 공극률은 20용량% 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 30용량% 이상이다. 또 유리화액 흡수층이, 상기한 다공성 수지 시트, 다공성 금속 시트, 및 다공성 금속 산화물 시트 등의 다공질체인 경우, 다공질체의 내부의 기공은, 두께 방향뿐만 아니라, 두께 방향에 대해 수직인 방향에 대해서도 연속적인 구조인 것이 바람직하다. 이러한 구조를 가지면, 다공질체 내부의 기공을 유효하게 이용할 수 있으므로, 유리화액의 높은 흡수 성능을 얻을 수 있다. 유리화액 흡수층의 두께, 다공질체의 공극률은, 이용하는 세포 또는 조직의 종류나 세포 또는 조직과 함께 떨어뜨려지는 유리화액의 떨어뜨려지는 양 등에 따라, 적절하게 선택할 수 있다.
상기한 공극률이란, 이하의 식으로 정의된다. 여기서 공극 용량 V는 수은 압입법을 이용하여 측정할 수 있다.
P=(V/T)×100(%)
P:공극률(%)
V:공극 용량(ml/m2)
T:두께(μm)
본 발명의 유리화 동결 보존용 지그가 갖는 유리화액 흡수체의 면적은, 세포 또는 조직과 함께 떨어뜨려지는 유리화액의 떨어뜨려지는 양 등에 따라 적절히 설정하면 되고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 떨어뜨려지는 유리화액 1μL에 대해 1mm2 이상으로 하는 것이 바람직하고, 2~400mm2로 하는 것이 보다 바람직하다. 또, 유리화액 흡수체가 복수의 유리화액 흡수층 부분을 갖는 것인 경우에는, 연속하고 있는 1개의 유리화액 흡수층 부분이 상기한 면적인 것이 바람직하다.
본 발명의 유리화 동결 보존용 지그가 갖는 유리화액 흡수체에 있어서, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분의 면적은, 세포 또는 조직의 크기나 세포 또는 조직과 함께 떨어뜨려지는 유리화액의 떨어뜨려지는 양 등에 따라 적절히 설정하면 되고, 특별히 한정되지 않지만, 연속하고 있는 1개의 유리화액 흡수층의 면적에 대한 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분의 면적의 비율은 2~70%인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 유리화액 흡수체가 갖는 지지체로는, 일반적으로 알려져 있는 다양한 지지체를 사용할 수 있다. 이러한 지지체로는, 각종 수지 필름, 금속, 유리, 고무 등을 들 수 있다. 본 발명의 효과를 발휘하게 되는 한, 2종 이상의 지지체를 조합하여 이용해도 된다. 그 중에서도, 세포 또는 조직의 시인성의 관점에서, 광투과성 지지체가 바람직하게 사용할 수 있고, 전체 광선 투과율 80% 이상인 광투과성 지지체가 보다 바람직하다. 또, 광투과성 지지체의 헤이즈값은 10% 이하인 것이 바람직하다. 이러한 광투과성 지지체로는, 예를 들면 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET)나 폴리에틸렌나프탈레이트(PEN) 등의 폴리에스테르 수지, 아크릴 수지, 에폭시 수지, 실리콘 수지, 폴리카보네이트 수지, 디아세테이트 수지, 트리아세테이트 수지, 폴리아릴레이트 수지, 폴리염화비닐 수지, 폴리술폰 수지, 폴리 에테르술폰 수지, 폴리이미드 수지, 폴리아미드 수지, 폴리올레핀 수지, 환상 폴리올레핀 수지 등으로 이루어지는 수지 필름을 들 수 있다. 또, 온도 전도성이 뛰어나고, 급속한 동결을 가능하게 한다고 하는 관점에서 금속 지지체를 적합하게 이용할 수 있다. 금속 지지체의 구체적인 예로는, 구리, 구리 합금, 알루미늄, 알루미늄 합금, 금, 금 합금, 은, 은 합금, 철, 스테인리스 등을 들 수 있다. 상기한 지지체의 두께는, 10μm~10mm인 것이 바람직하다. 또, 접착층과의 접착 강도를 높이기 위해서, 지지체의 표면은 코로나 방전 처리에 의해 용이접착처리가 실시되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서, 유리화액 흡수체가 갖는 접착층은, 습기 경화성의 접착 물질로 대표되는 순간 접착 조성물, 핫멜트 접착 조성물, 광경화성 접착 조성물 등을 함유하는 것이 가능하고, 예를 들면, 폴리비닐알코올, 히드록시셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 전분풀과 같은 수용성 고분자 화합물, 아세트산 비닐계 수지, 아크릴계 수지, 에폭시계 수지, 우레탄계 수지, 엘라스토머계 수지, 시아노아크릴레이트계 수지, 불소계 수지, 실리콘계 수지, 니트로셀룰로오스계 수지, 니트릴고무계 수지, 스티렌-부타디엔계 수지, 유리아계 수지, 스티렌계 수지, 페놀계 수지, 폴리이미드계 수지, 폴리아미드계 수지, 폴리에스테르계 수지, 비스말레이미드계 수지, 올레핀계 수지, EVA계 수지 등의 비수용성 수지를 함유하는 조성물을 바람직하게 이용할 수 있다. 상기 접착층은, 1종류의 수지를 함유해도 되고, 복수 종류의 수지를 함유해도 된다. 접착층의 고형 분량은, 0.01~100g/m2의 범위가 바람직하고, 또한 0.1~50g/m2의 범위가 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서 유리화액 흡수체는, 상기 유리화액 흡수층의 세포 또는 조직을 올려놓는 부분과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분을 갖는다. 이러한 부분을 갖는 유리화액 흡수체는, 접착층을 형성할 때, 지지체 상의 세포 또는 조직을 올려놓는 부분이 되는 위치에, 상기한 접착 조성물을 도포하지 않는 무도포부를 형성하고(예를 들면 접착 조성물의 도포시에, 지지체 상의 세포 또는 조직을 올려놓는 부분이 되는 위치에 마스킹을 행하여 도포한다), 그 후 접착 조성물이 건조될 때까지의 동안에 섬유로 이루어지는 시트, 다공성 수지 시트, 다공성 금속 시트, 및 다공성 금속 산화물 시트 등의 각종 시트를 겹쳐 건조함으로써 얻어진다.
이상, 본 발명의 유리화 동결 보존용 지그가 갖는 유리화액 흡수체에 대해서 설명해왔다. 본 발명의 유리화 동결 보존용 지그는, 상술한 바와 같이, 지지체 상에, 접착층과 유리화액 흡수층을 이 순서대로 갖는 유리화액 흡수체를 갖고, 유리화액 흡수층의 세포 또는 조직을 올려놓는 부분과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분을 갖는 구조를 갖는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 상기 유리화액 흡수체와 함께 파지부를 갖고 있어도 된다. 파지부를 갖으면, 동결 보존 작업시 및 융해 작업시의 작업성이 양호해지므로, 바람직하다.
도 1은 본 발명의 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그의 일례를 나타내는 전체도이다. 도 1에 있어서 유리화 동결 보존용 지그(9)는, 파지부(1)와 유리화액 흡수체(2)로 구성된다. 도 2는, 도 1 중의 파지부를 제외한 유리화액 흡수체의 확대도이다. 도 2 중, 유리화액 흡수체(2a)는, 지지체(4) 상에, 유리화액 흡수층(3)을 갖는 구조이며(접착층은 도시하고 있지 않음), 도면 중 점선으로 둘러싼, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)을 갖는다. 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)은, 세포 또는 조직이 올려놓아지는 개소가 된다.
도 1에 나타낸 파지부(1)는 내(耐)액체질소 소재인 것이 바람직하다. 이러한 소재로는, 예를 들면 알루미늄, 철, 구리, 스테인리스 합금 등의 각종 금속, ABS 수지, 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌 수지, 불소계 수지나 각종 엔지니어 플라스틱, 또한 유리 등을 적합하게 이용할 수 있다. 도 1 중, 파지부(1)는 원기둥형이지만, 그 형상은 임의이다. 또, 후술하는 바와 같이, 세포 또는 조직을 직접 액체질소에 접촉시키지 않는 것을 목적으로, 동결 전에 세포 또는 조직을 부착시킨 유리화액 흡수체에 캡을 씌우는 일이 있지만, 이 경우, 파지부(1)를, 유리화액 흡수체(2)를 갖지 않는 측에서부터, 유리화액 흡수체(2)를 갖는 측을 향해, 원기둥의 직경이 연속적으로 작아지는 형상으로 함으로써, 캡을 씌울 때의 작업성을 향상시키는 것도 가능하다. 유리화액 흡수체(2)의 형상은, 핸들링형상, 직사각형상 또는 시트형상인 것이 바람직하다.
도 1의 파지부(1)와 유리화액 흡수체(2)의 접속 방법에 대해서 설명한다. 파지부(1)가 수지인 경우, 예를 들면, 성형 가공할 때에 인서트 성형에 의해 유리화액 흡수체(2)를 파지부(1)에 접속할 수 있다. 또한, 파지부(1)에 도시하지 않은 구조체 삽입부를 제작하여 접착제로 유리화액 흡수체(2)를 접속할 수 있다. 접착제는 다양한 것을 사용할 수 있지만, 저온에 강한 실리콘계나 불소계의 접착제를 적합하게 이용할 수 있다.
도 3은, 도 2에 나타낸 유리화액 흡수체에 있어서의, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)의 단면 구조 개략도이다. 도 3에 있어서 유리화액 흡수층(3)은, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)과, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하는 부분(7)을 갖는다. 도 3에서는, 지지체(4) 상의 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)에는, 공간이 존재하지 않고, 지지체(4)와 유리화액 흡수층(3)이 직접 접하고 있다. 상술한 바와 같이, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)을 형성할 때에는, 지지체(4) 상에, 접착 조성물을 도포하지 않는 무도포부를 형성하고, 그 후, 상기 접착 조성물이 건조될 때까지의 동안에 섬유로 이루어지는 시트, 다공성 수지 시트, 다공성 금속 시트, 및 다공성 금속 산화물 시트 등의 각종 시트가 겹쳐진다. 그 때, 도포된 접착 조성물의 건조가 진행되기 전, 즉 상기 접착 조성물의 유동성이 충분히 확보되어 있는 상태이면, 상기한 각종 시트는, 상기 접착 조성물을 재빠르게 흡수하므로, 도 3에 나타낸 바와 같이, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)에 있어서, 공간이 존재하지 않고, 지지체(4)와 유리화액 흡수층(3)이 직접 접하고 있는 유리화액 흡수체를 얻을 수 있다. 즉, 건조가 진행되기 전의 접착 조성물은 유리화액 흡수층(3) 내에 도입되는 형태로 접착층(5)을 형성하기 때문에, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)에 있어서, 지지체(4)와 유리화액 흡수층(3) 사이에 공간은 생기지 않는다.
한편, 도포된 접착 조성물의 건조가 진행되어 버려, 접착 조성물의 유동성이 충분히 확보되지 않는 상태에 있어서는, 섬유로 이루어지는 시트, 다공성 수지 시트, 다공성 금속 시트, 및 다공성 금속 산화물 시트 등의 각종 시트는, 상기 접착 조성물을 재빠르게 흡수하는 것이 곤란해지므로, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)에 있어서, 지지체(4)와 유리화액 흡수층(3) 사이에 공간이 생기는 경우가 있다.
유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)에 있어서, 지지체(4)와 유리화액 흡수층(3)이 직접 접하고 있는 유리화액 흡수체, 혹은 지지체(4)와 유리화액 흡수층(3) 사이에 공간이 생긴 유리화액 흡수체 중 어느 것이더라도, 세포 또는 조직의 외주에 부착된 여분의 유리화액을 충분히 흡수하는 것이 가능하다. 그러나, 그 한편, 지지체(4)와 유리화액 흡수층(3) 사이에 공간이 생기면, 동결 보존한 세포 또는 조직을 융해할 때의, 세포 또는 조직의 시인성(현미경 관찰하에서의 시인성)이 저하되는 경우가 있다. 융해 작업시에서는, 세포 또는 조직이 유리화액 흡수체 상으로부터 유리되어, 별도로 준비한 융해액 중에 세포 또는 조직이 회수되는 모습을 투과형 광학 현미경으로 관찰하면서 실시된다. 이 때, 지지체(4)와 유리화액 흡수층(3) 사이에 공간이 존재하면, 융해액 중에서 유리화액 흡수층(3)에 흔들림이 발생해, 핀트가 일정하게 유지될 수 없음으로써, 시인성이 저하된다. 따라서 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)에 있어서, 지지체(4)와 유리화액 흡수층(3)이 접하고 있는 것이 바람직하다.
도 4는, 세포 또는 조직을 올려놓는 부분을 포함한 유리화액 흡수체의 구조를 나타내는 개략도이다. 도 4 중, (4-1)은, 세포 또는 조직을 올려놓는 부분(8)이 모두, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)인 유리화액 흡수체(2)의 일례이다. (4-2)는, 세포 또는 조직을 올려놓는 부분(8)의 일부에, 스트라이프형상으로 접착층을 갖는 유리화액 흡수체(2)의 일례이다. (4-3)은, 세포 또는 조직을 올려놓는 부분(8)의 일부에, 도트형상으로 접착층을 갖는 유리화액 흡수체(2)의 예이다. 또 상기한 (4-1)~(4-3)은, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6) 안에, 세포 또는 조직을 올려놓는 부분(8)이 전부 들어가는 유리화액 흡수체(2)의 일례이기도 하다. 한편, 도 4 중 (4-4)는, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)보다도, 세포 또는 조직을 올려놓는 부분(8)이 비어져나오는 유리화액 흡수체(2)의 일례이다.
본 발명의, 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그에 의해, 세포 또는 조직을 장기 동결 보존하는 경우, 세포 또는 조직을 외계와 차단하기 위해서 캡을 씌우거나, 또는 상기 유리화 동결 보존용 지그를 임의의 형상의 용기에 넣어 밀폐하는 것도 가능하다. 또한, 통상 액체질소는 멸균되어 있지 않고, 세포 또는 조직을 직접 액체질소에 접촉시켜 동결시키는 경우에 있어서는, 유리화 동결 보존용 지그가 멸균되어 있어도 멸균 상태를 보증할 수 없는 경우가 있다. 따라서 동결 전에 세포 또는 조직을 부착시킨 유리화액 흡수체에 캡을 씌워, 또는 유리화 동결 보존용 지그를 용기 중에 밀폐하여, 세포 또는 조직을 직접 액체질소에 접촉시키지 않고 동결시키는 경우가 있다. 또, 유럽 등 해외 선진국에서는 상기와 같이 액체질소에 직접 접촉시키지 않는 동결 방법이 주류이다. 이와 같은 이유로부터 캡 및 용기는 내액체질소성이 있는 소재인 각종 금속, 각종 수지, 유리, 세라믹 등으로 제작하는 것이 바람직하다. 형상으로는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 캡은, 연필용 캡과 같은 반방추형상 또는 돔형상 등의 캡, 원기둥형상의 스트로 캡 등 유리화액 흡수체와 접촉하지 않고, 세포 또는 조직을 외계와 차단할 수 있는 형상이라면 어떠한 형상이어도 된다. 용기는, 유리화액 흡수체 상의 세포 또는 조직에 접촉하지 않고, 유리화 동결 보존용 지그를 피포 또는 수납하여 밀폐할 수 있는 것이면 되고, 그 형상은 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서는, 본 발명의 효과를 해치지 않는 이상 유리화 동결 보존용 지그를 이러한 유리화액 흡수체 상의 세포 또는 조직을 외계와 차단할 수 있는 캡 또는 용기와 조합하여 사용할 수 있다. 또, 이러한 캡 또는 용기와 조합하여 사용되는 유리화 동결 보존용 지그도, 본 발명에 포함된다.
도 5~도 7은, 본 발명에 있어서의 유리화액 흡수체의 다른 일례를 나타내는 개략도이다. 앞의 도 1에 나타낸 유리화 동결 보존용 지그(9)에 있어서, 유리화액 흡수체(2)를 도 5~7에 나타낸 유리화액 흡수체(2b~2d)로 하는 것도 가능하다.
도 5에 있어서, 유리화액 흡수체(2b)는 지지체(4) 상에 유리화액 흡수층(3)을 갖고, 상기 유리화액 흡수층(3)은, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)의, 도면 중 좌우의 2방향(대향하는 2방향)에 존재하는 도시하지 않은 접착층에 의해서, 지지체(4) 상에 고정된다. 도 6에 있어서, 유리화액 흡수체(2c)는 지지체(4) 상에 유리화액 흡수층(3)을 갖고, 상기 유리화액 흡수층(3)은, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)의, 도면 중 왼쪽 방향에 존재하는 도시하지 않은 접착층에 의해서, 지지체(4) 상에 고정된다. 도 7에 있어서, 유리화액 흡수체(2d)는 지지체(4) 상에 유리화액 흡수층(3)을 갖고, 상기 유리화액 흡수층(3)은, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)을 갖고, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6) 이외의 장소(부분(6)의 주위의 모든 방향)에 존재하는, 도시하지 않은 접착층에 의해서, 지지체(4) 상에 고정된다. 본 발명에 있어서 유리화액 흡수층(3)은, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)의 주위의 적어도 2방향 이상(바람직하게는 대향하는 2방향)에 존재하는 접착층에 의해서, 지지체(4) 상에 고정되는 것이 바람직하다. 이에 의해서 융해액 중에서 유리화액 흡수층(3)의 흔들림이 개선되어, 동결 보존한 세포 또는 조직을 융해할 때의, 세포 또는 조직의 시인성이 뛰어난 유리화 동결 보존용 지그를 얻을 수 있다.
또 도 7에 나타내는 유리화액 흡수체(2d)는, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(6)을, 연속한 유리화액 흡수층(3) 중에 복수 갖는 유리화액 흡수체의 구조의 일례이기도 하다.
본 발명의 유리화 동결 보존용 지그는, 예를 들면, cryotop법에 있어서 적합하게 이용되는 것이다. 또, 종래의 cryotop법은, 통상, 단일의 세포 또는 10개 미만의 소수의 세포의 보존에 이용되지만, 본 발명의 유리화 동결 보존용 지그는, 보다 많은 세포의 보존(예를 들면, 10~1000000개의 세포의 보존)에 있어서도 적합하게 이용할 수 있다. 또한, 복수의 세포로 이루어지는 시트상의 세포(소위 세포 시트)의 보존에도 적합하게 이용할 수 있다. 본 발명의 유리화 동결 보존용 지그를 이용하면, 세포 또는 조직의 동결시 및 융해시에 세포 외의 유리화액에 의한 손상을 받기 어려워, 세포 또는 조직을 뛰어난 생존률로 동결 보존할 수 있다.
본 발명의 유리화 동결 보존용 지그를 이용하여 세포 또는 조직을 동결 보존하는 방법으로는, 세포 또는 조직을 유리화액에 침지하는 공정, 유리화액에 침지한 세포 또는 조직을, 유리화액과 함께 유리화액 흡수층 상에 떨어뜨리고, 상기 세포 또는 상기 조직의 주위에 부착되어 있는 유리화액을 유리화액 흡수층에 흡수시킴과 더불어, 유리화액 흡수층 상에 세포 또는 조직을 담지시키는 공정, 및 상기한 세포 또는 조직을 유지한 유리화 동결 보존용 지그를, 액체질소 등 중에 침지함으로써, 세포 또는 조직을 급속 동결시키는 공정을 적어도 구비한다. 또 상기한 세포 또는 조직을 유리화액에 침지하는 공정 전에, 예를 들면, 상기 유리화액보다도 저농도의 내동제를 함유하는 사전 처리액 중에 세포 또는 조직을 침지하는 평형화 처리 공정을 설치해도 되고, 세포 또는 조직을 급속 동결시키는 공정 전에, 유리화액 흡수층 상의 세포 또는 조직을 외계와 차단할 수 있는 캡을 유리화액 흡수체에 장착하는 공정, 또는 유리화 동결 보존용 지그를 상기한 용기에 밀폐하는 공정을 설치해도 된다.
본 명세서에 있어서의 급속 동결이란, 비교적 늦은 냉각 속도(예를 들면 0.3~0.5℃／min의 속도)로 동결하는 소위 완만 동결법과는 달리, 극저온의 냉매(예를 들면 액체질소)를 이용하여 빠른 냉각 속도로, 빙정 형성을 억제하면서 동결시키는 방법을 가리킨다. 급속 냉동시의 냉각 속도는, 예를 들면, CHINO사 제조 시스형 열전대(선단 외경 0.3mm)를 이용하여 측정되는 0℃에서부터 -150℃까지의 냉각 속도가 200℃／min 이상인 것이 바람직하다. 또 유리화액은, 통상 난자, 배아 등의 세포의 동결을 위해서 사용되는 것을 사용할 수 있고, 예를 들면, 상술한 글리세롤이나 에틸렌글리콜, DMSO(디메틸술폭시드) 등의 각종 내동제를 함유하는 수용액을 사용할 수 있다. 유리화액 중에 있어서의 내동제의 농도는, 상술한 특허 문헌 2에 기재된 바와 같이 20~60%로 하는 것이 일반적이다.
동결 보존 후, 세포 또는 조직을 융해할 때에는, 동결된 세포 또는 조직을 올려놓은 유리화액 흡수체를 융해액 중에 침지시킴으로써 세포를 융해시키는 것과 더불어, 유리화액을 희석하는 것이 바람직하다. 이러한 조작에 의해, 재빙정 형성이나 유리화액의 독성을 완화할 수 있다.
본 발명의 유리화 동결 보존용 지그를 이용하여 동결 보존할 수 있는 세포로서, 예를 들면, 포유류(예를 들면, 인간, 소, 돼지, 말, 토끼, 랫트, 마우스 등)의 난자, 배아, 정자 등의 생식 세포;인공다능성간세포(iPS 세포), 배성간세포(ES 세포) 등의 다능성간세포를 들 수 있다. 또, 초대 배양 세포, 계대 배양 세포, 및 세포주 세포 등의 배양 세포를 들 수 있다. 또, 세포는, 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 섬유아세포, 췌장암·간암 세포 등의 암 유래 세포, 상피 세포, 혈관내피세포, 림프관내피세포, 신경세포, 연골 세포, 조직간세포, 및 면역 세포 등의 접착성 세포를 들 수 있다. 또한, 동결 보존할 수 있는 조직으로서, 동종 또는 이종의 세포로 이루어지는 조직, 예를 들면, 난소, 피부, 각막 상피, 치근막, 심근 등의 조직을 들 수 있다. 본 발명은, 특히 시트상 구조를 갖는 조직(예를 들면, 세포 시트, 피부 조직 등)의 유리화 동결 보존에 적합하다. 본 발명의 유리화 동결 보존용 지그는, 직접 생체로부터 채취한 조직뿐만 아니라, 예를 들면, 생체 외에서 배양해 증식시킨 배양 피부, 생체 외에서 구축한 소위 세포 시트, 일본국 특허 공개 2012-205516호 공보에서 제안되고 있는 삼차원 구조를 갖는 조직 모델과 같은 인공 조직의 유리화 동결 보존에 대해서도, 적합하게 이용할 수 있다. 본 발명의 유리화 동결 보존용 지그는, 상기와 같은 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그로서 적합하게 이용된다.
실시예
이하에 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 나타내며, 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
섬도 0.06dtex(섬유 직경 약 2μm), 컷 길이 3mm의 연신 결정화 폴리에틸렌테레프탈레이트스테이플 40질량부, 섬도 0.1dtex(섬유 직경 약 3μm), 컷 길이 3mm의 연신 결정화 폴리에틸렌테레프탈레이트스테이플 20질량부 및 섬도 0.2dtex(섬유 직경 약 4μm), 컷 길이 3mm의 비연신 폴리에틸렌테레프탈레이트스테이플 40질량부를 습식 초조(濕式抄造)하고, 또한, 표면 온도 200℃의 열 캘린더에 의해 섬유 사이를 융착시키면서 두께 조정을 행하고, 평균 섬유 직경이 3.0μm, 평량 25g/m2, 밀도 0.5g/cm3의 부직포(유리화액 흡수층)를 얻었다.
용이접착처리된 투명 PET 필름 지지체(전체 광선 투과율 91%, 헤이즈값 5.5%) 상에, 접착층으로서, Kuraray사 제조 PVA235의 5질량% 수용액을 건조시의 고형 분량이 30g/m2가 되도록 도포했다. 도포한 접착층이 건조되기 전에, 신속하게 상기한 유리화액 흡수층을 상기 접착층에 겹쳐 70℃에서 충분히 건조시켰다. 또한, 상기 접착층을 도포할 때에, 투명 PET 필름 지지체 상의 일부분에 마스킹을 행하고, 접착층의 무도포부를 만듦으로써, 도 5에 나타내는 형태의 유리화액 흡수체를 제작했다. 이 유리화액 흡수체를 ABS 수지제의 파지부와 접합시켜, 도 1에 나타내는 형태로 실시예 1의 유리화 동결 보존용 지그를 제작했다. 또한, 실시예 1의 유리화 동결 보존용 지그의 유리화액 흡수체의 크기는 40mm2(2mm×20mm)이며, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분의 크기는 10mm2(2mm×5mm)이다. 실시예 1의 유리화 동결 보존용 지그는, 특히, 복수의 세포 또는 조직을, 비교적 많은 유리화액량과 함께 떨어뜨려 부착시켜, 동결 보존·융해 조작하는 것을 상정한 형태이다.
(실시예 2)
실시예 1의 유리화 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 용이접착처리된 투명 PET 필름 지지체 상에, 접착층으로서, Henkel Japan사 제조의 핫멜트 우레탄 수지 Purmelt QR 170-7141P를 건조시의 고형분량 30g/m2가 되도록 도포한 것 이외에는 동일하게 하여, 실시예 2의 유리화 동결 보존용 지그를 제작했다.
(실시예 3)
실시예 2의 유리화 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 접착층을 도포 후, 드라이어로 가열하면서, 유리화액 흡수층으로서, Advantech사 제조의 여과지 No.5C(평량 120g/m2, 밀도 0.57g/cm3, 두께 210μm)를 상기 접착층에 겹친 것 이외에는 동일하게 하여, 실시예 3의 유리화 동결 보존용 지그를 제작했다.
(비교예 1)
실시예 2의 유리화 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 접착층의 무도포 부분을 설치하지 않고, 투명 PET 필름 지지체 상의 전체면에 도포한 접착층이 건조되기 전에, 유리화액 흡수층을 겹친 것 이외에는 동일하게 하여, 비교예 1의 유리화 동결 보존용 지그를 제작했다.
(비교예 2)
실시예 3의 유리화 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 접착층의 무도포 부분을 형성하지 않고, 투명 PET 필름 지지체 상의 전체면에 도포한 접착층이 건조되기 전에, 유리화액 흡수층을 겹친 것 이외에는 동일하게 하여, 비교예 2의 유리화 동결 보존용 지그를 제작했다.
<유리화액의 흡수성의 평가>
실시예 1~3의 각 유리화 동결 보존용 지그의, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(2mm×5mm)의 유리화액 흡수층 상에, 유리 비즈(직경 100μm)를 유사 세포로서 복수개 포함하는 유리화액 1μL를 떨어뜨려 부착시켰다. 또, 비교예 1~2의 각 유리화 동결 보존용 지그의 유리화액 흡수층 상에, 마찬가지로 유리 비즈(직경 100μm)를 유사 세포로서 복수개 포함하는 유리화액 1μL를 떨어뜨려 부착시켰다. 또한, 유리화액은, Sigma-Aldrich사 제조 수정 TCM199 배지에, 20용적% 혈청, 15용적% DMSO, 15용적% 에틸렌글리콜, 0.2용적% 수크로오스가 포함되는 조성의 것을 이용했다. 떨어뜨려 부착시킨 후, 낙사(落射)형 정립 광학현미경(OMRON사 제조, VC4500-S1)으로, 유리화액 흡수층 상에 올려놓아진 유사 세포 주변의 유리화액이 흡수되는 모습을 관찰하고, 유리화액의 흡수성을 이하의 기준으로 평가했다. 이 결과를 표 1에 나타낸다.
○:유리화액을 떨어뜨려 부착시킨 후 10초 이내에, 유사 세포 주변의 여분의 유리화액의 잔존이 완전히 보이지 않게 되었다. 또는, 거의 보이지 않게 되었다.
×:유리화액을 떨어뜨려 부착시킨 후, 경과 시간이 10초를 초과해도, 유사 세포 주변의 여분의 유리화액의 잔존이 확인되었다.
Figure 112017003496217-pct00001
(실시예 4)
실시예 2의 유리화 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 접착층을 도포 후, 드라이어로 가열하면서, 유리화액 흡수층으로서, 큐프라 섬유로 이루어지는 부직포인 Asahi Kasei Fibers사 제조 Bemliese(등록상표) SE14G(평량 14g/m2, 밀도 0.19g/cm3, 두께 70μm)를 상기 접착층에 겹친 것 이외에는 동일하게 하여, 실시예 4의 유리화 동결 보존용 지그를 제작했다.
(실시예 5)
실시예 2의 유리화 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 접착층을 도포 후, 드라이어로 가열하면서, 유리화액 흡수층으로서, 종이인 Daio Paper사 제조 elleair(등록상표) 프로와이프 소프트마이크로와이퍼 S220(평량 22g/m2, 밀도 0.21g/cm3)을 상기 접착층에 겹친 것 이외에는 동일하게 하여, 실시예 5의 유리화 동결 보존용 지그를 제작했다.
(실시예 6)
실시예 2의 유리화 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 접착층을 도포 후, 드라이어로 가열하면서, 유리화액 흡수층으로서, 폴리에틸렌 수지로 이루어지는 다공성 수지 시트인 Asahi Kasei사 제조의 SUNFINE AQ800(세공 직경 35μm, 공극률 43%, 두께 500μm)을 상기 접착층에 겹친 것 이외에는 동일하게 하여, 실시예 6의 유리화 동결 보존용 지그를 제작했다.
(실시예 7)
실시예 2의 유리화 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 접착층을 도포 후, 드라이어로 가열하면서, 유리화액 흡수층으로서, 다공성 금속 산화물 시트인 Covalent Materials사 제조의 석영 유리 다공체(세공 직경 3.5μm, 공극률 33%, 두께 2mm)를 상기 접착층에 겹친 것 이외에는 동일하게 하여, 실시예 7의 유리화 동결 보존용 지그를 제작했다.
(실시예 8)
실시예 2의 유리화 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 접착층을 도포 후, 드라이어로 가열하면서, 유리화액 흡수층으로서, 폴리테트라플루오로에틸렌 수지로 이루어지는 다공성 수지 시트인 Merck Millipore사 제조의 친수화 처리된 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체(세공 직경 10μm, 공극률 80%, 두께 85μm)를 상기 접착층에 겹친 것 이외에는 동일하게 하여, 실시예 8의 유리화 동결 보존용 지그를 제작했다.
(실시예 9)
실시예 1의 유리화 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 접착층을 도포 후, 드라이어로 가열하면서, 유리화액 흡수층으로서, 폴리테트라플루오로에틸렌 수지로 이루어지는 다공성 수지 시트인 Merck Millipore사 제조의 친수화 처리된 폴리테트라플루오로에틸렌 다공체(세공 직경 10μm, 공극률 80%, 두께 85μm)를 상기 접착층에 겹친 것 이외에는 동일하게 하여, 실시예 9의 유리화 동결 보존용 지그를 제작했다.
(실시예 10)
실시예 2의 유리화 동결 보존용 지그의 제작에 있어서, 접착층을 도포 후, 드라이어로 가열하면서, 유리화액 흡수층으로서, 폴리비닐리덴디플로라이드 수지로 이루어지는 다공성 수지 시트인 Merck Millipore사 제조의 폴리비닐리덴디플로라이드 다공체(세공 직경 0.5μm, 공극률 70%, 두께 125μm)를 상기 접착층에 겹친 것 이외에는 동일하게 하여, 실시예 10의 유리화 동결 보존용 지그를 제작했다.
<유리화액의 흡수성의 평가>
상기와 같이 하여 얻어진 실시예 4~10의 각 유리화 동결 보존용 지그의, 유리화액의 흡수성의 평가를, 앞의 실시예 1~3 및 비교예 1~2의 각 유리화 동결 보존용 지그와 동일한 방법으로 평가했다. 이 결과를 표 2에 나타낸다.
<유사 세포의 시인성의 평가>
실시예 4~10의 각 유리화 동결 보존용 지그에 대해서, 앞의 「유리화액의 흡수성의 평가」에 기재된 방법으로, 유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분(2mm×5mm)의 유리화액 흡수층 상에, 유사 세포를 유리화액과 함께 떨어뜨려 부착시켰다. 떨어뜨려 부착시킨 후, 투과형 광학 현미경(Olympus사 제조, SZH-121)으로, 유리화액 흡수층 상에 올려놓은 유사 세포를 관찰할 수 있는지 어떤지를 이하의 기준으로 평가했다. 이 결과를 표 2에 나타낸다.
◎:유사 세포의 형태를 명료하게 관찰할 수 있다.
○:유사 세포의 형태를 관찰할 수 있다.
△:유사 세포의 존재를 확인할 수 있으나, 형태를 관찰할 수 없다.
×:유사 세포의 존재를 확인하는 것이 곤란하다.
Figure 112017003496217-pct00002
표 2의 결과로부터, 본 발명의 유리화 동결 보존용 지그에 의해서, 유리화액의 뛰어난 흡수 성능에 추가해, 뛰어난 시인성이 얻어지는 것을 알 수 있다.
본 발명은, 소 등의 가축이나 동물의 배아 이식이나 인공 수정, 인간으로의 인공 수정 등 외에, iPS 세포, ES 세포, 일반적으로 이용되고 있는 배양 세포, 생체로부터 채취한 검사용 또는 이식용 세포 또는 조직, 생체 외에서 배양한 세포 또는 조직 등의 동결 보존에 이용할 수 있다.
1:파지부
2, 2a~2d:유리화액 흡수체
3:유리화액 흡수층
4:지지체
5:접착층
6:유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분
7:유리화액 흡수층과 지지체 사이에 접착층이 존재하는 부분
8:세포 또는 조직을 올려놓는 부분
9:유리화 동결 보존용 지그

Claims (2)

  1. 전체 광선 투과율이 80% 이상이고, 헤이즈값이 10% 이하인 수지 필름을 지지체로 하고, 상기 지지체 상에, 접착층과 유리화액 흡수층을 적어도 이 순서대로 갖는 유리화액 흡수체를 갖고, 상기 유리화액 흡수체는 유리화액 흡수층을 지지체 상에 접착층을 통해 설치한 것이고, 상기 유리화액 흡수층의 세포 또는 조직을 올려놓는 부분과 지지체 사이에, 접착층이 존재하지 않는 부분을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 유리화액 흡수층이, 다공성 수지 시트, 다공성 금속 산화물 시트, 및, 밀도가 0.12~0.3g/cm3이며 평량이 10~100g/m2인 종이 또는 부직포 중에서 선택되는 어느 1종인 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그.
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