JP6768955B2 - 細胞又は組織の凍結保存用治具 - Google Patents
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Description
(2)上記した細胞又は組織を保持する凸部の高さが、細胞又は組織の平均径の1/100以上1/2未満であることを特徴とする、上記(1)に記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
(3)上記した細胞又は組織を保存液とともに載置する載置部表面の算術平均粗さRaが1.0μm以上であることを特徴とする、上記(1)に記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
(4)上記した載置部が保存液吸収体を有することを特徴とする、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
一態様において、本発明の凍結保存用治具は、好ましくは平均径が1〜500μmの細胞又は組織の凍結保存用治具として好適に使用される。
まず、本発明の凍結保存用治具が有する細胞又は組織を載置する載置部が非吸収体からなる場合について説明する。
本発明の凍結保存用治具が有する細胞又は組織を載置する載置部が、非吸収体である場合には、ポリエチレンテレフタレート(PET)やポリエチレンナフタレート(PEN)等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアリレート樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)等のフッ素樹脂等からなる各種樹脂、アルミニウムやアルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、鉄、銅、銅合金、ステンレスなどの各種金属、ガラス、ゴム等を用いることができる。
P=(V/T)×100(%)
P:空隙率(%)
V:空隙容量(ml/m2)
T:厚み(μm)
非吸収体である透明PETフィルムの特定の領域に、エンボスプレス機による圧熱転写加工により、高さ5μm、パターンピッチが50μmの四角錐形状が均一に配置された構造体を作製し、細胞又は組織を保持する凸部と保存液を貯留する凹部を有する載置部を得た。作製した載置部の領域を含む透明PETフィルムを1.5mm×20mmの短冊状に裁断し、ABS製把持部と接合し、実施例1の凍結保存用治具を作製した。
非吸収体である透明PETフィルムの特定の領域に、エンボスプレス機による圧熱転写加工により、高さ1μm、パターンピッチが10μmの六角柱形状が均一に配置された構造体を作製し、細胞又は組織を保持する凸部と保存液を貯留する凹部を有する載置部を得た。その後、実施例1と同様にして、ABS製把持部と接合し、実施例2の凍結保存用治具を作製した。
保存液吸収体として、アドバンテック東洋社製のポリテトラフルオロエチレン多孔体(細孔径0.2μm、空隙率71%、厚み35μm)を用いて、該保存液吸収体上に、圧熱転写加工により、高さ5μm、パターンピッチが50μmの四角錐形状が均一に配置された構造体を作製し、細胞又は組織を保持する凸部と保存液を貯留する凹部を有する載置部を得た。また、支持体として透明PETフィルムを用い、該支持体上に、接着層として、ヘンケルジャパン社製のホットメルトウレタン樹脂Purmelt(登録商標) QR 170−7141Pを乾燥時の固形分量が30g/m2となるように塗布した。接着層が完全硬化する前に、上記の方法で圧熱転写加工がなされた保存液吸収体を、該保存液吸収体の表面構造体を有さない側の面を、支持体と貼り合わせた。その後、作製した載置部の領域を含む保存液吸収体と支持体の貼合物を1.5mm×20mmの短冊状に裁断し、ABS製把持部と接合し、実施例3の凍結保存用治具を作製した。
前記した実施例3と同様にして、凸部と凹部からなる構造体を載置部上に有する保存液吸収体と支持体の貼合物を得た。その後、該貼合物に対し、水溶性高分子であるエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールであるゴーセネックス(登録商標)WO−320Rの2質量%水溶液をディップコーティングし、室温乾燥後、さらに120℃で40時間加熱乾燥を行った。なお、該水溶性高分子の塗布量は1.6g/m2であった。その後は、水溶性高分子を塗布した貼合物を、実施例1と同様にして、1.5mm×20mmの短冊状に裁断し、ABS製把持部と接合し、実施例4の凍結保存用治具を作製した。
圧熱転写加工により、高さ1μm、パターンピッチが50μmの四角錐形状が均一に配置された構造体を作製した以外は、実施例4と同様にして、実施例5の凍結保存用治具を作製した。
非吸収体である透明PETフィルムに対して表面加工を行わなかった以外は、実施例1と同様にして、比較例1の凍結保存用治具を作製した。
ポリテトラフルオロエチレン多孔体に対して表面加工を行わなかった以外は、実施例3と同様にして、比較例2の凍結保存用治具を作製した。
細胞又は組織の剥離性の評価に用いるスフェアは以下のように調製した。マウス胚性線維芽細胞を培養シャーレ上で培養後、トリプシン処理により剥離、回収した。その後、住友ベークライト(株)製PrimeSurface(登録商標)96Uプレートに50細胞/ウェルの細胞数で播種し、浮遊培養することでスフェア形成を誘導した。培養3日後に直径約100μmのスフェアを得た。
上記方法により調製したスフェアを回収し、平衡化液(7.5容量%ジメチルスルホキシド、7.5容量%エチレングリコール、85容量%199培地(Medium199(GEヘルスケア社)))に浸漬させた。その後、スフェアを平衡化液から回収し、ガラス化保存液(前記199培地を基礎液として、該基礎液の組成に加えて、15容量%ジメチルスルホキシド、15容量%エチレングリコール、14容量%ウシ胎児血清、0.5Mスクロースを含有させた溶液)に移した後に、30秒間浸漬させた。その後、ストリッパーピペッター(オリジオジャパン社)を用いて、微量のガラス化保存液(およそ0.4μl)と共にスフェアを回収し、実施例1〜5及び比較例1の凍結保存用治具の載置部上にそれぞれ滴下付着させた。保存液吸収体を有さない実施例1、2及び比較例1の凍結保存用治具においては、1個のスフェアを微量のガラス化保存液と共に載置部上に滴下付着させた後に、透過型顕微鏡観察下で、ストリッパーピペッターを用いて、スフェア周辺から余分なガラス化保存液を可能な限り除去し、その後、液体窒素中に浸漬し、載置部上のスフェアをガラス化凍結した。一方、保存液吸収体を有する実施例3〜5及び比較例2の凍結保存用治具においては、1個のスフェアを微量のガラス化保存液と共に滴下付着させた後に、透過型顕微鏡で、余分なガラス化保存液が自発的に吸収される様子を観察しながら、スフェアの周辺から余分なガラス化液が除かれたことを確認し、液体窒素中に浸漬し、載置部上のスフェアをガラス化凍結した。凍結させた凍結保存用治具は、融解するまで、液体窒素保存容器中で保管した。
スフェアを載置した実施例1〜5及び比較例1、2の凍結保存用治具を液体窒素中から取り出し、温度37℃の融解液(前記199培地を基礎液として、該基礎液の組成に加えて、1Mスクロースを含有させた溶液)に浸漬させた。浸漬後のスフェアの様子を透過型光学顕微鏡で観察し、スフェアの剥離性について以下の基準で評価した。これらの結果を表1の「細胞又は組織の剥離性」の項目に示す。
◎:凍結保存用治具を融解液に浸漬した後、把持部を穏やかにゆする程度で、30秒未満で、スフェアを剥離することができた。
○:凍結保存用治具を融解液に浸漬した後、把持部を穏やかにゆする程度で、30秒〜60秒で、スフェアを剥離することができた。
△:把持部を穏やかにゆする程度では、60秒以内にスフェアを剥離することができなかったため、把持部をやや強めにゆすり、スフェアを剥離することができた。
×:把持部を穏やかにゆする程度では、60秒以内にスフェアを剥離することができず、その後、把持部をやや強めにゆする操作においても、スフェアを剥離することができなかった。
ポリエチレンテレフタレートフィルムとして、東レ(株)製のルミラー(登録商標)T60(厚み188μm、全光線透過率91%)に、図14に示した、一辺の長さが50μm、高さ30μmの四角錐形状が連続して形成された雌金型(13×12cm、全厚130μm)を、サイトウエンヂニアーズ(株)製のロール式エンボス加工機、EMBOSTAR(商標登録)を用いてプレス加工することにより、ポリエチレンテレフタレートフィルムの一方の面に凸部を形成した。同機はギャップを調整可能な2本のロール間に加工対象物を通すことにより、凹凸加工を施すエンボス加工機であり、ロール間ギャップや加工温度の調整により対象物への加工深度を調整することが可能である。実施例6では、ロール間ギャップを320μmとした。また、加工時の温度(ロール最表面、接触式の温度計により測定)は240℃とした。上記の条件で加工したポリエチレンテレフタレートフィルム上に形成した凸部の高さは、5μm、凸部のパターンピッチは50μmであった。得られた凹凸加工ポリエチレンテレフタレートフィルムを、短辺1.5mm×長辺25.0mmの長方形に裁断し、ABS樹脂製の把持部と接合させ、図1に示す形態で実施例6の凍結保存用治具を作製した。
実施例6において、ロール間ギャップを310μmとしてプレス加工した以外は同様の方法で、実施例7の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例7において、ポリエチレンテレフタレートフィルム上に形成した凸部の高さは14μm、凸部のパターンピッチは50μmであった。
実施例6において、ロール間ギャップを300μmとしてプレス加工した以外は同様の方法で、実施例8の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例8において、ポリエチレンテレフタレートフィルム上に形成した凸部の高さは22μm、凸部のパターンピッチは50μmであった。
実施例6において、ロール間ギャップを290μmとしてプレス加工した以外は同様の方法で、実施例9の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例9において、ポリエチレンテレフタレートフィルム上に形成した凸部の高さは27μm、凸部のパターンピッチは50μmであった。
図15に示した、一辺の長さが50μm、高さ60μmの四角錐形状が連続して形成された雌金型(13×12cm、全厚300μm)を用いて、ロール間ギャップを450μmとしてプレス加工した以外は、実施例6と同様の方法で、実施例10の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例10において、ポリエチレンテレフタレートフィルム上に形成した凸部の高さは46μm、凸部のパターンピッチは50μmであった。
ポリエチレンテレフタレートフィルムとして、東レ(株)製のルミラー(登録商標)T60(厚み188μm)を短辺1.5mm×長辺25.0mmの長方形に裁断し、ABS樹脂製の把持部と接合させ、図1に示す形態で比較例3の凍結保存用治具を作製した。
直径が100μmのマウス卵子を、液温が15℃のIrvine Scientific社製Vit Kit平衡液に浸漬させた。次いで、平衡液浸漬後のマウス卵子を、液温が4℃のIrvine Scientific社製Vit Kitガラス化液に浸漬させた。90秒間ガラス化液に浸漬後、マウス卵子1個を透過型顕微鏡観察下で、凍結保存用治具(実施例6〜10、比較例3)の載置部上に、ピペットを用いて載置した。このとき、載置部に存在する余分なガラス化液は、ピペット操作により取り除いた。その後、液体窒素中に上記凍結保存用治具を浸漬し、ガラス化凍結させた。凍結後の凍結保存用治具は、液体窒素保存容器中で保管した。
マウス卵子を載置した凍結保存用治具(実施例6〜10、比較例3)を、液体窒素中から取り出し、温度37℃のIrvine Scientific社製Vit Kit融解液に浸漬させた。融解液中で、マウス卵子が凍結保存用治具の載置部から剥離する様子を、透過型光学顕微鏡で観察し、以下の基準で評価した。これらの評価結果を表2に示す。
○:凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部を緩やかにゆすると30〜60秒の間にマウス卵子を剥離することができた。
△:凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部を緩やかにゆすっても剥離ができず、強めにゆするとマウス卵子を剥離することができた。
×:凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部を緩やかにゆすっても、強めにゆすってもマウス卵子を剥離することができなかった。
細胞又は組織の剥離性の評価に用いるスフェアは以下のように調製した。マウス胚性線維芽細胞を培養シャーレ上で培養後、トリプシン処理により剥離、回収した。その後、住友ベークライト(株)製PrimeSurface(登録商標)96Uプレートに50細胞/ウェルの細胞数で播種し、浮遊培養することでスフェア形成を誘導した。培養約40時間後に直径50μmのスフェアを得た。
直径が50μmのスフェアを、液温が15℃のIrvine Scientific社製Vit Kit平衡液に浸漬させた。次いで、平衡液浸漬後のスフェアを、液温が4℃のIrvine Scientific社製Vit Kit(商標登録)ガラス化液に浸漬させた。90秒間ガラス化液に浸漬後、1個のスフェアを透過型顕微鏡観察下で、凍結保存用治具(実施例6〜10、比較例3)の載置部上に、ピペットを用いて載置した。このとき、載置部に存在する余分なガラス化液は、ピペット操作により取り除いた。その後、液体窒素中に上記凍結保存用治具を浸漬し、ガラス化凍結させた。凍結後の凍結保存用治具は、液体窒素保存容器中で保管した。
スフェアを載置した凍結保存用治具(実施例6〜10、比較例3)を、液体窒素中から取り出し、温度37℃のIrvine Scientific社製Vit Kit融解液に浸漬させた。融解液中で、スフェアが凍結保存用治具から剥離する様子を、透過型光学顕微鏡で観察し、先に記載した剥離性評価と同様の基準で評価した。これらの評価結果を表3に示す。
アドバンテック東洋(株)製のポリテトラフルオロエチレン多孔体(細孔径0.2μm、空隙率71%、厚み35μm)を20cm×10cmの短冊状に押切カッターを用いて裁断し、次いで、裁断後の多孔体を、厚み300μmのポリカーボネートフィルム上に載置した。ポリカーボネートフィルム上に載置した多孔体の上に、図14に示した、一辺の長さが50μm、高さ30μmの四角錐形状が連続して形成された雌金型(13×12cm、全厚130μm)を載置し、ロール間ギャップ510μm、加工時の温度40℃の条件で、多孔体に凹凸加工を施した。他方、支持体として、易接着処理されたポリエチレンテレフタレートフィルムである東レ(株)製のルミラー(登録商標)T60(厚み188μm)に接着層として、ヘンケルジャパン(株)製のホットメルトウレタン樹脂Purmelt(登録商標) QR 170−7141Pを、乾燥時の固形分量が30g/m2となるように塗布した。その後、凹凸加工した多孔体からポリカーボネートフィルム、金型を取り外し、多孔体の非凹凸加工面を、ポリエチレンテレフタレートフィルムの接着層塗布面と、接着層が完全硬化する前に貼り合わせた。得られた貼合体を、短辺1.5mm×長辺25.0mmの長方形に裁断し、ABS樹脂製の把持部と接合させ、実施例11の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例11において、多孔体上に形成した凸部の高さは3μm、凸部のパターンピッチは50μmであった。
実施例11において、ロール間ギャップを490μmとしてプレス加工した以外は同様の方法で、実施例12の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例12において、多孔体上に形成した凸部の高さは5μm、凸部のパターンピッチは50μmであった。
実施例11において、ロール間ギャップを470μmとしてプレス加工した以外は同様の方法で、実施例13の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例13において、多孔体上に形成した凸部の高さは9μm、凸部のパターンピッチは50μmであった。
実施例11において、ロール間ギャップを450μmとしてプレス加工した以外は同様の方法で、実施例14の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例14において、多孔体上に形成した凸部の高さは12μm、凸部のパターンピッチは50μmであった。
実施例11において、ロール間ギャップを430μmとしてプレス加工した以外は同様の方法で、実施例15の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例15において、多孔体上に形成した凸部の高さを電子顕微鏡により観察したところ、凸部の高さは16μm、凸部のパターンピッチは50μmであった。
実施例11において、図16に示した直径1.4〜2.0μmの円柱形状が、パターンピッチ2.7〜3.3μmで連続して形成された雌金型(外形13×13cm(パターン形成部の面積7×7cm)、全厚190μm)を用いて、ロール間ギャップを540μmとしてプレス加工した以外は同様の加工を行い、実施例16の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例16において、多孔体上に形成した凸部の高さは1.2μm、凸部のパターンピッチは3.0μmであった。
実施例16において、図16に示した雌金型に代わり、図17に示した、直径1.4〜2.0μmの円柱形状が、パターンピッチ2.7〜3.3μmで連続して形成された雄金型(外形13×13cm(パターン形成部の面積7×7cm)、全厚190μm)を用いて、プレス加工した以外は同様の加工を行い、実施例17の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例17において、多孔体上に形成した凸部の高さは1.1μm、凸部のパターンピッチは3.0μmであった。
実施例11で得た凍結保存用治具の載置部に、可溶性層を設ける以外は同様の方法で、実施例18の凍結保存用治具を作製した。なお、可溶性層は、貼合体を日本合成化学工業(株)製のゴーセネックス(登録商標)WO−320R(ケン化度88.3mol%)の2質量%水溶液にディップコーティングし、室温乾燥後、120℃で40時間加熱処理を行うことにより設けた。なお、実施例18において、多孔体上に形成した凸部の高さは2.9μm、凸部のパターンピッチは50μmであった。
実施例18と同様にして、実施例12で得た凍結保存用治具の載置部に可溶性層を設け、実施例19の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例19において、多孔体上に形成した凸部の高さは4.9μm、凸部のパターンピッチは50μmであった。
凸部を形成していないアドバンテック東洋(株)製のポリテトラフルオロエチレン多孔体を載置部として用いる以外は、実施例11と同様にして、比較例4の凍結保存用治具を作製した。
支持体として易接着処理された透明PETフィルム(全光線透過率91%、ヘーズ値5.5%)を用い、該支持体上に接着層として、ヘンケルジャパン(株)製のホットメルトウレタン樹脂Purmelt(登録商標) QR 170−7141Pを乾燥時の固形分量が30g/m2となるように塗布した。接着層が完全硬化する前に、下記の方法で片面を粗面化した保存液吸収体の粗面化していない側の面を、該接着層に貼り合わせた。
実施例20の凍結保存用治具の作製において、粗面化したポリテトラフルオロエチレン多孔体上に可溶性層を設けなかった以外は実施例20と同様にして、実施例21の凍結保存用治具を作製した。なお、載置部表面のRaを(株)東京精密製のサーフコム(登録商標)1400Dにより測定したところ、2.20μmであった。
実施例20の凍結保存用治具の作製において、圧熱転写時の面圧を2.87kNに高めて凍結保存用治具を作製し、実施例22とした。なお、載置部表面のRaを(株)東京精密製のサーフコム(登録商標)1400Dにより測定したところ、3.12μmであった。
直径が約100μmのマウス胚を液温が4℃の保存液(15容量%DMSO(ジメチルスルホキシド)、15容量%エチレングルコール、14容量%ウシ胎児血清、56容量%修正リン酸緩衝液(137mM NaCl、2.7mM KCl、0.9mM CaCl2・H2O、0.5mM MgCl2・6H2O、1.5mM KH2PO4、8mM Na2HPO4、5.6mM グルコース、0.3mM ピルビン酸Na、65μg/ml 硫酸ジベカシン、1mg/ml ポリビニルピロリドン、14.8mM L−proline、200mM トレハロース、0.5Mスクロース)に浸漬させた。30秒間の保存液への浸漬後、1個のマウス胚を、作製した凍結保存用治具の載置部上に載置し、透過型顕微鏡観察下で、ピペットを用いてマウス胚周辺の余分な保存液をできるだけ除いた。その後、液体窒素中に浸漬し、ガラス化凍結させた。凍結させた凍結保存用治具は、融解するまで、液体窒素保存容器中で保管した。
マウス胚を載置した凍結保存用治具を液体窒素中からとりだし、温度37℃の融解液(上記修正リン酸緩衝液に1Mスクロースを添加した溶液)に浸漬させた。浸漬後のマウス胚の様子を透過型光学顕微鏡で観察し、融解時のマウス胚の剥離性について以下の基準で評価した。これらの結果を表5の「細胞又は組織の剥離性」の項目に示す。
◎:凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部をゆすりながらマウス胚を剥離することができた(剥離に要した時間は20秒未満)。
○:凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部をゆすりながらマウス胚を剥離することができた(剥離に要した時間は20秒以上40秒未満)。
△:凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部をゆすりながらマウス胚を剥離するのに、40秒以上〜60秒未満を要した。
×:把持部をゆすることでは、60秒以内にマウス胚を剥離することができなかった。
2 支持体
3、3a、3b、3c、3d、3e、3f、3g、3h 載置部
4 凸部
5 凹部
6 細胞
7 保存液
8 保存液吸収体
9、9a、9b、9c 凍結保存用治具
Claims (4)
- 細胞又は組織を保存液とともに載置する載置部を有する凍結保存用治具であって、該載置部表面が細胞又は組織を保持する凸部と、保存液を貯留する凹部を有することを特徴とする細胞又は組織の凍結保存用治具。
- 前記した細胞又は組織を保持する凸部の高さが、細胞又は組織の平均径の1/100以上1/2未満であることを特徴とする、請求項1に記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
- 前記した細胞又は組織を保存液とともに載置する載置部表面の算術平均粗さRaが1.0μm以上であることを特徴とする、請求項1に記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
- 前記した載置部が保存液吸収体を有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
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