WO2020250766A1

WO2020250766A1 - 凍結保存用治具の固定具および該固定具を用いた凍結融解方法

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Publication number: WO2020250766A1
Application number: PCT/JP2020/021895
Authority: WO
Inventors: 篤史松澤; 翔吉田
Original assignee: 三菱製紙株式会社
Priority date: 2019-06-12
Filing date: 2020-06-03
Publication date: 2020-12-17
Also published as: EP3985090A4; KR20220020895A; EP3985090A1; US20220361483A1

Abstract

上面、側面及び底面を有する基材の上面に、少なくとも片端が基材の側面部に開口したスリット部を有するか、あるいは基材の上面に凍結保存用治具を挿入する挿入部と該挿入部の側面部に片端が開口したスリット部を有する凍結保存用治具の固定具。および該固定具を用いた細胞又は組織の凍結融解方法。

Description

凍結保存用治具の固定具および該固定具を用いた凍結融解方法

　本発明は、凍結した細胞又は組織の融解時において好適に利用される凍結保存用治具の固定具、および該固定具を用いた凍結融解方法に関する。

　細胞又は組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。例えば、牛の胚移植技術においては、胚を凍結保存し、受胚牛の発情周期に合わせて胚を融解し、移植することが行われている。また、ヒトの不妊治療においては、母体から卵子又は卵巣を採取後、移植に適したタイミングに合わせるために凍結保存しておき、移植時に融解して用いることがなされている。

　一般に、生体内から採取された細胞又は組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われたり、形質の変化が生じたりすることから、生体外での細胞又は組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を保った状態で長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞又は組織をより正確に分析することが可能になる。また優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま細胞又は組織を移植に用いることが可能となり、移植後の生着率が向上することが望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要な時に使用することも可能となり、医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。

　細胞又は組織の凍結保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞又は組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞又は組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３～０．５℃／分の速度）で、－３０～－３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が十分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞又は組織をさらに液体窒素の温度（－１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその外の周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固化する現象であるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞又は組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。

　また、細胞又は組織の凍結保存方法として、ガラス化凍結法も知られている。ガラス化凍結法とは、グリセロール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド等の耐凍剤を多量に含む保存液の凝固点降下により、氷点下であっても氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この保存液を急速に液体窒素中で冷却させると、氷晶を生じさせないまま固化させることができる。このように固化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む保存液は、ガラス化液と呼称される。

　前述した緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、冷却速度を制御するための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、前記緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞又は組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。これに対し、上記したガラス化凍結法では、操作の時間は短時間であり、特別な装置又は治具を必要としないプロセスである。加えて、ガラス化凍結法は、氷晶を生じさせないことによって高い生存率が得られる。

　ガラス化凍結法を用いた細胞又は組織の凍結保存方法については、様々な方法で、様々な種類の細胞又は組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞へのガラス化凍結法の適用が、凍結保存及び融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されている。

　ガラス化凍結法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化凍結法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化凍結法が有効であることが示されている。このように、ガラス化凍結法は広く様々な種の細胞及び組織の保存に有用であることが知られている。

　適切なガラス化凍結を成し得るために、凍結速度は速ければ速いほど好ましいことが知られている。さらに、凍結保存後の融解工程時においても、細胞又は組織中への再氷晶形成を抑制する観点で、融解速度は速ければ速いほど好ましいことが知られている。

　適切なガラス化凍結を成し得るための重要な因子である凍結速度と融解速度のうち、特に重要なのは、融解速度とされている。例えば、非特許文献２に記載されるように、迅速に凍結された細胞であっても、融解速度が遅い場合には生存率が低くなることが知られている。また特許文献３には、凍結したサンプルを急速融解法により融解することで、融解後のヒトｉＰＳ細胞由来神経幹細胞／前駆細胞の生存率が向上することが記載されている。

　一般に、ガラス化凍結法に関わる凍結方法としては、特許文献４において、哺乳動物胚または卵子を凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、これらの胚または卵子を包被するに十分な最少量のガラス化液で貼り付け、この容器を液体窒素に接触させて急速に冷却する方法が提案されている。該凍結方法の後に行われる融解方法は、前記した方法で保存した凍結保存用容器を液体窒素から取り出し、容器の一端部を開口し、この容器内に３３～３９℃の希釈液を注入し、凍結した胚または卵子を融解希釈するものである。この方法によれば、哺乳動物胚または卵子をウィルスや細菌に感染されるおそれがなく高い生存率で保存及び融解希釈することができるとされている。しかしながら、凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、胚または卵子を貼り付ける作業の難易度は高く、また確実に胚または卵子を凍結保存用容器内に載置されたことを確認することが難しかった。

　特許文献５では、熱伝導性部材を有した細胞保持部材と筒状収納部材を有した細胞凍結保存用具が記載されており、特許文献４の凍結融解方法における問題がある程度解決されている。特許文献５に記載されている凍結保存用具の使用方法として、顕微鏡下において、卵子を細胞保持部材に付着させ、細胞保持部材を筒状収納部材に収納した後に、液体窒素に浸漬してガラス化凍結する。その後に、筒状収納部材の開口部に蓋部材を装着し、液体窒素タンク内で保管する方法が記載されている。また特許文献６では、卵付着保持用ストリップ上に卵子を少量のガラス化液と共に載置し、凍結保存用治具全体を筒状の収納容器に収納した後に液体窒素に浸漬することで、ガラス化凍結が行われる。

　よりプロセスの少ないガラス化凍結法に関わる凍結方法として、特許文献７及び特許文献８に記載されるような、ヒトの不妊治療分野で使用されているいわゆるクライオトップ（登録商標）法という方法が開示されている。これらの方法における凍結操作では、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを備えた卵凍結保存用具を使用し、顕微鏡観察下で該フィルム上に極少量の保存液と共に卵子又は胚を載置し、卵子が付着したフィルムを液体窒素に浸漬することで、ガラス化凍結が行われる。そして凍結した卵子又は胚が載置された卵付着保持用ストリップはキャップ等で保護された後、液体窒素タンク内で保存される。

　またクライオトップ法に好適な凍結保存用治具として、例えば特許文献９～１１では、卵子又は胚の周囲に付着した余分な保存液を取り除く吸収性能を備えた凍結保存用治具により、優れた生存率でこれらの生殖細胞を凍結保存させる方法が提案されている。

　これらの方法によって凍結された卵子や胚などの融解は、卵付着保持用ストリップを保温された融解液に浸漬することによって行われ、該融解液中でストリップ上に載置された卵子や胚などは回収される。

　一方、凍結保存方法における融解操作の作業性を高めるために、特許文献１２に記載されるような液体窒素容器が知られている。該液体窒素容器はフタ部にスリット部が形成されており、筒状収納部材に収納された凍結保存用治具は、該スリット部に一旦立てかけられる。

　このようにして凍結された細胞又は組織を液体窒素の液面より下に位置する状態になるように一旦保持しておけば、例えば特許文献５や特許文献６に記載される方法においては、液体窒素の液面より上に位置する蓋部材を容易に取り外すことが可能となり、細胞又は組織を融解液中へ迅速に移動させることで、融解速度の低下を防ぐことができる。また特許文献７や特許文献８、および特許文献９～１１に記載される方法においては、該キャップから凍結保存用治具を引き抜くことで、細胞又は組織を融解液中へ迅速に移動でき、融解速度の低下を防ぐことができる。

特許第３０４４３２３号公報特開２００８－５８４６号公報特開２０１７－１０４０６１号公報特開２０００－１８９１５５号公報特許第５７９８６３３号公報国際公開第２０１９／００４３００号特開２００２－３１５５７３号公報特開２００６－２７１３９５号公報特開２０１４－１８３７５７号公報特開２０１５－１４２５２３号公報国際公開第２０１５／０６４３８０号米国意匠登録第６４２，６９７号公報

Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３４５：１７０－１７２（１９９０）僧都博著　「生細胞の凍結による障害と保護の機構」　化学と生物　第１８巻（１９８０）２号　Ｐ．７８～８７　日本農芸化学会発行

　しかしながら上記した特許文献１２に記載される液体窒素容器を用いた方法では、フタ部に形成されたスリット部に凍結保存用治具を立てかけた際、該凍結保存用治具を安定に保持することは可能であっても、凍結保存用治具の載置部が液体窒素の液面よりも下に位置し、確実に細胞又は組織の凍結状態が維持されているかを確認することが困難であった。また筒状収納部材の長さは、液体窒素容器の底部からフタ部が設置された位置までの長さよりも長い必要があり、このような場合、該筒状の樹脂部材の内部から細胞保持部材本体部を取り出す作業は煩雑であり、迅速な融解操作を行う観点で改善が望まれていた。

　また前述した特許文献７及び特許文献８では、卵子又は胚を載置するフィルムの幅を制限することによって、また特許文献９～１１では卵子又は胚の周囲に付着した余分な保存液を取り除く吸収性能を備えた凍結保存用治具によって、少ない量の保存液とともに卵子又は胚を凍結保存し、優れた生存率を得る方法が提案されている。しかしながら、これらの方法では、胚または卵子を融解・回収する融解操作時に、フィルム上に気泡が付着し、顕微鏡観察下において載置された胚又は卵子と気泡の区別がつきづらいといった問題があった。さらには、フィルム上に付着した気泡が卵子又は胚に付着し、これらの視認が阻害されるほか、気泡の浮力により卵子又は胚が不意に顕微鏡視野から外れてしまうといった問題があり、胚又は卵子の回収作業を阻害するといった問題もあった。

　本発明は、細胞又は組織のガラス化凍結保存の融解操作時において、好適な作業性を実現するための固定具を提供することを主な課題とする。より具体的には、凍結保存用治具を安定に保持することが可能で、凍結された細胞又は組織を融解液に移す操作に先立って、該細胞又は組織が確実に冷却された状態にあることを確認でき、凍結された細胞又は組織を保温された融解液中に迅速に移すことが可能な凍結保存用治具の固定具を提供することを課題とする。

　また本発明は、煩雑な作業を必要とせずに、細胞又は組織を凍結後に融解する際に、細胞又は組織の回収操作が容易な凍結融解方法を提供することを課題とする。

　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の構成を有する凍結保存用治具の固定具（以下、「本発明の固定具」ともいう。）によって上記課題を解決できることを見出した。また以下に記載する細胞または組織の凍結融解方法によって上記課題を解決できることを見出した。

［１］上面、側面及び底面を有する基材の上面に、少なくとも片端が基材の側面部に開口したスリット部を有するか、あるいは基材の上面に凍結保存用治具を挿入する挿入部と該挿入部の側面部に片端が開口したスリット部を有する凍結保存用治具の固定具であって、該スリット部は凍結保存用治具を固定するための固定構造部を有し、該固定構造部が下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の構造部のうちの少なくとも１つの構造部であることを特徴とする、凍結保存用治具の固定具。
（Ｉ）スリット部の内部の側面に形成された凹凸構造部。
（ＩＩ）スリット部の内部の側面間の距離が、スリット部の奥に進むほど徐々に狭まったテーパー構造部。
（ＩＩＩ）スリット部がスリット開口部から基材の内部に向かって直進した後に、該直進方向とは異なる方向に屈曲した屈曲構造部。
［２］固定構造部として、上記した（ＩＩ）のテーパー構造部、及び／または上記した（ＩＩＩ）の屈曲構造部の何れかを有することを特徴とする、上記［１］に記載の凍結保存用治具の固定具。
［３］固定構造部として上記した（ＩＩ）のテーパー構造部を有し、該テーパー構造部が下記式（１）の要件を満たすことを特徴とする、上記［１］または［２］に記載の凍結保存用治具の固定具。
（Ｔ２１－Ｔ２２）／Ｔ１１≦０．０３　　　式（１）
（式中、Ｔ２１はスリット開口部に最も近い部分におけるテーパー構造部の幅を表し、Ｔ２２はスリット開口部から最も離れた部分におけるテーパー構造部の幅を表し、Ｔ１１はテーパー構造部の奥行き長さを表す。）
［４］固定構造部として、上記した（ＩＩＩ）の屈曲構造部を有し、スリット部が直進方向とは異なる方向に屈曲した後に上記した（ＩＩ）のテーパー構造部を有する事を特徴とする、上記［１］～［３］の何れかに記載の凍結保存用治具の固定具。
［５］基材の上面または側面に、該基材の上面よりも上方に伸長した液面ゲージ部を有することを特徴とする、上記［１］～［４］の何れかに記載の凍結保存用治具の固定具。
［６］載置部を有する本体部材及び該本体部材に着脱自在なキャップ部材を少なくとも有する凍結保存用治具の載置部に、細胞又は組織を保存液と共に載置し、該載置部をキャップ部材で密閉する密閉工程と、該密閉した載置部を冷却溶媒により冷却し、細胞又は組織を凍結する凍結工程と、該凍結工程において凍結された細胞又は組織の凍結状態を維持する保冷工程と、および凍結状態が維持されていた細胞又は組織を融解する融解工程とを少なくとも有し、該融解工程の開始前において、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織を、上記［１］～［５］の何れかに記載の凍結保存用治具の固定具が有する固定構造部に固定し、該細胞又は組織が冷却溶媒の液面よりも下方に位置し、かつ本体部材とキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態で一旦保持し、該融解工程では本体部材とキャップ部材を分離し、本体部材が有する載置部を融解液に浸漬して細胞又は組織を融解することを特徴とする、細胞又は組織の凍結融解方法。
［７］上記した載置部が保存液吸収体を有することを特徴とする、上記［６］に記載の細胞又は組織の凍結融解方法。

　本発明によれば、細胞又は組織のガラス化凍結保存の融解操作時において、好適な作業性を実現するための固定具を提供することができる。より具体的には、凍結保存用治具を安定に保持することが可能で、凍結された細胞又は組織を融解液に移す操作に先立って、該細胞又は組織が確実に冷却された状態にあることを確認でき、凍結された細胞又は組織を保温された融解液中に迅速に移すことが可能な凍結保存用治具の固定具を提供することができる。

　また本発明によれば、煩雑な作業を必要とせずに、細胞又は組織を凍結後に融解する際に、細胞又は組織の回収操作が容易な凍結融解方法を提供することができる。

本発明の固定具で固定される凍結保存用治具の一例を示す上面概略図である。本発明の固定具で固定される凍結保存用治具の一例を示す側面概略図である。本発明の固定具で固定される凍結保存用治具のキャップ部材の一例を示す側面断面図である。本発明の固定具で固定される凍結保存用治具のキャップ部材の一例を開口部側から見た側面図である。本体部材とキャップ部材を篏合・固定した状態の一例を示す概略図である。凍結保存用治具に細胞と保存液を載置した状態を示す側面概略図である。凍結保存用治具に細胞と保存液を載置した後に、キャップ部材を篏合・固定した状態を示す側面概略図である。本発明の固定具の一例を示す上面概略図である。本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。本発明の固定具が有するスリット部の一例を示す側面概略図である。本発明の固定具が有するスリット部の別の一例を示す側面概略図である。本発明の固定具が有するスリット部のまた別の一例を示す側面概略図である。本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。本発明の固定具が有するスリット部のまた別の一例を示す側面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す側面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す側面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す側面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す側面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す側面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。本発明の固定具のまた別の一例を示す側面概略図である。融解工程の開始前に、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織が冷却溶媒の液面よりも下方に位置し、かつキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態を示す概略図である。融解工程の開始前に、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織が冷却溶媒の液面よりも下方に位置し、かつキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態を示す別の概略図である。本体部材とキャップ部材を分離し、載置部を融解液に浸漬した状態を示す概略図である。

　本発明の凍結保存用治具の固定具（以下、本発明の固定具と記載）は、細胞又は組織の凍結保存用治具を固定するために用いられるものである。また本発明の固定具は、細胞又は組織をいわゆるガラス化凍結保存法において凍結保存する際に、好適に用いられるものである。本発明において細胞とは、単一の細胞のみならず、複数の細胞からなる生物の細胞集団を含むものである。複数の細胞からなる細胞集団とは単一の種類の細胞から構成される細胞集団でも良いし、複数の種類の細胞から構成される細胞集団でも良い。また、組織とは、単一の種類の細胞から構成される組織でも良いし、複数の種類の細胞から構成される組織でも良く、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものでも良い。本発明の固定具は卵子又は胚の凍結保存において、特に好適に用いることができる。

　本発明の固定具は、細胞又は組織の凍結保存用治具の固定具、細胞又は組織の凍結保存用治具の固定用具、細胞又は組織の凍結保存用治具の固定器具、細胞又は組織の凍結保存用具の固定具、細胞又は組織の凍結保存器具の固定具と言い換えることができる。

　以下に本発明の固定具について詳細に説明する。

　本発明の固定具は上面（天面）、側面及び底面を有する基材からなる凍結保存用治具の固定具であって、凍結保存用治具を固定するためのスリット部を基材の上面に有する。あるいは基材の上面に凍結保存用治具を挿入する挿入部と該挿入部の側面部に片端が開口したスリット部を有する。本発明において該スリット部は、基材の上面に１ヶ所有していればよく、複数ヶ所に有していても良い。

　本発明の固定具を用いて凍結保存用治具を固定するにあたり、該凍結保存用治具が有する筒状収納部材の先端部、あるいはキャップ部材の先端部を、本発明の固定具が有するスリット部に挿入した後、該スリット部に沿って凍結保存用治具をスリット奥側へ移動させる。本発明の固定具が有するスリット部の幅は、凍結保存用治具を移動させる際の操作性と、凍結保存用治具の固定安定性を両立させる観点から、筒状収納部材の先端部の幅あるいはキャップ部材の先端部の幅に対し、９０～１１０％であることが好ましい。なお、筒状収納部材としては特許文献５に記載されたような、細胞保持部材を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材を使用することができる。

　本発明の固定具が有するスリット部は、挿入された凍結保存用治具を強固に固定・保持するために固定構造部を有し、該固定構造部として下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の構造部のうちの少なくとも１つの構造部を有する。
（Ｉ）スリット部の内部の側面に形成された凹凸構造部。
（ＩＩ）スリット部の内部の側面間の距離が、スリット部の奥に進むほど徐々に狭まったテーパー構造部。
（ＩＩＩ）スリット部がスリット開口部から基材の内部に向かって直進した後に、該直進方向とは異なる方向に屈曲する屈曲構造部。

　スリット部の内部の側面に形成された凹凸構造部について説明する。該スリット部の内部の側面に形成された凹凸構造部は、凍結保存用治具が有する先端部（筒状収納部材の先端部、あるいはキャップ部材の先端部）が凹凸構造を有する場合、固定具が有する凹凸構造部と凍結保存用治具が有する凹凸構造部とがはまり込むことで、凍結保存用治具を固定具に確実に固定することができる。スリット部が有する凹凸構造部は、スリット部の内部の側面において、固定具の底面に平行な方向に凹凸構造部の凹部及び／または凸部が延びた形状であることが好ましい。

　本発明の固定具が、スリット部の内部の側面に凹凸構造部を有する場合、固定される凍結保存用治具の先端部の形状、好ましくはキャップ部材の先端部の形状に合わせて、任意の形状の凹型構造及び／または凸型構造を有することができる。また、固定具が有する凹凸構造部の断面形状は、固定される凍結保存用治具の先端部の凹凸構造部の断面形状と同じ形状であることが好ましい。

　本発明の固定具が、スリット部の内部の側面に凹凸構造部を有する場合、スリット部の内部の側面の少なくとも一ヶ所に有していれば良い。凍結保存用治具の固定安定性を高める観点から、該スリット部の内部の互いに向かい合った側面の両面に凹凸構造部を有していることがより好ましい。ここで互いに向かい合った側面の両面とは、本発明の固定具を上方から見た際の上面概略図において、互いに向かい合っている側面の両面を意味する。なおこれら側面の両面に位置する凹凸構造部はスリット部の奥側で連続して繋がっていても良い。

　本発明の固定具が有するスリット部が固定構造部としてテーパー構造部を有する場合、該スリット部は、凍結保存用治具を挿入するスリット開口部から、挿入するにしたがってスリット部の内部の側面間の距離が短くなる。本発明の固定具が有するスリット部がテーパー構造部を有すると、挿入した凍結保存用治具はテーパー構造部にはまり込むことで、凍結保存用治具を固定具に確実に固定することができ、好ましい。テーパー構造の形状は、固定される凍結保存用治具の先端部の形状、具体的には筒状収納部材の先端部の形状、あるいはキャップ部材の先端部の形状に合わせて、任意の形状のテーパー構造を有することができるが、該テーパー構造部が下記の式（１）を満たす場合、凍結保存用治具の固定安定性にとりわけ優れた固定具が得られるため、好ましい。

（Ｔ２１－Ｔ２２）／Ｔ１１≦０．０３・・・・式（１）
（式中、Ｔ２１はスリット開口部に最も近い部分におけるテーパー構造部の幅を表し、Ｔ２２はスリット開口部から最も離れた部分におけるテーパー構造部の幅を表し、Ｔ１１はテーパー構造部の奥行き長さを表す。）

　本発明の固定具が有するスリット部が固定構造部として、屈曲構造部を有する場合、該スリット部は、凍結保存用治具を挿入するスリット開口部から、基材の内部に向かって一定距離直進した後に、該直進方向とは異なる方向に屈曲した構造を有する。該スリット部が屈曲構造部を有する場合には、スリット開口部から挿入された凍結保存用治具は屈曲構造部を経て、開口部から直進した方向とは別の方向へさらに直進挿入され、固定されるため、開口部側への不意な脱落を防止することができ、好ましい。なお基材の内部に向かって直進する一定距離は、固定されるキャップ部材の外形長さ（キャップ部材外形の挿入方向長さ）の３倍以上であることが好ましい。

　上述した（Ｉ）～（ＩＩＩ）の固定構造部の中でも、凍結保存用治具を確実に固定することができ、かつ固定する際の操作性に優れた（ＩＩ）のテーパー構造部は好ましい。また開口部側への凍結保存用治具の不意な脱落を防止できる（ＩＩＩ）の屈曲構造部は好ましい。更には、上述した（ＩＩＩ）の屈曲構造部を有し、スリット部が直進方向とは異なる方向に屈曲した後に、上記した（ＩＩ）のテーパー構造部を有する固定具は、凍結保存用治具の開口部側への不意な脱落を防止できると共に、凍結保存用治具の固定安定性と固定する際の操作性に優れるため、特に好ましい。

　本発明の固定具の形状（基材にスリット部が設けられていないとみなし、あるいは基材の上方に凍結保存用治具を挿入するための挿入部が設けられていないとみなし、また後述する液面ゲージ部が付設されていないとみなした際の概略形状）は、三角柱、四角柱、六角柱等の角柱構造の他、上面を設けた三角錐、四角錐等の角錐の部分構造が挙げられる。好ましくは、角柱構造であり、より好ましくは四角柱構造である。また、上記した以外にも円柱構造や円錐の部分構造も例示することができる。

　本発明において基材は液体窒素耐性材料で形成されることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミ、鉄、銅、ステンレス合金などの各種金属、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素系樹脂や各種エンジニアリングプラスチック、さらにはガラス、ゴム素材などを好適に用いることができる。特に金属は、優れた耐久性を有することに加えて、自重が大きく、凍結保存用治具を良好に固定できる観点から好ましい。中でも加工性の観点からアルミが好ましい。本発明の固定具は、一種類の素材から構成されていても良いし、複数の素材から構成されていても良い。

　本発明の固定具は基材の上面または側面に、該基材の上面よりも上方に伸長した液面ゲージ部を有することが好ましい。本発明の固定具が有する液面ゲージ部は、冷却溶媒の液面を管理するために用いる構造体である。液面ゲージ部があることにより、冷却溶媒の液面が容易に調整可能である。言い換えれば、細胞又は組織が載置された凍結保存用治具を本発明の固定具に固定した際に、凍結保存用治具に載置された細胞又は組織が確実に冷却された状態にあることを容易に確認することができる。

　本発明の固定具が好ましく有する液面ゲージ部は、容器の底から冷却溶媒の液面方向に延びた煙突状（四角柱等の角柱状または円柱状）の形状であることが好ましい。また液面ゲージ部は前述した基材と同様、液体窒素耐性材料で形成されることが好ましい。

　本発明の固定具が有する液面ゲージ部は、基材の上面よりも上方に伸長し、冷却溶媒の液面を管理する基準となり得るものであれば、特に形態は問わないが、作業者が容易に液面の位置を視認できる観点から、冷却溶媒の液面から出ているか、もしくは、わずかに液面に隠れる程度であることが好ましい。

　本発明の固定具が有する液面ゲージ部が、冷却溶媒の液面から突出する高さを有する場合、該液面ゲージ部はマーキング部を有することが好ましい。マーキング部の形態は特に限定されないが、冷却溶媒の液面に平行な線分であることが好ましい。マーキング部は、冷却溶媒の液面の高さの基準となる観点から、高さ方向に対して一ヶ所有していればよく、二ヶ所以上有していても良い。

　本発明の固定具は、細胞又は組織の凍結保存～融解の一連のプロセスにおいて、特に、液体窒素に代表される冷却溶媒が投入されたタンクから、凍結された細胞又は組織が一旦取り出された後の保冷操作、及び細胞又は組織を融解する際の融解操作において好適に用いることができる。一般に、細胞又は組織をいわゆるガラス化凍結法で保存する際、短冊状のストリップを有する凍結保存用治具を用いて凍結保存が行われる。このような凍結保存用治具は、前述した特許文献７～１１以外にも、例えば国際公開第２０１１／０７０９７３号に開示されている。

　凍結保存～融解の一連のプロセスとしては、第一に、凍結保存用治具のストリップに、平衡化処理がなされた細胞又は組織を保存液と共に滴下付着させ、次いで冷却溶媒（好ましくは液体窒素）を用いて細胞又は組織を冷却し、凍結操作を行う。第二に、凍結操作を行った細胞又は組織を、冷却溶媒タンクの内部で極低温の環境を保ったまま長期間保存する。第三に、凍結された細胞又は組織を、極低温の環境からいわゆる融解液と呼ばれる溶液中に移し、融解液中で融解・解凍する融解操作を行う。本発明の固定具は、前記した冷却溶媒タンクから細胞又は組織を取り出した後の保冷操作及び融解操作において、凍結保存用治具を固定・保持するために好適に用いることができる。

　本発明の固定具を用いた凍結保存～融解のプロセスにおける融解操作では、冷却溶媒タンク内にてガラス化状態が維持された凍結保存用治具を、該タンク内から取り出し、細胞又は組織を融解液に移す操作に先立って、本発明の固定具を用いて冷却溶媒中で保冷する。その際、本発明の固定具によって、凍結保存用治具が有する筒状収納部材の先端部、あるいはキャップ部材の先端が（凍結された細胞または組織が）、冷却溶媒の液面下に位置し、かつ該凍結保存用治具の一部が冷却溶媒の液面上に位置するように保持しておけば、細胞また組織を融解液中に迅速に移動することができる。したがって本発明により、凍結された細胞または組織の融解速度の低下を防ぐことができる。

　本発明の固定具は、細胞又は組織の凍結保存～融解の一連のプロセスで、細胞又は組織が冷却溶媒に接触しない、いわゆる閉鎖型の凍結保存～融解のプロセスに好ましく用いることができる。

　閉鎖型の凍結保存～融解のプロセスでは、凍結操作の際に、ストリップに対し細胞又は組織を保存液と共に滴下付着させた後に、端部が完全に閉塞された筒状収納部材により凍結保存用治具を被包し、外界から遮断する。あるいはストリップに対し細胞又は組織を保存液と共に滴下付着させた後に、キャップ部材により該ストリップを被包し、外界から遮断する。かかる遮断の後、該凍結保存用治具を冷却溶媒（好ましくは液体窒素）に浸漬して、細胞又は組織を冷却・凍結する。前記した閉鎖型の凍結操作及び保管等の際には、筒状収納部材あるいはキャップ部材を介して、細胞又は組織周辺の空気及び保存液が冷却され、ガラス化状態が維持される。

　ガラス化状態が維持された後、液体窒素の液面上に位置する筒状収納部材に固定された蓋を取り外すことで、細胞又は組織が載置された凍結保存用治具を、液体窒素に触れることなく迅速に取り出し、融解液中に浸漬することができる。あるいは本発明の固定具により固定されているキャップ部材から、細胞又は組織が載置されたストリップを有する凍結保存用治具を引き抜くことで、該ストリップに保持された細胞又は組織を液体窒素に触れることなく迅速に取り出し、融解液中に浸漬することができる。より迅速な操作が可能になるとの観点から、後者の凍結保存用治具が好ましい。

　上記した操作により融解液中に浸漬される細胞又は組織は、筒状収納部材より蓋部材が取り外されてから５分以内に融解液に浸漬することが好ましく、より好ましくは１分以内である。またキャップ部材からストリップを有する凍結保存用治具を引き抜くにあたり、一旦嵌合が緩められてから、５分以内に融解液に浸漬することが好ましく、より好ましくは１分以内である。筒状収納部材から蓋部材を取り外してから、あるいは凍結保存用治具を引き抜く際のキャップ部材との嵌合が緩められてから等の、いわゆる密閉状態が開放された期間が長い場合、空気中の窒素や酸素等の気体が、筒状収納部材内、あるいはキャップ部材内に入り込み、次いで冷却されて、液化することがある。液化した気体は載置部に付着して、融解液中に持ち込まれ、融解液の温度を下げる場合がある。融解液の温度が下がると、融解速度が遅くなってしまい、好ましくない。

　本発明の固定具は、細胞又は組織の凍結保存～融解の一連のプロセスで、細胞又は組織が液体窒素に接触する、いわゆる開放型の凍結保存・融解のプロセスにも用いることができる。開放型のプロセスにおいても、凍結された細胞又は組織を融解液に移す操作に先立って、本発明の固定具を用いて、凍結保存用治具を固定・保持しておくと、細胞又は組織を液体窒素中から融解液に迅速に移すことができるため、好ましい。

　ところで前述した、筒状の収納容器に凍結保存用治具全体を収納する方法では、融解工程の際に切断器具や取り出し器具が必要になったり、収納された凍結保存用治具を取り出す操作が煩雑となる場合があった。

　上記した理由から、載置部を有する本体部材及び該本体部材に着脱自在なキャップ部材を少なくとも有する凍結保存用治具は好適であり、また該凍結保存用治具の載置部に、細胞又は組織を保存液と共に載置し、該載置部をキャップ部材で密閉する密閉工程と、該密閉した載置部を冷却溶媒により冷却し、細胞又は組織を凍結する凍結工程と、該凍結工程において凍結された細胞又は組織の凍結状態を維持する保冷工程と、および凍結状態が維持されていた細胞又は組織を融解する融解工程とを少なくとも有し、該融解工程の開始前において、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織を、前述した（１）～（５）の何れかに記載の凍結保存用治具の固定具が有する固定構造部に固定し、該細胞又は組織が冷却溶媒の液面よりも下方に位置し、かつ本体部材とキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態で一旦保持し、該融解工程では本体部材とキャップ部材を分離し、本体部材が有する載置部を融解液に浸漬して細胞又は組織を融解する細胞又は組織の凍結融解方法は、好ましい。

また載置部が保存液吸収体を有する場合、余分な保存液を効果的に除去することができるため、高い操作性が得られることに加え、細胞又は組織の周囲に存在する保存液をより少ないものとできるため、高い凍結速度と融解速度が得られるため好ましい。

本発明の凍結融解方法では、第一に、上記した凍結保存用治具が有する載置部に細胞又は組織を保存液と共に載置する。かかる作業は透過型の顕微鏡観察下（以下、単に顕微鏡観察下とも記載）において行うことが好ましい。この時、凍結保存用治具が有する載置部が保存液吸収体を有すると、余分な保存液を効果的に除去することができるため、高い操作性が得られることに加え、細胞又は組織の周囲に存在する保存液をより少ないものとできるため、高い凍結速度と融解速度が得られるため好ましい。

　次いで、第二に、本体部材の載置部をキャップ部材に挿入し、キャップ部材を篏合・固定する。キャップ部材へ載置部を挿入する工程は、顕微鏡観察下で行ってもよい。載置部は、キャップ部材に挿入後、キャップ部材で完全に被覆し、キャップ部材を本体部材の嵌合構造部に篏合・固定することで完全に密閉する。

　次いで、キャップ部材を液体窒素等の冷却溶媒に浸漬し、載置部上に載置した細胞又は組織を冷却・凍結する。この時、キャップ部材によって被包され、完全に密閉された載置部及び載置部上の細胞又は組織は冷却溶媒と接触せずに冷却される。

　細胞又は組織を保存液と共に載置部に載置してから、密閉工程を経て、キャップ部材で密閉された本体部材を冷却溶媒に浸漬するまでの時間は、１分以内であることが好ましい。より好ましくは３０秒以内である。

　冷却された細胞又は組織は、そのガラス化凍結状態を維持したまま、冷却溶媒等により極低温が保たれた低温保管容器の中で保冷される。

　本発明の凍結融解方法では、融解工程に先立って、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織は、冷却溶媒の液面よりも下方に位置し、かつ凍結保存用治具のキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態で一旦保持される。この時、キャップ部材の固定機能を有した固定具を用いて凍結保存用治具を保持すると、ハンドリング性が向上し、好ましい。

　本発明の凍結融解方法では、融解工程の開始前において、凍結保存用治具のキャップ部材によって密閉された細胞又は組織の位置は冷却溶媒の中にあるが、本体部材とキャップ部材の接合部が冷却溶媒中に入らない状態で一旦保持したのちに、次いで、本体部材とキャップ部材の篏合・固定を緩め、その後キャップ部材と本体部材を分離する。そして、載置部を融解液に浸漬する融解工程を行う。融解工程前のこれらの操作により、本体部材が有する載置部は液体窒素等の冷却溶媒に接触することなく、融解液中に迅速に浸漬することができる。本体部材とキャップ部材の篏合・固定を緩めてから、載置部を融解液に浸漬するまでの時間は５分以内であることが好ましい。より好ましくは１分以内である。篏合・固定を緩め、密閉状態が開放された状態が長い場合、窒素や酸素等の気体が、キャップ部材内に入り込み、次いで冷やされて、液化することがある。液化された気体が載置部に付着し、融解工程の際に融解液中に持ち込まれると、融解液の温度を下げるおそれがあり、好ましくない。

　以上、本発明における凍結融解方法について説明した。次に本発明で用いる凍結保存用治具、および本発明の固定具について、図面に沿ってさらに詳細に説明する。

　図１は、本発明の固定具で固定される凍結保存用治具の一例を示す上面概略図である。図１に示す本体部材２は載置部４を有し、載置部４は把持部５に付設されている。把持部５は、細胞又は組織を載置する側を識別するためのマーキング部６を有する。図１に示すように、載置部４にもマーキング部を設けてもよい。また本体部材２は、キャップ部材を本体部材２に固定するための嵌合構造部７を有する。図１において、嵌合構造部７はテーパー構造を有している。

　本発明において把持部は、把持のしやすさや、操作性の向上を目的として、角柱状であることが好ましい。該把持部は、液体窒素等の冷却溶媒に耐性がある素材により形成された部材であることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミニウム、鉄、銅、ステンレスなどの各種金属、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素樹脂や各種エンジニアリングプラスチック、さらにはガラスなどを好適に用いることができる。

　図２は、本発明の固定具で固定される凍結保存用治具の一例を示す側面概略図である。図２に示す本体部材２が有する把持部５はその一部に凹部を設けることにより、操作者が本体部材２を把持した際に、載置部４の表裏の識別、すなわち細胞又は組織を載置する側の識別を容易としている。

　図３は、本発明の固定具で固定される凍結保存用治具のキャップ部材の一例を示す側面断面図であり、詳細には、前述した本発明の固定具が、固定構造部として（Ｉ）スリット部の内部の側面に形成された凹凸構造部を有する場合に好適なキャップ部材の一例である。また図３はキャップ部材３の内部構造を図示したものである。キャップ部材３はその一端のみが開口した構造であり、開口部の近傍には、本体部材と篏合するための篏合接触部８が形成されている。また該キャップ部材３は、融解工程の開始前にキャップ部材３を固定具に固定するための固定部位９を有する。

　なお本発明の固定具が、固定構造部として、（ＩＩ）スリット部の内部の側面間の距離が、スリット部の奥に進むほど徐々に狭まったテーパー構造部、あるいは（ＩＩＩ）スリット部がスリット開口部から基材の内部に向かって直進した後に、該直進方向とは異なる方向に屈曲した屈曲構造部を有する場合、キャップ部材３は固定部位９を有していなくても良い。

　図４は、本発明の固定具で固定される凍結保存用治具のキャップ部材の一例を開口部側から見た側面図である。図４に示すようにキャップ部材３は、四角柱状の外形形状に、円錐台の内面状の内腔形状を有している。

　図５は、本体部材とキャップ部材を篏合・固定した状態の一例を示す概略図である。なお、以下の図も含めて、キャップ部材３に被包されている載置部４の様子が分かるように、キャップ部材３の部分は内部構造を図示している。図５に示す凍結保存用治具１は、本体部材２が有する本体部材の嵌合構造部７とキャップ部材３との篏合接触部８により、キャップ部材３が本体部材２に完全に篏合・固定され、載置部４は、キャップ部材３によって、被包・密閉され、保護されている。キャップ部材３と本体部材２の境目が接合部１０である。

　上記した筒状収納部材およびキャップ部材は、例えば、各種樹脂、金属等の液体窒素等の冷却溶媒に耐性がある素材を用いて形成することができる。キャップ部材は１種類の素材からなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものでも良い。中でも樹脂は射出成型等のプロセスにより、テーパー構造やねじ切り構造を容易に形成できるため、好ましい。樹脂の具体例としては、ポリエチレンテレフタレートやポリエチレンナフタレート等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアクリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂が挙げられる。また、キャップ部材の全光線透過率が８０％以上であると、キャップ部材を篏合後に、キャップ部材の内部の載置部の様子を容易に確認することができるため好ましい。

　図６は、凍結保存用治具に細胞と保存液を載置した状態を示す概略図である。本発明の凍結融解方法において、操作者は、本体部材２に付設された載置部４上に、細胞１１と保存液１２を滴下付着し、細胞１１を載置部４上に載置する。

　図７は、凍結保存用治具に細胞と保存液を載置した後に、キャップ部材を篏合・固定した状態を示す側面概略図である。本体部材２の載置部４上に保存液１２と共に、細胞１１を滴下付着し、載置した後に、キャップ部材３を本体部材２に篏合・固定する。これにより、載置部４上に載置された細胞１１は、キャップ部材３により完全に被包・密閉され、外部環境から完全に保護される。

　上記した本体部材２が有する載置部４は、短冊状であることが好ましい。短冊状であると載置部をキャップ部材によって被包・保護することが容易である。また本体部材２が有する載置部４の形状は、平坦な平面シート形状、曲率を有するシート形状、Ｖ字型シート形状等とすることができる。平坦な平面シート形状は、細胞又は組織を載置部上に載置する作業において、作業性が高く好ましい。

　本発明において凍結保存用治具が有する載置部としては、例えば、各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等が挙げられる。載置部は１種類の素材からなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものでも良い。中でも樹脂フィルムは、取り扱いの観点で好適に用いられる。樹脂フィルムの具体例としては、ポリエチレンテレフタレートやポリエチレンナフタレート等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアクリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂フィルムが挙げられる。また、載置部の全光線透過率が８０％以上であると、載置部に載置した細胞又は組織を、透過型顕微鏡を用いて容易に確認することができるため好ましい。

　本発明において凍結保存用治具が有する載置部として、熱伝導性に優れ、急速な凍結を可能にするという観点で金属板も好適に用いることができる。金属板の具体例としては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、鉄、ステンレスなどを挙げることができる。上記した各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等の厚さは１０μｍ～１０ｍｍであることが好ましい。また目的に応じて、各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等の表面を、例えばコロナ放電処理のような電気的な方法や、あるいは化学的な方法により親水化することもでき、さらには粗面化することも可能である。

　本発明において凍結保存用治具が有する載置部として保存液吸収体を用いることもできる。載置部に保存液吸収体を用いると、該保存液吸収体により、余分な保存液を効果的に除去することができるため、細胞又は組織を載置し凍結する時の操作性が向上する。

　上記した保存液吸収体としては、例えば金網、紙等や合成樹脂からなるフィルム状物で貫通孔を有したものが例示される。その他の保存液吸収体として、屈折率が１．４５以下の素材を用いて形成された多孔質構造体が例示される。該多孔質構造体により、細胞又は組織の周囲に存在する保存液を除去することができる。また、透過型の光学顕微鏡観察下において、細胞又は組織を載置し凍結する操作および凍結後に融解する操作を、良好な視認性にて容易かつ確実に行うことができる。

　上記した多孔質構造体の素材の屈折率は、例えば、アッベ屈折計（Ｎａ光源、波長：５８９ｎｍ）を用いてＪＩＳ　Ｋ　００６２：１９９２、ＪＩＳ　Ｋ　７１４２：２０１４に準じて測定できる。多孔質構造体を形成する屈折率が１．４５以下の素材としては、ポリテトラフルオロエチレン樹脂、ポリビニリデンジフロライド樹脂、ポリクロロトリフルオロエチレン樹脂などのフッ素樹脂やシリコン樹脂のようなプラスチック樹脂材料、二酸化ケイ素のような金属酸化物材料、フッ化ナトリウム、フッ化マグネシウム、フッ化カルシウムのような無機材料が挙げられる。

　多孔質構造体による保存液吸収体の細孔径は５．５μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１．０μｍ以下、さらに好ましくは０．７５μｍ以下である。これにより光学顕微鏡観察下における細胞又は組織の視認性を高めることができる。保存液吸収体の厚みは、１０～５００μｍであることが好ましく、より好ましくは２５～１５０μｍである。なお、保存液吸収体の細孔径は、プラスチック樹脂材料の多孔質構造体の場合には、バブルポイント試験により測定される最も大きい細孔の直径である。また金属酸化物あるいは無機材料の多孔質構造体の場合には、該多孔質構造体の表面及び断面の画像観察から測定した平均細孔直径である。

　保存液吸収体の空隙率は３０％以上であることが好ましく、より好ましくは７０％以上である。空隙率とは、以下の式で定義される。ここで空隙容量Ｖは水銀ポロシメーター（測定器名称ＡｕｔｏｐｏｒｅＩＩ９２２０製造者ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い測定・処理された、保存液吸収体における細孔半径３ｎｍから４００ｎｍまでの累積細孔容積（ｍｌ／ｇ）に、保存液吸収体の乾燥固形分量（ｇ／平方メートル）を乗ずることで、単位面積（平方メートル）当たりの数値として求めることができる。また保存液吸収体の厚みＴは保存液吸収体の断面を電子顕微鏡で撮影し測長することで得ることができる。
Ｐ＝（Ｖ／Ｔ）×１００（％）
　Ｐ：空隙率（％）
　Ｖ：空隙容量（ｍｌ／ｍ^２）
　Ｔ：厚み（μｍ）

　図８は、本発明の固定具の一例を示す上面概略図である。図８において固定具１３は、基材２５の上面に凍結保存用治具が挿入されるスリット部１４を１ヶ所有している。スリット部１４は一方が基材２５の側面部にスリット開口部１６を有しており、もう一方は図中上面の中央部側で閉塞している。図示しない凍結保存用治具をスリット部１４に挿入する際には、凍結保存用治具をスリット開口部１６の側からスリット部１４に沿って図中上面の中央部に向かって挿入する。

　図８に示すＴ１は固定具１３のスリット部１４の長さ（奥行）を示す。Ｔ１は、凍結保存用治具を挿入後に保持できる長さであれば特に制限されないが、前述したクライオトップ法により細胞又は組織を凍結及び融解する場合、Ｔ１は３～５０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは５～４０ｍｍである。なお以下の説明において記載する、固定具１３の各寸法はいずれも、クライオトップ法による凍結及び融解作業を意図した寸法である。

　図８に示すＴ２はスリット部１４の幅方向の長さを示す。本発明においてＴ２は凍結保存用治具を挿入し、固定・保持できる長さであれば特に制限されないが、１～１０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは２～５ｍｍである。

　図９は、本発明の固定具の一例を示す上面概略図である。図９において、固定具１３は、基材２５の上面に凍結保存用治具が挿入される溝状構造であるスリット部１４を１ヶ所有している。スリット部１４は一方が基材２５の側面部にスリット開口部１６で開口しており、もう一方は上面の中央部側で閉塞している。そして、スリット部１４は凍結保存用治具を固定するために、その内部の側面に凹凸構造部１５を有する。この様な構造であると、スリット開口部１６から図示しないキャップ部材３を挿入し、閉塞部に向かってスライドさせながら差し込み、閉塞した端にてキャップ部材３を確実に固定することができる。なお、図９には凸型の凹凸構造部を図示している。図示しない凍結保存用治具をスリット部１４に挿入する際には、凍結保存用治具をスリット開口部１６の側からスリット部１４に沿って基材上面の中央部に向かって挿入する。

　図９に示すＴ１は固定具１３のスリット部１４の長さ（奥行）を示す。Ｔ１は、凍結保存用治具を挿入後に保持できる長さであれば特に制限されないが、前述したようにＴ１は３～５０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは５～４０ｍｍである。

　図９に示すＴ２は、スリット部１４の幅方向の長さを示す。本発明においてＴ２は凍結保存用治具を挿入し、固定・保持できる長さであれば特に制限されないが、１～１０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは２～５ｍｍである。

　図９に示すＴ４は、固定具１３のスリット部１４が有する凹凸構造部１５により狭まった部分の幅方向の長さを示す。本発明においてＴ４は、図示しない凍結保存用治具を固定・保持できる長さであれば特に制限されないが、０．５～５ｍｍであることが好ましく、より好ましくは１．５～４ｍｍである。

　図１０は、本発明の固定具（図９の固定具）が有する凹凸構造部の一例を示す側面概略図である。図１０において固定具１３は、基材２５の上面（天面）に凍結保存用治具が挿入されるスリット部１４を有し、スリット部１４は凍結保存用治具を固定するために、その内部の側面に凹凸構造部１５を有する。図１０の固定具が有する凹凸構造部１５は、凸型構造である。図９と同様に、スリット部１４の幅方向の長さをＴ２として、スリット部１４が有する凸型の凹凸構造部１５により狭まった部分の幅方向の長さをＴ４としてそれぞれ示した。

　図１０に示すＴ３は、固定具１３のスリット部１４の深さ方向の長さを示す。本発明においてＴ３は、図示しない凍結保存用治具を固定・保持できる長さであれば特に制限されないが、３～５０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは５～２０ｍｍである。

　図１１は、本発明の固定具が有する凹凸構造部の別の一例を示す側面概略図である。図１１において固定具１３が有するスリット部１４は、凍結保存用治具を固定するため、スリット部１４の内部の片側の側面のみに、凸型構造の凹凸構造部１５を１ヶ所有する。図１１に示すＴ６は、１ヶ所の凸型構造の凹凸構造部１５により狭まった部分の長さを示す。このような形状の固定具を用いると、凍結保存用治具を固定具のスリット部１４に沿わせて挿入する際の作業が容易である。なお、図１０および図１１においては基材側面の形状のみを示しており、スリット部の内部に見える閉塞面などは省略している。

　図１２は、本発明の固定具が有する凹凸構造部の別の一例を示す側面概略図である。図１２において固定具１３が有するスリット部１４は、凍結保存用治具を固定するため、その内部の側面に凹凸構造部１５を有する。図１２の固定具が有する凹凸構造部１５は凹型である。

　図１２に示すＴ５は、スリット部１４が有する凹型の凹凸構造部１５により拡張されたスリット部の幅方向の長さを示す。長さＴ５は、図示しない凍結保存用治具を固定・保持できる長さであれば特に制限されないが、２～１１ｍｍであることが好ましく、より好ましくは２．５～５．５ｍｍである。図１２に示すように、凹型の凹凸構造部１５を有する場合、凹型の凹凸構造部１５により拡張された幅方向の長さＴ５は、前述したスリット部１４の幅方向の長さＴ２よりも大きくなる。

　なお本発明においてスリット部１４が有する凹凸構造部としては、例えば図１０に示した凹凸構造部（スリット部１４の内部の両面に凸部が設けられた凸型の凹凸構造部）を複数箇所有しても良く、あるいは図１２に示した凹凸構造部（スリット部１４の内部の両面に凹部が設けられた凹型の凹凸構造部）を複数箇所有しても良く、更には上記した凸型と凹型の凹凸構造部を併せ有する事も可能である。

　図１３は、本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。図１３において固定具１３が有するスリット部１４は、凍結保存用治具を強固に固定するための固定構造部として、テーパー構造部及び凹凸構造部を有する。

　図１３において、固定具１３が有するスリット部１４の幅方向の長さＴ２は、スリット開口部１６から挿入方向に進むにつれ、徐々に減少する構造となっている。一方、スリット部１４の内部の両側面に形成された凸型の凹凸構造部１５により狭まった幅Ｔ４は一定である。図１３に示す固定具１３を用いると凹凸構造部１５に沿って挿入された凍結保存用治具は、凹凸構造部１５に加えて、奥に挿入するほど幅が狭まるスリット部１４の壁面によっても固定されることから、より強固な固定・保持が可能となる。

　図１４は、本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。図１４において、固定具１３は、凹凸構造部１５と共に、途中で９０度曲がった形状のスリット部１４を有する。このような形状の固定具を用いると、スリット開口部１６から凍結保存用治具をスリット部１４に挿入し、９０度曲がった先まで凍結保存用治具を押し込むことで、固定・保持した凍結保存用治具がスリット開口部１６から不意に脱落することを防止できるので好ましい。

　図１５は、本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。図１５において固定具１３が有するスリット部１４は、凍結保存用治具を強固に固定するための固定構造部として、テーパー構造部を有する。
図１５において、Ｔ２１はスリット開口部に最も近い部分のテーパー構造部の幅を表し、Ｔ２２はスリット開口部から最も離れたテーパー構造部の幅を表し、Ｔ１１はテーパー構造部の奥行き長さを表す。
図１５の固定具１３が有するテーパー構造部は、スリット開口部１６から基材２５の中央部側に向かって、スリット部１４の側面間の距離が徐々に減衰した構造であり、すなわち、Ｔ２１＞Ｔ２２である。図１５に示す固定具のように、スリット部１４がテーパー構造部を有する場合、スリット開口部１６からスリット部１４に沿って挿入した凍結保存用治具を強固に固定することができ、好ましい。また（Ｔ２１－Ｔ２２）／Ｔ１１の値が０．０３以下である場合、凍結保存用治具を強固に保持することが可能であり、かつ凍結された細胞又は組織を保温された融解液中に迅速に移すことが可能となるため好ましい。なお前記した（Ｔ２１－Ｔ２２）／Ｔ１１の値が０．００１以上であることは、凍結保存用治具の固定安定性の観点から好ましい。

　また図１５の固定具１３は、スリット部１４がテーパー構造部のみから構成される例でもある。したがって図１５では、スリット部の幅（Ｔ２）はスリット開口部に最も近い部分のテーパー構造部の幅（Ｔ２１）と等しく、同様に、スリット部の奥行き（Ｔ１）はテーパー構造部の奥行き（Ｔ１１）と等しい。

　図１６は、本発明の固定具の別の一例を示す上面概略図である。図１６において、固定具１３が有するスリット部１４は、凍結保存用治具を強固に固定するための固定構造部として、屈曲構造部を有する。屈曲構造部を有する図１６の固定具のスリット部１４は、スリット開口部１６から基材２５の中央部側に向かって、一定距離直進した後に、途中で９０度屈曲した形状である。スリット部が屈曲した形状の固定具を用いると、固定・保持した凍結保存用治具がスリット開口部１６から不意に脱落することを防止でき、好ましい。

　図１７は、本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。図１７において固定具１３が有するスリット部１４は、凍結保存用治具を固定するための固定構造部として、屈曲構造を有するスリット部と、該スリット部の奥側にテーパー構造部を有する。図１７の固定具１３が有するスリット部１４は、スリット開口部１６から基材２５の中央部側に向かって、一定距離（Ｔ１Ａ）直進し、途中で図中右側に９０度屈曲した形状を有し、また右側に９０度屈曲した後にテーパー構造を有する。また図１７において、スリット開口部に最も近い部分のテーパー構造部の幅（Ｔ２１）と、スリット開口部から最も離れたテーパー構造部の幅（Ｔ２２）との関係は、Ｔ２１＞Ｔ２２である。
また、図１７において、Ｔ１Ｂは、スリット部１４が９０度屈曲した地点から、スリット開口部１６から最も離れた地点までの距離である。

　図１７の形状を有する固定具を用いる場合、スリット開口部１６から凍結保存用治具をスリット部１４に挿入し、９０度屈曲した位置を通過させ、さらにスリット部の閉塞面方向へ凍結保存用治具を挿入させ、テーパー構造により固定することができる。固定構造部として、屈曲構造部とテーパー構造部の両方を有することにより、凍結保存用治具がテーパー構造部から外れた際にも、該凍結保存用治具を屈曲構造部によって保持することが可能であり、好ましい。

　図１８は、本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。図１８において、固定具１３が有するスリット部１４は、凍結保存用治具を固定するための固定構造部として、屈曲構造部とテーパー構造部の両方を有する。図１８に示す固定具はテーパーを有した案内部と、凍結保存用治具を固定するためのテーパー構造部を有する。このような場合、スリット開口部に最も近い部分のテーパー構造部の幅（Ｔ２１）と、スリット開口部から最も離れたテーパー構造部の幅（Ｔ２２）との関係（Ｔ２１＞Ｔ２２）を満たすテーパー構造部は、該スリット部の奥側に位置することが好ましく、この場合、凍結保存用治具を強固に固定・保持すると共に、実質固定するテーパー構造部へ挿入する際の作業性を良好にすることが可能となり、好ましい。

　図１９は、本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。図１９において、固定具１３は、基材２５の上面（天面）に、凍結保存用治具を挿入する挿入部２６を有し、該挿入部２６の側面部にスリット開口部１６を有する。図１９のような固定具では、基材の側面部に開口部を有さないために、固定・保持した凍結保存用治具の不意な脱落が生じにくい構造となっている。

　図２０は本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。図２０において固定具１３は、基材２５の上面に凍結保存用治具を挿入する挿入部２６と該挿入部２６の側面に片端が開口したスリット部１４を有し、該スリット部１４は凍結保存用治具を固定するためのテーパー構造部を有する。このような形状の固定具を用いると、テーパー構造部により凍結保存用治具を強固に固定でき、また固定・保持した凍結保存用治具がスリット開口部から脱落した場合であっても、該凍結保存用治具が挿入部２６に留まることが可能であり、好ましい。

　図２１は、本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。図２１において、固定具１３が有するスリット開口部１６は、スリット部１４の幅よりも広く開口しているため、凍結保存用治具を挿入する際の作業性に優れる。図２１には、基材２５の上面（天面）に付設された四角柱形状の液面ゲージ部２１を示している。

　図２２は、本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。図２２において、固定具１３は、１つのスリット部１４に対して、スリット開口部を２箇所（スリット開口部１６及びスリット開口部１６’）有する。また、個々のスリット開口部から基材２５の中央部側に向かって、スリット部１４の溝の幅が減衰したテーパー構造部を有する。図２２のような形状であると、図示しない凍結保存用治具をスリット部１４の両端どちらからでも挿入できるため、複数の凍結保存用治具を同時に保存可能な固定具が得られる。また、固定された凍結保存用治具は、スリット部１４が閉塞している場合と比較して、より多くの面積で冷却溶媒に接触するため、より効率的な冷却がなされることが期待できる。
スリット部１４の長さＴ１は、スリット開口部１６におけるテーパー構造部の奥行Ｔ１１とスリット開口部１６’におけるテーパー構造部の奥行Ｔ１１’の合計である。

　図２２に示した固定具において、２箇所に設けられたスリット開口部の形状（スリット開口部１６における（Ｔ２１－Ｔ２２）／Ｔ１１の値と、スリット開口部１６’における（Ｔ２１’－Ｔ２２’）／Ｔ１１’の値）は、同じであっても異なっていても良いが、同じであることが好ましい。

　上述した図２２は、１つのスリット部に対してスリット開口部を２箇所に設けた一例であるが、これ以外にも、例えば基材の上面の、それぞれ異なる側面部にスリット開口部を有するスリット部（それぞれ独立したスリット部）を設けること（後述する図２９）、および基材の上面の、同一の側面部に複数のスリット開口部を有するスリット部（それぞれ独立したスリット部）を設けることも可能である。

　図２３は、本発明の固定具が有するスリット部のまた別の一例を示す側面概略図である。図２３において固定具１３が有するスリット部１４は、凍結保存用治具を強固に固定するための固定構造部として、その内部の側面に凹凸構造部１５を有する。図２３の固定具が有する凹凸構造部１５は凸型である（かかる凹凸構造部は凹型であることも可能である）。また該凍結保存用治具は基材２５の上面（天面）に液面ゲージ部２１を有している。

　図２４は、本発明の固定具の一例を示す側面概略図である。図２４の固定具１３はスリット部１４と共に、基材２５の側面に付設され、該基材の上面（天面）よりも上方に伸長した構造である液面ゲージ部２１を有する。

　図２５は、本発明の固定具の別の一例を示す側面概略図である。図２５の固定具１３はスリット部１４と共に、基材２５の上面（天面）に付設された四角柱形状の液面ゲージ部２１を有する。図２５の固定具１３が有する液面ゲージ部２１は１ヶ所のマーキング部を有し、図２５に図示しているマーキング部は上限マーキング部２２である。上限マーキング部２２は図示していない液体窒素の液面に平行な線分である。作業者はこの位置を目安として液体窒素の量を管理することで、凍結された細胞又は組織が確実に冷却されていることを容易に確認できる。

　図２６は、本発明の固定具のまた別の一例を示す側面概略図である。図２６の固定具１３はスリット部１４と共に、基材２５の上面（天面）に付設された四角柱形状の液面ゲージ部２１を有する。図２６の固定具１３が有する液面ゲージ部２１は上限マーキング部２２及び下限マーキング部２３の合計２ヶ所のマーキング部を有する。固定具１３が上限マーキング部２２及び下限マーキング部２３を有すると、例えば作業者は上限マーキング部２２と下限マーキング部２３の間に、液体窒素の液面を設定・準備すればよく、液体窒素の量の管理がさらに容易である。

　図２７は、本発明の固定具のまた別の一例を示す側面概略図である。図２７の固定具１３はスリット部１４と共に、基材２５の上面（天面）に付設された四角柱形状の液面ゲージ部２１を有する。図２７の固定具１３が有する液面ゲージ部２１は凸状の上限マーキング部２２及び凸状の下限マーキング部２３を有し、作業者は凸状の上限マーキング部２２と凸状の下限マーキング部２３の間に、液体窒素の液面を設定・準備することができる。

　図２８は、本発明の固定具のまた別の一例を示す側面概略図である。図２８の固定具１３はスリット部１４と共に、基材２５の上面（天面）に付設された階段状の段差を有する立体形状の液面ゲージ部２１を有する。前述したマーキング部と同様に、作業者は階段状の段差による上限マーキング部２２と下限マーキング部２３の間に、液体窒素の液面を設定・準備することができる。

　図２９は、本発明の固定具のまた別の一例を示す上面概略図である。図２９において、固定具１３は、基材２５の上面に、複数の独立したスリット部１４を有する。スリット部１４は、それぞれ、凍結保存用治具を固定することが可能である。本実施形態によれば、基材２５の上面により多くのスリット部１４が設けられているため、一度に数多くの凍結保存用治具を固定・保持することができる。

　図３０は本発明の固定具のまた別の一例を示す側面概略図である。図３０において、固定具１３は空洞構造部１７を有する。空洞構造部１７を有すると、固定具１３が有する熱的な容量が抑制され、固定具１３を液体窒素に浸漬した際に、液体窒素の揮発量を抑えられるため、好ましい。

　次に、本発明の固定具を用いた、細胞又は組織の凍結、融解方法について、詳細に説明する。

　本発明において、載置部を有する本体部材及び該本体部材に着脱自在なキャップ部材を少なくとも有する凍結保存用治具の載置部に、細胞又は組織を保存液と共に載置し、該載置部をキャップ部材で密閉した後、該密閉した載置部を冷却溶媒により冷却して、凍結された細胞又は組織の凍結状態を維持し、その後、該細胞又は組織を融解する際においては、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織は、冷却溶媒の液面よりも下方に位置させ、かつ本体部材とキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態で一旦保持することは、本体部材とキャップ部材を素早く分離し、載置部を融解液中に迅速に浸漬できるため、好ましい。

　図３１は、融解工程の開始前に、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織が冷却溶媒の液面よりも下方に位置し、かつキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態を示す概略図である。図３１において凍結保存用治具は、本体部材２と該本体部材２に着脱自在なキャップ部材３を少なくとも有し、本体部材２が有する載置部４に、極少量の保存液１２と共に細胞１１が載置されている。

　極少量の保存液１２と共に細胞１１が載置された載置部４は、キャップ部材３で密閉されており、該載置部４に載置された細胞１１は液体窒素１８の液面１９よりも下方に位置することで冷却され、凍結された細胞１１は凍結状態が維持されている。凍結された細胞１１を融解する際には、キャップ部材３と本体部材２の接合部１０が、液体窒素１８の液面１９よりも上方に位置するため、本体部材２とキャップ部材３の嵌合・固定を緩め、嵌合を解除した場合にも、周囲の冷却溶媒（液体窒素）が直接的にキャップ部材３の内部に侵入することなく本体部材２をキャップ部材３から素早く引き抜き、分離することが可能であり、載置部を融解液中に迅速に浸漬できるため、好ましい。また固定具１３が液面ゲージ部２１を有する場合、液面１９の位置を作業者は把握しやすく、作業性が向上することができ、好ましい。図３１には、固定具１３の上面（天面）に付設した液面ゲージ部２１の上面を液面１９の位置の基準とした場合の一例を図示している。液面ゲージ部２１を用いると、液面１９を細胞１１よりも上方に位置させ、かつ、液面１９を接合部１０よりも下方に位置させることが容易である。

　図３２は、融解工程の開始前に、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織が冷却溶媒の液面よりも下方に位置し、かつキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態を示す別の概略図である。先の図３１では凹凸構造部を有する固定具１３により、凍結保存用治具を固定していたが、図３２は図示しないテーパー構造部を有する固定具１３により、凍結保存用治具を固定した状態を示している。

　図３３は、本体部材とキャップ部材を分離し、載置部を融解液に浸漬した状態を示す概略図である。図３３において、キャップ部材３が固定具１３に固定されることにより、本体部材２を引き抜く操作のみで、載置部４を有する本体部材２はキャップ部材３から迅速に分離される。分離後、載置部４を融解液２４に浸漬し、融解液２４中で細胞１１を融解・回収する。

　本発明の固定具を用いて細胞又は組織を融解する場合、保存液は、通常卵子、胚等の細胞の凍結のために使用されるものを使用でき、例えば、前述したリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤（グリセロール、エチレングリコール等）を含有する保存液や、グリセロールやエチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）等の各種耐凍剤を多量に（少なくとも保存液の全質量に対して１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上）含有する保存液を使用できる。融解液についても、通常卵子、胚等の細胞の融解のために使用されるものを使用でき、例えば、前述したリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に、浸透圧調整のために１Ｍのスクロースを含有する融解液を使用することができる。

　本発明において凍結保存及び融解される細胞としては、例えば、哺乳類（例えば、人（ヒト）、牛、豚、馬、ウサギ、ラット、マウス等）の卵子、胚、精子等の生殖細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。また、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞が挙げられる。また、細胞は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞、膵ガン・肝ガン細胞等のガン由来細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、組織幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。さらに、凍結保存・融解することができる組織として、同種又は異種の細胞からなる組織、例えば、卵巣、皮膚、角膜上皮、歯根膜、心筋等の組織が挙げられる。

　以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
　下記、凍結保存用治具を用いて、以下の手順で細胞又は組織の載置から密閉工程、凍結工程、保冷工程、融解工程を行った。

＜凍結保存用治具の作製＞
　図１～図４に示す形態を有する本体部材２及びキャップ部材３を作製した。本体部材２が有する載置部４は短冊状（幅１．５ｍｍ、長さ２０ｍｍ、厚み２５０μｍ）のポリエチレンテレフタレート樹脂フィルムを用い、ＡＢＳ樹脂からなる把持部５に付設した。キャップ部材３は、ＡＢＳ樹脂からなり、図３及び図４に示した形状を有しており、内部構造の一部である篏合接触部８にはテーパー構造を有している。キャップ部材３の開口部は円型であり直径は２ｍｍである。キャップ部材３の外形は３．１ｍｍの四角柱であり、先端部近くに０．３ｍｍの深さの凹部を有する構造である。

＜細胞又は組織の載置から密閉工程、凍結工程、保冷工程＞
　平衡化処理したマウス８細胞期胚を、ピペットを用いて、保存液と共に凍結保存用治具の載置部４上に滴下付着させ、余分な保存液を除いた後に、透過型の顕微鏡観察下で、載置部４をキャップ部材３へ挿入し、嵌合・固定した（密閉工程：図７の状態）。その後、凍結保存用治具１のキャップ部材側を液体窒素に浸漬した（凍結工程）。なお、保存液は、Ｌ－グルタミン、フェノールレッド、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）を含む市販のＭｅｄｉｕｍ１９９培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を基礎液として、エチレングリコールを１５容量％とＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を１５容量％、スクロースを０．５Ｍ、ゲンタマイシンを５０ｍｇ／Ｌ含有するものを使用した。マウス８細胞期胚を平衡化液から保存液に移した時点から、液体窒素へ浸漬するまでの時間は、１分間で行った。凍結工程を行った凍結保存用治具は、融解工程を行うまで、液体窒素下で保管した（保冷工程）。

＜融解工程＞
　上記の各工程を行った凍結保存用治具を取り出し、図３１に示す形態で、アルミからなる固定具１３のスリット部に固定し、凍結保存用治具のキャップ部材３の接合部１０が冷却溶媒である液体窒素１８の液面１９よりも上に位置する状態で一旦保持した。次いで、キャップ部材３と把持部５の嵌合を緩め、キャップ部材３から本体部材２を分離し、本体部材２が有する載置部４を３７℃に保温した融解液に浸漬した。その後、載置部４上からの胚の回収操作を行った。なお、キャップ部材３の篏合を緩めてから、キャップ部材３から本体部材２を分離するまでの作業は１０秒以内に、キャップ部材３から本体部材２を分離後、載置部４を融解液に浸漬するまでの時間は、１秒以内に操作することが可能であった。なお、融解液は、前記Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地を基礎液として、１Ｍのスクロースを含有するものを使用した。

（実施例２）
　ポリエチレンテレフタレート樹脂フィルム（幅１．５ｍｍ、長さ２０ｍｍ、厚み１８０μｍ）に、その長さ方向の両端２ｍｍにポリウレタン接着材を塗布し、その後、親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン樹脂からなる多孔性樹脂シート（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３０μｍ）をこれに貼り合わせ、これを凍結保存用治具の載置部４とした以外は実施例１と同様にして、凍結したマウス８細胞期胚に対する一連の凍結融解方法を行った。なお、実施例２の凍結融解方法では、細胞又は組織を載置する時に、胚を滴下付着する際に余分な保存液が自動的にのぞかれることから、ピペットを用いて保存液を除く操作は行わなかった。

（比較例１）
　実施例１において、マウス８細胞期胚を載置部４上に滴下付着した後に、キャップ部材３で被包することなく、載置部４を液体窒素に直接浸漬し、その後、液体窒素中で載置部４をキャップ部材３にて被包・保護し、凍結した以外は、実施例１と同様にして比較例１の凍結融解方法を行った。

（比較例２）
　実施例２において、マウス８細胞期胚を載置部４上に滴下付着した後に、キャップ部材３で被包することなく、載置部４を液体窒素に直接浸漬し、その後、液体窒素中で載置部４をキャップ部材３にて被包・保護し、凍結した以外は、実施例２と同様にして比較例２の凍結融解方法を行った。

（比較例３）
　実施例１の融解工程において、凍結保存用治具のキャップ部材３の接合部１０が液体窒素中に入った状態（接合部１０が液体窒素の液面よりも下に位置する状態）で、キャップ部材３と把持部５の嵌合を緩め、キャップ部材３から本体部材２を分離し、本体部材２が有する載置部４を３７℃に保温した融解液に浸漬した。

＜融解工程時の気泡付着の評価＞
　実施例１、２及び比較例１～３の凍結保存用治具について、融解工程時に、載置部を融解液に浸漬してから５秒後の時点での載置部上への気泡の付着の様子を評価した。評価として、先端から２ｍｍ～先端から７ｍｍの領域（幅１．５ｍｍ×長さ５ｍｍの面積）での、載置部４表面への気泡（直径３０μｍ以上）の付着数を計測した。それぞれの凍結融解方法において、評価は３回繰り返して実施した。結果を表１に示す。

　上記の結果から、本発明の凍結融解方法を用いると、融解操作を行う際に載置部上への気泡の付着、および細胞又は組織への気泡の付着を抑制でき、細胞又は組織の回収操作が容易であることが分かる。また、細胞又は組織の融解が極めて短時間に行うことが可能であり、高い生存率が得られることが期待される。

　以下、前記融解工程において用いた固定具について、詳細に検討を行った。

（実施例３）
　アルミを用いて金属切削加工により、図９及び図１０に示す、１ヶ所のスリット部１４に凸型の凹凸構造部１５を有する形態の実施例３の固定具を作製した。なお、基材２５の大きさは縦×横×高さが５０ｍｍ×５０ｍｍ×７０ｍｍであり、スリット部１４の幅Ｔ２は３．２ｍｍであり、スリット部１４の長さＴ１は基材２５の側面部から１０ｍｍであり、スリット部の深さＴ３は１０ｍｍである。凹凸構造部はスリット部の内部の側面からそれぞれ０．２５ｍｍの凸型構造とし、凸型の凹凸構造部１５により狭まった部分の幅方向の長さＴ４は２．７ｍｍである。

（実施例４）
　アルミを用いて金属切削加工により図１３に示す、１ヶ所のスリット部１４に凸型構造を凹凸構造部１５として有し、スリット開口部から挿入方向に進むほど、スリット部１４の幅Ｔ２が徐々に狭まった構造となっている形態の実施例４の固定具を作製した。なお、基材２５の大きさは縦×横×高さが５０ｍｍ×５０ｍｍ×７０ｍｍであり、スリット部１４の長さＴ１は基材２５の側面部から１０ｍｍであり、スリット部１４の深さＴ３は１０ｍｍである。スリット部の幅Ｔ２はスリット開口部１６で４ｍｍであり、スリット開口部１６から挿入方向に向かって、基材上面中央部側のスリット部１４の閉塞部で３ｍｍまで一定に減少する構造とした。凹凸構造部１５により狭まった部分の幅方向の長さＴ４は２．７ｍｍで一定とした。

（実施例５）
　アルミを用いて金属切削加工により、図１１に示す、スリット部の内部の片側の側面にのみ凸型構造の凹凸構造部１５を有する形態の実施例５の固定具を作製した。なお、基材２５の大きさは縦×横×高さが５０ｍｍ×５０ｍｍ×７０ｍｍであり、スリット部の幅Ｔ２は３．２ｍｍであり、スリット部の長さＴ１は基材２５の側面部から１０ｍｍであり、スリット部の深さＴ３は１０ｍｍである。凹凸構造部１５はスリット部の内部の側面から０．２５ｍｍの凸型構造であり、１ヶ所の凸型構造の凹凸構造部１５により狭まった部分の長さＴ６は２．９５ｍｍである。

（実施例６）
　ＡＢＳ樹脂を用いて積層型の３Ｄプリンターで加工を行った以外は実施例３と同様にして実施例６の固定具を作製した。

（実施例７）
　ＡＢＳ樹脂を用いて積層型の３Ｄプリンターで加工を行い、図１４に示す形態の屈曲構造部を有し、且つスリット部の内部の側面に凸型の凹凸構造部１５を有する実施例７の固定具を作製した。なお、基材２５の大きさは縦×横×高さが５０ｍｍ×５０ｍｍ×７０ｍｍであり、スリット部１４の幅Ｔ２は３．２ｍｍであり、スリット部の深さＴ３は１０ｍｍである。スリット部１４の長さは挿入方向から２０ｍｍ直進した後に９０度右側に向きを変えて１０ｍｍ直進した形態とした。凹凸構造部１５はスリット部１４の内部の側面からそれぞれ０．２５ｍｍの凸型構造とし、凹凸構造部１５により狭まった部分の幅方向の長さＴ４は２．７ｍｍである。

（実施例８）
アルミを用いて金属切削加工により、図２３に示す、１ヶ所のスリット部１４及び上面に付設された四角柱形状の液面ゲージ部２１を有する形態の実施例８の固定具を作製した。なお、基材２５の大きさは縦×横×高さが５０ｍｍ×５０ｍｍ×７０ｍｍであり、スリット部１４の幅Ｔ２は３．２ｍｍであり、スリット部１４の長さＴ１は基材２５の側面部から３０ｍｍであり、スリット部１４の深さＴ３は３０ｍｍである。上記基材２５の上面（天面）に液面ゲージ部２１が付設されており、液面ゲージ部２１の大きさは１５ｍｍ×１５ｍｍ×１５ｍｍである。スリット部１４は凹凸構造部１５を有し、凹凸構造部１５はスリット部１４の内部の側面からそれぞれ０．２５ｍｍの凸型構造とし、凸型の凹凸構造部１５により狭まった部分の幅方向の長さＴ４は２．７ｍｍである。

（実施例９）
　アルミを用いて金属切削加工により、図１５に示すスリット部１４にテーパー構造を有し、基材の上面に、先の実施例８において上面に付設された四角柱形状の液面ゲージ部２１を有する形態の固定具を、実施例９の固定具として作製した。基材の大きさは先の実施例８と同じであり、スリット部１４の開口部１６の幅Ｔ２１を４ｍｍ、閉塞側の幅Ｔ２２を３ｍｍとし、スリット部１４の長さＴ１（テーパー構造部の奥行Ｔ１１）は基材２５の側面部から３０ｍｍとした。テーパー構造部の傾き（Ｔ２１－Ｔ２２）／Ｔ１１が０．０３３である。

（実施例１０）
　ポリアミド樹脂を用いて３Ｄプリンター加工を行った以外は実施例９と同様にして、実施例１０の固定具を作製した。

（実施例１１）
　ポリアミド樹脂を用いて３Ｄプリンター加工により、図１９の上面概略図に示す形状の、基材２５の上面（天面）に凍結保存用治具を挿入する挿入部２６と挿入部２６の側面部にスリット開口部１６を有し、さらに図示しない液面ゲージ部を有する形態の実施例１１の固定具を作製した。基材２５の大きさは縦×横×高さが５０ｍｍ×５０ｍｍ×７０ｍｍであり、挿入部２６の大きさは縦×横×深さが２０ｍｍ×２０ｍｍ×３０ｍｍであり、スリット部１４の幅Ｔ２は３．２ｍｍであり、スリット部１４の長さはスリット開口部１６から２０ｍｍであり、スリット部１４の深さＴ３は３０ｍｍである。なお、スリット部１４はその両側面に長さ２０ｍｍに亘り凸型構造を凹凸構造部として有する構造とした。実施例１１の固定具の凹凸構造部は、スリット部１４の内部の側面からそれぞれ０．２５ｍｍの凸型構造とし、凸型の凹凸構造部により狭まった部分の幅方向の長さＴ４は２．７ｍｍである。また、実施例１１の固定具は上記基材２５の上面（天面）に、図示しない液面ゲージ部が付設されており、液面ゲージ部の大きさは１５ｍｍ×１５ｍｍ×１５ｍｍである。

＜凍結保存用治具の固定具合の評価＞
　実施例３～１１の固定具について、凍結保存用治具の固定具合を評価するために、図３１に図示されるような凍結保存用治具を作製した。該凍結保存用治具は、短冊状（幅１．５ｍｍ、長さ２０ｍｍ、厚み１９０μｍ）のポリエチレンテレフタレート樹脂フィルムを載置部４とし、ＡＢＳ樹脂の把持部５と接着し本体部材２を作製した。キャップ部材３をＡＢＳ樹脂で作製した。キャップ部材３の外形は３．１ｍｍの四角柱であり、先端部近くに０．３ｍｍの深さの凹部を有する構造である。上記凍結保存用治具を用いて、平衡化処理したマウス８細胞期胚を保存液０．１μＬと共に、透過型顕微鏡下で滴下付着させた。なお、保存液は、シグマアルドリッチ社製　Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地に、１５容積％ＤＭＳＯ、１５容積％エチレングリコール、１７質量％スクロースが含まれる組成のものを用いた。次いで、透過型顕微鏡下で、載置部を含むストリップをキャップ部材３に挿入し、その後、液体窒素に浸漬して凍結操作を行った。その後、液体窒素下で、上記凍結保存用治具のキャップ部材側をスリット部１４に固定した。なお、液体窒素１８の液面１９が実施例１～５の固定具が有する液面ゲージ部２１を基準として、凍結容器２０に液体窒素を充填し、図３１に示す形態で液面ゲージ部２１が液体窒素の液面よりもやや下に位置する状態で準備を行った。実施例３～１１の固定具１３のスリット部１４に凍結保存用治具のキャップ部材側を挿入し、図３１に示す形態で、固定・保持した際の様子を以下の基準で評価した。これらの結果を表２の「融解操作時の固定具合の評価」の項に示す。

◎◎：特に強固に固定ができ、特に優れた評価であった。
◎：強固に固定ができ、安定感があった。
○：安定して固定ができた。
△：固定ができたが、やや不安定であった。

（実施例１２）
　アルミを用いて金属切削加工により、図１５に示すスリット部１４にテーパー構造を有する実施例１２の固定具を作製した。基材２５の大きさは縦×横×高さが５０ｍｍ×５０ｍｍ×７０ｍｍであり、スリット部１４のスリット開口部１６の幅Ｔ２はテーパー構造部において基材の表面に最も近い位置におけるスリット部の幅Ｔ２１と同様で４ｍｍであり、閉塞側の幅Ｔ２２を３ｍｍとした。またスリット部１４の長さＴ１はテーパー構造部の奥行きＴ１１と同様であり、基材２５の側面部から３０ｍｍであり、スリット部１４の深さは３０ｍｍとした。（Ｔ２１－Ｔ２２）／Ｔ１１の値は０．０３３である。

（実施例１３）
　アルミを用いて金属切削加工により、図１５に示すスリット部１４にテーパー構造を有する実施例１２の固定具を作製した。基材２５の大きさは縦×横×高さが５０ｍｍ×５０ｍｍ×７０ｍｍであり、基材の表面に最も近い位置におけるスリット部の幅Ｔ２１は３．８ｍｍであり、閉塞側の幅Ｔ２２を３ｍｍとした。またテーパー構造部の奥行きＴ１１は、基材２５の側面部から３０ｍｍとし、（Ｔ２１－Ｔ２２）／Ｔ１１の値は０．０２７である。

（実施例１４）
　アルミを用いた金属切削加工により、図１７に示す、スリット部１４にテーパー構造部及び屈曲構造部を有する実施例１３の固定具を作製した。なお、基材２５の大きさは縦×横×高さが５０ｍｍ×５０ｍｍ×７０ｍｍであり、基材の表面に最も近い位置におけるスリット部１４の幅Ｔ２１は３．２ｍｍであり、スリット部の深さＴ３は３０ｍｍである。スリット部１４の長さは挿入方向から３０ｍｍ直進した後に９０度右側に向きを変えて１０ｍｍ直進した形態とした。テーパー構造部は、閉塞側の幅Ｔ２２を３ｍｍとし、テーパー構造部の傾き（Ｔ２１－Ｔ２２）／Ｔ１１を０．０２とした。

＜凍結保存用治具の固定具合の評価＞
　実施例１２～１４の固定具について、凍結保存用治具の固定具合を評価するために、図３２に図示されるような凍結保存用治具を作製した。図３２において凍結保存用治具は、短冊状（幅１．５ｍｍ、長さ２０ｍｍ、厚み１９０μｍ）のポリエチレンテレフタレート樹脂フィルムを載置部４とし、ＡＢＳ樹脂の把持部５と接着し本体部材２を作製した。またキャップ部材３をＡＢＳ樹脂で作製した。キャップ部材３の外形は３．１ｍｍの四角柱である。また図３２に記載されるキャップ部材３は凹部を有さない。

　上記した凍結保存用治具を用いて、平衡化処理したマウス８細胞期胚を保存液０．１μＬと共に、透過型顕微鏡下で滴下付着させた。なお、保存液は、シグマアルドリッチ社製　Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地に、１５容積％ＤＭＳＯ、１５容積％エチレングリコール、１７質量％スクロースが含まれる組成のものを用いた。次いで、透過型顕微鏡下で、載置部を含むストリップをキャップ部材に挿入し、その後液体窒素に浸漬して凍結操作を行った。該保冷操作の後に、液体窒素下で、上記した凍結保存用治具のキャップ部材側をスリット部１４内に挿入し、図３２に示す形態で、固定・保持した際の様子を以下の基準で評価した。これらの結果を表３の「融解操作時の固定具合の評価」の項に示す。

＜融解操作時の作業性の評価＞
　上記の「凍結保存用治具の固定具合の評価」と同様の方法により、図３３に示す形態で、実施例３～１４の固定具を用いて凍結保存用治具をそれぞれ固定・保持した。図３３は、本体部材２とキャップ部材３を分離し、載置部４を融解液２４に浸漬した状態を示す概略図である。
その後、図３３に示す形態のように、凍結保存用治具の本体部材とキャップ部材を分離する際の作業性を評価したが、実施例３～１４の固定具はいずれも迅速な融解操作が可能であり、高い作業性を有することが示された。また実施例３～１４の固定具を用いた融解作業では、細胞又は組織が液体窒素中に位置することを容易に確認できた。

　上記の結果から、本発明の固定具を用いると、細胞又は組織を融解液に移す操作に先立って、凍結保存用治具を安定的に固定・保持することが可能である。本発明の固定具を用いて、凍結保存用治具を固定・保持すると、細胞又は組織を融解液に移す操作に先立って、凍結保存用治具を固定・保持した際に、凍結保存用治具のストリップ上に載置された細胞又は組織が確実に液体窒素の液面よりも下に位置することを容易に確認できることに加え、迅速な融解操作を行うことが可能であることが判る。

　本発明は、牛等の家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精等の他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、胚又は卵子を含む生体から採取した検査用又は移植用の細胞又は組織、生体外で培養した細胞又は組織等の凍結保存及びその融解に用いることができる。

１　凍結保存用治具
２　本体部材
３　キャップ部材
４　載置部
５　把持部
６　マーキング部
７　嵌合構造部
８　嵌合接触部
９　固定部位
１０　接合部
１１　細胞
１２　保存液
１３　固定具
１４　スリット部
１５　凹凸構造部
１６　スリット開口部
１７　空洞構造部
１８　液体窒素
１９　液面
２０　凍結容器
２１　液面ゲージ部
２２　上限マーキング部
２３　下限マーキング部
２４　融解液
２５　基材
２６　挿入部

Claims

　上面、側面及び底面を有する基材の上面に、少なくとも片端が基材の側面部に開口したスリット部を有するか、あるいは基材の上面に凍結保存用治具を挿入する挿入部と該挿入部の側面部に片端が開口したスリット部を有する凍結保存用治具の固定具であって、該スリット部は凍結保存用治具を固定するための固定構造部を有し、該固定構造部が下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）の構造部のうちの少なくとも１つの構造部であることを特徴とする、凍結保存用治具の固定具。
（Ｉ）スリット部の内部の側面に形成された凹凸構造部。
（ＩＩ）スリット部の内部の側面間の距離が、スリット部の奥に進むほど徐々に狭まったテーパー構造部。
（ＩＩＩ）スリット部がスリット開口部から基材の内部に向かって直進した後に、該直進方向とは異なる方向に屈曲した屈曲構造部。
　固定構造部として、前記した（ＩＩ）のテーパー構造部及び／または前記した（ＩＩＩ）の屈曲構造部の何れかを有することを特徴とする、請求項１に記載の凍結保存用治具の固定具。
　固定構造部として前記した（ＩＩ）のテーパー構造部を有し、該テーパー構造部が下記式（１）の要件を満たすことを特徴とする、請求項１または２に記載の凍結保存用治具の固定具。
（Ｔ２１－Ｔ２２）／Ｔ１１≦０．０３　　　式（１）
（式中、Ｔ２１はスリット開口部に最も近い部分におけるテーパー構造部の幅を表し、Ｔ２２はスリット開口部から最も離れた部分におけるテーパー構造部の幅を表し、Ｔ１１はテーパー構造部の奥行き長さを表す。）
　固定構造部として、前記した（ＩＩＩ）の屈曲構造部を有し、スリット部が直進方向とは異なる方向に屈曲した後に前記した（ＩＩ）のテーパー構造部を有する事を特徴とする、請求項１～３の何れかに記載の凍結保存用治具の固定具。
　基材の上面または側面に、該基材の上面よりも上方に伸長した液面ゲージ部を有することを特徴とする、請求項１～４の何れかに記載の凍結保存用治具の固定具。
　載置部を有する本体部材及び該本体部材に着脱自在なキャップ部材を少なくとも有する凍結保存用治具の載置部に、細胞又は組織を保存液と共に載置し、該載置部をキャップ部材で密閉する密閉工程と、該密閉した載置部を冷却溶媒により冷却し、細胞又は組織を凍結する凍結工程と、該凍結工程において凍結された細胞又は組織の凍結状態を維持する保冷工程と、および凍結状態が維持されていた細胞又は組織を融解する融解工程とを少なくとも有し、該融解工程の開始前において、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織を、請求項１～５の何れかに記載の凍結保存用治具の固定具が有する固定構造部に固定し、該細胞又は組織が冷却溶媒の液面よりも下方に位置し、かつ本体部材とキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態で一旦保持し、該融解工程では本体部材とキャップ部材を分離し、本体部材が有する載置部を融解液に浸漬して細胞又は組織を融解することを特徴とする、細胞又は組織の凍結融解方法。
　前記した載置部が保存液吸収体を有することを特徴とする、請求項６に記載の細胞又は組織の凍結融解方法。