CN114071995B - 细胞或组织的冷冻保存用夹具 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供细胞或组织的冷冻操作以及融解操作的操作性优异的冷冻保存用夹具。本发明为细胞或组织的冷冻保存用夹具，其至少具备具有长方形前端部的主体部件以及包覆该主体部件前端部的盖部件，该前端部至少具备具有保存液吸收体的载置部，该前端部短轴方向的长度为该盖部件内径的70％以上，该盖部件内腔的长轴方向的长度为该前端部长轴方向的长度的200％以下。

Description

细胞或组织的冷冻保存用夹具
技术领域
本发明涉及细胞或组织的冷冻保存用夹具。
背景技术
各种工业领域都在寻求优异的细胞或组织保存技术。例如，在牛胚胎移植技术中，对胚胎进行冷冻保存，根据受体牛的发情周期将胚胎进行融解、移植。另外，在人类不孕治疗中，从母体采集卵子或卵巢后，为了适应移植的时机进行冷冻保存，移植时融解使用。
通常，由于从活体内采集的细胞或组织即使在培养液中也会逐渐失去活性或者性状发生改变，因此在体外进行细胞或组织的长期培养是不优选的。因此，在保持生物活性的状态下长时间保存的技术是重要的。通过优异的保存技术，可以更准确地分析采集的细胞或组织。此外，期望通过优异的保存技术，可以在保持较高生物活性的基础上将细胞或组织用于移植，移植后的存活率得到提高。进一步，也可以依次生产和保存体外培养的培养皮肤、体外构建的所谓细胞片这样的用于移植的人造组织，必要时可以使用，期待其不仅对医疗方面有益，在工业方面也带来很大的益处。
作为细胞或组织的冷冻保存方法，已知有例如缓冻法。该方法首先将细胞或组织浸渍在例如使磷酸缓冲生理盐水等生理溶液中含有防冻剂而得到的保存液中。作为该防冻剂，可以使用甘油、乙二醇、二甲亚砜等化合物。将细胞或组织浸渍在该保存液中后，通过以较慢的冷却速度(例如0.3～0.5℃/分钟的速度)冷却至-30～-35℃，使得细胞内外或者组织内外的溶液充分冷却，粘性变高。在这样的状态下，将该保存液中的细胞或组织进一步冷却至液氮的温度(-196℃)，发生玻璃化，即细胞内或组织内及其外围的极少量的溶液均以无定型的状态固化的现象。通过玻璃化，细胞内外或者组织内外固化，则分子基本上不动，因此认为通过将玻璃化的细胞或组织保存在液氮中，可以半永久性地保存。
此外，作为细胞或组织的冷冻保存方法，已知还有玻璃化冷冻法。玻璃化冷冻法是指，利用了含有大量防冻剂的保存液的凝固点降低使得即使在冰点以下也难以形成冰晶这一原理的方法。通过将该保存液快速地在液氮中冷却，可以在不产生冰晶的状态下使其固化。将这样的固化称作玻璃化冷冻。此外，含有大量防冻剂的保存液称作玻璃化液。
前述的缓冻法由于需要以较慢的冷却速度进行冷却，用于冷冻保存的操作费时。此外，还存在需要用于控制冷却速度的装置或者夹具的问题。此外，上述缓冻法由于在细胞外或者组织外的保存液中形成冰晶，存在细胞或组织受到该冰晶的物理损害的可能。与此相对地，上述的玻璃化冷冻法操作的时间为短时间，不需要特别的装置或者夹具。此外，玻璃化冷冻法由于不产生冰晶因而能够获得高的生存率。
关于使用了玻璃化冷冻法的细胞或组织的冷冻保存方法，公开有通过各种各样的方法使用各种细胞或组织的例子。例如，专利文献1中公开了将玻璃化冷冻法适用到动物或人的生殖细胞或体细胞在冷冻保存及融解后的生存率方面考虑是极其有用的。
玻璃化冷冻法尽管是一项主要使用人体生殖细胞开发的技术，但最近也在广泛研究其在iPS细胞、ES细胞的应用。此外，非专利文献1中公开了，玻璃化冷冻法对于果蝇胚胎保存是有效的。进一步，专利文献2中公开了玻璃化冷冻法在植物培养细胞、组织的保存中有效。因此，已知玻璃化冷冻法对于保存大量的各种物种的细胞以及组织有用。
已知，为了实现适宜的玻璃化冷冻，冷冻速度越快越好。另外已知，在冷冻保存后的融解工序时，从抑制细胞或组织中再形成冰晶的观点考虑，融解速度越快越好。
作为实现适宜的玻璃化冷冻的重要的因素的冷冻速度和融解速度中，尤其重要的是融解速度。例如，已知如非专利文献2所记载的，即使是迅速冷冻的细胞，在融解速度慢的情况下生存率变低。此外，专利文献3中记载了冷冻的样品通过快速融解法融解，融解后的人iPS细胞源性神经干细胞/祖细胞的生存率提高。
通常，作为与玻璃化冷冻法相关的冷冻保存用夹具及冷冻保存方法，专利文献4中提出了下述方法，将哺乳动物胚胎或者卵子通过足以包覆这些胚胎或卵子的最少量的玻璃化液贴附到冷冻吸管、冷冻瓶或者冷冻管等冷冻保存用容器的内表面，使该容器与液氮接触急速冷却的方法。该冷冻保存方法之后进行的融解方法为，将通过上述方法保存的冷冻保存用容器从液氮取出，将容器的一端部开口，向该容器内注入33～39℃的稀释液，将冷冻的胚胎或卵子融解稀释。根据该冷冻保存用夹具及冷冻保存方法，能够使哺乳动物胚胎或者卵子免于被病毒、细菌感染地以高的生存率进行保存及融解稀释。但是，在冷冻吸管、冷冻瓶或者冷冻管等冷冻保存用容器的内表面贴附胚胎或者卵子的冷冻工序的难度高，难以确认胚胎或者卵子确实载置于冷冻保存用容器。此外，即使在融解工序中使用稀释液进行融解，也难以对载置有胚胎或者卵子的地方可视地进行融解，难以确实地回收胚胎或者卵子。进一步，冷冻工序中需要吸管密封材，融解工序中需要吸管切割机等，需要特殊的器具，工艺变得繁杂。
专利文献5中记载了具备具有导热性部件的细胞保持部件和筒状收纳部件的细胞冷冻保存用具，在一定程度上解决了专利文献4的技术问题。作为专利文献5中记载的冷冻保存用具的使用方法，在显微镜下，使卵子附着于细胞保持部件，将细胞保持部件收纳到筒状收纳部件中后，浸渍于液氮中进行玻璃化冷冻。之后，在筒状收纳部件的开口部安装盖部件，在液氮罐内保管的方法。
作为与工艺更少的玻璃化冷冻法相关的冷冻保存用夹具及冷冻融解方法，如专利文献6、专利文献7所记载的，公开有人不育治疗领域使用的所谓的Cryotop(注册商标)法这一方法。该方法的冷冻操作时使用具备长方形挠性且无色透明的薄膜作为卵子附着保持用带材的卵子冷冻保存用具，在显微镜观察下在该薄膜上载置极少量的保存液以及卵子或胚胎，将附着有卵子的薄膜浸渍在液氮中进行冷冻。另一方面，融解操作时，将卵子附着保持用带材浸渍在保温的融解液中，在融解液中回收薄膜上载置的卵子或者胚胎。已知该方法通过作业者的操作使卵子、胚胎与少量的保存液一起载置于薄膜上，这样的手法存在操作难度高的问题，但能够以高的生存率冷冻卵子或者胚胎。
专利文献8～10提出了将细胞或组织与含有大量防冻剂的保存液一起载置于保存液去除材料上，去除细胞或组织周围附着的多余的保存液，以优异的生存率进行冷冻保存的方法。专利文献8中记载了具有特定的雾度值的保存液吸收体，进而专利文献9、专利文献10中记载了作为保存液吸收体具备多孔烧结形成体、具有特定的折射率的材料形成的多孔结构体的玻璃化冷冻保存用夹具。
专利文献11中记载了通过设置具有长方形有透光性的基部，进而在该基部的一部分上设置有被吸水部(保存液吸收体)围住的缺损部，不需要去除过量的保存液的操作的活细胞冷冻保存用具的例子。此外，专利文献11中记载了将卵子与少量的玻璃化液一起载置于上述缺损部，将含有卵子附着保持用带材的冷冻保存用夹具整个收纳到筒状的收纳容器中后，浸渍到液氮中进行玻璃化冷冻的冷冻保存方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第3044323号公报
专利文献2：日本特开2008-5846号公报
专利文献3：日本特开2017-104061号公报
专利文献4：日本特开2000-189155号公报
专利文献5：日本特许第5798633号公报
专利文献6：日本特开2002-315573号公报
专利文献7：日本特开2006-271395号公报
专利文献8：日本特开2014-183757号公报
专利文献9：日本特开2015-142523号公报
专利文献10：国际公开第2015/064380号
专利文献11：国际公开第2019/004300号
非专利文献
非专利文献1：Steponkus等人，Nature345：170-172(1990)
非专利文献2：僧都博著《活细胞冷冻造成的损伤和保护机制》化学和生物，第18卷(1980)2号P.78～87日本农艺化学会发行
发明内容
发明所要解决的问题
专利文献5中提出了具备有导热性部件的细胞保持部件和筒状收纳部件的细胞冷冻保存用具，但冷冻工序时，具有将盖部件安装到筒状收纳部件等工序，工序繁杂。此外，融解工序时，为了取出收纳在筒状收纳部件中的细胞保持部件，除了取下盖部件的操作之外，还需要用于取出的器具等，工序繁琐。
专利文献6、专利文献7中提出了通过限制用于载置卵子或者胚胎的薄膜的宽度，将卵子或者胚胎与少量的保存液一起冷冻保存，从而得到优异的生存率的冷冻保存用夹具，其提出了工艺更少的玻璃化冷冻法。但是，这些方法存在一些问题。首先，冷冻操作时，将卵子或者胚胎与保存液一起滴加到限制了宽度的薄膜上冷冻，之后收纳到筒状收纳部件中，但在将限制了宽度的薄膜的前端收纳到筒状收纳部件中时，存在固化的玻璃化液及卵子或者胚胎与筒状收纳部件的端面接触，意外脱落的风险。此外，融解、回收卵子或者胚胎的融解操作时，存在薄膜上有气泡附着，在显微镜观察下，难以区分载置的胚胎或者卵子与气泡的问题。进而，融解操作时，薄膜上附着的气泡附着到卵子或者胚胎，除了妨碍它们的可视性之外，还存在由于气泡的浮力，卵子或者胚胎突然脱离显微镜视野而看不见的问题、妨碍胚胎或者卵子的回收作业的问题。
专利文献8～10中提出了通过具备去除卵子或者胚胎周围附着的多余的保存液的吸收性能的冷冻保存用夹具，以优异的生存率冷冻保存这些生殖细胞的方法。但是，与专利文献6、专利文献7一样，融解操作时产生的气泡的影响依然没有得到解决。
专利文献11中记载了将载置有卵子的主体部收纳到筒状收纳容器中的冷冻保存用夹具，但与专利文献5一样，在融解工序时，需要切割器具、取出器具，从而使得取出收纳的冷冻保存用夹具的操作变得繁琐，结果，融解工序繁杂。此外，与专利文献6、专利文献7存在的问题一样，将卵子或者胚胎与保存液一起载置后，收纳到筒状部件时存在的脱落的风险依然没有得到改善。
本发明的主要的课题在于提供可以容易且确实地进行细胞或组织的冷冻保存作业的细胞或组织的冷冻保存用夹具。更具体地，提供冷冻工序时可以将卵子或者胚胎与少量的保存液一起冷冻保存，并且将载置部收纳到筒状部件中时没有细胞或组织脱落的风险，具有优异的插入操作性，并且融解工序时不需要繁琐的操作，通过短时间进行融解工序以及抑制气泡的附着，可以以优异的可视性从融解液中回收细胞或组织的细胞或组织的冷冻保存用夹具。
用于解决问题的方法
本发明人等为了解决上述问题进行了深入研究后发现，通过具有以下技术方案的细胞或组织的冷冻保存用夹具(以下，也称为“本发明的冷冻保存用夹具”)，能够解决上述问题。
本发明为一种细胞或组织的冷冻保存用夹具，其至少具备具有长方形前端部的主体部件和包覆该主体部件前端部的盖部件，其特征在于，该前端部至少具备具有保存液吸收体的载置部，该前端部短轴方向的长度为该盖部件内径的70％以上，该盖部件内腔的长轴方向的长度为该前端部长轴方向的长度的200％以下。
发明的效果
本发明可提供细胞或组织的冷冻保存用夹具，其在冷冻工序时能够将卵子或者胚胎与少量的保存液一起冷冻保存，并且在将载置部收纳到盖部件中时没有胚胎或者卵子脱落的风险，具有优异的插入操作性，此外，融解工序时不需要繁琐的操作，通过短时间进行融解工序，可以以优异的可视性从融解液中回收细胞或组织。
附图说明
图1为表示本发明的冷冻保存用夹具的主体部件的一个例子的俯视示意图。
图2为表示本发明的冷冻保存用夹具的主体部件的一个例子的侧视示意图。
图3为表示本发明的冷冻保存用夹具的盖部件的一个例子的侧面剖视图。
图4为表示本发明的冷冻保存用夹具的盖部件的一个例子的从开口部侧看的侧视图。
图5为表示主体部件与盖部件嵌合、固定的状态的一个例子的示意图。
图6为表示本发明的冷冻保存用夹具中载置有细胞和保存液的状态的侧视示意图。
图7为表示本发明的冷冻保存用夹具中载置细胞和保存液后嵌合、固定盖部件的状态的侧视示意图。
图8为表示使用了本发明的冷冻保存用夹具的冷冻融解方法中所用的固定件的一个例子的剖面示意图。
图9为表示融解工序开始前被盖部件密闭的细胞或组织位于冷却溶剂的液面下方，并且盖部件的接合部位于冷却溶剂的液面上方的状态的示意图。
图10为表示主体部件与盖部件分离、载置部浸渍在融解液中的状态的示意图。
具体实施方式
本发明的冷冻保存用夹具适合在所谓的玻璃化冷冻保存法中冷冻保存细胞或组织时使用。本发明中，细胞不仅指单一的细胞，还包含由多个细胞组成的生物的细胞群。由多个细胞组成的生物的细胞群可以是单一种类的细胞构成的细胞群，也可以是由多个种类的细胞构成的细胞群。此外，组织可以是由单一种类的细胞构成的组织，也可以是由多个种类细胞构成的组织，除细胞以外，还可以含有细胞外基质之类的非细胞性物质。本发明的冷冻保存用夹具尤其能够适用于卵子或者胚胎的冷冻保存。
本发明的冷冻保存用夹具能够用于载置细胞或组织后使用极低温的冷却溶剂使细胞或组织冷冻的冷冻工序、维持冷冻的状态的保冷工序、以及在融解液中融解、解冻细胞或组织，将它们回收的融解工序的一系列操作中使用。
本发明的冷冻保存用夹具也可以称作细胞或组织的保存用具、细胞或组织的冷冻保存器具、细胞或组织的保存用器具等。
以下，对本发明的冷冻保存用夹具详细进行说明。
本发明的冷冻保存用夹具具有：具有长方形前端部的主体部件，以及能包覆该主体部件前端部的盖部件。主体部件呈棒状，在一个端部具有前端部。
本发明的冷冻保存用夹具的主体部件所具有的前端部为长方形。该长方形前端部设计为前端部的长边方向与主体部件的长度方向平行。呈长方形则容易利用盖部件包覆、保护载置部。
本发明的冷冻保存用夹具的盖部件具有能包覆保护载置部的内腔。需要说明的是，盖部件优选具有开口端和封闭端，呈大致四棱柱状。盖部件的内腔优选呈大致圆筒形状。
本发明的冷冻保存用夹具的盖部件优选相对于主体部件装卸自如。装卸自如是指，不需要特殊的器具就能够容易地将盖部件嵌合、固定于主体部件，能够容易地将盖部件从主体部件取下。为了能够装卸自如，主体部件优选在前端部侧具有嵌合结构部，主体部件优选该嵌合结构部具有锥形结构或螺纹切削结构。从能够迅速且容易地装卸的观点考虑，更优选该嵌合结构部具有锥形结构。主体部件的嵌合结构部具有螺纹切削结构的情况下，优选盖部件也具有螺纹切削结构。此外，主体部件的嵌合结构部具有锥形结构的情况下，从更可靠地嵌合、固定的观点出发，盖部件也可以具有锥形结构。
本发明的冷冻保存用夹具的盖部件能够使用例如各种树脂、金属等对液氮等冷却溶剂具有耐性的材料形成。盖部件可以由1种材料形成，也可以由2种以上材料形成。其中，树脂能够通过注塑成型等工艺容易地形成锥形结构、螺纹切削结构，因而优选。作为树脂的具体例子，可以列举出聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯等聚酯树脂；丙烯酸树脂、环氧树脂、硅树脂、聚碳酸酯树脂、二醋酸酯树脂、三醋酸酯树脂、聚丙烯酸酯树脂、聚氯乙烯树脂、聚砜树脂、聚醚砜树脂、聚酰亚胺树脂、聚酰胺树脂、聚烯烃树脂、环状聚烯烃树脂等组成的树脂。此外，盖部件的总透光率为80％以上时嵌合盖部件后能够容易地确认盖内部的载置部的样子，因而优选。
本发明的冷冻保存用夹具所具有的盖部件优选具有固定部位，其用于固定于融解工序开始前利用的固定件。盖部件所具有的固定部位可以为与固定件的形状相契合的凹部或凸部等任意的凹凸形状。
本发明的冷冻保存用夹具的主体部件所具有的前端部至少具备具有保存液吸收体的载置部。载置部具有保存液吸收体，则能够通过该保存液吸收体有效地去除细胞或组织的周围存在的多余的保存液，提高载置、冷冻细胞或组织时的操作性。作为保存液吸收体，可以列举出例如金网、纸等或者由合成树脂形成的薄膜状物并且具有贯通孔的物质。作为其他的保存液吸收体，可以列举出使用折射率为1.45以下的材料形成的多孔结构体。通过该多孔结构体，能够去除细胞或组织周围存在的保存液。此外，通过该多孔结构体，能够在透过型光学显微镜观察下以良好的可视性容易且确实地进行载置、冷冻细胞或组织的操作以及冷冻后融解的操作。
本发明的冷冻保存用夹具通过在载置部具有保存液吸收体，能够使载置部载置的保存液的形状扁平。此外，载置细胞或组织后，通过极低温的冷却溶剂冷冻、固化时，细胞或组织的周围的保存液与保存液吸收体内吸收的部分连续，结果，利用极低温的冷却溶剂的冷冻、固化后细胞或组织不会从载置部脱落，能够将细胞或组织与其周围的保存液确实地保持在载置部上。
上述的多孔结构体的材料的折射率能够例如使用阿贝折光计(Na光源，波长：589nm)基于JIS K 0062：1992、JIS K 7142：2014进行测定。作为用于形成多孔结构体的折射率1.45以下的材料，可以列举出例如聚四氟乙烯树脂、聚偏二氟乙烯树脂、聚氯三氟乙烯树脂等氟树脂、有机硅树脂之类的塑料树脂材料，二氧化硅之类的金属氧化物材料，氟化钠、氟化镁、氟化钙之类的无机材料。
基于多孔结构体的保存液吸收体的孔径优选为5.5μm以下，更优选为1.0μm以下、进一步优选为0.75μm以下。由此能够提高光学显微镜观察下的细胞或组织的可视性。保存液吸收体的厚度优选为10～500μm，更优选为25～150μm。需要说明的是，在塑料树脂材料的多孔结构体的情况下，保存液吸收体的孔径是通过泡点试验测定的最大孔的直径。此外，金属氧化物材料或者无机材料的多孔结构体的情况下，为从该多孔结构体的表面及截面的图像观察测定的平均孔径。
保存液吸收体的孔隙率优选为30％以上，更优选为70％以上。孔隙率通过下式定义。这里，孔容V可以如下求得：使用水银孔隙率计(测定器名称Autopore II 9220，制造者micromeritics instrument corporation)测定、处理的保存液吸收体中的孔半径3nm～400nm的累计孔体积(ml/g)乘以保存液吸收体的干燥固形分量(g/平方米)得到的每单位面积(平方米)的数值。此外，保存液吸收体的厚度T可以通过电子显微镜拍摄保存液吸收体的截面并测定长度来得到。
P＝(V/T)×100(％)
P：孔隙率(％)
V：孔容(ml/m2)
T：厚度(μm)
本发明的冷冻保存用夹具的主体部件的前端部除了具备具有保存液吸收体的载置部之外，还可以具备支撑体。作为支撑体，可以列举出例如各种树脂薄膜、金属板、玻璃板、橡胶板等，可以仅由1种材料形成，也可以由2种以上的材料形成。其中，树脂薄膜从操作的观点考虑是适宜的。作为树脂薄膜的具体例子，可以列举出聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯等聚酯树脂；丙烯酸树脂、环氧树脂、有机硅树脂、聚碳酸酯树脂、二醋酸酯树脂、三醋酸酯树脂、聚丙烯酸酯树脂、聚氯乙烯树脂、聚砜树脂、聚醚砜树脂、聚酰亚胺树脂、聚酰胺树脂、聚烯烃树脂、环状聚烯烃树脂等形成的树脂薄膜。
本发明的冷冻保存用夹具的主体部件的前端部具有支撑体的情况下，从导热性优异、能够快速地冷冻的观点考虑，作为支撑体也能够适宜使用金属板。作为金属板的具体例子，可以列举出铜、铜合金、铝、铝合金、金、金合金、银、银合金、铁、不锈钢等。
上述的各种树脂薄膜、金属板、玻璃板、橡胶板等的厚度优选为10μm～10mm。此外，根据目的，还可以通过例如电晕放电处理等电气方法或者化学方法而将各种树脂薄膜、金属板、玻璃板、橡胶板等表面亲水化，进而也可以粗面化。
本发明的冷冻保存用夹具的主体部件所具有的前端部为长方形，在片状的矩形的平面内，以矩形的长边方向为长轴方向时，与其垂直的短轴方向的长度(矩形的宽度，即矩形的短边)为盖部件内径的70％以上。盖部件的内径是指，从开口部侧看盖部件时的内腔的最大径。前端部短轴方向的长度为上述范围时，将载置有细胞或组织以及保存液的载置部插入盖部件进行收纳时，不存在保存液及细胞或组织接触盖部件的开口部侧的端部而脱落的风险，能够被盖部件包覆。前端部短轴方向的长度低于70％的情况下，上述收纳操作时，前端部弯曲等情况下，有保存液及细胞或组织接触盖部件的开口部侧的端部而脱落的情况。需要说明的是，长方形前端部短轴方向的长度为盖部件内径的70％以上、95％以下，则插入时的操作性良好，因而优选。此外，长方形前端部优选沿长轴方向延伸的片的端边(长边)平行(矩形的宽度一定)，如果矩形的中心线沿长轴方向直线状延伸，则不平行也可以。这样的情况下，将矩形的最大宽度作为前端部短轴方向的长度。进而，优选前端部短轴方向的长度比盖部件的内腔的最小径小。
本发明的冷冻保存用夹具的盖部件内腔的长轴方向的长度为主体部件所具有的前端部长轴方向的长度的200％以下。盖部件内腔的长轴方向的长度是指，盖部件的内腔的空间延伸的方向中，盖部件的开口的一端到封闭的一端的内腔的空间的长度。盖部件内腔的长轴方向的长度为上述范围时，冷冻操作时，载置细胞或组织后，插入用于包覆前端部所具有的载置部的盖部件，能够以适宜的操作性进行安装作业。此外，融解工序时，可以将具有前端部的主体部件与盖部件迅速地分离。作为盖部件内腔的长轴方向的长度超过主体部件所具有的长轴方向的长度的200％的情况，已知有例如专利文献11中记载、图示的、在靠近把持部一侧设置有锥形结构等的嵌合结构部的冷冻保存用夹具，为这样的形态时，融解工序时难以将盖部件与主体部件迅速分离。此外，从利用盖部件包覆、保护前端部的观点考虑，本发明的冷冻保存用夹具的盖部件内腔的长轴方向的长度优选为主体部件所具有的前端部长轴方向的长度的105％以上。
由于本发明的冷冻保存用夹具的主体部件所具有的长方形前端部短轴方向的长度为盖部件内径的70％以上，并且，该盖部件内腔的长轴方向的长度为主体部件所具有的该前端部长轴方向的长度的200％以下，冷冻操作时，具有载置部的长方形前端部通过盖部件包覆，嵌合、固定后，浸渍在冷却溶剂中进行冷却、冷冻时，能够将盖部件的内腔中载置的细胞或组织迅速地冷却。例如，专利文献6记载、图示的那样的现有已知的冷冻保存用夹具，相对于含有载置部的前端部，盖部件的内腔大，无法迅速地冷却，不优选。
从操作性的观点考虑，优选本发明的冷冻保存用夹具的主体部件具有把持部，这样的情况下，出于容易把持、提高操作性的目的，把持部优选为棱柱状。该把持部优选为由对液氮等冷却溶剂有耐性的材料形成的部件。作为这样的材料，能够适宜使用例如铝、铁、铜、不锈钢等各种金属、ABS树脂、丙烯酸树脂、聚丙烯树脂、聚乙烯树脂、氟树脂、各种工程塑料、以及玻璃等。
本发明的冷冻保存用夹具的主体部件具有把持部的情况下，出于容易识别载置部的正反的目的，可以在把持部的正面或者反面具有标记部。此外，出于同样的目的，例如，可以在把持部的正面的一部分形成特征性结构(例如凹部或凸部)。
以上，对本发明的冷冻保存用夹具进行了说明。接着，对使用了本发明的冷冻保存用夹具的冷冻融解方法的一个例子进行说明。
使用了本发明的冷冻保存用夹具的冷冻融解方法进行冷冻工序、保冷工序、融解工序。冷冻工序中，第一步将细胞或组织与保存液一起载置于冷冻保存用夹具所具有的载置部。所述操作优选在透过型的显微镜观察下(以下，也简记为显微镜观察下)进行。此时，由于冷冻保存用夹具所具有的载置部具有保存液吸收体，能够有效地去除多余的保存液，因此，能够得到高的操作性，并且能够使细胞或组织的周围存在的保存液少，从而能够容易地得到高的冷冻速度和融解速度。
接着，第二步，将主体部件的含有载置部的前端部插入盖部件中，将盖部件嵌合、固定。向盖部件中插入前端部的操作可以在显微镜观察下进行。此时，本发明的冷冻保存用夹具的前端部短轴方向的长度为盖部件内径的70％以上，并且载置部上载置的保存液的液滴通过保存液吸收体的作用而在载置部上呈扁平的形状，不存在保存液及细胞或组织接触盖部件的端部而脱落的风险，能够通过盖部件包覆含有载置部的前端部。前端部插入盖部件后，被盖部件完全包覆，将盖部件嵌合、固定到主体部件的嵌合结构部而被完全密闭。
接着，第三步，将嵌合、固定到主体部件的盖部件浸渍到液氮等冷却溶剂中，将载置部上载置的细胞或组织冷却、冷冻。此时，被盖部件包覆、完全密闭的载置部及载置部上的细胞或组织不与冷却溶剂接触地被冷却。由于本发明的冷冻保存用夹具的主体部件所具有的长方形前端部短轴方向的长度为盖部件内径的70％以上，并且该盖部件内腔的长轴方向的长度为主体部件所具有的该前端部长轴方向的长度的200％以下，能够以适宜的操作性进行将前端部插入盖部件中，将盖部件嵌合、固定到嵌合结构部的操作，能够将位于盖部件的内腔之中的载置于载置部上的细胞或组织迅速地冷却。
从将细胞或组织与保存液一起载置于载置部，经过密闭的操作，直至将被盖部件密闭的主体部件浸渍到冷却溶剂中为止所需的时间优选为1分钟以内。更优选为30秒以内。上述冷冻工序所需要的时间超过1分钟的情况下，细胞或组织受到含有防冻剂的保存液的强烈影响，从存活率的观点考虑不优选。由于本发明的冷冻保存用夹具的盖部件内腔的长轴方向的长度为主体部件所具有的前端部长轴方向的长度的200％以下，因此，即使在上述的限定的时间以内的操作中也可以获得高的操作性。
接着，将冷却的细胞或组织以维持其玻璃化冷冻状态的方式在利用冷却溶剂等保持为极低温的低温保管容器中保冷。该工序为所谓的保冷工序。
本发明的冷冻保存用夹具的盖部件具有固定部位的情况下，在融解工序之前，可以利用盖部件优选具有的固定部位，使用具有固定盖部件的功能的固定件保持冷冻保存用夹具。利用盖部件的固定部位将本发明的冷冻保存用夹具固定到固定件，并与固定件一起浸渍到冷却溶剂中，则容易暂时保持为被盖部件密闭的细胞或组织冷却位于溶剂的液面下方、且冷冻保存用夹具的盖部件的接合部位于冷却溶剂的液面上方的状态，因此优选。
上述固定件优选具有用于冷冻保存用夹具的盖部件插入、固定的狭缝部。此外，狭缝部优选具有用于固定上述的盖部件所具有的固定部位的狭缝固定部。上述固定件所具有的狭缝部可以为1处，也可以有多处。
本发明中的固定件优选与上述的盖部件一样，由对液氮等冷却溶剂具有耐性的材料形成。作为这样的材料，可以适宜使用例如铝、铁、铜、不锈钢等各种金属，ABS树脂、丙烯酸树脂、聚丙烯树脂、聚乙烯树脂、氟树脂、各种工程塑料、以及玻璃等。从自重大、能够良好地固定冷冻保存用夹具的观点考虑，优选金属制固定件。
优选的是，本发明的冷冻保存用夹具的载置部在融解工序开始前暂时保持为被盖部件密闭，载置部载置的细胞或组织的位置为冷却溶剂之中，主体部件与盖部件的接合部没有进入冷却溶剂中的状态，接着，松开主体部件与盖部件的嵌合、固定，之后分离盖部件与主体部件。优选所述分离之后，将载置部浸渍到融解液中进行融解工序。通过融解工序前的这些操作，能够使主体部件所具有的载置部不与液氮等冷却溶剂接触地迅速地浸渍到融解液中。
融解工序中，从松开主体部件与盖部件的嵌合、固定到将载置部浸渍到融解液中的时间优选为5分钟以内。更优选为1分钟以内。松开嵌合、固定，密闭状态打开的状态时间长的情况下，氮气、氧气等气体进入盖内，接着被冷却、液化。液化的气体附着于载置部，融解工序时被带入融解液中，则存在融解液的温度降低的风险，因而不优选。
由于本发明的冷冻保存用夹具的盖部件内腔的长轴方向的长度为主体部件所具有的前端部长轴方向的长度的200％以下，因此上述融解工序中，盖部件与主体部件分离的操作性良好。尤其，能够容易地实现玻璃化冷冻法所要求的迅速的融解速度，优选能够在不到1秒钟将载置部上的细胞或组织从极低温的状态转移到融解液中。更优选为0.75秒以内。
本发明的冷冻保存用夹具能够在上述的冷冻融解方法中适宜地使用。若进行上述的冷冻工序及融解工序，则在将载置部上的细胞或组织浸渍到融解液中，从载置部上回收时，能够抑制气泡在载置部上的附着，融解工序时显示优异的回收操作性，因此优选。
以上，对使用了本发明的冷冻保存用夹具的冷冻融解方法进行了说明。接着，对于本发明的冷冻保存用夹具、使用了本发明的冷冻保存用夹具的冷冻融解方法中优选使用的固定件，按照附图进一步详细地进行说明。
图1是表示本发明的冷冻保存用夹具的主体部件的一个例子的俯视示意图。图1所示的主体部件2具有把持部8、嵌合结构部10和前端部4。前端部4具备载置部5、支撑体6以及前端标记部7，附设于嵌合结构部10。把持部8具有用于识别载置细胞或组织侧的把持部标记部9。前端部4的前端，即前端标记部7呈大致半圆状，能够提高向盖部件插入时的操作性。此外，嵌合结构部10为用于将盖部件固定于主体部件2的部位。图1中，嵌合结构部10具有从把持部8开始沿前端部4变细的圆锥台形的锥形结构。
图2是表示本发明的冷冻保存用夹具的主体部件的一个例子的侧视示意图。通过将图2所示主体部件2所具有的把持部8的一部分设计为凹部，操作者在把持主体部件2时，能够容易地识别前端部4的正反，即识别用于载置细胞或组织的载置部5一侧。同样地，出于识别前端部4的正反的目的，具备把持部标记部9。主体部件2的前端部4在支撑体6上具有由保存液吸收体组成的载置部5和前端标记部7。支撑体6上设置载置部5，能够借助粘接层将载置部5的二个短边粘接等(图2中未示出粘接层)。
图3是表示本发明的冷冻保存用夹具的盖部件的一个例子的侧面剖视图。图3所示的图中示出了用于包覆主体部件2的前端部4的盖部件3的内腔11的结构。盖部件3为仅一端开口的结构，开口部23附近形成有用于与主体部件2的嵌合结构部10嵌合的锥形结构。此外，盖部件3具有用于在融解工序开始前将盖部件3固定于固定件的固定部位12。固定部位12具有与后述的固定件16的形状契合的凹凸形状。
图4是表示本发明的冷冻保存用夹具的盖部件的一个例子的从开口部侧看的侧视图。图4所示盖部件3为具有四棱柱状的外表面形状、具有圆筒形状的内腔11的形状。
图5是表示主体部件2与盖部件3嵌合、固定的状态的一个例子的示意图。需要说明的是，包括后述的图在内，为了显示盖部件3中包覆的嵌合结构部10及前端部4的样子，盖部件3图示出内部结构(截面结构)。图5所示冷冻保存用夹具1通过主体部件2所具有的嵌合结构部10使得盖部件3完全嵌合、固定于主体部件2，前端部4通过盖部件3而被包覆、密闭，完全保护其免受外部环境的影响。盖部件所用材料的透光性不充分的情况下前端部4的正反的识别困难，因此优选设置把持部标记部9。
图6是表示冷冻保存用夹具中载置有细胞和保存液的状态的示意图。在使用了本发明的冷冻保存用夹具1的冷冻融解方法中，操作者将细胞14和保存液15滴加附着到附设于主体部件2的前端部4的载置部5上，将细胞14载置于载置部5上。滴加附着的保存液15的液滴通过由保存液吸收体形成的载置部5，多余的保存液被自动去除，并且在载置部5上呈扁平的形状。
图7是表示本发明的冷冻保存用夹具中载置有细胞和保存液后将盖部件嵌合、固定的状态的示意图。将细胞14与保存液15一起滴加附着到主体部件2的载置部5上载置后，将盖部件3嵌合、固定到主体部件2。由此，载置部5上载置的细胞14被盖部件3完全包覆、密闭，完全保护其免受外部环境的影响。盖部件3与主体部件2的接界处为接合部13。
图8是表示使用了本发明的冷冻保存用夹具的冷冻融解方法所用的固定件的一个例子的侧面剖面示意图。图8中，固定件16具有：盖部件3所插入的狭缝部17，狭缝部17具有用于固定盖部件3的固定部位12的狭缝固定部18。
图9是表示在融解工序开始前被盖部件密闭的细胞或组织位于冷却溶剂的液面下方，并且盖部件的接合部位于冷却溶剂的液面上方的状态的示意图。图9中，冷冻保存用夹具1所具有的盖部件3的固定部位12通过插入形成于固定件16的狭缝部17的一部分的狭缝固定部18而被保持、固定。此时，盖部件3与主体部件2的接合部13位于冷冻容器19中充填的冷却溶剂20的液面21的上部。因此，即使在冷冻保存用夹具1的主体部件2与盖部件3的嵌合、固定松动，嵌合解除的情况下，四周的冷却溶剂也不会直接浸入盖部件3的内部。即，冷却溶剂不与前端部4接触，也不与细胞14及保存液15接触，但维持细胞或组织的冷却状态，细胞14被充分冷却。由此，之后的融解工序中，能够将细胞或组织从极低温的状态转移到融解液中，迅速进行融解。即，能够不降低融解速度地迅速地融解细胞或组织。
图10是表示分离主体部件与盖部件，将载置部浸渍到融解液中的状态的示意图。图10中，通过将盖部件3固定于固定件16，仅利用拔出主体部件2的操作，就可以将具有前端部4和附设于前端部4的载置部5的主体部件2与盖部件3迅速分离。分离后，将载置部5浸渍在融解液22中，在融解液22中融解、回收细胞14。
使用采用了本发明的冷冻保存用夹具的冷冻融解方法冷冻保存、融解细胞或组织的情况下，保存液能够使用用于冷冻卵子、胚等细胞的常用的保存液，例如，前述的磷酸缓冲生理盐水等生理溶液中含有各种防冻剂(甘油、乙二醇、DMSO(二甲基亚砜)等)的保存液，可以使用大量含有各种防冻剂(相对于保存液总质量的至少10质量％以上，更优选为20质量％以上)的保存液。对于融解液，也可以使用用于融解卵子、胚等细胞的常用的融解液，例如，可以使用在前述的磷酸缓冲生理盐水等生理溶液中含有用于调整渗透压的1M蔗糖的融解液。
作为能够用于使用了本发明的冷冻保存用夹具的冷冻融解方法的细胞，可以列举出例如，哺乳类(例如，人、牛、猪、马、兔、大鼠、小鼠等)的卵子、胚胎、精子等生殖细胞，诱导多能干细胞(iPS细胞)、胚性干细胞(ES细胞)等多能干细胞。此外，可以列举出初代培养细胞、继代培养细胞以及细胞株细胞等培养细胞。此外，在一个或多个实施方式中，细胞可以列举出成纤维细胞、胰腺癌/肝癌细胞等癌源性细胞、上皮细胞、血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞、神经细胞、软骨细胞、组织干细胞及免疫细胞等粘附细胞。进而，作为能够冷冻保存、融解的组织，可以列举出由同种或不同种的细胞组成的组织，例如，卵巢、皮肤、角膜上皮、牙周膜、心肌等组织。本发明尤其适于具有片状结构的组织(例如，细胞片、皮肤组织等)的冷冻保存。本发明的冷冻保存用夹具不仅适用于直接从活体采集的组织，也适用于例如，体外培养和生长的培养皮肤，在体外构建的所谓细胞片，日本特开2012-205516号公报提出的具有三维结构的组织模型那样的人造组织的冷冻保存。本发明的冷冻保存用夹具可以适用作为上述那样的细胞或组织的冷冻保存用夹具使用。
实施例
以下，通过实施例更详细地说明本发明。虽然对本发明进行更具体的说明，但本发明不限于以下的实施例。
(实施例1)
按照图1及图3所示的方式制作实施例1的冷冻保存用夹具。以聚对苯二甲酸乙二醇酯树脂薄膜(总透光率89％、雾度值2.3％)作为支撑体，使用Advantec东洋公司制造的聚四氟乙烯多孔材料(孔径0.2μm，孔隙率71％，厚度35μm)作为保存液吸收体，使用HenkelJapan公司制造的热熔性聚氨酯树脂Purmelt(注册商标)QR 170-7141P作为粘接层，仅将短轴侧的两端两边贴合到该支撑体上固定，制作具有载置部的前端部。此外，使用ABS树脂制作主体部件的把持部、嵌合结构部以及盖部件。将前端部、把持部以及嵌合结构部接合，制作实施例1的冷冻保存用夹具。实施例1的冷冻保存用夹具的主体部件所具有的前端部短轴方向的长度为1.75mm，长轴方向的长度为20mm。此外，实施例1的冷冻保存用夹具的盖部件的内径为2.1mm，内腔的长轴方向的长度为35mm。
(实施例2)
将主体部件所具有的前端部短轴方向的长度由1.75mm替换为1.5mm，除此之外，与实施例1同样地制作实施例2的冷冻保存用夹具。
(实施例3)
将盖部件内腔的长轴方向的长度由35mm替换为40mm，除此之外，与实施例2同样地制作实施例3的冷冻保存用夹具。
(比较例1)
不设置保存液吸收体，将支撑体直接作为载置部，除此之外，与实施例2同样地制作比较例1的冷冻保存用夹具。
(比较例2)
将主体部件所具有的前端部短轴方向的长度由1.75mm替换为0.7mm，除此之外，与实施例1同样地制作比较例2的冷冻保存用夹具。
(比较例3)
制作盖部件内腔的长轴方向的长度为80mm的盖部件。此外，按照冷冻保存用夹具的主体部件的长度及盖部件嵌合、固定到主体部件时的总长与实施例1的冷冻保存用夹具相同的形状，将嵌合结构部的形状向把持部侧扩张，除此之外，与实施例1同样地制作比较例3的冷冻保存用夹具。
<冷冻工序时的盖部件的插入操作性评价>
在实施例1～3及比较例1～3的冷冻保存用夹具的载置部上，以玻璃珠(直径100μm)作为模拟细胞，与0.1μL保存液一起在透射显微镜下使其滴加附着。需要说明的是，保存液使用Sigma-Aldrich公司制造的Medium199培养基中含有15体积％DMSO、15体积％乙二醇、17质量％蔗糖组成的保存液。接着，在透射显微镜下，将含有载置部的前端部插入盖部件。此时，进行5次载置部上载置的保存液是否接触盖部件的开口部侧的端面的评价，作为“冷冻工序时的盖部件的插入操作性的评价”按照以下的基准进行评价。它们的结果示于表1。
○：5次评价中，保存液一次也没有与盖部件的开口部侧的端面接触。
×：5次评价中，保存液与盖部件的开口部侧的端面接触1次以上。
<融解工序时的融解液浸渍的操作性评价>
通过与上述同样的顺序，在实施例1～3及比较例1～3的细胞或组织的冷冻保存用夹具的载置部上，将模拟细胞与保存液一起滴加附着到载置部，将盖部件完全嵌合、固定到主体部件后，在液氮中浸渍进行冷冻。保冷工序后，在融解工序之前，按图9所示的方式将主体部件固定到图8所示的实施方式的固定件。之后，维持模拟细胞处于液氮的液面之下的状态，并且不与液氮接触，将盖部件的嵌合、固定稍微松开。接着，在图10所示的实施方式那样盖部件固定于固定件的状态下，拔出主体部件，与盖部件分离，使主体部件的前端部浸渍到融解液中，测量此时所需要的时间，作为“融解工序时的融解液浸渍的操作性评价”按照以下的基准进行评价。需要说明的是，融解液使用上述的Medium199培养基中含有34质量％蔗糖的组成的融解液。它们的结果示于表1。
◎：操作所需时同为0.75秒以内。
○：操作所需时间超过0.75秒且为1秒以内。
×：操作需要超过1秒的时间。
[表1]
Figure BDA0003447968410000201
<融解工序时的回收操作的操作性评价>
通过上述的“融解工序时的融解液浸渍的操作性评价”同样的方法，将实施例1～3及比较例1～3的冷冻保存用夹具的具有载置部的前端部浸渍到融解液中。之后，在显微镜下观察融解液中的载置部及载置部上的模拟细胞的样子。确认此时观察到的融解液中的载置部上有无气泡的附着，实施例1～3及比较例1～3的冷冻保存用夹具中均没有观察到气泡附着到载置部上，表明融解工序时的回收操作中具有高的操作性。
从上述结果可知，本发明的冷冻融解用夹具在冷冻工序和融解工序都具有优异的操作性。此外，细胞或组织的融解可以以极短的时间进行，能够期待得到高的生存率。
产业上的利用可能性
本发明能够用于牛等家畜、动物的胚胎移植、人工授精，人的人工授精等，以及iPS细胞、ES细胞、通常使用的培养细胞、含有胚胎或者卵子的从生物体采集的检查用或移植用的细胞或组织，体外培养的细胞或组织等的冷冻保存及其融解。
符号说明
1 细胞或组织的冷冻保存用夹具
2 主体部件
3 盖部件
4 前端部
5 载置部
6 支撑体
7 前端标记部
8 把持部
9 把持部标记部
10 嵌合结构部
11 盖部件的内腔
12 固定部位
13 接合部
14 细胞
15 保存液
16 固定件
17 狭缝部
18 狭缝固定部
19 冷冻容器
20 冷却溶剂
21 液面
22 融解液
23 开口部

Claims (1)

1.一种细胞或组织的冷冻保存用夹具，其至少具备具有长方形前端部的主体部件以及包覆该主体部件前端部的盖部件，其特征在于，该前端部至少具备具有保存液吸收体的载置部，该前端部短轴方向的长度为1.75mm以下且为该盖部件内径的70％以上，该盖部件内腔的长轴方向的长度为该前端部长轴方向的长度的200％以下。
CN202080048606.6A 2019-08-23 2020-08-05 细胞或组织的冷冻保存用夹具 Active CN114071995B (zh)

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