JP2008005846A - 多様な植物細胞の凍結保存方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】1)凍結保存剤および安定剤により予備処理した植物細胞を、低温に順化し、ローディング剤をローディングし、ガラス化溶液によりガラス化し、凍結保存温度で凍結する、植物細胞の凍結保存方法、2)凍結保存された生存植物細胞、3)前記細胞を解凍し、凍結保護剤および安定剤を含む培地内でインキュベートした後、凍結保護剤を除去して生存植物細胞を回復する方法。
【選択図】なし
Description
本出願は、1995年6月7日に出願された合衆国特許出願第08/486,204号の一部継続出願である。
1.発明の分野
本発明は、植物細胞の凍結保存方法、および、凍結保存された植物細胞の回復方法に関する。本発明はまた、凍結保存から好首尾に回復された植物、生存植物細胞および植物細胞培養組織に関する。
凍結保存(cryopreservation)は、超低温で保存することにより生体物質の代謝機能を減退してから停止することに基づいている。また、遺伝子変化を起こさずに植物および植物細胞を長期間に亙り凍結保存したり、それに引続き、特性および生合成能力を変化させずに通常の植物細胞を回復することは、植物繁殖、生体医学調査および遺伝子工学と重要な関係を有している。更に、液体窒素の温度(-196℃)では、細胞は殆ど全ての代謝作用を停止すると共に、この停止し乍らも生存可能な状態で長期に亙って保持され得る。
本発明は、現在の方法および対策に伴う問題および不利益を克服すると共に、植物細胞を凍結保存し且つ凍結保存された生存植物細胞を回復する方法を提供する。
発明の説明
本明細書中で実施される共に広範に記載された様に、本発明は、植物細胞の凍結保存方法、凍結保存された植物細胞の回復方法、および、凍結保存から好首尾に回復された生存植物細胞に関する。
予備処理
凍結保存されるべき植物細胞は、細胞の増殖間にもしくは細胞死滅によりもたらされた有害物質を培養培地から除去することにより細胞の生存度を高める試薬により予備処理される。これらの試薬は本明細書中では安定剤と称するが、それらは、自然に産するもしくは人工的に製造されると共に培養培地中に直接的に導入され得る材料を含む。安定剤としては、活性酸素種および他のフリーラジカルの存在に付随する有害効果を中和する抗酸化剤もしくはラジカル捕捉剤である化学試料が含まれる。上述の物質は、細胞膜、すなわち内部および外部の膜の両者を損傷し、凍結保存および回復の程度を相当に低下させるものである。もし、これらの物質が除去されずもしくは無効とされなければ、生存度に対するそれらの効果は経時的に蓄積され、実用上の貯蔵寿命を厳しく制限するであろう。更に、細胞は死滅しもしくは疲労することから、付加的な有害物質が放出されて隣接細胞が損傷かつ死滅する。
予備処理の間もしくは予備処理のいずれかの時点において、凍結保存されるべき細胞は、培養温度から低下される温度であり凍結温度よりは高い温度に順化させ得る。これにより、細胞代謝を相当に遅らせると共に更に限界的な温度変化の幾つかを通しての急速な温度遷移のショックを和らげることにより、細胞を凍結保存プロセスに対して調製する。限界的な温度範囲は、例えば水結晶形成の臨界温度近傍で細胞に損傷を与える危険性が高い温度範囲である。当業者に公知の如く、これらの温度は溶液組成に幾分なりとも依存して変化する。殆どの細胞培養培地の基本的成分である水の場合、氷結晶の形成および再形成は約0℃乃至約50℃にて生ずる。
ローディングは、ひとつ以上の凍結保存剤の溶液中での細胞の平衡化を含む。ローディング中に使用される試薬は、ローディング剤と称され得る。有用なローディング剤は、ひとつ以上の脱水剤、透過性もしくは非透過性の試薬、および、浸透剤を含み得る。ローディングの適切な試薬は、細胞懸濁液中に導入されると同時に細胞脱水を誘起する試薬を含む。DMSOおよびエチレングリコール等の透過剤、並びに、フルクトース、スクロースもしくはグルコース、および、ソルビトール、マンニトールもしくはグリセロールなどの透過性および非透過性の浸透剤の組合せ、の両者を使用することが可能である。この段階は、約0.5M乃至約2Mもしくは約5重量%乃至約20重量%の中濃度の凍結保存剤を細胞質ゾル内に導入することにより細胞質ゾルの溶質濃度を増大するものである。平衡化に要する時間を最小限にする為に、ローディングは略々室温で行うのが普通であるが、これは、ローディングに最適な温度および他の条件が、生存細胞培養を維持する培地、光強度および酸素レベルなどの条件を整合させるとしてもである。
凍結保存されるべき細胞は、予備処理、ローディングおよび/または凍結乾燥に引続いてガラス化される。ガラス化処理には幾つかの利点がある。システム内での氷結晶形成を防止することにより、氷形成に通ずる複雑な変数を最適化する必要性が無くなる。更に、試料は液体窒素中に直接的に投入され得ることから、この処理では冷却を制御するに必要とされる多数の装置を必要としない。ガラス化処理はまた、幾つかの異なる種類の細胞を含む複雑な組織に対する凍結保存処理を展開する上で大きな可能性を与える。
凍結乾燥は、凍結保存の前に真空蒸発により細胞の水分を減少することである。真空蒸発は、減圧雰囲気中に細胞を載置する段階を含む。所望の水分除去速度に依存して、約−30℃乃至−50℃の温度における減圧雰囲気は、100torr、ltorr、0.01torr、もしくはそれ以下、とされ得る。減圧条件下での水分蒸発速度は、細胞の65%の水分が一晩で除去され得る如く増大される。選択的な条件により、水分除去は数時間以下で行われ得る。蒸発における熱喪失により、細胞は冷却状態に保持される。真空レベルを注意深く調節することにより、真空蒸発処理の間、細胞は冷却順化温度に保持され得る。真空を強力にすれば水分蒸発は迅速になるが、細胞が凍結する危険性に晒される。凍結は、細胞に直接的に加熱するかもしくは真空レベルを調節することにより制御され得る。細胞を最初に蒸発チャンバ内に載置するときに高真空が加えられるが、これは、細胞内に残存する熱が凍結を妨げるからである。脱水が進むと共に細胞の温度が低下するにつれ、真空度を低下させもしくは加熱を行って凍結を防止し得る。半乾燥細胞は、蒸発チャンバ内に拡散する傾向がある。この傾向は、処理の終了時に空気流をチャンバ内に戻すときに特に顕著である。もし空気流が半乾燥の細胞の付近を流れると、それは細胞を吹き飛ばし、試料を相互汚染させる可能性もある。斯かる崩壊を回避すべく、蒸発冷却は、細胞を乾燥させ乍らも遠心力により管内に幽閉する真空遠心機中で行うことが出来る。このプロセスにおいて除去される水分の量は、細胞の乾燥重量を測定することにより定期的に関しされ得る。所望の水分量が除去されたとき、液体窒素中で直接凍結するに先立ち、ガラス化溶液は所定時間だけ半乾燥細胞に直接的に付加され得る。
予備処理され、ローディングされ、ガラス化され且つ/または凍結乾燥された植物細胞は、凍結保存温度に凍結することにより保存される。凍結段階は十分に迅速にし、細胞の生存に有害な大寸の氷結晶形成を防止せねばならない。細胞は、既に凍結保存温度に在る試薬に直接的に接触させ、直接的に凍結することもできる。直接方法は、液体窒素もしくは液体ヘリウムなどの極低温流体内に細胞を直接的に浸漬、噴霧、射出もしくは注入する段階を含む。細胞はまた、液体窒素により凍結された鋼鉄ブロックなどの冷却固体に直接的に接触され得る。また、細胞の容器上に極低温流体を直接的に注入しても良い。直接法はまた、極低温にて空気などの気体に細胞を接触することも包含する。窒素もしくはヘリウムの極低温気体流は、細胞懸濁液中に直接的に噴射しもしくは吹込んでも良い。間接的方法は、細胞を容器中に載置し、この容器を極低温の固体、液体、気体に接触させる段階を含む。適切な容器としては、例えば、極低温に耐える様に設計されたプラスチック小瓶、ガラス小瓶もしくはアンプルがある。間接凍結の為の容器は、空気もしくは液体に関して不透過性を有する必要は無い。例えば、プラスチックバッグ、もしくはアルミニウム箔が適切である。更に、容器が極低温に耐え得る必要は無い。極低温下でプラスチック小瓶がヒビ割れし乍らも実質的に元のままであれば、使用することが出来る。また、金属箔の一側を極低温の気体、固体もしくは液体に接触させ乍ら、他側に細胞の試料を載置して細胞を凍結しても良い。凍結は、氷結晶形成を阻害すべく十分に迅速でなければならない。凍結時間は約5分もしくは、4分、3分、2分、1分もしくはそれ以下とすべきである。臨界的な凍結時間は、単一の細胞の基準枠から測定すべきである。例えば、液体窒素中に大量の細胞試料を注入するには10分間かかるかも知れないが、この方法によれば個々の細胞は急速に凍結される。
本発明の別の実施例は、凍結保存された細胞の解凍方法に関する。細胞の生存および細胞の回復に対しては、それらが当初に凍結されたのと実質的に同一の条件で適切に解凍および回復を行うことが必須である。凍結保存された細胞の温度が解凍の間に上昇するとき、失透(devitrification)と称されるプロセスにおいて小寸の氷結晶が集結して大きくなる。細胞内に大きな氷結晶があると、一般的には細胞の生存に有害である。失透を防止すべく、凍結保存された細胞は可及的に急速に解凍されねばならない。加熱速度は、少なくとも約30℃毎分乃至60℃毎分とし得る。また、90℃毎分、140℃毎分乃至200℃毎分、もしくはそれ以上の急速加熱速度も使用することが可能である。この点、急速加熱が望ましいが、植物細胞は、室温よりも相当に高いインキュベート温度で生存する能力が低い。従って、過熱を防止すべく、細胞の温度を注意深く監視せねばならない。加熱方法としては、伝導、対流、放射、電磁放射、もしくはそれらの組合せを含む任意のものが使用され得る。伝導方法は、水浴内への浸漬、加熱ブロック内への載置、もしくは、開放炎内への直接載置を含む。対流方法は、ヒートガンもしくは炉の使用を含む。放射方法は、例えば、加熱ランプもしくは対流もしくは放射炉等の炉の使用を含む。電磁放射は、極超短波炉および類似装置の使用を含む。幾つかの装置は、これらの方法の幾つかを組合せて加熱を行う。例えば、炉は、対流および放射により加熱を行う。加熱は、細胞および周囲溶液が液状になると同時に終了せねばならないが、それは0℃以上である。凍結保存された細胞は、凍結点を降下させるひとつ以上の試薬の存在により凍結されていることも多い。これらの試薬が存在するとき、凍結された細胞は0℃以下の温度、たとえば約−10℃、−20℃、−30℃、もしくは−40℃の温度で液化し得る。凍結保存された細胞の解凍は、これらの温度のいずれか、もしくは、0℃以上の温度で終了することが出来る。
ガラス化溶液の希釈および細胞からの凍結保存剤の除去はアンローディングと称されるが、これは、凍結保存された細胞試料の解凍に引続いて可及的に迅速かつ可及的に早期に行わねばならない。凍結保存剤の細胞内濃度は高いことから、浸透拡張を最小化し乍ら懸濁培地を希釈することが好適である。従って、懸濁培地の希釈および試料標本内からの凍結保存剤流出は、高浸透圧培地内での希釈もしくは段階的希釈により行われるのが通常である。
イチイ(Taxus)の針葉を野性植物および養殖植物から採取した。植物材料は、希釈石鹸溶液で洗浄し、蒸留水で丹念に濯ぎ、且つ、亜塩素溶液(1%の次亜塩素酸、pH7)で10分間だけ殺菌する。殺菌状態下で、この材料は滅菌蒸留水で3回に亙り濯がれた。針葉は、100mgのL-アスコルビン酸(ビタミンC)を含む1%のポリビニルピロリジン(PVP)溶液中で切断された。これらの針葉は、切断端を以て半固体の培地E内に載置され、暗所にて24℃±1℃でインキュベートされる。培養物は毎日観察し、微生物汚染の徴侯があるものは廃棄した。相当のカルス形成が観察されると共に、カルスは外植体から20日間だけ分離され、かつ、表4に列挙された種々のカルス増殖培地上に載置された。Taxus chinesisのカルスは、培地D(表4)に移動された。この処理の結果、外植体の90%以上のカルス誘導が生じた。同一の処理が、T.brevifolia、T.canaensis、T.cuspidata、T.baccata、 T.globosa、T.floridana、T.wallichiana、 T.mediaおよびT.chinensisの培養を開始する上で好首尾に使用された。外植体から除去されたカルスは、暗所にて24℃で培養された。カルスの健康な部分は、10日毎に新たな培地に移動された。本発明に好適な成長および維持用培地を列挙する:
1グラムのカルス材料を、25mlの液体培地(表4)を含む125ml容量の三角フラスコに無菌的に植え付ける。フラスコをシリコーンフォームキャップでカバーすると共に、暗所にて24℃で120rpmの旋回シェーカ上に載置する。懸濁培養物は約3〜10日で形成された。培地の交換は、miraclothフィルタを含むブヒナー漏斗を通してフラスコの内容物を吸引濾過すると共に新鮮な培地内で全てのバイマスを再懸濁することにより開始された。また、毎週、25mlの新鮮な培地を含む125mlフラスコに1〜2グラムの細胞を移動した。代表的な種の懸濁培養において達成された典型的な増殖速度および細胞密度は、表5に示されている。
6〜7日経過したイチイ細胞の懸濁培養を収穫し、0.16Mのマンニトール、0.22Mのマンニトール、0.33Mのマンニトール、もしくは、0.44Mのマンニトール、を含む新鮮な増殖培地内で再懸濁された。
凍結されたイチイ細胞は、解凍されると共に、ソルビトールを0.15M、0.22M、0.33M、0.44Mおよび0.80Mだけ含む新鮮な増殖培地内で懸濁された。解凍後、直ちに生存度が測定された。多数の試みの結果の要約を以下に列挙する:
6〜7日経過したイチイ細胞の懸濁培養を収穫し、0.06M、0.12M、0.15M、0.29M、および、0.58Mのスクロース、を含む新鮮な増殖培地内で細胞バイオマスが再懸濁された。又、細胞は凍結保護され、凍結され、解凍され、且つ、透過的に調節された。細胞の生存度は解凍後に直ちに測定された。多数の実験結果の概要が表8に列挙されている:
増殖培地内の種々の浸透剤の効果を、該浸透剤により予備培養された、予備培養期間後の、および、凍結保護かつ凍結された細胞懸濁を解凍した後の、Taxus種細胞に関して測定した。3日間の細胞培養懸濁を行った細胞が、凍結保護に先立ち、種々の浸透剤を含む増殖培地内で予備培養された。凍結保護された細胞は、液体窒素内で凍結されると共に、最小限1時間だけ保存された。予備培養期間の終端(対照物)時と、凍結保護され且つ凍結された細胞の解凍の直後において、生存度試験が行われた。
Taxus(イチイ)の懸濁培養(KS1A)の細胞が収穫されると共に、培地内に種々の浸透剤を入れて予備培養された。試験された浸透剤は、トレハロース、プロリン、ソルビトール(0.15M-0.8M)、スクロース(2-20%)およびマンニトール(0.16M)を含むものである。生存度は、細胞懸濁の各々に対し、予備培養期間の終了時、および、解凍の直後において評価された。再培養は、解凍後の浸透調節後に評価された。使用されたガラス化溶液は、培養培地内のエチレングリコール/ソルビトール/ペクチン、および、40/30wt.%のエチレングリコール/ソルビトールであった。結果は表10に要約されている。最高の割合の生存度と最も活発な再増殖が観察されたのは、予備培養にマンニトールを使用すると共にガラス化溶液中の凍結保護剤としてエチレングリコール/ソルビトールを使用した場合であった。
細胞培養からイチイ(Taxus)細胞を収穫すると共に、バイオマスが3%の濃度のマンニトールを含む増殖培地中で室温で1日〜3日だけ懸濁された。ロードされた細胞は4℃で3時間だけインキュベートされ、かつ、培養溶媒中に40/30重量%のエチレングリコール/ソルビトールから成る冷却ガラス化溶液を含む4ml凍結用小瓶に移動された。この小瓶は4℃で3分間に亙りインキュベートされると共に、液体窒素に浸漬して凍結された。小瓶中に含まれた細胞は液体窒素中に少なくとも10分間だけ保持された。
Taxus種のKS1A系細胞の6〜7日間の細胞懸濁が、3%マンニトールで室温にて3日間だけ予備培養された。ロードされた細胞は4℃で3時間だけフラスコでインキュベートすることにより低温順化された。低温順化された細胞は4mlの凍結用小瓶に移動され、低温ガラス化溶液が各々に対して付加されて混合された。4℃にて3分間だけガラス化した後、細胞は液体窒素浸漬により凍結された。小瓶は液体窒素内に少なくとも10分間だけ保持された。
培養されたイチイ細胞が収穫されると共に、3%のマンニトールを含む新鮮な増殖培地内で3日間に亙り再懸濁された。細胞は3時間だけ低温順化されると共に、ガラス賀陽駅を含む小瓶に移された。細胞懸濁は液体窒素浸漬により凍結された。液体窒素により凍結された細胞は、40℃の水浴内で小瓶を1〜2分間だけ撹拌することにより解凍された。凍結保護剤としてのエチレングリコールと共に凍結された細胞が最も高い生存度を示した。
6〜7日間過ぎたTaxus種のKSlA系細胞の再冒険だくが収穫されると共に、3%のマンニトールを含む新鮮な培地中で再懸濁されると共に室温で3日間だけインキュベートされた。4℃で3時間だけ低温順化したあと、細胞は、培養培地内に40/30wt.%のエチレングリコール/ソルビトールを含む4ml小瓶に移された。小瓶は4℃で3分間だけインキュベートされると共に、液体窒素浸漬で凍結された。小瓶は、解凍する前に液体窒素中に少なくとも10分間だけ保持された。
最高の解凍後生存度に帰着するであろう段階を決定すべく、種々の方法段階が評価された。細胞は、凍結保護剤を使用し/使用せずに、浸透予備処理を行い/行わず、低温処理を行い/行わず、且つ、ガラス化を行い/行わずに、凍結保存された。
以下のTaxus(イチイ)種細胞系が、凍結保存後の細胞生存度及び再増殖を決定すべく評価された:KS1A;KEIR;647;1224;12-6;12-14;および12-20。
6〜7日経過したイチイ細胞系KS1Aの細胞懸濁が凍結保存され且つ解凍された。細胞は、増殖培地内の3%のマンニトールにより3日間だけ予備増殖されると共に、凍結保護剤としては40/30wt.%のエチレングリコール/ソルビトールが使用された。凍結および解凍を行う前後に、増殖倍加時間および生産物形成が評価された。生産物収量は、懸濁液内の増殖の5日後に観察された。細胞内の核DNA内容物を流動細胞計測法により観察し、凍結保存前では約22.7pg/核、かつ、凍結保存後では22.9pg/核であることが見出された。凍結保存は、生産物形成に影響しなかった。
イチイ種細胞系が凍結保存され、次に解凍されると共に解凍後の浸透調節が行われた。液体培養内で細胞の懸濁が確立された後に、増殖および生産物形成が測定された。増殖は、細胞懸濁が増殖培地内で確立された後の平均倍加時間を日数で反映するものである。生産物形成は、懸濁液内で増殖が14日間行われた後に測定された。結果は、表19に列挙されている。
細胞系は、単一のTaxus chinensis var.mairerツリーから形成された。これらの形成された細胞系の内のひとつが培養され、1年間だけ凍結保存され、かつ、解凍された。遺伝子分析は、初代の樹木からの細胞および凍結保存された細胞に関して行われ、凍結保存が細胞の遺伝子安定性に影響を与えたか否かに関して測定された。各細胞系から僅か10μgの総計DNAが、制限エンドヌクレアの消化により4倍に処理されると共に、アガロースゲル電気泳動により寸法分画された。寸法分画されたDNAはニトロセルロースの固体支持体上に移動されると共に、放射ラベル核酸プローブ即ちJeffreyの33.6ミニサテライトプローブにハイブリッド形成された。この高可変領域プローブは、図7のレーン1〜4において、4本の異なる樹木のDNAからの異なる帯域パターンを示している。これと対照的に、初代分離物(レーンA)、1年間だけ培養された細胞(レーンB)、及び、1年間だけ凍結保存された細胞(レーンC)は、同じ樹木から1年後に分離された細胞(レーンDおよびE)と同一であった。この分析によっては、凍結保存により一切の変異は検出できなかった。
凍結保存期間の長さが遺伝子の安定性に何らかの影響を有するか否かを決定する為に、イチイ細胞系1224を1時間乃至6ヶ月だけ凍結し、それらの遺伝子的安定性を分析した。これらの凍結保存された細胞から解凍されると共に再回復された生存培養増殖からDNAが抽出された。ゲノムを含む核酸リボソームコーディングおよび非コーディングDNAの3.1Kb多形領域が、重合酵素連鎖反応により増幅されると共にエンドヌクレアDpnIIにより消化された。消化されたDNAはゲル電気泳動を用いてサイズ分画されると共に、臭化エチジウムにより着色された後で視認化された。この分析の結果は図8に示されている。初代細胞系および凍結保存されなかった細胞系がレーンCおよびDに分析されている。関連の無い樹木から形成された関連の無い2つの細胞系統は、異なる消化パターンを示した。これと対照的に、1年間(レーンE)、1日(レーンF)、1週間(レーンG)、1ヶ月(レーンH)もしくは6ヶ月(レーンIおよびJ)だけ凍結保存された細胞にも、何らの遺伝子変異が検出されなかった。これらの凍結保存されたおよび凍結保存されなかった細胞の帯域パターンは、全て同一であった(レーンC乃至J)。
トマト細胞系の好首尾な凍結保存の為に、ローディングおよびガラス化溶液が段階的に漸進的に付加され、浸透の衝撃を減じた。ローディングおよびガラス化溶液は、30%(w/v)グリセロール、15%(w/v)エチレングリコール、および、15%(w/v)ジメチルスルホキシドを含んでいた。漸進的な付加を行わない場合、解凍後回復期間の後に細胞は急激に増幅しなかった。解凍後の生存度および回復再増殖の影響が検査され、その結果が表20に示されている。
凍結用小瓶内の細胞バイオマスが、40℃〜60℃に設定された水浴内で20秒〜45秒だけ急速加温された。この段階の直後、凍結用小瓶内で液状化された細胞バイオマスが、1〜2mMの濃度の浸透剤(スクロース、ソルビトール、もしくはマンニトール)、および、2μM〜20μMの濃度のエチレン阻害剤を含む液状栄養培地を含む滅菌遠心器に移された。内容物は穏やかに混合されると共に、シェーカ(120rpmの速度設定)上で室温にて30分だけインキュベートされた。これに続き、遠心が行われ、ペレットの細胞を吸収転移紙上に載置された二層の滅菌濾紙に移(して細胞もしくは細胞バイオマスからの過剰水分の除去を促進)した。細胞もしくは細胞バイオマスは約2分間だけインキュベートされた。インキュベートの後、細胞が残った上側の濾紙を、0.8M〜0.1Mの低濃度のスクロースを浸透剤として含む固体栄養培地に順次移動(し、細胞の浸透調節を実施)した。各段階において、濾紙上の細胞は1/2〜1時間だけインキュベートされ、最終的に、付加的な浸透剤の存在しない通常の固体栄養培地に移動された。この段階は、24時間の間に2回反復された。次に、細胞バイオマスは暗所にて25℃で、週ごとに移動を行って2〜3週間に亙りインキュベートされた。新たな細胞バイオマスの増殖が増大したとき、カルス細胞は濾紙から除去され、通常の固体栄養培地上に直接的に移動された。十分な増殖が生じた後、形成されたカルスから液体培地内での細胞懸濁が開始された。細胞の生存度の観察は解凍後の様々な時点で行われ、最も重要な観察は概略的に記録された。濾紙上の細胞は、浸透剤が存在しない通常の固体培地に移動された。細胞増殖回復速度は、暗所における25℃での濾紙上の全てのインキュベートに関し最初の3週間の間に観察された。
Claims (92)
- a)凍結保存剤および安定剤により植物細胞を予備処理する段階と;
b)予備処理された植物細胞を低温に順化する段階と;
c)植物細胞にローディング剤をローディングする段階と;
d)ガラス化溶液により植物細胞をガラス化する段階と;
e)ガラス化された植物細胞を凍結保存温度で凍結する段階と;
を備えて成る、植物細胞の凍結保存方法。 - a)凍結保存剤および安定剤により植物細胞を予備処理する段階と;
b)植物細胞をガラス化する段階と;
c)ガラス化された植物細胞を凍結保存温度で凍結する段階と;
を備えて成る、植物細胞の凍結保存方法。 - a)植物細胞を凍結乾燥する段階と;
b)凍結乾燥された植物細胞をガラス化溶液中でガラス化する段階と;
c)ガラス化された植物細胞を凍結保存温度で凍結する段階と;
を備えて成る、植物細胞の凍結保存方法。 - a)浸透剤およびエチレン阻害剤で植物細胞を予備処理する段階と;
b)植物細胞に凍結保護剤をローディングする段階と;
c)植物細胞を凍結保存溶液でガラス化する段階と;
d)植物細胞を凍結保存温度で凍結する段階と;
を備えて成る、植物細胞の凍結保存方法。 - a)浸透剤および約5mM以上の2価陽イオンにより植物細胞を予備処理する段階と;
b)植物細胞に凍結保護剤をローディングする段階と;
c)植物細胞を凍結保護溶液でガラス化する段階と;
d)ガラス化された植物細胞を凍結保存温度で凍結する段階と;
を備えて成る、植物細胞の凍結保存方法。 - a)植物細胞を熱ショックで予備処理する段階と;
b)順化された植物細胞をガラス化溶液でガラス化する段階と;
c)インキュベートされた植物細胞を凍結保存温度で凍結する段階と;
を備えて成る、植物細胞の凍結保存方法。 - 植物細胞は、裸子植物もしくは被子植物である、請求項1乃至6に記載の方法。
- 裸子植物は、モミ属(Abies)、イトスギ属(Cypressus)、イチョウ属(Ginkgo)、ビャクシン属(Juniperus)、トウヒ属(Picea)、マツ属(Pinus)、トガサワラ(ベイマツ)属(Pseudotsuga)、セコイア属(Sequoia)、イチイ属(Taxus)、ツガ属(Tsuga)もしくはザミア属(Zamia)の種である、請求項7記載の方法。
- イチイ(Taxus)種は、T.baccata(イチイ科ヨーロッパイチイ),T.brevifolia,T.canadensis,T.chinensis,T.cuspidata,T.floridana,T.globosa,T.media,T.nuciferaもしくはT.wallichianaである、請求項8記載の方法。
- 被子植物は単子葉植物細胞もしくは双子葉植物細胞である、請求項7記載の方法。
- 単子葉植物細胞は、からす麦属(Avena)、ココヤシ属(Cocos)、ヤマノイモ属(Dioscorea)、オオムギ属(Hordeum)、バショウ属(Musa)、イネ属(Oryza)、メダケ属(Saccharum)、モロコシ属(Sorghum)、コムギ属(Triticum)およびトウモロコシ属(Zea)である、請求項10記載の方法。
- 双子葉植物細胞は、Achyrocline属、Atropa属、アブラナ属(Brassica)、メギ属(Berberis)、トウガラシ属(Capsicum)、Catharanthus属、conospermum属、チョウセンアサガオ属(Datura)、ニンジン属(Daucus)、ジギタリス属(Digitalis)、Echinacea属・Eschscholtzia属、ダイズ属(Glycine)、ワタ属(Gossypium)、ヒヨス属(Hyoscyamus)、トマト属(Lycopersicum)、リンゴ属(Malus)、ムラサキウマゴヤシ属(Medicago)、タバコ属(Nicotiana)、panax属、エンドウ属(Pisum)、Rauvolfia属、Ruta属、ナス属(Solanunt)およびTrichosanthes属の種から成る群から選択される、請求項10記載の方法。
- 植物細胞は、新生の針葉、樹皮、葉、幹、根、地下茎、カルス細胞、原形質体、細胞懸濁、分裂組織、種子もしくは胚から得られる、請求項1乃至6記載の方法。
- 予備処理段階は、前記ローディング剤および前記安定剤を含む培地内で前記植物細胞を略々室温で約1時間乃至7日間に亙り培養する段階を含む、請求項1記載の方法。
- ローディング剤は、糖類、アミノ酸もしくはそれらの組合せである、請求項1記載の方法。
- 糖類は、フルクトース、グルコース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、および、それらの誘導体から成る群から選択されたひとつ以上の糖類である、請求項15記載の方法。
- ローディング剤は、約0.05M乃至約0.8M、もしくは、約1wt.%乃至約10wt.%の濃度の水溶液として使用される、請求項1記載の方法。
- 安定剤は、抗酸化剤、酸素ラジカル捕捉剤、2価陽イオン、エチレン阻害剤、もしくは、それらの組合せである、請求項2記載の方法。
- 安定剤は、還元形グルタチオン、テトラメチル尿素、テトラメチルチオ尿素、ジメチルホルムアミド、メルカプトプロピオニルグリシン、メルカプトエチルアミン、セレノメチオニン、チオ尿素、ジメルカプトプロパノール、アスコルビン酸、システイン、ナトリウムジエチルジチオカルバミド、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸銀、没食子酸プロピル、スペルミン、スペルミジン、および、それらの組合せおよび誘導体から成る群から選択される、請求項1記載の方法。
- 安定剤は、約1μM乃至約1mMの濃度の水溶液として使用される、請求項1記載の方法。
- 低温は約1℃乃至約15℃の間である、請求項1記載の方法。
- ローディング段階は、重量で約0.5%乃至約10%のガラス化剤を含むガラス化溶液内で前記植物細胞をインキュベートする段階を含んで成る、請求項1、4および5に記載の方法。
- 凍結保護剤は、DMSO、プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ブタンジオール、ホルムアミド、プロパンジオール、ソルビトール、マンニトール、およびそれらの混合物、から成る群から選択される、請求項1、2、4および5に記載の方法。
- 凍結保護もしくはガラス化溶液は、DMSO、プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ブタンジオール、ホルムアミド、プロパンジオール、ソルビトール、マンニトール、およびそれらの混合物、から成る群から選択された物質を含む、請求項1乃至6に記載の方法。
- 凍結保護もしくはガラス化溶液は、重量で約20%乃至約60%の凍結保存剤を含む、請求項1乃至6記載の方法。
- 凍結保護もしくはガラス化溶液は植物細胞に加えられ、溶液に対する割合が約250mg/ml以下のバイオマスを形成する、請求項1および3乃至6に記載の方法。
- ローディング剤およびガラス化剤は同一である、請求項1記載の方法。
- 浸透剤および凍結保護剤は同一である、請求項5記載の方法。
- ローディングおよびガラス化は実質的に同時に行われる、請求項1、4および5に記載の方法。
- ローディングもしくはガラス化は、単一段階もしくは複数段階の処理として行われる、請求項1乃至6記載の方法。
- 凍結乾燥段階は、植物細胞から重量で約40%乃至約60%の水分を除去する、請求項3記載の方法。
- 凍結乾燥およびガラス化は、植物細胞から重量で約75%乃至約95%の水分を除去する、請求項3記載の方法。
- 植物細胞には、ガラス化に先立ちローディング剤がロードされる、請求項2、3、4および6に記載の方法。
- 植物細胞は、該植物細胞を、DMSO、プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ソルビトール、マンニトール、およびそれらの混合物、から成る群から選択されるガラス化剤を含む約0℃乃至約4℃のガラス化溶液によりインキュベートすることによりガラス化される、請求項1乃至6記載の方法。
- 凍結段階は液体窒素中で急冷する段階から成る、請求項1乃至6記載の方法。
- 凍結段階に先立ち、凍結保護剤を含む培地内で前記植物細胞を培養する段階を更に備えて成る、請求項3乃至6記載の方法。
- 凍結保護剤は、フルクトース、グルコース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、および、それらの混合物並びに誘導体から成る群から選択される、請求項36記載の方法。
- 培地は安定剤を更に含んでなる、請求項36記載の方法。
- 安定剤は、酸化防止剤、酸素ラジカル捕捉剤、エチレン阻害剤、2価陽イオン、もしくは、それらの組合せである、請求項38記載の方法。
- 凍結保存温度は約-70℃以下である、請求項1乃至6記載の方法。
- 前記凍結保存温度で凍結保存された細胞を、1ヶ月以上の期間に亙り貯蔵する段階を更に備えて成る、請求項1乃至6記載の方法。
- 期間は1年以上である、請求項40記載の方法。
- 請求項1乃至6の方法により凍結保存された生存植物細胞。
- 凍結保存によっても前記細胞は遺伝子的もしくは表現型的にそれほど変化せしめられない、請求項42記載の生存植物細胞。
- イチイ(Taxus)種である、請求項42記載の生存植物細胞。
- 前記イチイ細胞はジテルペンを発出する、請求項45記載の生存植物細胞。
- ジテルペンはタキソールである、請求項46記載の生存植物細胞。
- 前記ジテルペンの発出は、凍結保存によりそれほど変化せしめられない、請求項46記載の生存植物細胞。
- 請求項1乃至6記載の方法により凍結保存された生存植物細胞の生殖細胞保存物。
- a)ガラス化剤および安定剤を含む培地内で植物細胞を低温で第1期間に亙りインキュベートする段階と;
b)上記ガラス化剤の濃度が高められた培地内で植物細胞を第2期間に亙りインキュベートする段階と;
c)凍結保存温度で植物細胞を凍結する段階と;
を備えて成る、植物細胞の凍結保存方法。 - 第1期間は約1時間乃至約7日間である、請求項50記載の方法。
- 第2期間は約30分乃至約2時間である、請求項50記載の方法。
- 前記ガラス化剤の高められた濃度は、重量で約20%乃至約60%である、請求項50記載の方法。
- 請求項50の方法により凍結保存された生存植物細胞。
- a)請求項1乃至6および50の方法に従って、植物細胞を凍結保存する段階と;
b)凍結保存された植物細胞を凍結以上の温度に解凍する段階と;
c)解凍された植物細胞を、凍結保護剤および安定剤を含む増殖培地内でインキュベートする段階と;
d)凍結保護剤を除去する段階と;
e)生存植物細胞を回復する段階と;
を備えて成る、凍結保存された植物細胞の回復方法。 - a)凍結保存された植物細胞を凍結以上の温度に解凍する段階と;
b)解凍された植物細胞を、エチレン阻害剤を含む増殖培地内でインキュベートする段階と;
c)生存植物細胞を回復する段階と;
を備えて成る、凍結保存された植物細胞を回復する方法。 - a)凍結保存された植物細胞を凍結以上の温度に解凍する段階と;
b)解凍された植物細胞を、凍結保護剤および安定剤を含む増殖培地内でインキュベートする段階と;
c)凍結保護剤を除去する段階と;
d)生存植物細胞を回復する段階と;
を備えて成る、凍結保存された植物細胞の回復方法。 - a)凍結保存された植物細胞を凍結以上の温度に解凍する段階と;
b)解凍された植物細胞を、2価陽イオンを含む増殖培地内でインキュベートする段階と;
c)生存植物細胞を回復する段階と;
を備えて成る、凍結保存された植物細胞を回復する方法。 - a)凍結保存された植物細胞を凍結以上の温度に解凍する段階と;
b)解凍された植物細胞を懸濁液内でインキュベートする段階と;
c)懸濁液内で生存植物細胞を回復する段階と;
を備えて成る、凍結保存された植物細胞を懸濁液内で回復する方法。 - 凍結保存された植物細胞は略々室温で解凍される、請求項55乃至59に記載の方法。
- 凍結保護剤は、糖類、アミノ酸もしくはそれらの混合物である、請求項55および57に記載の方法。
- 凍結保護剤は、ソルビトール、マンニトール、スクロース、トレハロース、プロリン、および、それらの混合物から成る群から選択される、請求項55および57に記載の方法。
- 安定剤は、抗酸化剤、酸素ラジカル捕捉剤、エチレン阻害剤、2価陽イオン、もしくは、それらの組合せである、請求項57記載の方法。
- 安定剤は、還元形グルタチオン、テトラメチル尿素、テトラメチルチオ尿素、ジメチルホルムアミド、メルカプトプロピオニルグリシン、メルカプトエチルアミン、セレノメチオニン、チオ尿素、ジメルカプトプロパノール、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸銀、アスコルビン酸、システイン、ナトリウムジエチルジチオカルバミド、スペルミン、スペルミジン、没食子酸プロピル、および、それらの組合せおよび誘導体から成る群から選択される、請求項57記載の方法。
- インキュベート段階および回復段階は液状培地内で行われる、請求項55乃至59記載の方法。
- 凍結保護剤は、前記液状培地により段階的にもしくは連続的希釈により除去される、請求項55乃至59記載の方法。
- インキュベートは半固体培地上で行われる、請求項55乃至59記載の方法。
- 除去段階は、浸透的に調節された細胞を、低下していく濃度で前記凍結保護剤を含む増殖培地により複数回だけ洗浄する段階を備えて成る、請求項55乃至59記載の方法。
- 回復された生存植物細胞はジテルペンを発出すると共に、ジテルペン発出は凍結保存によりそれほど変化せしめられない、請求項55乃至59記載の方法。
- 回復された植物細胞の約50%以上が生存する、請求項55乃至59記載の方法。
- 回復された植物細胞の約70%以上が生存する、請求項55乃至59記載の方法。
- 回復された植物細胞の約80%以上が生存する、請求項55乃至59記載の方法。
- 解凍された植物細胞は、約0℃乃至約10℃にて増殖培地内でインキュベートされる、請求項55乃至59記載の方法。
- 増殖培地は凍結保護剤から成る、請求項73記載の方法。
- 凍結保護剤は所定期間後に除去されると共に、植物細胞のインキュベートは増殖培地内および懸架液内で行われる、請求項55乃至59記載の方法。
- 増殖培地は安定剤を含む、請求項55乃至59記載の方法。
- 安定剤は、抗酸化剤、酸素ラジカル捕捉剤、エチレン阻害剤、2価陽イオン、もしくは、それらの組合せである、請求項76記載の方法。
- エチレン阻害剤は、エチレン生合成阻害剤もしくはエチレン作用阻害剤である、請求項77記載の方法。
- エチレン作用阻害剤は銀塩である、請求項78記載の方法。
- 銀塩は、チオ硫酸銀、硝酸銀、塩化銀、酢酸銀、リン酸銀、硫酸銀、亜硝酸銀から成る群から選択される、請求項79記載の方法。
- エチレン生合成阻害剤は、スペルミジン、スペルミン、カテコール、n-プロピル没食予酸、ヒドロキノン、鉄酸、アラール(alar)、フェニルエチルアミン、サリチルアルコール、インドメタシンから成る群から選択される、請求項78記載の方法。
- 2価陽イオンは、カルシウム、マグネシウムもしくはマンガンである、請求項79記載の方法。
- 植物細胞は半固体培地に移動される、請求項55乃至59記載の方法。
- インキュベートおよび回復は液状培地内で行われる、請求項55乃至59記載の方法。
- インキュベートは半固体培地上で行われる、請求項55乃至59記載の方法。
- 回復された生存植物細胞は活発に再増殖する、請求項55乃至59記載の方法。
- ローディングもしくはガラス化は、単一段階もしくは複数段階にて行われる、請求項55乃至59記載の方法。
- 複数段階は、1分間隔で5回に亙り凍結保護剤を植物細胞に添加する段階から成る、請求項87記載の方法。
- 請求項55乃至59の方法により回復された生存植物細胞。
- 請求項89の生存植物細胞から繁殖された植物。
- イチイ(Taxus)種である、請求項90記載の植物。
- 請求項55乃至59の方法により回復された生存植物細胞の懸濁物。
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