KR100868602B1 - 인간 적혈구가 고농도 트리할로즈에 노출되었을 때발생하는 세포 용혈 현상을 최소화하는 방법 - Google Patents
인간 적혈구가 고농도 트리할로즈에 노출되었을 때발생하는 세포 용혈 현상을 최소화하는 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100868602B1 KR100868602B1 KR1020070021350A KR20070021350A KR100868602B1 KR 100868602 B1 KR100868602 B1 KR 100868602B1 KR 1020070021350 A KR1020070021350 A KR 1020070021350A KR 20070021350 A KR20070021350 A KR 20070021350A KR 100868602 B1 KR100868602 B1 KR 100868602B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- trihalose
- cell
- cells
- hemolysis
- concentration
- Prior art date
Links
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 38
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title abstract description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 22
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- GZIFEOYASATJEH-VHFRWLAGSA-N δ-tocopherol Chemical compound OC1=CC(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1 GZIFEOYASATJEH-VHFRWLAGSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N alpha-Lipoic acid Natural products OC(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 claims abstract description 12
- AGBQKNBQESQNJD-SSDOTTSWSA-N (R)-lipoic acid Chemical compound OC(=O)CCCC[C@@H]1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims abstract description 11
- GZIFEOYASATJEH-UHFFFAOYSA-N D-delta tocopherol Natural products OC1=CC(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1 GZIFEOYASATJEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 11
- YJPIGAIKUZMOQA-UHFFFAOYSA-N Melatonin Natural products COC1=CC=C2N(C(C)=O)C=C(CCN)C2=C1 YJPIGAIKUZMOQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 235000010389 delta-tocopherol Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 11
- DRLFMBDRBRZALE-UHFFFAOYSA-N melatonin Chemical compound COC1=CC=C2NC=C(CCNC(C)=O)C2=C1 DRLFMBDRBRZALE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229960003987 melatonin Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 239000002446 δ-tocopherol Substances 0.000 claims abstract description 11
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 1
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 claims 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 claims 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 claims 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 claims 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 claims 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 13
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 abstract description 10
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 abstract description 8
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 abstract description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract description 8
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 abstract description 8
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 abstract description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 abstract description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 abstract description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 abstract 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 8
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- -1 memelatonin Chemical compound 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0641—Erythrocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2523/00—Culture process characterised by temperature
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
본 발명은 세포를 동결 건조할 때 고농도의 트리할로즈(trehalose)를 세포에 처리하는 과정이 필수적인데 이 과정에서 발생하는 세포 손상을 최소화하는 방법에 관한 것이다. 특히 트리할로즈를 부과하는 여러 가지 방법 중에서 세포 외부를 고농도 트리할로즈 환경을 만들어 이차적으로 세포 내부를 고농도 트리할로즈로 만드는 방법에 관한 것이다. 기존의 방법은 세포막에 트리할로즈 버퍼(buffer)만 부과하는 방법이기 때문에 세포 손상이 심해 임상적으로 바로 사용하기에는 무리가 따르지만 본 방법을 사용하면 세포의 손상을 최소화하면서 안전하게 트리할로즈를 고농도로 부과할 수 있다.
세포 모델로는 인간의 적혈구 세포를 선택했으며 실험방법으로는 적혈구를 15시간 동안 37℃에서 배양하면서 여러 실험 조건에 따른 용혈 현상을 관찰하였다. 이 실험에서 고농도의 트리할로즈를 세포에 부과시 용혈의 감소에 도움을 주는 최종 세포 보호 프로토콜의 물질과 농도는 5 × 10-4M L-ascorbic acid, 5 × 10-5M α-lipoic acid, 5 × 10-5M melatonin, 3 × 10-4M N-acetyl-L-cysteine, 10-5M δ-tocopherol 그리고 5 × 10-5M insulin이었다. 본 실험에서는 이들 물질을 복합적으로 사용하여 임상적으로 필요로 하는 세포 내부 농도인 60mM이상의 트리할로즈를 부과하면서도 5% 이하의 용혈 결과를 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 세포를 동결 건조할 때 고농도의 트리할로즈를 세포에 부과하는 특수한 상황에서 세포의 생존에 도움을 줄 수 있는 새로운 방법이기에 이의 내용에 대해 특허를 신청한다.
고농도 트리할로즈, 항산화제, 적혈구 용혈
Description
도 1은 적혈구를 37℃ 800mM 트리할로즈 부과 조건에서 세포 내부 트리할로즈 농도변화를 3시간 간격으로 측정한 그래프이다.
도 2는 적혈구를 37℃ 800mM 트리할로즈 부과 조건에서 세포 용혈의 정도를 3시간 간격으로 측정한 그래프이다.
도 3은 적혈구를 37℃ 800mM 트리할로즈 부과 조건에서 세포 보호 프로토콜 각각의 상황에 따라 발생하는 용혈 정도를 15시간 동안 관찰한 그래프이다.
도 4는 적혈구를 37℃ 800mM 트리할로즈 부과 조건에서 최종 세포 보호 프로토콜 상황에서 세포 내부 트리할로즈 농도변화를 3시간 간격으로 측정한 그래프이다.
도면 약어의 설명
T3: 3시간, T6: 6시간, T9: 9시간, T12: 12시간, T15: 15시간
A: 적혈구를 37℃ 800mM 트리할로즈를 3시간 동안 부과한 상황(condition).
B: 적혈구를 37℃ 800mM 트리할로즈를 15시간 동안 부과한 상황.
C: 적혈구를 37℃에서 800mM 트리할로즈, 5 × 10-4M L-ascorbic acid를 15시간 동안 부과한 상황.
D: 적혈구를 37℃에서 800mM 트리할로즈, 5 × 10-5M α-lipoic acid를 15시간 동안 부과한 상황.
E: 적혈구를 37℃에서 800mM 트리할로즈, 5 × 10-5M melatonin을 15시간 동안 부과한 상황.
F: 적혈구를 37℃에서 800mM 트리할로즈, 3 × 10-4M N-acetyl-L-cysteine을 15시간 동안 부과한 상황.
G: 적혈구를 37℃에서 800mM 트리할로즈, 10-5M δ-tocopherol을 15시간 동안 부과한 상황.
H: 적혈구를 37℃에서 800mM 트리할로즈, 5 × 10-4M L-ascorbic acid, 5 × 10-5M α-lipoic acid, 5 × 10-5M melatonin, 3 × 10-4M N-acetyl-L-cysteine, 10-5M δ-tocopherol을 15시간 동안 부과한 상황.
I: 적혈구를 37℃에서 800mM 트리할로즈, 5 × 10-4M L-ascorbic acid, 5 × 10-5M α-lipoic acid, 5 × 10-5M melatonin, 3 × 10-4M N-acetyl-L-cysteine, 10-5M δ-tocopherol 그리고 5 × 10-5M insulin을 15시간 동안 부과한 상황.
본 발명은 세포를 동결 건조시켜 장기간 보관하고자 하는 방법에 관한 분야이다. 세포를 건조하면 물이 없어지게 되는데 이때 물을 대신해서 세포막을 안정화시키는 물질이 반드시 필요하다. 이물질은 세포에서 물이 구조를 형성하던 수분(structural water)의 기능을 대신하고 또한 세포 내부의 여러 소기관의 막과 효소에 대한 구조적인 유지와 기능적 안정성을 유지하여야한다. 본 실험에서 선택한 트리할로즈는 이런 기능을 가진 가장 일반적인 물질이다. 이 물질은 미생물이나 일부 식물 등에서 발견된 것인데 진핵세포에서는 이 물질만으로는 세포를 장기간 보관할 수 없다. 여러 가지 이유가 있지만 진핵세포에서는 안전하게 트리할로즈를 부과시키기가 어렵기 때문이다. 트리할로즈 자체가 세포막을 통과하는 물질이 아니기 때문에 세포막에 인위적인 조작을 하여야 하기 때문이다. 현재까지 개발된 트리할로즈 부과 방법을 살펴보면 내포작용(endocytosis)에 의한 방법, dimethyl sulfoxide란 물질로 세포막의 투과성을 증가시키는 방법, 유전자 조작에 의해 세포막에 구멍을 내거나 트리할로즈 합성 효소를 만드는 방법, 실온에 고농도의 트리할로즈를 부과하여 세포막의 투과성을 증가시키는 방법 등이다.
각각의 방법은 그 장단점이 있는데 본 실험과 관련된 방법은 고농도의 트리할로즈를 세포에 부과하여 세포 내부의 트리할로즈 농도를 증가시키는 방법이다. 이 방법은 인위적으로 세포막을 조작하는 물질을 가하지 않는 장점이 있지만 고농 도의 트리할로즈를 세포막 외부에 부과하기 때문에 발생하는 세포막의 불안정으로 인해 세포손상이 증가한다는 단점이 있다. 적혈구 실험에서 24시간 배양하면 세포의 반 정도까지 용혈이 되어 임상적으로 사용하려면 일일이 구분해서 제거하여야 하며 용혈이 되지 않아도 건강한 세포로 여기기에는 무리가 있다. 그러서 이러한 방법에 있어 세포를 안정화시키는 방법이 필요하지만 현재까지 이러한 세포손상을 최소화하는 방법이 없어 이의 개발이 필요한 실정이다.
해결해야 하는 과제는 고농도의 트리할로즈를 부과할 때 임상적으로 사용가능한 정도까지 세포 손상을 줄일 수 있는가 하는 것이다. 임상적으로 사용하기 위해서는 다음 두 가지 조건을 만족하여야한다. 첫째는 세포 손상이 5% 전후가 되어야 한다. 이 이상의 손상은 임상적으로 손상된 세포를 하나하나 걸려내야만 하기 때문에 5% 이상의 손상이 없어야 한다. 두 번째는 세포 내부의 트리할로즈 농도는 60mM 이상이 되어야 한다. 즉 본 과제를 수행하기 위해 세포 보호 물질을 부과에도 세포내 농도는 60mM이상이 되도록 하여야 하고 이때 세포 손상도 5% 이하가 되도록 하여야 한다는 것이다.
고농도의 당을 부과할 때 항산화제와 인슐린의 복합 프로토콜이 도움이 됨을 본 연구소에서 이미 발견하여 일부의 내용을 특허로 신청하였다. 본 실험에서도 이런 복합 프로토콜이 적혈구의 용혈을 감소시킬 것이라고 가정하고 실험을 하였다.왜냐하면, 트리할로즈도 이당류로 당의 일반적 특성이 있다면 효과는 비슷할 것이기 때문이다. 이런 이유로 본 실험에서도 항산화제와 인슐린의 조합으로 세포의 용 혈을 최소화하는 프로토콜을 찾고자 하였다.
세포에 고농도의 트리할로즈를 부과하는 모델을 만드는 것을 어렵지 않다. 배양 배지에 세포를 넣고 고농도의 트리할로즈만 넣어주면 된다. 하지만, 용혈을 감소시키는 물질의 효과와 농도를 결정하는 것은 쉽지 않다. 여러 종류의 항산화제를 하나씩 넣고 결과를 하나하나 관찰해야 한다. 그리고 이들 항산화제의 농도를 조합해서도 실험해 보아야 한다. 시간낭비를 위해 가능성 있는 농도를 잘 선정해야하고 항산화제의 조합도 상당히 많기 때문에 발견이 될 때까지 이것저것 넣는 반복적인 작업이 필요하다.
고농도의 트리할로즈를 부과하는 세포모델로는 인간의 적혈구 모델을 사용한다. 항산화제 조합은 기존의 용혈 실험에서 가장 효과가 좋은 δ-tocopherol, α-lipoic acid, melatonin, N-acetyl-L-cysteine, L-ascorbic acid을 선택한다. 항산화제를 효과를 상승시키는 물질로는 insulin을 사용한다. buffer의 구성은 다음과 같다. PBS (Phosphate-buffered saline, 300mOsm, pH 7.2)는 154mM NaCl, 1.06mM KH2PO4, 5.6mM Na2HPO4를 포함한다. ADSOL (462mOsm)은 111mM glucose, 2mM adenine, 154mM NaCl, 41mM mannitol을 포함한다. Buffer PBS(T)는 PBS에 첨가된 트리할로즈양을 표시한 것이다. Buffer ADSOL(T)은 ADSOL에 K-phosphate가 첨가된 트리할로즈양으로 표시한 것이다. ADSOL(T) (800mM)은 800mM endotoxin-free trehalose (Hayashibara biochemical lab. Japan), 100mOsm ADSOL를 포함한다. δ-tocopherol 은 1%(v/v) ethanol, α-lipoic acid, melatonin은 0.5%(v/v) ethanol을 포함한 수용액으로 준비한다. 이 ethanol은 적혈구의 용혈에 다른 실험에서 통계학적으로 유의성 있는 차이를 주지 않았다. 다음은 실험의 순서와 측정방법 그리고 결과이다.
1. 실험의 순서
① 실험 당일 건강한 지원자의 동의하에 전혈(whole blood)을 채취한다.
② 전혈을 EDTA(ethylenediaminetetraacetate)가 들어있는 튜브에 모은다.
③ 전혈을 원심분리기(329g, 14분)를 이용하여 각각의 혈구로 분리한다.
이때 아래쪽 기저부 쪽에서 적혈구를 모으고 위쪽의 buffy coat와 혈장성분은 폐기한다.
④ 이후 PBS로 세척하고 원심분리 (515g, 10분)를 세 차례 한다. 각각의 원심분리기를 사용할 때마다 위와 같은 요령으로 적혈구 세포를 모은다. 세척한 적혈구는 hematocrit 30%로 만들어 4℃에서 보관하고 이 농도로 당일 실험한다. 실험 직전에 ADSOL(T) (800mM)로 세척하고 원심분리 (515g, 10분)를 세 차례 한다. 각각 원심분리기를 사용할 때마다 같은 요령으로 적혈구 세포를 모으고 세척한 적혈구는 hematocrit 30%로 만든다.
⑤ 이후 세포 현탁액의 일부를 삼각플라스크 (Erlenmeyer flask)에 넣고 실험을 하면서 시간 측정을 시작한다. 이후 실험에서 요구하는 조건대로 실험을 하고 실험에서의 모든 농도 표시는 세포 현탁액에 대한 최종농도로 표시한다. buffer는 ADSOL(T) (800mM)을 사용하고 15시간 동안 37℃로 각각 유지하면서 배양하고 실험에서 요구하는 농도의 항산화제와 인슐린을 프로토콜대로 넣어준다.
⑥ 모든 배양은 10 ㎕ penicillin-streptomycin/㎖ 을 사용하여 배양 중에 균이 증식하는 것을 억제한다. penicillin-streptomycin용액은 300㎎ penicillin G와 500mg streptomycin이 10㎖ buffer에 들어있다.
2. 트리할로즈 농도 측정방법
배양 시간이 끝난 적혈구는 900mOsm PBS로 세 차례 세척하고 원심분리 (1960g, 1분)로 적혈구만 모은다. 트리할로즈가 부과된 적혈구 세포 (0.5㎖ 30% hematocrit)을 3분 동안 350g로 원심분리한 후 80% methanol 4㎖과 섞는다. 이 혼합물을 45분간 85℃에서 배양하고 10분 동안 200g로 원심분리한다. 상청액(supernatant)을 모아서 진공 원심분리기(labconco, USA)를 통해 증발시킨다. 말린 찌꺼기를 3㎖ nano pure water에 녹인다. 이 3㎖ 샘플을 6㎖ anthrone reagent [2% anthrone in concentrated sulfuric acid]와 섞는다. 이후 3분간 100℃로 가열한 후 냉각한다. 실온에서 분광광도기(spectrophotometer ; Hitachi U2000, Japan)를 이용하여 620㎚의 파장에서 standard curve와 비교한다. 이 반응은 모든 당을 검출하므로 트리할로즈를 부과하지 않은 혈구의 값을 항상 측정하고 이 차이로 농도를 결정하고 자료는 세 차례 따로 실험을 하고 그 평균값을 최종 값으로 하였다.
3. 적혈구 용혈 정도 결정
부과된 적혈구는 일단 적혈구 수, 세포부피, 평균 적혈구 혈색소, 전체 헤모글로빈을 Beckman Coulter Count(Act Diff, USA)를 이용하여 측정한다. 전체 헤모글로빈은 현탁액의 헤모글로빈으로 구하고 상청액(supernatant)의 헤모글로빈은 원심분리 (1960g, 1분)에 의해 세포를 펠릿팅(pelleting)한 후 측정한다. 헤모글로빈 은 Drabkin's 시약을 이용하여 헤모글로빈을 cyanmethemoglobin으로 전환해 결정한다. cyanmethemoglobin의 흡광도 (absorbance) 측정은 540㎚이다. 용혈의 정도는 다음 식에 의해 구한다.
용혈 정도 % = 100 x (상청액의 OD540) / (전체 헤모글로빈의 OD540)
4. 통계처리
모든 시약은 특별한 언급이 없으면 모두 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)에서 구입한다. 자료는 systat program의 비모수적 윌콕슨 검정을 (n=5) 실시한다. 유의확률은(P value) 0.05내를 의미 있는 것으로 한다.
5. 결과
도 1은 37℃에서 15시간 동안 세포보호 프로토콜 없이 800mM 트리할로즈가 들어있는 버퍼에서 적혈구를 배양한 결과이다. 이 결과에서 안정적으로 세포 내부의 트리할로즈 농도가 60mM이상이 되려면 15시간(69±4.1mM)을 배양해야 하는 것으로 나온다.
도 2는 37℃에서 세포보호 프로토콜 없이 800mM 트리할로즈가 들어있는 버퍼에서 배양할 때 발생하는 적혈구의 용혈 정도이다. 15시간(25±3.1%)정도 배양하면 25% 정도 용혈이 일어나 임상적으로 이용하려면 죽은 세포를 분리해야만 사용 가능하다는 것을 알 수 있다. 5% 정도의 용혈은 3시간(5.2±0.7%)이 지나면 발생하는 것을 알 수 있다. 그러므로 임상적으로 3시간째의 용혈과 통계학적으로 차이가 없는 수준까지 세포보호 프로토콜이 내려 주어야 함을 알 수 있다.
도 3은 각각의 조건에 대한 용혈이 일어나는 정도를 표시한 것이다. 통계학적으로 A(5.2±0.69%)와 I(5.0±0.59%)가 통계학적으로 의미가 없고 다른 경우는 모두 의미 있는 차이가 있는 것으로 나타났다. H(6.6±1.17%)의 경우는 δ-tocopherol, α-lipoic acid, melatonin, N-acetyl-L-cysteine, L-ascorbic acid로 구성되어있는 세포보호 프로토콜로 5%대에 상당히 근접하는 것을 알 수 있다. I는 10-5M δ-tocopherol, 5 x 10-5M α-lipoic acid, 5 x 10-5M melatonin, 5 x 10-4M L-ascorbic acid, 3 x 10-4M N-acetyl-L-cysteine, 그리고 5 x 10-5M insulin이 들어있는 경우로 거의 5% 수준으로 떨어지는 것을 알 수 있다. 이것은 세포 보호 프로토콜로 δ-tocopherol, α-lipoic acid, melatonin, N-acetyl-L-cysteine, L-ascorbic acid, insulin을 사용하는 것은 매우 효과적이고 단일 물질로 세포를 보호하는 것보다 복합물질이 더 효과적인 것을 보여준다.
도 4는 37℃에서 최종 세포보호 프로토콜(δ-tocopherol, α-lipoic acid, memelatonin, N-acetyl-L-cysteine, L-ascorbic acid, insulin)을 사용하여 800mM 트리할로즈가 들어있는 버퍼에서 적혈구를 배양한 결과이다. 15시간(68±3.1mM) 배양하면 60mM이상이 되는 것을 볼 수 있다. 도 1의 15시간(69±4.1mM)과 비교하면 약간 적은 양이지만 통계적인 차이는 없음을 알 수 있다. 그러므로 배양은 15시간까지만 배양하면 세포보호 프로토콜의 유무에 관련 없이 임상적으로 필요로 하는 트리할로즈 양에 도달할 수 있다는 것을 알 수 있다.
1. 진핵세포를 동결건조하고자 할 때 고농도의 트리할로즈를 세포에 부과하는 방법으로도 장기간 보관할 수 있다는 하나의 가능성을 제시한다.
2. 본 실험결과를 진핵세포를 동결건조할 때 행할 수 있는 프로토콜의 하나로 제시할 수 있다.
3. 진핵세포의 동결건조는 하나의 특정물질만을 사용하는 것이 아니라 여러 가지 물질을 복합적으로 사용하는 방법이 용이함을 알다.
Claims (3)
- 800mM의 트리할로즈를 세포에 부과할 때 적혈구 세포의 용혈을 감소시키기 위해 L-아스코르브산(L-ascorbic acid), α-리포산(α-lipoic acid), 멜라토닌(melatonin), N-acetyl-L-cysteine, δ-토코페롤(δ-tocopherol) 그리고 인슐린(insulin)을 복합적으로 사용하여 적혈구와 함께 배양하는 방법.
- 1항에 있어 상기 아스코르브산의 농도는 5 × 10-4M, 리포산의 농도는 5 × 10-5M, 멜라토닌의 농도는 5 × 10-5M, N-acetyl-L-cysteine의 농도는 3 × 10-4M, 토코페롤의 농도는 10-5M 그리고 인슐린의 농도는 5 × 10-5M을 특징으로 하는 방법.
- 1항에 있어 세포 배양온도 37℃를 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020070021350A KR100868602B1 (ko) | 2007-03-05 | 2007-03-05 | 인간 적혈구가 고농도 트리할로즈에 노출되었을 때발생하는 세포 용혈 현상을 최소화하는 방법 |
| PCT/KR2008/001119 WO2008108549A1 (en) | 2007-03-05 | 2008-02-27 | Method on long-term structural preservation of hemocyte utilizing cellular lyophilization technique |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020070021350A KR100868602B1 (ko) | 2007-03-05 | 2007-03-05 | 인간 적혈구가 고농도 트리할로즈에 노출되었을 때발생하는 세포 용혈 현상을 최소화하는 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20080081421A KR20080081421A (ko) | 2008-09-10 |
| KR100868602B1 true KR100868602B1 (ko) | 2008-11-13 |
Family
ID=40021109
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020070021350A KR100868602B1 (ko) | 2007-03-05 | 2007-03-05 | 인간 적혈구가 고농도 트리할로즈에 노출되었을 때발생하는 세포 용혈 현상을 최소화하는 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100868602B1 (ko) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5242792A (en) | 1991-02-25 | 1993-09-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Method for the preservation of red blood cells by lyophilization using glycerol or inositol with disaccharides |
| US5965438A (en) | 1995-06-07 | 1999-10-12 | Phyton, Inc. | Cryopreservation of plant cells |
| US20040067480A1 (en) | 2002-10-04 | 2004-04-08 | Organ Recovery Systems, Inc. | Method for treatment of cellular materials with sugars prior to preservation |
| KR20040065208A (ko) * | 2001-08-09 | 2004-07-21 | 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 진핵 세포 및 세포 보존 방법 |
| US20070026377A1 (en) | 2000-02-10 | 2007-02-01 | The Regents Of The University Of California | Methods for preserving nucleated mammalian cells |
-
2007
- 2007-03-05 KR KR1020070021350A patent/KR100868602B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5242792A (en) | 1991-02-25 | 1993-09-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Method for the preservation of red blood cells by lyophilization using glycerol or inositol with disaccharides |
| US5965438A (en) | 1995-06-07 | 1999-10-12 | Phyton, Inc. | Cryopreservation of plant cells |
| US20070026377A1 (en) | 2000-02-10 | 2007-02-01 | The Regents Of The University Of California | Methods for preserving nucleated mammalian cells |
| KR20040065208A (ko) * | 2001-08-09 | 2004-07-21 | 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 진핵 세포 및 세포 보존 방법 |
| US20040067480A1 (en) | 2002-10-04 | 2004-04-08 | Organ Recovery Systems, Inc. | Method for treatment of cellular materials with sugars prior to preservation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20080081421A (ko) | 2008-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jensen et al. | Metabolism of separated leaf cells: I. Preparation of photosynthetically active cells from tobacco | |
| Vazquezdelara-Cisneros et al. | Induction of encystation of Entamoeba invadens by removal of glucose from the culture medium | |
| Van Rijn et al. | Biosynthesis of acid phosphatase of baker's yeast. Factors influencing its production by protoplasts and characterization of the secreted enzyme | |
| Fariss et al. | Extracellular calcium protects isolated rat hepatocytes from injury | |
| Johnson et al. | Detection and quantitation of octopine in normal plant tissue and in crown gall tumors | |
| CN106719600A (zh) | 一种脂肪组织冻存液 | |
| Miller et al. | Effect of carbon dioxide on pigment and membrane content in Synechococcus lividus | |
| Reznick et al. | Age related alterations in purified fructose-1, 6-diphosphate aldolase from the nematode Turbatrix aceti | |
| Fulton et al. | Metabolic studies on Toxoplasma gondii | |
| CN104777117A (zh) | 基于氧化石墨烯-纳米铂复合材料测定半胱氨酸的方法 | |
| Zhou et al. | Loading trehalose into red blood cells by electroporation and its application in freeze-drying | |
| WO2008108549A1 (en) | Method on long-term structural preservation of hemocyte utilizing cellular lyophilization technique | |
| CN104800891B (zh) | 一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基质生物材料、制备方法及其应用 | |
| Shostak et al. | Cultured rat mesothelial cells generate hydrogen peroxide: a new player in peritoneal defense? | |
| KR100868602B1 (ko) | 인간 적혈구가 고농도 트리할로즈에 노출되었을 때발생하는 세포 용혈 현상을 최소화하는 방법 | |
| WO2017100915A1 (en) | Extraction and process for active thylakoid membranes | |
| Frisk‐Holmberg | On the mechanism of chlorpromazine‐induced histamine release from rat mast cells | |
| Le et al. | Buthionine sulfoximine reduces the protective capacity of myocytes to withstand peroxide-derived free radical attack | |
| Zangen et al. | Thiamine deficiency in cardiac cells in culture | |
| Schmitt et al. | Mitochondrial biogenesis during differentiation of Artemia salina cysts | |
| CN111297741B (zh) | 一种松花粉发酵提取液的制备及应用 | |
| Hammerstedt | Use of high speed dialysis to prepare bovine sperm for metabolic studies | |
| Bartosz | Aging of the erythrocyte | |
| Zhou et al. | Loading trehalose into red blood cells by improved hypotonic method | |
| Weston et al. | Respiratory metabolism and thiabendazole susceptibility in developing eggs of Haemonchus contortus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20070305 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20080331 Patent event code: PE09021S01D |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20080916 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20081106 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20081106 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20111107 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20121010 Year of fee payment: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20121010 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20131017 Year of fee payment: 6 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20131017 Start annual number: 6 End annual number: 6 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee | ||
| PC1903 | Unpaid annual fee |
Termination category: Default of registration fee Termination date: 20151009 |