KR100763858B1 - 식물세포의동결보존방법및회복방법 - Google Patents
식물세포의동결보존방법및회복방법Info
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Abstract
본 발명은 식물 세포를 동결보존시키는 방법 및 장기간 또는 단기간 동결보존으로부터의 생존 가능한 식물 세포를 회수하는 방법에 관한 것이다. 동결보존하고자 하는 식물 세포를 배양액내에서 성장시키고, 동결보존제 및, 임의로 안정화제를 포함하는 용액으로 예비처리할 수 있다. 안정화제는 에틸렌 억제제, 산소 라디칼 스캐빈저 및 2가 양이온과 같은 막 안정화제인 것이 바람직하다. 또한, 세포는 배양물에 열 충격을 가해 살균할 수 있다. 예비처리된 세포는 감압으로 순양되고, DMSO, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 동결보존제가 장입된다. 장입된 세포는 예를들면, 고농도의 동결보존제를 갖는 용액을 포함하는 투화 용액으로 배양된다. 투화된 세포는 약 20% 미만의 수분 함량을 보유하고 있으며, 세포의 유전자형 또는 표현형 특성이 크게 변형되지 않은채 장기간동안 동결보존 온도에서 냉동될 수 있다. 또한, 식물 세포는 세포를 동결건조시켜 동결보존시킨 후, 투화 용액에 노출시킬 수 있다. 동결건조 및 투화 단계의 조합으로 식물 세포에서 약 80%∼약 95%의 수분을 제거한다. 장기간동안 세포를 성공적으로 동결보존시킬 수 있으며, 이는 생존가능하게 회수될 수 있다. 또한, 본 발명은 동결보존으로부터의 생존 가능한 식물 세포를 회수하는 방법에 관한 것이다. 세포는 약 실온으로 해동되고, 동결보존제 및 안정화제를 포함하는 배지내에서 배양한다. 동결보존제를 제거하고, 세포를 성공적으로 배양시키고, 액체 또는 반고형 성장 배지내에서 세포를 회수한다. 또한, 본 발명은 동결보존된 세포 및 장시간 또는 단시간동안의 동결보존으로부터 회수되는 생존 가능한 식물 세포에 관한 것이다.
Description
1. 발명의 기술분야
본 발명은 식물 세포의 동결보존 방법 및 동결보존된 식물세포의 회복 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 식물, 생존 가능한 식물 세포 및 동결보존으로부터 성공적으로 회복된 식물 세포 배양 조직에 관한 것이다.
2. 배경 설명
동결보존은 초저온에서 보관된 생물학적 물질의 대사 작용을 감소시키고 이어서 이를 정지시키는 것을 기초로 한다. 장시간동안 유전적 변화없이 식물 및 식물 세포를 극저온 보존시키고, 이어서 변형되지 않은 특성 및 생합성 활성을 갖는 보통의 식물 세포를 회복하는 것은 식물 번식, 생체의학적 조사 및 유전공학에 있어서 매우 중요한 의미를 함축한다. 액체 질소(-196℃)의 온도에서, 세포의 거의 모든 대사 활성은 중단되고, 세포는 이러한 정지된 상태로 유지되나, 장기간동안 생존가능하게 된다.
식물 세포를 동결보존하여 오염으로 인한 손실을 배제시키고, 연속 세포주에서의 유전적 변화를 최소화하고, 최종 세포주에서의 노화 및 형질전환을 회피시키기 위함이다. 바람직한 식물 특성의 보존에 위한 종래의 방법은 노지에서의 식물 콜로니의 형성을 포함하는데, 이는 많은 식물이 종자로부터 번식되지 않기 때문이다. 이러한 노지 식물의 저장은 많은 노동력의 투입과 토지를 요구하고 있으며, 기후, 질병 또는 기타의 위험으로 인한 손상의 위험성이 높게 된다. 노지 콜로니에 대한 대안으로서는 정상 또는 제한된 증식 조건하에서 식물 조직을 시험관내에서 배양하는 방법이 있다. 장기간동안의 저장의 경우, 통상적인 계대배양의 수행하지 않는 것이 바람직한데, 이는 조직 배양에 의한 변이, 오염, 노동 비용 및 인위적인 오조작의 위험이 있을 수 있기 때문이다.
식물을 비롯한 대부분의 생체 물질은 동결보호제 및 처리가 없으면 냉동 온도로의 냉동 및 이 온도로부터의 해동을 견딜 수 없다. 수많은 동결보존법은 저온 동결에 의한 악영향으로부터 세포를 보호할 수 있는 특성을 지닌다. 동결보존의 본질은 손상을 최소한으로 제어하는 방법으로 세포 탈수 및 사이토졸의 농축을 실시하여 예를 들면 액체 질소 내에서의 급냉중 사이토졸내의 얼음 결정을 배제시키거나 또는 최소화하도록 한다.
종래의 동결보존 절차에서, 세포 탈수는 현탁 배지를 동결에 의해 농축시키는 것을 수행하였다. 탈수에 의한 유해한 효과는 동결보존제의 존재에 의해 완화된다. 즉, 세포 및 기관과 같은 시료는 디메틸설폭시드(DMSO) 또는 에틸렌 글리콜과 같은 동결보존제를 포함하는 용액내에서 평형화된다. 현탁액은 이의 빙점보다 약간 낮은 온도에서 얼음 결정을 산포시켜 냉각시킨다. 또한, 이 현탁액을 약 -30℃∼약 -40℃의 중간 영하 이하의 온도로 최적의 속도로 재냉각시키고, 최종적으로 액체 질소내에서 급냉시켰다.
미생물, 접합체 및 접합체로부터 유도된 동물에 대해서는 통상의 동결 보존이 가능한 반면, 식물 세포의 동결보존은 통상의 것과는 크게 다르며, 흔히 식물의 각 종에 대한 여러가지 프로토콜이 필요하게 된다.
타수스 나무는 탁솔을 생성하며, 이는 퍼시픽 주목의 수피로부터 최초로 분리한 디테르페노이드 알칼로이드이다. 타수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia) 참조[문헌 : M.C. Wani et al., J. Am. Chem. Soc. 93:2325-27, 1971]. 실험에 의하면 이 화합물은 과도한 독성을 지니지 않으면서 포유동물 세포의 미소관의 중합을 효과적으로 억제하므로, 효과적인 항종양형성제가 된다. 임상적 추적에 의하면, 탁솔이 난치성 난소, 유방 및 기타 암에 대해 매우 효과적이라는 것을 확인하였다. 마찬가지로, 탁솔은 화학요법제에 있어서 획기적인 발견이 되는, 기본 메카니즘이 종래의 화학요법과 상이한 독특한 것이기 때문이다. 참고 문헌[L.A Rowinsky et al., J. Natl. Cancer Instit. 82:1247-59, 1990].
지금까지는 탁솔계에서의 가장 충격적인 변수는 공급원이다. 탁솔은 평균 수율이 낮기 때문에, 한명의 환자를 치료하기 위해서는 100년생 퍼시픽 주목이 3∼6그루가 소요된다. 참고 문헌[Witherup et al., 1990]. 치료 및 테스트에 필요한 함량의 탁솔의 제조는 수만 그루의 주목 파괴를 자초하게 된다. 주목 개체군은 벌목에 의해 거의 소멸되어 가고 있으며, 퍼시픽 주목의 수가 점차로 감소하고 있기 때문에 의학적 연구를 수행함에 있어서 탁솔에 대한 다른 형태의 공급원을 찾아야만 한다. 탁솔의 유용성 뿐 아니라, 식물 세포중에서 번식하거나 또는 수확될 수 있는 많은 기타 화합물은 타수스 및 기타 식물 세포를 배양하는데 있어서 그 중요성이 커지고 있다.
이들의 생합성 능력에 대한 식물 세포의 배양은 현재의 기법에 대해 특별한 문제를 부과하고 있다. 장기간에 걸쳐 식물 세포를 배양하는 것은 당초의 분리물에 존재해온 생합성 능력의 손실을 초래한다[참고 문헌 : Dhoot et al., Ann. Bot. 41:943-49, 1977; Barz et al., Ber. Dtsch. Bot. Ges. 94:1-26, 1981]. 표현형 변형화도 발생하며, 세포 배양을 추가로 복잡하게 한다. 식물 세포, 특히 타수스 세포를 냉동시키기 위한 프로토콜은 탁솔과 같은 유용한 식물성 알칼로이드의 제조에 대한 생합성 방법의 개발에 있어서 중요한 단계가 되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 현재의 방법과 대책에 따른 문제점 및 단점을 극복하며, 식물 세포의 동결보존 방법 및 생존가능한 식물 세포를 회복하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제1 실시태양은 식물 세포의 동결보존 방법에 관한 것이다. 겉씨 식물 또는 속씨 식물이 될 수 있는 식물 세포를 동결보호제와 안정화제로 예비처리하고, 이를 저온으로 순화시킨다. 예를 들면 2가 양이온과 같은 안정화제는 부분적으로는 세포성 막이 파열되는 것을 방지한다. 예비처리는 에틸렌 억제제, 예를 들면, 에틸렌 양이온 억제제 또는 에틸렌 생합성 억제제를 포함할 수 있다. 예비처리된 식물 세포를 투화시키고 동결보존 온도에서 냉동시킨다. 2가 양이온은 투화 단계 또는 장입 단계에 포함될 수 있다. 순화된 세포는 투화제와 동일할 수 있는 장입제와 함께 장입되며, 장입 세포는 투화 용액에 의해 투화된다. 투화된 식물 세포는 동결보존 온도, 예를 들면, 약 -70℃∼약 -200℃ 또는 미만에서 냉동된다.
본 발명의 제2 실시태양은 식물 세포를 동결보존시키는 방법에 관한 것이다. 동결보존시키고자 하는 식물 세포를 동결보호제, 에틸렌 억제제, 2가 양이온 또는 열 충격 단백질로 예비처리하고, 저온으로 순화시켰다. 에틸렌 억제제는 에틸렌 양이온 억제제 또는 에틸렌 생합성 억제제가 될 수 있다. 순화된 식물 세포는 투화되고 동결보존 온도에서 냉동된다.
본 발명의 제3 실시태양은 식물 세포를 동결보존시키는 방법에 관한 것이다. 동결보존시키고자 하는 식물 세포를 투화제 및 안정화제를 포함하는 배지내에서 저온에서 제1의 기간동안 배양시킨다. 배양된 식물 세포를 증가된 농도의 투화제를 포함하는 배지내에서 제2의 기간동안 더 배양시킨다. 고 농도의 투화제에서 투화된 식물 세포를 동결보존 온도에서 냉동시킨다.
본 발명의 제4 실시태양은 식물 세포를 동결보존시키는 방법에 관한 것이다. 동결보존시키고자 하는 식물 세포를 진공 증발에 의해 동결건조시키고, 투화 용액중에서 투화시킨다. 동결건조로 세포로부터 약 60%의 수분을 제거하며, 투화와 조합하면 약 95% 이하의 수분을 제거할 수 있다. 투화되고 동결건조된 식물 세포는 동결보존 온도에서, 예를 들면 세포를 질소 액체로 급냉시킴으로써 동결 및 보존된다.
본 발명의 제5 실시태양은 식물 세포를 동결보존시키는 방법에 관한 것이다. 동결보존시키고자 하는 식물 세포를 열 충격으로 예비처리한다. 열 충격은 단백질형질발현을 유도하며, 부분적으로 세포막이 파열되는 것을 안정화시킨다. 또한, 예비처리는 에틸렌 억제제, 예컨대, 에틸렌 작용 억제제 또는 에틸렌 생합성 억제제를 포함할 수 있다. 예비처리된 식물 세포를 투화시키고, 동결보존 온도에서 냉동시킨다. 2가 양이온은 예비처리 또는 투화 단계에서 또는 장입 단계에 포함될 수 있다.
본 발명의 제6 실시태양은 식물 세포를 동결보존으로부터 회복하는 방법에 관한 것이다. 식물 세포를 본 발명의 방법에 의해 동결보호시킨다. 해동된 식물 세포를 냉동 온도 이상의 온도로 가온시키고, 동결보호제 및 안정화제를 포함하는 배지내에서 배양시킨다. 삼투제를 제거하고, 생존 가능한 식물 세포를 회복한다.
본 발명의 제7 실시태양은 동결보존으로부터 식물 세포를 회복하는 방법에 관한 것이다. 식물 세포를 본 발명의 방법에 의해 동결보존시킨다. 해동된 식물 세포를 냉동 온도 이상의 온도로 가온시키고, 에틸렌 억제제, 산소 라디칼 스캐빈저, 2가 양이온, 동결보호제 또는 이들 물질의 조합물을 포함하는 배지내에서 배양시킨다. 생존 가능한 식물 세포를 회복하고, 이는 활발한 회복 재증식을 보이며, 세포 현탁액 중에서 신속하게 형성될 수 있다.
본 발명의 제8 실시태양은 동결보존으로부터 동결보존된 식물 세포를 회복하는 방법에 관한 것이다. 동결보존된 식물 세포를 냉동 온도 이상의 온도로 해동시키고, 동결보존제 및 안정화제를 포함하는 배지내에서 배양시킨다. 동결보호제는 세포의 혼합물 또는 펠릿을 희석하여 제거되며, 생존 가능한 식물 세포를 회복한다.
본 발명의 제9 실시태양은 본 발명의 방법에 의해 동결보존된 생존 가능한 식물 세포에 관한 것이다. 동결보존된 식물 세포는 동결보존에 의해 유전자적으로 또는 표현형적으로 거의 변형되지 않않다.
본 발명의 제10 실시태양은 현탁액내에서 동결보존된 식물 세포를 회복하는 방법에 관한 것이다. 동결보존된 식물 세포를 냉동 온도 이상의 온도로 해동시킨다. 해동된 식물 세포를 액체 현탁액내에서 배양시키고, 생존가능한 세포는 고형 또는 반고형 배양을 사용할 필요없이 액체 배지내에서 회복한다.
본 발명의 제11 실시태양은 동결보존된 생존 가능한 식물 및 식물 세포 그리고, 본 발명의 방법에 의해 회복된 생존 가능한 식물 및 식물 세포에 관한 것이다. 세포는 동결보존법에 의해 유전자적으로 그리고 표현적으로 그리 변형되지 않았으며, 생존 비율도 높다.
본 발명의 기타의 실시태양 및 잇점은 부분적으로는 하기의 기재에 의해 설명되며, 부분적으로는 본 발명의 실시로부터 알 수 있다.
도 1A, 1B 및 1C
각종 동결보존 및 회복 프로토콜의 개요
도 2
에틸렌 생성 및 억제점의 생합성 경로
도 3
타수스 세포의 동결보존 처리
도 4
타수스 치넨시스(Taxus chinensis) 현탁 배양주 K-1에서의 생체량 증가
도 5
6 개월동안 동결보존된 세포 (A)와 동결보존되지 않은 세포(B)와의 비교 크로마토그램
도 6
6 개월동안 동결보존된 세포 (A)와 동결보존되지 않은 세포(B)와의 비교 크로마토그램
도 7
동결보존된 세포의 유전자적 안정도에 대한 서던 블롯 분석
도 8
동결보존된 세포의 유전자적 안정도에 대한 PCR 분석
발명의 설명
본 발명은 본 명세서에서 구체화되고 광범위하게 기재된 바와 같이, 식물 세포의 동결보존 방법, 동결보존된 식물 세포의 회수 방법 및 동결보존으로부터 성공적으로 회수된 생존 가능한 식물 세포에 관한 것이다.
식물 세포는 식물 또는, 식물 세포의 효소적 경로에 대해 특이성을 갖는 화학적 제제, 재조합 단백질 또는 독특한 생성물의 제조에서의 그 유용성이 증가되고 있다. 캘러스와 같은 식물 세포의 배양은 계대 배양을 반복하여 연속적인 상태로 유지될 수 있다. 그러나, 계대배양은 흔히 염색체 수의 증가, 오염 위험성의 증가,자발적 변이의 축적, 형태학적 능력의 감소 및 손실, 생성물의 생합성 능력의 감소, 야생형으로의 선택된 세포주의 환원 유전, 노화 및 형질전환 무한 세포주 및 바람직하지 못한 표현형의 의도하지 않은 선택을 초래한다. 이러한 각각의 요인은 시판되는 고가의 화합물을 제조하는 세포 배양계의 개발을 상당히 촉진할 수 있다.
동물 조직을 배양하는 경우, 세포가 수년 동안 동결보존되는 것이 통상적이나, 유사한 동결보존 기술을 식물 세포에 대해 적용하는 것은 매우 곤란한 것으로 증명되었다. 식물 세포 및, 특히 배양중의 식물 세포는 증식 속도, 배가 시간, 분열 지수, 세포 동조성, 핵/세포질 비 및 액포화도에 대해 각종의 불균질성을 나타낸다. 소정의 배양중에 존재하는 세포는 생리적 및 형태적으로 각종의 변화를 나타낸다. 부가로, 식물 세포 현탁액 및 접착성의 세포 배양은 동결보존에 대한 여러 가지 프로토콜을 필요로 한다. 게다가, 부적절하게 실시하는 경우, 동결보존은 그 프로세스를 방지하고자 하는 바로 그 변이를 유도할 수 있다.
놀랍게도, 일련의 단계 및 특이성 제제를 사용함으로써 임의의 속 및 종의 식물 세포의 대부분이 동결보존되고 성공적으로 회복된다. 이러한 방법은 성공적인 식물 세포 동결보존이 세포로부터 수분을 상당량 제거함과 동시에, 적절한 조건하에서 세포의 생존도 커다란 영향을 미치지 않으면서 상당량의 수분을 제거할 수 있다는 관찰 결과를 토대로 한 것이다. 개발된 동결보존 프로토콜은 통상의 재현가능한 방법으로 생존가능한 세포를 저장, 유지 및 회복하는 것에 있어서 매우 성공적이다. 이러한 프로토콜은 생식질의 보존 및 세포 뱅크 관리 시스템을 생성하는 통상의 단의 조작으로 이루어질 수 있다. 또한, 세포는 식물 배양에 관하여 이제까지는 불가능하다고 생각되었던 방법인 액체 현탁액 중에서 세포를 전체적으로 회복하는 것이 가능하다. 동결보존된 세포로부터 수확한 생성물은 친세포로부터 거의 변형되지 않는데, 증식과 생존도, 생성물 형성 및 세포 생체량의 증식과 관련하여, 표현형 또는 유전자형의 변동이 거의 없기 때문이다. 이러한 변동은 관찰 가능하거나 또는 정량 가능한 표현형 또는 형태학적 변화로부터 결정된다. 이러한 변화는 이들이 표현형 변수를 작은 정도로 감소시키는 경우 중요하게 된다.
본 발명의 제12 실시태양은 식물 세포의 동결보존 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 놀랍게도 많은 유형의 식물 세포에 대해 재현가능하고 적용 가능하다. 따라서, 이들은 재현성에 관하여 정부 당국 또는 행정청의 기준을 필요로 하는 물질의 제조에 대해 매우 유용하게 된다.
기본적인 방법은 예비처리(예, 2가 양이온, 라디칼 스캐빈저와 같은 안정화제 또는 동결보존제 또는 열 충격에 의한 예비배양), 저온 순화, 단계적 또는 단일 투여 장입 또는 투화, 동결건조, 냉동 및 해동 단계의 조합에 의해 세포로부터 수분을 상당량 제거하는 것을 포함한다. 이러한 단계의 폭넓은 조합이 가능하며, 매 단계는 생존 가능한 식물 세포가 바람직하도록 하는 특징 및 성장 특성을 보유하는 생존 가능한 식물 세포의 성공적인 동결보존 및 회복을 위해 반드시 필요하지는 않다. 이러한 단계의 각 실시태양의 가능한 조합이 도 1A, 1B 및 1C에 도시되어 있다. 이러한 변형예가 단지 예로서 이해될 수도 있다. 식물의 각 유형(예, 강, 목, 과, 속, 종, 아종 또는 변종)은 동결보존으로부터의 회복을 최대로 하는 일련의 바람직한 조건을 확실히 갖는다. 본 명세서중에서 개시된 선택적인 변형예로부터 동결보존에 대한 최적의 변수를 용이하게 결정할 수 있다.
겉씨 식물 및 속씨 식물을 비롯한 이러한 방법을 이용한 대부분의 식물 세포는 성공적으로 동결보존 또는 회복될 수 있다. 동결보존될 수 있는 겉씨 식물의 특정 유형으로는 아비에스속(Abies, 전나무), 시프레수스속(Cypressus, 사이프레스), 징코속(Ginkgo, 공작고사리), 쥬니페루스속(Juniperus, 곱향나무), 피세아속(Picea, 가문비), 피누스속(Pinus, 소나무), 슈도추가속(Pseudotsuga, 미송), 세쿠오이아속(Sequoia), 타수스속(Taxus, 주목), 추가속(Tsuga, 헴록) 또는 자미아속(Zamia 소철)의 종이 있다. 매우 유용한 타수스속의 종에는 티. 바카타(T. baccata), 티. 브레비폴리아(T. brevifolia), 티. 카나덴시스(T. canadensis), 티. 치넨시스(T. chinensis), 티. 쿠스피다타(T. cuspidata), 티. 플로리다나(T. floridana), 티. 글로보사(T. globosa), 티. 메디아(T. media), 티. 누시페라(T. nucifera) 또는 티. 월리키아나(T. wallichiana) 등이 있다. 보존될 수 있는 속씨 식물에는 외떡잎 식물 세포 및 쌍떡잎 식물 세포가 있다. 외떡잎 식물 세포의 예로는 아베나속(Avena, 귀리), 코코스속(Cocos, 코코넛), 디오스코레아속(Dioscorea, 참마), 호르데움속(Hordeum, 보리), 무사속(Musa, 바나나), 오리자속(Oryza, 쌀), 사카룸속(Saccharum, 사탕수수), 소르굼속(Sorghum, 사탕수수), 트리티쿰속(Triticum, 밀) 및 제아속(Zea, 옥수수)의 종이 있다. 쌍떡잎 식물에는 아키로클린속(Achyrocline), 아트로파속(Atropa), 브라시카속(Brassica, 겨자), 베르베리스속(Berberis), 소포라(Sophora), 레굼(Legume), 루피누스(Lupinus), 캅시쿰속(Capsicum), 카타란투스속(Catharanthus), 코노스페르뭄속(Conospermum), 다투라속(Datura), 다우쿠스속(Daucus), 디지탈리스속(Digitalis), 에키나세아속(Echinacea), 에쉬콜리치아속(Eschscholtzia), 글리신속(Glycine, 대두), 고시피움속(Gossypium, 면), 히오스키아무스속(Hyoscyamus), 리코페르시쿰속(Lycopersicum, 토마토), 말루스속(Malus, 사과), 메디카고속(Medicago, 자주개자리), 니코티아나속(Nicotiana), 파낙스속(Panax), 피숨속(Pisum, 완두), 라우볼피아속(Rauvolfia), 루타속(Ruta), 솔라눔속(Solanum, 감자) 및 트리코산테스속(Trichosanthes)의 종이 있다.
식물 세포는 신생 증식 침엽, 잎, 뿌리, 수피, 줄기, 근경, 캘러스 세포, 원형질체, 세포 현탁, 기관 또는 기관계, 정단 분열조직과 같은 분열 조직, 종자 또는 배와 같은 노지로부터의 새로이 수확한 시료가 될 수 있다. 일반적으로, 배양중 또는 동결보존으로부터 회복시에 계대가 낮은 세포 및 초대 배양이 최대의 생존 가능성을 나타낸다. 또한, 확립된 시험관내 배양으로부터 시료 세포를 얻는 것이 낫다. 배양은 장시간에 걸쳐 수행된 것이거나 또는, 예를 들면 특정 온도, 특정 광 강도 또는 특수한 증식 또는 유지 배지 등의 시험관내 조건으로 수행한 최근의 것이다. 이러한 세포는 현탁 세포로서 또는 반고형 영양 배지상에서의 증식에 의해 유지될 수 있다.
현탁 배양은 타수스종의 캘러스 배양 또는 타수스종의 동결보존된 세포의 해동으로부터 유도될 수 있다. 계대가 낮은 초대 세포주는 이들의 배양이 장기간의 배양으로는 손실되는 독특한 특성을 지닐 수 있기 때문에 보존될 가치가 있다. 이러한 세포주 대부분은 디테르페노이드, 예컨대 각종 디테르페노이드 알칼로이드 탁산, 에스테르 측쇄 변형된 탁산, 탁솔(분자량 853) 및 탁산의 다양한 기타 변형예(바카틴 또는 10-데악틸바카틴)를 형질발현시킨다.
배양물용 타수스 세포는 임의의 식물 세포로부터 얻을 수 있다. 수집은 북아메리카 뿐 아니라 기타 대륙에 걸쳐서 이루어질 수 있다. 수피, 부름켜, 침엽, 줄기 구근, 구과 및 뿌리를 비롯한 식물의 임의의 부분으로부터의 조직은 세포 배양에 대해 선택되고 변형될 수 있다. 식물의 침엽 및 분열조직 부위, 특히 1∼3월령의 신생 침엽은 세포 배양을 개시하기에 바람직하다. 예를 들면, 선택된 식물 조직은 10 방울의 Tween 20이 첨가된 4 ℓ의 10% 표백제 용액 중에서 20 분 동안 침지시켜 표면 살균시킨다. 절단한 조직은 매우 작은 크기로 외식 배양한다.
타수스 배양에서는 특히 증식 형태, 증식성, 생산 프로파일 및 기타 특성이 변동되는 것이 통상적이다. 각각의 세포주는 증식 배지 성분에 대한 선호도가 변화하기 때문에, 세포 배양을 유도 및 증식시키기 위해 많은 상이한 증식 배지를 사용될 수 있다. 살균, 캘러스 증식의 개시 및 현탁 증식을 수행하는 방법 뿐 아니라, 적절한 영양 배지는 당업자에게 주지되어 있다.
타수스 현탁 배양은 급속한 증식 속도 및 높은 세포 밀도로 수행할 수 있다. 다양한 타수스 종의 초기 배양은 예를 들면 거대 또는 미세 영양, 유기 염 및 증식 호르몬을 포함하는 적절한 배지내로 이송하는 것에 의해 계대배양된다. 액체 배양은 공기중에 노출시키고, 바람직하게는 배지를 공기포화 처리하기 위해 교반하거나, 또는 공기를 배지내에서 버블링시킨다. 약 20℃의 온도에서, 약 3∼약 7, 바람직하게는 약 4∼약 6의 pH에서 배양을 유지시킨다. 이러한 배양은 증식 배지의 제거, 예를 들면, 여과 또는 원심분리에 의해 수확될 수 있다 가장 높은 생존 가능성을 갖는 세포는 초기의 유도기 또는 초기의 세포 분열 증식기 또는 세포 분열 또는 유사 분열을 통해 새롭게 계대시킨 것이다. 일반적으로, 증식 배지내의 타수스 종의 4∼10일된 세포 현탁, 바람직하게는 증식 배지내의 5∼8 일된 세포 현탁, 더욱 바람직하게는 증식 배지중의 타수스 종의 6∼7 일된 세포 현탁이 사용하기에 적절하다.
동결보존의 기본적인 단계 각각은 이하에 기재한다.
예비처리
냉동보존시키고자 하는 식물 세포를, 증식 동안 또는 세포 사멸 동안 세포에 의해 분비되는 유해 물질을 배양 배지로부터 제거하여 세포의 생존 가능성을 높히는 제제로 예비처리할 수 있다. 본 명세서에서 안정화제로 칭하는 이러한 시약은 천연으로 얻거나 인공 합성될 수 있으며, 배양 배지중에 직접 투입될 수 있는 물질을 포함한다. 안정화제의 예로는 활성 산소종 및 기타 자유 라디칼의 존재에 기인한 매우 유해한 효과를 중화시키는 산화방지제 또는 라디칼 스캐빈저 제제가 있다. 이러한 물질은 세포막, 즉 내부 및 외부의 막 모두에 손상을 끼칠 수 있어서 동결 보존 및 회복의 정도를 상당히 저하시킬 수 있다. 이러한 물질이 제거되지 않거나 또는 효과가 없는 경우, 생존 가능성에 대한 이러한 효과는 경시적으로 축적되며, 실제의 저장 수명을 크게 제한하게 된다. 게다가, 세포가 사멸되거나 또는 피로하게 되는 경우, 추가의 유해한 물질이 방출되어 인접 세포가 손상 및 사멸된다.
안정화제의 예로는 산소 라디칼과 같이 고 반응성, 손상성 분자를 격리시키는 화합물이 유용하다. 라디칼 스캐빈저 및 산화방지제의 특정예로서는 환원 글루타티온, 1,1,3,3-테트라메틸우레아, 1,1,3,3-테트라메틸-2-티오우레아, 티오황산나트륨, 티오황산은, 베타인, N,N-디메틸포름아미드, N-(2-머캅토프로피오닐) 글리신, β-머캅토에틸아민, 셀레노메티오닌, 티오우레아, 프로필갈레이트, 디머캅토프로판올, 아스코르브산, 시스테인, 나트륨 디에틸 디티오카르보메이트, 스퍼민, 스퍼미딘페룰산, 세사몰, 레소르시놀, 프로필갈레이트, MDL-71,897, 카다베린, 푸트레신, 디아미노프로판, 1,2-디아미노프로판, 데옥시글루코스, 요산, 살리실산, 3-아미노-1,2,4-트리아졸, 4-아미노-1,2,4-트리아졸, 벤조산, 히드록실아민, 이들 제제의 조합물 및 이들 제제의 유도체가 있다.
안정화제의 다른 군으로는 에틸렌 생합성 및/또는 에틸렌 작용을 방해하거나 또는 거의 방지하는 제제 등이 있다. 또한, 이들 화합물 중 몇몇은 마찬가지로 스캐빈저 특성을 갖는다. 에틸렌 억제제의 효과는, 에틸렌의 형질발현 또는 작용에 충분한 영향을 줌으로써 동결보존 방법에서 세포 회복을 증대시키는 경우에 상당하다. 많은 식물 세포들은 스트레스를 받을 때 에틸렌을 방출하는 것으로 주지되어 있다. 에틸렌은 세포를 손상시키고, 세포 사멸을 초래하게 된다. 에틸렌의 생성 또는 에틸렌의 작용을 방지하는 것은 세포 생존가능성 및 동결보존 방법으로부터의 세포 회복을 더욱 증대시킨다.
도 2에 예시된 바와 같이, 에틸렌 생합성에는 다수의 경로가 있으며, 이와 동등한 수의 억제제가 있다. 예를 들면, S-아데노실메티오닌(SAM)(ACC 신타제+SAM→ACC), 아미노시클로프로판 카르복실산(ACC)(ACC+ACC 옥시다제→에틸렌) 및 에틸렌(에틸렌+에틸렌 옥시다제→CO2)의 전환시에 생합성 경로를 억제할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 수많은 생합성 억제제는 하기 표 1에 제시되어 있다.
[표 1]
또한, 에틸렌 작용의 수많은 억제제가 있다. 이들 화합물의 몇몇은 하기 표 2에 제시되어 있다.
[표 2]
1976 년 이래로, 은 이온은 식물 조직 및 세포 배양의 수명을 개선시키고, 다양한 식물에서의 강력한 항-에틸렌 시약으로서 작용하는 것으로 공지되어 왔다. 예를 들면, 절단된 카네이션의 수명은 은염을 사용한 예비처리에 의해 증가될 수 있다. 은 이온은 비교적 부동성이서, 줄기의 기초 처리는 꽃에 직접적으로 분무 처리하는 것보다도 효과가 낮은 것으로 간주된다. 은 이온의 낮은 이동성은 금속을 티오황산은과 같은 음이온성 착체로 변화시킴으로써 증가되는 것으로 알 수 있다. 티오황산염 단독으로는 에틸렌 생합성 뿐 아니라 에틸렌 작용을 억제할 수가 없다.
은 이온에 의해 매개된 에틸렌 억제는 동일한 수용체 부위상에서 은이 구리로 대체되는 것을 기초로 하여 설명될 수 있다. 또한, 구리는 생합성에 관련된 효소 반응 또는 에틸렌 작용에 관여하는 금속인 것에 착안하였다. 이러한 이론은 은 및 구리의 크기가 유사하고, 동일한 산화 상태 및 양 금속이 에틸렌과 착체를 형성하는 능력을 갖고 있기 때문에 신빙성이 있다.
티오황산은을 비롯한 은염은 이들이 합성에 대해 현저하게 유도하는 효과를 갖는다할지라도, 식물 및 식물 세포 배양에서의 에틸렌 작용을 억제한다. 이러한 은 이온(티오황산은의 활성 성분)의 ACC 및 에틸렌 생합성에 대한 유도 효과는 ACC 옥시다제의 증가된 활성으로 인한 ACC의 에틸렌으로의 전환이 증가되는 것을 암시한다. 에틸렌 작용을 억제하는 은염의 몇몇의 예가 하기 표 3에 제시되어 있다.
[표 3]
냉동 공정, 회수, 해동 및 재증식 동안 안정화제가 존재하는 것이 바람직하기는 하나, 안정화제는 냉동 전에 식물 세포와 함께 배양되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 에틸렌 생합성 엑제제 및 에틸렌 작용 억제제는 해동 및 재성장동안 배양 배지내에 포함되는 것이 훨씬 바람직할 것이다. 배양은 시약 자체가 세포에 일반적으로 유해하지 않고 생존 가능성을 증가시킬 수 있기 때문에 수시간 또는 수일 동안 수행할 수 있다. 몇몇의 더 민감한 식물 세포주는 다른 것들에 비해 훨씬 더 긴 처리를 요할 수 있다. 정확한 배양 기간은 용이하게 실험에 의해 결정될 수 있다. 식물 세포는 안정화제 또는 안정화제 조합물과 함께 바람직하게는 약 1 ∼약 10일 동안, 더욱 바람직하게는 약 1∼7 일동안, 훨씬 더 바람직하게는 약 3일 동안 성장 배지내에서 배양시킨다. 이러한 정도의 시간은 배지내에서 제거하고자 하거나 또는, 세포에 대해 더 이상 해롭지 않은 정도로 적어도 감소시키고자하는 물질을 손상시키는데 특히 충분하다.
배양은 액체상 또는 반-고체상 배지내에서 실시할 수 있으며, 예를 들면 증식배지, 대사와 세포 증식을 촉진하는 배지, 또는 유지 배지, 반드시 세포 증식을 촉진하지는 않는 염과 영양원의 균형을 제공하는 배지 등이 있다. 세포는 동결보존용으로 조제되기 때문에, 이를, 보존 배지(차선의 또는 느린 증식 배양 배지; 예, 통상의 증식 배지의 염 농도의 1/4)내에서 세포의 대사 프로세스를 감소시키는 것이 바람직할 때도 있다.
실온에서 또는 식물 세포가 통상적으로 배양되는 온도에서 세포를 예비배양하여 예비처리를 실시할 수 있다. 예비배양은 약 실온(20℃)에서 실시하여 취급을 용이하게 하는 것이 바람직한데, 이는 대부분의 식물 세포가 실온에서 충분히 안정하기 때문이다. 안정화제는 배지에 직접 첨가될 수 있으며, 필요할 경우 보충할 수도 있다. 안정화제의 농도는 안정화제의 유형에 따라 다르나, 일반적으로 약 1 μM∼약 1 mM, 또는 바람직하게는 약 10 μM∼약 100 μM으로 사용되거나 또는, 1종 이상의 안정제를 사용하는 것이 통상적이지는 않다.
또한, 예비처리는 1이상의 삼투제의 존재하에 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 유용한 삼투제의 예로는 당 및 당 유도체, 아미노산 또는 이미노산, 예를 들면, 프롤린 및 프롤린 유도체 또는 이들 시약의 조합물이 있다. 당 및 당 유도체의 예로는 과당, 포도당, 맥아당, 만니톨, 소르비톨, 자당 및 트레할로즈인 것이 더욱 유용하다. 삼투제는 차후의 장입, 동결건조 및/또는 투화용 세포를 생성하는 농도에서 사용된다. 농도는 각종의 시약에 따라 크게 달라질 수 있으나, 일반적으로는 약 50 mM∼약 2 M이 된다. 이러한 농도는 원하는 정도가 달성될 때까지 연속적으로 또는 시간에 따라 증분으로(단계적으로) 소량의 시약을 첨가하여 얻을 수 있다. 배지내의 삼투제 농도는 바람직하게는 약 0.1 M∼약 0.8 M, 더욱 바람직하게는 약 0.2 M∼약 0.6 M이 된다. 또한, 삼투제는 약 1 중량%∼약 10 중량%의 농도의 수용액으로서 사용된다.
또한, 예비처리는 지질 이중층(예, 스테롤, 인지질, 당지질, 당단백질)에 삽입되는 화합물 또는 세포 배양에 첨가된 2가 양이온과 같은 막 안정화제를 단순히 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 2가 양이온은 열 충격 및 막 단백질을 안정화시키고, 또한 세포막 및 기타의 막 사이의 정전기적 반발을 감소시킨다. 마그네슘, 망간 및 칼슘은 저렴하고, 예를 들면, CaCl2, MnCl2 및 MgCl2와 같은 형태로 용이하게 입수 가능한 2가 양이온의 바람직한 예가 된다. 나트륨은 미량 농도 이상에서는 독성이 있어서 덜 바람직하다. 바람직한 농도 범위는 약 1 mM∼약 30 mM, 더욱 바람직하게는 약 5 mM∼약 20 mM, 훨씬 더 바람직하게는 약 10 mM∼약 15 mM이다. 또한, 배지중의 2가 양이온의 존재로 인해서 동결점을 더욱 빠르게 감소시키고, 통과하는 것이 가능하다. 세포간 및 세포내 얼음 결정 형성의 양자의 온도가 냉동시 그리고 해동시에 감소된다. 이러한 제제가 해동 및 해동후 배양시에 존재하는 것은 중요할 수 있다.
저온 순화
예비처리동안 또는 예비처리후의 어느 시점에서, 동결보존시키고자 하는 세포는 냉동 온도 이상이지만 배양 온도보다 감소된 온도로 순화될 수 있다. 이에 의해, 세포 대사를 크게 지연시키고, 또한 약간의 임계적 온도 변화를 통해 신속한 온도 전이의 충격을 감소시켜 세포를 동결보존 방법에 대해 생성한다. 임계 온도 범위는 예를 들면 얼음 결정 형성의 임계 온도 부근에서 세포 손상의 위험이 가장 높은 범위를 말한다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 이러한 온도는 용액의 조성에 다소 영향을 미친다. 대부분의 세포 배양 배지의 주성분인 물의 경우, 얼음 결정 형성 및 재형성은 약 0℃∼약 -50℃에서 발생한다.
순화으로 인해서 소정의 삼투 가능성에서 세포 탈수도를 감소시키는 내인성 용질의 축적이 발생하며, 과도한 탈수동안 단백질 및 막의 안정화에 기인하게 된다. 또한, 저온 순화는 투화제와 상승적으로 상호 작용하며, 세포막의 액체 입체배좌에서의 변형을 초래하여 삼투 배제 및 탈수 모두에 대한 허용차를 증가시킨다.
순화는 단계적 방식으로 또는 점진적으로 실시될 수 있다. 단계는 세포 손상을 일으키지 않으면서 저온에 순화되기에 충분한 시간 동안 약 0.5℃∼약 10℃ 증분으로 감소시킬 수 있다. 점진적이거나 또는 단계적이건간에 온도 구배는 세포가 가능한한 빠르게 빙점을 통과하도록 단계적으로 되어 있다. 세포는 저하된 온도에 대하여 점진적으로, 단계적 또는 연속적으로 또는 급속하게 순화될 수 있다. 순화기법은 당업자에게 공지되어, 시판되는 순화제를 포함한다. 점진적인 순화는 목표로 하는 온도가 달성될 때까지 시간당 약 1℃로 배양 온도를 감소시키는 것을 포함한다. 점진적인 순화는 민감성이 가장 높고, 동결보존시키기가 곤란한 것으로 간주되는 세포들에 대해 가장 유용하다. 단계적인 순화는 세포를 소정의 시간 동안 감온하에 배치하고, 추가로 저하된 온도에서 별도의 소정 시간동안 세포를 배치하는 단계를 포함한다. 이러한 단계는 필요에 따라 반복한다.
현탁 세포는 냉동 및 해동에서 가장 큰 생존율을 달성하는 후유도기 또는 조기 세포 분열기가 될 수 있다. 이러한 시기를 넘어선 세포는 액포화 및 분화도가 높아서 냉동에 의한 손상의 위험성을 증대시키고, 냉동 및 해동시의 생존율이 감소된다.
장입
장입은 하나이상의 동결보호제의 용액중에서 세포를 평형화시키는 것을 포함한다. 장입 중에 사용된 시약은 장입제로 칭할 수 있다. 장입제는 1이상의 탈수제, 투과성 또는 비투과성 시약 및 삼투제가 될 수 있는 것이 유용하다. 장입에 적절한 시약은 세포 현탁액 중에 유도될 수 있는 세포 탈수를 유도하는 시약이 있다. DMSO 및 에틸렌 글리콜과 같은 투과제 및, 과당, 자당 또는 포도당, 소르비톨, 만니톨 또는 글리세롤과 같은 투과성 및 비투과성 삼투제의 조합물을 사용할 수 있다. 이 단계는 약 0.5 M∼약 2 M 또는 약 5 중량%∼약 20 중량%의 적당한 농도의 동결보존제를 사이토졸에 투입하여 사이토졸의 용질 농도를 증가시킨다. 평형화에 필요한 시간을 최소로 하기 위해, 장입은 약 실온에서 실시하는 것이 통상적인데, 이는 장입에 최적의 온도 및 기타 조건이 생존 가능한 세포 배양을 유지하는 배지, 광 강도 및 산소 농도와 같은 조건과 맞추는 것이 바람직하다.
장입 단계에서, 단일 동결보존제 또는 여러 가지 동결보존제의 조합을 배양 배지에 연속적으로 또는 단계적으로 직접 첨가할 수 있다. 단계적 장입은 세포에 대한 장입제의 공급을 용이하게 하는데 바람직한데, 이는 단일 회분 장입보다도 약간 완화되었기 때문이다. 단계적 장입에 대한 첨가간의 시간 증분 또는 간격은 수분 내지 수시간 범위가 될 수 있지만, 바람직하게는 약 1∼약 10분, 더욱 바람직하게는 약 1∼약 5분, 훨씬 더 바람직하게는 약 1∼약 2 분 간격이 될 수 있다. 단계적 장입에서의 첨가 횟수는 대개 실질적으로 어떻든지 간에 수회 내지 다수회가 될 수 있다. 바람직하게는 약 20회 이하, 더욱 바람직하게는 약 10 회 이하, 훨씬 더 바람직하게는 약 5 회 정도가 된다. 간격 기간 및 간격 수는 세포 및 장입제의 유형에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 세포는 시약의 세포내 및/또는 세포외 농도를 평형화시키도록 장입제(들)(장입제의 함량을 연속적 또는 단계적으로 증가시키면서)를 포함하는 용액내에서 배양시킨다. 배양 시간은 실질적으로 수분 ∼ 수 시간이 된다. 장입의 보호 효과는 부분적으로는 소량이기는 하나, 유의적 함량의 수분을 세포로부터 제거하는 것을 포함한다. 이에 의해 세포내 갑작스런 수분 손실의 충격을 최소로 하여 세포는 차후의 투화 및/또는 동결건조에 대해서 생성된다.
장입후, 동결보존제를 포함하는 증식 배지를 제거하거나 또는, 사용하고자 하는 시약(투화제)가 동일하거나 또는 유사한 시약인 경우, 장입제는 그 상태로 투화를 위해 농도를 단순히 증가시킨다.
투화(vitrification)
동결보존시키고자 하는 세포를 예비처리, 장입 및/또는 동결건조 후 투화시킨다. 이러한 절차는 여러가지 잇점을 갖는다. 시스템내의 얼음 결정의 형성을 방지함으로써, 얼음 형성을 초래하는 복잡한 변수들을 최적화시키는 필요성이 없게 된다. 추가로, 시료는 액체 질소에 직접 넣을 수 있으며, 이러한 절차는 조절된 냉각에 필요한 다수의 장비를 필요로 하지 않는다. 투화 절차는 수개의 각종 유형의 세포로 구성된 복잡한 조직 및 기관에 대한 동결보존 절차를 개발하고자 하는 점에서 최대의 가능성을 제공한다.
투화 처리는 액체 질소 중에서의 급냉 이전에, 세포 또는 시료의 점진적 또는 단계적 삼투 탈수를 포함한다. 투화 처리에 있어서, 세포 탈수는 액체 질소 중에서의 냉각 이전에 농축 용액에 직접 노출시켜 실시한다. 노출은 세포에 첨가된 투화량을 연속적으로 증가시켜 점진적이 되거나 또는, 증가량을 일련의 시간동안 첨가하여 단계적이 될 수 있다. 단계적 투화에 대한 첨가 간의 시간 증분 또는 간격은 수분 ∼ 수시간 이상, 바람직하게는 약 1∼약 10 분, 더욱 바람직하게는 약 1 분∼약 5 분, 가장 바람직하게는 약 1 또는 약 2 분 범위내이다. 단계적 투화 처리에서의 첨가 횟수는 실질적인 것이 통상적이며 수회 ∼ 다수회가 될 수 있다. 바람직하게는 약 20 회 미만, 더욱 바람직하게는 약 10 회 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 5 회 이다. 간격 및 간격 횟수는 당업자라면 세포 및 투화제의 특정 유형에 따라 용이하게 결정될 수 있다. 세포는 소정 제제의 세포내 및/또는 세포외 농도를 평형화시키는 투화제(들)를 포함하는 용액내에서 (연속적 또는 단계적으로 증가된 함량으로)배양된다. 배양 시간은 수분 ∼ 수시간이 된다. 이상적인 조건하에서, 세포 또는 기관을 세포간 또는 세포내 얼음을 형성시키지 않고 매우 빠른 속도로 냉각시킬 수 있다. 그 결과로서, 얼음 형성에 영향을 미치는 모든 요인은 배제되며, 통상의 동결보존 처리에 비해서 투화 처리의 수개의 실질적인 잇점이 존재한다. 투화에 의해 복잡한 조직 및 기관에 대한 동결보존 절차를 개발할 가능성이 크게 된다. 시스템 내에서의 상당한 얼음 형성을 배제시킴으로써, 투화 절차는 통상의 동결보존 처리에 비해 조작이 훨씬 더 복잡해진다. 추가로, 투화에 의해 몇몇의 시료의 냉각 감도 문제를 대처하도록 초급냉 속도를 사용하는 것이 가능하게 한다. 냉각 속도를 조절하기 위한 특수 또는 고가의 장비가 필요하지 않게 된다.
투화는 고 농축된 사이토졸을 과냉각시켜 실질적인 결정화 없이 고체상의 준안정 유리를 형성하는 저온 방법이다. 임의의 세포를 동결보존시키는데 있어서의 주된 곤란성은 냉동 및 해동 모두에 있어서 세포내 얼음 결정의 형성이다. 과잉의 얼음 결정 형성은 세포막 및 세포기관(organelle)의 파열로 인해 세포 사멸을 초래한다. 얼음 결정 형성을 방지하는 한 방법은 형성된 얼음 결정이 상당한 손상을 일으키기에 충분할 정도로 크지 않은 정도로 세포를 급속히 냉동시키는 것이다. 수분 함량이 낮은 세포를 급속하게 냉동시키는 경우, 투화된다. 급속 냉동에 의한 투화는 수분 함량이 높은 식물 세포와 같은 세포에서는 가능하지 않다. 수분 함량이 높은 세포를 투화시키기 위해서는, 투화를 위한 급속 냉동 이외에 빙점 강하제 및 얼음 형성 억제제를 필요로 하게 된다. 적절하게 투화된 세포는 너무 작아서 광을 회절시키지 못하는 얼음 결정으로 구성된 투명 냉동 무정형 고체를 형성한다. 투화된 세포가 약 -40℃로 가온되는 경우, 실투가 발생될 수 있다. 실투시에, 얼음 결정은 세포 생존에 있어서 일반적으로 유해한 프로세스에 의해 크게 되어 굳어진다. 투화 용액은 냉동시에 세포 투화를 촉진시키고, 해동시에 실투를 지연시킨다.
대부분의 동결보존 용액은 대상 물질을 유리 또는 유리상 물질로 변형시킬 수 있으며, 단 냉각 속도는 얼음 결정의 핵화 및 성장을 방해하기에 충분하게 빠른 것을 조건으로 하며, 또한 임계 냉각 속도는 용질 농도에 따라 다르다. 마찬가지로, 세포의 투화는, 사이토졸이 충분하게 농축되는 경우, 실시될 수 있다. 동결보존 절차에 있어서, 액체 질소 내에서의 급냉 이전에 과도하게 농축된 용액내에서 세포를 탈수시키는 것으로 이루어질 수 있다. 동결보존 처리에서, 투화제 등의 동결보존제의 농축 용액중에 시료를 넣음으로써 투화에 필요한 농도로 사이토졸을 농축시킨다. 약 4 M∼약 10 M 또는 약 25 중량%∼약 60 중량%의 농도가 바람직하다. 이는 플 세포의 과도한 탈수를 생성한다. 7 M을 넘는 용액은 대개 90% 이상의 삼투 활성수를 세포로부터 제거하지만; 단, 각 시약에 대한 정확한 농도는 실험에 의해 측정될 수 있다. 사용가능한 투화제는 DMSO, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 부탄디올, 포름아미드, 프로판디올 및 이러한 물질들의 혼합물 등이 있다.
적절한 투화 용액은 DMSO(1∼50%), 프로필렌 글리콜(약 5∼25%), 글리세롤(약 0∼50%), PEG-8000(약 5∼20%), 에틸렌 글리콜(약 10∼75%), 에틸렌 글리콜/소르비톨(약 60/20 중량%∼약 10/60 중량%) 및 에틸렌 글리콜/소르비톨(약 40/30 중량%)를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 에틸렌 글리콜/소르비톨이 바람직하며, 50/30%, 45/35%, 40/40%, 40/30%, 30/50%의 농도로 사용되는 것이 바람직하며, 30/40%가 바람직하다. 이러한 투화 용액은 약 1℃∼약 8℃, 바람직하게는 2℃∼6℃, 더욱 바람직하게는 약 4℃의 온도에서 사용할 수 있다.
투화 용액에 노출시킨 결과로서의 손상을 최소로 하기 위해, 탈수는 약 0℃∼약 4℃에서 가능한한 짧은 노출 시간으로 실시할 수 있다. 이러한 조건하에서, 시료중의 동결 보존제는 추가로 유입하지 않는데, 이는 물과 용질에 대한 투과 계수차 때문이다. 그 결과, 시험체는 수축된 상태로 유지되며, 투화에 필요한 세포질 농도의 증가는 탈수에 의해 달성된다. 그러나, 동결보존제를 사용한 세포의 평형화(장입)는 식물 세포 또는 기관의 성공적인 투화에 대해 항상 필요한 것은 아니다. 예를 들면, 몇몇의 경우에 있어서, 장입제를 사용한 예비배양은 장입 단계와 동일한 목적을 달성한다.
장입을 필요로 하는 경우에 있어서, 이는 주로 세포막 및 가능한한 단백질의 탈수에 위한 불안정화를 방지하는 역할을 한다. 그러나, 장입 단계가 없을 경우, 이후에 탈수 및 냉각/가온 단계후, 세포 생존이 적게될 수 있다. 그래서, 장입 단계동안 세포내 에틸렌 글리콜 또는 기타의 동결보존제는 냉각시의 세포의 투화를 촉진할 뿐 아니라, 탈수 단계중의 손상으로부터 세포를 보호하게 된다.
동결건조
동결건조는 동결보존 전에 진공 증발에 의해 세포의 수분 함량을 감소시키는 것에 관한 것이다. 진공 증발은 감압 대기중에서 세포를 배치하는 단계를 포함한다. 원하는 수분 제거 속도에 따라서, 약 -30℃∼-50℃의 온도에서 감압 대기는 100torr, 1 torr, 0.01 torr 또는 그 미만이 될 수 있다. 감압 조건하에서, 수분 증발 속도는, 세포내 수분의 65% 이하가 밤새 제거될 수 있을 정도로 증가된다. 최적의 조건하에서, 수분 제거는 수시간 이하에서 실시될 수 있다. 증발동안의 열 손실에 의해 세포를 냉각 상태로 유지한다. 진공도를 주의하여 조절함으로써 진공 증발 공정중에 세포는 냉각 순화 온도에서 유지될 수 있다. 진공을 강력하게 하면, 수분 증발은 신속하게 이루어지며, 세포는 냉동될 위험이 있다. 냉동은 세포에 열을 직접 가하거나 또는 진동도를 조절함으로써 조절될 수 있다. 세포를 초기에 증발 챔버에 넣어 두는 경우, 고 진공을 가하는데, 이는 세포내에 잔존하는 열이 냉동을 방해하기 때문이다. 탈수가 진행되고 세포 온도가 강하되기 때문에, 진공도를 저하시키거나 또는 열을 가하여 냉동을 방지할 수 있다. 반건조 세포는 증발 챔버내에서 확산되는 경향이 있다. 이러한 경향은 처리 종료시에 기류를 챔버로 다시 유입시키는 경우에 특히 현저하다. 기류가 반건조 세포에 근접할 경우, 세포는 공기로 운반되어 시료를 교차 오염시킬 가능성이 있다. 이러한 파열을 방지하게 위해, 증발 냉각은 세포를 건조시키면서 원심력에 의해 시험관내에 가두어 진공 원심분리기 중에서 실시할 수 있다. 이러한 방법에서 제거된 수분량은 세포의 건조 중량 측정에 의해 주기적으로 모니터할 수 있다. 원하는 수분량이 제거되면, 액체 질소 내에서 직접 냉동시키기 전에 투화 용액을 일정 시간동안 반건조 세포에 직접 가할 수 있다.
냉동
예비처리, 장입, 투화 및/또는 동결건조시킨 식물 세포는 동결보존 온도로 냉동시켜 보존한다. 냉동 단계는 세포의 생존에 치명적인 커다란 얼음 결정의 형성을 방지하기에 충분하도록 빨라야 한다. 세포는 즉 이미 동결보존 온도에서 시약과 직접 접촉시키고, 직접적으로 냉동될 수 있다. 직접적인 방법은 액체 질소 또는 액체 헬륨과 같은 극저온 유체에 직접 세포를 침지, 분무, 주사 또는 주입하는 단계를 포함한다. 세포는 또한 냉동 고체, 예를 들면 액체 질소에 의해 냉동된 강철 블록과 직접 접촉시킬 수 있다. 극저온 유체를 세포 용기에 직접 주입할 수 있다. 직접적인 방법은 또한 공기를 비롯한 기체에 세포를 저온에서 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 질소 또는 헬륨의 극저온 기류를 세포 현탁액에 직접 송풍 또는 버블링시킬 수 있다. 간접적인 방법은 용기내에 세포를 넣고, 용기를 저온의 고체, 액체 또는 기체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 적절한 용기의 예로는 극저온 온도를 견디도록 고안된 플라스틱 바이알, 유리 바이알 또는 앰플이 있다. 간접 냉동을 위한 용기는 공기 또는 액체에 대해 불투과성을 지닐 필요는 없다. 예를 들면, 플라스틱 백 또는 알루미늄 호일이 적절하다. 게다가, 용기가 반드시 극저온을 견딜 필요는 없다. 극저온하에서 플라스틱 바이알이 균열되지만 실질적으로 손상이 없는 경우 사용할 수 있다. 또한 세포는 금속 호일의 한면상에서 극저온의 기체, 고체 또는 액체와 접촉시키고 호일의 다른 면에서 세포를 냉동시킬 수 있다. 냉동은 얼음 결정 형성을 방지하기에 충분히 빨라야 한다. 냉동 시간은 약 5 분 또는 4 분, 3 분, 2 분 또는 1 분 또는 그 이하가 되어야 한다. 임계 냉동 시간은 단일 세포의 기준 프레임으로부터 측정되어야 한다. 예를 들면, 액체 질소중에 다량의 세포 샘플을 주입하는 것에는 10 분이 소요되지만, 이러한 방법에 의하면, 각각의 세포는 급속 냉동된다.
해동
본 발명의 제13 실시태양은 동결보존된 세포를 해동시키는 방법에 관한 것이다. 세포의 생존 및 세포의 회복에 대해서는 이들이 본래 냉동된 실질적으로 동일한 조건에서 적절히 해동 및 회복을 수행하는 것이 필수적이다. 동결보존된 세포의 온도가 해동동안 증가되면, 실투로 불리우는 단계에서 작은 얼음 결정이 집결되어 크기가 증가된다. 세포내에 커다란 얼음 결정이 있으면, 일반적으로 세포 생존에 치명적이다. 실투를 방지하기 위해서 동결보존된 세포는 가능한한 빠르게 해동되어야만 한다. 가열 속도는 분당 약 30℃ 이상 내지 분당 60℃가 될 수 있다. 분당 90℃, 분당 140℃ 내지 분당 200℃ 이상의 급속 가열 속도도 사용할 수 있다. 급속 가열을 원하는 동시에, 식물 세포는 실온 이상보다 상당히 높은 배양 온도를 견디는 능력이 낮다. 따라서, 과열을 방지하기 위해, 세포 온도를 주위 깊게 모니터해야만 한다. 가열 방법의 예로는 전도, 대류, 복사, 전자기 복사 또는 이들의 조합을 포함한 임의의 것을 사용할 수 있다. 전도법은 수조내에 침지시키고, 가열 블록에 넣거나 개방 불꽃내에 직접 넣는 것을 포함한다. 대류법은 히트 건 또는 오븐을 사용하는 것을 포함한다. 복사법은 예를 들면 가열 램프 또는 오븐, 예컨대, 대류 또는 복사 오븐을 사용하는 것을 포함한다. 전자기 복사는 극초단파로 및 유사한 장치를 사용하는 것을 포함한다. 몇몇의 장치는 이들 방법을 조합하여 가열할 수 있다. 예를 들면, 오븐은 대류 및 복사에 의해 가열된다. 가열은 세포 및 주위 용액이 액상이 되는 것과 동시에 종료시켜야만 하므로, 0℃ 이상이 되어야 한다. 동결보존된 세포는 1 이상의 빙점강하제의 존재하에 냉동된다. 이러한 시약이 존재하는 경우, 냉동된 세포는 0℃ 이하의 온도에서, 예를 들면 약 -10℃, -20℃, -30℃ 또는 -40℃에서 액화될 수 있다. 동결보존된 세포의 해동은 이러한 임의의 온도에서 또는 0℃ 이상의 온도에서 중단될 수 있다.
해동후 처리
투화 용액의 희석 및, 세포로부터의 동결보존제의 제거는 역장입으로 불리우는데, 이는 동결보존된 세포 샘플의 해동에 이어서 가능한한 빠르게 실시해야한다. 세포내의 동결보존제 농도가 높아서, 삼투 팽창을 최소로 하면서 현탁 배지를 희석시키는 것이 바람직하다. 그러므로, 현탁 배지의 희석 및 시료 표본 내로부터의 동결보존제의 유출은 대개 고삼투압 배지 내에서의 희석 또는 단계적 희석에 의해 실시된다.
해동된 세포는 생존을 최대로 하는 증식 조건으로 점진적으로 순화될 수 있다. 투화제는 세포독성, 세포 증식 억제 또는 변이 유발성이 있을 수 있으며, 해동된 세포로부터 세포에 영향을 미치지 않는 속도로 제거되어야만 한다. 재현탁 및 원심분리, 투석, 순차 세정, 화학제를 사용한 생치료 및 중화 또는 전자기 복사와 같은 수많은 제거법을 사용할 수 있다. 몇몇의 투화 용액 및 삼투제의 급속 제거는 세포 스트레스 및 사멸을 증가시킬 수 있으며, 그리하여 제거 단계는 점진적이 될 수 있다. 제거 속도는 저 농도의 삼투제 또는 투화제를 포함하는 용액에 의해 순차 세정하여 조절할 수 있다. 제거 속도를 감소시키는 다른 방법의 예로는 저 투과도의 막을 사용한 투석, 저 농도의 투화제를 포함하는 반고형 또는 액체 배지상에서의 순차 증식을 포함한다. 기타의 방법으로는 동결 보존 시약에 대한 점진적인 희석, 투석, 생치료, 중화 및 촉매 분해가 있다.
해동처리 및 해동후처리는 안정화제의 존재하에 실시하여 생존을 확인하고, 유전적 및 세포성 손상을 최소로 한다. 예를 들면, 2가 양이온 또는 에틸렌 억제제와 같은 안정화제는 동결보존으로부터 생성된 손상 제제를 감소, 제거 또는 중화시킨다. 이러한 손상 제제의 예로는 자유 라디칼, 산화제 및 에틸렌이 있다. 이러한 몇몇의 제제는 다수의 특성을 지니며, 이러한 점에서 매우 유용하다. 놀랍게도 해동 단계 및 해동후 단계에서 안정화제를 첨가하면, 생존율 및 재증식율은 증가된다.
삼투제 및 투화제의 농도를 허용가능한 정도로 감소시킨 후, 세포는 적절한 매체내에서 재증식될 수 있다. 재증식에 대한 한 방법은 반고형 증식 배지, 예컨대, 한천 배지내에서 캘러스가 형성될 때까지 상기 해동된 세포를 배치하는 것을 포함한다. 세포를 캘러스로부터 회복하고, 액체 배양물 중에서 증식시킬 수 있다. 또한, 적절한 호르몬을 포함하는 반고형 배지내에 배치하여 캘러스 세포를 어린싹 및 뿌리로 성장시키도록 유도할 수 있다. 어린 싹 및 뿌리를 포함하는 캘러스 세포는 점진적으로 순화되어 식물이 증식할 때까지 온실내의 살균 토양상에서 증식될 수 있다. 온실 식물은 자연 환경내의 온실 외부에서 성장 순화될 수 있다. 또한, 반고형 배지를 사용하지 않고 세포를 해동시켜 재증식될 수 있다. 즉, 삼투제 및 투화제를 제거한 후, 세포를 재증식용 액체 배지에 직접 배치할 수 있다.
본 명세서에 개시된 1 이상의 변형예들은 다양한 세포 유형에 대해 동결보존 후 세포 회복을 실질적으로 증가시킬 수 있다. 이러한 방법은 동결보존제에 의한 독성, 에틸렌의 생성, 세포막에 따른 수용체를 포함한 특정 목표에 대한 에틸렌의 작용, 막의 불안정성 및 막 누출과 관련된 문제점을 방지한다. 본 명세서에서 개시된 방법으로부터, 단계의 특정 조합은 특정 세포 유형에 대해 최적인 것으로 나타났다. 예를 들면, 토마토, 감자 및 담배 세포는 2가 양이온을 사용한 단계적 장입 및/또는 투화를 사용한 동결보존에 잘 반응한다(프로토콜 10, 12, 13, 14).
탁솔을 생성하는 타수스 세포와 같은 식물 세포의 동결보존을 실시하는 한 방법이 도 3에 개략적으로 제시되어 있다. 간략하게, 초대 분리로부터 또는 세포 배양으로부터의 캘러스 세포 증식은 액체 증식 배지 내에서의 배양에 적절하다. 세포를 액체 배양에 대해 조절한 후, 이들을 삼투제 및 안정화제를 포함하는 예비처리 증식 배지에 24∼72 시간 동안 이동시킨다. 예비배양된 세포를 4℃에서 1∼4 시간 동안 예비처리 배양에 의해 저온 순화시킨다. 저온 순화 후, 세포를 원심분리 바이알로 옮기고, 세포가 손상되지 않은 채 펠릿으로 만드는 정도로 약하게 원심분리하였다. 삼투제 및 안정화제를 포함하는 예비처리 배지를 포함하는 상청액을 세포 펠릿으로부터 흡인시키고, 이를 버렸다. 안정화제 및 투화제를 포함하는 예비냉각된 용액을 세포 펠릿에 첨가하고, 세포를 약하게 재현탁시킨다. 투화 용액으로 처리한 3분 후, 세포를 포함하는 바이알을 액체 질소에 침지시킴으로써 극저온 보존 저장에 세포를 둔다. 극저온 보존된 세포를 액체 질소내에서 약 30 분∼수년 동안 저장 하였다. 세포를 부활시키기 위해, 동결보존된 세포를 포함하는 바이알을 액체 질소로부터 40℃ 수조에 빠르게 옮겼다. 내용물을 액화시킬 경우, 바이알을 40℃ 수조로부터 꺼낸다. 해동된 세포 분액의 일정량을 염료 방출 분석에 의해 즉시 생존 가능성에 대해 조사하였다. 안정화제 및 점진적으로 낮은 농도를 갖는 삼투제를 포함하는 일련의 저온 증식 배지로 세척하였다. 충분량의 삼투제 및 투화제를 일련의 세척에 의해 세포로부터 제거한 후, 세포를 액체 배지내로 직접 옮겼다. 또한, 세포를 평판지에 놓고, 안정화제 및 감소량의 삼투제 및 투화제를 포함하는 일련의 반고형 배지에 옮겼다. 이러한 일련의 평판은 세포가 삼투제 및 투화제 용액의 부재하에 반고형 배지상에서 재증식하도록 조절될 때까지 지속시켰다.
세포 동결보존의 다른 방법은 도 1A, 1B 및 1C에 개시되어 있다. 개략적인 도시에서 알 수 있는 바와 같이, 수많은 변형예가 바람직하다. 예를 들면, 단계 1에서, 삼투제(0.06 M∼0.80 M 농도의 자당, 소르비톨 또는 만니톨)를 포함하는 액체 배지내에서 세포 생체량을 1∼6 일 동안 액체 배지내에서 예비배양시켰다. 단계 2에서, 장입을 단계적으로 실시한다. 예비배양된 세포 생체량에 동결보존제(영양 배양 배지내에 40/30 중량%의 농도로 에틸렌 글리콜/소르비톨을 포함하는 20% 투화 용액(V2N), 또는 영양 배양 배지내에 또는 0.4 M 자당 용액(pH 5.6∼5.8) 중에 30%(w/v) 글리세롤, 15%(w/v) 에틸렌 글리콜 및 15%(w/v) 디메틸설폭시드를 포함하는 20% 투화 용액(VS3))를 장입한다. 액체내의 세포 생체량을 약하게 혼합하고, 얼음상에서 또는 0℃∼4℃의 냉장고내에서 5 분 동안 배양시킨다. 이 단계 직후, 투화 용액의 최종 농도가 65%에 이를 때까지 1 분 간격으로 냉각된 100% 투화 (V2N 또는 VS3) 용액을 5 회 첨가하여 액체내의 동결보존제의 농도를 단계적으로 증가시킨다. 장입 단계 및 0℃∼4℃의 배양에 사용된 총 시간은 10분이다. 혼합물(세포 생체량+투화)을 5 분 이하(1∼5 분)동안 100×g으로 원심분리하고 상청액을 버린다.
또한, 단계 2에서, 단일 단계로 장입을 실시할 수 있다. 예비배양된 세포 생체량에 동결보존제(영양 배양 배지내에 40/30 중량%의 농도로 에틸렌 글리콜/소르비톨을 포함하는 65% 투화 용액(V2N); 또는 영양 배양 배지내에 30%(w/v) 글리세롤, 15%(w/v) 에틸렌 글리콜 및 15%(w/v) DMSO를 포함하는 65% 투화용액(VN3); 또는 0.4 M 자당 용액(pH 5.6∼5.8))를 장입한다. 동결보존제를 포함하는 액체내의 세포 생체량을 약하게 혼합하고, 얼음상에서 배양시키거나 또는 0℃∼4℃의 냉장고내에서 10 분 동안 냉장시킨다.
또한, 장입은 1 이상의 막 안정화제를 포함하는 동결보존제를 사용하는 다단계 또는 단일 단계로 실시할 수 있다. 모든 생체막은 공통의 총체적 구조를 갖는다. 이는 비공유 상호작용에 의해 함께 유지되는 지질 및 단백질의 집합체이다. 지질은 이중층으로서 배열되며, 이는 막의 기본적인 구조물을 제공하며, 대부분의 수용성 분자의 흐름에 대해 비교적 불투과성인 차단물로서 작용한다. 단백질 분자는 지질 이중층내에 포함되며, 막의 다양한 작용을 조절한다. 단백질 분자는 세포, 예를 들면, 채널 단백질, 예컨대, 수동적 채널 단백질, 운반체 단백질 및 활성 수송과 관련된 단백질 등의 특정 분자를 세포내에 또는 세포외에 전달하는 작용을 한다. 다른 단백질은 막 관련 반응을 촉매화하는 효소이며, 기타의 단백질은 세포의 세포골격 및 세포외 기질 사이의 구조적 결합물로서 및/또는 세포 환경으로부터의 변환 화학적 신호를 수신하기 위한 수용체로서 작용한다.
특정 식물 종 및 세포주는 미리 설정된 동결보존 프로토콜에 저항을 갖는데, 이는 동결보존제의 유형 및 농도에 민감하게 반응하기 때문이다. 이에는 막의 불안정화와 관련된 2 이상의 잠재 원인이 있으며, 이는 장입 및 탈수 단계에 사용된 동결보존제의 화학적 독성 및 농축된 용액으로의 노출로부터 생성된 과도한 탈수(예, 투화)가 있다. 냉각 또는 가온 동안의 얼음의 형성 및 유리의 파손으로 인한 세포의 기계적 파손과 같은 기타의 요인은 막의 불안정화에 기인할 수 있다.
동결보존제 농축액으로의 노출에 의해 형성된 과도한 탈수는 지질, 단백질 및 핵산을 비롯한 생물학적 분자의 다양한 배열에서의 구조적 변이를 일으킬 수 있다. 이러한 조건하에서, 혈장 막 및 기타 세포성 막의 미세구조에는 여러가지 변형이 있을 수 있다. 이러한 변화는 혈장 막내의 특정 영역의 형성을 포함하는데, 이는 단백질의 친수성 부분과 관련된 물 및 막의 지질 성분의 제거를 초래한다. 또한, 불안정화는 식물 세포막을 투과성 동결보존제 화합물(예, 식물 세포 막내의 채널 단백질을 유동화시키는 화합물)과 접촉하여 발생할 수 있다. 단계적 장입 및/또는 투화는 과도한 탈수로부터 형성된 막 불안정화를 최소로 할 수 있다. 세포 부피, 혈장막의 투과성 등의 실질적인 변화와 관련된 다른 특징은 또한 단계적 장입에 의해 최소화될 수 있다.
열 충격 처리는 막 및 단백질을 안정화시킨다. 세포 생체량을 삼투제로 예비 배양시킨 후의 열 충격 처리는 동결보존제를 세포에 장입하기 전에 반드시 수행할 필요는 없다. 그러나, 세포 생체량이 삼투제와 함께 예비배양되지 않는 경우에는 열 충격 처리가 필요하다. 게다가, 2가 양이온을 포함하는 투화 용액(동결보존제)(CaCl2, MnCl2 또는 MgCl2, 5 mM∼20 mM)을 세포에 장입하는 것이 중요하다(예, 프로토콜 11 및 12). 열 충격 처리는 통상 세포 생체량의 예비배양 후 실시한다. 동결보존후 세포의 생존율이 약 20%∼약 40% 정도되는 것이 중요하다. 이 처리는 약 37℃에서 약 4 시간 이하 동안 수조 교반기내에서 세포 또는 세포 생체량(예비배양되거나 또는 예비배양되지 않음)의 배양을 포함한다. 이러한 처리후, 액체 배지(삼투제의 포함 또는 포함하지 않음)내의 세포를 동결보존(장입 단계)에 사용하기 전에 4 시간 이하동안 실온(23℃∼25℃)으로 만든다.
열 충격 처리는 스트레스에 적응하는데 포함되는 것으로 간주되는 특정 단백질(열 충격 단백질)의 새로운 합성을 유도하는 것을 알려졌다. 삼투제로 예비배양되지 않은 세포를 열 충격 처리하면, 냉동을 견디지 못한다. 열 충격은 냉동으로부터 생성된 세포내의 삼투제의 농도를 갑작스럽게 증가시킴으로써 단백질 및 막을 안정화시키는 열 충격 단백질의 형성에 의해 노출에 대한 내성을 유도한다. 열 충격은 약 31℃∼약 45℃, 바람직하게는 약 33℃∼약 40℃, 더욱 바람직하게는 약 37℃의 수조내에서 세포를 배양시킴으로써 실시된다. 배양은 수 분∼수 시간, 바람직하게는 약 1 시간∼약 6 시간, 더욱 바람직하게는 약 2 시간∼약 4 시간에 실시된다.
CaCl2, MnCl2 또는 MgCl2와 같은 2가 양이온은 세포를 LN2 온도에 노출시키기 전에 투화 용액내에 포함될 수 있다. 투화 용액 내에 포함되는 2가 양이온은 식물 세포 막 및 열 충격 단백질을 안정화시키는 것으로 나타났다. 2가 양이온은 막상의 이온 중심 사이의 정전기적 반발력을 감소시켜 세포막을 안정화시킨다. 또한, 2가 양이온은 냉동 및 해동동안 얼음 핵화를 방지할 수 있다. 막의 지질 이중층사이에 삽입되어 있는 스테롤, 인지질, 당지질 또는 당단백질은 또한 식물 세포막을 효과적으로 안정화시킬 수 있다. 이러한 화합물은 식물 세포 막 및/또는 열 충격 단백질의 안정화에서 2가 양이온을 대체할 수 있다.
예비배양되거나 또는 예비배양되지 않은 세포 생체량(37℃ 이에서 4 시간 이하동안 열 충격 처리하거나 또는 처리하지 않음)을 동결보존제과 함께 단계적으로 장입하는 처리는 투화 용액(V2N 또는 VS3)이 5 mM∼20 mM 범위내의 농도에서 막 안정화제 2가 양이온(예, CaCl2, MnCl2 또는 MgCl2)을 포함하는 것을 제외하고 동일하다.
단계 3에서, 투화 단계는 단계적으로 실시될 수 있다. 그리하여 장입 및 원심분리후에 얻은 세포 또는 세포 생체량은 단계적 방법으로 투화 용액(V2N 또는 VS3)으로 부가로 처리된다. 이 단계는 대개 원심분리후 세포 생체량을 냉각된 극저온 바이알로 전달하고, 0℃에서의 3분의 배양 기간동안 1 분 간격으로 농축된(100%) 투화 용액을 첨가한다. 배양 기간의 말기에, 극저온 바이알내의 내용물(세포+투화 용액)을 약하게 혼합한 후, LN2에 투입한다. 또한, 투화를 단일 단계로 실시할 수 있다. 그리하여 장입 및 원심분리 후에 얻은 세포 또는 세포 생체량은 투화 용액(100%)으로 부가로 처리된다. 이 단계는 대개 원심분리후 세포 생체량을 냉각된 극저온 바이알에 전달하고, 농축된 (100%) 투화 용액을 첨가한다. 극저온 바이알내의 내용물을 약하게 혼합하고, 3 분 동안 0℃에서 배양한 후, LN2에 투입한다. 또한, CaCl2 또는 MgCl2와 같은 2가 양이온 함유 동결보존제를 사용하여 투화를 단계적으로 또는 단일 단계가 될 수 있다.
장입된 세포 생체량을 동결보존제로 투화시키는 절차는 농축된 투화 용액(V2N 또는 VS3)이 약 5 mM∼약 20 mM 범위내의 농도에서 막 안정화제 2가 양이온(예, CaCl2 또는 MgCl2)을 포함하는 것을 제외하고 동일하다.
세포를 냉동시키는 것은 일반적으로 LN2 중에서의 극저온 바이알내에서 대개 급속으로 이루어지거나 또는 투화 용액내에 세포를 포함하는 극저온 바이알을 액체 질소(LN2)를 포함하는 저장 용기내로 신속 전달하는 것이다.
해동은 냉동된 세포 생체량 또는 세포를 포함하는 극저온 바이알을 40℃ 또는 60℃로 조절된 수조 내에서 급속 가온(예, 약 20 초∼약 45 초)을 포함한다. 해동후 처리는 삼투제(자당, 소르비톨 또는 만니톨, 농도 1M∼2M) 및 에틸렌 억제제 또는 에틸렌 작용 억제제(티오황산은; 농도 약 5 μM∼약 20 μM)와 함께 액체 영양 배지를 포함하는 살균 원심분리 시험관에 극저온 바이알내의 액화 세포 생체량을 즉시 전달하는 것을 포함한다. 내용물을 약하게 혼합하고, 교반기(120 rpm)상에서 30 분 동안 실온에서 배양한다. 이후, 원심분리하고, 펠릿내의 세포를 블롯팅지상에 있는 무균 여과지의 두 개의 층으로 전달한다(세포 또는 세포 생체량으로부터 과량의 수분을 제거하기 위해) 세포 또는 세포 생체량을 2 분 동안 배양한다. 이러한 배양 기간후, 상부 여과지와 세포를 0.8 M에서 0.1 M로 자당의 농도가 감소하도록 삼투제를 포함하는 고형 영양 배지에 순차적으로 전달하여 세포를 삼투 조절시킨다. 각 단계에서, 여과지상의 세포는 30 분∼1 시간 동안 배양시키고, 최종적으로 임의의 부가의 삼투제의 부재하에 보통의 고형 영양 배지로 전달한다. 이러한 배양 단계(보통의 영양 배지내의 임의의 부가 삼투제를 사용하지 않음)를 24 시간 배양 후 암실에서 25℃에서 반복한다.
또한, 해동 직후 펠릿내의 세포의 해동후 처리는 삼투제(자당, 소르비톨 또는 만니톨; 농도 범위 1 M∼2 M)를 포함하는 액체 배지로 신속하게 세척한다. 이는 대개 삼투제를 포함하는, 액체 영양 배지내에서 2∼5 분 동안 세포 생체량의 배양을 실시하고, 100×g으로 1∼3 분 동안 원심분리한다. 이 단계를 한 번더 반복한 후, 세포 생체량의 배양을 30 분 동안 삼투제 및 에틸렌 억제제 또는 에틸렌 작용 억제제(티오황산은, 5 μM∼20 μM)를 포함하는 액체 영양 배지내에서 배양시킨다.
새로운 캘러스 재증식은 1 주일 후에 일반적으로 눈에 보인다. 새로운 세포 생체량 증식이 증가하면, 캘러스 세포는 여과지로부터 제거되고, 보통의 고형 영양 배지상에 직접 이동시킨다. 충분한 증식이 발생한 후(일반적으로 2∼3 주간), 액체 배지내에 캘러스를 배치하여 세포 현탁이 개시된다.
본 발명의 제14 실시태양은 상기 기재된 방법에 의해 동결보존된 식물 세포에 관한 것이다. 세포는 상기 개시된 모든 속 또는 종의 세포 또는 동결보존법이 사용될 수 있는 세포이다. 동결보존된 세포는 극저온 보관에 대해 적절한 온도에서 유지될 수 있다. 세포는 액체 질소(약 -196℃), 액체 아르곤, 액체 헬륨 또는 액체 수소 중에서 유지되는 것이 바람직하다. 이러한 온도는 세포의 장기간 저장, 부가로 온도 변화를 최소로 하는 것에 가장 적절하다. 장기간의 저장은 수개월, 바람직하게는 수년이며, 회복시에 세포 생존가능성을 크게 상실하지 않은 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 동결보존된 세포의 효율적인 회복 방법에 관한 것이기 때문에, 세포 시료 전체가 사멸되지 않았다면, 비교적 대부분이 사멸될 수도 있다. 세포 또는 식물은 잔류하는 세포로부터 증식될 수 있다. 단기간의 저장, 수개월 미만의 저장은 -150℃, -100℃ 또는 -50℃의 저장 온도를 사용할 수 있어서 바람직할 수 있다. 드라이 아이스(이산화탄소) 및 통상의 냉각제를 사용하여 상기 온도를 유지한다.
본 발명의 제15 실시태양은 상기 기재된 동결보존 회복 방법에 의해 부활된 식물 및 식물 세포에 관한 것이다. 세포는 본 명세서에 개시된 임의의 속 또는 종 또는 극저온 회복법이 사용된 속 또는 종의 세포가 될 수 있다. 세포는 동결보존된 초대 세포 또는 상기 세포로부터 증식된 세포가 될 수 있다. 동질성 세포 배양으로 부터 구별되는 식물은 상호 관련된 작용을 갖는 관련 세포의 다양한 집합이다.
본 발명의 제16 실시태양은 동결보존된 세포의 이동 및 해동을 위한 방법 및 키트에 관한 것이다. 이러한 방법에 의해 동결보존된 세포는 차후의 회복을 위한 중앙 저장소에 보관할 수 있다. 우발적 사멸에 대한 안전성을 높히기 위해, 각각의 냉동된 세포주를 수많은 장소에 저장할 수 있다. 회복동안 동결보존된 세포를 포함하는 극저온 바이알을 적절한 용기에 넣어 수령인에게 수송할 수 있다. 적절한 용기는 수송동안 동결보존 온도를 유지할 수 있는 것이다. 모든 세포는 액체 질소와 같은 휴대용 동결보존제를 사용하여 장기간동안 비교적 낮은 온도에서 선적할 수 있다. 즉시 해동시키고자 하는 세포는 드라이 아이스 중에 수송하여 비용을 절감시킬 수 있다. 저장소로부터 세포를 회복하기 위한 키트는 동결보존된 세포 바이알, 적절한 농도의 삼투제를 포함한 충분한 배지, 투화 용액 및 순차의 세척용 안정화제를 포함한다. 또한, 세척 용액 대신에, 또는 세척 용액 이외에, 세포는 안정화제를 포함한 반고형 증식 배지와, 감소량의 삼투 및 투화 용액을 함께 세포를 수송할 수 있다. 해동 후, 세포를 세척하고, 즉시 사용하거나 또는, 반고형 배지상에 배치하여 투화 및 삼투제를 점진적으로 제거한다. 수송 키트는 해동후 생존 가능성 분석을 위한 제제 및, 해동된 세포로부터의 DNA와 비교하여 유전적 안정도를 비교하기 위한 표준 DNA 샘플을 부가로 포함할 수 있다.
하기의 실험은 본 발명의 실시태양을 예시하고자 제공하는 것으로 본 발명의 범주를 제한해서는 안 된다.
실시예 1
캘러스 개시 및 증식
타수스 침엽을 야생형 및 배양된 식물로부터 수집하였다. 식물 재료를 희석된 비누 용액으로 세척하고, 증류수로 강력 세척하고, 10 분 동안 염소 함유 용액(1% 차아염소산염, pH 7)내에서 표면을 살균시켰다. 살균 조건하에서, 재료를 살균 증류수로 3회 세척하였다. 침엽을 100 mg/ℓ 아스코르브산을 포함하는 1% 폴리비닐피롤리돈(PVP) 용액내에서 절단하였다. 반고형 배지 E 내의 절단 단부와 함께 침엽을 놓고, 암실에서 24℃±1℃로 배양하였다. 배양을 매일 모니터하고, 미생물 오염이 의심되는 것은 버린다. 상당한 캘러스가 형성된 것으로 관찰되었으며, 캘러스를 20 일 동안에 외식편으로부터 분리하고, 하기 표 4에 제시되어 있는 다양한 캘러스 증식 배지상에 놓는다. 타수스 치넨시스의 캘러스를 배지 D로 옮긴다(표 4). 이 처리로 외식편의 90% 이상의 캘러스 유도가 발생하였다. 동일한 처리를 사용하여 티. 브레비폴리아, 티. 카나덴시스, 티. 쿠스피다타, 티. 바카타, 티. 글로보사, 티. 플로리다나, 티. 월리키아나, 티. 메디아, 티. 치넨시스의 배양을 개시하였다. 외식편으로부터 제거한 캘러스를 24℃ 암실에서 배양하였다. 건강한 캘러스 부분을 신선한 배지에 매10 일마다 이동시켰다. 본 발명에 바람직한 증식 및 세포 유지 배지는 하기 표 4a 및 4b에 제시한다.
[표 4a]
[표 4b]
실시예 2
현탁 세포의 현탁 개시 및 증식
25 ㎖의 액체 배지(표 4a 및 4b)를 포함하는 125 ㎖의 삼각 플라스크에 1g의 캘러스 물질을 무균 접종하였다. 플라스크를 실리콘 발포 캡으로 도포하고, 24℃ 암실에서 120 rpm으로 선회 교반기상에 두었다. 현탁 배양물이 약 3∼10 일 동안 형성되었다. 미라클로쓰 여과지를 포함하는 뷰흐너 깔때기를 통해 플라스크 내용물을 흡입 여과하고 신선한 배지내의 모든 생체량을 재현탁시켜 배지 교환을 개시하였다. 25 ㎖의 신선한 배지를 포함하는 125 ㎖의 플라스크에 매주 1∼2 g의 세포를 옮겼다. 대표적인 종의 현탁 배양물에서 얻은 대표적인 증식 속도 및 세포 밀도를 하기 표 5에 제시한다.
[표 5]
티 치넨시스 주 K-1에 대한 시간에 따른 생체량(함수 및 건조 중량)의 증가를 도 4에 도시한다. 가장 빠른 생체량 증가를 나타내는 점에서의 기울기를 측정하여 최대 증식 속도를 측정하였다. 2.5 일의 최대 배가 시간을 갖는 티. 치넨시스의 세포 배양은 타수스 종 현탁 배양에 대해 이미 보고된 것보다 훨씬 높은 증식 속도를 나타낸다. 대표적인 타수스 배양은 배가 시간이 약 7∼12 일이 된다.
고밀도에서의 배양 세포는 세포 배양 방법의 생산율을 최대로 한다. 이전의 티 브레비폴리아 배양물이 1 ℓ당 건조 중량 1 g 미만의 세포 밀도를 갖는 반면, 현탁 배양물 티. 치넨시스는 18 일의 증식후 1 ℓ당 건조 중량 8∼20 g 이하의 밀도를 가질 수 있다. 세포 생존 가능성은 아세톤내의 0.05% 형광 디아세테이트(FDA)로 염색한 후[참고 문헌 : J M. Widholm, Stain Technol 47:189-94, 1972], 형광 현미경내의 청색광으로 여기시의 녹색 형광 세포의 수를 계수하여 결정한다. 세포 생존 가능성은 증식기 동안 90% 이상이 되었다.
실시예 3
만니톨을 사용한 예비배양후 타수스 세포의 생존 가능성
타수스 세포의 6∼7 일된 현탁 배양물을 수확하고, 0.16 M의 만니톨, 0.22 M의 만니톨, 0.33 M의 만니톨 및 0.44 M의 만니톨을 포함하는 신선한 증식 배지에 재현탁하였다.
만니톨을 포함하는 증식 배지내에서 3 일 동안 배양한 후, 세포를 4℃에서 3 시간 동안 저온 순화시켰다. 순화된 세포를 수확하고, 배지내에 40/30 중량%의 에틸렌 글리콜/소르비톨의 저온 투화 용액을 포함하는 4 ㎖의 극저온 바이알에 옮겼다. 바이알을 4℃에서 3 분 동안 배양하고, 액체 질소에 침지시켜 냉동시켰다. 바이알을 해동 실험에 사용하기 적어도 10 분 이상동안 액체 질소내에서 유지시켰다.
냉동된 세포의 바이알을 액체 질소 저장소에서 꺼내고, 내용물이 액화될 때까지(1∼2 분) 40℃에서 교반하였다. 액화된 세포를 1 M 소르비톨을 포함하는 무균 배지로 5∼6 회, 0.5 M 소르비톨 배지를 포함하는 배지로 3 회, 0.1 M 소르비톨 배지로 3 회, 무-소르비톨 배지로 3 회 세척하였다. 세척 배지내에서 세포를 재현탁시켜 세척을 실시하고, 50×g에서 2 분 동안 원심분리하고, 세포 펠릿으로부터 세척 배지를 흡기시켰다. 해동 직후의 세포 생존 가능성을 측정하였다. 다수의 실험 개요를 하기 표 6에 제시한다.
[표 6]
실시예 4
소르비톨을 사용하여 예비배양시킨 후의 타수스 세포의 생존 가능성
냉동된 타수스 세포를 해동시키고, 0.15 M, 0.22 M, 0.33 M, 0.44 M 및 0.80 M의 소르비톨로 소르비톨 함유 신선한 증식 배지에 현탁시켰다. 해동 직후의 세포 생존 가능성을 측정하였다. 다수의 실험 개요를 하기 표 7에 제시한다.
[표 7]
실시예 5
자당을 사용하여 예비배양시킨 후의 타수스 세포의 생존 가능성
증식 배지내의 6∼7 일된 현탁 배양물을 수확하고, 세포 생체량을 0.06 M, 0.12 M, 0.15 M, 0.29 M 및 0.58 M의 자당을 포함하는 신선한 증식 배지에 재현탁시켰다. 세포를 동결보존, 냉동, 해동 및 삼투 조절하였다. 해동 직후의 세포 생존 가능성을 측정하였다. 다수의 실험 개요를 하기 표 8에 제시한다.
[표 8]
실시예 6
타수스 세포의 생존에 대한 삼투제의 효과
예비배양 기간후 및, 동결보존되고 냉동된 타수스 세포 현탁액의 해동후, 상기 제제로 예비배양된 타수스 종 세포의 생존에 대한 증식 배지내의 다양한 삼투제의 효과를 측정하여 평가하였다. 동결보존 이전에 다양한 삼투제를 포함하는 증식 배지내에서 3 일된 세포 배양 현탁액의 세포를 예비배양하였다. 동결보존된 세포를 냉동시키고, 최소 1 시간 동안 액체 질소내에 보관하였다. 예비배양 기간의 말기에(대조용) 및 동결보존되고 냉동된 세포를 해동시킨 직후 생존 가능성 테스트를 실시하였다.
증식 배지내에서 만니톨을 사용하여 예비처리한 세포 배양물은 기타 삼투제를 사용하여 관찰된 생존 가능성과 비교하여 동결보존 및 냉동후의 해동시의 생존 가능성이 가장 높은 것으로 나타났다.
[표 9]
실시예 7
타수스 생존 가능성에 대한 삼투제 및 동결보존제의 효과
타수스 현탁 배양물(KSIA)의 세포를 수집하고, 배지내의 다양한 삼투제로 예비배양시켰다. 테스트한 삼투제는 트레할로즈, 프롤린, 소르비톨(0.15 M~0.8 M), 자당(2∼20%) 및 만니톨(0.16 M)이다. 예비배양 기간의 종반에 및 해동 직후에 각각의 세포 현탁액에 대해 생존 가능성을 평가하였다. 해동후 삼투 조절 이후 재증식을 평가하였다. 투화 용액은 에틸렌 글리콜/소르비톨/펙틴 및 에틸렌 글리콜/소르비톨을 배양 배지내에서 40/30 중량%로 사용하였다. 결과를 하기 표 10에 제시한다. 예비배양에 만니톨을 사용하고 투화 용액에 동결보존제로서 에틸렌 글리콜/소르비톨을 사용한 경우에 가장 높은 생존 가능성 및 가장 활발한 재증식이 관찰되었다.
[표 10]
실시예 8
생존에 대한 예비배양의 효과
타수스 세포를 세포 배양액으로부터 수확하고, 생체량을 3%의 농도로 1 또는 3 일 동안 실온에서 만니톨을 포함하는 증식 배지내에서 재현탁시켰다. 장입된 세포를 4℃에서 3 시간 동안 배양하고, 배양 배지내의 40/30 중량%의 에틸렌 글리콜/소르비톨을 포함하는 저온 투화 용액을 포함하는 4 ㎖ 극저온 바이알에 옮겼다. 바이알을 4℃에서 3 분 동안 배양하고, 액체 질소 침지로 냉동시켰다. 바이알에 포함된 세포를 10 분 이상 동안 액체 질소 내에서 유지시켰다.
동결보존된 세포를 해동시키고, 이의 생존 가능성을 FDA 및 트립판 블루 염색 처리로 측정하였다. 3 일 동안 만니톨로 예비배양시킨 세포는 만니톨을 포함하는 배치내에서 예비배양시키지 않은 세포보다 더 높은 해동후 이용가능성을 갖는 것으로 나타났다.
[표 11]
실시예 9
해동된 타수스 세포 생존 가능성애 대한 에틸렌 글리콜/소르비톨의 효과
타수스 종 세포주 KSIA의 6∼7 일간의 세포 현탁액을 3% 만니톨로 3일동안 실온에서 예비처리하였다. 4℃에서 3 시간 동안 플라스크를 배양시켜 장입된 세포를 저온 순화시켰다. 저온 순화된 세포를 4 ㎖ 극저온 바이알에 옮기고, 저온 투화 용액을 각각에 첨가하고, 혼합하였다. 4℃에서 3 분 동안 투화시킨 후, 세포를 액체 질소 침지로 냉동시켰다. 바이알을 적어도 10 분 동안 액체 질소내에 유지시켰다.
바이알을 액체 질소로부터 옮기고, 40℃ 수조에서 1∼2 분 동안 진탕시켜 동결보존된 세포를 해동시켰다. 해동후 생존 가능성을 FDA 염색 분석으로 측정하였다.
타수스 종 세포주 KSIA의 세포 현탁액을 평가하는 10회의 시험을 서로 다른 농도의 에틸렌 글리콜/소르비톨로 실시하였다. 결과를 하기 표 12에 제시한다 40/30 중량% 농도의 에틸렌 글리콜/소르비톨 함유 투화 용액내에서 냉동시킨 세포 현탁액은 다른 농도의 에틸렌 글리콜/소르비톨을 사용하여 투화시킨 세포에 비해서 해동후 생존 가능성(%)이 높을 뿐 아니라, 재증식이 활발한 것으로 나타났다.
[표 12]
실시예 10
196℃에서의 보관후 타수스 세포 생존에 대한 동결보존제의 효과
배양된 타수스 세포를 수확하고, 3% 만니톨을 포함하는 신선한 증식 배지를 3 일동안 재현탁하였다. 세포를 3 시간 동안 저온 순화시키고, 투화 용액을 포함하는 극저온 바이알에 옮겼다. 세포 현탁액을 액체 질소 침지로 냉동시켰다. 극저온 바이알을 40℃의 수조에서 1∼2 분 동안 진탕시켜 액체 질소 냉동된 세포를 해동시켰다. 동결보존제로서 에틸렌 글리콜로 냉동시킨 세포는 생존 가능성이 가장 높았다.
[표 13]
실시예 11
투화 용엑에 대한 생체량 함수로서의 타수스 세포의 생존 가능성
타수스 종 세포주 KSIA의 6∼7 일간의 세포 현탁액을 수확하고, 3% 만니톨을 포함하는 신선한 배지내에서 재현탁시키고, 3 일 동안 실온에서 배양시켰다. 4℃에서 3 시간 동안 저온 순화시킨 후, 배양 배지내의 40/30 중량%의 에틸렌 글리콜/소르비톨을 포함하는 4 ㎖의 극저온 바이알에 세포를 옮겼다. 바이알을 4℃에서 3 분 동안 배양시키고, 액체 질소 침지로 냉동시켰다. 바이알을 액체 질소내에서 적어도 10 분 동안 유지한 후 해동시켰다.
세포 생체량/투화 용액 함량이 167 mg/㎖인 경우 가장 높은 생존 가능성(%)을 나타냈다. 또한, 세포 생체량/투화 용액비가 143,200 및 250 mg/㎖인 경우 생존 가능성은 허용 가능하였다.
[표 14]
실시예 12
타수스 세포 생존 가능성에 대한 여러가지 방법 단계의 효과
가장 높은 해동후 생존 가능성(%)을 갖는 단계를 측정하기 위해 여러가지 방법의 단계를 평가하였다. 세포를 동결보존제의 존재와 부재하에, 삼투 예비처리의 존재와 부재하에, 저온 처리의 존재와 부재하에 및 투화의 존재와 부재하에 동결보존시켰다.
제1 시험에서, 6∼7 일된 타수스 세포 배양물을 동결보존제의 존재 또는 부재하에 냉동시켰다. 제2 시험에서, 세포를 40/30 중량%의 에틸렌 글리콜/소르비톨 투화 용액 처리로 냉동시켰다. 제3 시험에서, 세포를 투화시키고, 3% 만니톨 증식 배지내에서 3 일 동안의 배양을 포함하는 예비처리의 존재 및 부재하에 냉동시켰다. 제4 시험에서, 저온 순화의 존재 또는 부재하에 세포를 예비처리, 투화 및 냉동 시켰다.
각각의 시험에서, 해동 직후 생존 가능성 테스트를 실시하였다. 3%의 만니톨을 포함하는 증식 배지를 사용하여 3 일 동안 실온에서 세포를 예비배양시킨 후, 동결보존 전에 2∼4 시간 동안 저온 처리하여 생존 가능성(%)이 가장 높은 것으로 나타났다. 또한, 3%의 만니톨을 포함하는 배지내에서 3 일 동안 예비 배양시키고, 이를 사전의 저온 처리 없이 3 일 동안 증식 배지내에서 세포 예비배양으로 동결보존시키고, 24 시간 동안 만니톨을 포함하는 배지내에서 예비배양시킨 후, 동결보존 이전에 2∼4 시간 동안 저온 처리한 세포에서 생존 가능성이 적절한 것으로 관찰됐다.
[표 15]
본 명세서에 기재된 방법에 의해 실시된 지시된 단계를 이용하여 생존 가능성 테스트에 대해 세포를 다시 테스트하였다.
[표 16]
실시예 13
동결보존 전후의 세포 생존 가능성 및 증식
타수스 종 세포주 KSIA, KEIR, 647, 1224, 12-6, 12-14 및 12-20을 동결보존후 세포 생존 가능성 및 재증식을 측정하여 평가하였다.
각 세포주의 6∼7 일된 세포 현탁액을 수확하고, 3% 만니톨 함유 신선한 증식 배지내에서 생체량을 재현탁시켰다. 세포를 실온에서 3일동안 배양시킨 후, 장입된 세포 현탁액을 4℃에서 3 시간 동안 배양시켰다. 저온 순화된 세포를 40/30 중량%의 에틸렌 글리콜/소르비톨의 저온 투화 용액을 포함하는 4 ㎖의 극저온 바이알에 옮겼다. 투화 용액 및 세포를 약하게 혼합하고, 바이알을 40℃에서 3 분 동안 배양하였다. 그후, 세포 현탁액을 10 분 이상동안 액체 질소 침지에 의해 냉동시켰다.
냉동후, 액체 질소로부터의 냉동된 바이알을 40℃ 수조에 1∼2 분 동안 옮겨 세포를 해동시켰다. 해동후 세포 생존 가능성을 FDA 염색 분석에 의해 측정하였다. 세포를 저온 무균 1 M 소르비톨 배지로 5∼6 회 세척하고, 배지내의 신선한 1 M로 재현탁시켰다.
독성 동결보존제를 포함하지 않는 세포 현탁액을 무균 상태에서 뷰흐너 깔때기 및 Whatman 541 여과지를 사용하여 각각 별도로 여과하였다. 각각의 세포 현탁액에 대해, 세포를 포함하는 여과물을 0.5 M 소르비톨을 포함하는 반고형 증식 배지상에 적층시키고, 30 분 동안 실온에서 평형화시켰다. 세포를 포함하는 여과지를 0.1 M 소르비톨을 포함하는 고형 증식 배지에 옮기고, 24 시간 동안 배양하였다. 세포를 포함한 여과지를 소르비톨을 포함하지 않는 반고형 증식 배지에 옮기고, 실온에서 24 시간 동안 배양시켰다. 세포를 포함하는 여과지를 다시 소르비톨을 포함하지 않는 신선한 반고형 증식 배지에 옮기고, 실온에서 부가의 24 시간 동안 배양하였다. 반고형 영양 배지상에서의 캘러스 세포 증식은 약 2∼3 주에서 뚜렷하였다. 그후, 액체 증식 배지내의 세포 현탁을 캘러스로부터 개시시켰다.
하기에 제시되어 있는 표 17에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 세포 주는 허용가능한 해동후 생존 가능성 및 회복 증식을 나타냈다.
[표 17]
실시예 14
동결보존시의 타수스 세포의 증식 및 생성물 형성
타수스 세포주 KSIA의 6∼7 일된 세포 현탁액을 동결보존시키고, 해동시켰다. 세포를 증식 배지내의 3% 만니톨로 3 일 동안 예비배양시키고, 동결보존제로서 40/30 중량%의 에틸렌 글리콜/소르비톨을 사용하였다. 증식 배가 시간 및 생성물 형성을 냉동 및 해동 전후에 평가하였다. 수율은 현탁액 내에서의 5 일의 증식 후 모니터하였다. 세포내의 핵 DNA 함량을 유동 세포계수로 모니터하고, 동결보존전에 약 22.7 pg/핵 및 동결보존후에 22.9 pg/핵인 것으로 나타났다. 동결보존은 생성물의 생성에 영향을 미치지 않는다.
[표 18]
실시예 15
동결보존후의 타수스 세포의 증식 및 생성물 형성
타수스 세포주를 동결보존시킨 후, 해동시키고, 해동후 삼투 조절시켰다. 증식 및 생성물 형성을 액체 배양물내의 세포 현탁 형성후 측정하였다. 증식은 이들이 증식 배지내에서 형성된 후 수일동안 세포 현탁액의 평균 배가 시간을 반영한다. 생성물의 형성은 현탁액 내에서의 14 일의 증식후 측정하였다. 결과를 하기 표 19에 제시한다.
[표 19]
도 5는 타수스 종 세포주 1224로부터 20 일에 세포외 분획의 크로마토그래피를 예시하는 것으로서, (A)는 동결보존되지 않은 대조용 세포 현탁액을 나타내며, (B)는 동결보존, 냉동, 6 개월간의 저장, 해동 및 해동후 삼투 조절 이후 재생된 세포 현탁액을 나타낸다. 피이크 1은 10-데아세틸바카틴이며, 피이크 2는 9-디히드로바카틴 III이고, 피이크 3은 바카틴 III이며, 피이크 4는 9-디히드로-13-아세틸바카틴 III이며, 피이크 5는 탁솔이며; 피이크 6은 2-벤조일-2-데아세틸바카틴이며, 피이크 7은 2-벤조일-2-데아세틸-1-히드록시바카틴 I이다.
도 6은 타수스 종 세포주 203으로부터 20 일째의 세포외 분획의 크로마토그래피를 예시하는 것으로서, (A)는 동결보존되지 않은 대조용 세포 현탁액을 나타내며, (B)는 동결보존, 냉동, 3개월간의 저장, 해동 및 해동후 삼투 조절 이후 재생된 세포 현탁액을 나타낸다. 피이크 1은 10-데아세틸바카틴이며, 피이크 2는 9-디히드로바카틴 III이고, 피이크 3은 바카틴 III이며, 피이크 4는 9-디히드로-13-아세틸히드로바카틴 III이며, 피이크 5는 탁솔이며; 피이크 6은 2-벤조일-2-데아세틸바카틴이다. 도 5 및 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 생성물 형성 프로파일은 대조용 세포 현탁액 및 재생된 세포 현탁액과 거의 동일하다.
실시예 16
동결보존 및 동결보존되지 않은 세포의 유전적 안정성
단일 타수스 치넨시스 바. 마이러(Taxus chinensis var mairer) 나무로 부터 세포주를 얻었다. 얻은 세포주 중 하나를 배양, 1 년 동안 동결보존 및 해동시켰다. 초대 나무로부터의 세포 및 동결보존된 세포에 유전적 분석을 실시하여 동결보존이 세포의 유전적 안정성에 영향을 미치는지에 대해 결정하였다. 간략하게, 각 세포주로부터의 10 ㎍의 총 DNA를 제한 엔도뉴클레아제의 소화에 대해 4 배로 처리하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 크기 분별화(size fractionate)시켰다. 크기 분별화된 DNA를 니트로셀룰로스 고형 지지체에 옮기고, 방사 표지된 핵산 탐침, 제프리 33.6 미니 위성 탐침으로 하이브리드 처리하였다. 고가변 영역의 탐침은 도 7의 레인 1∼4에서의 4개의 상이한 나무의 DNA 로부터의 여러 가지 밴드 패턴이 나타났다. 반대로, 초기 분리물(레인 A), 1 년 동안 배양된 세포(레인 B) 및 1 년 동안 동결보존시킨 세포(레인 C)는 1 년 후 동일한 나무로부터 분리된 세포(레인 D 및 E)와 유전적으로 동일하다. 동결보존은 이러한 분석에 의해 검출되는 임의의 변이를 형성하지 않았다.
실시예 17
동결보존된 타수스 세포의 안정성
동결보존의 길이가 유전적 안정성에 어떠한 영향을 미치는지를 측정하기 위해, 타수스 세포주 1224를 1 시간∼6 개월 동안 냉동시키고, 이의 유전적 안정성에 대해 분석하였다. DNA를 동결보존시킨 세포로부터 증식, 해동 및 재형성된 생존 가능한 배양물로부터 추출하였다. 핵 리보좀 암호화 및 비-암호화 DNA를 포함하는 게놈의 3.1 Kb 다형성 영역을 폴리머라제 연쇄 반응으로 증폭시키고, 엔도뉴클레아제 DpnII으로 소화시켰다. 소화된 DNA를 겔 전기영동으로 크기별로 분류하고, 에티디움 브로마이드 염색후 가시화시켰다. 분석 결과를 도 8 에 제시한다. 초대 세포주 및 동결보존되지 않은 세포주를 각각 레인 C 및 D에서 분석하였다. 관련이 없는 나무로부터 형성된 두 개의 관련이 없는 세포주는 여러 가지 소화 패턴을 나타낸다. 반대로, 유전적 변이는 1 시간(레인 E), 1 일(레인 F), 1 주일(레인 G), 1 개월(레인 H) 또는 6 개월(레인 I 및 J)에 대해 동결보존된 세포내에서 검출되지 않았다. 이러한 동결보존된 세포 및 동결보존되지 않은 세포의 밴드 유형은 모두 동일하였다(레인 C∼J).
실시예 18
토마토 세포주의 동결보존
토마토 세포주의 성공적인 동결보존을 위해, 장입 및 투화 용액을 단계적 방식으로 점진적으로 첨가하여 삼투 충격을 감소시켰다. 장입 및 투화 용액은 30%(w/v) 글리세롤, 15%(w/v) 에틸렌 글리콜 및 15%(w/v) 디메틸설폭시드를 포함한다. 점진적으로 첨가하지 않으면 세포는 해동후 회복 기간 이후 빠르게 증식하지 않는다. 해동후 생존 가능성 및 회복 재증식의 효과를 시험하고, 그 결과를 하기 표 20에 제시한다.
[표 20]
세포를 3 일 동안 0.5 M 자당 또는 0.3 M 소르비톨, 65% 및 70% 각각을 포함하는 액체 영양 배지내에서 예비배양한 경우 생존 가능성(세포의 생존일수)이 가장 높았다. 이러한 예비 배양 조건은 세포 현탁액의 해동후 세포의 활발한 증식을 돕는다. 성공적인 동결보존은 예비배양 기간 및 삼투제의 농도에 따라 다르다. 예비배양 기간을 10 일로 연장시키고, 삼투제의 농도를 0.8 M 이상으로 증가시키면 세포의 생존 가능성은 증가되지 않는다. 예비배양시키지 않으면, 세포는 단일 단계로 또는 단계적 장입 및 투화 용액 첨가 방법으로 LN2 온도를 견디지 못한다.
예비배양된 세포를 열 충격 처리에 4 시간 이하 동안 노출시키고, 2가 양이온(CaCl2, MgCl2)을 첨가하여 생존 가능성 및 재증식 회복을 추가로 개선시켰다. 이러한 접근은 루피누스, 소포라, 코노스페르뭄, 니코티아나 및 솔라눔 종으로부터 유도된 세포주 뿐 아니라, 타수스 종, 예컨대, 타수스 치넨시스로부터 유도된 저항 세포주의 동결보존에 성공적으로 이용되어 왔다. 많은 경우에 있어서, 이러한 식물종의 세포주 재증식은 장입 및 투화 방법의 단일 단계로 6∼10 일에 비해 평판후 3∼4 일에 육안으로 확인된다. 에틸렌 작용 억제제 또는 에틸렌 생합성 억제제를 포함하는 액체 배지를 사용하여 세포 생체량의 해동후 세척은 회복된 세포주의 질을 추가로 개선시킨다. 90%의 생존 가능율이 달성되었으며, 세포 현탁액을 이러한 세포주로부터 형성한 후에 더 빠른 증식 속도가 관찰되었다.
실시예 19
에틸렌 억제제를 사용한 해동후 처리의 영향
극저온 바이알내의 세포 생체량을 20 초∼45 초 동안 40℃∼60℃로 조정된 수조 중에서 급속 가온에 의해 해동시켰다. 이 단계 직후, 극저온 바이알내의 액화 세포 생체량을 1∼2 mM 농도 범위의 삼투제(자당, 소르비톨 또는 만니톨) 및 2 μM∼20 μM 농도 범위의 에틸렌 억제제를 갖는 액체 영양 배지를 포함하는 무균 원심분리물에 옮겼다. 내용물을 약하게 혼합하고, 30 분 동안 실온에서 교반기(120 rpm으로 조절된 속도)상에서 배양시켰다. 이를 원심분리하고, 펠릿내의 세포를 블롯팅지(세포 또는 세포 생체량으로부터 과량의 수분을 제거하기 위해)상에 배치된 무균 여과지의 이중층으로 옮겼다. 세포 및 세포 생체량을 약 2 분 동안 배양하였다. 배양후, 농도가 0.8 M∼0.1 M의 자당(세포의 삼투 조절을 위해)으로 감소되는 삼투제를 포함하는 고형 영양 배지로 상기 세포를 포함하는 상부 여과지를 옮겼다. 각각의 단계에서, 여과지상의 세포를 30 분∼1 시간 동안 배양하고, 최종적으로 임의의 부가의 삼투제의 부재하에 보통의 고형 영양 배지로 옮겼다. 이 단계를 24 시간 동안 2 회 반복하였다. 암실에서 25℃에서 2∼3 주 동안 세포 생체량을 배양하고 1 주일에 1 회씩 옮겼다. 신생 세포 생체량의 증식이 증가되는 경우, 캘러스 세포를 여과지로부터 제거하고, 보통의 고형 영양 배지상에 직접 옮겼다. 충분한 증식이 발생한 후, 액체 배지내의 세포 현탁은 형성된 캘러스로부터 개시된다. 해동후 여러시간동안 세포의 생존 가능성을 관찰했으나, 가장 중요한 관찰이 기록되었다. 여과지상의 세포를 임의의 추가의 삼투제의 부재하에 보통의 고형 배지에 옮겼다. 세포 증식 회복율을 25℃ 암실내의 여과지상에서의 모든 생체량을 배양한 처음 3 주 동안 관찰하였다.
세포 또는 세포 생체량의 해동후와 관련된 대체 처리도 유용하다. 이 처리는 에틸렌 억제제의 부재하에 1∼2 M 농도 범위의 삼투제(자당, 소르비톨 또는 만니톨)을 포함하는 액체 배지로 세포를 신속하게 세척하는 것을 포함한다. 이는 2∼5 분 동안 삼투제를 포함하는 액체 영양 배지내에서 세포 생체량을 배양시키고, 100×g으로 1∼3 분 동안 원심분리하였다. 이 단계를 2 회 반복하여 투화 용액으로부터 독성 동결보존제를 제거한 후, 삼투제 및 에틸렌 억제제(농도 범위 2∼30 μM)를 포함하는 액체 영양 배지내에서 30 분 동안 세포 생체량을 배양시킨다.
에틸렌 억제제는 에틸렌 생성, 대사 또는 에틸렌 작용을 방해하는 물질이다. 이들은 에틸렌 생합성 길항제 및 에틸렌 작용 길항제로서 부가로 분류될 수 있다. 에틸렌 생합성 작용제는 에틸렌의 생합성 경로를 방해하는 화합물이다. 억제된 생합성 경로와 함께 효소의 예로는 ACC 신타제, ACC 옥시다제 및 에틸렌 옥시다제 등이 있다. 에틸렌 생합성 길항제의 예로는 α-아미노이소부티르산, 아세틸살리실산, 메티옥시비닐글리신, 아미노옥시아세트산 등이 있다. 에틸렌 작용 길항제의 예로는 은 함유 화합물, 은 착체 또는 은 이온, 이산화탄소, 1-메틸시클로프로펜, 2,5-노르보르나디엔, 트랜스-시클로옥텐, 시스부텐, 디아조-시클로펜타디엔 등이 있다. 적절한 은염의 예로는 질산은, 티오황산은, 인산은, 벤조산은, 황산은, 톨루엔설폰산의 은염, 염화은, 산화은, 아세트산은, 펜타플루오로프로피온산은, 시안산은, 락트산의 은염, 헥사플루오로프로피온산은, 헥사플로오로인산은, 아질산은 및 시트르산의 3은염 등이 있다. 다양한 은염에 의해 탁산 생합성을 증진시키는 예시적인 예는 표 1 및 2에 제시되어 있다.
실험 조건은 1.25 M의 삼투제 및 적절한 농도의 SLTS를 포함하는 영양 액체 배지로 구성된다. 삼투제는 자당, 소르비톨 또는 만니톨이다. 대조용 조건은 1.25 M의 삼투제는 포함하지만 SLTS는 포함하지 않는 영양 액체 배지로 구성된다. 결과를 하기 표 21에 제시하며, 이는 캘러스 세포 증식율 및 회복율(%)을 나타낸다.
[표 21]
에틸렌 억제제를 포함하는 액체 배지를 이용한 세포의 해동후 처리는 회복된 세포주의 생존 가능성 및 증식율을 일관되게 개선시켰다. 4 μM∼10 μM 농도 범위의 티오황산은이 회복된 세포주의 증식을 증진시키기 위한 2 μM 및 20 μM에서 보다 더 효과적이다. 사용된 세포주에 따라서, 생존 가능성은 90%에 달하였다 8 μM 및 10 μM의 SLTS를 포함하는 해동후 액체 배지는 훨씬 더 활발하게 세포 증식을 촉진하였으며, 세포 증식은 삼투제 및 에틸렌 억제제를 포함하지 않는 영양 배지상에서의 세포를 평판시킨 후 3∼4 일 후에 육안으로 확인된다.
본 발명의 기타 실시태양 및 용도는 본 명세서에 개시된 본 발명의 명세서 및 실시를 참고로 하여 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서에서 인용된 미국 특허는 참고로 인용한다. 명세서 및 실시예는 예시용으로 간주하며, 본 발명의 범위 및 범주는 특허 청구의 범위에 기재되어 있다.
관련출원 참조
본 출원은 1995년 6월 7일자로 출원된 미국 특허출원 제08/486,204호의 일계속 출원이다.
Claims (74)
- 나자식물세포(gymnosperm plant cell) 현탁배양액을 안정화제, 삼투제 또는 이들 모두로 약 1일 내지 약 10일 동안 예비 처리하는 단계;상기 식물 세포의 수분함량을 감소시키는 단계;상기 식물 세포를 동결용액 존재하에 위치시키는 단계; 및상기 식물 세포를 동결보존 온도에서 냉동시키는 단계를 포함하는 나자식물 세포 현탁배양액의 동결보존 방법.
- 제1항에 있어서, 수득된 식물 세포가 성장기 세포인 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제1항에 있어서,삼투제는 당, 당 유도체, 아미노산, 이미노산, 프롤린, 프롤린 유도체, 과당, 포도당, 맥아당, 만니톨, 소르비톨, 자당, 트레할로즈 및 이들의 혼합물 및 유도체로부터 선택되는 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제3항에 있어서, 삼투제가 약 0.1 M 내지 약 0.8 M 농도의 수용액으로 사용되는 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제1항에 있어서, 식물 세포를 약 1일 내지 약 7일 동안 안정화제 또는 삼투제로 처리하는 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제1항에 있어서, 안정화제가 산화방지제, 산소-라디칼 스캐빈저, 2가 양이온, 에틸렌 억제제 또는 이돌의 조합물인 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제1항에 있어서, 안정화제는 환원 글루타티온, 테트라메틸우레아, 베타인, 테트라메틸티오우레아,디메틸포름아미드, 머캅토프로피오닐 글리신, 머캅토에틸아민, 셀레노메티오닌, 티오우레아, 디머캅토프로판올, 티오황산나트륨, 티오황산은, 아스코르브산, 시스테인, 나트륨 디에틸디티오카르보메이트, 스퍼민, 스퍼미딘, 프로필갈레이트, MDL-71,897, 카다베린, 푸트레신, 디아미노프로판, 데옥시글루코스, 요산, 살리실산, 아미노트리아졸, 벤조산, 히드록실아민, 훼루르산, 세사몰, 레소르시놀 및 이의 조합물 및 유도체로 구성된 군에서 선택된 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제7항에 있어서, 에틸렌 억제제가 에틸렌 생합성 억제제 또는 에틸렌 작용억제제인 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제8항에 있어서, 에틸렌 작용억제제는 은염, 벤질이소티오시아네이트, 8-히드록시퀴놀린 황산염, 8-히드록시퀴놀린 시트레이트, 2,5-노르보르나디엔, N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드로퀴놀린, 트랜스-시클로옥텐, 7-브로모-5-클로로-8-히드록시퀴놀린, 시스-프로페닐포스폰산, 디아조시클로펜타디엔, 메틸시클로프로판, 2-메틸시클로프로판 카르복실산, 메틸시클로프로판 카르복실레이트, 시클로옥타디엔, 시클로옥토딘, 시클로프로판, 티오황산은, 질산은, 염화은, 아세트산은, 인산은, 황산은, 벤조산은, 산화은, 시트르산3은염, 아질산은, 시안산은, 락트산 은염, 펜타플루오로프로피온산은, 헥사플루오로인산은, 톨루엔설폰산의 은염 및, 이들의 배합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제6항에 있어서, 에틸렌 생합성 억제제는 리조비톡신, 메톡실아민 염산, 히드록실아민 유사체, α-카날린, DNP(2,4-디니트로페놀), SDS(라우릴황산나트륨), Triton X-100, Tween 20, 스퍼민, 스퍼미딘, ACC 유사체, α-아미노이소부티르산, 벤조산, 벤조산 유도체, 살리실산, 살리실산 유도체, 세사몰, 카다바린, AMO-1618, BHA(부틸화 히드록시아니솔), 브라시노스테로이드, p-클로로머큐리벤조에이트, N-에틸말레이미드, 요오도아세테이트, 염화코발트 및 기타 염, 비피리딜, 아미노(옥시아세트)산, 염화수은 및 기타 염, 살리신, 염화니켈 및 기타 염, 카테콜, n-프로필 갈레이트, 히드로퀴논, 페롤산, 알라, 페닐에틸아민, 살리실 알콜, 인도메타신, 플로로글루시놀, 1,2-디아미노프로판, 데스페리옥사민, 1,3-디아미노프로판 및 이들의 배합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제11항에 있어서, 안정화제는 약 1μM 내지 약 1mM 농도의 수용액으로 사용되는 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제6항에 있어서, 안정화제는 약 1mM 내지 약 30mM 농도로 투여되는 2가 양이온인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제12항에 있어서, 2가 양이온은 마그네슘, 망간 및 칼슘으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제1항에 있어서, 식물세포는 냉동시키기 전에 장입제(loading agent)와 배양되는 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제14 항에 있어서, 장입제와의 배양이 안정화제 또는 삼투제와의 배양에 의한 예비처리 후에 진행되는 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제14항에 있어서, 장입제가 DMSO, 프롤린, 에틸렌글리콜, 과당, 자당, 포도당, 트레할로스, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 삼투제 또는 이들의 배합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제14항에 있어서, 장입제와의 배양이 장입제를 용액상태로 연속적 또는 단계적으로 첨가하여 진행되는 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제 14항에 있어서, 장입제와의 배양이 장입제를 시간간격을 갖고 용액 상태로 단계적으로 첨가하여 진행되는 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제18항에 있어서, 장입제의 단계적인 첨가가 약 5분 내지 약 2시간 범위의 시간간격을 갖고 첨가되는 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제14항에 있어서, 식물 세포를 장입제 존재하에서 약 30분 내지 약 4시간 동안 배양시키는 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제14항에 있어서, 장입제와의 배양을 실온에서 진행시키는 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제1항에 있어서, 식물 세포가 배양온도 이하의 온도에서 순화(acclimation)되는 것인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 제22항에 있어서, 순화온도가 약 O℃ 이상 약 20℃ 미만인 나자식물 세포 현탁액 조성물의 동결보존 방법.
- 식물세포를 안정화제, 삼투제 또는 이들 모두로 약 1일 내지 약 10일 동안 예비 처리하는 단계;식물 세포의 수분함량을 감소시키는 단계;상기 식물 세포를 동결용액 존재하에 위치시키는 단계; 및상기 식물 세포를 동결보존 온도에서 냉동시키는 단계를 포함하며,식물 세포의 수분 함량을 투화(vitrification)에 의해 감소시키는 것인 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제24항에 있어서, 투화를 예비처리단계, 장입단계 및 온도순화단계 중 하나 이상의 단계를 수행한 후에 진행시키는 것인 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제24항에 있어서, 투화를 하나 이상의 투화제를 포함하는 투화용액으로 식물 세포를 배양함으로써 진행시키는 것인 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제26항에 있어서, 투화용액은 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 부탄디올, 포름아미드, 프로판디올 및 이들 물질의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택된 투화제를 포함하는 것인 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제27항에 있어서, 투화용액은 추가로 에틸렌글리콜/소르비톨을 포함하는 것인 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제27항에 있어서, 투화용액은 추가로 하나 이상의 2가 양이온을 포함하는 것인 식물 세포의 동결조존 방법.
- 제29항에 있어서, 2가 양이온이 칼슘, 마그네슘, 망간 및 이들의 배합물로부터 선택되는 것인 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제24항에 있어서, 투화가 식물 세포로부터 90 중량%까지의 수분을 제거하는 것인 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제26항에 있어서, 투화용액과 상기 식물 세포의 배양이 약 1℃ 내지 약 8℃ 온도에서 진행되는 것인 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제26항에 있어서, 투화용액이 약 25 중량% 내지 약 60 중량%의 투화제를 포함하는 것인 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 겉씨 식물은 아비에스속(Abies), 시프레수스속(Cypressus), 징코속(Ginkgo), 쥬니페루스속(Juniperus), 피세아속(Picea), 피누스속(Pinus), 슈도추가속(Pseudotsuga), 세쿠오이아속(Sequoia), 타수스속(Taxus), 추가속(Tsuga) 또는 자미아속(Zamia)의 종인 것인 나자식물세포 현탁배양액의 동결보존 방법.
- 제34항에 있어서. 상기 타수스속의 종은 티. 바카타(T. baccata), 티. 브레비폴리아(T. brevifolia), 티. 카나텐시스(T. canadensis), 티. 치넨시스(T. chinensis), 티. 쿠스퍼다타(T. cuspidata), 티. 플로리다나(T. floridana), 티. 글로보사(T. globosa), 티. 메디아(T. media), 티. 누시페라(T. nucifera) 또는 티. 월리키아나(T. wallichiana)인 것인 나자식물세포 현탁배양액의 동결보존 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 식물 세포는 신생 침엽, 수피, 잎, 줄기, 뿌리, 근경, 캘러스 세포, 원형질체, 세포 현탁액, 분열 조직, 종자 또는 배로부터 얻는 것인 나자식물세포 현탁배양액의 동결보존 방법.
- 제1항에 있어서, 냉동단계가 식물세포를 액체 질소로 급냉 시키는 것을 포함하는 것인 나자식물세포 현탁배양액의 동결보존 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 동결보존 온도는 약 -70℃ 미만인 것인 나자식물세포 현탁배양액의 동결보존 방법.
- 제26항에 있어서, 투화용액과 상기 식물 세포의 배양이 투화용액에서의 투화제의 농도를 점진적으로 증가시켜서 진행되는 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제26항에 있어서, 투화용액과 상기 식물 세포의 배양을 투화제를 시간간격을 갖고 단계적으로 첨가해서 진행시키는 것인 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제40항에 있어서, 투화제의 단계적인 첨가가 약 3분 내지 약 2시간 범위의 시간간격을 갖고 첨가되는 것인 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제26항에 있어서, 식물 세포를 하나 이상의 투화제를 포함하는 투화 용액으로 약 3분 내지 약 2시간 동안 배양하는 것인 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제1항에 따른 방법에 의해 동결 보존된 생존 가능한 식물 세포.
- 제43항에 있어서, 상기 세포는 동결보존에 의해 유전자적으로 또는 표현형적으로 크게 변형되지 않은 것인 생존 가능한 식물 세포.
- 제43항 또는 제44항에 있어서, 식물세포가 타수스(Taxus) 종의 것인 생존 가능한 식물 세포.
- 제45항에 있어서, 상기 타수스 세포가 디페르페노이드를 형질 발현시킨 것인 생존 가능한 식물 세포.
- 제46항에 있어서, 상기 디페르페노이드가 탁솔인 것인 생존 가능한 식물 세포.
- 제1항의 방법에 따라 동결 보존된 생존 가능한 식물 세포의 배아 세포 뱅크(bank).
- 동결 보존된 식물 세포를 냉동 온도 이상의 온도로 해동시키는 단계; 와생존 가능한 식물 세포를 회복하는 단계를 포함하는 제1항에 따라 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제49항에 있어서, 식물 세포를 약 40℃ 온도의 물 중탕에 함침시켜 해동시키는 것인 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제 49항에 있어서, 상기 해동된 식물 세포를 점진적으로 낮은 농도로는 삼투제를 포함하는 액체중식배지의 희석액으로 세척하는 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제51항에 있어서, 생존 가능한 식물 세포를 회복하기 전에 2가 양이온 과 같은 안정화제를 포함하는 성장배지 내에서 해동된 식물 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제50항 내지 제51항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생존 가능한 식물 세포를 회복하기 전에 현탁액 내에서 해동된 식물 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 현탁액 내에서의 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제51항에 있어서, 배양을 반고형 성장배지에서 수행하는 것인 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제51항에 있어서, 배양을 액체성장배지에서 수행하는 것인 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제50항에 있어서, 삼투제가 설탕, 아미노산 또는 이들의 혼합물인 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제56항에 있어서, 삼투제는 당, 당 유도체, 아미노산, 이미노산, 프롤린, 프롤린 유도체, 과당, 포도당, 맥아당, 만니톨, 소르비톨, 자당, 트레할로즈 및 이들의 혼합물 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 것인 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제50항에 있어서, 액체성장배지가 추가로 안정화제를 포함하는 것인 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제58항에 있어서, 안정화제는 산화방지제, 산소 라디칼 스캐빈저, 에틸렌 억제제, 2가 양이온 또는 이의 혼합물인 것인 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제59항에 있어서, 2가 양이온이 칼슘, 마그네슘 또는 망간인 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제59항에 있어서, 안정화제는 환원 글루타티온, 테트라메틸우레아, 베타인, 테트라메틸티오우레아, 디메틸포름아미드, 머캅토프로피오닐 글리신, 머캄토에틸아민, 셀레노메티오닌, 티오우레아, 디머캅토프로판올, 티오황산나트륨, 티오황산은, 아스코르브산, 시스테인, 나트륨 디에틸디티오카르보메이트, 스퍼민, 스퍼미딘, 프로필갈레이트, MDL-71,897, 카다베린, 푸트레신, 디아미노프로판, 데옥시글루코스, 요산, 살리실산, 아미노트리아졸, 벤조산, 히드록실아민, 훼루르산, 세사몰, 레소르시놀 및 이의 조합물 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 것인 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제59항에 있어서, 에틸렌 억제제가 에틸렌 생합성 억제제 또는 에틸렌 작용억제제인 것인 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제62항에 있어서, 에틸렌 작용억제제는 은염, 벤질이소티오시아네이트, 8-히드록시퀴놀린 황산염, 8-히드록시퀴놀린 시트레이트, 2,5-노르보르나디엔, N-에톡시카르보닐-에톡시-1,2-디히드로퀴놀린, 트랜스-시클로옥텐, 7-브로모-클로로-8-히드록시퀴놀린, 시스-프로페닐포스폰산, 디아조시클로펜타디엔, 메틸시클로프로판, 2-메틸시클로프로판 카르복실산, 메틸시클로프로판 카르복실레이트, 시클로옥타디엔, 시클로옥토딘, 시클로프로판, 티오황산은, 질산은, 염화은, 아세트산은, 인산은, 황산은, 벤조산은, 산화은, 시트르산 3은염, 아질산은, 시안산은, 락트산 은염, 펜타플루오로프로피온산은, 헥사플루오로인산은, 톨루엔설폰산의 은염 및 이들의 배합물로 구성된 군으로 부터 선택된 것인 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제62항에 있어서, 에틸렌 생합성 억제제는 리조비톡신, 메톡실아민 염산, 히드록실아민 유사체, α-카날린, DMP(2,4-디니트로페놀), SDS(라우릴황산나트륨), Triton X-100, Tween 20, 스퍼민, 스퍼미딘, ACC 유사체, α-아미노이소부티르산, 벤조산, 벤조산 유도체, 살리실산, 살리실산 유도체, 세사몰, 카다바린, AMO-1618, BHA(부틸화 히드록시아니솔), 브라시노스테로이드, p-클로로머큐리벤조에이트, N-에틸말레이미드, 요오도아세테이트, 염화코발트 및 기타 염, 비피리딜, 아미노(옥시아세트)산, 염화수은 및 기타 염, 살리신, 염화니켈 및 기타 염, 카테콜, n-프로필 갈레이트, 히드로퀴논, 페룰산, 알라, 페닐에틸아민, 살리실 알콜, 인도메타신, 플로로글루시놀, 1,2-디아미노프로판, 데스페리옥사민, 1,3-디아미노프로판 및 이들의 배합물로 구성된 군으로부터 선택된 것인 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 회복된 생존 가능한 식물 세포는 디페르페노이드를 형질 발현시키고, 디테르페노이드 형질발현은 동결보존에 의해 크게 변형되지 않는 것인 동결 보존된 식물 세포의 회복 방법.
- 제1항의 방법에 따라 식물 세포를 동결 보존하는 단계;동결 보존된 식물 세포를 냉동온도 이상의 온도로 해동하고, 또 생존 가능한 식물 세포로 회복하는 단계;회복된 생존 가능한 식물 세포로부터 세포 또는 식물을 번식시키는 단계; 및상기 번식된 물질에 의하여 생성된 식물 생성물을 수집하는 단계를 포함하는 식물 생성물의 생성방법.
- 제1항에 있어서, 세포를 냉동시키기 전에 열 처리해서 세포막을 안정화시키는 단계를 추가로 포함하는 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제1항에 있어서, 식물 세포으 수분 함량이 진공 증발에 의해 감소되는 식물 세포으 동결보존 방법.
- 제68항에 있어서, 식물 세포가 저온 순화온도로 유지되는 것인 식물 세포의 동결보존 방법.
- 제49항의 방법 의해 회복된 생존 가능한 식물 세포.
- 제70항에 있어서, 타수스 종인 것인 식물세포.
- 제49항의 방법 의해 회복된 생존 가능한 식물 세포의 현탁액.
- 제72항에 있어서, 회복된 식물세포으 5% 이상이 생존 가능한 식물세포의 현탁액.
- 타수스 식물세포의 수분 함량을 투화로 감소시키는 단계;상기 식물세포를 동결보존 온도에서 냉동시키는 단계를 포함하는 타수스 식물세포의 동결보존 방법.
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