CN111771876A - 一种滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法，涉及低温保存技术领域，本发明包括以下步骤：以低温处理后的滁菊优良株系组培再生丛生芽茎尖为外植体，接种于预培养基中进行高渗处理后，转至加载液中，经玻璃化溶液处理后转入装有冷冻保护剂的冻存管中，投入液氮中进行超低温保存。本发明的有益效果在于：节省开支，种子保存所需物理空间小，保存期间所需的财力物力较少；再生率高，获得的超低温保存再生苗可通过诱导在短时间内获得大量不定芽。
Description
技术领域
本发明涉及低温保存技术领域，具体涉及一种滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法。
背景技术
滁菊(Chrysanthemum morifolium'Chuju')是菊科菊属多年生的草本植物，滁菊主要产于滁州，是菊花中花瓣最为紧密的一种。滁菊偏肝阳，常用于治疗肝阳上亢所致的头晕目眩等症。然而到目前为止，滁菊种植资源保存方式依然为扦插和分枝的无性繁殖方式，同时菊花属于异花授粉植物，在种植过程中容易产生种质不纯的现象，且可能受到自然灾害的影响导致种植灭绝。
超低温保存是目前认为最为经济安全的种质资源保存方式，其中，玻璃化超低温保存是一种利用PVS2(MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4mol/L蔗糖)作为玻璃化脱水试剂的技术，适用于滁菊进行种质保存。基本原理为将保存材料缓慢脱水后，置于冷冻保护剂中投入液氮终止其生理活动，在需要材料再生时，将其取出解冻，并于恢复培养基中进行恢复培养。该方法是唯一一种不需要联系继代的保存方式，且目前已经应用到多种植物中，包括杭菊(Chrysanthemum morifolium‘Hangju’)，马铃薯(Solanum tuberosumL.)，兰科(Orchidaceae)，人参(Pana ginseng C.A.Mey)、西洋(P.quiciefoliusLinn.)等五加科人参属植物，如公开号为CN105519522A的专利公开一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，对乌桕茎尖进行超低温保存。在滁菊的种质资源保存方面，还尚未见有关超低温保存的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种适用于滁菊茎尖的超低温保存方法。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
一种滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法，包括以下步骤：以低温处理后的滁菊优良株系组培再生丛生芽茎尖为外植体，接种于预培养基中进行高渗处理后，转至加载液中，经玻璃化溶液处理后转入装有冷冻保护剂的冻存管中，投入液氮中进行超低温保存。
有益效果：本发明对滁菊进行种质资源保存操作简便、效率高，恢复培养四周后，成活率即正常发育的再生芽比例达到58％。
当滁菊茎尖不经过加载液处理时，处理后的滁菊茎尖无法恢复再生。
优选地，所述外植体的获取方法包括以下步骤：将滁菊优良株系组培获得的再生丛生芽放置于4℃低温锻炼1-7d，然后以大小为1.0-3.0mm的茎尖为外植体。
优选地，将滁菊优良株系组培获得的再生丛生芽放置于4℃低温环境中培养4天。
有益效果：当预培养基的组成为：MS+0.4mol/L蔗糖+6.8g/L琼脂时，超低温保存的滁菊茎尖的再生率最高。
优选地，所述预培养基包括预培养基a、预培养基b或预培养基c，所述预培养基a的组成包括：MS+0.4mol/L蔗糖+6.8g/L琼脂，pH为5.8；所述预培养基b的组成包括：MS+0.2mol/L葡萄糖+0.2mol/L甘油+6.8g/L琼脂，pH为5.8；所述预培养基c的组成包括：MS+0.3mol/L葡萄糖+0.3mol/L甘油+6.8g/L琼脂，pH为5.8。
优选地，所述预培养基的组分为：MS+0.4mol/L蔗糖+6.8g/L琼脂。
有益效果：当预培养基的组成为：MS+0.4mol/L蔗糖+6.8g/L琼脂时，超低温保存的滁菊茎尖的再生率最高。
优选地，所述外植体在预培养基中的培养条件为黑暗培养1-4d。
优选地，所述加载液的组分包括MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L甘油+50-80％PVS2，所述加载液的处理时间为10-30min，所述PVS2的成分包括MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4mol/L蔗糖。
有益效果：滁菊茎尖在投入液氮前，需要将其置于低温环境中，以适应低温胁迫，由于PVS2中含有二甲亚砜，需要在0℃环境下进行处理，所以加载过程以及玻璃化过程可以都在冰上进行，不需要设置其他低温环境，提高了保存效率，降低了实验难度。
优选地，所述加载液的组分为MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L甘油+60％PVS2，所述加载液的处理时间为20min。
有益效果：当加载液中添加60％PVS2处理20min时超低温保存再生效率最高，当添加40％PVS2或80％PVS2时，滁菊茎尖的再生率低于加载液组分为MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L甘油时的再生率。
优选地，所述经玻璃化溶液处理包括以下步骤：将加载液处理后的茎尖转接于玻璃化溶液PVS2中处理0-90min，所述PVS2的成分包括MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4mol/L蔗糖。
优选地，将加载液处理后的茎尖转接于玻璃化溶液PVS2中处理60min。
有益效果：当PVS2的处理时间为60min时，滁菊茎尖的超低温保存再生效率最高，随着处理时间的减少或延长，滁菊茎尖的再生率降低。
优选地，将玻璃化处理后的茎尖转接于加入冷冻保护剂2ml的冻存管中，所述冷冻保护剂为PVS2溶液，所述PVS2的成分包括MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4mol/L蔗糖。
优选地，将超低温保存后的滁菊茎尖用热水浴解冻，然后采用卸载液处理，在恢复培养基中进行暗处理培养，最后转入光照下进行再生培养。
优选地，所述热水浴解冻包括以下步骤：将超低温保存后的滁菊茎尖置于35-45℃水浴中解冻1-3min；所述卸载液组分包括MS+1.2mol/L蔗糖，卸载液处理时间为10-30min。
优选地，所述卸载液处理时间为15min。
有益效果：当卸载液处理时间为15min时，滁菊茎尖的超低温保存再生效率最高，随着处理时间的延长，再生效率降低。
优选地，所述恢复培养基的组分包括：MS+0.01-1.0mg/L 6-BA+0.01-1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+6.8g/L琼脂，pH＝5.8；暗处理培养时间为1-5d，然后转入光照强度为40μmolm- 2s-2，光照时间为14h的条件下进行再生培养。
本发明的优点在于：
(1)超低温保存方法是种质资源保存时效最长的方法，是传统种子库保存效率的175倍；
(2)节省开支，种子保存所需物理空间小，保存期间所需的财力物力较少；再生率高，获得的超低温保存再生苗繁殖速度快：超低温保存获得的5个不定芽在含有0.5mg/LNAA的MS固体培养基中，培养25天后生芽率为100％，且获得的新芽总数可达到23个；
(3)优化了实验试剂，选用了含有60％PVS2的溶液作为加载液，提高了保存效率，降低实验难度。
附图说明
图1为本发明实施例1中茎尖在恢复培养基中恢复4天后获得的再生芽；
图2为本发明实施例1中生长10天的再生芽；
图3为本发明实施例1中生长30天的再生芽；
图4为本发明实施例1中再生芽经过离体扩繁后获得的不定芽；
图5为本发明实施例1中诱导生根后的超低温保存再生植株；
图6为本发明实施例2中低温锻炼时间对滁菊茎尖超低温保存再生率影响的测定结果图；
图7为本发明实施例3中预培养基组分对滁菊茎尖超低温保存再生率影响的测定结果图；
图8为本发明实施例4中加载液组分对滁菊茎尖超低温保存再生率影响的测定结果图；
图9为本发明实施例6中加载液处理时间对滁菊茎尖超低温保存再生率影响的测定结果图；
图10为本发明实施例7中卸载液处理时间对滁菊茎尖超低温保存再生率影响的测定结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法
(1)低温锻炼：将滁菊优良株系组培获得的再生丛生芽置于4℃中低温锻炼3天；其中再生丛生芽采用公开号为CN105706933A的专利中的方法获得；
(2)茎尖剥离：在无菌条件下，将步骤(1)中继代30天的滁菊不定芽上剥取1.0-3.0mm的茎尖作为保存材料。
(3)预培养：将剥取的茎尖在含有0.4mol/L蔗糖+6.8g/L琼脂的MS培养基中，于4℃暗处理3天。
(4)加载液处理缓慢脱水：将预培养结束的茎尖于含有60％PVS2溶液的加载液中(其中PVS2溶液为MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4mol/L蔗糖)于0℃脱水20min。加载液是指MS液体培养基中含有0.4mol/L蔗糖+2mol/L甘油+60％PVS2。
(5)玻璃化脱水处理：将加载处理的茎尖置于玻璃化溶液PVS2中玻璃化处理60min，已彻底脱去水分。
(6)将玻璃化处理的茎尖转接于装有冷冻保护剂PVS2的冻存管中中，投入液氮中保存1h以上。
(7)液氮中取出于40℃快速解冻2min。
(8)卸载液处理：将解冻后得到茎尖置于卸载液(MS+1.2mol/L蔗糖)中进行洗涤，以逐步恢复其生理活性，洗涤时间为15min。
(9)茎尖恢复再生
茎尖卸载完成后，转接于含有(MS+6-BA0.1mg/L+IBA0.1mg/L+6.8g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH为5.8)的恢复培养基中，黑暗条件下恢复培养3d，后转至光照强度为40μmolm-2s-2，光照时间为14h的条件下进行植株再生，图1-图5分别为滁菊茎尖不同恢复培养阶段的图片。
实施例2
测定低温锻炼时间对滁菊茎尖超低温保存再生率的影响
将滁菊不定芽于4℃中分别低温锻炼0、1、2、3、4、5、6、7天，其余步骤参照实施例1，对经过不同低温锻炼后超低温保存的滁菊茎尖的成活率进行测定，恢复培养四周后，统计发育正常的再生芽的比例即成活率。
测定结果：如图6所示，结果表明低温锻炼4天超低温保存再生率最高，滁菊茎尖再生率呈现先升高后下降的趋势。
实施例3
测定预培养基组分对滁菊茎尖超低温保存再生率的影响
选取预培养基a、预培养基b或预培养基c分别进行预培养，预培养基a的组成为：MS+0.4mol/L蔗糖+6.8g/L琼脂，pH为5.8；预培养基b的组成为：MS+0.2mol/L葡萄糖+0.2mol/L甘油+6.8g/L琼脂，pH为5.8；预培养基c的组成为：MS+0.3mol/L葡萄糖+0.3mol/L甘油+6.8g/L琼脂，pH为5.8。其余步骤参照实施例1，对经过不同预培养基培养后超低温保存的滁菊茎尖的再生率进行测定，测定方法与实施例2中相同。
测定结果：如图7所示，结果表明当预培养基的组成为：MS+0.4mol/L蔗糖+6.8g/L琼脂时，超低温保存的滁菊茎尖的再生率最高。
实施例4
测定加载液组分对滁菊茎尖超低温保存再生率的影响
选取加载液的组分分别为MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L甘油、MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L甘油+50％PVS2、MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L甘油+60％PVS2、MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L甘油+80％PVS2，进行脱水处理，其余步骤参照实施例1，对经过不同加载液处理后超低温保存的滁菊茎尖的再生率进行测定，测定方法与实施例2中相同。
测定结果：如图8所示，当加载液中添加60％PVS2时超低温保存再生效率最高，当添加40％PVS2或80％PVS2时，滁菊茎尖的再生率低于加载液组分为MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L甘油时的再生率。
实施例5
测定加载液处理时间对滁菊茎尖超低温保存再生率的影响
采用实施例3中的加载液，分别处理10、15、20、30min，其余步骤参照实施例1，对加载液处理时间不同的超低温保存的滁菊茎尖的再生率进行测定，测定方法与实施例2中相同。
测定结果：如图8所示，当加载液处理20min时，滁菊茎尖超低温保存再生效率最高，随着加载液处理时间的延长，滁菊茎尖的再生率降低。
实施例6
测定玻璃化试剂脱水时间对超低温保存再生率的影响
玻璃化试剂PVS2的组分为MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4mol/L蔗糖，选取PVS2的处理时间为0，15、30、60、90min，其余步骤参考实施例1，对经过不同脱水时间后超低温保存的滁菊茎尖的再生率进行测定，测定方法与实施例2中相同。
测定结果：如图9所示，结果表明当PVS2的处理时间为60min时，滁菊茎尖的超低温保存再生效率最高，随着处理时间的减少或延长，滁菊茎尖的再生率降低。
实施例7
测定卸载液处理时间对超低温保存再生率的影响
卸载液分别处理10、15、20、30min，其余步骤参照实施例1，对经过不同卸载液处理时间后超低温保存的滁菊茎尖的再生率进行测定，测定方法与实施例2中相同。
测定结果：因超低温保存是一个连续过程，每个步骤的参数优化都以上一步得到的结果为基础，因此卸载处理作为保存过程的最后一步，前面的步骤所采用的处理方式都是最优条件。
如图10所示，结果表明当卸载液处理时间为15min时，滁菊茎尖的超低温保存再生效率最高，随着处理时间的延长，再生效率降低。
对比例1
本对比例与实施例1的区别之处在于：不包括加载液处理缓慢脱水步骤。
测定结果：若不进行加载液处理缓慢脱水步骤，处理后的滁菊茎尖无法恢复再生。
对比例2
本对比例采用公开号为CN 101401568A中的方法，即加载液为MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L甘油对滁菊茎尖进行超低温保存。
测定结果：如图8所示，采用含有MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L+60％的PVS2的溶液作为加载液，与只含有MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L甘油的加载液相比，其超低温保存再生率高7％左右。
本发明对低温锻炼时间、预培养基种类以及预培养时间、加载液种类以及加载时间、玻璃化脱水时间、以及卸载时间的参数优化，所得最优参数如实施例中所述，改变任何一个最优参数都不能得到滁菊的最佳超低温保存效果，具体再生率差异在图6-10中体现。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于：包括以下步骤：以低温处理后的滁菊优良株系组培再生丛生芽茎尖为外植体，接种于预培养基中进行高渗处理后，转至加载液中，经玻璃化溶液处理后转入装有冷冻保护剂的冻存管中，投入液氮中进行超低温保存。
2.根据权利要求1所述的滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于：所述外植体的获取方法包括以下步骤：将滁菊优良株系组培获得的再生丛生芽放置于4℃低温锻炼1-7d，然后以大小为1.0-3.0mm的茎尖为外植体。
3.根据权利要求1所述的滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于：所述预培养基包括预培养基a、预培养基b或预培养基c，所述预培养基a的组成包括：MS+0.4mol/L蔗糖+6.8g/L琼脂，pH为5.8；所述预培养基b的组成包括：MS+0.2mol/L葡萄糖+0.2mol/L甘油+6.8g/L琼脂，pH为5.8；所述预培养基c的组成包括：MS+0.3mol/L葡萄糖+0.3mol/L甘油+6.8g/L琼脂，pH为5.8。
4.根据权利要求3所述的滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于：所述外植体在预培养基中的培养条件为黑暗培养1-4d。
5.根据权利要求1所述的滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于：所述加载液的组分包括MS+0.4mol/L蔗糖+2mol/L甘油+50-80％PVS2，所述PVS2的成分包括MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4mol/L蔗糖。
6.根据权利要求1所述的滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于：所述经玻璃化溶液处理包括以下步骤：将加载液处理后的茎尖转接于玻璃化溶液PVS2中处理0-90min，所述PVS2的成分包括MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4mol/L蔗糖。
7.根据权利要求1所述的滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于：将玻璃化处理后的茎尖转接于加入冷冻保护剂2ml的冻存管中，所述冷冻保护剂为PVS2溶液，所述PVS2的成分包括MS+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4mol/L蔗糖。
8.根据权利要求1所述的滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于：将超低温保存后的滁菊茎尖用热水浴解冻，然后采用卸载液处理，在恢复培养基中进行暗处理培养，最后转入光照下进行再生培养。
9.根据权利要求8所述的滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于：所述热水浴解冻包括以下步骤：将超低温保存后的滁菊茎尖置于35-45℃水浴中解冻1-3min；所述卸载液组分包括MS+1.2mol/L蔗糖，卸载液处理时间为10-30min。
10.根据权利要求1所述的滁菊茎尖玻璃化超低温保存的方法，其特征在于：所述恢复培养基的组分包括：MS+0.01～1.0mg/L 6-BA+0.01～1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+6.8g/L琼脂，pH＝5.8；暗处理培养时间为1-5d，然后转入光照强度为40μmolm-2s-2，光照时间为14h的条件下进行再生培养。
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