CN111972402A - 一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的玻璃化超低温保存及解冻方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的保存及解冻方法，经过预培养、装载液处理、玻璃化脱水和液氮保存，对玛瑙红樱桃胚性愈伤组织进行长期冷冻保存，然后再经过水浴解冻并洗涤后恢复培养，培育玛瑙红樱桃植株，建立玛瑙红樱桃种质资源的超低温保存体系，生长成活率（61.5%）远高于自然播种萌芽率（5%‑20%），并且解冻后恢复培养生长的玛瑙红樱桃种质资源遗传稳定性好，解决玛瑙红樱桃胚性愈伤组织长时间连续继代增殖培养引起细胞胚性丧失或胚胎败育的问题，为玛瑙红樱桃产业发展提供保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种玛瑙红樱桃，尤其涉及一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的玻璃化超低温保存方法，属于超低温保存方法技术领域。
背景技术
玛瑙红樱桃(P.pseudocerasusLindl‘Manaohong’)是在贵州省纳雍县发现的本地酸樱桃变异新品种，属于蔷薇科、樱属。2011年12月通过贵州省农作物品种审定委员会审定(陈祖瑶，2013)。该品种丰产优质、果肉香甜、耐贮性好，目前在贵州省大面积栽培，并推广到周边省区。在樱桃的栽培中，由于经过长期的人工定向选择，导致许多栽培品种特别是早熟品种的种子生活力弱、发育不充实，自然播种后萌芽率低，得到杂种实生苗比较困难，许多早熟品种的发芽率仅有5％-20％，胚败育问题严重，因此选择利用玛瑙红樱桃的胚性愈伤组织进行增殖培育。但在近几年的试验中发现，玛瑙红樱桃胚性愈伤组织长时间连续继代在含有高浓度2,4-D、6-BA的增殖培养基上会引起细胞胚性丧失或胚胎败育等问题，重新启动胚性愈伤组织诱导不仅费时、费力，而且可能会引起体细胞变异。因此，研究建立玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存(cryopreservation)技术体系是实现其长期离体保存的最佳途径。
超低温保存是指将植物材料在-80℃甚至更低的温度下进行中长期离体保存的方法，因为通常是将植物材料保存在液氮(-196℃)中，又称液氮保存。玻璃化法超低温保存即指在投入液氮前，用由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液(lantvitrification solution,PVS)处理材料，使之与玻璃化溶液在足够快的降温速率下过冷到玻璃化转变温度，最终固化成无定形的玻璃化状态而避免胞内结冰，并以这种状态在低温下保存的过程。玻璃化超低温保存方法成功的关键在于冷冻材料进入液氮的瞬间即固化形成玻璃态，以及解冻时没有再结晶现象发生，而液氮中贮存时间的长短对冻后植株再生和细胞遗传的特性几乎没有影响。由于该方法具备操作简单、冻存率高、适应性广等优点，逐渐成为长期稳定保存植物种质资源的一条重要途径。近二、三十年来玻璃化法超低温保存(vitrification-based cryopreservation)种质资源的技术得到了很大程度的发展和应用。但是现有技术中，超低温保存技术大多针对水稻、马铃薯等作物，对于玛瑙红樱桃愈伤组织的超低温保存方法尚未见报道，还未建立玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的超低温保存体系。因此建立玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存体系并加以优化，提高玛瑙红樱桃胚性愈伤组织冻后存活率，对玛瑙红樱桃的研究与产业发展具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的保存及解冻方法，以解决现有玛瑙红樱桃种植自然播种萌芽率低、胚性愈伤组织长时间连续继代增殖培养会引起细胞胚性丧失或分化能力降低的问题，而重新启动胚性愈伤组织诱导不仅费时、费力，而且可能会引起体细胞变异。
本发明采用的技术方案是：
一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的玻璃化超低温保存方法，包括以下步骤：
S1预培养：将继代培养10d-20d的玛瑙红樱桃胚性愈伤组织接种到培养基中，在0℃-5℃低温下培养1-6d；
S2装载液处理：将预培养后的玛瑙红樱桃胚性愈伤组织于常温下用体积分数为60％PVS2装载20-80min；
S3玻璃化脱水：在-1℃-2℃用PVS2浸泡脱水处理玛瑙红樱桃胚性愈伤组织20-80min；
S4液氮保存：将脱水处理后的玛瑙红樱桃胚性愈伤组织泡在新鲜的PVS2中，将其迅速置于液氮中保存。
优选的，所述步骤S1预培养的培养基为MS+50ml/L DMSO+1.0mg/LTDZ+0.5mg/LIBA。
优选的，所述PVS2为MS+30％甘油+15％乙二醇+15％DMSO+0.4mol/L蔗糖的混合液。
一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的玻璃化超低温保存后的解冻方法，包括以下步骤：把玛瑙红樱桃胚性愈伤组织从液氮中取出，先温水浴化冻，用洗涤液洗涤玛瑙红樱桃胚性愈伤组织去除玻璃化溶液，再转入恢复培养基中恢复培养。
优选的，所述水浴化冻的条件为在43±2℃的温水浴中化冻1-5min。
优选的，所述洗涤方法为用1.2mol/L、0.9mol/L、0.6mol/L、0.3mol/L的蔗糖+MS溶液依次从浓度高向浓度低分别浸泡10-15min后洗涤。
优选的，所述恢复培养基包含MS+1.0mg/LTDZ+0.5mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。
优选的，所述恢复培养的条件为：温度25±2℃，湿度55％RH，暗培养一周后转光培养，光培养的光照时间为14h/d。
相较现有技术，本发明的有益效果是：
1.本发明采用玻璃化超低温保存的方式对玛瑙红樱桃胚性愈伤组织进行长期冷冻保存，然后再解冻恢复培养，培育玛瑙红樱桃植株，解决玛瑙红樱桃胚性愈伤组织长时间连续继代增殖培养引起细胞胚性丧失或分化能力降低的问题，防止重新启动胚性愈伤组织诱导费时费力，并且引起体细胞变异的情况发生；
2.本发明建立玛瑙红樱桃种质资源的超低温保存体系，填补玛瑙红樱桃超低温保存技术空白，同时针对该低温保存方法提出了解冻方法，提高玛瑙红樱桃超低温保存及解冻的成活率，达到61.5％，并且解冻后恢复培养生长的玛瑙红樱桃种质资源遗传稳定性好，生长成活率远高于自然播种萌芽率(5％-20％)，为玛瑙红樱桃产业发展提供保障；
3.本发明采用的冰冻保护剂成本低、毒性低，操作简单，并且精准控制各项操作时间，提高操作效率和超低温保存质量，节省时间和避免原料资源浪费；
4.本发明采用新鲜PVS2浸泡后再迅速利用液氮保存，而之前使用的PVS2主要用于细胞脱水，新鲜的PVS2重新对胚性愈伤组织进行保护，更好地防护细胞组织被冷冻而死，提高超低温保存成活率；
5.采用四步洗涤法进行洗涤，将洗涤液从浓度高到浓度低洗涤，通过梯度性的降低洗涤液的浓度，避免因浓度差过大造成细胞的破裂，同时，能提高洗涤效率，减少玻璃化溶液的残留，提高恢复培养成活率。
附图说明
图1为本发明的玛瑙红樱桃胚性愈伤组织玻璃化超低温保存后恢复培养1周的图片；
图2为本发明的玛瑙红樱桃胚性愈伤组织玻璃化超低温保存后恢复培养4周的图片；
图3为装载液处理时间对玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存成活率的影响效果图；
图4为玻璃化脱水时间对玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存成活率的影响效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将参照实施例对本发明作进一步的详细描述。
下述实施例中的实施方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，为一般商业途径获得。
本发明实施例中所用的MS培养基购自杭州百思生物技术有限公司。
TDZ：噻苯隆，是一种细胞分裂素；
IBA：吲哚丁酸，是一种内源生长素；
6-BA：6-苄氨基嘌呤，是一种细胞分裂素；
DMSO：二甲基亚砜，是一种渗透性保护剂。
实施例1
一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的玻璃化超低温保存方法，包括以下步骤：
S1预培养：将继代15d的玛瑙红樱桃胚性愈伤组织接种到MS+50ml/LDMSO+1.0mg/LTDZ+0.5mg/LIBA的培养基中进行预培养，在4℃低温下培养4d；
S2装载液处理：将预培养后的玛瑙红樱桃胚性愈伤组织于常温下用体积分数为60％PVS2(MS+30％甘油+15％乙二醇+15％DMSO+0.4mol/L蔗糖)装载20min；
S3玻璃化脱水：于0℃下用PVS2浸泡脱水处理玛瑙红樱桃胚性愈伤组织40min；
S4液氮保存：将脱水处理后的玛瑙红樱桃胚性愈伤组织泡在新鲜的PVS2中，将其迅速置于液氮中保存。
一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的玻璃化超低温保存后的解冻方法，包括以下步骤：把玛瑙红樱桃胚性愈伤组织从液氮中取出，在43℃的温水浴中化冻2min，先用1.2mol/L的蔗糖+MS溶液浸泡10-15min后洗涤，再用0.9mol/L的蔗糖+MS溶液浸泡10-15min后洗涤，0.6mol/L的蔗糖+MS溶液浸泡10-15min后洗涤，最后用0.3mol/L的蔗糖+MS溶液浸泡10-15min后洗涤，完全去除玻璃化溶液，再转入包含MS+1.0mg/LTDZ+0.5mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂的恢复培养基中恢复培养，所述恢复培养的条件为：在温度25±2℃、湿度55％RH条件下，暗培一周后转光培，光照时间为14h/d。
实施例2
实施例2与实施例1的操作步骤相同，不同之处在于所述玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的预培养时间分别设有0d、1d、2d、3d、5d和6d。测定预培养时间对玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存成活率的影响，结果如下表：
表1预培养时间对玛瑙红樱桃胚性愈伤组织相对成活率的影响
注：实验每处理20个愈伤组织，4次重复
根据实施例1和实施例2的试验结果可知：预培养时间对玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存的成活率有较大影响，玛瑙红樱桃胚性愈伤组织预培养0d时，细胞含水量太高，进行超低温保存时会形成大量冰晶，造成细胞损伤，超低温保存的成活率最低，仅为20.00％，随着预培养时间增加，超低温保存的成活率有所上升，预培养时间为4d时，玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存的成活率最高，达到65.00％，但是预培养时间超过4d后，会使胚性愈伤组织失水过多，细胞内渗透压升高造成细胞损伤，随着预培养时间的增加，超低温保存的成活率下降。
实施例3
实施例3与实施例1的操作步骤相同，不同之处在于步骤S2装载液处理和步骤3玻璃化脱水使用装载液和玻璃化保护液成分不同，所述玻璃化保护液分别为：PVS1(22％甘油+13％乙二醇+13％聚乙二醇+15％二甲基亚砜)；PVS2(30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖)；PVS3(50％甘油+50％蔗糖)。所述装载液对应玻璃化保护液使用，体积分数为玻璃化保护液的60％。测定装载液和玻璃化保护液对玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存成活率的影响，结果见表2：
表2不同玻璃化保护液对玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存成活率的影响
其中，成活率不同小写字母之间，表示差异显著。选择PVS2作为玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存玻璃化保护液使用时，成活率最高，为52.50a％，二甲基亚砜作为渗透性保护剂，能降低细胞的冰点，减少冰晶的形成，降低超低温保存对细胞的损害，提高玛瑙红樱桃胚性愈伤组织成活率，PVS2中蔗糖含量保持细胞内水分适宜，细胞脱水后细胞内的渗透压平衡，不影响玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存后的成活率。
实施例4
实施例4与实施例1操作流程一样，不同之处在于步骤S2装载液处理时间的不同，分别装载40min、60min和80min，其效果如图3所示。
装载时间影响玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存的成活率，装载20min其成活率最高，当装载时间超过20min后，细胞过度脱水，造成细胞内渗透压升高，使胚性愈伤组织在超低温保存前就受到损伤，导致超低温保存后成活率下降。
实施例5
实施例5与实施例1操作流程一样，不同之处在于步骤S3玻璃化脱水时间的不同，分别处理40min、60min和80min，其成活率如图4所示。
玻璃化脱水时间影响玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存的成活率，玻璃化脱水时间小于40min，细胞内含水量较高，影响玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存后的成活率；玻璃化脱水40min时成活率最高，玻璃化脱水不低于60min时，细胞脱水过度，细胞内渗透压升高导致细胞受损甚至死亡，瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存的成活率下降。
实施例6
测定恢复培养基对玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存成活率的影响，操作过程与实施例1相同，不同之处在于改变恢复培养基成分，实验具体设置及结果如下所示：
表3不同恢复培养基对玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存成活率的影响
使用的恢复培养基均在以上成分基础上添加30g/L蔗糖+7g/L琼脂
实验操作中，恢复培养的条件为：在温度25±2℃、湿度55％RH条件下，暗培一周后转光培，光照时间为14h/d。通过试验结果可以看出，以MS+1.0mg/LTDZ+0.5mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂为恢复培养基时，玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存后的成活率最高，为61.5％。
实施例7
水浴解冻时间对玛瑙红樱桃超低温保存后成活率的影响。操作流程与实施例1相同，不同之处在于水浴解冻时，分别在43℃温水中解冻1min、2min、4min和5min。
试验发现，水浴解冻1min时，时间较短，细胞内或玻璃化溶液温度较低，冰晶为完全融化，影响玛瑙红樱桃胚性愈伤组织恢复培养成活率；水浴时间超过4min时，虽然解冻充分，但是胚性愈伤组织与玻璃化溶液的接触时间增加，玻璃化保护液对胚性愈伤组织产生毒性，降低玛瑙红樱桃胚性愈伤组织恢复培养成活率。
实施例8
洗涤液使用对玛瑙红樱桃超低温保存后成活率的影响。操作流程与实施例1相同，不同之处在于水浴解冻后，去除玻璃化保护液的洗涤方式不同，分别用0.3mol/L的蔗糖+MS溶液浸泡10-15min洗涤；用0.6mol/L的蔗糖+MS溶液浸泡10-15min洗涤；用0.9mol/L的蔗糖+MS溶液浸泡10-15min洗涤；用1.2mol/L的蔗糖+MS溶液浸泡10-15min洗涤。经比对后发现，利用1.2mol/L、0.9mol/L、0.6mol/L和0.3mol/L的蔗糖+MS溶液对解冻后的玛瑙红樱桃胚性愈伤组织梯度性降低洗涤液浓度，避免因浓度差过大造成细胞破裂，提高洗涤效率，并且洁净效果最好，去除玻璃化溶液残留，提高玛瑙红樱桃胚性愈伤组织超低温保存后的成活率。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (8)
1.一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的玻璃化超低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1预培养：将继代培养10-20d的玛瑙红樱桃胚性愈伤组织接种到培养基中，在0℃-5℃低温下预培养1-6d；
S2装载液处理：将预培养后的玛瑙红樱桃胚性愈伤组织于常温下用体积分数为60％PVS2装载20-80min；
S3玻璃化脱水：在-1℃-2℃用PVS2浸泡脱水处理玛瑙红樱桃胚性愈伤组织20-80min；
S4液氮保存：将脱水处理后的玛瑙红樱桃胚性愈伤组织泡在新鲜的PVS2中，将其迅速置于液氮中保存。
2.根据权利要求1所述的一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的玻璃化超低温保存的方法，其特征在于：所述步骤S1预培养的培养基为MS+50ml/L DMSO+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L IBA。
3.根据权利要求1所述的一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的玻璃化超低温保存的方法，其特征在于：所述PVS2为MS+30%甘油+15%乙二醇+15%DMSO＋0.4mol/L蔗糖的混合液。
4.一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的玻璃化超低温保存后的解冻方法，其特征在于，包括以下步骤：把玛瑙红樱桃胚性愈伤组织从液氮中取出，先温水浴化冻，用洗涤液洗涤玛瑙红樱桃胚性愈伤组织去除玻璃化溶液，再转入恢复培养基中恢复培养。
5.根据权利要求4所述的一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的玻璃化超低温保存后的解冻方法，其特征在于：所述水浴化冻的条件为在43±2℃的温水浴中化冻1-5min。
6.根据权利要求4所述的一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的玻璃化超低温保存后的解冻方法，其特征在于：所述洗涤方法为用1.2mol/L、0.9mol/L、0.6mol/L、0.3mol/L的蔗糖+MS溶液依次从浓度高向浓度低分别洗涤3次。
7.根据权利要求4所述的一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的玻璃化超低温保存后的解冻方法，其特征在于：所述恢复培养基包含MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L IBA＋30g/L蔗糖＋7g/L琼脂。
8.根据权利要求4所述的一种玛瑙红樱桃胚性愈伤组织的玻璃化超低温保存后的解冻方法，其特征在于，所述恢复培养条件为：在温度为25±2℃，湿度55%RH的条件下，暗培养一周后转光培养，并且光培养的光照时间为14h/d。
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