HU220585B1

HU220585B1 - Eljárás növényi szövetek tenyésztésére és regenerálására

Info

Publication number: HU220585B1
Application number: HU9600888A
Authority: HU
Inventors: Caterina Maria Colijn-Hooymans; James Martin Dunwell; Robert David Hall; Franciscus Andries Krens; Hendricus Adrianus Verhoeven; Guy Weyens
Original assignee: Zeneca Limited
Priority date: 1993-10-14
Filing date: 1994-10-14
Publication date: 2002-03-28
Also published as: UA54369C2; GR3029551T3; WO1995010178A1; ES2127943T3; ATE176984T1; DE69416847T2; EP0838148A2; JP3673276B2; GB9321183D0; AU682404B2; EP0838148A3; EP0723393A1; US5969215A; HUT74396A; JPH09503668A; AU7859694A; CA2170760A1; DK0723393T3; HU9600888D0; EP0723393B1

Abstract

A találmány tárgya eljárás a Beta vulgaris-családba tartozó növények(így cukorrépa, takarmányrépa, sárgarépa és fehérrépa) szöveteinektenyésztésére és a növény regenerálására oly módon, hogy Beta vulgarissztómasejtet regeneráló táptalajon tenyésztenek. A találmány továbbánövényi sejtek genetikai átalakítására alkalmas eljárásra, teljesnövényeknek ilyen sejtekből való regenerálására, valamint az ígytermelt növényekre vonatkozik. Ebben az eljárásban növényi sejtekkéntsztómasejteket használnak. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás a Béta vulgaris-családba tartozó növények (így cukorrépa, takarmányrépa, sárgarépa és fehérrépa) szöveteinek tenyésztésére és a növény regenerálására. A találmány továbbá növényi sejtek genetikai átalakítására alkalmas eljárásra, teljes növényeknek ilyen sejtekből való regenerálására, valamint az így termelt növényekre vonatkozik.

Noha a genetikai transzformálás és az azt követő regenerálás ma már számos növényfajta esetén lényegében rutinfeladat, egyes növényfajták a rendelkezésre álló nagyszámú módszer túlnyomó részével nem transzformálhatok. Közismerten ilyen növényfajta a Béta vulgáris, amelynél - noha egyes sejtekben a kifejezés átmenetileg megoldható és egyes specifikus genotípusok sikeresen kialakíthatók - nem áll rendelkezésre egyszerű rutinmódszer a transzgenikus növények termelésére [WO 91/13159 számú nemzetközi közzétételi irat; D’Halluin K. és munkatársai: Biotechnology 10, 309-314 (1992)]. Pontosabban, erre a növényfajtára nem ismertettek még közvetlen géntranszfer és azt követő regenerálás útján végrehajtható transzformálási módszert. A cukorrépa-protoplasztok transzformációval szembeni ellenállását a szakirodalomban széles körben ismertették [Lindsey és munkatársai: Transformation in Sugár Beet (Béta vulgáris L.); Biotechnology in Agriculture and Forestry 23. kötet, IV. fejezet (Plánt Protoplasts and Genetic Engineering), szerkesztő: Y. P. S. Bajaj, kiadó: Springer Verlag (Berlin, 1993)]. In vitro körülmények között korlátozott a sejtosztódás, és teljesen működőképes telepek rendszerint igen kis (0,1 %-os vagy kisebb) gyakorisággal képződnek. A cukorrépalevelekből elkülönített protoplasztok változó méretűek és morfológiájúak, ami jól tükrözi azt, hogy a forrásszövetben mind fiziológiás szinten (a sejt in vivő körülmények közötti relatív helyzetéből adódóan), mind pedig citogenetikus szinten (ploiditás, sejtciklusfázis) milyen nagymértékben heterogén sejtek találhatók.

Szükség van tehát olyan egyszerű és nagy gyakorisággal végrehajtható transzformációs módszerre, amely répaféléken (Béta vulgáris) is sikerrel alkalmazható.

Ahhoz, hogy egy sejt hatásosan transzformálható legyen, több követelménynek kell teljesülnie. Először is, a beillesztendő génnek olyan szerkezetben kell elhelyezkednie, amely a gén transzkripcióját végrehajtó hatásos szabályozóelemeket tartalmaz. Ezenkívül léteznie kell egy olyan módszernek, amellyel a szerkezet bevihető a sejtbe. Ha már egyszer a sejthártyán belül van a szerkezet, az endogén kromoszómaanyagba való integrálódás vagy végbemegy, vagy sem. Noha az integrálódás valószínűsége egyes módszerekkel növelhető, az integrálódás általában egyszerű, irányítatlan véletlen jelenségnek minősül. Végül, növények esetén a célzott sejttípusnak olyannak kell lennie, hogy a sejtekből teljes növény legyen regenerálható.

A növényi sejtek a bakteriális és állati sejteknél nehezebben transzformálhatok, mert kemény sejtfaluk akadályt képez a szerkezetnek a falon keresztül való beillesztésével szemben. Különösen érvényes ez a Béta vulgáris-sejtekre.

A növényi sejtek transzformálására alkalmas módszerek tehát a célzott növénytípus számára megfelelő és elviselhető megoldásokra korlátozódnak [Potrykus, I., in Plánt Breeding: Principles and Prospects (szerkesztő: Hayward és munkatársai; kiadó : Chapman and Hall, London, 1993)]. Míg a kétszikű növények transzformálása könnyebb, az egyszikű növények igen nehezen transzformálhatok, és ezen a területen csak igen kevés (rendszerint alig sikeres) megoldást ismertettek.

Növényi sejtek transzformálásának egyik ismert módszere a „mikroinjektálás” néven ismert eljárás, amelynek során mikroszkóp alatt egy DNS-szerkezetet injektálnak üreges tűből a célzott sejtbe. Ennek az eljárásnak az egyik változatában a sejtfalat tűvel kiszakítják, a DNS-t a környező közeghez adják, és a DNS-t a sejtfal sérülésén keresztül a sejtbe hagyják diffündálni. Ezt az eljárásváltozatot „mikropontozás”-nak nevezik. Mindkét eljárás igen nagy kézügyességet igényel a személyzettől, és rendkívül időt rabló. A 03103183/1991 számon közzétett japán szabadalmi bejelentés szerint úgy juttatnak be idegen gént növényi sejtekbe, hogy a gént mikroinjektálással a növény epidermiszszöveteiben lévő védősejtekbe juttatják, majd ezeket a sejteket tenyésztik. A védősejtek fiziológiájának tanulmányozása során azonban kitűnt, hogy ezekben szokatlanul nagy a sejten belüli nyomás, így okkal megkérdőjelezhető, hogy mikroinjektálással egyszerűen be lehet-e juttatni a DNS-t a védősejtekbe. Bárhogy is, ez a módszer sem mentes a mikroinjektálás alapvető hátrányától, ami abban áll, hogy az eljárás annyira időigényes, hogy egy nap alatt csak viszonylag kevés sejt injektálható. A fenti közlemény az így kialakított transzgenikus növények elkülönítésének pontos leírását sem tartalmazza.

A génszerkezetek növényi sejtekbe - elsősorban egyszikű növények sejtjeibe - juttatásának vélhetően leghatékonyabb ma ismert módszere az úgynevezett „biobombázás”, amikor a génszerkezettel nagy sűrűségű fémrészecskéket (rendszerint volfrám- vagy aranyrészecskéket) vonnak be, és a bevont részecskéket robbanásszerűen sebes gázárammal a célzott sejt tenyészetébe hajtják. Ez a megoldás szakít a mikroinjektálás és mikropontozás során alkalmazott, nagy precizitású egyedi célbavétellel, és ehelyett „pergőtűz-technikát” alkalmaz, amikor rövid idő alatt igen sok sejt kap „lövést”, és nagyszámban képződnek további szűrésre alkalmas, feltételezett transzformátumok.

Noha a biobombázás hatékony módszer, hátránya, hogy költséges felszerelést igényel, és csak néhány más ismert megoldáshoz viszonyítva gyors, a valóságban azonban időigényes. Előnye viszont, hogy minden egyes bombázás nagyszámú transzformációs eseményt hoz létre. A módszer alkalmazásakor jelentkező problémák egyike a hirtelen kiteqedő gázsugár hatása a célzott szövetre. Szintén nehéz a „lövedékesőt” pontosan ráirányítani a kiválasztott célterületre. Az utóbbi nehézség kiküszöbölésére már sokféle mikrocélzó eszközt kidolgoztak [Leduc és munkatársai: Sex. Plánt Repród. 7, 135-143 (1994); Iglesias és munkatársai: Planta 192, 84-91 (1994)], ezzel a módszerrel azonban transzgenikus növényeket eddig még nem állítottak elő.

HU 220 585 Bl

A transzformálás egy másik, egyszerű és olcsó módszere a növényi sejtek plazmid-DNS-sel és szubmikronnyi átmérőjű rostokkal vagy rostkefékkel való összekeverése. A szilícium-karbid-kefék felhasználásával végzett transzformálásról számos közlemény jelent meg. Az első ilyen közlemény β-glükuronidáz (a továbbiakban: gus) tranziens kifejezését ismertette fekete mexikói édeskukorica (a továbbiakban: BMS)-sejtszuszpenzióban (Kaeppler és munkatársai, 1990). Ugyanez a munkacsoport nemrég tette közzé a BMS és dohány stabil transzformálásával kapcsolatos eredményeit (Kaeppler és munkatársai, 1992). A kukoricarendszerben BAR és gus-tartalmú plazmid felhasználásával minden egyes örvénykezelt sejtmintából (300 pl betöltött sejttérfogat) átlagosan 3,4 BASTA-rezisztens telepet különítettek el. Ezen herbicidre rezisztens telepek 65%-ában gus fejeződött ki [Kaeppler H. F., Gu W., Somers D. A., Rines H. W., Cockbum A. F.: „Silicon Carbide fiber-mediated DNA delivery intő plánt cells”, Plánt Cell Reports 9, 415-418 (1990) és Kaeppler H. F., Somers D. A., Rines H. W., Cockbum A. F.: „Silicon Carbide fibermediated stable transformation of plánt cells”, Theor. Appl. Génét. 84, 560-566 (1992)]. Növényi sejtek - elsősorban kukoricasejtek - kefék felhasználásával végzett transzformálását ismerteti továbbá az 5 302 523 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (Zeneca Limited).

A transzformálás sikerét több tényező befolyásolja. Az exogén génszerkezetnek és szabályozóelemeinek szerkezete és felépítése befolyásolja az exogén szekvenciának a növényi sejtmag kromoszóma-DNS-ébe való integrálódását, valamint azt, hogy a transzgén hogyan képes kifejeződni a sejtben. Alapvető feltétel, hogy az exogén génszerkezetet pusztulást nem okozó módszerrel juttassuk a növényi sejtmagba. Ha teljes növényt kívánunk regenerálni, szintén alapvető feltétel, hogy az a sejttípus, amibe a génszerkezetet bevezettük, megfelelő regenerálási eljárással növény regenerálására alkalmas legyen.

A találmány értelmében regenerálásra képes sejttípust választunk ki.

A találmány célja továbbá Béta vulgáris növények - különösen cukorrépa - transzformálására alkalmas eljárás biztosítása.

A találmány tárgya eljárás Béta vulgáris növény előállítására Béta vulgaris-sejt regeneráló táptalajon végzett tenyésztésével. A találmány értelmében Béta vulgáris-sejtként sztómasejtet használunk.

A sztómasejtet előnyösen az adott sejteket tartalmazó intakt szervben vetjük alá regenerálásnak, eljárhatunk azonban úgy is, hogy ezeket a sejteket előzetesen elkülönítjük.

A sztómasejtek egyik előnyös fonása az izolált levélepidermisz.

A találmány szerinti eljárás a Béta vulgaris-családba tartozó növények körében különösen előnyösen alkalmazható cukorrépára.

A regenerálás műveletsora előnyösen olyan lépést is tartalmaz, amelynek során hormonmentes közegen kalluszt termelünk.

A találmány tárgya továbbá eljárás növények genetikai transzformálására, amelynek során a növény sejtjébe átörökítőanyagot építünk be, és a transzformált sejtből a teljes növényt regeneráljuk. A találmány értelmében sejtekként sztómasejteket használunk.

A transzformálást sztómákat tartalmazó intakt szöveteken is végrehajthatjuk. Szövetként előnyösen öregedő levélszöveteket használunk.

Egy előnyös megoldás szerint sztómasejtekként a levélepidermiszben lévő sztómasejteket használjuk.

Más megoldás szerint a sztómasejteket tartalmazó szövetek szétoszlatásával sejtszuszpenziót is képezhetünk, és utóbb ebből regeneráljuk a növényeket.

A sztómasejteket regenerálás előtt előnyösen protoplasztokká alakítjuk.

Egy előnyös megoldás szerint átörökítőanyagként olyan DNS-szerkezetet használunk, amely egy adott antibiotikummal szemben rezisztenciát nem mutató szelektálható markergént tartalmaz, és a transzformált szövetet a megfelelő szelekciós szer hatásának tesszük ki.

A transzformálást védősejteket tartalmazó sejtpopuláción vagy megnövelt védősejt-koncentrációjú sejtpopuláción végezhetjük.

A transzformálást sejtszuszpenzióban is végrehajthatjuk.

A sztómasejteket a sejtfal enzimes emésztésével alakíthatjuk protoplasztokká. Ezt a műveletet akár a transzformálás előtt, akár a transzformálás után végrehajthatjuk.

A transzformálás egy előnyös módszere szerint a sztómasejtek szuszpenzióját mikroszkópos méretű rostos anyaggal elegyítjük, és az elegyet az átörökítöanyag jelenlétében keverjük.

A növények leveleinek, szárának és egyes reproduktív szöveteinek (így a portoknak) epidermiszrétegében „védősejtek” néven ismert specializálódott sejtek találhatók [Kendra G.: Python 4, 83-96 (1952)]. A levelek öregedése során a más típusú sejtek általában korábban pusztulnak el, mint a védősejtek [Zeiger E. és Schwartz A.: Science 218, 680-682 (1982)]. Ennek megfelelően az öregedő levelek védősejtekben különösen dús sejtforrást képeznek. A védősejtek a levelek pórusainak vagy sztómáinak nyílását szabályozzák [általános áttekintésként lásd Zeiger és munkatársai (szerkesztő): „Stomatal Function”, 1987]. Korábban már ismertettek eljárásokat a védősejtek elkülönítésére [lásd például Kruse és munkatársai: Plánt Physiology 90, 1382-1386 (1989)] és protoplasztokká alakítására [lásd például Mawson B. T.: Plánt Cell Environment 16, 207-214 (1993)], bár ezeket a módszereket fiziológiai tanulmányok végzéséhez dolgozták ki, és rendszerint Vicia faba növény felhasználásával végezték [Mawson B. T.: Planta 191, 293-301 (1993); Talbott és Zeiger: Plánt Physiology 102, 1163-1169 (1993)]. A védősejtek kis, egyedülálló alakú sejtek, amelyek fala viszonylag vastagabb, keményebb és nagyobb pektintartalmú, mint az egyéb levélsejteké. A sztómapórus két védősejt között alakul ki, és két alapformája (elliptikus és füszerű forma) van. A „sztóma” és „sztómák” megjelölésen általánosságban nemcsak a pórusokat értik, hanem a védősejteket és a

HU 220 585 BI szomszédos sejteket is, amelyek a sztómakomplexet alkotják [Weyers és Meider: „Methods in Stomatal Research” 3. oldal (Longmans, London, 1990)]. A leírásban a „védősejt” megjelölésen minden olyan sejtet értünk, amely részt vesz a sztómakomplex képzésében.

Hosszú időn át úgy vélték, hogy a védősejtek tenyészetben nem képesek osztódni [Tran Thantn Van K.: „Control of Morphogenesis or what shapes a group of cells” in Advances in Biochemical Engineering 18. kötet, Plánt Cell Cultures II (szerkesztő: Feichter A., kiadó: Springer Verlag, Berlin 1980) 151-171. oldal]. Az újabb kutatások azonban azt igazolták, hogy ez a feltételezés egy növényfajta, a Nicotiana glauca esetén nem helytálló [Cupples W. és munkatársai: Plánt Cell and Environment 14, 691-697 (1991)], és dohány védősejt-protoplasztokból teljes növények regenerálhatok [Sahgal P. és munkatársai: Plánt Science 97, 199-208 (1994)]. A dohányt a növénytan tudományában széles körben alkalmazzák modellnövényként, és egyik - modellrendszerként! hasznosíthatóságát biztosító - jellemzője az, hogy csaknem bármilyen sejttípusból regenerálható. így az a tapasztalat, hogy a dohány védősejtek alkalmasak a teljes növény regenerálására, valójában nem teljesen meglepő, és abból a tényből, hogy a dohány ezzel a képességgel rendelkezik, még semmiféle következtetés nem vonható le arra nézve, hogy más növények is rendelkeznek-e ezzel a sajátsággal vagy sem.

A szakirodalomban két rövid közlemény foglalkozik a cukorrépa epidermiszsejtjeiből való kallusztermeléssel [Kotowska és Rogozinska: Bull. of the Polish Acad. Sci. 32, 11-12 (1984); Kotowska: Beitr. Bioi. Pflanz. 67, 209-223 (1992)], és számos közlemény tárgyalja a levélnyél epidermiszén véletlenszerűen bekövetkező rügyképződést [lásd például Harms és munkatársai: Plánt Cell Tissue Organ Culture 2, 93-102 (1983); Schneiderés Gunther: Biochem. Physiol. Pflanzen 182, 485-490 (1987)]. Egyetlen esetben sem közöltek arra utaló adatot vagy eredményt, hogy a védősejtek osztódásra és kallusztermelésre képesek lennének.

A találmány szerinti eljárás egyik megvalósítási módja értelmében levélszöveteknek vagy azok epidermiszrétegének szétoszlatásával és emésztésével védősejteket tartalmazó tenyészetet alakítunk ki, a sejtfalak emésztésével protoplasztokat képezünk, a protoplasztokat megfelelő módszer alkalmazásával genetikailag transzformáljuk, kiválasztjuk a transzformátumokat, és a transzformátumokból növényeket regenerálunk.

Egy másik megvalósítási mód értelmében levélsejteket in situ transzformálunk úgy, hogy az intakt levélszövetet az exogén DNS-szerkezettel bevont mikrorészecskékkel bombázzuk. Ezután a bombázott szövetet szétoszlatjuk, a védősejteket - amelyek a más típusú sejteknél lényegesen rugalmasabbak - elkülönítjük, és azokból teljes növényeket regenerálunk.

Egy további megvalósítási mód szerint a levélszövetet szétoszlatjuk, és abból védősejtekben dús sejtpopulációt készítünk. Ezután a védősejtekben feldúsított sejtpopuláción végrehajtjuk a transzformálást, majd a sejtekből teljes növényeket regenerálunk. A védősejteket transzformálás előtt protoplasztokká alakíthatjuk. Egy további változat szerint az epidermiszdarabkákat kézi úton lehánthatjuk, és azokból kalluszt képezhetünk.

A védősejteket a más típusú sejtekhez viszonyított kiemelkedő rugalmassága, valamint a védősejtek és protoplasztjaik nem várt működőképessége különösen alkalmassá teszi a szomatikus hibridizációban, cibridképzésben [Krens és munkatársai: Theor. Appl. Génét. 79, 390-396 (1990)] vagy transzformálásban való felhasználásra. A sejtek rugalmasságát általában a DNS sejtbe juttatását akadályozó tényezőnek tekintik. Ezzel az általános nézettel szemben a találmány szerint elért eredmények azt igazolják, hogy a védősejtek ténylegesen transzformálhatok, és a transzformált sejtekből teljes növények regenerálhatok, így a találmány hatékony módszert biztosít transzgén növények termelésére.

A találmány szerinti eljárás igen fontos jellemzője, hogy répafélék (Béta vulgáris) transzformálására is alkalmazható. Amint ismert [Lindsey és munkatársai: Transformation in Sugár Beet (Béta vulgáris L.), in Biotechnology in Agriculture and Forestry, 23. kötet, ’Plant Protoplasts and Genetic Engineering IV” (szerkesztő: Y. P. S. Bajaj, kiadó: Springer Verlag, Berlin, 1993], ez a növényfajta mindeddig csak rendkívül csekély hatékonysággal volt transzformálható.

A találmány szerinti műveletsorban az alábbiakban felsorolt műveleti lépések vagy azok számos képviselője szerepelhet: transzformálás, az epidermisz elkülönítése, a védősejtek elkülönítése, protoplasztok képzése a védősejtekből, a transzformátumok kiválasztása (szelektálás), és a teljes növények regenerálása a transzformátumokból. A felsorolt műveleti lépések sorrendje azonban változtatható, és egyes lépések el is hagyhatók. Az alábbiakban néhány lehetséges műveletsor-változatot ismertetünk. Minden egyes változatnak van bizonyos előnye.

1. Eljárhatunk úgy, hogy az intakt levélszövetet transzformáljuk, majd ezt az anyagot vagy az abból elkülönített epidermiszt szétoszlatjuk, és a kapott sejtszuszpenziót szükség esetén hangbesugárzásnak vetjük alá. A felsorolt műveletek hatására a védősejtektől eltérő típusú sejtek preferenciálisan roncsolódnak. Minthogy a védősejtek az ilyen fizikai stresszhatással szemben viszonylag ellenállóak, azok koncentrációja megnő. Ezután a védősejtek flotálással vagy szűréssel elkülöníthetők a szuszpenzióból, és az elkülönített sejtekből teljes növények regenerálhatok.

2. A fent ismertetett 1. eljárás során a sejtbejuttatott DNS-szerkezet szelektálható markergént tartalmazhat; a leggyakoribb szelekciós paraméter valamely antibiotikummal - például kanamicinnel vagy higromicinnel vagy herbiciddel - például BASTA-val - szembeni rezisztencia lehet. Ezután a levelet szelekciós nyomásnak vetjük alá, és csak a túlélő sejtekből készítünk sejtszuszpenziót. Más megoldás szerint a szelektálóanyagot a teljes levélszövet szuszpenziójához adjuk, és az életképes védősejteket elkülönítjük. Ekkor az elkülönített sejtek kizárólag transzformált sejtek, így a külön szelekciós lépés szükségtelenné válik.

Előnyösebbnek találtuk azonban, ha a szerkezet egyáltalán nem tartalmaz antibiotikum-rezisztenciát biztosí4

HU 220 585 Bl tó géneket. Növényi sejtek esetén szelekciós paraméterként előnyösen a bialafosszal (herbicid hatóanyag) szembeni rezisztenciát választjuk. A szerkezet előállításának bakteriális szakaszában szelekcióra célszerűen a Saccharomyces cerevisiae IGPD (imidazol-glicerin-foszfát-dehidratáz) gént használjuk, ami képes a hisztidinbioszintézis-hiányos E. coli hisB mutáns törzset funkcionálisan kiegészíteni, és helyreállítja annak növekedőképességét minimális táptalajon. Ha a rekombináns szelekcióhoz ilyen auxotróf kiegészítő rendszert használunk, nincs szükség arra, hogy az E. colival végzett műveletek során, a növényi sejtekbe való bejuttatás előtt bakteriális antibiotikumrezisztencia-markereket építsünk be a plazmidokba.

3. Eljárhatunk úgy is, hogy az 1. eljárásváltozatnál leírtak szerint védősejt-szuszpenziót készítünk, és a transzformálást a szuszpendált sejteken hajtjuk végre. Ebben az esetben előnyösen alkalmazható transzformálást módszer a rostos anyag (például szilícium-karbidkefék) jelenlétében végzett örvénylő keverés. A transzformálást a védősejtek koncentrációjának fent ismertetett feldúsítása előtt vagy után egyaránt végrehajthatjuk, és a 2. eljárásnál leírtakat is alkalmazhatjuk.

4. Ismét más megoldás szerint a korábbiakban ismertetett módon védősejt-szuszpenziót vagy védősejtekben feldúsított sejtszuszpenziót készítünk, és a sejteket transzformálás előtt enzimes emésztéssel protoplasztokká alakítjuk. Végül a növényeket a protoplasztokból regeneráljuk. Ha a transzformálás célpontjaként protoplasztokat használunk, a transzformálásra néhány olyan ismert technikát is alkalmazhatunk, amelyek az intakt védősejtek transzformálásakor nem vezetnének eredményre.

5. A legegyszerűbb eljárásmód szerint az intakt levelet vagy a (mechanikusan vagy kézi úton) elkülönített epidermiszt transzformáljuk, majd szelekciós nyomás alkalmazása közben elvégezzük a regenerálást. Minthogy a védősejtektől eltérő típusú sejtek egyike sem alkalmas növény regenerálására, az utóbbi sejtek regenerálódás nélkül egyszerűen tovább élnek, és a növények csak a transzformált védősejtekből regenerálódnak. Ebben az eljárásban különösen előnyösen használhatunk részben elöregedett leveleket, amelyek főként csak életképes védősejteket tartalmaznak.

Az exogén DNS-szerkezet bevitelének módszere a találmány szempontjából nem döntő jelentőségű tényező: az tetszés szerint megválasztható. Sikeresen állítottunk elő transzgén növényeket az ismert polietilénglikol (PEG)-közvetített protoplaszttranszformálással, és azt követő szelekcióval és regenerálással.

A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük részletesebben. A példákban betűjelzésekkel jelölt táptalajok összetétele a következő:

„A” táptalaj: Félkoncentrációjú MS táptalaj*

3% szacharóz 0,3% Gelrite® pH 5,8, autoklávban kezelve „B” táptalaj: 9% mannit

3,8% CaCl₂.2H₂O 0,1 mmol n-propil-gallát

CPW sók** pH 5,8, szűréssel sterilizálva „C” táptalaj: 9% mannit

0,1 mmol n-propil-gallát CPW sók**

2% Cellulase R-10®

3% Macerozyme R-10®

PH 5,8, szűréssel sterilizálva „D” táptalaj: 9% mannit

0,1 mmol n-propil-gallát CPW sók** pH 5,8, szűréssel sterilizálva „E” táptalaj: 15% szacharóz

0,1 mmol n-propil-gallát CPW sók** pH 5,8, szűréssel sterilizálva „F” táptalaj: 9% mannit mmol CaCl₂.2H₂O szűréssel sterilizálva „G” táptalaj: 9% mannit mmol CaCl₂.2H₂O 2% nátrium-alginát autoklávban kezelve „H” táptalaj: 7,25% mannit mmol CaCl₂.2H₂O 0,9% Agarose® autoklávban kezelve „I” táptalaj: 1,5% Agarose® autoklávban kezelve „J” táptalaj: 6,84% glükóz

0,1 mmol n-propil-gallát

0,2 mg/12,4-diklór-fenoxi-ecetsav (2,4-D) mg/1 naffil-ecetsav (NAA)

0,5 mg/1 benzil-amino-purin (BAP)

K8p táptalaj (szekvesztrén és kazaminosavak nélkül)*** pH 5,8, szűréssel sterilizálva „K” táptalaj: 3% szacharóz 0,8% Agarose® pmol BAP

PGo táptalaj**** pH 5,8, autoklávban kezelve „L” táptalaj: 3% szacharóz 0,8% Agarose® pmol indol-vajsav (IBA) pH 5,8, autoklávban kezelve * Murashige T., Skoog F.: Physiologia Plantarum 15, 473-497 (1962) ** Frearson E. M., Power J. B., Cocking E. C.: Developmental Biology 33, 130-137(1973) *** Kao K. N., Michayluk Μ. K.: Planta 126, 105-110 (1975) **** De Greef W., Jacobs M.: Plánt Science Lettére 17, 55-61 (1979)

Az 1. ábrán az egyedi sejtek elhelyezésének és áthelyezésének megkönnyítésére szolgáló elrendezést szemléltetünk, ami a következő szerkezeti egységekből áll: 1 fedőlap, 2 táptalaj, 3 alginátba ágyazott sejtek, 4 agarózgyűrű, 5 arany elektronmikroszkópos rácsozat, 6 Pétri-csésze (átmérője 6 cm). Az 1. ábrán bemutatott elrendezés kialakítását a 4. példában ismertetjük részletesen.

HU 220 585 Bl

1. példa

A növényi anyag előállítása és növesztésének körülményei

Hall és munkatársai [Plánt Cell Reports 12, 339-342 (1993)] és Pedersen és munkatársai [Plánt Science 95, 87-97 (1993)] módszerét alkalmaztuk.

A következőképpen készítettünk aszeptikus Béta vulgaris-hajtástenyészeteket: A magvakat kénsavban 50 percig inkubálva sterilizáltuk, majd csapvízzel alaposan leöblítettük. Ezután a magvakat 15 percig 55 °C-os ionmentes vízben tartottuk, majd 30 percig 5%-os nátrium-hipoklorit-oldatban inkubáltuk. A sterilizálóoldatot steril csapvízzel végzett újabb három öblítéssel (5, 10,15 perc) távolítottuk el.

A magvakat vizes agaron (1,5% agart tartalmazó csapvíz), világos helyen, 22 °C-on csíráztattuk.

A steril magoncokat 4 hétig „A” táptalajon tovább tenyésztettük, majd a merisztémumokat eltávolítottuk, és ugyanazon a táptalajon továbbtenyésztettük.

A hajtásokat minden harmadik héten továbbtenyésztettük; ekkor a merisztémumokat elkülönítettük, és friss táptalajra helyeztük. Az összes tenyészetet megvilágítás közben (napi 16 óra, 3000 lux), 22 °C-on inkubáltuk.

2. példa

Protoplaszt elkülönítése a levelekből

A műveletet Krens és munkatársai módszerével [Theoretical and Applied Genetics 79, 390-396 (1990)] végeztük.

Béta vulgáris aszeptikus körülmények között növesztett 3 hetes hajtástenyészeteinek leveleiből a következőképpen különítettünk el protoplasztokat: A hajtástenyészetekről levágtuk a levéllemezeket, és 9 cm átmérőjű Petri-csészébe töltött 10 ml táptalajban körülbelül 1,5 g (száraz tömeg) levelet finomra aprítottunk.

A „B” táptalajt eltávolítottuk, és a levéldarabkákat az emésztő enzimeket tartalmazó 15 ml „C” táptalajban újra szuszpendáltuk.

A szuszpenziót 45 fordulat/perc sebességgel forgó rázógépen (amplitúdó: 11 mm) éjszakán (körülbelül 16 órán) át fénytől védve 25 °C-on inkubáltuk.

A nyers protoplasztelegyet enyhe szívás közben pipettába tízszer felszívtuk/kieresztettük, majd a protoplasztszuszpenziót 297 pm és 55 pm száltávolságú nejlonszitákon átszűrve összegyűjtöttük.

A protoplasztszuszpenziót két, egyenként 12 ml térfogatú centrifugacsőbe töltöttük, és 5 percig 55 g gyorsuláson centrifugáltuk. A protoplasztokat pellet formájában különítettük el.

A felülúszót elöntöttük, és a protoplasztokat 10 ml „D” táptalajjal kétszer mostuk és centrifugáltuk.

Végül a protoplasztokat 10 ml „E” táptalajban újra szuszpendáltuk, a szuszpenzió tetejére óvatosan 1 ml táptalajt rétegeztünk, és az elegyet a fentiek szerint centrifügáltuk.

Az „F” táptalaj felső 1 ml-es rétegéből elkülönítettük a protoplasztokat, és hemocitométerrel meghatároztuk a populáció sűrűségét.

Valamennyi protoplaszttenyészetet fénytől védve, 25 °C-on inkubáltuk.

3. példa

A protoplasztok beágyazása

A műveletet Hall és munkatársai módszerével [Plánt Cell Reports 12, 339-342 (1993)] végeztük.

Tenyésztés előtt a protoplasztokat a következőképpen immobilizáltuk:

A kívánt tenyésztési sűrűségnek megfelelő, ismert számú (általában Petri-csészénként 30 000 - 125 000) protoplasztot összesen 500 pl „F” táptalajban újraszuszpendáltunk. A szuszpenziót 500 pl „G” táptalajjal alaposan összekevertük, és a kapott szuszpenziót vékony rétegben egy 10 ml „H” táptalajjal töltött 6 cm átmérőjű Petri-csészén terítettük szét. Szobahőmérsékleten 2 óráig tartó inkubálás után a kalcium-alginát vékony koronggá szilárdult. A szilárd korongot eltávolítottuk, és üres Petri-csészébe helyeztük.

4. példa

Az immobilizált sejtek fixálása, a tenyészetek előkészítése a sejtkeresőben való vizsgálatra

Az egyedi sejtek elhelyezésének és áthelyezésének megkönnyítésére a tenyészetet a következő összeállításban készítettük ki;

Egy 24,5 mmx40 mm méretű üveg fedőlapot alkoholban sterilizáltunk, majd lángkezeltünk.

A fedőlap teljes felületén egy csepp (körülbelül 50 pl) „I” táptalajt terítettünk szét, és teljesen megszáradni hagytuk.

A kalcium-alginát-korongból éles szikével kivágtuk a középső 10 mm χ 25 mm méretű részt.

A fedőlapra egy csepp „G” táptalajt cseppentettünk, és ennek a tetejére helyeztük a kalcium-alginát-korongból kivágott téglalap alakú részt.

Az alginát téglalap szélei körül 35 °C-os „ I” táptalajból gyűrűt képeztünk úgy, hogy az mind az algináttal, mind pedig az agarózzal bevont üveg fedőlappal érintkezzen.

Végül két csepp „I” táptalaj felhasználásával a fedőlaphoz két, aranyból készült elektronmikroszkópos rácsozatot rögzítettünk, az egyiket felül középre, a másikat pedig alul jobbra.

Az agaróz megszilárdulása után az összeállítást 4 ml „J” táptalajt tartalmazó, 6 cm átmérőjű Petri-csészébe helyeztük. Az alginátkorong maradékát szintén ebbe a táptalajba helyeztük, és ezután a Petri-csészét Parafilmmel® lezártuk. A kapott összeállítást az 1. ábrán szemléltetjük.

5. példa

A sejtek elhelyezése és áthelyezése

Léptetőmotor-meghajtású tárgyasztallal felszerelt, Zeiss ICM 405 típusú, fordított elrendezésű mikroszkópot használtunk. A tárgyasztal mozgásának szabályozására, a rendszer kalibrálására, és a Petri-csészében lévő egyedi sejtek helyzetének 1 pm pontossággal való feljegyzésére alkalmas számítógépes program szolgált. A két elektronmikroszkópos rácsozat centrumait rögzített referenciapontokként használva meghatároztuk és feljegyeztük a kívánt méretű és morfológiájú sejtek helyzetét. Újrakalibrálás céljából az elektronmikroszkó6

HU 220 585 Β1 pos rácsozatok helyzetét a számítógépbe újra betáplálva ezek a sejtek félautomatikus módon áthelyezhetők.

6. példa

A cukorrépalevelekből nyert protoplasztpreparátumokban lévő, a sejtosztódásban részt vevő sejtek

A répalevél-preparátumokban két olyan protoplasztszubpopulációt azonosítottunk, amely osztódásra és életképes sejtek termelésére képes. Ezek a kalluszok azonban morfológiailag eltérnek egymástól, és csak az egyik típusuk teljesen működőképes.

A regenerálható típusú kallusz jellemzője, hogy igen puha, töredező és vizes, ennek következtében könnyen szétesik. Az ilyen típusú kallusz regenerálódóképessége a körülményektől és a genotípustól függően változik, de értéke legfeljebb 30%. Az ilyen típusú kallusz elődeiként azonosított protoplasztoknak nagyon jellemző morfológiája van; 510 mOs/kg ozmolalitású táptalajon 1 napig végzett tenyésztés után meghatározott átmérőjük 15-27 pm (23-as skála), tehát viszonylag kis érték. Ezek a sejtek kevés látható citoplazmakomponenst tartalmaznak, eltekintve néhány (rendszerint sejtenként 5-14 darab, leggyakrabban sejtenként 8-9 darab) szokatlanul nagyméretű keményítőszemcsétől. Ezek a keményítőszemcsék a sejttérfogat mintegy 50%-át tehetik ki. Az ilyen típusú sejtek osztódása viszonylag későn, 5-10 nappal a táptalajra helyezés után következik be, és laza szerkezetű kallusz képződik, amely sok, változó méretű és alakú keményítőszemcsét tartalmazó, dús citoplazmájú, apró sejtekből áll. Nyilvánvaló vakuolák nem észlelhetők.

A másik kallusztípus igen kemény és tömör, és rendszerint gömb alakú telepeket képez. Ez a kallusztípus nem teljesen működőképes. Ez a kallusztípus olyan protoplaszttípusból származik, amelynek átmérője 20-30 pm (27-es skála), citoplazmában dús, és sok apró, egyenetlen méretű és alakú keményítőszemcsét tartalmaz. Jellemzően ezekben a sejtekben (a táptalajra helyezés után 1 nappal vizsgálva) már sejtmag jelenik meg, ami centrálisán helyezkedik el a sejtben. Ezek a sejtek korán (rendszerint 3 napon belül) osztódnak, osztódásuk gyors, és szemcsés citoplazmájú, jól látható vakuolával rendelkező sejtekből álló kerek, tömör telepeket képeznek.

A morfológiai jellemzők vizsgálata és a részleges epidermiszemésztések eredményei alapján megállapítottuk, hogy a fent ismertetett első (regenerálódóképes kalluszt képező) sejttípus a védősejtekből származik. A második sejttípus feltehetőleg az erezet kambiumszöveteiből származik. A mezofil protoplasztok sohasem osztódnak.

7. példa

Az epidermisz elkülönítése lefejtéssel, a növény regenerálása

A levelek (in vitro körülmények között, valamint üvegházban termesztett anyag) alsó epidermiszrétegét görbe csipesszel kézi úton lefejtve epidermiszszalagokat kaptunk. A műveletet üres Petri-csészében, Whatman-szűrőpapír-darabon vagy folyékony közegben egyaránt végrehajthatjuk (ezek a körülmények az osztódási fázist valójában nem befolyásolják; a körülmények megválasztása lényegében attól függ, hogy az adott személy hogyan tud minél nagyobb szalagokat leválasztani a levélről). Sem a lefejtés szöge, sem pedig a megmaradt mezofil sejtek száma nem befolyásolja a sejttenyésztést és a védősejtek osztódóképességét.

Az epidermiszszalagokat közvetlenül lefejtésük után táptalajba helyeztük. Nincs jelentősége annak, hogy a szalag melyik oldala érintkezik a táptalajjal. A táptalajba helyezett szalagok mennyiségének már nagyobb jelentősége van: elkülönítés után a folyadékfelszínt körülbelül 95%-ban be kell borítania a szalagoknak. A tenyésztés során a szalagok megcsavarodnak és összetekerednek, sőt esetenként le is süllyednek, de ez a sejtosztódást nem befolyásolja.

Az epidermiszszalagokat 5 cm és 20 cm átmérőjű Petri-csészékben és mikromélyedésekben tenyésztettük mindaddig, amíg a fent említett feltétel teljesült. A szalagok tenyésztését fénytől védve, 28 °C-on végeztük.

Több táptalajon - így K8p, MS, PGo és BUL táptalajon - észleltünk sejtosztódást. A legalkalmasabbnak a PGo táptalajt találtuk, ahol a tenyészetek 95%-ánál nagyobb hányadában termelődött fehér, töredező kallusz. A legfontosabb tényező az volt, hogy ez a táptalaj nem tartalmaz hormont. A hormonokat (BAP, NAA, 2,4-D) tartalmazó táptalajok nem növelik a sejtosztódás gyakoriságát. Olyan táptalajokon azonban, amelyek 0,2-2 mg/1 koncentrációban tartalmaztak 2,4-D-t, nagy mennyiségű kemény típusú kallusz képződését észleltük. Minthogy ez a kallusz nem képes regenerálódásra, és részlegesen gátolja a fehér, töredező kallusz termelődését, a legcélszerűbb PGo táptalajt használnunk, amelyen nem - vagy csak nagyon ritkán - képződik kemény kallusz.

Az általunk vizsgált több mint 30 különböző cukorrépa genotípus mindegyike legalább egy alkalommal termelt fehér, töredező kalluszt. A fehér, töredező kallusz termelődése nem függ a kiindulási anyag forrásától (azaz hogy az epidermisz in vitro körülmények között tenyésztett klónból, magoncból vagy üvegházban termesztett növényből származik-e), és a felhasznált táptalaj (MS, MS/2, PGo+BAP) sem befolyásolja a védősejtek osztódóképességét.

Az epidermiszszalagokat fénytől védve, 28 °C-on 4-5 hétig tenyésztettük. A kapott fehér, töredező kalluszokat 1 mg/1 BAP-t tartalmazó PGo táptalajra vittük át, és azonos körülmények között 3-4 hétig továbbtenyésztettük. Az így kapott kalluszt ezután ugyanezen a táptalajon, vagy 1 mg/1 BAP-t és 0,2 mg/1 NAA-t tartalmazó PGo táptalajon, vagy ugyanezt a két hormont tartalmazó MS táptalajon 20-22 °C-on, 16 óra világos - 8 óra sötét ciklus fenntartásával tovább tenyésztettük. 2-3 hét elteltével elkülöníthetők az első regenerátumok. A legtöbb regenerátum az utóbbi két táptalajon képződött.

8. példa

Az epidermisz elkülönítése keveréses módszerrel

A kézi lefejtés nagyon fárasztó és időt rabló, a keveréses módszer (ahogy azt a protoplaszt elkülönítésének műveletében végezzük) viszont nagy mennyiségű apró

HU 220 585 Bl epidermiszszalagot szolgáltat. A keveréses módszer hátránya, hogy kevésbé szelektív, és a védősejtek mellett nagy mennyiségű apró levélszövet-törmelék (és főleg kemény típusú kalluszt képező sejtek) is kerülnek a tenyészetbe. 5

Noha az így elkülönített epidermisz PGo táptalajon végzett tenyésztése során sok esetben észleltük fehér típusú kallusz képződését, ez kevésbé volt kifejezett, mint a kézi úton lefejtett epidermiszszalagok alkalmazásakor. Tapasztalataink szerint a keveréssel elkülönített 10 epidermisz tenyésztésére alkalmasabb a BUL táptalaj, amelynek összetétele a következő:

Makrokompo- nensek	KNOj MgSO₄.7H₂O NaH₂PO₄.H₂O (NH₄)₂SO₄ CaCl₂.2H₂O	2500 mg/1 250 mg/1 150 mg/1 134 mg/1 150 mg/1
Mikrokompo- nensek	KI MnSO₄.H₂O H3BO3 ZnSO₄.7H₂O Na₂MoO₄.2H₂O CuSO₄ CoC1₂.6H₂O Na₂EDTA FeSO₄.7H₂O	1,5 mg/1 20 mg/1 6 mg/1 4 mg/1 0,5 mg/1 0,05 mg/1 0,05 mg/1 37,25 mg/1 27,85 mg/1
Vitaminok	Tiamin Piridoxin Nikotinsav B12 Riboflavin Aszkorb insav Biotin Folsav Kolin-klorid Pantotenát Kazein- hidrolizátum	2 mg/1 6 mg/1 4 mg/1 0,03 mg/1 1 mg/1 25 mg/1 2 mg/1 1 mg/1 2 mg/1 2 mg/1 500 mg/1
Hormonok	NAA BAP GA3	1 mg/1 0,2 mg/1 0,2 mg/1
Egyéb	Szacharóz Agár	30 g/1 8 g/1

A protoplaszt elkülönítése során a keverést Ficoll jelenlétében végeztük. A habzás kiküszöbölése és az elkülönítés időigényének rövidítése céljából a keverést közvetlenül a táptalajok (PGo, illetve BUL) jelenlétében végeztük. Noha a legmegfelelőbbnek a BUL táptalaj bizonyult, PGo táptalaj használatakor is jó eredményeket kaptunk.

A keveréses módszerrel kapott epidermiszszalagokat a 3. példában leírtakkal egyezően tenyésztettük.

9. példa

Védősejt-protoplasztok elkülönítése és tenyésztése

Krens és munkatársai módszerével [Plánt Physiology 90,1382-1386 (1989)] kapott epidermiszfragmenseket éjszakán át 2% cellulázt és 3% macerozymot tartalmazó „D” táptalajban emésztettünk. Megjegyezzük, hogy a különböző genotípusok emésztéséhez esetenként ettől kissé eltérő enzimkeverékekre van szükség. A 2. példában ismertetett mosás és tisztítás után védősejtekben igen dús protoplasztpopulációkat kaptunk. Ezzel a módszerrel esetenként 80-90%-ban védősejtprotoplasztokból álló populációkat is ki tudtunk alakítani. Ezután a protoplasztokat az 5. példában leírtak szerint kalcium-alginátba ágyaztuk be, majd 4 ml „J” táptalajjal töltött, Parafilmmel lezárt 6 cm átmérőjű Petricsészében fénytől védve 28 °C-on inkubáltuk. Ezekben a tenyésztésekben a védősejtekre rendszerint 25-50%os tenyésztési hatékonyságot észleltünk.

10. példa

Protoplasztok PEG-közvetített genetikai transzformálása

Ebben a példában pPG5 plazmidból származó DNS-t építettünk be, ami β-glükuronidáz (gus) riportergént és szelektálható markergénként Bialaphossal vagy foszfmotricinnel (két herbicid hatóanyag, amelyekre a cukorrépa rendszerint érzékeny) szemben rezisztenciát biztosító szekvenciát tartalmaz.

A műveletet Krens és munkatársai módszerével [Natúré 296, 72- 74 (1982)] végeztük, a következő paraméterek fenntartásával: Az optimális PEG-koncentrációt 20%-nak találtuk, azonban kisebb PEG-koncentrációk alkalmazásakor is képződtek stabil transzformátumok. Tapasztalataink szerint a PEG típusának nincs különösebb jelentősége. Az összes vizsgált DNS-koncentráció esetén képződtek stabil transzformátumok, optimálisnak azonban az 50 pg/500 000 protoplaszt koncentrációt találtuk. Az inkubálás időtartama 10-40 perc volt.

Néhány vizsgálat eredményeit az I. táblázatban foglaltuk össze.

I. táblázat

Stabil transzformációk gyakorisága

Cukorrépa- genotípus	Idő, pere	Tenyésztett protoplasztok (védősejt%)	Bialaphosrezisztens kalluszok	A transzformáció gyakorisága
(összesen)	(védősejtekre)
NF	10	180 000 (74)	22	l,2xl0-⁴	1,7x10-4
	20	180 000 (71)	23	l,3xl0-⁴	1,8x10-4
	30	83 000 (54)	28	3,4xl0-⁴	6,1x10-4
SES1	20	220 000 (80)	8	2,7x10-5	3,4x10-5
	30	190 000 (85)	1	5,3x10-«	6,2x10-5
	40	210 000 (76)	4	1,9x10-5	2,5x10-5

HU 220 585 Bl

A fent ismertetett összes esetben a PEG koncentrációja 13,3% volt, és 50 pg DNS-t (pPG5) használtunk.

Transzformálás után a protoplasztokat 0,25 mg/1 bialafoszt tartalmazó alginát táptalajra vittük át, és 4 hétig tenyésztettük. Ekkorra a transzformált védősejt-kalluszok jól azonosíthatókká váltak, és elkülönítés után regeneráló közegre átvihetők voltak.

11. példa

Levélszövet genetikai transzformálása

Ebben a példában pPG5 plazmidból származó DNS-t építettünk be, ami β-glükuronidáz (gus) riportergént és szelektálható markergénként Bialaphossal vagy foszfinotricinnel (két herbicid hatóanyag, amelyekre a cukorrépa rendszerint érzékeny) szemben rezisztenciát biztosító szekvenciát tartalmaz.

Két (BOÁI 13 és BUM2 jelű) cukorrépa-genotípus sterilen termesztett növényeiről levágtuk a leveleket, és a leveleket abaxiális felületükkel felfelé 0,6% agarral megszilárdított De Greef és Jacobs táptalajokra helyeztük. Egy-egy 9 cm átmérőjű Petri-csészébe 3-5 levelet helyeztünk.

1,6 pm átmérőjű aranyszemcséket szelektálható markerként foszfinotricin-acetil-transzferázt [foszfinotricinnel (bialaphos, BASTA) szemben rezisztenciát biztosító anyag] kódológént, valamint detektálható markergénként β-glükuronidázt (gus) kódoló gén másolatát tartalmazó plazmiddal vontunk be. A részecskék bevonására a kalcium-klorid/spermidin kicsapásos módszert használtuk, majd a részecskéket 100%-os etanolban újra szuszpendáltuk. A szuszpenzió 10 pl térfogatú aliquot részeit pipettával egy DuPont Biolistic PDSIOOO/He típusú génpisztoly makrohordozóira vittük fel, és szilikagél kristályok fölött megszáradni hagytuk.

A bombázást a következő körülmények között végeztük: a roncsolólemez és a makrohordozó közötti távolság 0,16 cm, a makrohordozó pásztázási távolsága 6 mm, a roncsolólemez nyomása 7-77 kg/cm², a célponttávolság 5, 8 vagy 12 cm, a célpontkamrában uralkodó nyomás pedig 71,6 Hgmm volt.

A bombázás után a leveleket 2 napig 23 °C-on tenyésztettük, majd a gus-gén kifejeződésének hisztokémiai lokalizálása céljából 5-bróm-4-klór-3-indolil-3-Dglükuroniddal (X-Gluc) megfestettük. Megfestés után a leveleket 20 percig 65 °C hőmérsékletű 95%-os etanolban tartva elszíntelenítettük. A gus-kifejezést mutató sejteket „színképző egységekének (CFU) neveztük. Mindkét genotípus esetén a védősejt-CFU-k gyakorisága az összes epidermisz-CFU-hoz viszonyítva 20-40% volt.

12. példa

A kalluszok tenyésztése és a növény regenerálása nap elteltével a láthatóvá vált mikrokalluszokat tartalmazó alginátdarabkákat 20 ml „K” táptalajt tartalmazó, 9 cm átmérőjű Petri-csészékbe helyeztük. A tenyésztést a fent közöltek szerint, fénytől védve végeztük.

A körülbelül 1-2 mm átmérőjű méretre növekedett töredező, vizes típusú kalluszokat egyenként kiemeltük, és húszas csoportokban friss „K” táptalajon tovább tenyésztettük. Ekkor mind a PCR-elemzés, mind a hisztokémiai gus-vizsgálat megerősítette a transzformátumok jelenlétét.

Kéthetes időközönként az összes kalluszt friss táptalajra helyeztük át, és továbbtenyésztettük.

Az egyedi kalluszok tenyésztésének első 8 hetében megjelentek a regenerátumok. Amikor az első hajtások láthatóvá váltak, és méretük elérte a körülbelül 2 mm-t, a Petri-csészét kiemeltük a sötét környezetből, és naponta 15 órán át 3000 lux fényerejű megvilágításban tartottuk.

A körülbelül 4 mm hosszúságú növénykéket egyenként 15 ml „K” táptalajt tartalmazó tenyésztőcsövekbe helyeztük át, és a fenti megvilágítási körülmények között tovább tenyésztettük.

13. példa

Gyökereztetés és talajba ültetés

Amikor a növénykék elérték a négyleveles állapotot (rendszerint 5-6 hét elteltével; eközben a harmadik hét végén egyszer a táptalajt frissre cseréltük), a növénykéket 15 ml „L” táptalajt tartalmazó tenyésztőcsövekbe helyeztük át, és a tenyésztést a fentiek szerint folytattuk.

Amikor a növénykék legalább egy gyökere elérte az 1 cm hosszúságot, a növénykéket kiemeltük a tenyésztőcsövekből, az agartörmelékeket folyó csapvizes mosással eltávolítottuk, és a növénykéket üvegházban tartott 9 cm átmérőjű cserepekben talajba ültettük.

Nedves környezet biztosítása céljából a növénykéket 7 napig átlátszó műanyag búra alatt tartottuk, majd védelem nélkül tovább hagytuk növekedni.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás Béta vulgáris növény előállítására, azzal jellemezve, hogy izolált Béta vulgaris-sztómasejtet regeneráló táptalajon tenyésztünk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy izolált Béta vulgaris-sztómasejtként cukorrépa-sztómasejtet használunk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sztómasejtet a sejtet tartalmazó intakt szervben vetjük alá regenerálásnak.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sztómasejtként az azt tartalmazó növényi szövetből elkülönített sejtet használunk.
5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sztómasejtként izolált levélepidermiszben lévő sejtet használunk.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a regenerálás során hormonmentes táptalajon kalluszt termelünk.
7. Eljárás növények genetikai transzformálására, azzal jellemezve, hogy a transzformálandó növény egy sztómasejtjébe átörökítőanyagot építünk be, és a transzformáit sejtből teljes növényeket regenerálunk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformálást öregedő levélszöveteken végezzük.

HU 220 585 Bl
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szövetként levélepidermiszt használunk.
10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformált sztómaszövet szétoszlatásával sejtszuszpenziót képezünk, és ebből regeneráljuk a növényeket.
11. A 7-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy regenerálás előtt a sztómasejteket protoplasztokká alakítjuk.
12. A 7-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy átörökítőanyagként egy adott antibiotikummal szemben rezisztenciát nem mutató szelektálható markergént tartalmazó DNS-szerkezetet használunk, és a transzformált szövetet a megfelelő szelekciós szer hatásának tesszük ki.
13. A 7-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy a transzformálást védősejtekben feldúsított sejtpopuláción hajtjuk végre.
14. A 7-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sztómasejteket a transzformálás előtt vagy után a sejtfal enzimes emésztésével protoplasztokká alakítjuk.
15. A 7-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformálás során a sztómasejtek szuszpenzióját mikroszkópos méretű rostos anyaggal keverjük össze, és a keveréket az átörökítőanyag jelenlétében keverjük.
16. A 7-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a regenerálás során hormonmentes táptalajon kalluszt termelünk.
17. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényként Béta vulgárist használunk, és az átörökítőanyagot közvetlen DNS-beillesztéssel visszük be a sztómasejtekbe.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy átörökítőanyagként antibiotikum-rezisztenciát biztosító gént nem tartalmazó DNS-szerkezetet használunk.
19. A 17. vagy 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy levélepidermiszben lévő sztómasejteket használunk.