JP2638217B2 - 外来遺伝子導入細胞培養法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、植物の細胞に外来遺伝子をマイクロインジ
ェクトする方法に関する。

（従来の技術） 植物の細胞に外来遺伝子をマイクロインジェクトする
場合、従来はプロトプラスト状態で行う。

例えば、カリフラワーモザイクウイルスDNAを所定の
濃度に調整し、コマツナのプロトプラストと混合しプリ
ッキング（針で刺す）すると、前記DNAが導入され、そ
の発現が蛍光塊により確認できる。

またカルスの細胞に、選択的に外来遺伝子をマイクロ
インジェクトする方法も開発されている。

（発明が解決しようとする問題点） プロトプラスト状態の細胞に外来遺伝子をマイクロイ
ンジェクト法により導入する場合、導入後のプロトプラ
ストの培養再生が困難で再生効率が悪いという問題点が
あった。

カルスにマイクロインジェクトする方法は、プロトプ
ラスト状態の場合に比較して再生率は良いが、導入後の
形質転換細胞由来のカルスの選抜が困難で、抗生物質耐
性を調べるのに時間がかかり、作業性が悪いという問題
点が残る。

そこで本発明は、外来遺伝子の導入を容易にし、かつ
導入後の細胞及び細胞由来のカルスを簡単に識別するこ
とを目的とする。

（問題点を解決するための手段） 上記問題点を解決するため、本発明は、植物の表皮組
織中の孔辺細胞に、マイクロインジェクション法により
外来遺伝子を導入した後、これを培養することを特徴と
する。

（作用と効果） 本発明により、外来遺伝子を導入した表皮組織のう
ち、表皮細胞には葉緑体がないから、葉緑体を有する緑
色の孔辺細胞を容易に識別できる。

従って、培養中、生長した細胞及びカルスのうち緑色
部分を選抜しこれを培養すれば、外来遺伝子を導入した
孔辺細胞及び細胞由来のカルスが得られる。

（実施例） 次に本発明の実施例を図面に示して説明する。

第１〜６図は本発明の第１実施例を示している。

第１図は葉の断面構造を示し、１、１は表皮組織で、
２は表皮細胞、３は孔辺細胞である。表皮組織１、１間
は棚状組織４と海綿状組織５が上下に層をなし、これら
の組織４、５と孔辺細胞３には葉緑体が存在する。

はじめに葉を高張液（0.8Mしょ糖液など）に浸漬し
て、マイクロインジェクトしやすいように原形質分離を
起こさせておく。

そしてマニュピュレータを装着した顕微鏡下で、孔辺
細胞に外来遺伝子ａをマイクロピペットにより導入する
（第２図）。

次に、表皮組織をピンセットで葉の他の組織より剥離
し（第３図）、フラスコ６内のカンテン培地７に置きカ
ルス培養する（第４図）。

培養中、生長した細胞及びカルス８のうち（第５
図）、緑色部分8a即ち葉緑体を持つ部分を選抜して継代
培養をする（第６図）。緑色部分以外の部分8bは葉緑体
を持たない表皮組織で外来遺伝子ａがない。

次に第２実施例を第７〜10図に示す。

この実施例においては、先ず葉の表皮10をメスで軽く
切り込み、ピンセットで剥離する（第７図Ａ、Ｂ）。

この表皮10を、マニュピュレータを装着した顕微鏡下
に置き、その孔辺細胞３に、マイクロインジェクション
法により、外来遺伝子ａを注入した後（第８図Ａ、
Ｂ）、表皮10をフラスコ中の酵素13に入れプロトプラス
トを単離する（第９図Ａ）。

次にこのプロトプラストをパコールで密度勾配をつけ
た遠心チューブ11に移し、ロータ12で遠心分離す（第９
図Ｂ、Ｃ）。

遠心チューブ11の中のプロトプラストは、細胞の大き
さにより孔辺細胞３と表皮細胞２とに層間分離する（第
10図Ａ）。

そこでパスツールピペット14を用いて、目的の層より
孔辺細胞３を取り出し、培養器15に移して培養する（第
10図Ｂ、Ｃ）。

このように遠心分離できない例外的植物の場合は、培
養後、葉緑体の有無によりカルスの色で識別して選別す
る。

第２実施例は、表皮組織中の細胞の形態の違いに着目
して、孔辺細胞に外来遺伝子をマイクロインジェクショ
ンするから、従来のプロトプラスト状態のマイクロイン
ジェクション法に比較して、導入操作の効率が格段によ
い。

また、表皮細胞と孔辺細胞は、密度勾配遠心分離法に
より容易に分離できるから、薬剤耐性に限界のある従来
法に比較し、細胞選抜操作の効率が著しく向上する。

【図面の簡単な説明】

第１〜第６図は本発明の第１実施例を図解的に示す。 第１図は葉の組織の断面図、第２図はその要部拡大図
で、外来遺伝子を導入する工程を示す。 第３図は葉の表皮組織を剥離する工程を示す。 第４図は表皮組織をフラスコ内の培養地に置く工程を示
す。 第５図は培養中のフラスコを示す。 第６図は培養したカルスのうち葉緑体を持つ緑色部分の
カルスを選抜し、別のフラスコへ移して継代培養する工
程を示す。 第７〜10図は本発明の第２実施例を示す。 第７図は、葉の表皮剥離工程を示し、そのうち（Ａ）は
葉の表皮にメスで切込み線を刻む工程を、また（Ｂ）は
切込み線で囲んだ表皮をピンセットで剥離する工程をそ
れぞれ示す。 第８図は、外来遺伝子導入工程を示し、そのうち（Ａ）
はマニュピュレータで外来遺伝子を導入する様子を表わ
し、（Ｂ）はその顕微鏡像を表わす。 第９図はプロプラストの単離工程を示し、（Ａ）はフラ
スコ中の酵素に表皮を入れるところを表わし、（Ｂ）は
フラスコからプロトプラストを遠心チューブに移し、パ
コールで密度勾配をつけるところを表わし、（Ｃ）は遠
心チューブをロータに設置し回転するところを表わす。 第10図は細胞選抜工程を示し、（Ａ）は孔辺細胞と表皮
細胞が遠心分離した状態を示す。（Ｂ）は遠心分離した
孔辺細胞をパスツールピペットで取り出す様子を示す。
（Ｃ）は孔辺細胞を培養器へ移す様子を示す。 １は表皮組織、２は表皮細胞、３は孔辺細胞、６はフラ
スコ、７は培地、８はカルス、8aは孔辺細胞由来のカル
ス、ａは外来遺伝子、10は表皮、11は遠心チューブ、12
はロータ、13は酵素。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】植物の表皮組織中の孔辺細胞に、マイクロ
   インジェクション法により外来遺伝子を導入した後、こ
   れを培養することを特徴とする外来遺伝子導入細胞培養
   法。