CN109971757A

CN109971757A - 一种双sgRNA位点敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统与应用

Info

Publication number: CN109971757A
Application number: CN201910242231.6A
Authority: CN
Inventors: 赵恩峰; 贺小宏; 王延宾; 任江涛; 韩露
Original assignee: Nanjing North Heng Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing North Heng Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2019-07-05

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及肿瘤发生、发展相关基因敲除方法，具体涉及一种双sgRNA位点敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统与应用；本发明首次双位点敲除法，采用在同一外显子上设计两个sgRNA序列，针对该外显子上两个位点进行切割，可高效敲除FOXR1基因，且只需PCR、电泳即可确定是否敲除成功，大大降低了敲除后鉴定成本，且敲除后只有一种突变型，大大增加了敲除结果的稳定性；将含有所述sgRNA的CRISPR/Cas9系统转染细胞，可获得敲除FOXR1基因的细胞株。

Description

一种双sgRNA位点敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及肿瘤发生、发展相关基因敲除方法，具体涉及一种双sgRNA位点敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统与应用。

背景技术

FOXR1基因(forkhead box R1)编码(Fox)家族许多成员的转录因子。FOX家族成员是具有约110aa的DNA结合结构域的单体螺旋螺旋蛋白。许多FOX转录因子在确定早期发育过程中的细胞命运起着重要作用。而FOXR1基因在神经母细胞瘤中表达急剧降低，根据这一特性，有助于发展新的肿瘤标志物和靶向治疗分子，为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路。

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来消除入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPRRNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链RNA。通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA)，引导Cas9对DNA的进行定点切割，CRISPR/Cas系统具有操作简单，剪切效率高等特点。

目前，CRISPR/Cas基因敲除技术已广泛应用于果蝇、大鼠、小鼠、斑马鱼等实验模型。传统的敲除方法使用一个sgRNA，针对一个位点进行敲除，虽然效率高，但DNA自主修复不确定性高，且缺失几个碱基不宜于鉴定，往往需要大量测序，花费大量资金进行鉴定。

发明内容

本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种双sgRNA位点敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统与应用。

为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

一种敲除FOXR1基因的sgRNA，包括FOXR1 sgRNA-1和FOXR1 sgRNA-2；

所述FOXR1 sgRNA-1的序列如下：

FOXR1 sgRNA-1：GTATCCCCCTGGAAAGCTGG(SEQ ID No.1)

FOXR1 sgRNA-1oligo1：5’-caccGTATCCCCCTGGAAAGCTGG-3’；(SEQ ID No.2)

FOXR1 sgRNA-1oligo2：5’-aaacCCAGCTTTCCAGGGGGATAC-3’；(SEQ ID No.3)

所述FOXR1 sgRNA-2的序列如下：

FOXR1 sgRNA-2：GAAAAGGCAAACCGCTTCCG(SEQ ID No.4)

FOXR1 sgRNA-2oligo1：5’-caccGAAAAGGCAAACCGCTTCCG-3’；(SEQ ID No.5)

FOXR1 sgRNA-2oligo2：5’-aaacCGGAAGCGGTTTGCCTTTTC-3’。(SEQ ID No.6)

一种双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统，包括所述FOXR1sgRNA-1和FOXR1 sgRNA-2的DNA序列。

一种双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统的构建方法，包括以下步骤：

步骤1，使用BsmbI酶切CRISPR/Cas9载体LentiCRISPR V2，得到酶切后的载体；

步骤2，将所述靶向敲除FOXR1基因的sgRNA的DNA序列磷酸化后与酶切后的LentiCRISPR-V2载体连接，得到得到靶向敲除FOXR1基因的LentiCRISPR V2-FOXR1 sgRNA-1&LentiCRISPR V2-FOXR1 sgRNA-2，构建靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统。

所述靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统可用于制备敲除FOXR1基因的细胞株。

一种敲除FOXR1基因的细胞株，所述细胞株是运用所述双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统进行靶向敲除得到的细胞中的FOXR1基因缺失的细胞株。

优选地，所述细胞株为A549细胞株。

优选地，所述的A549细胞株为人非小细胞肺癌细胞A549。

优选地，所述FOXR1基因的具体靶向敲除位点为：

TGAGTTCTCTGACCTGTTTCTGTGGCCTGGGCTGGAGACCAGGGGCACCCAAAGCCAGTGGGCTGTGGCACACAATCTTTTGTTCTGCACAGGTCCAGATTATGAGCCCAACCTCTGGATGTGGGTAAATCCCAACATTGTGTATCCCCCTGGAAAGC-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AAGCGGTTTGCCTTTTCCCCCAGCACCTGGGAGGTATGCATTTTTGGGGATGGGAGTGGGACTTGGGCAGTAGGCGAGGGGCATGGGGAAGAGCCATTACAGTTCTGCTCTCTTAGCCATAGCAAAAGGTGAATGGGTTCAGAAATTACCTACATGCTTGGGTTGGGGAGAAGCCCAAATGGTGGCCTTAGACCACCCCCCCTTCCTGCCACTGCACCCTGGAGTAGAGGCTGAGGAGT。(SEQ ID No.10)

所述敲除FOXR1基因的细胞株的制备方法，包括以下步骤：将含有sgRNA的质粒转染至细胞株，得到敲除FOXR1基因的细胞株；

所述双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的鉴定方法为：

步骤A，采用碱裂解法裂解细胞，释放细胞基因组DNA；

步骤B，采用PCR扩增和凝胶电泳检测。

优选地，所述PCR扩增的引物为：

FOXR1-jc-F:TGAGTTCTCTGACCTGTTTCTG(SEQ ID No.7)

FOXR1-jc-R:ACTCCTCAGCCTCTACTCCA(SEQ ID No.8)

相对于现有技术，本发明的优点如下，

本发明在同一外显子上设计两个sgRNA序列，针对该外显子上两个位点进行切割，只需PCR、电泳即可确定是否敲除成功，大大降低了敲除后鉴定成本，且敲除后只有一种突变型，大大增加了敲除结果的稳定性；

有技术一般采用单位点敲除法，本方法采用双位点敲除法；

本发明的FOXR1 sgRNA-1&FOXR1 sgRNA-2敲除效率高，

附图说明

图1为LentiCRISPR V2-FOXR1 sgRNA-1&LentiCRISPR V2-FOXR1 sgRNA-2测序结果；

图2为碱裂解法鉴定共转LentiCRISPR V2-FOXR1 sgRNA-1&LentiCRISPR V2-FOXR1 sgRNA-2电泳图；其中M为DNA Marker、-为阴性对照、+为共转双质粒；

图3为碱裂解法鉴定共转LentiCRISPR V2-FOXR1 sgRNA-1单克隆电泳图；其中M为DNA Marker、1为A549-FOXR1 1、2为A549对照组。；

图4为荧光定量PCR检测A549细胞FOXR1mRNA表达；其中actin为内参基因表达对照组；FOXR1组为敲除基因表达实验组；A549为FOXR1基因未敲除组、A549-FOXR1 1为FOXR1基因敲除组和阴性对照组；

图5为基因敲除测序结果；其中A549为阴性对照测序结果、A549-FOXR1 1为基因敲除组测序结果；

图6为FOXR1基因组序列信息；其中片段2为敲除组敲掉的基因片段信息。

具体实施方式

实施例1：

1.使用CRISPR/Cas9技术构建敲除FOXR1质粒

1.1sgRNA寡核苷酸链合成

使用CRISPR在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)根据评分系统，分别在FOXR1的3号外显子上设计2个20bp的sgRNA。根据这两条标准找到外显子上的核心序列：FOXR1 sgRNA-1和FOXR1 sgRNA-2。编码链模板5′端添加CACC，非编码链模板3′端添加AAAC，与BsmbI酶切后形成的粘性末端互补，设计2对CRISPR寡核苷酸链。

FOXR1靶向位点及sgRNA寡核苷酸序列

FOXR1 sgRNA-1oligo1：5’-caccGTATCCCCCTGGAAAGCTGG-3’；(SEQ ID No.2)

FOXR1 sgRNA-1oligo2：5’-aaacCCAGCTTTCCAGGGGGATAC-3’；(SEQ ID No.3)

FOXR1 sgRNA-2oligo1：5’-caccGAAAAGGCAAACCGCTTCCG-3’；(SEQ ID No.4)

FOXR1 sgRNA-2oligo2：5’-aaacCGGAAGCGGTTTGCCTTTTC-3’；(SEQ ID No.5)

1.2载体构建

1.2.1使用BsmbI酶切1μg LentiCRISPR V2质粒，30min，37℃：

1.2.2使用天根胶回收试剂盒纯化酶切质粒产物，按说明书进行操作。

1.2.3 sg RNA oligo退火及双链的形成

1.2.4 LentiCRISPR V2&sgRNA连接，16℃孵育2h。

1.2.5将连接后的质粒转化至感受态细胞DH5α中，均匀涂至amp抗性LB固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，单个菌落即可出现。

1.2.6挑取单个菌落扩大培养并质粒小提。

1.2.7测序鉴定质粒构建成功，命名为LentiCRISPR V2-FOXR1 sgRNA-1&LentiCRISPR V2-FOXR1 sgRNA-2。图1为LentiCRISPR V2-FOXR1 sgRNA-1&LentiCRISPRV2-FOXR1 sgRNA-2测序结果。

1.3脂质体法将两个质粒1：1转染细胞(将含有sgRNA&cas9基因的质粒LentiCRISPR V2-FOXR1 sgRNA-1转染至A549细胞株，得到敲除FOXR1基因的细胞株；所述的A549细胞株优选为人非小细胞肺癌细胞A549)

1.3.1欲混试剂：A&B；

1.3.2提前一天用完全培养基(10％胎牛血清的高糖DMEM培养基)接种细胞，于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养；

1.3.3细胞达到70-90％汇合度时转染；

1.3.4使用opti-MEM lipofectamine R 3000试剂充分混匀；

1.3.5使用opti-MEM培养基稀释DNA制备DNA欲混液，然后添加P3000^TM试剂充分混匀；

1.3.6将稀释DNA与稀释的lipofectamine R 3000试剂混合(1:1)；

1.3.7孵育5mins；

1.3.8加入DNA-脂质体复合物至细胞中；

1.3.9 48-72h用含1ng/ml嘌呤霉素(puro)完全培养基抗性筛选；

1.3.10待对照细胞完全死亡，改用完全培养基恢复培养2-3天；

1.3.11消化，收集细胞用于单克隆挑选&碱裂解法PCR鉴定；

1.3.12对共转LentiCRISPR V2-FOXR1 sgRNA-1&LentiCRISPR V2-FOXR1 sgRNA-2质粒A549结果如图2：PCR出现两个条带，其中2为双位点共同发生切割，导致基因片段缺失149bp，1为单位点切割或未发生切割基因片段大小无法判断。此种方法经PCR鉴定后是否发生切割一目了然，如出现双条带，且较小条带比预期片段小149bp，则该基因上的两个位点均发生了切割，缩短了鉴定时间，降低了鉴定成本。

1.4有限稀释法挑单克隆

1.4.1分装每孔0.1毫升A549细胞的96孔细胞培养板(可提前24小时准备就绪，置CO₂培养箱中备用)；

1.4.2自细胞培养瓶中收集长势良好的细胞(亦可自24孔培养板孔中收集)，制成悬液；

1.4.3按白细胞计数方法准确计得细胞悬液的细胞数，一般在10⁵/毫升左右；

1.4.4取3支10毫升刻度离心管排列在超净工作台试管架上，先用无血清培养基将细胞稀释至10³/毫升，再用含15％小牛血清的完全培养基稀释到10¹/毫升细胞，即每0.1毫升1个细胞；

1.4.5每孔0.1毫升细胞悬液；

1.4.6置37℃5％CO₂培养箱，4天后取出观察，并在板盖上打上标记，做好记录并统计结果；

1.4.7继续培养时，在第4-5天更换1/2培养基；

1.4.8约第7-9天选择单克隆生长孔，生长良好，阳性强者，转移到24孔板再做克隆经培养或扩大培养；

1.4.9实验结果以总细胞孔(如96孔)中出现克隆孔统计出克隆百分率，并可进一步按单细胞孔、双细胞孔、多细胞孔分别计算出百分率。

1.5碱裂解法鉴定基因敲除细胞株

1.5.1设计合成PCR鉴定引物

FOXR1-jc-F:TGAGTTCTCTGACCTGTTTCTG(SEQ ID No.7)

FOXR1-jc-R:ACTCCTCAGCCTCTACTCCA(SEQ ID No.8)

1.5.2配置50uM NaOH、1M PH 8.0trisHCl

1.5.3消化好的细胞≥5000rpm离心1～3分钟，弃上清

1.5.4向离心管底部加50ul 50uM NaOH

1.5.5 95℃/煮沸10～30分钟，冷却至室温

1.5.6加入10％1M PH 8.0tris-HCl中和溶液

1.5.7 12000rpm离心5min，吸取上清用于后续实验

1.5.8 PCR检测

1.5.9 2％琼脂糖凝胶电泳120v 20-25min

1.5.10电泳条带比对照小149bp的样品送测序

碱裂解法鉴定共转LentiCRISPR V2-FOXR1 sgRNA-1单克隆电泳图如图3所示；其中M为DNA Marker、1为A549-FOXR1 1、2为A549对照组；

荧光定量PCR检测A549细胞FOXR1mRNA表达的结果如图4所示；其中actin为内参基因表达对照组；FOXR1组为敲除基因表达实验组；A549为FOXR1基因未敲除组、A549-FOXR1 1为FOXR1基因敲除组和阴性对照组；

基因敲除测序结果如图5所示；其中A549为阴性对照测序结果、A549-FOXR1 1为基因敲除组测序结果；

FOXR1基因组序列信息如图6所示(SEQ ID No.9)；其中片段2为敲除组敲掉的基因片段信息；敲除后的FOXR1基因组序列如SEQ ID No.10所示。

1.5.11经测序鉴定A549-FOXR1 1均在NGG前3个碱基位置进行切割，多个克隆均缺失该片段信息，避免了单位点缺失不确定性，使基因敲除定点缺失操作性更强，同时简化了鉴定方法，既节省时间，又降低成本。

图5、图6可以看出基因组上该基因序列片段敲除成功，经mRNA反转录荧光定量PCR鉴定，该基因FOXR1并未表达，达到了基因敲除的目的。

需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京北恒生物科技有限公司

<120> 一种双sgRNA位点敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统与应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

gtatccccct ggaaagctgg 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caccgtatcc ccctggaaag ctgg 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaacccagct ttccaggggg atac 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

gaaaaggcaa accgcttccg 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccgaaaag gcaaaccgct tccg 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaaccggaag cggtttgcct tttc 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

tgagttctct gacctgtttc tg 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

actcctcagc ctctactcca 20

<210> 9

<211> 546

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

tgagttctct gacctgtttc tgtggcctgg gctggagacc aggggcaccc aaagccagtg 60

ggctgtggca cacaatcttt tgttctgcac aggtccagat tatgagccca acctctggat 120

gtgggtaaat cccaacattg tgtatccccc tggaaagctg gaggtctcag gacgtaggaa 180

gagggaggac ctgacaagca cactcccctc ctctcagcca ccccagaagg aggaagatgc 240

cagctgctca gaggccgcag gggtggaatc actgtcccag tcctccagca agcggtctcc 300

ccctcggaag cggtttgcct tttcccccag cacctgggag gtatgcattt ttggggatgg 360

gagtgggact tgggcagtag gcgaggggca tggggaagag ccattacagt tctgctctct 420

tagccatagc aaaaggtgaa tgggttcaga aattacctac atgcttgggt tggggagaag 480

cccaaatggt ggccttagac caccccccct tcctgccact gcaccctgga gtagaggctg 540

aggagt 546

<210> 10

<211> 397

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 10

tgagttctct gacctgtttc tgtggcctgg gctggagacc aggggcaccc aaagccagtg 60

ggctgtggca cacaatcttt tgttctgcac aggtccagat tatgagccca acctctggat 120

gtgggtaaat cccaacattg tgtatccccc tggaaagcaa gcggtttgcc ttttccccca 180

gcacctggga ggtatgcatt tttggggatg ggagtgggac ttgggcagta ggcgaggggc 240

atggggaaga gccattacag ttctgctctc ttagccatag caaaaggtga atgggttcag 300

aaattaccta catgcttggg ttggggagaa gcccaaatgg tggccttaga ccaccccccc 360

ttcctgccac tgcaccctgg agtagaggct gaggagt 397

Claims

1.一种敲除FOXR1基因的sgRNA，其特征在于，包括FOXR1 sgRNA-1和FOXR1 sgRNA-2；

所述FOXR1 sgRNA-1的序列如下：

FOXR1 sgRNA-1：GTATCCCCCTGGAAAGCTGG

FOXR1 sgRNA-1 oligo1：5’-caccGTATCCCCCTGGAAAGCTGG-3’；

FOXR1 sgRNA-1 oligo2：5’-aaacCCAGCTTTCCAGGGGGATAC-3’；

所述FOXR1 sgRNA-2的序列如下：

FOXR1 sgRNA-2：GAAAAGGCAAACCGCTTCCG

FOXR1 sgRNA-2 oligo1：5’-caccGAAAAGGCAAACCGCTTCCG-3’；

FOXR1 sgRNA-2 oligo2：5’-aaacCGGAAGCGGTTTGCCTTTTC-3’。

2.一种双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，包括权利要求1所述FOXR1 sgRNA-1和FOXR1 sgRNA-2的DNA序列。

3.如权利要求2所述的双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.如权利要求2或3所述靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统在制备敲除FOXR1基因的细胞株中的应用。

5.一种敲除FOXR1基因的细胞株，其特征在于，所述细胞株是运用权利要求2所述所述双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的CRISPR/Cas9系统进行靶向敲除得到的细胞中的FOXR1基因缺失的细胞株。

6.如权利要求5所述的敲除FOXR1基因的细胞株，其特征在于，所述细胞株为A549细胞株。

7.如权利要求5所述的敲除FOXR1基因的细胞株，其特征在于，所述FOXR1基因的具体靶向敲除位点为：

TGAGTTCTCTGACCTGTTTCTGTGGCCTGGGCTGGAGACCAGGGGCACCCAAAGCCAGTGGGCTGTGGCACACAATCTTTTGTTCTGCACAGGTCCAGATTATGAGCCCAACCTCTGGATGTGGGTAAATCCCAACATTGTGTATCCCCCTGGAAAGC-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AAGCGGTTTGCCTTTTCCCCCAGCACCTGGGAGGTATGCATTTTTGGGGATGGGAGTGGGACTTGGGCAGTAGGCGAGGGGCATGGGGAAGAGCCATTACAGTTCTGCTCTCTTAGCCATAGCAAAAGGTGAATGGGTTCAGAAATTACCTACATGCTTGGGTTGGGGAGAAGCCCAAATGGTGGCCTTAGACCACCCCCCCTTCCTGCCACTGCACCCTGGAGTAGAGGCTGAGGAGT。

8.如权利要求5所述的敲除FOXR1基因的细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有sgRNA的质粒转染至细胞株，得到敲除FOXR1基因的细胞株。

9.一种双sgRNA位点靶向敲除FOXR1基因的鉴定方法为，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A，采用碱裂解法裂解细胞，释放细胞基因组DNA；

步骤B，采用PCR扩增和凝胶电泳检测。

10.如权利要求9所述的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的引物为：

FOXR1-jc-F:TGAGTTCTCTGACCTGTTTCTG；

FOXR1-jc-R:ACTCCTCAGCCTCTACTCCA。