CN114606199B - 一种目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法，所述方法至少包括以下步骤：（1）将sgRNAs组转染到同一宿主细胞中，所述sgRNAs组中，包含2个sgRNA，且2个sgRNA靶向同一目的基因的不同靶点；所述sgRNAs组的数量为一个或多个；当所述sgRNAs组的数量为多个时，不同sgRNAs组靶向不同目的基因；（2）富集表达2个或多个所述sgRNAs的宿主细胞；（3）培养步骤（2）获得的宿主细胞，获得表达目标基因片段缺失的突变体细胞。本发明采用共转染结合短时间药物筛选，能够在培养细胞中富集同时包含表达2个或多个sgRNA的细胞，从而在小鼠胚胎干细胞高效获得发生基因片段缺失突变体细胞。

Description

一种目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，特别是涉及一种目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法。

背景技术

基因编辑(gene editing)，又称基因组编辑(genome editing)或基因组工程(genome engineering)，是一种新兴的能对生物体基因组特定目标基因进行改造的一种基因工程技术。它能利用位点专一的核酸内切酶在基因组特定位点上剪切，从而造成双链DNA断裂。随后，生物体启动自我修复途径引起目标位点碱基的插入、缺失或替换，从而在特定位点产生遗传变异。

基因编辑技术能够在细胞中高效产生点突变，有文献报道用2个sgRNA的基因编辑技术在胚胎干细胞中产生目标基因片段缺失突变体细胞，但效率很低。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法。

本发明第一方面提供一种目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法，所述方法至少包括以下步骤：

(1)将sgRNAs组转染到同一宿主细胞中，所述sgRNAs组中，包含2个sgRNA，且2个sgRNA靶向同一目的基因的不同靶点；所述sgRNAs组的数量为一个或多个；当所述sgRNAs组的数量为多个时，不同sgRNAs组靶向不同目的基因；

(2)富集表达2个或多个所述sgRNAs的宿主细胞；

(3)培养步骤(2)获得的宿主细胞，获得表达目标基因片段缺失的突变体细胞。

本发明第二方面提供目标基因片段缺失突变体细胞，所述突变体采用前述制备方法获得。

如上所述，本发明的目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法，具有以下有益效果：

本发明采用共转染结合短时间药物筛选，能够在培养细胞中富集同时包含表达2个或多个sgRNA的细胞，从而在小鼠胚胎干细胞高效获得发生基因片段缺失突变体细胞。这个技术将来也可以推广到包括人类胚胎干细胞等其它细胞。这有助于研究目标基因功能完全缺失的突变体细胞，类器官和动物模型。

附图说明

图1胚胎干细胞经过转染和嘌呤霉素药筛的前后生长情况。A,D1911胚胎干细胞已经达到比较富集，可以被胰蛋白酶消化后收集用于转染。B,转染1天后D1911胚胎干细胞克隆的生长情况。C,嘌呤霉素药筛1天后胚胎干细胞已开始快速死亡。D,嘌呤霉素药筛2天后胚胎干细胞已绝大部分死亡。E,去除嘌呤霉素用正常胚胎干细胞培养基培养1天后胚胎干细胞已经快速恢复生长。F,在无嘌呤霉素采用正常胚胎干细胞培养基培养2天后胚胎干细胞又已经达到比较富集。

图2单个胚胎干细胞克隆经过稀释铺板和挑选前后生长情况。A,经过嘌呤霉素药筛富集转染的D1911胚胎干细胞先用胰蛋白酶消化，然后稀释铺到预先铺好饲养层细胞的10-cm细胞培养板上。B,分开的胚胎干细胞单克隆会在几天后逐渐在饲养层细胞上长大。C,胚胎干细胞单克隆已经长大到可以在显微镜下单个被挑取。D,单个挑取的胚胎干细胞单克隆经过胰蛋白酶消化后铺到预先铺好饲养层细胞的24孔板细胞培养板，每个孔培养一个胚胎干细胞单克隆。E,胚胎干细胞克隆已经在24孔板细胞培养板饲养层细胞上快速生长。F,这些单个挑取的胚胎干细胞单克隆已长到可以被收集冻存，同时用这些胚胎干细胞单克隆的一些细胞提取基因组DNA样品用于PCR筛选缺失突变体。

图3在D1911胚胎干细胞中获得了Zfp445基因片段缺失的突变体细胞。

图4在TC1胚胎干细胞中获得了Zfp445基因片段缺失的突变体细胞。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，如本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

本发明一实施例的目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法，所述方法至少包括以下步骤：

(1)将sgRNAs组转染到同一宿主细胞中，所述sgRNAs组中，包含2个sgRNA，且2个sgRNA靶向同一目的基因的不同靶点；所述sgRNAs组的数量为一个或多个；当所述sgRNAs组的数量为多个时，不同sgRNAs组靶向不同目的基因；

(2)富集表达2个或多个所述sgRNAs的宿主细胞；

(3)培养步骤(2)获得的宿主细胞，获得表达目标基因片段缺失的突变体细胞。

本发明中，转染用的sgRNAs组靶向同一目的基因的不同靶点，能够造成该基因的大片段缺失。

靶点是指与sgRNA碱基互补配对的基因组DNA位点。

所述sgRNAs组中，2个sgRNA靶点的距离一般是100bp以上，可达几个kb或者更长，但一般效率可能会降低。

所述sgRNAs组中，2个sgRNA靶点的距离是指，与sgRNA碱基互补配对的基因组DNA2个位点之间碱基对的长度。

在一种实施方式中，同一目的基因的相邻sgRNA靶点的距离一般优选是100bp-1000bp。如果太长可能效率低一些。可能需要多挑选一些克隆筛选获得缺失突变体，但也可以通过适量减少表达药物抗性质粒进一步富集同一细胞中共转染表达2个sgRNAs或多个sgRNAs的质粒，然后获得缺失突变体。

可选的，为100-900bp,100-800bp，100-700bp，100-600bp，100-500bp，100-400bp，100-300bp,100-200bp；200-900bp，200-800bp，200-700bp，200-600bp，200-500bp，200-400bp，200-300bp；300-900bp,300-800bp,300-700bp，300-600bp，300-500bp，300-400bp；400-900bp，400-800bp，400-700bp，400-600bp，400-500bp；500-900bp，500-800bp，500-700bp，500-600bp；600-900bp，600-800bp，600-700bp；700-900bp，700-800bp，800-900bp。

步骤(1)中，所述sgRNAs组的数量为一个或多个。

当所述sgRNAs组的数量为多个时，不同sgRNAs组靶向不同目的基因。同一宿主细胞中，可以同时表达多对sgRNAs组，每2个sgRNAs组靶向同一目的基因2个不同靶点，多个sgRNAs组可以同时靶向多个目的基因，敲除多个目的基因。

在一种实施方式中，步骤(1)中，表达2个或者多个sgRNA的DNA序列包含于载体上。

优选的，sgRNA组中的2个或多个sgRNA包含于不同载体上，便于载体构建，也可以一个载体表达2个或多个sgRNA。

在一种实施方式中，所述宿主细胞为胚胎干细胞。

优选的，在步骤(2)之前，还包括以下步骤：将药物抗性基因转染到步骤(1)所述的宿主细胞中。

在一种实施方式中，步骤(2)中，富集的方式为采用药物去除不含药物抗性基因的宿主细胞。

可选的，富集天数为两天，也可延长1天。

在一种实施方式中，所述药物抗性基因包含于载体上。

优选的，所述sgRNA和所述药物抗性基因不在同一载体上，便于改变表达药物抗性基因的质粒用量，然后优化富集共转染细胞。

优选的，转染时，药物抗性基因的载体初始量少于每个sgRNA的载体初始量。

如果有多个sgRNA组，药物抗性基因的载体初始量也少于每个sgRNA的载体初始量。

每个sgRNA的载体初始量与所述药物基因的载体初始量比例可以调整。如果筛选后没有获得缺失突变体，药物抗性质粒的用量可以减少，这样可以进一步富集共转染的细胞，然后比较容易获得缺失突变体。

可选的，每个sgRNA的载体初始量与所述药物抗性基因的载体初始量的形式可以为数量或者是质量。

表达所有sgRNA的载体总共用量与所述药物抗性基因的载体用量的比例建议使用范围是20:1-4:1。可以适当调整超出这个范围。

在一种实施方式中，用2个sgRNA敲除一个目的基因，所述每个sgRNA的载体初始量与所述药物抗性基因的载体初始量的比为2：1。

在一种实施方式中，药物抗性基因的载体初始量为0.8μg及以下。

例如本发明使用的嘌呤霉素抗性载体的用量为0.8μg，也可以根据筛选需要减少用量少于0.8μg，进一步富集表达所有sgRNA的载体共转染细胞。

在一种实施方式中，所述药物为抗生素。

在一种实施方式中，抗生素为嘌呤霉素。

在一种实施方式中，步骤(1)中，转染的方法选自脂质体介导的转染。

目前没有人采用药物筛选来获得缺失突变体，本发明的方法加入了药物筛选。这里的药物筛选可以去掉大部分没有转染的胚胎干细胞，从而富集同时包含表达2个或多个sgRNA的细胞。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞，小鼠胚胎干细胞或人胚胎干细胞，小鼠或人iPS细胞等动物细胞。

实施例1

一、胚胎干细胞转染

本发明用两个携带不同sgRNA的质粒作用在同一个基因2个不同的靶点上，来造成该基因的大片段缺失。本实施例以Zfp445作为例子，在D1911和TC1细胞系中均能成功敲除这个基因，得到了预期的缺失突变体。

转染前的准备：

设计靶向Zfp445的sgRNAs，各个sgRNA序列如下所示：

sgRNA1：

由sgRNA1上游引物：

caccGAATAGGAATTTGTGACGTCC(SEQ ID NO:1)和

sgRNA1下游引物：

aaacGGACGTCACAAATTCCTATTC(SEQ ID NO:2)

这2个引物退火后形成双链DNA,然后克隆到pX330载体(来自于Addgene)。这就可以转染细胞后表达

sgRNA1:GAATAGGAATTTGTGACGTCC(SEQ ID NO:3)。

sgRNA2:

由sgRNA2上游引物：

caccGAGCTCAGCGCAATCTTTATC(SEQ ID NO:4)

和

sgRNA2下游引物：

aaacGATAAAGATTGCGCTGAGCT(SEQ ID NO:5)

这2个引物退火后形成双链DNA,然后克隆到pX330载体。这就可以转染细胞后表达

sgRNA2:GAGCTCAGCGCAATCTTTATC(SEQ ID NO:6)。

获得靶向Zfp445的DNA质粒，即分别这2个表达sgRNA的质粒pX330载体。

为了确保每种质粒转入胚胎干细胞(ES)细胞的概率相同，首先将用于转染的DNA质粒根据用量均匀混合，再将混合好的DNA质粒样品与Invitrogen生产的转染试剂Lipofectamine 2000或者Lipofectamine 3000均匀混合。此外，为了更大可能筛选出来被CRISPR编辑过的ES单克隆，本发明使用了比靶向Zfp445的DNA质粒用量少的嘌呤霉素抗性质粒进行转染。

含有嘌呤霉素抗性基因的表达质粒可以是来源于Addgene的pX334载体或其它载体。

含有嘌呤霉素抗性基因的表达质粒和表达2个sgRNA的pX330载体是不一样的，分别位于不同质粒上。减少表达嘌呤霉素抗性基因的质粒可以使嘌呤霉素药物筛选后存活的细胞比较高比例会同时携带表达2个sgRNA的pX330载体。

在ES细胞培养到接近互相接触(长满)之前，用胰蛋白酶消化后离心并计数(图.1A)。在做转染之前，提前4-12小时将含嘌呤霉素抗性基因的饲养层细胞铺到6孔板或者3.5cm板上，之后会将用来做转染的ES细胞铺到含嘌呤霉素抗性基因的饲养层细胞上。所述饲养层细胞是指用携带嘌呤霉素抗性基因的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)制备的饲养层细胞。

进行转染：

1.取两组1.5-ml EP管，组1为脂质体组，组2为DNA质粒组，按照转染组别进行标记。在组1中加入无血清的DMEM和转染所用的脂质体。如150μl DMEM和6μl Lipofectamine2000(或者Lipofectamine 3000)。小量程移液枪吸取脂质体，在DMEM液面上方成滴加入脂质体。用手指弹EP管底部几次混合或用移液枪温和吹打几次混合，室温静置5-10分钟，同时开始混合转染的DNA样品。DNA样品包括表达2个sgRNA的pX330载体和表达嘌呤霉素抗性基因的质粒。

2.组2为DNA质粒组。本实施例使用双质粒转染的方法，包括sgRNA1和sgRNA2。在每个转染体系中，每种靶向Zfp445的DNA质粒的用量为1.6μg。嘌呤霉素抗性质粒的用量为0.8μg。小量程移液枪吹打15次以上使之均匀混合。把混合好的质粒混合物中加入到包含150μl无血清DMEM的EP管中。

3.将稀释混匀好的DNA样品加入到室温静置的脂质体组中(即把组2的EP管中液体混合物加入到组1的EP管液体混合物中)。用手指弹EP管底部几次混合或用移液枪温和吹打几次混合，过2分钟可以再次混合。

4.将转染试剂混合物在室温静置15分钟。此时将提前铺好的嘌呤霉素抗性的饲养层细胞板中的培养基吸掉，在其上铺50万个经消化并计数的用来转染的ES细胞，控制细胞培养板中的ES细胞培养基总体积在1ml左右。将转染试剂混合物成滴且均匀加入到转染细胞板中，水平摇匀，使试剂和细胞均匀混合。将细胞培养板转移到37℃含5％

CO₂的细胞培养箱中培养。

5.大约6小时之后，在细胞培养板中加入更多的ES细胞培养液，每孔总体积在3-4ml。

之后将细胞放回37℃含5％CO₂细胞培养箱中继续培养。

ES细胞培养液为含谷氨酰胺的DMEM细胞培养基，15％胎牛血清，1％非必需氨基酸，1％青霉素和链霉素，少许巯基乙醇(每500毫升加入4微升巯基乙醇)。

二、转染成功的细胞富集

为了富集转染成功的细胞，本发明使用嘌呤霉素药筛法来除去绝大部分未转染成功的细胞。

6.转染完成后，次日(约24小时)进行药筛(图.1B)。吸走转染的细胞板中旧的培养液，加入3-4ml含有1μg/ml嘌呤霉素的ES培养液。

7.转染后第二天，继续换掉旧的培养液，加入3-4ml新鲜的含有1μg/ml嘌呤霉素的ES细胞培养液(图.1C)。因为含有嘌呤霉素的培养液会将未转染成功的细胞快速杀死，每天换液的步骤可以去除大部分未转染成功的死细胞。

8.转染后第四天，吸掉含有嘌呤霉素的旧培养液，加入2-3ml不含嘌呤霉素的正常ES培养液。通常在换成正常ES培养液之后，ES细胞会快速生长，大概1天后就可以在显微镜下观察到细胞单克隆(图.1E)。之后一直使用正常ES培养液，每天换液直至细胞细胞单克隆接近长满细胞培养板(图.1F)。当细胞相对稀少时，每孔通常需要2-3ml的新鲜ES细胞培养液。如果ES细胞接近长满，则在转染的ES细胞中加入4-5毫升新鲜的ES细胞培养液。

三、ES细胞的铺板和挑单克隆

ES细胞转染后并长满培养板后，需要被梯度稀释并以较低的密度铺到饲养层细胞上，以便分离出相对独立的ES单克隆，并在单克隆团长大后进行挑单克隆。

9.ES单克隆的分离铺板和培养

9.1.在ES单克隆成熟之前，提前一天在10-cm板中预先铺好饲养层细胞。按照标准细胞培养法将接近长满的ES单克隆细胞用胰蛋白酶消化。充分吹打消化下来的细胞，并计算获得的细胞总数，按照梯度稀释法将细胞稀释，并将合适数量的ES单克隆铺到预先铺好饲养层细胞的10-cm细胞培养板上(图.2A)。通常在1个10-cm中铺1x10⁶个ES细胞。剩余的细胞可以冻存1-2管作为备份。

9.2.从铺板后的第二天开始换液，在之后几天的换液中，逐渐增加新鲜ES细胞培养液的用量，至每块10-cm培养板最多20ml培养液。分离良好的细胞单克隆会在几天后逐渐在饲养层细胞上长到肉眼可见(图.2B)。继续培养至单克隆团足够大，以便于单克隆的挑取(图.2C)。

10.挑ES细胞单克隆

在ES单克隆细胞团长到可以被挑取的大小之前，提前1天在24孔板上铺好饲养层细胞。

10.1.使用负压装置，尽量吸干10cm培养板上的细胞培养液，在培养板底部外部用马克笔将肉眼可见的大细胞团的位置圈出来。用10ml灭菌的1XPBS溶液小心地润洗ES细胞，吸干洗液。在板中再次加入10ml 1XPBS溶液，将细胞培养板置于放置在生物安全柜里的显微镜下。显微镜视野中挑选出分散的，且形态良好的单克隆团，分别放到96孔板的不同孔中。

10.2.通常在挑取12个单克隆细胞之后，进行胰蛋白酶消化。在离心管中将胰蛋白酶试剂和灭菌的1XPBS按照1:1均匀混合。96孔板上每孔滴加一滴胰蛋白酶/PBS混合试剂，消化5分钟。然后每孔滴加2滴ES细胞培养液终止消化。每孔使用移液枪吹打15次分散单克隆团。为了节约时间，我们一般使用排枪吹打。提前1天在24孔板上铺好SNL饲养层细胞，每孔加1ml ES细胞培养液。将96孔板中吹打好的单克隆转移到的24孔板上的不同孔中。

四、挑ES单克隆后的细胞培养和冻存

在收取和永久冷冻保存之前，这些被挑取的单克隆要长到接近互相接触。同时，从这些ES单克隆中提取基因组DNA样本，来进行PCR筛选，在接下来的步骤中确定候选的ES单克隆。

11.通常次日不需要换液。隔天在24孔板中每孔换1ml新鲜ES培养液。

12.第三天起每天换液，直至孔中的细胞接近长满(图.2E-图.2F)。

13.随后将单克隆细胞暂时冻存，通过PCR筛选候选单克隆细胞并测序确认。

13.1.冻存24孔板上的ES单克隆细胞：将孔中的培养基吸掉，每孔用1ml灭菌后的1XPBS清洗一次，吸掉洗液，每孔加4滴胰蛋白酶/PBS 1:1混合液，室温消化5分钟，等大部分细胞消化到脱落下来，用1ml无菌枪头吹打15次将大细胞团吹散。

13.2.为了暂时保存ES单克隆细胞，我们通常在24孔板的每孔中加入1ml ES细胞冻存液。每孔用1ml移液枪吹打ES细胞15次。将大部分重悬的在冻存液中的ES细胞转移到标记好的2ml冷冻管中。将在冻存管中的ES细胞转移到-80℃冰箱或液氮罐中临时存储，直到确认理想的ES单克隆突变体。

五、ES单克隆突变体鉴定

用ES单克隆细胞样品中提取的基因组DNA样本进行PCR鉴定。一般使用跨两个CRISPR靶点的引物进行PCR，以鉴定出目标基因缺失突变体ES单克隆。对理想的大片段敲除的突变体的PCR产物进行测序，鉴定出CRISPR引起的具体突变。

14.为了提取这些ES单克隆的基因组DNA样本，在步骤13的24孔板的每孔中，向冻存后剩余的的ES单克隆悬液中加入1ml的ES细胞培养液。剩余的ES干细胞在不需要换培养液的情况下，将在几天内重新长满。通过使用从贴壁细胞中制备基因组DNA的标准程序，制备用于ES单克隆基因型鉴定的基因组DNA样品。

15.为了确定候选的ES单克隆细胞，通常我们使用PCR的方法从纯化的基因组DNA样本中扩增基因敲除的靶点位置。我们通常使用两种sgRNAs，靶向在目的基因的两个不同位置进行敲除，这样可以敲除包括部分外显子在内的相对较大的基因组片段。将这些从ES单克隆细胞中提取的基因组DNA样本进行PCR扩增，然后进行常规DNA凝胶电泳，以确定含有理想的目的基因大片段敲除的ES单克隆细胞。

16.接下来，对含有理想大小片段缺失的PCR产物进行测序，来确定它是否是目标基因的DNA双链敲除。将正确地缺失目的基因的ES单克隆的PCR产物纯化，可以克隆到常见的细菌载体如pBluescript中，以便精确了解在候选ES单克隆细胞中的序列缺失情况。

引物序列如下：我们用下面2个引物采用PCR筛选目标基因Zfp445的缺失突变体。Zfp445-Forward,5’-AGTGCGTCCTTCGTTACCTG(SEQ ID NO:7)

和

Zfp445-Reverse，5‘-GTGAAGGTAGCTGGGGATAC(SEQ ID NO:8)

我们对2个图中(图3和图4)所示的共15个缺失突变体克隆用测序验证，证明确实都发生了预期目标基因Zfp445的缺失突变。

如图3所示，转染后的D1911胚胎干细胞单个克隆在24-孔细胞培养板培养，然后获得单个克隆的基因组DNA样品。利用横跨两个Zfp445基因sgRNA目标位点的两个PCR引物对这些DNA样品进行PCR筛选。两个Zfp445基因sgRNA目标位点的距离是765bp左右，而用这两个PCR引物获得的野生型Zfp445基因型PCR产物长度是1039bp。*，可能携带Zfp445基因片段缺失突变的候选胚胎干细胞克隆。筛选的24个胚胎干细胞单克隆中有7个可能包含Zfp445基因片段缺失突变。这7个克隆缺失突变体PCR产物都经过测序鉴定，证明确实发生了由2个sgRNA在预期位点诱导的目的基因片段缺失突变。

如图4所示，转染后的TC1胚胎干细胞单个克隆在24-孔细胞培养板培养，然后获得单个克隆的基因组DNA样品。利用横跨两个Zfp445基因sgRNA目标位点的两个PCR引物对这些DNA样品进行PCR筛选。两个Zfp445基因sgRNA目标位点的距离是765bp左右，而用这两个PCR引物获得的野生型Zfp445基因型PCR产物长度是1039bp。*，可能携带Zfp445基因片段缺失突变的候选胚胎干细胞克隆。筛选的24个胚胎干细胞单克隆中有8个可能包含Zfp445基因片段缺失突变。这8个克隆缺失突变体PCR产物都经过测序鉴定，证明确实发生了由2个sgRNA在预期位点诱导的目的基因片段缺失突变。

现有技术用2个sgRNA获得的缺失突变体一般少于1％。本发明对2个图中(图3和图4)所示的共15个缺失突变体克隆用测序验证，证明确实都发生了预期目标基因Zfp445的缺失突变。用我们方法获得目标基因Zfp445缺失突变体的效率是15/48＝31.25％。

六、鉴定后ES细胞单克隆样品的扩增和冻存

在ES单克隆细胞解冻和扩增ES前一天，提前在6孔细胞培养板上铺好饲养层细胞，每孔加2毫升饲养层细胞培养液。

在经过了PCR和测序后，将步骤13里暂时存储在-80℃或液氮罐中的理想的突变体ES单克隆解冻，在饲养层细胞上进行扩增。将冻存管中的ES单克隆解冻，将含有冻存细胞的细胞冻存液转移到加有10ml ES细胞培养液的15-ml离心管中，1000转/分，离心5分钟。吸掉6孔板上的培养液，每个离心管中加入2ml的ES细胞培养液重悬细胞沉淀，加入到标记好的6孔板对应的孔中。

一般第二天不需要更换培养液。第三天起每日换液，ES细胞培养液从2ml逐渐加到5ml每孔，直到孔中的ES细胞长满，可以冻存并长期保存。

如有必要，可将敲除成功的ES单克隆突变体进一步扩增到10-cm细胞培养板的饲养层细胞上，冻存更多管细胞，以便长期保存。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海科技大学

<120> 一种目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caccgaatag gaatttgtga cgtcc 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaacggacgt cacaaattcc tattc 25

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaataggaat ttgtgacgtc c 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caccgagctc agcgcaatct ttatc 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaacgataaa gattgcgctg agct 24

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagctcagcg caatctttat c 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agtgcgtcct tcgttacctg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgaaggtag ctggggatac 20

Claims (6)

1.一种目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法，所述方法至少包括以下步骤：

(1)将sgRNAs组转染到同一宿主细胞中，所述sgRNAs组中，包含2个sgRNA，且2个sgRNA靶向同一目的基因的不同靶点；所述sgRNAs组的数量为一个或多个；当所述sgRNAs组的数量为多个时，不同sgRNAs组靶向不同目的基因；

(2)富集表达2个或多个所述sgRNAs的宿主细胞；

(3)培养步骤(2)获得的宿主细胞，获得表达目标基因片段缺失的突变体细胞；

在步骤(2)之前，还包括以下步骤：将药物抗性基因转染到步骤(1)所述的宿主细胞中；

步骤(1)中，各个sgRNA、药物抗性基因均包含于载体上；

所述sgRNA和所述药物抗性基因不在同一载体上；

表达所有sgRNA的载体总共用量与所述药物抗性基因的载体用量的比例为20:1-4:1。

2.如权利要求1所述的目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法，其特征在于，所述sgRNAs组中，2个sgRNA靶点的距离为100bp以上；一个sgRNAs组的2个sgRNA就是靶向同一目的基因的。

3.如权利要求2所述的目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法，其特征在于，所述sgRNAs组中，2个sgRNA靶点的距离为100bp-1000bp。

4.如权利要求1所述的目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，富集的方式为采用药物去除不含药物抗性基因的宿主细胞。

5.如权利要求1所述的目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法，其特征在于，所述药物选自抗生素。

6.如权利要求1所述的目标基因片段缺失突变体细胞的制备方法，其特征在于，若sgRNAs组的数量为1个，转染时，药物抗性基因的载体初始量少于sgRNAs组中各个sgRNA的载体初始量；若sgRNAs组的数量为多个，转染时，药物抗性基因的载体初始量少于每个sgRNA载体初始量。