CN112899296A - 一种转座酶的筛选报告载体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种转座酶的筛选报告载体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112899296A CN112899296A CN202010940614.3A CN202010940614A CN112899296A CN 112899296 A CN112899296 A CN 112899296A CN 202010940614 A CN202010940614 A CN 202010940614A CN 112899296 A CN112899296 A CN 112899296A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- transposase
- screening
- fragment
- transposon
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 title claims abstract description 207
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 title claims abstract description 206
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 112
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 73
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 136
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 91
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 70
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 90
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 44
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 43
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 43
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 38
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 37
- 230000017105 transposition Effects 0.000 claims description 34
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 24
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 23
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 21
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 21
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 20
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 17
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 6
- 229940126574 aminoglycoside antibiotic Drugs 0.000 claims description 6
- 239000002647 aminoglycoside antibiotic agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 5
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 4
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 claims description 3
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 claims description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 3
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 claims description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 3
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 3
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 description 2
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011311 validation assay Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101100480824 Bacillus subtilis (strain 168) tetB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100424890 Butyrivibrio fibrisolvens tetW gene Proteins 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101001030211 Homo sapiens Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- LUNBMBVWKORSGN-TYEKWLQESA-N P-factor Chemical group CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)CCC1 LUNBMBVWKORSGN-TYEKWLQESA-N 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101100206306 Streptomyces lividans tetM gene Proteins 0.000 description 1
- 101100350563 Streptomyces rimosus otrA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 1
- 102000053563 human MYC Human genes 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 102220215480 rs780747709 Human genes 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 101150118377 tet gene Proteins 0.000 description 1
- 101150015970 tetM gene Proteins 0.000 description 1
- 101150024821 tetO gene Proteins 0.000 description 1
- 101150004433 tetQ gene Proteins 0.000 description 1
- 101150014444 tetS gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000013819 transposition, DNA-mediated Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种转座酶的筛选报告载体及其制备方法和应用。该筛选报告载体含有URA3基因表达盒，URA3基因中含有转座子片段，转座子片段的5’IR与3’IR之间含有抗生素抗性基因；及转座酶基因表达盒，转座酶片段可操作地连接有诱导型启动子元件。该筛选报告载体简化转座酶筛选评价步骤，提高评价效率和准确度。基于该筛选报告载体构建的转座酶的突变体库，实现突变DNA片段到酵母菌的一步克隆，及基于该报告载体和/或突变体库构建的转座酶的高通量筛选体系，该高通实现大批量突变体的一次筛选，同时提高准确度和稳定性，保证筛选高活性转座酶的概率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及生物医药领域，具体涉及一种转座酶的筛选报告载体及其制备方法和应用。
背景技术
DNA转座可以从在宿主基因组中一个位置移动到另一个位置，作为基因和插入诱变的实验室工具已经在果蝇、秀丽线虫、植物等多种生物中运用，但是在哺乳动物中的应用确受阻，这些转座子经常在哺乳动物细胞内存在无活性或者转座效率极低的现象。Sleeping Beauty是第一发现能在哺乳细胞内具有转座活性的DNA转座子，他的发现加速了突变小鼠和大鼠的产生，也让体内正向遗传筛选成为可能，此外，利用DNA转座子作为非病毒载体进行基因组编辑、制备CAR T细胞的应用前景备受关注。piggyBac转座子是从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)TN368细胞系中分离的一种DNA转座子，是目前在哺乳动物细胞内最具应用价值的转座子，他具有搭载容量大、无痕切除等特性。可特异性的插入到“TTAA”把位点，借助转座酶，PiggyBac转座子可将目的基因从宿主精确切离，且切离后可恢复原有位点状态，不会留下转座子痕迹。
DNA转座子系统由两部分组成，两端带有反向重复序列(IRs)可携带目的DNA片段的转座子和能催化转座子发生“剪切和粘贴”的转座酶。转座酶首先结合转座子两侧的IRs序列，然后将转座子从宿主DNA位点精准地无痕移除，最终将DNA片段整合到新的位点上。高效转座系统的建立可以实现对靶基因的定点敲除或者目的基因的定点引入，为哺乳细胞内的基因编辑提供有效的载体工具。据报道，经过优化改造后的高活性Sleeping Beauty转座子SB100大大增加了转座效率，近期，欧洲分子生物学实验室Orsolya Barabas及德国维尔茨堡大学Michael Hudecek课题组也通过对SB的改造，设计出了设计创建具有增强的溶解性和稳定性的SB转座酶，并发表在Nature Biotechnology。转座系统的转座效率决定了基因编辑的效率，而转座效率很大一部分取决于转座酶的表达水平，因此，增加转座酶活性是增加转座子转座效率的关键技术点。
一种用于哺乳动物的高活性PiggyBac转移酶(A hyperactive piggyBactransposase for mammalian applications,PNAS|January 25,2011|vol.108|no.4|1531–1536)公开的转座酶的筛选报告载体中，转座子插入URA3基因中，转座子与URA3之间还连接有肌动蛋白内含子，当转座酶切除URA3基因中插入的转座子之后，URA3基因中仍存在插入的肌动蛋白内含子，为使URA3表达编码，还需进行激动蛋白内含子切除的繁琐操作，复杂化转座酶转座效率评估的步骤，降低效率、准确度和稳定性。该文献还公开一种转座效率为mPBase(经哺乳动物密码子优化的PiggyBac转移酶)10倍的进行以下位点氨基酸突变的高活性PiggyBac转移酶(指下述现有高活性转座酶hyPBase，经人类密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)：I30V、G165S、S103P、M282V、S509G、N570S和N538K。
因此，我们利用遗传操作相对简单的酿酒酵母建立了有效的筛选系统和高效的筛选流程，可高通量高效率的筛选到高活性转座酶。
发明内容
本发明提供一种转座酶的筛选报告载体及其制备方法，在检测转座酶转座功能的过程中，转座酶将插入URA基因中的转座子切除后，URA基因中不残留其他元件，简化除URA基因表达编码前URA基因中残留其他元件切除的繁琐步骤，提高转座酶转座功能评价的效率和准确度。
本发明还提供一种基于上述筛选报告载体构建的转座酶的突变体库及其制备方法，实现转座酶突变体库由突变DNA片段到酵母菌株的一步克隆，避免现有经大肠杆菌构建质粒扩增后再转入酵母菌株过程中突变体高频重复现象。
本发明还提供了一种基于上述筛选报告载体和/或突变体库构建的转座酶的高通量筛选体系及其筛选方法，该高通量筛选体系实现大批量突变体的一次筛选，同时提高准确度和稳定性，保证筛选高活性转座酶的概率。
为了便于转座酶转座剪切后URA基因的完整性和连续性，本发明还提供一种URA3基因表达盒，该基因表达盒的URA基因中插入转座子片段，转座子片段与URA基因间不连接其他元件，使得转座子片段被转座酶剪切后，URA基因中无残留元件片段，阻断URA基因的完整性和连续性，使得URA基因表达编码更简便、准确、稳定。
本发明的技术方案为，一种URA3基因表达盒，URA3基因中含有转座子片段，转座子片段可操作地插入URA3基因中TTAA处，转座子片段的5，IR与3，IR之间含有抗生素抗性基因。该URA3基因表达盒或者含有URA3基因表达盒的基因片段或者含有URA3表达盒的重组载体，均可用于制备筛选转座酶的报告载体。
一种转座酶的筛选报告载体，含有
(1)URA3基因表达盒，URA3基因中含有转座子片段，转座子片段可操作地插入URA3基因中TTAA处，转座子片段的5，IR与3，IR之间含有抗生素抗性基因；及
(2)转座酶基因表达盒，转座酶片段可操作地连接有诱导型启动子元件。
具体地，URA3基因表达盒与转座酶基因表达盒分别独立地分布在同一载体上，或者转座酶基因表达盒可操作地插入URA3基因表达盒中的转座子片段中。作为本发明的一个方案，URA3基因表达盒与转座酶基因表达盒分别独立地分布在同一载体上。“可操作地插入或连接”可通过基因重组手段实现。“表达盒”指在宿主细胞中指导目标序列表达编码，包含于目标序列可操作地连接的调控元件，所述调控原件包含启动子、增强子、静默子、终止子和/或其他控制目标序列表达的原件，所述表达编码包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌等。
URA3基因中含有的转座子片段同转座酶基因表达盒中转座酶片段表达的转座酶间特异性选择。
本发明转座酶的筛选报告载体，其转座酶基因表达盒表达编码的转座酶在切除URA3基因表达盒的URA3基因中插入的转座子片段后，URA3基因中不残留其他元件，保证URA3基因的完整性和连续性，进而避免URA3基因表达编码前需进行残留元件切除的繁琐工序，简化转座酶的筛选报告过程，提高筛选报告过程的效率、准确度和稳定性。
本发明转座酶的筛选报告载体，是可以在酵母菌株中进行包括蛋白质或多肽生产中所涉及的任何步骤的表达编码，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌等。
所述抗生素抗性基因包括四环素抗性基因、大环内酯抗生素抗性基因或者氨基糖苷类抗生素抗性基因等，优选氨基糖苷类抗生素抗性基因。所述四环素抗性基因包括tet(O)、tet(Q)、tet(W)、tet(M)、tet(P)、tet(S)、tet(T)或otrA等。所述大环内酯抗生素抗性基因包括红霉素抗性基因，所述氨基糖苷类抗生素基因包括G418抗性基因或卡那霉素抗性基因Npt等，优选G418抗性基因。
所述转座子片段包括SB转座子(睡美人tranposon，SleepingBeauty tranposon)片段、PB转座子(粉纹夜蛾tranposon，piggyBac tranposon)片段、P因子片段、Tn转座子片段或者IS转座子片段，优选PB转座子片段或SB转座子片段。
所述转座酶片段包括SB转座酶片段、PB转座酶片段、P转座酶片段、Tn转座酶片段或者IS转座酶片段，优选PB转座酶片段或SB转座酶片段。
所述诱导性启动子元件包括诱导型GALS启动子、诱导型AOX1启动子或者诱导型PAOX1启动子，优选为诱导型GALS启动子。
本发明上述转座酶的筛选报告载体不仅如实施例所示适于筛选PB转座酶，还可用于筛选SB转座酶、P转座酶、Tn转座酶或者IS转座酶等具有转座酶活性的生物活性物质。基于本发明转座酶的筛选报告载体构建的突变体库和高通量筛选体系同样适用于筛选其他具有转座酶活性的生物活性物质。
本发明上述转座酶的筛选报告载体的制备方法，步骤包括：含有URA3基因表达盒的线性片段同与之有同源序列的含有抗生素抗性基因的转座子片段，经同源重组酶连接，得含有URA3基因表达盒的载体，URA3基因中可操作地插入转座子，转座子中可操作地插入抗生素抗性基因；作为本发明的一个方案，构建的含有URA3基因表达盒的载体为含有URA3基因表达盒的PRS316质粒(PRS316-URS)；
可操作地连接有诱导型启动子元件的转座酶片段，在限制性内切酶作用下，克隆至含有URA3基因表达盒的载体上，得转座酶的筛选报告载体，URA3基因表达盒与转座酶基因表达盒连接于同一载体上。作为本发明的一个方案，所述的限制性内切酶为SacI和EcoRI，得到的转座酶的筛选报告载体为PRS316-URS-PB。
所述含有URA3基因表达盒的线性片段的制备包括：设计引物从URA3基因的TTAA处对含有URA3基因表达盒的模板载体进行PCR，得到含有URA3基因表达盒的线性片段；所述模板载体是可以在酵母菌株中进行包括蛋白质或多肽生产中所涉及的任何步骤的表达编码，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌等行为的载体，优选酵母菌质粒载体，优选为PRS316。
作为本发明的一个方案，设计引物pURA-F和pURA-R对模板载体PRS316进行PCR，得到含有URA3基因表达盒的线性片段。
pURA-F(SEQ ID NO:3)序列：aagccgctaaaggcattatccgcc；
pURA-R(SEQ ID NO:4)序列：aactgtgccctccatggaaaaatcagtc。
所述同含有URA3基因表达盒的线性片段具有同源序列的含有抗生素抗性基因的转座子片段的制备包括：设计引物对5，IR与3，IR之间含有抗生素抗性基因的转座子进行PCR，使得到的含有抗生素抗性基因的转座子片段同含有URA3基因表达盒的线性片段具有同源序列。
作为本发明的一个方案，设计引物pURA-IR-F和pURA-IR-R对5，IR与3，IR之间含有抗生素抗性基因的转座子进行PCR，使得到的含有抗生素抗性基因的转座子片段同含有URA3基因表达盒的线性片段具有同源序列。pURA-IR-F(SEQ ID NO:5)序列：gactgatttttccatggagggcacagttaaccctagaaagatagtctgcgtaaaattgacgcatgcgac；pURA-IR-R(SEQ IDNO:6)序列：ggcggataatgcctttagcggcttaaccctagaaagataatcatattgtg。
所述同源重组酶优选为NEBuilder同源重组酶。
利用本发明上述的转座酶的筛选报告载体构建转座酶的突变体库，其构建过程包括：
(1)设计PCR引物对上述转座酶的筛选报告载体进行PCR，得到转座酶开放阅读框架片段；
使用限制性内切酶对上述转座酶的筛选报告载体进行线性化，得到线性化载体片段，该线性化载体片段切除未突变的转座酶开放阅读框架片段，且与PCR处理得到的转座酶开放阅读框架片段间具有同源序列；
(2)对转座酶开放阅读框架片段进行易错PCR突变，得到不同的突变的转座酶开放阅读框架片段；
(3)将不同的突变的转座酶开放阅读框架片段与具有同源序列的线性化载体片段分别转染至不同的URA缺陷型的酵母菌株内，在酵母同源重组修复机制下，突变的转座酶开放阅读框架片段同具有同源序列的线性化载体片段重组连接，得到转染不同的突变的转座酶开放阅读框架片段的若干URA缺陷型的酵母菌株，构建转座酶的突变体库。
所述酵母菌株包括BJ2168、Y187、YBZ-1或YZH-Gold等，优选为酿酒酵母菌株BJ2168。
步骤(1)中，所述不同的突变的转座酶开放阅读框架片段与具有同源序列的线性化载体片段间的用量比为1～10:1，优选为10:1。
步骤(2)中，对转座酶开放阅读框架片段进行易错PCR逐次累积突变，每次突变得到的突变的转座酶开放阅读框架片段，即为不同的突变的转座酶开放阅读框架片段。
作为本发明的一个方案，步骤(1)中，设计引物GR-F与GR-R对转座酶的筛选报告载体PRS316-URS-PB进行PCR处理，GR-F(SEQ ID NO:7)序列：taatcagcgaagcgatga；GR-R(SEQID NO:8)序列：cagcatgcctgctattgtcttcc；使用限制性内切酶XbaI和EcoRI对筛选报告载体PRS316-URS-PB线性化。
即，基于本发明上述的转座酶的筛选报告载体构建的转座酶的突变体库，包含分别转染不同的突变的转座酶开放阅读框架架片段的URA缺陷型的酵母菌株，每个URA缺陷型的酵母菌株内，突变的转座酶开放阅读框架片段酶切连接于本发明上述的转座酶的筛选报告载体的转座酶基因表达盒内，替换转座酶基因表达盒内的未经突变的转座酶开放阅读框架片段。
所述酵母菌株包括BJ2168、Y187、YBZ-1或YZH-Gold等，优选为酿酒酵母菌株BJ2168。
本发明还利用上述的转座酶的筛选报告载体和/或上述的转座酶的突变体库构建转座酶的高通量筛选体系。该转座酶的高通量筛选体系还包括用于酵母菌生长的常用YPD培养基，和/或根据活化、诱导等实验需要而对常用培养基中成分作添加、减少或替换等改变而得的培养基，如：添加抗生素制备的活化培养基，添加抗生素的YPD培养基、添加抗生素的SCM培养基或添加抗生素的SD培养基等，和/或添加诱导物的诱导培养基，诱导物根据诱导型启动子的不同而不同，如适用于半乳糖诱导型的GALS启动子，添加诱导物半乳糖；适用于葡萄糖诱导型的AOX1启动子，添加诱导物葡萄糖；适用于甲醇诱导型的PAOX1启动子，添加诱导物甲醇；和/或根据筛选等实验需要而选用的URA缺陷型培养基。
当基于上述的转座酶的筛选报告载体构建转座酶的高通量筛选体系时，先将上述的转座酶的筛选报告载体按照上述的基于转座酶的筛选报告载体构建的转座酶的突变体库的构建过程构建得到转座酶的突变体库，转座酶的突变体库再进行转座酶的高通量筛选。
基于上述的转座酶的突变体库的转座酶的高通量筛选方法，步骤包括：将突变体库中分别转染不同的突变的转座酶开放阅读框架片段的酵母菌株单克隆活化后再诱导，将诱导后的酵母菌株接种至URA缺陷型培养基中培养，同平行培养的转入未经突变的上述的转座酶的筛选报告载体的酵母菌株进行对比，进行第一次筛选；
将第一筛选得到的突变体库中分别转染不同的突变的转座酶开放阅读框架片段的酵母菌株活化后调整OD600值一致，再接种诱导后调整OD600值一致，分别接种至URA缺陷型培养基与常用YPD培养基中培养，统计URA缺陷型培养基上的克隆数量，以常用培养基上的克隆数量为基础，计算并对比转座酶转座效率值，进行第二次筛选，得到含有高活性转座酶的酵母菌株。
上述转座酶的高通量筛选方法，还包括将从第二次筛选得到的含有高活性转座酶的酵母菌株中提取得到的酶切连接于高活性转座酶的筛选报告载体进行测序分析确定突变位点，和/或进行目标宿主进行转座效率验证。
第一次筛选过程中，酵母菌株单克隆接种至含有抗生素的活化培养基中活化18～30小时，优选活化24小时，所述抗生素包括链霉素、青霉素、庆大霉素、氨苄霉素或卡那霉素，优选为G418抗生素；所述活化培养基为根据酵母菌株活化的需要而在酵母菌株生长常用的培养基中添加抗生素，即为含有抗生素的活化培养基包括YPD培养基、SCM培养基或SD培养基，作为本发明的一个方案为，含有G418抗生素的YPD培养基。
活化后再接种至含有诱导物的诱导培养基中诱导18～30小时，优选诱导24小时，诱导培养基中诱导物的百分含量为1.5～3％，优选为2％；所述诱导培养基为根据酵母菌株诱导的需要而在酵母菌株生长常用的培养基中添加诱导物，即为含有诱导物的诱导培养基，诱导物包含半乳糖、葡萄糖或者甲醇等，优选为半乳糖；更优选为含有半乳糖的YPD培养基。
将诱导后的酵母菌株接种至URA缺陷型培养基中培养36～48小时，优选48小时。
第一次筛选过程中，酵母菌株诱导后接种至URA缺陷型培养基之前，对酵母菌株的诱导液进行稀释处理，具体地，稀释倍数为10～10000，优选为100～1000倍。
第二次筛选过程中，酵母菌株接种至含有抗生素的活化培养基中活化18～30小时，优选活化24小时，所述抗生素包括链霉素、青霉素、庆大霉素、氨苄霉素或卡那霉素，优选为G418抗生素；所述活化培养基为根据酵母菌株活化的需要而在酵母菌株生长常用的培养基中添加抗生素，即为含有抗生素的活化培养基包括YPD培养基、SCM培养基或SD培养基，优选为含有抗生素的YPD培养基，作为本发明的一个方案为，含有G418抗生素的YPD培养基。
活化并调整OD600值一致后按照1：50～200的体积比接种至含有半乳糖的诱导培养基中诱导18～30小时，具体地，优选按照1:100的体积比接种至含有半乳糖的诱导培养基中，诱导时间优选为24小时，诱导培养基中诱导物的百分含量为1.5～3％，优选为2％；所述诱导培养基为根据酵母菌株诱导的需要而在酵母菌株生长常用的培养基中添加诱导物，即为含有诱导物的诱导培养基，诱导物包含半乳糖、葡萄糖或者甲醇等，优选为半乳糖；更优选为含有半乳糖的YPD培养基。
诱导并调整OD600值一致后接种至URA缺陷型培养基培养36～48小时，优选48小时。
第二次筛选过程中，酵母菌株诱导并调整OD600值一致后，分别接种至URA缺陷型培养基与正常培养基之前，对酵母菌株的诱导液进行1～3次梯度稀释，取每次梯度稀释的各梯度浓度诱导液分别进行下次梯度稀释，优选进行2次梯度稀释；具体地，每次梯度稀释的倍数范围为10～106，优选为100～10000；优选地，进行2次梯度稀释时，第一次梯度稀释范围为100～10000，第二次梯度稀释范围为100～10000。
与传统细胞筛选或原核宿主筛选方法相比
1.利用最简单的真核生物，酿酒酵母做对筛选工具，筛选结果在细胞中重复性更好。
2.实现了高通量筛选。
3.筛选方法简单、易操作。
与PNAS文章A hyperactive piggyBac transposase for mammalianapplications相比：
1.使用了PRS316质粒与ura缺陷型酵母进行配合。
2.将转座子插入URA基因TTAA处，并未使用文章中“转座子移除后，内含子切除，基因表达”的繁琐步骤。
3.优化了筛选步骤，经过第一次初筛，第二次准确筛选的方法，提升了工作效率，实现了高通量筛选。
附图说明
图1为PRS316-URA-PBase载体图谱。
图2分别为PRS316-URA-PBase质粒(A)、PRS316-URA-control质粒(B)及两者在ura缺陷型固体培养基(C)和ura缺陷型液体培养基(D)中的克隆增长情况。
图3为转座酶进行多次累积易错PCR突变流程示意图(上方图)及易错PCR回收的转座酶片段和线性化载体按照10:1的摩尔比转化至ura缺陷型酵母菌株流程示意图(下方图)。
图4为突变体库及筛选高效转座酶的流程示意图。
图5为细胞验证试验中ploxP-PB质粒结构示意图。
图6为细胞验证试验中pSAD-EGFP质粒结构示意图。
图7为未突变的PB酶(hyPBase)和筛选得到的突变体PB-mutant(bz-hyPBase)在CHO细胞或PBMC中的转座效率示意图。
具体实施方式
结合说明书附图和具体实施例更清楚地对本发明进行阐述，所述的具体实施例只用于解释本发明，但并不因此而受到任何限制。所述的实施例中的实验方法条件如无特殊指明均是常规实验方法条件；试剂等无特殊说明均按厂家说明进行。
筛选报告载体的构建
用基因合成的方式将抗性基因G418插入转座子原件5’IR和3’IR之间，形成转座子G418-IR。将该转座子利用PCR后重组的方法将其插入URA3基因中TTAA处，将带有可诱导型启动子的转座酶插入PRS316多克隆酶切位点，最终构成筛选报告载体PRS316-URA-PBase。具体操作如下：(1)使用引物pURA-F(aagccgctaaaggcattatccgcc)和pURA-R(aactgtgccctccatggaaaaatcagtc)，对模板PRS316进行PCR，得到质粒PRS316的线性化片段1。(2)使用引物pURA-IR-F(gactgatttttccatggagggcacagttaaccctagaaagatagtctgcgtaaaattgacgcatgcgac)和pURA-IR-R(ggcggataatgcctttagcggcttaaccctagaaagataatcatattgtg)，对合成的转座子G418-IR进行PCR，得到转座子的与PRS316有同源序列的线性化片段2。(3)将片段1和片段2使用NEBuilder同源重组酶进行连接，构成质粒PRS316-URA。(4)合成带有GALS可诱导的启动子基因PB转座酶，使用SacI和EcoRI将其克隆进载体PRS316-URA，最终生成质粒PRS316-URA-PBase。PRS316-URA-PBase载体图谱如图1所示。
筛选报告系统的建立
将质粒PRS316-URA-PBase转入ura缺陷型酿酒酵母菌株BJ2168中，使用YPD培养基进行扩大培养，G418抗性进行筛选。在正常情况下，该酵母菌株不能在ura缺陷型培养基中生长。添加2％半乳糖后，GALS启动子开启，下游PB转座酶表达，PB酶的表达诱导转座子发生转座，转座子发生转座后ura基因正常表达，发生转座的克隆能在ura缺陷型培养基中正常生长。通过统计一定数量的酵母菌在半乳糖诱导后能在ura缺陷型培养基平板上生长的克隆数，即为发生转座的克隆数。
为了验证转座系统的可行性，我们将带有转座的质粒PRS316-URA-PBase(图2A)和不带有转座酶的质粒PRS316-URA-control(图2B)分别转入ura缺陷型酿酒酵母菌株中，挑单克隆进行活化，在固体平板和液体培养基中分别进行了验证。固体平板验证时，取相同数量活化后的酵母菌接种至含有2％半乳糖且相同体积的YPD培养基中进行诱导，诱导后将酵母菌进行梯度稀释至10-0、10-1、10-2、10-3，取10μl涂布于ura缺陷型培养基的平板中进行培养，如图2C所示，转入PRS316-URA-PBase质粒的酵母菌有克隆生长，生长的克隆即为已经发生转座的克隆，而不含转座酶的对照组则没有克隆生长。液体培养基验证时，取相同数量活化后的酵母菌接种至含有2％半乳糖且相同体积的ura缺陷型培养基中进行诱导培养，如图2D所示，培养24小时后，转入PRS-URA-PBase质粒的酵母菌能在液体培养基中生长，而对照组完全不能生长。在液体培养基中的筛选可用于从无活性的转座酶中筛选有活性的突变体。综合以上实验数据，本发明建立的筛选报告系统工作情况良好、严谨性强。
突变体库的构建
在转座酶开放阅读框架(ORF)之外设计PCR引物：GR-F(taatcagcgaagcgatga)和GR-R(cagcatgcctgctattgtcttcc)，PRS-URA-PBase载体上的转座酶ORF两端有50bp左右的同源序列，使用clonth的易错PCR试剂盒对转座酶进行突变，并可通过回收PCR片段作为模板多次突变累积突变数量(图3上方流程图所示)，最终得到含有点突变的转座酶片段。筛选报告载体PRS-URA-PBase使用XbaI和EcoRI进行线性化，并去掉原有未突变的转座酶。将PCR回收的转座酶片段和线性化载体按照10:1的摩尔比转化至ura缺陷型酵母菌株中(图3下方流程图及图4所示)。酵母会利用自带的同源重组修复机制，使得外源目的片段通过同源臂置换到携带有缺口的DNA质粒中，从而在酵母细胞内自动组合成带有目的片段的完整质粒。通过此方法，能实现DNA片段到酵母菌种的一步克隆，同时减少了在大肠杆菌构建质粒扩增后再转入酵母过程中突变体高频重复现象。通过此方法，转化后再平板上得到的克隆即为突变体，通过挑取单克隆的方法即可得到一定数量的突变体库。
筛选高效转座酶流程
如图4所示，筛选过程分为两次筛选。第一次筛选对全部突变体进行大范围的筛选，筛选得到明显比未突变对照组转座效率高的突变体，第二次筛选在第一次筛选得到的酵母中进行，通过计算确切的转座效率，得到在酵母中转座效率增高的突变体。
第一次筛选：将转化得到的突变体库挑单克隆到96孔板、含有G418抗生素的YPD培养基中进行活化，活化24小时后，使用复制器对其进行转接，接种至含有2％半乳糖的YPD培养基中进行诱导。诱导24小时后，对菌液进行稀释，稀释至10-2或10-3(根据酵母生长情况确定)，取10μl点板至ura缺陷型固体培养基上，培养48小时后观察突变体生长情况，并与未突变的克隆进行对比，将转座效率明显增高的克隆筛选出来，进行第二次筛选。
第二次筛选：将上述第一次筛选得到的疑似突变体进行活化24小时，活化后调整OD600值一致，按照1:100的比例接种至含有2％半乳糖的YPD培养基中进行诱导24小时，诱导后再次调整OD600值一致，梯度稀释至10-2、10-3、10-4，取20μl稀释至10-2、10-3涂布于ura缺陷型固体培养基上进行培养24小时，统计克隆数，在ura缺陷型固体培养基上生长的克隆即为已经发生转座的克隆。同时取20μl稀释至10-3、10-4涂布YPD完全固体培养基上对位对照，生长的克隆即为酵母总数量。转座酶转座效率＝发生转座的克隆数量/总克隆数量＝(在ura缺陷型培养基中克隆数*稀释倍数)/(在YPD培养基中克隆数*稀释倍数)*100％。通过此方法，即可实现高通量筛选，一次单人操作可实现96-960个突变体的通量筛选，大大增加了筛选得到高活性转座酶的概率。
通过上述计算，我们可以得到突变体准确的转座效率，我们将选取转座效率增高的菌株进行突变位点分析。接种最初活化的96孔板中的酵母进行扩大培养，抽提酵母质粒，送公司测序分析，通过与原始序列的比对即得到突变体突变位点。
转座酶在细胞中的验证
根据我们前期实验数据统计，通过上述步骤的筛选，每100个中即能得到1个转座效率明显优于未突变转座酶的突变体。酵母作为筛选载体，能高通量高效的对突变转座酶进行筛选，为了进一步验证转座酶在目的宿主中的转座效率，我们应将筛选得到的转座酶突变体在目标宿主中进行验证，我们选取了哺乳动物细胞CHO细胞和PBMC细胞分别进行了验证。
我们从上述步骤筛选得到的转座酶突变体库中选择一种突变体进行细胞验证试验，具体如下：
我们将背景技术记载的未突变的转座酶PB(SEQ ID NO:1)和经过筛选得到的突变体PB-mutant(SEQ ID NO:2所示核苷酸序列)克隆进哺乳动物细胞表达载体中生成质粒ploxP-PB(质粒结构同图5)和ploxP-PB-mutant(质粒结构同图5，仅将转座酶由PB替换为PB-mutant)，使其表达转座酶。PB和PB-mutant的启动子后均连接有人源c-myc核定位信号。将带有EGFP基因的转座子克隆进载体pSAD-EGFP(图6)，使其表达绿色荧光蛋白。将表达转座酶和转座子的两个质粒共同电转进入CHO细胞或PBMC中，带有EGFP的转座子会在转座酶的作用下插入基因组使其稳定表达绿色荧光蛋白，经过传代培养，第7天使用流式细胞检测技术对表达绿色荧光蛋白的细胞进行计数，能表达荧光蛋白的细胞数量越多，则表示转座酶转座效率越高。从图7的统计结果看来，ploxP-PB-mutant的转座活性明显优于ploxP-PB。也证明了该筛选系统和筛选方法的可实施性。
PB的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：
atgggccctgctgccaagagggtcaagttggacggcagcagcctggacgacgagcacatcctgagcgccctgctgcagagcgacgacgagctggtgggcgaggacagcgacagcgaggtgagcgaccacgtgagcgaggacgacgtgcagagcgacaccgaggaggccttcatcgacgaggtgcacgaggtgcagcccaccagcagcggcagcgagatcctggacgagcagaacgtgatcgagcagcccggcagcagcctggccagcaaccgcaatctgaccctgccccagcgcaccatccgcggcaagaacaagcactgctggagcaccagcaagcccacccgccgcagccgcgtcagcgccctgaacatcgtgcgcagccagcgcggccccacccgcatgtgccgcaacatctacgaccccctgctgtgcttcaagctgttcttcaccgacgagatcatcagcgagatcgtgaagtggaccaacgccgagatcagcctgaagcgccgcgagagcatgaccagcgccaccttccgcgacaccaacgaggacgagatctacgccttcttcggcatcctggtgatgaccgccgtgcgcaaggacaaccacatgagcaccgacgacctgttcgaccgcagcctgagcatggtgtacgtgagcgtgatgagccgcgaccgcttcgacttcctgatccgctgcctgcgcatggacgacaagagcatccgccccaccctgcgcgagaacgacgtgttcacccccgtgcgcaagatctgggacctgttcatccaccagtgcatccagaactacacccccggcgcccacctgaccatcgacgagcagctgctgggcttccgcggccgctgccccttccgcgtgtacatccccaacaagcccagcaagtacggcatcaagatcctgatgatgtgcgacagcggcaccaagtacatgatcaacggcatgccctacctgggccgcggcacccagaccaacggcgtgcccctgggcgagtactacgtgaaggagctgagcaagcccgtgcacggcagctgccgcaacatcacctgcgacaactggttcaccagcatccccctggccaagaacctgctgcaggagccctacaagctgaccatcgtgggcaccgtgcgcagcaacaagcgcgagatccccgaggtgctgaagaacagccgcagccgccccgtgggcaccagcatgttctgcttcgacggccccctgaccctggtgagctacaagcccaagcccgccaagatggtgtacctgctgagcagctgcgacgaggacgccagcatcaacgagagcaccggcaagccccagatggtgatgtactacaaccagaccaagggcggcgtggacaccctggaccagatgtgcagcgtgatgacctgcagccgcaagaccaaccgctggcccatggccctgctgtacggcatgatcaacatcgcctgcatcaacagcttcatcatctacagccacaacgtgagcagcaagggcgagaaggtgcagagccgcaagaagttcatgcgcaacctgtacatgggcctgaccagcagcttcatgcgcaagcgcctggaggcccccaccctgaagcgctacctgcgcgacaacatcagcaacatcctgcccaaggaggtgcccggcaccagcgacgacagcaccgaggagcccgtgatgaagaagcgcacctactgcacctactgccccagcaagatccgccgcaaggccagcgccagctgcaagaagtgcaagaaggtgatctgccgcgagcacaacatcgacatgtgccagagctgcttctaa
PB-mutant(SEQ ID NO:2)：
atgggccctgctgccaagagggtcaagttggacggcagcagcctggacgacgagcacatcctgagcgccctgctgcagagcgacgacgagctggtgggcgaggacagcgacagcgaggtgagcgaccacgtgagcgaggacgacgtgcagagcgacaccgaggaggccttcatcgacgaggtgcacgaggtgcagcccaccagcagcggcagcgagatcctggacgagcagaacgtgatcgagcagcccggcagcagcctggccagcaaccgcaacctgaccctgccccagcgcaccatccgcggcaagaacaagcactgctggagcaccagcaagcccacccgccgcagccgcgccagcgccctgaacatcgtgcgcagccagcgcggccccacccgcatgtgccgcaacatctacgaccccctgctgtgcttcaagctgttcttcaccgacgagatcatcagcgagatcgtgaagtggaccaacgccgagatcagcctgaagcgccgcgagagcatgaccagcgccaccttccgcgacaccaacgaggacgagatctacgccttcttcggcatcctggtgatgaccgccgtgcgcaaggacaaccacatgagcaccgacgacctgttcgaccgcagcctgagcatggtgtacgtgagcgtgatgagccgcgaccgcttcgacttcctgatccgctgcctgcgcatggacgacaagagcatccgccccaccctgcgcgagaacgacgtgttcacccccgtgcgcaagatctgggacctgttcatccaccagtgcatccagaactacacccccggcgcccacctgaccatcgacgagcagctgctgggcttccgcggccgctgccccttccgcgtgtacatccccaacaagcccagcaaatacggcatcaagatcctgatgatgtgcgacagcggcaccaagtacatgatcaacggcatgccctacctgggccgcggcacccagaccaacggcgtgcccctgggcgagtactacgtgaaggagctgagcaagcccgtgcacggcagctgccgcaacatcacctgcgacaactggttcaccagcatccccctggccaagaacctgctgcaggagccctacaagctgaccatcgtgggcaccgtgcgcagcaacaagcgcgagatccccgaggtgctgaagaacagccgcagccgccccgtgggcaccagcatgttctgcttcgacggccccctgaccctggtgagctacaagcccaagcccgccaagatggtgtacctgctgagcagctgcgacgaggacgccagcatcaacgagagcaccggcaagccccagatggtgatgtactacaaccagaccaagggcggcgtggacaccctggaccagatgtgcagcgtgatgacctgcagccgcaagaccaaccgctggcccatggccctgctgtacggcatgatcaacatcgcctgcatcaacagcttcatcatctacagccacaacgtgagcagcaagggcgagaaggtgcagagccgcaagaagttcatgcgcaacctgtacatgggcctgaccagcagcttcatgcgcaagcgcctggaggcccccaccctgaagcgctacctgcgcgacaacatcagcaacatcctgcccaaggaggtgcccggcaccagcgacgacagcaccgaggagcccgtgatgaagaagcgcacctactgcacctactgccccagcaagatccgccgcaaggccagcgccagctgcaagaagtgcaagaaggtgatctgccgcgagcacaacatcgacatgtgccggagctgcttctaa
最后应当说明的是，以上实施例仅仅用于说明本发明的技术方案，并不是对本发明的保护范围的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当明白在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应当视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海细胞治疗研究院
上海细胞治疗集团有限公司
<120> 一种转座酶的筛选报告载体及其制备方法和应用
<130> 199909
<150> CN 201911227291.7
<151> 2019-12-04
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1815
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggccctg ctgccaagag ggtcaagttg gacggcagca gcctggacga cgagcacatc 60
ctgagcgccc tgctgcagag cgacgacgag ctggtgggcg aggacagcga cagcgaggtg 120
agcgaccacg tgagcgagga cgacgtgcag agcgacaccg aggaggcctt catcgacgag 180
gtgcacgagg tgcagcccac cagcagcggc agcgagatcc tggacgagca gaacgtgatc 240
gagcagcccg gcagcagcct ggccagcaac cgcaatctga ccctgcccca gcgcaccatc 300
cgcggcaaga acaagcactg ctggagcacc agcaagccca cccgccgcag ccgcgtcagc 360
gccctgaaca tcgtgcgcag ccagcgcggc cccacccgca tgtgccgcaa catctacgac 420
cccctgctgt gcttcaagct gttcttcacc gacgagatca tcagcgagat cgtgaagtgg 480
accaacgccg agatcagcct gaagcgccgc gagagcatga ccagcgccac cttccgcgac 540
accaacgagg acgagatcta cgccttcttc ggcatcctgg tgatgaccgc cgtgcgcaag 600
gacaaccaca tgagcaccga cgacctgttc gaccgcagcc tgagcatggt gtacgtgagc 660
gtgatgagcc gcgaccgctt cgacttcctg atccgctgcc tgcgcatgga cgacaagagc 720
atccgcccca ccctgcgcga gaacgacgtg ttcacccccg tgcgcaagat ctgggacctg 780
ttcatccacc agtgcatcca gaactacacc cccggcgccc acctgaccat cgacgagcag 840
ctgctgggct tccgcggccg ctgccccttc cgcgtgtaca tccccaacaa gcccagcaag 900
tacggcatca agatcctgat gatgtgcgac agcggcacca agtacatgat caacggcatg 960
ccctacctgg gccgcggcac ccagaccaac ggcgtgcccc tgggcgagta ctacgtgaag 1020
gagctgagca agcccgtgca cggcagctgc cgcaacatca cctgcgacaa ctggttcacc 1080
agcatccccc tggccaagaa cctgctgcag gagccctaca agctgaccat cgtgggcacc 1140
gtgcgcagca acaagcgcga gatccccgag gtgctgaaga acagccgcag ccgccccgtg 1200
ggcaccagca tgttctgctt cgacggcccc ctgaccctgg tgagctacaa gcccaagccc 1260
gccaagatgg tgtacctgct gagcagctgc gacgaggacg ccagcatcaa cgagagcacc 1320
ggcaagcccc agatggtgat gtactacaac cagaccaagg gcggcgtgga caccctggac 1380
cagatgtgca gcgtgatgac ctgcagccgc aagaccaacc gctggcccat ggccctgctg 1440
tacggcatga tcaacatcgc ctgcatcaac agcttcatca tctacagcca caacgtgagc 1500
agcaagggcg agaaggtgca gagccgcaag aagttcatgc gcaacctgta catgggcctg 1560
accagcagct tcatgcgcaa gcgcctggag gcccccaccc tgaagcgcta cctgcgcgac 1620
aacatcagca acatcctgcc caaggaggtg cccggcacca gcgacgacag caccgaggag 1680
cccgtgatga agaagcgcac ctactgcacc tactgcccca gcaagatccg ccgcaaggcc 1740
agcgccagct gcaagaagtg caagaaggtg atctgccgcg agcacaacat cgacatgtgc 1800
cagagctgct tctaa 1815
<210> 2
<211> 1815
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggccctg ctgccaagag ggtcaagttg gacggcagca gcctggacga cgagcacatc 60
ctgagcgccc tgctgcagag cgacgacgag ctggtgggcg aggacagcga cagcgaggtg 120
agcgaccacg tgagcgagga cgacgtgcag agcgacaccg aggaggcctt catcgacgag 180
gtgcacgagg tgcagcccac cagcagcggc agcgagatcc tggacgagca gaacgtgatc 240
gagcagcccg gcagcagcct ggccagcaac cgcaacctga ccctgcccca gcgcaccatc 300
cgcggcaaga acaagcactg ctggagcacc agcaagccca cccgccgcag ccgcgccagc 360
gccctgaaca tcgtgcgcag ccagcgcggc cccacccgca tgtgccgcaa catctacgac 420
cccctgctgt gcttcaagct gttcttcacc gacgagatca tcagcgagat cgtgaagtgg 480
accaacgccg agatcagcct gaagcgccgc gagagcatga ccagcgccac cttccgcgac 540
accaacgagg acgagatcta cgccttcttc ggcatcctgg tgatgaccgc cgtgcgcaag 600
gacaaccaca tgagcaccga cgacctgttc gaccgcagcc tgagcatggt gtacgtgagc 660
gtgatgagcc gcgaccgctt cgacttcctg atccgctgcc tgcgcatgga cgacaagagc 720
atccgcccca ccctgcgcga gaacgacgtg ttcacccccg tgcgcaagat ctgggacctg 780
ttcatccacc agtgcatcca gaactacacc cccggcgccc acctgaccat cgacgagcag 840
ctgctgggct tccgcggccg ctgccccttc cgcgtgtaca tccccaacaa gcccagcaaa 900
tacggcatca agatcctgat gatgtgcgac agcggcacca agtacatgat caacggcatg 960
ccctacctgg gccgcggcac ccagaccaac ggcgtgcccc tgggcgagta ctacgtgaag 1020
gagctgagca agcccgtgca cggcagctgc cgcaacatca cctgcgacaa ctggttcacc 1080
agcatccccc tggccaagaa cctgctgcag gagccctaca agctgaccat cgtgggcacc 1140
gtgcgcagca acaagcgcga gatccccgag gtgctgaaga acagccgcag ccgccccgtg 1200
ggcaccagca tgttctgctt cgacggcccc ctgaccctgg tgagctacaa gcccaagccc 1260
gccaagatgg tgtacctgct gagcagctgc gacgaggacg ccagcatcaa cgagagcacc 1320
ggcaagcccc agatggtgat gtactacaac cagaccaagg gcggcgtgga caccctggac 1380
cagatgtgca gcgtgatgac ctgcagccgc aagaccaacc gctggcccat ggccctgctg 1440
tacggcatga tcaacatcgc ctgcatcaac agcttcatca tctacagcca caacgtgagc 1500
agcaagggcg agaaggtgca gagccgcaag aagttcatgc gcaacctgta catgggcctg 1560
accagcagct tcatgcgcaa gcgcctggag gcccccaccc tgaagcgcta cctgcgcgac 1620
aacatcagca acatcctgcc caaggaggtg cccggcacca gcgacgacag caccgaggag 1680
cccgtgatga agaagcgcac ctactgcacc tactgcccca gcaagatccg ccgcaaggcc 1740
agcgccagct gcaagaagtg caagaaggtg atctgccgcg agcacaacat cgacatgtgc 1800
cggagctgct tctaa 1815
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagccgctaa aggcattatc cgcc 24
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aactgtgccc tccatggaaa aatcagtc 28
<210> 5
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gactgatttt tccatggagg gcacagttaa ccctagaaag atagtctgcg taaaattgac 60
gcatgcgac 69
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggcggataat gcctttagcg gcttaaccct agaaagataa tcatattgtg 50
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taatcagcga agcgatga 18
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagcatgcct gctattgtct tcc 23
Claims (22)
1.一种转座酶的筛选报告载体，其特征在于，筛选具有转座酶活性的生物活性物质，含有
(1)URA3基因表达盒，URA3基因中含有转座子片段，转座子片段可操作地插入URA3基因中TTAA处，转座子片段的5’IR与3’IR之间含有抗生素抗性基因；及
(2)转座酶基因表达盒，转座酶片段可操作地连接有诱导型启动子元件。
2.根据权利要求1所述的筛选报告载体，其特征在于，URA3基因表达盒与转座酶基因表达盒相对独立地分布，或者转座酶基因表达盒可操作地插入URA3基因表达盒中的转座子片段中。
3.根据权利要求1所述的筛选报告载体，其特征在于，所述抗生素抗性基因包括四环素抗性基因、大环内酯抗生素抗性基因或者氨基糖苷类抗生素抗性基因，优选氨基糖苷类抗生素抗性基因；所述氨基糖苷类抗生素基因包括G418抗性基因或卡那霉素抗性基因Npt，优选G418抗性基因；
所述转座子片段包括SB转座子片段、PB转座子片段、P因子片段、Tn转座子片段或者IS转座子片段，优选PB转座子片段或SB转座子片段；
所述转座酶片段包括SB转座酶片段、PB转座酶片段、P转座酶片段、Tn转座酶片段或者IS转座酶片段，优选PB转座酶片段或者SB转座酶片段；
所述诱导性启动子元件包括诱导型GALS启动子、诱导型AOX1启动子或者诱导型PAOX1启动子，优选为诱导型GALS启动子；
所述具有转座酶活性的生物活性物质包括PB转座酶、SB转座酶、P转座酶、Tn转座酶或者IS转座酶，优选PB转座酶或SB转座酶。
4.根据权利要求1所述的筛选报告载体，其特征在于，URA3基因中含有的转座子片段同转座酶基因表达盒中转座酶片段表达的转座酶间特异性选择。
5.权利要求1至4任一项所述的筛选报告载体的制备方法，其特征在于，步骤包括：含有URA3基因表达盒的线性片段同与之有同源序列的含有抗生素抗性基因的转座子片段，经同源重组酶连接，得含有URA3基因表达盒的载体，URA3基因中可操作地插入转座子，转座子中可操作地插入抗生素抗性基因；
可操作地连接有诱导型启动子元件的转座酶片段，在限制性内切酶作用下，克隆至含有URA3基因表达盒的载体上，得转座酶的筛选报告载体，URA3基因表达盒与转座酶基因表达盒连接于同一载体上。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，含有URA3基因表达盒的线性片段的制备包括：设计引物从URA3基因的TTAA处对含有URA3基因表达盒的模板载体进行PCR，得到含有URA3基因表达盒的线性片段；优选地，设计引物pURA-F：SEQ ID NO:1和pURA-R：SEQ IDNO:2对模板载体PRS316进行PCR，得到含有URA3基因表达盒的线性片段；优选地，所述模板载体为酵母菌质粒载体，更优选为PRS316。
同含有URA3基因表达盒的线性片段具有同源序列的含有抗生素抗性基因的转座子片段的制备包括：设计引物对5’IR与3’IR之间含有抗生素抗性基因的转座子进行PCR，使得到的含有抗生素抗性基因的转座子片段同含有URA3基因表达盒的线性片段具有同源序列；优选地，设计引物pURA-IR-F：SEQ ID NO:3和pURA-IR-R：SEQ ID NO:4对5’IR与3’IR之间含有抗生素抗性基因的转座子进行PCR，使得到的含有抗生素抗性基因的转座子片段同含有URA3基因表达盒的线性片段具有同源序列。
7.权利要求1至4任一项所述的筛选报告载体构建的突变体库。
8.一种转座酶的突变体库，其特征在于，包含分别转染不同的突变的转座酶开放阅读框架片段的URA缺陷型的酵母菌株；每个URA缺陷型的酵母菌株内，突变的转座酶开放阅读框架片段酶切连接于权利要求1-6任一项所述的筛选报告载体的转座酶基因表达盒内，替换转座酶基因表达盒内未经突变的转座酶开放阅读框架片段。优选URA缺陷型的酵母菌株包括BJ2168、Y187、YBZ-1或YZH-Gold，更优选为URA缺陷型的酿酒酵母菌株BJ2168。
9.权利要求8所述的突变体库的制备方法，其特征在于，步骤包括：
(1)设计PCR引物对权利要求1-6任一项所述的转座酶的筛选报告载体进行PCR，得到转座酶开放阅读框架片段；
使用限制性内切酶对权利要求1-6任一项所述的转座酶的筛选报告载体进行线性化，得到线性化载体片段，该线性化载体片段切除未突变的转座酶开放阅读框架片段，且与PCR处理得到的转座酶开放阅读框架片段间具有同源序列；
(2)对转座酶开放阅读框架片段进行易错PCR突变，得到不同的突变的转座酶开放阅读框架片段；
(3)将不同的突变的转座酶开放阅读框架片段与具有同源序列的线性化载体片段分别转染至不同的URA缺陷型的酵母菌株内，在酵母同源重组修复机制下，突变的转座酶开放阅读框架片段同具有同源序列的线性化载体片段重组连接，得到转染不同的突变的转座酶开放阅读框架片段的若干URA缺陷型的酵母菌株，构建转座酶的突变体库。所述不同的突变的转座酶开放阅读框架片段与具有同源序列的线性化载体片段间的用量比优选为1～10:1，更优选为10:1；所述URA缺陷型的酵母菌株优选为BJ2168、Y187、YBZ-1或YZH-Gold，更优选为URA缺陷型的酿酒酵母菌株BJ2168。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，对转座酶开放阅读框架片段进行易错PCR逐次累积突变，每次突变得到的突变的转座酶开放阅读框架片段，即为不同的突变的转座酶开放阅读框架片段。
11.权利要求1-4任一项所述的筛选报告载体和/或权利要求8所述的突变体库用于制备转座酶的高通量筛选体系。
12.一种转座酶的高通量筛选体系，其特征在于，含有权利要求1-6任一项所述的筛选报告载体和/或权利要求8所述的突变体库。
13.根据权利要求12所述的高通量筛选体系，其特征在于，还含有培养基，培养基优选包括适用于酵母菌株的YPD培养基、和/或加入抗生素的活化培养基、和/或加入诱导物的诱导培养基、和/或URA缺陷型培养基。
14.一种转座酶的高通量筛选方法，其特征在于，包含以下步骤：
将权利要求8所述的突变体库中分别转染不同的突变的转座酶开放阅读框架片段的URA缺陷型的酵母菌株单克隆活化后再诱导，将诱导后的酵母菌株接种至URA缺陷型培养基中培养，同平行培养的转入权利要求1所述转座酶筛选报告载体的酵母菌株进行对比，进行第一次筛选；
将第一次筛选得到的权利要求8所述的突变体库中分别转染不同的突变的转座酶开放阅读框架片段的酵母菌株活化后调整OD600值一致，再接种诱导后调整OD600值一致，分别接种至URA缺陷型培养基与YPD培养基中培养，统计URA缺陷型培养基上的克隆数量，以常用培养基上的克隆数量为基础，计算并对比转座酶转座效率值，进行第二次筛选，得到含有高活性转座酶的酵母菌株。
15.根据权利要求14所述的高通量筛选方法，其特征在于，权利要求8所述的突变体库由权利要求1-6任一项所述的筛选报告载体采用权利要求9或10所述的方法制备得到。
16.根据权利要求14所述的高通量筛选方法，其特征在于，第一次筛选过程中，URA缺陷型的酵母菌株单克隆接种至含有抗生素的活化培养基中活化18～30小时，优选活化24小时，所述抗生素包括链霉素、青霉素、庆大霉素、氨苄霉素或卡那霉素，优选为G418抗生素；活化后再接种至含有诱导物的诱导培养基中诱导18～30小时，优选诱导24小时，诱导培养基中诱导物的百分含量为1.5～3％，优选为2％；诱导物包含半乳糖、葡萄糖或者甲醇，优选为半乳糖；将诱导后的酵母菌株接种至URA缺陷型培养基中培养36～48小时，优选48小时；所述含有抗生素的活化培养基优选为YPD培养基、SCM培养基或SD培养基，更优选为含有G418抗生素的YPD培养基；
第二次筛选过程中，酵母菌株接种至含有抗生素的活化培养基中活化18～30小时，优选活化24小时，所述抗生素包括链霉素、青霉素、庆大霉素、氨苄霉素或卡那霉素，优选为G418抗生素；活化并调整OD600值一致后按照1：50～200的体积比接种至含有诱导物的诱导培养基中诱导18～30小时，具体地，优选按照1:100的体积比接种至含有诱导物的诱导培养基中，诱导时间优选为24小时，诱导培养基中诱导物的百分含量为1.5～3％，优选为2％；诱导物包含半乳糖、葡萄糖或者甲醇，优选为半乳糖；诱导并调整OD600值一致后接种至URA缺陷型培养基培养36～48小时，优选48小时；所述含有抗生素的活化培养基优选为YPD培养基、SCM培养基或SD培养基，更优选为含有G418抗生素的YPD培养基。
17.根据权利要求14或16所述的高通量筛选方法，其特征在于，第一次筛选过程中，酵母菌株诱导后接种至URA缺陷型培养基之前，对酵母菌株的诱导液进行稀释处理，具体地，稀释倍数为10～10000，优选为100～1000倍。
18.根据权利要求14或16所述的高通量筛选方法，其特征在于，第二次筛选过程中，酵母菌株诱导并调整OD600值一致后，分别接种至URA缺陷型培养基与正常培养基之前，对酵母菌株的诱导液进行1～3次梯度稀释，取每次梯度稀释的各梯度浓度诱导液分别进行下次梯度稀释，优选进行2次梯度稀释；具体地，每次梯度稀释的倍数范围为10～106，优选为100～10000；优选地，进行2次梯度稀释时，第一次梯度稀释范围为100～10000，第二次梯度稀释范围为100～10000。
19.根据权利14所述的高通量筛选方法，其特征在于，还包括将从第二次筛选得到的含有高活性转座酶的酵母菌株中提取得到的高活性转座酶的筛选报告载体进行测序分析确定突变位点，和/或进行目标宿主进行转座效率验证。
20.一种URA3基因表达盒，其特征在于，URA3基因中含有转座子片段，转座子片段可操作地插入URA3基因中TTAA处，转座子片段的5’IR与3’IR之间含有抗生素抗性基因。
21.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求20所述的URA3基因表达盒。
22.权利要求20所述的URA3基因表达盒或者权利要求21所述的重组载体用于制备转座酶的筛选报告载体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911227291 | 2019-12-04 | ||
| CN2019112272917 | 2019-12-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112899296A true CN112899296A (zh) | 2021-06-04 |
Family
ID=76110956
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010940614.3A Pending CN112899296A (zh) | 2019-12-04 | 2020-09-09 | 一种转座酶的筛选报告载体及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112899296A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108728477A (zh) * | 2017-04-24 | 2018-11-02 | 华东理工大学 | 一种高效的转座突变系统及构建方法 |
| CN114591993A (zh) * | 2022-05-10 | 2022-06-07 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 快速鉴定Tn5转座酶活性的方法 |
-
2020
- 2020-09-09 CN CN202010940614.3A patent/CN112899296A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108728477A (zh) * | 2017-04-24 | 2018-11-02 | 华东理工大学 | 一种高效的转座突变系统及构建方法 |
| CN114591993A (zh) * | 2022-05-10 | 2022-06-07 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 快速鉴定Tn5转座酶活性的方法 |
| CN114591993B (zh) * | 2022-05-10 | 2022-08-12 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 快速鉴定Tn5转座酶活性的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering | |
| US11898270B2 (en) | Pig genome-wide specific sgRNA library, preparation method therefor and application thereof | |
| CN109880851B (zh) | 用于富集CRISPR/Cas9介导的同源重组修复细胞的筛选报告载体及筛选方法 | |
| Fan et al. | Transformation of Cryptococcus neoformans by electroporation using a transient CRISPR-Cas9 expression (TRACE) system | |
| CN112899296A (zh) | 一种转座酶的筛选报告载体及其制备方法和应用 | |
| CN112899252A (zh) | 一种高活性转座酶及其应用 | |
| CN106589134A (zh) | 嵌合蛋白pAgoE及构建方法、应用以及使用向导的嵌合蛋白pAgoE及构建方法、应用 | |
| US20090111099A1 (en) | Promoter Detection and Analysis | |
| WO2024207806A1 (zh) | 用于富养罗尔斯通氏菌快速基因编辑的双质粒系统及应用 | |
| Moqtaderi et al. | Construction of mutant alleles in Saccharomyces cerevisiae without cloning: overview and the delitto perfetto method | |
| US6376192B1 (en) | Method for screening of DNA libraries and generation of recombinant DNA constructs | |
| EP3676396B1 (en) | Transposase compositions, methods of making and methods of screening | |
| Xiong et al. | High efficiency and throughput system in directed evolution in vitro of reporter gene | |
| CA2430378A1 (en) | Substrate linked directed evolution (slide) | |
| JP2009502158A (ja) | 酵母のストレス耐性を増加させる遺伝子類の同定方法類、およびそれらの遺伝子類の酵母株改良のための使用 | |
| CN109402096B (zh) | 一种aid酶突变体及其应用 | |
| CN108728477A (zh) | 一种高效的转座突变系统及构建方法 | |
| US20050153343A1 (en) | Method of massive directed mutagenesis | |
| CN105695509B (zh) | 一种获得高纯度心肌细胞的方法 | |
| CN111334531A (zh) | 高信噪比阴性遗传筛选方法 | |
| CN116555269B (zh) | 熊蜂生假丝酵母诱导型启动子及其应用 | |
| WO2023050169A1 (zh) | 一种在基因组上高通量实现tag到taa转换的方法 | |
| KR102690862B1 (ko) | 페닐알라닌 검출용 바이오센서 및 그 용도 | |
| Horswill et al. | Identifying small‐molecule modulators of protein‐protein interactions | |
| WO2024068845A1 (en) | New loxpsym sites for large-scale orthogonal cre-mediated recombination |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Country or region after: China Address after: No. 1585 Yuanguo Road, Jiading District, Shanghai, 201805 Applicant after: SHANGHAI CELL THERAPY Research Institute Applicant after: Shanghai Cell Therapy Group Co.,Ltd. Address before: No. 1585 Yuanguo Road, Jiading District, Shanghai, 201805 Applicant before: SHANGHAI CELL THERAPY Research Institute Country or region before: China Applicant before: SHANGHAI CELL THERAPY GROUP Co.,Ltd. |
|
| CB02 | Change of applicant information |