JP2002507428A - カエノラブディティス・エレガンスのバリスティック形質転換法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 複数の微小発射体で線虫に衝撃を与えることを含む、線虫に核酸を導入するバリスティック法を記載する。本発明の方法にしたがって形質転換された線虫もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、核酸を線虫、特にカエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabd
itis elegans）に導入する方法に関する。 トランスジェニックカエノラブディティス・エレガンスは、現在、核酸（通常
、ＤＮＡ）を雌雄同体の生殖巣中に（すなわち、シンシチウム中に）または個々
の卵母細胞核中に注入することによって作製されている。典型的には、導入した
いＤＮＡ（本明細書中では以後、「試験ＤＮＡ」という）および非トランスジェ
ニック子孫とトランスジェニック子孫を区別することを可能にする選択マーカー
を有するプラスミドの混合物を注入する。選択マーカーは、トランスジェニック
虫の形状または活動に変化をもたらす可視表現型マーカー（例えば、ｒｏｌ−６
）、注入された虫の遺伝的バックグラウンドに導入された条件致死遺伝子をレス
キューするマーカー、またはクラゲAequorea victoria由来の緑色蛍光タンパク 質（ＧＦＰ）をコードしている核酸を含有するプラスミドであることができる。
次いで、注入された虫の子孫（Ｆ１世代）を、選択マーカーを発現している動物
についてスクリーンする。

【０００２】 注入された雌雄同体のＦ１子孫は、典型的には、平均１〜１０個体の選択マー
カーを発現する個体を含有する。次いで、これらの個体を培地中に置くが、平均
１０％のみが選択マーカーをそれらの子孫に伝え続けるであろう。一般に、マー
カーＤＮＡが虫ゲノム中に許容され、子孫に伝えられる場合、導入したい試験Ｄ
ＮＡを同時形質転換することが想定される。

【０００３】 形質転換のこの現行の方法は、虫へのＤＮＡ導入において、顕微鏡下でのシン
シチウム／卵母細胞の操作および注入を必要とすることによって、実際的に制限
される。この作業は、時間を浪費し、相当な熟練技術を必要とする。典型的には
、当業者は、注入技術において、１日に５０個までの雌雄同体に注入することが
可能である。

【０００４】 形質転換されたＤＮＡを遺伝によって伝えているトランスジェニック虫は、予
測できない構造において互いに結合されるマーカーおよび試験ＤＮＡの混合物よ
りなる余分のミニ染色体を組み込んでいる。該ミニ染色体は、有糸分裂および減
数分裂に不安定であり、細胞分裂あたり１％〜９９％の割合で失われる。

【０００５】 本発明の目的は、カエノラブディティス・エレガンスのためのより有効な形質
転換システムを提供することにある。理論的には、カエノラブディティス・エレ
ガンス染色体との相同組換えによって外来性試験ＤＮＡの組込みを達成すること
が望ましい。該目的を達成するために、多数の、すなわち、何千もの個々の虫に
ＤＮＡを同時に導入できる技術を開発する必要がある。

【０００６】 近年、開発されたＤＮＡを細胞中に導入する方法は、導入されるべきＤＮＡで
被覆された微小発射体（microprojectile）、典型的には直径約２μｍの金また はタングステン粒子を細胞に撃ち込むことを特徴とする。該技術は、一般に当業
者にバリスティック（ballistic）形質転換として知られており、植物細胞（Kle
inら、Nature, 327: 70-73 (1987); Christouら、Plant Physiol., 87: 671-674
(1988); Takeuchiら、Plant Molecular Biology, 18: 835-839 (1992)）、培養
哺乳動物細胞（Zeleninら、FEBS Letters, 244: 65-67 (1989)）、受精させた魚
卵（Zeleninら、FEBS Letters, 287: 118-120 (1991)）および無傷マウス組織お
よび器官（Zeleninら、FEBS Letters, 280: 94-94 (1991); Williamsら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 88: 2726-2730 (1991)）中にＤＮＡを首尾よく送達する
ために用いられてきた。

【０００７】 植物細胞および培養哺乳動物細胞を用いる技術の成功にもかかわらず、バリス
ティック技術を線虫に応用するにあたり、問題が当業者によって予期された。し
かしながら、本発明者らは、類似のバリスティック形質転換技術をカエノラブデ
ィティス・エレガンス中への核酸の導入に首尾よく応用した。該技術を用いると
、多数の個々の虫に核酸を同時に導入することが可能である。

【０００８】 したがって、第１の態様において、本発明は、複数の微小発射体で虫に衝撃を
与えることを特徴とする線虫に核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を導入する
方法を提供する。 本発明の１の具体例において、微小発射体は、線虫に導入することが望まれる
核酸で被覆されている。

【０００９】 高速微小発射体での線虫の衝撃は、当該分野で知られた型のヘリウムを流すこ
とに基づく粒子衝撃銃を用いて達成される（例えば、Johnston, Nature, 346: p
p776; Kleinら、Biotechnology, 10: pp286-291およびTakeuchiら、Plant Mol.
Biol., 18: pp835-839参照）。銃は、ヘリウムガス流を利用して、ＤＮＡ被覆粒
子を形質転換されるべき標的試料に向かって加速する。

【００１０】 核酸被覆微小発射体を用いるカエノラブディティス・エレガンスのバリスティ
ック形質転換についての詳細なプロトコールは、本明細書中、実施例に記載され
る。簡単に言えば、虫の小型ペレットを小型の線虫寒天プレート上に播く。次い
で、プレートを「銃」内部に置き、核酸で被覆された微小発射体（例えば、金粒
子）の懸濁液を虫に撃ち込む。短い回復期間の後、トランスジェニック動物の選
択のために、プレートをいくつかの切片に切断し、虫を生育させるための大型寒
天プレート上にそれを置く。形質転換手順はたったの２、３分を要し、技術的に
非常に単純であるため、多数の実験を非常にわずかな時間で行うことができる。

【００１１】 本発明の方法の別の具体例において、バリスティック形質転換はまた、まず、
核酸を含有する溶液を直接、線虫上に塗布し、次いで、核酸で被覆されていない
「裸の」微小発射体を線虫に撃ち込むことによって成し遂げることもできる。該
技術を用いると、微小発射体を核酸で被覆する必要がない。伝統的な衝撃技術を
用いると（すなわち、被覆された微小発射体を用いると）、形質転換子孫は、虫
の生殖巣細胞中に撃ち込まれている被覆粒子の結果として生産される。まず、虫
を核酸の濃厚な溶液で被覆し、次いで、「裸の」微小発射体で衝撃を与えるもう
１つ別のアプローチを用いると、粒子は、虫を通るその経路に沿ってＤＮＡを引
きずり、よって、粒子は必ずしも生殖巣細胞内で停止する必要がない。粒子が虫
を通るその経路上で単に生殖巣細胞を通過するにすぎない場合、それは、生殖巣
細胞の形質転換を生じるのに十分量の引きずっている核酸を後に残すことができ
る。

【００１２】 本発明の方法によってＤＮＡが首尾よく導入された形質転換体の選択を容易化
するために、例えば、ｒｏｌ−６または自律性蛍光タンパク質（ＡＦＰ）のよう
な優性表現型マーカーを、注入される虫の遺伝的バックグラウンドに導入された
条件致死遺伝子をレスキューするマーカーと組み合わせて用いる二重選択プロト
コールを用いることが好ましい。本明細書で使用される場合、「自律性蛍光タン
パク質」なる語は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および青色蛍光タンパク質（
ＢＦＰ）ならびにこの型のいずれか他の自律性蛍光タンパク質を包含する。下記
の実施例は、野生型ｐｈａ−１遺伝子をコードしているＤＮＡが共同選択マーカ
ーとして導入される、ｐｈａ−１遺伝子における温度感受性突然変異を有する遺
伝的バックグラウンドを有するカエノラブディティス・エレガンスの形質転換に
関する。しかしながら、他の条件致死突然変異を同等の効果をもって使用でき、
本発明は、形質転換された虫の同定を容易化するために用いられる選択マーカー
の性質によって制限されないことを理解されたい。 本発明は、添付の図面と一緒に下記の実施例に関して、さらに理解されるであ
ろう。

【００１３】 実施例１−バリスティック形質転換の基本プロトコール （Ａ）同調虫培養 １．カエノラブディティス・エレガンス虫（系統ｐｈａ−１（ｅ２１２３ｔｓ
））を大型の標準ＮＧＭプレート上で飢餓するまで生育させて、Ｌ１段階の幼虫
の蓄積を促進した。 ２．「Ｌ１島」を含有する寒天の断片を切り取り、新しい大型のＮＧＭプレー
トに接種するために用いた。 ３．虫を若い成虫段階になるまで、清潔な仮滅菌環境において特定のカエノラ
ブディティス・エレガンス系統の要求に応じて１５〜２０℃で生育させた。 ４．蒸留水またはエッグバッファーで虫をプレートから洗い出し、５０ｍｌフ
ァルコンチューブ中にプールし、重力によって沈殿させた。 ５．虫ペレットの約５００〜８００μｌアリコートを、ブルーチップを装着し
たギルソン（Gilson）（登録商標）ピペットを用いて吸引し、小型ＮＧＭプレー
トの中央に１滴ずつ置いた。 ６．プレートを氷上に置き、液体をしみ込ませて、不均一な虫の「ピロー（pi
llow）」を後に残した。虫のピローは、白金スパチュラを用いて直径約１０ｍｍ
の環状形に成形し、使用するまで氷上に置いた。

【００１４】 （Ｂ）バリスティック粒子衝撃 １．氷冷した虫を含有するＮＧＭプレートを銃の真空チャンバー内の十字線テ
ーブル上に、射撃チャンバーの開口部まで１２０ｍｍの距離で置いた。ＮＧＭプ
レートのふたを外し、真空チャンバーの扉をすぐに閉じた。次いで、射撃チャン
バー内のスチールグリッドにＤＮＡ被覆金懸濁液（エタノール中）を充填した。
金粒子は、試験ＤＮＡおよびマーカーＤＮＡ（ｒｏｌ−６を含有するプラスミド
ｐＲＦ４および野生型ｐｈａ−１を含有するｐＢＸ）の混合物で被覆されていた
。 ２．ヘリウム圧設定バルブを８〜１０バールに設定した。次いで、真空チャン
バーを排気し、部分真空が−５０ないし−１００ミリバールの圧力に達したとき
、圧力排出を解除した。 ３．次いで、真空チャンバーの扉を開け、ＮＧＭプレートのふたをすぐに戻し
て滅菌性を保持した。次いで、プレートを１５℃に置き、虫を衝撃処置から回復
させた。 ４．ＮＧＭ寒天を４〜８個の切片に切断し、各切片を新しい大型のＮＧＭ豊富
なプレート（２倍のトリプトン）上に置いた。次いで、該大型プレートを１５〜
２０℃でインキュベートした。

【００１５】 （Ｃ）形質転換体の選択 形質転換後の６〜７日後に、Ｆ１虫を： （ｉ）ｒｏｌ−６表現型を発現している虫について視覚的にスクリーンし、ｒ
ｏｌ−６表現型を発現している虫を単離し、続いて、安定な形質転換について試
験し、および／または （ｉｉ）２５℃にシフトし、さらに３〜４日間培養を維持することによって、
ｐｈａ−１レスキューについてスクリーンし、および／または上記のいずれかの
後、 （ｉｉｉ）次いで、ｒｏｌ−６表現型を発現するトランスジェニック虫系統お
よび２５℃でｐｈａ−１レスキューを示すトランスジェニック虫系統の両方を個
々に、当該分野で既知の技術を用いて、試験ＤＮＡの存在について試験した。

【００１６】 実施例２−バリスティック形質転換の詳細なプロトコール 用いられる方法をレシピの形態で記載する。全ての工程は滅菌条件下で行われ
る。一般的なカエノラブディティス・エレガンス法は、Wood W. B. (1988) 'The
nematode Caenorhabditis elegans', Cold Spring Harbor Laboratory, New Yo
rkにおいて記載されている。

【００１７】 （Ａ）虫の調製 プレートがＬ１幼虫の多くの島で被覆されるように、標的虫系統（ここではｐ
ｈａ−１(e2123ts)）を大型標準ＮＧＭプレート（直径９０ｍｍ）上で飢餓する まで生育させた。「Ｌ１島」の大きさによって、５〜１０ｍｍ²の寒天片に切断 し、１０回のショットあたり約８個の新しい大型ＮＧＭプレートに接種する。虫
は、成虫になる前に餓死すべきではない。虫は、イー・コリ（E. coli）のよう な細菌を餌にすることができる。虫の約５０％が２、３個の卵を含有するとき、
プレートの準備が整った。蒸留水で虫をプレートから洗い出し、５０ｍｌチュー
ブにプールする。重力によって虫を沈殿させる（室温で〜１５分）。約１００μ
ｌの虫ペレットを小型（３５ｍｍ）ＮＧＭプレートの中央に置く。これらのプレ
ートは数日間乾燥させており、その前日に、約１０ｍｍの直径を有するイー・コ
リ（系統ＯＰ５０）の薄層を播く（室温でインキュベーション）。プレートを氷
上に戻して、虫の移動を止め、液体を吸収させて、不均一な虫の「ピロー」を後
に残す。白金スパチュラを用い、約１０ｍｍの直径を有する多少均一な環状形の
虫の「ピロー」を成形する。使用するまで氷上に放置するが、１〜２時間以上に
はしない。

【００１８】 （Ｂ）バリスティック粒子衝撃 衝撃装置（銃）は、射撃距離（下記参照）に置かれたろ紙に向かって発射し、
次いで、標的領域の中央を通る十字線を引くことによって補正される。補正は、
時々繰り返すべきである。補正および形質転換のために、Ｈｅ圧設定バルブを８
〜１０バールに設定する。氷冷した虫プレートを銃真空チャンバー内の十字線テ
ーブル上に、フィルターホルダーまで１２０ｍｍの距離に調整して置き、チャン
バーを閉じる直前にプレートのふたを外す。射撃チャンバー内のスチールグリッ
ドをＥｔＯＨ中のＤＮＡ被覆金懸濁液で充填する。真空チャンバーの排気を開始
し、部分真空が５０〜１００ミリバールの値に達したとき、銃の引き金を引く（
パルス時間、約１０ｍｓ；圧力波は、圧力放出のための装置のふたを外すべきで
はない）。

【００１９】 発明者らは、衝撃圧または部分真空のいずれかに関して最良の結果を有意に得
る設定を決定することができなかった。この組織的な分析は、個々の装置に有用
であるかもしれない。虫はより強い部分真空であっても生き残った。８バール未
満の圧力で形質転換することもできるかもしれない。

【００２０】 真空を解除し、すぐに再び、虫プレートを閉じる。虫を１５℃で約３０分間、
回復させる。虫はウォームアップし、再び動き始めるであろう。寒天を４個以上
のセクターに切断し、各断片を新しい９０ｍｍＭＧＭ豊富なプレート（２倍のト
リプトン）上に置く。トランスジーンの選択プロトコールによって１５〜２０℃
でプレートを放置する。

【００２１】 （Ｃ）スクリーニング手順 該手順は、トランスジェニック虫をスクリーンするために使用される実際のシ
ステムによって変化させてもよい。ｒｏｌ−６（Mello, C.C.ら、(1991) EMBO J
. 10: 3959-3970）および／またはｐｈａ−１（Granato, M.ら、(1994) Nucl. A
cids Res. 22: 1762-1763）を使用する場合： ６〜７日後（１５℃）に、Ｆ１世代の中でｒｏｌ−６動物を検索する。ｒｏｌ
動物を別々のプレート上に置き、次いで、安定な形質転換について試験する。安
定なトランスジェニック系統は、ｒｏｌ−６子孫を非メンデル比において生産す
るべきである。残りのＦ１世代を２５℃にシフトし、さらに３〜４日後にｐｈａ
−１レスキューについて試験する。レスキューは、プレート上の若いＦ２幼虫の
出現によって示される。さらに３〜４日後、プレートを再びチェックする。生存
能力のある虫が見られる場合、これらのＦ２またはＦ３動物の１０〜２０匹を個
々に、死んだ卵および生存能力のある虫の非メンデル分離による安定な形質転換
について試験する。ｐｈａ−１が時々、自然発生的な二次的な部位抑制遺伝子を
獲得することによって復帰することに注目すべきである（Schnabel, H.ら、(199
1) Genetics, 129: 69-77）。したがって、ｐｈａ−１系統は、いくつかの虫を ２５℃（ｐｈａ−１が死んだ卵のみを生産する温度）にシフトすることによって
、その無欠性について規則的にチェックされるべきである。ｃｅｈ−１３ＧＦＰ
リポーター構築物の存在は、トランスジェニック雌雄同体由来の胚を蛍光顕微鏡
下で見ることによって直接的に試験された。母性効果胚性致死遺伝子ｓｕｄ−１
の非条件対立遺伝子ｔ１２３７のレスキューについて試験するために、トランス
ジェニックアレイ（array）をｓｕｄ−１バックグラウンドに交雑し（ｖａｂ− ９ ｓｕｄ−１ （ｔ１２３７）／ｍｎｃｌ;ｌｏｎ−２）、ホモ接合体Ｖａｂ 雌雄同体（ｖａｂ−９ ｓｕｄ−１）の子孫を生存能力についてスクリーンした
。

【００２２】 （Ｄ）バリスティック衝撃のための金粒子の調製 レシピは、Takeuchiら（1992）Plant Mol. Biol., 18: 835-839の方法に基づ く。５ｍｇの金粉末（Ａｕ；粉末、球形、直径１．５−３μｍ；Aldrich（登録 商標））を１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中に入れ、５００μｌ蒸留水で粒
子を予備洗浄する；攪拌後に均一懸濁液が現れるであろう。金粒子を沈殿させ、
注意深く水を捨てる。少量の新しい蒸留水および２０μｇの各プラスミドＤＮＡ
を加える。容量を水で１８０μｌに調整し、２０μｌの３Ｍ 酢酸Ｎａ溶液を加 える。攪拌する。ＤＮＡを２．５容量のＥｔＯＨで沈殿させる。−２０℃で３０
分間保管する。この間に数分、攪拌する。重力によって金粒子が沈殿され、上清
を吸引する。遠心分離をしない。粒子を２００μｌの氷冷無水ＥｔＯＨ中に懸濁
する。攪拌する。ここで、粒子を−２０℃で保管できる。形質転換のために、２
０μｌ（１ショットあたり約２〜６μｇのＤＮＡ）の懸濁溶液を衝撃に使用され
るスウィニー（Swinny）（登録商標）−フィルターホルダー（Millipore）中に 充填する。すぐに取付け、発射する。

【００２３】 別法では、金粒子を以下のように調製する。 ２０μｇのプラスミドＤＮＡを１０ｍｇの金粉末（Ａｕ；粉末、球形、直径１
．５−３μｍ；Aldrich（登録商標））に加える。蒸留水を全量２００μｌまで 加え、次いで、２０μｌ ３Ｍ酢酸Ｎａおよび５５０μｌエタノールを加え、− ２０℃で少なくとも３時間、３０分毎に勢いよく攪拌しながら放置して、ＤＮＡ
を沈殿させる。３時間後、金粒子を沈殿させ、上清を吸引し、金粒子を２００μ
ｌ氷冷エタノール中に再溶解する。該溶液２０μｌを各実験に使用する。

【００２４】 （Ｅ）バリスティック衝撃のためのガラス粒子の調製 金粒子バリスティック形質転換の別法として、以下のように調製されたガラス
微小発射体を用いて行うこともできる。 ２０μｇプラスミドＤＮＡを１０μｌの「ガラスミルク（glassmilk）」活性 化ガラス懸濁液（Jetsorb）に加え、３００μｌのバッファーＡ１（製造者によ ってガラスミルク懸濁液を補足された）を加える。ＤＮＡをガラスミルクに５３
℃で１５分間結合させ、遠心分離後、ペレットを３００μｌのバッファーＡ１で
洗浄する。得られた懸濁液を遠心分離によって再ペレット化し、次いで、バッフ
ァーＡ２（これもまた、ガラスミルク懸濁液を製造者によって補足されている）
で２回洗浄する。洗浄後、ペレットを乾燥させ、２００μｌのエタノール中に再
懸濁する。上記の金粒子に関するバリスティック衝撃手順にしたがって、２０μ
ｌアリコートを各形質転換実験に使用する。他の製造者由来の他の活性化ガラス
懸濁液もまた、該手順に使用することができる。

【００２５】 活性化ガラス懸濁液は、おそらく金よりもよくＤＮＡを結合することが知られ
ているが、ガラス粒子を用いるバリスティック形質転換実験は、高い形質転換効
率をもたらさなかった。おそらくより多くのＤＮＡがビーズに結合するが、ガラ
スは金よりも低密度であり、おそらく、線虫をあまり効率よく通過しないであろ
う。にもかかわらず、金粒子とほとんど同じ効率でカエノラブディティス・エレ
ガンスをガラス粒子で形質転換することが可能であり、導入されたＤＮＡの量ま
たは粒子の密度のいずれも、あまり重要でないことを示す。

【００２６】 結果 上記のプロトコールにしたがって実施された金粒子を用いるいくつかの独立し
たバリスティック形質転換実験の結果を下記に要約する。各ケースにおいて、試
験ＤＮＡおよびマーカーＤＮＡの性質を示す。各試験ＤＮＡ／マーカーの組み合
わせについて、いくつかの異なる衝撃手順を上記（Ｂ）に記載の方法にしたがっ
て実施した。次いで、形質転換体をｒｏｌ−６表現型の発現およびｐｈａ−１条
件致死突然変異のレスキューに関して評価した。

【００２７】 一般に、ｒｏｌ−６選択を用いると、各ショット由来の大型プレートにおいて
ねじれている動物についてＦ１を評価することによって、１ショットあたりの平
均２つの形質転換体が得られた（（Ｂ）の工程４）。ミクロインジェクションプ
ロトコールを用いる場合と同様に、これらのたった１０％が次世代で安定であっ
た（６ショットにおいて１系統）。これらの系統は、常に、２つの他の同時形質
転換プラスミド（ｃｅｈ−１３のＧＦＰリポーター構築物（Wittmann, C.ら、(1
997) Development, 124: pp4193-4200）またはｓｕｄ−１遺伝子を含有するプラ
スミドのいずれかと共同したｐｈａ−１）を発現した（表１０Ａに要約された結
果を参照）。ｐｈａ−１選択システムを用いると、プレートをＦ２世代における
レスキューのための非許容温度にシフトすることによって、２ショットあたり約
１個の安定な系統が得られた。したがって、ｐｈａ−１選択システムは、形質転
換動物の選択において、ｒｏｌ−６システムよりも３倍効果的である。ｐｈａ−
１トランスジェニック動物はまた、２次マーカーを同時発現したが、第一世代後
、安定なねじれについて選択された同じショット由来の動物におけるよりもわず
かに低い頻度（７０％）で同時形質転換が起こった（表１０Ｂ）。同時形質転換
は、最初、臨界量のＤＮＡに依存し、その結果、異なるＤＮＡが確実に共同連結
して、連鎖状（concatemeric）のアレイを形成することができる（Mello, C.C. ら、(1991) EMBO J., 10: pp3959-3970）。感受性のより小さいｒｏｌ−６表現 型を用いて選択することにより、ある特定の境界より下の動物のみを見逃し、よ
って、共同連結のより高いチャンスを有した動物について選択することができる
。

【００２８】 表１１は、一連のショットの詳細な分析を示す。形質転換事象のある特定のク
ラスター化が観察された。Ｆ２選択においてｐｈａ−１について形質転換された
系統を有する１４個のプレートのうち９個がＦ１選択においてＲｏｌ動物を有し
た。また、Ｒｏｌ選択（Ｆ１）において見出された両方のマーカーについて安定
な系統は、クラスターになった。これらのプレートは、常に、Ｆ２選択において
付加的に二重に形質転換した系統を有した。しかしながら、このことは、Ｆ１選
択においてねじれている動物の全てを見出せないためであった。どれ程多くの独
立した事象がＦ２選択に隠されているのかは、明らかではない。

【００２９】 本明細書に記載の実施例において、１２０ｍｍの効果的な距離および８〜１０
バールの圧力を全ショットに用いた。圧力（６〜１０バール）の変化および距離
は、形質転換の効率に対して非常にわずかな影響を有することが観察された。発
射後、プレートを顕微鏡下で見ると、プレートの中央にある多くの虫が殺されて
いることがわかり、該地帯の周りの虫は金粒子を含有したが（図１）、外の地帯
の虫は含有しなかった。したがって、速度勾配は非常に急であり、本明細書で用
いられる実施例の条件下で、圧力および距離に依存して虫ペレット内の異なる位
置に存在することになりうる形質転換の狭い地帯が存在するようである。重要な
因子は、虫を薄い適切に乾燥した細菌性ローン(lawn）に置くことであり、さも なければ、虫は吹き払われる。１ショットあたりの使用される虫の量に関し、射
撃領域に及ぶのに十分な量の虫を使用したが、Ｒｏｌ選択にはＦ１虫が多すぎる
、またはｐｈａ−１選択にはＦ２虫が大量であるような、扱うことが困難になる
程のあまりに多くの虫ではない。

【００３０】 形質転換手順の効率における変化は、プロトコールを適応させない、すなわち
、線虫に対して同一量のＤＮＡ、銃における同一の設定および同一の培養条件を
用いる反復実験においてでさえも起こることが観察される。より接近した観察は
、虫が衝撃後にプレートの中央に残った衝撃実験が、虫がプレートの中央から吹
き払われた実験よりも高い形質転換効率をもたらしたことを示す。さらに、銃の
高圧によって吹き払われる虫は、衝撃処置を生き残らなかった。

【００３１】 バリスティック形質転換法の再現性、およびより小さな程度には、その効率を
、非常に乾燥した寒天プレート、高濃度の寒天を含有する寒天プレートおよびイ
ー・コリを接種された寒天プレートを用いることによって改良できる。さらに、
寒天プレート上での虫の固定もまた、バリスティック形質転換の高い効率および
再現性をもたらすであろう。

【００３２】 まとめると、バリスティック衝撃によってカエノラブディティス・エレガンス
を形質転換できることが明らかになった。現在、該方法は、実施する人の訓練お
よび技術ならびに非常に高価な装置に非常に多くを依存するミクロインジェクシ
ョン法とほとんど同じくらい有効である。虫の脱水が線虫の内部圧を和らげるこ
とを助け、それにより、それらが針によって貫通されるとき破裂することを回避
するミクロインジェクションとは異なり、脱水された虫を用いずに、バリスティ
ック形質転換を成し遂げた。

【００３３】 ショット実験：１ カエノラブディティス・エレガンス系統：ｐｈａ−１（ｅ２１２３） マーカーＤＮＡ：１．ｐＲＦ４（ｒｏｌ−６）での選択；Ｆ１個別に１５℃ ２．ｐＢＸ（ｐｈａ−１）での選択；Ｆ２／３一緒に２５℃ 試験ＤＮＡ：− 核酸の添加：− 状態：終結

【表１】

【００３４】 ショット実験：４ カエノラブディティス・エレガンス系統：ｐｈａ−１（ｅ２１２３） マーカーＤＮＡ：１．ｐＲＦ４（ｒｏｌ−６）での選択；Ｆ１個別に１５℃ ２．ｐＢＸ（ｐｈａ−１）での選択；Ｆ２／３一緒に２５℃ 試験ＤＮＡ：ｐＨ１−ＦＭ６．９（ｓｕｄ−１） ｖａｂ−９ ｓｕｄ−１と交
雑後 核酸の添加：− 状態：終結

【表２】

【００３５】 ショット実験：６ カエノラブディティス・エレガンス系統：ｐｈａ−１（ｅ２１２３） マーカーＤＮＡ：１．ｐＲＦ４（ｒｏｌ−６）での選択；Ｆ１個別に１５℃ ２．ｐＢＸ（ｐｈａ−１）での選択；Ｆ２／３一緒に２５℃ 試験ＤＮＡ：ｐＨ１−ＦＭ６．９（ｓｕｄ−１） ｖａｂ−９ ｓｕｄ−１と交
雑後 核酸の添加：− 状態：終結

【表３】

【００３６】

【表４】

【００３７】 ショット実験：７ カエノラブディティス・エレガンス系統：ｐｈａ−１（ｅ２１２３） マーカーＤＮＡ：１．ｐＲＦ４（ｒｏｌ−６）での選択；Ｆ１個別に１５℃ ２．ｐＢＸ（ｐｈａ−１）での選択；Ｆ２／３一緒に２５℃ 試験ＤＮＡ：ｐＨ１−ＦＭ６．９（ｓｕｄ−１） ｖａｂ−９ ｓｕｄ−１と交
雑後 核酸の添加：− 状態：終結

【表５】

【００３８】

【表６】

【００３９】 ショット実験：８ カエノラブディティス・エレガンス系統：ｐｈａ−１（ｅ２１２３） マーカーＤＮＡ：１．ｐＲＦ４（ｒｏｌ−６）での選択；Ｆ１個別に１５℃ ２．ｐＢＸ（ｐｈａ−１）での選択；Ｆ２／３一緒に２５℃ 試験ＤＮＡ：ｐＨ１−ＦＭ６．９（ｓｕｄ−１） ｖａｂ−９ ｓｕｄ−１と交
雑後 核酸の添加：− 状態：終結

【表７】

【００４０】 ショット実験：９ カエノラブディティス・エレガンス系統：ｐｈａ−１（ｅ２１２３） マーカーＤＮＡ：１．ｐＲＦ４（ｒｏｌ−６）での選択；Ｆ１個別に１５℃ ２．ｐＢＸ（ｐｈａ−１）での選択；Ｆ２／３一緒に２５℃ 試験ＤＮＡ：ｐＦＭ（ｃｈｅ−１３：：ｌａｃＺ） Ｆ２／３における蛍光 核酸の添加：− 状態：終結

【表８】

【００４１】 ショット実験：１０ カエノラブディティス・エレガンス系統：ｐｈａ−１（ｅ２１２３） マーカーＤＮＡ：１．ｐＲＦ４（ｒｏｌ−６）での選択；Ｆ１個別に１５℃ ２．ｐＢＸ（ｐｈａ−１）での選択；Ｆ２／３一緒に２５℃ 試験ＤＮＡ：ｐＦＭ（ｃｈｅ−１３：：ｌａｃＺ） Ｆ２／３における蛍光 核酸の添加：ｔＲＮＡ 状態：終結

【表９】

【００４２】

【表１０】

【００４３】 ショット実験：１１ カエノラブディティス・エレガンス系統：ｐｈａ−１（ｅ２１２３） マーカーＤＮＡ：１．ｐＲＦ４（ｒｏｌ−６）での選択；Ｆ１個別に１５℃ ２．ｐＢＸ（ｐｈａ−１）での選択；Ｆ２／３一緒に２５℃ 試験ＤＮＡ：ｐＦＭ（ｃｈｅ−１３：：ｌａｃＺ） Ｆ２／３における蛍光 核酸の添加：− 状態：中断

【表１１】

【００４４】

【表１２】

【００４５】 ショット実験：１２ カエノラブディティス・エレガンス系統：ｐｈａ−１（ｅ２１２３） マーカーＤＮＡ：１．ｐＲＦ４（ｒｏｌ−６）での選択；Ｆ１個別に１５℃ ２．ｐＢＸ（ｐｈａ−１）での選択；Ｆ２／３一緒に２５℃ 試験ＤＮＡ：ｐＦＭ（ｃｈｅ−１３：：ｌａｃＺ） Ｆ２／３における蛍光 核酸の添加：− 状態：中断

【表１３】

【００４６】

【表１４】

【００４７】 表の基本的説明：

【表１５】

【００４８】 一次（Ｒｏｌ−６）および２次（ｐｈａ−１）選択を同じ２次プレート１〜４
上で行ったが、どちらの選択手順も互いに独立している。

【化１】 評価または実施しなかった選択経路

【００４９】 ショット番号２ ４個の２次プレートの１つにおいて、表現型Ｒｏｌ−６を用いて２匹のＦ１動
物を同定し、単離した；それらはＲｏｌ−６子孫を生産しなかった（Ｆ２−Ｆ４
）；一過性形質転換。 ショット番号３ ４個の２次プレートの２つにおいて、表現型Ｒｏｌ−６を用いて３匹および２
匹のＦ１動物を同定し、単離した；それらは、ケース３／２においてＲｏｌ−６
子孫を生産し、ケース３／４においてＲｏｌ−６子孫を生産しなかった（Ｆ２−
Ｆ４）；安定および一過性形質転換。

【００５０】 ショット番号６ ４個の２次プレートの１つにおいて、表現型Ｒｏｌ−６を用いて２匹のＦ１動
物を同定し、単離した；それらはＲｏｌ−６子孫を生産しなかったが（Ｆ２−Ｆ
４）、ｐｈａ−１の表現型レスキューを示した；一過性形質転換Ｒｏｌ−６であ
るが、安定な形質転換ｐｈａ−１。 ショット番号５ ４個の２次プレートの１つにおいて、選択条件下（＝２５℃）、ｐｈａ−１の
表現型レスキューがＦ２およびＦ３動物において観察された；数世代後に安定； 安定な形質転換 。

【００５１】 ショット番号８ ４個の２次プレートの２つにおいて、表現型Ｒｏｌ−６を用いて４および３匹
のＦ１動物を同定し、単離した；ケース８／２において、それらはＲｏｌ−６子
孫を生産せず、ケース８／３においてＲｏｌ−６子孫を生産した（Ｆ２−Ｆ４）
；さらに、ｐｈａ−１について同時形質転換も行われた；安定および一過性形質 転換 。 ４個の２次プレートの２つにおいて、選択条件下（＝２５℃）、ｐｈａ−１の
表現型レスキューがＦ２およびＦ３動物において観察された；数世代後に安定；
一つのケースにおいて（８／３）、Ｒｏｌ−６について安定な同時形質転換が明
らかであった；ｐｈａ−１およびＲｏｌ−６について安定な同時形質転換。 ケース８／２において、一時的に形質転換されたＲｏｌ−６子孫は、ｐｈａ−
１について同時形質転換に関連する；ケース８／３において、Ｒｏｌ−６につい
て安定な形質転換は、両方の選択経路によって確かめられた。

【００５２】 ショット番号３ 安定に形質転換された系統がさらに、特定のＤＮＡ試験種について同時形質転
換に関して調べられた；ｃｅｈ−１３：：ｇｆｐ（ｐＦＭ）において上蛍光性に
よって、およびｓｕｄ−１（ｐＨ１−ＦＭ６．９）においてｖａｂ−９ ｓｕｄ
−１（ｔ−１２３７）との交雑によって；各ケースにおいて５匹のＲｏｌ−６陽
性動物がこの点で試験された；ＤＮＡ試験について陽性。

【００５３】

【表１６】

【００５４】 表１０は、粒子衝撃によるカエノラブディティス・エレガンスの形質転換の結
果を示す。ｐｈａ−１（ｅ２１２３）雌雄同体を全実験に用いた。（Ａ）プラス
ミドｐＲＦ４（ｒｏｌ−６）およびｐＢＸ（ｐｈａ−１）で動物を形質転換した
。さらに、第３のＤＮＡをその同時発現について試験した。蛍光顕微鏡によって
明らかにされるように、ｃｅｈ−１３：：ＧＦＰ構築物は、トランスジェニック
胚において正確に発現された（上記のWittmanらを参照）。試験交雑によって明 らかにされるように、ｓｕｄ−１（ｔ１２３７）の母性効果突然変異もまた、同
時形質転換プラスミドｐＨ１−ＦＭ６．９（上記）によってトランスジーンにお
いて補足された。現在、約半分のショットは、いずれの形質転換体も示さない。
形質転換事象は、おそらく、単一の形質転換された雌雄同体のため、クラスター
化される（表Ｙ)。（形質転換体）は、全てのＲｏｌ動物の数を示す；（独立形 質転換体）は、射撃された元のプレートの異なる薄片由来のＲｏｌ動物、したが
って、独立して発生した動物を示す。また、（Ｂ）はｒｏｌ−６選択についての
より多くのデータを示す。（Ｂ）この一連の実験において、形質転換体は、ｐｈ
ａ−１システムを用いてＦ２においても選択された。同時形質転換された安定な
系統を約半分のショットにおいて単離した。ｒｏｌ−６で観察されたクラスター
化のため、これらの系統が単一の事象を示すかどうかは明らかではない。したが
って、系統は、同遺伝子型の系統を確立するためのクローンであるべきである。

【００５５】

【表１７】

【００５６】 表１１は、系列＃６のショットの分析を示す。全実験は、本明細書に示すよう
に評価された。ショットに対応する虫は、実施例２の（Ｃ）に記載のように、ト
ランスジェニック動物の選択のために４個のプレートに分配される。（Ｒ）は、
ねじれている形質転換体である。（Ｐ）は、ｐｈａ−１形質転換体である。普通
のフォントは、ｒｏｌマーカーの一過性発現を示す。Ｒｏｌ選択において見られ
る動物数を示す。１つの薄片由来の動物を一緒に培養して、ｒｏｌマーカーの安
定な発現を試験した。次いで、これらの系統をｐｈａ−１との同時形質転換につ
いて試験した。太字のフォントは、マーカーの安定な発現を示す。

【００５７】 実施例３−バリスティック形質転換のための別法の技術 実施例２の（Ａ）にしたがって、虫をバリスティック形質転換のために調製す
る。核酸の高濃度溶液を１滴（１ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上）、虫のピローの上
に置き、乾燥させる。次いで、実施例２の（Ｂ）に記載のプロトコールにしたが
って、いずれの核酸で被覆されていない微小発射体で虫に衝撃を与え、形質転換
体を選択する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 金粒子で衝撃を与えられたカエノラブディティス・エレガンスの
ノルマルスキ（Normarski）顕微鏡写真を示す。上方の矢印は生殖巣に位置した 金粒子を示し、下方矢印は、若い雌雄同体の腸に位置した金粒子を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 複数の微小発射体で線虫に衝撃を与えることを特徴とする線
   虫に核酸を導入する方法。
2. 【請求項２】 微小発射体が核酸で被覆されている請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 複数の微小発射体で衝撃を与える前に線虫を核酸で被覆する
   請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 線虫が条件致死突然変異遺伝子を有し、核酸が条件致死突然
   変異遺伝子の野生型等価物を含有するプラスミドを含む請求項１〜３のいずれか
   １項記載の方法。
5. 【請求項５】 核酸が優性表現型マーカーをコードする請求項１〜４のいず
   れか１項記載の方法。
6. 【請求項６】 優性表現型マーカーがＲｏｌ−６または自律性蛍光タンパク
   質である請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 さらに、複数の微小発射体で線虫に衝撃を与える前に、線虫
   を薄い乾燥した細菌性ローンの上に置くことを含む請求項１〜６のいずれか１項
   記載の方法。
8. 【請求項８】 さらに、複数の微小発射体で線虫に衝撃を与える前に、線虫
   を乾燥したポリマープレート上に置くことを含む請求項１〜６のいずれか１項記
   載の方法。
9. 【請求項９】 ポリマーが寒天である請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 複数の微小発射体で線虫に衝撃を与える前に、線虫を固定
    する前記請求項のいずれか１項記載の方法。
11. 【請求項１１】 微小発射体が金粒子または活性化ガラス粒子である前記請
    求項のいずれか１項記載の方法。
12. 【請求項１２】 線虫がカエノラブディティス・エレガンスである前記請求
    項のいずれか１項記載の方法。
13. 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法にしたがって導
    入された核酸を含有する線虫。