JP2003527864A - トランスポゾンを用いるトランスジェニック生物の作成方法 - Google Patents
トランスポゾンを用いるトランスジェニック生物の作成方法Info
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- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
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Abstract
Description
。特に、本発明は、転位性因子 (transposable element)又はトランスポゾンを1
つ以上含む生物に関する。トランスポゾンは好ましくはMinosトランスポゾンで
ある。
プする」又は転位することができる遺伝子エレメントである。それは昆虫を含む
動物中に幅広く存在している。
生物の遺伝子機能及びゲノム構成を研究するための鍵となる。3つの「古典的な
」モデル動物であるハエ、虫及びマウスでは、挿入の方法論に基づく効果的なト
ランスポゾンが、キイロショウジョウバエ(D. melanogaster)及び線虫(C. el
egans)において開発されている。キイロショウジョウバエ(Drosophila)にお
ける遺伝子導入及び挿入突然変異によるP因子の導入(Spradling及びRubin (198
2) Science 218, 341-347)は、キイロショウジョウバエの遺伝学を変化させ、
そして、他の真核生物において同等の方法論を開発するための模範となった。し
かしながら、P因子は宿主範囲が非常に限られており、それゆえに過去十年間に
、他の因子が、線虫、植物、魚類及び鳥類を含む種々の複雑な真核生物での遺伝
子運搬及び/又は突然変異のためのベクターとして使われてきた。
s, (1991) NAR 19:6646)。それについては米国特許第5,840,865号に記載されて
おり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。昆虫を形質転換するため
にMinosを使用することは上記の米国特許文献中に記載されている。
あったが、以後、幾つかの無脊椎動物種および脊椎動物種において発見されてい
る。生物を形質転換するためにmarinerを使用することは、国際特許出願番号WO9
9/09817に記載されている。
ることは米国特許第5,614,398号に記載されており、その全体は参照により本明
細書に組み込まれる。
ポゾンである。チチュウカイミバエの生殖細胞系の形質転換のためのその使用は
、Handlerら、(1998)PNAS (USA) 95:7520-5に記載されている。
を使用することを記載する。1つ以上のMinosの挿入を含む遺伝子導入マウスの
作成について記載する。
ト細胞系の形質転換のための使用について記載する。
ンサートラップ及び遺伝子標識のために使用することが記載されている:Wilson
ら、(1989) Genes dev. 3: 1301; Spradlingら、(1999) Genetics 153:135を参
照のこと。
めには同種由来のトランスポザーゼの使用が必要であると認識されている。記載
されているところによれば、トランスジェニック動物は、例えばトランスポザー
ゼ遺伝子との共形質転換により、cisの位置又はtransの位置に導入されたトラン
スポザーゼを有する。
スジェニック動物を作成するための、改良されたプロトコルを開発した。当該改
良されたプロトコルにおいては、必要な細胞又は組織中にトランスポゾンとトラ
ンスポザーゼの両方を含有する生物を作成する目的で、トランスジェニック生物
を交配させることによりトランスポザーゼの機能を提供する。本発明によれば、
組織特異的で制御可能な転位現象を、生物の遺伝子を操作するために使用するこ
とが可能になる。
している第1トランスジェニック生物を提供するステップ、 b) 組織または細胞の少なくとも一部のゲノム中に、Minosトランスポザーゼまた
はMinosトランスポザーゼをコードする1コピー以上の遺伝子を含有している第
2生物を提供するステップ;及び、 c) 組織又は細胞の少なくとも一部においてトランスポゾン及びトランスポザー
ゼの両方を含有するトランスジェニック子孫を得るために該生物を交配させるス
テップ、 を含む、トランスジェニック生物を作成するための方法が提供される。
、一方の生物は、好ましくは遺伝子導入の結果として、トランスポゾンを1コピ
ー以上含有しており、他方の生物は、好ましくは遺伝子導入の結果として、同種
由来のトランスポザーゼを1コピー以上含有している。
動物である。
部位からのトランスポゾンの切除、及び/又は第2の組込み部位でのトランスポ
ゾンの組込みを含むトランスポゾンの転位を活性化するのに有効な任意のトラン
スポザーゼを指す。好ましくは、同種由来のトランスポザーゼは、自然界でin v
ivo環境においてトランスポゾンと天然に会合するトランスポザーゼである。し
かしながら、本発明はまた、本発明の範囲内で有利に改良された活性を有し得る
、改変されたトランスポザーゼをも包含する。
ようなタイプ-2のトランスポゾンである。最も有利にはMinosである。他の利用
できるトランスポゾンには、mariner、Hermes及びpiggyBacが含まれる。
込まれた改変されたトランスポゾンの使用に関する。かかるコード配列は選択マ
ーカー遺伝子及び/又は非選択マーカー遺伝子を含み得る。該マーカー遺伝子は
、ゲノム中でのトランスポゾンの同定を可能にし、トランスポゾンが組み込まれ
ている遺伝子座のクローニングを可能にする。好適なマーカーには、GFP及びそ
の誘導体、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、又はクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ(CAT)のような蛍光性ポリペプチド及び/又は発光
性ポリペプチドが含まれる。
ック生物中において発現され得る。これは、トランスポゾンの活性化が、任意の
所望の基準により支配できることを意味する。例えば、トランスポザーゼは組織
特異的配列の制御下に置かれることができ、そうすればトランスポザーゼはトラ
ンスジェニック生物中の所望の部位でのみ発現される。かかる配列には、例えば
、組織特異的プロモーター、エンハンサー及び/又は遺伝子座制御配列が含まれ
得る。
ly-regulated expression)を付与する1以上の配列の制御下に置かれてもよい。
この場合は、トランスポゾンが、トランスジェニック生物又はその子孫の成長に
おいて所定の段階で活性化されるという結果になるであろう。
遺伝子が改変する現象が高い頻度で観察できる。そのうえ、トランスポゾンの挿
入の位置を確認することによって、改変が起こった遺伝子座を正確に特定するこ
とができる。隣接領域の配列決定を行うことで、潜在的には遺伝子座の配列決定
をする必要無しに、データベース中で遺伝子座を特定することが可能になる。そ
のうえ、トランスポゾンを使用することで、可逆的突然変異(reversible mutage
nesis)の方法が可能になり、その結果、制御された様式で改変を復帰させること
ができる。
高転写遺伝子中に挿入して、その結果として、オープンなクロマチン中に当該ト
ランスポゾンを局在化させる。これによって、転位の頻度が高まっていることが
あるトランスポゾンに接近し易くなる。
伝子を含んでいてもよい。これによって、トランスポゾンが組み込まれているク
ロマチン構造の活性化が引き起こされ、トランスポザーゼがそこに接近し易くな
るであろう。
ランスポゾンを、ES細胞のような細胞において、組換えにより遺伝子中に挿入し
てもよい。
テップ; (b) 該トランスジェニック生物の表現型を特徴分析するステップ; (c) 該生物のゲノムにおいて1以上のトランスポゾンの挿入が起こった位置を検
出するステップ;及び、 (d) 挿入が起こった位置と観察された表現型とを相関させるステップ、なお、挿
入が起こった位置は、観察された表現型と関係のある1以上の遺伝子座の位置を
指し示している、 を含む、トランスジェニック生物中での遺伝子突然変異の検出及び特徴分析のた
めの方法が提供される。
の結果としてトランスジェニック生物中で遺伝子突然変異が起こると、該生物に
おける新規の表現型の変化が生じる。新規の表現型は該生物のゲノムにおける挿
入の現象まで溯って追跡することができる。トランスポゾンの切除は、特徴的に
は、宿主ゲノムへの少数のヌクレオチドの挿入を引き起こす。これは、トランス
ポゾン及びトランスポゾンの挿入並びにその後の切除に伴う組換え現象によって
残されるものである。小さな挿入は、例えばあるポリペプチドの配列中に数個の
アミノ酸が挿入された結果生じる、表現型への小さな影響を有することがある。
あるいは、その影響がより重大であって、ある遺伝子を完全に不活性化すること
もあり得る。
上の影響をもつ可能性がより高い。
遺伝子の不活性化が起こり、それが切出されれば多くの場合は遺伝子の活性が回
復する。このように、本発明は、ある遺伝子を不活性化させた後に回復させるこ
とができる、可逆的突然変異の手法を提供する。
トランスポゾンの存在を探索することにより検知しうる。切除は、切除の後に残
される「シグネチャー」配列(”signature” sequence)により同定することも
できる。
するために使用してもよい。例えば、トランスポゾンを改変してエンハンサー又
は他の転写活性化因子を含ませてもよい。かかるトランスポゾンをある遺伝子の
近傍に移動し挿入すると、その遺伝子又は遺伝子座の発現がアップレギュレート
される。この実施形態は、癌遺伝子の単離において特に有利である。ここで癌遺
伝子は、トランスポゾンを局在化させることによってクローン性腫瘍中で同定す
ることができる。
テップ; (b) 該トランスジェニック生物の表現型を特徴分析するステップ; (c) 該生物のゲノムにおいて1以上のトランスポゾンの挿入が起こった位置を検
出するステップ;及び、 (d) 挿入を含む遺伝子座をクローニングするステップ、 を含む、トランスジェニック動物中において表現型上の特徴と関連する遺伝子を
単離するための方法が提供される。
ランスポゾンのジャンプによる遺伝子の破壊又は活性化は、トランスポゾンによ
る標識化のお陰で容易に追跡できるからである。
プロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含むトランスジェニック生物を、本
発明の第1の態様による手順により作成するステップ; (b) レポーター遺伝子が発現される生物の組織を同定するステップ; (c) 発現されるレポーター遺伝子を含む遺伝子座をクローニングするステップ;
を含む、トランスジェニック動物のエンハンサーを単離するための方法が提供さ
れる。
レポーター遺伝子を含むトランスジェニック生物を、本発明の第1の態様による
手順により作成するステップ; (b) レポーター遺伝子が発現される生物の組織を同定するステップ; (c) 発現されるレポーター遺伝子を含む遺伝子座をクローニングするステップ;
を含む、トランスジェニック動物の内因性遺伝子のエキソンを単離するための方
法が提供される。
ーカー遺伝子を含むトランスポゾンを挿入することによって、in vivoでのエン
ハンサートラップ及びエキソントラップの機能を提供するために使用し得る。か
かる用途に好適な構築物は欧州特許第0955364号に記載されており、当該技術分
野において知られている。トランスポゾンの活性化は、組織特異的な様式又は成
長に伴って制御される様式で影響を受けることがあるので、本発明は、トランス
ジェニック生物中で同様の制御を受けるエンハンサー又はエキソンをトラップす
ることを可能にする。
るステップ; (b) 該ライブラリーから、1以上のトランスポゾンの挿入が起こった結果として
対象とする遺伝子の発現が調節されている1以上のトランスジェニック生物を選
択するステップ; を含む、生物において遺伝子の発現を調節するための方法が提供される。
動物を含む。すなわち、異種トランスポゾンを1コピー以上含有し、同種由来の
トランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列を含有しないトランスジェニック生
物、及び、トランスポザーゼ酵素をコードし、同種由来トランスポゾンを含有し
ないトランスジェニック生物を包含する。
ものであるが、Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)
及びAusubelら, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第4版, John W
iley & Sons, Inc. を特に参照することもできる。
細胞真核生物である。
は昆虫ではない。好ましくは、該生物はキイロショウジョウバエ(D. melanogast
er)ではない。
軟体動物門、鋏角亜門、単肢動物門、甲殻類及び脊索動物に属する動物が含まれ
る。単肢動物門には、有翼昆虫などの昆虫を含む昆虫類が含まれる。脊索動物に
は、哺乳動物、鳥類、爬虫類及び両生類のような脊椎動物の群が含まれる。哺乳
動物の例としては特に、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、並びにウシ、ヤギ、ブタ、
ヒツジ及びウマのような有蹄動物、並びにマウス、ラット、アレチネズミ及びハ
ムスターのような齧歯動物が挙げられる。
双子葉植物及び単子葉植物が含まれる。双子葉植物の例としては、タバコ(ニコ
チアナ・プルムバギニフォリア(Nicotiana plumbaginifolia)及びタバコ(Nic
otiana tabacum))、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、セイヨウアブ
ラナ(Brassica napus)、クロガラシ(Brassica napus)、ケチョウセンアサガ
オ(Datura innoxia)、ウィキア・ナルボネンシス(Vicia narbonensis)、ソ
ラマメ(Vicia faba)、エンドウ(Pisum sativum)、カリフラワー、カーネイ
ション及びレンズマメ(Lens culinaris)が挙げられる。単子葉植物の例として
は、コムギ、オオムギ、オートムギ及びトウモロコシが挙げられる。
ている。このことに関して役に立つ一般的な参考書は、Houdebine, Transgenic
animals - Generation and Use (Harwood Academic, 1997) - であり、これは魚
からマウス及びウシに至るトランスジェニック動物を作成するために使用できる
技法についての広範な概説書である。
導入が可能となっている。例えば全能性又は多分化能性の幹細胞を、マイクロイ
ンジェクション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染
又は他の方法により、形質転換することができ、次いで、形質転換した細胞を胚
へ導入し、次いで、その胚がトランスジェニック生物へと発達する。非常に好ま
しい方法では、成長中の胚を所望のDNAを含むレトロウイルスで感染させ、トラ
ンスジェニック生物を感染させた胚から作成する。しかしながら、最も好ましい
方法では、適切なDNAを胚の前核又は細胞質に、好ましくは単細胞の段階で注入
し、その胚を成熟したトランスジェニック生物へと成長させる。Hoganら, Manip
ulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Press 1989); Krimpenfortら
, Bio/Technology 9:844 (1991); Palmeterら, Cell, 41: 343 (1985); Kraemer
ら, Genetic manipulation of the Mammalian Embryo, (Cold Spring Harbor La
boratory Press 1985); Hammerら, Nature 315: 680 (1985); Wagnerら, 米国特
許第5,175,385号; Krimpenfortら, 米国特許第5,175,384号を含む、異種DNAを哺
乳動物の成熟卵中にマイクロインジェクトするため標準的な実験手順に関する概
説を参照されたい。なお、これらの文献の各内容は参照により本明細書中に組み
入れるものとする。
により前核の段階にある卵に核酸をマイクロインジェクトすることが含まれる。
その後、注入された卵を、偽妊娠レシピエントの卵管中に移植する前に培養する
。
びCibelli, J.B.ら, 1998, Science, 280: 1256に記載される核移植技術により
作成することもできる。この方法を用いれば、ドナー動物からの線維芽細胞は、
制御配列の制御下にある所定のポリペプチドをコードする配列を組み込んだプラ
スミドにより安定にトランスフェクトされる。次に、安定な被導入体を、摘出し
た卵母細胞と融合し、培養して、そしてメスのレシピエントに移植する。
な方法によるPCR又はサザンブロット分析のいずれかで行う。
コードする配列を含むヌクレオチド構築物を、例えば米国特許第4,873,191号に
記載される技術を用いて、該哺乳動物から取り出したばかりの卵巣から得た卵母
細胞中にマイクロインジェクトする。卵母細胞は小胞から吸引し、静置した後、
ヘパリンで受精能を獲得させ、パーコール勾配により事前に分画して運動性の画
分を単離した、解凍した凍結精子と受精させる。
核を可視化し、次いで、卵管組織の条件にした培地中で接合体から桑実胚又は未
分化胚芽細胞の段階にまで培養する。この培地は卵管からかきとった管腔の組織
を用いて調整し、培養培地中に希釈したものである。接合体は、マイクロインジ
ェクション後2時間以内に該培地中に置かれなければならない。
ピエント哺乳動物で発情期を同調させる。発情期は2日以内に発生し、胚を、発
情後5〜7日後にレシピエントに移植する。移植の成功は、サザンブロットにより
、その子において評価できる。
して導入遺伝子により改変されていることを確かめることができる。次に、改変
された細胞を胞胚段階に注入し、その胞胚を偽妊娠宿主に移す。結果として得ら
れる子孫はES細胞と宿主細胞とのキメラであり、ES細胞の子孫のみからなる非キ
メラ系統は従来の交雑育種を用いて得ることができる。この技法は例えば国際特
許公開番号WO91/10741に記載されている。
られている。典型的には、植物体全体、細胞又はプロトプラストの何れもが、DN
A結合分子又は標的DNAをコードする適切な核酸構築物により形質転換され得る(
上記の核酸構築物の例を参照のこと)。形質転換しようとするDNA構築物を細胞
へと導入するための方法は数多く存在するが、全てがDNAを植物細胞に送達する
ために好適なわけではない。好適な方法には、アグロバクテリウム感染(特にTu
rpenら, 1993, J. Virol. Methods, 42: 227-239を参照のこと)、又は、例えば
PEGによる形質転換、エレクトロポーレーション若しくはDNA被覆粒子のアクセレ
ーションによるなどのDNAの直接的送達が含まれる。加速する方法が一般的に好
ましく、該方法には例えば微小粒子を発射する法が含まれる。トランスジェニッ
ク植物(特に単子葉植物)を作成するための典型的なプロトコルを後に記載する
が、これは米国特許第5,874,265号からのものである。
に、微小粒子を発射する方法がある。この方法では、非生物的な粒子を核酸で被
覆し、推進力により細胞へと送達する。例示できる粒子にはタングステン、金、
白金などからなる粒子が含まれる。
安定に再現的に形質転換するための有効な手段であるということに加えて、プロ
トプラストの単離もアグロバクテリウムの受容性も必要とされない点である。加
速によりDNAを植物細胞中に送達するための方法の説明に役立つ実例にBiolistic
s Particle Delivery Systemがある。これを用いて、DNAにより被覆した粒子を
、ステンレス鋼又はNytexのようなスクリーンを通して懸濁液中で培養した植物
細胞で覆われたフィルターの表面上に撃ち込むことができる。スクリーンはタン
グステン-DNA粒子を分散させるので、タングステン-DNA粒子が大きな凝集物の状
態でレシピエント細胞に送達されることはない。微小粒子の装置と撃ち込まれる
細胞との間に介在しているスクリーンが無ければ、微小粒子は凝集して、高頻度
の形質転換を実現するには大きくなりすぎるであろうと考えられる。これは、大
きすぎる微小粒子によってレシピエント細胞に加えられた損傷によるものである
。
込まれる細胞を含んだフィルターを、微小粒子を停止させるためのプレートの下
の適切な距離に設置する。所望であるならば、1枚以上のスクリーンも銃と打ち
込まれる細胞との間に設置する。本明細書に記載する技術を使用することにより
、発射を受けたフィルター上において(「焦点」において)、マーカー遺伝子を
一時的に発現する細胞集団が1000以上得られることがある。発射の48時間後に焦
点において外来遺伝子の産物を発現する細胞の数は、多くの場合1〜10の範囲で
あり、平均2〜3である。
の好ましいステップは、更なる培養及び植物の再生のために形質転換された細胞
を同定するステップである。このステップは、検出可能な形質に関して培養物を
直接にアッセイすること、又は、発射を受けた培養物を選択的な単独のまたは複
数の試剤に曝露することによりアッセイすることを含み得る。
て産生される赤色色素である。この色素は、この段階で成長を支えることのでき
る栄養培地を含む固体支持体上で細胞を培養し、例えば18℃にて180μEm-2s-1よ
りも上において細胞をインキュベートし、そして染色されたコロニー(細胞の目
で確認できる凝集物)から細胞を選択することによって検出し得る。これらの細
胞は、懸濁液中又は固体培地上のいずれかで更に培養してもよい。
た培養物を、代謝阻害剤、抗生物質、除草剤などのような選択試剤に曝露するこ
とが含まれる。形質転換されて、用いられる選択試剤に対する抵抗性を付与する
マーカー遺伝子を安定的に組み込んでいる細胞は、培地中で増殖し分離すること
になる。感受性のある細胞は更なる培養には耐えることができない。
性液体培地に再懸濁し、培養して(例えば1〜2週間)、1〜3 mg/lのビアラホ
スを含有する固体培地を覆うフィルターに移した。1〜3 mg/lの範囲が典型的に
は好ましいが、0.1〜50 mg/lの範囲が本発明の実施において有用であろうと考え
られる。打ち込みに使用するフィルターの種類は特に重要ではないと考えられ、
任意の固体支持体、多孔質支持体、不活性支持体を含み得る。
もよい。組織をホルモンを含有する基本的な培地上で2〜4週間維持した後、ホル
モンを含有しない培地に移す。2〜4週間後に、苗条の発育により別の培地へ移す
時が分かるであろう。
形質転換されたカルスからより成熟した植物までの一連の成長段階の間に適切な
栄養とホルモンシグナルが提供されるように改変されることを必要とする。成長
中の苗木を土壌に移し、例えば約85%の相対湿度、600ppmのCO2及び250μEm-2s- 1 の光度に環境を調節した部屋において成長させる。植物は好ましくは成長のた
めの部屋又は温室において成熟させる。再生の間、組織培養用容器中の固体培地
上で細胞を増殖させる。かかる容器の説明できる一例はペトリ皿である。再生す
る植物は、好ましくは約19℃〜28℃にて成長させる。再生する植物が苗条と根が
発達した段階に達した後に、その植物を更なる成長と試験のために温室に移して
もよい。
び/又はサザンブロットのような当業者にとって公知の技術を使用することによ
って確認してもよい。
原理は、遺伝情報を直接的に導入すること、及び、ベクター系を用いて遺伝情報
を導入することである。一般的な技術の概説はPotrykus (Annu Rev Plant Physi
ol Plant Mol Biol (1991) 42:205-225) 及びChristou (Agro-Food-Industry Hi
-Tech March/April 1994 17-27) による論文に見出し得る。
クターを含んでいることもあり得る。2つのベクターがある場合は、そのベクタ
ー系を、通常はバイナリーベクター系と呼ぶ。バイナリーベクター系は、Gynheu
ng Anら (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology manual A3, 1-19
により詳細に記載されている。
換のために広く用いられる系の1つは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
(Agrobacterium tumefaciens)からのTiプラスミド又はアグロバクテリウム・リ
ゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)からのRiプラスミドの使用に基づいてい
る(Anら (1986), Plant Physiol. 81, 301-305及びButcher D.N.ら (1980), Ti
ssue Culture Methods for Plant Pathologists, 編集: D.S. Ingrams及びJ.P.
Helgeson, 203-208)。
するために適した構築物である。
,865号及び欧州特許出願EP0955364に詳細に記載されており、それらによる開示
は参照により本明細書に組み入れられる。Minosトランスポゾンは、例えば本明
細書において記載するように1以上の選択マーカー遺伝子を挿入するなどして、
一般的な技法によって改変されてもよい。Minosを改変するための特定の技法は
欧州特許第0955364号に記載されている。
えば、生物発光においてエネルギー伝達の受容体として機能する刺胞動物の緑色
蛍光タンパク質(「GFP」)を本発明において使用できる。本明細書で使用する
緑色蛍光タンパク質は緑色光を蛍光発色するタンパク質であり、青色蛍光タンパ
ク質は青色光を蛍光発色するタンパク質である。GFPは、オワンクラゲ(Aequore
a Victoria)、ウミシイタケ(Renilla reniformis)及びコザラクラゲ(Phiali
dium gregarium)から単離される(Wardら, 1982, Photochem. Photobiol., 35:
803-808; Levineら, 1982, Comp. Biochem. Physiol., 72B: 77-85)。花虫類
の種から最近単離された蛍光タンパク質については同章中のMatzら, 1999を参照
されたい(受託番号AF168419、AF168420、AF168421、AF168422、AF168423及びAF
168424)。
orea)関連GFPは、オワンクラゲ(Aequorea Victoria)からの天然に存在するGF
Pのアミノ酸配列を改変することにより加工されている(Prasherら, 1992, Gene
, 111: 229-233; Heimら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91: 12501-1
2504; PCT/US95/14692)。本明細書中で使用する場合、蛍光タンパク質は、当該
蛍光タンパク質の150アミノ酸からなる任意の連続した配列が野生型のオワンク
ラゲ緑色蛍光タンパク質(SwissProt受託番号P42212)からのアミノ酸配列(連
続的であっても非連続的であってもよい)と少なくとも85%の配列相同性を有す
るならばオワンクラゲ関連蛍光タンパク質である。より好ましくは、蛍光タンパ
ク質は、当該蛍光タンパク質の200アミノ酸からなる任意の連続した配列がSwiss
Prot受託番号P42212である野生型のオワンクラゲ緑色蛍光タンパク質からのアミ
ノ酸配列(連続的であっても非連続的であってもよい)と少なくとも95%の配列
相同性を有するならばオワンクラゲ関連蛍光タンパク質である。同様にして、蛍
光タンパク質は、同じ基準を用いてウミシイタケ(Renilla)又はコザラクラゲ
(Phialidium)野生型蛍光タンパク質と関連付けることができる。
GFP(そのヌクレオチド配列及び導かれるアミノ酸配列はGenbank受託番号L29345
、M62654、M62653に提示されている)及び緑色蛍光タンパク質のオワンクラゲに
関連する操作された他の態様が含まれ、それらのうちの幾つかは上記に列記して
ある。これらの例えばP4、P4-3、W7及びW2の幾つかは野生型よりもより短い波長
において蛍光を発する。
より同定し得る。Minosは典型的にはTA塩基対において組み込まれ、切除により
、トランスポゾンの4個の末端ヌクレオチドを挟んだ標的TA配列重複が後に残る
。この配列又は関連する配列の存在は、配列決定、PCR及び/又はハイブリダイ
ゼーションのような技法により検出し得る。
的なPCRプライマーを用いて同定し得る。
のとおりに調節する調節配列に機能的に連結され得る。トランスポザーゼをコー
ドする配列に機能的に連結された制御配列には、プロモーター/エンハンサー及
び他の発現調節シグナルが含まれる。これら制御配列は、トランスポザーゼの発
現が必要とされる宿主生物に適合するように選択してよい。プロモーターという
用語は当該技術分野においてよく知られており、大きさ及び複雑さに関して、最
小プロモーターから上流の因子及びエンハンサーを含むプロモーターに至るまで
の範囲にある核酸領域を包含する。
目、界若しくは他の分類と同種由来の細胞タイプにおいて機能するプロモーター
から選択される。しかしながら異種プロモーターも機能し得る。例えば、原核生
物のプロモーターの幾つかは真核生物細胞において機能する。プロモーターはウ
イルス遺伝子又は真核生物遺伝子のプロモーター配列から導き得る。例えば、発
現が起こる細胞のゲノムから導かれたプロモーターであってよい。真核生物のプ
ロモーターに関していえば、普遍的に機能するプロモーター(α-アクチン、β-
アクチン、チューブリンのプロモーターなど)、あるいは組織特異的に機能する
プロモーター(ピルビン酸キナーゼの遺伝子のプロモーターなど)であってよい
。プロモーターはまた、特定の刺激に反応するプロモーター、例えばステロイド
ホルモン受容体に結合するプロモーターであってもよい。例えばモロニーマウス
白血病ウイルスの長い末端反復配列(MMLV LTR)プロモーター、ラウス肉腫ウイ
ルス(RSV)LTRプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)IEプロモータ
ーなどのウイルスプロモーターもまた使用してよい。
ベルが調節可能であることが有利である。誘導性であるとは、該プロモーターを
使用して得られる発現のレベルが調節可能であることを意味する。哺乳動物の細
胞において広く使用されるこの類の系は、Tet-Off遺伝子発現系とも呼ばれるテ
トラサイクリン/ドキシサイクリン抑制性転写活性化因子tTAと組み合わされたt
etOプロモーター-オペレーター(Gossen, M. 及びBujard, H. (1992) Tight con
trol of gene expression in mammalian cells by tetracycline responsive pr
omoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551)、又は、Tet-On系とも呼
ばれるドキシサイクリン誘導性転写活性化因子rtTAと組み合わされたtetOプロモ
ーター-オペレーター (Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G.,
Hillen, W.及びBujard, H. (1995) Transcriptional activation by tetracycl
ine in mammalian cells. Science 268:1766-1769) である。
クリン(Dox;Tcの誘導体)を培養培地から除いたときに開始される。対照的に
、Tet-On系ではDoxの添加により発現が開始される。染色体中に安定に組み込ま
れた転写活性化因子の遺伝子及びTet-調節性遺伝子を有する細胞系統を確立する
ための手順は記載されている。例えば、http://www.clontech.com/techinfo/man
uals/PDF/PT3001-1.pdfを参照されたい。例えば、Tet-On系は、トランスジェニ
ック生物においてMinosトランスポゾンのテトラサイクリン誘導性発現に使用し
てよい。二重トランスジェニック動物は標準的な相同組換えES細胞技術により作
成する。二つの構築物を使用する:第1には、構成性プロモーターの下にrtTA遺
伝子を含有する構築物である。かかる構築物の一例は、rtTA活性化因子をコード
する遺伝子をサイトメガロウイルス(CMV)極初期プロモーターの制御下に含むp
Tet-Onプラスミド(Clontech)である。この構築物がコードするrtTA転写活性化
因子はドキシサイクリンの存在下でのみ活性である。第2の構築物は、テトラサ
イクリン応答因子(又はTRE)の制御下にMinosトランスポザーゼを含有する。TR
Eは、tetオペレーター(tetO)を含有する42-bpの配列の7回直接反復からなってお
り、最小CMVプロモーターの直近の上流に位置する。ここで最小CMVプロモーター
は、通常はCMV極初期プロモーターと関連しているエンハンサー因子を欠いてい
る。このエンハンサー因子が無いので、rtTAによる結合が無いときにTREからの
トランスポザーゼの「リーク」発現が無い。かかる構築物の一例は、Minosトラ
ンスポザーゼをコードする遺伝子が挿入されたMCSにおけるpTRE2プラスミド(Cl
ontech)である。2つの構築物で安定に形質転換された細胞においては、rtTAは
発現されるが、ドキシサイクリンがその動物に投与されない限りMinosトランス
ポザーゼの転写は活性化されない。
シフェンが培養物に与えられるまでは細胞質中にトランスポザーゼを保持する、
トランスポザーゼと組み合わされた改変エストロゲン受容体ドメイン(Indraら,
Nucl Acid Res. 27, 4324-27, 1999)]、又はRU418誘導性トランスポザーゼ (
グルココルチコイド受容体により、同じ原理で制御する;Tsujitaら, J. Neuros
cience, 19, 10318-23, 1999)が含まれる。
なる調節配列を添加することにより改変してもよい。2つ以上の異なる上記プロ
モーターの配列因子を含むキメラプロモーターを使用してもよい。
調節された組織特異的制御を付与し、導入遺伝子の発現の忠実性(fidelity)を
非常に高める。多くのLCRが当該技術分野において知られている。それらには、
β-グロブリンLCR (Grosveldら, (1987) Cell 51:975-985); α-グロブリン(Ha
ttonら, (1990) Blood 76:221-227); 及びCD2(Festensteinら, (1996) Scienc
e 271:1123-1125);並びに免疫グロブリン、筋肉組織及びその他同種のものが含
まれる。
っても達成され得る。形質転換ES細胞をキメラ胚の構築に利用して、特定の組織
においてのみトランスポザーゼ遺伝子又はトランスポゾン因子を含有するトラン
スジェニック生物を作成することが可能である。これによって調節の更なるレベ
ルが提供できる。
このことを利用してある生物を遺伝的に操作してもよい。本明細書中において用
いる場合、「遺伝的に操作する」という用語は、ある生物のゲノムにおいて遺伝
子を操作することを指し、ある遺伝子または遺伝子の一部分を挿入又は切出すこ
とを含み得る。
るために改変してもよい。コドン使用を最適化することは、所定の遺伝子の発現
レベルを高めるための当該技術分野においてよく知られた方法である。
EMBO report.1, 416-421) をXbaI平滑末端断片としてベクターSVA(-)中にサブク
ローニングすることにより構築した。SVA(-)ベクターは、拡張された複数のクロ
ーニング部位を有するVAベクター (Zhumabekovら (1995). J Immunol Methods 1
85, 133-140) の誘導体である。
kisら (2000) Ins. Mol. Biol. 9, 269-275 (2000b)) をBamHIで切断し再ライゲ
ートして、Minosの両末端の間のテトラサイクリン抵抗性遺伝子を除去し、プラ
スミドpMILRΔBamH1を得た。カスリショウジョウバエ(D. hydei)由来のMinos
逆方向反復配列及び元々のフランキング配列を含有する、pMILRΔBamH1からのAs
p718/SacI断片をプラスミドpPolyIII-I-lox(loxPオリゴ:ATAACTTCGTATAGCATAC
ATTATACGAAGTTATの、ベクターpPolyIII-I(受託番号M18131)のAsp718部位への
挿入により作成される)へとクローニングして、プラスミドppolyMILRΔBamHを
得た。遺伝子導入マウスの作成に使用するための最終的な構築物(pMiCMVGFP、
図1)は、ppolyMILRΔBamH1のSpe I部位へ、プラスミドpBluescriptGFPからの2
.2kb SpeI 断片を挿入することにより作成した。ここで、同断片は、CMVプロモ
ーターにより駆動され、SV40介在配列及びポリアデニル化シグナルを下流に有す
るヒト化GFP遺伝子(ClontechプラスミドpHGFP-S65T)を含有していた。
DNAを含有する1kbのEcoRV/NotI断片をプラスミドpJG-3(pJG-1のpuro変異体;Dr
abekら (1997) Gene Ther. 4, 93-100 (1997))のEcoRV/NotIにクローニングし
た。得られたプラスミド(pJGD/トランスポザーゼ)は、トランスポザーゼcDNA
の上流のCMVプロモーター、スプライス部位を有するヒトβグロブリン遺伝子由
来イントロン及びポリA、並びに、PGKプロモーターにより駆動されかつポリ(A
)を下流に有するウシ成長ホルモン遺伝子由来ピューロマイシン耐性遺伝子を有
しており、胚線維芽細胞のトランスフェクションにおいてトランスポザーゼ源と
して使用した。
.5kb SfiI断片をCBA x C57 B1/10受精卵母細胞へ注入することにより作成した。
1kbのトランスポザーゼcDNA断片をプローブとして用いる尾部生検からのDNAのサ
ザンブトットにより遺伝子導入始祖個体を特定し、F1 CBA x C57 B1/10マウスと
交配して系統を作成した。
B X FVB受精卵母細胞へ注入することにより構築した。GFP DNAをプローブとして
用いる尾部生検からのDNAのサザンブロットにより遺伝子導入始祖個体を特定し
た。
メスとの交雑種に属する)を屠殺し、胚を単離し、該素材の一部を遺伝子型分析
に使用した。残りの胚組織を鋏を用いて刻み、10%FCS及び抗生物質を添加したF
10/DMEM培養培地の薄層に浸した。MCG/+遺伝子型を有する2つの自発性不死化マ
ウス胚線維芽細胞系統(MEF)を、一次MEFのサブクローニングにより得た。それ
らを、Lipofectin (GibcoBRL)を用いて、ScaIにより線状化した20μgのプラスミ
ドpJGD/ILMiにより恒常的にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細
胞を、1μg/mlの濃度のピューロマイシン上で選択した。
7). Analytical Biochem. 162, 156-159) を、15% ホルムアルデヒドを含有す
る1.2%アガロースゲル中での電気泳動に供した。ノーザンブロット分析を既に記
載されたように行った(Sambrookら (1989) Molecular Cloning. A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。
の説明に従って単離した。PCR反応はプライマー11DML: (5’-AAGTGTAAGTGCTTGAAATGC-3’) 及びGOUM67: (5’-GCATCAAATTGAGTTTTGCTG-3’) を用いて行った。
50mMのKCl, 1.5mMのMgCl2, 0.001%のゼラチン; 1.2ユニットのTaq2000(商標)D
NAポリメラーゼ(STRATAGENE), 200 gの鋳型DNA及び10pmolの各プライマー。9
4℃にて30分間、59℃にて30分間及び72℃にて30分間を43サイクル又は60サイク
ル行った。PCR産物をPCRII TAクローニングベクター(Invitrogen)中にクロー
ニングし、T7プライマーを用いて配列決定した。
ブリドーマ培地(GIBCO BRL)、3.4μg/mlの塩化リチウム (MERCK)、7.2μg/mlの
コンカナバリン-A (SIGMA)、22.7 i.u./ml ヘパリン(LEO)、50μMのメルカプ
トエタノール、25.4μg/mlのL.P.S. (SIGMA)、10ng/mlのインターロイキン6(PE
PROTECH EC LTD)を添加したRPMI培地(GIBCOBRL)中で48時間培養した。染色体の
調製及びFISHを既に記載されたように行った(Mulderら (1995) Hum Genet 96,
133-141)。pMiCMVGFP構築物からの737bpのSacI/NotI GFP断片をプローブとして
使用した。プローブをビオチン(Boehringer Manheim)により標識し、FITCを用
いて免疫化学的に検出した。染色体14についてのテロメアプローブ(Shi, Y.ら
(1997) Genomics 45, 42-47) をジゴキシゲニン(Boehringer Manheim)により
標識し、テキサスレッドを用いて免疫化学的に検出した。
転位できるかどうかを判断した:なお、一方はMinosトランスポゾンを含有し、
他方は組織特異的な様式で発現されるMinosトランスポザーゼ遺伝子を含有して
いた。トランスポゾン担持系統(系統MCG)は、サイトメガロウイルスプロモー
ターの制御下にあるGFP遺伝子を含有するMinosトランスポゾンを含有する断片(
MiCMVGFP、図1)のタンデムアレイを含有していた。トランスポゾンを改変し、
その結果、逆方向反復配列の内部のほとんど全ての配列がCMV/GFPカセットによ
り置換された。トランスポザーゼをコードする遺伝子を含んでいないので、この
トランスポゾンは自律的ではなく、トランスポザーゼ源が存在する場合にのみ移
動し得る。トランスポザーゼ発現系統(系統TM2)は、CD2プロモーター及びLCR
因子を含むヒトCD2遺伝子座の制御下にMinosトランスポザーゼcDNAを含有する構
築物(pCD2/ILMi、図1)のタンデムアレイ (tandem array) を含有していた。ト
ランスジェニックマウスでは、ヒトCD2遺伝子座は、末梢T細胞(Zhumabekov, T.
ら (1995) J Immunol Methods 185, 133-140)と同様に、事実上全ての胸腺細胞
において高レベルで転写された。
いてノーザンブロット分析により試験した。MinosトランスポザーゼmRNAは、多
数のT細胞を有する2つの器官である胸腺及び脾臓において検出されたが、腎臓な
どの他の組織においては検出されなかった(図2)。
、トランスポゾンの切除についてのPCRアッセイを使用した。該アッセイは、図
1に示す構築物においてMinosトランスポゾンに近接する移動性ではないカスリ
ショウジョウバエ(Drosophila hydei)の配列にハイブリダイズするプライマー
を使用するものである(Klinakisvら (2000) Ins. Mol. Biol. 9, 269-275)。
ショウジョウバエの細胞中では、トランスポザーゼが媒介するMinosの切除に続
いて、特徴的な6塩基対のフットプリントを通常は残す染色分体の修復が行われ
る(Arcaら (1997) Genetics 145, 267-279)。PCRアッセイに使用するプライマ
ーと特異的な対を有するこれは、診断用の167bpのPCR断片を形成する(Catteruc
cia F.ら (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2157-2162)。図3に示すよ
うに、診断用のバンドは、トランスポザーゼを発現する二重トランスジェニック
マウス(MCG/+ TM2/+)の組織には存在したが、トランスポザーゼを発現しないM
CG/+マウスの組織には存在しなかった。断片の正体は、増幅した配列に特異的な
標識DNAプローブを用いたサザンブロット分析により確認した(データは示して
いない)。切除は主に二重トランスジェニック体の胸腺及び脾臓において検出で
き、より低レベルの切除が肝臓において検出できた(図3)。極低レベルの切除
が、腎臓、脳及び骨格筋において、増幅を更に15サイクル行った後に検出できた
(データは示していない)。トランスジェニックマウスの肝臓及び肺における、
低レベルのヒトCD2遺伝子座の発現は既に記載されている(Lang, G.ら (1988) E
MBO J. 6, 1675-1682)。そこで我々は、胸腺及び脾臓以外の組織において検出
された切除は、少数のT細胞の存在によるものであるか、又は該組織の非T細胞に
おける位置の影響によるトランスポザーゼの発現によるものであると考える。
におけるMinosの切除を検出した。細胞を、CMV制御下にMinosトランスポザーゼc
DNAを担持するプラスミド(pJGD/ILMi、図1)によりトランスフェクトし、PCR
切除アッセイにより分析した。切除による産物は、トランスフェクトした細胞で
は検出できたが、トランスフェクトしていない細胞では検出できなかった(デー
タは示していない)。この結果は、T細胞以外の組織においてトランスポゾン導
入遺伝子がMinosトランスポザーゼに近づくことができることを示唆する。
R産物並びにpJGD/ILMiでトランスフェクトした胚線維芽細胞からのPCR産物をク
ローン化し配列決定した。ショウジョウバエ(Drosophila)においてMinosの切
除の後に残される配列は、Minosの挿入が起こる際に生じるTAジヌクレオチド重
複(duplication)を含み、その重複は該トランスポゾンの末端4ヌクレオチドを
挟んでいる(すなわち、TA標的部位におけるAcgagTの挿入またはActcgTの挿入の
どちらかである)。マウスにおける切除を分析したところ、フットプリントの大
きさと配列はかなり多様であった(図4)。32のフットプリントのうち2つのみが
典型的な6bpの配列を有していた;それ以外は、典型的なフットプリントの完全
な態様又は部分的な態様に加えて、追加的なヌクレオチドを含んでいた。四回の
現象により、隣接するカスリショウジョウバエ(D. hydei)染色体配列のうち1
〜2ヌクレオチドが欠失した。ショウジョウバエ(Drosophila)とマウスの間に
観察されるフットプリント構造の差異は、Minosの切除及び/又は切除後の染色
分体修復における宿主側の要因の関与を反映しているものと考えられる。
の組織において転位が起こり得ることが示された。転位現象の検出は簡単ではな
い。なぜならば各転位現象が独特のものだからであり、かつ、その結果として転
位が発生した組織が、独特の転位を有する細胞の寄せ集めとなるからである。実
際、サザン分析は二重トランスジェニック体の胸腺における転位現象を明らかに
しなかった。このことは、上述の寄せ集めが存在するのであれば、少数のクロー
ン的に関連した細胞 (clonally related cell) からなることを示す。
てFISHを行った。GFP断片をプローブとして使用して、トランスポゾンの新しい
染色体上の位置への再配置を検出した。中期の染色体及び間期の染色体において
染色体14のテロメア配列に特異的なプローブを用いて同時に局在化させることに
より示されるように、トランスポゾンのアレイの最初の位置は染色体14の先端に
あり、テロメアと見分けのつかない位置であった(図5、A-B)。5匹のMCG/+TM2/
+マウスからの3,114個の中期細胞を分析した;1,688個は脾臓からであり、1,426
個は胸腺からであった。これらの中期細胞のうち19個が転位を示した(11個が脾
臓からであり、8個が胸腺からである)。染色体14の先端にあるシグナルに加え
て、これらの中期細胞では14以外の染色体上に又は染色体14の新しい位置に点の
対が存在していた。代表的な中期細胞を図5(C-F)に示す。新しい挿入を担持
する染色体を形態的に分析したところ、1つを除いて全ての現象が互いに独立で
あった、すなわち、異なる転位を示した。染色体14のテロメアに特異的なプロー
ブを用いて陽性中期細胞を分析したところ、転位はテロメアの物質の移動を伴わ
ないことが示された(データは示していない)。対照として、5匹のMCG/+マウス
の胸腺及び脾臓からの2,440個の中期細胞を調査した;これらの試料では転位は
検出されなかった。
ランスポゾンを移動させて新しい染色体上の位置へとジャンプさせることができ
るということの最初の実証である。
。記載する本発明に係る方法及び系についての種々の改変及び態様は、本発明の
範囲及び精神を逸脱すること無しに当業者にとって明白であろう。本発明を特定
の好ましい実施形態と関連付けて記載しているが、特許請求に係る発明はそれら
特定の実施形態に不当に限定されるべきでないと理解されたい。実際、本発明の
実施のために記載された態様の、分子生物学又は関連する分野における当業者に
とって明白な種々の改変は、特許請求の範囲内であることを意図するものである
。
印で示す。これらの矢印の外側にある白色のブロックは、カスリショウジョウバ
エゲノム中の元のMinos因子のフランキング配列を示す。矢印の先端はMinosの切
除を検出するのに用いるプライマーの位置を示す。小さな矢印はGFP遺伝子及び
トランスポザーゼ遺伝子の転写方向を示す。黒色のバーはプローブとして用いら
れるフラグメントを示す。
異的発現を示す。TM2/+マウスから単離した胸腺、脾臓及び腎臓のRNAのノーザン
ブロット分析(露出40時間)。対照RNAは非トランスジェニックマウスの胸腺か
らのものである。下部のパネルは、同じフィルターをマウスアクチンプローブと
再ハイブリダイズして得られたシグナルを示す(露出3時間)。
及び組織特異的切除を示す。トランスポゾンに近接するオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いてPCRを行い、その産物をアガロースゲル電気泳動により分析した
。左パネル:胸腺におけるトランスポザーゼ依存的切除を示す。使用鋳型DNA:
レーン1、非トランスジェニック;レーン2、TM2/+;レーン3-7、MCG/+;レーン8
-12、MCG/+ TM2/+。右パネル:トランスポザーゼ発現マウスの種々の組織におけ
る切除を示す。使用鋳型DNA:レーン1、3、5、7、9、11、MCG/+マウスから。レ
ーン2、4、6、8、10、12、MCG/+ TM2/+マウスから。レーン1-2、胸腺。レーン3-
4、脾臓。レーン5-6、肝臓。レーン7-8、腎臓。レーン9-10、脳。レーン11-12、
筋肉。レーン13、DNAを加えず。
示す。DNAは二重トランスジェニックマウスの胸腺及び脾臓から抽出し(上図)
、又は、トランスポザーゼ発現プラスミドによりトランスフェクションした後の
MCG/+マウスからの胚線維芽細胞系統から抽出し(下図)、近接するプライマー
を用いたPCRのための鋳型として使用した。PCR増幅したバンドをクローニングし
、32クローンを配列決定した(胸腺及び脾臓から19、線維芽細胞から13)。TAは
標的部位の重複 (duplication) である。赤色のヌクレオチドはトランスポゾン
の末端反復配列の端に相当し、青色のヌクレオチドは未知の起点(origin)であ
る。隣接するヌクレオチド及びTA反復を整列させた。
をDAPIで染色した。パネルA及びBは、同じMCG/+中期細胞核からのものであって
、それぞれGFP及びテロメア14特異的プローブで標識してある。パネルC及びDは
、それぞれ、同じMCG/+, TM2/+マウスの胸腺及び脾臓からのものである。パネル
E及びFは、2つの異なるMCG/+, TM2/+マウスの脾臓からのものである。黄色の矢
印の先端は、染色体14のテロメアの近傍にあるトランスポゾン導入遺伝子の最初
の組込み部位を指し示す。緑色の矢印の先端は染色体14のテロメアを指し示す。
赤色の矢印の先端は転位現象を指し示す。
Claims (29)
- 【請求項1】 以下のステップ、 a) 組織または細胞の少なくとも一部にMinosトランスポゾンを1コピー以上含有
している第1トランスジェニック生物を提供するステップ、 b) 組織または細胞の少なくとも一部のゲノム中に、Minosトランスポザーゼまた
はMinosトランスポザーゼをコードする1コピー以上の遺伝子を含有している第
2生物を提供するステップ;及び、 c) 組織又は細胞の少なくとも一部においてMinosトランスポゾン及びMinosトラ
ンスポザーゼの両方を含有するトランスジェニック子孫を得るために該生物を交
配させるステップ、 を含む、トランスジェニック生物を作成するための方法。 - 【請求項2】 生物が哺乳動物である、請求項1に記載の方法。
- 【請求項3】 以下のステップ、 a) 組織または細胞の少なくとも一部にトランスポゾンを1コピー以上含有して
いる第1トランスジェニック生物を提供するステップ、 b) 組織または細胞の少なくとも一部のゲノム中に、トランスポザーゼまたはト
ランスポザーゼをコードする1コピー以上の遺伝子を含有している第2生物を提
供するステップ;及び、 c) 組織又は細胞の少なくとも一部においてトランスポゾン及びトランスポザー
ゼの両方を含有するトランスジェニック子孫を得るために該生物を交配させるス
テップ、 を含む、トランスジェニック生物を作成するための方法。 - 【請求項4】 トランスポゾンが、該トランスポゾンに相同な逆方向末端反
復配列に挟まれた異種核酸配列を含むよう改変された、請求項1〜3の何れか1
項に記載の方法。 - 【請求項5】 組込まれると該トランスポゾンがオープンクロマチン構造中
に存在するようにトランスポゾンがその内部に高転写遺伝子を挿入している、請
求項1〜4の何れか1項に記載の方法。 - 【請求項6】 トランスポゾンが高発現される遺伝子中に挿入されている、
請求項1〜5の何れか1項に記載の方法。 - 【請求項7】 トランスポゾンが組換えによりES細胞中に挿入されている、
請求項6に記載の方法。 - 【請求項8】 トランスポゾンがMinos、mariner、Hermes及びpiggyBacから
なる群から選択される、請求項3に記載の方法。 - 【請求項9】 トランスポゾンがMinosである、請求項8に記載の方法。
- 【請求項10】 トランスポゾンが選択マーカーをコードする核酸配列を含
んでいる、請求項4〜9の何れか1項に記載の方法。 - 【請求項11】 選択マーカーが蛍光性ポリペプチド又は発光性ポリペプチ
ドである、請求項10に記載の方法。 - 【請求項12】 トランスポザーゼが最適コドン使用頻度に改変されている
、請求項1〜11の何れか1項に記載の方法。 - 【請求項13】 トランスポザーゼが、該トランスポザーゼの発現の調節を
可能にする制御配列の制御下で発現される、請求項1〜12の何れか1項に記載
の方法。 - 【請求項14】 制御配列が、テトラサイクリン、エストロゲン及びエクジ
ソン誘導が可能な系からなる誘導性発現系から選択される、請求項13に記載の
方法。 - 【請求項15】 プロモーターが、組織特異的シグナル、発達シグナル又は
外来シグナルに応答して制御される、請求項13に記載の方法。 - 【請求項16】 制御配列が遺伝子座制御領域を含む、請求項13〜15の
何れか1項に記載の方法。 - 【請求項17】 トランスポザーゼの発現の調節がトランスポゾンの切除を
誘導する、請求項13〜16の何れか1項に記載の方法。 - 【請求項18】 トランスポゾンの切除を利用して生物を遺伝子操作する、
請求項17に記載の方法。 - 【請求項19】 生物の遺伝子操作が遺伝子破壊の復帰を含む、請求項17
又は18に記載の方法。 - 【請求項20】 以下のステップ、 (a) 請求項1〜19の何れか1項に記載の手順によりトランスジェニック生物を
作成するステップ; (b) 該トランスジェニック生物の表現型を特徴分析するステップ; (c) 該生物のゲノムにおいて1以上のトランスポゾンの挿入が起こった位置を検
出するステップ;及び、 (d) 挿入が起こった位置と観察された表現型とを相関させるステップ、ここで、
挿入が起こった位置は、観察された表現型と関係のある1以上の遺伝子座の位置
を指し示している、 を含む、トランスジェニック生物中での遺伝子突然変異の検出及び特徴分析のた
めの方法。 - 【請求項21】 以下のステップ、 (a) 請求項1〜19の何れか1項に記載の手順によりトランスジェニック生物を
作成するステップ; (b) 該トランスジェニック生物の表現型を特徴分析するステップ; (c) 該生物のゲノムにおいて1以上のトランスポゾンの挿入が起こった位置を検
出するステップ;及び、 (d) 挿入を含む遺伝子座をクローニングするステップ、 を含む、トランスジェニック動物中において表現型上の特徴と関連する遺伝子を
単離するための方法。 - 【請求項22】 以下のステップ、 (a)トランスポゾンが基準レベルで発現されるように最小プロモーターの制御下
にレポーター遺伝子を含むトランスジェニック生物を、請求項1〜19の何れか
1項に記載の手順により作成するステップ; (b) トランスジェニック生物の1以上の組織においてレポーター遺伝子の発現レ
ベルを評価するステップ; (c)基準の発現レベルと比較してレポーター遺伝子の調節が増加または減少する
遺伝子座を同定し、クローニングするステップ;及び、 (d) クローニングした遺伝子座を特徴分析するステップ、 を含む、トランスジェニック動物においてエンハンサーを単離するための方法。 - 【請求項23】 以下のステップ、 (a) トランスポゾンが、翻訳開始配列を欠いているがスプライス受容配列を含む
レポーター遺伝子を含む、請求項1〜19の何れか1項に記載の手順によりトラ
ンスジェニック生物を作成するステップ; (b) レポーター遺伝子が発現される生物の組織を同定するステップ; (c) 発現されるレポーター遺伝子を含む遺伝子座をクローニングするステップ;
を含む、トランスジェニック動物内のエンハンサーを単離するための方法。 - 【請求項24】 以下のステップ、 (a) トランスポゾンが基準レベルで発現されるように最小プロモーターの制御下
にレポーター遺伝子を含むトランスジェニック生物を、請求項1〜19の何れか
1項に記載の手順により作成するステップ; (b) トランスジェニック生物の1以上の組織においてレポーター遺伝子の発現レ
ベルを評価するステップ; (c)基準の発現レベルと比較してレポーター遺伝子の調節が増加または減少する
遺伝子座を同定およびクローニングするステップ;及び、 (d) クローニングした遺伝子座を特徴分析するステップ、 を含む、トランスジェニック動物においてエキソンを単離するための方法。 - 【請求項25】 以下のステップ、 (a) トランスポゾンが、翻訳開始配列を欠いているがスプライス受容配列は含む
レポーター遺伝子を含むトランスジェニック生物を請求項1〜19の何れか1項
に記載の手順により作成するステップ; (b) レポーター遺伝子が発現される該生物の組織を同定するステップ; (c) 発現されるレポーター遺伝子を含む遺伝子座をクローニングするステップ;
を含む、トランスジェニック動物においてエキソンを単離するための方法。 - 【請求項26】 以下のステップ、 (a) 請求項1〜19の何れか1項に記載の手順によるトランスジェニック生物の
ライブラリーを作成するステップ; (b) 該ライブラリーから、1以上のトランスポゾンの挿入が起こった結果として
、対象とする遺伝子の発現が調節されている1以上のトランスジェニック生物を
選択するステップ; を包含する、生物において遺伝子の発現を調節するための方法。 - 【請求項27】 異種トランスポゾンを1コピー以上含有し、同種由来のト
ランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列を含有する、トランスジェニック生物
。 - 【請求項28】 同種由来のトランスポゾンを含有せず、トランスポザーゼ
酵素をコードするトランスジェニック生物。 - 【請求項29】 哺乳動物又は植物である、請求項27又は28に記載の生
物。
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