CN104472438B - 一种线虫物理损伤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种线虫物理损伤的方法，包括以下步骤：将玻璃碎片均匀分布于NGM平板表面，取一块带有线虫的NGM琼脂块，倒置于上述NGM平板上，按压后放置25‑35分钟，然后将琼脂块转移至新NGM平板上。应用本发明的方法对线虫样本进行物理损伤，造成的伤口浅，存活率高。同时对线虫造成的伤口较多，损伤效果均一，重复性好，便于收集样本。本方法中使用的材料简单，不需使用大型仪器设备，节约时间和使用成本，简便易行，便于进行批量损伤，大批量损伤的线虫适于应用于伤口愈合的新药筛选，具有广阔应用前景。

Description

一种线虫物理损伤的方法

技术领域

本发明涉及线虫领域，特别涉及一种对线虫进行物理损伤的方法。

背景技术

线虫为线虫动物门(Aschelminthes)线虫纲(Nematoda)所有蠕虫的通称，系动物界中数量最丰者之一，寄生于动、植物，或自由生活于土壤、淡水和海水环境中。这里所说的线虫特指秀丽隐杆线虫(C.elegans)，是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫，以细菌为食。因其遗传背景清楚、个体结构简单、生活史短、基因组测序完成等，秀丽隐杆线虫作为模式生物在遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、人类遗传性疾病、病原体与生物机体的相互作用、药物筛选、动物的应急反应、环境生物学和信号传导等领域得到广泛应用。

在大多数动物中，表皮是与外界环境接触、抵御外界病原体和损伤的第一道屏障。目前的研究表明，对秀丽隐杆线虫表皮进行物理损伤可以引起线虫固有免疫应答以及伤口愈合反应，因此研究秀丽隐杆线虫的物理损伤有重大意义。目前对线虫进行物理损伤的研究通常采用激光照射或显微针刺的方法，由于秀丽隐杆线虫成虫体长约1mm，肉眼难以辨别，对其进行激光照射或显微针刺难度较大，若需要批量损伤，操作费时费力，损伤程度无法均一，样本收集不方便，结果重复性较差，容易导致样本死亡，且伤口数量少(见图4)，无法满足研究的需要。之前的研究证实，批量处理的线虫可用于新药筛选，将其分布于小分子化合物库中，利用染料染色等方法可筛选得到目的化合物，因此我们需要一种可以简便的对大批量线虫进行物理损伤的方法，以用于进行促进伤口愈合的新药筛选。

发明内容

针对上述现有技术中的缺陷，本发明要解决的技术问题是提供一种简便易行的线虫物理损伤新方法，利用玻璃碎片对线虫进行物理损伤，伤口多，存活率高，重复性好，可以满足批量损伤的需要。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明提供一种利用玻璃碎片对线虫进行物理损伤的方法，具体步骤为：于NGM平板表面铺一层玻璃碎片，将带有线虫的NGM琼脂块带有所述线虫一面置于所述NGM平板的玻璃碎片上，适当按压所述NGM琼脂块让琼脂块紧贴平板，放置25-35分钟，然后将所述NGM琼脂块转移至一新NGM平板上，得到损伤效果均一的线虫样本。

其中，所述玻璃碎片由毛细玻璃管研磨得到。优选的，所述毛细玻璃管壁厚0.25mm。玻璃碎片依靠重力作用在水或乙醇中进行分离，优选75％乙醇溶液，达到去除过大或过小的碎片。由imageJ进行测量并分析每个玻璃碎片的最长轴线，由此得到的所述玻璃碎片的最长轴线为10-100um。将玻璃碎片用75％乙醇洗涤并储存在M9缓冲液中，保持玻璃碎片的清洁和完整。

作为优选的，所述线虫为秀丽隐杆线虫。

本发明中对线虫样本进行物理损伤，造成的伤口较浅，不会对线虫造成明显的死亡，存活率高。同时对线虫造成的伤口较多，损伤效果均一，重复性好，易得到损伤效果一致的样本。另外，此方法便于收集样本，所得到损伤效果一致的线虫样本直接收集到琼脂块上，减少了转移环节，既节省程序，又减少了线虫在转移过程中的其它损伤和死亡。本方法中使用的材料简单，毛细玻璃管和NGM培养基均为常见常用实验材料；本方法不需使用大型仪器设备，一般实验室不具备激光共聚焦和显微注射系统；本方法节约时间和使用成本，简便易行，适于进行批量损伤。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明：

图1是本发明物理损伤的方法示意图；

图2是研磨得到的玻璃碎片照片；

图3是使用imageJ进行测量的玻璃碎片的最长轴线；

图4是正常线虫表皮的照片；

图5是显微针刺对线虫进行物理损伤的伤口照片；

图6是本发明方法线虫进行物理损伤的伤口照片；

图7是不同方法对线虫进行物理损伤的存活率；

图8是不同方法对线虫进行物理损伤的伤口数量；

图9是使用本发明方法进行物理损伤的线虫结果均一性统计数据；

其中：1为玻璃碎片；2为琼脂块；3为线虫；4为伤口。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：

取一根0.25mm厚的毛细玻璃管，折断成小段放入研钵中进行研磨，直到玻璃碎片最长轴线为100um以下。将研磨得到的玻璃碎片放入75％乙醇溶液中，依靠不同大小的碎片在溶液中靠重力的沉降时间的差异，除去过大或过小的碎片，得到的玻璃碎片用imageJ进行测量并分析，测得玻璃碎片的最长轴线为10-100um(见图3)。得到的玻璃碎片(见图2)用于对线虫进行物理损伤。将得到的玻璃碎片用75％乙醇洗涤并储存在M9缓冲液中待用。

制作一个秀丽隐杆线虫生长的NGM平板，将上述玻璃碎片均匀平铺于NGM平板表面上，取一块带有数百条秀丽隐杆线虫的NGM琼脂块，倒置于放有玻璃碎片的平板上，使秀丽隐杆线虫与玻璃碎片充分接触，轻压琼脂块并放置25-35分钟，以使玻璃碎片的尖锐边缘对秀丽隐杆线虫造成物理损伤。然后将琼脂块转移至新NGM平板上，完成对秀丽隐杆线虫的物理损伤。压力不得过大，以免造成秀丽隐杆线虫损伤过大，同时也要保持琼脂块的完整，便于后期的转移。此过程示意图见图1。

对比例：

运用显微注射针刺线虫的方法：将线虫用Halocarbon oil(聚三氟氯乙烯)固定在agrose(琼脂糖)盖玻片上，在倒置显微镜下，使用显微注射仪，对线虫进行针刺损伤，一次造成一个伤口，一般一次处理1-5条线虫。

本发明中对线虫样本进行物理损伤，造成的伤口较浅，存活率高。用玻璃碎片对线虫进行物理损伤，线虫存活率为98％，针刺损伤存活率为53％(见图7)。同时本发明的方法对线虫造成的伤口较多，对线虫进行玻璃损伤的伤口数量与针刺方法的伤口数量比为6：1(见图8)。使用本发明的方法对线虫损伤效果均一，重复性好，易得到损伤效果一致的样本。使用本方法物理损伤的线虫进行QPCR实验，结果重复性好，抗菌肽上调倍数在5.8至7.2之间(见图9)。另外，此方法便于收集样本，所得到损伤效果一致的线虫样本直接收集到琼脂块上，减少了转移环节，既节省程序，又减少了线虫在转移过程中的其它损伤和死亡。本方法中使用的材料简单，不需使用大型仪器设备，节约时间和使用成本，简便易行，适于批量损伤。使用本方法大批量对线虫进行物理损伤后收集的样本可进行促进伤口愈合的新药筛选。

上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种线虫物理损伤的方法，其特征在于，包括以下步骤：于NGM平板表面铺一层玻璃碎片，将带有线虫的NGM琼脂块带所述线虫一面置于上述NGM平板的玻璃碎片上，适当按压所述NGM琼脂块让琼脂块紧贴平板，放置25-35分钟，然后将所述NGM琼脂块转移至一新NGM平板上。

2.根据权利要求1所述的线虫物理损伤的方法，其特征在于，所述玻璃碎片的最长轴线为10-100um。

3.根据权利要求1所述的线虫物理损伤的方法，其特征在于，所述玻璃碎片由毛细玻璃管研磨得到。

4.根据权利要求3所述的线虫物理损伤的方法，其特征在于，所述毛细玻璃管厚0.25mm。

5.根据权利要求2所述的线虫物理损伤的方法，其特征在于，所述玻璃碎片依靠重力作用在水或乙醇中进行分离，得到所述最长轴线为10-100um的碎片。

6.根据权利要求2或5所述的线虫物理损伤的方法，其特征在于，铺设于所述NGM平板之前将所述玻璃碎片用75％乙醇洗涤并储存在M9缓冲液中。

7.根据权利要求1所述的线虫物理损伤的方法，其特征在于，所述线虫为秀丽隐杆线虫。