JPH09500004A - 動物トランスジェニック幹細胞の単離、選択、および増殖 - Google Patents
動物トランスジェニック幹細胞の単離、選択、および増殖Info
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Abstract
(57)【要約】
動物幹細胞が、ゲノムに選択マーカーを含む細胞を培養することにより得られそして維持される。この選択マーカーの特異な発現は、非幹細胞と比較して所望の幹細胞の選択的な生存および／または分割を可能にする。この選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子であり得る。
Description
【発明の詳細な説明】
動物トランスジェニック幹細胞の単離、選択、および増殖
本発明は、動物幹細胞を単離するおよび／または富化するおよび／または選択
的に増殖する方法、該方法に用いる遺伝学的に改変された動物細胞および動物、
このような細胞の供給源を提供するトランスジェニック動物、ならびに遺伝学的
に改変された細胞およびトランスジェニック動物の生産のための選択マーカー構
築物に関する。
幹細胞は、自己再生および成熟体組織への分化の両方の能力を有する前駆細胞
である。
胚幹細胞は、原型幹細胞であり、それは成体動物に見られる全般の細胞型を形
成するために分化可能である。このような幹細胞は、多くの細胞型に分化可能な
多能性として記載されている。幹細胞の他の型、例えば、骨髄幹細胞および表皮
幹細胞は、成体動物中に存続している。これらの幹細胞はより限定された分化能
力を有する。
一般に、研究目的または医療使用に必要である場合、幹細胞は種々の分画手順
により組織試料から単離されなければならないが、注意深い細胞型の分離の後で
さえ、これらの幹細胞調製物は、幹細胞に富んでいるが、混合した細胞型からな
り、幹細胞として分類されない高割合の分化した細胞を含有する。
さらに、大部分の幹細胞は培養液中で容易に培養され得ず、そして幹細胞を培
養する試みがなされる場合、培養される細胞(通常、細胞型の混合集団を含む)は
、異なる速度で成長し、そして幹細胞は容易に非幹細胞型により過剰成長する。
マウスの２つの特異的な株(129およびBlack6)由来の胚幹細胞がインビトロで培
養され得ることは除外する。従って、胚幹細胞の樹立株は、ネズミ129株およびB
lack6株、またはそのハイブリッド由来の初期(3.5日)胚細胞の培養により得られ
得る。
インビトロで胚幹細胞を、他のネズミ株から、およびさらに特別には、他の実
験動物(例えば、ラット、ウサギ、およびモルモット)、家畜動物(例えば、ヒツ
ジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、鳥、魚など)、および霊長類を包含する他の種か
ら、単離および維持を強いる必要性が出てきた。同様に、造血幹細胞のような他
の多能性細胞についての多くの医療適応もまた、それらの単離およびインビトロ
での培養を必要とする。
しかし、従来、十分に低い程度に不均一な細胞集団を生産する問題および非多
能性細胞の培養での過剰成長の問題を包含する幹細胞培養物の生産に関する問題
は、解決されていない。特定の分化細胞型の存在の存続に関する特別な問題は、
それらの分化またはプログラムされた細胞死を誘導することにより培養物から幹
細胞を除去し得ることである。
本発明者らは、現在、前記の問題を解決し得ることにより技術を開発した。
本発明の１つの局面によれば、動物幹細胞を単離するおよ
び／または富化するおよび／または選択的に増殖する方法を提供し、この方法は
、細胞の生存の助けとなる培養条件下で上記細胞の供給源を維持することを包含
し、細胞の供給源は、(a)幹細胞および(b)所望の幹細胞以外の細胞で特異な発現
が可能な選択マーカーを含む細胞を包含することで特徴づけられ、それにより、
上記選択マーカーの特異な発現は、所望の幹細胞の選択的な単離および／または
生存および／または分割を生じる。本発明の文脈において、用語「動物細胞」は
、全ての動物細胞、特にヒト細胞を含む哺乳動物種の細胞を包含することを意図
する。
幹細胞の例には、単能性および多能性の両方の幹細胞、胚幹細胞、性腺幹細胞
、体幹／前駆細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、および神経幹細胞を包含する。
本発明の方法の実施において、細胞の供給源は陽性選択マーカーを有する多能
性細胞を包含し得、そして上記マーカーの発現は多能性細胞の単離および維持を
可能にするために使用される。あるいは、細胞の供給源は、所望の多能性細胞以
外の細胞で発現する陰性選択マーカーを包含し得、そして所望の多能性細胞以外
の細胞の細胞供給源を枯渇するために選択的に用いられる。
選択マーカーは、例えば、外来遺伝子、細胞性遺伝子、または抗生物質耐性遺
伝子(例えば、細菌性ネオマイシン耐性遺伝子)であり得る。
あるいは、選択マーカーは成長刺激遺伝子、例えば、不死
化遺伝子、オンコジーン、またはポリオーマもしくはSV40T抗原またはその誘導
体をコードする遺伝子であり得、あるいは選択マーカーは成長因子または成長因
子レセプターまたはシグナル形質導入分子または細胞死を阻止する分子をコード
する遺伝子であり得る。
１つの特定の実施態様では、所望の多能性細胞の単離および／または富化およ
び／または選択的な増殖は、所望の多能性細胞以外の細胞の存在に依存し、そし
て両方の細胞型の同時の持続は、一方または他方の細胞集団での選択マーカーの
発現に依存し、それはマーカーを発現しないがマーカーを自己発現する隣接の細
胞を助ける能力を有する。この例では、選択マーカーは、例えば、ヒポキサンチ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子であり得る。
他の実施態様では、選択マーカーは、毒性そのものである産物をコードする遺
伝子、または自殺基質との組合せで条件により活性である毒性遺伝子産物であり
得る。このような遺伝子産物の例は、ガンシクロビル(ganciclovir)と組合せた
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)である。
選択マーカーの発現は、細胞供給源に導入する前に、選択マーカーを発現構築
物に作動可能に挿入することにより達成され得、この場合、選択マーカーの発現
は、安定に組み込まれた構築物または一過的に組み込まれた構築物のいずれかの
誘導から生じ得る。あるいは、選択マーカーの発現は、細胞供給源の内因性遺伝
子に選択マーカーを作動可能に挿入する
ことから生じる。
選択マーカーの種々の導入手段が使用され得、これにはトランスフェクション
、リポフェクション、注入、衝撃ミサイル、ウイルスベクター、またはエレクト
ロポレーションによる細胞への導入を包含する。
細胞の供給源は稔性化卵母細胞のような単細胞であり得、あるいは、それは、
正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常
に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物を包含し得る。後者の場合では
、選択マーカーをトランスジェニック動物のゲノムに取り込み得る。
最も好ましくは、本発明の実施で、選択マーカーに作動可能に結合し、そして
選択マーカーの発現を調節する遺伝子または遺伝子フラグメントは、細胞発達の
多能性段階に関連する。このような遺伝子または遺伝子フラグメントは、発達し
ている胚の多能性細胞、特に内細胞塊および／または初期外胚葉で活性であり得
、あるいは、成熟幹細胞で活性であり得る。
本発明に従って使用するための細胞供給源の調製において、以下のプロトコル
の１つを有利に適応し得る：
−幹細胞を含有する細胞供給源に、選択マーカー構築物を導入すること、ここ
で、上記選択マーカー構築物は、上記特異な発現を提供する内因性遺伝子に作動
可能に連結するために適応される、または
−幹細胞を含有する細胞供給源に、選択マーカー構築物を導入すること、ここ
で、上記選択マーカー構築物は、上記特異な発現を提供する１つまたはそれ以上
の遺伝子フラグメントに作動可能に連結されている。
遺伝子マーカーは、好ましくは、所望の多能性細胞で特異に活性であるプロモ
ーターに作動可能に連結した選択マーカーを包含する(例えば、初期外胚葉)。「
選択マーカー」は、標的細胞集団で、外来遺伝子、または天然に発現する細胞性
遺伝子、または天然に発現するが不適当なレベルであるような遺伝子であり得る
選択遺伝子を意味する。用いるこの遺伝子は、標的細胞集団の表現型に適応する
ことにより、選択マーカーとして働き、このように適応した表現型を有する細胞
は、特定の培養条件下で富化または枯渇し得る。
幹細胞が胚細胞である場合では、選択マーカーが幹細胞(例えば、初期外胚葉
、原基生殖細胞)および非幹細胞で特異に活性であるプロモーターに作動可能に
連結されることが好ましい。プロモーターおよびその他のシス調節エレメントは
、細胞に導入する前またはプロモーターがない構築物を部位特異的な組換えによ
る特異的な遺伝子に標的することにより、発現構築物に含まれ得る。
多様な遺伝子産物は、所望の幹細胞の選択的な単離および増殖に依存し得、培
養液中に存在する阻害因子の影響から所望の細胞を防御するために設計されるマ
ーカーを包含している。この例では、阻害因子は、例えば、培養細胞(すなわち
、
所望の細胞以外の細胞)の成長または再生を阻害し、遺伝子を発現しない抗生物
質であり得る。選択マーカー(例えば、HPRT)はまた、それが発現される所望の細
胞および代謝的救済によるその他の密接に関連した細胞の両方についての防御を
提供し得る。
あるいは、選択マーカーは、幹細胞の成長を選択的に可能にし得る。この例で
は、マーカーは成長因子、成長因子レセプター、転写因子、不死化またはオンコ
ジーン産物(例えば、温度感受性シミアンウイルス40Ｔ抗原)をコードし得る。
あるいは、選択マーカーは、例えば、パンニングまたは蛍光活性化細胞分類(F
ACS)による、発現細胞の精製または枯渇を可能にする細胞表面抗原またはその他
の遺伝子産物であり得る。従って、本発明は、幹細胞集団を十分な程度の相同性
を有しながら獲得／維持することを可能にする。
あるいは、選択マーカーが条件的毒性遺伝子、例えば、単純ヘルペスウイルス
チミジンキナーゼ[HSV-TK]であり得る。この例では、選択マーカーの発現は、所
望の細胞以外の細胞に働くが、幹細胞に働かない。所望の表現型以外の細胞は、
致死基質(例えば、ガンシクロビル)の添加により選択的に枯渇され得る。
遺伝子マーカーは、注入、トランスフェクション、リポフェクション、エレク
トロポレーションを含む種々の手段により、またはウイルスベクターの感染によ
り、細胞供給源に導入され得る。
さらに、細胞供給源は、即席のトランスフェクションにより生産され得、ある
いは細胞供給源は、トランスジェニック動物(例えば、創始トランスジェニック
動物)、またはその遺伝子補足物に導入した前述の遺伝子マーカーを有する少な
くとも１匹の祖先がいる動物に由来し得る。このようなトランスジェニック動物
では、マーカーが、生殖系列を代々伝えそして必要な細胞供給源が由来し得る組
織から(特に、胚組織から)、最終的に子孫を生産することが可能である。
従って、本発明のさらなる局面によれば、幹細胞の単離および／または富化お
よび／または選択的増殖を可能にするように適切な選択培養条件下で培養され得
る動物細胞を提供し、上記細胞が選択マーカーを包含することで特徴付けられ、
ここで、(a)所望の幹細胞および(b)所望の幹細胞以外の細胞での選択マーカーの
特異な発現が、所望の幹細胞の選択的な成長が生じることを可能にする。
本発明はさらに、幹細胞として成長するような選択培養条件下で培養され得る
動物細胞を提供し、上記細胞が、遺伝子マーカーを含む幹細胞を包含することで
特徴付けられ、それにより遺伝子マーカーと関連した遺伝子産物が生産され、そ
して上記培養条件下で、所望の幹細胞の選択的生存および／または分割を生じさ
せる。
本発明のこの局面によれば、動物細胞は、好ましくは上記の好ましい特徴を有
することにより特徴付けられる。
本発明はさらに、本発明の他の局面によれば、トランスジ
ェニック動物を提供し、これはこの動物またはその子孫が、胚発達またはその後
の寿命の間、上記の定義のように動物多能性細胞の供給源を構成するような遺伝
的特徴を有する。
このようなトランスジェニック動物を、インビトロで稔性化卵母細胞または胚
細胞、または胚幹細胞に遺伝子マーカーを導入することにより、ここでこの遺伝
子マーカーは上記の特徴を有しており、そして所望のトランスジェニック動物の
前駆細胞として得られる形質転換された卵母細胞または胚細胞を利用することに
より、本発明に従って生産し得る。
上記の動物細胞の生産で用いるためのベクターは本発明のさらなる局面を形成
する。
従って、本発明は、さらに、上記の方法のための細胞供給源としての使用に適
切な形質転換細胞を生産するように、動物細胞の遺伝学的な改変に用いるための
ベクターを提供し、上記ベクターは、上記選択マーカーに対応する第一の遺伝子
成分および第二の遺伝子成分を包含し、該第二の遺伝子成分は遺伝学的に改変さ
れた動物細胞において、(1)一過的に組み込まれた構築物または安定に組み込ま
れた構築物のいずれかに由来の選択マーカーの上記特異な発現を生じ、あるいは
(2)選択マーカーと標的化内因性遺伝子調節エレメントとの作動可能なカップリ
ングを提供するような、特異的な遺伝子への選択マーカーの部位指向的組み込み
を可能にする。
このようなベクターは、発現ベクターの形態であり得、ベクター内で上記第二
の遺伝子成分は、制御配列を包含し、そ
の配列は、(a)幹細胞でおよび(b)所望の幹細胞以外の細胞で特異に活性化される
。
本発明は、動物細胞を形質転換するに用いる場合に動物ゲノムに組み込まれる
ベクターおよびそのように組み込まれないベクターを包含する。
上記の発現ベクターは、遺伝制御エレメントに作動可能に連結した上記の選択
マーカーをコードするDNA配列、またはプロモーターのないマーカーの上記幹細
胞および所望の幹細胞以外の細胞で特異に発現する内因性遺伝子に対する標的を
可能にする配列を包含し得る。
多能性胚幹細胞を生じるために、発現構築物は、好ましくは、遺伝制御エレメ
ントに作動可能に連結したまたは標的する前記選択マーカーをコードするDNA配
列を包含し、この遺伝制御エレメントが多能性胚細胞の分化前に、胚発達の段階
と関連する。最も好ましくは、遺伝制御エレメントは、マウス胚盤胞の内細胞塊
で、初期外胚葉で、および初期胚の原基生殖細胞で特異的に活性な遺伝子に由来
する。
さらに詳細には、本発明では、幹細胞で選択マーカーを特異的に発現しそして
分化した細胞型で発現しない発現構築物の発達を得た。トランスフェクションに
よりまたはトランスジェニック動物の発生を介することにより発現構築物を導入
すると、混合細胞集団内に存在する幹細胞は、インビトロで選択剤の存在下で培
養することにより、または培養条件を他に操作することにより単離され得る。
適切に制限された幹細胞発現パターンを示し、そしてそのために、本発明によ
る選択マーカーの発現のために適切な「幹細胞特異的」調節エレメントを提供し
得る遺伝子の１例は、Oct4遺伝子である。
８量体結合転写因子４は、転写因子のPOUファミリーのメン
は、発達中のマウス胚で４細胞期と８細胞期との間で活性化され、そして増大す
る胚盤胞でそして次いで卵円柱(egg cylinder)の多能性細胞で高発現する。転写
は、初期外胚葉が分化して中胚葉を形成するようにダウンレギュレートされ(Sch
に原基生殖細胞の移動を制限する。高レベルのOct4遺伝子発現はまた、多能性胚
癌腫および胚幹細胞株で観察され得、そしてこれらの細胞が分化するように誘導
される場合、ダウン
本発明によれば、Oct4プロモーターの制御下の選択マーカー遺伝子は、胚幹細
胞系の単離に適用され得る。さらに、いくつかの成人組織での低レベルのOct4発
現を記載する報告(Takedaら、1992)は、胚幹細胞を超えたこれらの発現構築物の
有用性を、組織恒常性に不可欠なその他の幹細胞を含みそして造血系を包含する
その他の系で修復するように拡張し得る。Oct4が体幹細胞で発現しない場合では
、造血幹細胞特異抗原CD34と関連したような他の転写調節エレメントは、同様の
方法で有用であり得る。
本発明によれば、２つの特異的なアプローチが、トランスジェニック発現で所
望の空間的および時間的な制限を生じることについて提供される。第一のアプロ
ーチは、部分的に特徴付けられたOct4遺伝子プロモーターフラグメント(Okazawa
ら、1991)を使用して選択マーカーの幹細胞特異転写を行うトランスジェニック
動物の発生を介する。適切な選択マーカーは、抗生物質G418に耐性を与えるネオ
マイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。あるいは、代謝物中の遺伝子
欠失を妨げ得る遺伝子産物の生産に関する選択マーカー、例えば、ヒポキサンチ
ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子欠失細胞中のHPRT
遺伝子(Hooperら、1987)を利用することである。このアプローチは、幹細胞が密
接関連した分化細胞からの連続支持を必要とする状況で有益である。この例では
、直接的な細胞の接触は、支持細胞で選択マーカー遺伝子が発現しないにもかか
わらず、幹細胞による隣接している支持細胞の代謝救済を可能にする。
第二のアプローチは、内因性Oct4遺伝子座を利用し、そしてそれゆえ、内因性
Oct4遺伝子発現プロフィールとできるだけ密接に耐性マーカー遺伝子発現を連結
するために、関連したOct4遺伝子調節エレメントを利用する。これは、胚幹細胞
でOct4遺伝子の変異誘発を標的する高効率な遺伝子トラップにより達成され得る
。このアプローチは、しばしば、ランダムに組み込まれた構築物の予測できない
発現パターンを生じるランダムな組み込み部位効果を避けることにより、選択マ
ーカー遺伝子発現のより厳しい調節制御を提供する。
本発明は、以下の実施例、特に添付の図面(図１は、プラスミドOct-4-Neo-βS
の構造を示し、図２は、プラスミドOct-4-Neo-βfosの構造を示し、そして図３
は、プラスミドOct-4-tgtvecの構造を示す)に関してさらに詳細に記載される。実施例１
１．OCT4プロモーター配列の単離：
本発明者らは、330bpの5'Oct4 cDNAフラグメントを用いて、129株マウスゲノ
ムラムダライブラリーをスクリーニングした。いくつかのクローンを単離し、制
限分析およびサザンブロットハイブリダイゼーションによってスクリーニングし
た。Oct4プロモーターエレメントを含む1.4kbのBam HI-HindIIIフラグメント(Ok
azawaら、1991)をクローン１から単離し、pBluescript II KS(-) (Stratagene)
に連結し、pOct4(5'ゲノム)を作成した。
２．プラスミドの構築：
Oct4-Neoプロモーター構築物を作成するために、翻訳開始コドンにNcoI制限部
位を提供するように設計された遺伝子操作されたネオマイシン耐性遺伝子(neo)
を、脳心筋炎(encephalomyocarditus)ウイルス内部リボソームエントリー部位配
列(EMCV-IRES、Ghattasら、1991)および5'-Neoコーディング配列を含む1.1kbのX
baI-SphIフラグメントとしてpLZINから単離
し(Ghattasら、1991)、そしてpSP72(Promega Biotech)にクローニングした。Kpn
I-NcoI EMCV-IRES配列を、KpnIおよび次に部分的なNcoI制限消化によってpOct4(
5'ゲノム)から単離した1.3kbのOCt4プロモーターフラグメントで置換した。Neo3
'-コーディング配列、ウサギβ-グロビン遺伝子配列（イントロン）、およびSV4
0ポリアデニル化配列を、6P-IRESNeo-βS由来の1.7kbのSphIフラグメントとして
単離し、そしてSphI部位に連結し、Oct4-Neo-βS（図１）を作成した。Oct4-Neo
-βfos構築物（図２）を作成するために、Oct4プロモーター、neo遺伝子、およ
びウサギβ-グロビンイントロンを含むOct4-Neo-βS BamHIフラグメントをヒトc
-fosゲノム配列の5'側に挿入した。この1.7kbのゲノム配列(BalI-SphI)は、先に
mRNA不安定化と関連のあったヒトc-fos mRNA3'コーディング配列および非コーデ
ィング配列(WilsonおよびTriesman，1988)、ならびにc-fosポリアデニル化配列
をコードする。
Oct4-neo構築物(Oct4-tgtvec)は、Oct4遺伝子に標的組み込みのために設計さ
れている(図３)。Oct4標的構築物は、1.7kbの5'Oct4遺伝子配列および4.2kbの3'
Oct4遺伝子配列を含む。以下の相同組換えでは、この構築物は、lacZ-ネオマイ
シン融合遺伝子(βgeo、２機能性タンパク質、FreidrichおよびSoriano、1991)
をOct4遺伝子の最初のイントロンに組み込む。最初のエキソン-イントロンの境
界のスプライスドナー配列から組み込まれたIRES-βgeo配列までのスプライシン
グは、IRES-βgeo配列のすぐ5'側のネズミのとがった波形になった(eng
railed)-2スプライスアクセプター配列(Skarnesら、1992)の含有によって促進さ
れる。Oct4-βgeo融合転写物のβgeoシストロンの翻訳は、βgeoコーディング配
列のすぐ5'側のEMCV-IRESの含有によって促進される。
３．ES細胞のトランスフェクションおよびコロニー選択：
マウス129ES細胞(CGR-8株)を、Smith(1991)によって記載されたように、分化
阻害活性剤(DIA)または白血病阻害因子(LIF)の存在下で調製しそして維持した。
トランスフェクションのためのプラスミドDNAをSalI消化によって直鎖状にし、
エタノール沈澱し、そしてPBS中で10〜14mg/mlで再懸濁した。新鮮な培養液中で
10時間培養した後、ほぼコンフルエントなES細胞をトリプシン処理によって分散
し、続いて培養液およびPBSで洗浄し、そして直後のトランスフェクションのた
めにPBS中で1.4×108/mlに再懸濁した。日常的に、0.7mlの細胞懸濁液を、溶液
を含む0.1mlのDNAと混合し、そしてBiorad Gene Pulserおよび0.4cmキュベット
を用いて0.8kVおよび3.0μFDでエレクトロポレーションを行った。トランスフェ
クションは、ゼラチン化した組織培養皿上で増殖培地中5〜8×104/cm2で播いて1
6時間放置し、その後200μg/ml(活性)G418(Sigma)を含む選択培養液を加えた。
単一なコロニーをトランスフェクションの8〜10日後に選択し、そして200μg/ml
のG418を含む増殖培養液中でさらなる増加のために24ウエル組織培養プレートに
２連で移した。
Oct4-Neo-βSおよびOct4-Neo-βfos構築物を有するクローン化細胞株(Oct4-Ne
o細胞株と称す)を２日間培養し、PBSで２回洗浄し、そして培養液をDIAを含むま
たは含まないG418培養液に置き換えた。DIAの存在下で正常に成長するが、DIAの
非存在下で生存しない細胞株を、拡張およびさらなる分析のために選択した。
Oct4-tgtvec標的構築物を有するクローン化細胞株(Oct4-標的細胞株と称す)を
、２連の24ウエルプレートで増加させた。一旦コンフルエントになると、一連の
細胞を保存のために冷凍するが、残存物をサザン分析で分析した。
４．Oct4-NeoおよびOct4-標的細胞株のさらなる特徴付け：
選択したOct4-Neo細胞株を、G418の種々の濃度でDIA追加した培養液または追
加しない培養液中でのES細胞の成長および分化についてアッセイした。細胞を、
種々の培養調製物中1×104/cm2で12ウエル組織培養プレートに播き、そして６日
間培養した。新鮮な培養液を、先に記載のように(Smith，1991)、細胞が固定し
そして染色される６日目まで２日毎に加えた。ゲノムサザン分析によりポジティ
ブなOct4-標的細胞株を、lacZ染色により、ならびに200μg/mlのG418中のDIA追
加または非追加培養液における成長および分化を分析した。
５．Oct4-Neo細胞株由来の胚様体の生産：
胚様体を、懸滴培養法(hanging dropn method)(Holeおよび
Smith，印刷中)により発生させ、そしてG418の存在下または非存在下で２、４、
６、または８日間懸濁培養で維持した。コントロールの胚様体を、G418の非存在
下で親細胞株CGR-8から発生させた。次いで、胚様体を回収しそしてゼラチン化
組織培養皿に移し、寄与している細胞型の分析のための集合体の付着および増加
を可能にする。全ての胚様体をDIAおよびG418の非存在下で４日間維持した後、
視察した。
６．Oct4-NeoおよびOct-4標的細胞株由来のキメラの生産：
選択したOct4-Neo細胞株を、G418の非存在下で７日間培養した後、先に記載さ
れたように(Nicholsら、1990)胚注入した。簡単に言えば、注入する胚盤胞を、C
57BL/6ドナー由来の4d.p.c.を回収し、10〜20細胞に注入しそして培養で再増加
することを可能にした後、偽妊娠レシピエントの子宮に移した。キメラを、C57B
L/6の地色の薄茶の皮の色の斑点の存在により同定した。雄のキメラを、Oct4-Ne
oトランスジーンの伝達について試験飼育した。次いで、トランスジェニックマ
ウスを異なった遺伝子背景上で掛け合わせた。
７．結果
Oct4-Neo-βS構築物は、約50コロニー/106のトランスフェクトした細胞を生産
したが、Oct4-Neo-βfos構築物は約10倍少ないコロニーを生産した。３つのクロ
ーンを、DIAの存在下または非存在下でG418(200μg/ml)を含有する培養液中にお
け
るそれらの特異な生存に基づき選択した。３つの細胞株は全て、DIA追加G418含
有培養液で正常な成長速度を明らかに示し、そしてG418培養液中でDIAの非存在
下で培養した場合に死んた。DIA追加G418培養液で維持される培養物は、本質的
に純粋なES細胞として成長したが、G418の非存在下でDIA追加培養液で維持され
る培養物は、ES細胞と親CGR-8株の細胞と非常によく似た分化した子孫との混合
した培養物として成長した。従って、G418選択は、分化した細胞型を排除し、そ
して純粋な幹細胞集団の増殖を可能にする。選択した３つの細胞株を、Oct4-Neo
-βS18、Oct4-Neo-βS21、およびOct4-Neo-βfos11を命名した。これらの細胞株
は、宿主胚盤胞に導入され、そして生じたキメラは試験飼育され得る。同様な結
果は、Oct4-tgtvec構築物で標的したESクローンで得られた。さらに、β-ガラク
トシダーゼ活性についてのこれらの培養物の組織化学的染色は、βgeoの発現が
未分化の幹細胞に制限されることを確認した(Mountfordら、1994)。
胚様体をOct4-Neo細胞株Oct4-Neo-βfos11から発生させて、混合細胞集合体で
のG418選択の効果を試験し、そして混合細胞集団からES細胞を単離する選択系の
有用性を試験した。実験用細胞株(Oct4-Neo-βfos11)および親細胞株(CGR-8)の
両方で発生し、そしてG418の非存在下で培養される胚様体は、ES様細胞をほとん
ど有さないほぼ完全な分化細胞で構成された。対照的に、増加したコロニーの視
覚分析は、G418の存在下で培養したOct4-Neo-βfos11胚様体が高い割合のES細胞
を含有
することを示した。従って、分化系からの幹細胞の単離の可能性を確認した。
８．要旨
生殖系伝達可能なES細胞は、マウスの２つの同系繁殖系、129およびC57BL/6の
みから既に樹立されている。Oct4-ネオマイシン選択図とES細胞単離および増殖
手順の確立(EvansおよびKaufman、1981；Martin、1981；Nicholsら、1990；Yosh
idaら、1994)を組み合わせることは、Oct4が特異に発現される、以前の非生産性
マウス株およびその他の哺乳動物種由来のES細胞株誘導を可能にすべきである。
混合細胞集団における非幹細胞表現型に対する選択は、いくつかの理由で有利
であり得る。第一には、混合集団における分化細胞に対する選択は、大量な幹細
胞富化物についての方法を提供する。第二には、分化細胞の選択的な除去は、培
養物中でのそれらの過剰成長を防御する。第三には、分化細胞の排除は、分化細
胞に関連する活性を誘導する分化の損失のために、幹細胞自身の再生を増強し得
る。実施例２
ES細胞胚様体由来の多能性幹細胞の救済および回収
方法
１．細胞培養
ES細胞を、Smith(1991)により記載されたように分化阻害活性剤(DIA)を追加し
た培養液中で日常的に維持した。胚様体をDIAの非存在下でES細胞の集合体によ
り形成した。この集合体は、10μlまたは30μl滴の培養液中で100細胞/滴の濃度
で分離したES細胞を播くことにより生産した。滴の配列をマルチピペッターを用
いて10cm組織培養皿のフタの上に置いた。次いで、これを皿の底と逆転し、この
皿は湿度を維持するために10mlの水を含有し、そして懸滴を７％CO2雰囲気中で3
7℃にて培養した。
２．組織学およびβ-ガラクトシダーゼ染色
胚様体をブーアン(Bouin)溶液中で固定しそして寒天中に包埋した。次いで、
パラフィン切片を標準的手順により調製しそしてヘマトキシリン(haematoxylin)
およびエオシンで染色した。胚様体派生物のアルカリホスファターゼ染色をSigm
a Kit 86-Rを用いて実施した。β-ガラクトシダーゼの組織化学的染色を記載(Be
ddingtonら、1986)のようにXgalを用いて行った。
結果
３．細胞株および選択系
Fos11は、Oct4neofos構築物でトランスフェクトしたES細胞株CGR8の誘導体で
ある。Fos11細胞は、Oct4近接プロモーターエレメントの制御下で低レベルのG41
8耐性を発現するが、分
化した子孫はトランスジーンの発現を示さず、そしてそれゆえG418に感受性であ
る。OKO160およびOKO8は、それぞれES細胞株CGR8およびE14TG2aの誘導体であり
、そこではIRES-βgeopAカセットが前記のような相同組換えによりOct4遺伝子の
１つの対立遺伝子に導入されている。OKO細胞株は未分化状態で高レベルのβgeo
を発現し、そしてそれゆえXgalで強力に染色しそしてG418耐性である。分化した
子孫はβgeoの発現を喪失しそしてXgal染色について陰性およびG418に感受性と
なる。単層培養では、Fos11およびOKO細胞を、DIAの存在下での培養により純粋
なES細胞集団として維持し、G418で選択する。しかし、DIA(Smith，1991)の低濃
度および非存在のような分化に有利な条件下では、G418選択の結果、３〜５日間
にわたりこれらの培養物は完全に除去される。Rb40細胞は、ヒトβ-アクチンプ
ロモーターにより指示されるneoRの発現のため、G418に対して構成的に耐性であ
るCGR8の誘導体である。
４．分化細胞に対する選択の存在および非存在下における胚様体の形成
細胞の凝集塊を分離し続いて大量の懸濁培養物中で集合する従来の手順(Doets
chemanら、1986)による胚様体の生産は、サイズおよび分化状態の両方が不均一
な集合体の混合集団を生じる。さらに単一および一貫した発達を得るために、最
近の研究では、胚様体を、培養培地の個々の滴中で一定の数の細胞の集合体によ
り形成した(方法の項を参照のこと)。懸滴
培養の48時間後、集合体をG418の存在または非存在下の懸濁培養にひとまとめに
して移した。
分化した子孫に対するG418選択下において、集合体はFos11細胞およびOKOクロ
ーンの両方からなお形成されていた。いくつかの死んだ細胞が集合体の周囲に現
れたが、本体自身は、培養期間の間にサイズを増大した。試料を大量の培養物か
ら定期的に採取し、そして組織学的試験を行った。数日後、選択の非存在下で形
成した胚様体は、ほとんど嚢胞性でありそして種々の形態学的に分化した細胞型
を包含していた。未分化細胞はまれに見られた。対照的に、選択下で維持される
集合体は、細胞の特殊化の徴候を示さず、そして本体は、未分化細胞の固体球か
らなるようであった。これらの未分化集合体中の大部分の細胞は、正常および生
存可能なようであり、そして時折アポトーシスを示唆する核濃縮核が見られたが
、壊死の証拠はなかった。しかし、G418で形成した胚様体は、選択の非存在下で
形成したそれらの対照物より顕著に小さかった。これは嚢胞発達の欠損および分
化細胞の除去の組合せに特徴があり得る。
５．分化細胞に対する選択下で形成した胚様体中の多能性幹細胞の持続性。
コントロール培養物中において未分化集合体が少しも存在しないことは、おそ
らく、G418の効果が非分化集合体の亜集団の選択のためではないことを意味する
。しかし、この可能
性を最終的に除外するために、およびまたG418選択の効果の量的な決定を容易に
するために、改変したプロトコルを用いて個々の集合体の行動(behavior)の評定
を可能にした。培養を、G418の存在下または非存在下で30μlの懸滴中で開始し
、そして７〜８日間滴培養で維持した。次いで、胚様体をゼラチンコートした96
ウエル組織培養プレートに個々に移し、そしてこの培養液をG418を欠いた培養液
で６倍希釈した。幹細胞維持因子DIAをこの段階で添加し、存在するあらゆる未
分化ES細胞を増加させた。培養物を、付着させ、次いで48時間過剰成長させて固
定し、アルカリホスファターゼまたはβ-ガラクトシダーゼで適切に染色した。
表１に要約したデータは、選択の全くの非存在下で、未分化幹細胞が、７日目
の懸濁培養物内の胚様体からほぼ完全に除去されることを示す。過剰成長物は種
々の形態学的に分化した細胞型を含むが、ESの細胞形態学を有する細胞領域は観
察されなかった。OKO細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの発現は、幹細胞特異的
転写因子Oct4に結びつき(Mountfordら、1994)、そしてそれゆえ、未分化細胞の
マーカーとして働く。単離したXgal-染色細胞は、時折OKO過剰成長物中に見られ
るが、染色細胞のクラスターはこれらの状態下で検出されなかった(しかし、論
考の項を参照のこと)。
G418での胚様体形成の効率は、非選択培養中で本質的に100％に等しかった。
しかし、未処理の胚様体との著しい対比では、継続的なG418選択下で樹立した胚
様体は、主としてES細
胞からなる過剰成長を生じた。これらの未分化な細胞の性質を、ES細胞コロニー
の形態学的特徴によりおよびアルカリホスファターゼでの染色により同定し、そ
してOKO過剰成長物のXgal染色により確認した。
選択下で形成した胚様体由来のいくつかの過剰成長物を摘出し、そして２cmウ
エルに移した。摘出した全てのコロニーを未分化細胞の大量培養物で容易に増加
した。これらの培養物は、非追加培養液中に置いた場合、DIAに依存して残り、
そして親ES細胞と同様の様式で分化した。さらに、これらの誘導体は、集合体で
複数の細胞型に効率よく分化し、それらの多能性を確認した。
これらの発見は、分化した子孫の選択的除去がES細胞集合体での多能性幹細胞
の持続性を生じることを証明する。
６．混合集合体での幹細胞の死滅
分化した子孫が胚様体での幹細胞死滅に直接的な原因であり得るという意味が
さらに提示された。OKO細胞の行動を、G418の存在下で分化し得るRb40 ES細胞と
混合した集合体の形成に続き評定した。Rb40細胞はネオマイシンホスホトランス
フェラーゼを構成的に発現し、そしてG418選択は、単層培養または集合体のいず
れかにおいてそれらの分化への認められる効果を有さない。懸滴培養物を、３：
１の比のOKO細胞：Rb40細胞を用いて樹立した。混合胚様体のパラフィン切片は
、それらがG418の存在または非存在下の両方で大量に分化をす
ることを明らかにした。両方の条件下での未分化幹細胞の効果的な除去を、過剰
成長物のXgal染色により確認した(表１)。
この結果は、分化した子孫の存在が多能性幹細胞の除去を誘導する直接的な証
拠を提供する。これは、特定の分化幹細胞の子孫が誘導シグナルの供給源である
ことを包含し、このシグナルは、残っている幹細胞のさらなる分化を指示するか
またはおそらくアポトーシスへ導入するよう誘導するかのいずれかである。
結論
集合体はES細胞を誘導して、胚様体として公知の分化構造物に発達する。多能
性幹細胞は、効果的な分化の誘導およびおそらくまた選択的な細胞死のために、
これらの胚様体で迅速に死滅する。しかし、分化した子孫が本発明の方法を用い
て集合体から特異的に除去される場合、幹細胞は持続しそして増殖し得る。
上記の詳述した発見は、本発明の幹細胞特異的選択系の使用を通じて、分化ま
たは死のいずれかにより正常にそれらの除去をさせる条件から幹細胞を再生する
ことが可能であることを明確に示す。
実施例３
マウス胚から胚幹細胞培養物を樹立する手順
トランスジェニックマウスの系を、G418耐性を与えるネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子がOct4遺伝子の特異性を有して発現することで樹立した。
βS21系はOct4neoβSトランスジーンを有するが、OKO系では、neo遺伝子がOct4-
tgtvec構築物で標的する遺伝子を介して内因性Oct遺伝子に取り込まれている。
これらのマウスを、MFI異系交配アルビノマウスおよび同系交配CBAマウスを用い
て２世代について外部交配した。これらのマウスの系のいずれも標準手順を用い
てES細胞を生産しない。
幹細胞を単離する４つの好ましい手順を記載する。全ての
場合において、胚は、分化阻害活性剤(Smith，1991)またはインターロイキン-６
と可溶性インターロイキン-６レセプター(Yoshidaら、1994)のいずれかを追加し
た標準ES細胞培養液で培養される。G418を200μg/ml〜１mg/mlの濃度で添加する
。
手順１
胚盤胞を妊娠４日目で洗い出す。４〜10のグループの胚盤胞を１cmの組織培養
ウエルでG418選択下で培養する。過剰成長を個々に分離し、そして記載した(Nic
holsら、1990)ように培養４〜６日後、トリプシンで分離し、そして１つのウエ
ルに置き換える。G418選択を維持する。次の14日間にわたり培養物中に見られる
ES細胞の形態学的特徴を有するコロニーを摘出し、そして連続選択下で増加させ
る。
手順２
胚盤胞が、妊娠３日目で母体の卵巣切除により採取する前に着床遅延になるこ
とを除いては、手順１のように行った。胚盤胞を卵巣切除４日後に洗い出す。
手順３
交尾後5.5および7.5日の間の着床後の胚を単離し、そして初期外胚葉を顕微解
剖および／またはプロテアーゼ消化より分離する。外胚葉は、穏やかに20〜50細
胞の凝集塊に分離し、それは、次いで手順１のように培養される。
手順４
手順１、２、または３のように調製した胚は、組織培養ウエルに移しそして続
いて手順１のように操作する前に、５〜７日の期間G418選択下の懸滴中で培養さ
れる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，
ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ
Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ
，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，
ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ
Ｎ
(72)発明者 マウントフォード，ピーター スコット
オーストラリア国 ビクトリア 3004，メ
ルボルン，エスティー キルダ ロード
420，レベル 10，ステム セル サイエ
ンシーズ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．動物幹細胞を単離するおよび／または富化するおよび／または選択的に増殖 する方法であって、該方法は、細胞の生存の助けとなる培養条件下で、該細胞の 供給源を維持する工程を包含し、該細胞の供給源が、(a)所望の幹細胞および(b) 幹細胞以外の細胞で特異な発現が可能な選択マーカーを含む細胞を包含すること で特徴づけられ、それにより、該選択マーカーの特異な発現が、該所望の幹細胞 の選択的な単離および／または生存および／または分割を生じる、方法。 ２．前記所望の幹細胞が、単能性幹細胞、多能性幹細胞、胚幹細胞、性腺幹細胞 、体幹／前駆細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、および神経幹細胞から選択される 、請求項１に記載の方法。 ３．前記細胞供給源が陽性選択マーカーを有する幹細胞を包含し、そして前記マ ーカーの発現が幹細胞の単離および／または富化および／または維持を可能にす るために用いられる、請求項１または２のいずれかに記載の方法。 ４．前記所望の幹細胞以外の細胞での陰性選択マーカーの発現が、該所望の幹細 胞以外の細胞の細胞供給源を選択的に枯渇するために用いられる、請求項１〜３ のいずれかに記載の 方法。 ５．前記選択マーカーが、外来遺伝子、細胞性遺伝子、および抗生物質耐性遺伝 子から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 ６．前記抗生物質耐性遺伝子が細菌性ネオマイシン耐性遺伝子である、請求項５ に記載の方法。 ７．前記選択マーカーが成長刺激遺伝子である、請求項１〜６のいずれかに記載 の方法。 ８．前記成長刺激遺伝子が、オンコジーンまたはその誘導体である、請求項７に 記載の方法。 ９．前記成長刺激遺伝子が、SV40ラージＴ抗原またはSV40ラージＴ抗原の誘導体 である、請求項７に記載の方法。 １０．前記成長刺激遺伝子が、成長因子をコードする遺伝子、成長因子レセプタ ーをコードする遺伝子、シグナル形質導入分子をコードする遺伝子、および転写 因子をコードする遺伝子から選択される、請求項７に記載の方法。 １１．前記選択マーカーが不死化遺伝子である、請求項１〜 ５のいずれかに記載の方法。 １２．前記不死化遺伝子が、ポリオーマラージＴ遺伝子、細胞死を阻止する遺伝 子、およびbc1-2遺伝子から選択される、請求項１１に記載の方法。 １３．前記所望の多能性細胞の単離および／または富化および／または増殖が、 該所望の多能性細胞以外の細胞の存在に依存し、そして両方の細胞型の同時の維 持が、一方または他方の細胞集団で選択マーカーの発現に依存し、それは該マー カーを自己発現しないこれらの細胞に隣接する細胞を助ける能力を有する、請求 項１〜５のいずれかに記載の方法。 １４．前記選択マーカーが、HPRT、毒性産物をコードする遺伝子、自殺基質と組 合せて条件により活性な毒性遺伝子産物、および単純ヘルペスウイルスチミジン キナーゼ(HSV-TK)遺伝子である、請求項１３に記載の方法。 １５．前記細胞が２つの選択マーカーを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載 の方法。 １６．前記選択マーカーの発現が、細胞供給源に導入する前に、該選択マーカー を発現構築物に作動可能に挿入することにより達成される、請求項１〜１５のい ずれかに記載の方法。 １７．前記選択マーカーの発現が、安定に組み込まれた構築物、エピソーム的に 維持され構築物、または一過的に維持された構築物の誘導から生じる、請求項１ 〜１６のいずれかに記載の方法。 １８．前記選択マーカーの発現が、細胞供給源の内因性遺伝子に該選択マーカー を作動可能に挿入することから生じる、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法 。 １９．前記選択マーカーが、トランスフェクション、リポフェクション、注入、 衝撃ミサイル、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、または任意の他の 手段により、前記細胞へ導入される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。 ２０．前記細胞供給源が、単細胞または細胞株；稔性化卵母細胞；トランスジェ ニック動物；非トランスジェニック動物；胚、血液、または体組織由来の細胞； および細胞混合物から選択される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。 ２１．前記選択マーカーがトランスジェニック動物に取り込まれる、請求項１〜 ２０のいずれかに記載の方法。 ２２．前記選択マーカーが、遺伝子または遺伝子フラグメントが幹細胞および非 幹細胞で特異な活性である発現を調節す る遺伝子または遺伝子フラグメントに作動可能に連結される、請求項１〜２１の いずれかに記載の方法。 ２３．前記選択マーカーに作動可能に結合し、そして選択マーカーの発現を調節 する遺伝子または遺伝子フラグメントが、細胞の発達の多能性段階に関連する、 請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。 ２４．前記遺伝子または遺伝子フラグメントが、発達している胚の多能性細胞で 活性である、請求項２３に記載の方法。 ２５．前記遺伝子または遺伝子フラグメントが、初期外胚葉で活性である、請求 項２３または２４に記載の方法。 ２６．前記遺伝子または遺伝子フラグメントが、Oct4遺伝子の全てまたは一部分 である、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。 ２７．前記遺伝子または遺伝子フラグメントが、Oct4プロモーターである、請求 項２２〜２６のいずれかに記載の方法。 ２８．前記選択マーカーがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である 、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。 ２９．前記遺伝子または遺伝子フラグメントが多能性造血細胞で活性である、請 求項２２〜２８のいずれかに記載の方法。 ３０．前記遺伝子または遺伝子フラグメントがCD34遺伝子の全てまたは一部分で ある、請求項２９に記載の方法。 ３１．選択マーカー構築物を、幹細胞を含む細胞供給源に導入する工程を包含す る、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法であって、該選択マーカー構築物が 、前記特異な発現を提供する内因性遺伝子に作動可能に連結するために適応され ている、方法。 ３２．選択マーカー構築物を、幹細胞を含む細胞供給源に導入する工程を包含す る請求項１〜３０のいずれかに記載の方法であって、前記選択マーカー構築物が 前記特異な発現を提供する１つまたはそれ以上の遺伝子または遺伝子フラグメン トに既に連結されている、方法。 ３３．動物幹細胞を選択的に単離および／または富化および／または増殖する方 法であって、選択マーカー構築物を、幹細胞を含む細胞供給源に導入する工程を 包含し、該選択マーカー構築物が遺伝子または遺伝子フラグメントに作動可能に 連結するかまたは既に連結されており、該遺伝子または遺伝子フラグメントが幹 細胞および所望の幹細胞以外の細胞で該 選択マーカーの特異な発現を提供し、そして該方法が適切な培養条件下で所望の 幹細胞の選択的な単離および／または富化および／または増殖を可能にする、方 法。 ３４．前記選択マーカーが発現を調節する遺伝子または遺伝子フラグメントに作 動可能に連結し、遺伝子または遺伝子フラグメントが幹細胞および非幹細胞で特 異な活性である、請求項３３に記載の方法。 ３５．前記遺伝子または遺伝子フラグメントがOct4プロモーターである、請求項 ３４に記載の方法。 ３６．前記選択マーカーがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である 、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。 ３７．動物幹細胞を選択的に単離するおよび／または富化するおよび／または増 殖する方法であって、選択培養条件下で細胞供給源を培養する工程を包含し、該 細胞供給源が遺伝子マーカーを含む幹細胞を含むことで特徴づけられ、それによ り該遺伝子マーカーと関連した遺伝子産物が生産され、そして該培養条件下で所 望の幹細胞の選択的再生産を起こす、方法。 ３８．幹細胞の単離および／または富化および／または増殖を可能にするように 適切な選択培養条件下で培養され得る動物細胞であって、該細胞が選択マーカー を含むことで特徴付けられ、ここで(a)所望の幹細胞および(b)所望の幹細胞以外 の細胞で該選択マーカーの特異な発現が、所望の幹細胞の選択的な生存または成 長を起こすことを可能にする、動物細胞。 ３９．請求項３８に記載の動物細胞であって、そして請求項１〜３７のいずれか に記載の細胞の特徴を包含する、動物細胞。 ４０．請求項１〜３７のいずれかに記載の方法により、幹細胞の単離および／ま たは増殖に適切な細胞供給源を包含する、トランスジェニック動物。 ４１．請求項１〜３７のいずれかに記載の方法により得られる細胞を用いて生産 される、トランスジェニック動物。 ４２．前記選択マーカーを含む細胞を有する、請求項４１に記載のトランスジェ ニック動物。 ４３．請求項４１に記載のトランスジェニック動物の子孫であって、該子孫の細 胞が前記選択マーカーを包含しない、子孫。 ４４．請求項１〜３１のいずれかに記載の細胞供給源としての使用に適切である ように、細胞の遺伝学的な改変に用いるためのベクターであって、該ベクターは 前記選択マーカーに対応する第一の遺伝子成分および第二の遺伝子成分を包含し 、該第二の遺伝子成分が、遺伝学的に改変された動物細胞で、該選択マーカーの 前記特異な発現を直接的にまたは非直接的に生じる、ベクター。 ４５．請求項４４に記載のベクターであって、発現ベクターの形態であり、前記 第二の遺伝子成分が、(a)幹細胞および(b)所望の幹細胞以外の細胞で特異に活性 化される制御配列を含む、ベクター。 ４６．前記制御配列がOct4プロモーターである、請求項４５に記載のベクター。 ４７．前記選択マーカーが抗生物質マーカーである、請求項４６に記載のベクタ ー。 ４８．前記抗生物質マーカーがネオマイシンホスホトランスフェラーゼである、 請求項４７に記載のベクター。 ４９．請求項４４〜４８のいずれかに記載のベクターであって、請求項１〜３７ にいずれかに記載の方法で使用するため の細胞の遺伝学的改変に用いる場合にゲノムに組み込まれない、ベクター。 ５０．請求項４４〜４８のいずれかに記載のベクターであって、前記第二の遺伝 子成分が、前記第一の遺伝子成分の少なくとも一部分をゲノムに特異的に組み込 むことを可能にする配列を包含する、ベクター。 ５１．認識配列、eg loxPまたはFRT部位をさらに含む、請求項４４〜５０のいず れかに記載のベクターであって、部位特異的組換えを介して組み込まれた構築物 の続いての切除を可能にする、ベクター。 ５２．請求項１〜３７のいずれかに記載の方法により得られる幹細胞を培養する 工程、および前記選択マーカーを続いて切除する工程を包含する、トランスジェ ニック動物を調製する方法。 ５３．トランスジェニック動物を調製する方法であって、該動物が、以下を包含 する幹細胞の単離および増殖に適切な細胞供給源を含む、方法： 胚盤胞を提供する工程； 該胚盤胞に動物細胞を導入する請求項３８〜３９のいずれかに記載の動物細胞 を提供する工程； レシピエントに胚盤胞を移す工程；および、胚をキメラ動物に発達させ、選択 マーカーの生殖系伝達を可能にする工程。
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