JP2002511246A - 系列特異性細胞および前駆体細胞 - Google Patents

系列特異性細胞および前駆体細胞

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Abstract

(57)【要約】 選択された系列の細胞について精製または富含化されている培養物を発生させる方法が記載され、その方法では、他の細胞中でのその発現と比べて、選択された系列の細胞において特異的に発現される選択性マーカーが、多型潜在性細胞に導入され、この多型潜在性細胞を、選択された系列の細胞への、または選択された系列の細胞を含む細胞の混合物への多型潜在性細胞の分化を誘発する、または、選択された系列の細胞の選択的生存を誘発するため培養する。次に、選択性マーカーを発現するこれらの細胞が選択される。選択された系列の前駆体細胞も、アッセイ技術における方法における用途とともに記載される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、系列特異性細胞および前駆体細胞、それらを取得する方法、および
その用途に関する。多能性胚幹（ＥＳ）細胞は生体外で分化させて、細胞外卵黄
包および全部で３つの胚芽層の誘導体を含んでなる、細胞型の混合物とすること
ができる。しかしながら、分化の無秩序かつ不均質な性質が、個々の系列の操作
および分析の障害となる。特に、本発明は、分化しているＥＳ細胞から神経前駆
体の精製個体群を確立するための系列特異性遺伝子選択技術を提供する。
【０００２】 （背景技術） 胚幹（ＥＳ）細胞は、マウスまたはヒトの胚、エピブラストにおける多能性確
立組織から直接誘導される形質転換されていない細胞系である（Ｅｖａｎｓおよ
びＫａｕｆｍａｎ、１９８１年；Ｍａｒｔｉｎ、１9８１年；Ｂｒｏｏｋおよび
Ｇａｒｄｎｅｒ、１９９７年；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年；Ｓｈａｍｂｌｏ
ｔｔら、１９９８年）。ＥＳ細胞は、複系列分化の性能を維持しつつ、生体内と
生体外の両方において、増殖および、高度に遺伝的な操作を施すことができる（
Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９８７年）。培養におけるＥＳ細胞の分化は、胚におけ
る分化事象を密接に反映する。従って、理論的には、ＥＳ細胞は、哺乳動物の胚
において細胞多様性を発生させる、有益かつ選択的なプロセスを生体外で研究す
る手段を提供する（Ｓｍｉｔｈ、１９９２年）。
【０００３】 ＥＳ細胞の複系列分化は、単純な集合により開始させることができる（Ｍａｒ
ｔｉｎおよびＥｖａｎｓ、１９７５年：Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８５年）
。集合は胚様体として知られている構造体を形成し、その分化は、直前ならびに
着床後初期のマウス胚形成を反映する（Ｍａｒｔｉｎら、１９７７年；Ｄｏｅｔ
ｓｃｈｍａｎら、１９８５年）。続いて、種々の細胞型が、胚様体からの成長に
おいて見出される（ＷｅｉｓｓおよびＯｒｋｉｎ、１９９６年）。特定の系列の
発現は、ジメチルスルホキシドまたはレチン酸（ＲＡ）による処理することで、
減少または増進させることができるが、分化産物は、常に、細胞型の混合物から
なっている。この内在的な無秩序および複雑さは、発育経路における遺伝子機能
の特定のために、生体外ＥＳ細胞分化の利用を制限していた。
【０００４】 幾つかの報告が、胚様体成長において神経細胞およびグリアの存在の証拠を提
供している（Ｂａｉｎ、１９９５年；Ｆｒａｉｃｈａｒｄら、１９９５年；Ｓｔ
ｒｕｂｉｎｇら、１９９５年；Ｏｋａｂｅら、１９９６年）。これは、神経発生
およびニューロンおよびグリア分化を調節する因子を検出、特定および操作する
ために利用することができる。ＥＳ細胞は、生化学的および機能研究のため、あ
るいは移植のための、正常または遺伝操作された神経細胞の供給源として用いる
こともできる。しかしながら、これらの目標は、培養物中の多量の非神経細胞に
より全くといって邪魔されることが課題であり、現在のところ、神経前駆体細胞
を主成分として含む培養物を確立または維持することは不可能であるという理由
からである。
【０００５】 すなわち、従来の技術は、任意の選択された系列の細胞の実質的に純粋な個体
群、および、特に選択された前駆体細胞を取得するための信頼性のある方法を提
供するに至っていない。
【０００６】 （発明の開示） 本発明は、前駆体細胞および／または選択された系列の分化細胞、そのような
細胞への因子の効果を調べる評価方法、および移植のようなそれらの細胞の用途
を提供することを目的とする。本発明は、さらに、培養物から非神経細胞を除去
するため、および分化性能のある神経前駆体の胚様体からの精製を可能とするた
めの、遺伝的選択技術を提供することを目的とする。
【０００７】 本発明は、二つの工程の組み合わせてなる、選択された系列の細胞の培養物を
取得する方法を提供する。一つの工程は、その系列の細胞に特徴的な遺伝子を発
現する細胞を選択するものである。他の工程は、細胞が、その系列の細胞に分化
またはその系列の細胞として増殖するに至るまで、細胞を培養するものである。
その結果は、選択された系列の細胞の、他の方法によって達成されたものよりも
、より高度に精製された培養物を産出することである。
【０００８】 一例として、組み合わせの一つの工程は、造血前駆体細胞において独自に発現
されることが知られている遺伝子を発現する細胞を選択することであり、他の工
程は、造血前駆体細胞への細胞分化を促進することが知られている栄養を含む培
地において細胞を培養することである。
【０００９】 従って、本発明は、選択された系列の細胞について、精製または富含化されて
いる培養物を発生させる方法であって、 （ｉ）他の細胞中におけるその発現と比べて、選択された系列の細胞中におい
て、特異的に発現される選択性マーカーを多型潜在性細胞に導入する工程、 （ｉｉ）多型潜在性細胞を培養することにより、（ａ）選択された系列の細胞
への、または選択された系列の細胞であるまたはそれを含む細胞の混合物への多
型潜在性細胞の分化、あるいは（ｂ）選択された系列の細胞の選択的な生存を誘
発する工程、および （ｉｉｉ）選択性マーカーを発現する細胞を選択する工程 を含んでなる方法を提供する。
【００１０】 この方法は、高純度の選択された系列の細胞、場合によっては、前駆体細胞を
取得する目的に適している。神経細胞を含む培養物へのＥＳ細胞の分化を誘発す
る従来技術の方法によれば、最大約５０％の神経前駆体細胞を提供することが可
能であるに過ぎないが、本発明の技術を用いれば、７０％を超える純度を得るこ
とができ、また、以下に記載の特定の態様においては、純度は実質的に１００％
である。
【００１１】 工程（ｉｉｉ）は、細胞の純粋な個体群、または所望の細胞について、少なく
とも僅かにさらなる精製または富含化されている混合培養物をもたらし、また、
選択された系列の前駆体細胞への細胞の分化を誘発する因子の存在下に多能性細
胞を培養することにより好適に実施することができる。一例として、神経前駆体
細胞に特異的な有糸分裂促進剤は線維芽細胞成長因子である。「因子」という用
語の範囲は、蛋白またはポリペプチド因子に限定するものでなく、任意の生物学
的に活性な分子あるいは生物学的に活性な可能性のある分子をも含む意味として
いる。
【００１２】 多型潜在性細胞は、胚幹（ＥＳ）細胞、胚芽（ＥＧ）細胞、胚性癌腫（ＥＣ）
細胞、胎細胞の一次培養物、新生細胞の一次培養物、および成体細胞の一次培養
物から選択することができる。この方法は、さらに、選択された系列の前駆体細
胞における遺伝子機能を評価する、あるいは、より移植に適するようにするべく
、細胞表現型を適合させる目的で、遺伝子を欠失、変異、置換または付加させる
ように、細胞を遺伝的に修飾することを含み得る。すなわち、細胞は、選択性マ
ーカーを多機能細胞系または目的とする細胞を含む一次培養物に導入し、次に、
目的とする細胞を選別することにより取得することもできる。場合によっては、
ＷＯ−Ａ−９４／２４２７４に記載の方法を好適に用いて、選択性マーカーは、
トランスジェニック動物を介するトランスフェクションまたはウイルス感染によ
り導入され、 次に、それから一次培養物を確立してもよい。
【００１３】 すなわち、本発明は、選択された系列の細胞の高度に富含化された個体群、特
に、全ての系列の前駆体細胞を取得することを、有利に可能とする。以下の例に
おいて、得られる個体群は実質的に１００％純粋であり、既知の前駆体細胞系列
の単一細胞の単離を可能とする。本発明は、細胞、特に、前駆体細胞の全ての系
列へ適用できる。Ｓｏｘ遺伝子を発現する細胞中で発現される選択性マーカーは
、神経前駆体細胞を引き出し；ＣＤ３４、ＣＤ４４およびＳＣＬ遺伝子は、造血
前駆体細胞の取得に、また、Ｎｋｘ２．５またはＧＡＴＡ−４遺伝子は心臓前駆
体細胞に適している。筋原性前駆体細胞を発生させるためには、Ｍｙｏ０または
ｍｙＥ５が適している。レチン酸の使用は、ＥＳ細胞の神経細胞への分化を誘発
し、ＤＭＳＯは、造血細胞への分化を誘発し、また、レチン酸の不存在は、心臓
前駆体細胞が富含化された個体群を誘発する。
【００１４】 この方法は、場合によっては、さらに、 （ｉｖ）選択された前駆体系列の細胞の分化により選択された下位系列の細胞
を形成した際、その選択された下位系列の細胞中において、他の細胞中における
その発現と比べて、特異的に発現される第二の選択性マーカーを多型潜在性細胞
に導入する工程、および （ｖ）選択された系列の前駆体細胞の培養物を取得した際、細胞の分化を許容
または誘発させ、かつ第二の選択性マーカーを発現する細胞を選択する工程 を含んでもよい。
【００１５】 本発明のこの形態は、細胞の得られる培養物の純度をさらに増進させ、また、
選択された系列の細胞は遺伝子を特異的に発現するものの、目標とされていない
細胞から僅かに異なる水準でしかない場合に有利である。
【００１６】 以下により詳細に説明する本発明の好ましい態様において、選択性マーカーは
、抗生物質耐性をコードする遺伝子であり、選択的マーカーを発現する細胞の選
択は、培地に抗生物質を導入することを含む。使用において、抗生物質の適用は
、マーカーを発現しない細胞を選択的に殺すまたは除去し、抗生物質耐性を発現
する細胞について、精製または富含化されている細胞の集団、すなわち選択され
た系列の生存細胞を後に残す。選択性マーカーを導入する、少なくとも２つの手
法が知られており、ともに本発明に適している。選択性マーカーは、選択された
系列の前駆体細胞において特異的に発現される遺伝子への、部位特異的な組み込
みまたは遺伝子トラッピングにより、多能性細胞中に導入することができる。そ
れにより、選択性マーカーの発現は、特異的に発現される遺伝子と所望のパター
ンにおいて機能的に連結される。選択的マーカーは、選択された系列の前駆体細
胞において特異的に発現される遺伝子の調節要素の制御下において発現される、
トランス遺伝子としてランダム組み込みを介して多能性細胞中に導入することも
できる。
【００１７】 選択性マーカーは、より一般的には、発現された際、マーカーを発現している
細胞の選択的生存をもたらすマーカーでもよく、抗生物質耐性がその一例である
。この場合、マーカーは、選択された系列の細胞において発現される。選択性マ
ーカーは、その発現により、マーカーを発現している細胞の選択的な殺傷をもた
らすマーカーであってもよい。その場合、マーカーは、選択された系列のもの以
外の細胞において発現される。
【００１８】 以下の事例に記載する発明の特定の態様において、多能性細胞は、ＥＳ、ＥＣ
またはＥＧ細胞であり、方法は、多能性細胞の分化；一例として、細胞からの胚
様体の形成、および細胞の分離を含む。一例において、トリプシンが用いられる
。それにより、個々の細胞を取得されるという利点がある。これらは全て、培地
に曝され、そして、隣接に付着することなく、細胞は、細胞の成長および／また
は分化のパターンに影響し、本発明による前駆体細胞の形成を妨害するかもれな
い細胞−細胞の影響から開放される。
【００１９】 腹部前駆体細胞について、精製または富含化されている培養物は、選択性マー
カーは神経前駆体細胞において特異的に発現され、また、第二の選択性マーカー
は腹部前駆体細胞において特異的に発現される際、本発明により取得することが
できる。この目的の第二の選択性マーカーは、好適には、Ｐａｘ６を発現する細
胞において特異的に発現される。
【００２０】 背部前駆体細胞について精製または富含化されている培養物は、選択性マーカ
ーは神経前駆体細胞において特異的に発現され、また、第二の選択性マーカーは
背部前駆体細胞において特異的に発現される際、本発明により取得することがで
きる。この目的の第二の選択性マーカーは、好適には、Ｐａｘ３を発現する細胞
において特異的に発現される。
【００２１】 本発明は、本発明の方法により取得することができる、選択された系列の細胞
、好ましくは前駆体細胞をも提供する。ある選択された細胞が前駆体細胞である
か否かに関して、今までの前駆体細胞の調製は、その確実性について、全く乏し
いものであった。前駆体細胞を実質的に１００％の純度で調製することが可能な
本発明による培養物を用いることで、単一の前駆体細胞の単離が達成される。
【００２２】 本発明は、さらに、細胞の大部分が選択された系列の前駆体細胞である、複数
の細胞を含む組成物を提供する。好ましくは、細胞の少なくとも６０％は、選択
された系列の前駆体細胞である。より好ましくは、細胞の少なくとも６０％は、
神経前駆体細胞である。さらに、本発明は、単離された神経前駆体細胞を提供す
る。
【００２３】 本発明の意味深い利用は、選択された前駆体細胞に対して有する効果について
、因子を評価する分野である。すなわち、本発明は、さらに、選択された系列の
前駆体細胞の培養物に対する因子の効果の評価法であって、 （ｉ）選択された系列の細胞中において、他の細胞中におけるその発現と比べ
て特異的に発現される選択性マーカーを多型潜在性細胞に導入する工程、 （ｉｉ）多型潜在性細胞を培養することにより、選択された系列の細胞を含む
細胞への、または細胞の混合物への多型潜在性細胞の分化を誘発させる、あるい
は、選択された系列の細胞の選択的生存を誘発させる工程、 （ｉｉｉ）選択性マーカーを発現する細胞を選択する工程、および （ｉｖ）それにより取得される選択された系列の細胞を、因子の存在下に培養
する工程 を含んでなるアッセイ方法を提供する。
【００２４】 このアッセイ方法は、好ましくは、選択性マーカーが前駆体細胞中において特
異的に発現される、選択された系列の前駆体細胞の培養物に対する因子の効果の
アッセイ方法である。このアッセイ方法において、「因子」の内容は、選択され
た系列の細胞の培養物に導入してもかなわない、実際に、あるいはおそらくは生
物学的に活性な何らかの分子を意味し、蛋白質およびポリペプチド因子に限定さ
れることを意味しない。この用語は、また、それより選択された系列の細胞の取
得がなされる、多能性細胞中に導入または改変される遺伝子も包含することを意
見している。つまり、このアッセイ方法は、関心のあるポリペプチドおよび／ま
たは蛋白因子あるいは小さな分子の効果と同様に、特定の遺伝子の効果について
の評価するためにも好適に利用できる。
【００２５】 この方法は、選択された系列の前駆体細胞に対して、因子が、増殖、成熟、毒
性または保護効果を有するか否か、あるいは、神経前駆体細胞ないしは、前駆体
の分化と選択の終了後に取得される他の分化細胞に対して、因子が、増殖、成熟
、細胞毒性またはグリア保護効果を有するか否か、その評価をするために用いる
こともできる。
【００２６】 選択された系列の末端分化細胞の個体群を取得すること、また、遺伝子ならび
に薬剤の選別スクリーニングのようなアッセイに利用することを可能とする点が
、このアッセイ方法の利点である。
【００２７】 さらに、移植のための、神経前駆体細胞、あるいは神経前駆体細胞を主要成分
として含む培養物が、本発明により提供される。以下の事例において、本発明の
神経前駆体細胞は、単離した上で、ラットの脳への移植に成功している。その神
経細胞は、場合によっては、ニューロン細胞またはグリア細胞とすることもでき
る。
【００２８】 この移植は、本発明の神経前駆体細胞から取得されるニューロン細胞を用いて
行うこともできる。精製されたニューロンを発生させるに適する方法は、選択性
マーカーは、Ｓｏｘ遺伝子を発現する細胞において特異的に発現される場合に本
発明の方法を用いて、神経前駆体細胞について精製された培養物を取得し、そし
て、前駆体細胞のニューロンへの分化に適した媒体の存在下に得られる前駆体細
胞を培養することを含む。精製されたグリア細胞を発生させるに適する方法は、
選択性マーカーは、Ｓｏｘ遺伝子を発現する細胞において特異的に発現される場
合に本発明の方法を用いて、神経前駆体細胞について精製された培養物を取得し
、そして、前駆体細胞のグリア細胞への分化に適した媒体の存在下に得られる前
駆体細胞を培養することを含む。
【００２９】 さらに、本発明は、神経退化疾患または神経／脳損傷を治療する目的の移植の
ための神経前駆体細胞；神経退化疾患または神経／脳損傷を治療する目的の移植
のための、ＥＳ細胞、ＥＣ細胞、ＥＧ細胞、胎細胞の一次培養物および新生細胞
の一次培養物から選択される細胞より取得可能な、移植用の神経前駆体細胞；神
経前駆体細胞を移植することを含んでなる、神経退化疾患または神経／脳損傷を
治療する方法；ならびに、本発明の方法に従って細胞を取得し、そして、１０％
ジメチルスルホキシドのような凍結保護物質の存在下に細胞を凍結させることを
含んでなる、保管のための神経前駆体細胞またはその分化された子孫を調製する
方法、をも提供する。
【００３０】 本発明の１つの態様において、選択／リポーター遺伝子、βｇｅｏは、神経板
および神経管における前駆体細胞において均一に発現されるｓｏｘ２遺伝子中に
相同組換えにより組み込まれた。ｓｏｘ２−標的化細胞の分化培養物へのＧ４１
８の適用は、βｇｅｏ−陽性生存細胞の効果的な単離をもたらした。これらの細
胞は、感覚上皮前駆体細胞のマーカーを発現した。これらは、種々のニューロン
・マーカーを発現した、ニューロン様細胞のネットワークへと効率的に分化した
。すなわち、哺乳動物神経分化の遺伝子的および分子的な区分のための生体外シ
ステムが、また、移植を含む機能研究のための、正常または遺伝的に改変された
神経前駆体ならびにニューロンの純粋な個体群を生産するための手順も、本発明
により提供される。さらに、本発明の系列選択の手順は、分化しているＥＳ細胞
培養物からの他の前駆体個体群の単離に応用することができる。
【００３１】 本発明は、さらに、選択された系列の前駆体細胞の精製された個体群を増幅す
る方法であって、有糸分裂促進剤および成長因子の存在下の培地に細胞を維持す
ることを含んでなる方法をも提供する。
【００３２】 前駆体細胞は、好ましくは、その遺伝子は、他の細胞中でのその発現と比べて
、前駆体細胞において特異的に発現される、選択性マーカーをコードする遺伝子
を含み、その方法は、さらに、その選択性マーカーを発現する細胞を選択するこ
とを含む。場合によっては、培養物を複数世代にわたって維持し、選択性マーカ
ーを発現する細胞を周期的に選択することできる。
【００３３】 場合によっては、培養物を複数世代にわたって維持し、選択性マーカーを発現
する細胞を連続的に選択することもできる。選択性マーカーが抗生物質耐性であ
る場合、方法は、抗生物質の存在下における連続培養を含んでもよい。
【００３４】 本発明を、添付の図面を参照して説明する。
【００３５】 図１は、４日培養におけるニューロンおよびグリアの形態および同定を示す。
【００３６】 図２は、０日細胞（２ａ−播種後４時間）およびＳｏｘ１抗体染色（２ｂ）の
位相差顕微鏡写真を示す：スケールバーは５０ミクロンである。
【００３７】 図３は、本発明による系列選択の手順を模式的に示す。
【００３８】 図４は、Ｇ４１８選択によるＳｏｘ２−陽性細胞に関して富含な培養物を示す
。
【００３９】 図５は、部位特異的神経前駆体マーカーの発現を示す。
【００４０】 図６は、ＦＧＦ−２に応答した生体外でのＳｏｘ２陽性細胞増殖を示す。
【００４１】 図７は、Ｓｏｘ２選択に続いて分化したＥＳ細胞誘導ニューロンを示す。
【００４２】 図８は、神経前駆体細胞に対するソニック・ヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ ｈｅ
ｄｇｅｈｏｇ）の効果のアッセイの結果を示す。 また、 図９は、子宮での移植後のＥＳ細胞誘導ニューロンを示す。
【００４３】 より詳しくは、図１は、培養第４日目におけるニューロンおよびグリアの形態
および同定を示す。Ｅ１４ＴＧ２ａ ＥＳ細胞を誘発して集合中で８日間分化さ
せ、Ｎ２を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２中にてポリ−Ｄ−リシン／ラミン基質上に播
種した。細胞を、培養４日後に、位相差光学顕微鏡で生きた状態で写真に撮った
。細胞の大部分はニューロン様であり、神経突起が細胞ネットワークに組み込ま
れている。（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ、抗−ＮＦＬ、抗−ＭＡＰ
２および抗−ＧＦＡＰで染色した培養物を示す。
【００４４】 図４において、 Ｓｏｘ２遺伝子中にβｇｅｏの部位特異的な挿入がなされて
いるＥＳ細胞は、培養により集合体（「胚様体」）として分化するように、誘発
された。４日後、それらを１０-6Ｍのレチン酸にさらに４日間曝した。次に、集
合体を分離させ、細胞を、Ｎ２を加えた血清非含有培地中でポリ−Ｄ−リシンお
よびラミニンを被覆した皿上に塗布した。培養物は、選択を施さない、またはＧ
４１８に、集合培養の後半の４８時間（ｂ，ｆ，ｈ，ｉ）、または塗布後の２４
時間（ｄ）曝した。
【００４５】 ａ． 塗布３時間後、非選択培養物中のＳｏｘ２連結β−ガラクトシダーゼの
発現。
【００４６】 ｂ． 塗布３時間後、Ｇ４１８選択培養物中のＳｏｘ２連結β−ガラクトシダ
ーゼの発現。
【００４７】 ｃ． 塗布２４時間後、非選択培養物中のＳｏｘ２連結β−ガラクトシダーゼ
の発現。
【００４８】 ｄ． 塗布２４時間後、Ｇ４１８選択培養物中のＳｏｘ２連結β−ガラクトシ
ダーゼの発現。
【００４９】 ｅ． 塗布３時間後、非選択培養物の抗Ｓｏｘ２による免疫染色。
【００５０】 ｆ． 塗布３時間後、Ｇ４１８選択培養物の抗Ｓｏｘ２による免疫染色。
【００５１】 ｇ． パネルｅのＤＡＰＩ対比染色。
【００５２】 ｈ． パネルｆのＤＡＰＩ対比染色。
【００５３】 ｉ． 塗布３時間後、Ｇ４１８選択培養物の抗ネスチン（緑色）および抗Ｓｏ
ｘ２（赤/橙色）による二重標識。
【００５４】 スケールバーは、（ａ，ｂ，ｃ，ｄ）について１００μｍ、（ｅ，ｆ，ｇ，ｈ
）について６６．７μｍ、および（ｉ）について５０μｍを示す。
【００５５】 図５において、Ｓｏｘ２発現細胞は、ＥＢ培養物中においてＧ４１８を用いて
２日間選択し、細胞を分離し、培養皿に３時間付着させてから、固定した。Ｐａ
ｘ３（ａ）、ｄｅｌｔａ−１（ｂ）、Ｍａｓｈ−１（ｃ）およびＭａｔｈ−４ａ
（ｄ）についての発現を、特定のアンチセンス・リボプローブを用いた、系内ハ
イブリダイゼーションにより検出し； Ｐａｘ６発現細胞の存在は、抗Ｐａｘ６
抗体による培養物の染色（ｅ）で検出し、培養物ｅは、ＤＡＰＩで二重標識（ｆ
）して、全ての細胞の核を着色した。スケールバー：１００μｍ。
【００５６】 図６について、８日間の神経分化の誘発に続き、細胞は、トリプシン処理によ
り分離し、低密度で塗布し、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦおよび２００μｇ／ｍｌ
のＧ４１８の存在下、Ｎ２培地を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。（ａ）
一晩培養；（ｂ）４日間培養。培養期間中、細胞数は約１０倍増加した。ｂＦＧ
Ｆの存在下に伸び広がった細胞は、Ｘ−ｇａｌ染色により示されるようにＳｏｘ
２発現を維持した。スケールバー：５０μｍ。
【００５７】 図７について、胚様体培養中にＧ４１８に４８時間曝すことにより選択された
Ｓｏｘ２発現細胞を塗布し、Ｎ２培地中、Ｇ４１８の存在下に、４８時間（ａお
よびｂ）または９６時間（ｃ−ｅ）、あるいは、７２時間、続いて、Ｂ２７補足
剤および２％ウマ血清を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地において、さらに７２
時間（ｆ−ｉ）成長させた（スケールバー：１００μｍ）。
【００５８】 ａ，ｂ． ニューロンマーカーβ−チュブリン３（ｂ）を発現する新たに分化
している細胞におけるＳｏｘ２（ａ）の抑制制御を示す二重免疫標識。
【００５９】 ｃ． ＞９０％の細胞のニューロン分化を示す、ヨー化プロピジウム対比染色
を用いるニューロンマーカーβ３−チュブリンについての免疫染色。
【００６０】 ｄ，ｅ． ニューロンマーカーシナプシン−１（ｄ）およびＭＡＰ２／Ｔａｕ
（ｅ）についての二重免疫標識。
【００６１】 ｆ． ＧＡＢＡについての免疫染色。
【００６２】 ｇ． ｆの視野の位相差像。
【００６３】 ｈ． グルタメートについての免疫染色。
【００６４】 ｉ． ｈの視野の位相差像。
【００６５】 図８において、ｇ４１８選択を受けているＣＣＥ−ｓｏｘ２ ＥＳ胚様体は、
表記される濃度の組換えソニック・ヘッジホッグ蛋白質に曝された。細胞を固定
し、分離の４８時間後、運動ニューロンマーカーislet１／２について免疫染色
した。
【００６６】 図９において、胚様体培養中にｇ４１８に曝すことにより選択されたｓｏｘ−
２発現細胞を分離し、ＰＫＨ２６−ＧＬ（Ｓｉｇｍａ製）で標識し、子宮中のＥ
１６ラット胎児の前脳小疱に注入した。次に、妊娠を満期まで進めた。新生児を
Ｐ２上で誅した。ビブラトーム（Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）部分を調製し、蛍光顕微
鏡検査により調べた。図は、典型的未成熟ニューロン形態を示す皮質中の代表的
なＰＫＨ２６−ＧＬ標識細胞を示す。この調査は、Ｓｏｘ２選択細胞が、脳に組
み込まれ分化し得ることを例示している。
【００６７】 ［材料および方法］ ［ＥＳ細胞培養物］ この研究で使用したＥＳ細胞系は：Ｅ１４ＴＧ２ａ（Ｈｏｏｐｅｒら、１９８
７年）、ＣＧＲ８（Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄら、１９９４年）、ならびに、その中の
Ｓｏｘ２遺伝子の１つのコピーが、相同組換えにより破壊されているＣＣＥの一
誘導体；ＣＣＥ−Ｓｏｘ２（Ｂｒａｄｌｅｙら、１９８４年）である。全てのＥ
Ｓ細胞系は、１０-4２−メルカプトエタノール、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）
および１００Ｕ／ｍｌ ＬＩＦを加えたＧｌａｓｇｏｗの改良Ｅａｇｌｅ’ｓ培
地（ＧＭＥＭ）中で、ゼラチン被覆組織培養プラスチック中に維持した（Ｓｍｉ
ｔｈ、１９９１年）。
【００６８】 ［分化の誘発］ 基本的プロトコールは、記載（Ｂａｉｎ、１９９５年）されたものに基づく。
ＥＳ細胞を、軽いトリプシン処理により小さな集塊とし、ＬＩＦの不存在下、懸
濁培地中で集合体形成させた。４日間培養後、全トランス−レチン酸（ＲＡ）を
１０-6Ｍの濃度で添加した。さらに４日間の後、集合体を、トリプシンとともに
インキュベーションと、粉砕により分離させた。細胞を、ポリ−Ｄ−リシンおよ
びラミニンを被覆した４−ウエル皿（Ｎｕｎｃ製）中で３×１０5細胞／ウエル
の密度で播種した。細胞培地は、Ｎ２、ならびに、特記する場合は、２％ウマ血
清を加えたＢ２７（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ製）で補った血清非含有ＤＭＥＭ／Ｆ１
２（５０／５０）であった。
【００６９】 ［基質調製］ 組織培養プレートは、ＰＢＳ中の濃度１０μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リシン（Ｐ
ＤＬ、３０〜７０ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ製）で、２０分間の予備被覆を施した。余
剰のＰＤＬを取り除き、プレートをＰＢＳで３回濯いだ後、ＰＢＳ中の濃度２〜
１０μｇ／ｍｌのラミニン（Ｓｉｇｍａ製）で、４℃、一晩の被覆を施した。
【００７０】 ［免疫細胞化学］ Ｓｏｘ１とＳｏｘ２についての染色は、ＭＥＭＦＡ（４％ホルムアルデヒド、
１００ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．４、２０ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4
）中で１時間、固定された培養物に対して行った。ＧＡＢＡならびにグルタメー
トに対する抗体で細胞を染色するため、細胞は、ＰＢＳ中、１％のグルタルアル
デヒド（Ｔｕｒｎｅｒ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）で固定した。他の細胞
内抗原の検出のために、培養物は、ＰＢＳ中、４％のパラホルムアルデヒド中で
１５分間、固定した。固定された細胞は、ＰＢＳで濯ぎ、ブロッキング緩衝液（
ＰＢＳ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および
１％ヤギ血清）と共に３０分間インキュベートし、続いて、ブロッキング緩衝液
中の一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。次に、細胞は、ＰＢＳで濯
ぎ、ブロッキング緩衝液中、種特異的な二次抗体と共に１時間インキュベートし
た。培養物は、ＰＢＳを３度交換して洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（
Ｖｅｃｔｏｒ）で封入し、蛍光顕微鏡下に観察した。
【００７１】 一次抗体の適当な組み合わせで、同時に細胞をインキュベートし、続いて、非
交差反応性二次抗体と共にインキュベートすることにより、二重標識実験を行っ
た。一部の実験においては、培養物は、それぞれ１ｎｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍ
ｌの濃度のヨー化プロピジウムまたはＤＡＰＩで、対比染色された。
【００７２】 以下の希釈率を、一次および二次抗体に対して用いた：ウサギ抗Ｓｏｘ１およ
び抗Ｓｏｘ２（１：５００）、ウサギ抗ＧＡＢＡ（１：２０００、Ｓｉｇｍａ製
）、ウサギ抗グルタメート（１：４０００、Ｓｉｇｍａ製）、マウス抗β−チュ
ブリン３（１：２００、Ｓｉｇｍａ製）；マウス抗ＮＦ６８（１：４００、Ｓｉ
ｇｍａ製）；ＭＡＰ２およびＴａｕと反応する、ウサギ抗ＭＡＰ（１：４００、
Ｓｉｇｍａ製）；マウス抗ＧＦＡＰ（１：４００、Ｓｉｇｍａ製）；マウス抗シ
ナプシン（１：５０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製）、マウス抗ネンチン（１：５０、Ｄ
ＳＨＢ製）、マウス抗Ｐａｘ６（１：１０、同上）、Ｃｙ３−共役ヤギ抗マウス
ＩｇＧ（１／５０、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ製）、ＦＩ
ＴＣ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１００、Ｓｉｇｍａ製）、ＦＩＴＣ−結合
ヤギ抗ウサギＩｇ（１：１００、Ｓｉｇｍａ製）、ＴＲＩＴＣ−結合ヤギ抗ウサ
ギＩｇ（１：５０、Ｓｉｇｍａ製）。
【００７３】 ［培養細胞の系内ハイブリダイゼーション］ プロトコールは、培養細胞に適合しているもの（ＲｏｓｅｎおよびＢｅｄｄｉ
ｎｇｔｏｎ、１９９３年）に基づく。簡単に説明すると、培養物は、４％パラホ
ルムアルデヒド中で固定し、１００％メタノール中、−２０℃で浸透した。次に
、細胞を、一連のメタノールにより再び水和し、最後に０．１％Ｔｗｅｅｎ−２
０を含むＰＢＳ中に入れた。前ハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液（５０％超純粋ホルムアミド、５×ＳＳＣ、ｐＨ４．５、５０ｍｇ／
ｍｌヘパリン、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡおよびｔＲＮＡ、０．１％Ｔ
ｗｅｅｎ−２０）中１〜４時間行い、１μｇ／ｍｌの濃度でジゴキシゲニン（Ｄ
ＩＧ）−標識プローブを、７０℃、一晩添加した。翌日、洗浄緩衝液（５０％ホ
ルムアミド、２×ＳＳＣ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中にて６５℃、３０分間
の洗浄を３回、ＴＢＳＴ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
、ｐＨ７．６、３ｍＭ ＫＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中にて５分間の洗
浄を３回、ならびに、１０％血清／ＴＢＳＴ中にて１時間のブロッキングをした
。次に、細胞は、アルカリ・ホスファターゼ結合抗−ＤＩＧ抗体（１：２０００
、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）と共に４℃で一晩インキュベー
トした。翌日、細胞は、ＴＢＳＴで１時間を３回、アルカリ・ホスファターゼ緩
衝液（ＡＰＢ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．５、５
０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０分間を３回の洗浄を行
った。アルカリ・ホスファターゼ染色反応は、ＡＰＢ中の４．５μｌ／ｍｌ Ｎ
ＢＴおよび３．５μｌ／ｍｌ ＢＣＩＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ製）を用いて、
３時間〜一晩進めた。
【００７４】 ［ＤＩＧ標識ＲＮＡプローブ］ リボプローブの鋳型として用いられるネズミｃＤＮＡは、５１９ｂｐ Ｐａ×
３フラグメント（Ｄｒ Ｒｏｓａ Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎにより提供）、７００
ｂｐ Ｄｅｌｔａ−１クローン（Ｄｒ Ｄｏｍｉｎｇｏｓ Ｈｅｎｒｉｑｕｅに
より提供）、６７０ｂｐ Ｍａｓｈ−１フラグメント、および１．５ｋｂ Ｍａ
ｔｈ−４Ａ ｃＤＮＡ（いずれも、Ｄｒ Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｇｕｉｌｉｅｍｏ
ｔにより提供）であった。ＤＮＡは、線状化し、そして、ＲＮＡ合成は、供給元
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）の推奨するようにＤＩＧ−標識ヌクレオチド混合物を
含めて、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて行った。産物は
、０．８％アガロースゲル上で分析し、約１μｇ／ｍｌのＤＩＧ−標識アンチセ
ンスＲＮＡは、用いて細胞ハイブリダイゼーションを行った。
【００７５】 ［β−ガラクトシダーゼの検出］ 細胞を、固定緩衝液（０．２％グルタルアルデヒド、０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ７．２、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＥＧＴＡ）中にて４℃で１０分間固
定し、洗浄緩衝液（０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．２、２ｍＭ ＭｇＣｌ2）
で３回洗浄した。次に、細胞は、洗浄緩衝液（Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎら、１９８
９年）中の１ｍｇ／ｍｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ（Ｘ−ｇａｌ）、４ｍＭフェリシアン化カリウム、４ｍＭフェ
ロシアン化カリウムと共に３７℃で一晩インキュベートした。
【００７６】 ［結果］ ［ＥＳ細胞からのニューロンおよびグリアの効率的発生］ 神経分化の誘発は、ＥＳ細胞を胚様体を形成するため懸濁液中で集合体形成さ
せ、レチン酸に曝し、次いで、基質上への再付着ならびに成長させるという、公
開された方法（Ｂａｉｎ、１９９５年；Ｆｒａｉｃｈａｒｄら、１９９５年）に
基づいた。これらの条件下、ニューロン様細胞が、種々の他の細胞型を伴ってい
るものの、成長において数日後の成長体中に明確となる。我々は、プロトコール
に２つの変更を導入し、それがニューロン細胞の最終的発現を増進した。第一は
、胚様体は、播種の前に分離した。これは、均質な分散をもたらし、また、速や
かに胚様体中における誘発的かつ選択的効果を停止させる。第二は、ニューロン
細胞の付着および成長を助ける、ポリ−Ｄ−リシンおよびラミニンで被覆した基
質上の確立されたニューロン培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｎ２）に播種した。これ
らの手順の各々は、培養物中の神経細胞の割合に好ましい効果を有していた。組
み合わせた際には、播種の４日後には、５０％を超える生存細胞が突起を伸ばし
ており、また、そこでは、ニューロンマーカーのニューロフィラメント軽鎖と重
鎖、ＭＡＰ２／ｔａｕまたはβチュブリンＩＩＩについて免疫反応性であった（
図１および図示しないデータ）。約２０％の細胞の少数部分は、アストロサイト
マーカーＧＦＡＰを発現した（図示せず）。３種の独立したＥＳ細胞系ならびに
幾つかのサブクローンを用いても、匹敵する結果が得られたので、この事象は、
明らかに、細胞系に特異的ではない。
【００７７】 しかしながら、これらの培養物中には、非神経細胞型も残留しており、しばし
ば、大きく平坦な非応答性細胞として確認された。任意の時点において、ＤＭＥ
Ｍ／Ｆ１２＋Ｎ２に、血清または有糸分裂促進剤（ＦＧＦ−２またはＢ２７補助
剤）を補うと、これらの非神経細胞は迅速に広がり、次第に主要な細胞型となっ
た。
【００７８】 ［Ｓｏｘ１／Ｓｏｘ２を発現する神経前駆体細胞の検出］ 分化したニューロンおよびグリアの高い割合での発生は、神経前駆体細胞は、
分化プロトコールにおける初期段階において検出が可能であることを示唆してい
た。図２ａは、播種から４時間後の代表的な培養物を示す。この段階では、細胞
は、形態的には区別できないようである。大部分の細胞の細胞体は、小さく、長
いまたは卵円形である。一部の細胞は、それらの細胞体と長さが同じくらいの短
い突起を有している。これらの形態的な特徴は、既に報告された一次神経前駆体
（Ｋａｌｙａｎｉら、１９９７年）と類似している。これらの細胞は、播種から
３時間後では、検出可能な量のＮＦ−ＬあるいはＧＦＡＰ３を発現していない。
一晩培養した後でも、集団の１％未満が、これらの２つのマーカーのいずれかが
陽性であった。
【００７９】 培養物を、感覚上皮細胞において発現される、中間体フィラメントであるネス
チン（Ｌｅｎｄａｈｌら、１９９０年）の存在について調べた。しかしながら、
殆ど全ての細胞がネスチン陽性であり、これはおそらく、ネスチンの発現は、感
覚上皮に厳格に限定されてはいない故である（Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄ、１９８５年
、＃８６８）。従って、我々は、より特異的なマーカーを探した。ＳＲＹ関連転
写因子Ｓｏｘ１は、神経板の感覚上皮に限定され、初期マウス胚において神経前
駆体細胞を分画する（Ｐｅｖｎｙ、非公開データ）。関連のＳｏｘ２遺伝子は、
床板および初期神経クレスト細胞も含む重複したパターンで発現される。Ｓｏｘ
１およびＳｏｘ２に対して創製された抗体による、新たに播種した細胞の免疫染
色は、細胞の４０〜５０％が陽性であることを示した（図２ｂおよび図３ｅ）。
これらの細胞は、おそらく神経前駆体細胞に相当する。
【００８０】 ［Ｓｏｘ２−発現神経前駆体細胞の選択および精製］ 神経前駆体細胞プールを単離するために、我々は、二官能性選択マーカー／リ
ポーター遺伝子βｇｅｏが、相同組換えによりＳｏｘ２遺伝子中に組み込まれて
いるＥＳ細胞（参照）を用いた。前述のように分化するように誘発された際、β
−ガラクトシダーゼ活性について染色された、これらの細胞の約５０％は、Ｓｏ
ｘ２蛋白質を発現する細胞の割合と一致する（図２および表１）。我々は、Ｓｏ
ｘ２陰性非神経細胞を除去するため、Ｇ４１８を分化している培養物に適用した
（図３）。
【００８１】 レチン酸誘発の後に、Ｇ４１８（２００μｇ／ｍｌ）を、胚様体培養中または
播種時に添加した。両方の条件において、評価できる程度の細胞死滅が見出され
た。しかしながら、生き残った細胞の大半が典型的な感覚上皮形状を示すことが
重要である。これらの細胞の９０％以上は、顕著なβガラクトシダーゼ染色を示
した（図４）。Ｓｏｘ２蛋白質発現との一致は、免疫染色により確認された（図
４、表１）。関連するＨＭＧ−ボックス因子Ｓｏｘ１、すなわち多能性神経板段
階細胞および神経管中ＣＮＳ制限前駆体の排他的マーカーは、大部分の細胞中で
検出することができた。ほぼ全ての生存細胞はネスチンを発現した。
【００８２】 ［Ｓｏｘ２選択細胞は、神経前駆体細胞に特異的なマーカーを発現する］ 中枢神経系の発生的組織形成および細分化は、遺伝子発現の一時的かつ空間的
パターニングにより制御される（ＴａｎａｂｅおよびＪｅｓｓｅｌｌ、１９９６
年）。胚軸性組織の不存在下における、ＥＳ細胞から達成される神経分化の多様
性を評価するために、我々は、重要な決定因子である、Ｐａｘ遺伝子および神経
性ｂＨＬＨ転写因子の発現を先ず調べた。
【００８３】 胚性神経管の長手方向の全体において、分裂している神経前駆体中に、対をな
すボックス転写因子Ｐａｘ３およびＰａｘ６が見出される。Ｐａｘ３は、当初、
神経板において発現され、次第に、神経管の背部半分に限定されていく（Ｌｉｅ
ｍら、１９９５年）。Ｐａｘ６は、主に神経管の腹部領域において発現される（
ＷａｌｔｈｅｒおよびＧｒｕｓｓ、１９９１年；ＴａｎａｂｅおよびＪｅｓｓｅ
ｌｌ、１９９６年）。両方のｐａｘ遺伝子の広範な発現が、播種の日に分析され
たｓｏｘ−２選択細胞において見出された（図５および表２）。これは、ＥＳ細
胞誘導神経前駆体は、腹部および背部の両方の形態を取り得ることを示唆する。
【００８４】 ｂＨＬＨ遺伝子、ｍａｓｈ１およびｍａｔｈ４Ａ（ニューロゲニン）は、神経
前駆体細胞の下位群にのみ、より限定された局在を示す。個々の発現は、ｓｏｘ
２選択培養物において確かに検出されたが、ｐａｘ遺伝子産物よりも明らかに少
ない細胞においてでった（図５、表２）。ｍａｓｈ１およびｍａｔｈ４Ａの発現
は、これらの２つの転写因子の分布は、大部分のＣＮＳ領域において相互に排他
的であるので（Ｇｒａｄｗｏｈｌら、１９９６年）、前駆体細胞の異なる下位個
体群の仕分けに適する。
【００８５】 ニューロン分化の２つの初期マーカーも検討した。ニューロン分化の直前に拘
束された細胞において見られる（参照）、ノッチ配位子δ１は、播種の直後では
、１〜２％の細胞においてのみ発現され、これは、細胞の大部分は、最終的な分
化へ未だ拘束されていないことを示している（議論の欄を参照）。運動ニューロ
ンおよび腹部介在ニューロンの分化の初期マーカーである、ＬＩＭ類似ドメイン
蛋白質 islet１／２（Ｅｒｉｃｓｏｎら、１９９２年）の発現を、播種から４
８時間後にＳｏｘ２選択培養物において調べた。再現性よく、１〜２％の細胞が
この段階において免疫反応性であった（図示せず）。
【００８６】 ［Ｓｏｘ２選択細胞がＦＧＦ−２に応答して増殖する］ 幾つかの研究が、基本的な線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）は、一次神経前
駆体細胞および不滅化された前駆体細胞系の増殖を助けることができることの証
拠を示している（Ｐａｌｍｅｒら、１９９７年）。Ｓｏｘ−２選択培養物へのＦ
ＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）の添加は、同様に、細胞増殖を刺激した。図６は、
ＦＧＦ−２の添加後の典型的なＸｇａｌ染色培養物を示す。全ての細胞が比較的
に分化していない形態を維持し、強力なＸｇａｌ染色を示すことがわかる。その
ような培養物は拡張し、少なくとも２週間、継続的に継代することができる。
【００８７】 ［Ｓｏｘ２選択細胞のニューロン分化］ Ｓｏｘ２選択前駆体細胞が、ニューロン分化の性能を維持するか否かを決める
ために、培地からＧ４１８を除去した。４８時間以内に、細胞は神経突起を伸ば
し始め、９６時間までに、ニューロン様細胞のネットワークが形成された（図７
）。β−ガラクトシダーゼ活性が大部分の細胞から失われ（図示せず）、ニュー
ロンの分化におけるＳｏｘ２の抑制制御（参照）と一致している。免疫染色は、
Ｓｏｘ２蛋白質の消失を確認した（図７ｂ）。Ｐａｎニューロンマーカー ニュ
ーロフィラメント軽鎖および重鎖（図示せず）、ミクロチューブル関連蛋白質（
ＭＡＰ／ｔａｕ）、β−チュブリンＩＩＩ（Ｌｅｅら、１９９０年）およびシナ
プシンＩは、４８時間以降に検出することができ、Ｓｏｘ２の抑制制御と一致し
ている。９６時間までに、９０％を超える細胞は、長い樹状突起を有しており、
ニューロンマーカーを発現した（図７）。培地にＢ２７およびウマ血清を補うと
、ニューロン細胞のさらなる成熟をおこし、樹状突起の増加した新規形成と、刺
激および抑制神経伝達物質であるＧＡＢＡおよびグルタメートの産生との両方に
より確認された（図７）。
【００８８】 哺乳動物神経系は、神経管の感覚上皮細胞およびその神経クレスト誘導体から
誘導される。神経発生中、これらの神経前駆体細胞は増殖し、次第にその多能性
を失い、種々のタイプの有糸分裂後ニューロンおよびグリア細胞へと最終的に分
化する［Ａｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３年、＃６７３、ＭｃＫａｙ、１９８９年、
＃６７２（ＴａｎａｂｅおよびＪｅｓｓｅｌｌ、１９９６年；ＭｃＫａｙ、１９
９７年）］。神経前駆体細胞の方向付けおよび分化に含まれる機構は、熱心な研
究の対象である。これは、しかしながら、哺乳動物胚の比較的入手困難さおよび
組織の複雑さのため、今まで妨げられてきた。感覚上皮細胞を誘導でき、また、
増殖ならびに分化させることができる、本発明の生体外モデル系は、神経の仕分
けおよび分化を決める内因性および外因性因子を研究するための強力な道具をも
提供する。
【００８９】 ＥＳ細胞は、キメラにおける全ての系列の移植により証明されたように、任意
の細胞型へと発育する能力を有する（ＢｅｄｄｉｎｇｔｏｎおよびＲｏｂｅｒｔ
ｓｏｎ、１９８９年）。しかしながら、生体外において、発生経路を分析するた
めにＥＳ細胞を用いる期待は、分化の制御または誘導の不可能さにより挫折して
いた。先に記載した本発明の態様において、発生している胚様体から、目的とす
る系列の前駆体を選択する手法が提供される。我々の結果は、Ｓｏｘ２遺伝子活
性による選択により、生存可能な神経前駆体を単離できることを示している。こ
れらの細胞は、誘発して、増殖またはニューロンへと分化させることができる。
従って、生体外での生存および神経系統の発生は、他の細胞型との連続的な相互
作用を必要としない。さらに、胚様体の分解を引き起こすことなく、かつ生存細
胞の発生を明らかに阻害することなく、多くの細胞成分を除去し得るという知見
は、驚くべきものであると共に、この手法を他の系列への応用を推進するもので
もある。実際、他の系列由来の細胞または同系列のより成熟した細胞のいずれか
である、分化誘発信号の供給源を除去することによる、特定の幹細胞個体群の維
持ならびに拡張に、そのような除去を利用することが可能である（Ｍｏｕｎｔｆ
ｏｒｄおよびＳｍｉｔｈからに私信）。
【００９０】 Ｓｏｘ２選択培養物中の決定遺伝子の異質な発現（図５）は、神経管中の前駆
体細胞の細分化を反映している。従って、個々の前駆体細胞型の誘発、成長およ
び分化に関する要件は、細胞外調節因子を培養系に添加すること、ならびに分化
前のＥＳ細胞に遺伝的な操作を施すことにより検討することができた。後者は、
特に、ホモ接合遺伝子の欠失または生体内でのトランス遺伝子発現が胚致死性を
引き起こす状況と関連する。加えて、遺伝的に修飾したニューロンを生成する可
能性は、ニューロン細胞生物学および生化学において多大な用途を見出す上で好
適である。
【００９１】 発生中の（Ｂｒｕｓｔｌｅら、１９９７年）あるいは、成体の（Ｄｅａｃｏｎ
ら、１９９８年）げっ歯類の脳に注入された分化ＥＳ細胞は、宿主神経系にコロ
ニーを形成し、成熟したニューロン表現型を発生できることが最近報告された。
しかしながら、そのような移植体は非ニューロン細胞をも含む。これらの異種細
胞は、奇形腫および他の良性または悪性成長物を発生させる可能性がある。これ
らは、栄養伝達、および宿主細胞から注入神経細胞への誘導信号を邪魔するかも
しれない。本発明により、神経前駆体を予め単離すると、これらの問題は排除さ
れる。さらに、系列選択の適用に続いて、精製された神経細胞を、生体外成熟の
任意の段階において得ることができ、移植のために採取することができる。
【００９２】 本発明は、移植における臨床使用のための、前記実施例のマウスＥＳ細胞と類
似しているヒト多様性幹細胞を開発する道を開く。パーキンソン病およびハンチ
ントン病のような神経退化症状は、細胞置換手段により治癒できる可能性があり
、移植可能な細胞の産生のための再生性幹細胞源の開発において、現に切迫して
いる状況である（ＳｖｅｎｄｓｅｎおよびＲｏｓｓｅｒ、１９９５年；Ｒｏｓｅ
ｎｔｈａｌ、１９９８年）。適当な指示因子と組み合わされる、系列選択の手法
は、多能性供給源からの所定の細胞個体群を発生を可能とする際、そのような系
の重要な構成要素である。
【００９３】
【表１】
【００９４】 参考文献
【００９５】
【表２】
【００９６】
【表３】
【００９７】
【表４】
【００９８】
【表５】
【００９９】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、４日培養におけるニューロンおよびグリアの形態および同定を示す。
【図２】 図２は、０日細胞（２ａ−播種後４時間）およびＳｏｘ１抗体染色（２ｂ）の
位相差顕微鏡写真を示す：スケールバーは５０ミクロン。
【図３】 図３は、本発明による系列選択の手順を模式的に示す。
【図４】 図４は、Ｇ４１８選択によるＳｏｘ２−陽性細胞の富含化培養物を示す。
【図５】 図５は、部位特異的神経前駆体マーカーの発現を示す。
【図６】 図６は、ＦＧＦ−２に応答した生体外でのＳｏｘ２陽性細胞増殖を示す。
【図７】 図７は、Ｓｏｘ２選択に従う、分化したＥＳ細胞誘導ニューロンを示す。
【図８】 図８は、神経前駆体細胞に対するソニック・ヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ ｈｅ
ｄｇｅｈｏｇ）の効果のアッセイの結果を示す。
【図９】 図９は、子宮への移植後のＥＳ細胞誘導ニューロンを示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年７月４日（２０００．７．４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 リー、マング イギリス国 イーエイチ９ ３ジェイキュ ー エディンバラ ウエスト メーンズ ロード ザ キングス ビルディングス センター フォー ジノム リサーチ （番地なし) Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA02 DA02 FA10 GA11 GA18 4B063 QA05 QQ08 QQ35 QR56 QR68 QR69 QR80 QS05 QS24 QS34 QS36 QS38 QX01 4B065 AA90X AB01 AC10 AC14 BA02 BA25 BB37 CA44 CA46

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 選択された系列の細胞が精製または富含化されている培養物
    を発生させる方法であって、 Ａ （ｉ）選択された系列の細胞中において、他の細胞中におけるその発現と比べ
    て、特異的に発現される選択性マーカーを多型潜在性細胞に導入する工程、 （ｉｉ）多型潜在性細胞を培養することにより、選択された系列の細胞への、
    または選択された系列の細胞を含む細胞の混合物への多型潜在性細胞の分化を誘
    発させる、あるいは、細胞の混合培養物における、選択された系列の選択的生存
    を誘発する工程、および （ｉｉｉ）選択性マーカーを発現する細胞を選択する工程 を含んでなる方法。
  2. 【請求項２】 選択された系列の前駆体細胞が富含化または精製されている
    培養物を発生させる請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 多型潜在性細胞が、胚幹（ＥＳ）細胞、胚芽（ＥＧ）細胞、
    胚性癌腫（ＥＣ）細胞、胎細胞の一次培養物、新生細胞の一次培養物、および成
    体細胞の一次培養物から選択される請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 （ｉ）選択された系列の前駆体細胞にいて、遺伝子機能を評
    価する、および／または（ｉｉ）選択された細胞をより移植に適しているように
    する目的で、遺伝子を欠失、変異、置換または付加させる多型潜在性細胞の遺伝
    的な修飾を含んでなる、請求項１、２または３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 （ｉｖ）選択された前駆体系列の細胞の分化により選択され
    た下位系列の細胞を形成した際、その選択された下位系列の細胞中において、他
    の細胞中におけるその発現と比べて、特異的に発現される第二の選択性マーカー
    を多型潜在性細胞に導入する工程、および （ｖ）選択された系列の前駆体細胞の培養物を取得した際、細胞の分化を許容
    または誘発させ、かつ第二の選択性マーカーを発現する細胞を選択する工程 をさらに含んでなる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】 選択性マーカーは、部位特異的組み込みまたはランダム遺伝
    子トラップ組み込みにより多型潜在性細胞中に導入され、選択された系列の前駆
    体細胞において特異的に発現される遺伝子と機能的に結合させる、請求項１〜５
    のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 選択性マーカーは、トランス遺伝子のランダム組み込みを介
    して多型潜在性細胞中に導入され、選択性マーカーは、選択された系列の前駆体
    細胞において特異的に発現される遺伝子と機能的に結合されている、請求項１〜
    ５のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 多型潜在性細胞は、ＥＳ、ＥＧまたはＥＣ細胞であり、方法
    は、胚様体を形成する、または細胞の分化を誘発することを含んでなる請求項１
    〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 分化細胞は、実質的に個々の細胞からなる培養物を形成する
    ように分離される請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 胚様体の分化細胞は、トリプシンのようなプロテアーゼを
    用いて分離される請求項８または９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 神経前駆体細胞について、精製または富含化されている培
    養物を発生させるために、神経前駆体細胞において特異的に発現される選択性マ
    ーカーを多型潜在性細胞中に導入することを含んでなる請求項１〜１０のいずれ
    かに記載の方法。
  12. 【請求項１２】 選択性マーカーは、Ｓｏｘ遺伝子を発現する細胞中におい
    て発現される請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 Ｓｏｘ遺伝子は、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２およびＳｏｘ３から
    選択される請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 心臓前駆体細胞を発生させるために、選択性マーカーを、
    Ｎｋｘ２．５またはＧＡＴＡ−４遺伝子を発現する細胞中において発現させるこ
    とを含んでなる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
  15. 【請求項１５】 造血前駆体細胞について、精製または富含化されている培
    養物を発生させるための請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
  16. 【請求項１６】 選択性マーカーは、ＣＤ３４、ＣＤ４４またはＳＣＬを発
    現する細胞中において発現される請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 選択性マーカーは抗生物質耐性遺伝子であり、方法は、抗
    生物質の存在下における培養を含んでなる請求項１〜１６のいずれかに記載の方
    法。
  18. 【請求項１８】 請求項１〜１７のいずれかに記載の方法により取得するこ
    とができる、選択された系列の前駆体細胞。
  19. 【請求項１９】 複数種の細胞を含んでなり、その細胞の大部分が選択され
    た系列の前駆体細胞である組成物。
  20. 【請求項２０】 細胞の少なくとも６０％が選択された系列の前駆体細胞で
    ある請求項１９に記載の組成物。
  21. 【請求項２１】 細胞の少なくとも６０％が神経前駆体細胞である請求項１
    ９または２０に記載の組成物。
  22. 【請求項２２】 単離された神経前駆体細胞。
  23. 【請求項２３】 選択性マーカーは神経前駆体細胞において特異的に発現さ
    れ、第二の選択性マーカーは腹部前駆体細胞において特異的に発現されることを
    特徴とする、腹部前駆体細胞について、精製または富含化されている培養物を取
    得するための請求項５に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 第二の選択性マーカーは、Ｐａｘ６を発現する細胞におい
    て特異的に発現される請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 選択された系列の前駆体細胞の培養物に対する因子の効果
    の評価法であって、 Ａ （ｉ）選択された系列の細胞中において、他の細胞中におけるその発現と比べ
    て、特異的に発現される選択性マーカーを多型潜在性細胞に導入する工程、 （ｉｉ）多型潜在性細胞を培養することにより、選択された系列の細胞への、
    または選択された系列の細胞を含む細胞の混合物への多型潜在性細胞の分化を誘
    発させる、あるいは、細胞の混合培養物における、選択された系列の選択的生存
    を誘発する工程、および （ｉｉｉ）選択性マーカーを発現する細胞を選択する工程、 ならびに Ｂ それにより取得される、選択された系列の前駆体細胞を、因子の存在下に培養
    する工程 を含んでなるアッセイ方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２〜１７のいずれかに従うことを特徴とする請求項
    ２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 因子が、選択された系列の前駆体細胞に対して、増殖、成
    熟、毒性または保護効果を有するか否かを評価するための請求項２５または２６
    に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 因子が、神経前駆体細胞に対して、増殖、成熟、細胞毒性
    またはグリア保護効果を有するか否かを評価するための請求項２７に記載の方法
    。
  29. 【請求項２９】 移植のための、神経前駆体細胞、または神経前駆体細胞を
    主用部分として含む培養物。
  30. 【請求項３０】 神経前駆体細胞がニューロン細胞である請求項２９に記載
    の細胞。
  31. 【請求項３１】 神経前駆体細胞がグリア細胞である請求項２９に記載の細
    胞。
  32. 【請求項３２】 神経前駆体細胞またはその分化した子孫を保管のために調
    製する方法であって、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法においてその細胞
    を取得し、その細胞を凍結保護物質の存在下に凍結させることを含んでなる方法
    。
  33. 【請求項３３】 精製されたニューロンを発生させる方法であって、Ｓｏｘ
    遺伝子を発現する細胞において選択性マーカーが特異的に発現される請求項１〜
    １７のいずれかに記載の方法を用いて、神経前駆体細胞について精製された培養
    物を取得すること、および前駆体細胞のニューロンへの分化に適した媒体の存在
    下に得られた前駆体細胞を培養することを含んでなる方法。
  34. 【請求項３４】 神経退化疾患または神経／脳損傷を治療するための移植の
    ための神経前駆体細胞。
  35. 【請求項３５】 神経退化疾患または神経／脳損傷を治療するための移植の
    ための、ＥＳ細胞、ＥＣ細胞、ＥＧ細胞、胎細胞の一次培養物、新生細胞の一次
    培養物、および成体細胞の一次培養物から選択される細胞から取得することが可
    能である、移植のための神経前駆体細胞。
  36. 【請求項３６】 神経前駆体細胞を移植することを含んでなる、神経退化疾
    患または神経／脳損傷を治療する方法。
  37. 【請求項３７】 選択された系列の前駆体細胞の精製済み個体群を増幅する
    方法であって、有糸分裂促進剤および成長因子の存在下の培地に細胞を維持する
    ことを含んでなる方法。
  38. 【請求項３８】 他の細胞中におけるその発現と比べて、前駆体細胞中にお
    いて特異的に発現される遺伝子である、選択性マーカーをコードする遺伝子を前
    駆体細胞が含み、かつ、方法は、選択性マーカーを発現する細胞を選択すること
    をさらに含んでなる、請求項３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 方法が、培養物を複数世代にわたって維持しつつ、選択性
    マーカーを発現する細胞を周期的に選択することを含んでなる請求項３８に記載
    の方法。
  40. 【請求項４０】 方法が、培養物を複数世代に渡って維持し、選択性マーカ
    ーを発現する細胞を連続的に選択することを含んでなる請求項３８に記載の方法
    。
  41. 【請求項４１】 選択性マーカーが抗生物質耐性であり、方法が、抗生物質
    の存在下における連続培養を含んでなる請求項４０に記載の方法。
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