ES2938049T3 - Inducción de células pluripotentes - Google Patents

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Abstract

La cinética lenta y la baja eficiencia de los métodos de reprogramación para generar células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) imponen importantes limitaciones a su utilidad en aplicaciones biomédicas. Aquí describimos un enfoque químico que mejora drásticamente (> 200 veces) la eficiencia de la generación de iPSC a partir de fibroblastos humanos, dentro de los siete días de tratamiento. Esto proporcionará una base para desarrollar métodos no virales más seguros y eficientes para reprogramar células somáticas humanas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inducción de células pluripotentes
Antecedentes de la invención
Avances recientes en la generación de células madre pluripotentes inducidas humanas (ipsc) (takahashi, k. Y otros, cell 131, 861-72 (2007); yu, j. Y otros, science 318, 1917-20 (2007); muller, l.u.w., y otros, mol. Ther. 17, 947-53 (2009)) han despertado esperanzas acerca de su utilidad en la investigación biomédica y en las aplicaciones clínicas. Sin embargo, la generación de ipsc es aún un proceso muy lento (~4 semanas) e ineficaz (<0,01 % (takahashi, k. Y otros, cell 131, 861-72 (2007); yu, j. Y otros, science 318, 1917-20 (2007)) que resulta en una población heterogénea de células. La identificación de ipsc completamente reprogramadas a partir de una mezcla de este tipo es tediosa y requiere experiencia específica en cultivo de células pluripotentes humanas. D. A. Claassen y otros (2009) molecular reproduction & development 76:722-732 describe que la inhibición de rock mejora la recuperación y el crecimiento de células madre embrionarias humanas crioconservadas y de células madre pluripotentes inducidas humanas. El documento us 2008/0066197 describe células pluripotentes a partir de rata y otras especies.
Aunque se están superando los peligros de la inserción genómica de factores de reprogramación exógenos, la baja eficacia y la cinética lenta de la reprogramación continúa presentando un problema tremendo para las aplicaciones finales de ipsc humana. Por ejemplo, podría ocurrir un aumento en las anomalías genéticas o epigenéticas durante el proceso de reprogramación, donde pueden inhibirse los supresores de tumores y pueden activarse las vías oncogénicas. Aunque estudios recientes han informado una eficacia mejorada de la reprogramación mediante manipulaciones genéticas (feng, b. Y otros cell stem cell 4, 301-12 (2009)) además de los cuatro factores originales, tales manipulaciones típicamente hacen el proceso incluso más complejo y aumentan el riesgo de alteraciones genéticas y tumorigenicidad. Por lo tanto, todavía existe una gran necesidad de un procedimiento más seguro, más fácil y más eficaz para la generación de ipsc humanas y facilitar la identificación y caracterización de los mecanismos fundamentales de reprogramación.
Breve resumen
La presente invención proporciona un uso ex vivo de una combinación de inhibidores para inducir pluripotencia en una o más células de mamífero no pluripotentes en una mezcla que comprende: (i) una o más células de mamífero no pluripotentes; y (ii) la combinación de inhibidores, en donde dicha combinación comprende: un inhibidor de alk5; un inhibidor de mek; y un inhibidor de rock. Se proporciona, además, un uso ex vivo de una composición que comprende una combinación de inhibidores para inducir pluripotencia en una o más células de mamífero no pluripotentes, en donde dicha combinación de inhibidores comprende: un inhibidor de alk5, un inhibidor de mek y un inhibidor de rock. Se proporciona, además, un método in vitro o ex vivo para inducir células de mamífero no pluripotentes a células madre pluripotentes inducidas, que comprende: poner en contacto las células de mamífero no pluripotentes con una combinación de inhibidores para inducir pluripotencia en condiciones suficientes para inducir células de mamífero no pluripotentes a células madre pluripotentes inducidas, en donde dicha combinación de inhibidores comprende: un inhibidor de alk5, un inhibidor de mek y un inhibidor de rock.
Resumen de la descripción adicional
Además, en la presente descripción se describen mezclas (por ejemplo, útiles para inducir iPSC). La mezcla puede comprender:
células de mamífero;
un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5;
un inhibidor de MEK; y
un inhibidor de la vía Rho GTPasa/ROCK.
Al menos el 99 % de las células pueden ser células no pluripotentes. Todas o esencialmente todas las células pueden ser células no pluripotentes.
Las células pueden ser células humanas.
El inhibidor del receptor de TGFp/ALK5 puede ser SB431542.
El inhibidor de MEK puede ser PD0325901.
El inhibidor de ROCK puede ser un compuesto que tiene la fórmula:
Figure imgf000003_0001
el anillo A es un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
el anillo B es un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
L1 es -C(O)-NR2- o -C(O)-NR2-;
L2 es un enlace, alquileno sustituido o no sustituido o heteroalquileno sustituido o no sustituido; y
R1 y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
El inhibidor de ROCK puede tener la fórmula:
Figure imgf000003_0002
en donde, y es un número entero de 0 a 3; z es un número entero de 0 a 5; X es -N=, -CH= o -CR5=; R3, R4 y R5 son independientemente CN, S(O)nR6, NR7R8, C(O)R9, NR10-C(O)R11, NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un número entero de 0 a 2, en donde si z es mayor que 1, dos porciones R3 se unen opcionalmente para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido; y R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 y R19 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido.
El inhibidor de ROCK puede tener la fórmula:
Figure imgf000003_0003
Figure imgf000004_0002
El inhibidor de ROCK puede ser
Figure imgf000004_0001
La concentración de los inhibidores puede ser suficiente para mejorar en al menos un 10 % la eficacia de inducción de células no pluripotentes en la mezcla a células madre pluripotentes inducidas cuando la mezcla se somete a condiciones suficientes para inducir la conversión de las células a células madre pluripotentes inducidas.
La mezcla puede comprender, además, un inhibidor de GSK3 y/o un inhibidor de HDAC.
Los polipéptidos pueden seleccionarse a partir de Oct-3/4, Sox2, KLF4 y c-Myc. Las células pueden seleccionarse a partir de células humanas, células animales no humanas, células de ratón, primates no humanos u otras células animales.
Además, se describen métodos para inducir células de mamífero no pluripotentes a células madre pluripotentes inducidas. El método puede comprender
poner en contacto células no pluripotentes con:
un inhibidor del receptor de TGF0/ALK5;
un inhibidor de MEK; y
un inhibidor de ROCK,
en condiciones suficientes para inducir al menos a algunas células a convertirse en células madre pluripotentes. Las condiciones pueden comprender la introducción de al menos un factor de transcripción exógeno en las células no pluripotentes. El al menos un factor de transcripción exógeno puede ser un polipéptido Oct y las células pueden ponerse en contacto adicionalmente con un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC).
El factor de transcripción puede seleccionarse a partir del grupo que consiste en un polipéptido Oct, un polipéptido Klf, un polipéptido Myc y un polipéptido Sox.
El método puede comprender la introducción de al menos dos, tres o cuatro factores de transcripción exógenos en las células no pluripotentes, en donde los factores de transcripción se seleccionan a partir del grupo que consiste en un polipéptido Oct, un polipéptido Klf, un polipéptido Myc y un polipéptido Sox. Los polipéptidos pueden seleccionarse a partir de Oct-3/4, Sox2, KLF4 y c-Myc. Las células pueden seleccionarse a partir de células humanas, células animales no humanas, células de ratón, primates no humanos u otras células animales.
El al menos un factor de transcripción puede introducirse mediante la introducción de un polinucleótido en las células no pluripotentes, en donde el polinucleótido codifica al menos un factor de transcripción exógeno, de esta manera se expresan los factores de transcripción en las células.
El al menos un factor de transcripción puede introducirse mediante el contacto de un polipéptido exógeno con las células no pluripotentes, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del factor de transcripción, en donde la introducción se realiza en condiciones para introducir el polipéptido en las células. El polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos que potencia el transporte a través de las membranas celulares.
Las células pueden ser células humanas.
El inhibidor del receptor de TGF0/ALK5 puede ser SB431542.
El inhibidor de MEK puede ser PD0325901.
El inhibidor de ROCK puede ser un compuesto que tiene la fórmula:
Figure imgf000005_0001
el anillo A es un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
el anillo B es un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
L1 es -C(O)-NR2- o -C(O)-NR2-;
L2 es un enlace, alquileno sustituido o no sustituido o heteroalquileno sustituido o no sustituido; y
R1 y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido.
El inhibidor de ROCK puede tener la fórmula:
Figure imgf000005_0002
en donde, y es un número entero de 0 a 3; z es un número entero de 0 a 5; X es -N=, -CH= o -CR5=; R3, R4 y R5son independientemente CN, S(O)nR6, NR7R8, C(O)R9, NR10-C(O)R11, NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un número entero de 0 a 2, en donde si z es mayor que 1, dos porciones R3 se unen opcionalmente para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido; y R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R18 y R19son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido.
El inhibidor de ROCK puede tener la fórmula:
Figure imgf000005_0003
Figure imgf000006_0003
El inhibidor de ROCK puede ser
Figure imgf000006_0001
La concentración de los inhibidores puede ser suficiente para mejorar en al menos un 10 % la eficacia de la inducción de células no pluripotentes en la mezcla a células madre pluripotentes inducidas, cuando la mezcla se somete a condiciones suficientes para inducir la conversión de las células a células madre pluripotentes inducidas. La mezcla puede comprender, además, un inhibidor de GSK3.
Además, se describen kits para inducir pluripotencia en células de mamífero no pluripotentes. El kit puede comprender,
un inhibidor del receptor de TGF0/ALK5;
un inhibidor de MEK; y
un inhibidor de ROCK.
El inhibidor del receptor de TGF0/ALK5 puede ser SB431542.
El inhibidor de MEK puede ser PD0325901.
El inhibidor de ROCK puede ser un compuesto que tiene la fórmula:
Figure imgf000006_0002
el anillo A es un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
el anillo B es un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido;
L1 es -C(O)-NR2- o -C(O)-NR2-;
L2 es un enlace, alquileno sustituido o no sustituido o heteroalquileno sustituido o no sustituido; y
R1 y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
El inhibidor de ROCK puede tener la fórmula:
Figure imgf000007_0001
en donde, y es un número entero de 0 a 3; z es un número entero de 0 a 5; X es -N=, -CH= o -CR5=; R3, R4 y R5 son independientemente CN, S(O)nR6, NR7R8, C(O)R9, NR10-C(O)R11, NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un número entero de 0 a 2, en donde si z es mayor que 1, dos porciones R3 se unen opcionalmente para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido; y R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 y R19 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido.
El inhibidor de ROCK puede tener la fórmula:
Figure imgf000007_0002
El inhibidor de ROCK puede ser
Figure imgf000008_0001
El kit puede comprender, además, un inhibidor de GSK3 y/o un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC).
Definiciones
Un "polipéptido Oct" se refiere a cualquiera de los miembros naturales de la familia de factores de transcripción de unión a Octámeros, o variantes de estos que mantienen la actividad del factor de transcripción, similar (dentro de al menos 50 %, 80 % o 90 % de actividad) en comparación con el miembro de la familia de origen natural más cercano relacionado, o polipéptidos que comprenden al menos el dominio de unión al ADN del miembro de la familia de origen natural y pueden comprender, además, un dominio de activación transcripcional. Los polipéptidos Oct representativos incluyen Oct-1, Oct-2, Oct-3/4, Oct-6, Oct-7, Oct-8, Oct-9 y Oct-11. Por ejemplo, Oct3/4 (denominado en la presente descripción "Oct4") contiene el dominio POU, una secuencia de 150 aminoácidos conservada entre Pit-1, Oct-1, Oct-2 y uric-86. Ver, Ryan, A.K. & Rosenfeld, M.G. Genes Dev. 11, 1207-1225 (1997). Las variantes pueden tener al menos un 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos en toda su secuencia en comparación con un miembro de la familia de polipéptidos Oct de origen natural, tales como los enumerados anteriormente o tales como los enumerados en el número de acceso de Genbank NP_002692.2 (Oct4 humano) o NP_038661.1 (Oct4 ratón). Los polipéptidos Oct (por ejemplo, Oct3/4) pueden ser de humano, ratón, rata, bovino, porcinos u otros animales. Generalmente, se usará la misma especie de proteína con la especie de las células que se manipulan.
Un "polipéptido Klf" se refiere a cualquiera de los miembros de origen natural de la familia de factores similares a Krüppel (Klf), proteínas con dedos de zinc que contienen secuencias de aminoácidos similares a las del regulador del patrón embrionario de Drosophila Krüppel, o variantes del miembros de origen natural que mantienen una actividad del factor de transcripción similar (dentro de al menos un 50 %, 80 % o 90 % de actividad) en comparación con el miembro de la familia de origen natural más cercano relacionado, o polipéptidos que comprenden al menos el dominio de unión al ADN de la familia de origen natural y puede comprender, además, un dominio de activación transcripcional. Ver, Dang, D.T., Pevsner, J. & Yang, V.W.. Cell Biol. 32, 1103-1121 (2000). Los miembros de la familia Klf representativos incluyen, Klf1, Klf2, Klf3, Klf-4, Klf5, Klf6, Klf7, Klf8, Klf9, Klf10, Klf11, Klf12, Klf13, Klf14, Klf15, Klf16 y Klf17. Se descubrió que Klf2 y Klf-4 eran factores capaces de generar células iPS en ratones, y los genes relacionados Klf1 y Klf5 también lo hacían, aunque con una eficacia reducida. Ver, Nakagawa, y otros, Nature Biotechnology 26:101 - 106 (2007). Las variantes pueden tener al menos un 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos en toda su secuencia en comparación con un miembro de la familia de polipéptidos Klf de origen natural, tales como como los enumerados anteriormente o tales como los enumerados en el número de acceso de Genbank CAX16088 (Klf4 ratón) o CAX14962 (Klf4 humano). Los polipéptidos Klf (por ejemplo, Klf1, Klf4 y Klf5) pueden ser de humano, ratón, rata, bovino, porcino u otros animales. Generalmente, se usará la misma especie de proteína con la especie de las células que se manipulan. En la medida en que se describe un polipéptido Klf en la presente descripción, puede reemplazarse con un polipéptido del receptor beta relacionado con estrógenos (Essrb). Por lo tanto, se pretende que para cada uso de un polipéptido Klf descrito en la presente descripción, se describa igualmente un uso correspondiente de Essrb en lugar de un polipéptido Klf4.
Un "polipéptido Myc" se refiere a cualquiera de los miembros de origen natural de la familia Myc (ver, por ejemplo, Adhikary, S. & Eilers, M. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6:635-645 (2005)), o variantes de estos que mantienen una actividad del factor de transcripción similar (dentro de al menos un 50 %, 80 % o 90 % de actividad) en comparación con el miembro de la familia de origen natural más cercano relacionado, o polipéptidos que comprenden al menos el dominio de unión al ADN del miembro de la familia de origen natural y puede comprender, además, un dominio de activación transcripcional. Los polipéptidos Myc representativos incluyen, por ejemplo, c-Myc, N-Myc y L-Myc. Las variantes pueden tener al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 85 %, 90 % o 95 % en toda su secuencia en comparación con un miembro de la familia de polipéptidos Myc de origen natural, tales como los enumerados anteriormente o tales como los enumerados en el número de acceso de Genbank CAA25015 (Myc humano). Los polipéptidos Myc (por ejemplo, c-Myc) pueden ser de humano, ratón, rata, bovino, porcino u otros animales. Generalmente, se usará la misma especie de proteína con la especie de las células que se manipulan.
Un "polipéptido Sox" se refiere a cualquiera de los miembros de origen natural de los factores de transcripción HMG-box (Sox) relacionados con SRY, caracterizados por la presencia del dominio del grupo de alta movilidad (HMG), o variantes de estos que mantienen la actividad del factor de transcripción similar (dentro de al menos 50 %, 80 % o 90 % de actividad) en comparación con el miembro de la familia de origen natural más cercano relacionado, o polipéptidos que comprenden al menos el dominio de unión al ADN del miembro de la familia de origen natural y pueden comprender, además, un dominio de activación transcripcional. Ver, por ejemplo, Dang, D.T., y otros, Int. J. Biochem. Cell Biol. 32:1103-1121 (2000). Los polipéptidos Sox representativos incluyen, por ejemplo, Sox1, Sox-2, Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, Sox10, Sox11, Sox12, Sox13, Sox14, Sox15, Sox17, Sox18, Sox-21 y Sox30. Se ha demostrado que Sox1 produce células iPS con una eficacia similar a Sox2, y se ha demostrado, además, que los genes Sox3, Sox15 y Sox18 generan células iPS, aunque con algo menos de eficacia que Sox2. Ver, Nakagawa, y otros, Nature Biotechnology 26:101 - 106 (2007). Las variantes pueden tener al menos un 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos en toda su secuencia en comparación con un miembro de la familia de polipéptidos Sox de origen natural, tales como los enumerados anteriormente o tales como los enumerados en el número de acceso de Genbank CAA83435 (Sox2 humano). Los polipéptidos Sox (por ejemplo, Sox1, Sox2, Sox3, Sox15 o Sox18) pueden ser de humano, ratón, rata, bovino, porcino u otros animales. Generalmente, se usará la misma especie de proteína con la especie de las células que se manipulan.
"H3K9" se refiere a la histona H3 lisina 9. Las modificaciones de H3K9 asociadas con la actividad del gen incluyen la acetilación de H3K9 y las modificaciones de H3K9 asociadas con la heterocromatina, incluyen la dimetilación o trimetilación de H3K9. Ver, por ejemplo, Kubicek, y otros, Mol. Cell473-481 (2007).
El término "pluripotente" o "pluripotencia" se refiere a células con la capacidad de dar lugar a una progenie de células que pueden diferenciarse, en las condiciones apropiadas, en tipos de células que colectivamente demuestran características asociadas con linajes celulares de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las células madre pluripotentes pueden contribuir a todos los tejidos derivados de embriones de un animal prenatal, posnatal o adulto. Puede usarse una prueba estándar aceptada en la técnica, tal como la capacidad de formar un teratoma en ratones SCID de 8 a 12 semanas de edad, para establecer la pluripotencia de una población celular; sin embargo, puede usarse, además, la identificación de varias características de células madre pluripotentes para detectar células pluripotentes.
Las "características de las células madre pluripotentes" se refieren a las características de una célula que distinguen a las células madre pluripotentes de otras células. La capacidad de dar lugar a una progenie que pueda diferenciarse, en las condiciones apropiadas, en tipos de células que demuestren colectivamente características asociadas con linajes celulares de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo) es una característica de las células madre pluripotentes. La expresión o no expresión de determinadas combinaciones de marcadores moleculares también son características de las células madre pluripotentes. Por ejemplo, las células madre pluripotentes humanas expresan al menos alguno y, en algunos casos, todos los marcadores de la siguiente lista no limitante: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-caderina, UTF-1, Oct4, Rex1, y Nanog. Las morfologías celulares asociadas con las células madre pluripotentes también son características de las células madre pluripotentes.
Como se usa en la presente descripción, "células no pluripotentes" se refiere a células de mamífero que no son células pluripotentes. Los ejemplos de tales células incluyen células diferenciadas así como también células progenitoras. Los ejemplos de células diferenciadas incluyen, pero no se limitan a, células de un tejido seleccionado a partir de médula ósea, piel, músculo esquelético, tejido adiposo y sangre periférica. Los tipos de células representativas incluyen, pero no se limitan a, fibroblastos, hepatocitos, mioblastos, neuronas, osteoblastos, osteoclastos y células T.
Cuando se va a tratar a un individuo con las células pluripotentes resultantes, pueden usarse las propias células no pluripotentes del individuo para generar células pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción.
Las células pueden ser de, por ejemplo, humanos o mamíferos no humanos. Los mamíferos no humanos representativos incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, gatos, perros, conejos, cobayos, hámsteres, ovejas, cerdos, caballos, bovinos y primates no humanos (por ejemplo, chimpancés, macacos y simios).
Un polinucleótido "recombinante" es un polinucleótido que no está en su estado natural, por ejemplo, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que no se encuentra en la naturaleza, o el polinucleótido está en un contexto diferente al que se encuentra naturalmente, por ejemplo, separado a partir de secuencias de nucleótidos con las que normalmente está en proximidad en la naturaleza, o secuencias de nucleótidos adyacentes (o contiguas a) con las que normalmente no está en proximidad. Por ejemplo, la secuencia en cuestión puede clonarse en un vector o puede recombinarse de cualquier otra manera con uno o más ácidos nucleicos adicionales. "Casete de expresión" se refiere a un polinucleótido que comprende un promotor u otra secuencia reguladora unida operativamente a una secuencia codificante de una proteína.
Los términos "promotor" y "secuencia de control de la expresión" se usan en la presente descripción para referirse a una serie de secuencias de control de ácidos nucleicos que dirigen la transcripción de un ácido nucleico. Como se usa en la presente descripción, un promotor incluye secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción, tal como, en el caso de un promotor de tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor incluye, además, opcionalmente elementos potenciadores o represores distales, que pueden ubicarse hasta varios miles de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción. Los promotores incluyen promotores constitutivos e inducibles. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está activo bajo la regulación ambiental o de desarrollo. El término "unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de la expresión de ácido nucleico (tal como un promotor o una matriz de sitios de unión de factores de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de la expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
Una "secuencia heteróloga" o un "ácido nucleico heterólogo", como se usa en la presente descripción, es uno que se origina a partir de una fuente ajena a la célula hospedera particular o, si es de la misma fuente, se modifica a partir de su forma original. Por lo tanto, un casete de expresión heterólogo en una célula es un casete de expresión que no es endógeno a la célula huésped particular, por ejemplo, al estar unido a secuencias de nucleótidos de un vector de expresión en lugar de al ADN cromosómico, al estar unido a un promotor heterólogo, al estar unido a un gen reportero, etcétera.
Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de estos en forma monocatenaria o bicatenaria. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o enlaces o residuos de la columna vertebral modificados, que son sintéticos, de origen natural y no natural, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA).
A menos que se indique de cualquier otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular además incluye variantes modificadas conservativamente de estos (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como también la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados pueden lograrse mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer y otros, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka y otros, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini y otros, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
Los "inhibidores", "activadores" y "moduladores" de la expresión o de la actividad se usan para referirse a moléculas inhibidoras, activadoras o moduladoras, respectivamente, identificadas mediante el uso de ensayos in vitro e in vivo para la expresión o actividad de una proteína diana descrita (o polinucleótido codificante), por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas y sus homólogos y miméticos. El término "modulador" incluye inhibidores y activadores. Los inhibidores son agentes que, por ejemplo, inhiben la expresión o se unen, bloquean total o parcialmente la estimulación o la actividad inhibidora de la proteasa, reducen, disminuyen, previenen, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o regulan negativamente la actividad de la proteína diana descrita, por ejemplo, antagonistas. Los activadores son agentes que, por ejemplo, inducen o activan la expresión de una proteína diana descrita o se unen, estimulan, aumentan, abren, activan, facilitan, mejoran la activación o la actividad inhibidora de la proteasa, sensibilizan o regulan positivamente la actividad de la proteína diana descrita (o polinucleótido codificante), por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen ligandos, antagonistas y agonistas de origen natural y sintéticos (por ejemplo, moléculas químicas pequeñas, anticuerpos y similares que funcionan como agonistas o antagonistas). Tales ensayos para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, aplicar compuestos moduladores putativos a células que expresan la proteína diana descrita y después determinar los efectos funcionales sobre la actividad de la proteína diana descrita, como se describe anteriormente. Las muestras o ensayos que comprenden la proteína diana descrita que se tratan con un activador, inhibidor o modulador potencial se comparan con muestras de control sin el inhibidor, activador o modulador para examinar el alcance del efecto. A las muestras de control (no tratadas con moduladores) se les asigna un valor de actividad relativa del 100 %. La inhibición de una proteína diana descrita se logra cuando el valor de actividad relativo al control es aproximadamente 80 %, opcionalmente 50 % o 25 %, 10 %, 5% o 1%. La activación de la proteína diana descrita se logra cuando el valor de actividad relativo al control es 110 %, opcionalmente 150 %, opcionalmente 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o 1000-3000% o más alto.
Cuando los grupos de sustituyentes químicos se especifican mediante sus fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, abarcan igualmente los sustituyentes químicamente idénticos que resultarían de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo, -CH2O- es equivalente a -OCH2-.
El término "alquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique de cualquier otra manera, una cadena lineal (es decir, no ramificada) o ramificada, o una combinación de estas, que puede estar completamente saturada, mono o poliinsaturada y puede incluir radicales di- y multivalentes, que tienen el número de átomos de carbono indicado (es decir, C1-C10 significa uno a diez carbonos). Los ejemplos de radicales de hidrocarburos saturados incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más dobles enlaces o triples enlaces. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo y los homólogos e isómeros superiores.
El término "alquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de un alquilo, como se ejemplifica, pero no limitado, a -CH2CH2CH2CH2-. Típicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, ejemplificándose en la presente descripción aquellos grupos que tienen 10 o menos átomos de carbono. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, que generalmente tiene ocho átomos de carbono o menos.
El término "heteroalquilo", solo o en combinación con otro término, significa, a menos que se indique de cualquier otra manera, un radical hidrocarbonado estable de cadena lineal o ramificada, o cíclico, o combinaciones de estos, que consiste en al menos un átomo de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, N, P, Si y S, y en donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden oxidarse opcionalmente y el heteroátomo de nitrógeno puede cuaternizarse opcionalmente. Los heteroátomos O, N, P y S y Si pueden colocarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la que el grupo alquilo está unido al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, -CH2-CH2-O-CH3, - CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2,-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3, O-CH3, -O-CH2-CH3, y -CN. Pueden ser consecutivos hasta dos heteroátomos como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-O-Si(CH3)3. De manera similar, el término "heteroalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ejemplifica, pero no se limita a, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para los grupos heteroalquileno, los heteroátomos pueden, además, ocupar uno o ambos extremos de la cadena (por ejemplo, alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino y similares). Aún más, para los grupos enlazadores alquileno y heteroalquileno, la dirección en la que se escribe la fórmula del grupo enlazador no implica ninguna orientación del grupo enlazador. Por ejemplo, la fórmula -C(O)2R'-representa tanto -C(O)2R'- como -R'C(O)2-. Como se describió anteriormente, los grupos heteroalquilo, como se usan en la presente descripción, incluyen aquellos grupos que están unidos al resto de la molécula a través de un heteroátomo, tal como -C(O)R', -C(O)NR', -NR'R", -OR', -Sr ', y/o - SO2R'. Cuando se menciona "heteroalquilo", seguido de enumeraciones de grupos heteroalquilo específicos, tales como -NR'R" o similares, se entenderá que los términos heteroalquilo y -NR'R" no son redundantes ni mutuamente excluyentes. Más bien, los grupos heteroalquilo específicos se enumeran para añadir claridad. Por lo tanto, el término "heteroalquilo" no debe interpretarse en la presente descripción como excluyente de grupos heteroalquilo específicos, tales como -NR'R" o similares.
Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por sí mismos o en combinación con otros términos, representan, a menos que se indique de cualquier otra manera, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la que el heterociclo está unido al resto de la molécula. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo y similares. Los ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridilo), 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1 -piperazinilo, 2-piperazinilo y similares. Un "cicloalquileno" y un "heterocicloalquileno" se refieren a un radical divalente derivado de cicloalquilo y heterocicloalquilo, respectivamente.
Los términos "halo" o "halógeno", por sí mismos o como parte de otro sustituyente, significan, a menos que se indique de cualquier otra manera, un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo. Adicionalmente, los términos tales como "haloalquilo" incluyen monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el término "haloalquilo (C1-C4)" incluye, pero no se limitan a, trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo y similares.
El término "arilo" significa, a menos que se indique de cualquier otra manera, un sustituyente de hidrocarburo aromático poliinsaturado que puede ser un solo anillo o anillos múltiples (preferentemente de 1 a 3 anillos) que están fusionados entre sí o enlazados covalentemente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen de uno a cuatro heteroátomos seleccionados a partir de N, O y S, en donde los átomos de nitrógeno y azufre están opcionalmente oxidados y los átomos de nitrógeno están opcionalmente cuaternizados. Un grupo heteroarilo puede unirse al resto de la molécula a través de un carbono o un heteroátomo. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1 -naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1 -isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillos de arilo y heteroarilo indicados anteriormente se seleccionan a partir del grupo de sustituyentes aceptables que se describen más abajo. "Arileno" y "heteroarileno" se refieren a un radical divalente derivado de un arilo y heteroarilo, respectivamente.
Para abreviar, el término "arilo" cuando se usa en combinación con otros términos (por ejemplo, ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluye tanto anillos arilo como heteroarilo como se define anteriormente. Por lo tanto, el término "arilalquilo" incluye aquellos radicales en los que un grupo arilo está unido a un grupo alquilo (por ejemplo, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y similares), que incluye aquellos grupos alquilo en los que un átomo de carbono (por ejemplo, un grupo metileno) se ha remplazado, por ejemplo, por un átomo de oxígeno (por ejemplo, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3-(1-naftiloxi)propilo y similares).
El término "oxo", como se usa en la presente descripción, significa un oxígeno que tiene un doble enlace con un átomo de carbono.
El término "alquilsulfonilo", como se usa en la presente descripción, significa una porción que tiene la fórmula -S(O2)-R', donde R' es un grupo alquilo como se definió anteriormente. R' puede tener un número específico de carbonos (por ejemplo, "alquilsulfonilo C1-C4").
Cada uno de los términos anteriores (por ejemplo, "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y "heteroarilo") pretende incluir formas tanto sustituidas como no sustituidas del radical indicado. Los sustituyentes representativos para cada tipo de radical se proporcionan más abajo.
Los sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (que incluye los grupos a menudo denominados como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados a partir de, pero no limitados a, a: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halógeno, - SiR'R"Rm, -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -S(O)R', - S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN y -NO2 en un número que va de cero a (2m'+1), en donde m' es el número total de átomos de carbono en dicho radical. Cada uno de R', R", Rm y R"" se refiere, preferentemente, independientemente a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido (por ejemplo, arilo sustituido con 1-3 halógenos), alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto descrito en la presente descripción incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como son cada grupo R', R", Rm y R"" cuando está presente más de uno de estos grupos. Cuando R' y R" están unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 4, 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" pretende incluir, pero no se limita a, 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir de la discusión anterior de los sustituyentes, un experto en la técnica entenderá que el término "alquilo" incluye grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos distintos de los grupos de hidrógeno, tales como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 y similares).
Al igual que los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo varían y se seleccionan, por ejemplo, a partir de: halógeno, -OR', -NR'R", -SR', -halógeno, -SiR'R"Rm, -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"Rm, -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"Rm)=NR"", -NR-C(NR'R")=NRm, -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN y -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoroalcoxi(Ci-C4) y fluoroalquilo(Ci-C4) en un número que va desde cero hasta el número total de valencias abiertas en el sistema de anillos aromáticos; y donde R', R", Rm y R"" se seleccionan, preferentemente, independientemente a partir de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido. Cuando un compuesto descrito en la presente descripción incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como son cada grupo R', R", Rm y R"" cuando está presente más de uno de estos grupos.
Dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden formar opcionalmente un anillo de fórmula -TC(O)-(CRR')q-U-, en donde T y U son independientemente -NR-, -O-, -CRR'- o un enlace simple y q es un número entero de 0 a 3. Alternativamente, dos de los sustituyentes en los átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo pueden reemplazarse opcionalmente con un sustituyente de fórmula -A-(CH2)r-B-, en donde A y B son independientemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- o un enlace simple y r es un número entero de 1 a 4. Opcionalmente, uno de los enlaces sencillos del nuevo anillo así formado puede reemplazarse con un doble enlace. Alternativamente, dos de los sustituyentes en los átomos adyacentes del anillo de arilo o heteroarilo pueden reemplazarse opcionalmente con un sustituyente de la fórmula -(CRR')s-X'-(C"Rm)d-, donde s y d son independientemente números enteros de 0 a 3, y X' es -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- o -S(O)2NR'-. Los sustituyentes R, R', R” y Rm se seleccionan, preferentemente, independientemente a partir de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido.
Como se usa en la presente descripción, el término "heteroátomo" o "heteroátomo de anillo" incluye oxígeno (O), nitrógeno (N), azufre (S), fósforo (P) y silicio (Si).
Un "grupo sustituyente", como se usa en la presente descripción, significa un grupo seleccionado a partir de las siguientes porciones:
(A) -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, oxo, halógeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido y
(B) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado a partir de:
(i) oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, halógeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido y (ii) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado a partir de:
(a) oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, halógeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo no sustituido y alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, sustituido con al menos un sustituyente seleccionado a partir de oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, halógeno, alquilo no sustituido, heteroalquilo no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, arilo no sustituido y heteroarilo no sustituido. Un "sustituyente de tamaño limitado" o "grupo sustituyente de tamaño limitado", como se usa en la presente descripción, significa un grupo seleccionado a partir de todos los sustituyentes descritos anteriormente para un "grupo sustituyente", en donde cada alquilo sustituido o no sustituido es un grupo alquilo C1-C20 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 20 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C4-C8 sustituido o no sustituido y cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 4 a 8 miembros sustituido o no sustituido. Un "sustituyente inferior" o "grupo sustituyente inferior", como se usa en la presente descripción, significa un grupo seleccionado a partir de todos los sustituyentes descritos anteriormente para un "grupo sustituyente", en donde cada alquilo sustituido o no sustituido es un alquilo C1-C8 sustituido o no sustituido, cada heteroalquilo sustituido o no sustituido es un heteroalquilo de 2 a 8 miembros sustituido o no sustituido, cada cicloalquilo sustituido o no sustituido es un cicloalquilo C5-C7 sustituido o no sustituido y cada heterocicloalquilo sustituido o no sustituido es un heterocicloalquilo de 5 a 7 miembros sustituido o no sustituido.
El término "sales farmacéuticamente aceptables" pretende incluir sales de los compuestos activos que se preparan con ácidos o bases relativamente no tóxicos, en dependencia de los sustituyentes particulares encontrados en los compuestos descritos en la presente descripción. Cuando los compuestos descritos en la presente descripción contienen funcionalidades relativamente ácidas, las sales de adición de base pueden obtenerse mediante el contacto de la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente de la base deseada, ya sea pura o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adición de base farmacéuticamente aceptables incluyen sal de sodio, potasio, calcio, amonio, amino orgánico o magnesio, o una sal similar. Cuando los compuestos descritos en la presente descripción contienen funcionalidades relativamente básicas, las sales de adición de ácido pueden obtenerse mediante el contacto de la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente del ácido deseado, ya sea puro o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, nítrico, carbónico, monohidrogenocarbónico, fosfórico, monohidrogenofosfórico, dihidrogenofosfórico, sulfúrico, monohidrogenosulfúrico, yodhídrico o fósforos y similares, así como también las sales derivadas de ácidos orgánicos relativamente no tóxicos como acético, propiónico, isobutírico, maleico, malónico, benzoico, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, Itálico, bencenosulfónico, p-tolilsulfónico, cítrico, tartárico, metanosulfónico y similares. Además, se incluyen sales de aminoácidos tales como arginato y similares, y sales de ácidos orgánicos como ácidos glucurónicos o galactunóricos y similares (ver, por ejemplo, Berge y otros, "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Determinados compuestos específicos descritos en la presente descripción contienen funcionalidades tanto básicas como ácidas que permiten que los compuestos se conviertan en sales de adición de bases o de ácidos.
Por lo tanto, los compuestos descritos en la presente descripción pueden existir como sales con ácidos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de tales sales incluyen clorhidratos, bromhidratos, sulfatos, metanosulfonatos, nitratos, maleatos, acetatos, citratos, fumaratos, tartratos (por ejemplo, (+)-tartratos, (-)-tartratos o mezclas de estos, que incluyen las mezclas racémicas, succinatos, benzoatos y sales con aminoácidos tales como el ácido glutámico. Estas sales pueden prepararse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las formas neutras de los compuestos se regeneran, preferentemente, mediante el contacto de la sal con una base o un ácido y mediante el aislamiento del compuesto original de la manera convencional. La forma parental del compuesto difiere de las diversas formas de sal en determinadas propiedades físicas, tales como la solubilidad en disolventes polares.
Además de las formas de sal, se describen compuestos que están en forma de profármaco. Los profármacos de los compuestos descritos en la presente descripción son aquellos compuestos que experimentan fácilmente cambios químicos en condiciones fisiológicas para proporcionar los compuestos descritos en la presente descripción. Además, los profármacos pueden convertirse en los compuestos descritos en la presente descripción mediante métodos químicos o bioquímicos en un entorno ex vivo. Por ejemplo, los profármacos pueden convertirse lentamente en los compuestos descritos en la presente descripción cuando se colocan en un depósito de parche transdérmico con una enzima o reactivo químico adecuado.
Determinados compuestos descritos en la presente descripción pueden existir en formas no solvatadas así como también en formas solvatadas, que incluye las formas hidratadas. En general, las formas solvatadas son equivalentes a las formas no solvatadas y se incluyen en la presente descripción. Determinados compuestos descritos en la presente descripción pueden existir en múltiples formas cristalinas o amorfas. En general, todas las formas físicas son equivalentes para los usos contemplados en la presente descripción.
Determinados compuestos descritos en la presente descripción poseen átomos de carbono asimétricos (centros ópticos) o enlaces dobles; los racematos, diastereoisómeros, tautómeros, isómeros geométricos e isómeros individuales están abarcados en la presente descripción. Los compuestos descritos en la presente descripción no incluyen los que se conocen en la técnica que son demasiado inestables para sintetizarlos y/o aislarlos.
Los compuestos descritos en la presente descripción pueden contener, además, proporciones no naturales de isótopos atómicos en uno o más de los átomos que constituyen tales compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden estar radiomarcados con isótopos radiactivos, tales como por ejemplo tritio(3H), yodo-125 (125I) o carbono-14 (14C). Todas las variaciones isotópicas de los compuestos descritos en la presente descripción ya sean radiactivos o no, están abarcadas en la presente descripción.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. El tratamiento con los compuestos durante siete días es suficiente para inducir células madre pluripotentes a partir de fibroblastos humanos transducidos con los cuatro factores de reprogramación. (a) Cronología para la inducción de iPSC humana mediante el uso del tratamiento combinado SB431542 y PD0325901 junto con 4TF. El tratamiento comenzó con la resiembra de células el día 7 después de la transducción de 4TF y se mantuvo durante 7 días. (b) Tinción para colonias ALP+ que surgieron en cultivos no tratados (izquierda) o tratados con 2 compuestos (derecha) en siete días. (c) RT-PCR que muestra una expresión elevada de ARNm endógeno de los marcadores de pluripotencia OCT4 y NANOG en cultivos tratados con 2 compuestos. (d) Tinción TRA-1-81 en el día 14 sin (izquierda) o con (derecha) tratamiento de 2 compuestos. (e) Se representan gráficamente los números de colonias NANOG+ en el día 14 en diferentes condiciones de tratamiento. (f) Tinción típica para marcadores específicos de hESC (NANOG y SSEA4) exhibidos por iPSC el D14. Barras de escala, 50 pm en (d & f).
Figura 2. El tratamiento prolongado con compuestos y el pase de las células aumentaron drásticamente el número de colonias reprogramadas. (a) Cronología de la inducción de iPSC humanas con SB431542, PD0325901 y tiazovivina. (b) El día 30 las iPSC expresaron marcadores de pluripotencia NANOG, SSEA4 y TRA-1-81. Barras de escala, 50 pm (c) Tinción ALP de cultivos del día 30 con (paneles superiores) o sin (paneles inferiores) tratamiento de 3 compuestos. Las áreas encuadradas en los paneles de la izquierda se amplían en los paneles de la derecha. Barras de escala, 200 pm (d) Número de colonias NANOG+ en el día 30 en diferentes condiciones de tratamiento, sin división. (e) Número de colonias NANOG+ en el día 30 de cultivos tratados con 3 compuestos tripsinizados como se indica. (f) La RT-PCR en colonias de iPSC que se obtuvieron mediante el tratamiento con 3 compuestos muestra la expresión reactivada de marcadores de pluripotencia endógenos. HDF: Fibroblasto Dérmico Humano.
Figura 3. Diferenciación in vitro e in vivo de iPSC generadas con el tratamiento de 3 compuestos. (a) Las micrografías muestran cuerpos embrioides (EB) generados a partir de iPSC y la diferenciación in vitro en tipos de células ectodérmicas (Tu Bu LINA pIII), mesodérmicas (BRACHYURY) y endodérmicas (PDX1). Barras de escala, EB: 100 pm; otros 10 pm (b) RT-PCR que muestra la expresión de marcadores de linaje representativos y la ausencia de expresión del ARNm de OCT4 en células en diferenciación. U-indiferenciado, D-diferenciado. (c) Los teratomas generados en ratones desnudos a partir de iPSC (3 colonias independientes analizadas) consisten en tejidos de las tres capas germinales. Panel izquierdo: 1- músculo, 2- epitelio neural; panel central: 1- piel, 2-epitelio intestinal; panel derecho: 1- hueso, 2- cartílago. Barras de escala, 20 pm.
Figura 4. El tratamiento con los compuestos mejoró la generación de células iPS de manera dependiente de la dosis.
Figura 5. Estructura química de la Tiazovivina.
Figura 6. La expresión del transgén y el silenciamiento son independientes del tratamiento con los compuestos. Figura 7. Las colonias de células iPS expandidas de forma estable generadas a través del tratamiento con los compuestos exhibieron un cariotipo normal.
Figura 8 Generación de células madre pluripotentes humanas inducidas a partir de queratinocitos primarios mediante un único gen, OCT4 y moléculas pequeñas, (a) El tratamiento con PD0325901 (PD) 0,5 pM y A-83-01 (A83) 0,5 pM mejoró significativamente la generación de iPSC a partir de queratinocitos humanos primarios transducidos con 4t F (4F, OKSM) o 3TF (3F, OKS). Las NHEK se sembraron a una densidad de 100000 células transducidas por placa de 10 cm. (b) Otras selecciones químicas identificaron PS48, NaB y su combinación que puede mejorar sustancialmente la reprogramación de queratinocitos humanos primarios transducidos con 2TF (OK). Las NHEK se sembraron a una densidad de 100 000 células transducidas por placa de 10 cm. (c) Esquema experimental para la generación de iPSC humanas a partir de queratinocitos humanos primarios transducidos mediante un único gen de reprogramación, OCT4. KCM, medio de cultivo de queratinocitos; hESCM, medios de cultivo de ESC humanas. (d) Inmunotinción en vivo con TRA-1-81 de colonias iPSC que se generaron a partir de queratinocitos humanos primarios transducidos con 2TFs/OK o 1TF/OCT4 antes de la recolección de las colonias. (e) Las células iPSC-OK e iPSC-O humanas establecidas expresan marcadores de pluripotencia típicos, que incluye ALP (fosfatasa alcalina), OCT4, SOX2, NANOG, Ss Ea -4 y TRA-1-81. Los núcleos se tiñeron con DAPI.
Figura 9 Caracterizaciones detalladas de células iPSC-OK e iPSC-O humanas. (a) Análisis de expresión por RT-PCR de los genes de pluripotencia endógenos y OCT4 y KLF4 exógenos. Se usó GAPDH como control de entrada. (b) Análisis de metilación de los promotores OCT4 y NANOG mediante secuenciación genómica de bisulfato. Los círculos abiertos y los círculos cerrados indican CpG no metilados y metilados en las regiones del promotor, respectivamente. (c) Gráficos de dispersión que comparan patrones de expresión génica global entre células iPSC-O y NHEK, y hESC. Las posiciones de los genes de pluripotencia OCT4, NANOG y SOX2 se muestran con flechas. Las líneas negras indican el equivalente lineal y los cambios dobles en los niveles de expresión génica entre las muestras. (d) Las iPSC-OK e iPSC-O humanas podrían diferenciarse eficazmente in vitro en células de las tres capas germinales, que incluyen las células ectodérmicas neurales (tubulina pIII), las células mesodérmicas (SMA) y las células endodérmicas (AFP) mediante el uso del método EB. (e) Prueba de PCR cuantitativo de tres marcadores de capas germinales de iPSC humanas diferenciadas mediante el uso del método EB: ectodermo (PAX6, pIII TUBULINA), mesodermo (FOXF1, HAND1) y endodermo (AFP, GATA6). Los datos indican cambios de veces normalizados por GAPDH en relación con las iPSC humanas parentales no diferenciadas. (f) Las iPSC-OK e iPSC-O humanas podrían producir eficazmente un teratoma completo, que contiene células diferenciadas en las tres capas germinales, en ratones SCID.
Figura 10 Generación y caracterizaciones de células madre pluripotentes humanas inducidas a partir de células endoteliales de la vena umbilical humana mediante único gen, OCT4 y moléculas pequeñas, (a) Esquema experimental para la generación de iPSC humanas a partir de HUVEC transducidas por OCT4. HCM, medio de cultivo de HUVEC; hESCM, medio de cultivo de ESC humana. (b) Las células hiPSC-O establecidas a partir de HUVEC expresan marcadores de pluripotencia típicos, que incluyen NANOG y SSEA-4. Los núcleos se tiñeron con DAPI. (c) Análisis de expresión por RT-PCR de los genes de pluripotencia endógena. Se usó GAPDH como control de entrada. (d) Análisis de metilación de los promotores de OCT4 y NANOG mediante secuenciación genómica de bisulfato. Los círculos abiertos y los círculos cerrados indican CpG no metilados y metilados en las regiones del promotor, respectivamente. (e) las células hiPSC-O de HUVEC podrían diferenciarse efectivamente in vitro en células en las tres capas germinales, que incluyen las células ectodérmicas neurales (tubulina pIII), las células mesodérmicas (SMA) y las células endodérmicas (AFP) mediante el uso del método EB. (f) las células hiPSC-O podrían producir eficazmente un teratoma completo, que contiene células diferenciadas en las tres capas germinales en ratones SCID.
Figura 11 Caracterización de células iPSC-O humanas de AHEK. (a) Las células hiPSC-O establecidas a partir de queratinocitos adultos expresan marcadores de pluripotencia típicos, que incluyen NANOG, SOX2 y SSEA-4. Los núcleos se tiñeron con DAPI. (b) Estas células hiPSC-O podrían diferenciarse eficazmente in vitro en células en las tres capas germinales, que incluye las células ectodérmicas neurales (tubulina pIII), las células mesodérmicas (SMA) y las células endodérmicas (AFP) mediante el uso del método EB.
Figura 12 Caracterización de células iPSC-O humanas de AFDC. (a) Las células hiPSC-O establecidas a partir de células derivadas de líquido amniótico expresan marcadores de pluripotencia típicos, que incluye NANOG, SOX2 y SSEA-4. Los núcleos se tiñeron con DAPI. (b) Estas células hiPSC-O podrían diferenciarse eficazmente in vitro en células en las tres capas germinales, que incluye las células ectodérmicas neurales (tubulina pIII), las células mesodérmicas (SMA) y las células endodérmicas (AFP) mediante el uso del método EB.
Figura 13 Líneas celulares hiPSC adicionales expresan marcadores de pluripotencia típicos. Las otras líneas celulares hiPSC-O establecidas expresan marcadores de pluripotencia típicos, que incluye NANOG y SSEA-4. Los núcleos se tiñeron con DAPI.
Figura 14 Cultivo de líneas celulares hiPSC sin alimentador. Las hiPSC se dividieron en placas recubiertas con Matrigel/ECM en medio hESC químicamente definido como se informó anteriormente. Estas hiPSC podrían mantenerse y expandirse en un entorno sin alimentador. ICC mostró la expresión de los marcadores de pluripiotencia, OCT4 y SSEA4. Los núcleos se tiñeron con DAPI.
Figura 15 Genotipado de hiPSC. El análisis de RT-PCR mediante el uso de ADN genómico muestra que solo el transgén OCT4 se integró en el genoma de las líneas hiPSC-O (hiPSC-O#1, hiPSC-O#3, hiPSC-O#21, hiPSC-O#26 y hiPSC-O#31). NHEK (a) y HUVEC (b) se usaron como controles negativos, mientras que los vectores se usaron como controles positivos.
Figura 16 Integración del transgén OCT4 en hiPSC. El ADN genómico (10 |jg) se digirió con EcoRI y se hibridó con la sonda de ADNc de OCT4 (un fragmento EcoRI/Spel de pSin-EF2-OCT4-Pur). Se detectaron múltiples integraciones transgénicas.
Figura 17 Cariotipo para líneas celulares hiPSC. La propagación en metafase de hiPSC-O#1 (a) y hiPSC-O#21 (b) muestra un cariotipo normal después del pase 15.
Descripción detallada
I. Introducción
La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que una combinación de un inhibidor de ALK5, un inhibidor de MEK y un inhibidor de ROCK mejora en gran medida la eficacia de la inducción de pluripotencia en células de mamífero no pluripotentes transformadas con cuatro factores de transcripción. Por consiguiente, en la presente descripción se describen métodos para inducir la pluripotencia en células de mamífero no pluripotentes, en donde el método comprende poner en contacto las células no pluripotentes con al menos un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, preferentemente, en combinación con un inhibidor de la vía de MEK/ERK, y en casos particulares, un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK.
II. Inhibidores del receptor de TGFp/ALK5
La cinasa 5 similar al receptor de activina (ALK-5) es el receptor principal de TGFp que media las respuestas celulares a los TGF-p (Massague J. Annu Rev Biochem 67:753-791 (1998); Massague J, Chen YG. Genes Dev 14:627-644 (2000); Franzen P, y otros, Cell 75:681-692 (1993)). Después de la unión del ligando, la cinasa TpRII constitutivamente activa fosforila ALK-5 que, a su vez, activa las cascadas de transducción de señales corriente abajo. La fosforilación de Smad2 y Smad3 activada por ALK-5 es la vía más prominente (Massague J, Chen YG. Genes Dev 14:627-644 (2000)). Una vez activado, Smad2/3 se asocia con Smad4 y se traslada al núcleo, donde el complejo regula transcripcionalmente la expresión del gen diana.
Los inhibidores del receptor de TGFp (es decir, ALK5) pueden incluir anticuerpos contra variantes negativas dominantes de, ARNip, microARN, ácidos nucleicos antisentido y otros polinucleótidos que suprimen la expresión de receptores de TGFp (por ejemplo, ALK5). Los inhibidores representativos del receptor de TGFp/ALK5 incluyen, pero no se limitan a, SB431542 (ver, por ejemplo, Inman, y otros, Molecular Pharmacology 62(1):65-74 (2002)), A-83-01, también conocido como 3-(6-Metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1 -carbotioamida (ver, por ejemplo, Tojo, y otros, Cancer Science 96(11):791-800 (2005), y comercialmente disponible de, por ejemplo, Toicris Bioscience); 2-(3-(6-Metilpiridin-2-il)-1H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina, Wnt3a/BIO (ver, por ejemplo, Dalton, y otros, documento WO2008/094597), BMP4 (ver, Dalton, supra), GW788388 (-{4-[3-(piridin-2-il)-1H-pirazol-4-il]piridin-2-il}-N-(tetrahidro-2H- piran-4-il)benzamida) (ver, por ejemplo, Gellibert, y otros, Journal of Medicinal Chemistry 49(7):2210-2221 (2006)), SM16 (ver, por ejemplo, Suzuki, y otros, Cancer Research 67(5):2351-2359 (2007)), IN-1130 (3-((5-(6-metilpiridin-2-il)-4-(quinoxalin-6-il)-1H-imidazol-2-il)metil)benzamida) (ver, por ejemplo, Kim, y otros, Xenobiotica 38(3):325-339 (2008)), GW6604 (2-fenil-4-(3-piridin-2-il-1H-pirazol-4-il)piridina) (ver, por ejemplo, de Gouville, y otros, Drug News Perspective 19(2):85-90 (2006)), SB-505124 hidrocloruro de (2-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-2-terc-butil-3H-imidazol-4-il)-6-metilpiridina) (ver por ejemplo, DaCosta, y otros, Molecular Pharmacology 65(3):744-752 (2004)) y derivados de pirimidina (ver, por ejemplo, aquellos listados en Stiefl, y otros, documento WO2008/006583). Además, aunque "un inhibidor de ALK5" no pretende abarcar inhibidores de cinasa no específicos, debe entenderse que un "inhibidor de ALK5" abarca inhibidores que inhiben ALK4 y/o ALK7 además de ALK5, tales como, por ejemplo, SB- 431542 (ver, por ejemplo, Inman, y otros, J, Mol. Phamacol. 62(1): 65-74 (2002). En vista de los datos de la presente descripción que muestran el efecto de inhibir ALK5, se cree que la inhibición de la vía de TGFp/activina tendrá efectos similares. Por lo tanto, cualquier inhibidor (por ejemplo, aguas arriba o aguas abajo) de la vía de TGFp/activina puede usarse en combinación con, o en lugar de, inhibidores de ALK5 como se describe en cada párrafo de la presente descripción. Los inhibidores representativos de la vía de TGFp/activina incluyen, pero no se limitan a: inhibidores del receptor de TGFp, inhibidores de la fosforilación de SMAD 2/3, inhibidores de la interacción de SMAD 2/3 y SMAD 4, y activadores/agonistas de SMAD 6 y SMAD 7. Además, las categorizaciones descritas más abajo son meramente para fines organizativos y un experto en la técnica sabrá que los compuestos pueden afectar uno o más puntos dentro de una vía y, por lo tanto, los compuestos pueden funcionar en más de una de las categorías definidas.
Los inhibidores del receptor de TGFp pueden incluir anticuerpos contra, variantes negativas dominantes de y ARNip o ácidos nucleicos antisentido que se dirigen a los receptores de TGFp. Los ejemplos específicos de inhibidores incluyen, pero no se limitan a, SU5416; hidrocloruro de 2-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-2-terc-butil-3H-imidazol-4-il)-6-metilpiridina (SB-505124); lerdelimumb (CAT-152); metelimumab (CAT-192); GC-1008; ID11; AP-12009; AP-11014; LY550410; LY580276; LY364947; LY2109761; SB-505124; SB-431542; SD-208; SM16; NPC-30345; Ki26894; SB-203580; SD-093; Gleevec; 3,5,7,2',4'-pentahidroxiflavona (Morin); activina-M108A; P144; TBR2-Fc soluble; y células tumorales transfectadas con antisentido que se dirigen a los receptores de TGFp. (Ver, por ejemplo, Wrzesinski, y otros, Clinical Cancer Research 13(18):5262-5270 (2007); Kaminska, y otros, Acta Biochimica Polonica 52(2):329 337 (2005); y Chang, y otros Frontiers in Bioscience 12:4393-4401 (2007). Además, los inventores han encontrado que los inhibidores de TGFp BMP-4 y BMP-7 tienen efectos de reprogramación celular similares a los del inhibidor de ALK5 descrito en los ejemplos, lo que proporciona evidencia adicional de que los inhibidores de TGFp pueden usarse para la reprogramación (por ejemplo, en combinación con un inhibidor de la vía MEK/ERK y un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK). Las secuencias de proteínas BMP-4 y BMP-7 humanas representativas se exponen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. núm. 7,405,192.
Los inhibidores de la fosforilación de SMAD 2/3 pueden incluir anticuerpos contra variantes negativas dominantes y ácidos nucleicos antisentido que se dirigen a SMAD2 o SMAD3. Los ejemplos específicos de inhibidores incluyen PD169316; SB203580; SB-431542; LY364947; A77-01; y 3,5,7,2',4'-pentahidroxiflavona (Morin). (Ver, por ejemplo, Wrzesinski, supra; Kaminska, supra; Shimanuki, y otros, Oncogene 26:3311-3320 (2007); y Kataoka, y otros, EP1992360.)
Los inhibidores de la interacción de SMAD 2/3 y smad4 pueden incluir anticuerpos contra variantes negativas dominantes y ácidos nucleicos antisentido que se dirigen a SMAD2, SMAD3 y/o smad4. Los ejemplos específicos de inhibidores de la interacción de SMAD 2/3 y SMAD4 incluyen, pero no se limitan a Trx-SARA, Trx-xFoxH1b y Trx-Lef1. (Ver, por ejemplo, Cui, y otros, Oncogene 24:3864-3874 (2005) y Zhao, y otros, Molecular Biology of the Cell, 17:3819-3831 (2006).)
Los activadores/agonistas de SMAD 6 y SMAD 7 incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos contra variantes negativas dominantes y ácidos nucleicos antisentido que se dirigen a SMAD 6 o SMAD 7. Los ejemplos específicos de inhibidores incluyen, pero no se limitan a, smad7-as PTO-oligonucleótidos. Ver, por ejemplo, Miyazono, y otros, documento US6534476, y Steinbrecher, y otros, documento US2005119203.
Los expertos apreciarán que la concentración del inhibidor del receptor de TGFp/ALK5 dependerá del inhibidor específico que se use. En general, la concentración de un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5 en un cultivo celular estará en el intervalo de IC20-IC100 (es decir, concentraciones en las que se logra una inhibición del 20 % al 100 % en las células). Por ejemplo, SB432542 podría usarse a 0,5-10 pM, de manera óptima alrededor de 1-5 pM. Puede usarse una combinación de dos o más inhibidores del receptor de TGFp/ALK5 diferentes.
III. Inhibidores de la vía MEK/ERK
La vía MEK/ERK se refiere a las cinasas serina/treonina MEK y ERK que forman parte de una vía de transducción de señales. Generalmente, Ras activado activa la actividad de la proteína cinasa de la cinasa RAF. La cinasa RAF fosforila y activa a MEK, que a su vez fosforila y activa a una proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK). MAPK se denominó originalmente "cinasas reguladas por señales extracelulares" (ERK) y proteína cinasa asociada a microtúbulos (MAPK). Por lo tanto, "ERK" y "MAPK" se usan como sinónimos.
Los inhibidores de la vía MEK/ERK se refieren a los inhibidores de MEK o ERK que forman parte de la vía Raf/MEK/ERK. Debido a que los inventores han encontrado que los inhibidores de MEK son efectivos para mejorar la inducción de iPSC, y debido a que MEK controla directamente la actividad de ERK, se cree que los inhibidores de MEK como se describe en la presente descripción pueden reemplazarse con un inhibidor de ERK según sea conveniente.
Los inhibidores de MEK (es decir, MEK1 (también conocido como proteína cinasa 1 activada por mitógeno) y/o MEK2 (también conocida como proteína cinasa 2 activada por mitógeno)) pueden incluir anticuerpos contra, variantes negativas dominantes de y ARNip y ARNip, microARN, ácidos nucleicos antisentido y otros polinucleótidos que suprimen la expresión de MEK. Los ejemplos específicos de inhibidores de MEK incluyen, pero no se limitan a, PD0325901, (ver, por ejemplo, Rinehart, y otros, Journal of Clinical Oncology 22: 4456-4462 (2004)), PD98059 (disponible, por ejemplo, en Cell Signaling Technology), U0126 (disponible, por ejemplo, en Cell Signaling Technology), SL 327 (disponible, por ejemplo, en Sigma-Aldrich), ARRY-162 (disponible, por ejemplo, en Array Biopharma), PD184161 (ver, por ejemplo, Klein, y otros, Neoplasia 8:1 - 8 (2006)), PD184352 (Ci-1040) (ver, por ejemplo, Mattingly, y otros, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 316:456-465 (2006)), sunitinib (ver, por ejemplo, Voss, y otros, US2008004287), sorafenib (ver, Voss supra), Vandetanib (ver, Voss supra), pazopanib (ver, por ejemplo, Voss supra), Axitinib (ver, Voss supra) y PTK787 (ver, Voss supra).
Actualmente, varios inhibidores de MEK se encuentran en evaluación en ensayos clínicos. CI-1040 se ha evaluado en ensayos clínicos de fase I y II para el cáncer (ver, por ejemplo, Rinehart, y otros, Journal of Clinical Oncology 22(22):4456-4462 (2004)). Otros inhibidores de MEK que se están evaluando en ensayos clínicos incluyen PD184352 (ver, por ejemplo, English, y otros, Trends in Pharmaceutical Sciences 23(1):40-45 (2002)), BAY 43-9006 (ver, por ejemplo, Chow, y otros, Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46:72-78 (2001)), PD-325901 (además, PD0325901), GSK1120212, ARRY-438162, RDEA119, AZD6244 (además, ARRY-142886 o ARRY-886), RO5126766, XL518 y AZD8330 (además, ARRY-704). (Ver, por ejemplo, la información de los Institutos Nacionales de la Salud que se encuentra en la Red Mundial en Clinicaltrials.gov, así como también la información del Instituto Nacional del Cáncer que se encuentra en la Red Mundial en cancer.gov/clinicaltrials.
Los inhibidores representativos de ERK (es decir, ERK1 (también conocido como MAPK3) y/o ERK2 (también conocido como MAPK1)) incluyen PD98059 (ver, por ejemplo, Zhu, y otros, Oncogene 23:4984-4992 (2004)), U0126 (ver, Zhu, supra), FR180204 (ver, por ejemplo, Ohori, Drug News Perspective 21(5):245-250 (2008)), sunitinib (ver, por ejemplo, US2008004287), sorafenib, Vandetanib, pazopanib, Axitinib y PTK787.
Los expertos apreciarán que la concentración del inhibidor de la vía MEK/ERK dependerá del inhibidor específico que se use. Puede usarse una combinación de dos o más inhibidores de la vía MEK/ERK diferentes.
IV. Inhibidores de Rho GTPasa/ROCK
En la presente descripción se describen usos y composiciones que comprenden inhibidores de la vía Rho-GTPasa/ROCK. La vía incluye la proteína miosina II corriente abajo, que está más abajo de ROCK (Rho-ROCK-Miosina II forma la vía/eje). Por lo tanto, uno puede usar cualquiera o todos los inhibidores de Rho GTPasa, un inhibidor de ROCK o un inhibidor de miosina II para lograr los efectos descritos en la presente descripción. Los expertos apreciarán que la concentración del inhibidor de la vía Rho-GTPasa/ROCK dependerá del inhibidor específico que se use. Puede usarse una combinación de dos o más inhibidores de la vía Rho-GTPasa/ROCK diferentes.
Cualquier Rho GTPasa debería ser eficaz en los métodos y composiciones descritos en la presente descripción. Los inhibidores de la Rho GTPasa pueden incluir anticuerpos que se unen, variantes negativas dominantes de ARNip, microARN, ácidos nucleicos antisentido y otros polinucleótidos que se dirigen a la Rho GTPasa. Un inhibidor representativo de Rho GTPasa es la toxina C3 de Clostridium botulinum.
Cualquier inhibidor de la miosina II debería ser eficaz en los métodos y composiciones descritos en la presente descripción. Los inhibidores de la miosina II pueden incluir anticuerpos que se unen, variantes negativas dominantes de ARNip, microARN, ácidos nucleicos antisentido y otros polinucleótidos que se dirigen a la miosina II. Un inhibidor representativo de la miosina II es la blebbistatina. Los inventores han encontrado que la blebbistatina puede sustituirse por SB431542 (un inhibidor de ALK5), aunque con un efecto reducido, en las mezclas y en los métodos descritos en la sección de ejemplos. Otros inhibidores incluyen, pero no se limitan a, los descritos en la patente de EE. UU. núm. 7,585,844.
"ROCK" que se usa en la presente descripción se refiere a una cinasa serina/treonina que actúa corriente abajo de Rho. Ro Ck I (también denominado como ROK p o p160ROCK) y ROCK II (también denominado como Ro K a o Rho cinasa) están ambos regulados por RhoA. Ver, por ejemplo, Riento, K. and Ridley, A.J., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 4, 446-456 (2003). Un "inhibidor de ROCK" se refiere a agentes que inhiben ambos o cualquiera de los ROCK. Los inhibidores de ROCK pueden incluir anticuerpos que se unen, variantes negativas dominantes de ARNip, microRNA, ácidos nucleicos antisentido y otros polinucleótidos que se dirigen a ROCK. Algunos inhibidores de ROCK representativos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las publicaciones internacionales núms.: documentos WO98/06433, WO00/78351, WO01/17562, WO02/076976, WO02/076977, WO2003/062227, WO2003/059913, WO2003/062225, WO2002/076976, WO2004/039796, WO03/082808, WO05/035506, WO05/074643 y solicitudes de patente de EE. UU. núm.: 2005/0209261, 2005/0192304, 2004/0014755, 2004/0002508, 2004/0002507, 2003/0125344 y 2003/0087919. Los inhibidores de ROCK incluyen, por ejemplo, diclorhidrato de (+)-(R)-trans-4-(1-aminoetil)-N-(4-piridil)ciclohexanocarboxamida, o Wf536; monoclorhidrato de 4-[(1R)-1-aminoetil]-N-(4-piridil)benzamida o Fasudil; clorhidrato de 5-(hexahidro-1H-1,4-diazepin-1-ilsulfonil)isoquinolina o Compuesto 1; 4-[(trans-4-aminociclohexil)amino]-2,5-difluorobenzamida o Compuesto 2; 4-[(trans-4-aminociclohexil)amino]-5-cloro-2-fluorobenzamida o Compuesto 3; diclorhidrato de 2-[4-(1H-indazol-5-il)fenil]-2-propanamina o Compuesto 4; N-(3-metoxibencil)-4-(4-piridil)benzamida, Y-27632 (ver, por ejemplo, Ishizaki y otros, Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya y otros, Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)), Fasudil (también referido como HA1077) (por ejemplo, referirse a Uenata y otros, Nature 389: 990-994 (1997)), sc-3536 (ver, por ejemplo, Darenfed, H., y otros, Cell Motil. Cytoskeleton. 64: 97-109, 2007), H-1152 (por ejemplo, referirse a Sasaki y otros, Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)), Wf-536 (por ejemplo, referirse a Nakajima y otros, Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)), Y-30141 (descrito en la patente de EE. UU. núm. 5,478,838) y derivados de estos, y ácido nucleico antisentido para ROCK, ácido nucleico inductor de ARN de interferencia (por ejemplo, ARNip), péptidos competitivos, péptidos antagonistas, anticuerpos inhibidores, fragmentos de anticuerpos-ScFV, variantes negativas dominantes y vectores de expresión de estos.
Los compuestos anteriores pueden prepararse como sales de adición de ácido con ácidos inorgánicos o ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables, según se requiera. Los ejemplos de sales de adición de ácido incluyen sales con ácidos minerales tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares; sales con ácidos carboxílicos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido fumárico, ácido maleico, ácido oxálico, ácido cítrico, ácido málico, ácido tartárico, ácido aspártico y ácido glutámico; y sales con ácidos sulfónicos tales como ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido hidroxibencenosulfónico, ácido dihidroxibencenosulfónico y similares.
Los compuestos y sales de adición de ácido de estos pueden ser un anhídrido, hidrato o solvato de estos.
Para practicar la presente invención, los inhibidores de ROCK generalmente son adecuados sin limitación, siempre que un inhibidor pueda inhibir la función de la Rho-cinasa (ROCK), y los inhibidores adecuados incluyen Y-27632 (por ejemplo, referirse a Ishizaki y otros, Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya y otros, Methods Enzymol.
325,273-284 (2000)), sc-3536 (ver, por ejemplo, Darenfed, H., y otros, Cell Motil. Cytoskeleton. 64: 97-109, 2007), Fasudil (también conocido como HA1077) (por ejemplo, referirse a Uenata y otros, Nature 389: 990-994 (1997)), H-1152 (por ejemplo, referirse a Sasaki y otros, Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)), Wf-536 (por ejemplo, referirse a Nakajima y otros, Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)), Y-30141 (descrito en la patente de EE. UU. núm. 5,478,838) y derivados de estos, y ácido nucleico antisentido para ROCK, ácido nucleico inductor de ARN de interferencia (por ejemplo, ARNip), péptidos competitivos, péptidos antagonistas, anticuerpos inhibidores, fragmentos de anticuerpos-ScFV, variantes negativas dominantes y vectores de expresión de estos. Además, dado que otros compuestos de bajo peso molecular se conocen como inhibidores de ROCK, tales compuestos o derivados de estos también pueden usarse en la presente invención (por ejemplo, referirse a solicitudes de patente de EE. UU. núms.
20050209261 , 20050192304, 20040014755, 20040002508, 20040002507, 20030125344 y 20030087919, y publicaciones internationales de patentes núm.2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976 y 2004/039796). En la presente invención, puede usarse, además, una combinación de uno o dos o más de los inhibidores de ROCK.
Los inhibidores de ROCK adicionales incluyen, por ejemplo, HA1100, 3-(4-piridil)-1H-indol y N-(4-piridil)-N'-(2,4,6-triclorofenil)urea, cada uno de los cuales está disponible comercialmente (por ejemplo, en Alexis Biochemicals (Plymouth Meeting, PA).
Los inhibidores de ROCK pueden tener la fórmula:
Figure imgf000019_0001
En la Fórmula (I), el anillo A es un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido. El Anillo B es un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
L1 es -C(O)-NR2- o -NR2-C(O)-. L2 es un enlace, alquileno sustituido o no sustituido o heteroalquileno sustituido o no sustituido.
R1 y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido.
El anillo A puede ser un arilo sustituido o no sustituido. El anillo A puede ser, además, un fenilo sustituido o no sustituido.
El anillo B puede ser un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido o un heteroarilo sustituido o no sustituido. El anillo B puede ser, además, un heteroarilo sustituido o no sustituido. El anillo B puede ser un pirazolilo sustituido o no sustituido, furanilo sustituido o no sustituido, imidazolilo sustituido o no sustituido, isoxazolilo sustituido o no sustituido, oxadiazolilo sustituido o no sustituido, oxazolilo sustituido o no sustituido, pirrolilo sustituido o no sustituido, piridilo sustituido o no sustituido, pirimidilo sustituido o no sustituido, piridazinilo sustituido o no sustituido, tiazolilo sustituido o no sustituido, triazolilo sustituido o no sustituido, tienilo sustituido o no sustituido, dihidrotienopirazolilo sustituido o no sustituido, tianaftenilo sustituido o no sustituido, carbazolilo sustituido o no sustituido, benzotienilo sustituido o no sustituido, benzofuranilo sustituido o no sustituido, indolilo sustituido o no sustituido, quinolinilo sustituido o no sustituido, benzotriazolilo sustituido o no sustituido, benzotiazolilo sustituido o no sustituido, benzooxazolilo sustituido o no sustituido, bencimidazolilo sustituido o no sustituido, isoquinolinilo sustituido o no sustituido, isoindolilo sustituido o no sustituido, acridinilo sustituido o no sustituido, benzoisazolilo sustituido o no sustituido o dimetilhidantoína sustituida o no sustituida.
L2 puede ser alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. L2 puede ser alquilo C1-C10 no sustituido. L2 puede ser, además, metileno sustituido o no sustituido (por ejemplo, metileno no sustituido).
R2 puede ser hidrógeno. R1 puede ser hidrógeno o alquilo C1-C10 no sustituido. R1 puede ser simplemente hidrógeno. En algunos casos de la Fórmula (I), el anillo A puede ser arilo sustituido o no sustituido, el anillo B es heteroarilo sustituido o no sustituido, R1 es hidrógeno y L2 es alquilo C1-C10 no sustituido.
El inhibidor de ROCK puede tener la fórmula:
Figure imgf000020_0001
En la Fórmula (II), y es un número entero de 0 a 3 y z es un número entero de 0 a 5. X es -N=, -CH= o -CR4=. R1 y L2 son como se definen anteriormente en las definiciones de la Fórmula (I).
R3, R4 y R5 son independientemente -CN, -S(O)nR6, -NR7R8, -C(O)R9, -NR10-C(O)R11, -NR12-C(O)-OR13, -c(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un número entero de 0 a 2, en donde si z es mayor que 1, dos porciones R3 se unen opcionalmente para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido. R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 y R19 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido.
L2 puede ser alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. L2 puede ser, además, alquilo C1-C10 no sustituido. Alternativamente, L2 es metileno sustituido o no sustituido (por ejemplo, metileno no sustituido).
X puede ser -N= o -CH=. El símbolo z puede ser 2. Dos porciones R3 en vértices adyacentes pueden unirse para formar un heterocicloalquilo sustituido o no sustituido. El símbolo z puede ser además, 1. El símbolo y puede ser 0 o 1. R3 puede ser-OR18. R18 puede ser hidrógeno o alquilo C1-C10 no sustituido.
L2 puede ser metileno sustituido o no sustituido (por ejemplo, metileno sustituido), X es -N= o -CH=, R1 es hidrógeno y y y z son 0.
Los compuestos pueden tener la fórmula:
Figure imgf000020_0002
(a veces llamada Tiazovivina o "Tzv"),
Figure imgf000020_0003
o
Figure imgf000021_0001
V. Inhibidores de GSK3
Pueden incluirse uno o más inhibidores de GSK3 en los métodos, mezclas y kits descritos en la presente descripción. Los inventores han encontrado que la inclusión de inhibidores de GSK3 con al menos un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, preferentemente, en combinación con un inhibidor de la vía MEK/ERK y, en casos particulares, un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK. Los inhibidores de GSK3 pueden incluir anticuerpos que se unen, variantes negativas dominantes de ARNip, microARN, ácidos nucleicos antisentido y otros polinucleótidos que se dirigen a GSK3. Los ejemplos específicos de inhibidores de GSK3 incluyen, pero no se limitan a, Kenpaullone, 1-Azakenpaullone, CHIR99021, CHIR98014, AR-A014418 (ver, por ejemplo, Gould, y otros, The International Journal of Neuropsychopharmacology 7:387-390 (2004)), CT 99021 (ver, por ejemplo, Wagman, Current Pharmaceutical Design 10:1105-1137 (2004)), CT 20026 (ver, Wagman, supra), SB216763 (ver, por ejemplo, Martin, y otros, Nature Immunology 6:777-784 (2005)), AR-A014418 (ver, por ejemplo, Noble, y otros, PNAS 102:6990-6995 (2005)), litio (ver, por ejemplo, Gould, y otros, Pharmacological Research 48: 49-53 (2003)), SB 415286 (ver, por ejemplo, Frame, y otros, Biochemical Journal 359:1-16 (2001)) y TDZD-8 (ver, por ejemplo, Chin, y otros, Molecular Brain Research, 137(1-2):193-201 (2005)). Otros inhibidores de GSK3 representativos disponibles en Calbiochem (ver, por ejemplo, Dalton, y otros, documento WO2008/094597), incluyen pero no se limitan a BIO (2'Z,3'£)-6-Bromoindirubin-3'-oxime (Inhibidor GSK3 IX); BIO-Acetoxima (2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-acetoxima (Inhibidor GSK3 X); (5-Metil-1H-pirazol-3-il)-(2-fenilquinazolin-4-il)amina (Inhibidor GSK3 XIII); complejo de Piridocarbazol-ciclopenadienilrutenio (Inhibidor GSK3 XV); TDZD-8 4-Benzil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidina-3,5-diona (Inhibidor GSK3beta I); 2-Tio(3-iodobenzil)-S-(1-piridil)-[1,3,4]-oxadiazol (Inhibidor GSK3beta II); OTDZT 2,4-Dibenzil-5-oxotiadiazolidina-3-tiona (Inhibidor GsK3beta III); alfa-4-Dibromoacetofenona (Inhibidor GSK3beta VII); AR-AO 14418 N-(4-Metoxibenzil)-N'-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)urea (Inhibidor GSK-3beta VIII); 3-(1-(3-Hidroxipropil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il]-4-pirazin-2-il-pirrol-2,5-diona (Inhibidor GSK-3beta XI); compuesto TwSl 19 pirrolopirimidina (Inhibidor GSK3beta XII); L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2 o su forma Miristoilada (Inhibidor GSK3beta XIII); 2-Cloro-1-(4,5-dibromo-tiofen-2-il)-etanona (Inhibidor GSK3beta VI); AR-AO144-18; SB216763; y SB415286. Se han identificado residuos de GSK3b que interactúan con los inhibidores. Ver, por ejemplo, Bertrand y otros, J. Mol Biol. 333(2): 393-407 (2003). Los inhibidores de GSK3 pueden activar, por ejemplo, la vía Wnt/p-catenina. Muchos de los genes aguas abajo de p-catenina regulan conjuntamente las redes de genes de pluripotencia. Por ejemplo, un inhibidor de GSK activa la expresión de cMyc y mejora su estabilidad proteica y su actividad transcripcional. Por lo tanto, los inhibidores de GSK3 pueden usarse para estimular la expresión del polipéptido MYC endógeno en una célula, de esta manera se elimina la necesidad de expresión de MYC para inducir la pluripotencia.
Los expertos apreciarán que la concentración del inhibidor de GSK3 dependerá del inhibidor específico que se use. Puede usarse una combinación de dos o más inhibidores de GSK3 diferentes.
VI. Métodos de inducción de pluripotencia
Hasta la fecha, se ha establecido una gran cantidad de métodos y protocolos diferentes para inducir células de mamífero no pluripotentes a células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Se cree que los agentes descritos en la presente descripción pueden usarse en combinación con prácticamente cualquier protocolo para generar iPSC y, por lo tanto, mejorar la eficacia del protocolo. Por lo tanto, en la presente descripción se describe la incubación de células no pluripotentes con al menos un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, preferentemente, en combinación con un inhibidor de la vía MEK/ERK y, en casos particulares, un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK en combinación con cualquier protocolo para generar iPSC. Más abajo se describe una selección de protocolos y se cree que cada uno puede combinarse con los agentes descritos en la presente descripción para mejorar la eficacia del protocolo.
La mejora en la eficacia de un protocolo de generación de iPSC dependerá del protocolo y de los agentes que se usen. La eficacia puede mejorarse en al menos un 10 %, 20 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 % o más en comparación con el mismo protocolo sin la inclusión de los agentes (es decir, el inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, el inhibidor de la vía MEK/ERK y el inhibidor de Rho GTPasa/ROCK). La eficacia se mide con respecto a la mejora de la cantidad de iPSC generadas en un período de tiempo particular o la velocidad con la que se generan las iPSC.
Los estudios han demostrado que la transducción retroviral de fibroblastos de ratón con cuatro factores de transcripción que están altamente expresados en ESC (Oct-3/4, Sox2, KLF4 y c-Myc) generan células madre pluripotentes inducidas (iPS). Ver, Takahashi, K. & Yamanaka, S. Cell 126, 663-676 (2006); Okita, K., Ichisaka, T. & Yamanaka, S. Nature 448, 313-317 (2007); Wernig, M. y otros, Nature 448, 318-324 (2007); Maherali, N. y otros, Cell Stem Cell 1, 55-70 (2007); Meissner, A., Wernig, M. & Jaenisch, R. Nature Biotechnol. 25, 1177-1181 (2007); Takahashi, K. y otros, Cell 131, 861-872 (2007); Yu, J. y otros, Science 318, 1917-1920 (2007); Nakagawa, M. y otros, Nature Biotechnol. 26, 101-106 (2007); Wernig, M., Meissner, A., Cassady, J. P. & Jaenisch, R. Cell Stem Cell.
2, 10-12 (2008). Las células iPS son similares a las ESC en morfología, proliferación y pluripotencia, a juzgar por la formación de teratomas y la contribución de quimeras.
Como se señaló anteriormente, mientras que el protocolo original implicaba la introducción de cuatro factores de transcripción en células no pluripotentes, se ha descubierto más recientemente que pueden omitirse algunos factores de transcripción. Por lo tanto, los protocolos pueden implicar la introducción de uno, dos o tres de un polipéptido Oct, un polipéptido Klf, un polipéptido Myc y un polipéptido Sox en células no pluripotentes en condiciones que permitan que las células no pluripotentes se conviertan en iPSC. Por ejemplo, cada uno de Maherali and Konrad Hochedlinger, "Tgf13 Signal Inhibition Cooperates in the Induction of iPSCs and Replaces Sox2 and cMyc" Current Biology (2009) y el documento WO/2009/117439 describen protocolos que no requieren los cuatro factores de transcripción para inducir pluripotencia. Además, los inventores han encontrado que las iPSC pueden generarse mediante la introducción de Oct4 solo en las células y mediante la incubación de las células con un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, un inhibidor de la vía MEK/ERK, un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK y un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC). Por ejemplo, la introducción de Oct4 exógeno en células de mamífero, en presencia de una cantidad suficiente de SB431542, PD0325901, Tzv y ácido valproico o butirato de sodio, generó con éxito células iPSC.
Los inhibidores de HDAC representativos pueden incluir anticuerpos que se unen, variantes negativas dominantes y ARNip y ácidos nucleicos antisentido que se dirigen a una o más HDAC. Los inhibidores de HDAC incluyen, pero no se limitan a, TSA (trichostatin A) (ver, por ejemplo, Adcock, British Journal of Pharmacology 150:829-831 (2007)), VPA (ácido valproico) (ver, por ejemplo, Munster, Journal of Clinical Oncology 25:18S (2007): 1065), butirato de sodio (NaBu) (ver, por ejemplo, Han, y otros, Immunology Letters 108:143-150 (2007)), SAHA (ácido suberoilanilida hidroxámico o vorinostat) (ver, por ejemplo, Kelly, y otros, Nature Clinical Practice Oncology 2:150-157 (2005)), fenilbutirato de sodio (ver, por ejemplo, Gore, y otros, Cancer Research 66:6361-6369 (2006)), depsipéptido (FR901228, FK228) (ver, por ejemplo, Zhu, y otros, Current Medicinal Chemistry 3(3): 187-199 (2003)), trapoxin (TPX) (ver, por ejemplo, Furumai, y otros, PNAS 98(1):87-92 (2001)), péptido 1 que contiene ácido cíclico hidroxámico (CHAP1) (ver, Furumai supra), MS-275 (ver, por ejemplo, Carninci, y otros, documento WO2008/126932)), LBH589 (ver, por ejemplo, Goh, y otros, documento WO2008/108741) y PXD101 (ver, Goh, supra). En general, a nivel global, las células pluripotentes tienen más acetilación de histonas y las células diferenciadas tienen menos acetilación de histonas. La acetilación de histonas está involucrada, además, en la regulación de la metilación de histonas y ADN. Los inhibidores de HDAC pueden facilitar la activación de genes de pluripotencia silenciados.
Para abordar los problemas de seguridad que surgen de los genomas de células diana que portan secuencias exógenas integradas, se han desarrollado una serie de protocolos genéticos modificados. Estos protocolos producen células iPS con riesgos potencialmente reducidos e incluyen adenovirus que no se integran para el suministro de genes de reprogramación (Stadtfeld, M., y otros, (2008) Science 322, 945-949), transfección transiente de plásmidos de reprogramación (Okita, K., y otros, (2008) Science 322, 949-953), sistemas de transposición piggyBac (Woltjen, K., y otros, (2009). Nature 458, 766-770, Kaji, K., y otros, (2009) Nature 458, 771-775), virus Cre escindible (Soldner, F., y otros, (2009) Cell 136, 964-977), y sistema de expresión episomal basado en oriP/EBNA1 (Yu, J., y otros, (2009) Science DOI: 10.1126). Además, las estrategias de explotación de la expresión de genes endógenos en determinados tipos de células también permitieron una reprogramación más fácil y/o con menos genes exógenos requeridos (Shi, Y., y otros, (2008b). Cell Stem Cell 2, 525-528; Aasen, T., y otros, (2008) Nat Biotechnol 26, 1276­ 1284; Kim, J.B., y otros, (2008). Nature 454, 646-650). Además, se han identificado moléculas pequeñas que mejoran la eficacia de la reprogramación y reemplazan determinados factores de reprogramación (Shi, Y., y otros, (2008) Cell Stem Cell 2, 525-528, Shi, Y., y otros, (2008) Cell Stem Cell 3, 568-574, Li, W., y otros, (2009) Cell Stem Cell 4, 16-19; Huangfu, D., y otros, (2008) Nat Biotechnol 26, 1269-1275, Huangfu, D., y otros, (2008) Nat Biotechnol 26, 795-797).
Además, recientemente, se ha demostrado que los factores de transcripción pueden suministrarse como proteína exógena a células no pluripotentes para generar iPSC. Ver, por ejemplo, el documento WO/2009/117439; Zhou y otros, Cell Stem Cell 4:381-384 (2009). Puede introducirse un polipéptido exógeno (es decir, una proteína proporcionada desde fuera de la célula y/o que no es producida por la célula) en la célula mediante varios métodos diferentes que no implican la introducción de un polinucleótido que codifica el polipéptido. Por lo tanto, las células no pluripotentes pueden ponerse en contacto con un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, preferentemente, en combinación con un inhibidor de la vía MEK/ERK y, en casos particulares, un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK y una o más proteínas del factor de transcripción exógenas, por ejemplo, uno, dos, tres o los cuatro de un polipéptido Oct, un polipéptido Klf, un polipéptido Myc y un polipéptido Sox.
Se han descrito diversas formas para introducir los factores proteicos relevantes en las células diana. La introducción de un polipéptido en una célula puede comprender la introducción de un polinucleótido que comprende uno o más casetes de expresión en una célula e inducir la expresión, de esta manera se introducen los polipéptidos en la célula mediante transcripción y traducción a partir del casete de expresión.
Alternativamente, una o más proteínas pueden simplemente cultivarse en presencia de células diana en condiciones que permitan la introducción de las proteínas en la célula. Ver, por ejemplo, Zhou H y otros, Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 2009 May 8;4(5):381-4. Las proteínas exógenas pueden comprender el polipéptido del factor de transcripción de interés unido (por ejemplo, unido como una proteína de fusión o unido covalente o no covalentemente) a un polipéptido que mejora la capacidad del factor de transcripción para entrar en la célula (y en algunos casos al núcleo de la célula).
Los ejemplos de secuencias polipeptídicas que mejoran el transporte a través de las membranas incluyen, pero no se limitan a, la proteína de transcripción de antenapedia homeoproteína de Drosophila (AntHD) (Joliot y otros, New Biol. 3: 1121-34,1991 ; Joliot y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. uSa , 88: 1864-8,1991 ; Le Roux y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 9120-4,1993), la proteína estructural VP22 del virus del herpes simple (Elliott and O'Hare, Cell 88: 223-33,1997); la proteína Ta T activador transcripcional de HIV-1 (Green and Loewenstein, Cell 55: 1179-1188, 1988 ; Frankel and Pabo, Cell 55: 1289-1193, 1988); transportadores que mejoran el suministro, tales como los descritos en la patente de EE. UU. núm. 6,730,293 (que incluye pero no se limita a una secuencia peptídica que comprende al menos 7-25 argininas contiguas); y el péptido Penetratin™ 1 comercialmente disponible, y los vectores peptídicos de Diatos ("DPV") de la plataforma Vectocell® disponible de Daitos SA de París, Francia. Ver además, los documentos WO/2005/084158 y WO/2007/123667 y transportadores adicionales descritos en ellos. Estas proteínas no solo pueden atravesar la membrana plasmática, sino que la unión de otras proteínas, tales como los factores de transcripción descritos en la presente descripción, es suficiente para estimular la captación celular de estos complejos.
Los polipéptidos del factor de transcripción descritos en la presente descripción pueden introducirse de forma exógena como parte de un liposoma o cóctel de lípidos, tal como Fugene6 y Lipofectamina, disponibles comercialmente. En otra alternativa, las proteínas del factor de transcripción pueden microinyectarse o introducirse directamente de cualquier otra manera en la célula diana.
Como se discutió en los Ejemplos del documento WO/2009/117439, la incubación de células con los polipéptidos del factor de transcripción descritos en la presente descripción durante periodos prolongados es tóxica para las células. Por lo tanto, en la presente descripción se describe la incubación intermitente de células de mamífero no pluripotentes con uno o más de un polipéptido Klf, un polipéptido Oct, un polipéptido Myc y/o un polipéptido Sox, con períodos intermedios de incubación de las células en ausencia de uno o más polipéptidos. El ciclo de incubación con y sin los polipéptidos puede repetirse 2, 3, 4, 5, 6 o más veces y se realiza durante períodos de tiempo suficientes (es decir, las incubaciones con y sin proteínas) para lograr el desarrollo de células pluripotentes. Pueden incluirse diversos agentes (por ejemplo, inhibidor de la vía MEK/ERK y/o inhibidor de GSK3 y/o inhibidor de TGFbeta/ALK5 y/o inhibidor de la vía Rho GTPasa/ROCK) para mejorar la eficacia del método.
Los diversos inhibidores (por ejemplo, el inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, inhibidor de la ruta de MEK/ERK y, en casos particulares, el inhibidor de Rho GTPasa/ROCK y/o el inhibidor de GSK3, etcétera) pueden ponerse en contacto con células no pluripotentes antes de, simultáneamente con, o después del suministro de factores de transcripción de programación (por ejemplo, suministrados a través de un casete de expresión o como proteínas). Por conveniencia, el día en que se suministran los factores de reprogramación se designa como "día 1". Los inhibidores pueden ponerse en contacto con las células en conjunto (es decir, como un "cóctel") aproximadamente en los días 3-7 y continuar durante 7-14 días. Alternativamente, el cóctel puede ponerse en contacto con las células el día 0 (es decir, un día antes de los factores de reprogramación) e incubarse durante aproximadamente 14-30 días. Pueden añadirse diferentes inhibidores en diferentes momentos. De 1-7 días después del suministro de los factores de reprogramación, las células pueden ponerse en contacto con una combinación de compuestos de un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5 (por ejemplo, SB431542) y un inhibidor de ROCK durante 1-8 días, seguido del contacto de las células con el inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, el inhibidor de ROCK y un inhibidor de la vía MEK/ERK (por ejemplo, PD0325901) durante 1-8 días. Esto puede seguirse opcionalmente por el contacto con el inhibidor del receptor de TGFp/ALK5 y el inhibidor de la vía de MEK/ERK (pero no necesariamente el inhibidor de ROCK) durante 1-4 días, seguido del contacto con el inhibidor de la vía de MEK/ERK (pero no el inhibidor del receptor de TGFp/ALK5 o el inhibidor de ROCK) y, opcionalmente, finalmente con medio ES basal (por ejemplo, basal humano) sin inhibidores durante 1-4 días. Además, pueden emplearse otras combinaciones.
IV. Transformación
Esta invención emplea técnicas de rutina en el campo de la genética recombinante. Los textos básicos que describen los métodos generales de uso en esta invención incluyen Sambrook y otros, Molecular Cloning, A LaboratoryManual (3ra ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, eds., 1994)).
Las especies de células y proteínas a expresar pueden ser las mismas. Por ejemplo, si se usa una célula de ratón, se introduce un ortólogo de ratón en la célula. Si se usa una célula humana, se introduce un ortólogo humano en la célula.
Se apreciará que cuando se van a expresar dos o más proteínas en una célula, pueden usarse uno o múltiples casetes de expresión. Por ejemplo, cuando un casete de expresión expresa múltiples polipéptidos, puede usarse un casete de expresión policistrónico.
A. Vectores plasmídicos
Puede contemplarse un vector plasmídico para usar con el propósito de transformar una célula hospedera. En general, los vectores plasmídicos que contienen replicón y secuencias de control que se derivan de especies compatibles con la célula hospedera se usan en relación con estos hospederos. El vector puede llevar un sitio de replicación, así como también secuencias de marcado que son capaces de proporcionar la selección fenotípica en células transformadas.
B. Vectores virales
La capacidad de determinados virus para infectar células o ingresar a las células a través de endocitosis mediada por receptores, y para integrarse en el genoma de la célula hospedera y expresar genes virales de manera estable y eficiente, los ha convertido en candidatos atractivos para la transferencia de ácidos nucleicos extraños a las células (por ejemplo, células de mamífero). Los ejemplos no limitantes de vectores virales que pueden usarse para suministrar un ácido nucleico se describen más abajo.
i. Vectores adenovirales
Un método particular para el suministro del ácido nucleico implica el uso de un vector de expresión de adenovirus. Aunque se sabe que los vectores de adenovirus tienen una baja capacidad de integración en el ADN genómico, esta característica se ve contrarrestada por la alta eficacia de transferencia de genes que ofrecen estos vectores. "Vector de expresión de adenovirus" pretende incluir aquellos constructos que contienen secuencias de adenovirus suficientes para (a) soportar el empaquetamiento del constructo y (b) expresar finalmente un constructo específico de tejido o célula que se ha clonado en él. El conocimiento de la organización genética o adenovirus, un virus de ADN lineal de doble cadena de ~36 kb, permite la sustitución de grandes fragmentos de ADN adenoviral con secuencias extrañas de hasta 7 kb (Grunhaus y otros, Seminar in Virology, 200(2):535-546, 1992)).
ii. Vectores AAV
El ácido nucleico puede introducirse en la célula mediante el uso de transfección asistida por adenovirus. Se han informado mayores eficacias de transfección en sistemas celulares que usan sistemas acoplados a adenovirus (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6): 1110-7, 1994; Cotten y otros, Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64, 1994.). El virus adenoasociado (AAV) es un sistema de vector atractivo ya que tiene una alta frecuencia de integración y puede infectar células que no se dividen, lo que lo hace útil para el suministro de genes en células de mamífero, por ejemplo, en cultivo de tejidos (Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992) o en vivo. Los detalles relacionados con la generación y el uso de vectores rAAV se describen en las patentes de EE. UU. núm. 5,139,941 y 4,797,368.
iii. Vectores retrovirales
Los retrovirus son prometedores como vectores de suministro de genes debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma del hospedero, mediante la transferencia de una gran cantidad de material genético extraño, infectando un amplio espectro de especies y tipos de células y siendo empaquetados en líneas celulares especiales (Miller y otros, Am. J. Clin. Oncol., 15(3):216-221, 1992).
Para construir un vector retroviral, se inserta un ácido nucleico (por ejemplo, un gen codificante de interés) en el genoma viral en el lugar de determinadas secuencias virales para producir un virus que es defectuoso en la replicación. Para producir viriones, se construye una línea celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol y env pero sin la LTR ni los componentes de empaquetamiento (Mann y otros, Cell, 33:153-159, 1983). Cuando un plásmido recombinante que contiene un ADNc, junto con la LTR retroviral y las secuencias de empaquetamiento se introducen en una línea celular especial (por ejemplo, mediante precipitación con fosfato de calcio, por ejemplo), la secuencia de empaquetamiento permite que la transcripción de ARN del plásmido recombinante se empaquete en partículas virales, que después se secretan en los medios de cultivo (Nicolas and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), Nueva York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986; Mann y otros, Cell, 33:153-159, 1983). Después, se recolecta el medio que contiene los retrovirus recombinantes, se concentra opcionalmente y se usa para la transferencia de genes. Los vectores retrovirales pueden infectar una amplia variedad de tipos de células. Sin embargo, la integración y la expresión estable típicamente implican la división de las células hospederas (Paskind y otros, Virology, 67:242-248, 1975).
Los lentivirus son retrovirus complejos que, además de los genes retrovirales comunes gag, pol y env, contienen otros genes con función reguladora o estructural. Los vectores lentivirales son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Naldini y otros, Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey y otros, Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer y otros, J Virol., 71(9):6641-6649, 1997; patentes de EE. UU. núm. 6,013,516 y 5,994,136). Algunos ejemplos de lentivirus incluyen los Virus de Inmunodeficiencia Humana: HIV-1, HIV-2 y el Virus de Inmunodeficiencia de Simios: SIV. Los vectores lentivirales se han generado mediante la atenuación múltiple de los genes de virulencia del HIV, por ejemplo, los genes env, vif, vpr, vpu y nef se eliminan lo que hace que el vector sea biológicamente seguro.
Los vectores lentivirales recombinantes son capaces de infectar células que no se dividen y pueden usarse para la transferencia de genes y la expresión de secuencias de ácidos nucleicos tanto in vivo como ex vivo. Por ejemplo, el lentivirus recombinante capaz de infectar una célula que no se divide, en donde una célula hospedera adecuada se transfecta con dos o más vectores que portan las funciones de empaquetamiento, específicamente, gag, pol y env, así como también rev y tat, se describe en la patente de EE. u U. núm. 5,994,136. Uno puede dirigirse al virus recombinante mediante el enlace de la proteína de la envoltura con un anticuerpo o un ligando particular para dirigirse a un receptor de un tipo de célula particular. Mediante la inserción de una secuencia (que incluye una región reguladora) de interés en el vector viral, junto con otro gen que codifica el ligando de un receptor en una célula diana específica, por ejemplo, el vector ahora es específico de la diana.
iv. Suministro mediante el uso de virus modificados
Un ácido nucleico que va a suministrarse puede alojarse dentro de un virus infeccioso que se ha modificado genéticamente para expresar un ligando de unión específica. Por lo tanto, la partícula de virus se unirá específicamente a los receptores afines de la célula diana y suministrará el contenido a la célula. Se desarrolló un enfoque novedoso diseñado para permitir el direccionamiento específico de vectores de retrovirus basado en la modificación química de un retrovirus mediante la adición química de residuos de lactosa a la envoltura viral. Esta modificación puede permitir la infección específica de hepatocitos a través de receptores de sialoglicoproteína. Se diseñó otro enfoque para el direccionamiento de retrovirus recombinantes en el que se usaron anticuerpos biotinilados contra una proteína de la envoltura retroviral y contra un receptor celular específico. Los anticuerpos se acoplaron a través de los componentes de biotina mediante el uso de estreptavidina (Roux y otros, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86:9079-9083, 1989). Mediante el uso de anticuerpos contra antígenos de clase I y clase II del complejo mayor de histocompatibilidad, demostraron la infección de una variedad de células humanas que portaban esos antígenos de superficie con un virus ecotrópico in vitro (Roux y otros, 1989).
C. Suministro de vectores y transformación celular
Se cree que los métodos adecuados para el suministro de ácidos nucleicos para la transformación de una célula, un tejido o un organismo incluyen prácticamente cualquier método mediante el cual pueda introducirse un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) en una célula, un tejido o un organismo, como se describe en la presente descripción o como sería conocido por un experto en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, el suministro directo de ADN, tal como por transfección ex vivo (Wilson y otros, Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel and Baltimore, Nature 326:711-713, 1987), opcionalmente con Fugene6 (Roche) o Lipofectamina (Invitrogen), mediante inyección (patentes de EE. UU. núm. 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 y 5,580,859), que incluye microinyección (Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985; patente de EE. UU. núm. 5,789,215); mediante electroporación (patente de EE. UU. núm. 5,384,253; Tur-Kaspa y otros, Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter y otros, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984); mediante precipitación con fosfato de calcio (Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987; Rippe y otros, Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990); mediante el uso de DEAE-dextrán seguido de polietilenglicol (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985); mediante carga sónica directa (Fechheimer y otros, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987); mediante transfección mediada por liposoma (Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley y otros, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau y otros, Methods Enzymol., 149:157-176, 1987; Wong y otros, Gene, 10:87-94, 1980; Kaneda y otros, Science, 243:375-378, 1989; Kato y otros, J Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991) y transfección mediada por receptor (Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987); y cualquier combinación de tales métodos.
VII. Mezclas
En la presente descripción se describen mezclas que mejoran la eficacia de generación de iPSC. Por ejemplo, se describen mezclas de un inhibidor del receptor de TGFp/ÁLK5, un inhibidor de la vía de MEK/ERK, un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK, en casos particulares, con células de mamífero. Por ejemplo, las mezclas pueden incluirse en medios de cultivo celular, con o sin células. Los contenidos de los medios de cultivo celular son generalmente conocidos en la técnica. Los medios de cultivo celular representativos se describen en detalle en los Ejemplos. Generalmente, los cultivos celulares que comprenden células de mamífero y los agentes descritos en la presente descripción (inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, un inhibidor de la vía MEK/ERK y un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK) inicialmente contendrán todas o sustancialmente todas las células no pluripotentes. Sin embargo, con el tiempo, especialmente en las condiciones de los protocolos descritos en la presente descripción, una parte de las células se volverá pluripotente (es decir, iPSC).
Las células que se van a inducir a la pluripotencia pueden cultivarse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica. Las pautas generales para las condiciones de cultivo para generar iPSC pueden encontrarse en, por ejemplo, Maherali, y otros, Cell Stem Cell 3:595-605 (2008).
Las células pueden cultivarse en contacto con células alimentadoras. Las células alimentadoras representativas incluyen, pero no se limitan a, células de fibroblastos, por ejemplo, células de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). Los métodos de cultivo de células sobre células alimentadoras son conocidos en la técnica.
Las células pueden cultivarse en ausencia de células alimentadoras. Las células, por ejemplo, pueden unirse directamente a una superficie de cultivo sólida (por ejemplo, una placa de cultivo), por ejemplo, a través de una atadura molecular. Los inventores han encontrado que el cultivo de células inducidas a la pluripotencia tiene una eficacia de inducción a la pluripotencia mucho mayor (es decir, una mayor parte de las células alcanza la pluripotencia) cuando las células se unen directamente a la superficie de cultivo sólida en comparación con la eficacia de las células tratadas de manera idéntica que se cultivan sobre células alimentadoras. Las ataduras moleculares representativas incluyen, pero no se limitan a, Matrigel®, una matriz extracelular (ECM), análogos de ECM, laminina, fibronectina o colágeno. Sin embargo, los expertos en la técnica reconocerán que esta es una lista no limitante y que pueden usarse otras moléculas para unir células a una superficie sólida. Los métodos para la fijación inicial de las ataduras a la superficie sólida son conocidos en la técnica.
Como se describe en la presente descripción, las mezclas descritas en la presente descripción pueden incluir o excluir células de mamífero (que incluye células pluripotentes o no pluripotentes) y uno o más de un inhibidor de HDAC, inhibidor de GSK3 o un agonista del canal de Ca tipo L; un activador de la vía del AMPc; un inhibidor de la ADN metiltransferasa (DNMT); un ligando de receptor nuclear, por ejemplo, como se describe en el documento PCT WO/2009/117439.
VIII. Kits
En la presente descripción se describen kits, por ejemplo, para usar en la generación de células madre pluripotentes inducidas. Tales kits pueden comprender cualquiera o todos los reactivos descritos en la presente descripción, que incluyen, pero no se limitan a: un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5, un inhibidor de la vía MEK/ERK y/o un inhibidor de Rho GTPasa/ROCK, como se describe en la presente descripción. Estos tres agentes, o subconjuntos de estos, pueden estar presentes en el kit en recipientes separados o juntos como una mezcla. Los kits pueden incluir, además, uno o más de un inhibidor de HDAC, un inhibidor de GSK3 o un agonista del canal de Ca de tipo L; un activador de la vía del AMPc; un inhibidor de la ADN metiltransferasa (DNMT); y un ligando del receptor nuclear. Los kits pueden incluir uno o más tipos de células de mamífero (por ejemplo, humano, ratón, rata, etcétera) y/o medios de cultivo celular.
Los kits pueden incluir uno o más polinucleótidos que comprenden casetes de expresión para la expresión de uno o más del polipéptido Oct, un polipéptido Klf, un polipéptido Myc y un polipéptido Sox. Además, o alternativamente, los kits pueden comprender una o más proteínas de factor de transcripción aisladas, por ejemplo, uno, dos, tres o los cuatro de un polipéptido Oct, un polipéptido Klf, un polipéptido Myc y un polipéptido Sox. Las proteínas del factor de transcripción pueden fusionarse con una secuencia polipeptídica para potenciar el transporte de las proteínas del factor de transcripción a través de las membranas celulares.
VI. Usos de las células pluripotentes
La presente descripción permite el estudio y desarrollo adicional de tecnologías de células madre, que incluye pero no se limitan a, usos profilácticos o terapéuticos. Por ejemplo, las células descritas en la presente descripción (ya sean células pluripotentes o células inducidas para diferenciarse a lo largo de un destino celular deseado) pueden introducirse en personas que lo necesiten, que incluye, entre otras, personas que necesitan la regeneración de un órgano, tejido o tipo de célula. Las células pueden obtenerse originalmente en una biopsia de un individuo; inducida a la pluripotencia como se describe en la presente descripción, opcionalmente inducida a la diferenciación (por ejemplo, en una célula progenitora particular conveniente) y después trasplantada de nuevo al individuo. Las células pueden modificarse genéticamente antes de su introducción en el individuo.
Las células pluripotentes generadas de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción pueden inducirse posteriormente para formar, por ejemplo, células hematopoyéticas (madre/progenitoras), células neurales (madre/progenitoras) (y opcionalmente, células más diferenciadas, tales como subtipo específico de neuronas, oligodendrocitos, etcétera), células pancreáticas (por ejemplo, células progenitoras endocrinas o células que expresan hormonas pancreáticas), hepatocitos, células cardiovasculares (madre/progenitoras) (por ejemplo, cardiomiocitos, células endoteliales, células de músculo liso), células retinales, etcétera.
Se conocen una variedad de métodos para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes en tipos de células convenientes. Una lista no limitante de publicaciones de patentes recientes que describen métodos para inducir la diferenciación de células madre en varios destinos celulares es la siguiente: publicaciones de patentes de EE. UU. núm.: 2007/0281355; 2007/0269412; 2007/0264709; 2007/0259423; 2007/0254359; 2007/0196919; 2007/0172946; 2007/0141703; 2007/0134215.
Una variedad de enfermedades puede mejorarse mediante la introducción y, opcionalmente, el direccionamiento de células pluripotentes a un tejido particular lesionado. Los ejemplos de enfermedades resultantes de un tejido lesionado incluyen, pero no se limitan a, enfermedad neurodegenerativa, infarto cerebral, enfermedad vascular obstructiva, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfisema pulmonar, bronquitis, enfermedad pulmonar intersticial, asma, hepatitis B (daño hepático), hepatitis C (daño hepático), hepatitis alcohólica (daño hepático), cirrosis hepática (daño hepático), insuficiencia hepática (daño hepático), pancreatitis, diabetes mellitus, enfermedad de Crohn, colitis inflamatoria, glomerulonefritis por IgA, glomerulonefritis, insuficiencia renal, decúbito, quemadura, herida por suturas, laceración, herida incisa, herida por mordedura, dermatitis, queloide cicatricial, queloide, úlcera diabética, úlcera arterial y úlcera venosa.
Las iPSC pueden usarse en varios ensayos y exámenes para identificar moléculas que modulan su función, lo que incluye, pero no se limita a, promover la supervivencia y/o la diferenciación de las iPSC.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada.
Ejemplo 1: una plataforma química para mejorar la inducción de iPSC humanas
Los fibroblastos de tipo mesenquimatoso reprogramados con los "cuatro factores" (OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC; 4TF en lo sucesivo) experimentaron cambios morfológicos drásticos que resultaron en iPSC con distinta polaridad celular, límites e interacciones célula-célula. Las células reprogramadas expresaron E-cadherina, un marcador para las células epiteliales (Hay, E.D., Acta Anat. (Basel) 154, 8-20 (1995)), que además se expresa en gran medida en células madre embrionarias humanas (hESC). Razonamos que los factores que promueven la transición mesenquimatosa a epitelial (MET), tales como los antagonistas de la vía del TGFp, tendrían un impacto directo en el proceso de reprogramación. Además, se demostró previamente que la inhibición de la vía MEK-ERk desempeña un papel importante en varias etapas de la reprogramación (Chen, S. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 104, 10482­ 87 (2007); Shi, Y. y otros, Cell Stem Cell 2, 525-8 (2008)). Además, los factores que promueven la supervivencia celular también podrían ser beneficiosos para mejorar la eficacia de la reprogramación. En consecuencia, nos enfocamos en moléculas pequeñas que pueden regular estos tres procesos y vías, ya que las moléculas pequeñas tienen muchas ventajas (Feng, B. y otros, Cell Stem Cell 4, 301-12 (2009); Shi, Y. y otros, Cell Stem Cell 2, 525-8 (2008) ; Xu, Y. y otros, Nature 453, 338-44 (2008)) en el estudio de procesos biológicos y son una opción más segura que la manipulación genética. Aquí describimos una plataforma química simple que mejora sustancialmente la generación de iPSC humanas completamente reprogramadas a partir de fibroblastos a través de un proceso mucho más rápido y eficiente.
Probamos inhibidores conocidos del receptor de TGFp y MEK en 1*104 (Feng, B. y otros, Cell Stem Cell 4, 301-12 (2009) ) fibroblastos primarios humanos (CRL2097 o BJ) que se transdujeron retroviralmente con los 4TF, por su efecto sobre la cinética y la eficacia de la reprogramación (ver Figura 1a para los detalles). En el día 7 (D7) después de la infección, se añadieron los compuestos, individualmente o en combinaciones, y se examinaron los cultivos en busca de iPSC durante las siguientes 1-3 semanas.
En el día 7 después del tratamiento (D14), observamos el efecto más fuerte en los cultivos tratados con una combinación del inhibidor de ALK5 SB431542 (2 pM) y el inhibidor de MEK PD0325901 (0,5 pM), que resultó en ~45 colonias ALP+ grandes (Figura 1b) con una morfología característica similar a hESC, de las cuales más de 24 colonias eran TRA-1-81 (Figura 1d), y aproximadamente de 6-10 colonias se tiñeron positivamente para SSEA4 y NANOG, un factor de pluripotencia maduro que no se introduce ectópicamente (Figuras 1e y 1f). Además, los cultivos tratados mostraron un alto nivel de expresión del ARNm endógeno para los genes de pluripotencia (Figura 1c). Por el contrario, no se observaron colonias NANOG+ en los cultivos de control no tratados (Figura 1e y Figura 4a) o en cultivos que se trataron solo con PD0325901 (Figura 4a). Sin embargo, en los cultivos tratados solo con SB431542, todavía observamos 1-2 colonias ALP+ similares a hESC (Figura 4a). Es importante destacar que el efecto combinado de ambos inhibidores (Figuras 4b y 4c), así como también el efecto individual de SB431542 fue dependiente de la dosis.
Cuando mantuvimos los cultivos tratados con SB431542 más PD0325901 durante 30 días sin dividirlos, obtuvimos aproximadamente 135 colonias iPSC por pocillo (Figura 2d), una mejora de más de 100 veces en la eficacia con respecto al método convencional. De acuerdo con informes anteriores (Takahashi, K. y otros, Cell 131, 861-72 (2007)), en controles no tratados que portaban los 4TF, observamos 1-2 colonias iPSC además de varias colonias granulares (Figura 2c). Se ha sugerido que estas estructuras granulares son colonias parcialmente reprogramadas (Takahashi, K. y otros, Cell 131, 861-72 (2007)). Además, observamos colonias granulares en los cultivos tratados con SB431542, que superaban varias veces en número a las pocas colonias similares a hESC. Curiosamente, el número de colonias granulares se redujo drásticamente en el tratamiento combinado de SB431542 y PD0325901, que resultó en un aumento concomitante en el número de colonias similares a hESC. Esto sugirió que una inhibición combinada de ALK5 y MEK puede guiar a las colonias parcialmente reprogramadas a un estado completamente reprogramado y, por lo tanto, mejorar el proceso de reprogramación general. Además, el hecho de que observáramos una mejor inducción de iPSC tan pronto como 7 días después del tratamiento sugiere que el tratamiento con estas pequeñas moléculas no solo mejoró la eficacia del proceso de reprogramación, sino que además puede haber acelerado su cinética (Figura 1a). Se requieren experimentos adicionales para determinar si las células reprogramadas en esta etapa realmente se vuelven totalmente independientes de los factores de reprogramación exógenos antes que en los cultivos no tratados.
Aunque las colonias de iPSC se seleccionaron y se expandieron, como en los cultivos de hESC, los cultivos divididos mediante tripsinización resultaron en una supervivencia deficiente. A partir de una selección reciente realizada en nuestro laboratorio, identificamos una nueva molécula pequeña, la tiazovivina (Figura 5), que mejoró drásticamente la supervivencia de las hESC después de la tripsinización. La adición de tiazovivina a nuestro cóctel de SB431542 y PD0325901 también mejoró enormemente la supervivencia de las iPSC después de dividirse mediante tripsinización (Figura 2a), y se obtuvo una gran cantidad de colonias reprogramadas. De 10 000 células que se sembraron originalmente, una única división 1:4 en el día 14 resultó en ~1000 colonias similares a hESC en el día 30 (Figura 2e), mientras que dos rondas de división (el día 14 y el día 21 (1:10)) resultó en ~11 000 colonias similares a hESC (Figuras 2c y 2e) en el día 30. Estas colonias mostraron altos niveles de ARNm endógeno (Figura 2f) y expresión de proteínas (Figuras 2b y 2c) de marcadores de pluripotencia, mientras que la expresión de los cuatro transgenes apenas pudo detectarse (Figura 2f). Por el contrario, no se obtuvieron colonias iPSC de muestras no tratadas o tratadas con 2 compuestos que se tripsinizaron (Tabla 1).
Tabla 1: Una comparación del número de colonias de iPSC observadas en cultivos no tratados, tratados con 2 compuestos y tratados con 3 compuestos en el día 30.
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Para examinar si el efecto positivo de la tiazovivina se debe únicamente a la supervivencia de las colonias después de la división o si también aumenta el efecto de reprogramación del tratamiento combinado con SB431542 y PD0325901, probamos el cóctel de 3 compuestos en células transducidas con los 4TF que no se sometieron a división. En estos cultivos, para el día 14 observamos ~25 colonias grandes que expresaban Nanog (Figura 1e). Para el día 30, observamos ~205 colonias NANOG+ muy grandes (Figura 2d), que también eran TRA-1-81 y SSEA4+ (datos no mostrados), lo que se tradujo en una mejora de más de 200 veces en la eficacia sobre el tratamiento sin compuesto y un aumento del doble sobre el tratamiento de 2 compuestos.
El tratamiento con dos compuestos resultó, además, en un mayor número de colonias positivas para fosfatasa alcalina en comparación con los controles no tratados cuando los factores de reprogramación se introdujeron mediante el uso de un sistema lentiviral, en lugar de un sistema retroviral (Figura 6a). Además, el cóctel de 3 compuestos no pareció influir en la expresión del factor de reprogramación de los vectores retrovirales (Figuras 6b-f). Las colonias de iPSC generadas con el cóctel de 3 compuestos se expandieron fácil y establemente a largo plazo en condiciones de cultivo convencionales de hESC (más de 20 pases) y se parecían mucho a las hESC en términos de morfología, expresión de marcadores típicos de pluripotencia y potenciales de diferenciación. Exhibían un cariotipo normal (Figura 7) y podían diferenciarse en derivados de las tres capas germinales, tanto in vitro (Figuras 3a y 3b) como in vivo (Figura 3c). Estos resultados sugirieron, además, que no hay ningún efecto adverso a corto plazo asociado con el procedimiento de tripsinización mucho más conveniente.
La demostración de que la inhibición de la vía TGFp y MEK-ERK mejoró la reprogramación de fibroblastos sugirió papeles críticos para estas dos vías de señalización y mecanismos de MET en el proceso. Consistentemente, la adición de TGFp tuvo un efecto inhibidor sobre la reprogramación de fibroblastos mediada por los 4 factores (datos no mostrados). El TGFp y los miembros de su familia juegan papeles contextuales importantes en la autorrenovación y diferenciación de eSc (Watabe, T. and Miyazono, K., Cell Res. 19, 103-15 (2009)). Además, el TGFp es una citocina prototípica para la inducción de la transición mesenquimatosa epitelial (EMT) y el mantenimiento del estado mesenquimatoso (Willis, B.C. and Borok, Z., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.293, L525-34 (2007)). Un punto final importante de esta señalización, en este contexto, es la regulación negativa de la E-cadherina (Thiery, J.P. and Sleeman, J.P., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 7, 131-42 (2006)). Se ha demostrado que la E-cadherina es importante para el mantenimiento de la pluripotencia de las ESC y recientemente se ha sugerido que es un regulador de la expresión de NANOG (Chou, Y.F. y otros, Cell 135, 449-61 (2008)). Por lo tanto, la inhibición de la señalización de TGFO, que resulta en la desrepresión del destino epitelial, podría beneficiar el proceso de reprogramación de múltiples maneras. La señalización e Rk también promueve la EMT (Thiery, J.P. and Sleeman, J.P., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 131-42 (2006)), y está aguas abajo de TGFp en el proceso (Chou, Y.F. y otros, Cell 135, 449-61 (2008)). Anteriormente habíamos demostrado que el efecto de la reversina, una molécula pequeña que puede reprogramar los mioblastos a un estado multipotente, está mediado en parte por la inhibición de MEK-ERK (Chen, S. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. US A 104, 10482-87 (2007)). Esto puede explicar el efecto observado en la reprogramación cuando se combinó con la inhibición de TGFp.
La plataforma química descrita aquí es única, ya que modula las vías de señalización aguas arriba y podría mejorar radicalmente la reprogramación en un tipo de célula general, como los fibroblastos. Las condiciones químicas descritas aquí proporcionan una plataforma básica para los métodos de reprogramación no viral y no basados en ADN (Zhou, H. y otros, Cell Stem Cell 4, 381-84, (2009)), más eficaces y seguros, que podrían generar un suministro ilimitado de iPSC humanas seguras para diversas aplicaciones.
Métodos
Cultivo de células
Los fibroblastos primarios de piel crl2097 y bj (prepucio neonatal) se adquirieron de la atcc. Todos los reactivos de medios de cultivo celular se adquirieron de invitrogen corporation, ca. Las células se mantuvieron en dmem (10313­ 021) que contenía fbs 10 % (10439-024), mem de aminoácidos no esenciales (11140-050) ix, glutamax (35050-061) 1x, hepes (15630-080) 10 mm y 2-mercaptoetanol 0,11 mm (21985-023). Las células se pasaron 1:5 mediante el uso de tripsina-edta al 0,05 % (ix) (25300-054).
Plásmidos
El vector pMXs que codifica los ADNc humanos para OCT4, SOX2, c-MYC y KLF4, descritos antes (Takahashi, K. y otros, Cell 131, 861-72 (2007)), se obtuvieron de ADDGENE. Mouse Slc7a1 ORF se clonó en pWPXLD (Addgene), como se describió anteriormente (Takahashi, K. y otros, Cell 131, 861-72 (2007)).
Infección retroviral y generación de células iPS
Los lentivirus que portaban OCT4, NANOG, SOX2 y LIN28 se produjeron como se describió anteriormente (Yu, J. y otros, Science 318, 1917-20 (2007)). Para la producción de retrovirus, las células de empaquetamiento PLAT-E se sembraron en placas a razón de 1x106 células/pocillo en una placa de 6 pocillos. Después de 24 horas, las células se transfectaron con vectores pMXs que portaban los ADNc de OCT4, SOX2, c-MYC y KLF4 mediante el uso del reactivo de transfección Fugene 6 (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, el medio se reemplazó con medio nuevo y la placa se transfirió a 32 °C para la producción de retrovirus. Los virus se recolectaron a las 48 horas y a las 72 horas y se filtraron con un filtro de 0,45 |jm antes de la transducción.
Las células de fibroblastos humanos que expresan Slc7a1 se sembraron a razón de 1x105 células/pocillo en una placa de 6 pocillos el día 1. El día 2, se añadieron a las células 0,25 ml de cada sobrenadante retroviral en presencia de 6 jg/ml de polibreno. Se realizó una segunda ronda de transducción el día 3. La eficacia de la infección se estimó mediante microscopía de fluorescencia en células transducidas en paralelo con retrovirus portadores de los genes GFP o RFP. Siete días después de la transducción inicial, los fibroblastos se recolectaron mediante tripsinización y se volvieron a sembrar en placas a razón de 1x104 células/pocillo en una placa de 6 pocillos recubierta con matrigel (dilución 1:50, núm. de catálogo 354234, BD Biosciences). Para el tratamiento con los compuestos, las células se cultivaron en medio de reprogramación humano (DMEM/F12, sustituto de suero de desactivación génica al 20 %, MEM de aminoácidos no esenciales 1x, glutamax 1x, 2-mercaptoetanol 0,11 mM, bFGF 20 ng/ml y LIF 1000 U/ml) y se trataron con SB4315422 jM (Stemgent), PD0325901 0,5 jM (Stemgent), tiazovivina 0,5 jM o combinaciones de los compuestos. Los medios se cambiaron cada 2-3 días en dependencia de la densidad celular. Siete días después del tratamiento con los compuestos, las placas se fijaron y se tiñeron para detectar la actividad de fosfatasa alcalina (ALP), o se tiñeron para revelar marcadores de proteínas, o los cultivos continuaron con o sin la división indicada mediante tripsinización hasta el día 30. Para los cultivos divididos, las células se dividieron (1:4) y se volvieron a sembrar sobre una capa alimentadora MEF CF-1 irradiada (2,5*105 células/pocillo) en cada pocillo de una placa de 6 pocillos y se dividieron (1:10) nuevamente el día 21 Las células se mantuvieron en los mismos medios y mezcla de los compuestos descritos anteriormente excepto por las concentraciones de PD0325901 (0,5 jM para el D14 y 1 jM para el D21) y SB431542 (0,5-1 jM después del D14). Las colonias iPSC se mantuvieron posteriormente en medios convencionales de hESC en ausencia de los compuestos anteriores.
Tinción con fosfatasa alcalina e inmunocitoquímica
La tinción con fosfatasa alcalina se realizó mediante el uso del kit de detección de ALP (núm. de catálogo: SCR004, Chemicon) de acuerdo con las instrucciones del producto. Para la inmunocitoquímica, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % (10 min, RT), se lavaron dos veces con PBS, se bloquearon con suero de burro normal al 5 % (Chemicon) y TritonX-100 al 0,1 % (15 min, RT) y después se trataron con anticuerpos primarios durante toda la noche a 4 °C. Los anticuerpos primarios usados fueron anti-NANOG (núm. de catálogo: AB9220, Chemicon, 1:1000); anti-OCT4 (núm. de cat.: sc-5279, Santa Cruz Biotech, 1:200), anti-SSEA 4 (núm. de cat.: mab4304, Chemicon, 1:500), anti-Tra-1-81 (núm. de cat. 560123, BD Biosciences, 1:100), anti-Tra-1 -81 (AcM 4381, Chemicon, 1:500), anti-pIII TUBULINA (núm. de cat.: MMS-435P, Covance Research Products Inc, 1:1000), anti-PDX 1 (1:500) (donado gentilmente por el Dr. C. Wright), anti-BRACHYURY (núm. de catálogo: AF2085, R&D, concentración final 0,2 pg/ml). Las células se lavaron dos veces con PBS y después se trataron con anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios usados fueron Alexa fluor 488 anti-conejo o anti-ratón IgG generado en burro (Invitrogen, 1:1000) y Alexa fluor 555 anti-conejo o anti-ratón IgG generado en burro (Invitrogen, 1:1000). Los núcleos se tiñeron con DAPI 0,5 pg/ml (Sigma). Las imágenes se capturaron con un microscopio Nikon Eclipse TE2000-U/X-cite 120 EXFO con una cámara fotométrica CoolSnap HQ2.
Ensayo de teratoma y diferenciación in vitro
La generación de cuerpos embrioides y la diferenciación in vitro se realizaron como se describe en otra parte (Takahashi, K. y otros, Cell 131, 861-72 (2007)). Para el ensayo de teratoma, se inyectaron de 3 a 5 millones de células debajo de la cápsula renal de ratones s CiD. Treinta y un días después, los tumores se extirparon y se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se analizaron histológicamente en las instalaciones centrales de histología de Ts Ri. El uso de ratones SCID se aprobó por el comité de investigación animal de UCSD.
RT-PCR
El ARN total se extrajo de las células mediante el uso del minikit RNeasy (Qiagen). Los ADNc se sintetizaron de acuerdo con las instrucciones del producto mediante el uso del kit de síntesis de la primera hebra Superscript III (Invitrogen). Se usaron dos microlitros del producto de reacción para 24-28 ciclos de PCR mediante el uso de los cebadores respectivos. Las secuencias de los cebadores se describen en otra parte (Takahashi, K. y otros, Cell 131, 861-72 (2007)).
Citometría de flujo
Para el análisis de citometría de flujo, los cultivos se tripsinizaron ligeramente y se recolectaron a partir de las placas de 6 pocillos. Las células se lavaron y se suspendieron en tampón FACS (PBS, EDTA 2 mM, HEPES 2 mM, FBS 1 %) y se analizaron en un citómetro fAc S Calibur (Becton Dickinson, San José, CA) con el programa CellQuest. Ejemplo 2: Síntesis de N-(ciclopropilmetil)-4-(4-(6-hidroxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il)pirimidin-2-ilamino) bencenosulfonamida (Tiazovivina)
El matraz de reacción que contiene 2,4-dicloropirimidina (372 mg, 2,5 mmol), 6-metoxi-1,2,3,4-tetrahidroquinolina (489 mg, 3 mmol) y diisopropiletilamina (0,52 ml, 3 mmol) en n-butanol (10 ml) se calentó a 40 °C durante toda la noche. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida para dar 2-cloro-4-(6-metoxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il) pirimidina (551 mg, 80 %). Este producto intermedio (250 mg, 0,91 mmol) después se disolvió en diclorometano y se trató con BBr3 (1 M en diclorometano) (1 ml, 1 mmol) a -78 °C. La mezcla de reacción se calentó lentamente hasta temperatura ambiente y se agitó durante 1 hora, se vertió en agua y se extrajo con diclorometano. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida para dar 2-cloro-4-(6-hidroxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il) pirimidina (154 mg, 65 %). A una solución agitada de 2-cloro-4-(6-hidroxi-3,4-dihidroquinolin-1(2H)-il) pirimidina (29 mg, 0,11 mmol) y 4-amino-N-(ciclopropilmetil) bencenosulfonamida (27 mg, 0,12 mmol) en DMF (0,5 ml) se añadieron ácido p-toluenosulfónico (2 M en dioxano) (55 pl, 0,11 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 90 °C durante toda la noche, después se purificó mediante HPLC para dar el compuesto del título (27 mg, 56 %).
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Ejemplo 3: Reprogramación de células somáticas primarias humanas por OCT4 y compuestos químicos
Aquí informamos sobre un nuevo cóctel de moléculas pequeñas que permite la reprogramación de células somáticas primarias humanas a iPSC con expresión exógena de solo OCT4.
Entre numerosos tipos de células somáticas humanas primarias fácilmente disponibles, los queratinocitos que pueden aislarse fácilmente de la piel humana o del folículo piloso representan una fuente de células atractiva para la reprogramación, porque expresan endógenamente KLF4 y cMYC, y se informó que se reprogramaron de manera más eficaz mediante el uso de los cuatro TF o de tres TF convencionales (sin MYC) (Aasen, T. y otros, Nat Biotechnol 26:1276-1284 (2008); Maherali, N. y otros, Cell Stem Cell 3, 340-345(2008)). Más recientemente, informamos que la inhibición dual de las vías Tg F|3 y MAPK/ERK mediante el uso de moléculas pequeñas (es decir, SB431542 y PD0325901, respectivamente) proporciona una condición drásticamente mejorada para la reprogramación de fibroblastos humanos con los cuatro TF exógenos (es decir, OSKM) (Lin, T. y otros, Nat Methods 6:805-808 (2009)). Además, hemos demostrado que tal inhibición dual de la vía también podría mejorar la reprogramación de los queratinocitos humanos mediante dos TF exógenos (es decir, OK) con dos moléculas pequeñas, Parnato (un inhibidor de la desmetilasa 1 específica de la lisina) y CHIR99021 (un inhibidor de GSK3) (Li, W. y otros, Stem Cells 27:2992-3000 (2009)). Sin embargo, tal proceso de reprogramación de 2-TF era muy ineficaz y complejo (por ejemplo, involucraba dos TF exógenos y cuatro productos químicos) y la reprogramación con incluso un TF menos parecía abrumadora. En dirección hacia la reprogramación única de OCT4, desarrollamos una estrategia paso a paso para refinar la condición de reprogramación e identificar nuevas entidades químicas de reprogramación. Primero intentamos optimizar aún más el proceso de reprogramación bajo la condición de cuatro o tres TF (es decir, OSKM u OSK) en queratinocitos epidérmicos humanos neonatales (NHEK) mediante la evaluación de varios inhibidores de las vías TGFp y MAPK en diferentes concentraciones mediante el uso de métodos de caracterización de iPSC humana informados anteriormente (Lin, T. y otros, Nat Methods 6:805-808 (2009)). De manera alentadora, descubrimos que la combinación de PD0325901 0,5 pM y A-83-01 0,5 pM (un inhibidor del receptor de TGFp más potente y selectivo) fue más eficaz para mejorar la reprogramación de queratinocitos humanos transducidos con OSKM u OSK (Figura 8a). Sorprendentemente, cuando redujimos aún más las transducciones virales a solo dos factores/OK, aún pudimos generar iPSC a partir de NHEK cuando se trataron con PD0325901 0,5 pM y A-83-01 0,5 pM, aunque con baja eficacia. Después, comenzamos a seleccionar moléculas pequeñas adicionales a partir de una colección de compuestos bioactivos conocidos, en varias concentraciones, como se informó anteriormente. Entre docenas de compuestos evaluados hasta ahora, sorprendentemente encontramos que un activador de molécula pequeña de PDKl (cinasa-1 dependiente de 3'-fosfoinositido), PS48 (5 pM) que nunca se ha informado en la reprogramación, puede mejorar significativamente la eficacia de reprogramación aproximadamente quince veces. Curiosamente, además encontramos que el butirato de sodio 0,25 mM (NaB, un inhibidor de la histona desacetilasa) resultó ser mucho más confiable y eficaz que el VPA 0,5 mM informado anteriormente para la generación de iPSC en condiciones OK (Figura 8b). Los estudios de seguimiento posteriores demostraron que la combinación de PS48 5 pM y NaB 0,25 mM podría mejorar aún más la eficacia de reprogramación por más de veinticinco veces (Figura 8b y Tabla 4). Con una eficacia sin precedentes en la reprogramación de NHEK con solo dos TF, exploramos más a fondo la posibilidad de generar iPSC solo con OCT4 mediante el refinamiento de las combinaciones de esas moléculas pequeñas durante diferentes ventanas de tratamiento. Los NHEK primarios se transdujeron con OCT4 y se trataron con productos químicos (Figura 8c). Entre varias condiciones, pequeñas colonias de iPSC que se asemejan a hESC (de cuatro a seis colonias de 1000000 de células sembradas) aparecieron en NHEK infectados con OCT4 que se trataron con NaB 0,25 mM, PS485 pM y A-83-01 0,5 pM durante las primeras cuatro semanas, seguido del tratamiento con NaB 0,25 mM, PS485 pM, A-83-01 0,5 pM y PD0325901 0,5 pM durante otras cuatro semanas (Figura 8c). Tales colonias de iPSC positivas para TRA-1-81 (Figura 8d) crecieron más grandes en medios de cultivo convencionales de hESC y pudieron pasarse en serie para producir clones de iPSC estables que se caracterizaron posteriormente (Figura 8e y 9). Más significativamente, las iPSC con solo OCT4 también podrían generarse a partir de queratinocitos adultos humanos mediante la adición de Parnato 2 pM y CHIR99021 3 pM (que se ha demostrado que mejora la reprogramación de NHEK en condiciones OK) a este cóctel químico. Después de la reprogramación confiable de queratinocitos primarios a iPSC mediante OCT4 y moléculas pequeñas, aplicamos las condiciones a otros tipos de células primarias humanas, que incluye las HUVEC (células de mesodermo diferenciadas) y AFDC (células derivadas de líquido amniótico). De manera similar, las colonias iPSC positivas para TRA-1-81 aparecieron en HUVEC y AFDC infectados con OCT4 que se trataron con los productos químicos. Sorprendentemente, parecía que la reprogramación de HUVEC y AFDC era más eficaz y más rápida que la reprogramación de NHEK bajo el OCT4 y en condiciones de molécula pequeña (Tabla 4). Dos clones de iPSC de cada tipo de célula durante más de 20 pases en condiciones de cultivo convencionales de hESC se expandieron a largo plazo y se caracterizaron posteriormente (Tabla 5).
Estas células hiPSC-OK e hiPSC-O expandidas de forma estable son morfológicamente indistinguibles de las hESC y podrían cultivarse en una superficie recubierta de ECM en condiciones definidas químicamente y sin alimentador (Figura 8e y Figura 13). Se tiñeron positivos para fosfatasa alcalina (ALP) y expresaron marcadores de pluripotencia típicos, que incluye OcT4, SOX2, NANo G, TRA-1-81 y SSEA4, detectados mediante inmunocitoquímica/ICC (Figuras 8e, 10b, Figuras 11-12). Además, el análisis de RT-PCR confirmó la expresión de los genes endógenos humanos OCT4, SOX2, NANOG, REX1, UTF1, TDGF2, FGF4 y el silenciamiento de OCT4 y KLF4 exógenos (Figuras 9a y 10c). Además, el análisis de secuenciación con bisulfito reveló que los promotores de OCT4 y NANOG de las células hiPSC-OK y hiPSC-O están ampliamente desmetilados (Figuras 9b y 10d). Este resultado proporciona evidencia adicional para la reactivación del programa de transcripción de pluripotencia en las células hiPSC-OK e hiPSC-O. El análisis de la expresión génica global de células hiPSC-O, NHEK y hESC mostró que las células hiPSC-O son distintas de las NHEK (valor de correlación de Pearson: 0,87) y más similares a las hESC (valor de correlación de Pearson: 0,98) (Figura 9c). El análisis de genotipado mostró que las células hiPSC-O solo contenían el transgén OCT4 sin la contaminación del transgén KLF4 o SOX2 (Figura 15). El análisis de transferencia Southern mostró que había múltiples sitios de integración diferentes del transgén OCT4 (Figura 16) entre diferentes clones. Además, el resultado del cariotipo demostró que las hiPSC-O mantuvieron un cariotipo normal durante todo el proceso de reprogramación y expansión (Figura 17). Además, la prueba de huellas dactilares de ADN excluyó la posibilidad de que estas hiPSC surgieran a partir de la contaminación de hESC en el laboratorio (Tabla 6). Para examinar el potencial de desarrollo de estas células hiPSC-O, se diferenciaron in vitro mediante el método estándar de diferenciación de cuerpos embrioides (EB). Los análisis de ICC demostraron que podían diferenciarse eficazmente en células neuronales características pIII-tubulina+ (ectodermo), células mesodérmicas SMA+ y células endodérmicas AFP+ (Figuras 9d y 10e). Los análisis de PCR cuantitativos confirmaron aún más la expresión de estos y otros genes marcadores específicos de linaje, que incluye células ectodérmicas (plIl-tubulina y NESTINA), células mesodérmicas (MSX1 y MLC2a) y células endodérmicas (FOXA2 y AFP) (Figura 9e). Siguiendo el protocolo EB, estas células hiPSC-OK e hiPSC-O también podrían dar lugar a cardiomiocitos que laten rítmicamente. Para evaluar su pluripotencia in vivo, se trasplantaron a ratones SCID. Cuatro a seis semanas más tarde, estas células hiPSC-O generaron efectivamente teratomas típicos que contenían derivados de las tres capas germinales (Figuras 9f y 10f). En conjunto, estas caracterizaciones in vitro e in vivo demostraron que un solo factor de transcripción, OCT4, combinado con un cóctel de moléculas pequeñas definido es suficiente para reprogramar varias células somáticas primarias humanas a iPSC que son morfológica, molecular y funcionalmente similares a las hESC pluripotentes.
Los estudios presentados anteriormente tienen una serie de implicaciones importantes: (1) Aunque se demostró que las NSC fetales se reprogramaron a iPSC mediante la expresión ectópica de Oct4 solo, ha habido escepticismo significativo sobre si el gen Oct4 exógeno solo sería suficiente para reprogramar otras células somáticas humanas más prácticas que no expresan endógenamente Sox2 (uno de los dos genes maestros de pluripotencia en la reprogramación), se encuentran en etapas de desarrollo posteriores (por ejemplo, embrionario temprano/fetal versus nacido/adulto) y pueden obtenerse sin daños significativos para el individuo. Hasta donde conocemos, nuestro estudio es la primera demostración de que las iPSC pueden derivarse prácticamente de células somáticas humanas primarias fácilmente disponibles (por ejemplo, queratinocitos) transducidas con un único gen de reprogramación exógeno, Oct4. A diferencia de las células madre neurales del cerebro, los queratinocitos son más accesibles y pueden obtenerse fácilmente a partir de individuos nacidos, con procedimientos menos invasivos. Esto fortalece aún más la estrategia de explotar varias células somáticas humanas prácticamente accesibles para la generación de iPSC con enfoques más seguros y/o mejores cualidades. Por lo tanto, este nuevo método y su desarrollo posterior facilitarían significativamente la producción de células madre pluripotentes específicas de pacientes para diversas aplicaciones. (2) Aunque se han identificado moléculas pequeñas y sus combinaciones para reemplazar solo uno o dos TF de reprogramación, se vuelve exponencialmente desafiante generar las iPSC cuando se omiten juntos más TF de reprogramación exógenos. La identificación de este nuevo cóctel de moléculas pequeñas, que reemplaza funcionalmente tres factores de transcripción maestros juntos (es decir, Sox2, Klf4 y cMyc) para permitir la generación de iPSC solo con Oct4, representa otra etapa importante en dirección hacia la reprogramación definitiva con solo moléculas pequeñas y demostró y consolidó aún más el enfoque químico de las iPSC. (3) Esta condición demostrada de un solo gen tiene, además, una implicación significativa para la tecnología de células madre pluripotentes inducidas mediante proteínas (piPSC). Un desafío práctico para la tecnología de piPSC es la producción confiable y a gran escala de las cuatro proteínas de reprogramación transducibles, cada una de las cuales se comporta de manera diferente en la fabricación (por ejemplo, su expresión, plegamiento, estabilidad, etcétera). Claramente, la combinación de este cóctel de moléculas pequeñas con una sola proteína transducible simplificaría significativamente la tecnología de piPSC y facilitaría sus aplicaciones. (4) Más significativamente, identificamos una nueva molécula pequeña, PS48, con una nueva diana/mecanismo para mejorar la reprogramación. PS48 es un activador alostérico de molécula pequeña de PDK1, que es una cinasa importante aguas arriba para numerosas cinasas AGC, que incluye Akt/PKB (Alessi y otros, Curr Biol 7, 261-269 (1997)). Su efecto potenciador de la reprogramación puede atribuirse en parte a la activación de Akt/PKB, que promueve la proliferación y supervivencia celular (Manning, B. D., Cantley, L. C., Cell 129, 1261-1274 (2007)). Caracterizaciones adicionales en profundidad sobre cómo los mecanismos involucrados en PDK1 se regulan con precisión durante el proceso de reprogramación deberían proporcionar información adicional sobre la reprogramación y la pluripotencia. Además, debido a que podría haber riesgos ocultos aún mayores (por ejemplo, podrían generarse o seleccionarse anomalías genéticas y/o epigenéticas más sutiles durante el proceso de reprogramación) impuestos por la baja eficacia y la cinética lenta de la reprogramación, la identificación de nuevas moléculas pequeñas para mejorar la reprogramación como se ilustra nuevamente en este estudio siempre sería muy valioso para un procedimiento más seguro, más fácil y más eficaz para la generación de iPSC humanas. (5) Finalmente, este nuevo y poderoso cóctel de moléculas pequeñas para la reprogramación validó la optimización química paso a paso y la estrategia de detección presentada aquí como un enfoque productivo hacia la culminación de células madre pluripotentes inducidas puramente de forma química. Además, el hallazgo de que diferentes moléculas pequeñas que modulan la misma diana/mecanismo podrían tener efectos significativamente diferentes sobre la reprogramación en un contexto diferente, ejemplificado por las mejores actividades de mejora de la reprogramación de A-83-01 y NaB en queratinocitos humanos, sugiere la importancia de "individualizar" la optimización y el tratamiento con diferentes regímenes para un contexto específico de reprogramación.
Cultivo de células
Los queratinocitos epidérmicos humanos normales (Lonza) se mantuvieron en medio de cultivo de queratinocitos (KCM, Lonza). Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, Millipore) se mantuvieron en medio completo EndoGRO-VEGF (HCM, CHEMICON). Las ESC humanas y las hiPSC se cultivaron sobre células alimentadoras MEF en medios de cultivo convencionales de ESC humanos (hESCM: DMEM/F12, reemplazo de suero de desactivación génica 15 %, Glutamax 1 %, aminoácidos no esenciales 1 %, penicilina/estreptomicina 1 %, p-mercaptoetanol 0,1 mM y bFGF 10 ng/ml). Todos los productos de cultivo celular eran de Invitrogen/Gibco BRL excepto donde se menciona.
Producción de lentivirus
Los sobrenadantes de lentivirus se produjeron y se recolectaron como se describió anteriormente (Yu, J. y otros, Science 318:1917-1920 (2007)). Los plásmidos usados para la producción de lentivirus incluyen pSin-EF2-PurohOCT4, pSin2-EF2-Puro-hSOX2, pLove-mKlf4, pLove-mMyc, el plásmido de empaquetamiento psPAX2 y plásmido codificante de la envoltura pMD2.G (Yu, J. y otros, Science 318:1917-1920 (2007) y Li, W. y otros, Stem Cells 27:2992-3000 (2009)).
Reprogramación de NHEK
Los NHEK se cultivaron en una placa de cultivo de tejidos de 100 mm y se transdujeron 3 veces (3-4 horas cada transducción) con sobrenadantes de lentivirus recién producidos. Se sembraron 1000000 de NHEK transducidos sobre las células alimentadoras MEF CF1 inactivadas mediante radiación con rayos X en una placa de 100 mm y se cultivaron en KCM y se trataron con PS48 5 j M, NaB 0,25 mM (Stemgent) y A-83-01 0,5 j M (Stemgent) durante 2 semanas, seguido del cambio de la mitad del volumen de medio a hESCM y de suplementar con PS48 5 j M, NaB 0,25 mM y A-83-01 0,5 j M durante otras 2 semanas. Después, los medios de cultivo celular se cambiaron a hESCM y se suplementaron con PS485 j M, NaB 0,25 mM, A-83-01 0,5 j M y PD0325901 0,5 j M (Stemgent) durante cuatro semanas adicionales. Los mismos queratinocitos infectados con OCT4 cultivados en medios sin productos químicos se usaron como control. El cultivo se dividió mediante Accutase (Millipore) y se trató con tiazovivina 1 j M (Stemgent) el primer día después de la división. Las colonias iPSC teñidas positivas con el anticuerpo Alexa Fluor 555 anti­ Human TRA-1-81 generado en ratón (BD Pharmingen) se recolectaron para su expansión sobre células alimentadoras en hESCM y se cultivaron de forma rutinaria.
Reprogramación de HUVEC
Las HUVEC se cultivaron en una placa de cultivo de tejidos de 100 mm y se transdujeron 2 veces (4-6 horas cada transducción) con sobrenadantes de lentivirus recién producidos. Se sembraron 200 000 HUVEC transducidas en una placa de 100 mm recubierta de gelatina, se cultivaron en HCM y se trataron con PS485 j M, NaB 0,25 mM y A-83-01 0,5 j M durante 2 semanas, seguido del cambio de la mitad del volumen de medio a hESCM y de suplementar con PS485 j M, NaB 0,25 mM y A-83-01 0,5 j M durante otras 2 semanas. Después, los medios de cultivo celular se cambiaron a hESCM y se complementaron con PS48 5 j M, NaB 0,25 mM, A-83-01 0,5 j M y PD0325901 0,5 j M durante 1 a 2 semanas adicionales. Las colonias de iPSC teñidas positivas con el anticuerpo Alexa Fluor 555 anti­ Human TRA-1-81 generado en ratón se recolectaron para su expansión sobre células alimentadoras en hESCM y se cultivaron de forma rutinaria. El cultivo se dividió mediante Accutase y se trató con tiazovivina 1 j M el primer día después de la división.
Diferenciación in vitro
La diferenciación in vitro de hiPSC se realizó mediante el método de cuerpo embrioide (EB) estándar. Brevemente, las hiPSC se disociaron mediante Accutase (Millipore), se cultivaron en una placa de 6 pocillos de unión ultrabaja durante ocho días y después se transfirieron a una placa de 6 pocillos recubierta con Matrigel en medio de diferenciación. Las células se fijaron para análisis inmunocitoquímicos o se recolectaron para pruebas de RT-PCR ocho días después. Medio de diferenciación: DMEM/F12, FBS 10 %, Glutamax 1 %, Aminoácidos no esenciales 1 %, Penicilina/estreptomicina 1 %, p-mercaptoetanol 0,1 mM.
Ensayo de inmunocitoquímica y tinción con fosfatasa alcalina
La tinción con fosfatasa alcalina se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante mediante el uso del kit de detección de fosfatasa alcalina (Stemgent). El ensayo de inmunocitoquímica estándar se realizó como se informó anteriormente (Li, W. y otros, Stem Cells 27:2992-3000 (2009)). Los anticuerpos primarios usados pueden encontrarse en la Tabla 3. Los anticuerpos secundarios fueron Alexa Fluor 488 anti-ratón o anti-conejo IgG generado en burro (1:1000) (Invitrogen). Los núcleos se visualizaron mediante tinción con DAPI (Sigma-Aldrich). Las imágenes se capturaron mediante el uso de un microscopio Nikon Eclipse TE2000-U.
Análisis de expresión génica por RT-PCR y qRT-PCR
Para el análisis de RT-PCR y qRT-PCR, se extrajo el ARN total de las iPSC humanas mediante el uso del Mini Kit RNeasy Plus en combinación con QIAshredder (Qiagen). La transcripción inversa de la primera hebra se realizó con 2 jg de ARN mediante el uso del kit de síntesis de ADNc iScript™ (BioRad). La expresión de los marcadores de pluripotencia se analizó por RT-PCR mediante el uso de Platinum PCR SuperMix (Invitrogen). La expresión de marcadores específicos de linaje después de la diferenciación se analizó por qRT-PCR mediante el uso de iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Los cebadores pueden encontrarse en la Tabla 2.
Análisis de micromatrices
Se usó el Beadchip de expresión Human Ref-8_v3 (Illumina, CA, EE. UU.) para hibridaciones de micromatrices con el propósito de examinar la expresión génica global de las células NHEK, hiPSC y hES. El ARNc marcado con biotina-16-UTP se sintetizó a partir de 500 ng de ARN total con el kit de amplificación de ARN Illumina TotalPrep (Ambion AMIL1791, Foster City, CA, EE. UU.). La mezcla de hibridación que contiene 750 ng de ARNc amplificado marcado se preparó de acuerdo con el Manual del sistema Illumina BeadStation 500x (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) mediante el uso de los reactivos suministrados y la solución de tinción de estreptavidina-Cy3 de GE Healthcare. La hibridación con el Beadchip de expresión Human Ref-8_v3 de Illumina se realizó durante 18 h a 55 °C en un BeadChip Hyb Wheel. La matriz se escaneó mediante el uso del lector de Illumina BeadArray. Todas las muestras se prepararon en dos réplicas biológicas. El procesamiento y el análisis de los datos de micromatrices se realizaron mediante el programa informático de Illumina BeadStudio. Los datos se sustrajeron para el fondo y se normalizaron mediante el uso de la opción de rango invariante.
Secuenciación genómica de bisulfato
Los ADN genómicos se aislaron mediante el uso del kit de aislamiento de ADN no orgánico (Millipore) y después se trataron con el kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research Corp., Orange, CA). Después, los ADN tratados se usaron como moldes para amplificar las secuencias de interés. Los cebadores usados para la amplificación del fragmento del promotor OCT4 y NANOG se indican en la Tabla 2. Los fragmentos resultantes se clonaron mediante el uso del kit de clonación TOPO TA para secuenciación (Invitrogen) y se secuenciaron.
Genotipado de hiPSC
El genotipado de las líneas hiPSC se realizó mediante RT-PCR de ADN genómico con cebadores específicos (Tabla 2; Yu, J. y otros, Science 318:1917-1920 (2007) y Li, W. y otros, Stem Cells 27:2992-3000 (2009)).
Formación de teratoma
Las líneas hiPSC se recolectaron mediante el uso de tripsina-EDTA 0,05 %. Se inyectaron cinco millones de células debajo de la cápsula renal de ratones SCID (n=3). Después de 4 a 6 semanas, los teratomas bien desarrollados se recolectaron, se fijaron y después se analizaron histológicamente en las instalaciones centrales de histología de TSRI.
Tabla 2 Cebadores usados
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
Tabla 3 Anticuerpos primarios aplicados
Figure imgf000035_0002
Tabla 4 Resumen de los experimentos de reprogramación
Figure imgf000036_0001
NHEK, queratinocitos epidérmicos humanos neonatales; HUVEC, células endoteliales de la vena umbilical humana; AHEK, queratinocitos epidérmicos humanos adultos; AFDC, Células Derivadas de Líquido Amniótico. Concentración de los productos químicos usada: PD, 0,5 pM PD0325901; A83, 0,5 pM A-83-01; Ps48, PS48 5 pM; VPA, ácido valproico 0,5 mM; NaB, butirato de sodio 0,25 mM; Par, Parnato 2 pM; CHIR, 3 pM CHIR99021. Para la reprogramación inducida por cuatro o tres factores, se sembraron NHEK a una densidad de 100 000 células transducidas por placa de 10 cm y se contaron las colonias positivas cuatro semanas después; Para la reprogramación inducida por dos factores, se sembraron NHEK a una densidad de 100000 células transducidas por placa de 10 cm y las colonias positivas se contaron seis semanas después; Para la reprogramación inducida por un factor, se sembraron NHEK y AHEK a una densidad de 1000 000 de células transducidas por placa de 10 cm y se contaron las colonias positivas ocho semanas después; Se sembraron HUVEC y AFDC a una densidad de 200 000 células transducidas por placa de 10 cm y las colonias positivas se contaron seis semanas después.
Tabla 5 Caracterización de las líneas celulares iPSC humanas establecidas
Figure imgf000037_0001
Aquellas líneas celulares caracterizadas se expandieron a largo plazo durante más de 20 pases en condiciones de cultivos convencionales de hESC y se caracterizaron adicionalmente por expresión de marcador y pluripotencia; mientras que otras líneas celulares establecidas se almacenaron en el pase 5 o 6. Las entradas en blanco indican no determinado.
Tabla 6 Análisis de huellas dactilares de ADN en iPSC inducidas por Oct4 y líneas celulares parentales
Figure imgf000037_0002
Se investigaron quince loci polimórficos de ADN de repetición corta en tándem (STR) y el marcador de cromosoma sexual amelogenina.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un uso ex vivo de una combinación de inhibidores para inducir pluripotencia en una o más células de mamífero no pluripotentes en una mezcla que comprende:
    (i) la una o más células de mamífero no pluripotentes; y
    (ii) la combinación de inhibidores, en donde dicha combinación comprende: un inhibidor de ALK5; un inhibidor de MEK; y un inhibidor de ROCK.
    El uso de la reivindicación 1, en donde el inhibidor de ROCK tiene la estructura:
    Figure imgf000038_0001
    en donde,
    L2 es alquileno C1-C10 sustituido o no sustituido;
    y es un número entero de 0 a 3;
    z es un número entero de 0 a 5;
    X es -N=, -CH= o -CR5=;
    R1 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido;
    R3, R4 y R5 son independientemente -CN, -S(O)nR6, -NR7R8, -C(O)R9, -NR10-C(O)R11, -NR12-C(O)-OR13, -C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido, en donde n es un número entero de 0 a 2, en donde si z es mayor que 1, dos porciones R3 se unen opcionalmente para formar un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido;
    R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18 y R19 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido o heteroarilo sustituido o no sustituido; o un racemato, diastereómero, tautómero o un isómero geométrico de estos, o una sal farmacéuticamente aceptable de estos; y
    la una o más células de mamífero no pluripotentes son células humanas.
    El uso de la reivindicación 2, en donde
    (i) el inhibidor de ALK5 es 3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1-carbotioamida (A-83-01) o 4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-5-(piridin-2-il)-1H-imidazol-2-il) benzamida (SB431542); o
    (ii) el inhibidor de m EK es N-(2,3-dihidroxi-propoxi)-3,4-difluoro-2-(2-fluoro-4-yodo-fenilamino)-benzamida (PD0325901); o
    (iii) el inhibidor de ROCK tiene la estructura (II) en donde L2 es metileno; X es N= o CH=; R1 es hidrógeno;
    o y y z son 0; o
    (iv) el inhibidor de ROCK tiene la estructura (II) en donde L2 es metileno; X es N= o CH=; R1 es hidrógeno;
    y y y z son 0; o
    (v) el inhibidor de ROCK tiene la estructura:
    Figure imgf000038_0002
    o
    Figure imgf000039_0001
    4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende, además,
    (i) un inhibidor de la glucógeno sintasa cinasa 3 (GSK3); o
    (ii) un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC).
    5. Un uso ex vivo de una composición que comprende una combinación de inhibidores para inducir pluripotencia en una o más células de mamífero no pluripotentes, en donde dicha combinación de inhibidores comprende: un inhibidor de ALK5, un inhibidor de MEK y un inhibidor de ROCK.
    6. El uso de la reivindicación 5, en donde el inhibidor de ROCK tiene la estructura:
    Figure imgf000039_0002
    en donde,
    L2 es alquileno Ci-Ci0 no sustituido;
    y es un número entero de 0 a 1;
    z es un número entero de 0 a 1;
    X es -N=, o -CH=;
    R1 es hidrógeno o alquilo C1-C6 no sustituido;
    R3 es -OR18, o alquilo C1-6 sustituido o no sustituido, en donde el alquilo C1-6 sustituido está sustituido con halógeno;
    R4 es -OR18; y
    R18 es hidrógeno o alquilo C1-6 no sustituido;
    o una sal farmacéuticamente aceptable de este.
    7. El uso de la reivindicación 6, en donde
    L2 es metileno;
    X es N= o CH=;
    R1 es hidrógeno; o
    y y z son 0.
    8. El uso de la reivindicación 6, en donde el inhibidor de ROCK tiene la estructura:
    Figure imgf000039_0003
    9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde la composición comprende la una o más células de mamífero.
    10. Un método in vitro o ex vivo para inducir células de mamífero no pluripotentes a células madre pluripotentes inducidas, que comprende:
    poner en contacto las células de mamífero no pluripotentes con una combinación de inhibidores para inducir pluripotencia en condiciones suficientes para inducir células de mamífero no pluripotentes a células madre pluripotentes inducidas, en donde dicha combinación de inhibidores comprende: un inhibidor de ALK5, un inhibidor de MEK y un inhibidor de ROCK.
    11. El método de la reivindicación 10, en donde las condiciones suficientes para inducir células de mamífero no pluripotentes a células madre pluripotentes inducidas comprenden introducir en las células de mamífero no pluripotentes polinucleótidos que codifican (i) Oct3/4 y opcionalmente, uno o más de Klf y Sox2; o (ii) Oct3/4 y Klf.
    12. El método de la reivindicación 10 u 11, en donde el inhibidor de ROCK tiene la estructura:
    Figure imgf000040_0001
    en donde,
    L2 es alquileno C1-C10 no sustituido;
    y es un número entero de 0 a 1;
    z es un número entero de 0 a 1;
    X es -N=, o -CH=;
    R1 es hidrógeno o alquilo Ci-C6 no sustituido;
    R3 es -OR18, o alquilo C1-6 sustituido o no sustituido, en donde el alquilo C1-6 sustituido está sustituido con halógeno;
    R4 es -OR18; y
    R18 es hidrógeno o alquilo C1-6 no sustituido;
    o una sal farmacéuticamente aceptable de este.
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