CN108779439B

CN108779439B - 利用低分子化合物的由成熟肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法

Info

Publication number: CN108779439B
Application number: CN201780005945.4A
Authority: CN
Inventors: 落谷孝广; 胜田毅
Original assignee: Avia Life Sciences Co ltd
Current assignee: Avia Life Sciences Co ltd
Priority date: 2016-01-08
Filing date: 2017-01-06
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2037-01-06
Also published as: KR20180114032A; EP3401392A1; WO2017119512A1; EP3401392B1; AU2017205801A1; CN108779439A; SG11201805846TA; SG10202006104YA; DK3401392T3; CA3010808A1; PL3401392T3; JP7063624B2; US10961507B2; RU2018128598A; JPWO2017119512A1; ES2908707T3; US20190010464A1; EP3401392A4

Abstract

本发明提供一种由肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法，其包括：使哺乳动物的肝细胞与TGFβ受体抑制药在体外接触、以及任意地还包括使哺乳动物的肝细胞与GSK3抑制药和/或ROCK抑制药在体外接触。

Description

利用低分子化合物的由成熟肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法

技术领域

本发明涉及利用低分子化合物的由成熟肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法、含有该低分子化合物而成的由成熟肝细胞诱导肝干细胞/前体细胞的肝干细胞/前体细胞诱导剂等。

背景技术

干细胞生物学的进步引起对于其在肝再生医疗中的应用的极大关心，但是还没有实现这种应用。作为最受期待的细胞来源之一的人工多能性干细胞(iPS细胞)被集中研究，但是对功能性的肝细胞的有效分化是困难的，依然存在肿瘤形成危险，因此这种应用现在仍然受限。利用最近开发的方法时，甚至不能以比得上成熟肝细胞的效率产生具有使受伤的肝脏再生的能力的肝细胞(非专利文献1)。另一方面，通过最近的研究，表明能够将不同家谱的细胞直接转换(直接重编程，direct reprogramming)为肝细胞样的细胞(非专利文献2及3)。尽管这种发现有希望，但是直接重编程与iPS细胞的情况同样地伴随有基因修饰，因此依然存在预想不到的危险，不能应用于再生医疗。

最近，几个小组报告了，若肝脏受到慢性损害则成体肝细胞能够重编程为增殖性且两能性的肝干细胞/前体细胞这一令人惊讶的发现(非专利文献4及5)。这些革新的发现，不仅对于肝干细胞理论，而且对于肝再生研究提供大的洞察。即，若体外可以再现这种重编程则能够期待如此得到的肝干细胞/前体细胞成为肝再生医疗中的新的细胞来源。

但是不伴随基因修饰地将成熟肝细胞重编程为肝干细胞/前体细胞的方法完全不为人所知。

本发明人等、其它小组以前报告了某种低分子抑制药的组合有助于干细胞的多能性的诱导以及维持(非专利文献6及7)。但是，完全没有关于这些低分子抑制药对于由成熟肝细胞向肝干细胞/前体细胞的重编程的贡献的报告。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Zhu,S.et al.,Nature 508,93-97(2014)

非专利文献2：Huang,P.et al.,Nature 475,386-389(2011)

非专利文献3：Sekiya,S.,and Suzuki,A.Nature 475,390-393(2011)

非专利文献4：Tarlow,B.D.et al.,Cell Stem Cell 15,605-618(2014)

非专利文献5：Yanger,K.et al.,Genes Dev.27,719-724(2013)

非专利文献6：Hou,P.et al.,Science 341,651-654(2013)

非专利文献7：Kawamata,M.and Ochiya,T.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,107,14223-14228(2010)

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于，提供不伴随基因修饰地、有效地将成熟肝细胞重编程为肝干细胞/前体细胞的方法。

用于解决问题的方案

本发明人等为了达成上述目的而进行深入研究，结果发现，若在TGFβ受体抑制药的存在下培养哺乳动物的成熟肝细胞则能够将该细胞重编程为增殖性且能够分化为肝细胞和胆管上皮细胞中的任意一种的两能性的细胞。进而，通过使TGFβ受体抑制药组合糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制药或Rho激酶(ROCK)抑制药来使用，成功改善了重编程效率。重编程效率改善效果通过在TGFβ受体抑制药组合GSK3抑制药而变得显著。可知组合使用TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药和ROCK抑制药这三种药剂的情况，与组合TGFβ受体抑制药和GSK3抑制药的情况，在重编程效率方面没有发现大的差异，但是组合使用三种药剂时细胞的增殖能力优异。如此得到的源自成熟肝细胞的肝干细胞/前体细胞，若移植到存在慢性肝损伤的免疫缺陷小鼠则表现出与成熟肝细胞同等的肝再生能力。

本发明人等基于这些发现进一步重复研究，结果完成了本发明。

即，本发明如以下所述。

(1)一种由肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法，其包括：使哺乳动物的肝细胞在体外与TGFβ受体抑制药接触。

(2)根据(1)所述的方法，其还包括：使GSK3抑制药和/或ROCK抑制药在体外与前述肝细胞接触。

(3)根据(1)所述的方法，其还包括：使GSK3抑制药和ROCK抑制药在体外与前述肝细胞接触。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，前述肝细胞与前述TGFβ受体抑制药的接触通过在该抑制药的存在下对该肝细胞进行培养来实施。

(5)根据(2)～(4)中任一项所述的方法，其中，前述肝细胞与前述GSK3抑制药和/或前述ROCK抑制药的接触通过在该抑制药的存在下对该肝细胞进行培养来实施。

(6)根据(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，哺乳动物为人、大鼠或小鼠。

(7)一种由肝细胞诱导肝干细胞/前体细胞的肝干细胞/前体细胞诱导剂，其是含有TGFβ受体抑制药而成的。

(8)根据(7)所述的诱导剂，其是GSK3抑制药和/或ROCK抑制药组合而成的。

(9)根据(7)所述的诱导剂，其是GSK3抑制药和ROCK抑制药组合而成的。

(10)根据(7)～(9)中任一项所述的诱导剂，其中，肝细胞源自人、大鼠或小鼠。

(11)一种源自哺乳动物的肝细胞的肝干细胞/前体细胞，其具有以下的特征：

(a)具有自身再生能力，

(b)能够分化为肝细胞和胆管上皮细胞这两者，

(c)作为表面抗原标记物，表达EpCAM，但是不表达Dlk1。

(12)根据(7)～(10)中任一项所述的诱导剂，其被用作通过(1)～(6)中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或(11)所述的肝干细胞/前体细胞的维持/扩增剂。

(13)一种细胞的维持/扩增方法，其特征在于，其为通过(1)～(6)中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或(11)所述的肝干细胞/前体细胞的维持/扩增方法，

(i)第1继代直至第4继代为止在用胶原或基质胶涂覆的培养容器上，

(ii)第5继代及以后在用基质胶涂覆的培养容器上，

在TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药和ROCK抑制药的存在下对该肝干细胞/前体细胞进行继代培养。

(14)一种胆管上皮细胞的诱导方法，其为由通过(1)～(6)及(13)中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或(11)所述的肝干细胞/前体细胞诱导胆管上皮细胞的方法，其包括：

(i)在低密度的饲养细胞上，在TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药和ROCK抑制药的存在下对该肝干细胞/前体细胞进行培养的工序；和

(ii)将工序(i)中得到的细胞在含有基质胶的培养基中进一步培养的工序。

(15)一种评价方法，其为评价被检化合物在哺乳动物体内的代谢的方法，其包括：

(i)使由通过(1)～(6)及(13)中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或(11)所述的肝干细胞/前体细胞分化诱导而得到的肝细胞与被检化合物接触的工序；和

(ii)测定该肝细胞中的被检化合物的代谢的工序。

(16)一种评价方法，其为评价被检化合物对于哺乳动物的肝毒性的方法，其包括：

(ii)测定该肝细胞的损伤的有无或其程度的工序。

(17)一种肝损伤改善剂，其是含有通过(1)～(6)及(13)中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或(11)所述的肝干细胞/前体细胞而成的。

(18)一种肝损伤的改善方法，其为哺乳动物的肝损伤的改善方法，其包括：向存在肝损伤的哺乳动物给予通过(1)～(6)及(13)中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或(11)所述的肝干细胞/前体细胞的有效量。

(19)通过(1)～(6)及(13)中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞或(11)所述的肝干细胞/前体细胞作为肝损伤改善剂的应用。

发明的效果

根据本发明，可以不伴随有基因修饰地由肝细胞安全且迅速地诱导肝干细胞/前体细胞，所述肝干细胞/前体细胞具有自身复制能力和向肝细胞及胆管上皮细胞的分化能力(两能性)。

附图说明

图1为表示对于由初代大鼠成熟肝细胞向肝干细胞/前体细胞的重编程造成影响的TGFβ受体抑制药(A)、GSK3抑制药(C)、ROCK抑制药(Y)和MEK抑制药(P)的各种组合的效果的图。

图2为表示在YAC的存在下以及在YAC的非存在下培养的初代大鼠成熟肝细胞的增殖性的图。

图3为表示在YAC的存在下以及在YAC的非存在下培养的初代大鼠成熟肝细胞中的N/C比、肝干细胞/前体细胞标记物的表达的图。

图4为表示源自大鼠成熟肝细胞的肝干细胞/前体细胞具有向功能性的肝细胞的再分化能力的图。

图5为表示示出源自大鼠成熟肝细胞的肝干细胞/前体细胞具有向功能性的肝细胞的再分化能力的基因聚类解析的结果的图。

图6为表示源自大鼠成熟肝细胞的肝干细胞/前体细胞具有向功能性的胆管上皮细胞的再分化能力的图。

图7为表示源自大鼠成熟肝细胞的肝干细胞/前体细胞能够不会失去增殖能力和对肝细胞的再分化能力地长期继代的图。

图8为表示移植了源自大鼠成熟肝细胞的肝干细胞/前体细胞的小鼠肝损伤模型中的肝再生效果的图。

图9为表示利用YAC刺激进行的由冷冻大鼠成熟肝细胞诱导肝干细胞/前体细胞的图。

图10为表示利用YAC刺激进行的由人冷冻肝细胞诱导肝干细胞/前体细胞的图。

图11为表示将源自人冷冻肝细胞的肝干细胞/前体细胞继代培养的结果的图。

具体实施方式

1.由成熟肝细胞诱导肝干细胞/前体细胞

本发明提供由成熟肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法(也称为“本发明的重编程法”)，其包括：使哺乳动物的肝细胞与至少含有TGFβ受体抑制药的一种以上的低分子信号转导通路抑制药在体外接触。

作为本发明的重编程法的起始材料使用的“肝细胞”指的是表达肝细胞标记物基因(例如白蛋白(ALB)、转甲状腺素蛋白(transthyretin)(TTR)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)、酪氨酸转氨酶(TAT)、色氨酸-2,3-双加氧酶(TDO2)、细胞色素(cytochrome)P450(CYP)、miR-122等)的至少1种(优选选自ALB、TTR、G6PC、TAT、TDO2和CYP中的2种以上、更优选3种以上、进一步优选4种以上、特别优选5种以上、最优选全部6种)的细胞。该肝细胞优选为功能性。“功能性”的肝细胞指的是保持了选自(i)具有毛细胆管结构、将药物代谢物蓄积于该小管；(ii)在细胞膜表达ABC转运体(例如MDR1、MRP等)；(iii)ALB的分泌表达；(iv)糖原蓄积；(v)药物代谢酶(例如CYP1A1、CYP1A2等)活性中的1种以上、优选2种以上、更优选3种以上、进一步优选4种以上、最优选全部功能的肝细胞。

本发明的重编程法中使用的肝细胞，若通过上述肝细胞标记物基因的表达而表现出特征则可以由任意来源提供，例如可以包括：由哺乳动物(例如人、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、羊、马、猪、牛、猴子等、优选人、大鼠、小鼠)的胚胎干细胞(ES细胞)或iPS细胞等多能性干细胞，通过自身公知的分化诱导方法(例如上述非专利文献1)得到的肝细胞；或者由成纤维细胞通过直接重编程而诱导的肝细胞(上述非专利文献2及3)等。但是，若考虑到不伴随有基因修饰地安全且迅速地提供肝干细胞/前体细胞的本发明的主要目的，则作为肝细胞，优选使用由自哺乳动物摘除的肝脏分离纯化得到的肝细胞。例如大鼠的情况下，优选使用自10-20周龄的成体大鼠摘除的肝脏，但是也可以使用源自2个月龄以下的幼大鼠的肝脏。人的情况下，优选使用通过外科手术切除的成人肝脏组织片，但是也可以使用由死亡胎儿切除的肝脏。或者也可以使用将由这些摘除的肝脏分离纯化得到的肝细胞冷冻而成的细胞(冷冻肝细胞)。

作为由哺乳动物的肝脏或其组织片纯化肝细胞的方法，可列举出灌流法(《培养细胞实验手册(培養細胞実験ハンドブック)》(羊土社、2004年)等)。即，通过门静脉用EGTA液进行预备灌流后，用胶原酶、分散酶等酶溶液(汉克斯液等)灌流将肝脏消化，通过过滤、低速离心等去除细胞片、非实质细胞，从而纯化肝细胞。

使如上所述制造的肝细胞与含有TGFβ受体抑制药的1种以上的低分子信号转导通路抑制药在体外接触。

作为本发明中使用的TGFβ受体抑制药，若具有抑制转化生长因子(TGF)β受体功能的作用则没有特别限定，可列举出例如2-(5-苯并[1,3]二氧环戊烯-4-基-2-叔丁基-1H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶、3-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)-1-苯基硫代氨基甲酰基-1H-吡唑(A-83-01)、2-(5-氯-2-氟苯基)蝶啶-4-基)吡啶-4-基胺(SD-208)、3-(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)]-1H-吡唑、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-二氮杂萘(以上、Merck Ltd.)、SB431542(Sigma Aldrich公司)等。优选列举出A-83-01。TGFβ受体抑制药中也包括TGFβ受体拮抗剂。

这些TGFβ受体抑制药可以使用一种化合物、也可以将两种以上化合物组合来使用。

作为TGFβ受体抑制药以外的低分子信号转导通路抑制药，优选列举出GSK3抑制药和ROCK抑制药。

作为本发明中使用的GSK3抑制药，若是具有抑制糖原合成酶激酶(GSK)3的功能的作用物质则没有特别限定，可列举出例如SB216763(Selleck公司)、CHIR98014、CHIR99021(以上Axon medchem公司)、SB415286(Tocris Bioscience公司)、Kenpaullone(Cosmo BioCo.,Ltd)等。优选列举出CHIR99021。

这些GSK3抑制药可以使用1种化合物、也可以将2种以上化合物组合来使用。

作为本发明中使用的ROCK抑制药，若具有抑制Rho连接激酶的功能的作用则没有特别限定。作为ROCK抑制药，可列举出例如GSK269962A(Axon medchem公司)、盐酸法舒地尔(Fasudil hydrochloride)(Tocris Bioscience公司)、Y-27632、H-1152(以上和光纯药工业株式会社)等。优选列举出Y-27632。

这些ROCK抑制药可以使用1种化合物、也可以将2种以上化合物组合来使用。

如后述的实施例所示那样，GSK3抑制药和ROCK抑制药即使分别单独与肝细胞接触、也几乎不能诱导肝干细胞/前体细胞，但是若使GSK3抑制药与TGFβ受体抑制药一起与肝细胞接触则与仅使TGFβ受体抑制药接触的情况相比，肝干细胞/前体细胞的诱导效率(也称为“重编程效率”)显著升高。另外，使ROCK抑制药与TGFβ受体抑制药一起与肝细胞接触的情况，与仅使TGFβ受体抑制药接触的情况相比，重编程效率也升高。因此，在本发明的重编程法中，优选除了使TGFβ受体抑制药之外，还使GSK3抑制药和/或ROCK抑制药与肝细胞接触。特别是优选使用作为TGFβ受体抑制药的A-83-01(A)，组合作为GSK3抑制药的CHIR99021(C)(AC)；使用作为TGFβ受体抑制药的A-83-01(A)，组合作为ROCK抑制药的Y-27632(Y)(YA)；使用作为TGFβ受体抑制药的A-83-01(A)，组合作为GSK3抑制药的CHIR99021(C)以及作为ROCK抑制药的Y-27632(Y)(YAC)。

使TGFβ受体抑制药组合GSK3抑制药和ROCK抑制药来使用的情况，与将TGFβ受体抑制药和GSK3抑制药组合来使用的情况相比，在重编程效果方面没有发现大的差异，但是前者与后者相比，所得到的肝干细胞/前体细胞的增殖能力优异。因此，本发明的特别优选的实施方式中，使TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药和ROCK抑制药与肝细胞接触。

本发明的重编程法中，也可以将GSK3抑制药、ROCK抑制药以外的低分子信号转导通路抑制药与TGFβ受体抑制药组合。作为这种抑制药，可列举出例如MEK抑制药等，但是不限定于此。作为MEK抑制药，若是具有抑制MEK(MAP激酶-ERK激酶，MAP kinase-ERK kinase)功能的作用的物质则没有特别限定，可列举出例如AZD6244、CI-1040(PD184352)、PD0325901、RDEA119(BAY869766)、SL327、U0126(以上Selleck公司)、PD98059、U0124、U0125(以上Cosmo Bio Co.,Ltd.)等。

本发明的重编程法中，肝细胞与含有TGFβ受体抑制药的低分子信号转导通路抑制药的接触可以通过在这些抑制药的存在下培养肝细胞来进行。具体而言，在培养基中以有效浓度添加这些抑制药进行培养。在此，作为培养基，可以广泛利用动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基。也可以利用市售的基础培养基，作为它们，可列举出例如最小必需培养基(MEM)、Dulbecco改良最小必需培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基、Ham’sF12培养基、William’s E培养基等，它们可以单独使用或组合两种以上来使用，但是不特别限于它们。作为对培养基的添加剂，可列举出例如各种氨基酸(例如L-谷氨酰胺、L-脯氨酸等)、各种无机盐(亚硒酸盐、NaHCO₃等)、各种维生素(烟酰胺、抗坏血酸衍生物等)、各种抗生素(例如青霉素、链霉素等)、抗真菌剂(例如两性霉素等)、缓冲剂(HEPES等)等。

另外，在培养基中也可以添加5-20％的血清(FBS等)，但是也可以为无血清培养基。无血清培养基的情况下，可以添加血清替代物(BSA、HAS、KSR等)。进而，通常添加生长因子、细胞因子、激素等因子。作为这些因子，可列举出例如上皮生长因子(EGF)、胰岛素、转铁蛋白、肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素M(OsM)、氢可的松21-半琥珀酸或其盐、地塞米松(Dex)等，但是不限于它们。

TGFβ受体抑制药对培养基的添加浓度例如可以从0.01-10μM、优选0.1-1μM的范围适当选择。

GSK3抑制药对培养基的添加浓度例如可以从0.01-100μM、优选1-10μM的范围适当选择。

ROCK抑制药对培养基的添加浓度例如可以从0.0001-500μM、优选1-50μM的范围适当选择。

这些抑制药为水不溶性或水难溶性的化合物的情况下，溶解于少量的低毒性的有机溶剂(例如DMSO等)后，以形成上述最终浓度的方式添加到培养基中即可。

该培养中使用的培养容器，若适于黏连培养则没有特别限定，可列举出例如培养皿、有盖培养皿、组织培养用培养皿、复合皿、微量板、微孔板、复合板、多孔板、腔室培养玻片、培养皿、培养管、培养托盘、培养袋等。作为培养容器可以使用为了提高与细胞的粘接性而内表面被细胞支持用底物涂覆而成的培养容器。作为这种细胞支持用底物，可列举出例如胶原、明胶、基质胶、聚-L-赖氨酸、层黏连蛋白、纤连蛋白等。优选列举出胶原或基质胶。

肝细胞可以以10²-10⁶细胞/cm²、优选10³-10⁵细胞/cm²的细胞密度接种于培养容器上。培养可以在CO₂培养器中，在1-10％、优选2-5％、更优选约5％的CO₂浓度的气氛下，在30-40℃、优选35-37.5℃、更优选约37℃下进行。作为培养期限，可列举出例如1-4周、优选1-3周、更优选约2周。每1-3天更换为新鲜的培养基。

如上所述，使肝细胞与TGFβ受体抑制药、以及任意地GSK3抑制药和/或ROCK抑制药接触，由此可以将肝细胞重编程为肝干细胞/前体细胞。通常认为成熟肝细胞在体外不会增殖，但是如后述的实施例所示可知，例如使用作为TGFβ受体抑制药的A-83-01(A)、组合作为GSK3抑制药的CHIR99021(C)以及作为ROCK抑制药的Y-27632(Y)(YAC)、培养大鼠初代成熟肝细胞的情况下，通过2周的培养，增殖到约15倍。另外，将以低密度(1×10²细胞/cm²)接种的大鼠初代成熟肝细胞在YAC存在下培养，通过低速度拍摄调查各单一细胞的增殖，结果在与YAC接触开始后第2天直至第6天为止的5天的培养期间，增殖到5个细胞以上的单一细胞的比率约25％，与在不存在YAC下培养的情况的约1.4％相比显著增加。

本说明书中，“肝干细胞/前体细胞”(也称为“LSC”)指的是(a)具有自身再生能力、且(b)具有能够分化为肝细胞和胆管上皮细胞这两者的两能性的细胞。在此“胆管上皮细胞”(也称为“BEC”)指的是表达作为BEC标记物的细胞角蛋白19(CK19)和GRHL2的细胞。胎儿肝脏的肝母细胞、肝损伤时出现的卵圆细胞也包含于肝干细胞/前体细胞(LSC)。

优选的一实施方式中，通过本发明的重编程方法得到的LSC，除了上述(a)和(b)的性质之外，与以往公知的LSC同样地(c)作为表面抗原标记物表达上皮细胞粘附分子(EpCAM)，但是不表达其它的已知LSC中表达的delta同系物1(Dlk1)。因此，本发明的LSC是新型的LSC。另外，一实施方式中，本发明的LSC也不表达作为已知LSC标记物的含有富含亮氨酸的重复单位的G蛋白质共轭受体5(LGR5)、FoxL1。

本发明的LSC还具有以下的特征中的一种以上。

(d)至少10继代、优选20继代以上，表观上的增殖速度不会降低，

(e)至少10继代、优选20继代以上，保持对肝细胞和BEC的分化能力，

(f)与肝细胞相比，核/细胞质(N/C)比高，

(g)选自由α-胎蛋白(AFP)、SRY-box(Sox)9、EpCAM、Thy-1/CD90、肝细胞核内因子1同源异型盒B(HNF1β)、叉头框J1(FoxJ1)、HNF6/one cut-1(OC1)、CD44、整联蛋白α-6(A6)和CK19基因组成的组中的1种以上的LSC标记物基因的表达与肝细胞相比升高，

(h)选自由AFP、CD44、EpCAM、CK19、Sox9、A6和CD90组成的组中的1种以上蛋白质的表达与肝细胞相比升高。

优选的实施方式中，本发明的LSC具有上述(d)～(h)的全部特征。

如上所述，通过使肝细胞与TGFβ受体抑制药、优选进而与GSK3抑制药和/或ROCK抑制药接触，可以由该肝细胞诱导LSC。

因此，本发明还提供由肝细胞诱导LSC的LSC诱导剂，其含有TGFβ受体抑制药而成。本发明的LSC诱导剂，优选为使TGFβ受体抑制药组合GSK3抑制药和/或ROCK抑制药而成的组合剂，更优选使在TGFβ受体抑制药组合GSK3抑制药和ROCK抑制药而成的组合剂。

TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药和ROCK抑制药可以直接用作LSC诱导剂，但是也可以溶解于适当溶剂而形成液体制剂。或者，这些抑制药也可以与由上述的肝细胞诱导LSC的诱导用培养基组合而试剂盒化。

2.LSC的维持/扩增

如上所述得到的本发明的LSC，通过

(ii)第5继代及以后在用基质胶涂覆的培养容器上，

分别在TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药和ROCK抑制药的存在下进行继代培养，可以有效地维持/扩增。

作为培养容器，可以使用与由肝细胞诱导LSC中使用的培养容器相同的培养容器。第1继代-第4继代用的培养容器用胶原或基质胶涂覆。

将如上所述得到的初代LSC，在到达70-100％铺满的阶段以10³-10⁵细胞/cm²的密度接种于上述涂布有胶原或基质胶的培养容器上。作为培养基，可以同样地使用对于LSC的诱导培养而言的上述培养基。TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药、ROCK抑制药的添加浓度也可以从对于LSC的诱导培养而言的上述的浓度范围适当选择。培养温度、CO₂浓度也基于LSC诱导培养的条件。在达到70-100％融合的阶段，对于细胞进行胰岛素处理使其解离、进行继代。

第5继代及以后使用涂布有基质胶的培养容器。可以以5-8继代程度得到稳定的LSC。10继代以上继代后，可以通过常规方法进行克隆化。

如上所述，TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药、ROCK抑制药，不仅在LSC的诱导培养添加，而且在维持/扩增培养中也添加到培养基。因此，另外本发明提供LSC的维持/扩增剂，其是含有TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药、ROCK抑制药而成的。

3.由LSC向肝细胞的再分化

由LSC向肝细胞的再分化诱导可以通过自身公知的方法进行。可列举出例如利用添加有制瘤素M(OsM)、地塞米松(Dex)、肝细胞生长因子(HGF)等的培养液进行培养的方法(Journal of Cellular Physiology,Vol.227(5),p.2051-2058(2012)；Hepatology,Vol.45(5),p.1229-1239(2007))；组合了基质胶层叠法的方法(Hepatology 35,1351-1359(2002))等。在对肝细胞的分化诱导用培养基中可以添加或不添加TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药、ROCK抑制药，但是优选添加。

通过将本发明的LSC分化诱导而得到的肝细胞具有成熟肝细胞中典型的毛细胆管样结构，可以在该小管中蓄积药物代谢物。另外，细胞膜中，表达MRP2蛋白质等ABC转运体。进而，可以发挥白蛋白的分泌表达、糖原的蓄积、细胞色素(chytochrome)p450(CYP)药物代谢酶活性等一系列的肝功能。即，本发明的LSC可以再分化为功能性的肝细胞。

4.由LSC向BEC的分化诱导

由LSC向BEC的分化诱导可以通过自身公知的方法进行。可列举出例如使用胶原凝胶，在含有EGF、胰岛素样生长因子2(IGF2)的培养基中进行培养的方法等。

本发明人等新发现，以形成胆管样结构的方式使本发明的LSC再现良好地分化的方法。因此，本发明还提供由LSC诱导BEC的方法。本发明的BEC诱导法包括：

(i)在低密度的饲养细胞上，在TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药和ROCK抑制药的存在下培养本发明的LSC的工序；和

(ii)将工序(i)中得到的细胞在含有基质胶的培养基中进一步进行培养的工序。

对于工序(i)中使用的饲养细胞没有特别限定，可以使用为了辅助维持培养而通常使用的任意的细胞。可列举出例如源自小鼠胚胎的成纤维细胞(MEF)、STO细胞(ATCC、CRL-1503)等，但是优选为MEF。

在此，“低密度”指的是与为了辅助维持培养而通常使用的细胞密度相比为低密度，可列举出例如1×10³-5×10⁴细胞/cm²、优选5×10³-3×10⁴细胞/cm²的范围的细胞密度。接种饲养细胞的培养容器使用用胶原、明胶等细胞支持用底物涂覆的培养容器。对于进行了初代或继代培养的本发明的LSC进行胰岛素处理、解离，再悬浮于含有TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药和ROCK抑制药的培养基中，以10⁴-10⁵细胞/cm²的细胞密度接种于前述饲养细胞上。在培养基中根据需要可以添加血清。次日，将培养基置换为mTeSR^TM1(StemcellTechnologies)等多能性干细胞的维持培养基，在TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药和ROCK抑制药的存在下，培养3-10天、优选4-8天。每1-3天更换为新鲜的培养基。然后，将培养基置换为含有基质胶的培养基，进而培养3-10天、优选4-8天。每1-3天更换为新鲜的培养基。基质胶对培养基的添加浓度可以在1-5％、优选1-3％的范围内适当选择。通过总计1-3周程度的培养，形成胆管样结构，细胞以高水平表达作为BEC标记物的CK19和GRHL2。进而，AQP1、AQP9等水通道蛋白、CFTR和AE2等离子通道的基因和蛋白质表达升高。另外，在管结构的内腔确认到作为密合结合标记物的ZO-1的强表达。进而，该细胞由于具有水输送能力、对内腔内输送/蓄积药物代谢物的能力，因此本发明的LSC可以分化为功能性的BEC。

5.本发明的LSC的用途

如上述3.中记载那样由本发明的LSC再分化的肝细胞例如可以用于被检化合物的代谢、肝毒性的评价等。

被检化合物的代谢、肝毒性的评价中以往使用动物模型等，但是可以同时评价的被检化合物数受限，另外存在不能将动物模型等中得到的评价直接适用于人的问题。因此，采用使用人肝癌细胞株、初代正常人培养肝细胞的评价方法。但是，人肝癌细胞株由于为癌细胞，因此人肝癌细胞株中得到的评价有可能不能适用于人正常肝细胞。另外，初代正常人培养肝细胞在稳定供给、成本方面存在问题。另外示出，将初代正常人培养肝细胞永生化的细胞株，与没有永生化的情况相比，CYP3A4的活性降低(International Journal ofMolecular Medicine 14:663-668,2004,Akiyama I.et al.)。利用通过本发明的方法制造的肝细胞，能够解决这种问题。

因此另外，本发明提供评价被检化合物的代谢的方法。该方法中，使通过本发明的方法制造的肝细胞与被检化合物接触。接着测定经过与肝细胞接触的被检化合物的代谢。

作为本发明中使用的被检化合物，没有特别限制。可列举出例如生物体异物、天然化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、肽等单一化合物、以及化合物库、基因库的表达产物、细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产生物、海洋生物提取物、植物提取物等，但是不限于它们。

作为生物体异物，可列举出例如药剂、食品的候补化合物、现有的药剂、食品，但是不限于它们，只要对于生物体而言为异物，则包含于本发明的生物体异物。更具体而言，可例示出利福平(Rifampin)、地塞米松(Dexamethasone)、苯巴比妥(Phenobarbital)、环格列酮(Ciglirazone)、苯妥英(Phenytoin)、依法韦仑(Efavirenz)、斯伐他汀(Simvastatin)、β-萘黄酮(β-Naphthoflavone)、奥美拉唑(Omeprazole)、克霉唑(Clotrimazole)、3-甲基胆蒽(3-Methylcholanthrene)等。

肝细胞与被检化合物的接触通常通过在培养基、培养液中添加被检化合物来进行，但是不限于该方法。被检化合物为蛋白质等情况下，也可以通过将表达该蛋白质的DNA载体导入到该细胞来进行接触。

被检化合物的代谢，可以利用对于本领域技术人员而言周知的方法测定。例如检测被检化合物的代谢产物的情况下，判定被检化合物被代谢。另外，通过被检化合物的接触，CYP(细胞色素p450)、MDR、MRP等酶基因的表达被诱导的情况、这些酶的活性升高的情况下，判定被检化合物被代谢。

另外，本发明提供评价被检化合物的肝毒性的方法。该方法中，使通过本发明的方法制造的肝细胞与被检化合物接触。接着，测定接触了被检化合物的肝细胞的损伤的程度。损伤的程度例如可以将肝细胞的存活率、GOT、GPT等肝损伤标记物作为指标来测定。

例如通过在肝细胞的培养液添加被检化合物，肝细胞的存活率降低的情况下，判定该被检化合物具有肝毒性，存活率没有显著变化的情况下，判定该被检化合物不具有肝毒性。另外例如在肝细胞的培养液添加被检化合物后，培养液中的GOT、GPT升高的情况下判定该被检化合物具有肝毒性，在GOT、GPT没有显著变化的情况下，判定该被检化合物不具有肝毒性。

需要说明的是，通过使用已经判明肝毒性有无的化合物作为对照，可以更正确地评价被检化合物是否具有肝毒性。

如后述的实施例所示，通过将本发明的LSC移植到存在慢性的肝损伤的免疫缺陷小鼠，可以发挥与移植初代成熟肝细胞的情况同等的肝再生能力。因此本发明还提供含有本发明的LSC而成的肝损伤改善剂。

本发明的LSC，根据需要可以使用对于作为表面抗原标记物的EpCAM的抗体、利用流式细胞计纯化来使用。LSC可以悬浮于适当的等渗缓冲液(例如PBS)而制剂化。根据需要可以还含有可药用的添加物。该LSC悬浮液根据肝疾病的种类、肝损伤的严重程度等不同而不同，例如成人的情况下可以通过门静脉内给药、脾内给药等移植10⁸-10¹¹细胞。

以下列举出实施例对本发明进行更具体说明，但是本发明不被这些实施例任何限定。

实施例

实验步骤

成熟肝细胞的分离

由10-20周龄的雌性Wistar大鼠(CREAJapan,Inc.、静冈)，使用Seglen的手法分离成体大鼠肝细胞。简而言之，通过门静脉用不含Ca²⁺的汉克斯/EGTA溶液预备灌流后，对于肝脏利用含有0.05％胶原酶的汉克斯液(Hanks solution)约400mL以25-30mL/分钟进行灌流。将所摘除的肝脏用剪刀机械消化，进而在0.025％胶原酶溶液中、37℃下消化15分钟。接着，将所消化的肝脏用经过灭菌的棉网过滤2次，以57g离心分离1分钟，回收细胞悬浮液。将细胞悬浮液用60μm不锈钢双层网细胞过滤器(池本理化工业、东京)过滤，由此去除非消化细胞块，以57g离心分离1分钟，回收通过液。使用Percol(GE HEALTHCARE)，以57g离心分离10分钟，去除死细胞后，以57g通过2分钟的离心分离，将细胞用E-MEM洗涤2次。如此纯化的肝细胞用于各种实验。

成熟肝细胞的初代培养

作为成熟肝细胞培养用的基本培养基，使用小型肝细胞培养培养基(SHM)，即添加有5mM HEPES(Sigma,St.Louis,MO)、30mg/L L-脯氨酸(Sigma)、0.05％BSA(Sigma)、10ng/mL上皮细胞生长因子(Sigma)、胰岛素-转铁蛋白-丝氨酸(ITS)-X(Lifetechnologies)、10^- ⁷M地塞米松(Dex)、10mM烟酰胺(Sigma)、1mM抗坏血酸2-磷酸酯(和光纯药、东京)以及抗生素/抗真菌药溶液(100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和0.25mg/mL两性霉素B)(Lifetechnologies)的、含有2.4g/L NaHCO₃和L-谷氨酰胺的DMEM/F12(Lifetechnologies,Carlsbad,CA)。将所纯化的新鲜的大鼠成熟肝细胞悬浮于添加有或没有添加以下的4种低分子抑制药：10μMY-27632(WAKO)、1μM PD0325901(Axon Medchem,Groningen,Netherland)、0.5μM A-83-01(TOCRIS,Bristol,UK)和3μM CHIR99021(AxonMedchem)的任意组合的SHM中，以1×10⁴细胞/cm²接种于用I型胶原涂覆的板(AGC TECHNOGLASS Co.,Ltd.、静冈)上。接种1天后更换培养基，然后每隔1天更换培养基。

MH-LSC的继代培养

在初代培养的第14天，对于在YAC存在下培养的细胞进行胰岛素处理并回收，以3×10⁴细胞/cm²接种于添加有YAC的SHM中。对于最初的4继代，在用基质胶或胶原涂覆的板上培养细胞。5继代以后，基本上在涂覆有基质胶的板上培养细胞。使用CELLBANKER(注册商标)1(宝酒造、大津)制造冷冻原种(stock)。至少10继代后，使用Stem Cell Cutting Tool(VERITAS Corporation.、东京)实施MH-LSC的克隆。

低细胞密度下的低速度拍摄

将初代肝细胞在YAC的存在下或非存在下以1×10²细胞/cm²接种于用胶原涂覆的35mm板(IWAKI)上。第1天更换培养基。第2次更换培养基后，使用BZ9000一体式(all inone)荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION、大阪)进行低速度拍摄。相位差图像自第2天直至第6天为止以30分钟间隔拍摄300次，对于各解析范围制成动画。接着，在整个拍摄期间追踪各细胞，计测源自目的细胞的最终的细胞数。另外，对于源自各细胞的凋亡细胞的总计也计数，凋亡频率作为总凋亡细胞/最初的总细胞数(低速度拍摄的开始时计数)定量。

定量的RT-PCR

自肝细胞和LSC细胞，使用miRNeasy Mini Kit(QIAGEN)分离总RNA。逆转录反应，使用High-Capacity cDNAReverse Transcription Kit(Lifetechnologies)，根据制造者的操作说明书实施。所得到的cDNA作为模板，使用Platinum SYBRGreen qPCR SuperMixUDG(Invitrogen)进行PCR。靶基因的表达水平用作为内源性对照的β-肌动蛋白标准化。

免疫细胞化学、免疫组织化学和PAS染色

将细胞利用冷甲醇(-30℃)在冰上固定5分钟。用封闭液(Blocking One)(Nacalaitesque、京都)在4℃培养30分钟后，将细胞与一次抗体在室温下培养1小时或4℃下培养一晩。接着，使用Alexa Fluor 488或Alexa Fluor594-结合二次抗体(Lifetechnologies)，检测一次抗体。对核用Hoechst 33342(Dojindo)进行共染色。

对于组织样品，进行福尔马林固定、石蜡包埋。进行脱蜡和再水合后，对于标本在稀释1/200的ImmunoSaver(日新EM、东京)中、98℃下煮沸45分钟，由此进行热诱导性表位修复。接着对于标本用0.1％Triton-X 100进行处理、膜透过化。用封闭试剂(Nacalaitesque)在4℃进行30分钟处理后，将标本与一次抗体在室温下培养1小时。对于这些切片，根据制造者的指示使用ImmPRESS IgG-peroxidase kit(Vector Labs)和metal-enhancedDAB substrate kit(Life Technologies)进行染色。用苏木精进行对比染色后，将标本脱水、封固。

高碘酸Schiff(PAS)染色使用PAS kit(Sigma-Aldrich)进行，以唾液淀粉糖化酶前处理的有无检测糖原。

MH-LSC的肝细胞诱导

对于第14天的初代MH-LSC或Rep-LS细胞株的细胞进行胰岛素处理并回收。将细胞悬浮于添加有5％FBS的SHM+YAC中，以3.75×10⁴-5×10⁴细胞/cm²接种于用胶原涂覆的板。第1天将培养基更换为SHM+YAC后，培养2天。接着为了进行肝细胞分化，将培养基置换为添加有20ng/mL制瘤素M(OsM)(Wako)和10^-6M Dex的SHM+YAC，每2天更换培养基的同时将细胞培养6天。诱导开始第6天，在细胞上层叠基质胶(Corning)与上述肝细胞诱导培养基的1:7混合物，进而培养2天。在肝细胞诱导结束时将基质胶吸引去除，将细胞用于各种功能分析。作为阴性对照，在整个所对应的培养期间在SHM+YAC中维持细胞。

MH-LSC的胆管诱导

在MH-LSC的接种之前，将停止了细胞周期的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)以5×10⁴细胞/孔接种于用胶原涂覆的12-孔板上。次日，对于第14天的初代MH-LSC进行胰岛素处理并回收，再悬浮于添加有5％FBS的SHM+YAC中，在预先接种的MEF上以5×10⁵细胞/孔接种。次日，通过培养基更换为含有YAC的mTeSR^TM1(Stemcell Technologies)(mTeSR1+YAC)，开始胆管诱导，每2天更换培养基的同时继续培养6天。在诱导开始第6天，将培养基置换为添加有2％基质胶的mTeSR1+YAC，每2天更换培养基的同时进一步继续培养6天。总计12天的培养后完成胆管诱导，将所得到的细胞用于分析。作为阴性对照，在整个所对应的培养期间在SHM+YAC中、MEF上培养细胞。

白蛋白分泌分析

使用Rat Albumin ELISA Quantitation Set(Bethyl,Montgomery,TX)，通过ELISA测定白蛋白(ALB)浓度。为了监控ALB分泌能力的经时变化，在肝细胞诱导的最初6天、每2天对于培养上清进行取样。为了测定肝细胞诱导完成后的ALB分泌能力，将第8天层叠的基质胶吸引去除。为了进行DNA含量测定而回收这些细胞的一半，对剩余的一半添加新鲜培养基进一步培养2天。第10天回收培养上清，测定自第8天到第10天期间分泌的ALB，以第8天的DNA含量标准化。DNA含量使用DNA Quantity Kit(Cosmo Bio Co.,Ltd.、东京)测定。

CYP1A活性测定

为了诱导CYP1A活性，对于第8天的肝细胞诱导的细胞用5μM 3-甲基胆蒽(3-MC)(Sigma)处理4天(第2天更换培养基)。对照细胞仅用作为溶剂的DMSO进行处理。4天后，使用P450-Glo CYP1A1 Assay(Luciferin-CEE)测定CYP1A活性。根据制造者的随附文件，该试剂盒与CYP1A1活性相比可以更有效地检测CYP1A2活性。在CYP1A活性之后接着测定细胞的DNA含量，将CYP活性标准化。为了调查对3-MC的响应性，活性的倍率变化，对于各实验使用3孔/条件作为[3-MC存在下的平均发光量/3-MC非存在下的平均发光量]算出，求出5次的独立的实验的平均值。2次实验中，将总RNA分离，也评价CYP1A1和CTP1A2的基因表达水平。

荧光素二乙酸酯分析

肝细胞诱导的情况下，将细胞用含有2.5μg/mL荧光素二乙酸酯(FD)(Sigma)的培养基、在CO₂培养箱中培养15分钟。将培养基置换为汉克斯平衡盐溶液(HBSS)(Lifetechnologies)后，在荧光显微镜下检测所代谢的荧光素。胆管诱导的情况下，培养15分钟后，将培养基更换为新鲜的培养基，进一步继续30分钟培养，诱导向内腔输送所代谢的荧光素。接着将培养基置换为HBSS，在荧光显微镜下观察荧光素的分布。

分泌分析

将胆管诱导的细胞在2×10^-7M大鼠促胰液素(Wako)的存在下培养30分钟，观察胆管样结构的内腔的扩张。

细胞核的计数

将进行了甲醇固定的细胞通过用PBS(-)稀释到1/1000的hoechst33342染色，根据制造者的指南使用Cellomics^TMArrayScan(R)VTI System(Lifetechnologies)，对核进行计数。

由冷冻肝细胞诱导LSC

根据制造者的指南将冷冻大鼠成熟肝细胞(Biopredic)融解。作为冷冻大鼠肝细胞培养用的基本培养基，使用小型肝细胞培养培养基(SHM)，即添加有5mM HEPES(Sigma,St.Louis,MO)、30mg/L L-脯氨酸(Sigma)、0.05％BSA(Sigma)、10ng/mL上皮细胞生长因子(Sigma)、胰岛素-转铁蛋白-丝氨酸(ITS)-X(Lifetechnologies)、10^-7M地塞米松(Dex)、10mM烟酰胺(Sigma)、1mM抗坏血酸2-磷酸酯(和光纯药、东京)和抗生素/抗真菌药溶液(100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和0.25mg/mL两性霉素B)(Lifetechnologies)的、含有2.4g/L NaHCO₃和L-谷氨酰胺的DMEM/F12(Lifetechnologies,Carlsbad,CA)。将融解了的冷冻大鼠成熟肝细胞、以下的4种低分子抑制药：10μM Y-27632(WAKO)、1μM PD0325901(Axon Medchem,Groningen,Netherland)、0.5μM A-83-01(TOCRIS,Bristol,UK)和3μMCHIR99021(Axon Medchem)悬浮于SHM中，以1×10⁴细胞/cm²接种于用I型胶原涂覆的板(AGCTECHNO GLASS Co.,Ltd.、静冈)上。接种1天后更换培养基，然后每隔1天更换培养基。

由人冷冻肝细胞诱导LSC

根据制造者的指南将人冷冻肝细胞(Xenotech)融解。作为人冷冻肝细胞培养用的基本培养基，使用SHM。使用除了PD0325901之外的3种低分子抑制药，除此之外通过与上述的由冷冻大鼠成熟肝细胞诱导LSC同样的方法进行诱导。所使用的人冷冻肝细胞如表1所示。

[表1]

Lot ID	年龄	性别	人口统计	供给者
					HC1-14	55	男性	高加索(Caucasus)	Xenotech
HC3-14	45	男性	高加索(Caucasus)	Xenotech
					HC5-25	56	男性	高加索(Caucasus)	Xenotech

由人冷冻肝细胞诱导的MH-LSC的继代培养

通过与上述的MH-LSC的继代培养相同的方法，进行由人冷冻肝细胞诱导的MH-LS的继代培养。

实施例1低分子抑制药诱导初代成熟肝细胞的增殖

本发明人等、其它的小组以往报告了低分子抑制药有助于干细胞的多能性的诱导以及维持(Hou et al.,2013；Kawamata and Ochiya,2010)。进而，本发明人等明白了，乳癌细胞的体外的维持强烈依赖于低分子的存在。基于这些发现，本发明人等调查这些低分子的某特定的组合、即Rho激酶抑制药Y-27632、有丝分裂原活化蛋白质激酶(MEK)抑制药PD0325901、1型转化生长因子(TGF)-β受体抑制药A-83-01、和糖原合成酶激酶-3(GSK3)抑制药CHIR99021是否将成体肝细胞重编程为肝干细胞样的分化状态。首先自10-20周龄的大鼠分离初代成熟肝细胞，在上述4因子的可能的全部组合的存在下进行培养。与成熟肝细胞在体外不会增殖的通常的想法相反，在4因子的若干组合的存在下，观察到成熟肝细胞的明确的增殖(图1的a及b)。它们之中，Y-27632、A-83-01和CHIR99021的3因子的组合(以下称为YAC)产生成熟肝细胞的最高增殖能力。因此，以下的实验中，对焦于YAC对成熟肝细胞造成的效果。本发明人等确认了YAC在2周的培养期间使细胞核数增加到约15倍(图2的A)。通过微阵列解析可知，培养第7天(D7)及第14天(D14)中的一系列的细胞周期标记物的基因表达水平在YAC存在下被增量调节(up-regulate)(图2的B)。定量的RT-PCR解析的结果确认了，YAC刺激下的2周的成熟肝细胞的培养期间中，PCNA和FoxM1始终以高的水平表达(图2的C)。通过稀疏接种的肝细胞的帧拍摄解析，确认了增殖中的细胞源自具有典型的成熟肝细胞的形态的细胞(图2的D)。进而，若干增殖中的细胞当初为双核细胞(图2的D)，强烈暗示了成熟肝细胞为YAC诱导性的增殖细胞的起源。对照性地，在YAC非刺激下，几乎不出现增殖细胞，更多的细胞凋亡死亡(图2的D)。定量解析的结果，在YAC存在下与YAC非存在下之间，细胞数图谱发现明确的位移(shift)(图2的E)。特别是5天的培养(自第2天到第6天)期间产生超过5个细胞的单一细胞的比率，在YAC非存在下为1.39％，与此相对地在YAC存在下为25.1％、显著增大(图2的F)。对照性地，形成1个细胞以下的单一细胞的比率在YAC非存在下为77.3％，与此相对地，在YAC存在下仅4.30％(图2的G)。另外，初代肝细胞的凋亡的频率，与YAC非存在下相比，在YAC存在下时得到抑制(图2的H)。

实施例2 YAC诱导性增殖细胞与肝前体细胞类似

YAC诱导性增殖细胞与第0天的初代肝细胞、YAC非刺激下的细胞相比示出高的核/细胞质(N/C)比(图3的a)。这种形态在包含胚胎肝母细胞、成体卵形细胞的LSC中是特征性的。因此，本发明人等调查YAC诱导性增殖细胞在LSC标记物的表达方面是否类似于LSC。定量的RT-PCR解析的结果可知，包含α-胎蛋白(AFP)、SRY-box(Sox)9、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、Thy-1/CD90、肝细胞核内因子1同源异型盒B(HNF1β)、叉头框J1(FoxJ1)、HNF6/onecut-1(OC1)、CD44、整联蛋白α-6(A6)和CK19的很多LSC标记物的表达水平在YAC刺激下的2周的培养期间升高(图3的b)。确认了AFP、CD44、EpCAM、CK19、Sox9、A6和CD90的蛋白质表达水平通过YAC刺激而升高(图3的c)。这些结果强烈暗示，YAC刺激对于成熟肝细胞而言，不仅至少部分地赋予增殖能力而且至少部分地赋予LSC特异性的标记物的表达。因此，本发明人等，将YAC诱导性增殖细胞命名为源自成熟肝细胞的肝干细胞样细胞(MH-LSC)。接着本发明人等调查MH-LSC是否能够分化为肝细胞和胆管上皮细胞(BECs)这两者。

实施例3 MH-LSC能够分化为功能性的肝细胞

本发明人等首先使用以前报告的肝成熟试验方案(Kamiya et al.,2002)调查MH-LSC是否具有对肝细胞的分化能力(图4的A)。若在通过制瘤素M(OsM)和地塞米松(Dex)而受到肝分化刺激的MH-LSC(称为Hep-i(+)细胞)层叠基质胶，则形成具有毛细胆管样结构的典型性的成熟肝细胞样的形态(图4的B)。实际上给予荧光素二乙酸酯(FD)后，所代谢的荧光素蓄积于通过Hep-i(+)细胞形成的这些小管(图4的C)。这种现象，在肝诱导前的MH-LSC中、没有进行肝诱导地培养相同期间的MH-LSC(Hep-i(-)细胞)中都没有观察到(图4的C)。另外，Hep-i(+)细胞在细胞膜中表达了MRP2蛋白质，但是MH-LSC或Hep-i(-)细胞都没有表达该蛋白质(图4的D)。进而，Hep-i(+)细胞与Hep-i(-)细胞、未分化的MH-LSC相比以高水平发挥一系列的肝功能、即蛋白质水平的白蛋白(ALB)表达(图4的E)及其分泌(图4的F、G)、糖原的蓄积(图4的H)和CYP1A活性(图4的I)。重要的是，不仅CYP1A活性(图4的I、J)，而且CYP1A1及CYP1A2的基因表达(图4的K、L)也响应于3-甲基胆蒽(3-MC)刺激而更有效地被诱导。这些发现被使用了mRNA微阵列的基因聚类解析(gene clustering analysis)支持(图5的A)。实际上，与代谢过程、防御应答等肝功能相关的基因集对于Hep-i(+)细胞而言被增量调节(图5的B)。微阵列的数据通过定量的RT-PCR确认(图5的C)。重要的是，与细胞周期相关的基因的大部分在肝诱导后被减量调节(down regulate)。这种基因表达图案与未分化的MH-LSC的表达图案相比为明显对照。因此强烈暗示MHC-LSC通过YAC刺激、不会产生致癌性转化。

实施例4 MH-LSC能够分化为功能性的胆管上皮细胞

本发明人等发现MH-LSC除了对肝细胞的分化能力之外、也能够分化为胆管上皮细胞(BEC)。预备实验中，本发明人等研究能够进行MH-LSC的长期培养的培养条件，颇有意思的是发现了对于MH-LSC赋予形成胆管样结构的能力的条件。本发明人等稍微改变该条件成功以形成胆管样结构的方式使MH-LSC再现良好地分化。该改变了的培养条件包括将MH-LSC在稀疏接种的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上、在mTeSR1培养基中共培养6天的工序；将该工序中得到的细胞在添加有2％基质胶的mTeSR1培养基中进一步培养6天的工序这2个工序(图6的A)。该条件下培养的MH-LSC(称为BEC-i(+)细胞)形成管状结构，与此相对地，在基础的MH-LSC维持培养基中MEF上培养的MH-LSC(BEC-i(-)细胞)示出通常的单层形态(图6的B)。BEC-i(+)细胞，与BEC-i(-)细胞、未分化MH-LSC相比，以高水平表达作为BEC标记物的CK19及GRHL2(图6的C)。应该注意的是，2个水通道蛋白AQP1及AQP9、和2个离子通道CFTR及AE2对于BEC-i(+)细胞而言显著被增量调节(图6的C)，强烈暗示功能性地分化为胆管。另一方面，BEC-i(-)细胞如ALB及AFP表达水平增加所示那样自然向肝细胞样细胞分化(图6的C)。对照性地，BEC-i(+)细胞没有示出这些肝细胞标记物基因的表达升高(图6的C)，暗示被BEC谱系決定。免疫细胞化学分析的结果确认了，BEC-i(+)细胞在管结构顶端侧表达AQP1(图6的D)。另外，AE2及CFTR也在形成有单层上皮的BEC-i(+)中细胞表达(图6的D)。进而，在管结构的内腔表达有密合结合标记物ZO-1(图6的D)。这些结果强烈暗示管结构是功能性的。实际上，若将BEC-i(+)细胞用促胰液素刺激则引起内腔的扩张(图6的E)，证实该细胞具有水输送能力。进而，在FD的存在下，管结构将所代谢的荧光素输送/蓄积于内腔(图6的F)。总结以上示出MH-LSC能够增殖并且也能够分化为肝细胞和BEC中的任意一者，强烈暗示作为表型接近真正的LSC。

实施例5有效的肝分化能力没有消失的MH-LSC的长期培养

为了评价MH-LSC对肝再生医疗的应用可能性，本发明人等研究能够持续多少继代稳定地扩增MH-LSC的条件。其结果发现，通过将培养板用基质胶涂覆，能够实现MH-LSC的连续继代(图7的A)。最初的实验中确认了，MH-LSC可以表观上增殖能力不会降低地实现至少26继代(图7的B)。进而，可以将稳定培养的MH-LSC克隆化而扩增(图7的C)。接着，在约10继代后，在5次独立的实验中可以分别建立2-4克隆。它们的肝特性通过显微镜观察和定量的RT-PCR进行评价。各实验中，可以得到示出上皮形态的克隆(图7的C)。这些细胞应答于上述的肝诱导(图4的A)而示出成熟肝细胞样的形态(图7的D)。ALB、AFP和G6PC等肝细胞标记物的基因表达水平，在所建立的克隆之间存在变动(图7的E)，但是任意一克隆，都应答于肝诱导而这些基因的表达水平增大(图7的F)。如上所述，该培养条件下，在保持肝分化能力的状态下使MH-LSC稳定地扩增，可以再现性良好地建立MH-LSC的克隆。

实施例6被慢性损伤的肝脏中的MH-LSC的再生能力

向存在慢性肝损伤的免疫缺陷小鼠移植MH-LSC，调查其再生能力。使用与SCID小鼠杂交的尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)转基因小鼠(uPA/SCID小鼠)。为了移植分析，选择3个独立的克隆，使用慢病毒导入copGFP基因，用嘌呤霉素挑选导入细胞后，将该进行了标记化的MH-LSC克隆以1.5×10⁶细胞/小鼠进行脾脏内移植到uPA/SCID小鼠(图8的A)。作为阳性对照，以2×10⁵细胞/小鼠移植大鼠成熟肝细胞。移植后每2周监控血清中大鼠ALB水平，结果移植大鼠成熟肝细胞的情况下，移植后直至8周为止稳健增加(图8的B)。自移植有MH-LSC的小鼠切除的肝脏的整体图像，没有发现肿瘤形成，包含很多茶色的区域，与此相对地，非移植小鼠的肝脏为白色、且示出重度的慢性的肝损伤(图8的C上图示板)。由荧光染色的整体图像确认了茶色的区域通过GFP阳性细胞构成(图8的C下图示板)，示出MH-LSC将损伤肝置换为普遍存在(ubiquitous)。进而，对于大鼠Cyp2c6的免疫组织化学分析的结果可知，MH-LSC移植小鼠的肝脏整体的84％被源自MH-LSC的细胞置换(图8的D)。通过免疫组织化学分析及PAS染色，源自MH-LSC的细胞同样地表达各种成熟肝细胞标记物(Cyp2c6、Cyp1a2、Cyp3a1、Cyp7a1、Mrp2、Hnf4α)，另外示出蓄积糖原(图8的E)。进而也示出源自MH-LSC的细胞高频地为双核性。这些结果示出，MH-LSC能够使受损的肝脏有效地再生、能够不形成肿瘤地分化为功能性的肝细胞。

实施例7 MH-LSC的其它已知LSC标记物的表达

本发明人等对于delta同系物1(Dlk1)、含有富含亮氨酸的重复单位的G蛋白质共轭受体5(LGR5)(Huch,M.et al.,Nature,494:247-250(2013)；(Huch,M.et al.,Cell,160:299-312(2015))、以及FoxL1(Sackett,S.D.et al.,Hepatology,49:920-929(2009))等其它报告的肝前体细胞标记物实施定量的RT-PCR，但是在YAC存在下和YAC非存在下中的任意一条件下都没有检测出它们的表达。这些结果暗示，YAC诱导性增殖细胞一部分模仿以前报告的肝前体细胞的基因表达谱，但是有可能不完全一致。

实施例8由冷冻成熟肝细胞诱导MH-LSC

本发明人等调查通过YAC刺激而是否由冷冻大鼠肝细胞诱导LSC。冷冻大鼠肝细胞通过YAC刺激、与成熟肝细胞相比，确认了核/细胞质(N/C)比高的细胞的增殖(图9)。对照性地，在YAC非刺激下，几乎不会出现增殖细胞，更多的细胞凋亡死亡(图9)。

实施例9由人冷冻肝细胞诱导MH-LSC

本发明人等调查通过YAC刺激而是否由人冷冻肝细胞诱导LSC。人冷冻肝细胞通过YAC刺激而增殖。另外，通过YAC刺激，出现与大鼠肝细胞中发现的细胞相同形态的菌落(图10)。

实施例10由人冷冻肝细胞诱导的MH-LS的继代培养

本发明人等进行由人冷冻肝细胞诱导的MH-LS的继代培养，调查是否能够连续继代。其结果，由人冷冻肝细胞诱导的MH-LS即使3次继代后也保持增殖能力(图11)。

产业上的可利用性

根据本发明，可以不伴随基因修饰地、由肝细胞安全且迅速地诱导具有自身再生能力和向肝细胞及胆管上皮细胞分化的能力(两能性)的肝干细胞/前体细胞，因此在能够实现对药物评价系统、肝再生医疗的应用方面极大有用。

本申请基于日本申请的日本特愿2016-003088(申请日：2016年1月8日)，将其内容全部包含于本说明书。

Claims

1.一种由成熟的哺乳动物肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法，其包括使所述肝细胞在体外与TGFβ受体抑制药接触，其中所述方法还包括使GSK3抑制药和ROCK抑制药在体外与所述肝细胞接触，其中所述方法在不对所述肝细胞实施基因修饰的情况下进行，其中所述肝干细胞/前体细胞具有以下的特征：(a)具有自身再生能力，(b)能够分化为肝细胞和胆管上皮细胞这两者，和(c)作为表面抗原标记物，表达EpCAM，但是不表达Dlk1，其中所述TGFβ受体抑制药选自由2-(5-苯并[1,3]二氧环戊烯-4-基-2-叔丁基-1H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶、3-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)-1-苯基硫代氨基甲酰基-1H-吡唑、2-(5-氯-2-氟苯基)蝶啶-4-基)吡啶-4-基胺、3-(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)]-1H-吡唑、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-二氮杂萘和SB431542组成的组，所述GSK3抑制药选自由SB216763、CHIR98014、CHIR99021、SB415286和Kenpaullone组成的组，和所述ROCK抑制药选自由GSK269962A、盐酸法舒地尔、Y-27632和H-1152组成的组。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肝细胞与所述TGFβ受体抑制药的接触通过在该抑制药的存在下对该肝细胞进行培养来实施。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肝细胞与所述GSK3抑制药和所述ROCK抑制药的接触通过在所述GSK3抑制药和所述ROCK抑制药的存在下对该肝细胞进行培养来实施。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物为人、大鼠或小鼠。

5.一种药剂在用于由肝细胞体外诱导制作肝干细胞/前体细胞的方法中的用途，其中所述药剂含有TGFβ受体抑制药、GSK3抑制药和ROCK抑制药，其中所述方法在不对所述肝细胞实施基因修饰的情况下进行，其中所述肝干细胞/前体细胞具有以下的特征：(a)具有自身再生能力，(b)能够分化为肝细胞和胆管上皮细胞这两者，和(c)作为表面抗原标记物，表达EpCAM，但是不表达Dlk1，其中所述TGFβ受体抑制药选自由2-(5-苯并[1,3]二氧环戊烯-4-基-2-叔丁基-1H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶、3-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)-1-苯基硫代氨基甲酰基-1H-吡唑、2-(5-氯-2-氟苯基)蝶啶-4-基)吡啶-4-基胺、3-(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)]-1H-吡唑、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-二氮杂萘和SB431542组成的组，所述GSK3抑制药选自由SB216763、CHIR98014、CHIR99021、SB415286和Kenpaullone组成的组，和所述ROCK抑制药选自由GSK269962A、盐酸法舒地尔、Y-27632和H-1152组成的组。

6.根据权利要求5所述的用途，其中，肝细胞源自人、大鼠或小鼠。

7.根据权利要求5～6中任一项所述的用途，其中所述药剂用于维持或繁殖通过权利要求1～4中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞。

8.一种细胞的维持或繁殖方法，其特征在于，其为通过权利要求1～4中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞的维持或繁殖方法，所述方法包括：

(i)第1继代直至第4继代为止在用胶原或基质胶涂覆的培养容器上、在所述TGFβ受体抑制药、所述GSK3抑制药和所述ROCK抑制药的存在下对该肝干细胞/前体细胞进行继代培养，

(ii)第5继代及以后在用基质胶涂覆的培养容器上、在所述TGFβ受体抑制药、所述GSK3抑制药和所述ROCK抑制药的存在下对该肝干细胞/前体细胞进行继代培养。

9.一种胆管上皮细胞的体外诱导方法，其为由通过权利要求1～4及8中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞诱导产生胆管上皮细胞的方法，其包括：

(i)在低密度的饲养细胞上，在所述TGFβ受体抑制药、所述GSK3抑制药和所述ROCK抑制药的存在下对该肝干细胞/前体细胞进行培养的工序；和

10.一种评价方法，其为评价被检化合物在哺乳动物体内的代谢的方法，其包括：

(i)使由通过权利要求1～4及8中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞分化诱导而得到的肝细胞与被检化合物接触的工序；和

(ii)测定该肝细胞中的被检化合物的代谢的工序。

11.一种评价方法，其为评价被检化合物对于哺乳动物的肝毒性的方法，其包括：

(ii)测定该肝细胞的损伤的有无或其损伤程度的工序。

12.通过权利要求1～4及8中任一项所述的方法得到的肝干细胞/前体细胞在制备用于改善哺乳动物的肝损伤的药物中的用途。