CN105143445A - 衍生自人多能干细胞的肝细胞样细胞的成熟 - Google Patents

衍生自人多能干细胞的肝细胞样细胞的成熟 Download PDF

Info

Publication number
CN105143445A
CN105143445A CN201380062656.XA CN201380062656A CN105143445A CN 105143445 A CN105143445 A CN 105143445A CN 201380062656 A CN201380062656 A CN 201380062656A CN 105143445 A CN105143445 A CN 105143445A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ketone
cells
hepatocyte
paro
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380062656.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105143445B (zh
Inventor
芭芭拉·屈珀斯-蒙特
何塞菲娜·埃德斯巴格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takara Bio Europe AB
Original Assignee
Takara Bio Europe AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takara Bio Europe AB filed Critical Takara Bio Europe AB
Publication of CN105143445A publication Critical patent/CN105143445A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105143445B publication Critical patent/CN105143445B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/06—Anti-neoplasic drugs, anti-retroviral drugs, e.g. azacytidine, cyclophosphamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/405—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclins, cyclin-dependant kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/03—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from non-embryonic pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及肝细胞样细胞的定向分化和成熟。特别地，本发明涉及使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂，例如视黄酸(RA)，任选地与GSK-3(糖原合酶激酶3)抑制剂或Wnt信号传导激活剂相组合和/或与用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。本发明还涉及使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂，例如视黄酸(RA)，任选地与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂和/或与用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。与之前的表现相比，根据本发明获得的肝细胞样细胞表现出更类似于原代肝细胞的表型。

Description

衍生自人多能干细胞的肝细胞样细胞的成熟
技术领域
本发明涉及肝细胞样细胞的定向分化和成熟。与之前的表现相比，根据本发明获得的肝细胞样细胞表现出更类似于原代肝细胞的表型。特别地，本发明涉及使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂，例如视黄酸(retinoicacid，RA)，任选地与GSK-3(糖原合酶激酶3，Glycogensynthasekinase3)的抑制剂或Wnt信号传导激活剂相组合和/或与用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。本发明还涉及使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂，例如视黄酸(RA)，任选地与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclindependentkinase，CDK)的抑制剂和/或用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。如本文公开的，本发明人发现与当前可用的现有技术方法相比，使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂导致肝细胞样细胞发育出更成熟和更具功能性的特征以及更纯和更均一的肝细胞样细胞群。
背景技术
新药物的开发面临着许多挑战，尤其是克服不利毒性作用的问题。事实上，不利的肝反应是最突出的副作用。大部分小分子药物的代谢和最终清除发生在肝脏中，因此药物开发中一个主要的关注领域在于这些化合物或其代谢过程是否具有任何肝毒性作用。此外，同样重要的是，在药物可以开始临床试验项目之前，发现这些化合物的次级代谢物是否也具有任何细胞毒作用。
因此，在新药和化学物的开发中对于模拟人肝细胞并且能够预测候选分子作用的模型肝系统具有迫切需求。传统上，研究人员已经被迫依靠原代肝衍生的肝细胞进行这样的筛选，但是它们具有许多缺点，包括难以在长期培养中维持所述细胞以及难以获得一致的均一细胞群。对此已经以衍生自人多能干细胞的肝细胞样细胞的形式提供了解决方案。人多能干细胞(humanpluripotentstemcells，hPS)已经开始彻底改变相关人细胞类型的获得方式。使多能人胚胎衍生干(humanembryonic-derivedstem，hES)细胞和人诱导多能干(humaninducedpluripotentstem，hiPS)细胞无限繁殖并随后将其分化成期望靶细胞类型的可能性目前为许多体内和体外应用提供了稳定且几乎无限的细胞供应。
遗憾的是，由于形态和功能的差异，目前可用的肝细胞类型并不始终是肝脏环境的精确模型。例如，原代细胞的一种经常使用的替代物是包含非常低水平(或完全不包含)代谢酶并且具有与体内天然肝细胞大幅不同的其他重要蛋白质表达的肝细胞系。这尤其与药物代谢相关，因为肝细胞系的一个主要缺陷是不存在或异常高地表达对于药物筛选目的来说必需的药物转运蛋白。与临床更相关的成体肝细胞相比，其他可用的肝细胞系的形态和生理机制更多地记忆了胎儿(fetal)肝细胞或幼年肝细胞。由于这些原因，对于开发不仅容易培养和繁殖，并且还具有更成熟表型、行为方式更加接近成体原代肝细胞的肝细胞系具有强烈需求。
本领域中良好建立了从多能干细胞衍生肝细胞样细胞。对于体外用途，多个小组已经开发了用于从hES细胞(Hay等，2007；Hay等，2008；Brolen等2010；Funakoshi等2011)和从hiPS细胞(US8148151B；Song等2009；Sullivan等2010；Si-Tayeb等2010；Chen等2012)得到肝细胞样细胞的方案。但是，所有这些方案的一个共同之处在于成熟肝细胞的典型基因特定的低mRNA和蛋白质表达，例如I相和II相基因(例如，CYP1A2、2B6、2C9、2D6、3A4)、核受体(例如，CAR和PXR)以及其他成体肝标志物(例如，白蛋白)。另外，这些hESC和hiPSC衍生肝细胞样细胞具有胎儿肝基因的高表达，例如甲胎蛋白(AFP)和CYP3A7，结果是本文所述细胞类型具有胎表型但不具有成体表型(综述参见，例如Baxter等2010)。此外，在对于hESC和hiPSC衍生肝细胞样细胞的大部分公开的研究中，对药物转运蛋白的表达和功能从未有过研究。
之前已经表明RA信号传导的调节在早期肝细胞分化的过程中，尤其是在定形内胚层(definitiveendoderm，DE)被特化变成肝脏内胚层的阶段很重要(Touboul等2010)。此外，已经在多种对于早期肝细胞特化来说重要的基因(例如，AFP和HNF4α)中鉴定出了RA应答性元件(参见Qian等2000；Magee等1998和Hatzis等2001)。但是，已知RA在该早期阶段具有多种作用，并且已经发现其对于从多能干细胞得到胰脏内胚层重要(Mfopou等2010)。美国专利申请公开US2012/0143316A1公开了使用全反式视黄酸(all-transretinoicacid)诱导由内胚层样细胞进行肝分化。很明显，所有这些公开内容均涉及在内胚层和早期肝细胞分化过程中调节RA信号传导。但是，这些文献均未教导或暗示视黄酸适于作为肝细胞成熟促进剂，更不必说其在肝细胞分化的晚期阶段中的用途。
之前已经描述了将GSK3抑制剂用于内胚层的早期分化的用途。WO08094597(Dalton)描述了一种通过在分化培养基中使灵长类动物多能干细胞(primatepluripotentstemcells，pPSC)与有效量的GSK3抑制剂接触来由pPSC产生中内胚层的方法。WO2007050043(Stanton)描述了一种由多能干细胞产生中胚层或内胚层细胞的方法，其包括多能干细胞中的Wnt信号传导通路。US2006003446(Keller)描述了一种在不存在血清但是存在激活素和Wnt信号传导抑制剂的情况下培养胚胎干细胞产生富集之内胚层细胞细胞群的方式。已经表明，通过使用GSK3抑制剂调节Wnt信号传导在DE细胞暴露于这种处理时对于特化肝细胞命运有益(WO2011/116930)。另外，所有这些公开内容均涉及在内胚层或肝特化的相对早期阶段调节GSK3信号传导。
已知在某些基质组分上培养细胞影响其生长，并且在多潜能细胞的情况下，影响其最终分化。例如，已经表明，通过用某些基质组分覆盖干细胞，多能干细胞经历上皮到间充质的转变，并由此发育成心肌细胞类型(WO2011060342)。另外，一直已知在确定的“夹心式”基质组分中培养成体原代肝细胞有助于保持其表型和代谢活性(Dunn等1991)，(Page等2007)。
发明内容
本发明描述了改进的方法，通过这些方法，衍生自人多能干(hPS)细胞(例如但不限于hiPS细胞和hES细胞)的肝细胞样细胞可进一步成熟为具有更接近离体原代肝细胞的表型的肝细胞样细胞。
在第一个方面，本发明提供一种用于促进人肝细胞样细胞成熟的方法，其使所述肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂(例如视黄酸)，任选地与暴露于GSK3信号传导抑制剂或Wnt信号传导激活剂和/或用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。
因此，提供了一种用于促进人肝细胞样细胞成熟的方法，所述方法包括：
使所述人肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。
用于促进人肝细胞样细胞成熟的所述方法还可包括在分化条件下培养人肝祖细胞以获得所述肝细胞样细胞。
在第二个方面，本发明提供了一种用于产生人肝细胞样细胞的方法，其在分化条件下培养人肝祖细胞以获得肝细胞样细胞，并使获得的肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂(例如视黄酸)，任选地与暴露于GSK3信号传导抑制剂或Wnt信号传导激活剂和/或用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。
因此，提供了一种用于产生人肝细胞样细胞的方法，所述方法包括：
在分化条件下培养人肝祖细胞以获得肝细胞样细胞，并且
使所述肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。
本发明人出乎意料地发现，使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂(如视黄酸)提高了成熟肝细胞的许多标志物的基因和蛋白质表达，尤其是HNF4α、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4、CYP3A5、CAR、GSTA1-1和NTCP的成体同工型，因此使得肝细胞样细胞具有更接近于原代肝细胞的表型。另外，在暴露于视黄酸应答性受体的激活剂、GSK3抑制剂以及用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分覆盖时，发现了令人出乎意料的协同作用，使得肝细胞样细胞的表型甚至更接近人原代肝细胞。除了肝基因的表达和功能改善外，还改善了肝细胞样细胞的形态，例如加强了细胞-细胞接触，使肝细胞样细胞的寿命延长7至10天(图8)。
视黄酸应答性受体的激活剂(如视黄酸)的存在可贯穿于肝祖细胞向肝细胞样细胞的分化，以及所获得肝细胞样细胞的进一步成熟(“分化和成熟”)，其可需要至多35天。因此，可在分化和成熟期间使分化和成熟中的肝细胞持续/长期暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。或者，可使肝细胞样细胞暴露于所述视黄酸应答性受体的激活剂大于4小时且不大于72小时的持续时期，例如5、24或48小时的持续时期。还可使肝细胞样细胞暴露于所述视黄酸应答性受体的激活剂至少两个、例如至少三个、至少四个或至少五个大于4小时且不大于72小时的持续时期，例如5、24或48小时的持续时期。所述至少两个持续时期通常被不暴露于所述视黄酸应答性受体的激活剂的时期隔开。这种不暴露时期可持续数小时至数天，例如12至24小时，或1至10天(例如1至2天)。在这种情况下，可以在肝细胞样细胞成熟期间的任意时间点将视黄酸应答性受体的激活剂添加到培养基。可以在肝祖细胞开始向肝细胞样细胞分化后t≥7天的时间时使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。因此，可在肝祖细胞开始向肝细胞样细胞分化后第7、9或12天时使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。
本发明方法还可包括通过在分化条件下培养hPS细胞来初始产生肝祖细胞(本文中也称为“初始肝分化”)。因此，使hPS细胞初始分化为所述肝祖细胞。这种初始培养或分化可包括在分化条件下培养hPS细胞以获得定形内胚层细胞(DE细胞)(前内胚层化(pre-endodermal)步骤)，以及在分化条件下进一步培养所获得的DE细胞以获得肝祖细胞(前肝化(pre-hepatic)步骤)。因此，可由此使hPS细胞首先分化成定形内胚层，然后进一步使定形内胚层分化为肝祖细胞。
此外，在hPS细胞向内胚层和/或肝祖细胞初始分化期间，可使分化中的hPS细胞暴露于DNA去甲基化试剂(例如5-氮杂-2-脱氧胞苷或5-氮杂胞苷)，以对基因组的部分进行去甲基并允许基因的转录激活。向所述DNA去甲基化试剂的暴露可发生在hPS细胞向DE细胞的分化期间，即前内胚层化步骤期间。然后在整个内胚层化阶段培养细胞，直到到达肝祖细胞阶段，即直到获得肝祖细胞，此时肝细胞样细胞的进一步分化和成熟包括进行只暴露于视黄酸应答性受体的激活剂，或者暴露于视黄酸应答性受体的激活剂与GSK-3的抑制或Wnt信号传导的激活和/或基质覆盖之组合。
已经出乎意料地发现，用DNA去甲基化试剂处理分化中的hPS细胞导致改善DE细胞形态并且提高其产率。另外，与当前可用的现有技术方法相比，暴露于去甲基化试剂提供了只有更低表达干细胞标志物(如Oct4)的更纯并且更均一的DE群(参见图13A至D)。此外，发现了这些内胚层细胞的许多定形内胚层特征性标志物(如sox17、cxcr4和hhex)的基因表达提高(参见图13D)。相信是第一次表明DNA去甲基的这种作用，以及可通过普遍的甲基化的缺失来增强在基因组水平下起作用的参与由hPS向定形内胚层分化之生长因子的应用。另外，当在早期内胚层发育中用DNA去甲基化试剂处理细胞，然后使获得的肝祖细胞只暴露于视黄酸应答性受体的激活剂，或者暴露于视黄酸应答性受体的激活剂与GSK3抑制剂和/或基质覆盖物之组合时，发现了对肝细胞样细胞成熟的强协同作用。
由于根据本发明的方法，获得了具有更接近于原代肝细胞表型的肝细胞样细胞。在成熟阶段之后对细胞的分析揭示，成熟肝细胞的某些标志物的表达水平明显提高，尤其是但不限于：HNF4α、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4、CYP3A5、CAR、GSTA1-1和NTCP的成体同工型(参见例如图1B、4B+C、6、9、10、12)。另外，与原代肝细胞相比，通过早期阶段去甲基处理以及晚期阶段暴露于视黄酸应答性受体的激活剂、GSK3抑制剂(或Wnt信号传导激活剂)和基质覆盖物获得的肝细胞样细胞表现出肝基因(如CYP)随培养时间稳定或逐渐提高的表达。在培养的原代肝细胞中，CYP活性和mRNA表达随时间迅速降低，而在根据本发明的肝细胞样细胞中观察到了相反情况(参见图16)。另一种广泛使用的肝细胞类型是HepG2，其表现出比根据本发明的肝细胞样细胞低得多的CYP活性。
本发明提供了一种促进人肝细胞样细胞成熟的方法，其使所述肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂(如视黄酸)，任选地与暴露于CDK抑制剂和/或用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。
因此，提供了一种用于促进人肝细胞样细胞成熟的方法，所述方法包括：
使所述人肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。
用于促进人肝细胞样细胞成熟的所述方法还可包括在分化条件下培养人肝祖细胞以获得所述肝细胞样细胞。
本发明还提供了一种用于产生人肝细胞样细胞的方法，其在分化条件下培养人肝祖细胞以获得肝细胞样细胞，并使获得的肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂(例如视黄酸)，任选地与暴露于CDK抑制剂和/或用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。
因此，提供了一种用于产生人肝细胞样细胞的方法，所述方法包括：
在分化条件下培养人肝祖细胞以获得肝细胞样细胞，并且
使所述肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。
如上文指出的，本发明人出乎意料地发现，使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂(如视黄酸)提高了成熟肝细胞的许多标志物的基因和蛋白质表达，尤其是HNF4α、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4、CYP3A5、CAR、GSTA1-1和NTCP的成体同工型，并因此使得肝细胞样细胞具有更接近于原代肝细胞的表型。另外，在暴露于视黄酸应答性受体的激活剂、CDK抑制剂并且用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分覆盖时，发现了令人惊讶的协同效应，使得肝细胞样细胞的表型甚至更接近人原代肝细胞。除了肝基因的表达和功能改善外，还改善了肝细胞样细胞的形态，例如加强了细胞-细胞接触，使肝细胞样细胞的寿命延长7至10天(图8)。
此外，视黄酸应答性受体的激活剂(如视黄酸)的存在可贯穿肝祖细胞向肝细胞样细胞的分化，以及所获得肝细胞样细胞的进一步成熟(“分化和成熟”)，其可至多35天。因此，可在分化和成熟期间使分化和成熟中的肝细胞持续/长期暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。或者，可使肝细胞样细胞暴露于所述视黄酸应答性受体的激活剂大于4小时且不大于72小时的持续时期，例如5、24或48小时的持续时期。还可使肝细胞样细胞暴露于所述视黄酸应答性受体的激活剂至少两个、例如至少三个、至少四个或至少五个大于4小时且不大于72小时的持续时期，例如，5、24或48小时的持续时期。所述至少两个持续时期通常被不暴露于所述视黄酸应答性受体的激活剂的时期隔开。这种不暴露时期可持续数小时至数天，例如12至24小时，或1至10天(例如1至2天)。在这种情况下，可以在肝细胞样细胞成熟期间的任意时间点将视黄酸应答性受体的激活剂添加到培养基。可以在肝祖细胞开始向肝细胞样细胞分化后t≥7天的时间时使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。因此，可在肝祖细胞开始向肝细胞样细胞分化后的第7、9或12天时使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。
本发明方法还可包括通过在分化条件下培养hPS细胞来初始产生肝祖细胞(本文中也称为“初始肝分化”)。因此，使hPS细胞初始分化为所述肝祖细胞。这种初始培养或分化可包括在分化条件下培养hPS细胞以获得定形内胚层细胞(DE细胞)(前内胚层化步骤)，以及在分化条件下进一步培养所获得的DE细胞获得肝祖细胞(前肝化步骤)。因此，可由此使hPS细胞首先分化成定形内胚层，然后进一步使定形内胚层分化为肝祖细胞。
此外，在hPS细胞向内胚层和/或肝祖细胞的初始分化期间，可使分化中的hPS细胞暴露于DNA去甲基化试剂，例如5-氮杂-2-脱氧胞苷或5-氮杂胞苷，以对基因组的部分进行去甲基并允许基因的转录激活。向所述DNA去甲基化试剂的暴露可发生在hPS细胞向DE细胞分化期间，即前内胚层化步骤期间。然后在整个内胚层化阶段培养细胞，直到到达肝祖细胞阶段，即直到获得肝祖细胞，此时肝细胞样细胞的进一步分化和成熟包括进行只暴露于视黄酸应答性受体的激活剂，或者暴露于视黄酸应答性受体的激活剂与CDK的抑制和/或基质覆盖之组合。
已经出乎意料地发现，用DNA去甲基化试剂处理分化中的hPS细胞导致改善DE细胞形态并且提高其产率。另外，与当前可用的现有技术方法相比，暴露于去甲基化试剂提供了更低表达干细胞标志物(如Oct4)的更纯并且更均一的DE群(参见图13A至D)。此外，发现了这些内胚层细胞的许多定形内胚层特征性标志物(如sox17、cxcr4和hhex)的基因表达提高(参见图13D)。相信是第一次表明DNA去甲基的这种作用，以及可通过普遍的甲基化的缺失来增强在基因组水平起作用的参与由hPS细胞向定形内胚层分化之生长因子的应用。另外，当在早期内胚层发育中用DNA去甲基化试剂处理细胞，然后使获得的肝祖细胞只暴露于视黄酸应答性受体的激活剂，或者暴露于视黄酸应答性受体的激活剂与CDK抑制剂和/或基质覆盖物之组合时，发现了对肝细胞样细胞的成熟的强协同作用。
由于根据本发明的方法，获得了具有更接近于原代肝细胞的表型的肝细胞样细胞。在成熟阶段之后对细胞的分析揭示，成熟肝细胞的某些标志物的表达水平明显提高，尤其是但不限于：HNF4α、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4、CYP3A5、CAR、GSTA1-1和NTCP的成体同工型(参见例如图1B、4B+C、6、9、10、12)。另外，与原代肝细胞相比，通过早期阶段去甲基处理以及晚期阶段暴露于视黄酸应答性受体的激活剂、CDK抑制剂和基质覆盖物获得的肝细胞样细胞表现出肝基因(如CYP)随培养时间稳定或提高的表达。在培养的原代肝细胞中，CYP活性和mRNA表达随时间迅速降低，而在根据本发明的肝细胞样细胞中观察到了相反情况(参见图16)。另一种广泛使用的肝细胞类型是HepG2，其表现出比根据本发明的肝细胞样细胞低得多的CYP活性。
因此，在另一些方面，本发明涉及通过本发明方法获得的肝细胞样细胞，以及包含所述肝细胞样细胞或由所述肝细胞样细胞组成的细胞组合物。
在另一个方面，本发明涉及本发明的肝细胞样细胞或细胞组合物在医学、尤其是在再生医学中的进一步用途。换言之，本发明的肝细胞样细胞或细胞组合物用于医学，尤其是用于再生医学。特别地，本发明的肝细胞样细胞或细胞组合物用于预防和/或治疗由组织退化造成的病理和/或病症。本发明的肝细胞样细胞或细胞组合物还用于预防和/或治疗肝病。本发明的肝细胞样细胞或细胞组合物还用于预防和/或治疗代谢病理和/或疾病。因此，本发明的肝细胞样细胞或细胞组合物可用于制备尤其用于预防和/或治疗由组织退化造成的病理和/或病症的药物或医药产品，例如替代组织或细胞之注射剂的形式。本发明的肝细胞样细胞或细胞组合物还可用于制备用于预防和/或治疗肝病的药物或医药产品。本发明的肝细胞样细胞或细胞组合物可用于制备用于预防和/或治疗代谢病理和/或疾病的药物或医药产品。本发明的这个方面还包括用于治疗本文所述病理和/或疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的本发明的肝细胞样细胞或细胞组合物。
在另一些方面，本发明提供了本发明的肝细胞样细胞或细胞组合物在药物和毒理学筛选中的进一步用途，例如，药物开发过程或毒性测试，如在用于研究肝发生(hepatogenesis)的体外模型中用于研究药物转运蛋白或药物代谢酶；以及用于研究人肝再生性疾病。
在另一个方面，本发明涉及视黄酸应答性受体的激活剂用于使人肝细胞样细胞成熟的用途。这个方面还包括视黄酸应答性受体的激活剂与GSK3信号传导抑制剂和/或基质覆盖物组合用于使人肝细胞样细胞成熟的用途。这个方面还包括视黄酸应答性受体的激活剂与Wnt信号传导激活剂和/或基质覆盖物组合用于使人肝细胞样细胞成熟的用途。这个方面还包括视黄酸应答性受体的激活剂与CDK抑制剂和/或基质覆盖物组合用于使人肝细胞样细胞成熟的用途。
在另一个方面，本发明涉及可用于实施本发明方法的试剂盒。包括在这个方面中的试剂盒包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂以及选自GSK3抑制剂、Wnt信号传导激活剂、CDK抑制剂和细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)组分或ECM组分混合物的至少一种物质。应理解，本文给出的关于在本发明方法中使用的组分的细节还适用于本发明的试剂盒中包含的组分。
在另一个方面，本发明涉及组合物。这种组合物尤其可用于根据本发明使人肝细胞样细胞成熟。包括在这个方面中的组合物包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂以及选自GSK3抑制剂、Wnt信号传导激活剂和CDK抑制剂的至少一种物质。应理解，本文给出的关于在本发明方法中使用的组分的细节还适用于本发明的组合物中包含的组分。
发明详述
本发明提供了用于使人肝细胞样细胞成熟的方法，其通过使所述细胞只暴露于视黄酸受体激活剂，或者暴露于视黄酸受体激活剂与GSK3信号传导抑制剂或Wnt信号传导激活剂和/或用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞之组合来实现。所述方法还可包括在支持性培养物和分化培养基中培养人肝祖细胞以获得所述肝细胞样细胞，然后使所述细胞只暴露于视黄酸应答性受体的激活剂，或者暴露于视黄酸应答性受体激活剂与GSK3信号传导抑制剂或Wnt信号传导激活剂和/或用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞之组合。
本发明还提供了用于使人肝细胞样细胞成熟的方法，其通过使所述细胞只暴露于视黄酸受体的激活剂，或者暴露于视黄酸受体的激活剂与CDK抑制剂和/或用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞之组合来实现。所述方法还可包括在支持性培养基和分化培养基中培养人肝祖细胞以获得所述肝细胞样细胞，然后使所述细胞只暴露于视黄酸应答性受体的激活剂，或者暴露于视黄酸应答性受体激活剂与CDK抑制剂和/或用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞之组合。
本发明的起始材料可以是具有肝细胞命运、发育到内胚层阶段后的任何阶段的任何细胞，例如但不限于胎儿肝细胞和肝祖细胞。
如上文指出的，本发明提供了用于促进人肝细胞样细胞成熟的方法，其使所述肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂(例如视黄酸)，任选地与暴露于GSK3信号传导抑制剂或Wnt信号传导激活剂和/或用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。
因此，用于促进人肝细胞样细胞成熟的方法可描述为包括以下步骤：
使所述人肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。
用于促进人肝细胞样细胞成熟的方法还可包括在分化条件下培养人肝祖细胞以获得所述肝细胞样细胞的步骤。
本发明还提供了用于产生人肝细胞样细胞的方法，其在分化条件下培养人肝祖细胞以获得肝细胞样细胞，并使获得的肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂(例如视黄酸)，任选地与暴露于GSK3信号传导抑制剂或Wnt信号传导激活剂和/或用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。
因此，所述用于产生人肝细胞样细胞的方法可描述为包括以下步骤：
在分化条件下培养人肝祖细胞以获得肝细胞样细胞，并且
使所述肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。
本发明还提供了一种用于促进人肝细胞样细胞成熟的方法，其使所述肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体激活剂(例如视黄酸)，任选地与暴露于CDK抑制剂和/或用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。
因此，用于促进人肝细胞样细胞成熟的方法可描述为包括以下步骤：
使所述人肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。
用于促进人肝细胞样细胞成熟的所述方法还可包括在分化条件下培养人肝祖细胞以获得所述肝细胞样细胞的步骤。
本发明还提供了用于产生人肝细胞样细胞的方法，其在分化条件下培养人肝祖细胞以获得肝细胞样细胞，并使获得的肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂(例如视黄酸)，任选地与暴露于CDK抑制剂和/或用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。
因此，所述用于产生人肝细胞样细胞的方法可描述为包括以下步骤：
在分化条件下培养人肝祖细胞以获得肝细胞样细胞，并且
使所述肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。
因此，可使用人肝祖细胞作为根据本发明的起始材料。肝祖细胞起始材料可以是例如已建立的肝祖细胞的细胞系，或者可以重头制备，例如由hPS细胞或内胚层细胞制备。
肝细胞样细胞的分化和成熟可分为两个阶段，即，肝祖细胞分化成肝细胞样细胞的第一阶段(“肝祖细胞阶段”)，和获得的肝细胞样细胞进一步成熟的第二阶段(成熟阶段)。在成熟阶段期间，获得的肝细胞样细胞表现出肝细胞特征性标志物的提高的基因和蛋白质表达。
用于从hES细胞(Hay等，2007；Hay等，2008；Brolen等2010；Funakoshi等2011)和从hiPS细胞(US8148151B；Song等2009；Sullivan等2010；Si-Tayeb等2010；Chen等2012)开始使肝祖细胞分化成肝细胞样细胞的合适条件是已知的。例如WO2009/013254A1描述了由肝祖细胞获得肝细胞样细胞的合适的基础方案(实施方案1至4)。
通常，在包含一种或更多种生长因子(如HGF)和/或一种或更多种分化诱导物(如二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、地塞米松(dimethylsulfoxide，DexM)、奥美拉唑、制癌蛋白M(OncostatinM，OSM)、利福平、脱氧苯巴比妥、乙醇或异烟肼)的分化培养基中培养肝祖细胞。所述一种或更多种生长因子(如HGF)的浓度通常为约10至约300ng/ml，例如约20至约250ng/ml，约50至约250ng/ml，约100至约250ng/ml，约150至约250ng/ml，约50至约200ng/ml，约50至约150ng/ml或约50至约100ng/ml；或者可以是约100ng/ml，约150ng/ml，约200ng/ml，约250ng/ml或约300ng/ml。所述一种或更多种分化诱导物的浓度可根据所使用的特定化合物而改变。DMSO的浓度通常例如为约0.1至约2％v/v，例如约0.1至约1.5％v/v，约0.1至约1％v/v，约0.25至约1％v/v，约0.25至约0.75％v/v，约0.5至约1.5％v/v，或约0.5至约1％v/v。OSM的浓度例如通常为约1至约20ng/ml，例如约1至约15ng/ml，约5至约15ng/ml，或者约7.5至约12.5ng/ml。DexM的浓度例如通常为约0.05至约1μM，例如约0.05至约0.5μM，约0.05至约0.2μM，约0.05至约0.1μM或者约0.1至约0.5μM。
分化培养基还可包含血清，例如FBS或FCS，和/或一种或更多种骨形态发生蛋白(BMP)，例如骨形态发生蛋白2(BMP2)和/或骨形态发生蛋白4(BMP4)。如果存在，则血清浓度通常为约0.1至约5％v/v，例如约0.1至约0.5％，0.2至3％v/v，约0.5至约2.5％v/v，约0.5至1％v/v或者约1至约2.5％v/v。如果存在，则一种或更多种BMP的浓度通常为约50至约300ng/ml，例如约50至约250ng/ml，约100至约250ng/ml，约150至约250ng/ml，约50至约200ng/ml，约100至约200ng/ml或者约150至约200ng/ml。
分化培养基还可包含另一些补充剂，例如PEST和/或GlutaMAX。PEST的浓度通常为约0.1至约0.5％v/v，例如约0.1至约0.25％v/v。GlutaMAX的浓度通常为约0.5至约1.5％v/v，例如约0.75至1.25％v/v，例如约1％v/v。
形成分化培养基之基础的培养基可以是适合于培养人肝祖细胞的任何培养基，例如RPMI1640或高级培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、HCM培养基、HBM培养基、Waymouth培养基或基于WilliamsE的培养基。因此，分化培养基可以是RPMI1640或者含有或补充有上述组分的高级培养基。或者，分化培养基可以是含有或补充有上述组分的DMEM。又或者，分化培养基因此可以是含有或补充有上述组分的HCM或HBM培养基。又或者，分化培养基因此可以是含有或补充有上述组分的Waymouth培养基或基于WilliamsE的培养基。
人肝祖细胞的分化和获得的肝细胞样细胞的进一步成熟(“分化和成熟”)通常总共用至多35天。因此，为了获得肝细胞样细胞，将人肝祖细胞在分化培养基中培养至多35天。例如，可将人肝祖细胞在分化培养基中培养约7至约35天之间的任何时间。因此，还可将其培养约10至约30天。还可将其培养约10至约25天。或者，可以将其培养约10至约20天，或者约10至约15天。还可以将其培养约15至约35天。因此，还可以将其培养约15至约30天。或者，可以将其培养约15至约25天。还可以将其培养约15至约20天。在培养期间，通常每两天或三天将分化培养基替换为新鲜培养基。
在上述条件下，在培养7天时或7天后由肝祖细胞获得肝细胞样细胞。因此，可以将肝细胞样细胞的分化和成熟分为使肝祖细胞分化成肝细胞样细胞之7天的肝祖细胞阶段和使获得的肝细胞样细胞进一步成熟之持续到全部培养期结束(例如到第35天)的成熟阶段。
本发明方法中使用的视黄酸应答性受体的激活剂可以是能够结合并激活人视黄酸受体(retinoicacidreceptor，RAR)和/或人的类视黄醇X受体(retinoidXreceptor，RXR)的任何化合物，例如能够结合并激活RAR和RXR二者的化合物。
用于本发明的合适的视黄酸应答性受体的激活剂是视黄酸，例如9-顺式视黄酸(9-cis-retinoicacid)和13-顺式视黄酸，或者其他视黄酸异构体，包括全反式视黄酸，7-顺式视黄酸和11-顺式视黄酸，或者视黄酸的类似物，例如TTNPB、AM580、retilloic酸或CBS-211A，或者类视黄醇。
因此，可使用9-顺式视黄酸作为根据本发明的视黄酸应答性受体的激活剂。替选地或另外地，还可使用13-顺式视黄酸作为根据本发明的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使用13-顺式视黄酸作为根据本发明的视黄酸应答性受体的激活剂。
例如，已经报道9-顺式视黄酸是唯一结合并激活RXR和RAR二者的视黄酸立体异构体(Allenby等；Idres等)。但是，另一份报道声称11-顺式视黄酸、13-顺式视黄酸和全反式视黄酸也可结合RXR，但是具有比9-顺式视黄酸低得多的亲和力(Heyman等)。总之，这些报道表明，与其他RA异构体相比，9-顺式视黄酸可能是主要的RXR激活剂。因此，用于本发明的视黄酸应答性受体的激活剂可以是视黄酸，视黄酸的类似物，或者能够结合并激活RAR和RXR二者的类视黄醇，例如9-顺式视黄酸或其类似物。
此外，可使用全反式视黄酸、7-顺式视黄酸、11-顺式视黄酸或13-顺式视黄酸作为视黄酸应答性受体的激活剂。已经表明，这些异构体特异性结合RAR，但是不结合RXR(Allenby等；Idres等)，或者对RXR的亲和力比9-顺式视黄酸低得多(Heyman等)。因此，用于本发明的视黄酸应答性受体的激活剂可以是视黄酸，视黄酸的类似物，或者能够结合并激活RAR，但是不结合或较弱地结合并激活RXR的类视黄醇，例如全反式视黄酸或全反式视黄酸的类似物，或者7-顺式视黄酸或7-顺式视黄酸的类似物，或者11-顺式视黄酸或11-顺式视黄酸的类似物，或者13-顺式视黄酸或13-顺式视黄酸的类似物。
用于本发明的视黄酸应答性受体的激活剂还可以是仅能够结合并激活RXR，但是不结合和激活RAR的类视黄醇，例如Bexarotene(LGD1069)、LG100268或SR11237。
如上文提到的，还可使用视黄酸的类似物(如TTNPB、AM580、retilloic酸或CBS-211A)作为视黄酸应答性受体的激活剂。因此，可使用视黄酸类似物TTNPB作为视黄酸应答性受体的激活剂。或者，可使用视黄酸类似物AM580作为视黄酸应答性受体的激活剂。
还构想了使用结合并激活人视黄酸受体(RAR)和/或类视黄醇X受体(RXR)的小分子、脂质、多肽或蛋白质作为视黄酸应答性受体的激活剂。这些化合物的非限制性实例是Ch55、AC261066、AC55649、CD1530、CD437、CD3254、AM80、BMS753、BMS961、阿达帕林、他扎罗汀、二十二碳六烯酸和氟贝沙罗汀(Fluorobexarotene)，其全部是已知的RAR或RXR激动剂。
任选地，可使肝细胞样细胞暴露于一种或更多种另外的视黄酸应答性受体的激活剂。因此，不仅可使肝细胞样细胞暴露于一种视黄酸应答性受体的激活剂，还可暴露于一种或更多种另外的视黄酸应答性受体的激活剂，例如两种、三种或四种上述那些的组合。例如，可使肝细胞样细胞暴露于9-顺式视黄酸和13-顺式视黄酸二者。
在本发明的一个方面中，在肝细胞样细胞分化和成熟期间，使分化和成熟中的肝细胞持续/长期暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。因此，视黄酸应答性受体的激活剂可在整个分化和成熟期间存在于分化培养基中。
分化和成熟中的肝细胞可例如暴露于视黄酸应答性受体的激活剂至多约35天。其可以例如暴露于视黄酸应答性受体的激活剂约10天至约30天。其还可以暴露于视黄酸应答性受体的激活剂约10天至约25天。其还可以暴露于视黄酸应答性受体的激活剂约10天至约20天。其还可以暴露于视黄酸应答性受体的激活剂约10天至约15天。其还可以暴露于视黄酸应答性受体的激活剂约15天至约35天。其还可以暴露于视黄酸应答性受体的激活剂约15天至约30天。其还可以暴露于视黄酸应答性受体的激活剂约15天至约25天。其还可以暴露于视黄酸应答性受体的激活剂约15天至约20天。
在本发明的另一个方面，使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂大于4小时且不大于72小时的持续时期。因此，可在分化和成熟期间添加视黄酸应答性受体的激活剂并因此使其存在于分化培养基中大于4小时且不大于72小时的持续时期。
持续暴露时期可以是约5至约10小时。持续暴露时期还可以是约5至约12小时。持续暴露时期还可以是约5至约18小时。持续暴露时期还可以是约5至约24小时。持续暴露时期还可以是约5至约48小时。因此，持续暴露时期可以是约5小时。持续暴露时期还可以是约12至约18小时。持续暴露时期还可以是约12至约24小时。持续暴露时期还可以是约12至约48小时。持续暴露时期还可以是约12至约72小时。因此，持续暴露时期可以是约12小时。持续暴露时期还可以是约18至约24小时。持续暴露时期还可以是约18至约48小时。持续暴露时期还可以是约18至约72小时。因此，持续暴露时期可以是约18小时。持续暴露时期还可以是约24至约48小时。持续暴露时期还可以是约24至约72小时。因此，持续暴露时期可以是约24小时。持续暴露时期还可以是约48至72小时。因此，持续暴露时期可以是约48小时或约72小时。
持续暴露时期还可以例如是约5、约10、约12、约18、约24、约48或约72小时。持续暴露时期可以是约5。还可以是约24。或者，持续暴露时期还可以是约48。
例如，如在实施例4(图2)中示出的，使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂(此处为9-顺式视黄酸)例如5、24和48小时，导致与未处理细胞相比，CYP1A、CYP2C9和3A活性增加。另外，在使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂5或24小时后，即刻观察到成体肝基因CYP3A4的mRNA表达的增加，和胎儿肝基因CYP3A7的强烈降低(参见实施例5，图3)。
肝细胞样细胞不仅可暴露于视黄酸应答性受体的激活剂一个大于4小时且不大于72小时的持续时期，还可暴露于所述视黄酸应答性受体的激活剂至少两个、例如至少三个、至少四个或至少五个大于4小时且不大于72小时的持续时期，例如5、24或48小时的持续时期。因此，肝细胞样细胞可例如暴露于视黄酸应答性受体的激活剂两个大于4小时且不大于72小时的持续时期。肝细胞样细胞还可暴露于视黄酸应答性受体的激活剂三个大于4小时且不大于72小时的持续时期。肝细胞样细胞还可暴露于视黄酸应答性受体的激活剂四个大于4小时且不大于72小时的持续时期。肝细胞样细胞还可暴露于视黄酸应答性受体的激活剂五个大于4小时且不大于72小时的持续时期。
如实施例4中所示，重复暴露于视黄酸应答性受体的激活剂比单次暴露对例如CYP1A和CYP2C9具有更强的逐渐增加的影响。
在该持续暴露时期后，可将分化培养基替换为不含视黄酸应答性受体的激活剂的分化培养基，并继续培养分化中的细胞。因此，在一个方案中，肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂至少两个上文限定的持续暴露时期，所述至少两个持续暴露时期被不暴露于所述视黄酸应答性受体的激活剂的时期隔开。这种不暴露时期可以持续数小时至数天，例如12至24小时，或者1至10天。不暴露时期可持续1至2天。不暴露时期还可持续1至5天。不暴露时期还可持续2至5天。不暴露时期可例如持续1天。不暴露时期还可持续2天。不暴露时期可例如持续5天。
根据本发明，一旦获得了肝细胞样细胞，可在任何时间点将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基，例如，培养7、9、11、13、15、20、25和/或30天后。
因此，可以例如在分化和成熟的第7天和第30天之间(如第7至第15天之间)将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。因此，可以在分化和成熟的第7天和第9天之间将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。
因此，还可在分化和成熟的第7天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。还可以在分化和成熟的第9天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。还可以在分化和成熟的第11天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。还可以在分化和成熟的第13天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。还可以在分化和成熟的第15天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。还可以在分化和成熟的第20天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。还可以在分化和成熟的第25天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。还可以在分化和成熟的第30天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。
还可以在分化和成熟的第7天和第9天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。还可以在分化和成熟的第7、9和11天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。还可以在分化和成熟的第1、6、9、11和16天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。还可以在分化和成熟的第7、9、11和16天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。还可以在分化和成熟的第7、9、11、13和16天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。还可以在分化和成熟的第1、7、9、11和16天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。还可以在分化和成熟的第1、3、7、9、11和16天将视黄酸应答性受体的激活剂添加到分化培养基用于大于4小时且不大于72小时的持续时期。
肝细胞样细胞通常暴露于浓度为约0.1至约5μM，例如约0.5至约1.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。
因此，可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约2.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约1.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约1μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约0.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约0.3μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.2至约5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.2至约2.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.2至约1.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约3μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约2.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约2μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约1.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约1μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约3μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约2.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约2μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约1.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约1.25μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约2.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约2μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约1.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。
因此，可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.2μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1.25μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1.75μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约2μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约2.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约3μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约3.5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约4μM的视黄酸应答性受体的激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约5μM的视黄酸应答性受体的激活剂。
在例如使用9-顺式视黄酸作为根据本发明的视黄酸应答性受体的激活剂的情况下，可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约2.5μM，例如约0.1至约0.5μM，例如约0.2μM的9-顺式视黄酸。
因此可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约2μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约1.5μM的9-顺式视黄酸。因此可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约1μM的9-顺式视黄酸。因此可肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约0.75μM的9-顺式视黄酸。因此可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约0.5μM的9-顺式视黄酸。因此可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约0.3μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.2至约2.5μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.2至约1.5μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约2.5μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约2μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约1.5μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约1μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约2.5μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约2μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约1.5μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约1.25μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约2.5μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约2μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约1.5μM的9-顺式视黄酸。
因此，还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.2μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5μM的9-顺式视黄酸。还可使分化中的肝祖细胞暴露于浓度为约0.75μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1.25μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1.5μM的9-顺式视黄酸。还可使分化中的肝祖细胞暴露于浓度为约1.75μM的9-顺式视黄酸。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约2μM的9-顺式视黄酸。
类似浓度可用于使用例如13-顺式视黄酸作为根据本发明的视黄酸应答性受体的激活剂的情况。
除了暴露于视黄酸应答性受体的激活剂，肝细胞样细胞还可任选地暴露于GSK-3抑制剂或Wnt信号传导激活剂和/或哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分的覆盖物(基质覆盖物)。因此，暴露于视黄酸应答性受体的激活剂与暴露于GSK-3抑制剂或与暴露于基质覆盖物或者这二者组合。暴露于视黄酸应答性受体的激活剂还可与暴露于Wnt信号传导激活剂或与暴露于基质覆盖物或者这二者组合。已经表明，使分化中的肝祖细胞额外暴露于GSK-3抑制剂或Wnt信号传导激活剂和/或基质覆盖物进一步改善了肝细胞样细胞的成熟和功能特征(图4)。
本发明方法中使用的GSK-3抑制剂可以是能够抑制GSK-3信号传导的任何化合物。用于本发明的合适的GSK-3抑制剂是9-溴-7，12-二氢-吲哚并[3，2-d][1]苯并氮杂-6(5H)-酮，也称为坎帕罗酮(Kenpaullone)或NSC664704；1-氮杂坎帕罗酮(9-溴-7，12-二氢-吡啶并[3′，2′：2，3]氮杂并[4，5-b]吲哚-6(5H)-酮)；阿司特帕罗酮(Alsterpaullone)(9-硝基-7，12-二氢吲哚并[3，2-d][1]苯并氮杂-6(5)-酮)；4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-N-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-3-甲酰胺，也称为AT-7519；N-(5-((5-叔丁基唑-2-基)甲硫基)噻唑-2-基)哌啶-4-甲酰胺，也称为SNS-032(BMS-387032)；4-(1-异丙基-2-甲基-1H-咪唑-5-基)-N-(4-(甲基磺酰基)苯基)嘧啶-2-胺，也称为AZD5438；(2′Z，3′￡)-6-溴靛玉红-3′-肟，也称为BIO(GSK3抑制剂IX)；(2′Z，3′E)-6-溴靛玉红-3′-丙酮肟，也称为BIO-丙酮肟(GSK3抑制剂X)；(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺(GSK3抑制剂XIII)；吡啶并咔唑-环戊二烯基钌配合物(GSK3抑制剂XV)；TDZD-84-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮(4-Benzyl-2-methyl-l，2，4-thiadiazolidine-3，5-dione)(GSK3β抑制剂I)；2-硫代(3-碘代苄基)-5-(1-吡啶基)-[1，3，4]-二唑(GSK3β抑制剂II)；OTDZT2，4-二苄基-5-氧代噻二唑烷-3-硫酮(2，4-Dibenzyl-5-oxothiadiazolidine-3-thione)(GSK3β抑制剂III)；α-4-二溴苯乙酮(GSK3β抑制剂VII)；N-(4-甲氧基苄基)-N′-(5-硝基-1，3-噻唑-2-基)脲，也称为AR-AO14418(GSK3β抑制剂VIII)；3-(1-(3-羟丙基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2，5-二酮(GSK-3β抑制剂XI)；TWSI19吡咯并嘧啶化合物(GSK3β抑制剂XII)；L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2或其十四酰化形式(GSK3β抑制剂XIII)；2-氯-1-(4，5-二溴-噻吩-2-基)-乙酮(GSK3β抑制剂VI)；氨基嘧啶CHIR99021；3-(2，4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮，也称为SB216763；和靛玉红-3′-单肟。GSK-3抑制剂可选自以上组。
另一些可使用在本发明方法中的合适的GSK-3抑制剂是3F8(5-乙基-7，8-二甲氧基-1H-吡咯并[3，4-c]-异喹啉-1，3-(2H)-二酮)，A1070722，无机离子如铍、铜、锂、汞、钨酸盐(钨)和锌，AR-A014418，AZD2858，AxinGID-25残基(肽)，双吲哚基马来酰亚胺，CHIR98014(CT98014)，CHIR98023(CT98023)，FRATide-39残基(肽)，卤代甲基酮衍生物如HMK-32，KT5720，L803-mts(肽)和变体，LY20900314，NP-12(Tideglusib，NP031112)，NP00111，NP031115，多氧化产生的双-7-氮杂吲哚基-马来酰亚胺，RO31-8220，SB415286(马来酰亚胺)，TC-G24，TCS2002，TCS21311，TDZD-8，TOS119和TWS119(二氟乙酸酯)。GSK-3抑制剂可选自以上组。
GSK-3抑制剂可以是例如选自以下的一种：坎帕罗酮(Kenpaullone)、1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮、氨基嘧啶CHIR99021和靛玉红-3′-单肟。
本发明方法中使用的GSK-3抑制剂可以是坎帕罗酮9-溴-7，12-二氢-吲哚并[3，2-d][1]苯并氮杂-6(5H)-酮。GSK-3抑制剂还可以是1-氮杂坎帕罗酮。GSK-3抑制剂还可以是阿司特帕罗酮。GSK-3抑制剂还可以是AT-7519。GSK-3抑制剂还可以是SNS-032(BMS-387032)。GSK-3抑制剂还可以是AZD5438。GSK-3抑制剂还可以是BIO(2′Z，3′￡)-6-溴靛玉红-3′-肟。GSK-3抑制剂还可以是BIO-丙酮肟(2′Z，3′E)-6-溴靛玉红-3′-丙酮肟。GSK-3抑制剂还可以是(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺。GSK-3抑制剂还可以是吡啶并咔唑-环戊二烯基钌配合物。GSK-3抑制剂还可以是TDZD-84-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮。GSK-3抑制剂还可以是2-硫代(3-碘代苄基)-5-(1-吡啶基)-[1，3，4]-二唑。GSK-3抑制剂还可以是OTDZT2，4-二苄基-5-氧代噻二唑烷-3-硫酮。GSK-3抑制剂还可以是α-4-二溴苯乙酮。GSK-3抑制剂还可以是AR-AO14418N-(4-甲氧基苄基)-N′-(5-硝基-1，3-噻唑-2-基)脲。GSK-3抑制剂还可以是3-(1-(3-羟丙基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2，5-二酮。GSK-3抑制剂还可以是TWSI19吡咯并嘧啶化合物。GSK-3抑制剂还可以是L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2或其十四酰化形式。GSK-3抑制剂还可以是2-氯-1-(4，5-二溴-噻吩-2-基)-乙酮。GSK-3抑制剂还可以是氨基嘧啶CHIR99021。GSK-3抑制剂还可以是SB2167633-(2，4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮。GSK-3抑制剂还可以是靛玉红-3′-单肟。
肝细胞样细胞不仅可暴露于一种GSK-3抑制剂，还可暴露于一种或更多种另外的GSK-3抑制剂，例如两种、三种或四种上述那些的组合。
肝细胞样细胞通常可暴露于浓度为约0.01至约10μM的GSK-3抑制剂。
因此可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约5μM的GSK-3抑制剂。因此可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约2.5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约2μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约1.5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约1μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约0.5μM的GSK-3抑制剂。可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约5μM的GSK-3抑制剂。因此还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约2.5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约2μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约1.5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约1μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约0.5μM的GSK-3抑制剂。
还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25至约5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25至约2.5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25至约1.5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25至约1μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25至约0.75μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25至约0.5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约2.5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约2μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约1.5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约1μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约2.5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约2.0μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约1.5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约1μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约4μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约3μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约2.5μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约2μM的GSK-3抑制剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约1.5μM的GSK-3抑制剂。
在例如使用坎帕罗酮作为GSK3抑制剂的情况下，可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约5μM的坎帕罗酮，例如约0.5至约1.5μM的坎帕罗酮。
可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约2μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约1.5μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约1μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约0.5μM的坎帕罗酮。可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约2μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约1.5μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约1μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约0.5μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25至约2.5μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25至约1.5μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25至约1μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25至约0.75μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25至约0.5μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约2.5μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约2μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约1.5μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约1μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约2.5μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约2.0μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约1.5μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75至约1μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约2.5μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约2μM的坎帕罗酮。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约1.5μM的坎帕罗酮。
类似浓度可用在使用例如1-氮杂坎帕罗酮或阿司特帕罗酮作为根据本发明的GSK-3抑制剂的情况下。
除了抑制GSK3外，根据本发明使用的GSK-3抑制剂还可以表现出对细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)(如CDK2)的抑制活性。这样的双重抑制剂的实例是坎帕罗酮、AT-7519、SNS-032(BMS-387032)和AZD5438。这样的双重抑制剂的另一些实例是1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮和靛玉红-3′-单肟。这样的双重抑制剂的另一些实例是2-溴-9-硝基帕罗酮、2-溴-9-三氟甲基帕罗酮、2-溴帕罗酮、2-碘-9-三氟甲基帕罗酮、2-碘帕罗酮、2-苯基-4-(2-噻吩基)-5H-吡啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮、2-[2-(1-羟基环己基)-乙炔基]-9-三氟甲基-帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-硝基帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-三氟甲基帕罗酮、2，3-二甲氧基帕罗酮、2-(3-羟基-1-丙炔基)-9-三氟甲基帕罗酮、2，9-二溴帕罗酮、3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)丙腈、4-甲氧基帕罗酮、4-(4-氯苯基)-2-(2-萘基)-5H-吡啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮、5-苄基-9-溴帕罗酮、5-碘-靛玉红-3-单肟、5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、6溴靛玉红、8，10-二氯帕罗酮、9-溴-2，3-二羟基帕罗酮、9-溴-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-溴-4-羟基帕罗酮、9-溴-4-甲氧基帕罗酮、9-溴-5-乙基帕罗酮、9-溴-5-(甲氧羰基甲基)帕罗酮、9-溴-5-甲基帕罗酮、9-溴-5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、9-溴-5，7-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，7，12-三-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，12-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-7，12-二氢-6-(羟基氨基)-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂9-溴-7，12-二氢-6-甲硫基-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂9-溴-7，12-二氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(5H)-硫酮、9-溴-12-(2-羟乙基)-帕罗酮、9-溴-12-(2-丙烯基)-帕罗酮、9-溴-12-乙基帕罗酮、9-溴-12-甲基帕罗酮、9-溴-12-甲氧基羰基-甲基帕罗酮、9-溴-12-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-氯帕罗酮、9-氰基帕罗酮、9-氰基-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-氟帕罗酮、9-甲氧基帕罗酮、9-甲基帕罗酮、9-氧代-噻唑并[5，4-f]喹唑啉-2-腈衍生物、9-三氟甲基帕罗酮、10-溴帕罗酮、11-溴帕罗酮、11-氯帕罗酮、11-乙基帕罗酮、11-甲基帕罗酮、Aloisines(＝6-苯基[5H]吡咯并[2，3-6]吡嗪)如AloisineA、AZD1080、双-吲哚靛玉红、Debromohymenialdisine，Dibromocantharelline、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯酸甲酯、(E)-2-(3-氧代-1-丁烯基)-9-三氟甲基帕罗酮、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯腈、靛玉红、Hymenidin、Hymenialdisine、Manzamines如ManzamineA、Meridiamins、帕罗酮、吡唑并[3，4-b]吡啶衍生物、吡唑并[3，4-b]喹喔啉衍生物和噻唑并[5，4-f]喹唑啉-9-酮衍生物。
作为GSK3抑制剂的替代物，可使肝细胞样细胞暴露于Wnt信号传导激活剂。本发明方法中使用的Wnt信号传导激活剂可以是激活Wnt信号传导的任何化合物。
用于本发明方法的合适的Wnt信号传导激活剂是Wnt蛋白，例如Wnt1、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3A、Wnt3、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、Wnt9A、Wnt9B、Wnt10A、Wnt10B、Wnt11和Wnt16，其可以是重组的或天然的。
因此，Wnt信号传导激活剂可选自上述Wnt蛋白的组。Wnt信号传导激活剂可以是例如Wnt3A。Wnt信号传导激活剂还可以是Wnt5A。
通常可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约10ng/ml的Wnt信号传导激活剂。
因此，可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约5ng/ml的Wnt信号传导激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约5ng/ml的Wnt信号传导激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约5ng/ml的Wnt信号传导激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约5ng/ml的Wnt信号传导激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约2至约5ng/ml的Wnt信号传导激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约2.5ng/ml的Wnt信号传导激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约2ng/ml的Wnt信号传导激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约2.5ng/ml的Wnt信号传导激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约2ng/ml的Wnt信号传导激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约1.5ng/ml的Wnt信号传导激活剂。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约2.5ng/ml的Wnt信号传导激活剂。
在例如使用Wnt3A作为Wnt信号传导激活剂的情况下，可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约10ng/ml，例如约0.5至约2.5μM的Wnt3A。
因此，可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05至约5ng/ml的Wnt3A。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约5ng/ml的Wnt3A。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约5ng/ml的Wnt3A。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约5ng/ml的Wnt3A。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约2至约5ng/ml的Wnt3A。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约2.5ng/ml的Wnt3A。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1至约2ng/ml的Wnt3A。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约2.5ng/ml的Wnt3A。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约2ng/ml的Wnt3A。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5至约1.5ng/ml的Wnt3A。还可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1至约2.5ng/ml的Wnt3A。
肝细胞样细胞不仅可暴露于一种Wnt信号传导激活剂，还可暴露于一种或更多种另外的Wnt信号传导激活剂，例如两种、三种或四种上述那些的组合。
除了暴露于视黄酸应答性受体的激活剂之外，还可任选地使肝细胞样细胞暴露于CDK抑制剂和/或哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分的覆盖物(基质覆盖物)。因此，暴露于视黄酸应答性受体的激活剂与暴露于CDK抑制剂或与暴露于基质覆盖物或其二者组合。已经表明，使分化中的肝祖细胞额外暴露于CDK抑制剂和/或基质覆盖物进一步改善了肝细胞样细胞的成熟和功能特征(图4)。
本发明方法中使用的CDK抑制剂可以是能够抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)之功能(例如，活性)的任何化合物。本发明方法中使用的CDK抑制剂可以是例如CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7和CDK9中的一种或更多种的抑制剂。本发明方法中使用的CDK抑制剂可以是细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的抑制剂。本发明方法中使用的CDK抑制剂可以是例如CDK1和CDK2的抑制剂。本发明方法中使用的CDK抑制剂可以是例如CDK2和CDK5的抑制剂。本发明方法中使用的CDK抑制剂可以是例如CDK1、CDK2和CDK5的抑制剂。
用于本发明的适当的CDK抑制剂如下：9-溴-7，12-二氢-吲哚并[3，2-d]-[1]苯并氮杂-6(5H)-酮，又称为坎帕罗酮或NSC664704；(R)-2-(6-(苄基氨基)-9-异丙基-9H-嘌呤-2-基氨基)丁-1-醇，又称为Roscovitine；2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-((3S，4R)-3-羟基-1-甲基哌啶-4-基)-4H-色满-4-酮，又称为Flavopiridol；4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-N-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-3-甲酰胺，又称为AT-7519；6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮盐酸盐，又称为PD0332991HCl；N-(5-((5-叔丁基唑-2-基)甲硫基)噻唑-2-基)哌啶-4-甲酰胺，又称为SNS-032(BMS-387032)；JNJ-7706621；N(6，6-二甲基-5-(1-甲基哌啶-4-羰基)-1，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基)-3-甲基丁酰胺，又称为PHA-793887；Dinaciclib(SCH727965)；(4-丁氧基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-基)(2，6-二氟-4-甲基苯基)甲酮，又称为BMS-265246；N，1，4，4-四甲基-8-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基氨基)-4，5-二氢-1H-吡唑并[4，3-h]喹唑啉-3-甲酰胺，又称为PHA-848125；2-(吡啶-4-基)-6，7-二氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-4(5H)-酮，又称为PHA-767491；SCH900776；2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-((3S，4R)-3-羟基-1-甲基哌啶-4-基)-4H-色满-4-酮盐酸盐，又称为FlavopiridolHCl；(4-氨基-2-(1-(甲基磺酰基)哌啶-4-基氨基)嘧啶-5-基)(2，3-二氟-6-甲氧基苯基)甲酮，又称为R547；(2S)-1-(5-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)吡啶-3-基氧基)-3-苯基丙-2-胺，又称为A-674563；4-(1-异丙基-2-甲基-1H-咪唑-5-基)-N-(4-(甲基磺酰基)苯基)嘧啶-2-胺，又称为AZD5438；N5-(6-氨基己基)-N7-苄基-3-异丙基吡唑并[1，5-a]嘧啶-5，7-二胺盐酸盐，又称为BS-181HCl；CY-202；AG-024322；P276-00；ZK304709；GPC-286199；以及BAY80-3000。CDK抑制剂可选自以上的组。
可用于本发明方法的另一些适当的CDK抑制剂为：2-hydroxybohemine、A674563、Aminopurvanolol、BAY1000394、BMS-265246、BS-181丁内酯I、CR8S-异构体、Diaciclib(SCH727965)、JNJ-7706621、N9-异丙基奥罗莫星、NU6140、NU6102、奥罗莫星II、羟吲哚I、P276-00、PD332991、PHA-793887、PHA-767491、PHA-848125、PNU112455A、PurvanololA和B、R547、(R)-DRF053和SCH900776(MK-8776)。CDK抑制剂可选自以上的组。
用于本发明方法的CDK抑制剂可以为例如坎帕罗酮。已知坎帕罗酮为CDK2的抑制剂。CDK抑制剂也可为Roscovitine。CDK抑制剂也可为Flavopiridol。CDK抑制剂也可为AT-7519。CDK抑制剂也可为PD0332991HCl。CDK抑制剂也可为SNS-032(BMS-387032)。CDK抑制剂也可为JNJ-7706621。CDK抑制剂也可为PHA-793887。CDK抑制剂也可为Dinaciclib(SCH727965)。CDK抑制剂也可为BMS-265246。CDK抑制剂也可为PHA-848125。CDK抑制剂也可为PHA-767491。CDK抑制剂也可为SCH900776。CDK抑制剂也可为FlavopiridolHCl。CDK抑制剂也可为R547。CDK抑制剂也可为A-674563。CDK抑制剂也可为AZD5438。CDK抑制剂也可为BS-181HCl。CDK抑制剂也可为CY-202。CDK抑制剂也可为AG-024322。CDK抑制剂也可为P276-00。CDK抑制剂也可为ZK304709。CDK抑制剂也可为GPC-286199。CDK抑制剂也可为BAY80-3000。
CDK抑制剂可选自：坎帕罗酮、SNS-032(BMS-387032)、AT-7519和AZD5438。
CDK抑制剂可选自：坎帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、靛玉红-3′-单肟、阿司特帕罗酮、SNS-032(BMS-387032)、AT-7519和AZD5438。
肝细胞样细胞不但可暴露于一种CDK抑制剂，而且也可暴露于一种或更多种另外的CDK抑制剂，例如暴露于两种、三种或四种以上所提及那些的组合。
通常，可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.01μM至约10μM的CDK抑制剂。
因此，可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05μM至约5μM的CDK抑制剂。因此可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05μM至约2.5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05μM至约2μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05μM至约1.5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05μM至约1μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05μM至约0.5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1μM至约5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1μM至约2.5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1μM至约2μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1μM至约1.5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1μM至约1μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1μM至约0.5μM的CDK抑制剂。
也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25μM至约5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25μM至约2.5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25μM至约1.5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25μM至约1μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25μM至约0.75μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25μM至约0.5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5μM至约5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5μM至约2.5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5μM至约2μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5μM至约1.5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5μM至约1μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75μM至约5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75μM至约2.5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75μM至约2.0μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75μM至约1.5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75μM至约1μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1μM至约5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1μM至约4μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1μM至约3μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1μM至约2.5μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1μM至约2μM的CDK抑制剂。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1μM至约1.5μM的CDK抑制剂。
在例如将如坎帕罗酮用作CDK抑制剂的情况下，也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05μM至约5μM(例如约0.5μM至约1.5μM)的坎帕罗酮。
也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05μM至约2μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05μM至约1.5μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05μM至约1μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.05μM至约0.5μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1μM至约2μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1μM至约1.5μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1μM至约1μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.1μM至约0.5μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25μM至约2.5μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25μM至约1.5μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25μM至约1μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25μM至约0.75μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.25μM至约0.5μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5μM至约2.5μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5μM至约2μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5μM至约1.5μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.5μM至约1μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75μM至约2.5μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75μM至约2.0μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75μM至约1.5μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约0.75μM至约1μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1μM至约2.5μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1μM至约2μM的坎帕罗酮。也可使肝细胞样细胞暴露于浓度为约1μM至约1.5μM的坎帕罗酮。
除了抑制CDK之外，根据本发明使用的CDK抑制剂还可表现出针对糖原合酶激酶3(GSK-3)特别是GSK-3β的抑制活性。这样的双重抑制剂的实例为抑制CDK2和GSK3两者的坎帕罗酮、SNS-032(BMS-387032)、AT-7519和AZD5438。这样的双重抑制剂的另一些实例为1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮和靛玉红-3′-单肟。这样的双重抑制剂的另一些实例为1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮和靛玉红-3′-单肟。这样的双重抑制剂的又一些实例为2-溴-9-硝基帕罗酮、2-溴-9-三氟甲基帕罗酮、2-溴帕罗酮、2-碘-9-三氟甲基帕罗酮、2-碘帕罗酮、2-苯基-4-(2-噻吩基)-5H-比啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮、2-[2-(1-羟基环己基)-乙炔基]-9-三氟甲基-帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-硝基帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-三氟甲基帕罗酮、2，3-二甲氧基帕罗酮、2-(3-羟基-1-丙炔基)-9-三氟甲基帕罗酮、2，9-二溴-帕罗酮、3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙腈、4-甲氧基帕罗酮、4-(4-氯苯基)-2-(2-萘基)-5H-比啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮，5-苄基-9-溴帕罗酮、5-碘-靛玉红.3-单肟、5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、6溴靛玉红、8，10-二氯帕罗酮、9-溴-2，3-二羟基帕罗酮、9-溴-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-溴-4-羟基帕罗酮、9-溴-4-甲氧基帕罗酮、9-溴-5-乙基帕罗酮、9-溴-5-(甲氧羰基甲基)帕罗酮、9-溴-5-甲基帕罗酮，9-溴-5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、9-溴-5，7-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，7，12-三-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，12-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-7，12-二氢-6-(羟氨基)-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂9-溴-7，12-二氢-6-甲硫基-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂9-溴-7，12-二氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(5H)-硫酮、9-溴-12-(2-羟乙基)-帕罗酮、9-溴-12-(2-丙烯基)-帕罗酮、9-溴-12-乙基帕罗酮、9-溴-12-甲基帕罗酮、9-溴-12-甲氧基羰基-甲基帕罗酮、9-溴-12-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-氯帕罗酮、9-氰基帕罗酮、9-氰基-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-氟帕罗酮、9-甲氧基帕罗酮、9-甲基帕罗酮、9-氧代-噻唑并[5，4-f]喹唑啉-2-腈衍生物、9-三氟甲基帕罗酮、10-溴帕罗酮、11-溴帕罗酮、11-氯帕罗酮、11-乙基帕罗酮、11-甲基帕罗酮、Aloisines(＝6-苯基[5H]吡咯并[2，3-6]吡嗪)(例如AloisineA)、AZD1080、双-吲哚靛玉红、Debromohymenialdisine、Dibromocantharelline、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯酸甲酯、(E)-2-(3-氧代-1-丁烯基)-9-三氟甲基帕罗酮、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯腈、靛玉红、Hymenidin、Hymenialdisine、Manzamines(例如ManzamineA)、Meridiamins、帕罗酮、吡唑并[3，4-b]吡啶衍生物、吡唑并[3，4-b]喹喔啉衍生物和噻唑并[5，4-f]喹唑啉-9-酮衍生物。
本发明还预期使暴露于GSK3抑制剂或Wnt信号传导激活剂的肝细胞样细胞进一步暴露于CDK抑制剂。如果使用的GSK抑制剂未表现出针对细胞周期依赖性激酶(CDK)的抑制活性，则这是特别令人感兴趣的。
同样地，本发明预期使暴露于CDK抑制剂的肝细胞样细胞进一步暴露于GSK3抑制剂或Wnt信号传导激活剂。如果使用的CDK抑制剂未表现出针对糖原合酶激酶3(GSK-3)的抑制活性，则这是特别令人感兴趣的。
因此，本发明还提供了一种用于促进人肝细胞样细胞成熟的方法，由此使所述肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂(例如视黄酸)，任选地与暴露于GSK3信号传导抑制剂或Wnt信号传导激活剂以及CDK抑制剂相组合，进一步任选地与用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。
因此，可根据所包括的以下步骤来描述用于促进人肝细胞样细胞成熟的方法：
使所述人肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂，任选地与暴露于CDK抑制剂以及GSK3抑制剂或Wnt信号传导激活剂相组合，进一步任选地与暴露于用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。
此外，本发明还提供了一种用于产生人肝细胞样细胞的方法，由此在分化条件下培养人肝祖细胞以获得肝细胞样细胞，并且将所获得的肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂(例如视黄酸)，任选地与暴露于GSK3信号传导抑制剂或Wnt信号传导激活剂以及CDK抑制剂相组合，进一步任选地与用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。
因此，可根据所包括的以下步骤来描述用于产生人肝细胞样细胞的方法：
在分化条件下培养人肝祖细胞以获得肝细胞样细胞，并且
使所述肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂，任选地与暴露于CDK抑制剂以及GSK3抑制剂或Wnt信号传导激活剂相组合，进一步任选地与暴露于用哺乳动物细胞外基质的一种或更多种特征性组分(基质覆盖物)覆盖所述细胞相组合。
作为实例，如果使肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂以及GSK3抑制剂和CDK抑制剂，则GSK3抑制剂可以为CHIR99021并且CDK抑制剂可以为Roscovitine或Flavopiridol。然而，应理解任何其他的GSK3抑制剂或CDK抑制剂(尤其是本文所特别提及的那些)可作为替代来使用。
数十年以来一直使用由胶原蛋白I或人工基底膜(Matrigel)组成的基质覆盖物(从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的基底膜混合物)来培养原代肝细胞(例如Dunn等1991；Page等2007)，原因是发现原代肝细胞在所谓的夹心式结构中维持更好的功能性并存活更久，所述夹层结构具有处于细胞下方的一个细胞外基质(ECM)层以及处于细胞顶部的一个ECM层。通常胶原蛋白I或人工基底膜覆盖物较厚，其包含例如125μg人工基底膜/cm2或50μg胶原蛋白I/cm2。然而，这并不能反映肝ECM的生理组成或厚度(例如，Turner等2011；Wang等2011的比较)。
本发明方法所用基质覆盖物为存在于成体肝ECM中组分的新的更具生理作用的组合并且包含一种或更多种ECM组分(其形成正常哺乳动物细胞外基质环境的一部分)或由其构成。用作本发明基质覆盖物的适当的ECM组分为胶原蛋白(例如胶原蛋白I、II、III、IV、V或VI)、纤连蛋白、弹性蛋白、硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖、肝素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖、黏结蛋白聚糖或串珠蛋白聚糖)、葡糖氨基葡聚糖、巢蛋白/触觉蛋白、层粘连蛋白(laminin)、双糖链蛋白聚糖、生腱蛋白(tenascin)、乙酰透明质酸或其他ECM组分，或者包含例如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、生腱蛋白、蛋白聚糖和葡糖氨基葡聚糖或由这些组成的ECM组分混合物。
因此，肝细胞样细胞可暴露于包含一种或更多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或达二十种)上述ECM组分或由其构成的基质覆盖物。因此，肝细胞样细胞可暴露于包含两种上述ECM组分或由其构成的基质覆盖物。肝细胞样细胞也可暴露于包含三种上述ECM组分或由其构成的基质覆盖物。肝细胞样细胞也可暴露于包含四种上述ECM组分或由其构成的基质覆盖物。肝细胞样细胞也可暴露于包含五种上述ECM组分或由其构成的基质覆盖物。肝细胞样细胞也可暴露于包含六种上述ECM组分或由其构成的基质覆盖物。肝细胞样细胞也可暴露于包含七种上述ECM组分或由其构成的基质覆盖物。肝细胞样细胞也可暴露于包含八种上述ECM组分或由其构成的基质覆盖物。肝细胞样细胞也可暴露于包含九种上述ECM组分或由其构成的基质覆盖物。肝细胞样细胞也可暴露于包含十种上述ECM组分或由其构成的基质覆盖物。
例如，肝细胞样细胞可暴露于包含胶原蛋白和纤连蛋白或由其构成的基质覆盖物(胶原蛋白-纤连蛋白基质覆盖物)，如包含胶原蛋白I和纤连蛋白或由其构成的基质覆盖物(胶原蛋白I-纤连蛋白基质覆盖物)。肝细胞样细胞也可暴露于包含胶原蛋白(例如胶原蛋白I)和层粘连蛋白或由其构成的基质覆盖物(胶原蛋白-层粘连蛋白基质覆盖物)。肝细胞样细胞也可暴露于包含胶原蛋白(例如胶原蛋白I)、巢蛋白和层粘连蛋白或由其构成的基质覆盖物(胶原蛋白-巢蛋白-层粘连蛋白基质覆盖物)。肝细胞样细胞也可暴露于包含胶原蛋白(例如胶原蛋白I)、纤连蛋白和层粘连蛋白或由其构成的基质覆盖物(胶原蛋白-纤连蛋白-层粘连蛋白基质覆盖物)。肝细胞样细胞也可暴露于包含纤连蛋白和层粘连蛋白或由其构成的基质覆盖物(纤连蛋白-层粘连蛋白基质覆盖物)。肝细胞样细胞也可暴露于包含纤连蛋白、巢蛋白和层粘连蛋白或由其构成的基质覆盖物(纤连蛋白-巢蛋白-层粘连蛋白基质覆盖物)。
肝细胞样细胞也可暴露于包含纤连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、胶原蛋白VI、巢蛋白、双糖链蛋白聚糖和层粘连蛋白或由其构成的基质覆盖物(纤连蛋白-胶原蛋白I、胶原蛋白IV、胶原蛋白VI-巢蛋白-双糖链蛋白聚糖-层粘连蛋白基质覆盖物)。
肝细胞样细胞也可暴露于包含纤连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、巢蛋白、双糖链蛋白聚糖和层粘连蛋白或由其构成的基质覆盖物(纤连蛋白-胶原蛋白I、胶原蛋白IV-巢蛋白-双糖链蛋白聚糖-层粘连蛋白基质覆盖物)。
肝细胞样细胞也可暴露于包含胶原蛋白(如胶原蛋白I)、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和葡糖氨基葡聚糖的基质覆盖物(胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和葡糖氨基葡聚糖基质覆盖物)。肝细胞样细胞也可暴露于包含胶原蛋白(例如胶原蛋白I)、层粘连蛋白、纤连蛋白和蛋白聚糖的基质覆盖物(胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和蛋白聚糖基质覆盖物)。
肝细胞样细胞也可暴露于包含胶原蛋白(例如胶原蛋白I)、层粘连蛋白、纤连蛋白、生腱蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和葡糖氨基葡聚糖的基质覆盖物(胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、生腱蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和葡糖氨基葡聚糖基质覆盖物)。
本发明方法所用基质覆盖物与目前所用的厚基质相比更薄。基质覆盖物的厚度由此与使用的ECM组分浓度相关联。适用于本基质覆盖物的浓度为例如0.01μg至30μg(如0.01μg至20μg)ECM组分/cm2。
因此，可使各ECM组分以约0.1μg至约20μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约0.1μg至约15μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约0.1μg至约12.5μg蛋白质组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约0.1μg至约10μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约0.1μg至约5μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约0.1μg至约2.5μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约0.2μg至约20μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约0.2μg至约15μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约0.2μg至约12.5μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约0.2μg至约10μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约0.2μg至约5μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约0.5μg至约25μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约0.5μg至约20μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各蛋白质组分以约0.5μg至约15μg的蛋白质组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各蛋白质组分以约0.5μg至约10μg的蛋白质组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各蛋白质组分以约0.5μg至约7.5μg的蛋白质组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各蛋白质组分以约0.5μg至约5μg的蛋白质组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各蛋白质组分以约0.5μg至约2.5μg的蛋白质组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各蛋白质组分以约0.5μg至约1.5μg的蛋白质组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各蛋白质组分以约0.5μg至约1μg的蛋白质组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约1μg至约20μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约1μg至约15μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约1μg至约12.5μg的蛋白质组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约1μg至约10μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约1μg至约5μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约1μg至约2.5μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约2μg至约20μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约2μg至约15μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约2μg至约12.5μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约2μg至约10μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约2μg至约5μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约5μg至约25μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各ECM组分以约5μg至约20μgECM组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各蛋白质组分以约5μg至约15μg的蛋白质组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各蛋白质组分以约5μg至约10μg的蛋白质组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。也可使各蛋白质组分以约5μg至约7.5μg的蛋白质组分/cm2的浓度存在于基质覆盖物中。
可使胶原蛋白I例如以约2μg/cm2至约20μg/cm2(例如约5μg/cm2至约15μg/cm2)的浓度存在于基质覆盖物中。
可使胶原蛋白IV例如以约0.01μg/cm2至约10μg/cm2(例如约0.05/cm2μg至约10μg/cm2)的浓度存在于基质覆盖物中。
可使胶原蛋白VI例如以约0.01μg/cm2至约15μg/cm2(例如约0.01μg/cm2至约10μg/cm2或约0.1μg/cm2至约15μg/cm2)的浓度存在于基质覆盖物中。
可使纤连蛋白例如以约2μg/cm2至约30μg/cm2(例如约2μg/cm2至约20μg/cm2)的浓度存在于基质覆盖物中。
可使巢蛋白例如以约0.01μg/cm2至约10μg/cm2(例如约0.05μg/cm2至约10μg/cm2)的浓度存在于基质覆盖物中。
可使层粘连蛋白例如以约0.01μg/cm2至约10μg/cm2(例如约0.05μg/cm2至约10μg/cm2)的浓度存在于基质覆盖物中。
可使双糖链蛋白聚糖例如以约0.01μg/cm2至约10μg/cm2(例如约0.1μg/cm2至约10μg/cm2)的浓度存在于基质覆盖物中。
应理解，如上以“μg/cm2”计的浓度是对于其干状态下的各组分。
通常，细胞可在作为生长支持物的覆盖培养容器表面的覆层上培养。基于明胶或纤连蛋白的覆层被广泛用作生长支持物。因此，可在基于明胶或纤连蛋白的覆层上培养所述细胞(特别是肝祖细胞和肝细胞样细胞)。然而，也可在具有与如上限定的基质覆盖物类似或相同组成的覆层上培养所述细胞。例如，当采用基质覆盖物时，可在与所采用的基质覆盖物具有相同组成的覆层上培养细胞。因此，提供所谓的“夹心(sandwich)”式培养环境。
作为任选的预步骤，用于本发明方法的肝祖细胞可最初衍生自人多能干(hPS)细胞，例如人胚胎干(hES)细胞或人诱导多能干细胞(hiPS)。因此，本发明方法可进一步包括如在分化条件下培养hPS细胞以获得所述肝祖细胞的初始步骤。因此，hPS细胞可最初分化为所述肝祖细胞。在本文中，该步骤称为初始肝分化。
如以上所指出的，也可用作起始材料以获得内胚层和/或肝祖细胞的人多能干细胞可为人胚胎干细胞。用于获得该hES细胞的各种技术是本领域技术人员已知的。然而，优选地，用于根据本发明用途的hES细胞为在不破坏人胚胎的情况下得到(或获得)的hES细胞，例如通过采用单卵裂球移除技术(singleblastomereremovaltechnique)(例如在Chung等(2008)中所述的，Mercader等在EssentialStemCellMethods(第一版，2009)中进一步有所描述)。所使用的适当的hES细胞系为例如NIH干细胞登记处、英国干细胞库和欧洲hESC登记处列出的细胞系SA167、SA181、SA461(CellartisAB，Sweden)并且可根据需要得到。用于使用的另一些适当的细胞系为Klimanskaya等(2006)(例如细胞系MA01和MA09)以及Chung等(2008)(例如细胞系MA126、MA127、MA128和MA129)建立的那些，其均由国际干细胞登记处(转让给AdvancedCellTechnology，Inc.Worcester，MA，USA)列出。
或者，可用作起始材料以获得内胚层和/或肝祖细胞的人多能干细胞可为人诱导多能干细胞。用于获得该hipS细胞的各种技术已在科学文献中有所描述，并且因此是本领域技术人员已知的[参见例如Takahashi等(2007)；Zhou等(2009)；Yu和Thomson在EssentialsofStemCellBiology(第二版)中]。
也可以设想，内胚层和/或肝祖细胞也可衍生自其他多能干细胞(例如成体干细胞、癌干细胞或其他胚胎、胎、幼年或成体来源)。
使hPS细胞分化为肝祖细胞的适当条件是已知的(参见例如Hay2008，Brolen2010和Duan2010)。例如WO2009/013254A1描述了用于获得肝祖细胞的适当方案(实施方案1至4)。
通常在适当的分化培养基中将hPS细胞培养至多14天以获得肝祖细胞。例如，可在适当的分化培养基中将hPS细胞培养约10天至约14天，例如约11天至14天。
初始肝分化可通过包括如下的步骤来定义：前内胚层化步骤，即在分化条件下培养hPS细胞以获得定形内胚层细胞(DE细胞)；接着为前肝化步骤，即在分化条件下培养所获得的DE细胞以获得肝祖细胞。因此，hPS细胞先分化为定形内胚层，然后定形内胚层进一步分化为肝祖细胞。
通常，为了获得内胚层细胞，在包含激活素(例如激活素A或激活素B)的分化培养基中培养hPS细胞。分化培养基可进一步包含组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，例如丁酸钠(NaB)、苯丁酸盐/酯(PB)、丙戊酸盐/酯、曲古抑菌素A、恩替司他(Entinostat)或帕比司他(Panobinstat)。分化培养基可进一步包含一种或更多种生长因子，例如FGF1、FGF2和FGF4和/或血清，例如FBS或FCS。分化培养基可包含GSK3抑制剂(例如CHIR99021)或Wnt信号传导激活剂(例如Wnt3A)。分化培养基还可包含PI3K(磷酸肌醇3-激酶)抑制剂，例如LY294002。
激活素的浓度通常为约50ng/ml至约150ng/ml，例如约80ng/ml至约120ng/ml。可使激活素例如以约50ng/ml或约100ng/ml的浓度存在于分化培养基中。HDAC抑制剂的浓度通常为约0.5mM至约2mM。可使HDAC抑制剂例如以约0.5mM或约1mM的浓度存在于分化培养基中。一种或更多种生长因子的浓度可以根据所用具体化合物来变化。FGF2的浓度例如通常为约2ng/ml至约50ng/ml，例如约2ng/ml至约10ng/ml。可使FGF2例如以约4ng/ml或约5ng/ml的浓度存在于分化培养基中。FGF1的浓度例如通常为约50ng/ml至约200ng/ml，例如约80ng/ml至约120ng/ml。可使FGF1例如以约100ng/ml的浓度存在于分化培养基中。FGF4的浓度例如通常为约20ng/ml至约40ng/ml。可使FGF4例如以约30ng/ml的浓度存在于分化培养基中。如果存在血清，则其浓度通常为约0.1％v/v至约2％v/v，例如约0.1％v/v至约0.5％v/v、约0.2％v/v至约1.5％v/v、约0.2％v/v至约1％v/v、约0.5％v/v至1％v/v或约0.5％v/v至约1.5％v/v。可使血清例如以约0.2％v/v、约0.5％v/v或约1％v/v的浓度存在于分化培养基中。如果存在GSK3抑制剂，则其浓度通常为约0.1μM至约10μM，例如约0.05μM至约5μM。如果存在Wnt信号传导激活剂，则其浓度通常为约0.05ng/ml至约10ng/ml，例如约0.5ng/ml至约5μM。P13K抑制剂的浓度例如通常为约0.1μM至10μM，例如约1μM至5μM。
分化培养基还可包含另一些补充剂，例如PEST和/或GlutaMAX。分化培养基也可包含ROCK抑制剂。PEST的浓度通常为约0.1％v/v至约0.5％v/v，例如约0.1％v/v至约0.25％v/v。GlutaMAX的浓度通常为约0.5％v/v至约1.5％v/v，例如约0.75％v/v至约1.25％v/v(例如约1％v/v)。分化培养基还可包含ROCK抑制剂。ROCK抑制剂的浓度通常为约1μM至约10μM，例如约2.5μM至约7.5μM(例如约5μM)。
形成分化培养基之基础的培养基可以为适于培养hPS细胞的任何培养基，例如RPMI1640或高级培养基——Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、HCM培养基、HBM培养基或基于WilliamsE的培养基。因此，分化培养基可以为包含或补充有上述组分的RPMI1640或高级培养基。或者，分化培养基可以为包含或补充有上述组分的DMEM。分化培养基因此也可为包含或补充有上述组分的HCM培养基。分化培养基因此也可为包含或补充有上述组分的HBM培养基。分化培养基因此也可为包含或补充有上述组分的基于WilliamsE的培养基。
对内胚层分化而言，通常在含激活素的上述分化培养基中将hPS细胞培养至多10天。例如可在所述分化培养基中将hPS细胞培养约4天至约10天，例如约7天至约9天。
然后，在含DMSO的分化培养基中进一步培养所得DE细胞以获得肝祖细胞。或者，可在包含一种或更多种生长因子(例如FGF1、FGF2和FGF4)以及一种或更多种骨形态发生蛋白(例如BMP2和BMP4)的分化培养基中培养所得DE细胞。分化培养基还可包含HGF、EGF和/或血清。
DMSO的浓度通常为约0.1％至约2％v/v，例如约0.5％至约1.5％v/v。可使DMSO例如以约1％的浓度存在于分化培养基中。一种或更多种生长因子的浓度可根据所用具体化合物来变化。FGF2的浓度通常例如为约2ng/ml至约50ng/ml，例如约2ng/ml至约10ng/ml。可使FGF2例如以4ng/ml或5ng/ml的浓度存在于分化培养基中。FGF1的浓度通常例如为约50ng/ml至约200ng/ml，例如约80ng/ml至约120ng/ml。FGF1可例如以约100ng/ml的浓度存在于分化培养基中。FGF4的浓度通常例如为约20ng/ml至约40ng/ml。可使FGF4例如以30ng/ml的浓度存在于分化培养基中。如果存在HGF，则其浓度通常在约10ng/ml至约30ng/ml的范围内。可使HGF例如以约20ng/ml的浓度存在于分化培养基中。如果存在EGF，则其浓度通常在约5ng/ml至约15ng/ml的范围内。可使EGF例如以约10ng/ml的浓度存在于分化培养基中。如果存在血清，则其浓度通常为约0.1％v/v至约2％v/v，例如约0.1％v/v至约0.5％v/v、约0.2％v/v至约1.5％v/v、约0.2％v/v至约1％v/v、约0.5％v/v至约1％v/v或约0.5％v/v至约1.5％v/v。可使血清例如以约0.2％v/v、约0.5％v/v或约1％v/v的浓度存在于分化培养基中。
分化培养基还可包含另一些补充剂，例如PEST和/或GlutaMAX。PEST的浓度通常在约0.1％v/v至约0.5％v/v，例如约0.1％v/v至约0.25％v/v。GlutaMAX的浓度通常为约0.5％v/v至约1.5％v/v，例如约0.75％v/v至约1.25％v/v(例如约1％v/v)。
形成分化培养基之基础的培养基可以为适于培养人内胚层细胞的任何培养基，例如RPMI1640或高级培养基——Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、HCM培养基、HBM培养基或基于WilliamsE的培养基。因此，分化培养基可以为包含或补充有上述组分的RPMI1640或高级培养基。或者，分化培养基可以为包含或补充有上述组分的DMEM。分化培养基因此也可为包含或补充有上述组分的HCM培养基。分化培养基因此也可为包含或补充有上述组分的HBM培养基。分化培养基因此也可为包含或补充有上述组分的基于WilliamsE的培养基。
对于分化为肝祖细胞而言，通常在如上所述分化培养基中将DE细胞培养至多7天。例如可在分化培养基中将DE细胞培养约4天至约7天。
本文实施例2中提供了用于获得DE细胞、肝祖细胞和肝细胞样细胞的基本非限制性培养条件。
也可使分化中的hPS细胞暴露于DNA去甲基化试剂。细胞可以于多能干细胞阶段与定形内胚层阶段之间的任意阶段暴露于试剂(或经所述试剂处理)。因此，所述暴露于DNA去甲基化试剂的步骤可发生于hPS细胞向DE细胞分化期间，即前内胚层化步骤期间。然后在整个内胚层阶段培养细胞，直至到达肝祖细胞阶段，即直至获得肝祖细胞，此时进行进一步分化并成熟为肝细胞样细胞，其包括只进行暴露于视黄酸应答性受体的激活剂，或者与GSK-3抑制或Wnt信号传导激活和/或CDK抑制剂和/或基质覆盖物相组合。
根据本发明方法采用的DNA去甲基化试剂可以为干扰DNA甲基转移酶活性的任何化合物。适当的DNA去甲基化试剂为核苷类似物类的DNA去甲基化试剂，例如胞苷类似物，如5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)或泽布拉林(Zebularine)；以及非核苷类，例如普鲁卡因、RG108、S-5-腺苷-L-高半胱氨酸、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯(Epogallocatechingallate)、盐酸肼苯哒嗪(Hydralazinehydrochloride)、盐酸普鲁卡因酰胺(Procainamidehydrochloride)或PsammaplinA。
因此，本发明方法采用的DNA去甲基化试剂可为核苷类似物类的DNA去甲基化试剂。或者，本发明方法采用的DNA去甲基化试剂可为非核苷类的DNA去甲基化试剂。
因此，本发明方法采用的DNA去甲基化试剂可为胞苷类似物，例如5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)、泽布拉林、伪异胞苷(Pseudoisocytidine)、5-氟-2-脱氧胞苷、5，6-二氢-5-氮杂胞苷、2′-脱氧-5，6-二氢-5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷和2′，2′-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)或胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(Cytosine-beta-D-arabinofurasonide)。
本发明方法采用的DNA去甲基化试剂可因此为选自以下的胞苷类似物：5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)、5-氟-2-脱氧胞苷、5，6-二氢-5-氮杂胞苷、2′-脱氧-5，6-二氢-5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷和2′，2′-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)。
本发明方法采用的DNA去甲基化试剂可因此为选自5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)和5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)的胞苷类似物。或者，本发明方法采用的DNA去甲基化试剂可为不是5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)或5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)的胞苷类似物。
或者，本发明方法采用的DNA去甲基化试剂可为5-氮杂-2-脱氧胞苷。DNA去甲基化试剂也可为5-氮杂胞苷。DNA去甲基化试剂也可为泽布拉林。DNA去甲基化试剂也可为伪异胞苷。DNA去甲基化试剂也可为5-氟-2-脱氧胞苷。DNA去甲基化试剂也可为5，6-二氢-5-氮杂胞苷。DNA去甲基化试剂也可为2′-脱氧-5，6-二氢-5-氮杂胞苷。DNA去甲基化试剂也可为6-氮杂胞苷。DNA去甲基化试剂也可为2′，2′-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)。DNA去甲基化试剂也可为胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷。DNA去甲基化试剂也可为普鲁卡因。DNA去甲基化试剂也可为RG108。DNA去甲基化试剂也可为S-5-腺苷-L-高半胱氨酸。DNA去甲基化试剂也可为咖啡酸。DNA去甲基化试剂也可为绿原酸。DNA去甲基化试剂也可为表没食子儿茶素没食子酸酯。DNA去甲基化试剂也可为盐酸肼苯哒嗪。DNA去甲基化试剂也可为盐酸普鲁卡因酰胺。DNA去甲基化试剂也可为PsammaplinA。
分化中的hPS细胞不仅可暴露于一种DNA去甲基化试剂，而且也可暴露于一种或更多种另一些DNA去甲基化试剂，例如暴露于两种、三种或四种以上提及的那些的组合。
通常可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约10μM(例如约1nM至约5μM)的DNA去甲基化试剂。
因此，可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约1μM的DNA去甲基化试剂。因此可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约500nM的DNA去甲基化试剂。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约250nM的DNA去甲基化试剂。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约100nM的DNA去甲基化试剂。因此可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约50nM的DNA去甲基化试剂。因此可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约25nM的DNA去甲基化试剂。因此可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约15nM的DNA去甲基化试剂。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约10nM的DNA去甲基化试剂。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约5nM至约500nM的DNA去甲基化试剂。因此可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约5nM至约250nM的DNA去甲基化试剂。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约5nM至约100nM的DNA去甲基化试剂。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约5nM至约50nM的DNA去甲基化试剂。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约5nM至约25nM的DNA去甲基化试剂。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约5nM至约15nM的DNA去甲基化试剂，例如在约10nM的范围内。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约7.5nM至约250nM的DNA去甲基化试剂。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约7.5nM至约100nM的DNA去甲基化试剂。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约7.5nM至约50nM的DNA去甲基化试剂。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约7.5nM至约25nM的DNA去甲基化试剂。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约7.5nM至约12.5nM的DNA去甲基化试剂。
在例如将5-氮杂-2-脱氧胞苷用作DNA去甲基化试剂的情况下，可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约1μM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。因此可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约500nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约250nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约100nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。因此可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约50nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。因此可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约25nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。因此可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约15nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约1nM至约10nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约5nM至约500nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。因此可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约5nM至约250nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约5nM至约100nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约5nM至约50nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约5nM至约25nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约5nM至约15nM(例如在约10nM的范围内)的5-氮杂-2-脱氧胞苷。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约7.5nM至约250nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约7.5nM至约100nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约7.5nM至约50nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约7.5nM至约25nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。也可使分化中的hPS细胞暴露于浓度为约7.5nM至约12.5nM的5-氮杂-2-脱氧胞苷。
类似的浓度可用于将5-氮杂胞苷或泽布拉林用作DNA去甲基化试剂的情况。类似的浓度也可用于另一些胞苷类似物的情况，例如伪异胞苷、5-氟-2-脱氧胞苷、5，6-二氢-5-氮杂胞苷、2′-脱氧-5，6-二氢-5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷、2′，2′-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)或胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷，特别是5-氟-2-脱氧胞苷、5，6-二氢-5-氮杂胞苷、2′-脱氧-5，6-二氢-5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷或2′，2′-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)。
当分化中的hPS细胞表现出如细胞倍增时间所显示的最大的增殖能力时(例如在分化第2天至第7天之间)，通常将其暴露于核苷类似物类(例如5-氮杂-2-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、泽布拉林)的DNA去甲基化试剂。因此，可在分化第2天将DNA去甲基化试剂添加至分化培养基。也可在分化第3天将DNA去甲基化试剂添加至分化培养基。也可在分化第4天将DNA去甲基化试剂添加至分化培养基。也可在分化第5天将DNA去甲基化试剂添加至分化培养基。也可在分化第6天将DNA去甲基化试剂添加至分化培养基。可在分化方案的任何时候添加非核苷类的DNA去甲基化试剂(例如普鲁卡因、RG108、S-5-腺苷-L-高半胱氨酸)，原因是其不需要细胞增殖来起作用。
如本文图13(实施例10)所示，采用DNA去甲基化试剂处理分化中的hPS细胞出乎意料地使DE细胞的形态和产率得到改善。此外，采用DNA去甲基化试剂处理还出乎意料地使DE细胞中干细胞标志物Oct4的表达显著下调(图13C和D)并使DE特异性标志物SOX17、CXCR4和HHEX的表达得到改善(图13D)。认为本发明该方面首次示出DNA去甲基作用与特异性生长因子(其在基因组水平上的作用可通过普遍的甲基化的缺失来增强)应用之间的特异性协同作用。此外，当在早期内胚层发育期间用DNA去甲基化试剂处理细胞，然后使所得肝祖细胞暴露于视黄酸应答性受体、GSK3抑制剂/Wnt信号传导激活剂和/或基质覆盖物(实施例8；图9、10和12)时，发现了强协同作用对肝细胞样细胞成熟的作用。
此外，在无异源条件下获得本发明肝细胞样细胞。因而，本发明方法采用的起始材料可因此为无异源的，例如在无动物的条件下获得或建立的无异源hPS细胞或细胞系，或者无异源的肝祖细胞或细胞系。此外，贯穿本发明方法，可在完全无异源条件下培养细胞，从而产生真正无异源的肝细胞样细胞。这样的细胞或细胞系将更好地适于治疗性或再生医学应用并且可通过非无异源细胞的非人唾液酸Neu5Gc或另一些非人标志物的存在将其与非无异源组合区分开来(Martin等2005)。
作为本发明方法的结果，对更加成熟具有功能特征的所得肝细胞样细胞与目前获得的现有技术方法进行比较。
采用本发明方法获得的肝细胞样细胞示出与肝细胞相关基因(例如CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP7A1、CYP2B6、CYP3A5、MRP2、CAR、NTCP、GSTA-1、PXR和成体同工型HNF4a)的表达提高。其进一步示出增加了代谢活性，正如用于代谢药物(例如扑热息痛、双氯芬酸)的CYP酶(CYP1A1/2、2C9和3A4/5/7)或UGT酶(UDP-葡糖醛酸基转移酶)(例如UGT1A1、UGT1A9和UGT2B7)的增加的活性所证实的。本发明的肝细胞样细胞还示出相比于未处理的对照细胞延长了寿命。当与不使用5杂氮-脱氧胞苷、视黄酸、坎帕罗酮和基质覆盖物的培养物比较时，采用本发明方法获得的肝细胞样细胞还示出细胞色素P450活性的倍数变化超过至少1.5倍(例如2倍)。
此外，所获得的肝细胞样细胞群或细胞组合物比通过以下目前获得的现有技术方法所获得的更纯并且更均一。
本发明的一种或更多种细胞组合物的特征还可在于：至少70％(例如75％、80％、90％或95％)的细胞为本发明的肝细胞样细胞。
采用本发明方法和本发明所述原理获得的肝细胞样细胞可用于多个目的，包括药物递送过程、毒性测试、用于研究药物转运蛋白、代谢药物的酶，如用于研究肝发育(例如早期肝发育)、用于研究人肝再生性病症、用于体外肝毒性测试的体外模型。
此外，采用本发明方法获得的肝细胞样细胞可用于治疗目的，包括：在药物方面，用来制备用于预防和/或治疗由组织退化(例如肝组织的退化)引起的病理和/或疾病的药物或药物产品。本发明的肝细胞样细胞也可用于制备用来治疗肝病的药物或药物产品。肝病为例如自身免疫病，包括原发性胆汁性肝硬变；代谢性病症，包括血脂异常；由例如酒精滥用引起的肝病；由病毒引起的疾病，例如乙型肝炎、丙型肝炎和甲型肝炎；由对于例如药物的急性中毒反应引起的肝坏死；以及患有例如肝细胞癌的患者的肿瘤切除。
或者，采用本发明方法获得的肝细胞样细胞可用于制备用于治疗和/或预防代谢病理和/或疾病的药物或药物产品。
药剂或药物产品可例如为替代组织或细胞的注射剂的形式。
根据本发明的肝细胞样细胞的分化和成熟对于以下情况可以是有用的：获得代谢得到改善的肝细胞样细胞，研究肝细胞样细胞的成熟或针对其调节肝细胞功能的能力来筛选化合物，所述筛选化合物的方法包括使根据本文所提供方面获得的衍生肝细胞样细胞在体外暴露于化合物，确定细胞中由于与化合物相接触所导致的任何表型或代谢的改变，并所述改变与调节肝细胞功能的能力联系起来。
本发明还提供试剂盒。这样的试剂盒在实施本发明方法中是特别有用的，例如用于使根据本发明的人肝细胞样细胞成熟的方法。根据本发明的试剂盒包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂，以及选自GSK3抑制剂、Wnt信号传导激活剂、CDK抑制剂和细胞外基质(ECM)组分或ECM组分混合物中的至少一种。
因此，本发明的试剂盒可包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂、至少一种GSK3抑制剂和任选的至少一种细胞外基质(ECM)组分或ECM组分混合物。
本发明试剂盒也可包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂、至少一种Wnt信号传导激活剂和任选的至少一种细胞外基质(ECM)组分或ECM组分混合物。
本发明试剂盒也可包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂、至少一种CDK抑制剂和任选的至少一种细胞外基质(ECM)组分或ECM组分混合物。
本发明试剂盒也可包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂、至少一种CDK抑制剂和至少一种GSK3抑制剂或Wnt信号传导激活剂，以及任选的至少一种细胞外基质(ECM)组分或ECM组分混合物。
本发明试剂盒也可包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂和至少一种细胞外基质(ECM)组分或ECM组分混合物。
如上所述，应理解本文所给出关于本发明方法所用组分的详细内容也用于本发明试剂盒所包含的组分。
因此，本发明试剂盒所包含的至少一种视黄酸应答性受体的激活剂可例如为视黄酸，如9-顺式视黄酸。
本发明试剂盒所包含的至少一种GSK-3抑制剂可例如为选自以下的一种：坎帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮、氨基嘧啶CHIR99021和靛玉红-3′-单肟。
本发明试剂盒所包含的至少一种GSK-3抑制剂可例如为选自以下的一种：坎帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮、靛玉红-3′-单肟、2-溴-9-硝基帕罗酮、2-溴-9-三氟甲基帕罗酮、2-溴帕罗酮、2-碘-9-三氟甲基帕罗酮、2-碘帕罗酮、2-苯基-4-(2-噻吩基)-5H-吡啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮、2-[2-(1-羟基环己基)-乙炔基]-9-三氟甲基-帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-硝基帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-三氟甲基帕罗酮、2，3-二甲氧基帕罗酮、2-(3-羟基-1-丙炔基)-9-三氟甲基帕罗酮、2，9-二溴-帕罗酮、3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙腈、4-甲氧基帕罗酮、4-(4-氯苯基)-2-(2-萘基)-5H-吡啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮，5-苄基-9-溴帕罗酮、5-碘-靛玉红.3-单肟、5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、6溴靛玉红、8，10-二氯帕罗酮、9-溴-2，3-二羟基帕罗酮、9-溴-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-溴-4-羟基帕罗酮、9-溴-4-甲氧基帕罗酮、9-溴-5-乙基帕罗酮、9-溴-5-(甲氧羰基甲基)帕罗酮、9-溴-5-甲基帕罗酮，9-溴-5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、9-溴-5，7-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，7，12-三-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，12-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-7，12-二氢-6-(羟氨基)-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂、9-溴-7，12-二氢-6-甲硫基-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂、9-溴-7，12-二氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(5H)-硫酮、9-溴-12-(2-羟乙基)-帕罗酮、9-溴-12-(2-丙烯基)-帕罗酮、9-溴-12-乙基帕罗酮、9-溴-12-甲基帕罗酮、9-溴-12-甲氧基羰基-甲基帕罗酮、9-溴-12-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-氯帕罗酮、9-氰基帕罗酮、9-氰基-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-氟帕罗酮、9-甲氧基帕罗酮、9-甲基帕罗酮、9-氧代-噻唑并[5，4-f]喹唑啉-2-腈衍生物、9-三氟甲基帕罗酮、10-溴帕罗酮、11-溴帕罗酮、11-氯帕罗酮、11-乙基帕罗酮、11-甲基帕罗酮、Aloisines(＝6-苯基[5H]吡咯并[2，3-6]吡嗪)(例如AloisineA)、AZD1080、双-吲哚靛玉红、Debromohymenialdisine、Dibromocantharelline、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯酸甲酯、(E)-2-(3-氧代-1-丁烯基)-9-三氟甲基帕罗酮、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯腈、靛玉红、Hymenidin、Hymenialdisine、Manzamines(例如ManzamineA)、Meridiamins、帕罗酮、吡唑并[3，4-b]吡啶衍生物、吡唑并[3，4-b]喹喔啉衍生物和噻唑并[5，4-f]喹唑啉-9-酮衍生物。
本发明试剂盒所包含的至少一种Wnt信号传导激活剂可例如为选自以上所公开Wnt蛋白质的组中的一种。其可例如为Wnt3A或Wnt5A。
本发明试剂盒所包含的至少一种CDK抑制剂可例如为选自以下的一种：坎帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮、靛玉红-3′-单肟、SNS-032(BMS-387032)、AT-7519和AZD5438。
本发明试剂盒所包含的至少一种CDK抑制剂可例如为选自以下的一种：坎帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮、靛玉红-3′-单肟、2-溴-9-硝基帕罗酮、2-溴-9-三氟甲基帕罗酮、2-溴帕罗酮、2-碘-9-三氟甲基帕罗酮、2-碘帕罗酮、2-苯基-4-(2-噻吩基)-5H-吡啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮、2-[2-(1-羟基环己基)-乙炔基]-9-三氟甲基-帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-硝基帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-三氟甲基帕罗酮、2，3-二甲氧基帕罗酮、2-(3-羟基-1-丙炔基)-9-三氟甲基帕罗酮、2，9-二溴-帕罗酮、3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙腈、4-甲氧基帕罗酮、4-(4-氯苯基)-2-(2-萘基)-5H-吡啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮，5-苄基-9-溴帕罗酮、5-碘-靛玉红.3-单肟、5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、6溴靛玉红、8，10-二氯帕罗酮、9-溴-2，3-二羟基帕罗酮、9-溴-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-溴-4-羟基帕罗酮、9-溴-4-甲氧基帕罗酮、9-溴-5-乙基帕罗酮、9-溴-5-(甲氧羰基甲基)帕罗酮、9-溴-5-甲基帕罗酮，9-溴-5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、9-溴-5，7-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，7，12-三-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，12-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-7，12-二氢-6-(羟氨基)-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂、9-溴-7，12-二氢-6-甲硫基-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂、9-溴-7，12-二氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(5H)-硫酮、9-溴-12-(2-羟乙基)-帕罗酮、9-溴-12-(2-丙烯基)-帕罗酮、9-溴-12-乙基帕罗酮、9-溴-12-甲基帕罗酮、9-溴-12-甲氧基羰基-甲基帕罗酮、9-溴-12-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-氯帕罗酮、9-氰基帕罗酮、9-氰基-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-氟帕罗酮、9-甲氧基帕罗酮、9-甲基帕罗酮、9-氧代-噻唑并[5，4-f]喹唑啉-2-腈衍生物、9-三氟甲基帕罗酮、10-溴帕罗酮、11-溴帕罗酮、11-氯帕罗酮、11-乙基帕罗酮、11-甲基帕罗酮、Aloisines(＝6-苯基[5H]吡咯并[2，3-6]吡嗪)(例如AloisineA)、AZD1080、双-吲哚靛玉红、Debromohymenialdisine、Dibromocantharelline、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯酸甲酯、(E)-2-(3-氧代-1-丁烯基)-9-三氟甲基帕罗酮、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯腈、靛玉红、Hymenidin、Hymenialdisine、Manzamines(例如ManzamineA)、Meridiamins、帕罗酮、吡唑并[3，4-b]吡啶衍生物、吡唑并[3，4-b]喹喔啉衍生物和噻唑并[5，4-f]喹唑啉-9-酮衍生物。
本发明试剂盒所包含的至少一种ECM组分可例如为选自以下的一种：胶原蛋白(例如胶原蛋白I、II、III、IV、V或VI)、纤连蛋白、弹性蛋白、硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖、肝素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖、黏结蛋白聚糖或串珠蛋白聚糖)、葡糖氨基葡聚糖、巢蛋白/触觉蛋白、层粘连蛋白、双糖链蛋白聚糖、生腱蛋白和乙酰透明质酸。
本发明试剂盒可包含ECM组分混合物，其包含两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或达二十种本文所提及的ECM组分或由其构成。因此，本发明试剂盒可包含含有两种本文所提及的ECM组分或由其构成的ECM组分混合物。本发明试剂盒也可包含含有三种本文所提及的ECM组分或由其构成的ECM组分混合物。本发明试剂盒也可包含含有四种本文所提及的ECM组分或由其构成的ECM组分混合物。本发明试剂盒也可包含含有五种本文所提及的ECM组分或由其构成的ECM组分混合物。本发明试剂盒也可包含含有六种本文所提及的ECM组分或由其构成的ECM组分混合物。本发明试剂盒也可包含含有七种本文所提及的ECM组分或由其构成的ECM组分混合物。本发明试剂盒也可包含含有八种本文所提及的ECM组分或由其构成的ECM组分混合物。本发明试剂盒也可包含含有九种本文所提及的ECM组分或由其构成的ECM组分混合物。本发明试剂盒也可包含含有十种本文所提及的ECM组分或由其构成的ECM组分混合物。
例如，本发明试剂盒可包含ECM组分混合物，其包含胶原蛋白和纤连蛋白或由其构成，例如ECM组分混合物包含胶原蛋白I和纤连蛋白或由其构成。本发明试剂盒可包含含有胶原蛋白(例如胶原蛋白I)和层粘连蛋白或由其构成的ECM组分混合物。本发明试剂盒可包含含有胶原蛋白(例如胶原蛋白I)、巢蛋白和层粘连蛋白或由其构成的ECM组分混合物。本发明试剂盒可包含含有胶原蛋白(例如胶原蛋白I)、纤连蛋白和层粘连蛋白或由其构成的ECM组分混合物。本发明试剂盒可包含含有纤连蛋白和层粘连蛋白或由其构成的ECM组分混合物。本发明试剂盒可包含含有纤连蛋白、巢蛋白和层粘连蛋白或由其构成的ECM组分混合物。
本发明试剂盒可包含含有纤连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、胶原蛋白VI、巢蛋白、双糖链蛋白聚糖和层粘连蛋白或由其构成的ECM组分混合物。
本发明试剂盒可包含含有纤连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、巢蛋白、双糖链蛋白聚糖和层粘连蛋白或由其构成的ECM组分混合物。
本发明试剂盒可包含含有胶原蛋白(例如胶原蛋白I)、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和葡糖氨基葡聚糖或由其构成的ECM组分混合物。本发明试剂盒可包含含有胶原蛋白(例如胶原蛋白I)、层粘连蛋白、纤连蛋白和蛋白聚糖或由其构成的ECM组分混合物。
本发明试剂盒可包含含有胶原蛋白(例如胶原蛋白I)、层粘连蛋白、纤连蛋白、生腱蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和葡糖氨基葡聚糖或由其构成的ECM组分混合物。
因此，本发明试剂盒可包含9-顺式视黄酸和坎帕罗酮。这样的试剂盒可进一步包含如上所公开的ECM组分混合物，例如含有胶原蛋白和纤连蛋白或由其构成的ECM组分混合物，例如含有胶原蛋白I和纤连蛋白或由其构成的ECM组分混合物。
本发明试剂盒可包含9-顺式视黄酸和靛玉红-3′-单肟。这样的试剂盒可进一步包含如上所公开的ECM组分混合物，例如含有胶原蛋白和纤连蛋白或由其构成的ECM组分混合物，例如含有胶原蛋白I和纤连蛋白或由其构成的ECM组分混合物。
本发明试剂盒还可包含至少一种DNA去甲基化试剂。如果本发明试剂盒包含DNA去甲基化试剂，则其可以为胞苷类似物，例如5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)、泽布拉林、伪异胞苷、5-氟-2-脱氧胞苷、5，6-二氢-5-氮杂胞苷、2′-脱氧-5，6-二氢-5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷、2′，2′-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)或胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷。
所述至少一种DNA去甲基化试剂可例如为5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)。所述至少一种DNA去甲基化试剂也可为、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)。
本发明试剂盒还可包含人多能干细胞。因此，本发明试剂盒可包含人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。人多能干细胞可适当地以细胞悬液提供，并且可以以冷冻状态提供。
本发明试剂盒还可包含定形内胚层细胞(DE细胞)。DE细胞可适当地以细胞悬液提供，并且可以以冷冻状态提供。
本发明试剂盒的组分可提供于同一或分开的容器中。例如，所述至少一种视黄酸应答性受体的激活剂和至少一种GSK3抑制剂、至少一种Wnt信号传导激活剂或者至少一种CDK抑制剂可提供于同一容器中。如果试剂盒还包含至少一种细胞外基质(ECM)组分或ECM组分混合物，则这样的ECM组分或ECM组分混合物通常可提供于分开的容器中。因此，当至少一种视黄酸应答性受体的激活剂和至少一种GSK3抑制剂、至少一种Wnt信号传导激活剂或者至少一种CDK抑制剂可提供于同一容器中时，则至少一种细胞外基质(ECM)组分或ECM组分混合物提供于不同容器中。
同样地，如果试剂盒包含人多能干细胞或定形内胚层细胞(DE细胞)，则人多能干细胞或DE细胞通常可提供于与包含其他组分的容器不同的容器中。
本发明还提供组合物。这样的组合物对于根据本发明的使人肝细胞样细胞成熟的步骤是特别有用的。本发明组合物包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂，以及选自GSK3抑制剂、Wnt信号传导激活剂和CDK抑制剂的至少一种。
因此，本发明组合物可包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂和至少一种GSK-3抑制剂，以及任选的至少一种CDK抑制剂。
本发明组合物也可包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂和至少一种Wnt信号传导激活剂，以及任选的至少一种CDK抑制剂。
本发明组合物也可包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂和至少一种CDK抑制剂，以及任选的至少一种GSK3抑制剂或至少一种Wnt信号传导激活剂。
如上所述，应理解本文所给出关于本发明方法所用组分的详细内容也应用于本发明组合物所包含的组分。
因此，本发明组合物所包含的至少一种视黄酸应答性受体的激活剂可例如为视黄酸，如9-顺式视黄酸。
本发明组合物所包含的至少一种GSK-3抑制剂可例如为选自以下的一种：坎帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮、氨基嘧啶CHIR99021和靛玉红-3′-单肟。
本发明组合物所包含的至少一种GSK-3抑制剂可例如为选自以下的一种：坎帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮、靛玉红-3′-单肟、2-溴-9-硝基帕罗酮、2-溴-9-三氟甲基帕罗酮、2-溴帕罗酮、2-碘-9-三氟甲基帕罗酮、2-碘帕罗酮、2-苯基-4-(2-噻吩基)-5H-吡啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮、2-[2-(1-羟基环己基)-乙炔基]-9-三氟甲基-帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-硝基帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-三氟甲基帕罗酮、2，3-二甲氧基帕罗酮、2-(3-羟基-1-丙炔基)-9-三氟甲基帕罗酮、2，9-二溴-帕罗酮、3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙、4-甲氧基帕罗酮、4-(4-氯苯基)-2-(2-萘基)-5H-吡啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮，5-苄基-9-溴帕罗酮、5-碘-靛玉红.3-单肟、5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、6溴靛玉红、8，10-二氯帕罗酮、9-溴-2，3-二羟基帕罗酮、9-溴-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-溴-4-羟基帕罗酮、9-溴-4-甲氧基帕罗酮、9-溴-5-乙基帕罗酮、9-溴-5-(甲氧羰基甲基)帕罗酮、9-溴-5-甲基帕罗酮，9-溴-5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、9-溴-5，7-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，7，12-三-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，12-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-7，12-二氢-6-(羟氨基)-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂、9-溴-7，12-二氢-6-甲硫基-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂、9-溴-7，12-二氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(5H)-硫酮、9-溴-12-(2-羟乙基)-帕罗酮、9-溴-12-(2-丙烯基)-帕罗酮、9-溴-12-乙基帕罗酮、9-溴-12-甲基帕罗酮、9-溴-12-甲氧基羰基-甲基帕罗酮、9-溴-12-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-氯帕罗酮、9-氰基帕罗酮、9-氰基-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-氟帕罗酮、9-甲氧基帕罗酮、9-甲基帕罗酮、9-氧代-噻唑并[5，4-f]喹唑啉-2-腈衍生物、9-三氟甲基帕罗酮、10-溴帕罗酮、11-溴帕罗酮、11-氯帕罗酮、11-乙基帕罗酮、11-甲基帕罗酮、Aloisines(＝6-苯基[5H]吡咯并[2，3-6]吡嗪)(例如AloisineA)、AZD1080、双-吲哚靛玉红、Debromohymenialdisine、Dibromocantharelline、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯酸甲酯、(E)-2-(3-氧代-1-丁烯基)-9-三氟甲基帕罗酮、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯腈、靛玉红、Hymenidin、Hymenialdisine、Manzamines(例如ManzamineA)、Meridiamins、帕罗酮、吡唑并[3，4-b]吡啶衍生物、吡唑并[3，4-b]喹喔啉衍生物和噻唑并[5，4-f]喹唑啉-9-酮衍生物。
本发明组合物所包含的至少一种Wnt信号传导激活剂可例如为选自以上所公开Wnt蛋白质的组中的一种。其可例如为Wnt3A或Wnt5A。
本发明组合物所包含的至少一种CDK抑制剂可例如为选自以下的一种：坎帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮、靛玉红-3′-单肟、SNS-032(BMS-387032)、AT-7519和AZD5438。
本发明组合物所包含的至少一种CDK抑制剂可例如为选自以下的一种：坎帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮、靛玉红-3′-单肟、2-溴-9-硝基帕罗酮、2-溴-9-三氟甲基帕罗酮、2-溴帕罗酮、2-碘-9-三氟甲基帕罗酮、2-碘帕罗酮、2-苯基-4-(2-噻吩基)-5H-吡啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮、2-[2-(1-羟基环己基)-乙炔基]-9-三氟甲基-帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-硝基帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-三氟甲基帕罗酮、2，3-二甲氧基帕罗酮、2-(3-羟基-1-丙炔基)-9-三氟甲基帕罗酮、2，9-二溴-帕罗酮、3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙腈、4-甲氧基帕罗酮、4-(4-氯苯基)-2-(2-萘基)-5H-吡啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮，5-苄基-9-溴帕罗酮、5-碘-靛玉红.3-单肟、5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、6溴靛玉红、8，10-二氯帕罗酮、9-溴-2，3-二羟基帕罗酮、9-溴-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-溴-4-羟基帕罗酮、9-溴-4-甲氧基帕罗酮、9-溴-5-乙基帕罗酮、9-溴-5-(甲氧羰基甲基)帕罗酮、9-溴-5-甲基帕罗酮，9-溴-5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、9-溴-5，7-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，7，12-三-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，12-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-7，12-二氢-6-(羟氨基)-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂、9-溴-7，12-二氢-6-甲硫基-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂、9-溴-7，12-二氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(5H)-硫酮、9-溴-12-(2-羟乙基)-帕罗酮、9-溴-12-(2-丙烯基)-帕罗酮、9-溴-12-乙基帕罗酮、9-溴-12-甲基帕罗酮、9-溴-12-甲氧基羰基-甲基帕罗酮、9-溴-12-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-氯帕罗酮、9-氰基帕罗酮、9-氰基-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-氟帕罗酮、9-甲氧基帕罗酮、9-甲基帕罗酮、9-氧代-噻唑并[5，4-f]喹唑啉-2-腈衍生物、9-三氟甲基帕罗酮、10-溴帕罗酮、11-溴帕罗酮、11-氯帕罗酮、11-乙基帕罗酮、11-甲基帕罗酮、Aloisines(＝6-苯基[5H]吡咯并[2，3-6]吡嗪)(例如AloisineA)、AZD1080、双-吲哚靛玉红、Debromohymenialdisine、Dibromocantharelline、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯酸甲酯、(E)-2-(3-氧代-1-丁烯基)-9-三氟甲基帕罗酮、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯腈、靛玉红、Hymenidin、Hymenialdisine、Manzamines(例如ManzamineA)、Meridiamins、帕罗酮、吡唑并[3，4-b]吡啶衍生物、吡唑并[3，4-b]喹喔啉衍生物和噻唑并[5，4-f]喹唑啉-9-酮衍生物。
因此，本发明组合物可包含9-顺式视黄酸和坎帕罗酮。
本发明组合物可包含9-顺式视黄酸和靛玉红-3′-单肟。
本发明组合物可包含13-顺式视黄酸和坎帕罗酮。
本发明组合物可包含13-顺式视黄酸和靛玉红-3′-单肟。
定义
如本文所用，“多能”或“多能性”是指形成三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的所有类型特化细胞的潜能；并且有别于能形成能够产生后代的完整胚胎的“全能”或“全能性”。
本文所用术语“人多能干细胞”(hPSC)是指能够在适当条件下自我更新并能够形成三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的任意类型特化细胞的人细胞。hPS细胞可具有在8至12周龄的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养物中形成所有三个胚层之可鉴定细胞的能力。人多能干细胞的定义中包括多种类型的胚胎细胞，包括人胚胎干(hES)细胞(参见例如Thomson等(1998)，Heins等(2004))以及诱导多能干细胞[参见例如Takahashi等(2007)；Zhou等(2009)；Yu和Thomson，EssentialsofStemCellBiology(第二版)中]。本文所述的多种方法可利用来自各种来源的hPS细胞。例如，适于使用的hPS细胞可通过使用非破坏性技术(例如通过采用单卵裂球移除技术，如Chung等(2008)所述的，Mercader等进一步在EssentialStemCellMethods(第一版，2009)中有所描述)由发育中的胚胎获得。另外或者可替代地，适当的hPS细胞可获自已建立的细胞系或者可以为成体干细胞。
本文所用“hiPS细胞”是指人诱导多能干细胞。hiPS细胞为通过诱导与多能性相关的基因的表达衍生自非多能细胞(通常为成体体细胞)的一类多能干细胞，所述基因例如SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、Oct-4、Sox2、Nanog和Lin28。
本文所用“定形内胚层(DE)”和“定形内胚层细胞(DE细胞)”是指这样一种细胞，其表现出与定形内胚层细胞或包含显著量的与定形内胚层细胞类似之细胞的组合物相同的蛋白质和/或基因表达以及形态。定形内胚层为产生肠、胰腺、肝和肺细胞的胚细胞层。通常DE细胞的特征可在于内胚层标志物FOXA2、CXCR4、HHEX、SOX17、GATA4和GATA6的阳性基因和蛋白质表达，并因此由其识别。两种标志物SOX17和CXCR4对于DE是特异性的并且在hPSC、肝祖细胞或肝细胞中不能检测到。最终，虽然DE细胞未表现出未分化细胞标志物Oct4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81的基因和蛋白质表达，但是可显示低的Nanog表达。
本文所用“肝祖(hepaticprogenitor)”或“肝祖细胞”是指已进入肝细胞途径并产生肝细胞的细胞。因此“肝祖”区分于“内胚层细胞”，原因在于其丧失了发育为肠、胰腺和肺之细胞的潜能。通常“肝祖”的特征可在于并因此由早期肝标志物EpCAM、c-Met(HGF受体)、AFP、CK19、HNF6、C/EBPα和β阳性的基因和蛋白质表达鉴定出。其并未示出DE-标志物CXCR4和SOX17的基因和蛋白质表达。最终，“肝祖”未示出未分化细胞标志物Oct4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81或成熟肝标志物CYP1A2、CYP2C9、CYP19、CYP3A4、CYP2B6和PXR的基因和蛋白质表达。
本文所用“肝细胞”或“肝细胞样细胞”是指完全分化的肝细胞。通常可由成熟肝标志物CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6、GSTA1-1、OATP-2、NTCP、白蛋白、PXR、CAR和HNF4a(同工型1+2)等阳性的基因和蛋白质表达来描述并因此鉴定出“肝细胞”或“肝细胞样细胞”。此外，“肝细胞”或“肝细胞样细胞”并未示出未分化细胞标志物Oct4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的基因和蛋白质表达。与DE细胞相比，“肝细胞”或“肝细胞样细胞”并未示出DE细胞标志物SOX17和CXCR4的基因和蛋白质表达。与“肝祖”相比，“肝细胞”或“肝细胞样细胞”并未示出肝祖标志物细胞角蛋白19和AFP的基因和蛋白质表达。
如本文所指，如果在测定所述基因或蛋白质表达水平的实验中，所测得的表达水平高于测定的标准偏差的三倍，则基因或蛋白质应被解释为被“表达的”，其中在10个独立的表达水平测定中测定表达水平和标准偏差。优选根据背景信号校正在10个独立的测定中测定的表达水平。
如本文所用，HDAC抑制剂是指组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如丁酸钠(“NaB”)、苯基丁酸盐/酯(“PB”)、曲古抑菌素A和丙戊酸盐/酯(“VA”)。
如本文所用，“GSK抑制剂”是指抑制GSK(尤其是GSK3，包括GSK3α或GSK3β)的化合物。
如本文所用，“Wnt信号传导激活剂”是指激活Wnt信号传导的化合物。
如本文所用，DNA去甲基化试剂旨在意指干扰DNA甲基转移酶活性的化合物，例如核苷类似物(如胞苷类似物)，特别是5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)和5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)，以及非核苷类，例如RG108、S-5-腺苷-L-高半胱氨酸和普鲁卡因。
如本文所用“CYP”旨在意指细胞色素P，并且更特别的为细胞色素P450，肝代谢重要的I相酶，其包括多种不同的同工酶(例如CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6/2A7/2A13、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP7A1)。
如本文所用，术语“GST”旨在意指谷胱甘肽转移酶，并且其同工型的实例为GSTA1-1、GSTM1-1和GSTP1-1。
如本文所用，术语“UGT”旨在意指尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶，其为一组催化葡糖苷酸化活性的肝酶。
如本文所用，术语“NTCP”意指Na+-牛磺胆酸协同转运多肽，其为由基因SLC10A1编码的钠/胆汁酸协同转运蛋白。
如本文所用，术语“CAR”意指结构性雄烷受体。
术语“功能性药物代谢酶”旨在意指属于对生物异源物质和药物进行化学改性(称为药物或生物异源物质代谢)的I相酶和II相酶的功能性酶。
如本文所用，术语“功能活性”意指可有效测定的肝细胞功能，例如可测定药物转运蛋白对药物的转运，可测定对细胞色素P450(CYP)而言酶的代谢(通常在原代人肝细胞中检测)。
如本文所用，术语“胚外内胚层(ExE)”旨在意指分化内胚层细胞，其与定形内胚层相对，将构成人发育胚体(例如卵黄囊)外区。
如本文所用，术语“AAT”旨在意指肝标志物α抗胰蛋白酶。
如本文所用，术语“AFP”旨在意指肝标志物甲胎蛋白。
如本文所用，术语“BSEP”旨在意指胆汁转运体胆盐输出泵。
如本文所用，术语“CK”旨在意指肝标志物细胞角蛋白(可交替使用)，其具有不同同工型例如细胞角蛋白18(CK18/KRT18)、细胞角蛋白19(CK19/KRT19)、细胞角蛋白8(CK8)和细胞角蛋白7(CK7)。
如本文所用，术语“FGF”意指成纤维细胞生长因子，优选人和/或重组来源，并且属于其的同工型为例如“bFGF”(意指碱性成纤维细胞生长因子，有时也称为FGF2)和FGF4。“aFGF”意指酸性成纤维细胞生长因子(有时也称为FGF1)。
如本文所用，术语“BMP”意指骨形态发生蛋白，优选人和/或重组来源，并且属于其的同工型为例如BMP4和BMP2。
如本文所用，术语“HGF”意指肝细胞生长因子，优选人和/或重组来源。
如本文所用，术语“EGF”意指表皮生长因子，优选人和/或重组来源。
如本文所用，可交替使用的“HNF4α”或“HNF4a”旨在意指肝细胞核因子4(也称为NR2A1，核受体亚家族2，组A，成员1)，一种调节内胚层衍生的组织(例如肝、胰岛和脂肪细胞)之基因表达的转录因子。编码的蛋白质控制几种基因的表达，其包括肝细胞核因子1α。
如本文所用，术语“MDR”旨在意指多药物抗性转运蛋白，MDR1和MDR3均为转运蛋白ATP结合盒(ABC)家族的成员并且两者均为药物外排转运蛋白。MDR1在调节药物、肽和生物异源物质向体内运输以及使身体免受生物异源物质损害和药物毒性中是重要的，而MDR3则对磷脂向胆管中的分泌至关重要。
如本文所用，术语“激活素”旨在意指表现出各种各样生物活性(包括细胞增殖和分化调控)的TGF-β家族成员，例如“激活素A”或“激活素B”。激活素属于常见的配体TGF-β超家族。
如本文所用，术语“视黄酸应答性受体的激活剂”旨在意指能够结合并激活人视黄酸受体(RAR)和/或人类视黄醇X受体(RXRs)的化合物。
如本文所用，术语“视黄酸受体”或“RAR”旨在意指视黄酸受体家族的成员，特别是分别由RARA、RARB、RARG基因编码的RAR-α、RAR-β和RAR-γ。每种受体同工型具有几种剪接变体：α有两种，β有四种并且γ有两种。这些同工型也包括在“视黄酸受体”的定义之内。
如本文所用，术语“类视黄醇X受体”旨在意指类视黄醇X受体家族的成员，特别是分别由RXRA、RXRB、RXRG基因编码的RXR-α、RXR-β和RXR-γ。
如本文所用，术语“视黄酸”旨在意指视黄酸异构体，包括但不限于全反式视黄酸、7-顺式视黄酸、9-顺式视黄酸、11-顺式视黄酸和13-顺式视黄酸。
如本文所用，术语“细胞周期依赖性激酶抑制剂”或“CDK抑制剂”旨在意指能够抑制细胞周期依赖性激酶(如细胞周期依赖性激酶2(CDK2))的功能(例如活性)的化合物。
如本文所用，术语“ROCK抑制剂”旨在意指与ROCKRho相关的蛋白激酶活性的抑制剂。
如本文所用，术语“基质”旨在指形成正常哺乳动物细胞外基质环境部分的任意组分(单独或组合)。这样的基质组分包括但不限于胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白，并且可来自天然或合成来源。
如本文所用，术语“覆盖物”旨在指施加于培养细胞顶部的例如细胞外基质组分的层。
如本文所用，术语“覆层”旨在指例如覆盖培养容器表面并在其上培养细胞的例如细胞外基质组分的层。
如本文所用，术语“无异源”旨在意指完全规避直接或间接暴露于非人动物组分。
如本文所用，术语“肝细胞毒性”指示细胞应答例如坏死性毒性、凋亡、线粒体毒性、磷脂沉积、脂肪变性和胆汁酸转运。
附图简述
图1
暴露于不同时长之视黄酸处理的hESC衍生肝细胞中HNF4α的表达。
图2
暴露于不同时长之视黄酸处理的hESC衍生肝细胞中几种CYP酶的功能性表达。
图3
暴露于不同时长之视黄酸处理的hESC衍生肝细胞中CYP酶、核受体CAR和PXR以及甲胎蛋白的基因表达。
图4
暴露于视黄酸与坎帕罗酮和基质覆盖物之组合的hESC和hiPS衍生肝细胞中CYP酶的功能性表达。
图5
暴露于视黄酸、坎帕罗酮和基质覆盖物的hESC衍生肝细胞样细胞(通过基本方案B衍生)中I相酶、II相酶、药物转运蛋白和核受体的基因表达。
图6
暴露于视黄酸、坎帕罗酮和基质覆盖物的hESC和hiPSC衍生肝细胞样细胞(通过基本方案C和D衍生)中I相酶、II相酶、药物转运蛋白和核受体的基因表达。
图7
经基质覆盖物处理的hESC衍生肝细胞(通过基本方案B衍生)的形态和寿命(方案B)。
图8
暴露于视黄酸、坎帕罗酮和基质覆盖物的hESC和hiPSC衍生肝细胞(通过基本方案C和D衍生)的形态和寿命。
图9
先经5-氮杂-脱氧胞苷处理并随后暴露于视黄酸、坎帕罗酮和基质覆盖物的hESC和hiPSC衍生肝细胞样细胞(通过基本方案C和D衍生)中I相酶、II相酶、药物转运蛋白和核受体的基因表达。
图10
先经5-氮杂-脱氧胞苷处理并随后暴露于视黄酸、坎帕罗酮和基质覆盖物的hESC和hiPSC衍生肝细胞样细胞(通过基本方案C和D衍生)中CYP酶的功能性表达。
图11
先经5-氮杂-脱氧胞苷处理并随后暴露于视黄酸、坎帕罗酮和基质覆盖物的hESC和hiPSC衍生肝细胞样细胞(通过基本方案C和D衍生)的形态和寿命。
图12
经如下处理的hESC和hiPSC衍生肝细胞样细胞(通过基本方案C和D衍生)中CYP酶的功能性表达比较：先进行和不进行5-氮杂-脱氧胞苷处理以及随后暴露于和不暴露于视黄酸、坎帕罗酮和基质覆盖物。
图13
在前内胚层化阶段(方案的第0天至第7天)进行和不进行5-氮杂-脱氧胞苷处理之hESC和hiPSC衍生的定形内胚层细胞(通过基本方案C和D衍生)的特征。
图14
由在前内胚层化阶段(方案的第0天至第7天)进行5-氮杂-脱氧胞苷处理之由27个不同hESC和hiPSC系衍生(分别通过基本方案C和D衍生)的定形内胚层细胞的特征。
图15
由在前内胚层化阶段(方案的第0天至第7天)进行和不进行5-氮杂-脱氧胞苷或5-氮杂胞苷处理之由3个hESC和hiPSC系衍生(分别通过基本方案C和D衍生)的定形内胚层细胞的特征。
图16
先经5-氮杂-脱氧胞苷处理并随后暴露于视黄酸、坎帕罗酮和基质覆盖物之冷藏人原代肝细胞以及hESC和hiPS衍生肝细胞样细胞(通过基本方案C和D衍生)中CYP酶表达的比较。
图17
先经5-氮杂-脱氧胞苷处理并随后暴露于一种或两种视黄酸应答性受体激活剂、坎帕罗酮和基质覆盖物之hiPSC衍生肝细胞样细胞(通过基本方案C和D衍生)中CYP酶的功能性表达。
图18
先经5-氮杂-脱氧胞苷处理并随后暴露于一种或两种视黄酸应答性受体激活剂、坎帕罗酮和基质覆盖物之hiPSC衍生肝细胞样细胞(通过基本方案C和D衍生)中CYP酶和核受体PXR的基因表达。
图19
先经5-氮杂-脱氧胞苷处理并随后暴露于视黄酸、坎帕罗酮和简单或更复杂基质覆盖物之hiPSC衍生肝细胞样细胞(通过基本方案C和D衍生)中CYP酶的功能性表达。
图20
先经5-氮杂-脱氧胞苷处理并随后暴露于坎帕罗酮、9顺式视黄酸或9顺式视黄酸类似物之hiPSC衍生肝细胞样细胞(通过基本方案D衍生)中CYP2C9酶的功能性表达。
图21
先经5-氮杂-脱氧胞苷处理并随后暴露于9顺式视黄酸、坎帕罗酮或坎帕罗酮类似物之hiPSC和hESC衍生肝细胞样细胞(通过基本方案C和D衍生)中CYP2C9酶和3A酶的功能性表达。
实施例
以下申请中公开了一般培养技术和传代技术的实例：WO2004/099394、WO2003/055992、WO/2007/042225、WO2007/140968和WO2011116930。
如以下实施例中所示出的，起始材料可包含任何的肝祖细胞类型，特别是通过从人多能干细胞向定型或胚外谱系初始分化而衍生的肝祖细胞类型。起始材料还可以是肝祖谱系的任何细胞。
实施例1：hPS细胞类型的维持
所有的hPS细胞(如上文所定义的)均可用作用于本发明的起始材料。在下文的实施例中，特别地，肝细胞样细胞在体外由建立在mEF饲养细胞上(Heins等2004)并且在无饲养条件下得以维持的未分化人胚胎干细胞(hESC)衍生而来。用于本实验的细胞系可以是，但不局限于SA167、SA181、SA461(CellatisAB，Sweden)，并且它们可以按照Heins等2004所述进行繁殖。这些细胞系列于NIH干细胞登记处、英国干细胞库(UKStemCellbank)和欧洲hESC登记处(EuropeanhESCregistry)中，并且可根据需要得到。
与获自hESC的hPS一起，还使用hiPS(人类诱导多能干)细胞来获得用于本发明实施例的肝细胞。
如下衍生用于本发明中的hiPSC系：将人真皮成纤维细胞(CRL2429，ATCC)在37℃下在空气中5％CO2的湿润气氛中维持在补充有10％胎牛血清、1×glutamax、5U/ml青霉素和5μg/ml链霉素的DMEM中。将成纤维细胞用编码小鼠Oct4、Sox2、Klf4和c-myc的重组慢病毒转导并培养5天。然后，将转导的细胞用胰蛋白酶分散并以5×103个细胞/cm2的密度接种到其正常生长培养基中丝裂霉素C处理的人真皮成纤维细胞饲养细胞上。24小时后，在37℃下、在空气中5％CO2的湿润气氛中，将培养基换成补充有20％knockout血清替代物、1×非必需氨基酸、1×glutamax、5U/ml青霉素、5μg/ml链霉素、100μM2-巯基乙醇和30ng/mlbFGF的knockoutDMEM。每日，将一半体积的培养基替换，并且在约30天后，出现iPS细胞的群落。挑选iPS群落、在DEF-CSTM中扩增并制备细胞库。随后，将成库细胞(bankedcell)表征以检测内源Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的表达、转基因的沉默、在体外分化成代表所有三个胚层之细胞类型的潜力，并通过STR作图和与亲代成纤维细胞系(ATCC)进行比较来确定其真实性。作为使用慢病毒进行重编程的替选方案，还可使用逆转录病毒、仙台病毒(Sendaivirus)、腺病毒、附加体质粒载体(episomalplasmidvector)、蛋白质和mRNA或其他技术来对hiPSC系细胞系进行重编程。适合使用的另一些细胞系是由Chung等(2008)所建立的那些，例如细胞系MA126、MA127、MA128和MA129(AdvancedCellTechnology，Inc.Worcester，MA，USA)，这些细胞系全部列于国际肝细胞注册表(Internationalstemcellregistry)中。这些细胞系已通过采用单卵裂球去除技术并不破坏人胚胎得到(或获得)。
实施例2：hPS细胞类型分化以产生肝细胞样细胞
肝细胞样细胞可通过采用以下示例性基本方案A、B、C和D由hPS细胞衍生而来：
方案A：
将未分化的hPS细胞解离并直接接种到新鲜制备的第0天培养基中。新鲜制备不同的培养基并在第0、1、2、3、4、5、7天进行添加，之后在前肝化(pre-hepatic)阶段以及分化和成熟阶段期间每2天或每3天添加。
第0天
RPMI1640(+0.1％PEST，+1％Glutamax)
1×B27
100ng/ml激活素A
1mMNaB
5μMROCK抑制剂
第1天
RPMI1640(+0.1％PEST，+1％Glutamax)
1×B27
100ng/ml激活素A
1mMNaB
第2天至第7天
RPMI1640(+0.1％PEST+1％Glutamax)
1×B27
100ng/ml激活素A
0.5mMNaB
在第7天，对细胞进行传代。将细胞与TrypLESelect一起在37℃下孵育3至7分钟、添加相同体积的VitroHES并将细胞悬液在200g至300g下离心5至6分钟。在此之后，将细胞以50000至350000个细胞/cm2例如100000至300000个细胞/cm2，优选150000个细胞/cm2的细胞密度重铺板到明胶基覆层上。
第7天至第14天(前肝化)
VitroHES
1％DMSO
第14天至第45天(分化和成熟)
WME+SQ(-GA1000)+1％Glutamax+0.1％PEST
0.1μMDexM
10ng/mlOsM
20ng/mlHGF
0.5％DMSO
1，4μM(2’Z，3’￡)-6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)
方案B：
将未分化的hPS细胞解离并直接接种到新鲜制备的第0天培养基中。新鲜制备不同的培养基并在第0、1、2、3、4、5、7天进行添加，之后在前肝化阶段以及分化和成熟阶段期间每2天或每3天添加。
第0天
RPMI1640(+0.1％PEST，+1％Glutamax)
1×B27
100ng/ml激活素A
1mMNaB
5μMROCK抑制剂
第1天
RPMI1640(+0.1％PEST，+1％Glutamax)
1×B27
100ng/ml激活素A
1mMNaB
3μMCHIR99021
第2天至第7天
RPMI1640(+0.1％PEST+1％Glutamax)
1×B27
100ng/ml激活素A
0，5mMNaB
在第7天，对细胞进行传代。将细胞与TrypLESelect一起在37℃下孵育3至7分钟、添加相同体积的VitroHES并将细胞悬液在200g至300g下离心5至6分钟。在此之后，将细胞以50000个至350000个细胞/cm2例如100000至300000个细胞/cm2，优选150000个细胞/cm2的细胞密度重铺到纤连蛋白基覆层上。有关第7天至第14天(前肝化)培养基和第14天至第45天(分化和成熟)培养基，参见方案A。
方案C：
将未分化的hPS细胞解离并直接接种到新鲜制备的第0天培养基中。新鲜制备不同的培养基并在第0、1、2、3、4、5、7天添加，之后在前肝化阶段以及分化和成熟阶段期间每2天或每3天添加。预处理培养基获自CellectisAB(ArvidWallgrensBacke20，41346Gothenburg，Sweden)。
第0天
预处理培养基
3μMCHIR99021
5μMROCK抑制剂
第1天
预处理培养基
3μMCHIR99021
第2天
RPMI1640(+0.1％PEST+1％Glutamax)
1×B27
50ng/ml激活素A
3μMCHIR99021
5μMLY294002
第3天
RPMI1640(+0.1％PEST+1％Glutamax)
1×B27
50ng/ml激活素A
5μMLY294002
第4天至第7天
RPMI1640(+0.1％PEST+1％Glutamax)
1×B27
50ng/ml激活素A
有关第7天传代、第7天至第14天(前肝化)培养基和第14天至第45天(分化和成熟)培养基，参见方案B。
方案D：
将未分化的hPS细胞解离并直接接种到新鲜制备的第0天培养基中。新鲜制备不同的培养基并在第0、1、2、3、4、5、7天添加，之后在前肝化阶段以及分化和成熟阶段期间每2天或每3天添加。预处理培养基获自CellectisAB(ArvidWallgrensBacke20，41346Gothenburg，Sweden)。
第0天
预处理培养基
3μMCHIR99021
5μMROCK抑制剂
第1天
RPMI1640(+0.1％PEST+1％Glutamax)
1×B27
50ng/ml激活素A
3μMCHIR99021
5μMLY294002
第2天
RPMI1640(+0.1％PEST+1％Glutamax)
1×B27
50ng/ml激活素A
5μMLY294002
第3天至第7天
RPMI1640(+0.1％PEST+1％Glutamax)
1×B27
50ng/ml激活素A
有关第7天传代、第7天至第14天(前肝化)培养基和第14天至第45天(分化和成熟)培养基，参见方案B。
实施例3：用9顺式视黄酸处理hESC衍生肝细胞样细胞对不同HNF4α同工型之表达的影响
步骤：
按照基本方案A，在该方案的第23天(即在分化和成熟的第9天)用1μM或2μM9顺式视黄酸处理在明胶基覆层上培养之由hES细胞衍生的肝细胞样细胞5小时、24小时或48小时，或者从第14天开始(即从分化或成熟阶段的第1天开始)及其后长期处理，在暴露后(图1A、B、C)或7天后(图C)立即进行分析。使用三种不同的HNF4α-TaqMan测定来分析HNF4α表达：一种测定检测全部9种HNF4α同工型、一种测定检测同工型1-3(包括成年同工型1和2)并且一种测定检测同工型4-9(包括胎儿同工型7和8)。同工型3、4、5、6和9体内根本不表达或以非常低的水平表达，因此可忽略不计。
结果：
A)5小时的RA暴露使成年HNF4a1-3同工型的表达强烈增加，但也使胎儿HNF4a4-9同工型的表达增加。24小时、48小时的暴露和持续RA处理使成年HNF4a1-3同工型略有增加，但使胎儿HNF4a4-9同工型略有降低，从而导致1-3同工型/4-9同工型的比例与hphep更相似，还参见图1B。
B)人原代肝细胞(hphep)具有高的成年HNF4a1-3同工型与胎儿HNF4a4-9同工型的比，而HepG2具有较低的比。24小时和48小时的RA暴露以及长期/持续处理使hESC衍生肝细胞之1-3/4-9比例增加至与hphep中相似的水平。5小时的暴露并未使1-3/4-9比增加，因为4-9同工型的表达也增加(参见图1A)。hphep：7批新鲜分离的hphpe的平均值。HepG2：2批的平均值。
C)用1μMRA暴露5小时使HNF4α同工型1-3的表达在暴露后立即增加(还参见A)，但是7天后，与未经处理的对照细胞相比，经RA处理的细胞中同工型1-3的表达略低。在暴露后，与对照细胞相比，经RA处理的细胞中同工型4-9的表达立即略低。在7天后，胎儿同工型的表达上升超过对照值。
因此，用于在第23天使HNF4a之成年同工型增加而使胎儿同工型最小增加或降低的最佳培养条件包括1μM或2μMRA的持续处理或者在第23天之24小时或48小时暴露，其对应于与原代人肝细胞(hphep)最接近的表达谱。期望产生具有未改变之表达谱的细胞的技术人员可替代地选择5小时的RA暴露。
实施例4：用9顺式视黄酸(RA)处理hESC衍生的肝祖细胞和肝细胞样细胞对CYP活性的影响
步骤：
按照基本方案A，在该方案的第21天、第22天或第23天(即在分化和成熟阶段的第7天、第8天或第9天；图2A、B、D)用1μM9顺式视黄酸处理在明胶基覆层上培养之分化中的hES细胞衍生肝祖细胞和肝细胞样细胞5小时、24小时或48小时；在该方案的第11天、第16天、第23天、第25天和第30天(即在前肝化阶段的第4天以及分化和成熟阶段的第2天、第9天、第11天和第16天；图2C)重复5小时暴露；或者从第14天(即，从分化和成熟阶段的第1天开始；图2D)开始及其后进行长期/持续处理。
在RA处理结束之后，立即根据以下方案对细胞培养物进行CYP活性测定：将细胞用温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)洗涤两次。然后，向细胞添加CYP活性测定物(例如220μl/24孔)，并在37℃下孵育16小时，所述CYP活性测定物由温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)、2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES、26μM非那西汀(针对CYP1A的模式底物)、9μM双氯芬酸(针对CYP2C9的模式底物)和3μM咪达唑仑(针对CYP3A的模式底物)组成。然后，收集上清液并在4℃下以10.000rcf离心20分钟。随后，将120μl上清液转移到96孔板中，并用紧密密封带密封，并储存在-20℃或-80℃直至对代谢物形成进行LC/MS分析：针对CYP1A的对乙酰氨基酚(Paracetamol)、针对CYP2C9的OH-双氯芬酸和针对CYP3A的OH-咪达唑仑。
结果：
A)在该方案第21天(即分化和成熟阶段的第7天)的5小时和24小时RA暴露后，可观察到hESC衍生肝细胞中的CYP1A和3A活性立即增加：CYP1A活性与培养48小时的原代肝细胞中的活性在相同水平上，而CYP3A活性大致是培养48小时之原代肝细胞的25％。与hESC衍生肝细胞相比，HepG2具有低得多的CYP1A和3A活性。在该方案的第23天，在hESC衍生肝细胞中检测不到CYP2C9活性。
B)在该方案第23天(即分化和成熟阶段的第9天)的单次5小时RA暴露后7天，与未经处理的细胞相比，hESC衍生肝细胞仍具有增加的CYP1A、2C9和3A活性。然而，在重复5次5小时暴露之后，CYP1A和2C9活性的增加更高(参见图2C)。
C)在该方案第11天、第16天、第23天、第25天和第30天(即在肝祖细胞步骤的第4天以及成熟步骤的第2天、第9天、第11天和第16天)的5次重复5小时RA脉冲导致在该方案的第31天CYP1A、2C9和3A活性显著增加。然而，在该方案的第24天，可观察到CYP1A活性增加，而CYP3A活性未增加(在该方案的第24天没有检测到CYP2C9活性)。因此，与单次5小时RA暴露相比，重复5小时RA暴露对CYP1A和2C9活性具有更强的增加作用(相比较于图2B)。
D)对5小时、24小时、48小时暴露和持续处理的比较显示：与5小时、24小时和48小时RA暴露相比，在持续RA处理下获得最强的CYP3A活性增加，而在24小时的RA暴露后，观察到最强的CYP1A活性增加。
在重复5小时暴露下，从第24天开始(即在分化和成熟阶段的第12天)观察到CYP2C9表达具有最强增加。因此，期望使特定CYP基因增加的技术人员可根据其目的基因而从这些脉冲条件选择。
实施例5：9顺式视黄酸(RA)处理诱导hESC衍生肝细胞样细胞的更成年的表型。
步骤：
按照基本方案A，在该方案的第21天(即在分化和成熟阶段的第7天)用1μM9顺式视黄酸处理在明胶基覆层上培养的hES细胞衍生肝细胞样细胞5小时，或者在该方案的第22天至第23天(即在分化和成熟阶段的第8天至第9天)处理24小时。
在该方案的第21天或第23天(即在分化和成熟阶段的第7天或第9天迈)，收获细胞，并用qRT-PCR分析基因表达，根据管家基因CREBBP进行归一化，将结果表示为根据校准物归一化的相对量化(图3)。
结果：
A)在第21天(即分化和成熟阶段的第7天)的5小时RA暴露后立即观察到成年肝基因CYP3A4的mRNA表达增加，以及在2和7天后(即分别在该方案的第23天和第30天)也观察到成年肝基因CYP3A4的mRNA表达增加。该方案第22天至第23(即在分化和成熟阶段的第8天至第9天)的24小时RA暴露也导致成年CYP3A4表达在第23天(即在分化和成熟阶段的第9天)立即上调。
B)第21天(即分化和成熟阶段的第7天)的5小时暴露使胎儿肝基因CYP3A7之表达在第21天暴露之后立即略有降低，但在2天后，即在该方案的第23天(即在分化和成熟阶段的第9天)，其强烈降低。类似地，该方案第22天至第23天(即分化和成熟阶段的第8天至第9天)的24小时RA暴露使胎儿肝基因CYP3A7之表达在该方案第23天(即在分化和成熟阶段的第9天)的暴露后立即强烈降低。
C)第21天(即分化和成熟阶段的第7天)的5小时暴露使成年肝基因PXR之mRNA表达在第23天(即在分化和成熟阶段的第9天)增加，但不是在第21天(即分化和成熟阶段的第7天)的5小时暴露后立即增加。
在方案的第22-23天(即分化和成熟阶段第8-9天)进行的24小时RA暴露也提高了成体肝基因PXR表达的mRNA表达。
D、E)持续/长期RA处理导致分别与第22天和第21天至第22天(分别在分化和成熟阶段的第8天和第7天至第8天)的5小时和24小时暴露相比，成年肝基因CAR(D)具有更高的mRNA表达增加，而胎儿肝基因甲胎蛋白(AFP，E)更强烈下调。
在这种情况下，可以看出，第21天(在肝祖细胞期末期)的RA暴露导致成年基因CYP3A4、CAR和PXR表达增加，但导致胎儿基因AFP和CYP3A7下降，因此表明获得更成熟且更成年表型。技术人员还可通过选择5小时脉冲、24小时脉冲或持续处理对该方法进行改进，如果该组中存在它们期望上调或下调的一个特定基因或基因组。
实施例6：用9顺式视黄酸(RA)、坎帕罗酮(K)和薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物(薄FC-覆盖物)处理hESC和hiPSEC-衍生肝细胞样细胞对CYP活性的影响。
步骤：
按照基本方案B，从该方案的第14天(即分化和成熟阶段的第1天)开始用持续/长期的0.2μM9顺式视黄酸和0.5μM坎帕罗酮处理在纤连蛋白基覆层上培养之分化中的hES细胞衍生祖细胞和hES细胞衍生的肝细胞样细胞，并在该方案的第14天和第16天(即在分化和成熟阶段的第1天和第3天)使其接受薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物，在此之后，在第23天、第30天、第37天等(即在分化和成熟阶段的第9天、第16天、第23天等)每周更新一次。此后，将薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物、RA和坎帕罗酮的这种组合成为“RA+基质覆盖物+坎帕罗酮”。
如下施加薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物：通过用0.02M乙酸稀释胶原蛋白I贮存液来制备3mg/ml大鼠尾胶原蛋白I溶液。将细胞培养基预先温热至室温并添加8μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝25μg胶原蛋白I/ml)和50μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝50μg纤连蛋白/ml)。从培养物中移除旧培养基并添加0.5ml含胶原蛋白I和纤连蛋白的培养基/cm2培养物表面(＝12.5μg胶原蛋白I/cm2和25μg纤连蛋白/cm2)。在每周一次更新覆盖物时，添加4μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝6.25μg/ml)和10μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝5μg/ml)。
为分析CYP酶的功能性表达，根据以下方案对细胞培养物进行CYP活性测定：将细胞用温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)洗涤两次。然后，向细胞添加CYP活性测定物(例如220μl/24孔)，并在37℃下孵育16小时，所述CYP活性测定物由温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)、2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES、26μM非那西汀(针对CYP1A的模式底物)、9μM双氯芬酸(针对CYP2C9的模式底物)和3μM咪达唑仑(针对CYP3A的模式底物)组成。然后，收集上清液并在4℃下以10.000rcf离心20分钟。随后，将120μl上清液转移到96孔板中，用紧密密封带密封，并且储存在-20℃或-80℃直至对代谢物形成进行LC/MS分析：针对CYP1A的对乙酰氨基酚(Paracetamol)、针对的CYP2C9的OH-双氯芬酸和针对CYP3A的OH-咪达唑仑。
结果：
本发明人已发现：不仅单独使用RA，用薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物、0.5μM坎帕罗酮和0.2μMRA(此后的“RA+基质覆盖物+坎帕罗酮”)持续/长期处理之组合(从第14天开始及其后，即从分化和成熟阶段的第1天开始)也可重复地使hESC衍生肝细胞(图4A、B)和hiPSC衍生肝细胞(图4C)中的CYP活性增加，并因此诱导更成年的肝细胞表型(与人原代肝细胞更相似)。
A)经0.2μMRA和0.5μM坎帕罗酮处理之hESC衍生肝细胞的持续处理(从第14天开始及其后)和施加薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物之组合是唯一在该方案的第36天(即在分化和成熟的第22天)已使CYP2C9-和3A-活性两者都增加的实验组。然而，一些单或双处理组也显示CYP2C9-和3A-活性增加，但没有一组同时具有高CYP2C9-和3A-活性。在单独覆盖物情况下。CYP1A活性最高。HepG2仅表现出CYP1A活性，而无2C9或3A活性。
B、C)用薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物、0.5μM坎帕罗酮和0.2μMRA的组合持续/长期处理(从第14天开始及其后)可重复地使hESC衍生肝细胞和hiPSC衍生肝细胞中的CYP1A、2C9和3A活性增加。
以下实施例中已对与成熟肝表型有关之不同CYP基因及其他标志物的表达水平进行了进一步检测，这些实施例为期望通过使用这种三元组合来改善成熟肝表型的那些人们提供了更详细的指导。
实施例7：肝细胞样细胞中肝I相酶和II相酶、药物转运蛋白和核受体的表达增加
步骤：
按照基本方案B(图5)，C(图6中的hESC衍生肝细胞)或D(图6中的hiPSC衍生肝细胞)，从该方案的第14天(即分化和成熟阶段的第1天)开始用0.2μM9顺式RA和0.5μM坎帕罗酮持续/长期处理在纤连蛋白基覆层上培养之分化中的hPS细胞衍生祖细胞和肝细胞样细胞，并在该方案的第14天和第16天(即在分化和成熟阶段的第1天和第3天)使其接受薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物，在此之后，在第23天、第30天、第37天等(即在分化和成熟阶段的第9天、第16天、第23天等)每周更新一次。
如下施加薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物：通过用0.02M乙酸稀释胶原蛋白I贮存液来制备3mg/ml大鼠尾胶原蛋白I溶液。将细胞培养基预先温热至室温并添加8μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝25μg胶原蛋白I/ml)和50μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝50μg纤连蛋白/ml)。从培养物中移除旧培养基并添加0.5ml包含胶原蛋白I和纤连蛋白的培养基/cm2培养物表面(＝12.5μg胶原蛋白I/cm2和25μg纤连蛋白/cm2)。在每周一次更新覆盖物时，添加4μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝6.25μg/ml)和10μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝5μg/ml)。
在该方案的第23天、第30天和第36天/第37天(即在分化和成熟阶段的第9天、第16天和第22天/23天)，收获细胞，并用qRT-PCR分析基因表达，根据管家基因CREBBP进行归一化，将结果表示为根据校准物归一化的相对量化(图5和6)。
结果：
图5和图6总结了一些实验的结果，其中使用几种hESC系(图5)或来自几种独立系的hESC和hiPSC(图6)来产生肝细胞样细胞。然后，使这些细胞暴露于视黄酸、坎帕罗酮和基质覆盖物的组合，之后通过QRT-PCR测定成熟肝细胞之多个标志物的mRNA表达，包括NTCP、GSTA1-1、CAR、CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4、CYP3A5、CYP1A2、CYP2D6。
图5A至F)在用RA、坎帕罗酮和基质覆盖物的组合处理之后，由三种不同hESC系(SA181、SA167和SA461；使用基本方案B)衍生的肝细胞样细胞在该方案的第23天、第30天和第37天(即分化和成熟阶段的第9天、第16天和第23天)在以下成年肝标志物的mRNA表达增加方面表现出相似趋势：NTCP、GSTA1-1、CAR、CYP2B6、CYP2C9和CYP3A4。
图6A至G)在用RA、坎帕罗酮和基质覆盖物的组合处理之后，由hESC和hiPSC两者衍生的肝细胞样细胞(分别使用基本方案C和D)在该方案的第29天和第36天(即分化和成熟阶段的第15天和第22天)在以下成年肝标志物的mRNA表达方面表现出相似增加：CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5、CAR、GSTA1-1、NTCP和CYP1A2。
坎帕罗酮、基质覆盖物和RA之组合表现出的协同作用超过单独RA暴露(参见例如图3A相对于图5F中的CYP3A4mRNA表达，或图4A中的CYP2C9和3A活性)。这种作用在几种独立的hESC系之间和在hiPS细胞系之间是一致的，如图6中的成对图像所示，图6对hESC和hiPS衍生肝细胞样细胞中多个基因的基因表达进行了比较。
因此，技术人员可从作为起始材料的多个多能干细胞系来源进行选择以实施本发明。技术人员还可采用图3、5和6中获得的结果以根据它们期望上调的标志物通过选择处理(单独RA暴露、或RA+基质覆盖物+GSK-3抑制剂或CDK抑制剂)和特定处理时间点来选择性地上调一个或更多个基因标志物。
实施例8：肝细胞样细胞中肝I相酶和II相酶、药物转运蛋白以及核受体有表达增加：预先暴露于DNA去甲基化剂
步骤：
按照基本方案C(hESC衍生肝细胞)或D(hiPSC衍生肝细胞)，在该方案的第2天至第3天，用10nMDNA去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理处于前内胚层化阶段的分化中hES和hiPS细胞24小时。
随后在该方案中，从该方案的第14天开始(即在分化和成熟阶段的第1天)，用0.2μM9顺式RA和0.5μM坎帕罗酮持续/长期处理在纤连蛋白基覆层上培养之hPS细胞衍生的肝祖细胞和肝细胞样细胞，并在该方案的第14天和第16天(即在分化和成熟阶段的第1天和第3天)使其接受薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物，在此之后，在第23天、第30天、第37天等(即在分化和成熟阶段的第9天、第16天、第23天等)每周更新一次。
如下施加薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物：通过用0.02M乙酸稀释胶原蛋白I贮存液来制备3mg/ml大鼠尾胶原蛋白I溶液。将细胞培养基预先温热至室温并添加8μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝25μg胶原蛋白I/ml)和50μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝50μg纤连蛋白/ml)。从培养物中移除旧培养基并添加0.5ml含胶原蛋白I和纤连蛋白的培养基/cm2培养物表面(＝12.5μg胶原蛋白I/cm2和25μg纤连蛋白/cm2)。在每周一次更新覆盖物时，添加4μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝6.25μg/ml)和10μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝5μg/ml)。
为了mRNA表达的分析(图9)，在该方案的第29天和第36天(即在分化和成熟阶段的第15天和第22天)收获细胞，并用qRT-PCR分析基因表达，根据管家基因CREBBP进行归一化，将结果表示为根据校准物归一化的相对量化。
在于第36天分析CYP酶的功能性表达时(即在成熟步骤的第22天；图10)，根据以下方案对细胞培养物进行CYP活性测定：将细胞用温的Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)洗涤两次。然后，向细胞添加CYP活性测定物(例如220μl/24孔)，并在37℃下孵育16小时，所述CYP活性测定物由温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)、2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES、26μM非那西汀(针对CYP1A的模式底物)、9μM双氯芬酸(针对CYP2C9的模式底物)和3μM咪达唑仑(针对CYP3A的模式底物)组成。然后，收集上清液并在4℃下以10.000rcf离心20分钟。随后，将120μl上清液转移到96孔板中，并用紧密密封带密封，之后储存在-20℃或-80℃，直至对代谢物形成进行LC/MS分析：针对CYP1A的对乙酰氨基酚(Paracetamol)、针对的CYP2C9的OH-双氯芬酸和针对CYP3A的OH-咪达唑仑。
结果：
图9A至G：当在前内胚层化阶段期间用去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理并在分化和成熟阶段期间用RA、坎帕罗酮和基质覆盖物之组合处理时，由hESC和hiPSC两者衍生的肝细胞样细胞均在该方案的第29天和第36天(在即分化和成熟阶段的第15天和第22天)在以下成年肝标志物的mRNA表达方面表现出相似的增加：CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5、CAR、GSTA1-1、NTCP和CYP1A2。
图10A、B：在分化和成熟阶段期间用RA、坎帕罗酮和基质覆盖物之组合处理可重复地使hESC衍生肝细胞和hiPSC衍生肝细胞中的CYP1A、2C9和3A活性增加，其中hESC衍生肝细胞和hiPSC衍生肝细胞衍生自在前内胚层化阶段期间经去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理的hPS细胞。
图11：细胞的相应形态可参见图11，图11示出了hESC和hiPSC衍生肝细胞样细胞的细胞形态，其中在前内胚层化阶段期间用DNA去甲基化剂处理分化中的hPS细胞，之后使获得的肝细胞样细胞暴露于与坎帕罗酮薄和RA组合的基质覆盖物。图像示出了在通过用DNA去甲基化剂、与坎帕罗酮和RA组合的基质覆盖物进行细胞处理获得的肝细胞样细胞中，在起始hPS细胞分化后，肝形态可维持长达并且超过42天，而未经处理的细胞开始相继死亡或者脱分化。
图12A、B：在此示出了对如下获得的hESC和hiPSC衍生肝细胞中CYP活性的比较：在该方案第2天至第3天进行或不进行去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理并且在分化和成熟阶段期间进行或不进行0.2μM9顺式RA和0.5μM坎帕罗酮的持续处理。对于CYP1A和3A活性两者而言，经全部4个因素处理(即5-氮杂-2-脱氧胞苷、基质覆盖物、坎帕罗酮和RA)的肝细胞样细胞获得最高数值，这表明这4个因素对CYP1A和3A活性具有协同作用，并且所有4个因素的组合处理诱导最成熟的肝表型。对CYP2C9活性未能观察到另外的增加，这归因于DNA去甲基化剂的处理。
在此看出，一般趋势是：hiPS和hESC衍生肝细胞两者均表现出成熟标志物表达的增加；其中处理开始时(第29天)产生较小的增加，但是到第36天产生较大的增加。例如，图9A示出了DNA去甲基化处理与随后RA+基质覆盖物+坎帕罗酮之组合提供了hESC和iPS衍生肝细胞样细胞两者中CYP2B6表达的增加，并且这种增加在第36天时比在第29天时更显著。可例如从NTCP的表达方面说明将早期的DNA去甲基化处理与随后的RA+基质覆盖物+坎帕罗酮组合的协同作用(参见图5A相对于图9F)，其中这种协同作用产生较高倍的NTCP表达。再次，技术人员可利用图9和10中所例示的结果来改善经处理细胞的整体肝表型或者上调一个或更多个所选择的基因标志物。
实施例9：由经去甲基化剂、视黄酸、坎帕罗酮和基质覆盖物处理之hESC和hiPSC衍生的肝细胞样细胞中的稳定CYP表达
步骤：
按照基本方案C(hESC衍生的肝细胞)或D(hiPSC衍生的肝细胞)，在该方案的第2天至第3天用10nMDNA去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理DE步骤中的细胞24小时。随后在该方案中，从该方案的第14天开始(即成熟步骤第1天)，用0.2μM9顺式RA和0.5μM坎帕罗酮持续/长期处理在纤连蛋白基覆层上培养之hPS细胞衍生的肝祖细胞和肝细胞样细胞，并在该方案的第14天和第16天(即在分化和成熟阶段的第1天和第3天)使其接受薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物，在此之后，在第23天、第30天、第37天等(即在分化和成熟阶段的第9天、第16天、第23天等)每周更新一次。
如下施加薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物：通过用0.02M乙酸稀释胶原蛋白I贮存液来制备3mg/ml大鼠尾胶原蛋白I溶液。将细胞培养基预先温热至室温并添加8μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝25μg胶原蛋白I/ml)和50μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝50μg纤连蛋白/ml)。从培养物中移除旧培养基并添加0.5ml含胶原蛋白I和纤连蛋白的培养基/cm2培养物表面(＝12.5μg胶原蛋白I/cm2和25μg纤连蛋白/cm2)。在每周一次更新覆盖物时，添加4μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝6.25μg/ml)和10μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝5μg/ml)。
对于mRNA表达的分析(图9)，在该方案的第22天、第29天和第36天(即在成熟阶段的第8天、第15天和第22天)收获hESC和hiPSC衍生肝细胞，以及平板接种后4小时或48小时的人原代肝细胞。用qRT-PCR分析基因表达，根据管家基因CREBBP进行归一化，将结果表示为根据校准物归一化的相对量化。
在于第22天、第29天和第36天(在成熟步骤的第8天、第15天和第22天)分析hESC和hiPSC衍生肝细胞中的CYP酶活性和于铺平板后4小时、24小时、48小时、72小时和96小时分析人原代肝细胞中的CYP酶活性时，根据以下方案对细胞培养物进行CYP活性测定：将细胞用温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)洗涤两次。然后，向细胞添加CYP活性测定物(例如220μl/24孔)，并在37℃下孵育16小时，所述CYP活性测定物由温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)、2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES、26μM非那西汀(针对CYP1A的模式底物)、9μM双氯芬酸(针对CYP2C9的模式底物)和3μM咪达唑仑(针对CYP3A的模式底物)组成。然后，收集上清液并在4℃下以10.000rcf离心20分钟。随后，将120μl上清液转移到96孔板中，并用紧密密封带密封，之后储存在-20℃或-80℃直至对代谢物形成进行LC/MS分析：针对CYP1A的对乙酰氨基酚(Paracetamol)、针对的CYP2C9的OH-双氯芬酸和针对CYP3A的OH-咪达唑仑。
结果：
本发明人还已对早期DNA去甲基化处理与随后RA+基质覆盖物+坎帕罗酮之组合的长期作用进行了研究以确定肝表型和肝标志物基因表达在长时间培养后是否得以维持。
图16A、B：与在培养时通常快速丧失CYP活性和mRNA表达的人原代肝细胞相反，如下获得的hESC和hiPSC衍生肝细胞样细胞表现出意外稳定的CYPA1、2C9和3A活性或者使CYPA1、2C9和3A活性水平提高(图16A-2)，并且几种CYP表现出稳定的mRNA表达或者使其mRNA表达提高(图16B)：在早期的内胚层发育期间用DNA去甲基化剂处理并在分化和成熟阶段期间暴露于视黄酸、坎帕罗酮和基质覆盖物。HepG2对很多成年肝基因具有非常低的表达或者不表达。因此，技术人员可采用这种处理技术并确保能够长期维持肝表型；如果它们将期望只产生一个或更多个特定标志物的长期表达的话，技术人员还可基于此并基于之前的实施例对处理程序进行进一步调整。
实施例10：验证经DNA去甲基化剂处理的hESC和hiPSC衍生DE具有改善的定形内胚层表型
步骤：
按照基本方案C(对于hESC和hiPSC衍生的肝细胞两者)，在前内胚层化阶段期间，在不同时间点用10nM5-氮杂-2-脱氧胞苷对细胞进行不同持续时间的处理，例如在该方案的第2天至第3天、第2天至第4天、第3天至第4天和第4天至第6天(hESC-DE：无5azadCn＝4、5azadC第2天至第3天n＝4、第3天至第4天n＝1、第2天至第4天n＝1、第4天至第6天n＝1；hiPSC-DE：无5azadCn＝5、5azadC第2天至第3天n＝5、第3天至第4天n＝2、第2天至第4天n＝1、第4天至第6天n＝1；其中n是单独实验的数目)。
对于mRNA表达的分析，在该方案的第7天收获hESC和hiPSC衍生的DE细胞，并用qRT-PCR分析基因表达，根据管家基因CREBBP进行归一化，将结果表示为根据校准物归一化的相对量化。
结果：
图13A：
与未经处理的对照DE相比，由经在第2天至第3天(图13A2)之10nM5-氮杂-2-脱氧胞苷处理的hESC衍生的DE较均质并且具有更显著的细胞-细胞接触(图13A1)。注意到对照DE中存在未分化的细胞(图13A1)，这与对照DE中具有较高的Oct4表达和NanogmRNA表达相一致(比较图13D)。当在第2天至第4天、第3天至第4天和第4天至第6天处理细胞和用100nM5-氮杂-2-脱氧胞苷处理细胞时获得相似的结果。1nM5-氮杂-2-脱氧胞苷具有较小的作用(数据未示出)。
图13B
与对照DE相比，由经在第2天至第3天之10nM5-氮杂-2-脱氧胞苷处理的hiPSC衍生DE(图13B2)具有较高的汇合度(moreconfluent)并且具有更显著的细胞-细胞接触(图13B1)。当在第2天至第4天、第3天至第4天和第4天至第6天用100nM5-氮杂-2-脱氧胞苷处理细胞时获得相似的结果。1nM5-氮杂-2-脱氧胞苷处理具有较小的作用(数据未示出)。
图13C
与未经处理的对照相比，经在第2天至第3天之10nM5-氮杂-2-脱氧胞苷处理的hiPSC衍生DE在第7天具有少得多的Oct4-免疫阳性细胞，即较不分化的细胞得以留下，并且在用去甲基化剂处理之后DE更均质。
图13D
与未经处理的对照相比，在经在第2至3天、第3天至第4天、第2至4天和第4至第6天用10μM5azadC处理的hESC和hiPSC衍生DE中干细胞标志物Oct4的表达低得多(图13D1)。在经5azadC处理的hESC衍生DE中，干细胞标志物Nanog的mRNA表达强烈降低，而在hiPSC衍生DE中，其基本上保持不受影响(图13D1)。与未经处理的对照相比，在经5azadC处理的hESC和hiPSC衍生DE中，DE标志物Sox17、Cxcr4、FoxA2和hHex的表达上调，而hESC衍生DE中的这种作用比hiPSC衍生DE中强(图13D3-6)。胚外标志物Sox7的表达在对照以及经5azadC处理的hESC和hiPSC衍生DE两者中均非常低，除使Sox7mRNA水平增加的第2天至第4天和第4天至第6天的5azadC处理之外。
总而言之，在前内胚层化阶段期间用DNA去甲基化剂处理细胞导致hESC和hiPSC衍生细胞两者中DE形态改善和DE细胞产量提高(图13A-B)。此外，其导致干细胞标志物Oct4更强烈地减少，如通过免疫细胞化学所检测到的(图13C)；导致充分限定的DE标志物SOX17、CXCR4、HEX、Foxa2的表达提高并导致胚外内胚层标志物Sox7以及干性标志物Oct4和Nanog减少(图13D)。因此，期望产生较均质的定形内胚层细胞群的技术人员可从一种或更多种DNA去甲基化剂进行选择并使用它们，例如在多能肝细胞类型分化期间的第2天至第3天或第3天至第4天使用它们。
实施例11：当在DE分化期间用DNA去甲基化剂进行处理后由27个hPSC系的组衍生得到高度均质的定形内胚层
步骤：
按照基本方案C或D，在前内胚层化阶段期间在第2天至第3天用10nM5-氮杂-2-脱氧胞苷处理由27个hPSC系衍生的细胞(方案C：ChiPSC14、ChiPSC19、ChiPSC22、P11015、SA167、SA181、SA461和Va19；方案D：ChiPSC4、ChiPSC6b、ChiPSC7、ChiPSC8、ChiPSC9、ChiPSC10、ChiPSC11、ChiPSC13、ChiPSC15、ChiPSC17、ChiPSC18、ChiPSC19、ChiPSC20、ChiPSC21、ChiPSC23、ChiPSC24、P11012、P11021、P11025和SA121)。
将27个hPSC系中的23个用方案C和D两者进行测试。在这23个系中，只有4个细胞系(ChiPSC14、ChiPSC23、P11015和P11032)仅在两个方案之一的情况下可分化。将4个hPSC系(ChiPSC8、ChiPSC9、ChiPSC10和ChiPSC11)只用方案D进行测试。
对于mRNA表达的分析，在该方案的第7天收获hPSC和hiPSC衍生的DE细胞，并用qRT-PCR分析基因表达，根据管家基因CREBBP进行归一化，将结果表示为根据校准物归一化的相对量化。
结果：
图14A至D
通过使用基本方案C或D，与未分化的hESC(SA181)和hiPSC(ChiPSC4)相比，来自27个不同hPSC系的未分化干细胞可分化成高度均质的DE，这些DE对干细胞标志物Oct-4和Nanog表现出低mRNA表达水平(图14A、B)而对DE标志物Sox17和Cxcr4表现出高水平(图14C、D)，所述基本方案C或D包括在前内胚层化阶段期间在第2天至第3天的DNA去甲基化剂处理。
总而言之，在前内胚层化阶段期间用DNA去甲基化剂处理细胞允许从所有的测试hPSC系衍生得到均质的DE，这些DE对干细胞标志物具有低表达水平的，而对DE标志物具有高表达水平。均质DE的得到对衍生均质的肝细胞培养物是关键的，因为它们可由所有的测试系获得(数据未示出)。
因此，期望由任何给定hPSC系产生均质定形内胚层细胞(和肝细胞)群的技术人员可包括用DNA去甲基化剂进行处理，例如在前内胚层化阶段期间的第2天至第3天。
实施例12：DNA去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷和5-氮杂胞苷两者均改善hESC和hiPSC衍生DE中的定形内胚层表型
步骤：
按照基本方案C(P11032、SA181)或D(P11012)，在前内胚层化阶段期间在第2天至第3天用10nM5-氮杂-2-脱氧胞苷或1μM5-氮杂胞苷处理由3个不同hPSC系衍生的细胞。
对于mRNA表达的分析，在该方案的第7天收获hESC和hiPSC衍生的DE细胞，并用qRT-PCR分析基因表达，根据管家基因CREBBP进行归一化，将结果表示为根据校准物归一化的相对量化。
结果：
图15：
A、B)在不进行去甲基化剂处理的情况下，三种hPSC系P11032、SA181和P11012产生均质的DE，这些DE对干细胞标志物Oct4和Nanog具有相对高的mRNA表达(图15A、B)。用DNA去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5azadC)和5-氮杂胞苷(5azaC)进行处理使Oct4和Nanog的mRNA显著降低(图15A、B)，并因此允许由这3个hPSC系衍生均质的DE群。
C、D)当用10nM5-氮杂-2-脱氧胞苷或1μM5-氮杂胞苷进行处理时，对DE标志物Sox17和Cxcr4的mRNA表达未能观察到显著变化(15C、D)。
总而言之，用DNA去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5azadC)和5-氮杂胞苷(5azaC)两者进行处理允许从hPSC系衍生均质DE，或者如果不进行处理的话得到异质DE。
因此，期望产生均质定型内胚层细胞群的技术人员可从一种或更多种DNA去甲基化剂选择并使用它们，例如在多能干细胞类型分化期间的第2天至第3天使用它们。
实施例13：由经去甲基化剂、两种视黄酸应答性受体激活剂、坎帕罗酮和基质覆盖物处理之hESC和hiPSC衍生的肝细胞样细胞具有进一步改善的功能性
步骤：
按照基本方案D(hiPSC衍生的肝细胞)，在该方案的第2天至第3天，用10nMDNA去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理处于前内胚层化阶段的分化中hES细胞24小时。随后在该方案中，从该方案的第14天开始(即分化和成熟阶段的第1天)，用0.2μM9顺式RA和0.5μM坎帕罗酮持续/长期处理在纤连蛋白基覆层上培养之hPS细胞衍生的肝祖细胞和肝细胞样细胞，并在该方案的第14天和第16天(即在分化和成熟阶段的第1天和第3天)使其接受薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物，在此之后，在第23天、第30天、第37天等(即在分化和成熟阶段的第9天、第16天、第23天等)每周更新一次。除所述处理之外，使一组从该方案的第21天(即分化和成熟阶段的第7天)开始接受0.2μM13顺式RA。
如下施加薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物：通过用0.02M乙酸稀释胶原蛋白I贮存液来制备3mg/ml大鼠尾胶原蛋白I溶液。将细胞培养基预先温热至室温并添加8μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝25μg胶原蛋白I/ml)和50μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝50μg纤连蛋白/ml)。从培养物中移除旧培养基并添加0.5ml包含胶原蛋白I和纤连蛋白的培养基/cm2培养物表面(＝12.5μg胶原蛋白I/cm2和25μg纤连蛋白/cm2)。在每周一次更新覆盖物时，添加4μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝6.25μg/ml)和10μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝5μg/ml)。
对于mRNA表达的分析，在该方案的第36天(即在分化和成熟阶段的第22天)收获hESC和hiPSC衍生的肝细胞，并在铺平板后48小时收获人原代肝细胞。用qRT-PCR分析基因表达，根据管家基因CREBBP进行归一化，将结果表示为根据校准物归一化的相对量化。
在于第36天(即在分化和成熟阶段的第22天)分析hiPSC衍生肝细胞和铺板48小时后的HepG2和人原代肝细胞中CYP酶的活性时，根据以下方案对细胞培养物进行CYP活性测定：将细胞用温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)洗涤两次。然后，向细胞添加CYP活性测定物(例如220μl/24孔)，并在37℃下孵育16小时，所述CYP活性测定物由温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)、2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES、10μM非那西汀(针对CYP1A的模式底物)、10μM丁氨苯丙酮(针对CYP2B6的模式底物)、10μM双氯芬酸(针对CYP2C9的模式底物)、10μM丁呋洛尔(针对CYP2D6的模式底物)和5μM咪达唑仑(针对CYP3A的模式底物)组成。然后，收集上清液并在4℃下以10.000rcf离心20分钟。随后，将120μl上清液收集并在4℃下以10.000rcf离心20分钟。随后，将120μl上清液转移到96孔板中，并用紧密密封带密封，之后储存在-20℃或-80℃，直至对代谢物形成进行LC/MS分析：针对CYPlA的对乙酰氨基酚(Paracetamol)、针对CYP2B6的OH-丁氨苯丙酮、针对CYP2C9的OH-双氯芬酸、针对CYP2D6的OH-丁呋洛尔和针对CYP3A的OH-咪达唑仑。
结果：
除早期的DNA去甲基化处理和随后的RA+基质覆盖物+坎帕罗酮处理之外，本发明人还已对另外的视黄酸应答性受体激活剂的处理作用进行了研究以确定这是否可进一步改善肝细胞成熟。
图17A至E：
如下获得的hiPSC衍生肝细胞样细胞在用13顺式RA进行处理后表现出进一步增加的CYP1A、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A活性：在内胚层发育早期用DNA去甲基化剂处理，并在分化和成熟阶段期间暴露于9顺式RA、坎帕罗酮和基质覆盖物。
图18A至E：
如下获得的hiPSC衍生肝细胞样细胞表现出对CYP2C9、CYP3A4、CYP3A5和PXR的最高mRNA表达水平：在内胚层发育早期用DNA去甲基化剂处理，并在分化和成熟阶段期间暴露于9顺式RA、坎帕罗酮和基质覆盖物以及另外的视黄酸应答性受体激活剂13顺式RA。
在13顺式RA处理组中，可发现，相比较于CYP2B6的活性增加、(图17B)，CYP2B6的mRNA表达降低(图18A)。
因此，技术人员可采用用一种以上视黄酸应答性受体激活剂进行处理，例如用两种、三种、四种或更多种激活剂进行处理，以获得具有最成熟特征的肝细胞样细胞。
实施例14：由经去甲基化剂、视黄酸、坎帕罗酮和更复杂基质覆盖物处理之hESC和hiPSC衍生的肝细胞样细胞具有改善的功能性
步骤：
按照基本方案C(hESC衍生的肝细胞)和D(hiPSC衍生的肝细胞)，在该方案的第2天至第3天，用10nMDNA去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理处于前内胚层化阶段的细胞24小时。随后在该方案中，从该方案的第14天开始(即在分化和成熟阶段的第1天)，用0.2μM9顺式RA和0.5μM坎帕罗酮的持续/长期处理hPS细胞衍生的肝祖细胞和由hPS细胞衍生的肝细胞样细胞，并在该方案的第14天和第16天(即在分化和成熟阶段的第1天和第3天)使其接受薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物，在此之后，在第23天、第30天、第37天等(即在分化和成熟阶段的第9天、第16天、第23天等)每周更新一次。
使一个实验组培养在由纤连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、层粘连蛋白、巢蛋白/内功素(Entactin)和双糖链蛋白聚糖组成的肝基质样覆层上，并接受由纤连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、层粘连蛋白、巢蛋白/内功素和双糖链蛋白聚糖组成的薄肝基质样覆盖物。
使另一实验组生长在由纤连蛋白、胶原蛋白I和人细胞外基质制备物(包括胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、生腱蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖)组成的纤连蛋白-胶原蛋白I-基底层混合覆盖物，并接受由纤连蛋白、胶原蛋白I和人细胞外基质制备物(包括胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、生腱蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖)组成的薄纤连蛋白-胶原蛋白I基底层混合覆盖物。
使对照组生长在标准纤连蛋白基覆层上并在该方案的第14天和第16天(即在分化和成熟其的第1天和第3天)接受薄-纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物，在此之后，在第23天、第30天、第37天等(即在分化和成熟阶段的第9天、第16天、第23天等)每周更新一次。
如下施加薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物：通过用0.02M乙酸稀释胶原蛋白I贮存液来制备3mg/ml大鼠尾胶原蛋白I溶液。将细胞培养基预先温热至室温并添加8μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝25μg胶原蛋白I/ml)和50μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝50μg纤连蛋白/ml)。从培养物中移除旧培养基并添加0.5ml包含胶原蛋白I和纤连蛋白的培养基/cm2培养物表面(＝12.5μg胶原蛋白I/cm2和25μg纤连蛋白/cm2)。在每周一次更新覆盖物时，添加4μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝6.25μg/ml)和10μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝5μg/ml)。
对于薄肝基质样覆盖物，添加8μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝25μg胶原蛋白I/ml)、50μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝50μg纤连蛋白/ml)、1.2μl0.5mg/ml胶原蛋白IV溶液/ml培养基(＝0.6μg/ml)、6μl100μg/ml巢蛋白/内功素溶液/ml培养基(＝0.6μg/ml)、6μl100μg/ml层粘连蛋白1溶液/ml培养基(＝0.6μg/ml)和6μl200μg/ml双糖链蛋白聚糖溶液/ml培养基(＝1.2μg/ml)。对于薄纤连蛋白-胶原蛋白I-基底层-覆盖物，添加8μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝25μg胶原蛋白I/ml)、50μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝50μg纤连蛋白/ml)和6μl1mg/ml人细胞外基质制备物/ml培养基(＝6μg/ml)。合适的人细胞外基质制备物的一个实例是Sigma-Aldrich的MaxGelTM。
在第36天(即在分化和成熟阶段的第22天)分析hESC和hiPSC衍生肝细胞中的CYP酶活性和于铺板后48小时分析HepG2和人原代肝细胞中的CYP酶活性时，根据以下方案对细胞培养物进行CYP活性测定：将细胞用温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)洗涤两次。然后，向细胞添加CYP活性测定物(例如220μl/24孔)，并在37℃下孵育16小时，所述CYP活性测定物由温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)、2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES、10μM非那西汀(针对CYP1A的模式底物)、10μM丁氨苯丙酮(Buprotpion)(针对CYP2B6的模式底物)、10μM双氯芬酸(针对CYP2C9的模式底物)、101μM丁呋洛尔(针对CYP2D6的模式底物)和5μM咪达唑仑(针对CYP3A的模式底物)组成。然后，收集上清液并在4℃下以10.000rcf离心20分钟。随后，将120μl上清液转移到96孔板中，并用紧密密封带密封，之后储存在-20℃或-80℃，直至对代谢物形成进行LC/MS分析：针对CYP1A的对乙酰氨基酚(Paracetamol)、针对CYP2B6的OH-丁氨苯丙酮、针对CYP2C9的OH-双氯芬酸、针对CYP2D6的OH-丁呋洛尔和针对CYP3A的OH-咪达唑仑。
结果：
除早期的DNA去甲基化处理以及随后的视黄酸和坎帕罗酮处理之外，本发明人还已研究了用更复杂的ECM样覆层和覆盖物进行处理的作用，以确定与对照组的标准纤连蛋白基覆层和薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物相比这样是否可进一步改善肝细胞成熟。
图19A至C
当与对照组的标准纤连蛋白基覆层和薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物相比，覆层和覆盖物两者都更复杂并且更类似于ECM时，如下获得的hESC和hiPSC衍生肝细胞样细胞表现出更高的CYP2C9和CYP3A活性：在内胚层发育早期用DNA去甲基化剂进行处理，并在分化和成熟阶段期间暴露于视黄酸、坎帕罗酮和基质覆盖物。
因此，技术人员可采用用类似于肝基质的更复杂覆层和覆盖物进行处理以获得具有最成熟特征的肝细胞样细胞。
实施例15：由经去甲基化剂、坎帕罗酮和9顺式视黄酸或9顺式视黄酸类似物处理之hiPSC衍生的肝细胞样细胞具有改善的功能性
步骤：
按照基本方案D，在该方案的第2天至第3天用10nMDNA去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理处于前内胚层化阶段的细胞24小时。
随后在该方案中，从该方案的第14天开始(即在分化和成熟阶段的第1天)，用0.2μM9顺式RA和0.5μM坎帕罗酮的持续/长期处理hPS细胞衍生的肝祖细胞和由hPS细胞衍生的肝细胞样细胞，并在该方案的第14天和第16天(即在分化和成熟阶段的第1天和第3天)使其接受薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物，在此之后，在第23天、第30天、第37天等(即在分化和成熟阶段的第9天、第16天、第23天等)每周更新一次。
将一些试验组用0.5μM的全反式视黄酸(alltrans-retinoicacid，ATRA)、5μMAM580、0.2μM13顺式RA、5μMLGD1069、5μMLG100268或5μMSR11237代替0.2μM9顺式RA进行处理。
如下施加薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物：通过用0.02M乙酸稀释胶原蛋白I贮存液来制备3mg/ml大鼠尾胶原蛋白I溶液。将细胞培养基预先温热至室温并添加8μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝25μg胶原蛋白I/ml)和50μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝50μg纤连蛋白/ml)。从培养物中移除旧培养基并添加0.5ml包含胶原蛋白I和纤连蛋白的培养基/cm2培养物表面(＝12.5μg胶原蛋白I/cm2和25μg纤连蛋白/cm2)。在每周一次更新覆盖物时，添加4μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝6.25μg/ml)和10μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝5μg/ml)。
在于第36天(即分化和成熟阶段的第22天)分析hESC衍生肝细胞中的CYP酶活性时，根据以下方案对细胞培养物进行CYP活性测定：将细胞用温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)洗涤两次。然后，向细胞添加CYP活性测定物(例如220μl/24孔)，并在37℃下孵育16小时，所述CYP活性测定物由温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)、2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES、10μM非那西汀(针对CYP1A的模式底物)、10μM丁氨苯丙酮(针对CYP2B6的模式底物)、10μM双氯芬酸(针对CYP2C9的模式底物)、10μM丁呋洛尔(Bufuralol)(针对CYP2D6的模式底物)和5μM咪达唑仑(针对CYP3A的模式底物)组成。然后，收集上清液并在4℃下以10.000rcf离心20分钟。随后，将120μl上清液转移到96孔板中，并用紧密密封带密封，之后储存在-20℃或-80℃，直至对代谢物形成进行LC/MS分析：针对CYP1A的对乙酰氨基酚(Paracetamol)、针对CYP2B6的丁氨苯丙酮、针对的CYP2C9的OH-双氯芬酸、针对CYP2D6的丁呋洛尔和针对CYP3A的OH-咪达唑仑。
结果：
本发明人已研究了除9顺式RA之外的其他RXR-和RAR-激动剂是否可诱导具有改善的功能性的hiPSC衍生肝细胞。
图20：
13顺式RA处理使CYP2C9活性增加至与用9顺式RA处理后相似的水平，而SR11237、ATRA、AM580、LGD1069和LG100268处理导致略少的增加(图20)。
因此，技术人员可使用除9顺式RA之外的其他RXR-和RAR-激动剂(例如13顺式RA、ATRA、AM580、LGD1069、LG100268和SR11237)来获得更成熟的肝细胞样细胞。
实施例16：由经去甲基化剂、9顺式视黄酸和坎帕罗酮或坎帕罗酮类似物处理之由hESC和hiPSC衍生的肝细胞样细胞具有改善的功能性
步骤：
按照基本方案C(hESC衍生的肝细胞)和D(hiPSC衍生的肝细胞)，在该方案的第2天至第3天，用10nMDNA去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理处于前内胚层化阶段的细胞24小时。随后在该方案中，从该方案的第14天开始(即在分化和成熟阶段的第1天)，用0.2μM9顺式RA和0.5μM坎帕罗酮的持续/长期处理hPS细胞衍生的肝祖细胞和由hPS细胞衍生的肝细胞样细胞，并在该方案的第14天和第16天(即在分化和成熟阶段的第1天和第3天)使其接受薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物，在此之后，在第23天、第30天、第37天等(即在分化和成熟阶段的第9天、第16天、第23天等)每周一次更新。
将一个实验组用0.5μM靛玉红-3-肟代替0.5μM坎帕罗酮进行处理。
如下施加薄纤连蛋白-胶原蛋白I-覆盖物：通过用0.02M乙酸稀释胶原蛋白I贮存液来制备3mg/ml大鼠尾胶原蛋白I溶液。将细胞培养基预先温至室温并添加8μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝25μg胶原蛋白I/ml)和50μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝50μg纤连蛋白/ml)。从培养物中移除旧培养基并添加0.5ml包含胶原蛋白I和纤连蛋白的培养基/cm2培养物表面(＝12.5μg胶原蛋白I/cm2和25μg纤连蛋白/cm2)。在每周一次更新覆盖物时，添加4μl3mg/ml胶原蛋白I溶液/ml培养基(＝6.25μg/ml)和10μl1mg/ml纤连蛋白溶液/ml培养基(＝5μg/ml)。
在于第36天(即分化和成熟阶段的第22天)分析hESC和hiPSC衍生肝细胞中的CYP酶活性时，根据以下方案对细胞培养物进行CYP活性测定：将细胞用温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)洗涤两次。然后，向细胞添加CYP活性测定物(例如220μl/24孔)，并在37℃下孵育16小时，所述CYP活性测定物由温Williams培养基Ew/o酚红(+0.1％PEST)、2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES、10μM非那西汀(针对CYP1A的模式底物)、10μM丁氨苯丙酮(针对CYP2B6的模式底物)、10μM双氯芬酸(针对CYP2C9的模式底物)、10μM丁呋洛尔(针对CYP2D6的模式底物)和5μM咪达唑仑(针对CYP3A的模式底物)组成。然后，收集上清液并在4℃下以10.000rcf离心20分钟。随后，将120μl上清液转移到96孔板中，并用紧密密封带密封，之后储存在-20℃或-80℃直至对代谢物形成进行LC/MS分析：针对CYP1A的对乙酰氨基酚(Paracetamol)、针对CYP2B6的丁氨苯丙酮、针对的CYP2C9的OH-双氯芬酸、针对CYP2D6的丁呋洛尔和针对CYP3A的OH-咪达唑仑。
结果：
本发明人已研究了除坎帕罗酮之外的其他CDK抑制剂和GSK3抑制剂是否可诱导具有改善的功能性的hiPSC衍生肝细胞。
图21：
在hiPSC衍生肝细胞(图21A1、A2)和hESC衍生肝细胞(图21B1、B2)两者中，靛玉红-3-肟处理使CYP2C9和3A活性增加至与用坎帕罗酮处理时相似的水平。
因此，技术人员可使用除坎帕罗酮之外的其他CDK抑制剂和GSK-3抑制剂来获得更成熟的肝细胞样细胞。
参考文献
Allenby，G.etal(1993)RetinoicacidreceptorsandretinoidXreceptors：Interactionswithendogenousretinoicacids.PNASBiochemistry，90：30-34
Brolen，G.etal.(2010)Hepatocyte-likecellsderivedfromhumanembryonicstemcellsspecificallyviadefinitiveendodermandaprogenitorstage.JBiotechnol.1；145(3)：284-94
Chen，Y.F.etal.(2012)Rapidgenerationofmaturehepatocyte-likecellsfromhumaninducedpluripotentstemcellsbyanefficientthree-stepprotocol.Hepatology.201255(4)：1193-203
Chung，Y.etal.(2008)HumanEmbryonicStemCellLinesGeneratedwithoutEmbryoDestructiondol：10.1016/j.stem.2007.12.013
Duan，Y.etal.Differentiationandcharacterizationofmetabolicallyfunctioninghepatocytesfromhumanembryonicstemcells.StemCells.28(4)：674-86
Dunn，Jetal.(1991)Long-terminVitrofunctionofadulthepatocytesinacollagensandwichconfiguration.Biotechnol.Prog.7：237-245
Funakoshi，N.etal.(2011)Comparisonofhepatic-likecellproductionfromhumanembryonicstemcellsandadultliverprogenitorcells：CARtransductionactivatesabatteryofdetoxificationgenes.StemCellRev.7(3)：518-31
Hatzis，P.etal(2001)RegulatoryMechanismsControllingHumanHepatocyteNuclearFactor4αGeneExpression.Mol.Cell.Biol.Nov2001：7320-7330
Hay，D.etal(2007)Directdifferentiationofhumanembryonicstemcellstohepatocyte-likecellsexhibitingfunctionalactivities.CloningStemCells.2007Spring；9(1)：51-62.Erratumin：CloningStemCells.2009Mar；11(1)：209.
Hay，D.etal(2008)Efficientdifferentiationofhepatocytesfromhumanembryonicstemcellsexhibitingmarkersrecapitulatingliverdevelopmentinvivo.StemCells.Apr；26(4)：894-902.
Heins，N.etal(2004)Derivation，characterization，anddifferentiationofhumanembryonicstemcells.StemCells.22(3)：367-76.
Heyman，RA.etal.(1992)9-cisretinoicacidisahighaffinityligandfortheretinoidXreceptor.Cell.199268(2)：397-406.
Idres，N.etal(2002)Activationofretinoicacidreceptor-dependenttranscriptionbyall-trans-retinoicacidmetabolitesandisomers.JBiolChem.277(35)：31491-8.
Klimanskaya，I.etal(2006)Humanembryonicstemcelllinesderivedfromsingleblastomeres.Nature，Nov23；444(7118)：481-5.Epub2006Aug23.Erratumin：Nature.2006Nov23；444(7118)：512.Nature.2007Mar15；446(7133)：342.
Magee，T.etal(1998)RetinoicAcidMediatesDown-regulationoftheα-FetoproteinGenethroughDecreasedExpressionofHepatocyteNuclearFactors.J.Bio.Chem.273，45：30024-30032
MartinM.etal(2005)Humanembryonicstemcellsexpressanimmunogenicnonhumansialicacid.NatMed.Feb；11(2)：228-32.
Mfopou，J.etal.(2010)Noggin，Retinoids，andFibroblastGrowthFactorRegulateHepaticorPancreaticFateofHumanEmbryonicStemCells.Gastroenterology138：2233-2245.
Mercader，A.etal(2009)HumanEmbryoCulture.EssentialStemCellMethods，Chapter16，AcademicPress，1stEdition.Eds.Lanza.R.andKlimanskaya，I.
Page，Jetal.(2007)Geneexpressionprofilingofextracellularmatrixasaneffectorofhumanhepatocytephenotypeinprimarycellculture.ToxScl.97(2)：384-397
Qian，A.etal.(2000)identificationofRetnoicAcid-ResponsiveElementsontheHNF1αandHNF4αGenes.Biochem.Biophys.Res.Comm.276：837-842
Si-Tayeb，K.etal.(2010)Highlyefficientgenerationofhumanhepatocyte-likecellsfrominducedpluripotentstemcellsHepatology51(1)：297-305.
Song.Z.etal.(2009)Efficientgenerationofhepatocyte-likecellsfromhumaninducedpluripotentstemcells.CellRes.19(11)：1233-42
Sullivan，G.J.etal.(2010)Generationoffunctionalhumanhepaticendodermfromhumaninducedpluripotentstemcells.Hepatology.51(1)：329-35.
Takahashi，K.etal(2007)Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.CellNov30；131(5)：861-72.
Thomson，J.etal.(1998)Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.Science.Nov6；282(5391)：1145-7.Erratumin：Science1998Dec4；282(5395)：1827.
Touboul，T.etal.(2010)GenerationofFunctionalHepatocytesfromHumanEmbryonicStemCellsUnderChemicallyDefinedConditionsthatRecapituateLiverDevelopment.Hepatology51：1754-1765
Turner，R.etal.(2011)Humanhepaticstemcellandmaturationalliverlineagebiology.Hepatology.53(3)：1035-45
Wang，Y.etal.(2011)Lineagerestrictionofhumarhepaticstemcellstomaturefatesismadeefficientbytissue-specificbiomatrixscaffolds.Hepatology.53(1)：293-305.
Yu，J.andThomson，J.(2009)InducedPuripotentStemCellDerivation.EssentialsofStemCellBiology，Chapter37，AcademicPress，2ndEdition(2009)，Eds.Lanza，R.etal.
ZhouH.etal(2009).Generationofinducedpluripotentstemcellsusingrecombinantproteins，CellStemCell.4(5)：381-4.

Claims (88)

1.一种用于促进人肝细胞样细胞成熟的方法，所述方法包括：
使所述人肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括在分化条件下培养人肝祖细胞以获得所述肝细胞样细胞。
3.一种用于产生人肝细胞样细胞的方法，所述方法包括：
在分化条件下培养人肝祖细胞以获得肝细胞样细胞，并且
使所述肝细胞样细胞暴露于视黄酸应答性受体的激活剂。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中在分化条件下培养人肝祖细胞以获得所述肝细胞样细胞的所述步骤开始后t≥7天的时间时进行所述肝细胞样细胞对视黄酸应答性受体的激活剂的暴露。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其还包括在分化条件下初始培养人多能干(hPS)细胞以获得所述肝祖细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述初始培养hPS细胞的步骤包括在分化条件下培养所述hPS细胞以获得定形内胚层细胞(DE细胞)，以及在分化条件下进一步培养所获得的细胞以获得所述肝祖细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其还包括使所述肝细胞样细胞在暴露于视黄酸应答性受体的激活剂的同时，暴露于GSK3抑制剂和/或基质覆盖物。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其还包括使所述肝细胞样细胞在暴露于视黄酸应答性受体的激活剂的同时，暴露于Wnt信号传导激活剂和/或基质覆盖物。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其还包括使所述肝细胞样细胞在暴露于视黄酸应答性受体的激活剂的同时，暴露于CDK抑制剂和/或基质覆盖物。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其还包括使所述肝细胞样细胞暴露于CDK抑制剂。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中使分化中的hPS细胞暴露于DNA去甲基化试剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中暴露于所述DNA去甲基化试剂发生在所述hPS细胞向DE细胞分化期间。
13.根据权利要求2至12中任一项所述的方法，其中所述肝祖细胞衍生自人多能(hPS)干细胞。
14.根据权利要求5至13中任一项所述的方法，其中所述人多能干细胞是人胚胎干(hES)细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述人胚胎干细胞在不破坏人胚胎的情况下获得。
16.根据权利要求2至12中任一项所述的方法，其中所述人多能干细胞是人诱导多能干(hiPS)细胞。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中使所述肝细胞样细胞暴露于浓度为0.1至5μM，如0.1至2.5μM的所述视黄酸应答性受体的激活剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述视黄酸应答性受体的激活剂的浓度为0.2至1.5μM。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述视黄酸应答性受体的激活剂的浓度为0.2μM。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中使所述肝细胞样细胞暴露于所述视黄酸应答性受体的激活剂大于4小时且不大于72小时的持续时期，例如5、24或48小时的持续时期。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中使所述肝细胞样细胞暴露于所述视黄酸应答性受体的激活剂5小时的持续时期。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中使所述肝细胞样细胞暴露于所述视黄酸应答性受体的激活剂至少两个、例如至少三个、至少4个或至少5个大于4小时且不大于72小时的持续时期，例如5、24或48小时的持续时期。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述至少两个持续暴露时期被不暴露于所述视黄酸应答性受体的激活剂的时期隔开。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述视黄酸应答性受体的激活剂是视黄酸。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述视黄酸是视黄酸异构体，例如7-顺式视黄酸、9-顺式视黄酸、11-顺式视黄酸、13-顺式视黄酸或全反式视黄酸，视黄酸类似物，如TTNPB或AM580或类视黄醇。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述视黄酸是9-顺式视黄酸。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述视黄酸是13-顺式视黄酸。
28.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中使所述细胞暴露于9-顺式视黄酸和13-顺式视黄酸的组合。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述视黄酸是全反式视黄酸。
30.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述视黄酸应答性受体的激活剂是AM580。
31.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述视黄酸应答性受体的激活剂是LGD1069。
32.根据权利要求7和10至31中任一项所述的方法，其中使所述肝细胞样细胞暴露于浓度为0.1至10μM的所述GSK-3抑制剂。
33.根据权利要求7和10至32中任一项所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂是GSK-3α抑制剂或GSK-3β抑制剂。
34.根据权利要求7和10至32中任一项所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂选自：9-溴-7，12-二氢-吲哚并[3，2-d][1]苯并氮杂-6(5H)-酮，也称为坎帕罗酮或NSC664704；1-氮杂坎帕罗酮(9-溴-7，12-二氢-吡啶并[3′，2′：2，3]氮杂并[4，5-b]吲哚-6(5H)-酮)；阿司特帕罗酮(9-硝基-7，12-二氢吲哚并[3，2-d][1]苯并氮杂-6(5)-酮)；BIO(2′Z，3′￡)-6-溴靛玉红-3′-肟(GSK3抑制剂IX)；BIO-丙酮肟(2′Z，3′E)-6-溴靛玉红-3′-丙酮肟(GSK3抑制剂X)；(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺(GSK3抑制剂XIII)；吡啶并咔唑-环戊二烯基钌配合物(GSK3抑制剂XV)；TDZD-84-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮(GSK3β抑制剂I)；2-硫代(3-碘代苄基)-5-(1-吡啶基)-[1，3，4]-二唑(GSK3β抑制剂II)；OTDZT2，4-二苄基-5-氧代噻二唑烷-3-硫酮(GSK3β抑制剂III)；α-4-二溴苯乙酮(GSK3β抑制剂VII)；AR-AO14418N-(4-甲氧基苄基)-N′-(5-硝基-1，3-噻唑-2-基)脲(GSK3β抑制剂VIII)；3-(1-(3-羟丙基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2，5-二酮(GSK-3β抑制剂XI)；TWSI19吡咯并嘧啶化合物(GSK3β抑制剂XII)；L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2或其十四酰化形式(GSK3β抑制剂XIII)；2-氯-1-(4，5-二溴-噻吩-2-基)-乙酮(GSK3β抑制剂VI)；氨基嘧啶CHIR99021；SB2167633-(2，4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮；以及靛玉红-3′-单肟。
35.根据权利要求7和10至32中任一项所述的方法，其中所述GSK3抑制剂选自：坎帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮、氨基嘧啶CHIR99021和靛玉红-3′-单肟。
36.根据权利要求7和10至32中任一项所述的方法，其中所述GSK3抑制剂还表现出对细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)如CDK2的抑制活性。
37.根据权利要求7和10至32中任一项所述的方法，其中所述GSK3抑制剂选自：坎帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮、靛玉红-3′-单肟、2-溴-9-硝基帕罗酮、2-溴-9-三氟甲基帕罗酮、2-溴帕罗酮、2-碘-9-三氟甲基帕罗酮、2-碘帕罗酮、2-苯基-4-(2-噻吩基)-5H-吡啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮、2-[2-(1-羟基环己基)-乙炔基]-9-三氟甲基-帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-硝基帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-三氟甲基帕罗酮、2，3-二甲氧基帕罗酮、2-(3-羟基-1-丙炔基)-9-三氟甲基帕罗酮、2，9-二溴帕罗酮、3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)丙腈、4-甲氧基帕罗酮、4-(4-氯苯基)-2-(2-萘基)-5H-吡啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮、5-苄基-9-溴帕罗酮、5-碘-靛玉红-3-单肟、5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、6溴靛玉红、8，10-二氯帕罗酮、9-溴-2，3-二羟基帕罗酮、9-溴-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-溴-4-羟基帕罗酮、9-溴-4-甲氧基帕罗酮、9-溴-5-乙基帕罗酮、9-溴-5-(甲氧羰基甲基)帕罗酮、9-溴-5-甲基帕罗酮、9-溴-5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、9-溴-5，7-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，7，12-三-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，12-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-7，12-二氢-6-(羟基氨基)-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂、9-溴-7，12-二氢-6-甲硫基-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂、9-溴-7，12-二氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(5H)-硫酮、9-溴-12-(2-羟乙基)-帕罗酮、9-溴-12-(2-丙烯基)-帕罗酮、9-溴-12-乙基帕罗酮、9-溴-12-甲基帕罗酮、9-溴-12-甲氧基羰基-甲基帕罗酮、9-溴-12-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-氯帕罗酮、9-氰基帕罗酮、9-氰基-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-氟帕罗酮、9-甲氧基帕罗酮、9-甲基帕罗酮、9-氧代-噻唑并[5，4-f]喹唑啉-2-腈衍生物、9-三氟甲基帕罗酮、10-溴帕罗酮、11-溴帕罗酮、11-氯帕罗酮、11-乙基帕罗酮、11-甲基帕罗酮、Aloisines(＝6-苯基[5H]吡咯并[2，3-6]吡嗪)如AloisineA、AZD1080、双-吲哚靛玉红、Debromohymenialdisine，Dibromocantharelline、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯酸甲酯、(E)-2-(3-氧代-1-丁烯基)-9-三氟甲基帕罗酮、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯腈、靛玉红、Hymenidin、Hymenialdisine、Manzamines如ManzamineA、Meridiamins、帕罗酮、吡唑并[3，4-b]吡啶衍生物、吡唑并[3，4-b]喹喔啉衍生物和噻唑并[5，4-f]喹唑啉-9-酮衍生物。
38.根据权利要求7和10至32中任一项所述的方法，其中所述GSK3抑制剂是坎帕罗酮。
39.根据权利要求7和10至32中任一项所述的方法，其中所述GSK3抑制剂是1-氮杂坎帕罗酮。
40.根据权利要求7和10至32中任一项所述的方法，其中所述GSK3抑制剂是阿司特帕罗酮。
41.根据权利要求7和10至32中任一项所述的方法，其中所述GSK3抑制剂是靛玉红-3′-单肟。
42.根据权利要求8和10至31中任一项所述的方法，其中使所述肝细胞样细胞暴露于浓度为0.05ng/ml至10ng/ml的Wnt信号传导激活剂。
43.根据权利要求8、10至31和42中任一项所述的方法，其中所述Wnt信号传导激活剂是Wnt蛋白。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述Wnt蛋白选自Wnt1、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3A、Wnt3、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、Wnt9A、Wnt9B、Wnt10A、Wnt10B、Wnt11和Wnt16。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述Wnt蛋白是Wnt3A。
46.根据权利要求9至31中任一项所述的方法，其中使所述肝细胞样细胞暴露于浓度为0.1至10μM的所述CDK抑制剂。
47.根据权利要求9至31和46中任一项所述的方法，其中所述CDK抑制剂是CDK2的抑制剂。
48.根据权利要求9至31和46中任一项所述的方法，其中所述CDK抑制剂是CDK1和CDK2的抑制剂。
49.根据权利要求9至31和46中任一项所述的方法，其中所述CDK抑制剂是CDK1、CDK2和CDK5的抑制剂。
50.根据权利要求9至31和46中任一项所述的方法，其中所述CDK抑制剂选自9-溴-7，12-二氢-吲哚并[3，2-d]-[1]苯并氮杂-6(5H)-酮，又称为坎帕罗酮或NSC664704；(R)-2-(6-(苄基氨基)-9-异丙基-9H-嘌呤-2-基氨基)丁-1-醇，又称为Roscovitine；2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-((3S，4R)-3-羟基-1-甲基哌啶-4-基)-4H-色满-4-酮，又称为Flavopiridol；4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-N-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-3-甲酰胺，又称为AT7519；6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮盐酸盐，又称为PD0332991HCl；N-(5-((5-叔丁基唑-2-基)甲硫基)噻唑-2-基)哌啶-4-甲酰胺，又称为SNS-032(BMS-387032)；JNJ-7706621；N(6，6-二甲基-5-(1-甲基哌啶-4-羰基)-1，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基)-3-甲基丁酰胺，又称为PHA-793887；Dinaciclib(SCH727965)；(4-丁氧基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-基)(2，6-二氟-4-甲基苯基)甲酮，又称为BMS-265246；N，1，4，4-四甲基-8-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基氨基)-4，5-二氢-1H-吡唑并[4，3-h]喹唑啉-3-甲酰胺，又称为PHA-848125；2-(吡啶-4-基)-6，7-二氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-4(5H)-酮，又称为PHA-767491；SCH900776；2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-((3S，4R)-3-羟基-1-甲基哌啶-4-基)-4H-色满-4-酮盐酸盐，又称为FlavopiridolHCl；(4-氨基-2-(1-(甲基磺酰基)哌啶-4-基氨基)嘧啶-5-基)(2，3-二氟-6-甲氧基苯基)甲酮，又称为R547；(2S)-1-(5-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)吡啶-3-基氧基)-3-苯基丙-2-胺，又称为A-674563；4-(1-异丙基-2-甲基-1H-咪唑-5-基)-N-(4-(甲基磺酰基)苯基)嘧啶-2-胺，又称为AZD5438；N5-(6-氨基己基)-N7-苄基-3-异丙基吡唑并[1，5-a]嘧啶-5，7-二胺盐酸盐，又称为BS-181HCl；CY-202；AG-024322；P276-00；ZK304709；GPC-286199；以及BAY80-3000。
51.根据权利要求9至31和46中任一项所述的方法，其中所述CDK抑制剂还表现出对糖原合酶激酶3(GSK-3)的抑制活性。
52.根据权利要求9至31和46中任一项所述的方法，其中所述CDK抑制剂选自坎帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮、靛玉红-3′-单肟、SNS-032(BMS-387032)、AT-7519和AZD5438。
53.根据权利要求9至31和46中任一项所述的方法，其中所述CDK抑制剂选自：坎帕罗酮、1-氮杂坎帕罗酮、阿司特帕罗酮、靛玉红-3′-单肟、2-溴-9-硝基帕罗酮、2-溴-9-三氟甲基帕罗酮、2-溴帕罗酮、2-碘-9-三氟甲基帕罗酮、2-碘帕罗酮、2-苯基-4-(2-噻吩基)-5H-吡啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮、2-[2-(1-羟基环己基)-乙炔基]-9-三氟甲基-帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-硝基帕罗酮、2，3-二甲氧基-9-三氟甲基帕罗酮、2，3-二甲氧基帕罗酮、2-(3-羟基-1-丙炔基)-9-三氟甲基帕罗酮、2，9-二溴帕罗酮、3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)丙腈、4-甲氧基帕罗酮、4-(4-氯苯基)-2-(2-萘基)-5H-吡啶并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(7H)-硫酮、5-苄基-9-溴帕罗酮、5-碘-靛玉红-3-单肟、5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、6溴靛玉红、8，10-二氯帕罗酮、9-溴-2，3-二羟基帕罗酮、9-溴-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-溴-4-羟基帕罗酮、9-溴-4-甲氧基帕罗酮、9-溴-5-乙基帕罗酮、9-溴-5-(甲氧羰基甲基)帕罗酮、9-溴-5-甲基帕罗酮、9-溴-5，6，7，12-四氢-苯并[6±7]环庚[1，2-b]吲哚、9-溴-5，7-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，7，12-三-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-5，12-双-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-溴-7，12-二氢-6-(羟基氨基)-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂、9-溴-7，12-二氢-6-甲硫基-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂、9-溴-7，12-二氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-6(5H)-硫酮、9-溴-12-(2-羟乙基)-帕罗酮、9-溴-12-(2-丙烯基)-帕罗酮、9-溴-12-乙基帕罗酮、9-溴-12-甲基帕罗酮、9-溴-12-甲氧基羰基-甲基帕罗酮、9-溴-12-(叔丁氧基羰基)-帕罗酮、9-氯帕罗酮、9-氰基帕罗酮、9-氰基-2，3-二甲氧基帕罗酮、9-氟帕罗酮、9-甲氧基帕罗酮、9-甲基帕罗酮、9-氧代-噻唑并[5，4-f]喹唑啉-2-腈衍生物、9-三氟甲基帕罗酮、10-溴帕罗酮、11-溴帕罗酮、11-氯帕罗酮、11-乙基帕罗酮、11-甲基帕罗酮、Aloisines(＝6-苯基[5H]吡咯并[2，3-6]吡嗪)如AloisineA，AZD1080，双-吲哚靛玉红、Debromohymenialdisine，Dibromocantharelline、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯酸甲酯、(E)-2-(3-氧代-1-丁烯基)-9-三氟甲基帕罗酮、(E)-3-(6-氧代-9-三氟甲基-5，6，7，12-四氢-吲哚并[2±3-d][1]苯并氮杂-2-基)-丙烯腈、靛玉红、Hymenidin、Hymenialdisine、Manzamines如ManzamineA、Meridiamins、帕罗酮、吡唑并[3，4-b]吡啶衍生物、吡唑并[3，4-b]喹喔啉衍生物和噻唑并[5，4-f]喹唑啉-9-酮衍生物。
54.根据权利要求9至31和46中任一项所述的方法，其中所述CDK抑制剂是坎帕罗酮。
55.根据权利要求9至31和46中任一项所述的方法，其中所述CDK抑制剂是1-氮杂坎帕罗酮。
56.根据权利要求9至31和46中任一项所述的方法，其中所述CDK抑制剂是阿司特帕罗酮。
57.根据权利要求9至31和46中任一项所述的方法，其中所述CDK抑制剂是靛玉红-3′-单肟。
58.根据权利要求9至31和46中任一项所述的方法，其中所述CDK抑制剂是SNS-032(BMS-387032)。
59.根据权利要求9至31和46中任一项所述的方法，其中所述CDK抑制剂是AT-7519。
60.根据权利要求9至31和46中任一项所述的方法，其中所述CDK抑制剂是AZD5438。
61.根据权利要求7至60中任一项所述的方法，其中所述基质覆盖物是纤连蛋白-胶原蛋白I基质覆盖物。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述纤连蛋白的浓度为2至约30μg/cm2，例如2至20μg/cm2，并且所述胶原蛋白I的浓度为2至20μg/cm2，例如5至约15μg/cm2。
63.根据权利要求7至60中任一项所述的方法，其中所述基质覆盖物包含胶原蛋白I、层粘连蛋白、纤连蛋白、生腱蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和葡糖氨基葡聚糖。
64.根据权利要求7至60中任一项所述的方法，其中所述基质覆盖物包含纤连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、胶原蛋白VI、巢蛋白、双糖链蛋白聚糖和层粘连蛋白。
65.根据权利要求64所述的方法，其中胶原蛋白I的浓度为2至20μg/cm2，例如约5至约15μg/cm2，胶原蛋白IV的浓度为0.01至10μg/cm2，例如0.05至10μg/cm2，胶原蛋白VI的浓度为0.01至15μg/cm2，例如0.01至10μg/cm2，或0.1至15μg/cm2，纤连蛋白的浓度为2至30μg/cm2，例如2至20μg/cm2，巢蛋白的浓度为0.01至10μg/cm2，例如0.05至10μg/cm2，层粘连蛋白的浓度为0.01至10μg/cm2，例如0.05至10μg/cm2，双糖链蛋白聚糖的浓度为0.01至10μg/cm2，例如0.1至约10μg/cm2。
66.根据权利要求11至65中任一项所述的方法，其中使分化中的hPS细胞暴露于浓度为1nM至10μM的DNA去甲基化试剂。
67.根据权利要求11至66中任一项所述的方法，其中所述DNA去甲基化试剂选自5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)、泽布拉林、普鲁卡因、RG108、S-5-腺苷-L-高半胱氨酸、咖啡酸、绿原酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、盐酸肼苯哒嗪、盐酸普鲁卡因酰胺和PsammaplinA。
68.根据权利要求11至66中任一项所述的方法，其中所述DNA去甲基化试剂是胞苷类似物。
69.根据权利要求11至66中任一项所述的方法，其中所述DNA去甲基化试剂是选自以下的胞苷类似物：5-氮杂-2-脱氧胞苷(地西他滨)、5-氮杂胞苷(阿扎胞苷)、5-氟-2-脱氧胞苷、5，6-二氢-5-氮杂胞苷、2′-脱氧代-5，6-二氢-5-氮杂胞苷、6-氮杂胞苷和2′，2′-二氟-脱氧胞苷(吉西他滨)。
70.根据权利要求11至66中任一项所述的方法，其中所述DNA去甲基化试剂是5-氮杂-2-脱氧胞苷。
71.根据权利要求11至66中任一项所述的方法，其中所述DNA去甲基化试剂是5-氮杂胞苷。
72.根据权利要求1至71中任一项所述的方法，其中所述用于获得肝细胞样细胞的分化条件具有以下特征：在分化培养基中存在一种或更多种生长因子如HGF，和/或一种或更多种分化诱导物如二甲基亚砜(DMSO)、地塞米松(DexM)、奥美拉唑、制癌蛋白M(OSM)、利福平、脱氧苯巴比妥、乙醇或异烟肼。
73.根据权利要求1至72中任一项所述的方法，其中所述用于获得肝细胞样细胞的分化条件还具有以下特征：在分化培养基中培养所述细胞至多35天，例如15至25天。
74.根据权利要求6至73中任一项所述的方法，其中所述用于获得所述定形内胚层细胞的分化条件具有以下特征：在分化培养基中存在激活素，例如激活素A或B，以及任选的一种或更多种生长因子，例如FGF1、FGF2或FGF4，和/或血清，例如FBS或FCS。
75.根据权利要求6至74中任一项所述的方法，其中所述用于获得所述定形内胚层细胞的分化条件还具有以下特征：在分化培养基中培养所述hPS细胞至多10天，例如4至10天。
76.根据权利要求6至75中任一项所述的方法，其中所述用于获得肝祖细胞的分化条件具有以下特征：在分化培养基中存在二甲基亚砜(DMSO)或者一种或更多种生长因子，例如FGF1、FGF2或FGF4，和任选地HGF、EGF和/或血清。
77.根据权利要求6至76中任一项所述的方法，其中所述用于获得肝祖细胞的分化条件还具有以下特征：在分化培养基中培养所述定形内胚层细胞至多7天，例如4至7天。
78.视黄酸应答性受体的激活剂用于使肝细胞样细胞成熟的用途。
79.一种试剂盒，其包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂，以及选自GSK3抑制剂、Wnt信号传导激活剂、CDK抑制剂和细胞外基质(ECM)组分或ECM组分混合物的至少一种。
80.根据权利要求79所述的试剂盒，其包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂、至少一种GSK3抑制剂和任选地至少一种细胞外基质(ECM)组分或ECM组分混合物。
81.根据权利要求79所述的试剂盒，其包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂、至少一种Wnt信号传导激活剂和任选地至少一种细胞外基质(ECM)组分或ECM组分混合物。
82.根据权利要求79所述的试剂盒，其包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂、至少一种CDK抑制剂和任选地至少一种细胞外基质(ECM)组分或ECM组分混合物。
83.根据权利要求79所述的试剂盒，其包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂和至少一种细胞外基质(ECM)组分或ECM组分混合物。
84.根据权利要求79所述的试剂盒，其包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂、至少一种CDK抑制剂和至少一种GSK3抑制剂或Wnt信号传导激活剂，以及任选地至少一种细胞外基质(ECM)组分或ECM组分混合物。
85.一种组合物，其包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂，以及选自GSK3抑制剂、Wnt信号传导激活剂和CDK抑制剂的至少一种。
86.根据权利要求85所述的组合物，其包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂和至少一种GSK-3抑制剂，以及任选地至少一种CDK抑制剂。
87.根据权利要求85所述的组合物，其包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂和至少一种Wnt信号传导激活剂，以及任选地至少一种CDK抑制剂。
88.根据权利要求85所述的组合物，其包含至少一种视黄酸应答性受体的激活剂和至少一种CDK抑制剂，以及任选地至少一种GSK3抑制剂或至少一种Wnt信号传导激活剂。
CN201380062656.XA 2012-11-29 2013-11-28 衍生自人多能干细胞的肝细胞样细胞的成熟 Expired - Fee Related CN105143445B (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261731281P 2012-11-29 2012-11-29
US201261731266P 2012-11-29 2012-11-29
US61/731,266 2012-11-29
US61/731,281 2012-11-29
DKPA201270741 2012-11-29
DKPA201270740 2012-11-29
DKPA201270740 2012-11-29
DKPA201270741 2012-11-29
PCT/EP2013/075017 WO2014083132A1 (en) 2012-11-29 2013-11-28 Maturation of hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105143445A true CN105143445A (zh) 2015-12-09
CN105143445B CN105143445B (zh) 2020-07-07

Family

ID=50827209

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380062656.XA Expired - Fee Related CN105143445B (zh) 2012-11-29 2013-11-28 衍生自人多能干细胞的肝细胞样细胞的成熟

Country Status (5)

Country Link
US (2) US10294457B2 (zh)
EP (2) EP2925859B1 (zh)
JP (2) JP6476127B2 (zh)
CN (1) CN105143445B (zh)
WO (1) WO2014083132A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108779439A (zh) * 2016-01-08 2018-11-09 国立研究开发法人国立癌症研究中心 利用低分子化合物的由成熟肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102168088B1 (ko) 2013-03-14 2020-10-20 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. 상피 줄기 세포 확장 및 배양을 위한 조성물 및 방법
WO2015069736A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 The Mclean Hospital Corporation METHODS FOR EFFICIENT GENERATION OF GABAergic INTERNEURONS FROM PLURIPOTENT STEM CELLS
IL299964A (en) 2014-09-03 2023-03-01 Massachusetts Inst Technology Preparations, systems and methods for producing hair cells in the inner ear to treat hearing loss
JP7253692B2 (ja) * 2014-12-26 2023-04-07 国立大学法人京都大学 肝細胞誘導方法
EP3760708A1 (en) 2015-06-03 2021-01-06 Takara Bio Europe AB Maturation of mammalian hepatocytes
CN108137595B (zh) * 2015-06-18 2021-04-20 听治疗有限责任公司 预防和治疗听力损失的方法和组合物
CN106554936B (zh) * 2015-09-30 2020-05-05 海门雨霖细胞科技有限责任公司 诱导人干细胞向肝细胞定向分化的新方法
GB201521179D0 (en) 2015-12-01 2016-01-13 Univ Leuven Kath Methods for differentiating cells into hepatic stellate cells
CA3010610A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Production of differentiated enteroendocrine cells and insulin producing cells
US10201540B2 (en) 2016-03-02 2019-02-12 Frequency Therapeutics, Inc. Solubilized compositions for controlled proliferation of stem cells / generating inner ear hair cells using GSK3 inhibitors: I
US11260130B2 (en) 2016-03-02 2022-03-01 Frequency Therapeutics, Inc. Solubilized compositions for controlled proliferation of stem cells / generating inner ear hair cells using a GSK3 inhibitor: IV
US10213511B2 (en) 2016-03-02 2019-02-26 Frequency Therapeutics, Inc. Thermoreversible compositions for administration of therapeutic agents
KR101918817B1 (ko) * 2016-10-06 2018-11-14 (주) 넥셀 인간 줄기세포 유래 간세포 분화 방법 및 간세포
CA3048220A1 (en) 2016-12-30 2018-07-05 Frequency Therapeutics, Inc. 1h-pyrrole-2,5-dione compounds and methods of using them to induce self-renewal of stem/progenitor supporting cells
JP6954531B2 (ja) * 2017-09-15 2021-10-27 国立大学法人大阪大学 高機能分化誘導細胞の濃縮方法及び高機能分化誘導細胞集団
CN108588008A (zh) * 2018-04-18 2018-09-28 广西壮族自治区畜牧研究所 一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用
EP3837352A1 (en) 2018-08-17 2021-06-23 Frequency Therapeutics, Inc. Compositions and methods for generating hair cells by upregulating jag-1
US11617745B2 (en) 2018-08-17 2023-04-04 Frequency Therapeutics, Inc. Compositions and methods for generating hair cells by downregulating FOXO
WO2020069077A1 (en) * 2018-09-28 2020-04-02 New York Medical College Generation of post-mitotic migratory cortical interneurons
US20220133740A1 (en) 2019-02-08 2022-05-05 Frequency Therapeutics, Inc. Valproic acid compounds and wnt agonists for treating ear disorders
CN114144514A (zh) * 2019-05-09 2022-03-04 富士胶片细胞动力公司 产生肝细胞的方法
CN115551994A (zh) 2020-03-11 2022-12-30 倍特博有限公司 产生肝细胞的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100173414A1 (en) * 2008-12-03 2010-07-08 International Stem Cell Corporation Methods of Deriving Differentiated Cells from Stem Cells
WO2011116930A1 (en) * 2010-03-22 2011-09-29 Cellartis Ab Directed differentiation and maturation of pluripotent cells into hepatocyte like cells by modulation of wnt-signalling pathway

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU621972B2 (en) * 1988-12-14 1992-03-26 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Cell culture medium for human liver epithelial cell line
DK0859608T3 (da) * 1995-09-18 2004-06-14 Ligand Pharm Inc Behandling af NIDDM med RXR-agonister
US8579966B2 (en) 1999-11-17 2013-11-12 Medtronic Corevalve Llc Prosthetic valve for transluminal delivery
US7732199B2 (en) 2001-07-12 2010-06-08 Geron Corporation Process for making transplantable cardiomyocytes from human embryonic stem cells
EP1456374A4 (en) 2001-11-26 2005-08-17 Advanced Cell Tech Inc METHODS FOR THE PRODUCTION AND USE OF REPROGRAMME HUMAN SOMATIC CELL CORES AND AUTOLOGOUS AND ISOGENIC HUMAN STEM CELLS
IL162663A0 (en) 2001-12-28 2005-11-20 Cellartis Ab A method for the establishment of apluripotent human blastocyst-derived stem cell line
US20060003446A1 (en) 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
GB2417960B8 (en) 2003-05-08 2008-05-09 Cellartis Ab A method for efficient transfer of human blastocyst-derived stem cells (hbs cells) from a feeder-supported to a feeder-free culture system
WO2005017131A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 THE GOUVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT F HEALTH AND HUMAN SERVICES Methods for the differentiation of human stem cells
JP2005095138A (ja) * 2003-08-19 2005-04-14 Effector Cell Institute Inc 多分化能を有する細胞の分化誘導方法
EP1885454A2 (en) * 2005-05-04 2008-02-13 DeveloGen Aktiengesellschaft Use of gsk-3 inhibitors for preventing and treating pancreatic autoimmune disorders
WO2007042225A2 (en) 2005-10-07 2007-04-19 Cellartis Ab A method for obtaining a xeno-free hbs cell line
US8460928B2 (en) 2005-10-24 2013-06-11 Agency For Science, Technology And Research Methods of specifying mesodermal, endodermal and mesoendodermal cell fates
US20070196514A1 (en) * 2006-02-21 2007-08-23 Benyi Li Prostate cancer treatment with glycogen synthase kinase-3beta inhibitors
US8741643B2 (en) * 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
EP2024492B1 (en) 2006-06-02 2017-03-29 Asterias Biotherapeutics, Inc. Differentiation of primate pluripotent cells to hepatocyte-lineage cells
CA2654130A1 (en) 2006-06-04 2007-12-13 Cellartis Ab Novel hepatocyte-like cells and hepatoblast-like cells derived from hbs cells
US9175260B2 (en) * 2007-01-30 2015-11-03 TheUniversity of Georgia Research Foundation, Inc. Early mesoderm cells, a stable population of mesendoderm cells that has utility for generation of endoderm and mesoderm lineages and multipotent migratory cells (MMC)
US20090053182A1 (en) * 2007-05-25 2009-02-26 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
SG183067A1 (en) 2007-07-20 2012-08-30 Cellartis Ab A novel population of hepatocytes derived via definitive endoderm (de-hep) from human blastocysts derived stem cells
US9005962B2 (en) * 2007-08-24 2015-04-14 The University Court Of The University Of Edinburgh Regionalised endoderm cells and uses thereof
US20100143313A1 (en) * 2008-12-10 2010-06-10 The General Hospital Corporation Homogeneous differentiation of hepatocyte-like cells from embryonic stem cells
US20120121546A1 (en) * 2009-02-05 2012-05-17 Vishal Bhasin Method of Producing Progenitor Cells from Differentiated Cells
US20120142005A1 (en) 2009-05-26 2012-06-07 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for screening of regenerative medicine
KR101874463B1 (ko) 2009-10-31 2018-08-02 뉴 월드 레보러토리즈 인코포레이티드. 세포의 재프로그램화 방법 및 이의 용도
US9068167B2 (en) 2009-11-13 2015-06-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined conditions using matrix overlay methods
RU2576000C2 (ru) * 2010-08-09 2016-02-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения клеток, продуцирующих панкреатические гормоны

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100173414A1 (en) * 2008-12-03 2010-07-08 International Stem Cell Corporation Methods of Deriving Differentiated Cells from Stem Cells
WO2011116930A1 (en) * 2010-03-22 2011-09-29 Cellartis Ab Directed differentiation and maturation of pluripotent cells into hepatocyte like cells by modulation of wnt-signalling pathway

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIAYI HUANG等: "Retinoic acid signalling induces the di¡erentiation of mouse fetal liver-derived hepatic progenitor cells", 《LIVER INTERNATIONAL》 *
L.FALASCA等: "The effect of retinoic acid on the re-establishment of differentiated hepatocyte phenotype in primary culture", 《CELL AND TISSUE RESEARCH》 *
SI-TAYEB K等: "Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells", 《HEPATOLOGY》 *
夏明明 等: "异视黄酸对人肝癌细胞的诱导分化作用", 《细胞生物学杂志》 *
黄佳祎: "永生化肝前体细胞株的构建及维甲酸都在肝前体细胞分化中的作用研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108779439A (zh) * 2016-01-08 2018-11-09 国立研究开发法人国立癌症研究中心 利用低分子化合物的由成熟肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法
CN108779439B (zh) * 2016-01-08 2023-05-30 埃维亚生命科学有限公司 利用低分子化合物的由成熟肝细胞制作肝干细胞/前体细胞的制作方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2925859A1 (en) 2015-10-07
EP3401391A1 (en) 2018-11-14
WO2014083132A1 (en) 2014-06-05
JP6476127B2 (ja) 2019-02-27
JP2016503304A (ja) 2016-02-04
US20150307839A1 (en) 2015-10-29
CN105143445B (zh) 2020-07-07
US10294457B2 (en) 2019-05-21
EP2925859B1 (en) 2018-05-02
JP2019088308A (ja) 2019-06-13
JP6780216B2 (ja) 2020-11-04
US20190194609A1 (en) 2019-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105143445A (zh) 衍生自人多能干细胞的肝细胞样细胞的成熟
JP5897543B2 (ja) Ｗｎｔシグナル経路の調節による多能性細胞から肝細胞様細胞への分化誘導と成熟
JP6792652B2 (ja) Ｈｂ９調節物を用いたヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化
JP6025715B2 (ja) 多能性幹細胞の肝細胞への分化を向上する三次元スキャホールド
JP6847048B2 (ja) 哺乳動物肝細胞の成熟
KR20230019992A (ko) 다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법
WO2012056997A1 (ja) 多能性幹細胞の分化誘導効率を改善するための方法及び培地
KR20150127063A (ko) 만능 줄기 세포의 췌장 내배엽 세포 (pec) 및 내분비 세포로의 시험관내 분화
JP2016514481A (ja) 浮遊液中で内胚葉前駆細胞を培養するための方法および組成物
CN107075467A (zh) 由干细胞分化肝细胞样细胞
Class et al. Patent application title: 3-DIMENSIONAL SCAFFOLDS FOR IMPROVED DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS TO HEPATOCYTES Inventors: Janne Jensen (Gothenburg, SE) Assignees: Cellartis AB
Hilcove Small molecules, regeneration, and cell fate

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200707

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee