KR20150127063A - 만능 줄기 세포의 췌장 내배엽 세포 (pec) 및 내분비 세포로의 시험관내 분화 - Google Patents

만능 줄기 세포의 췌장 내배엽 세포 (pec) 및 내분비 세포로의 시험관내 분화 Download PDF

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Abstract

인간 미성숙 내분비 세포 집단, 및 미성숙 내분비 세포 집단의 제조 방법이 제공된다. 구체적으로, 미성숙 베타 세포 및 미성숙 베타 세포의 생산 방법이 기재된다. 미성숙 베타 세포는 INS 및 NKX6.1을 공발현하고, 단능이며, 따라서 이식되었을 때 생체내에서 성숙 베타 세포로 발달된다. 생체내의 성숙 베타 세포는 글루코스 자극에 반응하여 인슐린을 생산할 수 있다.

Description

만능 줄기 세포의 췌장 내배엽 세포 (PEC) 및 내분비 세포로의 시험관내 분화 {IN VITRO DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS TO PANCREATIC ENDODERM CELLS (PEC) AND ENDOCRINE CELLS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2013년 3월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 61/781,005, 및 2013년 12월 13일에 출원된 미국 실용신안 출원 번호 14/106,330을 우선권 주장하고, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 세포 배양물의 단리, 유지 및 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 이는 시험관내의 만능(pluripotent) 줄기 세포를, 비-내분비 다능(multipotent) 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)이 강화되었지만 내분비 계통에 수임된 세포 (CHGA+)가 비교적 충분한 췌장 내배엽 세포 (PEC) 배양물로 분화시키는 세포 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한 본 명세서는 시험관내의 만능 줄기 세포를, 포유동물 내로의 이식 후에 생체내에서 글루코스 자극에 반응하여 인슐린을 생산하는 내분비 세포로 분화시키는 세포 조성물 및 방법을 최초로 기재한다. 본 명세서는 시험관내의 만능 줄기 세포를 시험관내에서 인슐린을 생산하는 내분비 세포로 분화시키는 세포 조성물 및 방법을 또한 기재한다.
세포 이식에 사용될 수 있는 인간 췌장 β-세포의 확장된 집단을 개발하는 것은 당뇨병 연구의 주요 목표이다. 최근 몇 년 동안, β-세포에 대한 잠재적인 재생가능한 공급원으로서 만능 줄기 세포를 사용하는 것에 관심이 집중되었다. 현재 아직 해명되지 않은 췌장 내분비 분화의 복잡한 성질로 인해, 만능 줄기 세포의 기능성 성숙 β-세포로의 분화가 시험관내에서 효율적으로 달성되지 않았다. 현재까지, 췌장 내배엽 세포 (PEC)와 같은 선조 세포만 설치류 내로 이식되었고, 8-12주 후에 인간-특이적 β-세포 기능을 입증하였다. PEC 세포 집단은 적어도 2가지의 세포 집단을 포함한다: 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-) 및 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+). PEC 이식 시, 생체내에서 성숙되어 β-세포를 형성하는 것이 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)이라는 것이 발견되었다. PEC 세포 집단을 이식하는 것은 생체내에서의 긴 성숙 시간 (8-12주)을 필요로 하고, 이는 (a) 시험관내 PEC 집단이 생체내에서 β-세포로 성숙되는 세포 유형 (즉, 비-내분비 다능 췌장 선조 세포 (CHGA-))을 더 많이 함유하거나, (b) 최종 (β-세포) 분화가 시험관내에서 달성되거나, 또는 (c) 현재 사용되는 것보다 분화 경로를 더 따르는 시험관내 선조 집단, 즉 발생적으로 진행된 세포 집단이 확인된다면, 단축 또는 제거될 수 있다.
본원을 어떠한 한 이론에도 제한하지 않으면서, 왜 만능 줄기 세포가 시험관내에서 충분히 기능성인 β-세포로 성숙되지 않는지에 관한 가능한 설명은 시험관내에서 유래된 세포가 생체내 포유동물 췌장 발생 동안과 동일한 시점에 마커 발현이 동일하지 않다는 것이다. 예를 들어, 시험관내 분화 동안의 NGN3 발현이 생체내 포유동물 췌장 발생에서보다 조기에 발생한다. 실제로, 본원에 전문이 참조로 포함된 출원인의 다수의 공보 및 특허에 기재된 바와 같은 전통적인 4단계 분화 프로토콜에서, PEC 집단은 NGN3 및 NKX2.2를 발현한다는 것이 관찰되었다. 따라서, PDX1 / NKX6.1 발현 공동-양성 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 분화 이후까지 NGN3 발현을 억제 또는 저해하는 것은 시험관내에서의 만능 줄기 세포의 기능성 성숙 β-세포로의 분화 또는 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)와 비교하여 더 많은 비-내분비 다능 췌장 선조 세포 (CHGA-)를 함유하는 PEC 집단의 분화를 달성하는 것에서의 중요한 단계이다.
NGN3 및 NKX2.2의 발현을 지연시키는 프로토콜을 확인하는 것은 명확하지 않은데, 이는 분화 프로토콜이 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)의 형성을 파괴시키지 않아야 하고, 바람직하게는 이를 증가시켜야 하며, 세포 상실을 최소화시켜야 하거나; 또는 최소한 적합한 세포 질량 및 세포 수율 (즉, 세포의 마이크로그램, 그램, 킬로그램)을 유지하여야 하기 때문이다.
추가적으로, NGN3 발현이 내분비 세포 분화 개시, 섬세포 성숙 촉진 및 섬 기능 유지에 필요하기 때문에, 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)에서 NGN3 발현을 자극하거나 유도하는 것은 만능 줄기 세포의 기능성 성숙 β-세포로의 시험관내 분화를 달성하는데 있어서 중요한 단계이다.
한 측면에서, 인간 PDX1 양성 췌장 내배엽 세포를 포함하는 세포 집단을 생산하는 시험관내 방법이 제공된다. 이러한 방법은 확정적 내배엽 계통 세포를 포함하는 세포 집단을 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자 및 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시킴으로써, PDX1 양성 췌장 내배엽 세포를 포함하는 세포 집단을 생성시키는 것을 포함한다. 실시양태들에서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자는 노달(Nodal), 액티빈(Activin) A, 액티빈 B, BMP2, BMP4, GDF8, GDF-10, GDF-11 및 GDF-15로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시양태들에서, 이러한 방법은 확정적 내배엽 계통 세포를 포함하는 세포 집단을 ERBB 수용체 키나제(kinase) 활성화제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 실시양태들에서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자는 액티빈 A이다. 실시양태들에서, Wnt 패밀리 구성원은 Wnt3a이다. 실시양태들에서, ERBB 수용체 키나제 활성화제는 헤레귤린(Heregulin)이다.
실시양태들에서, PDX1 양성 췌장 내배엽 세포를 포함하는 세포 집단은 25 ng/mL 이상의 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자와 접촉된다. 실시양태들에서, PDX1 양성 췌장 내배엽 세포를 포함하는 세포 집단은 50 ng/mL 이상의 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자와 접촉된다. 실시양태들에서, PDX1 양성 췌장 내배엽 세포를 포함하는 세포 집단은 75 ng/mL 이상의 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자와 접촉된다.
실시양태들에서, PDX1 양성 췌장 내배엽 세포를 포함하는 세포 집단은 25 ng/mL 이상의 Wnt 패밀리 구성원과 접촉된다. 실시양태들에서, PDX1 양성 췌장 내배엽 세포를 포함하는 세포 집단은 50 ng/mL 이상의 Wnt 패밀리 구성원과 접촉된다. 실시양태들에서, PDX1 양성 췌장 내배엽 세포를 포함하는 세포 집단은 75 ng/mL 이상의 Wnt 패밀리 구성원과 접촉된다.
실시양태들에서, 세포 집단은 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자 및 Wnt 패밀리 구성원 각각 보다 5-15배 더 적은 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉된다. 실시양태들에서, PDX1 양성 췌장 내배엽 세포를 포함하는 상기 세포 집단의 약 50％ 이상이 PDX1-양성 췌장 내배엽 세포이다. 실시양태들에서, PDX1 양성 췌장 내배엽 세포를 포함하는 세포 집단의 약 60％ 이상이 PDX1-양성 췌장 내배엽 세포이다. 실시양태들에서, PDX1 양성 췌장 내배엽 세포를 포함하는 세포 집단의 약 70％ 이상이 PDX1-양성 췌장 내배엽 세포이다. 실시양태들에서, PDX1 양성 췌장 내배엽 세포를 포함하는 세포 집단의 약 80％ 이상이 PDX1-양성 췌장 내배엽 세포이다. 실시양태들에서, PDX1 양성 췌장 내배엽 세포를 포함하는 세포 집단의 약 90％ 이상이 PDX1-양성 췌장 내배엽 세포이다.
실시양태들에서, PDX1-양성 췌장 내배엽 세포는 NKX6.1을 추가로 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는다. 실시양태들에서, PDX1-양성 췌장 내배엽 세포는 CHGA를 발현하지 않는다. 실시양태들에서, PDX1-양성 췌장 내배엽 세포는 NKX6.1 및 PFT1A를 추가로 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는다. 실시양태들에서, PDX1-양성 췌장 내배엽 세포는 단능(unipotent) 미성숙 베타 세포로 분화될 수 있는 다능 세포이다.
한 측면에서, 확정적 내배엽 계통 세포 및 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자 및 Wnt 패밀리 구성원을 포함하는 인간 췌장 내배엽 세포 배양물이 제공된다. 실시양태들에서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자는 노달, 액티빈 A, 액티빈 B, BMP2, BMP4, GDF8, GDF-10, GDF-11 및 GDF-15로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시양태들에서, 이러한 방법은 확정적 내배엽 계통 세포를 포함하는 세포 집단을 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 실시양태들에서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자는 액티빈 A이다. 실시양태들에서, Wnt 패밀리 구성원은 Wnt3a이다. 실시양태들에서, ERBB 수용체 키나제 활성화제는 헤레귤린이다.
또 다른 측면에서, 시험관내 단능 인간 미성숙 베타 세포가 제공된다. 실시양태들에서, 단능 인간 미성숙 베타 세포는 INS 및 NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는다. 실시양태들에서, 단능 인간 미성숙 베타 세포는 성숙 베타 세포로 분화될 수 있다. 실시양태들에서, 분화는 생체내 분화이다. 실시양태들에서, 단능 인간 미성숙 베타 세포는 세포 집단의 일부를 형성한다. 실시양태들에서, 세포 집단의 10％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 20％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 30％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 40％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 50％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 60％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 80％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 90％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 98％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 인간 미성숙 베타 세포는 단일 호르몬성이다. 실시양태들에서, 단능 인간 세포는 MAFB를 발현한다.
한 측면에서, 단능 인간 미성숙 베타 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원 및 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시킴으로써 미성숙 베타 세포를 생성시키는 것을 포함한다. 실시양태들에서, 단능 인간 미성숙 베타 세포는 INS, NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는다. 실시양태들에서, TGFβ 슈퍼패밀리 구성원은 노달, 액티빈 A, 액티빈 B, BMP2, BMP4, GDF8, GDF-10, GDF-11 및 GDF-15로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시양태들에서, 이러한 방법은 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 실시양태들에서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자는 액티빈 A이다. 실시양태들에서, Wnt 패밀리 구성원은 Wnt3a이다. 실시양태들에서, ERBB 수용체 키나제 활성화제는 헤레귤린이다. 실시양태들에서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자는 BMP이다.
실시양태들에서, 이러한 방법은 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 니코틴아미드, 레틴산 또는 레틴산 유사체, rho 키나제 억제제 또는 감마 세크레타제(secretase) 억제제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 실시양태들에서, 레틴산은 올(all)-트랜스-레틴산 (RA), 13-시스-레틴산 (13-시스-RA), 및 아로티노이드산 (TTNPB)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시양태들에서, 레틴산은 올-트랜스 레틴산 (RA)이다. 실시양태들에서, 레틴산은 13-시스-레틴산 (13-시스-RA)이다. 실시양태들에서, 레틴산은 아로티노이드산 (TTNPB)이다. 실시양태들에서, rho 키나제 억제제는 Y-27632, 파수딜(Fasudil), H-1152P, Wf-536 및 Y-30141로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시양태들에서, rho 키나제 억제제는 Y-27632이다.
실시양태들에서, 감마 세크레타제 억제제는 감마 세크레타제 억제제 I (GSI I), 감마 세크레타제 억제제 II (GSI II), 감마 세크레타제 억제제 III (GSI III), 감마 세크레타제 억제제 IV (GSI IV), 감마 세크레타제 억제제 V (GSI V), 감마 세크레타제 억제제 VI (GSI VI), 감마 세크레타제 억제제 VII (GSI VII), 감마 세크레타제 억제제 IX (GSI IX), (DAPT), 감마 세크레타제 억제제 XI (GSI XI), 감마 세크레타제 억제제 XII, (GSI XII), 감마 세크레타제 억제제 XIII (GSI XIII), 감마 세크레타제 억제제 XIV (GSI XIV), 감마 세크레타제 억제제 XVI (GSI XVI), 감마 세크레타제 억제제 XVII (GSI XVII), 감마 세크레타제 억제제 XIX (GSI XIX), 감마 세크레타제 억제제 XX (GSI XX), 감마 세크레타제 억제제 XXI (GSI XXI), 감마40 세크레타제 억제제 I, 감마40 세크레타제 억제제 II 및 RO4929097로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시양태들에서, 감마 세크레타제 억제제는 RO4929097이다. 실시양태들에서, 감마 세크레타제 억제제는 GSI IV이다.
또 다른 측면에서, 생체내에서 성숙 베타 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (a) 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원 및 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시킴으로써, 미성숙 베타 세포를 생성시키는 단계; (b) 단계 (a)의 미성숙 베타 세포를 포유동물 대상체 내로 이식하는 단계; 및 생체내에서 미성숙 베타 세포가 분화되게 하여 성숙 베타 세포를 포함하는 세포들의 집단을 생산하는 단계를 포함한다. 실시양태들에서, 이러한 방법은 성숙 베타 세포가 글루코스 자극에 반응하여 인슐린을 생산하게 하는 것을 추가로 포함한다. 실시양태들에서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자는 노달, 액티빈 A 및 액티빈 B, GDF-8, GDF-11 및 GDF-15로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시양태들에서, 이러한 방법은 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 실시양태들에서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자는 액티빈 A이다. 실시양태들에서, Wnt 패밀리 구성원은 Wnt3a이다. 실시양태들에서, ERBB 수용체 키나제 활성화제는 헤레귤린이다.
실시양태들에서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포는 25 ng/mL 이상의 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자와 접촉된다. 실시양태들에서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포는 50 ng/mL 이상의 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자와 접촉된다. 실시양태들에서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포는 75 ng/mL 이상의 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자와 접촉된다.
실시양태들에서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포는 25 ng/mL 이상의 Wnt 패밀리 구성원과 접촉된다. 실시양태들에서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포는 50 ng/mL 이상의 Wnt 패밀리 구성원과 접촉된다. 실시양태들에서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포는 75 ng/mL 이상의 Wnt 패밀리 구성원과 접촉된다.
실시양태들에서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포는 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자 및 Wnt 패밀리 구성원보다 5-15배 더 적은 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉된다. 실시양태들에서, 세포 집단의 10％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 20％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 30％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 40％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 50％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 60％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 70％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 80％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 세포 집단의 90％ 이상이 미성숙 베타 세포이다. 실시양태들에서, 미성숙 베타 세포는 INS 및 NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는다. 실시양태들에서, 미성숙 베타 세포는 INS, NKX6.1 및 MAFB를 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는다.
한 측면에서, 시험관내 단능 인간 미성숙 베타 세포가 제공된다. 실시양태들에서, 단능 인간 미성숙 베타 세포는 INS 및 NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는다. 실시양태들에서, 단능 인간 미성숙 베타 세포는 성숙 베타 세포로 성숙될 수 있다.
한 측면에서, 생체내에서 성숙 베타 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 a. 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원 및 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시킴으로써 미성숙 베타 세포를 생성시키는 단계; b. 단계 (a)의 미성숙 베타 세포를 포유동물 대상체 내로 이식하는 단계; 및 c. 미성숙 베타 세포가 생체내에서 성숙되게 하여 인슐린 분비 베타 세포를 포함하는 세포들의 집단을 생산하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, INS 및 NKX6.1을 발현하고 NGN3을 실질적으로 발현하지 않는 단능 인간 미성숙 베타 세포가 제공된다. 실시양태들에서, 단능 인간 미성숙 베타 세포는 성숙 베타 세포로 성숙될 수 있다. 실시양태들에서, 단능 인간 미성숙 베타 세포는 MAFB를 추가로 발현한다.
한 측면에서, INS 및 NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는 시험관내 단능 인간 미성숙 베타 세포가 제공된다. 실시양태들에서, 단능 인간 미성숙 베타 세포는 성숙 베타 세포로 성숙될 수 있다. 실시양태들에서, 단능 인간 미성숙 베타 세포는 MAFB를 추가로 발현한다.
한 측면에서, 단능 인간 미성숙 베타 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원 및 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시킴으로써 단능 인간 미성숙 베타 세포를 생산하는 것을 포함한다. 실시양태들에서, 단능 인간 미성숙 베타 세포는 INS, NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는다. 실시양태들에서, 이러한 방법은 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 실시양태들에서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자는 액티빈 A이다. 실시양태들에서, Wnt 패밀리 구성원은 Wnt3a이다. 실시양태들에서, ERBB 수용체 키나제 활성화제는 헤레귤린이다.
한 측면에서, 생체내에서 성숙 베타 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 a. 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원 및 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시킴으로써 미성숙 베타 세포를 생성시키는 단계; b. 단계 (a)의 미성숙 베타 세포를 포유동물 대상체 내로 이식하는 단계; 및 c. 미성숙 베타 세포가 생체내에서 성숙되게 하여 인슐린 분비 베타 세포를 포함하는 세포들의 집단을 생산하는 단계를 포함한다. 실시양태들에서, 이러한 방법은 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 실시양태들에서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자는 액티빈 A이다. 실시양태들에서, Wnt 패밀리 구성원은 Wnt3a이다. 실시양태들에서, ERBB 수용체 키나제 활성화제는 헤레귤린이다. 실시양태들에서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포는 50 ng/mL 이상의 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자와 접촉된다. 실시양태들에서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포는 25 ng/mL 이상의 Wnt 패밀리 구성원과 접촉된다. 실시양태들에서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포는 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자 및 Wnt 패밀리 구성원보다 5-15배 더 적은 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉된다. 실시양태들에서, 미성숙 베타 세포는 INS 및 NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는다. 실시양태들에서, 미성숙 베타 세포는 INS, NKX6.1 및 MAFB를 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는다.
한 실시양태는 만능 줄기 세포 또는 만능 줄기 세포로부터 유래된 전구 세포를 내분비 및 비-내분비 집단으로 분화시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 측면에서, 내분비 세포는 적어도 CHGA를 발현하고 (또는 CHGA+), 비-내분비는 CHGA를 발현하지 않는다 (또는 CHGA-). 한 측면에서, 이러한 세포 집단들은 내분비 (CHGA+) 및 비-내분비 (CHGA-) 하위집단으로, 또는 단순히 CHGA+ 또는 CHGA- 하위집단으로, 또는 간단히 내분비 및 비-내분비 하위집단으로 지칭된다. 또 다른 측면에서, 이러한 내분비 및 비-내분비 하위집단은 다능 선조/전구 하위집단 예컨대 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 또는 내분비 다능 췌장 선조 하위집단일 수 있거나; 또는 단능 하위집단 예컨대 미성숙 내분비 세포, 바람직하게는 미성숙 베타 세포, 미성숙 글루카곤 세포 등일 수 있다.
한 실시양태는 시험관내의 만능 줄기 세포를 내분비 및 비-내분비 하위집단 양쪽 모두를 포함하는 췌장 내배엽 세포 (PEC) 배양물로 분화시키기 위한 조성물 및 방법을 제공하고, 이때 NGN3의 발현이 억제된다. 한 측면에서, NKX2.2의 발현 또한 PEC 배양물에서 억제된다. 한 측면에서, CHGA의 발현 또한 PEC 배양물에서 억제된다. 한 측면에서, PDX1 및 NKX6.1의 발현이 PEC 배양물 내의 단일 세포 상에서 공발현된다. 한 측면에서, PEC 배양물 내의 세포의 50％ 미만, 바람직하게는 40％, 30％ 미만, 더욱 바람직하게는 20％, 10％, 5％, 2％, 1％ 미만이 NGN3, NKX2.2 또는 CHGA를 발현한다. 한 측면에서, PEC 배양물이 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)에 대해 강화된다. 한 측면에서, PEC 배양물은 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)에 대한 마커 (PDX1 및/또는 NKX6.1)를 발현한다. 한 측면에서, 비-내분비 다능 선조 하위집단 (CHGA-)이 풍부한 PEC 배양물이 포유동물 숙주 내에 이식되고, 이식편이 성숙되어 생체내에서 글루코스에 반응하여 인슐린을 생산한다. 한 측면에서, 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)이 풍부한 PEC 배양물이 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)이 풍부하지 않은 PEC 배양물보다 생체내에서 더 신속하게 성숙된다. 한 측면에서, 비-내분비 다능 선조 하위집단 (CHGA-)이 풍부한 이식된 PEC 배양물은 이식하고 나서 약 10주 또는 약 12주 후의 글루코스 자극에 반응한 C-펩티드 (인슐린) 생산에 의해 측정된 바와 같은 생체내 기능이 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)이 풍부하지 않은 이식된 PEC 배양물보다 2× 이상 개선된다.
한 실시양태는 내분비 분화 및 발생에 전형적인 유전자 예컨대 NGN3 및 NKX2.2의 발현이 비-내분비 다능 췌장 선조 (CHGA- 및 PDX1 / NKX6.1 공발현) 생산 이후까지 억제되는, 시험관내의 만능 인간 줄기 세포를 분화시키기기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
한 실시양태는 (a) PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포 집단을 수득하는 단계; (b) 단계 (a)에서의 세포 집단을 TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 활성화시키는 작용제와 접촉시킴으로써, CHGA, NGN3 또는 NKX2.2를 포함하는 군으로부터 선택된 마커를 실질적으로 발현하지 않는 PEC를 포함하는 세포 배양물을 생성시키는 단계를 포함하는, 시험관내의 만능 줄기 세포를 PEC 배양물로 분화시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, PEC는 PDX1 및 NKX6.1를 공발현하는 세포들의 하위집단을 포함한다. 한 측면에서, PEC는 비-내분비 다능 췌장 선조 (CHGA-) 세포들의 하위집단을 포함한다. 한 측면에서, TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 활성화시키는 작용제는 노달, 액티빈 A, 액티빈 B, BMP2, BMP4, GDF8, GDF-10, GDF-11, GDF-15 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 측면에서, 액티빈 A는 단계 3에서 100 ng/mL, 75 ng/mL, 50 ng/mL, 25 ng/mL 또는 10 ng/mL로, 그리고 단계 4에서 15 ng/mL, 10 ng/mL 또는 5 ng/mL로 첨가된다. 한 측면에서, 액티빈 A를 PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포 집단에 첨가함으로써 형성된 PEC 배양물은 글루코스 자극에 반응한 C-펩티드 (인슐린) 생산에 의해 측정된 바와 같은 생체내 기능이 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)이 풍부하지 않은 PEC 배양물보다 2× 이상 개선된다.
한 측면에서, 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)이 있는 PEC 배양물은 글루코스 자극에 반응한 인슐린 생산에 의해 측정된 바와 같은 생체내 기능이 비-내분비 다능 선조 하위집단 (CHGA-)이 풍부하지 않은 PEC 세포 배양물보다 2× 이상 개선된다.
한 실시양태는 (a) PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포 집단을 수득하는 단계, (b) 단계 (a)에서의 세포 집단을 TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 활성화시키는 작용제와 접촉시킴으로써, CHGA, NGN3 또는 NKX2.2를 포함하는 군으로부터 선택된 마커를 실질적으로 발현하지 않는 PEC 집단을 생성시키는 단계를 포함하는, 시험관내의 만능 줄기 세포를 PEC를 포함하는 세포 집단으로 분화시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, PEC 집단은 PDX1 및 NKX6.1을 공발현하는 세포를 포함한다. 한 측면에서, PEC 집단은 비-내분비 다능 췌장 선조 세포 (CHGA-)를 포함한다. 한 측면에서, TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 활성화시키는 작용제는 노달, 액티빈 A, 액티빈 B, BMP2, BMP4, GDF8, GDF-10, GDF-11, GDF-15 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 측면에서, TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 활성화시키는 작용제는 액티빈 A이다. 한 측면에서, 액티빈 A는 단계 3에서 100 ng/mL, 75 ng/mL, 50 ng/mL, 25 ng/mL 또는 10 ng/mL로, 그리고 단계 4에서 15 ng/mL, 10 ng/mL 또는 5 ng/mL로 첨가된다. 한 측면에서, EGF 패밀리 리간드는 헤레귤린 (뉴레귤린(Neuregulin)1 (NRG1)로 또한 공지됨), 뉴레귤린2 (NRG2), 뉴레귤린3 (NRG3), 뉴레귤린4 (NRG4), EGF (표피 성장 인자) 및 베타셀룰린(betacellulin)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 한 측면에서, EGF 패밀리 리간드는 헤레귤린이다. 한 측면에서, 헤레귤린은 2 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 15 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL 또는 80 ng/mL로 첨가된다. 한 측면에서, 액티빈 A 및 헤레귤린을 PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포 집단에 첨가함으로써 형성된 PEC 배양물은 글루코스 자극에 반응한 C-펩티드 (인슐린) 생산에 의해 측정된 바와 같은 생체내 기능이 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)이 풍부하지 않은 PEC 배양물보다 2× 이상 개선된다.
한 실시양태는 (a) PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포 집단을 수득하는 단계, (b) 단계 (a)에서의 세포 집단을 적어도 TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 활성화시키는 작용제, EGF 패밀리 리간드 또는 Wnt 신호전달 경로를 활성화시키는 작용제 (단독적이거나 또는 조합됨)와 접촉시킴으로써, CHGA, NGN3 또는 NKX2.2를 포함하는 군으로부터 선택된 마커를 실질적으로 발현하지 않는 PEC를 포함하는 세포 배양물을 생성시키는 단계를 포함하는, 시험관내의 만능 줄기 세포를 PEC를 포함하는 세포 배양물로 분화시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, PEC 배양물은 PDX1 및 NKX6.1을 공발현하는 세포를 포함한다. 한 측면에서, PEC 세포 배양물은 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)을 포함한다. 한 측면에서, TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 활성화시키는 작용제는 노달, 액티빈 A, 액티빈 B, BMP2, BMP4, GDF8, GDF-10, GDF-11, GDF-15 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 측면에서, TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 활성화시키는 작용제는 액티빈 A이다. 한 측면에서, Wnt 신호전달 경로를 활성화시키는 작용제는 WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16 및 Wnt3A로 이루어진 군으로부터 선택된 Wnt 패밀리 구성원이다. 한 측면에서, Wnt 패밀리 구성원은 Wnt3A이다. 한 측면에서, 액티빈 A는 단계 3에서 100 ng/mL, 75 ng/mL, 50 ng/mL, 25 ng/mL 또는 10 ng/mL로, 그리고 단계 4에서 15 ng/mL, 10 ng/mL 또는 5 ng/mL로 첨가된다. 한 측면에서, 헤레귤린은 2 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 15 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL 또는 80 ng/mL로 첨가된다. 한 측면에서, WNT는 5 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL 내지 75 ng/mL로, 더욱 바람직하게는 50 ng/mL로 첨가된다.
한 측면에서, 액티빈 A는 단계 3에 단독으로 또는 WNT와 조합되어 첨가된다. 또 다른 측면에서, 액티빈 A는 단계 3에 WNT 또는 WNT 및 헤레귤린과 함께 첨가된다. 또 다른 측면에서, 액티빈 A는 단계 4에 단독으로 또는 헤레귤린과 조합되어 첨가된다.
한 측면에서, 세포 집단 내의 세포의 10％ 초과, 바람직하게는 20％, 30％, 40％ 초과, 더욱 바람직하게는 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 초과 또는 100％가 비-내분비 다능 선조 하위집단 (CHGA-)이다. 한 측면에서, 액티빈 A, 헤레귤린 및 WNT를 PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포 집단에 첨가함으로서 형성된 PEC 세포 배양물은 글루코스 자극에 반응한 인슐린 생산에 의해 측정된 바와 같은 생체내 기능이 비-내분비 다능 선조 하위집단 (CHGA-)이 풍부하지 않은 PEC 세포 배양물보다 2× 이상 개선된다.
한 실시양태는 시험관내의 만능 줄기 세포를 최소한의 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)를 포함하는 PEC 배양물로 분화시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 측면에서, 내분비 계통으로 수임된 세포는 CHGA의 발현을 특징으로 한다. 한 측면에서, PEC 배양물 내의 세포 내의 50％ 미만, 바람직하게는 40％, 30％ 미만, 더욱 바람직하게는 20％, 10％, 5％, 2％, 1％ 미만의 세포가 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)이다.
한 실시양태는 시험관내의 만능 줄기 세포를 실질적으로 PEC 배양물로 분화시키고, 추가로 시험관내의 PEC 배양물을 내분비 세포로 분화시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 측면에서, 내분비 세포는 CHGA를 발현한다. 한 측면에서, 내분비 세포는 시험관내에서 인슐린을 생산할 수 있다. 한 측면에서, 시험관내의 내분비 인슐린 분비 세포는 글루코스 자극에 반응하여 인슐린을 생산할 수 있다. 한 측면에서, 세포 집단 내의 세포의 10％ 초과, 바람직하게는 20％, 30％, 40％ 초과, 더욱 바람직하게는 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 초과 또는 100％가 내분비 세포이다.
한 실시양태는 (a) PEC를 포함하는 세포 집단을 수득하는 단계, (b) 단계 (a)에서의 세포 집단을 골 형태형성 단백질 (BMP), 헤지호그(hedgehog) 억제제, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 섬유모세포 성장 인자 패밀리의 구성원, 레티노이드, 인슐린 성장 인자 1 및 2 (IGF1 및 IGF2) 및 니코틴아미드로 이루어진 군으로부터 선택된 성장 인자와 접촉시킴으로써 내분비 세포를 생성시키는 단계를 포함하는, 시험관내의 만능 줄기 세포를 내분비 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 내분비 세포는 CHGA를 발현한다. 한 측면에서, 내분비 세포는 시험관내의 미성숙 인슐린-생산 베타-세포이다. 한 측면에서, 내분비 세포는 이식가능한 반투과성 캡슐화 장치 내로 로딩(loading)되고, 성숙되어, 생체내에서 글루코스 자극에 반응하여 인슐린을 생산할 수 있다. 한 측면에서, 세포 집단 내의 세포의 10％ 초과, 바람직하게는 20％, 30％, 40％ 초과, 더욱 바람직하게는 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 초과 또는 100％가 내분비 세포이다. 한 측면에서, SSH가 10 g/mL 내지 100 ng/mL로 첨가된다. 한 측면에서, PDGF가 10 ng/mL 내지 100 ng/mL로 첨가된다. 한 측면에서, BMP가 10 g/mL 내지 20 ng/mL로 첨가된다. 한 측면에서, FGF2가 2 ng/mL 내지 20 ng/mL로 첨가된다. 한 측면에서, IGF1 또는 IGF2가 25 ng/mL 내지 100 ng/mL로 첨가된다. 한 측면에서, 상기 화합물들이 서로 조합되어 투여된다. 한 측면에서, 섬유모세포 성장 인자 패밀리의 구성원은 FGF2이다. 한 측면에서, 레티노이드는 레틴산 및/또는 레틴산 유사체 예컨대 TTNPB 또는 TT3, 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I 또는 IGF1) 및 -II (IGF-II 또는 IGF2)이다. 한 측면에서, 골 형태형성 단백질은 BMP4이다. 한 측면에서, 헤지호그 억제제는 소닉(sonic) 헤지호그, KAAD-시클로파민, KAAD-시클로파민 유사체, 제르빈(jervine), 제르빈 유사체, 헤지호그 경로 차단 항체, 및 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기타 헤지호그 경로 기능 억제제이다.
한 실시양태는 (a) PEC를 포함하는 세포 집단을 수득하는 단계, (b) 단계 (a)에서의 세포 집단을 감마 세크레타제 억제제와 접촉시킴으로써 시험관내에서 내분비 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 시험관내의 만능 줄기 세포를 내분비 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 내분비 세포는 CHGA를 발현한다. 한 측면에서, 내분비 세포는 시험관내의 미성숙 인슐린-생산 베타-세포이다. 한 측면에서, 내분비 세포는 시험관내에서 글루코스 자극에 반응하여 인슐린을 생산하는 인슐린 분비 세포이다. 한 측면에서, 내분비 세포가 이식가능한 반투과성 캡슐화 장치 내로 로딩되고, 성숙되어, 생체내에서 글루코스 자극에 반응하여 인슐린을 생산할 수 있다. 한 측면에서, 감마 세크레타제 억제제는 N-[N-(3,5-디플루오로페나세틸-L-알라닐)]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르 (DAPT), RO44929097, 1-(S)-엔도-N-(1,3,3)-트리메틸비시클로[2.2.1]헵트-2-일)-4-플루오로페닐 술폰아미드, WPE-III31C, S-3-[N'-(3,5-디플루오로페닐-알파-히드록시아세틸)-L-알라닐릴]아미노-2,3-디히드로-1-메틸-5-페닐-1H-1,4-벤조디아제핀-2-온, (N)-[(S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴]-1-(L-알라니닐)-(S)-1-아미노-3-메틸--4,5,6,7-테트라히드로-2H-3-벤즈아제핀-2-온, BMS-708163 (아바가세스탯(Avagacestat)), BMS-708163, 세마가세스탯(Semagacestat) (LY450139), 세마가세스탯 (LY450139), MK-0752, MK-0752, YO-01027, YO-01027 (디벤즈아제핀, DBZ), LY-411575, LY-411575, 또는 LY2811376을 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 감마 세크레타제 억제제는 세포 배양물 또는 세포 집단에 약 0.01 μM 내지 약 1000 μM의 농도로 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 감마 세크레타제 억제제는 세포 배양물 또는 세포 집단에 약 0.1 μM 내지 약 100 μM의 농도로 존재한다. 한 측면에서, 감마 세크레타제 억제제는 이의 첨가 후에 제거된다.
본원에 기재된 실시양태들은 시험관내의 만능 인간 줄기 세포를 내분비 세포로 분화시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 한 측면에서, 내분비 세포는 CHGA를 발현한다. 한 측면에서, 내분비 세포는 시험관내에서 인슐린을 생산할 수 있다. 한 측면에서, 내분비 세포는 미성숙 내분비 세포 예컨대 미성숙 베타 세포이다. 한 측면에서, 시험관내의 인슐린 생산 세포는 글루코스 자극에 반응하여 인슐린을 생산할 수 있다.
한 실시양태는 (a) 내분비 세포 집단을 이식가능한 반투과성 장치 내로 로딩하는 단계; (b) 내분비 세포가 있는 장치를 포유동물 숙주 내로 이식하는 단계; 및 (c) 상기 장치 내의 내분비 세포 집단을 생체내에서 성숙시키고, 이때 내분비 세포의 적어도 일부가 생체내에서 글루코스 자극에 반응하여 인슐린을 생산하는 인슐린 분비 세포이며, 이에 의해 포유동물의 생체내에서 인슐린을 생산하는 단계를 포함하는, 포유동물의 생체내에서 인슐린을 생산하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 내분비 세포는 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)이 더 높은 PEC를 포함하는 세포 조성물로부터 유래된다. 또 다른 측면에서, 내분비 세포는 내분비 하위집단 (CHGA+)이 감소된 PEC를 포함하는 세포 조성물로부터 유래된다. 또 다른 측면에서, 내분비 세포는 미성숙 내분비 세포, 바람직하게는 미성숙 베타 세포이다.
한 측면에서, 만능 줄기 세포로부터 시험관내에서 제조된 내분비 세포는 PDX-1 양성 췌장 내배엽 집단 또는 PDX1/NKX6.1 양성인 비-내분비 (CHGA-) 하위집단과 비교하여 더 많은 PDX1 및 NKX6.1을 발현한다. 한 측면에서, 만능 줄기 세포로부터 시험관내에서 제조된 내분비 세포는 PEC 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)보다 비교적 더 많은 PDX1 및 NKX6.1을 발현한다. 한 측면에서, 골 형태형성 단백질 (BMP) 및 레틴산 (RA) 유사체가 단독으로 또는 조합되어 세포 배양물에 첨가되어, PEC 비-내분비 다능 선조 하위집단 (CHGA-)과 비교하여 PDX1 및 NKX6.1의 발현이 증가된 내분비 세포가 수득된다. 한 측면에서, BMP는 BMP2, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8 및 BMP4로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 BMP4이다. 한 측면에서, 레틴산 유사체는 올-트랜스 레틴산 및 TTNPB (4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]벤조산 아로티노이드 산), 또는 0.1-10 μM AM-580 (4-[(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카르복사미도]벤조산)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 TTNPB이다.
한 실시양태는 응집체의 해리 및 재회합을 포함하는, 시험관내의 만능 줄기 세포를 내분비 및 미성숙 내분비 세포, 바람직하게는 미성숙 베타 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 해리 및 재회합은 단계 1, 단계 2, 단계 3, 단계 4, 단계 5, 단계 6 또는 단계 7, 또는 이들의 조합에서 일어난다. 한 측면에서, 확정적 내배엽, PDX1-음성 앞창자 내배엽, PDX1-양성 앞창자 내배엽, PEC, 및/또는 내분비 및 내분비 선조/전구 세포가 해리 및 재회합된다. 한 측면에서, 단계 7 해리 및 재응집 세포 응집체는 내분비 (CHGA+) 하위집단과 비교하여 더 적은 비-내분비 (CHGA-) 하위집단으로 이루어진다. 한 측면에서, 세포 집단 내의 세포의 10％ 초과, 바람직하게는 20％, 30％, 40％ 초과, 더욱 바람직하게는 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 초과 또는 100％가 내분비 (CHGA+) 세포이다.
한 실시양태는 단계 4 PEC 생산 동안 제조된 내분비 세포를 제거함으로써 PDX1+ 및 NKX6.1+인 비-내분비 다능 췌장 선조 (CHGA-) 하위집단을 강화하는 것에 의한, 시험관내의 만능 줄기 세포를 내분비 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태는 표 17에서 정의된 바와 같은 단계 6 및 단계 7 세포가 약 0.02％ 내지 2％, 바람직하게는 약 0.02％ 내지 0.05％, 바람직하게는 약 0.05％ 내지 1％, 바람직하게는 0.05％의 낮은 수준의 매트리겔(Matrigel)에서 배양되는, 시험관내의 만능 줄기 세포를 내분비 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태는 세포 배양물을 매트리겔 및 rho-키나제 또는 ROCK 억제제로 처리함으로써 PEC 및 내분비 세포 응집체의 세포 부착을 개선하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, rho-키나제 또는 ROCK 억제제는 Y-27632이다.
한 실시양태에서, 단계 3 및/또는 단계 4에 노긴(Noggin) 패밀리 구성원을 첨가하지 않는 것에 의해 비-내분비 다능 선조 하위집단 (CHGA-)에 대해 강화된 PEC 배양물이 제조된다. 한 실시양태에서, 단계 3 및/또는 단계 4에 노긴 패밀리 구성원을 첨가하지 않는 것에 의해 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)가 비교적 충분한 PEC 배양물이 제조된다. 한 측면에서, 노긴 패밀리 구성원은 노긴, 코딘(Chordin), 폴리스타틴(Follistatin), 폴리스타틴-유사 단백질, 세르베루스(Cerberus), 코코(Coco), 단(Dan), 그렘린(Gremlin), 스클레로스틴(Sclerostin), PRDC (단 및 세르베루스와 관련된 단백질)를 포함하는 군으로부터 선택된 화합물이다.
한 실시양태는 높은 수준의 외인성 글루코스를 포함하는 배지에서 내분비 세포를 배양하는 것에 의해 내분비 세포를 배양 상태로 유지시키는 방법을 제공하고, 이때 외인성 글루코스는 약 1 mM 내지 25 mM, 약 1 mM 내지 20 mM, 약 5 mM 내지 15 mM, 약 5 mM 내지 10 mM, 약 5 mM 내지 8 mM이다. 한 측면에서, 배지는 DMEM, CMRL 또는 RPMI를 기초로 하는 배지이다.
한 실시양태는 세포 응집체를 해리 및 재회합시키면서 또는 세포 응집체의 해리 및 재회합 없이 시험관내의 만능 줄기 세포를 내분비 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 해리되지 않은 세포 응집체 또는 해리 및 재회합된 세포 응집체가 내분비 세포의 생체내 기능에 영향을 미치지 않으면서 단계 6 및/또는 단계 7에 냉동 보존 또는 동결된다. 한 측면에서, 냉동보존된 내분비 세포 배양물이 해동되고, 배양되며, 이식되었을 때 생체내에서 기능한다.
또 다른 실시양태는 초기 분화 단계 동안 내분비 유전자 발현을 억제하거나 저해할 수 있는 작용제 및 후기 분화 단계 동안 내분비 유전자 발현을 유도할 수 있는 작용제를 적어도 포함하는, 만능 줄기 세포를 내분비 세포로 분화시키기 위한 배양 시스템을 제공한다. 한 측면에서, 췌장 PDX1 음성 앞창자 세포로 이루어진 배양 시스템에 내분비 유전자 발현을 억제하거나 저해할 수 있는 작용제가 첨가된다. 한 측면에서, PDX1-양성 췌장 내배엽 선조 또는 PEC로 이루어진 배양 시스템에 내분비 유전자 발현을 유도할 수 있는 작용제가 첨가된다. 한 측면에서, 내분비 유전자 발현을 억제하거나 저해할 수 있는 작용제는 TGF베타 수용체 패밀리를 활성화시키는 작용제이고, 바람직하게는 이는 액티빈이며, 바람직하게는 이는 높은 수준의 액티빈에 이어지는 낮은 수준의 액티빈이다. 한 측면에서, 내분비 유전자 발현을 유도할 수 있는 작용제는 N-[N-(3,5-디플루오로페나세틸-L-알라닐)]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르 (DAPT), RO44929097, DAPT (N--[N-(3,5-디플루오로페나세틸-L-알라닐)]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르), 1-(S)-엔도-N-(1,3,3)-트리메틸비시클로[2.2.1]헵트-2-일)-4-플루오로페닐 술폰아미드, WPE-III31C, S-3-[N'-(3,5-디플루오로페닐-알파-히드록시아세틸)-L-알라닐릴]아미노-2,3-디히드로-1-메틸-5-페닐-1H-1,4-벤조디아제핀-2-온, (N)-[(S)-2-히드록시-3-메틸-부티릴]-1-(L-알라니닐)-(S)-1-아미노-3-메틸-- 4,5,6,7-테트라히드로-2H-3-벤즈아제핀-2-온, BMS-708163 (아바가세스탯), BMS-708163, 세마가세스탯 (LY450139), 세마가세스탯 (LY450139), MK-0752, MK-0752, YO-01027, YO-01027 (디벤즈아제핀, DBZ), LY-411575, LY-411575, 또는 LY2811376로 이루어진 군으로부터 선택된 감마 세크레타제 억제제이다. 한 측면에서, 높은 수준의 액티빈은 40 ng/mL, 50 ng/mL, 및 75 ng/mL를 초과하는 수준을 의미한다. 한 측면에서, 높은 수준의 액티빈은 단계 3 동안 또는 췌장 앞창자 내배엽 세포의 생산 전에 사용된다. 한 측면에서, 낮은 수준의 액티빈은 30 ng/mL, 20 ng/mL, 10 ng/mL 및 5 ng/mL 미만을 의미한다. 한 측면에서, 낮은 수준의 액티빈은 단계 4 동안 또는 PEC 생산을 위해 사용된다. 한 측면에서, 억제 또는 유도되는 내분비 유전자는 NGN3이다. 또 다른 측면에서, 췌장 앞창자 내배엽 세포의 생산 전에 또는 바람직하게는 단계 3 동안 내분비 발현을 억제하기 위해, 바람직하게는 NGN3 발현을 억제하기 위해 액티빈 A 및 Wnt3A가 단독으로 또는 조합되어 사용된다. 한 측면에서, 감마 세크레타제 억제제, 바람직하게는 RO44929097 또는 DAPT가 PEC 생산 후에 또는 바람직하게는 단계 5, 단계 6 및/또는 단계 7 동안에 내분비 유전자 발현의 발현을 유도하기 위해 배양 시스템에서 사용된다.
내분비 세포를 포함하는 시험관내 세포 배양물이고, 이때 상기 인간 세포의 5％ 이상이 인슐린 (INS), NK6 호메오박스(homeobox) 1(NKX6.1), 췌장 및 십이지장 호메오박스 1 (PDX1), 전사 인자 관련 유전자좌 2 (NKX2.2), 페어드 박스(paired box) 4 (PAX4), 신경성 분화 1 (NEUROD), 포크헤드(forkhead) 박스 A1 (FOXA1), 포크헤드 박스 A2 (FOXA2), 달팽이 패밀리 아연 핑거 2 (SNAIL2), 및 근건막 섬유육종 종양유전자 패밀리 A 및 B (MAFA 및 MAFB)로 이루어진 군으로부터 선택된 내분비 마커를 발현하고, 뉴로제닌(Neurogenin) 3 (NGN3), 섬 1 (ISL1), 간세포 핵 인자 6 (HNF6), GATA 결합 단백질 4 (GATA4), GATA 결합 단백질 6 (GATA6), 췌장 특이적 전사 인자 1a (PTF1A) 및 SRY (성 결정 영역 Y)-9 (SOX9)로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 실질적으로 발현하지 않으며, 상기 내분비 세포가 단능이고 췌장 베타 세포로 성숙될 수 있는 시험관내 세포 배양물.
내분비 세포가 미성숙 베타 세포인 것이 바람직하다.
상기 인간 세포의 10％ 이상이 미성숙 베타 세포인 것이 바람직하다.
상기 인간 세포의 20％ 이상이 미성숙 베타 세포인 것이 바람직하다.
상기 인간 세포의 50％ 이상이 미성숙 베타 세포인 것이 바람직하다.
세포가 비-재조합 세포인 것이 바람직하다.
세포가 인간 배아 줄기 세포 (hESC), 유도형 만능 줄기 세포 (iPSC), 단성생식 세포, 배아 암종 (EC) 세포, 중내배엽 세포, 확정적 내배엽 세포, PDX1-1 음성 췌장 앞창자 내배엽 세포, PDX1-양성 췌장 앞창자 내배엽 세포, 및 췌장 내배엽 세포 (PEC)로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 만능 줄기 세포로부터 유래되는 것이 바람직하다.
a) PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포 집단을 TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 활성화시키는 인자와 접촉시킴으로써, PDX1-양성 췌장 내배엽 세포 집단을 생산하는 단계; 및 b) PDX-양성 췌장 내배엽 세포 집단을 감마 세크레타제 억제제와 접촉시킴으로써, INS 및 NKX6.1을 발현하는 미성숙 베타 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 미성숙 베타 세포를 생산하는 방법.
PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포 집단이 Wnt 및 헤레귤린 패밀리 구성원과 접촉되는 것이 바람직하다.
TGF베타-수용체 패밀리 구성원이 액티빈 A, 액티빈 B, 노달, GDF-8, GDF-10, GDF-11 및 GDF15로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
TGF베타-수용체 패밀리 구성원이 액티빈 A, GDF-8 및 GDF-11인 것이 바람직하다.
TGF베타-수용체 패밀리 구성원이 액티빈 A인 것이 바람직하다.
Wnt 패밀리 구성원이 WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16 및 WNT3A로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
Wnt 패밀리 구성원이 Wnt3a인 것이 바람직하다.
헤레귤린 (HRG) 패밀리 구성원이 HRG1, HRG 2, HRG 3 및 HRG4인 것이 바람직하다.
HRG 패밀리 구성원이 HRG1 및 HRG2인 것이 바람직하다.
a) PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포 집단을 TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 활성화시키는 인자와 접촉시킴으로써, PDX1-양성 췌장 내배엽 세포 집단을 생산하는 단계; 및 b) PDX-양성 췌장 내배엽 세포 집단을 감마 세크레타제 억제제와 접촉시킴으로써, INS 및 NKX6.1을 발현하는 미성숙 베타 세포를 생산하는 단계; c) 단계 (b)로부터의 미성숙 베타 세포를 이식하는 단계; 및 d) 세포를 글루코스 자극에 반응하여 생체내에서 인슐린을 분비하는 성숙 베타 세포로 성숙시키는 단계를 포함하는, 생체내에서 인슐린을 생산하는 방법.
본 발명의 바람직한 특색 및 측면은 하기와 같다.
단계 7에, 작용제들이 여전히 유전자 발현을 조정할 수 있다. FGF 슈퍼패밀리의 구성원이 단계 7에 첨가되는 것이 바람직하다. FGF2가 단계 7에 첨가되는 것이 바람직하다. FGF2는 SST 발현을 증가시킬 수 있고/있거나 INS, GCG 또는 GHRL 발현을 억제할 수 있다. BMP가 단계 7에 첨가되는 것이 바람직하다. BMP는 INS, PDX1 또는 IDI 발현을 증가시킬 수 있다.
생체내 기능을 초래하는 미성숙 베타 세포 집단. 미성숙 베타 집단이 CHGA+인 것이 바람직하다. 미성숙 베타 세포 집단이 생체내에서 기능할 수 있는 것, 즉 이식되었을 때 혈액 글루코스에 반응하여 인슐린을 분비할 수 있는 것이 바람직하다. 내분비 세포 집단이, 이식되었을 때, 기능성 췌장 섬 세포로 발달 및 성숙될 수 있는 것이 바람직하다. 미성숙 베타 세포 집단에서 내분비 세포가 강화되는 것 (또는 비-내분비 세포가 고갈되는 것)이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 미성숙 베타 세포 집단 내의 세포의 약 50％ 초과가 CHGA+이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 미성숙 베타 세포 집단 내의 세포의 약 60％ 또는 70％ 또는 80％ 또는 90％ 또는 95％ 또는 98％ 초과 또는 100％가 CHGA+이다. 바람직한 실시양태에서, 미성숙 베타 세포 집단 내의 세포의 약 50％ 미만이 CHGA-이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 미성숙 베타 세포 집단 내의 세포의 약 15％ 미만이 CHGA-이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 미성숙 베타 세포 집단 내의 세포의 약 10％ 또는 5％ 또는 3％ 또는 2％ 또는 1％ 또는 0.5％ 미만 또는 0％가 CHGA-이다. 추가로, 단계 3 동안의 NGN3 발현과 같이 미성숙 베타 세포의 생산 동안 특정 마커의 발현이 억제될 수 있다. 미성숙 베타 세포 집단이 단일-호르몬성 (예를 들어 INS 단독)인 것이 바람직하다. 미성숙 베타 세포 집단이 NKX6.1 및 PDX1을 포함하는 다른 세포 마커를 공발현하는 것이 바람직하다. 미성숙 베타 세포 집단이 단일-호르몬성이고 또한 NKX6.1 및 PDX1을 포함하는 다른 세포 마커를 공발현하는 것이 바람직하다. 미성숙 베타 세포 집단에 전체 INS 집단의 백분율로서 더 많은 단일 호르몬 발현 INS 세포가 있는 것이 바람직하다. 미성숙 베타 세포 집단에 전체 INS 집단의 백분율로서 50％ 이상의 단일 호르몬 발현 INS 세포가 있는 것이 바람직하다. 미성숙 베타 세포 집단이 CHGA+/INS+/NKX6.1+ (3중 양성)인 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 미성숙 베타 세포 집단 내의 세포의 약 25％ 초과가 CHGA+/INS+/NKX6.1+ (3중 양성)이다. 바람직한 실시양태에서, 미성숙 베타 세포 집단 내의 세포의 약 30％ 또는 40％ 또는 50％ 또는 60％ 또는 70％ 또는 80％ 또는 90％ 또는 95％ 초과, 100％가 CHGA+/INS+/NKX6.1+ (3중 양성)이다.
세포 응집체의 해리 및 재응집에 의해 제조된 강화된 미성숙 베타 세포 집단. 강화된 미성숙 베타 세포 집단이 단계 7에 해리 및 재응집되는 것이 바람직하다. 미성숙 베타 세포 집단이 대략적으로 제25일, 제26일, 또는 제27일 또는 제28일 또는 제29일 또는 제30일 또는 그 이후에 해리 및 재응집되는 것이 바람직하다.
복합 배지가 내분비 세포 유지에 중요하다. 복합 배지가 CMRL 또는 RPMI인 것이 바람직하다. 복합 배지가 단계 6 또는 단계 7 또는 단계 6 및 단계 7 양쪽 모두에 사용되는 것이 바람직하다. CMRL이 내분비 마커 발현을 증가시켰다. RPMI가 내분비 마커 발현을 증가시켰다.
냉동보존은 단계 7에 미성숙 베타 세포 집단을 감소시키지 않는다. 냉동보존은 단계 7에 CHGA+ 발현을 감소시키지 않는다.
단계 7 세포는 NKX6.1 양성이다. 단계 7 세포는 C-펩티드 양성이다. 단계 7 세포는 NKX6.1 및 C-펩티드 공동-양성이다. 단계 7 세포는 단일 호르몬성이다. 단계 7 세포는 단독으로 INS 및 GCG를 발현한다.
단계 7 세포의 해리 및 재응집은 생체내 기능에 영향을 미치지 않는다.
단계 7 세포의 냉동보존은 생체내 기능에 영향을 미치지 않는다.
단계 7 세포는 냉동보존될 수 있고, 이의 생체내 기능을 유지한다.
글루코스 농도를 증가시키는 것은 INS, GCG 또는 SST 발현을 증가시킨다. 글루코스 농도가 단계 6 또는 단계 7 또는 양쪽 모두에 증가되는 것이 바람직하다. 글루코스 농도 증가와 함께 GHRL 발현이 감소되는 것이 바람직하다.
단일-호르몬성 (INS 단독)인 시험관내 미성숙 베타 세포.
NKX6.1 및 PDX1을 공발현하는 시험관내 미성숙 베타 세포.
단일-호르몬성 (INS 단독)이고, NKX6.1 및 PDX1을 공발현하는 시험관내 미성숙 베타 세포.
단일-호르몬성 (INS 단독)이고, NKX6.1 및 PDX1을 공발현하며, 혈액 글루코스에 반응하여 인슐린을 분비할 수 있는 세포로 생체내에서 성숙될 수 있는 시험관내 미성숙 베타 세포.
혈액 글루코스에 반응하여 인슐린을 분비할 수 있는 세포로 생체내에서 성숙될 수 있는 시험관내 미성숙 베타 세포.
CHGA+, INS+ 및 NKX6.1+인 시험관내 미성숙 베타 세포. 전체 시험관내 세포 집단의 10％ 초과가 CHGA+, INS+ 및 NKX6.1+인 미성숙 베타 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 전체 시험관내 세포 집단의 50％ 초과가 CHGA+, INS+ 및 NKX6.1+인 미성숙 베타 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 전체 시험관내 세포 집단의 80％ 초과가 CHGA+, INS+ 및 NKX6.1+인 미성숙 베타 세포를 포함하는 것이 바람직하다.
정제된 미성숙 베타 세포. 정제된 미성숙 베타 세포 전구체. 미성숙 베타 세포 또는 베타 세포 전구체가 아연 센서를 사용하여 단계 7 세포 집단으로부터 정제되는 것이 바람직하다. 아연에 결합된 Py 1 센서의 존재로 인한 어두운 형광이 베타 세포에 대해 강화되는 것이 바람직하다. 아연에 결합된 Py 1 센서의 존재로 인한 밝은 형광이 알파 세포에 대해 강화되는 것이 바람직하다. 아연 센서를 사용하여 베타 세포를 정제하는 방법. 아연 센서를 사용하여 알파 세포를 정제하는 방법. 정제된 알파 세포. 정제된 알파 세포 전구체.
베타 세포 계통의 마커 예컨대 INS, IAPP, PDX1, NKX6.1, PAX4, PCSK1, G6PC2, GCK, 또는 SLC30A8을 발현하는 강화된 세포 집단.
알파 세포 계통의 마커 예컨대 GCG, ARX, 또는 SLC30A8을 발현하는 강화된 세포 집단
세포의 50％ 초과가 INS 양성인, 강화된 세포 집단. 세포 집단에 90％를 초과하는 INS 양성 세포가 있는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 세포의 50％-99％가 INS 양성 세포이다.
a) 시험관내에서 CHGA+ 세포들의 집단을 수득하는 단계; 및 b) CHGA+ 세포를 이식함으로써 생체내에서 인슐린을 생산하는 단계를 포함하는, 생체내에서 인슐린을 생산하는 방법.
CHGA+ 세포가 단계 7에 해리 및 재응집되는 것이 바람직하다.
CHGA+ 세포가 PDX1 및 NKX6.1을 발현하는 것이 바람직하다.
CHGA+ 세포가 INS 및 NKX6.1을 발현하는 것이 바람직하다.
CHGA+ 세포가 CMRL 또는 RPMI에서 배양되는 것이 바람직하다.
CHGA+ 세포가 냉동보존되고, 이식 전에 해동되는 것이 바람직하다.
CHGA+ 세포가 고-글루코스를 함유하는 배지에서 배양되는 것이 바람직하다.
생체내에서 생리학적으로 기능성인 인슐린 분비 세포를 초래할 수 있는 시험관내 내분비 세포.
생체내에서 생리학적으로 기능성인 인슐린 분비 세포를 초래할 수 있는, 시험관내의 정확하게 특정된 미성숙 베타 세포.
정확하게 특정된 미성숙 베타 세포가 단계 7에 해리 및 재응집되는 것이 바람직하다.
정확하게 특정된 미성숙 베타 세포가 PDX1 및 NKX6.1을 발현하는 것이 바람직하다.
정확하게 특정된 미성숙 베타 세포가 INS 및 NKX6.1을 발현하는 것이 바람직하다.
정확하게 특정된 미성숙 베타 세포가 CMRL 또는 RPMI에서 배양되는 것이 바람직하다.
정확하게 특정된 미성숙 베타 세포가 냉동보존되고, 이식 전에 해동되는 것이 바람직하다.
정확하게 특정된 미성숙 베타 세포가 고-글루코스를 함유하는 배지에서 배양되는 것이 바람직하다.
CHGA+ 세포들의 집단을 수득하는 단계 및 분류하는 단계를 포함하는, 시험관내에서 강화된 미성숙 베타 세포 집단을 생산하는 방법. CHGA+ 세포들의 집단을 수득하는 단계 및 분류하는 단계를 포함하는, 시험관내에서 INS, IAPP, PDX1, NKX6.1 또는 PAX4를 발현하는 강화된 세포 집단을 생산하는 방법.
CHGA+ 세포들의 집단을 수득하는 단계 및 분류하는 단계를 포함하는, 시험관내에서 강화된 알파 세포 집단을 생산하는 방법.
CHGA+ 세포들의 집단을 수득하는 단계 및 분류하는 단계를 포함하는, 시험관내에서 GCG 또는 ARX를 발현하는 강화된 세포 집단을 생산하는 방법.
알파 또는 베타 세포들의 강화된 집단이 Py 1 아연 센서를 사용하여 분류되는 것이 바람직하다.
실시양태들에서, 미성숙 베타 세포는 INS 및 NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는다. 실시양태들에서, 미성숙 베타 세포는 INS, NKX6.1 및 MAFB를 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는다.
도 1은 리프로그래밍된 탈분화 세포 (본원에서 iPS 세포로도 지칭됨)의 응집체 현탁 배양물의 사진 영상이다. 실시예 1 참조.
도 2a-l은 OCT4 (도 2a), 브라키우리(BRACHYURY) (도 2b), CER1 (도 2c), GSC (도 2d), FOXA2 (도 2e), FOXA1 (도 2f), HNF6 (도 2g), PDX1 (도 2h), PTF1A (도 2i), NKX6.1 (도 2j), NGN3 (도 2k) 및 INS (도 2l)의 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이다. 발현 수준은 하우스키핑(housekeeping) 유전자인 시클로필린 G 및 TATA 결합 단백질 (TBP) 발현의 평균 발현 수준에 대해 표준화된다. 그래프는 데이터 세트 내의 최저 데이터 지점에 대한 배수 상향 조절을 도시한다. 실시예 1 참조.
도 3은 (패널 A) PDX-1; (패널 B) NKX6.1; (패널 C) PTF1A; 및 (패널 D) Dapi에 대해 특이적인 항체를 사용한 단계 4 분화로부터의 인간 iPS 세포 (G4 hIPS 세포주를 사용한 E2021) 배양물 (PDX1-양성 췌장 내배엽 세포)의 면역세포화학 (ICC)의 현미경사진이다. 실시예 2 참조.
도 4는 (패널 A) 글루카곤; (패널 B) 인슐린; (패널 C) 소마토스타틴; 및 (패널 D) Dapi에 대해 특이적인 리간드를 사용한 단계 5 분화로부터의 iPS 세포 배양물 (G4 hIPS 세포주를 사용한 E2021)의 면역세포화학 (ICC)의 사진이다. 실시예 2 참조.
도 5a-b는 R&D 시스템즈(R&D Systems)의 프로테옴 프로파일러(Proteome Profiler)™ 인간 포스포-RTK 항체 어레이에서 제공된 어레이 위치 지도 및 어레이 키(key)이다. 도 5a의 위치 지도는 RTK 항체의 좌표 또는 위치를 나타낸다. RTK 패밀리 및 항체의 신원 또는 명칭이 도 5b의 키에서 기재된다. 따라서, 도 5a에서와 같은 투명체를 오버레이하고 오버레이 상의 좌표 (도 5a)와 도 5b의 RTK의 명칭을 지칭하여 신호를 확인함으로써, 현상된 필름에서 관찰된 양성 신호를 확인할 수 있다. 실시예 4 참조.
도 6은 실시예 5에 기재된 4가지 상이한 조건 (패널 A, B, C 및 D) 하에서의 iPS 세포-유래 췌장 내배엽 세포 (PEC)의 RTK 어레이 분석이다. 고강도 대 저강도 신호의 확인에 의해 특정 RTK의 티로신 인산화가 관찰된다. IGF1R/IR 및 ERBB (EGFR) 패밀리 구성원이 확인되거나 또는 상자로 표시된다. 실시예 5 참조.
도 7a-c는 실험 E2314, E2356 및 E2380 (도 7a), E2347 (도 7b), 및 E2354 (도 7c)에 대한 이식 마우스의 혈청 내의 인간 C-펩티드 및 인슐린의 농도를 나타내는 그래프이다. 도 7a: PDX1-발현 세포를 시험관내에서 헤레귤린으로 처리하는 것이 이식 및 생체내에서의 성숙 시 글루코스-자극 인슐린 분비를 개선시킨다. 도 7b: 이식 23주 후, 마우스 당뇨병 모델의 STZ-유도 3주 전의 글루코스-자극 C-펩티드 수준. PEC가 이식된 마우스를 지시된 생착-후 시점에 공복, 복막내 글루코스 투여 30분 후 및 60분 후의 인간 C-펩티드의 혈청 수준에 대해 분석하였다. 도 7c에서는, 세포 캡슐화 장치 (엔캡트라(Encaptra)® EN20, 또는 EN20, 비아사이트(ViaCyte) (캘리포니아주 샌디에고))에 PEC가 캡슐화되었고, 일부 경우에서는, 장치에 미세천공이 있었다 (pEN20, 비아사이트 (캘리포니아주 샌디에고)). 이같은 장치가 미국 특허 번호 8,278,106에 기재되어 있다. 실시예 7 참조.
도 8a-b는 실험 #2347에 대한 STZ-처리 마우스의 혈액 글루코스 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 이식된 iPEC로부터 유래된 글루코스-반응성 인슐린-분비 베타 세포가 STZ-유도 당뇨병 모델에서 혈액 글루코스를 제어한다는 것이 제시된다. 도 8a: 13마리의 마우스 각각에 대한 혈액 글루코스를 나타낸다 (헤레귤린 존재 또는 부재 하의 기준선). 도 8b는 각각의 처리에 대한 합쳐진 평균 측정치를 나타낸다 (헤레귤린 존재 또는 부재 하의 기준선). 무작위 비-공복 혈액 글루코스의 측정치가 STZ 처리일 (제0일) 전에 14일까지의 iPEC 이식편이 이식된 마우스 13마리 및 STZ 처리 후 및 이식편이 체외이식된 후의 동일한 마우스에 대해 제시된다. 이식편 이식 약 26주 후에 STZ-처리 동물에 STZ가 제공되었다 (제0일). STZ-처리를 시작한지 약 2주 후인 이식편 이식 약 28주 후에, iPEC 이식편을 체외이식하였다 (제거하였다). 각각의 동물에 대해 경시적으로 비-공복 혈액 글루코스 측정치를 수집하였다. 실시예 7 참조.
도 9a-e는 PDX1 (도 9a), NKX6.1 (도 9b), PTF1A (도 9c), NKX2.2 (도 9d), 및 NGN3 (도 9e)의 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이다. 실시예 8 참조.
도 10은 50 ng/mL의 액티빈 A의 첨가로 PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포 (단계 2)가 PDX1-양성 앞창자 내배엽 (단계 3)으로 분화된 응집체 현탁 배양물의 사진 영상이다. 실시예 8 참조.
도 11은 5 ng/mL (ACT5) 또는 10 ng/mL (ACT10)의 액티빈 A를 단계 3에 또는 5 ng/mL (ACT5)의 액티빈을 단계 3 및 단계 4에 사용한 단계 3 (제8일, 상부 패널) 및 단계 4 (제12일, 하부 패널) 마지막의 응집체 현탁 배양물의 사진 영상이다. 실시예 8 참조.
도 12는 단계 4 동안 (a-e, 상부 패널) 또는 단계 4 마지막 (a-e, 하부 패널)의 응집체 현탁 배양물의 사진 영상이다. 상부 패널은 10 ng/mL의 액티빈 A 및 2 ng/mL 헤레귤린 (ACT 10 HGN 2), 또는 20 ng/mL의 액티빈 A 및 2 ng/mL 헤레귤린 (ACT 20 HGN 2), 또는 20 ng/mL의 액티빈 A 및 10 ng/mL 헤레귤린 (ACT 20 HGN 10), 또는 10 ng/mL의 액티빈 A, 2 ng/mL 헤레귤린 및 50 ng/mL WNT (ACT 10 HGN 2 WNT 50)가 단계 3에 첨가되었음을 나타낸다. 하부 패널은 25 ng/mL의 액티빈 A (ACT 25), 50 ng/mL의 액티빈 A (ACT 50), 75 ng/mL의 액티빈 A (ACT 75), 또는 100 ng/mL의 액티빈 A (ACT 100)가 단계 3에 첨가되었음을 나타낸다. 모든 조건에서 단계 4에 낮은 액티빈 및 헤레귤린이 제공되었다. 실시예 9 참조.
도 13a-c는 실시예 9에 기재된 바와 같이 액티빈, 헤레귤린 및 WNT (AHW)가 단계 3에 첨가되고 액티빈 및 헤레귤린 (AH)이 단계 4에 첨가되었을 때의 NGN3 (도 13a), NKX2.2 (도 13b) 및 NKX6.1 (도 13c)의 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이다.
도 14a-b는 실시예 10에 기재된 바와 같이 액티빈, 헤레귤린 및 WNT (AHW)가 단계 3에 첨가되고 액티빈 및 헤레귤린 (AH)이 단계 4에 첨가되었을 때의 NKX6.1 (도 14a) 및 NGN3 (도 14b)의 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이다.
도 15는 캡슐화된 PEC (대조군) 및 캡슐화된 변형된 PEC (단계 3의 액티빈, 헤레귤린 및 WNT (AHW), 및 단계 4의 액티빈 및 헤레귤린 (AH)을 사용하여 생산됨)가 이식된 마우스의 혈청 내의 인간 C-펩티드의 농도를 나타내는 그래프이다. 생착 11주 후에 발현 수준을 공복, 복막내 글루코스 투여 30분 후 및 60분 후에 분석하였다. 실시예 10 참조.
도 16은 캡슐화된 PEC (대조군) 및 캡슐화된 변형된 PEC (단계 3의 액티빈, 헤레귤린 및 WNT (AHW), 및 단계 4에 첨가된 액티빈 및 헤레귤린 (AH)을 사용하여 생산됨)가 이식된 마우스의 혈청 내의 인간 C-펩티드의 농도를 나타내는 그래프이다. 생착 14주 후에 발현 수준을 공복, 복막내 글루코스 투여 30분 후 및 60분 후에 분석하였다. 실시예 10 참조.
도 17은 실시예 11에 기재된 바와 같이 단계 5에 감마-세크레타제 억제제로 처리한 후의 제13일, 15일 및 제17일의 뉴로제닌 3의 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이다.
도 18a-d는 단계 1-5에 대한 표 17에 따른 분화 후의 PDX1 (도 18a), NKX6.1 (도 18b), SOX9 (도 18c) 및 PTF1A (도 18d)의 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이고, 단계 6 및 7에 대해서는 실시예 12에 기재된 바와 같이 FBS, 매트리겔 및 rho-키나제 억제제만 기본 DMEM 배지에 더하여 사용되었다.
도 19a-d는 실시예 12에 기재된 바와 같은 도 18에서와 동일한 분화 조건 하의 INS (도 19a), GCG (도 19b), GHRL (도 19c) 및 SST (도 19d)의 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이다.
도 20은 실시예 12에 기재된 바와 같이 제조된 캡슐화된 내분비가 이식된 마우스의 혈청 내의 인간 C-펩티드의 농도를 나타내는 그래프이다 (E2395, Rag 2, 제10주 GSIS). 생착 10주 후에 발현 수준을 공복 및 복막내 글루코스 투여 60분 후에 분석하였다. 실시예 12 참조.
도 21은 실시예 12에 기재된 바와 같이 제조된 캡슐화된 내분비가 이식된 마우스의 혈청 내의 인간 C-펩티드의 농도를 나타내는 그래프이다 (E2395, Rag 2, 제15주 GSIS). 생착 15주 후에 발현 수준을 공복 및 복막내 글루코스 투여 60분 후에 분석하였다. 실시예 12 참조.
도 22a-d는 실시예 12에 기재된 바와 같이 생체내에서 분화 및 성숙된 내분비 세포 응집체를 나타내는 현미경사진이다. DAPI (도 22a) 또는 NKX6.1에 대한 항체 (도 22b & 도 22c, 핵 염색), 및 크로모그라닌(Chromogranin) A (도 22b & 도 22d, 세포질)로 세포 필드가 염색된다. 모든 영상에서 동일한 필드가 제시된다. 실시예 12 참조.
도 23a-c는 실시예 12에 기재된 바와 같은 내분비 세포 응집체를 나타내는 현미경사진이다. 도 23a는 INS (세포질) 및 NKX6.1 (핵)에 대해 염색된 세포의 필드를 나타낸다. 도 23b는 INS (세포질) 및 PDX1 (핵)에 대해 염색된 세포의 동일한 필드를 나타낸다. 도 23c는 DAPI로 염색된 세포의 동일한 필드를 나타낸다. 실시예 12 참조.
도 24a-d는 실시예 13에 기재된 분화 조건 하의 INS (도 24a), NKX6.1 (도 24b), PDX1 (도 24c) 및 ID1 (도 24d)의 상대적인 유전자 발현 수준의 나노스트링(Nanostring) mRNA 데이터를 나타내는 막대 그래프이다.
도 25a-c는 실시예 13에 기재된 바와 같은 내분비 세포 응집체를 나타내는 현미경사진이다. 도 25a는 TT 또는 BMP가 첨가되지 않은 대조군이고, 도 25b는 단계 7의 TT 첨가를 나타내며, 도 25c는 단계 7의 BMP 첨가를 나타낸다. 도 25a-c는 C-펩티드 (세포질) 및 PDX1 (핵)에 대한 염색을 나타낸다.
도 26a-b는 실시예 13에 기재된 바와 같은 내분비 세포 응집체를 나타내는 현미경사진이다. 도 26a는 단계 6 및 7에 TT 및 BMP로 처리되고, 도 26b는 단계 7의 TT 및 BMP 첨가를 나타낸다. 도 26a 및 b는 C-펩티드 (세포질) 및 PDX1 (핵)에 대한 염색을 나타낸다.
도 27a-c는 실시예 13에 기재된 바와 같은 내분비 세포 응집체를 나타내는 현미경사진이고, 도 25에서와 동일한 필드를 도시한다. 도 27a는 TT 또는 BMP가 첨가되지 않은 대조군이고, 도 27b는 단계 7의 TT 첨가를 나타내며, 도 27c는 단계 7의 BMP 첨가를 나타낸다. 도 27a-c는 C-펩티드 (세포질) 및 NKX6.1 (핵)에 대한 염색을 나타낸다.
도 28a-b는 실시예 13에 기재된 바와 같은 내분비 세포 응집체를 나타내는 현미경사진이고, 도 26에서와 동일한 필드를 도시한다. 도 28a는 단계 6 및 단계 7에 TT 및 BMP로 처리되고, 도 28b는 단계 7의 TT 및 BMP 첨가를 나타낸다. 도 28a 및 b는 C-펩티드 (세포질) 및 NKX6.1 (핵)에 대한 염색을 나타낸다.
도 29a-e는 실시예 13에 기재된 바와 같이 단계 6에 니코틴아미드로 처리되거나 (오른쪽 막대; d21 gi- d13-d15) 또는 처리되지 않고 (왼쪽 막대; d21 gi- d13-d15+NIC d15), 제21일에 분석된 내분비 응집체의 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이다.
도 30은 실시예 14에 기재된 바와 같이 단계 7을 시작할 때 해리 및 재응집된 후, FBS 단독 (패널 A) , FBS 및 0.05％ 매트리겔 양쪽 모두 (MG; 패널 B), FBS 및 10 μM Y-27632 양쪽 모두 (Y; 패널 C), 또는 FBS, 0.05％ 매트리겔 (MG) 및 10 μM Y-27632 3가지 모두 (Y; 패널 D)가 첨가된 내분비 세포 응집체 현탁 배양물의 사진 영상 (제21일, 제22일 및 제23일)을 나타낸다.
도 31a-d는 1일, 2일 및 3일 동안 노긴이 있는 분화 조건 및 노긴이 없는 분화 조건을 비교하는 NKX6.1 (도 31a), NKX2.2 (도 31b), PDX1 (도 31c) 및 INS (도 31d)의 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이다. 실시예 15 참조.
도 32a-c는 지시된 인자에 의한 유전자 발현에 대한 효과를 기재하는 INS 및 GCG (도 32a), GHRL 및 SST (도 32b) 및 PDX1 및 ID1 (도 32c)의 상대적인 유전자 발현 수준의 나노스트링 mRNA 데이터를 나타내는 막대 그래프이다. 실시예 16 참조.
도 33a-c는 비-재응집 배양물과 비교하여 재응집 배양물에서의 내분비 (CHGA+) 하위집단 및 비-내분비 (CHGA-) 하위집단을 기재하는 PDX1, NKX6.1, PTF1A, SOX9 (도 33a); INS, GCG, PPY,GHRL (도 33b) 및 PCSK1, GCK, SLC30A8, G6PC2 (도 33c)의 상대적인 유전자 발현 수준의 나노스트링 mRNA 데이터를 나타내는 막대 그래프이다. 실시예 17 참조.
도 34는 실시예 18에 기재된 바와 같이 제조되어 단계 7을 시작할 때의 해리 및 재응집에 의해 내분비 (CHGA+) 세포 유형이 강화된 캡슐화된 내분비 세포 (재응집 샘플)이 이식된 마우스의 혈청 내의 인간 C-펩티드의 농도를 동일한 방식으로 분화되었지만 재응집되지 않은 세포 (대조군 샘플)과 비교하여 나타내는 그래프이다. 생착 21주 후에 발현 수준을 공복, 복막내 글루코스 투여 30분 후 및 60분 후에 분석하였다. 실시예 18 참조.
도 35a-c는 단계 7 동안의 DMEM 및 CMRL 기재 배지의 효과를 기재하는 CHGA, INS, GCG, GHRL, PPY, SST (도 35a); GCK, G6CP2, UCN3, PCSK1 (도 35b); HNF1a, HNF4A, SLC30A8, CADH1 (도 35c)의 상대적인 유전자 발현 수준의 나노스트링 mRNA 데이터를 나타내는 막대 그래프이다. 실시예 19 참조.
도 36a-c는 실시예 20에 기재된 바와 같은 단계 7 내분비 세포 응집체를 나타내는 현미경사진이다. 이러한 응집체는 단계 7에 재응집되지 않았다. 도 36a 및 도 36b에서의 동일한 필드가 각각 INS (세포질) 및 GCG (세포질)에 대해 염색되었고, 도 36c는 NKX6.1 (핵) 및 C-펩티드 (세포질)에 대해 염색되었다.
도 37a-c는 실시예 20에 기재된 바와 같은 단계 7 내분비 세포 응집체를 나타내는 현미경사진이다. 이러한 응집체는 단계 7에 재응집되었다. 도 37a 및 도 37b에서의 동일한 필드가 각각 INS (세포질) 및 GCG (세포질)에 대해 염색되었고, 도 37c는 NKX6.1 (핵) 및 C-펩티드 (세포질)에 대해 염색되었다.
도 38은 실시예 20에 기재된 바와 같이 제조되어, 세포 배양물이 동결 (냉동보존) 및 해동되고 (F/T), 해리 및 재응집되지 않은 캡슐화된 내분비 세포 (좌측), 또는 동결되지 않았고 (신선), 단계 7을 시작할 때 해리 및 재응집된 캡슐화된 내분비 세포 (우측)가 이식된 마우스의 혈청 내의 인간 C-펩티드의 농도를 나타내는 그래프이다. 생착 12주 후에 발현 수준을 공복, 복막내 글루코스 투여 30분 후 및 60분 후에 분석하였다. 실시예 21 참조.
도 39a-b는 내분비 호르몬 발현에 대한 단계 6 동안의 외인성 고-글루코스의 효과를 기재하는 INS, GCG (도 39a) 및 SST, GHRL (도 39b)의 상대적인 유전자 발현 수준의 나노스트링 mRNA 데이터를 나타내는 막대 그래프이다. 실시예 21 참조.
도 40a-b는 단계 7 동안의 외인성 고-글루코스가 있는 실시예 21에 기재된 바와 같은 단계 7 내분비 세포 응집체를 나타내는 현미경사진이다. 도 40a는 INS (세포질)에 대한 염색을, 도 40b는 GCG (세포질)에 대한 염색을 나타낸다.
도 41은 먼저 아연 결합제인 Py1로 처리되고 형광을 통해 분류된 단계 7로부터의 미성숙 내분비 베타 세포의 강화를 나타내는 유동 세포측정법 그래프이다. 실시예 24 참조.
도 42a-c는 아연 분류로부터 강화된 세포를 특성화 및 확인하는 INS, GCG, GHRL, IAPP, SST 및 SST (도 42a); PAX4, PDX1, ARX, NKX6.1 (도 42b); 및 PCSK1, GCK, G6PC2 및 SLC30A8 (도 42c)의 상대적인 유전자 발현 수준의 나노스트링 mRNA 데이터를 나타내는 막대 그래프이다. 실시예 24 참조.
도 43은 시험관내에서의 췌장 내배엽 세포 (PEC)의 생산을 위한 단계 1-4 및 생체내에서의 인슐린 분비 베타 세포로의 성숙의 개략도이다. 이러한 개략도는 PEC의 2개의 주요 하위집단인 내분비 (CHGA+) 및 비-내분비 (CHGA-) 세포를 또한 도시한다. 배아 줄기 세포 (ESC), 중내배엽 (ME), 확정적 내배엽 (DE), 앞창자 (FG), 후기 앞창자 (pFG), 및 췌장 상피 또는 췌장 내배엽 (PE).
도 44는 시험관내에서의 내분비 세포의 생산을 위한 단계 1-7의 개략도이다. 이러한 개략도는 높은 수준의 액티빈 (단계 3)에 이어지는 낮은 수준의 액티빈 및 WNT의 제거 (단계 4)가 NGN3 발현을 억제 또는 저해하고, 이는 나중에 단계 5 동안 감마 세크레타제 억제제의 첨가로 발현된다는 것을 또한 도시한다. 배아 줄기 세포 (ESC), 중내배엽 (ME), 확정적 내배엽 (DE), 앞창자 (FG), 후기 앞창자 (pFG), 및 췌장 상피 또는 췌장 내배엽 (PE).
도 45는 시험관내에서의 내분비 세포의 생산을 위한 단계 1-7의 개략도이다. 이러한 개략도는 단계, 성장 인자, 세포 유형, 및 각각의 세포 유형의 서명 마커를 또한 나타낸다: 배아 줄기 세포 (ESC), 중내배엽 (ME), 확정적 내배엽 (DE), 앞창자 (FG), 후기 앞창자 (pFG), 췌장 상피 또는 췌장 내배엽 (PE), 프리(pre)-베타 세포 (프리-B; 또는 미성숙 베타 세포) 및 베타-세포 (β-세포).
하기의 본 발명의 바람직한 실시양태의 상세한 설명 및 본원에 포함된 실시예를 참조로 본 발명이 더욱 쉽게 이해될 수 있다. 그러나, 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법이 개시 및 기재되기 전에, 본 발명이 구체적인 세포 유형, 구체적인 피더(feeder) 세포 층, 구체적인 조건, 또는 구체적인 방법 등에 제한되지 않고 이러한 것들이 변할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 이들에서의 수많은 변형 및 변경이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본원에서 사용된 용어법은 구체적인 실시양태를 기재하기 위한 목적뿐이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다는 것을 또한 이해하여야 한다. 모든 특허 및 비-특허 간행물 참고문헌은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
만능 줄기 세포로부터 유래된 다양한 세포 조성물이 본원에 기재되어 있고, 출원인의 미국 특허 출원 번호 10/486,408 (영문 명칭이 "METHODS FOR CULTURE OF HESC ON FEEDER CELLS"이고, 2002년 8월 6일 출원됨); 11/021,618 (영문 명칭이 "DEFINITIVE ENDODERM"이고, 2004년 12월 23일 출원됨); 11/115,868 (영문 명칭이 "PDX1 EXPRESSING ENDODERM"이고, 2005년 4월 26일 출원됨); 11/165,305 (영문 명칭이 "METHODS FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DIFFERENTIATING DEFINITIVE ENDODERM"이고, 2005년 6월 23일 출원됨); 11/573,662 (영문 명칭이 "METHODS FOR INCREASING DEFINITIVE ENDODERM DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS WITH PI-3 KINASE INHIBITORS"이고, 2005년 8월 15일 출원됨); 12/729, 084 (영문 명칭이 "PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM"이고, 2005년 10월 27일 출원됨); 12/093,590 (영문 명칭이 "MARKERS OF DEFINITIVE ENDODERM"이고, 2005년 11월 14일 출원됨); 11/993,399 (영문 명칭이 "EMBRYONIC STEM CELL CULTURE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF"이고, 2006년 6월 20일 출원됨); 11/588,693 (영문 명칭이 "PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM"이고, 2006년 10월 27일 출원됨); 11/681,687 (영문 명칭이 "ENDOCRINE PROGENITOR/PRECURSOR CELLS, PANCREATIC HORMONE-EXPRESSING CELLS AND METHODS OF PRODUCTION"이고, 2007년 3월 2일 출원됨); 11/807,223 (영문 명칭이 "METHODS FOR CULTURE AND PRODUCTION OF SINGLE CELL POPULATIONS OF HESC"이고, 2007년 5월 24일 출원됨); 11/773,944 (영문 명칭이 "METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES"이고, 2007년 7월 5일 출원됨); 11/860,494 (영문 명칭이 "METHODS FOR INCREASING DEFINITIVE ENDODERM PRODUCTION"이고, 2007년 9월 24일 출원됨); 12/099,759 (영문 명칭이 "METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES"이고, 2008년 4월 8일 출원됨); 12/107,020 (영문 명칭이 "METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FORM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS"이고, 2008년 4월 21일 출원됨); 12/618,659 (영문 명칭이 "ENCAPSULATION OF PANCREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS"이고, 2009년 11월 13일 출원됨); 12/765,714 및 13/761,078 (양쪽 모두 영문 명칭이 "CELL COMPOSITIONS FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLS"이고, 2010년 4월 22일 및 2013년 2월 6일 출원됨); 11/838,054 (영문 명칭이 "COMPOSITIONS AND METHODS USEFUL FOR CULTURING DIFFERENTIABLE CELLS"이고, 2007년 8월 13일 출원됨); 12/264,760 (영문 명칭이 "STEM CELL AGGREGATE SUSPENSION COMPOSITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATION THEREOF"이고, 2008년 11월 4일 출원됨); 13/259,15 (영문 명칭이 "SMALL MOLECULES SUPPORTING PLURIPOTENT CELL GROWTH"이고, 2010년 4월 27일 출원됨); PCT/US11/25628 (영문 명칭이 "LOADING SYSTEM FOR AN ENCAPSULATION DEVICE"이고, 2011년 2월 21일 출원됨); 13/992,931 (영문 명칭이 "AGENTS AND METHODS FOR INHIBITING PLURIPOTENT STEM CELLS"이고, 2010년 12월 28일 출원됨); 및 미국 디자인 출원 번호 29/408,366 (2011년 12월 12일 출원됨); 29/408,368 (2011년 12월 12일 출원됨); 29/423,365 (2012년 5월 31일 출원됨); 및 29/447,944 (2013년 3월 13일 출원됨); 및 미국 가출원 번호 61/774,443 (영문 명칭이 "SEMIPERMEABLE MACRO IMPLANTABLE CELLULAR ENCAPSULATION DEVICES"이고, 2013년 3월 7일 출원됨); 61/775,480 (영문 명칭이 "CRYOPRESERVATION, HIBERNATION AND ROOM TEMPERATURE STORAGE OF ENCAPSULATED PANCREATIC ENDODERM CELL AGGREGATES"이고, 2013년 3월 8일 출원됨); 및 61/781,005 (영문 명칭이 "IN VITRO DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS TO PANCREATIC ENDODERM CELLS (PEC) AND ENDOCRINE CELLS"이고, 2013년 3월 14일 출원됨)에서 확인될 수 있다.
정의
본원에서 표현된 숫자 범위는 기재된 종점들을 포함하고, 언급된 숫자 범위의 종점들 사이의 모든 정수를 기재하는 것으로 이해될 것이다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 용어들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의한 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서 및 첨부된 청구항의 목적을 위하여, 달리 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구항에서 사용된 성분의 양, 물질의 백분율 또는 비율, 반응 조건 및 기타 수치를 표현하는 모든 숫자는모든 경우에 "약"이라는 용어가 이를 수식하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구항에 기재된 숫자 파라미터는 본 발명에 의해 수득되도록 추구되는 원하는 성질에 따라 변할 수 있는 근사값이다. 최소한, 그리고 균등론을 청구항의 범주에 적용하는 것을 제한하려 하지 않으면서, 각각의 숫자 파라미터는 적어도 보고된 유효 숫자(significant digit)의 수의 견지에서, 그리고 통상적인 반올림 기술을 적용함으로써 해석되어야 한다.
본원에 기재된 실시양태들의 실행은, 달리 지시되지 않는 한, 세포 생물학, 분자 생물학, 유전학, 화학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "세포"라는 용어는 개별적인 세포, 세포주, 또는 이같은 세포로부터 유래된 배양물을 또한 지칭한다. "배양물"은 동일한 유형 또는 상이한 유형의 단리된 세포들을 포함하는 조성물을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "배양물", "집단" 또는 "세포 집단"은 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 상호교환가능하게 사용되며, 이의 의미는 문맥에 따라 명백할 것이다. 예를 들어, "집단"이라는 용어는 동일한 특성을 지니는 1가지를 초과하는 세포의 세포 배양물일 수 있거나, 또는 이는 상이한 확인 특성이 있는 1가지를 초과하는 세포 유형의 배양물일 수 있으며, 예를 들어, 한 문맥에서의 집단이 또 다른 문맥에서의 하위집단일 수 있다. "하위집단"이라는 용어는 세포 배양물 또는 세포 집단 내의 특정 세포 유형을 기재하는데 사용되는 경우의 세포 배양물 또는 집단의 부분집합을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "전능(totipotent) 줄기 세포"는 생물을 구성하는 모든 세포로 분화되는 능력이 있는 세포, 예컨대 난자와 정자 세포의 융합으로부터 생산된 세포를 지칭한다. 수정난의 처음 몇 번의 분할로 생산된 세포 또한 전능일 수 있다. 이러한 세포들은 배아 및 배아외 세포 유형으로 분화될 수 있다. 만능 줄기 세포, 예컨대 ES 세포는 임의의 태아 또는 성체 세포 유형을 초래할 수 있다. 그러나, 이들은 단독으로는 태아 또는 성체 동물로 발달될 수 없는데, 배아외 조직으로 발달될 잠재력이 없기 때문이다. 배아외 조직은, 부분적으로, 배아외 내배엽으로부터 유래되고, 벽측 내배엽 (라이헤르트(Reichert) 막) 및 내장 내배엽 (난황낭의 일부를 형성함)으로 추가로 분류될 수 있다. 벽측 내배엽 및 내장 내배엽 양쪽 모두 배아의 발달을 지지하지만, 그들 자신이 배아 구조를 형성하지는 않는다. 배아외 중배엽 및 배아외 외배엽을 포함하는 기타 배아외 조직이 또한 존재한다.
일부 실시양태에서, "만능 세포"는 내배엽 계통, 더욱 특히 췌장 내배엽 유형 세포로의 분화를 위한 출발 물질로서 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "만능" 또는 "만능 세포" 또는 이의 등가물은 세포 배양물에서의 증식 및 다능 성질을 나타내는 다양한 계통-제한 세포 집단으로의 분화 양쪽 모두가 가능한 세포를 지칭하고, 예를 들어, 만능 ES 세포 및 유도형 만능 줄기 (iPS) 세포 양쪽 모두 3가지 배아 세포 계통 각각을 초래할 수 있다. 그러나, 만능 세포는 전체 생물을 생산할 수 없다. 즉, 만능 세포는 전능이지 않다.
특정 실시양태에서, 출발 물질로서 사용되는 만능 세포는 hES 세포, hEG 세포, iPS 세포, 심지어 단성생식 세포 등을 포함하는 줄기 세포이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "배아"는 단일 접합체에서 시작하여 발달된 생식자 세포 이외의 만능 또는 전능 세포를 더 이상 포함하지 않는 다세포 구조로 끝나는 생물의 일련의 발생 단계를 지칭한다. 생식자 융합에 의해 유래된 배아에 더하여, "배아"라는 용어는 체세포 핵 전달에 의해 유래된 배아를 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, 만능 세포가 배아로부터 유래되지 않거나 또는 즉각적으로 배아로부터 유래되지 않고, 예를 들어, iPS 세포가 비-만능 세포, 예를 들면, 다능 세포 또는 최종적으로 분화된 세포로부터 유래된다. 본원에서 사용된 인간 만능 줄기 세포주는 hESC 및 iPSC, 예를 들어, CyT49, CyT25, CyT203, CyT212, BG01, BG02, BG03, 또는 표 4 및 5에 열거된 것들 중 임의의 것, 또는 현재 공지되었거나 공개적으로 입수가능하거나 추후에 제조되는 임의의 것을 포함한다.
인간 만능 줄기 세포는 분화에 이르는 유전자의 억제 및 만능의 유지를 확실히 하는 코어(core) 조절 복합체를 형성하는, 전사 인자 Oct-4, Nanog, 및 Sox-2를 포함하는 몇몇 전사 인자 및 세포 표면 단백질; 및 세포 표면 항원, 예컨대 당지질 SSEA3, SSEA4 및 케라틴 술페이트 항원, Tra-1-60 및 Tra-1-81, 및 알칼리성 포스파타제(phosphatase)의 존재에 의해서 또한 규정 또는 특성화될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유도형 만능 줄기 세포" 또는 "iPS 세포" 또는 "iPSC"라는 구절은 리프로그래밍 인자로 지칭되는 특정 유전자 또는 유전자 산물을 삽입함으로써 비-만능 세포, 전형적으로는 성체 체세포 또는 최종 분화 세포, 예컨대 섬유모세포, 조혈 세포, 근세포, 뉴런, 표피 세포 등으로부터 인공적으로 제조된 만능 줄기 세포의 유형을 지칭한다. 문헌 [Takahashi et al., Cell 131:861-872 (2007)]; [Wernig et al., Nature 448:318-324 (2007)]; [Park et al., Nature 451:141-146 (2008)] 참조. iPSC를 제조하기 위한 이러한 방법 및 추후에 공지된 방법이 주지되어 있고, 어떻게 iPSC가 유래 또는 생산되는지는 본원에서 발명을 제한짓지 않는다. 유도형 만능 줄기 세포는 특정 줄기 세포 유전자 및 단백질의 발현, 크로마틴 메틸화 패턴, 배가 시간, 배양체 형성, 기형종 형성, 생육가능한 키메라 형성, 및 효능 및 분화능을 포함하는 많은 면에서 인간 만능 줄기 세포, 예컨대 hES 세포와 실질적으로 유사하다. 인간 iPS 세포는 배아의 연관 사용 없이 만능 줄기 세포의 공급원을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "리프로그래밍", "리프로그래밍된" 또는 이의 등가물은 리프로그래밍이 없는 동일한 조건 하에 그러할 것보다 측정가능하게 증가된, 배양에서 또는 생체내에서 하나 이상의 새로운 세포 유형의 자손을 형성하는 능력을 세포에 부여하는 프로세스를 지칭한다. 본원에 기재된 특정 실시양태에서, 체세포가 만능 세포로 "리프로그래밍"된다. 특정 측면에서, 충분한 증식 후, 생체내의 또는 시험관내 세포 배양물 내의 측정가능한 비율의 세포가 새로운 만능 세포 유형의 표현형 특성을 나타내는 경우에 체세포가 리프로그래밍된다. 리프로그래밍 없이는, 이같은 체세포는 새로운 만능 세포 유형의 표현형 특성을 나타내는 자손을 초래하지 않을 것이다. 리프로그래밍 없이도 체세포가 새로운 만능 세포 유형의 표현형 특성을 나타내는 자손을 초래할 수 있다면, 새로운 만능 세포 유형의 표현형 특성을 나타내는 이러한 체세포로부터의 자손의 비율이 리프로그래밍 전보다 측정가능하게 더 많다.
본원에서 사용된 바와 같이, "분화 프로그래밍"이라는 구절은 분화 리프로그래밍이 없는 동일한 조건 하에 그러할 것보다 배양에서 또는 생체내에서 새로운 분화 상태의 하나 이상의 새로운 세포 유형의 자손을 형성하도록 세포를 변화시키는 프로세스를 지칭한다. 이러한 프로세스는 분화, 탈분화 및 전환분화(transdifferentiation)를 포함한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "분화"라는 구절은 덜 특수화된 세포가 더 특수화된 세포 유형이 되는 프로세스를 지칭한다. 대조적으로, "탈분화"라는 구절은 부분적으로 또는 최종적으로 분화된 세포가 더 이전의 발생 단계, 예컨대 만능 또는 다능이 있는 세포로 되돌아가는 세포성 프로세스를 지칭한다. 더욱 대조적으로, "전환분화"라는 구절은 하나의 분화된 세포 유형을 또 다른 분화된 세포 유형으로 형질전환시키는 프로세스를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "다능" 또는 "다능 세포" 또는 이의 등가물은 제한된 개수의 다른 특정 세포 유형을 초래할 수 있는 세포 유형을 지칭한다. 즉, 다능 세포는 하나 이상의 배아 세포 운명에 수임되고, 따라서, 만능 세포와 대조적으로, 3가지 배아 세포 계통 각각, 뿐만 아니라 배아외 세포를 초래할 수 없다. 다능 체세포는 만능 세포와 비교하여 더욱 분화된 것이지만, 최종적으로 분화된 것은 아니다. 따라서, 만능 세포가 다능 세포보다 효능이 더 높다. 체세포를 리프로그래밍시킬 수 있거나 또는 iPS 세포를 생성시키는데 사용될 수 있는 효능-결정 인자는 Oct-4, Sox2, FoxD3, UTF1, 스텔라(Stella), Rex1, ZNF206, Sox15, Myb12, Lin28, Nanog, DPPA2, ESG1, Otx2 또는 이들의 조합물과 같은 인자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단능인" 또는 "단능" 또는 "단능 세포" 또는 이의 등가물은 오직 1개의 다른 계통 세포를 초래할 수 있는 세포 유형을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 미성숙 베타 세포는 인슐린 베타 세포로만 분화되는 능력이 있고, 예를 들어 글루카곤 (알파) 세포, 소마토스타틴 (델타) 세포 및 췌장 폴리펩티드 (감마) 세포로 분화되는 잠재력은 없다. 대조적으로, 내분비 전구 세포, PDX1-양성 췌장 내배엽 세포, 확정적 내배엽 세포, 또는 중내배엽 세포, 및 hES 세포 모두는 췌장 알파, 베타, 델타 및 감마 섬 세포 각각을 초래할 수 있는 다능 또는 만능 (hESC) 세포이다. 유사하게, 췌장 알파, 베타, 델타 및 감마 섬 세포는 내분비 전구 세포, PDX1-양성 췌장 내배엽 세포, 확정적 내배엽 세포, 또는 중내배엽 세포, 및 hES 세포의 계통 세포이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단일 호르몬성" 및 "다중호르몬성" 세포는 1개의 호르몬만 발현하는 세포 (예를 들어 미성숙 베타 세포 및 베타 세포는 인슐린 단백질만 발현하고 글루카곤 또는 소마토스타틴 단백질은 발현하지 않는다), 또는 1개를 초과하는 호르몬 또는 다중 호르몬을 발현하는 세포 (예를 들어, 내분비 전구체 또는 선조 세포는 동일한 세포 상에서 2개, 3개, 또는 4개 또는 이를 초과하는 개수의 호르몬을 발현하는 세포의 하위집단이 있다)를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "ERBB 수용체 티로신 키나제 활성화제"는 ERBB 수용체에 결합하는 16가지 이상의 상이한 EGF 패밀리 리간드: EGF (표피 성장 인자), AG 또는 AREG (앰피레귤린(Amphiregulin)), 및 TGF-알파 (형질전환 성장 인자-알파), Btc (베타셀룰린(Betacellulin)), HBEGF (헤파린-결합 EGF), 및 Ereg (에피레귤린(Epiregulin)), 뉴레귤린 (또는 헤레귤린) 예컨대 뉴레귤린-1, -2, -3 및 -4 (또는 헤레귤린-1, -2, -3 및 -4)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그러나, 본 발명은 4가지 ERBB 수용체 중 어느 하나 또는 이들의 조합물에 결합하여 동종- 및 이종이량체 수용체 복합체의 형성 (내인성 키나제 도메인의 활성화 및 이어지는 인산화에 이름)을 유도할 수 있는 임의의 리간드를 구상한다. 표 13을 또한 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "세포 계통"이라는 용어는 가장 초기의 전구 세포에서 완전히 성숙된 세포 (즉, 특수화된 세포)까지의 세포 유형 발달의 모든 단계를 지칭한다. 예를 들어, "확정적 내배엽 계통 세포" 또는 "PDX1-음성 내배엽 계통 세포" 또는 "PDX1-양성 췌장 내배엽 계통 세포" 또는 "내분비 전구체 계통 세포" 또는 "내분비 계통 세포" 또는 "미성숙 베타 계통 세포" 등은 확정적 내배엽 세포, PDX1-음성 내배엽 세포, PDX1-양성 췌장 내배엽 세포 등으로부터 유래 또는 분화된 세포를 지칭한다. 확정적 내배엽 세포는 이의 전구체 중 하나인 중내배엽 세포의 계통이다. PDX-1 양성 췌장 내배엽 세포는 이의 전구체 중 하나인 확정적 내배엽 세포의 계통이다. 내분비 전구체는 PDX1-양성 췌장 세포, 확정적 내배엽 세포 및 중내배엽 세포의 계통이고, 모두가 이의 전구체이다. 미성숙 베타 세포는 내분비 전구 세포, PDX1-양성 췌장 세포, 확정적 내배엽 세포 및 중내배엽 세포의 계통이고 모두가 이의 전구체이다. 베타 세포는 예를 들어 미성숙 베타 세포의 유일한 계통이다. 그러나, 본원에 기재된 모든 내배엽 계통 세포는 hES 계통 세포이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "전구 세포" 또는 "선조 세포"는, 일반적으로, 더욱 성숙한 세포로 분화될 수 있는 세포 분화 경로 내의 임의의 세포일 수 있다. 따라서, 전구 세포는 만능 세포일 수 있거나, 또는 이는 부분적으로 분화된 다능 세포 또는 가역적으로 분화된 세포일 수 있다. "전구체 세포 집단"이라는 용어는 더욱 성숙한 또는 분화된 세포 유형으로 발달될 수 있는 일군의 세포를 지칭한다. 전구체 세포 집단은 만능인 세포, 제한된 줄기 세포 계통인 세포 (즉, 전체보다 적은 외배엽 계통으로 또는 예를 들어 뉴런 계통의 세포로만 발달될 수 있는 세포), 및 가역적으로 제한된 줄기 세포 계통인 세포를 포함할 수 있다. 따라서, "선조 세포" 또는 "전구 세포"라는 용어는 "만능 세포" 또는 "다능 세포"일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "내분비 선조/전구 세포"는 췌장 섬 호르몬-발현 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 내분비 시스템의 세포로 추가로 분화될 수 있는 뉴로제닌 3 (NEUROG3), PDX1, PTF1A, SOX9, NKX6.1, HNF1b, GATA4, HNF6, FOXA1, FOXA2, GATA6, MYT1, ISLET1, NEUROD, SNAIL2, MNX1, IA1, RFX6, PAX4, PAX6, NKX2.2, MAFA 및 MAFB로 이루어진 목록으로부터의 마커를 적어도 발현하는 확정적 내배엽 계통의 다능 세포를 지칭한다. 내분비 선조/전구 세포는 덜 명확화게 분화된 확정적 내배엽 계통 세포, 예컨대 PDX1-양성 췌장 내배엽 세포 또는 확정적 내배엽 세포 또는 중내배엽 세포와 비교하여 그만큼 많은 상이한 세포, 조직 및/또는 기관으로 분화될 수 없다. 내분비 선조/전구 세포가 적어도 출원인의 미국 특허 번호 8,129,182에 상세하게 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "만능 세포로부터 발달됨", "만능 세포로부터 분화함", "만능 세포로부터 성숙됨" 또는 "만능 세포로부터 생산됨", "만능 세포로부터 유래됨", "만능 세포로부터 분화됨"이라는 용어 및 등가적인 표현은 시험관내 또는 생체내에서의 만능 세포로부터의 분화된 세포 유형의 생산을 지칭하고, 예를 들어, 영문 명칭이 "METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES"인 국제 특허 출원 번호 PCT/US2007/015536에 기재된 바와 같이 이식된 PDX1 췌장 내배엽 세포로부터 생체내에서 성숙된 내분비 세포의 경우이다. 모든 이같은 용어는 2가지 이상의 상이한 세포 계통으로 분화되는 잠재력이 있는 단계에서 특수화 및 최종 분화 세포가 되는 단계로 세포가 진행되는 것을 지칭한다. 이같은 용어들은 본원의 목적을 위해 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 만능 또는 적어도 1가지를 초과하는 세포 계통으로 분화되는 능력을 선택적으로 되찾을 수 있도록, 본원에 기재된 실시양태는 이같은 분화가 가역적이게 허용하는 배양 조건을 구상한다.
"피더 세포"라는 용어는 시험관내에서 성장하고, 하나 이상의 인자를 배양 배지 내로 분비하며, 배양물 내의 또 다른 관심 세포의 성장을 지지하는데 사용될 수 있는 세포들의 배양물을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "피더 세포 층"은 "피더 세포"라는 용어와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 피더 세포는 피더 세포가 배양 접시의 표면을 완전한 층으로 덮은 후에 서로의 위에서 성장하는 단층을 포함할 수 있거나, 또는 세포들의 클러스터를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 피더 세포는 부착성 단층을 포함한다.
유사하게, 만능 세포 배양물 또는 응집체 만능 현탁 배양물이 피더 세포를 사용하지 않는 규정 배지 또는 배양 시스템에서 성장되는 실시양태는 "무-피더(feeder-free)"이다. 무-피더 배양 방법은 만능 세포 배양물의 확장성 및 재현성을 증가시키고, 예를 들어 피더 세포 또는 기타 동물-원천 배양 성분으로부터의 감염체에 의한 오염의 위험을 감소시킨다. 무-피더 방법이 보드나(Bodnar) 등의 미국 특허 번호 6,800,480 (캘리포니아주 멘로 파크의 제론 코포레이션(Geron Corporation)에 양도됨)에 또한 기재되어 있다. 그러나, 그리고 미국 특허 번호 6,800,480 특허에 대조적으로, 본원에 기재된 실시양태는, 만능이든, 다능이든 또는 분화된 세포 배양물이든, 무-피더이고, 내인성 또는 외인성 세포외 매트릭스를 추가로 함유하지 않는다; 즉 본원에 기재된 배양물은 무-피더일 뿐만 아니라, 세포외 매트릭스가 없다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,800,480에서는, 섬유모세포를 배양하고, 섬유모세포를 원위치에서 용해시킨 후, 용해 후 남은 것을 세정함으로써 세포외 매트릭스가 제조된다. 대안적으로, 미국 특허 번호 6,800,480에서, 콜라겐, 태반 매트릭스, 피브로넥틴, 라미닌, 메로신, 테나신, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 어그레칸, 비글리칸, 트롬보스폰딘, 비트로넥틴 및 데코린으로부터 선택된 단리된 매트릭스 성분 또는 성분들의 조합물로부터 세포외 매트릭스가 또한 제조될 수 있다. 본원에 기재된 실시양태들은 피더 또는 섬유모세포 층을 성장시키고 세포외 매트릭스를 생산하도록 세포를 용해시키는 것에 의해 세포외 매트릭스를 생산하지 않거나, 또는 먼저 조직 배양 용기를 콜라겐, 태반 매트릭스, 피브로넥틴, 라미닌, 메로신, 테나신, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 어그레칸, 비글리칸, 트롬보스폰딘, 비트로넥틴 및 데코린으로부터 선택된 세포외 매트릭스 성분 또는 세포외 매트릭스 성분들의 조합물로 코팅하는 것을 필요로 하지 않는다. 따라서, 만능, 다능 및 분화된 세포를 위한 본원에 기재된 응집체 현탁 배양물은 피더 층, 세포외 매트릭스 코팅물을 생산하기 위한 용해된 피더 또는 섬유모세포, 외인성으로 첨가된 세포외 매트릭스 또는 매트릭스 성분을 필요로 하지 않고, 그보다는 영문 명칭이 "METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIPOTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HUMAN SERUM"인 국제 출원 PCT/US2008/080516에 기재된 바와 같은 가용성 인간 혈청 성분을 사용하는 것이 피더 세포 또는 피더 단층의 필요성을 극복하고, 뿐만 아니라 피더 또는 섬유모세포 세포로부터 또는 외인성으로 첨가된 세포외 매트릭스 성분으로부터의 내인성 세포외-매트릭스에 대한 요구를 극복한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "클러스터" 및 "클럼프" 또는 "응집체"라는 용어들은 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 일반적으로 단일 세포로 해리된 후 클러스터를 형성하도록 응집되지 않았거나 또는 세포-대-세포 접촉이 밀접한 일군의 세포를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "재응집된"은 클러스터, 클럼프 및/또는 응집체가 더 작은 클러스터, 클럼프 및/또는 응집체 또는 단일 세포로 해리된 후, 클러스터, 클럼프 및/또는 응집체로 재응집시키는 것에 의해 새로운 세포-대-세포 접촉을 형성하는 경우를 지칭한다. 전형적으로 이러한 해리는 성질 면에서 수동이지만 (예컨대 파스퇴르 파이펫을 사용함), 기타 해리 수단이 구상된다. 응집체 현탁 만능 또는 다능 세포 배양물은 실질적으로 국제 공보 PCT/US2007/062755 (영문 명칭이 "COMPOSITIONS AND METHODS FOR CULTURING DIFFERENTIAL CELLS"임) 및 PCT/US2008/082356 (영문 명칭이 "STEM CELL AGGREGATE SUSPENSION COMPOSITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATION THEREOF"임)에 기재된 바와 같다.
"단일 세포 현탁액" 또는 이의 등가물은 임의의 기계적 또는 화학적 수단에 의한 만능, 다능 또는 최종 분화 단일 세포 현탁액 또는 만능 또는 다능 세포로부터 유래된 단일 세포 현탁액을 지칭한다. 일차 조직, 배양물 내의 부착된 세포, 및 응집체로부터 세포 클러스터를 해리시켜 단일 세포 현탁액을 형성시키기 위한 몇몇 방법, 예를 들어, 물리적 힘 (기계적 해리 예컨대 세포 긁개, 내경이 좁은 파이펫을 통한 저작, 미세 바늘 흡인, 와동 분해, 및 미세 나일론 또는 스테인레스 스틸 망을 통한 강제 여과), 효소 (효소적 해리 예컨대 트립신, 콜라게나제(collagenase), 아큐타제(Accutase)™ 등), 또는 양쪽 모두의 조합이 존재한다. 추가로, 만능, 다능 또는 분화 세포의 단일 세포 해리를 지지할 수 있는 방법 및 배양 배지 조건이 확장, 세포 분류, 및 멀티-웰(multi-well) 플레이트 분석법을 위한 제한된 시딩(seeding)에 유용하고, 배양 절차 및 클론 확장의 자동화를 가능하게 한다.
바람직한 실시양태에서, 배양 방법 또는 배양 시스템에 동물 원천의 생성물이 없다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 배양 방법에 제노(xeno)가 없다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서, 인간 세포 치료제의 상업적 제조를 위한 하나 이상의 조건 또는 요건이 본원에 기재된 배양 방법에 의해 충족되거나 능가된다.
만능 세포의 집단이 특정 보충 성장 인자의 존재 하에 추가로 배양되어 상이한 세포 계통이거나 또는 상이한 세포 계통으로 발달될 세포들의 집단이 수득될 수 있거나, 또는 상이한 세포 계통으로 발달될 수 있기 위하여 선택적으로 역전될 수 있다. "보충 성장 인자"라는 용어는 이의 가장 넓은 문맥으로 사용되고, 만능 세포의 성장을 촉진하고/하거나, 세포 생존을 유지시키고/시키거나, 세포 분화를 자극하고/하거나, 세포 분화의 역전을 자극하는 물질을 지칭한다. 추가로, 보충 성장 인자는 피더 세포가 이의 배지 내로 분비하는 물질일 수 있다. 이같은 물질은 사이토카인, 케모카인, 소형 분자, 중화 항체 및 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 성장 인자는 세포간 신호전달 폴리펩티드를 또한 포함할 수 있고, 이는 세포의 발달 및 유지, 뿐만 아니라 조직의 형태 및 기능을 제어한다. 바람직한 실시양태에서, 보충 성장 인자는 줄기 세포 인자 (SCF), 온코스타틴 M (OSM), 섬모 향신경성 인자 (CNTF), 가용성 인터류킨-6 수용체 (IL-6R)와 조합된 인터류킨-6 (IL-6), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 골 형태형성 단백질 (BMP), 종양 괴사 인자 (TNF), 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 바와 같은 세포를 생산하는 특정 방법에서, 성장 인자가 이의 첨가 후에 세포 배양물 또는 세포 집단으로부터 제거된다. 예를 들어, 성장 인자, 예컨대 액티빈 A, 액티빈 B, GDF-8, 또는 GDF-11이 첨가되고, 이를 첨가하고 나서 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 또는 약 10일 후 이내에 제거될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분화 인자 자체가 세포 배양물로부터 제거되지 않고, 세포 배양 배지에서 이를 생략하는 것이 제거 수단이며, 예를 들어 액티빈을 함유한 세포 배양 배지가 액티빈을 함유하지 않은 것으로 변화된다.
세포 성장 조건, 성장 인자 농도 및 배양 단계의 시기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 파라미터를 변형시킴으로써 분화 프로세스의 효율이 조정될 수 있기 때문에, 본원에 기재된 분화 절차는 약 5％, 약 10％, 약 15％, 약 20％, 약 25％, 약 30％, 약 35％, 약 40％, 약 45％, 약 50％, 약 55％, 약 60％, 약 65％, 약 70％, 약 75％, 약 80％, 약 85％, 약 90％, 약 95％, 또는 약 95％ 초과의 만능 세포 (유도형 만능 세포 포함)의 다능 또는 분화 세포, 예를 들어 확정적 내배엽으로의 전환을 초래할 수 있다. 또한, 전환 비율 또는 효율 비율은 한 유형의 다능 세포가 추가로 분화된 다능 세포로 분화되는 것, 예를 들어, 확정적 내배엽이 앞창자 내배엽, PDX1-양성 앞창자 내배엽, PDX1-양성 췌장 내배엽 또는 PDX1/NKX6.1 공동-양성 췌장 내배엽, 내분비 선조/전구체 또는 NGN3/NKX2.2 공동-양성 내분비 선조/전구체, 및 호르몬 분비 내분비 세포 또는 INS, GCG, GHRL, SST, PP 단일-양성 내분비 세포로 분화되는 것을 또한 지칭할 수 있다. 전-원시(preprimitive) 선 또는 중내배엽 세포의 단리가 사용되는 프로세스에서, 실질적으로 순수한 전-원시 선 또는 중내배엽 세포 집단이 회수될 수 있다.
hES 세포로부터 유래된 내배엽 계통 세포의 생산을 위한 일반적인 방법이 상기 지시된 바와 같은 관련된 미국 출원, 및 문헌 [D'Amour et al. 2005 Nat Biotechnol. 23:1534-41] (2005년 10월 28일에 온라인에서 공개됨); [D'Amour et al. 2006 Nat Biotechnol. 24(11):1392-401] (2006년 10월 19일에 온라인에서 공개됨); [Kroon et al. (2008) Nat Biotechnol. 26 (4):443-452] (2008년 2월 20일에 온라인에서 공개됨); [Kelly et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29(8):750-6] (2011년 7월 31일에 온라인에서 공개됨); 및 [Schulz et al. (2012) PLosOne, 7(5): e37004] (2012년 5월 18일에 온라인에서 공개됨)에 기재되어 있다. 다무르(D'Amour) 등은 5단계 분화 프로토콜을 기재하였다: 단계 1 (주로 확정적 내배엽 생산을 초래함), 단계 2 (주로 PDX1-음성 앞창자 내배엽 생산을 초래함), 단계 3 (주로 PDX1-양성 앞창자 내배엽 생산을 초래함), 단계 4 (주로 췌장 내배엽 또는 췌장 내분비 선조 생산을 초래함) 및 단계 5 (주로 호르몬 발현 내분비 세포 생산을 초래함).
"영양외배엽"이라는 용어는 비-영양외배엽 세포 또는 세포 집단에서의 HAND1, 에오메스(Eomes), MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, 및 ERBB의 발현 수준과 비교하여 HAND1, 에오메스, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, 및 ERBB 유전자를 포함하는 군으로부터 선택된 마커의 발현이 상대적으로 높은 다능 세포를 지칭한다.
"배아외 내배엽"이라는 용어는 비-배아외 내배엽 세포 또는 세포 집단에서의 SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1, 또는 AFP의 발현 수준과 비교하여 SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1, 또는 AFP 유전자를 포함하는 군으로부터 선택된 마커의 발현이 상대적으로 높은 다능 세포를 지칭한다.
"전-원시 선 세포"라는 용어는 BRACHURY 저(low), FGF4 저, SNAI1 저, SOX17 저, FOXA2 저, SOX7 저 및 SOX1 저와 비교하여 FGF8 및/또는 NODAL 마커 유전자의 발현 수준이 상대적으로 높은 다능 세포를 지칭한다.
"중내배엽 세포"라는 용어는 SOX17 저, CXCR4 저, FOXA2 저, SOX7 저 및 SOX1 저와 비교하여 브라키우리, FGF4, SNAI1 MIXL1 및/또는 WNT3 마커 유전자의 발현 수준이 상대적으로 높은 다능 세포를 지칭한다.
"확정적 내배엽 (DE)"이라는 용어는 창자관 또는 창자관으로부터 유래된 기관의 세포로 분화될 수 있는 다능 내배엽 계통 세포를 지칭한다. 특정 실시양태에 따르면, 확정적 내배엽 세포는 포유동물 세포이고, 바람직한 실시양태에서, 확정적 내배엽 세포는 인간 세포이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 확정적 내배엽 세포는 특정 마커를 발현하거나, 또는 특정 마커를 유의하게 발현하는데 실패한다. 일부 실시양태에서, SOX17, CXCR4, MIXL1, GATA4, HNF3β, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 및 CRIP1로부터 선택된 하나 이상의 마커가 확정적 내배엽 세포에서 발현된다. 기타 실시양태에서, OCT4, 알파-태아단백질 (AFP), 트롬보모듈린(Thrombomodulin) (TM), SPARC, SOX7 및 HNF4알파로부터 선택된 하나 이상의 마커가 확정적 내배엽 세포에서 발현되지 않거나 또는 유의하게 발현되지 않는다. 확정적 내배엽 세포 집단 및 이의 생산 방법이 미국 출원 번호 11/021,618 (영문 명칭이 "DEFINITIVE ENDODERM"이고, 2004년 12월 23일 출원됨)에 또한 기재되어 있다.
"PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포" 또는 "앞창자 내배엽 세포"라는 용어 또는 이의 등가물은 SOX17, HNF1β (HNF1B), HNF4알파 (HNF4A) 및 FOXA1 마커를 발현하지만 PDX1, AFP, SOX7, 또는 SOX1을 실질적으로 발현하지 않는 세포이다. PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포 집단 및 이의 생산 방법이 미국 출원 번호 11/588,693 (영문 명칭이 "PDX1-expressing dorsal and ventral foregut endoderm"이고, 2006년 10월 27일 출원됨)에 또한 기재되어 있다.
"PDX1-양성, 등-편향, 앞창자 내배엽 세포" (등 PDX1-양성 앞창자 내배엽 세포) 또는 단순히 "PDX1-양성 내배엽"이라는 용어 또는 이의 등가물은 표 1로부터 선택된 하나 이상의 마커 및/또는 표 2로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포이고, 관련된 미국 출원 11/588,693 (영문 명칭이 "PDX1 EXPRESSING DOSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM"이고, 2006년 10월 27일 출원됨)에, 그리고 또한 미국 출원 번호 11/115,868 (영문 명칭이 "PDX1-expressing endoderm"이고, 2005년 4월 26일 출원됨)에 또한 기재되어 있다.
<표 1>
등 및 배 PDX1-양성 앞창자 내배엽 양쪽 모두에서 발현되는 마커
Figure pct00001
Figure pct00002
<표 2>
등-편향 PDX1-양성 앞창자 내배엽에서 발현되는 마커
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
"췌장 내배엽", "췌장 상피의", "췌장 상피" (모두 "PE"로 약기될 수 있음), "췌장 선조", "PDX-1 양성 췌장 내배엽"이라는 용어 또는 이의 등가물, 예컨대 "췌장 내배엽 세포" (PEC)는 모두 전구체 또는 선조 췌장 세포이다. 본원에 기재된 바와 같은 PEC는 단계 4 분화 이후 (약 제12일-14일)의 선조 세포 집단이고, 2가지 이상의 주요한 별개 집단을 포함한다: i) PDX1 및 NKX6.1을 발현하지만 CHGA를 발현하지 않는 (또는 CHGA 음성, CHGA-) 췌장 선조 세포, 또는 "비-내분비 다능 선조 하위집단 (CHGA-)", 또는 "비-내분비 (CHGA-) 하위집단" 또는 "비-내분비 (CHGA-) 세포" 또는 이의 등가물; 및 ii) CHGA를 발현하는 (CHGA 양성, CHGA+) 다중호르몬 내분비 세포, 또는 "내분비 다능 선조 하위집단 (CHGA+)", 또는 "내분비 (CHGA+) 하위집단" 또는 "내분비 (CHGA+) 세포" 또는 이의 등가물. PDX1 및 NKX6.1을 발현하지만 CHGA를 발현하지 않는 PEC 췌장 선조 하위집단은 "비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)" 또는 "비-내분비 선조 하위집단", "비-내분비 (CHGA-) 하위집단", "비-내분비 (CHGA-) 하위집단", "다능 선조 하위집단" 등으로 또한 지칭된다. CHGA를 발현하는 PEC 다중호르몬 내분비 세포 하위집단은 "내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)", 또는 내분비 세포" 또는 "CHGA+ 세포" 등으로 또한 지칭된다. 이론에 제한되지 않으면서, NKX6.1을 발현하지만 CHGA를 발현하지 않는 세포 집단이 PEC의 더욱 활성이거나 치료적인 성분인 것으로 가정되는 반면, CHGA-양성 다중호르몬 내분비 세포들의 집단은 생체내에서 글루카곤-발현 섬 세포로 추가로 분화 및 성숙되는 것으로 가정된다. 문헌 [Kelly et al. (2011) Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells, Nat Biotechnol. 29(8):750-756] (2011년 7월 31일에 온라인에서 공개됨) 및 [Schulz et al. (2012), A Scalable System for Production of Functional Pancreatic Progenitors from Human Embryonic Stem Cells, PLosOne 7(5): 1-17, e37004] 참조.
때때로, 췌장 내배엽 세포는 상기 기재된 바와 같은 PEC에 대한 언급없이 사용되고, 일반적으로 적어도 단계 3 및 4 유형 세포를 지칭하도록 사용된다. 문맥으로부터 용법 및 의미가 명확할 것이다. 이러한 방식의 만능 줄기 세포, 적어도 hES 및 hIPS 세포로부터 유래된 췌장 내배엽은 PDX1, NKX6.1, PTF1A, CPA1, cMYC, NGN3, PAX4, ARX 및 NKX2.2 마커로부터 선택된 마커의 차별적인 또는 높은 발현 수준을 기초로 다른 내배엽 계통 세포 유형과 구별되지만, 췌장 내분비 세포의 홀마크인 유전자, 예를 들어, CHGA, INS, GCG, GHRL, SST, MAFA, PCSK1 및 GLUT1을 실질적으로 발현하지 않는다. 추가적으로, NGN3을 발현하는 일부 "내분비 선조 세포"가 기타 비-췌장 구조 (예를 들어, 십이지장)으로 분화될 수 있다. 췌장 내배엽 또는 내분비 선조 세포 집단 및 이의 방법이 미국 특허 출원 번호 11/773,944 (영문 명칭이 "Methods of producing pancreatic hormones"이고, 2007년 7월 5일 출원됨), 및 미국 특허 출원 번호 12/107,020 (영문 명칭이 "METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FORM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS"이고, 2008년 4월 21일 출원됨)에 또한 기재되어 있다.
"내분비 세포" 또는 "췌장 섬 호르몬-발현 세포", "췌장 내분비 세포", "췌장 섬 세포", "췌장 섬"이라는 용어 또는 이의 등가물은 다중호르몬성 또는 단일 호르몬성일 수 있는 세포를 지칭한다. 따라서 세포는 하나 이상의 췌장 호르몬을 발현하고, 이는 인간 췌장 섬 세포의 기능 중 적어도 일부를 지닌다. 췌장 섬 호르몬-발현 세포는 성숙 세포 또는 미성숙 세포일 수 있고, 추가로 분화되거나, 또는 이들이 유래된 내분비 선조/전구체 유형 세포보다 발생적으로 더 수임된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "정확하게 특정된 내분비 세포" 또는 "단계 7 배양물" 또는 "미성숙 내분비 세포" ("미성숙 베타 세포" 포함)는 생체내에서 기능할 수 있는 시험관내에서 제조된 내분비 세포 집단을 지칭하고, 예를 들어, 미성숙 베타 세포는 이식되었을 때 혈액 글루코스에 반응하여 인슐린을 분비한다. 정확하게 특정된 내분비 세포 또는 단계 7 배양물은 하기를 포함하는 추가적인 특성이 있을 수 있다: 이식되었을 때, 정확하게 특정된 내분비 세포는 기능성 췌장 섬 세포로 발달 및 성숙될 수 있다. 정확하게 특정된 내분비 세포는 내분비 세포에 대해 강화될 수 있다 (또는 비-내분비 세포가 고갈될 수 있다). 바람직한 실시양태에서, 정확하게 특정된 내분비 세포 집단 내의 세포의 약 50％ 초과가 CHGA+이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 정확하게 특정된 내분비 세포 집단 내의 세포의 약 60％ 또는 70％ 또는 80％ 또는 90％ 또는 95％ 또는 98％ 초과 또는 100％가 CHGA+이다. 바람직한 실시양태에서, 정확하게 특정된 내분비 세포 집단 내의 세포의 약 50％ 미만이 CHGA-이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 정확하게 특정된 내분비 세포 집단 내의 세포의 약 15％ 미만이 CHGA-이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 정확하게 특정된 내분비 세포 집단 내의 세포의 약 10％ 또는 5％ 또는 3％ 또는 2％ 또는 1％ 또는 0.5％ 미만 또는 0％가 CHGA-이다. 게다가, 단계 3 동안의 NGN3 발현과 같이 특정 마커의 발현이 정확하게 특정된 내분비 세포에서 억제될 수 있다. 정확하게 특정된 내분비 세포는 단계 5에 NGN3의 발현이 증가되어 있을 수 있다. 정확하게 특정된 내분비 세포는 단일 호르몬성일 수 있다 (예를 들어 INS 단독, GCG 단독 또는 SST 단독). 정확하게 특정된 내분비 세포는 NKX6.1 및 PDX1을 포함하는 다른 미성숙 내분비 세포 마커를 공발현할 수 있다. 정확하게 특정된 내분비 세포는 단일 호르몬성이고 또한 NKX6.1 및 PDX1을 포함하는 다른 미성숙 내분비 세포 마커를 공발현할 수 있다. 정확하게 특정된 내분비 세포는 전체 INS 집단의 백분율로서 단일 호르몬 발현 INS 세포가 더 많을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 정확하게 특정된 내분비 세포는 전체 INS 집단의 백분율로서 단일 호르몬 발현 INS 세포가 50％ 이상일 수 있다. 정확하게 특정된 내분비 세포는 CHGA+/INS+/NKX6.1+ (3중 양성)일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포 집단 내의 세포의 약 25％ 초과가 CHGA+/INS+/NKX6.1+ (3중 양성)이다. 바람직한 실시양태에서, 세포 집단 내의 세포의 약 30％ 또는 40％ 또는 50％ 또는 60％ 또는 70％ 또는 80％ 또는 90％ 또는 95％ 초과, 100％가 CHGA+/INS+/NKX6.1+ (3중 양성)이다.
"미성숙 내분비 세포", 구체적으로는 "미성숙 베타-세포"라는 용어, 또는 이의 등가물은 INS, NKX6.1, PDX1, NEUROD, MNX1, NKX2.2, MAFA, PAX4, SNAIL2, FOXA1 또는 FOXA2로 이루어진 군으로부터 선택된 마커를 적어도 발현하는, 내분비 선조/전구 세포, 췌장 내배엽 (PE) 세포, 췌장 앞창자 세포, 확정적 내배엽 세포, 중내배엽 세포 또는 추후에 기재되는 임의의 이전 유래 세포를 포함하는 임의의 기타 내분비 세포 전구체로부터 유래되는 세포를 지칭한다. 바람직하게는, 본원에 기재된 미성숙 베타-세포는 INS, NKX6.1 및 PDX1을 발현하고, 더욱 바람직하게는 이는 INS 및 NKX6.1을 공발현한다. "미성숙 내분비 세포", "미성숙 췌장 호르몬-발현 세포", 또는 "미성숙 췌장 섬"이라는 용어 또는 이의 등가물은, 예를 들어, 적어도 단능 미성숙 베타 세포, 또는 도 45에 기재된 바와 같은 프리-베타 세포를 지칭하고, 기타 미성숙 세포를 포함하지 않으며, 예를 들어, 이러한 용어는 미성숙 알파 (글루카곤) 세포, 또는 미성숙 델타 (소마토스타틴) 세포, 또는 미성숙 엡실론 (그렐린) 세포, 또는 미성숙 췌장 폴리펩티드 (PP)를 포함하지 않는다.
규정 배지, 컨디셔닝 배지, 무-피더 배지, 무혈청 배지 등을 포함하는 다수의 줄기 세포 배지 배양물 또는 성장 환경이 본원에 기재된 실시양태에서 구상된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "성장 환경" 또는 "환경(milieu)"이라는 용어 또는 이의 등가물은 미분화 또는 분화 줄기 세포 (예를 들어, 영장류 배아 줄기 세포)가 시험관내에서 증식할 환경이다. 이러한 환경의 특색은 세포가 배양되는 배지, 및 존재하는 경우의 지지 구조 (예컨대 고체 표면 상의 기판)를 포함한다. 만능 세포의 배양 또는 유지 및/또는 만능 세포의 분화를 위한 방법이 PCT/US2007/062755 (영문 명칭이 "COMPOSITIONS AND METHODS USEFUL FOR CULTURING DIFFERENTIABLE CELLS"이고, 2007년 2월 23일 출원됨); 미국 출원 번호 11/993,399 (영문 명칭이 "EMBRYONIC STEM CELL CULTURE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF"이고, 2007년 12월 20일 출원됨); 및 미국 출원 번호 11/875,057 (영문 명칭이 "Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum"이고, 2007년 10월 19일 출원됨)에 또한 기재되어 있다.
"본질적으로" 또는 "실질적으로"라는 용어는 임의의 세포 집단 또는 배양물 내에 존재하는 성분 또는 세포의 대부분의 양 또는 사소한 양 또는 감소된 양을 의미하고, 예를 들어, 본원에 기재된 미성숙 베타 세포 배양물은 "본질적으로 또는 실질적으로 세포"이거나 또는 "본질적으로 또는 실질적으로, INS, NKX6.1 및 PDX1을 발현하고 NGN3을 본질적으로 또는 실질적으로 발현하지 않는 미성숙 베타 세포"이다. 기타 예는 "본질적으로 또는 "본질적으로 또는 실질적으로 hES 세포", "본질적으로 또는 실질적으로 확정적 내배엽 세포", "본질적으로 또는 실질적으로 앞창자 내배엽 세포", "본질적으로 또는 실질적으로 PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포", "본질적으로 또는 실질적으로 PDX1-양성 췌장 내배엽 세포", "본질적으로 또는 실질적으로 췌장 내분비 전구 세포", "본질적으로 또는 실질적으로 췌장 내분비 세포" 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
세포 배양물 또는 세포 집단 내의 세포와 관련하여, "~이 실질적으로 없는"은 이러한 세포 배양물 또는 세포 집단에 없는 특정 세포 유형이 세포 배양물 또는 세포 집단 내에 존재하는 세포의 전체 개수의 약 10％, 약 9％ 미만, 약 8％ 미만, 약 7％ 미만, 약 6％ 미만, 약 5％ 미만, 약 4％ 미만, 약 3％ 미만, 약 2％ 미만, 또는 약 1％ 미만의 양으로 존재한다는 것을 의미한다.
"감소된 혈청" 또는 "무혈청"이라는 용어 또는 이의 등가물은 감소된 혈청을 함유하거나 또는 혈청이 실질적으로 없거나 또는 혈청이 전혀 없는 배지에서 성장된 세포 배양물을 지칭한다. 특정 배양 조건 하에, 혈청 농도는 약 0％ (v/v) 내지 약 10％ (v/v) 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 분화 프로세스에서, 배지의 혈청 농도는 약 0.05％ (v/v) 미만, 약 0.1％ (v/v) 미만, 약 0.2％ (v/v) 미만, 약 0.3％ (v/v) 미만, 약 0.4％ (v/v) 미만, 약 0.5％ (v/v) 미만, 약 0.6％ (v/v) 미만, 약 0.7％ (v/v) 미만, 약 0.8％ (v/v) 미만, 약 0.9％ (v/v) 미만, 약 1％ (v/v) 미만, 약 2％ (v/v) 미만, 약 3％ (v/v) 미만, 약 4％ (v/v) 미만, 약 5％ (v/v) 미만, 약 6％ (v/v) 미만, 약 7％ (v/v) 미만, 약 8％ (v/v) 미만, 약 9％ (v/v) 미만 또는 약 10％ (v/v) 미만일 수 있다. 일부 프로세스에서, 전-원시 선 세포는 혈청 없이 또는 혈청 대체물 없이 성장된다. 또 다른 프로세스에서, 전-원시 선 세포는 B27의 존재 하에 성장된다. 이같은 프로세스에서, B27 보충물의 농도는 약 0.1％ (v/v) 내지 약 20％ (v/v) 범위일 수 있다.
또 다른 프로세스에서, 세포 배양물은 B27의 존재 하에 성장된다. 이같은 프로세스에서, B27 보충물의 농도는 약 0.1％ (v/v) 내지 약 20％ (v/v) 범위일 수 있거나, 또는 약 20％ (v/v) 초과의 농도일 수 있다. 특정 프로세스에서, 배지 내의 B27의 농도는 약 0.1％ (v/v), 약 0.2％ (v/v), 약 0.3％ (v/v), 약 0.4％ (v/v), 약 0.5％ (v/v), 약 0.6％ (v/v), 약 0.7％ (v/v), 약 0.8％ (v/v), 약 0.9％ (v/v), 약 1％ (v/v), 약 2％ (v/v), 약 3％ (v/v), 약 4％ (v/v), 약 5％ (v/v), 약 6％ (v/v), 약 7％ (v/v), 약 8％ (v/v), 약 9％ (v/v), 약 10％ (v/v), 약 15％ (v/v) 또는 약 20％ (v/v)이다. 대안적으로, 첨가된 B27 보충물의 농도는 시판되는 B27 스톡(stock) 용액의 강도의 배수의 관점에서 측정될 수 있다. 예를 들어, B27이 인비트로젠(Invitrogen) (캘리포니아주 칼스배드)로부터 50× 스톡 용액으로서 입수가능하다. 충분한 양의 이러한 스톡 용액을 충분한 부피의 성장 배지에 첨가하면 원하는 양의 B27이 보충된 배지가 생산된다. 예를 들어, 10 ml의 50× B27 스톡 용액을 90 ml의 성장 배지에 첨가하면 5× B27이 보충된 성장 배지가 생산될 것이다. 배지 내의 B27 보충물의 농도는 약 0.1×, 약 0.2×, 약 0.3×, 약 0.4×, 약 0.5×, 약 0.6×, 약 0.7×, 약 0.8×, 약 0.9×, 약 1×, 약 1.1×, 약 1.2×, 약 1.3×, 약 1.4×, 약 1.5×, 약 1.6×, 약 1.7×, 약 1.8×, 약 1.9×, 약 2×, 약 2.5×, 약 3×, 약 3.5×, 약 4×, 약 4.5×, 약 5×, 약 6×, 약 7×, 약 8×, 약 9×, 약 10×, 약 11×, 약 12×, 약 13×, 약 14×, 약 15×, 약 16×, 약 17×, 약 18×, 약 19×, 약 20×, 약 20× 초과일 수 있다.
또 다른 측면에서, 분화에 대한 인슐린 수준 요건이 낮은 경우, B27이 사용되지 않는데, 이는 B27이 높은 수준의 인슐린을 함유하기 때문이다. 예를 들어, 출원인은 100× B27 및 ITS 스톡 및 RPMI 내의 각각의 1× 작업 스톡 용액 내의 인슐린 수준을 결정하였다. 메르코디아 울트라센서티브(Mercodia Ultrasensitive) 인슐린 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 인슐린 수준을 결정하였다. 각각 100× 및 50×의 미개봉 B27 및 ITS 스톡에서 검정법을 수행하였고, 양쪽 모두 라이프 테크놀러지스(Life Technologies) (캘리포니아주 칼스배드)에서 구입하였다. 검정법으로부터 생성된 결과가 하기 표 3에서 제시된다.
<표 3>
Figure pct00006
표 3은 각각 약 3 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL의 인슐린이 1×B27 및 1×ITS 내에 존재한다는 것을 나타낸다. 게다가, ITS의 100× 스톡 내의 인슐린 농도는 제조사가 열거한 인슐린 농도와 일관된다. 라이프 테크놀러지스가 50× B27에 대한 인슐린 농도를 제공하지 않으므로 제조사가 언급한 인슐린 농도에 대한 비교가 없지만, 인슐린 및 인슐린 유사 성장 인자 (IGF) 양쪽 모두가 PI3-키나제 의존적 신호전달의 잘 확립된 작동제라는 것을 나타내어 PI3-키나제 억제제 (예를 들어 LY 294002)가 인슐린/IGF의 이펙터를 억제함으로써 확정적 내배엽 형성을 촉진할 것임을 시사하는 상기 문헌 [McLean et al. (2007)]를 기초로 동시에 수행된 100× ITS 스톡의 정확한 측정치를 기초로 약 160 ㎍/mL의 상기 인슐린 농도는 정확하다. 도 6A 및 B를 참조하고, 구체적으로 SOX17 발현이 1 ㎍/mL의 인슐린으로 4배만큼 감소된다. 인슐린 및/또는 IGF는 다양한 배지 보충물 예컨대 KSR, FCS (송아지 태아 혈청), FBS (소 태아 혈청), B27 및 StemPro34 내에 생물학적으로 활성인 수준으로 존재하고, 이같은 배양 조건 하에 확정적 내배엽 분화를 억제할 수 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Jiang et al. (2007)]).
본원에서 사용된 바와 같이, 배양물 또는 컨디셔닝 배지의 문맥에서의 "외인성" 또는 "외인성으로 첨가된" 화합물 예컨대 작용제, 성분, 성장 인자, 분화 인자 등은 배양물 또는 배지 내에 이미 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있는 임의의 화합물 또는 성장 인자를 보충하기 위해 배양물 또는 배지에 첨가되는 것을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포 배양물 및/또는 세포 집단은 외인성으로 첨가된 레티노이드를 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "레티노이드"는 레티놀, 레티날 또는 레틴산, 뿐만 아니라 이러한 화합물 중 임의의 것의 유도체를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 레티노이드는 레틴산이다.
"FGF 패밀리 성장 인자", "섬유모세포 성장 인자" 또는 "섬유모세포 성장 인자 패밀리의 구성원"이라는 용어는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22 및 FGF23을 포함하는 군으로부터 선택된 FGF를 의미한다. 일부 실시양태에서, "FGF 패밀리 성장 인자", "섬유모세포 성장 인자" 또는 "섬유모세포 성장 인자 패밀리의 구성원"은 공지된 섬유모세포 성장 인자 패밀리의 구성원과 상동성이 있고/있거나 이와 유사한 기능이 있는 임의의 성장 인자를 의미한다.
"TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자" 또는 "TGFβ 슈퍼패밀리 리간드" 또는 "TGFβ TGF-베타 신호전달 경로 활성화제"라는 용어 또는 이의 등가물은 TGF-베타1, TGF-베타2, TF-베타3, GDF-15, GDF-9, BMP-15, BMP-16, BMP-3, GDF-10, BMP-9, BMP-10, GDF-6, GDF-5, GDF-7, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-2, BMP-4, GDF-3, GDF-1, GDF 11, GDF8, 액티빈 베타C, 베타E, 베타A 및 베타B, BMP-14, GDF-14, MIS, 인히빈(Inhibin) 알파, 레프티(Lefty)1, 레프티2, GDNF, 뉴테우린(Neurteurin), 퍼세핀(Persephin) 및 아르테민(Artemin)의 서브패밀리를 포함하는 30가지를 초과하는 구조적으로 관련된 단백질들을 지칭한다. 문헌 [Chang et al. (2002) Endocrine Rev. 23(6):787-823] 참조. 이러한 리간드들은 전형적으로 아미노산 (aa) 약 400-500개의 프리프로펩티드(prepropeptide)로서 합성되고, "TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자" 또는 "TGFβ 슈퍼패밀리 리간드" 또는 "TGFβ TGF-베타 신호전달 경로 활성화제" 또는 이의 등가물은 전장 단백질 또는 이의 단백질분해성 펩티드일 수 있다.
"ERBB 리간드"라는 용어는 ErbB 수용체 중 어느 하나에 결합하고, 이러한 수용체가 차례로 또 다른 ErbB 수용체와 이량체화할 수 있거나 또는 단량체로서 기능할 수 있어서, ErbB 부분 단량체 또는 이량체 또는 이종이량체 수용체의 티로신 키나제 활성을 활성화시키는 리간드를 지칭한다. ErbB 리간드의 비제한적인 예는 뉴레귤린-1; HRG-β, HRG-α, Neu 분화 인자 (NDF), 아세틸콜린 수용체-유도 활성 (ARIA), 아교 성장 인자 2 (GGF2), 및 감각 및 운동 뉴런-유래 인자 (SMDF)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 뉴레귤린-1의 스플라이스(splice) 변이체 및 이소형(isoform); 뉴레귤린-2; NRG2-β를 포함하나 이에 제한되지는 않는 뉴레귤린-2의 스플라이스 변이체 및 이소형; 에피레귤린; 및 비레귤린(Biregulin)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "발현"이라는 용어는 물체 또는 물질의 생산, 뿐만 아니라 물체 또는 물질의 생산의 수준 또는 양을 지칭한다. 따라서, 특정 마커의 발현을 결정하는 것은 발현되는 마커의 상대적인 양 또는 절대적인 양을 결정하는 것, 또는 단순히 마커의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "마커"라는 용어는 관찰 또는 검출될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 예를 들어, 마커는 핵산, 예컨대 특정 유전자의 전사체, 유전자의 폴리펩티드 생성물, 비-유전자 생성물 폴리펩티드, 당단백질, 탄수화물, 당지질, 지질, 지질단백질 또는 소형 분자 (예를 들어, 분자량이 10,000 amu 미만인 분자)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
대부분의 본원에 기재된 마커에 대해, 공식 인간 게놈 기구(Human Genome Organization) (HUGO) 유전자 기호가 제공된다. HUGO 유전자 명명 위원회(Gene Nomenclature Committee)가 개발한 이같은 기호는 명명된 인간 유전자 및 유전자 생성물 각각에 독특한 약어를 제공한다. 이러한 유전자 기호는 쉽게 인식되고, 통상의 기술자는 용이하게 이를 상응하는 독특한 인간 유전자 및/또는 단백질 서열과 연관시킬 수 있다.
HUGO 명칭에 따르면, 하기의 유전자 기호가 하기와 같이 정의된다: GHRL - 그렐린(ghrelin); IAPP - 섬 아밀로이드 폴리펩티드; INS - 인슐린; GCG - 글루카곤; ISL1 - ISL1 전사 인자; PAX6 - 페어드 박스 유전자 6; PAX4 - 페어드 박스 유전자 4; NEUROG3 - 뉴로제닌 3 (NGN3); NKX2-2 - NKX2 전사 인자 관련, 유전자좌 2 (NKX2.2); NKX6-1 - NKX6 전사 인자 관련, 유전자좌 1 (NKX6.1); IPF1 - 인슐린 프로모터 인자 1 (PDX1); ONECUT1 - 단일 절단 도메인, 패밀리 구성원 1 (HNF6); HLXB9 - 호메오박스 B9 (HB9); TCF2 - 전사 인자 2, 간 (HNF1b); FOXA1 - 포크헤드 박스 A1; HGF - 간세포 성장 인자; IGF1 - 인슐린-유사 성장 인자 1; POU5F1 - POU 도메인, 클래스 5, 전사 인자 1 (OCT4); NANOG - Nanog 호메오박스; SOX2 - SRY (성 결정 영역 Y)-박스 2; CDH1 - 카드헤린 1, 유형 1, E-카드헤린 (ECAD); T - 브라키우리 상동체 (BRACH); FGF4 - 섬유모세포 성장 인자 4; WNT3 - 윙리스(wingless)-유형 MMTV 통합 부위 패밀리, 구성원 3; SOX17 - SRY (성 결정 영역 Y)-박스 17; GSC - 구스코이드(goosecoid); CER1 - (세르베루스(cerberus) 1, 시스테인 노트(knot) 슈퍼패밀리, 상동체 (CER); CXCR4 - 케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 4; FGF17 - 섬유모세포 성장 인자 17; FOXA2 - 포크헤드 박스 A2; SOX7 - SRY (성 결정 영역 Y)-박스 7; SOX1 - SRY (성 결정 영역 Y)-박스 1; AFP - 알파-태아단백질; SPARC - 분비 단백질, 산성, 시스테인-풍부 (오스테오넥틴(osteonectin)); 및 THBD - 트롬보모듈린(thrombomodulin) (TM), NCAM - 신경 세포 부착 분자; SYP - 시냅토피신(synaptophysin); ZIC1 - Zic 패밀리 구성원 1; NEF3 - 신경미세섬유 3 (NFM); SST - 소마토스타틴; MAFA - v-maf 근건막 섬유육종 종양유전자 상동체 A; MAFB - v-maf 근건막 섬유육종 종양유전자 상동체 B; SYP - 시냅토피신; CHGA - 크로모그라닌 A (부갑상선 분비 단백질 1); NGN3 - 뉴로제닌 3, NKX2.2 - NK2 호메오박스 2; NKX6.1 - NK6 호메오박스 1; ID1- DNA 결합 억제제 1, GHRL- 그렐린/오베스타틴(Obestatin) 프리프로펩티드, GSK - 글리코겐 신타제(Synthase) 키나제, G6PC2 - 글루코스-6-포스파타제, UCN3- 유로코르틴(urocortin) 3, PCSK1- 프로프로틴(proprotein) 컨버타제 서브틸리신(subtilisin)/켁신(kexin) 유형 1, SLC30A8 - 용질 운반체 패밀리 30 (아연 수송체), 구성원 8, 및 CADH1 - E-카드헤린. 섬유모세포 성장 인자 7 (FGF7) 및 각질세포 성장 인자 (KGF)라는 용어들은 동의성이다.
특정 세포에 특징적인 유전자 또는 유전자 마커의 상대적인 발현을 제2 유전자 또는 대조군 유전자, 예를 들어, 살림 유전자의 발현과 비교하여 결정함으로써 만능 세포가 다양한 다능 및/또는 분화 세포로 진행되는 것을 모니터링할 수 있다. 일부 프로세스에서, 마커의 존재 또는 부재를 검출하는 것에 의해 특정 마커의 발현이 결정된다. 대안적으로, 세포 배양물 또는 세포 집단의 세포 내에 마커가 존재하는 수준을 측정함으로써 특정 마커의 발현이 결정될 수 있다. 이같은 프로세스에서, 마커 발현의 측정은 정성적 또는 정량적일 수 있다. 마커 유전자에 의해 생산되는 마커의 발현을 정량하는 한 방법은 정량적 PCR (Q-PCR)의 사용을 통한 방법이다. Q-PCR을 수행하는 방법은 관련 기술분야에 주지되어 있다. 관련 기술분야에 공지된 기타 방법이 마커 유전자 발현을 정량하는데 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 마커 유전자 생성물에 대해 특이적인 항체를 사용함으로써 마커 유전자 생성물의 발현을 검출할 수 있다.
추가적으로, 다중화 검정법 및/또는 방법이 다수의 유전자를 높은 감도 및 효율로 분석하기 위해 이용가능하다. 예를 들어, 적어도 엔카운터 시스템(nCounter System) (미국 워싱턴주 시애틀의 나노스트링이 제공함)으로, 현재 사용자가 800개까지의 유전자의 발현 수준을 정량적 PCR 시스템에 필적하는 감도 및 반응 당 15분 미만의 조작 시간으로 동시에 분석할 수 있다. 따라서, 임의의 샘플 (예를 들어, 각각 단계 4 PEC 및 단계 7 내분비 선조/전구체 및 내분비 세포 배양물) 내의 전체 RNA를 6100 핵산 추출기 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems); 미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 단리할 수 있고 (예를 들어, 삼중으로), 반응 당 약 100 ng이 나노스트링 엔카운터 시스템을 사용하는 유전자 발현의 정량에 필요하다. 그리고 아날로그 검출 대신에, 엔카운터 시스템은 디지털 검출을 사용하고, 이에 의해 독특한 유색 형광단 스트링 (분자 바코드)에 부착된 DNA 절편에 결합된 프로브에 의해 각각의 유전자 전사체가 검출된다. 따라서 이러한 전사체의 확인은 형광 강도보다는 스트링 상의 형광의 순서에만 좌우된다. 둘째로, 특정 형광 스트링 (바코드)이 검출된 시간의 총수를 카운팅함으로써 샘플 내의 전체 전사체의 개수가 정량된다. 게다가, 이러한 방법은 표적 mRNA의 증폭을 필요로 하지 않아서, 범위가 생물학적 발현 범위이고, 전형적으로는 3자릿수이다. 현재, 이러한 시스템은 적게는 세포 당 20개의 사본 (10 fM)의 단일 전사체의 1.2배 변화를 통계적으로 유의하게 측정할 수 있다 (p < 0.05). 세포 당 사본 0.5개 내지 20개의 수준으로 발현되는 유전자의 경우, 발현 수준에서의 1.5배 차이가 동일한 신뢰 수준으로 검출가능하다.
일부 프로세스에서, 예를 들어, 다른 유전자의 더 낮은 발현과 비교하여 하기 유전자의 더 높은 발현이 특정 세포 집단을 가리킨다: SOX17, SOX7, AFP 또는 THBD는 배아외 내배엽을 가리키고; NODAL 및/또는 FGF8은 전-원시 선을 가리키고; 브라키우리, FGF4, SNAI1 및/또는 WNT3은 중내배엽을 가리키고; CER, GSC, CXCR4, SOX17 및 FOXA2는 확정적 내배엽 세포를 가리키고; SOX17, FOXA2, FOXA1, HNF1B 및 HNF4A는 앞창자 내배엽 (또는 PDX1-음성 내배엽)을 가리키고; PDX1, HNF6, SOX9 및 PROX1은 PDX1-양성 내배엽을 가리키고; PDX1, NKX6.1, PTFA1, CPA 및 cMYC는 췌장 상피 (PE 또는 췌장 선조)를 가리키고; NGN3, PAX4, ARX 및 NKX2.2는 내분비 선조/전구 세포를 가리키고; INS, GCG, GHRL, SST 및 PP는 다양한 내분비 세포를 가리키고; 비교적 높은 MAFA 대 MAFB 유전자 발현은 인슐린 분비 내분비 세포를 가리키며; MAFB 대 MAFA 유전자 발현의 비교적 높은 발현은 글루카곤 분비 내분비 세포를 가리킨다. 특정 도면에서, 특정 계통의 이러한 특정 세포 유형에 전형적인 "서명" 또는 "주요" 마커만 제시된다. 통상의 기술자는 기타 마커 또는 유전자, 예를 들어, 구성적으로 발현되거나 또는 특정 계통 또는 전체 계통의 모든 또는 대부분의 또는 대다수의 세포 유형에서 발현되는 유전자가 발현되지만 제시 또는 기재되지 않는다는 것을 잘 이해한다.
유도형 만능 줄기 ( iPS ) 세포의 생산 방법
본원에 기재된 실시양태들은 어느 한 유형의 iPS 세포 또는 iPS 세포를 생산하는 어느 한 방법에 제한되지 않는다. 실시양태들은 iPS 세포의 생산 효율의 수준에 제한되거나 의존적이지 않은데, 다양한 방법이 존재하기 때문이다. 본원에 기재된 실시양태들은 iPS 세포의 내배엽-계통 세포로의 분화 및 이의 용도에 적용된다.
특정 핵 리프로그래밍 인자를 사용하는 연구는 만능 줄기 세포 또는 만능-유사 줄기 세포가 환자 자신의 체세포로부터 유래되는 것을 허용하였다. 이러한 세포들은 유도형 만능 줄기 (iPS) 세포로 또한 칭해진다. 본 발명은 교토 대학교(Kyoto University)의 신야 야마나카(Shinya Yamanaka)가 제공하는 다양한 iPS 세포주를 기재한다. 그러나, 기타 iPS 세포주, 예를 들어, 제임스 톰슨(James Thomson) 등이 기재한 것들이 본원에서의 발명에 의한 것이다. 미국 공보 20090047263, 국제 공보 WO2005/80598, 미국 공보 20080233610 및 국제 공보 WO2008/11882를 참조한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "유도형 만능 줄기 (iPS) 세포"는 다른 만능 줄기 세포, 예를 들어, hES 세포, hEG 세포, pPS (영장류 만능 줄기) 세포, 단성생식 세포 등과 성질이 유사한 세포를 의미한다.
핵 프로그래밍 인자가 미국 공보 20090047263, 국제 공보 WO2005/80598, 미국 공보 20080233610 및 국제 공보 WO2008/11882에 기재되어 있고, 난자, 배아 또는 ES 세포를 사용하지 않으면서 분화 세포의 리프로그래밍을 유도하는데 사용되었다. 본 발명에서 사용 및 기재된 것과 유사한 핵 리프로그래밍 인자를 사용함으로써 체세포로부터 유도형 iPS 세포를 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 체세포 및 유도형 만능 줄기 세포가 증식할 수 있는 환경 하에 핵 리프로그래밍 인자가 체세포와 접촉된다. 본원에 기재된 특정 실시양태의 장점은 난자, 배아 또는 배아 줄기 (ES) 세포의 부재 하에 핵 리프로그래밍 인자를 체세포와 접촉시킴으로써 유도형 만능 줄기 세포가 제조될 수 있다는 것이다. 핵 리프로그래밍 인자를 사용함으로써, iPS 세포 또는 "ES-유사 세포"를 수득하도록 체세포의 핵이 리프로그래밍될 수 있다.
본원에 기재된 만능 줄기 세포는, hES 세포이든 또는 iPS 세포이든, 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 만능 세포 마커를 임의의 개수로 발현할 수 있다: 알칼리성 포스파타제 (AP); ABCG2; 기 특이적 배아 항원-1 (SSEA-1); SSEA-3; SSEA-4; TRA-1-60; TRA-1-81; Tra-2-49/6E; ERas/ECAT5, E-카드헤린; .β.III-튜불린; .알파.-평활근 액틴 (.알파.-SMA); 섬유모세포 성장 인자 4 (Fgf4), 크립토(Cripto), Dax1; 아연 핑거 단백질 296 (Zfp296); N-아세틸트랜스퍼라제-1 (Nat1); (ES 세포 연관 전사체 1 (ECAT1); ESG1/DPPA5/ECAT2; ECAT3; ECAT6; ECAT7; ECAT8; ECAT9; ECAT10; ECAT15-1; ECAT15-2; Fthl17; Sal14; 미분화 배아 세포 전사 인자 (Utf1); Rex1; p53; G3PDH; TERT를 포함하는 텔로머라제(telomerase); 침묵 X 염색체 유전자; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; F-박스 함유 단백질 15 (Fbx15); Nanog/ECAT4; Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42, FoxD3; GDF3; CYP25A1; 발달 만능-연관 2 (DPPA2); T-세포 림프종 중단점 1 (Tcl1); DPPA3/스텔라; DPPA4 등. 본 발명이 본원에 열거된 이러한 마커들에 제한되지 않고, 세포 표면 마커, 항원, 및 EST, RNA (마이크로RNA 및 안티센스 RNA 포함), DNA (유전자 및 cDNA 포함), 및 이의 일부분을 포함하는 기타 유전자 생성물을 포함하는 것으로 이해된다.
한 실시양태에서, 본원에서 사용된 iPS 세포주는 하기의 핵 리프로그래밍 인자 유전자를 함유한다: Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, 및 Sox 패밀리 유전자. 한 iPS 세포주에서, 하기의 3종의 유전자 각각이 제공된다: Oct3/4, Klf4, 및 Sox2. 다른 iPS 세포주에서는, 하기의 3종의 유전자 각각의 유전자 생성물이 사용되었다: Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, 및 Myc 패밀리 유전자, 예를 들어, Oct3/4, Klf4 및 c-Myc. 따라서, 핵 리프로그래밍 인자가 Myc 패밀리 유전자와 함께일 수 있거나 또는 Myc 패밀리 유전자가 없을 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 기재되어 있고 또한 관련 기술분야에 공지된 된 핵 리프로그래밍 인자가 분화된 성체 체세포로부터 iPS 세포를 생성시키는데 사용될 수 있고, 리프로그래밍되는 체세포의 유형에 의해 제한되지 않으며, 즉 임의의 종류의 체세포가 리프로그래밍 또는 탈분화될 수 있다. 체세포를 리프로그래밍하는 것은 난자 및/또는 배아를 필요로 하지 않기 때문에, iPS 세포가 포유동물 세포일 수 있고, 따라서 환자- 또는 질환-특이적 만능 줄기 세포를 생성시키는 기회를 제공한다.
아데노바이러스, 플라스미드, 또는 Cre-loxP3를 사용한 리프로그래밍 인자의 절단, 또는 돼지 BAC 전위를 사용하여 유도형 만능 줄기 세포 (iPSC)를 생성시키는 바이러스, 비-바이러스 및 비-통합 바이러스 방법들이 기재되었다. 문헌 [Stadtfeld, M., et al., Science 322, 945-949 (2008)]; [Okita, K. et al., Science 322, 949-953 (2008)]; [Kaji, K. et al. Nature 458, 771-775 (2009)]; [Soldner, F. et al. Cell 136, 964-977 (2009)]; 및 [Woltjen, K. et al. Nature 458, 766-770 (2009)] 참조. 맥 에이(Mack, A.) 등의 미국 특허 출원 번호 20100003757 (2010년 1월 7일 공개) 및 시(Shi) 등의 PCT/US2009/037429를 또한 참조한다. 그러나, 이러한 방법들은 리프로그래밍 효율이 낮고 (<0.003％), 절단에도 불구하고 잔류 벡터 서열을 남길 수 있으며, 이는 이들의 치료 용도를 제한한다. 예를 들어, 숙주 게놈 내의 바이러스 통합 및 상기 전사 인자의 과발현이 종양발생과 연관되었고, 잠재적으로 잔류 트랜스진(transgene) 발현은 ES 세포 및 iPS 세포를 구별하는 특색이다. 문헌 [Solder, F. et al., Cell 136:964-977 (2009)]; [Foster et al., Oncogene 24:1491-1500 (2005)]; 및 [Hochedlinger, K. et al., Cell 121:465-477 (2005)] 참조.
본 발명의 다른 실시양태에서, iPSC의 생성 방법은 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스로부터 유래된 에피솜 벡터를 포함한다. 문헌 [Yu, J. et al. Science 324, 797-801 (2009)] 및 맥 에이 등의 미국 출원 20100003757 (2010년 1월 7일 공개)을 참조한다. 이러한 방법들은 종양유전자 SV40를 포함하는 7개의 인자의 조합을 보유하는 3개의 별도의 플라스미드를 필요로 한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, iPSC의 생성 방법은 마우스 및 인간 태아 및 비-태아 세포로부터의 단백질-기재 iPSC를 포함한다. 문헌 [Zhou, H. et al. Cell Stem Cell 4, 381-384 (2009)]; 및 [Kim, D. et al. Cell Stem Cell 4, 472-476 (2009)] 참조. 이러한 방법은 화학적 처리 (예를 들어 상기 문헌 [Zhou et al. 2009]의 경우의 발프로산) 또는 다수의 처리 라운드 (상기 문헌 [Kim et al. 2009])를 사용하는 것을 수반한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 박테리아 복제 기원 및 항생제 저항성 유전자가 결여된 슈퍼코일드(upercoiled) DNA 분자인 미니서클(minicircle) 벡터 또는 플라스미드가 사용될 수 있다. 문헌 [Chen, Z.-Y. et al., Mol. Ther. 8, 495-500 (2003)]; [Chen, Z.-Y. et al., Hum. Gene Ther. 16, 126-131 (2005)]; 및 [Jia, F. et al., Nature Methods Advance Publication Online 7 February 2010] 참조. 이들은 외인성 침묵화 메커니즘의 활성화가 더 낮기 때문에 이소성 발현이 더 길고 형질감염 효율이 풍부한 iPSC가 이러한 방법들로 생성된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 당뇨병 환자, ALS, 척수성 근육 위축 및 파킨슨 환자를 포함하는 다양한 질환의 인간 환자로부터 iPS 세포가 생성될 수 있다. 문헌 [Maehr et al. PNAS USA 106(37):15768-73 (2009)]; [Dimos et al., Science, 321:1218-21 (2008)]; [Ebert et al. Nature 457:277-80 (2009)]; [Park et al. Cell 134:877-886 (2008)]; 및 [Soldner et al., Cell 136:964-977] 참조. 특정 질환의 환자로부터 hIPS 세포를 생산하는 것의 하나 이상의 장점은 유래된 세포가 이러한 인간 질환의 유전자형 및 세포 반응을 함유할 것이라는 것이다. 적어도 일부의 기존의 인간 iPS 세포주가 열거된 표 4를 또한 참조한다. 이러한 정보는 <National Institutes of Health (NIH) Stem Cell Registry>, <Human Embryonic Stem Cell Registry> 및 <International Stem Cell Registry> (미국 매사추세츠주 우스터 소재의 매사추세츠 대학교 의과 대학(University of Massachusetts Medical School)에 위치함)가 예를 들어 포함되는 공개적으로 입수가능한 데이터베이스 및 문헌으로부터 유래되었다. 세포주들이 입수가능해지고 등록이 수득됨에 따라 이러한 데이터베이스들은 주기적으로 업데이트된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 실시양태들은 CyT49, CyT212, CyT203, CyT25 (적어도 본원의 출원 시점에 비아사이트 인크(ViaCyte Inc.) (캘리포니아주 92121 샌디에고 제네럴 아토믹스 코트 3550에 위치함)로부터 시판됨), BGO1, BG02 및 MEL1을 포함하나 이에 제한되지는 않는 hESC, 및 유도형 만능 줄기 (iPS) 세포 예컨대 iPSC-482c7 및 iPSC-603 (셀룰러 다이나믹스 인터내셔널 인크(Cellular Dynamics International, Inc.) (위스콘신주 매디슨)로부터 시판됨) 및 iPSC-G4 (이하 "G4") 및 iPSC-B7 (이하 "B7") (교토 대학교의 iPS 세포 연구 센터(Center for iPS Cell Research)의 신야 야마나카로부터 시판됨)과 같은 인간 만능 줄기 세포를 포함하는 다양한 분화가능한 영장류 만능 줄기 세포의 사용을 구상하고, 이러한 인간 IPS 세포 및 기타 인간 IPS 세포를 사용하는 연구가 미국 특허 출원 12/765,714 및 13/761,078 (양쪽 모두 영문 명칭이 "CELL COMPOSITIONS FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLS"이고 각각 2010년 4월 22일 및 2013년 2월 6일 출원됨)에 상세하게 기재되어 있다. 이러한 인간 만능 줄기 세포 중 몇몇은 국립 등록소 예컨대 국립 보건원 (NIH)에 등록되어 있고, <NIH Human Stem Cell Registry>에 열거되어 있다 (예를 들어, CyT49 등록 번호 #0041). CyT49, 기타 입수가능한 세포주에 대한 정보를 stemcells.nih.gov/research/registry의 월드와이드웹에서 또한 확인할 수 있다. 또 다른 세포주, 예를 들어, BG01 및 BG01v가 시판되고, 위스콘신 국제 줄기 세포(Wisconsin International Stem Cell) (WISC) 뱅크의 계열사인 WiCell® (카탈로그명, BG01) 및 ATCC (카탈로그 번호 SCRC-2002) 각각에 의해 제3의 단체에 배포되었다. 본원에 기재된 기타 세포주가 생물학적 저장소, 예컨대 WiCell® 또는 ATCC에 등록 또는 배포되지 않을 수 있지만, 책임 연구원, 실험실 및/또는 기관으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 이같은 세포주가 공개적으로 시판된다. 세포주 및 시약의 공개적인 요청은, 예를 들어, 생명 과학 분야의 기술자들에게 통상적이다. 전형적으로, 이러한 세포 또는 물질의 운송은 세포주 또는 물질의 소유주와 수용자 사이의 표준 물질 운송 협약에 의한 것이다. 이러한 유형의 물질 운송은 연구 환경에서, 특히 생명 과학의 연구 환경에서 빈번하게 발생한다. 실제로, 상업적 및 비영리 산업 파트너 및 공동연구자와의 이같은 협약을 통해 출원인은 CyT49 (2006), CyT203 (2005), Cyt212 (2009), CyT25 (2002), BG01 (2001), BG02 (2001), BG03 (2001) 및 BG01v (2004)를 포함하는 세포를 이들이 유도 및 특성화된 이래로 일상적으로 운송하였다. 상기 목록의 각각의 세포주 옆의 괄호 안의 연도는 세포주 또는 물질이 공개적으로 입수가능해지고 불멸화된 (예를 들어 세포 뱅크가 제조된) 연도를 가리키고, 따라서 본원에 기재된 조성물을 제조하고 본원에 기재된 방법을 실행하기 위해 이러한 세포주의 확립 이래로 또 다른 배아의 파괴가 수행 또는 요구되지 않았다.
표 4 및 5는 각각 연구 및/또는 상업적 목적을 위해 세계적으로 입수가능한 특정 iPSC 및 hESC의 비포괄적인 목록이고, 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용하기에 적절하다. 표 3 및 4의 정보는 <National Institutes of Health (NIH) Human Stem Cell Registry>, <Human Embryonic Stem Cell Registry> 및 <International Stem Cell Registry> (미국 매사추세츠주 우스터 소재의 매사추세츠 대학교 의과 대학에 위치함)가 예를 들어 포함되는 공개적으로 입수가능한 데이터베이스 및 문헌으로부터 유래되었다. 세포주들이 입수가능해지고 등록이 수득됨에 따라 이러한 데이터베이스들은 주기적으로 업데이트된다.
셀룰러 다이나믹스 인터내셔널 인크 (미국 위스콘신주 매디슨)에서 본원에 기재된 인간 iPSC (적어도 iPSC-603 및 iPSC-482-c7)가 제공되었다.
<표 4>
인간 유도형 만능 줄기 (hIPS) 세포주의 목록
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
hIPS 세포를 사용하는 것의 또 다른 장점은 이같은 hIPS 세포가 면역학적으로 매칭되는 자가 세포 집단일 것이라는 것과 환자-특이적 세포가 질환의 기원 및 진행을 연구하는 것을 허용할 것이라는 것이다. 따라서, 질환의 근본 원인을 이해하는 것이 가능하고, 이는 이러한 질환에 대한 예방적 및 치료적 처치의 발달에 이르는 식견을 제공할 수 있다.
만능 인간 배아 줄기 ( hES ) 세포
일부 실시양태는 인간 배아 줄기 (hES) 세포를 출발 물질로 사용하여 확정적 내배엽 세포, 궁극적으로는 임의의 내배엽-계통 유래 세포 유형 (앞창자 내배엽, 췌장 내배엽, 내분비 선조/전구 세포 및/또는 췌장 섬 호르몬-발현 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 유도하는 방법에 관한 것이다. 이러한 hES 세포는 상실배, 배아 속세포덩이, 또는 배아 생식제로부터 수득된 것들에서 기원하는 세포일 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 인간 배아 줄기 세포가 실질적인 분화 없이 만능 상태로 배양에서 유지될 수 있다. 이같은 방법이, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,453,357; 5,670,372; 5,690,926; 5,843,780; 6,200,806 및 6,251,671에 기재되어 있다.
일부 프로세스에서, 만능 줄기 세포, 예를 들어 hES 세포가 피더 층 상에서 유지된다. 이같은 프로세스에서, 만능 세포가 만능 상태로 유지되도록 허용하는 임의의 피더 층이 사용될 수 있다. 인간 배아 줄기 세포의 배양을 위한 한 통상적으로 사용되는 피더 층은 마우스 섬유모세포의 층이다. 더욱 최근에는, 만능 세포의 배양에서 사용하기 위해 인간 섬유모세포 피더 층이 개발되었다 (미국 특허 출원 공개 번호 2002/0072117 참조). 대안적인 프로세스는 피더 층을 사용하지 않으면서 만능 세포의 유지를 허용한다.
본원에 기재된 만능 세포는 혈청의 존재 또는 부재, 세포외 매트릭스의 존재 또는 부재, FGF의 존재 또는 부재 하에 배양에서 유지될 수 있다. 일부 만능 세포 유지 절차에서, 혈청 대체물이 사용된다. 각각 만능 또는 다능 세포의 배양 및 분화를 위한 이러한 방법 및 기타 방법이 PCT/US2007/062755 (2007년 2월 23일 출원되고, 영문 명칭이 "COMPOSITIONS AND METHODS FOR CULTURING DIFFERENTIAL CELLS"임) 및 PCT/US2008/080516 (2008년 10월 20일 출원되고, 영문 명칭이 "METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIPOTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HUMAN SERUM"임)에 기재되어 있다.
본원에 기재된 방법은 모든 hES 세포주, 및 적어도 표 5에 열거된 것들에 유용하고, 이들은 wicell.org/home/stem-cell-lines/order-stem-cell-lines/obtain-stem-cell-lines.cmsx의 월드와이드웹 상에서 WiCell로부터 상업적 구입을 위해 또는 확인된 회사로부터 시판된다. 이러한 정보는 <National Institutes of Health (NIH) Stem Cell Registry>, <Human Embryonic Stem Cell Registry> 및 <International Stem Cell Registry> (미국 매사추세츠주 우스터 소재의 매사추세츠 대학교 의과 대학에 위치함)가 예를 들어 포함되는 공개적으로 입수가능한 데이터베이스 및 문헌으로부터 유래되었다. 세포주들이 입수가능해지고 등록이 수득됨에 따라 이러한 데이터베이스들은 주기적으로 업데이트된다. 적어도 254개의 <International Stem Cell Registry>로 열거된 시판되는 iPSC 세포주 및 1211개의 시판되는 hESC 세포주가 있다. 하기의 표 5는 열거된 모든 hESC 및 iPSC를 포함하지 않고, 그보다는, 잠재적으로 이용가능한 만능 줄기 세포의 예이다.
<표 5>
인간 배아 줄기 (hES) 세포주의 목록
Figure pct00016
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만능 줄기 세포를 유도하는 대안적인 방법
배아 파괴 없이, 만능 줄기 세포, 예컨대 포유동물 ES 세포를 유도하는 방법이 존재한다. 간략하게, 배아를 무손상이게 두고 따라서 이의 파괴를 야기하지 않는, 단일 할구로부터의 마우스 및 인간 ES 세포의 유도를 기재하는 3개의 과학 저널 논문을 어드밴스드 셀 테크놀러지 (미국 매사추세츠주 우스터)가 발표하였다. 2005년 후반에, 정(Chung) 등이 단일 할구로부터 마우스 ES 세포를 제조하는 방법을 최초로 기재하였다. 문헌 [Chung et al. (2006) Nature 439: 216-219] (2005년 10월 16일에 온라인에서 발표됨) 참조. 문헌 [Chung et al. (2006)]에서, 착상전 유전 진단에 사용된 기술과 유사한 미세조작 기술을 사용하여 배아로부터 생검을 취하는 것이 기재되었다; 217면 참조. 이때는 정(Chung) 등 (2006)이 할구 세포주를 다른 배아 줄기 세포와 함께 공동-배양하였지만, 추후에는 이를 필요로 하지 않은 방법을 개발하였다. 문헌 [Chung et al. (2008) Human Embryonic Stem Cell Lines Generated without Embryo Destruction, Cell Stem Cell 2: 113-117] 참조.
착상전 유전 진단은 착상 전에 배아에서의 유전적 이상을 분석하기 위해 사용된다. 이러한 방법은 투명대에 구멍을 만들고, 개구부를 통해 1개 또는 2개의 할구를 흡인 또는 압출 또는 절단함으로써, 양친의 유전적 입력값이 연구될 수 있을 때, 초기의 정상적으로 발생 중인 배아 (예를 들어, 8-세포 단계)에서 수행된다. 형광 원위치 혼성화 (FISH) 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하는 유전학적 분석이 각각 염색체 이상 및 단일유전자 장애를 분석하기 위해 PGD에서 통상적으로 사용된다. 이어서, 유전적 이상이 없으면, 나머지 무손상 배아를 정상적인 임신 기간을 위해 여성 환자 내로 이식한다. 빠르게는 2004년에 문헌 [Staessen, C. et al. (2004), Comparison of blastocyst transfer with or without preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening in couples with advanced maternal age: a prospective randomized controlled trial, Hum. Reprod. 19: 2849-2858] 및 [Monni et al. (2004) Preimplantation genetic diagnosis for beta-thalassaemia: the Sardinian experience. Prenat Diagn 24: 949-954]를 포함하는 다양한 그룹에서 착상전 유전 진단 기술이 보고되었다. 따라서, 정 등 (2006)은 배아를 파괴하지 않으면서 초기 배아로부터 할구를 추출하는데 이용가능한 방법을 기재했을 뿐이었다.
추가로, 2006년 8월에, 문헌 [Chung et al. (2006)]의 제2 저자이고 또한 어드밴스드 셀 테크놀러지 출신인 클리만스카야(Klimanskaya) 등이, 상기 문헌 [Chung et al. (2006)]에 최초로 기재된 것과 유의하게 상이하지 않게, 비록 효율적이지는 않았지만 (단리된 할구의 2％만이 hES 세포주를 생성함), 유사한 PGD 기술이 단일 할구로부터의 인간 ES 세포주의 유도를 가능하게 하였음을 입증한 절차를 기재하였다. 문헌 [Klimanskanya et al. (2006) Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres, Nature 444, 481-485] 참조. 클리만스카야 등은 새롭게 유도된 hES 세포주를 정 등 (2006)이 중요할 수 있다고 언급된 다른 ES 세포과 함께 공동-배양하였다. 정 등 (2006)은 "(그의) 연구에서의 ES 공동-배양 시스템의 성공이 ES 세포가 분비하는 물질에 기인할 수 있는지 여부 또는 세포-세포 접촉이 필요한지가 불명확하다"고 언급하였다. 상기 문헌 [Chung et al. (2006)]의 218면의 오른쪽 단락 참조. 그러나, 동일한 정 등의 추후의 2008년의 연구에서는, hES 세포주가 ES 세포와의 공동-배양을 전혀 필요로 하지 않았음이 입증되었는데, 이는 단리된 할구를 라미닌이 있는 배지에서 배양하는 것이 이들이 hESC를 초래하는 능력을 강화시켰기 때문이다. 2008년 1월 10일에 온라인에서 공개된 문헌 [Chung et al. (2008), Human Embryonic Stem Cell Lines Generated without Embryo Destruction, Cell Stem Cell (2):113-117, p.116] 참조. 게다가, 이러한 방식으로 수득된 hES 세포는 미분화 상태를 6개월 초과 동안 유지할 수 있는 것을 포함하여 hES 세포를 포함하는 다른 인간 만능 줄기 세포와 동일한 특성이 있었고, 정상적인 핵형 및 만능 마커 (Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Nanog 및 알칼리성 포스파타제를 포함함)의 발현을 나타냈으며, 분화될 수 있고, 3가지 배아 배엽 모두의 유도체를 시험관내에서, 그리고 생체내에서 기형종에서 형성할 수 있다.
따라서, 단일 할구를 다른 ES 세포와 함께 공동-배양하는 것이 정 등 (2006)이 최초로 가정한 바와 같이 결정적이지 않은지, 및 이들을 단지 라미넨 (다수의 세포외 매트릭스 (시판되고/되거나 예를 들어 피더 세포를 용해시팀으로써 제조됨)의 통상적인 성분이고, 포유동물 세포를 성장시키는데 통상적으로 사용되고 포유동물 세포를 성장시키는 것으로 공지됨) 상에서 배양하는 것 등이 정의 2006년 간행물에 의해 단일 할구로부터의 마우스 ES 세포주의 유도가 최초로 제시된 시점에 공지되어 있었고, 이용가능하였다. 따라서, 관련 기술분야의 기술자가 상기 문헌 [Chung et al. (2006)]의 방법을 취하고, 상기 문헌 [Straessen et al. (2004)]에 앞서 기재된 바와 같이 이용가능한 지식을 사용하여, 배아를 보존하면서 또는 이의 파괴를 방지하면서 단일 할구로부터 hES 세포주를 유도할 수 있었다는 것이 전적으로 가능하다.
만능 줄기 세포 및 만능 줄기 세포로부터 유래된 세포의 응집체 현탁액
개별적인 세포들을 중합체 스캐폴드, 매트릭스 및/또는 겔 내로 시딩하는 것을 기초로 하는 기존에 공지된 조직 조작 방법과 대조적으로, 본원에 기재된 실시양태들은 만능 줄기 세포로부터 형성된 응집체 세포 응집체 현탁액, 단일 세포 현탁액, 또는 이로부터 유래된 분화된 단일 세포 현탁액을 사용할 수 있다. 줄기 세포 응집체 현탁액을 프로세싱 및/또는 제작하는 방법 및 이의 세포의 분화가 PCT/US2007/062755 (2007년 2월 23일에 출원되고, 영문 명칭이 "COMPOSITIONS AND METHODS FOR CULTURING DIFFERENTIAL CELLS"이며, 현재 미국 특허 8,211,699 및 8,415,158임); 및 PCT/US2008/080516 (2008년 10월 20일에 출원되고, 영문 명칭이 "METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIPOTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HUMAN SERUM"이며, 현재 미국 특허 8,334,138임), 및 상기 문헌 [Schulz T. et al. (2012)]에 기재되어 있다.
본원에 기재된 실시양태들은 미분화 상태에서의 확장을 허용하는 부착 성장 배양 조건에서 만능 세포를 배양하고; 부착성 만능 세포 배양물을 단일 세포 현탁 배양물로 해리시키고; 단일 세포 현탁 배양물이 현탁 상태의 만능-유래 세포 응집체를 형성하는 기간까지 단일 세포 현탁 배양물을 진탕시킴으로써 현탁 상태의 hES-유래 세포 응집체의 형성을 허용하는 제1 분화 배양 조건과 단일 세포 현탁 배양물을 접촉시키고, 이에 의해 현탁 상태의 만능-유래 세포 응집체를 생성시키는 것에 의해, 만능 부착 배양물로부터 현탁 상태의 만능 세포 응집체를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 단일 세포 현탁 배양물의 진탕은 약 80 rpm 내지 160 rpm에서의 회전에 의해 수행된다. 본원에 기재된 특정한 다른 실시양태에서, rho-키나제 억제제가 만능 줄기 세포 응집, 성장, 증식, 확장 및/또는 세포 질량을 용이하게 하는데 사용된다.
"실질적으로 균일한" 또는 "크기 또는 형상이 실질적으로 동일한"이라는 구절 또는 이의 등가물은 응집체의 균일성의 폭을 지칭하고, 약 20％ 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 응집체의 균일성의 폭은 약 15％, 10％ 또는 5％ 이하이다.
또 다른 실시양태에서, hES 세포 응집체 현탁액이 실질적으로 혈청이 없는 배지에서, 게다가 외인성으로 첨가된 섬유모세포 성장 인자 (FGF)의 부재 하에 배양되었다. 이는 혈청은 없지만 외인성으로 첨가된 성장 인자 (FGF 포함)를 함유하는 배지에서 hES 세포를 배양하는 것을 필요로 하는 톰슨, 제이(Thomson, J.)의 미국 특허 번호 7,005,252와 구별된다. 일부 실시양태에서, iPS 세포 응집체 현탁액은 혈청이 실질적으로 없는 배지에서, 그리고/또는 외인성으로 첨가된 섬유모세포 성장 인자 (FGF)의 부재 하에 배양된다.
정확한 응집체 당 세포수는 중요하지 않지만, 통상의 기술자는 각각의 응집체의 크기 (따라서 응집체 당 세포의 개수)가 중심 세포로 확산되는 산소 및 영양분의 용량에 의해 제한되고, 이러한 개수가 세포 유형 및 이러한 세포 유형의 영양 요건에 따라 또한 변할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 세포 응집체는 응집체 당 최소 개수의 세포 (예를 들어, 2개 또는 3개의 세포)를 포함할 수 있거나, 또는 응집체 당 수백 개 또는 수천 개의 세포를 포함할 수 있다. 전형적으로, 세포 응집체는 응집체 당 수백 개 내지 수천 개의 세포를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 세포 응집체는 전형적으로 크기가 약 50 마이크로미터 내지 내지 약 600 마이크로미터이지만, 세포 유형에 따라 크기가 이러한 범위보다 작거나 클 수 있다. 한 실시양태에서, 세포 응집체는 크기가 약 50 마이크로미터 내지 약 250 마이크로미터이거나, 또는 크기가 약 75 내지 200 마이크로미터이고, 바람직하게는 크기가 약 100 내지 150 마이크로미터이다.
또 다른 실시양태는 배상체 (EB)의 제조를 기재한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "배상체", "응집체"라는 용어 또는 이의 등가물은 ES 세포가 단층 배양물에서 과성장되거나, 또는 미규정 배지에서 현탁 배양물로 유지되거나, 또는 다수의 배엽층 조직을 향한 비-지향성 프로토콜을 통해 분화되었을 때에 나타나는 분화 및 미분화 세포의 응집체를 지칭한다. 즉, EB는 본원에 기재된 바와 같이 만능 줄기 세포의 단일 세포 현탁액으로부터 형성되지 않고, 만능-유래 다능 세포의 부착 배양물로부터 EB가 형성되지 않는다. 이러한 특색들은 단독으로 본 발명이 배상체와 명확히 구별되게 한다.
분화 및 미분화 세포의 혼합물이고, 전형적으로 여러 배엽층으로부터의 세포로 이루어지며, 무작위 분화가 진행되는 배상체와 대조적으로, 본원에 기재된 세포 응집체는 본질적으로 또는 실질적으로 동종-세포성이어서, 만능, 다능, 이능성, 또는 단능 유형 세포, 예를 들어, 배아 세포, 확정적 내배엽, 앞창자 내배엽, PDX1 양성 췌장 내배엽, 췌장 내분비 세포 등의 응집체로서 존재한다.
본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 보드나 등의 미국 특허 6,800,480 (제론 코포레이션에 양도됨)에 기재된 바와 같이, 배양 용기를 먼저 세포외 매트릭스로 코팅하는 것을 결코 필요로 하지 않는다. 본원에 기재된 일부 실시양태에서, 다른 만능 줄기 세포, 예를 들어, hES 및 iPS 세포가 출원인의 미국 특허 8,334,138; 및 상기 문헌 [Schulz T. et al. (2012)]에 실질적으로 기재된 바와 같이 가용성 인간 혈청을 사용하여 배양되는 것과 동일한 방식으로 iPS 세포가 배양될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 톰슨, 제이의 미국 특허 번호 7,005,252 (위스콘신 얼럼나이 리서치 파운데이션 (WARF)에 양도됨)에 기재된 바와 같이 섬유모세포 피더 층 이외의 공급원으로부터 공급된 외인성으로 첨가된 섬유모세포 성장 인자 (FGF)를 결코 필요로 하지 않는다.
다능 및 분화된 세포 조성물
본원에 기재된 방법으로 생산된 세포 조성물은 만능 줄기 세포, 전-원시 선, 중내배엽, 확정적 내배엽, 앞창자 내배엽, PDX1-양성 앞창자 내배엽, PDX1-양성 췌장 내배엽 또는 PDX1/NKX6.1 공동-양성 췌장 내배엽, 내분비 선조/전구체 또는 NGN3/NKX2.2 공동-양성 내분비 선조/전구체, 및 호르몬 분비 내분비 세포 또는 INS, GCG, GHRL, SST, PP 단일-양성 내분비 세포를 포함하는 세포 배양물로서, 배양물 내의 세포의 적어도 약 5-90％가 생산된 전-원시 선, 중내배엽, 확정적 내배엽, 앞창자 내배엽, PDX1-양성 앞창자 내배엽, PDX1-양성 췌장 내배엽 또는 PDX1/NKX6.1 공동-양성 췌장 내배엽, 내분비 선조/전구체 또는 NGN3/NKX2.2 공동-양성 내분비 선조/전구체, 및 호르몬 분비 내분비 세포 또는 INS, GCG, GHRL, SST, PP 단일-양성 내분비 세포를 포함하는 세포 배양물을 포함한다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 만능 세포 예컨대 줄기 세포 및 iPS 세포, 및 다능 세포 예컨대 전-원시 선, 중내배엽 또는 확정적 내배엽 양쪽 모두, 뿐만 아니라 더욱 분화되었지만 여전히 다능인 세포, 예컨대 PDX1-양성 앞창자 내배엽, PDX1-양성 췌장 내배엽 또는 PDX1/NKX6.1 공동-양성 췌장 내배엽, 내분비 선조/전구체 또는 NGN3/NKX2.2 공동-양성 내분비 선조/전구체, 및 호르몬 분비 내분비 세포 또는 INS, GCG, GHRL, SST, PP 단일-양성 내분비 세포를 포함하는 조성물, 예컨대 세포 집단 및 세포 배양물에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여, 만능 줄기 세포 및 기타 다능 또는 분화 세포의 혼합물을 포함하는 조성물이 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 약 5의 다능 또는 분화 세포 대 약 95의 만능 세포를 포함하는 조성물이 생산된다. 다른 실시양태에서, 적어도 약 95의 다능 또는 분화 세포 대 약 5의 만능 세포를 포함하는 조성물이 생산된다. 추가적으로, 다른 비율의 다능 또는 분화 세포 대 만능 세포를 포함하는 조성물이 구상된다. 예를 들어, 적어도 약 1의 다능 또는 분화 세포 대 약 1,000,000 만능 세포, 적어도 약 1의 다능 또는 분화 세포 대 약 100,000의 만능 세포, 적어도 약 1의 다능 또는 분화 세포 대 약 10,000의 만능 세포, 적어도 약 1의 다능 또는 분화 세포 대 약 1000의 만능 세포, 적어도 약 1의 다능 또는 분화 세포 대 약 500의 만능 세포, 적어도 약 1의 다능 또는 분화 세포 대 약 100의 만능 세포, 적어도 약 1의 다능 또는 분화 세포 대 약 10의 만능 세포, 적어도 약 1의 다능 또는 분화 세포 대 약 5의 만능 세포, 및 최대 약 1의 만능 세포 및 적어도 약 1,000,000의 다능 또는 분화 세포 대 약 1의 만능 세포를 포함하는 조성물이 구상된다.
본원에 기재된 일부 실시양태는 적어도 약 5％의 다능 또는 분화 세포 대 적어도 약 99％의 다능 또는 분화 세포를 포함하는 세포 배양물 또는 세포 집단에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포 배양물 또는 세포 집단은 포유동물 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양물 또는 세포 집단은 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, 특정한 구체적인 실시양태는 인간 세포를 포함하고, 인간 세포의 적어도 약 5％ 내지 적어도 약 99％가 다능 또는 분화 세포인 세포 배양물에 관한 것이다. 다른 실시양태는 인간 세포를 포함하고, 인간 세포의 적어도 약 5％, 적어도 약 10％, 적어도 약 15％, 적어도 약 20％, 적어도 약 25％, 적어도 약 30％, 적어도 약 35％, 적어도 약 40％, 적어도 약 45％, 적어도 약 50％, 적어도 약 55％, 적어도 약 60％, 적어도 약 65％, 적어도 약 70％, 적어도 약 75％, 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％, 적어도 약 98％, 적어도 약 99％, 또는 99％ 초과가 다능 또는 분화 세포인 세포 배양물에 관한 것이다. 세포 배양물 또는 세포 집단이 인간 피더 세포를 포함하는 실시양태에서, 상기 백분율은 세포 배양물 내의 인간 피더 세포를 고려하지 않고 계산된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 여러 유용한 특색이 있다. 예를 들어, 다능 세포, 예를 들어, 전-원시 선 세포 및/또는 중내배엽 세포를 포함하는 세포 배양물 및 세포 집단, 뿐만 아니라 이같은 세포 배양물 및 세포 집단을 생산하는 방법은 인간 발생의 초기 단계를 모델링하는데 유용하다. 또한, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 질환 상태, 예컨대 당뇨병에서의 치료적 개입을 위한 역할을 할 수도 있다. 예를 들어, 전-원시 선 세포 및/또는 중내배엽 세포는 제한된 수의 조직에 대해서만 원천으로서의 역할을 하기 때문에, 순수한 조직 또는 세포 유형의 발생에서 사용될 수 있다. 전-원시 선 세포를 생산하는 일부 프로세스에서, 출발 물질로서 사용된 만능 세포는 만능 줄기 세포, 예를 들어, hES, hEG 또는 iPS 세포이다.
영양외배엽 세포
본원에 기재된 방법을 사용하여, 다른 세포 유형이 실질적으로 없는 영양외배엽 세포를 포함하는 조성물이 생산될 수 있다. 본원에 기재된 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법으로 생산된 영양외배엽 세포 집단 또는 세포 배양물은 HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, 및 ERBB 유전자를 포함하는 군으로부터 선택된 마커의 발현이 비-영양외배엽 세포 또는 세포 집단에서의 HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2, 및 ERBB의 발현 수준과 비교하여 실질적으로 높다.
전-원시 선 세포
본원에 기재된 방법을 사용하여, 다른 세포 유형이 실질적으로 없는 전-원시 선 세포를 포함하는 조성물이 생산될 수 있다. 본원에 기재된 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법으로 생산된 전-원시 선 세포 집단 또는 세포 배양물은 BRACHURY 저, FGF4 저, SNAI1 저, SOX17 저, FOXA2 저, SOX7 저 및 SOX1 저와 비교하여 FGF8 및/또는 NODAL 마커 유전자를 실질적으로 발현한다. 전-원시 선 세포 및 전-원시 선 세포의 생산 방법이 출원인의 미국 특허 7,958,585 (영문 명칭이 "PREPRIMITIVE STREAK AND MESENDODERM CELLS"이고, 2011년 7월 26일 허여됨)에 상세하게 기재되어 있다.
배아외 세포
본원에 기재된 방법을 사용하여, 다른 세포 유형이 실질적으로 없는 배아외 세포를 포함하는 조성물이 생산될 수 있다. 원시, 내장 및 벽측 내배엽 세포가 배아외 세포이다. 원시 내배엽 세포는 내장 및 벽측 내배엽 세포를 초래한다. 내장 내배엽 세포는 난황낭의 일부를 형성하는 내배엽 세포이다. 내장 내배엽 세포는 영양분 흡수 및 수송 양쪽 모두에서 기능한다. 벽측 내배엽 세포는 라이헤르트 막으로 공지된 배아외 조직에 인접한다. 벽측 내배엽 세포의 역할 중 하나는 기저막 성분을 생산하는 것이다. 공동으로, 내장 내배엽 세포 및 벽측 내배엽 세포는 배아외 내배엽으로 종종 지칭되는 것을 형성한다. 명칭이 시사하는 바와 같이, 배아외 내배엽 세포는 발생 동안 형성되는 배아 구조를 초래하지 않는다. 대조적으로, 본원에 기재된 확정적 내배엽 세포 및 기타 내배엽-계통 또는 췌장-계통 세포는 배아성이거나 또는 배아 세포로부터 유래되고, 배아 발생 동안 형성되는 창자관으로부터 유래되는 조직을 초래한다. 본원에 기재된 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법으로 생산된 배아외 세포 집단 또는 세포 배양물은 SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1, HNF4알파 또는 AFP 유전자를 포함하는 군으로부터 선택된 마커의 발현이 적어도 SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1, 또는 AFP (다른 유형의 세포 또는 세포 집단, 예를 들어, 확정적 내배엽에서 발현되지 않음)의 발현 수준과 비교하여 실질적으로 높다.
중내배엽 세포
본원에 기재된 방법을 사용하여, 다른 세포 유형이 실질적으로 없는 중내배엽 세포를 포함하는 조성물이 생산될 수 있다. 본원에 기재된 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법으로 생산된 중내배엽 세포 집단 또는 세포 배양물은 FGF4, SNAI1 MIXL1 및/또는 WNT3 마커 유전자를 포함하는 군으로부터 선택된 마커의 발현이 SOX17 저, CXCR4 저, FOXA2 저, SOX7 저 및 SOX1 저와 비교하여 실질적으로 높다. 중내배엽 세포 및 중내배엽 세포의 생산 방법이 출원인의 미국 특허 7,958,585 (영문 명칭이 "PREPRIMITIVE STREAK AND MESENDODERM CELLS"이고, 2011년 7월 26일 허여됨)에 상세하게 기재되어 있다.
스크리닝 방법
일부 실시양태에서, 스크리닝 방법이 만능, 다능 및/또는 분화 세포, 예컨대 인간 만능 줄기 세포, 유도형 만능 줄기 세포, 전-원시 선 세포, 중내배엽 세포, 확정적 내배엽 세포, 앞창자 내배엽 또는 PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포, PDX1-양성 앞창자 내배엽 또는 PDX1-양성 췌장 내배엽 세포 또는 췌장 선조 세포, 내분비 선조/전구 세포, 및/또는 내분비 세포를 포함하는 특정 세포 집단을 수득하는데 사용된다. 그 후, 세포 집단에 후보 분화 인자가 제공된다. 후보 분화 인자를 제공하기 전이거나 또는 이와 거의 동일한 시점인 제1 시점에, 마커 발현이 결정된다. 대안적으로, 마커 발현이 후보 분화 인자를 제공한 후에 결정될 수 있다. 제1 시점 이후이고, 후보 분화 인자를 세포 집단에 제공하는 단계 이후인 제2 시점에, 동일한 마커의 발현이 다시 결정된다. 제1 시점의 마커의 발현을 제2 시점의 마커의 발현과 비교함으로써 후보 분화 인자가 췌장 전구 세포의 분화를 촉진할 수 있는지 여부가 결정된다. 제2 시점의 마커의 발현이 제1 시점의 마커의 발현과 비교하여 증가 또는 감소되면, 후보 분화 인자는 췌장 선조 세포의 분화를 촉진할 수 있다.
본원에 기재된 스크리닝 방법의 일부 실시양태는 인간 확정적 내배엽, PDX-1 음성 앞창자 내배엽, PDX-1 양성 앞창자 내배엽, PDX-1 양성 췌장 내배엽, 또는 췌장 선조 또는 내분비 선조/전구 세포를 포함하는 세포 집단 또는 세포 배양물을 이용한다. 예를 들어, 세포 집단은 PDX-1-양성 췌장 내배엽 또는 췌장 선조 세포의 실질적으로 정제된 집단일 수 있다. 예를 들어, 세포 집단은 인간 췌장 선조 세포의 강화 집단일 수 있고, 이때 세포 집단 내의 인간 세포의 적어도 약 50％ 내지 97％가 인간 췌장 선조 세포이며, 나머지는 내분비 선조/전구체 또는 내분비 세포 및 기타 세포 유형으로 구성된다. 췌장 선조 집단의 강화가 출원인의 미국 특허 출원 번호 12/107,020 (영문 명칭이 "METHOD FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS"이고, 2008년 4월 21일에 출원되었으며, 현재 미국 특허 번호 8,338,170임) 및 상응하는 상기 문헌 [Kelly et al. (2011)]에 상세하게 기재되어 있다.
본원에 기재된 스크리닝 방법의 실시양태에서, 세포 집단이 후보 (테스트) 분화 인자와 접촉되거나 또는 다른 방식으로 세포 집단에 후보 (테스트) 분화 인자가 제공된다. 후보 분화 인자는 임의의 상기 언급된 세포, 예를 들어, 인간 췌장 선조 세포의 분화를 촉진하는 잠재력이 있을 수 있는 임의의 분자를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 일부 실시양태에서, 후보 분화 인자는 하나 이상의 세포 유형에 대한 분화 인자인 것으로 공지된 분자를 포함한다. 대안적인 실시양태에서, 후보 분화 인자는 세포 분화를 촉진하는 것으로 공지되지 않은 분자를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 후보 분화 인자는 인간 췌장 선조 세포의 분화를 촉진하는 것으로 공지되지 않은 분자를 포함한다. 예를 들어 확정적 내배엽을 분화시키는 인자에 대한 스크리닝이 출원인의 미국 특허 출원 번호 12/093,590 (영문 명칭이 "MARKERS OF DEFINITIVE ENDODERM"이고, 2008년 7월 21일에 출원됨)에 상세하게 기재되어 있다.
제1 시점에 하나 이상의 마커의 발현을 결정하는 것에 더하여, 본원에 기재된 스크리닝 방법의 일부 실시양태는 제1 시점 이후이고, 후보 분화 인자를 세포 집단에 제공한 후인 제2 시점에 하나 이상의 마커의 발현을 결정하는 것을 구상한다. 이같은 실시양태에서, 동일한 마커의 발현이 제1 시점 및 제2 시점 양쪽 모두에 결정된다. 일부 실시양태에서, 다수의 마커의 발현이 제1 시점 및 제2 시점 양쪽 모두에 결정된다. 이같은 실시양태에서, 동일한 다수의 마커의 발현이 제1 시점 및 제2 시점 양쪽 모두에 결정된다. 일부 실시양태에서, 각각 제1 시점 이후이고, 각각 후보 분화 인자를 세포 집단에 제공한 후인 다수의 시점에 마커 발현이 결정된다. 특정 실시양태에서, Q-PCR에 의해 마커 발현이 결정된다. 다른 실시양태에서, 면역세포화학에 의해 마커 발현이 결정된다.
본원에 기재된 스크리닝 방법의 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 시점에 발현이 결정된 마커는 췌장 선조 세포가 췌장 섬 조직을 구성하는 최종 분화 세포의 전구체인 세포로 분화되는 것과 연관된 마커이다. 이같은 세포는 미성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 스크리닝 방법의 일부 실시양태에서, 세포 집단에 후보 분화 인자를 제공하는 것과 제2 시점에 마커 발현을 결정하는 것 사이에 충분한 시간이 허용된다. 세포 집단에 후보 분화 인자를 제공하는 것과 제2 시점에 마커 발현을 결정하는 것 사이의 충분한 시간은 적게는 약 1시간 내지 많게는 약 10일일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 마커의 발현이 세포 집단에 후보 분화 인자를 제공한 후에 여러 번 결정된다. 일부 실시양태에서, 충분한 시간은 적어도 적어도 약 1시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 5주, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주, 또는 적어도 약 8주이다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 제2 시점의 마커의 발현이 제1 시점의 이러한 마커의 발현과 비교하여 증가 또는 감소되었는지 여부가 추가로 결정된다. 하나 이상의 마커의 발현의 증가 또는 감소는 후보 분화 인자가 내분비 선조/전구 세포의 분화를 촉진할 수 있다는 것을 가리킨다. 유사하게, 다수의 마커의 발현이 결정된다면, 제2 시점의 다수의 마커의 발현이 제1 시점의 이러한 다수의 마커의 발현과 비교하여 증가 또는 감소되었는지 여부가 추가로 결정된다. 마커 발현의 증가 또는 감소는 제1 및 제2 시점의 세포 집단 내의 마커의 양, 수준 또는 활성을 측정하거나 또는 다른 방식으로 평가함으로써 결정될 수 있다. 이같은 결정은 다른 마커, 예를 들어 하우스키핑 유전자 발현에 대해 상대적일 수 있거나, 또는 절대적일 수 있다. 마커 발현이 제1 시점과 비교하여 제2 시점에 증가된 특정 실시양태에서, 증가량은 적어도 약 2배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배 또는 적어도 약 100배 초과이다. 일부 실시양태에서, 증가량은 2배 미만이다. 마커 발현이 제1 시점과 비교하여 제2 시점에 감소된 특정 실시양태에서, 감소량은 적어도 약 2배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배 또는 적어도 약 100배 초과이다. 일부 실시양태에서, 감소량은 2배 미만이다.
다능 또는 분화 세포 생산의 모니터링
만능 세포가 다능 세포로, 추가로 다능 세포 또는 분화 세포, 예컨대 췌장 선조 또는 호르몬 내분비 분비 세포로 프로세싱되는 것을 유전자 마커 및 표현형 마커를 포함하는 특정 세포에 특징적인 마커의 발현, 예컨대 섬 호르몬의 발현 및 내분비 세포에서 프로인슐린이 인슐린 및 C 펩티드로 프로세싱되는 것을 결정함으로써 모니터링할 수 있다. 일부 프로세스에서, 마커의 존재 또는 부재를 검출함으로써 특정 마커의 발현이 결정된다. 대안적으로, 세포 배양물 또는 세포 집단의 세포 내에 마커가 존재하는 수준을 측정함으로써 특정 마커의 발현이 결정될 수 있다. 예를 들어, 특정 프로세스에서, 미성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포에 특징적인 마커의 발현, 뿐만 아니라 만능 세포, 확정적 내배엽, 앞창자 내배엽, PDX1-양성 앞창자 내배엽, 내분비 선조/전구체, 배아외 내배엽, 중배엽, 외배엽, 성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포 및/또는 기타 세포 유형에 특징적인 마커의 유의한 발현의 결여가 결정된다.
확정적 내배엽 계통의 다른 덜 분화된 세포 유형의 생산을 모니터링하는 것과 관련하여 기재된 바와 같이, 정량적 또는 반-정량적 기술, 예컨대 블롯 트랜스퍼(blot transfer) 방법 및 면역세포화학이 마커 발현을 측정하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, Q-PCR 또는 나노스트링의 엔카운터와 같은 기술 또는 수백개 이상의 마커를 동시에 분석 및 검정할 수 있는 관련된 고처리량 멀티플렉스 기술의 사용을 통해 마커 발현이 정확하게 정량될 수 있다. 추가적으로, 폴리펩티드 수준에서, 췌장 섬 호르몬-발현 세포의 마커의 다수가 분비 단백질이라는 것이 이해될 것이다. 따라서, 세포외 마커 함량을 측정하기 위한 기술, 예컨대 ELISA가 이용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 면역조직화학이 상기 언급된 유전자에 의해 발현되는 단백질을 검출하는데 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 효과적으로, 그리고 정확하게 세포 유형을 특성화 및 확인하고, 대상 세포 유형 내의 이같은 마커의 양 및 상대적인 비율 양쪽 모두를 결정하기 위해 Q-PCR이 면역조직화학 기술 또는 유동 세포측정법과 함께 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, Q-PCR로 혼합형 세포 집단을 함유하는 세포 배양물에서의 RNA 발현 수준을 정량할 수 있다. 그러나, Q-PCR은 대상 마커 또는 단백질이 동일한 세포 상에서 공발현되는지 여부를 제공하거나 정량할 수 없다. 또 다른 실시양태에서, 세포 유형을 특성화 및 확인하기 위해 Q-PCR이 유동 세포측정법과 함께 사용된다. 따라서, 본원에 기재된 방법들, 예컨대 상기 기재된 것들의 조합을 사용함으로써, 내배엽 계통 유형 세포를 포함하는 다양한 세포 유형의 완전한 특성화 및 확인이 달성 및 입증될 수 있다.
예를 들어, 한 바람직한 실시양태에서, 췌장 선조 또는 췌장 내배엽 또는 PDX-1 양성 췌장 내배엽은 Q-PCR 및/또는 ICC에 의해 입증되는 바와 같이 적어도 PDX1, Nkx6.1, PTF1A, CPA 및/또는 cMYC를 발현하지만, PDX1-양성 발현 세포로서 확인되기 위하여, 이같은 세포는 ICC에 의해 입증된 바와 같이 PDX1 및 Nkx6.1를 적어도 공발현하고, SOX17 CXCR4, 또는 CER를 포함하는 다른 마커를 발현하지 않는다. 유사하게, 시험관내 또는 생체내에서의 성숙 호르몬 분비 췌장 세포의 정확한 확인을 위해, 예를 들어, 인슐린 분비 세포에서 ICC에 의해 C-펩티드 (성숙형이고 기능성인 β 세포에서의 프로인슐린의 정확한 프로세싱의 생성물) 및 인슐린이 공발현된다는 것이 입증된다.
관련 기술분야에 공지된 또 다른 방법이 마커 유전자 발현을 정량하는데 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 마커 유전자 생성물에 대해 특이적인 항체를 사용함으로써 마커 유전자 생성물의 발현을 검출할 수 있다 (예를 들어, 웨스턴 블롯, 유동 세포측정법 분석 등). 특정 프로세스에서, hES-유래 세포에 특징적인 마커 유전자의 발현, 뿐만 아니라 hES-유래 세포에 특징적인 마커 유전자의 유의한 발현의 결여. hES-유래 세포 유형을 특성화 및 확인하는 또 다른 방법이 상기 지시된 바와 같은 관련 출원에 기재되어 있다.
PDX1 -양성 췌장 내배엽의 생산 (단계 1 내지 4) 및 생체내에서의 인슐린 생산의 요약
특정 내배엽-계통 및 췌장 내배엽-계통 세포의 생산 방법이 본원에서 제공되고, 그밖에 관련 출원 예컨대 미국 특허 번호 7,534,608; 7,695,965; 및 7,993,920 (영문 명칭이 "METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES"임); 및 미국 특허 번호 8,129,182 (영문 명칭이 "ENDOCRINE PROGENITOR/PRECURSOR CELLS, PANCREATIC HORMONE-EXPRESSING CELLS AND METHODS OF PRODUCTION"임)에서 논의된다. 표 17 및 도 42, 43 및 44를 또한 참조한다.
간략하게, 만능 줄기 세포, 예를 들어, hES 및 iPS 세포에 대한 본원에서의 지향성 분화 방법은 원하는 최종 단계 세포 배양물 (PEC 또는 내분비 세포)에 따라 적어도 4개 또는 5개 또는 6개 또는 7개의 단계로 기재될 수 있다. 단계 1은 만능 줄기 세포로부터의 확정적 내배엽의 생산이고, 약 2일 내지 5일, 바람직하게는 2일 또는 3일이 걸린다. 만능 줄기 세포가 RPMI, TGFβ 슈퍼패밀리 구성원 성장 인자, 예컨대 액티빈 A, 액티빈 B, GDF-8 또는 GDF-11 (100 ng/mL), Wnt 패밀리 구성원 또는 Wnt 경로 활성화제, 예컨대 Wnt3a (25 ng/mL), 및 대안적으로는 성장 및/또는 생존 및/또는 증식 및/또는 세포-세포 부착을 강화하도록 rho-키나제 또는 ROCK 억제제, 예컨대 Y-27632 (10 μM)를 포함하는 배지에 현탁된다. 약 24시간 후, 배지가 또 다른 24시간 (제1일) 내지 48시간 (제2일) 동안 RPMI + 혈청, 예컨대 0.2％ FBS, 및 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원 성장 인자, 예컨대 액티빈 A, 액티빈 B, GDF-8 또는 GDF-11 (100 ng/mL), 및 대안적으로 rho-키나제 또는 ROCK 억제제를 포함하는 배지로 교환된다. 대안적으로, 액티빈/Wnt3a를 포함하는 배지에서의 약 24시간 후, 세포가 후속 24시간 동안 액티빈만 포함하는 배지 (즉, Wnt3a를 포함하지 않는 배지)에서 배양된다. 중요하게, 확정적 내배엽의 생산은 혈청 함량이 낮고, 이에 의해 인슐린 또는 인슐린-유사 성장 인자 함량이 낮은 세포 배양 조건을 필요로 한다. 문헌 [McLean et al. (2007) Stem Cells 25: 29-38] 참조. 문헌 [McLean et al.]은 hES 세포를 단계 1에서 0.2 ㎍/mL만큼 적은 농도의 인슐린과 접촉시키는 것이 확정적 내배엽의 생산에 해로울 수 있다는 것을 또한 나타낸다. 예를 들어, 적어도 문헌 [Agarwal et al., Efficient Differentiation of Functional Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells, Stem Cells (2008) 26:1117-1127]; [Borowiak et al., Small Molecules Efficiently Direct Endodermal Differentiation of Mouse and Human Embryonic Stem Cells, (2009) Cell Stem Cell 4:348-358]; 및 [Brunner et al., Distinct DNA methylation patterns characterize differentiated human embryonic stem cells and developing human fetal liver, (2009) Genome Res. 19:1044-1056]에서, 통상의 기술자가 실질적으로 본원 및 문헌 [D'Amour et al. (2005)]에 기재된 바와 같은 만능 세포의 확정적 내배엽으로의 단계 1 분화를 변형시켰다. 다른 내배엽-계통 세포를 유도하기 위해 확정적 내배엽의 정확한 분화, 특정, 특성화 및 확인이 필요하다. 이러한 단계의 확정적 내배엽 세포는 SOX17 및 HNF3β (FOXA2)를 공발현하고, 적어도 HNF4알파, HNF6, PDX1, SOX6, PROX1, PTF1A, CPA, cMYC, NKX6.1, NGN3, PAX3, ARX, NKX2.2, INS, GSC, GHRL, SST, 또는 PP를 감지할 수 있게 발현하지 않는다. 확정적 내배엽에서의 HNF4알파 발현의 부재가 적어도 문헌 [Duncan et al. (1994), Expression of transcription factor HNF-4 in the extraembryonic endoderm, gut, and nephrogenic tissue of the developing mouse embryo: HNF-4 is a marker for primary endoderm in the implanting blastocyst", Proc. Natl. Acad. Sci, 91:7598-7602] 및 [Si-Tayeb et al. (2010), Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-Like cells from Induced Pluripotent Stem Cells", Hepatology 51:297-305]에서 지지되고 상세하게 기재된다.
단계 2는 단계 1로부터의 확정적 내배엽 세포 배양물을 이용하고, 현탁 배양물을 혈청 수준이 낮은, 예컨대 0.2％ FBS가 있는 RPMI 내의 ITS의 1:1000 희석물, 25 ng KGF (또는 FGF7), 및 대안적으로 ROCK 억제제와 함께 24시간 (제2일 내지 제3일) 동안 인큐베이션함으로써 앞창자 내배엽 또는 PDX1-음성 앞창자 내배엽을 생산한다. 24시간 (제3일 내지 제4일) 후, 또 다른 24시간 (제4일 내지 제5일) 내지 48시간 (제6일) 동안 세포의 성장, 생존 및 증식을 강화하기 위해 배지를 TGFβ 억제제가 없지만 여전히 ROCK 억제제가 있는 동일한 배지로 교환한다. 앞창자 내배엽의 정확한 특정을 위한 결정적인 단계는 TGFβ 패밀리 성장 인자의 제거이다. 따라서, TGFβ 억제제, 예컨대 2.5 μM의 4번 TGFβ 억제제 또는 5 μM의 SB431542 (TGFβ I형 수용체인 액티빈 수용체-유사 키나제 (ALK)의 특이적 억제제)가 단계 2 세포 배양물에 첨가될 수 있다. 단계 2로부터 생산된 앞창자 내배엽 또는 PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포는 SOX17, HNF1β 및 HNF4알파를 공발현하고, 적어도 SOX17 및 HNF3β (FOXA2), 또는 HNF6, PDX1, SOX6, PROX1, PTF1A, CPA, cMYC, NKX6.1, NGN3, PAX3, ARX, NKX2.2, INS, GSC, GHRL, SST, 또는 PP (확정적 내배엽, PDX1-양성 췌장 내배엽 또는 췌장 선조 세포 또는 내분비 선조/전구체, 뿐만 아니라 전형적으로 다중호르몬성인 유형의 세포의 홀마크임)를 인지할 수 있게 공발현하지 않는다.
PEC 생산을 위한 단계 3 (제5일-제8일)은 단계 2로부터의 앞창자 내배엽 세포 배양물을 이용하고, 약 24시간 (제7일) 내지 48시간 (제8일) 동안의 DMEM 또는 RPMI 내의 1％ B27, 0.25 μM KAAD 시클로파민, 레티노이드, 예컨대 0.2 μM 레틴산 (RA) 또는 레틴산 유사체 예컨대 3 nM의 TTNPB (또는 KAAD 시클로파민 및 TTNPB의 조합물인 CTT3), 및 50 ng/mL의 노긴에 의해 PDX1-양성 앞창자 내배엽 세포를 생산한다. 구체적으로, 출원인은 대략적으로 2003년 이래로 DMEM-고 글루코스를 사용하였고, 이러한 시점 이후의 모든 특허 및 비-특허 개시물은 "DMEM-고 글루코스" 등을 언급하지 않았더라도 DMEM-고 글루코스를 사용하였다. 이는, 부분적으로, 깁코(Gibco)와 같은 제조사가 이들의 DMEM, 예를 들어 DMEM (카탈로그 번호 11960) 및 녹아웃(Knockout) DMEM (카탈로그 번호 10829)을 이와 같이 명명하지 않았기 때문이다. 본원의 출원일 이후로, 깁코가 더 많은 DMEM 제품을 제공하지만 고 글루코스를 함유하는 이의 DMEM 제품 중 일부, 예를 들어 녹아웃 DMEM (카탈로그 번호 10829-018)에 여전히 "고 글루코스"를 붙이지 않다는 것이 주목할 만하다. 따라서, DMEM이 기재된 각각의 경우에 이는 고 글루코스 DMEM을 의미하는 것으로 가정될 수 있고, 이는 이러한 분야의 연구 및 개발을 행하는 다른 사람들에게 명백하였다. 외인성 고-글루코스의 사용을 기재하는 더 많은 상세사항이 실시예 21에서 기재된다. 이번에도, ROCK 억제제 또는 rho-키나제 억제제 예컨대 Y-27632가 성장, 생존, 증식을 강화하고 세포-세포 부착을 촉진하도록 사용될 수 있다. 단계 3으로부터 생산된 PDX1-양성 앞창자 세포는 PDX1 및 HNF6, 뿐만 아니라 SOX9 및 PROX를 공발현하고, 단계 1 및 2에서 상기 기재된 바와 같은 확정적 내배엽 또는 앞창자 내배엽 (PDX1-음성 앞창자 내배엽) 세포 또는 PDX1-양성 앞창자 내배엽 세포를 가리키는 마커를 인지가능하게 공발현하지 않는다.
상기 단계 3 방법은 PEC 생산을 위한 4개의 단계 중 하나이다. 하기 실시예 9-24에서 상세히 기재된 바와 같은 내분비 선조/전구체 및 내분비 세포의 생산을 위해, 노긴, KAAD-시클로파민 및 레티노이드에 더하여, 양호한 세포 응집체 질량을 유지하면서 NGN3 발현을 억제하도록 액티빈, Wnt 및 헤레귤린이 단독으로 및/또는 조합되어 사용된다. 실시예 8, 9 및 10 참조.
단계 4 (제8일-제14일) PEC 생산은 단계 3으로부터의 배지를 이용하고, 이를 DMEM 내의 1％ vol/vol B27 보충물, + 50 ng/mL KGF 및 50 ng/mL의 EGF 및 때때로 또한 50 ng/mL 노긴 및 ROCK 억제제를 함유하는 배지로 교환하며, 추가로 액티빈을 단독으로 또는 헤레귤린과 조합하여 포함한다. 이러한 새로운 방법으로 적어도 PDX1 및 NKX6.1, 뿐만 아니라 PTF1A를 공발현하는 췌장 선조 세포가 초래된다. 이러한 세포는 단계 1, 2 및 3에서 상기 기재된 바와 같은 확정적 내배엽 또는 앞창자 내배엽 (PDX1-음성 앞창자 내배엽) 세포를 가리키는 마커를 인지가능하게 발현하지 않는다. 도 44 참조.
대안적으로, 단계 4로부터의 세포가 약 1일 내지 6일 (바람직하게는 약 2일, 즉 제13일-제15일) 동안 DMEM + 1％ vol/vol B27 보충물을 함유하는 배지에서 내분비 선조/전구체 또는 선조 유형 세포 및/또는 단일 및 다중-호르몬성 췌장 내분비 유형 세포가 생산되도록 단계 5에서 추가로 분화될 수 있다. 단계 5로부터 생산된 내분비 선조/전구체는 적어도 CHGA, NGN3 및 Nkx2.2를 공발현하고, PEC 생산을 위한 단계 1, 2 3 및 4에서 상기 기재된 바와 같은 확정적 내배엽 또는 앞창자 내배엽 (PDX1-음성 앞창자 내배엽)을 가리키는 마커를 인지가능하게 발현하지 않는다. 도 44 참조.
PEC 생산을 위해, 단계 4로부터 생산된 PDX1-양성 췌장 내배엽이 로딩되어 전체적으로 마크로캡슐화 장치 내에 함유되고, 환자에게 이식되며, PDX1-양성 췌장 내배엽 세포가 생체내에서 췌장 호르몬 분비 세포, 또는 췌장 섬, 예를 들어, 인슐린 분비 베타 세포로 성숙된다 ("생체내 기능"으로 또한 지칭됨). PDX1-양성 췌장 내배엽 세포의 캡슐화 및 생체내에서의 인슐린 생산이 미국 출원 번호 12/618,659 ('659 출원) (영문 명칭이 "ENCAPSULATION OF PANCREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS"이고, 2009년 11월 13일 출원됨)에 상세하게 기재되어 있다. '659 출원은 특허 가출원 번호 61/114,857 (영문 명칭이 "ENCAPSULATION OF PANCREATIC PROGENITORS DERIVED FROM HES CELLS"이고, 2008년 11월 14일 출원됨); 및 미국 특허 가출원 번호 61/121,084 (영문 명칭이 "ENCAPSULATION OF PANCREATIC ENDODERM CELLS"이고, 2008년 12월 9일 출원됨); 및 현재의 미국 특허 8,278,106 및 8,424,928을 우선권으로 청구한다. 본원에 기재된 방법, 조성물 및 장치는 현재 바람직한 실시양태를 대표하고, 예시적이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 취지 내에서 포함되고 개시내용의 범주에 의해 규정되는 그 안에서의 변화 및 기타 용도가 통상의 기술자에게 일어날 것이다. 따라서, 다양한 치환 및 변형이 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 본원에 개시된 발명에 이루어질 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
예를 들어, 성장 인자 또는 신호전달 단백질의 TGFβ 슈퍼패밀리의 구성원인 액티빈 A가 만능 세포, 예를 들어, hES 세포 및 iPS 세포로부터 확정적 내배엽을 생산하는데 사용되지만, 국제 출원 PCT/US2008/065686 (영문 명칭이 "GROWTH FACTORS FOR PRODUCTION OF DEFINITIVE ENDODERM"이고, 2008년 6월 3일 출원됨)에 기재된 것과 같이 다른 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원, 예를 들어 GDF-8 및 GDF-11가 확정적 내배엽을 생산하는데 사용될 수 있다.
또 다른 정황에서, 액티빈 단독 또는 Wnt 및 헤레귤린과 조합된 액티빈이 높은 수준 및 낮은 수준에서 NGN3의 발현을 억제 및 저해할 수 있다; 낮은 수준에서 단독으로 또는 헤레귤린과 조합되어, 또는 대안적으로 높은 수준에서 WNT 및 헤레귤린과 조합되어, 세포 질량, 따라서 수율이 유지될 수 있다. 실시예 8, 9 및 10 참조.
PEC 생산을 위해, 레틴산 (RA)이 단계 2에서의 PDX1-음성 앞창자 내배엽 세포를 단계 3에서의 PDX1-양성 앞창자 세포로 분화시키는데 사용된다. 그러나, 다른 레티노이드 또는 레틴산 유사체 예컨대 4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]벤조산 (또는 TTNPB) 및 비슷한 유사체 (예를 들어, 4-HBTTNPB)가 사용될 수 있다. 내분비 및 내분비 선조/전구 세포 생산을 위해, 레틴산 또는 임의의 이의 유사체가 또한 호르몬 유전자 발현을 유도하도록 단계 6 및/또는 7 동안 첨가될 수 있다. 실시예 13 및 16 참조.
노긴은 예를 들어 TGFβ 슈퍼패밀리 신호전달 단백질의 구성원, 예컨대 골 형태형성 단백질-4 (BMP4)를 불활성화시키는 단백질이다. 그러나, 다른 BMP4 억제제 예컨대 코딘 및 트위스티드 개스트룰레이션(Twisted Gastrulation) (Tsg) 또는 항-BMP 중화 항체가 BMP가 이의 세포 표면 수용체에 결합하는 것을 방지함으로써 BMP 신호전달을 효과적으로 억제할 수 있다. 대안적으로, 인간 노긴에 대한 유전자가 클로닝 및 시퀀싱되었다. 미국 특허 번호 6,075,007 참조. 노긴 서열의 분석은 쿠니츠(Kunitz)-유형 프로테아제 억제제에 대한 상동성이 있는 카르복시 말단 영역을 나타내고, 이는 잠재적으로 다른 쿠니츠-유형 프로테아제 억제제가 BMP 억제에 대한 효과가 유사할 수 있다는 것을 가리킨다. 실시예 15는 비-내분비 (CHGA-) 하위집단의 생산을 증가시키기 위한 노긴의 용도를 기재한다.
마지막으로, 본원 및 '659 출원; 미국 디자인 출원 29/447,944; 29/408,366; 29/408,368; 29/423,365; 및 61/774,443 (영문 명칭이 "SEMIPERMEABLE MACRO IMPLANTABLE CELLULAR ENCAPSULATION DEVICES"이고, 2013년 3월 7일 출원됨)에 기재된 마크로캡슐화 장치 역시 예시적일 뿐이고, 본 발명의 범주에 대한 제한으로 의도되지 않는다. 특히, 장치 디자인 예컨대 장치 크기, 장치 내의 챔버 또는 하위구획의 복수성, 또는 포트의 복수성, 또는 심지어 장치의 로딩 및 추출을 위한 메커니즘에 대한 변화가 모두 본 발명의 취지 내에 포함된다. 따라서, 본원에 기재된 분화 방법에 대해서만이 아니라 또한 캡슐화 장치에 대한 다양한 치환 및 변형이 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 본원에 개시된 발명에 이루어질 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 실시예 10, 12 및 18 참조.
만능 세포를 확정적 내배엽 세포로 분화시키는 방법 중 일부와 관련하여, 만능 세포의 적어도 일부분이 확정적 내배엽 세포 및 췌장 계통 세포로 분화되는 것을 촉진하는데 충분한 농도로 성장 인자가 배양물 내에 존재하도록 상기 언급된 성장 인자들이 세포에 제공된다. 일부 방법에서, 상기 언급된 성장 인자들은 적어도 약 5 ng/mL, 적어도 약 10 ng/mL, 적어도 약 25 ng/mL, 적어도 약 50 ng/mL, 적어도 약 75 ng/mL, 적어도 약 100 ng/mL, 적어도 약 200 ng/mL, 적어도 약 300 ng/mL, 적어도 약 400 ng/mL, 적어도 약 500 ng/mL, 적어도 약 1000 ng/mL, 적어도 약 2000 ng/mL, 적어도 약 3000 ng/mL, 적어도 약 4000 ng/mL, 적어도 약 5000 ng/mL 또는 약 5000 ng/mL 초과의 농도로 세포 배양물 내에 존재한다. 또 다른 작용제 또는 성장 인자들이 적어도 0.1 mM 또는 10 mM 또는 이를 초과하는 농도로 세포 배양물 내에 존재한다.
특정 방법에서, 만능 줄기 세포 분화제 및/또는 성장 인자가 이의 첨가 후에 세포 배양물로부터 제거된다. 예를 들어, 성장 인자가 이를 첨가하고 나서 약 1일 후, 약 2일 후, 약 3일 후, 약 4일 후, 약 5일 후, 약 6일 후, 약 7일 후, 약 8일 후, 약 9일 후 또는 약 10일 후에 제거될 수 있다. 바람직한 방법에서, 성장 인자가 이를 첨가하고 나서 약 4일 후에 제거된다. 작용제 및/또는 성장 인자의 제거는 작용제 및/또는 성장 인자의 부재 하에 배지를 교환함으로써 또는 이러한 작용제 및/또는 성장 인자의 기능을 억제하는 또 다른 작용제를 사용함으로써 달성될 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 단계 3 세포 배양물은 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)의 억압, 억제, 저해 등이 가능한 작용제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이같은 작용제는 분화를 촉진하고/하거나 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)을 가리키는 마커의 발현을 유도하고, 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)의 마커 발현을 억압하거나 최소화하는데 충분한 양의 액티빈, 헤레귤린 및 WNT 및 이러한 3가지의 조합물을 또한 포함한다. 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)를 가리키는 마커는 NGN3, NKX2.2 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 단계 4 세포 배양물은 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)의 억압, 억제, 저해 등이 가능한 작용제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이같은 작용제는 분화를 촉진하고/하거나 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)을 가리키는 마커의 발현을 유도하고, 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)의 마커 발현을 억압하거나 최소화하는데 충분한 양의 액티빈 및 헤레귤린 및 이러한 2가지의 조합물을 또한 포함한다. 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)를 가리키는 마커는 NGN3, NKX2.2 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 단계 3 및 4 동안 적어도 NGN3을 억제하는 수단이 하기 실시예 8-21에서 상세하게 기재된다.
한 실시양태에서, 단계 4 세포 배양물이 적어도 노긴, KGF, EGF, 및 노치(Notch) 신호전달 또는 경로 억제제로 단계 5에서 추가로 분화된다. 내분비 분화를 가리키는 마커는 NGN3, NKX2.2 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 생체내 발생 연구에서 관찰되는 것을 시험관내에서 모사하거나 효과적으로 모방하는 작용제가 단계 1-7에서 사용된다. 예를 들어, 본원에서의 표 17에 따른 단계 3 및 4는 내분비 분화의 지연, 억압, 억제 및/또는 저해 또는 NGN3 및 NKX2.2를 포함하나 이에 제한되지는 않는 내분비 분화를 가리키는 마커의 지연, 억압, 억제 및/또는 저해가 가능한 작용제를 사용한다. 단계 5, 6, 및/또는 7 동안, 예를 들어, 노치 경로 억제제 예컨대 감마 세크레타제 억제제를 사용함으로써, 세포 배양물이 내분비 분화의 유도, 증가 및/또는 촉진이 가능한 작용제로 처리된다. 요약하면, 단계 3 및 4 세포 배양 조건은 내분비 표현형을 억제하는 반면, 단계 5, 6, 및/또는 7로부터의 세포 배양 조건은 인슐린 (INS), 글루카곤 (GCG), 소마토스타틴 (SST), 췌장 폴리펩티드 (PP), 그렐린 (GHRL), 용질 운반체 패밀리 30 구성원 8 (SLC30A8), 글루코스-6-포스파타제 2 (G6PC2), 프로호르몬 컨버타제 1 (PCSK1) 및 글루코스 키나제 (GCK)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 내분비 표현형을 점진적으로 유도한다.
한 실시양태에서, 노치 신호전달 억제제, 예를 들어, 감마 세크레타제 억제제 예컨대 R04929097 (단독으로 또는 레티노이드 예컨대 레틴산과 함께 사용됨)의 존재 하에 PDX1-양성 췌장 내배엽 세포의 인큐베이션을 계속함으로써 PDX1-양성 췌장 내배엽 세포가 내분비 및 내분비 선조/전구 세포로 분화된다. 노치 신호전달 억제제의 존재는 단계 5 동안 NGN3의 발현을 유도한다. 다른 실시양태에서, 감마 세크레타제 억제제가 분화 프로세스를 시작할 때, 예를 들어, 만능 단계에 제공되고, 췌장 섬 호르몬-발현 세포로의 분화 동안 내내 세포 배양물 내에 잔존한다. 또 다른 실시양태에서, 감마 세크레타제 억제제가 분화 시작 이후에, 그러나 PDX1-양성 앞창자 내배엽 단계로의 분화 이전에 첨가된다. 바람직한 실시양태에서, 감마 세크레타제 억제제가 확정적 내배엽의 PDX1-양성 내배엽으로의 전환을 촉진하는 분화 인자를 제공하는 것과 거의 동시에 세포 배양물 또는 세포 집단에 제공된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 세포 배양물 또는 세포 집단 내의 세포의 실질적인 부분이 PDX1-양성 앞창자 내배엽 세포로 분화된 후에 감마 세크레타제 억제제가 세포 배양물 또는 세포 집단에 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 단계 5로부터의 세포 배양물이 단계 6 및 7에 추가로 분화된다. 이러한 단계들 동안, 생체내에서 발생적으로 더욱 진행되고/되거나 성숙된 내분비 세포로 분화되도록 내분비 선조/전구체 또는 선조 세포를 정확하게 특정할 수 있는 작용제가 사용된다. 이같은 작용제는 레티노이드 또는 레틴산, BMP, 니코틴아미드, IGF, 헤지호그 단백질 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, TTNPB (4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]벤조산 또는 아로티노이드 산)은 핵 전사 인자인 레틴산 수용체 (RAR) α, β, 및 γ에 대한 친화력이 있는 선택적으로 고도로 강력한 레틴산 유사체이다. TTNPB 및 기타 레틴산 또는 레틴산 유사체는 레틴산 반응 요소를 보유하는 유전자의 리간드-활성화 전사를 일으킨다. 따라서, 레틴산 반응 요소를 활성화시킬 수 있거나 또는 임의의 RAR에 결합할 수 있는 기타 작용제 또는 리간드가 잠재적으로 유용하고, 내분비 세포 분화를 촉진하기 위해 본 발명에 대해 수정가능하다.
또 다른 실시양태에서, 단계 5 또는 단계 6 또는 단계 7로부터의 세포 배양물이 세포 부착을 개선하도록 rho-키나제 억제제와 함께 매트리겔로 또는 매트리겔 단독으로 추가로 처리될 수 있다. 대안적으로, rho-키나제 억제제가 세포-생존, 세포 질량 및 수율을 촉진하는데 충분한 농도로 단계 5, 6, 또는 7 중 임의의 단계에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 원치 않는 세포 유형을 제거하거나 고갈시키기 위해 단계 6 및 7 동안 또는 단계 6과 단계 7 사이에 세포 배양물이 해리 및 재회합될 수 있다. 실시예 14 참조.
또 다른 실시양태에서, 단계 1-7 중 임의의 단계가 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 이를 초과하는 일수만큼 연장될 수 있거나, 또는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 이를 초과하는 일수만큼 단축될 수 있다. 예를 들어, 한 바람직한 실시양태에서, 표 17에 따르면, 단계 6은 약 6일에 걸쳐 발생하고, 단계 7은 약 9일에 걸쳐 발생한다. 그러나, 양쪽 단계 모두 내분비 선조/전구체의 생산을 수용하기 위해 단축될 수 있고, 예를 들어, 발생적으로 더욱 진행된 내분비 세포를 생산하도록 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일, 36일, 37일, 38일, 39일, 40일 또는 이를 초과하는 일수로 길어지고 연장될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 발생적으로 더욱 진행된 PEC 또는 췌장 내분비 선조/전구체 또는 췌장 내분비 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 본 발명의 한 측면에서, PDX1 및 NKX6.1가 공동-양성인 단일 췌장 호르몬 발현 내분비 세포, 예를 들어 INS, PDX1 및 NKX6.1을 공발현하는 미성숙 베타 세포가 제공된다. 또 다른 측면에서, 발생적으로 진행된 세포는 적어도 PDX 및 NKX6.1를 발현하는 비-내분비 췌장 선조 세포로 주로 이루어지지만 적어도 CHGA+, NGN3 및/또는 NKX2.2를 발현하는 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)로는 이루어지지 않거나 또는 최소한으로 이루어지는 PEC 배양물일 수 있다. 이러한 PEC 배양물은 췌장 분화의 발생 연구에서 생체내에서 나타난 것과 더욱 유사한 것으로 간주되기 때문에 발생적으로 진행된 것이다. 문헌 [Jorgensen et al. (2007), An Illustrated Review of Early Pancreas Development in the Mouse, Endocrine Reviews 28(6):685-705] 및 [Rukstalis and Habener (2009), Neurogenin3: A master regulator of pancreatic islet differntiation and regeneration, Islets 1(3): 177-184] 참조. 발생적으로 진행된 세포 또는 세포 배양물의 또 다른 예는 재응집된 세포 배양물이 더욱 균질한 세포 집단으로 이루어지도록 해리 및 재응집 또는 재회합된 것이다. 본 발명의 한 측면에서의 이러한 더욱 균질한 세포 집단은 초기 단계 세포 유형, 예를 들어 PDX1 및 NKX6.1에 대해 공동-양성인 단일 호르몬 발현 세포로 주로 구성되지만, 단계 3 및 4로부터의 세포 또는 하위집단 또는 비-내분비 다능 췌장 선조 (CHGA-) 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 PEC 또는 PEC 하위집단을 포함하지 않는 췌장 내분비 선조/전구체 또는 내분비 세포, 또는 나머지/삼중 음성 세포 (CHGA-/PDX1-/NKX6.1-) 등, 또는 다중 호르몬 발현 세포 (즉 임의의 한 세포 유형에서 1가지를 초과하는 호르몬을 발현하는 세포)를 포함하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 바람직하게는 본원에서 제공되는 세포 배양물은 발생 생물학 분야에서의 구체적이고 특정한 의미를 지니도록 정확하게 특정된다. 발생생물학의 정황에서, 이는 세포가 이에 의해 독특한 운명을 수득하거나 또는 특정되거나 정확하게 특정되는 메커니즘이다. 시험관내에서의 세포 배양물 분화는 생체내 발생 연구에 전형적인 시기적 구성 및 신호가 없기 때문에, 세포 마커 (표면 또는 내부 마커 예컨대 전사 인자), 특히 특정 세포 유형을 가리키는 서명 세포 마커 또는 현저한 세포 마커를 사용하고 이에 의존하는 것이 필수적이다. 따라서, 정확하게 특정된 세포, 세포 배양물, 하위집단 및 집단에 대한 언급은 이러한 세포들이 독특한 운명이 있고 이러한 운명들이 마커 발현, 이들이 발현하는 마커, 그리고 또한 중요하게 이들이 발현하지 않는 마커의 프로파일을 기초로 하여 더욱 확실하고 결정된다는 것을 의미한다. 시험관내의 세포 배양물의 정확한 특정은 유사한 세포의 생체내 발생 연구에 의존적이고, 따라서 한 바람직한 실시양태에서, 생체내 발생 연구가 시험관내 분화 및 정확하게 특정된 세포의 특성화에 대한 지침이다.
본원에 기재된 발명의 일부 실시양태에서, 엑센딘 4가 분화 중인 세포 배양물 또는 세포 집단에 감마 세크레타제 억제제와 거의 동일한 시간에 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 약 0.1 ng/mL 내지 1000 ng/mL의 농도로 세포 배양물 또는 세포 집단에 존재하도록 엑센딘 4가 제공된다.
분화 조건에 따라 내분비 선조/전구 세포에서 광범위한 상이한 수준에 걸쳐 NGN3, NKX2.2 및/또는 PAX4 마커 발현이 유도되는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본원에 기재된 일부 실시양태에서, 내분비 선조/전구 세포 또는 세포 집단에서의 NGN3, NKX2.2 및/또는 PAX4 마커의 발현은 비-내분비 선조/전구 세포 또는 세포 집단, 예를 들어 만능 줄기 세포, 확정적 내배엽 세포, PDX1-양성 앞창자 내배엽 세포, 미성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포, 성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포, 배아외 내배엽 세포, 중배엽 세포 및/또는 외배엽 세포에서의 NGN3, NKX2.2 및/또는 PAX4 마커의 발현보다 적어도 약 2배 내지 적어도 약 10,000배 더 높다. 다른 실시양태에서, 내분비 선조/전구 세포 또는 세포 집단에서의 NGN3, NKX2.2 및/또는 PAX4 마커의 발현은 비-내분비 선조/전구 세포 또는 세포 집단, 예를 들어 만능 줄기 세포, 확정적 내배엽 세포, PDX1-양성 앞창자 내배엽 세포, 미성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포, 성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포, 배아외 내배엽 세포, 중배엽 세포 및/또는 외배엽 세포에서의 NGN3, NKX2.2 및/또는 PAX4 마커의 발현보다 적어도 약 4배, 적어도 약 6배 내지 10,000배 더 높다. 일부 실시양태에서, 내분비 선조/전구 세포 또는 세포 집단에서의 NGN3, NKX2.2 및/또는 PAX4 마커의 발현은 비-내분비 선조/전구 세포 또는 세포 집단, 예를 들어 만능 세포 예컨대 iPS 세포 및 hES 세포, 확정적 내배엽 세포, PDX1-양성 앞창자 내배엽 세포, 미성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포, 성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포, 배아외 내배엽 세포, 중배엽 세포 및/또는 외배엽 세포에서의 NGN3, NKX2.2 및/또는 PAX4 마커의 발현보다 무한대로 더 높다.
본 발명의 추가적인 실시양태는 인간 내분비 선조/전구 세포를 포함하는 인간 세포를 포함하고, 이때 인간 세포의 적어도 약 2％에서 NGN3 마커의 발현이 AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, 및/또는 PAX6 마커의 발현보다 더 큰 조성물, 예컨대 세포 배양물 또는 세포 집단에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 인간 세포의 적어도 약 5％ 내지 98％에서 NGN3 마커의 발현이 AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, 및/또는 PAX6 마커의 발현보다 더 크다. 일부 실시양태에서, 세포 배양물 또는 집단 내의 NGN3의 발현이 AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, 및/또는 PAX6 마커의 발현보다 더 큰 인간 세포의 백분율은 피더 세포와 관계 없이 계산된다.
본 발명의 일부 실시양태는 인간 내분비 선조/전구 세포를 포함하고, 이때 인간 세포의 적어도 약 2％ 내지 적어도 약 98％ 초과에서 NKX2.2 및/또는 PAX4의 발현이 AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, 및/또는 PAX6 마커의 발현보다 더 큰 조성물, 예컨대 세포 배양물 또는 세포 집단에 관한 것이라는 것이 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 인간 세포의 적어도 약 5％ 내지 인간 세포의 98％에서 NKX2.2 및/또는 PAX4의 발현이 AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, 및/또는 PAX6 마커의 발현보다 더 크다. 일부 실시양태에서, 세포 배양물 또는 집단 내의 NKX2.2 및/또는 PAX4의 발현이 AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, 및/또는 PAX6 마커의 발현보다 더 큰 인간 세포의 백분율은 피더 세포와 관계 없이 계산된다.
본원에 기재된 방법을 사용하여, 다른 세포 유형이 실질적으로 없는 내분비 선조/전구 세포를 포함하는 조성물이 생산될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법으로 생산된 내분비 선조/전구체 세포 집단 또는 세포 배양물은 AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 및/또는 NFM 마커를 유의하게 발현하는 세포가 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법으로 생산된 세포 배양물의 내분비 선조/전구체 세포 집단은 AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL, 및/또는 PAX6 마커를 유의하게 발현하는 세포가 실질적으로 없다.
본원에 개시된 미성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포의 생산을 위한 또 다른 방법에서, 내분비 선조/전구 세포의 적어도 일부분이 미성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포로 분화되는 것을 촉진하는데 충분한 농도로 세포 배양물 또는 세포 집단 내에 존재하도록 HGF가 세포에 제공된다. 일부 실시양태에서, HGF는 적어도 약 1 ng/mL, 적어도 약 5 ng/mL 내지 1000 ng/mL의 농도로 세포 배양물 또는 세포 집단 내에 존재한다.
본원에 개시된 미성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포의 생산을 위한 또 다른 방법에서, 내분비 선조/전구 세포의 적어도 일부분이 미성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포로 분화되는 것을 촉진하는데 충분한 농도로 세포 배양물 또는 세포 집단 내에 존재하도록 IGF1이 세포에 제공된다. 일부 실시양태에서, IGF1는 적어도 약 1 ng/mL 내지 1000 ng/mL의 농도로 세포 배양물 또는 세포 집단 내에 존재한다.
본원에 기재된 바와 같은 미성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포를 생산하는 방법의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 이전에 제공된 분화 인자가 세포 배양물로부터 제거된 후에 니코틴아미드, 엑센딘 4, HGF 및 IGF1 중 하나 이상이 제공된다. 다른 실시양태에서, 이전에 제공되었거나 니코틴아미드, 엑센딘 4, HGF 및 IGF1 중 하나 이상과 거의 동일한 시간에 제공된 하나 이상의 분화 인자를 포함하는 세포 배양물 또는 세포 집단에 니코틴아미드, 엑센딘 4, HGF 및 IGF1 중 하나 이상이 제공된다. 바람직한 실시양태에서, 이전에 제공되었거나 니코틴아미드, 엑센딘 4, HGF 및 IGF1 중 하나 이상과 거의 동일한 시간에 제공된 분화 인자는 DAPT, FGF-10, KAAD-시클로파민, 액티빈 A, 액티빈 B, BMP4 및/또는 RA를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 추가적인 실시양태는 인간 미성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포를 포함하는 인간 세포를 포함하고, 이때 인간 세포의 적어도 약 2％에서 MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, PAX6, NEUROD, PDX1, HB9, GHRL, IAPP, INS GCG, SST, PP, 및/또는 C-펩티드 마커의 발현이 NGN3, MAFA, MOX1, CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 및/또는 NFM 마커의 발현보다 더 큰 조성물, 예컨대 세포 배양물 또는 세포 집단에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 인간 세포의 적어도 약 5％, 인간 세포의 적어도 약 10％ 내지 인간 세포의 95％에서 또는 인간 세포의 적어도 약 98％에서 MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, PAX6, NEUROD, PDX1, HB9, GHRL, IAPP INS GCG, SST, PP, 및/또는 C-펩티드 마커의 발현이 NGN3, MAFA, MOX1, CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 및/또는 NFM 마커의 발현보다 더 크다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 미성숙 췌장 섬 호르몬-발현 세포를 포함하는 세포 배양물 및/또는 세포 집단은 그렐린, 인슐린, 소마토스타틴 및/또는 글루카곤으로부터 선택된 하나 이상의 분비형 호르몬을 포함하는 배지를 또한 포함한다. 다른 실시양태에서, 배지는 C-펩티드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 배지 내의 하나 이상의 분비형 호르몬 또는 C-펩티드의 농도는 세포 DNA 1 ㎍ 당 적어도 약 1 pmol의 그렐린, 인슐린, 소마토스타틴, 글루카곤 또는 C-펩티드 내지 세포 DNA 1 ㎍ 당 적어도 약 1000 피코몰 (pmol)의 그렐린, 인슐린, 소마토스타틴, 글루카곤 또는 C-펩티드 범위이다.
생체내에서 인슐린을 생산하는 방법
일부 실시양태에서, 상기 기재된 시험관내에서 유래된 췌장 선조 세포 또는 PDX-1-양성 췌장 내배엽 유형 세포 또는 이의 등가물이 포유동물 대상체 내로 이식된다. 이러한 방법들이 국제 출원 PCT/US2007/015536 (영문 명칭이 "METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES"임), 및 상기 문헌 [Kroon et al. (2008)]에 상세하게 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 포유동물 대상체는 인간 대상체이다. 특히 바람직한 대상체는 생리학적으로 높은 혈액 글루코스 농도에 반응하여 충분한 수준의 인슐린을 생산하는 대상체의 능력을 제한하는 병태가 있는 것으로 확인된 대상체이다. 임의의 특정 포유동물 종에 대한 생리학적으로 높은 혈액 글루코스 수준을 구성하는 광범위한 혈액 글루코스 수준이 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 공인된 질병 또는 병태를 초래하는 임의의 지속적인 혈액 글루코스 수준은 생리학적으로 높은 혈액 글루코스 수준인 것으로 간주된다.
본 발명의 추가적인 실시양태는 시험관내 만능 줄기 세포 또는 이의 자손, 예를 들어, 다능 세포, 예컨대 PDX-1 양성 앞창자 내배엽 세포, PDX-1 양성 췌장 내배엽 또는 췌장 선조 세포, 내분비 선조/전구체, 예컨대 NGN3 양성 내분비 선조/전구체, 또는 기능성의 분화된 호르몬 분비 세포, 예컨대 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 그렐린, 또는 췌장 폴리펩티드 분비 세포로부터 유래된 생체내 인슐린 분비 세포에 관한 것이다. 상기 기재된 최종 분화 또는 다능 세포 중 임의의 것이 숙주 또는 포유동물 내로 이식될 수 있고, 숙주 혈액 글루코스 수준에 반응하여 생리학적으로 기능성인 호르몬 분비 세포, 예컨대 인슐린 분비 세포로 성숙될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 생체내에서 기형종을 형성하지 않고, 그렇게 형성된다면, 이식 구역에 국소화되어 잔존하며, 쉽게 절제 또는 제거될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 세포는 시험관내 분화 프로세스 동안, 또는 포유동물 내로 이식되었을 때 생체내에서, 또는 생체내에서 성숙되어 기능성 섬으로 발달되었을 때 어떠한 핵형 이상도 함유하지 않는다.
또한, 본원에 기재된 실시양태들이 조작된 또는 유전자 재조합 만능 세포, 만능 세포로부터 유래된 다능 또는 분화 세포, 예컨대 인간 iPS 세포에 관한 것이지만, 본원에서 제공된 설명을 기초로, iPS 세포가 hES 세포 및 hES-유래 세포의 것과 유사한 생리학 및 유전자 마커 발현 프로파일을 나타내기 때문에, 이들은 생체내에서 생리학적 특성이 유사할 것으로 예상된다.
췌장 선조를 캡슐화하는 방법
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 만능, 다능 및 분화 세포 조성물이 생물학적 및/또는 비-생물학적 기계 장치 내에 캡슐화될 수 있고, 이때 캡슐화된 장치는 숙주로부터 세포 조성물을 분리 및/또는 단리한다.
캡슐화 방법이 미국 출원 61/114,857 (2008년 11월 14일 출원되었고, 영문 명칭이 "ENCAPSULATION OF PANCREATIC PROGENITORS DERIVED FROM HES CELLS"임), 및 미국 출원 번호 61/121,086 (2008년 12월 12일 출원되었고, 영문 명칭이 "ENCAPSULATION OF PANCREATIC ENDODERM CELLS"임)에 상세하게 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 캡슐화 장치는 만능 유래 세포, 예를 들어, PDX-1 양성 앞창자 내배엽 세포, PDX-1 양성 췌장 내배엽 또는 선조 세포, 내분비 또는 내분비 선조/전구체, 예컨대 NGN3 양성 내분비 선조/전구체, 또는 기능성인 분화된 호르몬 분비 세포, 예컨대 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 그렐린, 또는 췌장 폴리펩티드 분비 세포를 반투과성 막 내에 함유하고, 이러한 막은 이식된 세포 집단의 통과를 방지하여 이들을 장치 내에 유지시키는 한편, 동시에 특정한 분비된 폴리펩티드, 예를 들어, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 그렐린, 췌장 폴리펩티드 등의 통과는 허용한다. 대안적으로, 장치는 혈관생성 막을 포함하는 다수의 막이 있다.
인간 만능 줄기 세포 , 예를 들어, hES 세포 및 iPS 세포의 성장, 생존, 증식 및 세포-세포 부착을 강화 및 촉진하는 작용제의 사용
세포 조절이 막을 가로지르는 세포외 신호의 전달을 통해 영향을 받을 수 있고, 차례로 이는 세포 내의 생화학 경로를 조정한다. 단백질 인산화는 세포내 신호가 분자에서 분자로 전파되어 최종적으로 세포 반응을 초래하는 한 과정을 나타낸다. 이러한 신호 전달 케스케이드는 다수의 단백질 키나제, 뿐만 아니라 포스파타제의 존재에 의해 증명되는 바와 같이 고도로 조절되고 종종 중복된다. 인간에서, 단백질 티로신 키나제가 당뇨병, 암을 포함하는 다수의 질병 상태의 발달에서 유의한 역할이 있는 것으로 공지되었고, 광범위한 선천적 증후군에 또한 연관되었다는 것이 보고되었다. 세린 트레오닌 키나제, 예를 들어, Rho 키나제는 억제된다면 당뇨병, 암 및 다양한 염증성 심혈관 장애 및 AIDS를 포함하는 인간 질환의 치료에 대한 관련성이 있을 수 있는 효소들의 부류이다. 현재까지 확인된 대부분의 억제제는 ATP-결합 부위에서 작용한다. 이같은 ATP-경쟁적 억제제는 ATP-결합 부위의 더 불량하게 보존된 구역을 표적화하는 이의 능력에 의해 선택성을 입증하였다.
소형 GTP 결합 단백질의 Rho 키나제 패밀리는 Rho A-E 및 G, Rac 1 및 2, Cdc42, 및 TC10을 포함하는 10개 이상의 구성원을 함유한다. 억제제는 종종 ROK 또는 ROCK 억제제 또는 Rho-키나제 억제제로 지칭되고, 이들은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. RhoA, RhoB, 및 RhoC의 이펙터 도메인은 아미노산 서열이 동일하고, 세포내 표적이 유사한 것으로 보인다. Rho 키나제는 Rho의 주요 하류 매개물로서 작동하며, 2개의 이소형으로 존재한다: α (ROCK2) 및 β (ROCK1). Rho 키나제 패밀리 단백질은 이의 N-말단 도메인 내의 촉매 (키나제) 도메인, 이의 중간 부분의 코일드-코일(coiled-coil) 도메인, 및 이의 C-말단 영역 내의 추정 플레크스트린(pleckstrin)-상동성 (PH) 도메인이 있다. ROCK의 Rho-결합 도메인은 코일드-코일 도메인의 C-말단 부분에 위치하고, GTP-결합 형태의 Rho의 결합은 키나제 활성의 강화를 초래한다. Rho/Rho-키나제-매개 경로는 안지오텐신 II, 세로토닌, 트롬빈, 엔도텔린-1, 노르에피네프린, 혈소판-유래 성장 인자, ATP/ADP 및 세포외 뉴클레오티드, 및 유로텐신 II를 포함하는 다수의 작동제에 의해 개시되는 신호 전달에서 중요한 역할을 한다. 이의 표적 이펙터/기질의 조정을 통해, Rho 키나제는 평활근 수축, 액틴 세포골격 조직화, 세포 부착 및 운동성, 및 유전자 발현을 포함하는 다양한 세포 기능에서 중요한 역할을 한다. 동맥경화증의 발병기전과 연관된 것으로 생각되는 다수의 세포 기능을 매개하는 것에서 Rho 키나제가 하는 역할에 의해, 이러한 키나제의 억제제는 다양한 동맥경화성 심혈관 질환의 치료 또는 예방에서 또한 유용할 수 있고, 내피 수축에서 수반될 수 있다.
일부 실시양태에서, Rho-키나제 억제제 Y-27632, 파수딜 (HA1077로 또한 지칭됨), H-1152P 및 ITS (인슐린/트랜스페린/셀레늄; 깁코), Wf-536, Y-30141 (미국 특허 번호 5,478,838에 기재됨) 및 이의 유도체, 및 ROCK에 대한 안티센스 핵산, RNA 간섭 유도 핵산 (예를 들어, siRNA), 경쟁적 펩티드, 길항제 펩티드, 억제 항체, 항체-ScFV 단편, 우성 음성 변이체 및 이의 발현 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 세포 성장, 생존, 증식 및 세포-세포 부착을 촉진 및/또는 지지하는 작용제가 다양한 세포 배양 배지 조건에 첨가된다. 추가로, 기타 저분자 화합물이 ROCK 억제제로서 공지되어 있기 때문에, 이같은 화합물 또는 이의 유도체가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 20050209261, 20050192304, 20040014755, 20040002508, 20040002507, 20030125344 및 20030087919, 및 국제 특허 공보 번호 2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976 및 2004/039796을 참조한다).
본 발명에서, ROCK 억제제 중 하나 또는 2개 이상의 조합물이 또한 사용될 수 있다. 이러한 작용제들은, 부분적으로, 해리된 hES 세포, iPS 또는 분화된 세포 배양물, 예를 들어, 확정적 내배엽, 앞창자 내배엽, 췌장 내배엽, 췌장 상피, 췌장 선조 집단, 내분비 선조 및 집단 등의 재회합을 촉진함으로써 기능한다. 유사하게, 세포 해리가 수행되지 않았을 때 작용제가 기능할 수 있다. 인간 만능 줄기 세포의 성장, 생존, 증식 및 세포-세포 부착의 증가는 (세포외 매트릭스 성분의 존재 또는 부재, 혈청의 존재 또는 부재, 섬유모세포의 존재 또는 부재, FGF의 존재 또는 부재, 액티빈의 존재 또는 부재 하에) 세포가 현탁액 내의 세포 응집체로부터 또는 부착 플레이트 배양물로부터 생산되었는지 여부와 관계없이 달성되었다. 이러한 세포 집단의 생존의 증가는 세포 분류기를 사용하는 정제 시스템을 용이하게 하고, 이를 개선시키며, 따라서 개선된 세포 회수를 허용한다. Rho 키나제 억제제 예컨대 Y27632의 사용은 해리된 단일 세포를 연속적으로 계대배양하는 동안 또는 극저온 보존으로부터 생존을 촉진하는 것에 의해 분화된 세포 유형의 확장을 또한 허용할 수 있다. Rho 키나제 억제제 예컨대 Y27632가 인간 만능 줄기 세포 (예를 들어, hES 및 iPS 세포) 및 이의 분화된 세포 상에서 테스트되었지만, Rho 키나제 억제제는 다른 세포 유형, 예를 들어, 일반적으로, 장, 폐, 흉선, 신장을 포함하나 이에 제한되지는 않는 상피 세포, 뿐만 아니라 색소 망막 상피와 같은 신경 세포 유형에 적용될 수 있다.
농도가 원하는 효과를 달성할 수 있는 한, 예컨대 세포의 성장, 생존, 증식 및 세포-세포 부착을 강화하고/하거나, 증가시키고/시키거나 촉진하는 것이 달성된다면, 세포 배양 배지 내의 ROCK 억제제의 농도는 하기 실시예에 기재된 것에 제한되지 않는다. 통상의 기술자는 다양한 조건 하의 다양한 ROCK 억제제의 최적화가 필요할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, Y-27632를 사용하는 경우, 바람직한 농도는 약 0.01 내지 약 1000 μM, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 약 100 μM, 더욱 더 바람직하게는 약 1.0 내지 약 50 μM, 가장 바람직하게는 약 5 내지 20 μM 범위일 수 있다. 파수딜/HA1077이 사용되는 경우, 이는 상기 언급된 Y-27632 농도의 약 2배 또는 3배로 사용될 수 있다. H-1152가 사용되는 경우, 이는 상기 언급된 Y-27632 농도의 대략적인 분율, 예를 들어, 약 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50 또는 1/60의 양으로 사용될 수 있다. 사용된 ROCK-억제제의 농도는, 부분적으로, 억제제의 생물활성 및 효능 및 억제제가 사용되는 조건에 좌우될 것이다.
ROCK 억제제로 처리하는 시간 및 기간은 원하는 효과 예컨대 성장, 생존, 증식 (세포 질량) 및 세포-세포 부착을 강화하고/하거나, 증가시키고/시키거나 촉진하는 것에 따라 제한될 수 있거나 또는 제한되지 않을 수 있다. 그러나, ROCK 억제제의 첨가는 실시예 7에 더 양호하게 기재된 바와 같이 뜻밖의 방식으로 분화에 또한 영향을 미칠 수 있다. 하기 실시예들은 약 12시간, 24시간, 48, 또는 이를 초과하는 시간 동안 처리된 인간 만능 줄기 세포 배양물 및/또는 분화된 세포 배양물을 기재한다.
원하는 효과 예컨대 세포의 성장, 생존, 증식 및 세포-세포 부착을 강화하고/하거나, 증가시키고/시키거나 촉진하는 것이 달성되는 밀도인 한 ROCK 억제제로 처리된 인간 만능 줄기 세포 배양물의 밀도 또한 제한되지 않는다. 시딩된 세포의 세포 밀도는 부착 또는 현탁 배양의 사용, 사용된 세포 배양 배지의 구체적인 처방전, 성장 조건 및 배양된 세포의 구상되는 용도를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 요인에 따라 조정될 수 있다. 세포 배양 밀도의 예는 0.01×105개의 세포/ml, 0.05×105개의 세포/ml, 0.1×105개의 세포/ml, 0.5×105개의 세포/ml, 1.0×105개의 세포/ml, 1.2×105개의 세포/ml, 1.4 ×105개의 세포/ml, 1.6×105개의 세포/ml, 1.8×105개의 세포/ml, 2.0×105개의 세포/ml, 3.0×105개의 세포/ml, 4.0×105개의 세포/ml, 5.0×105개의 세포/ml, 6.0×105개의 세포/ml, 7.0×105개의 세포/ml, 8.0×105개의 세포/ml, 9.0×105개의 세포/ml, 또는 10.0×105개의 세포/ml, 또는 이를 초과하는 값, 예를 들어, 5×107개의 세포/mL 또는 이를 초과하는 값, 또는 이들 사이의 임의의 값을 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 양호한 세포 성장, 생존, 증식 및 세포-세포 부착으로 배양되었다.
TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 활성화시키는 작용제의 사용
또 다른 실시양태에서, 성장인자의 TGFβ 슈퍼패밀리의 구성원을 포함하는 TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 활성화시키는 작용제가 본원에서 기재된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "TGFβ 슈퍼패밀리 구성원" 또는 이의 등가물은 TGFβ1, TGFβ2, TF-β3, GDF-15, GDF-9, BMP-15, BMP-16, BMP-3, GDF-10, BMP-9, BMP-10, GDF-6, GDF-5, GDF-7, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-2, BMP-4, GDF-3, GDF-1, GDF 11, GDF8, 액티빈 βC, βE, βA 및 βB, BMP-14, GDF-14, MIS, 인히빈 알파, 레프티1, 레프티2, GDNF, 뉴테우린, 퍼세핀 및 아르테민을 포함하는 서브패밀리를 포함하는 30가지를 초과하는 구조적으로 관련된 단백질들을 지칭한다. 문헌 [Chang et al. (2002) Endocrine Rev. 23(6):787-823] 참조.
TGFβ 패밀리 구성원은 TGFβ 패밀리 구성원에 반응하여 세포 성질을 변환시키거나 또는 다른 방식으로 세포 성질의 변화를 일으키는데 참여하는 폴리펩티드 또는 상호작용 중 하나 이상을 자극하는 화합물인 TGFβ 신호전달 경로 활성화제로 교체되거나 또는 이와 함께 사용될 수 있다. TGFβ 신호전달 경로는 TGFβ 패밀리 구성원 자체를 포함한다. TGFβ 슈퍼패밀리 구성원은 II형 및 I형 세린-트레오닌 키나제 수용체 및 Smad로 공지된 세포내 이펙터를 통해 신호를 전달함으로서 핵에 신호를 전송한다. 이러한 수용체들은 리간드에 결합하고 신호를 변환하도록 협동하여 작용하는 I형 및 II형 수용체로 공지된 2개의 서브패밀리에 속한다 (Attisano et al., Mol Cell Biol 16 (3), 1066-1073 (1996)). 리간드가 세포 표면 상의 I형 및 II형 수용체에 결합하여, 인산화를 통해 I형 수용체의 활성화를 촉진한다. 차례로 이러한 활성화된 복합체가 세포내 Smad들을 활성화시키고, 이는 전사를 조절하는 멀티서브유닛 복합체로 조립된다. TGF베타 슈퍼패밀리의 구성원은 2개의 신호전달 하위군으로 나뉜다: 기능적으로 TGFβ/액티빈에 관련된 것 및 BMP/GDF 서브패밀리에 관련된 것. 대부분의 TGFβ 리간드는 먼저 II형 수용체에 결합하는 것으로 생각되고, 그 후 이러한 리간드/II형 수용체 복합체가 I형 수용체를 동원하거나 또는 인산화시킨다 (Mathews, L S, Endocr Rev 15:310-325 (1994); Massague, Nature Rev: Mol Cell Biol. 1, 169-178 (2000)). II형 수용체 키나제가 I형 수용체 키나제를 인산화 및 활성화시킨 후, I형 수용체 키나제가 Smad 단백질을 인산화 및 활성화시킨다. TGFβ/액티빈 리간드가 TGFβ 및 액티빈 II형 수용체에 결합하고, Smad-2 및 -3을 활성화시킬 수 있다. 이러한 액티빈-유형 경로를 통해 노달 및 레프틸이 신호를 전달한다. BMP/GDF 리간드가 BMP II형 수용체에 결합하고, Smad 1, 5, 및 8을 활성화시킬 수 있다. 문헌 [Derynck, R et al. Cell 95, 737-740 (1998)] 참조. 리간드 자극 시, Smad가 핵 내로 이동하고, 전사 복합체의 성분으로서 기능한다.
TGFβ 신호전달은 다양한 메커니즘을 통해 양성 및 음성으로 조절된다. 양성 조절은 생물학적 활성에 충분한 수준으로 신호를 증폭시킨다. TGFβ 슈퍼패밀리 리간드가 II형 수용체에 결합하고, 이는 I형 수용체를 동원하고 인산화시킨다. 그 후, I형 수용체가 수용체-조절 SMAD (R-SMAD 예를 들어, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5, 및 SMAD8)를 인산화시키고, 이제 이는 공통 매개물인 Smad 또는 co-SMAD에 결합할 수 있다. R-SMAD/coSMAD 복합체가 핵 내에 축적되고, 여기에서 이는 전사 인자로서 작용하고, 표적 유전자 발현의 조절에 참여한다. 예를 들어, 성장 분화 인자는 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 15를 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, GDF8 및 GDF11는 TGFβ 신호전달 경로 활성화제 (양성 조절)이기도 한 TGFβ 패밀리 구성원이고, ActRII 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인 부분에 결합한 후 ActRI과 복합체를 형성함으로써 작용하여, Smad7 음성 조절인자의 억제 및 Smad2/Smad3 복합체의 인산화에 이른다. Smad2/Smad3 복합체는 Smad4와 회합되어 특정 유전자의 발현을 조절한다.
임의의 작용제의 사용과 같이, 예를 들어 TGFβ 수용체 패밀리 구성원을 활성화시키는 것과 같은 원하는 효과를 농도가 달성할 수 있는 한 세포 배양 배지 내의 임의의 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원의 농도는 하기 실시예에 기재된 것으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 액티빈, 예를 들어, 액티빈 A 및/또는 B, 또는 GDF8 및 GDF-11을 사용하는 경우, 바람직한 농도는 약 10 내지 약 300 nM, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 200 nM, 더욱 더 바람직하게는 약 75 내지 약 150 nM, 가장 바람직하게는 약 100 내지 125 nM 범위일 수 있다. 통상의 기술자는 임의의 농도를 테스트할 수 있고, 관련 기술분야의 표준 기술을 사용하여 이같은 농도의 효능을 결정할 수 있으며, 예를 들어, 임의의 세포 유형에 대한 유전자 마커들의 패널의 발현 및 비-발현을 결정함으로써 분화를 평가할 수 있다.
내분비 세포를 생산하는 작용제의 사용
한 실시양태에서, 본 발명은 감마 세크레타제 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 노치 경로 억제제를 내분비 분화를 촉진하고/하거나 내분비 세포의 홀마크이고 내분비 분화를 가리키는 특정 마커의 발현을 유도하는데 충분한 양으로 사용하여, 췌장 내배엽-계통 유형 집단 및/또는 하위집단, 구체적으로는 PEC 및/또는 췌장 내분비-계통 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 수많은 감마 세크레타제 억제제가 기재되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,756,511; 6,890,956; 6,984,626; 7,049,296; 7,101,895; 7,138,400; 7,144,910; 및 7,183,303 참조. 감마 세크레타제 억제제는 예를 들어 칼바이오켐(Calbiochem) (캘리포니아주 라호야)로부터 쉽게 입수가능하다: 감마 세크레타제 억제제 I, (GSI I), Z-Leu-Leu-노르류신-CHO; 감마 세크레타제 억제제 II; 감마 세크레타제 억제제 III, (GSI III), N-벤질옥시카르보닐-Leu-류시날; 감마 세크레타제 억제제 IV, (GSI IV), N-(2-나프토일)-Val-페닐알라니날; 감마 세크레타제 억제제 V, (GSI V), N-벤질옥시카르보닐-Leu-페닐알라니날; 감마 세크레타제 억제제 VI, (GSI VI), 1-(S)-엔도-N-(1,3,3)-트리메틸비시클로[2.2.1]헵트-2-일)-4-플루오로페닐 술폰아미드; 감마 세크레타제 억제제 VII, (GSI VII), 멘틸옥시카르보닐-LL-CHO; 감마 세크레타제 억제제 IX, (GSI IX), (DAPT), N--[N-(3,5-디플루오로펜아세틸-L-알라닐)]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르; 감마 세크레타제 억제제 X, (GSI X), {1S-벤질-4R-[1-(1S-카르바모일-2-페네틸카르바모일)-1S-3-메틸부틸카르바모일]-2R-히드록시-5-페닐펜틸}카르밤산 tert-부틸 에스테르; 감마 세크레타제 억제제 XI, (GSI XI), 7-아미노-4-클로로-3-메톡시이소쿠마린; 감마 세크레타제 억제제 XII, (GSI XII), Z-Ile-Leu-CHO; 감마 세크레타제 억제제 XIII, (GSI XIII), Z-Tyr-Ile-Leu-CHO; 감마 세크레타제 억제제 XIV, (GSI XIV), Z-Cys(t-Bu)-Ile-Leu-CHO; 감마 세크레타제 억제제 XVI, (GSI XVI), N-[N-3,5-디플루오로펜아세틸]-L-알라닐-S-페닐글리신 메틸 에스테르; 감마 세크레타제 억제제 XVII, (GSI XVII), WPE-III-31C); 감마 세크레타제 억제제 XIX, (GSI XIX), (2S,3R)-3-(3,4-디플루오로페닐)-2-(4-플루오로페닐)-4-히드록시-N-((3S)-2-옥소- -5-페닐-2,3-디히드로-1H-벤조[e][1,4]디아제핀-3-일)-부티라미드; 감마 세크레타제 억제제 XX, (GSI XX), (디벤즈아제핀 (DBZ)), (S,S)-2-[2-(3,5-디플루오로페닐)아세틸아미노]-N-(5-메틸-6-옥소-6,7-디히드로- -5H-디벤조[b,d]아제핀-7-일)프로피온아미드, 감마 세크레타제 억제제 XXI, (GSI XXI), (S,S)-2-[2-(3,5-디플루오로페닐)-아세틸아미노]-N-(1-메틸-2-옥소-5-페닐-2- ,3-디히드로-1H-벤조[e][1,4]디아제핀-3-일)-프로피온아미드; 감마40 세크레타제 억제제 I, N-트랜스-3,5-디메톡시신나모일-Ile-류시날; 감마40 세크레타제 억제제 II, N-tert-부틸옥시카르보닐-Gly-Val-발리날; 및 이소발레릴-V-V-Sta-A-Sta-OC3.
한 측면에서, 감마 세크레타제 억제제는 하기 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이때 신질환은 사구체 신질환 또는 세뇨관 신질환이다: Z-Leu-Leu-노르류신-CHO, N-벤질옥시카르보닐-Leu-류시날, N-(2-나프토일)-Val-페닐알라니날, N-벤질옥시카르보닐-Leu-페닐알라니날, 1-(S)-엔도-N-(1,3,3) 트리메틸비시클로[2.2.1]헵트-2-일)-4-플루오로페닐 술폰아미드, 멘틸옥시카르보닐-LL-CHO, N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸-L-알라닐)]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르, {1S-벤질-4R-[1-(1S-카르바모일-2-페네틸카르바모일)-1S-3-메틸부틸카르바모일]-2R-히드록시-5-페닐펜틸}카르밤산 tert-부틸 에스테르, 7-아미노-4-클로로-3-메톡시이소쿠마린, Z-lle-Leu-CHO, Z-Tyr-lle-Leu-CHO, Z-Cys(t-Bu)-lle-Leu-CHO, N-[N-3,5-디플루오로펜아세틸]-L-알라닐-S-페닐글리신 메틸 에스테르, (2S,3R)-3-(3,4-디플루오로페닐)-2-(4-플루오로페닐)-4-히드록시-N-((3S)-2-옥소- -5-페닐-2,3-디히드로-1H-벤조[e][1,4]디아제핀-3-일)-부티라미드, (S,S)-2-[2-(3,5-디플루오로페닐)-아세틸아미노]-N-(1-메틸-2-옥소-5-페닐-2-,3-디히드로-1H-벤조[e][1,4]디아제핀-3-일)-프로피온아미드, N-트랜스-3,5-디메톡시신나모일-Ile-류시날, N-tert-부틸옥시카르보닐-Gly-Val-발리날, 이소발레릴-V-V-Sta-A-Sta-OCH3. 본 발명의 한 측면에서, 약 0.5 내지 10 mM, 0.5 내지 5 mM, 0.5 내지 3 mM, 바람직하게는 0.5 내지 1 mM의 감마 세크레타제 억제제가 본원에 기재된 단계 1-7 중 어느 하나 또는 모두에서, 그리고 표 8 및 17에 따라 사용된다.
한 실시양태에서, 인슐린 성장 인자 (IGF)는 세포가 이의 생리학적 환경과 통신하는데 사용하는 복합 시스템의 일부분이고, 따라서 PSC를 PEC 및/또는 췌장 내분비-계통 세포로 분화시키는데 사용될 수 있다. 이러한 복합 시스템 (종종 IGF "축"으로 지칭됨)은 2개의 세포-표면 수용체 (IGF1R 및 IGF2R), 2개의 리간드 (인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1) 및 인슐린-유사 성장 인자 2 (IGF-2)), 6개의 고친화력 IGF-결합 단백질 (IGFBP-1 내지 IGFBP-6)의 패밀리, 뿐만 아니라 회합된 IGFBP 분해 효소들 (총괄적으로 프로테아제로 지칭됨)로 이루어진다. IGF는 인슐린 수용체인 IGF1R, 인슐린-관련 수용체인 IGF-2 수용체, 및 가능하게는 기타 수용체에 결합하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서, 이러한 수용체들에 결합하는 성장 인자는 IGF1 및 IGF2를 포함하나, 이에 제한되지 않는데, 이러한 수용체 중 어느 하나 또는 이들의 조합물에 결합하는 임의의 성장 인자, 작용제 또는 형태원(morphogen)에 잠재적으로 본원에서 기재 및 예상되는 것과 동일한 생리학적 효과가 있기 때문이다. 본 발명의 한 측면에서, 약 5 내지 200 ng/mL, 10 내지 100 ng/mL, 10 내지 75 ng/mL, 바람직하게는 10 내지 50 ng/mL, 바람직하게는 20 내지 50 ng/mL의 IGF가 본원에 기재된 단계 1-7 중 어느 하나 또는 모두에서, 그리고 표 8 및 17에 따라 사용된다.
한 실시양태에서, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)가 PSC를 PEC 및/또는 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)로 분화시키는데 사용된다. PDGF는 다양한 종류의 세포의 강력한 유사분열 촉진제로서 광범위하게 기재된 주요 단백질 성장 인자이다. PDGF는 상이한 티로신 키나제 수용체 (PDGFR-α 및 PDGFR-β)를 통해 작용하는 폴리펩티드 사슬 A, B, C 및 D의 이량체성 이소형들의 패밀리에 속한다. 본 발명의 한 측면에서, 리간드는 2가지 유형의 수용체에 결합하는 PDGFaa, PDGFab 또는 PDGFbb를 포함하나 이에 제한되지는 않는 PDGF 또는 이의 기능성 등가물이다. 본 발명의 한 측면에서, 약 5 내지 100 ng/mL, 10 내지 75 ng/mL, 10 내지 50 ng/mL, 바람직하게는 10 내지 20 ng/mL의 PDGF가 본원에 기재된 단계 1-7 중 어느 하나 또는 모두에서, 그리고 표 8 및 17에 따라 사용된다.
한 실시양태에서, 니코틴아미드 (니아신아미드 및 니코틴산 아미드로 또한 공지됨)는 니코틴산 (비타민 B3 / 니아신)의 아미드이고, PSC를 PEC 및/또는 췌장 내분비-계통 세포로 분화시키는데 사용된다. 니아신으로 또한 공지된 니코틴산이 생체내에서 니코틴아미드로 전환되고, 니아신 및 니코틴아미드는 이들의 비타민 기능에서는 동일하지만, 니코틴아미드는 니아신과 약리학적 및 독성 효과가 동일하지 않다. 따라서, 니코틴아미드와 유사하게 기능하는 다른 비타민 B 또는 비타민 B 유도체가 본 발명에서 구현된다. 본 발명의 한 측면에서, 약 5 내지 100 ng/mL, 10 내지 75 ng/mL, 10 내지 50 ng/mL, 바람직하게는 10 내지 20 ng/mL의 니코틴아미드가 본원에 기재된 단계 1-7 중 어느 하나 또는 모두에서, 그리고 표 8 및 17에 따라 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 헤지호그 패밀리 단백질이 PSC를 PEC 및/또는 췌장 내분비-계통 세포로 분화시키는데 사용된다. 본 발명이 제공하는 척추동물 세포간 신호전달 분자들의 헤지호그 패밀리는 데저트(Desert) 헤지호그 (Dhh), 소닉(Sonic) 헤지호그 (Shh), 인디언(Indian) 헤지호그 (Ihh) 및 문라트(Moonrat) 헤지호그 (Mhh)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 4개 이상의 구성원으로 이루어진다. 한 측면에서, 약 5 내지 200 ng/mL, 10 내지 200 ng/mL, 10 내지 150 ng/mL, 바람직하게는 10 내지 100 ng/mL의 헤지호그 단백질이 본원에 기재된 단계 1-7 중 어느 하나 또는 모두에서, 그리고 표 8 및 17에 따라 사용된다.
본 발명이 일반적으로 기재되었지만, 설명의 목적으로만 본원에서 제공되고 제한적인 것으로 의도되지 않는 특정한 구체적인 실시예들을 참조로 추가적인 이해가 수득될 수 있다.
실시예
상기는 본 발명의 바람직한 실시양태들에 관한 것이고, 수많은 변화가 그 안에서 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다는 것을 또한 이해하여야 한다. 본 발명이 하기의 실시예에 의해 추가로 설명되고, 이는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주에 제한을 부여하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 대조적으로, 본원의 명세서를 읽은 후에 본 발명의 취지 및/또는 첨부된 청구항의 범주를 벗어나지 않으면서 통상의 기술자에게 자신들을 제시할 수 있는 다양한 다른 실시양태, 변형 및 이의 등가물을 의지할 수 있다는 것이 명확하게 이해되어야 한다.
실시예 1
확정적 내분비 및 내분비 중간체를 통한 인간 iPS 세포의 췌장 선조 및 내분비 세포로의 분화
인간 유도형 만능 줄기 (iPS) 세포가 약 2주 (또는 14일) 과정에 걸쳐 4단계 절차를 사용하여 현탁 응집체에서 분화되어, 췌장 선조, 내분비 선조 및 호르몬 발현 내분비 세포를 포함하는 췌장 세포 유형의 집단이 생성되었다. 본원에서 사용된 인간 iPS 세포주는 일본 교토 대학교의 에스. 야마나카 및 셀룰러 다이나믹스 인터내셔널 인크(Cellular Dynamics International, Inc.) (CDI)에 의해 제공되었다.
본원에 기재된 iPS 세포는 최초로 신야 야마나카에 의해, 추후에는 CDI에 의해 제공되었다. 미분화 iPS 세포가 20％ 녹아웃 혈청 교체물을 함유하는 DMEM/F12 내의 유사분열이 불활성화된 마우스 배아 섬유모세포 또는 바람직하게는 무-피더 (섬유모세포 피더 세포 층이 없음) 상에서 성장되었다. 아큐타제를 사용하여 미분화 iPS 세포를 단일 세포로 해리시킴으로써 분화가 개시되었고, RNA 단리 & 분석을 위해 세포 샘플을 취하였다. 세포를 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS)의 1:5000 희석물, 액티빈 A (100 ng/mL), wnt3a (50 ng/mL), 및 10 μM의 rho-키나제 또는 ROCK 억제제인 Y-27632를 함유하는 RPMI + 0.2％ vol/vol FBS에 1-2백만개의 세포/㎖로 재현탁시키고, 울트라-로우(ultra-low) 부착 6웰 플레이트 내에 놓고, 회전 플랫폼 상에 놓고, 약 100 rpm에서 회전시켰다. 매일 배지를 교환하면서 나머지 분화 프로세스 동안 100 rpm에서 배양물을 회전시켰다. iPSC의 성장, 계대 및 증식은 실질적으로 미국 특허 번호 7,961,402 및 8,211,699에 기재된 바와 같다.
만능 세포, 예를 들어, hES 또는 iPS 세포, 및 만능 세포로부터 유래된 세포의 응집체 현탁 배양물을 생산하기 위한 본원에 기재된 방법은 실질적으로 PCT/US2007/062755 (2007년 2월 23일 출원되고, 영문 명칭이 "Compositions and methods for culturing differential cells"임) 및 PCT/US2008/080516 (2008년 10월 20일 출원되고, 영문 명칭이 "Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum"임)에 기재된 바와 같다.
본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 보드나 등의 미국 특허 6,800,480 (제론 코포레이션에 양도됨)에 기재된 바와 같이, 먼저 배양 용기를 세포외 매트릭스로 코팅하는 것에 의해 용이해질 수 있다. 다른 만능 줄기 세포, 예를 들어, hES 및 iPS 세포를 배양하기 위한 다른 방법과 같이 이러한 방법은 실질적으로 미국 출원 PCT/US2008/080516 (2008년 10월 20일 출원되고, 영문 명칭이 "Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum"임)에 기재된 바와 같이 가용성 인간 혈청을 사용하여 배양될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 톰슨, 제이의 미국 특허 번호 7,005,252 (위스콘신 얼럼나이 리서치 파운데이션 (WARF)에 양도됨)에 기재된 바와 같이 단순히 섬유모세포 피더 층 이외의 공급원으로부터 공급된 외인성으로 첨가된 섬유모세포 성장 인자 (FGF)에 의해 용이해질 수 있다.
대략적으로 처음 24시간의 회전 동안, 단일 세포들이 각각의 다른 형성된 세포 응집체에 부착되고, RNA 단리 & 분석을 위해 충분한 세포 샘플을 취하였다. 세포 응집체는 직경이 약 60 마이크로미터 내지 120 마이크로미터 범위였다. iPS 세포를 회전 플랫폼 상에 놓고 나서 약 1일 (또는 24시간) 후에, 배양물에 ITS의 1:5000 희석물, 액티빈 A (100-200 ng/mL), 및 Wnt3a (50-100 ng/mL)를 함유하는 RPMI + 0.2％ vol/vol FBS를 약 1일 (0시 내지 제1일) 동안 공급하고, 추가일 동안 동일하지만 Wnt3a가 없는 배지 내에 놓았다 (제1일 내지 제2일). RNA 단리 & 분석을 위해 매일 세포 샘플을 취하였다. 2일의 분화 후, 배양물에 ITS의 1:1000 희석물, KGF (또는 FGF7, 25 ng/mL), 및 TGFβ 억제제 4번 (2.5μM)을 함유하는 RPMI + 0.2％ vol/vol FBS를 1일 (또는 24시간, 제2일 내지 제3일) 동안 공급하였다. 다음 2일 동안 (제3일 내지 제5일), TGFβ 억제제가 배양 배지로부터 제거된 것을 제외하고는 동일한 성장 인자 칵테일 배지를 iPS 세포 응집체 현탁액에 공급하였다. 또 다시, 이러한 단계의 마지막에 (단계 2, 또는 제5일), RNA 단리를 위해 세포 샘플을 취하였다. 단계 3 (제5일 내지 제8일)을 위해, 세포 배양 배지를 TTNPB [4-[E-2-(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]벤조산] (3 nM), KAAD-시클로파민 (0.25 μM) 및 노긴 (50 ng/mL)을 함유하는 DMEM + 1％ vol/vol B27 보충물로 바꿨다. 또 다시, 이러한 단계의 마지막에 (단계 3, 제8일), RNA 단리 & 분석을 위해 세포 샘플을 취했다. 단계 4 (제8일 내지 제14일)을 위해, 배지를 노긴 (50 ng/mL), KGF (50 ng/mL) 및 EGF (50 ng/mL)를 함유하는 DMEM + 1％ vol/vol B27 보충물로 바꿨다. 또다시, 단계 4의 마지막에 (또는 제14일), RNA 단리 & 분석을 위해 세포 샘플을 취했다.
실시간 PCR을 수행하여 분화 과정 동안의 다양한 마커 유전자에 대한 유전자 발현을 측정하였다. 특정 마커 또는 유전자의 유전자 발현을 먼저 하우스키핑 유전자인 시클로필린 G 및 TATA 결합 단백질 (TBP) 발현의 평균 발현 수준에 대해 표준화하였다. 그 후, 표준화된 상대적인 유전자 발현이 미분화 iPS 세포에서의 발현 수준에 대해 상대적인 막대 그래프에서 디스플레이되었고, 따라서 이는 다양한 분화 마커에 대한 배수 상향조절을 나타낸다. OCT4의 경우는, 유전자 발현이 데이터 세트 내의 최저 샘플 (제14일)을 설정하도록 표준화되었고, 따라서 분화 과정 동안의 배수 하향 조절을 나타낸다.
도 2a-l은 미분화 iPS 세포에서의 동일한 유전자의 발현 수준에 대해 상대적인 확인된 유전자 (예를 들어, Oct4, 브라키우리, Cer1, GSC, FOXA2, FOXA1, HNF6, PDX1, PTF1A, NKX6.1, NGN3 및 INS)의 상대적인 유전자 발현을 나타내는 막대 그래프이다. 유전자들의 발현 수준은 하우스키핑 유전자들의 세트 (대조군)에 대해 표준화되었고, 상이한 2개의 시점의 유전자 발현 수준을 비교하는 것은 이러한 유전자 또는 발현 마커에 대한 상향 또는 하향 조절이 있었는지 여부를 가리켰다. OCT4 (도 2a)의 경우, 유전자 발현이 표준화되었고, 최저 수준 발현 샘플이 1에 설정되었다 (제14일). 따라서, 도 2a에 지시된 바와 같이, OCT4의 상대적인 발현 수준은 분화 과정 동안 (X축, 단계 0 내지 4, 또는 제0일 내지 제14일)의 배수 하향 조절 (Y축)을 나타낸다.
도 2a에 나타난 바와 같이, OCT4 (POU5F1)는 미분화 iPS 세포에서 높은 수준으로 발현되고, 이어지는 하향 조절을 분화 과정 (제0일 내지 제14일) 동안 나타낸다. 제14일에, OCT4 발현 수준은 미분화 세포에서 관찰되는 발현 수준으로부터 3000배를 초과하여 감소되었다. 대조적으로, 처음 2일 (제1일 및 제2일) 동안에 브라키우리 유전자 (브라키우리, 도 2b) 발현의 일시적인 상향 조절이 있었다. 브라키우리의 일시적인 상향 조절은 액티빈 A 및 wnt3a의 적용에 의한 만능/iPS 세포의 중내배엽으로의 지향성 분화의 결과였다. 액티빈 A에 대한 지속적인 노출에 의해 제2일 및 제3일 동안 중내배엽이 확정적 내배엽으로 분화되었다는 것이 제3일의 단계 1 마지막 무렵의 CER1, GSC 및 FOXA2의 상향 조절에 의해 지시되었다 (도 2c-e). 단계 2 동안, 분화 제6일의 FOXA1의 상향 조절, FOXA2 발현의 유지 및 CER1 및 GSC의 하향 조절 (도 2c-f)에 의해 지시되는 바와 같이 확정적 내배엽이 창자관 내배엽으로 분화되도록 추가로 지시되었다. 단계 3 동안, 레티노이드, 시클로파민 및 노긴에 노출되었을 때, 제8일의 HNF6 및 PDX1의 상향 조절 (도 2g-h)에 의해 지시되는 바와 같이 창자관 내배엽이 후기 앞창자/PDX1-발현 내배엽으로 분화되도록 추가로 지시되었다. 단계 4 동안, KGF 및 EGF에 노출되었을 때, 제14일의 PTF1A, NKX6-1, NGN3 및 INS의 상향 조절 (도 2i-l)에 의해 지시되는 바와 같이 후기 앞창자/PDX1-발현 내배엽이 췌장 선조, 내분비 선조 및 호르몬 발현 내분비 세포로 분화되도록 추가로 지시되었다.
실시예 2
RHO - 키나제 억제제가 IPS 세포의 성장, 생존, 증식 및 세포-세포 부착을 촉진한다
다양한 hES 및 iPS 세포주를 분화시키는 방법은 실질적으로 본원 및 실시예 1에 기재된 바와 같다. 단계 1, 2, 3, 4 및 5에 대해 기재된 바와 같은 배양 조건에 더하여, 분화 동안 성장, 생존, 증식 및 세포-세포 부착을 강화 및 촉진하도록 세포자멸사 억제제 및/또는 Rho-키나제 또는 ROCK 억제제를 배양 배지에 첨가하였다. 전형적으로, 약 10 μM의 Rho-키나제 억제제, 예를 들어, Y-27632가 각각의 단계에 세포 배양물에 첨가되었다. 대안적으로, Rho-키나제 억제제가 적어도 단계 1 및 2 및 단계 4 및 5, 또는 이의 임의의 조합에 첨가되었다. 분화된 iPS 현탁 (응집체) 세포 배양물의 형태학 및 유전자 마커 발현 프로파일은 hES 세포로부터 유래된 현탁 세포 배양물의 것과 실질적으로 유사하다.
도 3 및 4는 각각 단계 4 & 5로부터의 iPS 세포 배양물의 면역세포화학 (ICC)을 나타낸다. 도 3은 PDX1/NKX6.1 공동-양성 세포를 포함하는 PDX1-양성 췌장 내배엽 (췌장 상피 또는 췌장 선조로도 지칭됨)에 특징적인 전형적인 유전자 마커를 발현하는 단계 4로부터의 세포 응집체를 나타낸다. 도 3에 제시되지는 않았지만, 단계 4 세포는 단계 5 세포에 더욱 전형적인 호르몬 분비 단백질 또는 유전자 마커 예컨대 인슐린 (INS), 글루카곤 (GCG), 소마토스타틴 (SST) 및 췌장 폴리펩티드 (PP)를 발현하지 않는다. 도 4는 단계 5로부터의 호르몬 발현 세포의 세포 응집체를 나타낸다. 이러한 ICC 결과가 QPCR을 사용하여 추가로 확증되었다. 그러나, QPCR은 샘플 또는 세포 배양물에서 발현된 RNA의 전체 수준의 전체 집단 연구이기 때문에, 이는 임의의 한 세포가 다중 마커를 발현한다는 것을 확정적으로 나타낼 수 없다.
실시예 3
IPS -유래 췌장 선조의 캡슐화
현재까지, IPS 세포의 생산 방법 및 IPS 세포 생산용 공급원이 보고되었다. 그러나, 특정 질환, 예를 들어, 당뇨병을 치료하기 위한 세포 요법에서의 잠재적인 사용을 위해 임의의 IPS 세포를 임의의 기능성 분화 세포로 분화시키는 것은 충분히 기재되어 있지 않다.
인간 iPS 세포로부터 유래된 단계 4 PDX1-양성 췌장 내배엽 또는 췌장 선조 세포 배양물이 충분히 생체내에서 글루코스 감수성 인슐린 분비 세포로 발달 및 성숙될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 실질적으로 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 췌장 선조 집단을 미국 출원 12/618,659 (영문 명칭이 "ENCAPSULATION OF PANCREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS"이고, 2009년 11월 13일에 출원됨); 및 미국 특허 번호 7,534,608 및 7,695,965 (영문 명칭이 "METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES"임)에 기재된 것과 실질적으로 유사한 마크로캡슐화 장치 내로 로딩하였다. 간략하게, 약 5-10-20 ㎕의 중력으로 침강된 세포 현탁 응집체를 각각의 장치 내로 로딩하였고, 실질적으로 약 3×106개의 세포가 있었다.
그 후, 장치 내의 캡슐화된 세포를 포유동물, 면역-손상 SCID/Bg 마우스 내로의 이식용으로 만들었지만, 래트, 돼지, 원숭이 또는 인간 환자를 포함하는 더 큰 동물에 이식될 수 있다. 캡슐화된 세포 및 장치의 이식 방법은 GELFOAM 매트릭스 상에서 이식되고 부고환 지방 패드 (EFP) 하에 이식되는 췌장 선조 세포를 포함하여, 실질적으로 미국 특허 출원 번호 12/618,659, 미국 특허 번호 7,534,608 및 7,695,965에 기재된 바와 같다.
이러한 연구에서는 면역억제가 필수적이지 않았지만, 특정 동물의 경우에는 장치 내의 선조가 충분히 성숙하고 글루코스에 대해 반응성일 때까지 초기의 일시적인 기간 동안 면역억제가 필요할 수 있다. 일부 포유동물에서, 면역억제 요법은 약 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주 또는 이를 초과하는 주 동안일 수 있고, 포유동물에 따라 좌우될 것이다.
이식된 세포가 생체내에서 분화 및 추가로 성숙되도록 허용되었다. 이식된 세포에 예를 들어 천연 발생 베타 세포와 같은 정상적인 생리학적 기능이 있는지 여부를 결정하기 위해, 인간 C-펩티드의 수준을 테스트함으로써 인간 인슐린의 수준이 결정될 것이다. 인간 C-펩티드는 인간 프로-인슐린으로부터 절단 또는 프로세싱되고, 따라서 내인성 마우스 C-펩티드가 아니라 인간 C-펩티드를 구체적으로 검출하는 것은 인슐린 분비가 이식된 (외인성) 세포로부터 유래된다는 것을 가리킨다. 아르기닌 또는 글루코스, 바람직하게는 글루코스의 볼루스를 주사하는 것에 의해 이식편이 있는 동물이 약 2주, 3주 또는 4주마다 인간 C-펩티드 수준에 대해 테스트될 것이다. 그 후, 성숙 베타 세포 (분화된 만능 iPS 세포로부터 유래됨)는 생리학적으로 기능성이어야 하고, 천연 발생 또는 내인성 베타 세포와 다르지 않게 글루코스에 반응성이어야 한다. 전형적으로, 평균 기저 (역치) 수준 또는 50 pM 초과의 인간 C-펩티드의 양은 이식된 선조로부터의 현재의 베타 세포의 기능의 지표이다.
상기 문헌 [Kroon et al. (2008)], 미국 출원 12/618,659, 미국 특허 번호 7,534,608; 7,695,965 및 7,993,920에 기재된 것과 유사하게, hIPS 세포로부터 유래된 캡슐화된 췌장 선조는 천연 발생 섬에서와 다르지 않게 내분비, 샘꽈리 및 관 세포가 있는 기능성 췌장 섬 클러스터로 성숙될 것으로 예상된다. 이식 전의 hIPS 세포로부터 유래된 정제 또는 강화된 췌장 선조가 또한 생체내에서 기능성 췌장 섬으로 성숙 및 발달되고 인슐린을 생산할 것으로 또한 예상된다. 다양한 분화된 세포집단의 정제 및 강화를 위한 특정 실시양태가 미국 출원 12/107,020 (영문 명칭이 "METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FROM HES CELLS"이고, 2008년 4월 8일 출원되었으며, 현재 미국 특허 8,338,170임)에 더욱 상세하게 기재되어 있다. 냉동보존된 hIPS 세포로부터 유래된 췌장 선조가 이식 전에 해동되어 배양물에서 개조될 수 있고, 이에 따라 생체내에서 성숙되어 인슐린을 생산할 수 있는 것으로 추가로 예상된다. hIPS 세포로부터 유래된 췌장 선조가 이식된 당뇨병이 유도된 동물에서 저혈당증이 호전될 수 있다.
요약하면, 마크로캡슐화 장치 내의 완전히 캡슐화된 hIPS 세포로부터 유래된 췌장 선조 세포가 생리학적으로 기능성인 췌장 섬으로 성숙되고, 생체내에서 글루코스에 반응하여 인슐린을 생산할 것으로 예상된다.
실시예 4
췌장 선조 및 호르몬 분비 세포 조성물
분화된 hIPS 세포 집단을 각각 표 6a, 6b 및 7에 제시된 바와 같이 PDX1-양성 췌장 내배엽 또는 췌장 선조 세포 함량 (단계 4); 및 내분비 또는 내분비 선조/전구 세포 함량 (단계 5)에 대해 유동 세포측정법을 사용하여 분석하였다. 표 6b는 표 6a에서의 것과 동일한 데이터 세트이지만, 비교를 위해 표 10의 것과 유사하게 제시된다. 표 6a 집단은 서로 중첩되고, 예를 들어, 총 세포수가 100％를 초과하는데 이는 총 PDX1+ 및 NKX6.1+ 수가 NKX6.1+/PDX1+/CHGA- 세포 집단의 것 (표 6a의 5번째 열)과 중첩되기 때문이다. 표 6b는 표 6a에 제시되지 않은 PDX1+ 단독 및 삼중 음성 (나머지) 데이터를 포함한다. 이러한 iPEC 이식편 중 몇몇, 뿐만 아니라 실질적으로 유사한 제제를 사용하는 기타의 것이 생체내 기능을 결정하기 위해 동물 내로 이식되었지만, 인간 혈청 C-펩티드의 수준이 임의의 잠재적인 치료적 목적을 위해 충분히 강건하지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 제시된 값은 소정의 집단에 속하는 총 세포의 백분율이다. 현탁 세포 응집체 내의 췌장 선조 (NKX6.1(+)/PDX1(+)/크로모그라닌A(-)) 및 NKX6.1+/PDX1-/CHGA-의 매우 작은 집단의 수는 미국 출원 12/264,760 (영문 명칭이 "STEM CELL AGGREGATE SUSPENSION COMPOSITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATION THEREOF"이고, 2008년 11월 4일 출원됨)에 기재된 바와 같은 hES 세포로부터 유래되고 ESC 단계에서 응집된 췌장 선조 세포 현탁 응집체에서 관찰된 것과 일관되었다. 내분비 및/또는 내분비 선조/전구 세포의 수준 또한 미국 출원 12/107,020 (영문 명칭이 "METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FROM HES CELLS"이고, 2008년 4월 8일 출원됨)에서의 hES-유래 세포 배양물에서 수득된 것과 실질적으로 일관되었다. hES-유래 세포 현탁 응집체와 유사하게, 특정 분화 단계 (예를 들어, 단계 4)의 배양 배지 내의 여러 성장 인자의 농도를 변화시키는 것은 췌장 내배엽, 내분비, PDX1-양성 내배엽 또는 비-췌장 세포 유형의 특정 집단을 증가 및/또는 감소시켜야 한다.
<표 6a>
단계 4 췌장 선조 세포 조성 (총 세포의 백분율)
Figure pct00028
<표 6b>
단계 4 췌장 선조 세포 조성 (총 세포의 백분율)
Figure pct00029
<표 7>
단계 5 내분비 세포 조성 (총 세포의 백분율)
Figure pct00030
실시예 5
PEC 수용체 티로신 키나제
상기 기재된 방법들은 상기 문헌 [Schulz et al., (2012)]으로부터 개조된, 하기 표 8에 기재된 것들과 실질적으로 유사하다. 본원에 기재된 이러한 방법 및 기타 방법을 미국 특허 번호 7,964,402; 8,211,699; 8,334,138; 8,008,07; 및 8,153,429를 포함하는 출원인의 다수의 특허 및 비-특허 간행물에서 확인할 수 있다.
<표 8>
hESC로부터 유래된 췌장 내배엽 세포 (PEC)를 제조하기 위한 표준 제작 방법
Figure pct00031
hESC Agg .: hESC 응집체; XF HA: 10％ v/v의 제노-프리 녹아웃 혈청 교체물, 1％ v/v 비-필수 아미노산, 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 1％ v/v 페니실린/스트렙토마이신 (모두 라이프 테크놀러지스(Life Technologies)), 10 ng/mL 헤레귤린-1β (페프로테크(Peprotech)) 및 10 ng/mL 액티빈 A (R&D 시스템즈)가 보충된, 글루타맥스(GlutaMAX)를 함유하는 DMEM/F12; SP: 스템프로(StemPro)® hESC SFM (라이프 테크놀러지스); r0. 2FBS: RPMI 1640 (미디어테크(Mediatech)); 0.2％ FBS (하이클론(HyClone)), 1× 글루타맥스-1 (라이프 테크놀러지스), 1％ v/v 페니실린/스트렙토마이신; ITS: 1:5000 또는 1:1000 희석된 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (라이프 테크놀러지스); A100: 100 ng/mL 재조합 인간 액티빈 A (R&D 시스템즈); W50: 50 ng/mL 재조합 마우스 Wnt3A (R&D 시스템즈); K25: 25 ng/mL 재조합 인간 KGF (R&D 시스템즈); IV: 2.5 μM TGF-β RI 키나제 억제제 IV (이엠디 바이오사이언스(EMD Bioscience)); db: 0.5× B-27 보충물 (라이프 테크놀러지스), 1× 글루타맥스, 및 1％ v/v 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 하이 글루코스(HI Glucose) (하이클론); CTT3: 0.25 μM KAAD-시클로파민 (토론토 리서치 케미컬즈(Toronto Research Chemicals)) 및 3 nM TTNPB (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)); N50: 50 ng/mL 재조합 인간 노긴 (R&D 시스템즈); K50: 50 ng/mL 재조합 인간 KGF (R&D 시스템즈); E50: 50 ng/mL 재조합 인간 EGF (R&D 시스템즈); 공급 없음: 지시된 날에 세포에 재공급되지 않았음을 가리킴; db, DMEM (고-글루코스).
상기 방법들이 동물에 이식된 iPS 세포 및 췌장 선조에 적용되었을 때, 출원인은 동일한 방법이 hESC 및 hES-유래 췌장 선조에 적용되었을 때와 비교하여 동일한 강건한 생체내 기능을 일관적으로 수득하지 않았다. iPS 세포는 hESC의 형태 및 유전자-발현 패턴을 지니는 인간 만능 줄기 세포이고, 시험관내에서의 배상체 및 생체내에서의 기형종 양쪽 모두를 형성할 수 있어서, 이들이 3가지 배엽층 모두로부터의 세포를 형성할 수 있다는 것을 가리킨다고 하면 이는 뜻밖이었다. 적어도 예를 들어 문헌 [Yu et al. (2007)]; 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0047263, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2005/80598; 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0233610; 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO2008/11882를 참조한다. 이러한 참고문헌들은 iPS 세포가 ESC의 정의 기준을 충족시킨다는 것을 기재한다. 따라서, 생체내에서 충분히 기능성인 글루코스 반응성 세포로 추가로 성숙 및 발달되는 hES-유래 췌장 선조 세포가 산출되는 시험관내 분화 프로토콜에서 iPS 세포가 ESC를 치환할 수 있을 것으로 예상된다. 그러나, 상기 방법을 사용한 생체내 기능화 데이터에서 일관성이 없다고 하여, 출원인은 hESC로부터 유래된 PEC에 대해 일관적으로 관찰된 실질적으로 유사한 강건한 수준의 생체내 기능을 제공할 수 있는 췌장 선조 및/또는 췌장 내배엽 세포 (PEC), 즉, hiPSC로부터 유래된 단계 4 유래 세포 (또는 "iPEC")에 독특한 분화 배지 제제를 탐구하려고 노력하였다.
출원인은 PEC 내에 존재하는 내분비 세포 (CHGA+ 세포)가 다중호르몬성 내분비 세포이고, 생체내에서 글루코스-반응성 인슐린-분비 세포가 있는 섬을 초래하는 PEC 내의 세포의 하위집단이 아니라는 것을 기존에 보고하였다. 상기 문헌 [Kelly et. al. (2011)] 참조. 그보다는, 비-내분비 세포 집단 (CHGA- 세포), 특히 NKX6.1 및 PDX-1을 공발현하는 것이 생체내에서 기능성 섬을 실제로 초래하는 PEC인 것으로 여겨진다. 따라서, 출원인은 내분비 및 비-내분비 하위집단의 상대적인 비율을 조정하거나, 변화시키거나 또는 변이시키는 것이 추후의 생체내 기능에 영향을 미칠 것인지 여부를 탐구하였다.
hESC 내의 수용체-리간드 신호전달을 해독하려는 기존의 노력으로 자가 재생을 촉진하는 성장 인자가 성공적으로 확인되었고, 규정 배지 배양 조건의 발달이 가능해졌다. 상기 문헌 [Wang et al (2007)] 참조. 왕(Wang) 등은 ERBB3에 결합하고, ERBB2와의 이량체화를 유도하여, 이와 관련하여 hESC의 자가 재생에 영향을 미친 리간드로서 헤레귤린-1β를 확인하였다. ERBB는 수용체 티로신 키나제 (RTK)이고, RTK는 성장 인자 및 기타 세포외 신호전달 분자에 대한 수용체로서 작용하는 광범위하게 발현되는 막횡단 단백질이다. 리간드 결합 시, 세포질 꼬리 내의 특정 잔기에서 티로신 인산화, 및 RTK-매개 신호 전달에서 수반되는 다른 단백질 기질의 결합을 위한 신호전달 케스케이드의 착수가 이들에 진행된다. RTK는 세포 생존, 증식 및 운동성을 조절하는 것을 포함하여 여러 발생 프로세스에서 기능하고, 암 형성에서의 이의 역할이 잘 문서화되어 있다. ERBB 티로신 키나제 수용체는 인간 태아 췌장이 발달되는 동안 내내 발현되는 것으로 또한 공지되었지만, 특정 ERBB 수용체 및 이의 리간드의 구체적인 역할은 미지이다. 문헌 [Mari-Anne Huotari et al. (2002) ERBB Signaling Regulates Lineage Determination of Developing Pancreatic Islet Cells in Embryonic Organ Culture, Endocrinology 143(11): 4437-4446] 참조.
상기 문헌 [Wang et al. (2007)]에서 입증된 바와 같은 만능 줄기 세포 자가 재생에서의 ERBB RTK 신호전달의 역할 및 인간 태아 췌장에서의 이의 발현, 및 인간 태아 췌장에서의 ERBB RTK 발현으로 인해, 출원인은 분화 동안 PEC 특정을 개선할 수 있는 수용체 및 리간드를 확인하기 위한 노력에서의 hESC로부터 유래된 시험관내 췌장 내배엽 세포 (PEC)에서의 RTK의 잠재적인 활성화, 또는 자기 재생의 촉진을 통한 확장, 또는 생체내에서의 생리학적으로 기능성인 섬 호르몬 분비 세포로의 성숙을 촉진하는 일부 기타 미지의 메커니즘을 연구하는 것으로 전환하였다. PEC는 하기의 변형을 제외하고는 실질적으로 표 8에 기재된 바와 같이 현탁액에서 분화 중인 응집체에서 생성되었다.
RTK 블롯팅 분석을 위해 4개의 PEC 샘플이 생성되었다. db-N50 K50 E50 내의 PEC 응집체의 "정상 상태" 샘플을 단계 4의 마지막 (또는 d13)에 수집하였다. "고갈" 샘플은 db (DMEM 고-글루코스 또는 0.5× B-27 보충물 (라이프 테크놀러지스)가 보충된 DMEM 고-글루코스) 배지 단독 (성장 인자 없음)이 공급되었고 d13에 수집된 d12 PEC 응집체를 나타냈다. 2개의 "펄스" 샘플은 d12에 db 배지가 공급되어 배양된 후, d13에 db-K50 E50 배지, 또는 2％ FBS를 함유하는 db 배지가 수확 15분 전에 공급되었다. 이같은 조건은 단계 4 조건에서 활성인 RTK, 및 어떤 반응이 KGF, EGF 및 인슐린 (B27 보충물 내에 존재함), 또는 혈청의 펄스로 도출될 수 있는지를 검출하도록 의도되었다. 혈청 펄스는 광-스펙트럼 성장 인자 자극으로서 의도되어, PEC 내에 존재하고 활성화될 수 있지만 현재의 단계 4 조건으로 자극되지 않는 RTK가 잠재적으로 확인되었다.
본질적으로 기존에 상기 문헌 [Wang et al, (2007)]에서 기재된 바와 같이 RTK 분석을 수행하였다. 간략하게, 프로테옴 프로파일러™ 인간 포스포-RTK 항체 어레이 (R&D 시스템즈)를 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 단백질 용해물이 1％ NP-40, 20 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 10％ 글리세롤, 2.0 mM EDTA, 1.0 mM 소듐 오르토바나데이트, 10 ㎍/mL 아프로티닌(Aprotinin), 및 10 ㎍/mL 류펩틴(Leupeptin)에서 제조되었다. 500 ㎍의 신선한 단백질 용해물을 42개의 항-RTK 항체 및 5개의 음성 대조군 항체에 대한 이중 스폿, 뿐만 아니라 8개의 항-포스포티로신 양성 대조군 스폿이 점재된 니트로셀룰로스 막과 함께 철야로 인큐베이션하였다 (도 5a). 어레이된 항체들은 인산화 및 비인산화 RTK 양쪽 모두의 세포외 도메인을 포획하고, 결합된 포스포-RTK는 화학발광을 사용하여 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 접합된 팬(pan) 항-포스포-티로신 항체로 검출된다. RTK 어레이에 대한 도 5, 뿐만 아니라 어레이 내의 RTK의 목록에 대한 하기의 표 9를 참조한다.
<표 9>
PEC의 수용체 티로신 키나제 (RTK) 분석을 위한 RTK의 목록
Figure pct00032
Figure pct00033
RTK 블롯 (도 6A)은 인슐린- 및 IGF1-수용체 (각각 IR, IGF1R)가 기존에 hESC로 관찰된 것과 유사하게 모든 조건에서 인산화 및 활성화되었음을 가리켰다. 상기 문헌 [Wang et al (2007)] 참조. EGF 수용체 (EGFR (ERBB1로 또한 공지됨))는 정상 상태 조건에서 인산화되었고, 이는 단계 4 배지 내의 EGF의 존재 하에 예상되었다. 실제로, ERBB2의 저-수준 인산화가 정상 상태 및 고갈 조건 양쪽에서 검출되었다. EGFR 및 ERBB2 양쪽 모두의 인산화가 각각의 펄스 조건에서 상승되어, 리간드의 펄스에 반응한 활성화를 검출하는 검정법의 능력이 확증되었다. 인산화된 VEGFR3이 또한 모든 조건에서 검출되었고, 펄스 샘플에서 상승되었다. 이는 PEC가 내인성 VEGFR3 리간드를 생산한다는 것을 시사하고, 가능한 후보는 VEGF-C 및 D이다. 혈청 펄스는 낮은 수준의 ERBB3 인산화를 포함하여 추가적인 수용체를 활성화시키는 것으로 보였다. 인산화된 ERBB2/3의 검출은 헤레귤린-유사 EGF-패밀리 구성원이 PEC에서의 신호전달을 활성화시킬 수 있음을 시사한다. TIE-2는 2개의 안지오포이에틴 수용체 중 하나이고, 혈청에 반응하여 낮은 수준으로 인산화되는 것으로 보인다. 안지오포이에틴 1 및 안지오포이에틴 4는 Tie-2의 활성화 리간드인 것으로 공지된 반면, 안지오포이에틴 2 및 안지오포이에틴 3은 상황 의존적인 경쟁적 길항제로서 기능한다. HGF-수용체 (HGFR) 또한 혈청 펄스에 반응하여 인산화되었고, 이는 간세포 성장 인자 또한 PEC에서 신호전달을 도출할 수 있다는 것을 시사한다. 마지막으로, 에프린 B2 RTK (EPHB2)의 저-수준 인산화가 검출된 한편, 에프린/Eph 신호전달은 막에 결합된 세포-세포 신호전달 시스템이고, PEC 분화에서 쉽게 활용될 것 같지 않다. 흥미롭게도, ERBB4는 인산화되지 않았다. 따라서 RTK 분석은 PEC에서 상이한 조건, 예를 들어 혈청에 반응하여 인산화되거나 또는 인산화될 수 있는 여러 수용체를 눈에 띄게 하였다. 이러한 결과들은 여러 가용성 리간드가 PEC에서 RTK 신호전달을 도출할 수 있고, 잠재적으로 세포 증식, 분화 및/또는 특정에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 잠재적으로 추후의 생체내에서의 기능성 췌장 섬으로의 성숙영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 6
헤레귤린 및 FGF2 성장 인자가 hESC 조성물로부터 유래된 PEC에 영향을 미친다
실시예 5에서 상기 기재된 바와 같이 특정 조건 하에 특정 RTK가 활성화 (또는 인산화)되었음이 입증된 RTK 분석을 고려하여, 그리고 적어도 ERBB2 및 ERBB3이 PEC에서 (단계 1-4로부터의 분화 13일 이후에) 활성화된 것으로 보이기 때문에, 출원인은 단계 3 및 4 세포에 적용되었을 때의 헤레귤린 효과를 결정하려고 노력하였다.
헤레귤린 및 FGF를 사용하여 예비 연구를 수행하였다. 이러한 연구 중 몇몇에서, Rho-키나제 억제제인 Y-27632가 포함되었다. 이러한 예비 연구는 만능 줄기 세포를 단계 1에서 1일 동안 10 ng/mL 헤레귤린-1β (문헌 [Wang et al. (2007)]에 개시된 바와 동일한 농도 및 헤레귤린 이성질체)로 처리하는 것이 헤레귤린-1β (Hrg1β)가 없는 현탁 배양에서의 hES-유래 세포의 응집체 크기와 비교하여 현탁 배양에서의 hES-유래 세포 응집체의 세포 응집체 크기를 증가시켰음을 나타냈다. 세포 응집체 크기의 증가는 추후의 이식 및 동물에서의 기능 테스트를 위한 더 높은 세포 질량을 초래한다는 점에서 유리하다. 또한, Hrg1β가 단계 3에서 10 ng/mL에서 50 ng/mL로 증가되었을 때 응집체 디스크 크기가 증가되었다. 이러한 결과는 FGF2의 부재 하에서의 배양물과 비교하여 50 ng/mL의 또 다른 성장 인자인 FGF2가 단계 3에서 사용되었을 때 또한 관찰되었다. 단계 3 배양물이 추가적인 날 동안 FGF2에 노출되었을 때, 예를 들어, 2일에 비교하여 3일 동안 50 ng/mL FGF2에 노출되었을 때 세포 응집체 크기의 증가가 또한 관찰되었다.
표 10은 단계 3에서 Hrg1β 및 FGF2로 처리된 PEC 세포의 유동 세포측정법 분석의 요약을 제공한다. 내분비 세포는 CHGA 양성 (또는 CHGA+) 세포로 표기되고, 비-내분비 세포는 CHGA 음성 (또는 CHGA-) 세포로 표기된다. 내분비 (CHGA+) 및 비-내분비 세포 (CHGA-)는 다른 마커에 대해 양성으로, 예를 들어 PDX1 및/또는 NKX6.1에 대해 양성으로 염색될 수 있다. 테스트된 마커 중 어느 것으로도 염색되지 않는 세포는 삼중 음성 세포 또는 나머지 세포 (CHGA-/NKX6.1-/PDX1)로 표기된다.
<표 10>
hESC로부터 유래되고 헤레귤린 및/또는 FGF2로 처리된 PEC의 유동 세포측정법 분석
Figure pct00034
Hg, 헤레귤린-β; FGF2, 섬유모세포 성장 인자 2; Hrg10, 10 ng/mL 헤레귤린-1β; Hrg50, 50 ng/mL 헤레귤린-1β; 2d FGF -50, 단계 3의 2일 동안 50 ng/mL의 FGF2; 3d FGF2-50, 단계 3의 3일 동안 50 ng/mL의 FGF2
세포 응집체 크기의 증가가 PEC 하위집단에 영향을 미쳤는지 여부를 결정하기 위해, PEC 집단의 조성을 유동 세포측정법으로 분석하였다. Hrg1β 및 FGF2가 세포를 분화시키는데 사용되지 않은 대조군 배양물과 비교하여, PEC 비-내분비 하위집단 (CHGA-)이 단계 3에서의 10 ng/mL Hrg1β의 첨가로 54.01％에서 61.2％로 증가하였고, 단계 3에서의 50 ng/mL Hrg1β의 첨가로 54.01％에서 64.2％로 증가하였다. 내분비 하위집단 (CHGA+)은 10 ng/mL Hrg1β 처리로 유의하게 영향을 받지 않았지만, 50 ng/mL로는 더욱 그러하였다. 동시에, 나머지 세포의 상대적인 수준이 감소되었고, 50 ng/mL Hrg1β로 더욱 그러하였다. 따라서, Hrg1β 처리로의 세포 응집체 크기의 증가는 내분비 및 나머지 하위집단과 비교하여 비-내분비 하위집단의 증가에 대부분 기인하였다.
단계 3 배양물에서의 FGF2의 효과는 Hrg1β와 유사하였지만, Hrg1β에 대한 것보다 더욱 더 명백하였다. 예를 들어, PEC 비-내분비 하위집단 (CHGA-)이 Hrg1β에 대한 것과 같이 증가하였다. 이러한 배양물에서의 FGF2의 주요 효과는 내분비 하위집단의 실질적인 감소였다. 일부 경우에, 이러한 세포들은 3일 처리로 거의 검출불능이었다 (32.9％ → 0.33％). 따라서, FGF2로 처리된 배양물에 대한 세포 응집체 크기의 증가는 비-내분비의 증가에 거의 기인하였고, 일부 경우에는 나머지 하위집단 (단계 3에서의 3일에 대해 13.1％ → 22.7％)의 증가에 기인하였다.
따라서, 헤레귤린 및/또는 FGF2가 PEC 집단 내의 세포의 특정에서 역할을 하는 것으로 보인다. 상기 문헌 [Wang et al (2007)]에서 만능 줄기 세포의 상황에서 사용되었을 때 헤레귤린 단독이 세포 재생에서 역할을 하였음이 보고되었음을 생각하면 이는 뜻밖이다.
실시예 7
IPS -유래 세포 배양물을 헤레귤린으로 처리하는 것에 의해 PEC의 생체내 이식편 기능을 개선하는 방법
iPEC를 생산하기 위해 iPSC에 적용되었을 때 표 8에 따른 방법이 동물에서 강건한 생체내 기능을 제공하지 않았기 때문에, 출원인은 다른 iPEC 생산 방법을 탐구하였다. 표 8에 기재된 바와 같은 표준 방법에 대한 변화는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 임의의 iPSC가 계대되는 횟수의 최적화; BMP 신호전달 수준을 조정하는 것; 확장 및 분화 동안 iPSC 현탁 응집 파라미터 (예를 들어, 전단력, 회전 속도 등)를 조정하는 것; 성장 인자, 예컨대 Wnt, 액티빈 및 rho-키나제 억제제의 농도, 사용 시간 및 사용 기간의 최적화; 및 세포 질량, 증식, 분화, 생존 등을 개선하는 후보물로서의 분화 프로토콜의 다양한 단계 1 내지 4 동안의 다른 성장 인자 (예를 들어 ERBB 리간드)로의 처리. 어떻게 단계 1-4 동안의 iPSC의 분화 방법이 최적화될 수 있는지를 결정하기 위해 이러한 다수의 반복 실험이 단독으로 또는 조합되어 테스트되었다. 이같은 최적화된 분화 방법으로, 이식되었을 때 hESC에 대해 관찰 및 보고된 것과 유사하게 생체내에서 강건한 글루코스-반응성 인슐린-분비 세포를 초래한 iPEC 집단이 생산된다. 하기 표 11은 iPSC를 iPEC (추후에 생체내에서 글루코스-반응성 섬 세포로 성숙됨)로 분화시키는 것으로 입증된, 헤레귤린의 존재 또는 부재 하의 기준선 조건을 기재한다. 기준선 조건은 헤레귤린이 단계 3 및 4에 첨가된 것을 제외하고는 본원의 실시예 1, 2 및 5, 뿐만 아니라 표 8에 기재된 것과 유사하였다. 30 ng/mL의 Hrg1β가 사용되었지만, 10 ng/mL 내지 50 ng/mL 범위이거나 또는 심지어 50 ng/mL를 초과하는 농도가 적절하다. 또한, rho-키나제 억제제인 Y-27632의 첨가가 실시예 2에서 기재된 바와 같은 분화 배양물에서 유지되었다.
<표 11>
iPSC로부터 유래된 췌장 내배엽 세포 (PEC)를 제조하기 위한 기준선 및 헤레귤린 분화 배지 제제의 비교
Figure pct00035
iPSC Aggs: iPSC 응집체; KSR: 녹-아웃 혈청 (라이프 테크놀러지스); F10: 10 ng/mL bFGF (R&D 시스템즈); A10: 10 ng/mL 액티빈 A (R&D 시스템즈); A100: 100 ng/mL 액티빈 A; r0. 2FBS: RPMI 1640 (미디어테크); 0.2％ FBS (하이클론), 1× 글루타맥스-1 (라이프 테크놀러지스), 1％ v/v 페니실린/스트렙토마이신; ITS: 1:5000 또는 1:1000로 희석된 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (라이프 테크놀러지스); A100: 100 ng/mL 재조합 인간 액티빈 A (R&D 시스템즈); K25: 25 ng/mL 재조합 인간 KGF (R&D 시스템즈); CTT3: 0.25 μM KAAD-시클로파민 (토론토 리서치 케미컬즈) 및 3 nM TTNPB (시그마-알드리치); N50: 50 ng/mL 재조합 인간 노긴 (R&D 시스템즈); K50: 50 ng/mL 재조합 인간 KGF (R&D 시스템즈); E50: 50 ng/mL 재조합 인간 EGF (R&D 시스템즈); Y10: 10μM Y-27632; 스톡 20 mM, 2000×; H30: 30 ng/mL 헤레귤린 (스톡 100 ug/mL); db, DMEM (고-글루코스)
헤레귤린 또는 헤레귤린 및 rho-키나제 억제제를 단계 3 및 4 세포 하위집단에 첨가하는 것의 효과를 결정하기 위해, iPEC 집단을 유동 세포측정법으로 분석하였다. 표 12는 표 11에 기재된 제제, 뿐만 아니라 액티빈 농도를 200 ng/mL로 증가시킴으로써 변형된 이같은 제제를 사용한 다양한 iPEC 집단의 유동 세포측정법 분석의 요약을 제공한다. 또한, 표 12는 각각의 실험 세트에 사용된 일반적인 조건 (헤레귤린의 존재 또는 부재 하의 기준선) 및 iPEC 집단 내의 세포 유형 (내분비, 비-내분비, PDX1 단독 및 삼중 음성 또는 나머지 세포 하위집단)의 상대적인 백분율을 나타낸다. 표 12는 각각의 실험에서 생산된 세포의 생체내 기능에 관한 데이터를 또한 개시한다.
<표 12>
헤레귤린으로 처리된 iPS-유래 세포 배양물로부터의 iPEC 조성
Figure pct00036
BL, 기준선 조건; hIPSC, 인간 유도형 만능 줄기 세포; Hg30, 30 ng/mL 헤레귤린-1; St 3+4, 단계 3 및 4; hESC, 인간 배아 줄기 세포, CHGA, 크로모그라닌 A
특정 조건 하에, PEC (hESC, E2354) 및 iPEC (E2314, E2344, E2347) 집단 내의 세포들의 하위집단의 비가 변경되었다. 예를 들어, 때때로, 기준선 (헤레귤린 없음) 조건에 비교하여 내분비 (CHGA+) 세포의 백분율이 감소되었고, 비-내분비 세포 (CHGA-/NKX6.1+/PDX1+)의 백분율이 증가되었다. 헤레귤린이 이러한 PEC 및 iPEC 집단에서의 비-내분비 세포에 대해 상대적인 내분비 세포의 비율을 변화시키는 것을 담당하는 것으로 보였지만, 실험 #2380 (E2380)에서는, 내분비 (CHGA+) 세포의 수준이 헤레귤린 첨가로 감소되기 보다는 증가되었다.
PEC 및 iPEC 집단의 조성의 변화가 생체내 기능에 영향을 미쳤는지 여부를 결정하기 위해, 표 12에 기재된 실험 대부분으로부터의 PEC 및 iPEC 이식편을 실질적으로 본원에서, 그리고 상기 문헌 [Schulz et al. (2012)] 및 [Kroon et al (2008)] 및 상기 미국 특허 번호 7,534,608; 7,695,965; 7,993,920 및 8,278,106를 포함하는 출원인의 다른 특허 및 비-특히 간행물에서 앞서 기재된 바와 같이 마우스 내로 이식하였다. 간략하게, PEC 및 iPEC 집단을 생체분해성인 반투과성 세포 캡슐화 장치 (이들 중 일부는 미세 천공을 포함하였다)로 전체적으로 캡슐화하였다. 이러한 장치는 출원인에 의해 제조되었고, 미국 특허 번호 8,278,106 (영문 명칭이 "ENCAPSULATION OF PANCREATIC CELLS FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS"이고, 2009년 11월 13일에 출원됨)에 상세하게 기재되어 있다. 글루코스 자극 인슐린 분비 (GSIS) 검정법을 이식 약 56일 후에 시작하여 수행하였다. 글루코스 투여 전 (공복), 및 글루코스 투여 후 30분 및/또는 60분의 조합에 혈액을 수집하였다. 글루코스 투여에 반응하여 혈청 내의 인간 C-펩티드 농도를 측정함으로써 이식편 기능을 평가하였다.
혈청 내로 방출된 인간 C-펩티드의 양은 방출된 인슐린의 양을 가리킨다. C-펩티드는 기능성 베타 또는 인슐린 분비 세포에 의해 분비되는, 프로인슐린 및 프리프로인슐린의 A 및 B-사슬을 연결 또는 링크하는 아미노산 31개의 짧은 펩티드이다. 상기 문헌 [Kroon et al. (2008)] 등에서 앞서 논의된 바와 같이, 인간 C-펩티드 치수는 이식된 세포에 의한 디 노보(de novo)-생성 인슐린의 방출을 평가하는데 적합하다. 따라서, 이러한 동물의 혈청 내의 인간 C-펩티드의 수준은 성숙 PEC 및 iPEC 이식편의 생체내 기능의 척도이다. 적어도 이식 후 8주까지 혈청에서 인간 C-펩티드가 검출되었다. 추가적인 주 동안의 이식 및 공복 동안, 글루코스-자극 C-펩티드 수준이 증가되었고, 이때 C-펩티드의 피크 수준이 글루코스 투여 후 60분에서 30분으로 이동하였으며, 이는 인슐린 세포가 성숙함에 따른 글루코스 챌린지에 대한 더욱 신속한 반응을 가리킨다. 기능을 나타내지 못하거나 또는 건강 불량으로 인해 희생된 몇몇 마우스가 있었다; 그러나, 이러한 마우스들은 다르게는 고-기능성 동물을 나타낸 코호트 내에 있었고, 따라서 이식된 세포의 분화 및 기능성 불능보다는 생착 실패를 시사한다.
도 7a-c는 E2344를 제외한 표 12에 지시된 모든 실험에 대한 글루코스 투여 후의 혈청 내의 인간 C-펩티드 수준을 나타낸다. 도 7a-c는 기준선 대조군과 비교하여, 헤레귤린 처리로부터 초래된 이식편들이, 일반적으로, 혈청 인간 C-펩티드 수준이 더 높다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 도 7a에서, 실험 2380에서, 헤레귤린 없이 제조된 것들 (기준선)과 비교하여 헤레귤린 처리로부터 초래된 이식편에서 약 5배의 증가가 있다 (글루코스 투여 60분 후 933 pM : 200 pM). 실험 2354 (도 7c)가 기준선 대조군과 비교하여 헤레귤린 처리로부터 초래된 이식편에서 더 높은 수준의 혈청 C-펩티드를 나타내지 않기 때문에, 헤레귤린은 hESC로부터 생산된 PEC에 대한 효과가 더 적은 것으로 보인다. 또한, hESC (CyT203)로부터 유래된 PEC 및 iPSC로부터 유래된 iPEC를 비교했을 때, iPEC 이식편은 PEC 이식편에 필적하는 생체내 기능이 있다 (예를 들어, 도 7a 및 도 7b (iPSC 이식편)를 도 7c (CyT203 hESC)와 비교한다). 따라서, iPEC 이식편은 PEC 이식편만큼 강건하다. 또한, iPEC 집단 중 일부 (예를 들어 E2314, E2347 및 E2354)에 영향을 미친 것으로 보인 내분비 대 비-내분비 세포의 상대적인 비가 생체내 기능에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았는데, 이는 내분비 및 비-내분비 하위집단에서의 동일한 이동이 없는 E2380 또한 양호한 기능을 나타냈기 때문이다 (도 7a-c 참조).
글루코스-자극 인슐린 분비에 대해 테스트되는 것에 더하여, 숙주 동물의 베타 세포가 파괴된 경우에, 성숙 iPEC 이식편이 이들 단독이 hESC로부터 유래된 PEC에 의해 유지되는 정상혈당과 유사하게 정상혈당을 유지할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 테스트되었다. 이는 이식된 마우스의 베타 세포를 베타 세포 독소인 스트렙토조토신 (STZ)을 사용하여 파괴하는 것을 수반하였고, 이는 인간 베타 세포와 비교하여 마우스 베타 세포에 대해 더 큰 세포독성을 나타낸다. 무작위 비-공복 혈액 글루코스를 각각의 마우스에 대해 STZ-처리 전 및 후에 측정하였다. STZ 처리 후의 제13일에 iPEC 이식편을 체외이식했을 때, 고혈당 (혈액 글루코스 스파이크를 주지한다)이 재개되었고, 이는 내인성 마우스 췌장보다는 iPEC 이식편에 의한 당혈증의 제어를 입증한다 (도 8a 및 도 8b 참조).
또한, 헤레귤린 및 rho-키나제 억제제가 분화의 단계 1-4 동안 제공되었을 때 상승작용성 효과가 있는 것으로 보였다 (표 11 참조). 예를 들어, rho-키나제 억제제 없이 단계 3 및 4에 헤레귤린으로 처리된 iPSC는 이식을 불가능하게 만든 시각적으로 불량한 세포 덩이를 초래하였다. 헤레귤린 및 rho-키나제 억제제의 상승작용에 대한 추가적인 지지가 일부 실험, 예를 들어 rho-키나제 억제제만 있는 기준선 조건이 rho-키나제 억제제 및 헤레귤린이 있는 이식편만큼 강건하게 기능하지 않은 E2356, E2380에서 명백하였다 (도 7a 및 b 참조). 헤레귤린만 첨가하는 것은 이식을 위한 불충분한 세포 질량을 제공하였고, rho-키나제 억제제만 첨가하는 것 (기준선 조건)은 생체내 기능이 불량하였기 때문에, 헤레귤린 및 rho-키나제 억제제로의 처리는 부가적이지 않은 것으로 보인다. 따라서, 헤레귤린만 또는 rho-키나제 억제제만 제공하는 것은 2가지가 조합된 것의 합계 효과와 실질적으로 유사하지 않다. 즉, 어느 하나 단독으로는 생체내에서 강건한 글루코스 반응성이 초래되지 않지만, 조합되었을 때는 이들이 hES-유래 세포의 것과 유사한 글루코스 반응성을 일으킨다. 따라서, 헤레귤린 및 rho-키나제 억제제 양쪽 모두를 제공하는 것은 이들의 조합 효과가 개별적으로 각각의 효과의 합계보다 더 크기 때문에 상승작용성인 것으로 보인다. 즉, rho-키나제 억제제 및 헤레귤린으로 처리된 iPEC가 생체내에서 성숙되어 글루코스-자극 인슐린 분비를 나타냈고, 당뇨병 마우스 모델에서 정상혈당을 유지시킬 수 있었다 (도 7a-b 및 도 8a-b 참조).
ERBB 기능성은 리간드 결합, 수용체 이량체화, 및 수용체 트래피킹(trafficking)을 필요로 한다. 각각의 프로세스에서의 가변성이 수용체 및 이들이 제어하는 하류 신호의 상이한 조절을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 별개의 ERBB 리간드들이 상이한 친화력으로 ERBB 수용체에 결합하고, 이에 의해 ERBB 이량체 형성의 패턴 및 역학을 변경시킨다. 표 13은 리간드 및 수용체 결합 복합체의 다수의 가능한 상이한 조합을 나타낸다. 이러한 시스템의 복잡성에 관한 리뷰가 문헌 [Oda, et al. (2005) A comprehensive pathway map of epidermal growth factor receptor signaling, Mol. Syst. Biol., 1 (2005)] 및 [Lazzara et al. (2009) Quantitative modeling perspectives on the ERBB system of cell regulatory processes, Experimental Cell Research 315(4):717-725]에서 제공된다.
<표 13>
ERBB 수용체 티로신 키나제 및 이의 리간드
Figure pct00037
ERBB 수용체 티로신 키나제 : ErbB1 (Her1, 또는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)로 또한 명명됨); ErbB2 (인간 표피 성장 인자 수용체, 또는 Her2로 또한 명명됨; 또는 Neu); ErbB3 (Her3으로 또한 명명됨), ErbB4 (Her4로 또한 명명됨), ERBB 리간드: EGF, 표피 성장 인자; TGFα, 전환 성장 인자 α; HB - EGF, 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자; EPR, 에피레귤린; EPG, 에피겐; AR, 암피레귤린, Hrg1, 헤레귤린-1 또는 뉴레귤린-1; Hrg2, 헤레귤린-2 또는 뉴레귤린-2; Hrg3, 헤레귤린-3 또는 뉴레귤린-3; Hrg4, 헤레귤린-4 또는 뉴레귤린-4; 헤레귤린은 뉴레귤린과 상호교환가능하게 사용된다.
후오타리(Huotari) 등은 글루카곤 (알파) 세포를 희생시켜 소마토스타틴 (델타) 세포의 수를 증가시키는 것에 의해 뉴레귤린-4가 내분비 세포 하위집단의 상대적인 수준을 조정할 수 있다는 것과 뉴레귤린-4가 외분비 (예를 들어, 아밀라제) 대 내분비 (예를 들어, ß-인슐린, α-글루카곤, δ-소마토스타틴, PP-췌장 폴리펩티드) 세포의 비에 영향을 미치지 않았다는 것을 제안하였다. 그러나, 이러한 연구들은 E12.5일 마우스로부터 수득된 온조직 장기 조직 배양물 상에서 뉴레귤린-4를 인큐베이션함으로써 수행되었다. 이러한 마우스 체외이식편 세포 집단은 본원에 기재된 단계 3 (예를 들어 PDX1 음성 앞창자 내배엽) 및/또는 단계 4 (PDX1 양성 앞창자 내배엽) 세포 집단보다 더 분화되었다. 뉴레귤린-4는 ERBB4 RTK에만 결합하여, 이러한 상황에서 온조직 마우스 배양물의 내분비 하위집단만 뉴레귤린-4에 의해 조정될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 단계 3 (PDX1 음성 앞창자 내배엽) 및/또는 단계 4 (PDX1 양성 앞창자 내배엽) 세포를 상이한 ERBB 리간드, 예를 들어 Hrg1로 처리하는 것은 후오타리에서와 같이 상대적인 내분비 하위집단을 조정할 것으로 예상되지 않을 것인데, 이는 Hrg1이 ERBB3에 결합하고 ERBB2/3의 이량체화를 유도하는 것으로 이미 나타났기 때문이다. 그러나, 도 6에 나타난 바와 같은 PEC에서의 ERBB2 및 3의 저수준 발현으로 인해, 단계 3 및 4 유형 세포가 저수준 또는 고수준의 ERBB2 및 3을 발현하여 Hrg1에 결합할 것인지 여부는 불명확하였다.
또한, 다른 상황에서, 출원인은 Hrg1이 ERBB 2/3에 결합하였고 만능 줄기 세포의 자가 재생을 촉진하였음을 기재하였다 (문헌 [Wang et al. (2007)] 참조). Hrg1이 단계 3 및 4의 상황에서 동일한 능력으로 작용할 수 있는 것이 가능하지만, 출원인은 PEC 생산을 위한 세포 확장의 대부분이 만능 줄기 세포 단계 (단계 0)에서 발생한다는 것을 기존에 기재하였다. 단계 0 동안, 약 2주 동안 hESC이 성장, 계대 및 확장된다. 따라서, 대부분의 세포 확장 또는 세포 확장을 일으키는 자가 재생은 단계 1-4 동안 발생하지 않는다. 상기 문헌 [Schulz et al. (2012)]을 참조한다. 또한, ERBB2/3이 단계 3 및 4 동안 존재한다고 가정하면, 헤레귤린이 지향성 분화에 영향을 미치는 것과 대조적으로 만능 줄기 세포와 동일한 효과 (자가 재생)를 지니는 것으로 예상할 수 있다. 기능에서의 차이는 상황, 즉 만능 줄기 세포 대 내배엽 또는 췌장-계통 세포 유형에 의존하는 것으로 보인다.
요약하면, 헤레귤린 또는 헤레귤린 및 rho-키나제 억제제를 시험관내에서 앞창자 내배엽 (단계 3) 및 PDX1 발현 췌장 내배엽 세포 (단계 3의 마지막 및 단계 4)에 제공하는 것은 PEC 및 iPEC 집단을 생산하였고, 이들은, 이식되었을 때, 생체내에서 글루코스 반응성 인슐린-분비 세포로 성숙 및 발생된다 (도 7 및 8 참조). 헤레귤린 또는 헤레귤린 및 rho-키나제 억제제의 이같은 사용이 본원에서 최초로 보고되었다. 이같은 사용 및 효과는 특허 또는 비-특허 문헌에서 기존에 기재된 것들로부터 인식할 수 없다.
실시예 8
액티빈이 췌장 내배엽 세포 ( PEC ) 배양물에서의 NGN3 발현 및 내분비 계통으로 수임된 세포의 생산을 억제한다
췌장 내배엽 세포 또는 "PEC"는 2개의 독특한 하위집단으로 주로 구성되는 췌장 세포 집단이다: (i) 생체내에서 글루코스-반응성 인슐린-분비 베타 세포를 초래하도록 발달 및 성숙되는 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-) (이하 "비-내분비 (CHGA-)"); 및 (ii) 생체내 성숙 동안 기타 비-인슐린 분비 또는 섬 지지 세포를 초래할 수 있는 내분비 계통으로 수임된 세포의 하위집단 (CHGA+) (이하 "내분비 (CHGA+)"). 비-내분비 (CHGA-) 하위집단은 CHGA 음성이고, 주로 PDX1 및 NKX6.1 양성인 반면, 내분비 계통으로 수임된 세포의 하위집단은 CHGA 양성이고, 대부분 PDX1 및 NKX6.1 음성이다. 비-내분비 (CHGA-) 하위집단은 생체내에서의 인슐린 (C-펩티드에 대한 ELISA에 의해 검정되는 바와 같음) 반응의 전신 검출을 허용하는 양으로 글루코스-반응성 인슐린 분비 베타 세포로 발달 및 성숙되는데 약 8 내지 12주 이상이 걸린다. 그러나, 정상적인 배아 발생 동안 글루코스-반응성 세포가 생체내에서 발달 및 성숙되는 것은 8주 미만이 걸린다. 따라서, (1) 비-내분비 (CHGA-) 하위집단이 증가된 PEC 집단, 및/또는 (2) 시험관내에서 글루코스-반응성이고/이거나 발생 면에서 진행된 집단인 진정한 내분비 (CHGA+) 세포 집단 (예를 들어, 정확하게 특정되고, 생체내의 유사한 췌장 집단에 대해 기재된 것과 일관되는 특정 서명 마커가 있음), 및/또는 (3) 생체내에서의 발달 및 성숙 기간의 시간을 단축 및/또는 감소시킬 수 있는 선조 세포 집단을 수득하는 것이 여전히 바람직하다.
첫 번째 목표와 관련하여, 생체내에서 천연적으로 발생하는 것과 유사하게 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)로의 분화가 억제되는 동시에 비-내분비 (CHGA-) 하위집단이 무손상으로 유지되는 PEC 집단을 수득하는 것이 바람직하다. 하기의 실시예는 이같은 PEC 집단의 생산 방법을 기재한다.
정상적인 생체내 발달 동안, 전사 인자인 뉴로제닌-3 (NGN3)이 내분비 세포 발달의 마스터 조절인자이고, 예를 들어 생체내의 췌장 내배엽-계통 세포에서, PDX1 및 NKX6.1의 상향 조절 이후까지 NGN3의 발현이 발생하지 않는 것으로 여겨진다. 문헌 [Rukstalis and Habener (2009), Neurogenin3: A master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration, Islets 1(3): 177-184] 참조. 표 8에 따르면, 단계 3에서, 레틴산 (RA) 또는 레티노이드 유사체, 4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]벤조산 또는 "TTNPB" (또는 표 8의 "TT3")가 PDX1 발현을 유도하는데 사용된다. 그러나, 동시에, 레틴산은 내분비 특정을 개시하는 NGN3 발현을 또한 조기에 유도한다. 따라서, 단계 3 및/또는 단계 4 동안의 NGN3의 억제, 억압 또는 저해가 PEC 내의 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+) 하위집단을 최소화하는 것 및/또는 시험관내 및/또는 생체내에서 더 이후의 발달 단계에 내분비 세포를 수득하는 것에 하나의 비결을 제공할 수 있다. 중요하게, NGN3의 임의의 억제제, 억압제 또는 저해제는 동시에 비-내분비 (CHGA-)를 억제, 억압 또는 저해하지 않아야 하고, 바람직하게는 시험관내에서의 PEC 생산 동안 이러한 하위집단을 증가시킨다.
다양한 성장 인자가 단계 3 및 4 동안 NGN3과 같은 유전자의 발현을 억제하는 능력에 대해 탐구되었다. 한 후보 성장 인자는 줄기 세포 확장 분화에서 다양한 기능이 있는 액티빈이었다. 예를 들어, 낮은 수준 (예를 들어 10 ng/mL)에서, 액티빈은 만능 줄기 세포 만능 및 세포 증식을 유지하는 것을 돕는다. 더 높은 수준 (예를 들어 100 ng/mL)에서는, 액티빈이 단계 1에서 확정적 내배엽 생산을 담당하는 분화 성장 인자로서 작용한다 (예를 들어, 표 8 참조). PEC 생산 동안 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)를 억압하는 것에 대한 이의 효과를 테스트하기 위해, 출원인은 먼저 표준 부착 분화로 약 50 ng/mL의 중간 수준 농도에서 액티빈을 테스트하였다. 이러한 수준에서, 액티빈은 PEC에서 PDX1 및 NKX6.1 유전자 발현을 억제하지 않으면서 NGN3 발현을 억제할 수 있었다 (도 9d-e를 도 9a-b와 비교한다). 그러나, 동일한 수준의 액티빈이 단계 3 동안 더욱 규모조정가능한 세포 응집체 현탁 배양물과 함께 사용되었을 때, 전체적인 세포 질량이 극적으로 감소되었고, 일부 경우에는 세포 응집체가 근절되었다 (도 10의 대조군 대 액티빈 처리 세포 응집체를 비교한다). 세포 응집체의 유사한 감소가 50 ng/mL과 같이 25 ng/mL의 액티빈의 경우에 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음).
이러한 결과를 고려하여, 더 낮은 농도의 액티빈 (예를 들어 5 ng/mL 및 10 ng/mL)이 단계 3 및 4에서 테스트되었다. 도 11에 제시된 바와 같이, 더 낮은 액티빈 농도에서, 세포 응집체가 대조군과 비교하여 세포 질량 및 수율을 유지할 수 있었다 (제8일의 도 11B-C 및 제12일의 도 11B-D를 d8 및 d12에 대한 도 11A, 대조군에 비교한다). 따라서, 약 25 ng/mL 미만의 액티빈 수준이 세포 질량 및 수율을 유지시키는데 허용가능한다. 그 후, 출원인은 이러한 세포배양물에 대한 유동 세포측정법 분석을 수행하여, 단계 3 및 4 동안의 낮은 수준의 액티빈에 세포 응집체 조성에 대한 임의의 효과가 있었는지 여부를 결정하였다; 표 14 참조. 표 14는 낮은 수준의 액티빈이 비-내분비 (CHGA-) 하위집단의 생산을 감소시키지 않고, 단계 3 및 4 양쪽 모두에 처리가 적용된 경우, 실제로 이러한 하위집단을 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다 (표 14 A5 단계 3&4 결과 참조). 그러나, 매우 유사한 백분율의 내분비 (CHGA+) 세포가 액티빈의 존재 및 부재 하에 나타나는 것을 생각하면 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)로의 분화가 여전히 유도되고 있는 것으로 보인다 (표 13의 내분비 열을 참조한다). 따라서, QPCR로 관찰된 바와 같이 액티빈이 NGN3 및 NKX2.2 발현을 억제 또는 저해할 수 있지만, 단계 4 마지막에 분석되었을 때, 더 낮은 수준에서는 (세포 질량이 유지되게 함), 내분비 계통으로 수임된 하위집단 (CHGA+)을 감소시키지 않는다. 유리하게는, 특히 액티빈이 단계 3 및 4에서 사용된 경우에, 대조군과 비교하여 PDX1 단독 및 삼중 음성 하위집단이 감소된다.
<표 14>
낮은 액티빈 수준이 PEC 비-내분비 하위집단을 유지시킨다
Figure pct00038
실시예 9
액티빈 , 헤레귤린 및 WNT가 PEC 배양물 내의 내분비 계통으로 수임된 세포의 생산을 억제한다
실시예 8은 단계 3 및 4 동안의 중등도 수준의 액티빈 (예를 들어, 50 ng/mL)이 NGN3 발현을 억제 또는 억합할 수 있었지만 (도 9), 이러한 동일한 수준은 세포 질량을 유지시키지 않았다는 것을 나타냈다. 더 낮은 수준의 액티빈 (예를 들어, 5 및 10 ng/mL)이 세포 질량을 유지시킬 수 있었지만 (도 11), 단계 4 동안 내분비 분화를 계속 억압하는데는 충분하지 않았는데, 내분비 계통 세포 (CHGA+)의 백분율이 대조군 (표 14, CHGA+ 열) 및 이전의 실시예에서 기재된 것과 실질적으로 유사하게 유지되었기 때문이다. 따라서, 이러한 낮은 수준에서 주로 단계 3 동안 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)로의 분화를 억제하는 것이 충분하지 않은 것으로 보이는데, 단계 4를 통한 이러한 하위집단의 분화의 계속된 억제가 여전히 필수적인 것으로 생각되기 때문이다. 상기 문헌 [Rukstalis et al. (2009)] 참조. 따라서, 동시에 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단의 생산에 영향을 미치지 않고 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)의 분화를 억제하면서, 세포 상실 및 수율을 방지할 수 있는 (즉, 중등도 내지 고도의 액티빈 수준의 효과를 대항할 수 있는) 추가적인 성장 인자가 탐구되었다.
단계 3 및 4 동안의 30 ng/mL의 헤레귤린이 종종 PEC의 내분비 (CHGA+) 및 비-내분비 (CHGA-) 하위집단의 상대적인 수준을 변화시키는 것을 기재한 상기 실시예를 고려하여, 출원인은 헤레귤린 농도를 감소시키는 것이 액티빈과 조합되었을 때 PEC 생산에 어떠한 효과가 있을지를 테스트하였다.
단계 3 동안 2 ng/mL 또는 10 ng/mL의 헤레귤린과 함께 액티빈이 10 ng/mL 또는 20 ng/mL로 포함되었고, 단계 4 동안 액티빈이 5 ng/mL로 감소되었으며, 이때 헤레귤린은 2일 동안은 1 ng/mL이었고, 그후에는 10 ng/mL였다는 것을 제외하고는, 표 8에 따른 표준 프로토콜을 사용하여 만능 줄기 세포가 분화되었다. 도 12 (제10일 영상; 상부 패널)에 나타난 바와 같이, 10 ng/mL의 액티빈 및 2 ng/mL의 헤레귤린은 대조군과 비교하여 세포 상실을 나타냈다 (상부 패널의 도 12A 및 B를 비교한다). 헤레귤린은 여전히 2 ng/mL로 마찬가지이면서 액티빈을 20 ng/mL로 증가시키는 것은 세포 상실을 악화시켰다 (상부 패널의 도 12B 및 C를 비교한다). 그러나, 더 높은 농도의 액티빈 (20 ng/mL)에서의 더 높은 세포 상실의 방지가 20 ng/mL의 액티빈의 상황에서 헤레귤린을 10 ng/mL로 상승시키는 것에 의해 가능하였다 (상부 패널의 도 12 D 및 C를 비교한다). 따라서, 헤레귤린 수준이 너무 낮은 경우, 유의한 세포 상실이 관찰되지만, 헤레귤린 수준이 상승된 경우, 예를 들어 적어도 20 ng/mL인 경우, 내분비 계통 (CHGA+) 하위집단과 비교하여 비-내분비 세포 (CHGA-)의 백분율의 변화가 있다.
정량적 PCR 분석을 수행하여 액티빈 및 헤레귤린의 상기 조합으로의 분화 제8일, 제10일 및 제12일의 유전자 발현의 상대적인 수준을 결정하였다 (도 13). 실시예 8 (도 9)에서 나타난 것과 유사하게, 10 및 20 ng/mL의 액티빈이 NKX6.1 발현을 감소시키지 않으면서 NGN3 및 NKX2.2 (또 다른 내분비 분화 마커)를 억압할 수 있었다 (도 13a 및 b를 c의 것에 비교한다). NKX6.1 발현이 여전히 높다는 사실은 비-내분비 (CHGA-) 하위집단의 생산이 변화가 없거나 또는 영향을 받지 않는다는 것을 가리킨다. 그러나, 구체적으로, 20 ng/mL의 액티빈 및 10 ng/mL의 헤레귤린, 또는 10 ng/mL 액티빈 및 2 ng/mL의 헤레귤린에서, 액티빈이 25 ng/mL 및 50 ng/mL로 사용되었을 때 이전에 관찰된 액티빈-의존적 세포 상실 (도 10)이 더욱 감소되었다 (도 12 D & E, 상부 패널). 따라서, 단계 3에서의 액티빈 사용에 의해 원래 관찰된 세포 상실을 헤레귤린이 효과적으로 대항하는 것으로 보인다. 그리고, 일부 NGN3 및 NKX2.2 유도가 여전히 발생하지만 (즉, 실시예 8에서의 부착-기반 분화에서 50 ng/mL의 액티빈이 단계 3 및 4에서 사용되었을 때 관찰된 바 (도 9)와 같이 고도로 억압되지 않지만), 표준 조건과 비교하여 유의하게 감소되었다 (도 13a 및 b의 대조군 조건 및 A20H10 조건을 비교한다).
20 ng/mL보다 높은 액티빈이 마커 NGN3 및 NKX2.2를 추가로 억압할 것이고, 따라서 더욱 더 많은 내분비 분화를 억압할 것이지만, 더 높은 수준의 헤레귤린이 고농도에서의 액티빈의 용량 효과를 상쇄하도록 세포 질량을 유지하는데 요구될 것이다. 그러나, 상기 실시예에서 기재된 바와 같은 더 높은 수준의 헤레귤린은 PEC의 내분비 (CHGA+) 및 비-내분비 (CHGA-) 하위집단의 상대적인 생산을 변화시킬 수 있다. 아직도, NGN3 발현의 억압에 대한 더 높은 수준의 액티빈의 효과가 아직 요망되었다. 따라서, 출원인은 WNT, FGF, PDGF, 레틴산 (RA 또는 TTNPB), BMP, 헤지호그, EGF, IGF 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 전방 및 후방 내배엽 운명을 초래할 수 있고 발생의 다른 측면을 제어할 수 있는 추가적인 성장 인자 또는 형태원을 탐구하였다.
특히, Wnt3A를 단계 3 및/또는 4의 액티빈 및 헤레귤린 분화 배지 내로 첨가하는 것에 의해 정규 Wnt 신호전달 경로에 영향을 미치는 것이 탐구되었다. 또 다시, 임의의 조합은 동시에 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단에 영향을 미치지 않으면서, NGN3 및 NKX2.2 발현의 억압을 통해 관찰되는 바와 같이 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)의 분화를 억제할 필요가 있고, 양호한 세포 질량 (즉, 제한된 세포 질량 상실)을 유지할 필요가 있다. 테스트된 한 이같은 혼합물은 단계 3에 10 ng/mL의 액티빈 및 2 ng/mL의 헤레귤린이 50 ng/mL의 Wnt과 함께 있는 것이었고, 상기와 같이, 단계 4 동안, 2일 동안은 5 ng/mL의 액티빈 + 1 ng/mL의 헤레귤린이었고, 그후에는 5 ng/mL의 액티빈 및 10 ng/mL의 헤레귤린이었다. 이는 동일한 농도의 액티빈 및 헤레귤린만 있는 것보다 더 큰 세포 (PEC) 질량 (상부 패널의 도 12D 및 E를 비교한다), 및 심지어 대조군보다 더 큰 세포 질량 (상부 패널의 도 12A 및 E를 비교한다)을 초래하였다. 이러한 조건 (예를 들어, 단계 3의 액티빈, 헤레귤린 및 Wnt 및 단계 4의 액티빈 및 헤레귤린의 조합) 하에서의 세포 응집체의 QPCR 분석은 단계 3 및 4, 특히 제8일, 제10일 및 제12일에서의 감소된 NGN3 및 NKX2.2 발현 (도 13 a 및 b)에 의해 관찰되는 바와 같이 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+) 분화의 유의한 억제가 있었음을 나타냈다. 그러나, NKX6.1 발현이 초기에는 제8일에 억압된 반면 제10일 및 제12일 (단계 4)에 유의하게 상승되었다 (도 13c). 따라서, 비-내분비 (CHGA-) 하위집단의 발달이 Wnt의 첨가로 손상되지 않았고, 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)의 분화가 지연 또는 억제되는 것으로 보였으며, 명백한 세포 질량 손실이 없었다.
단계 3 동안의 액티빈, 헤레귤린 및 Wnt의 조합으로의 PEC 집단의 세포 조성을 결정하기 위해, 유동 세포측정법을 단계 4 후에 수행하였고, PEC 세포 조성이 표 14에서 제시된다. 제시된 바와 같이, 조합된 성장 인자 (액티빈, 헤레귤린 및 Wnt, 또는 "AHW")가 표준 프로토콜 (표 8) 하의 대조군 세포 배양물과 비교하여 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)의 분화를 이러한 하위집단의 감소된 백분율 (15.6 대 58.8)에 의해 관찰되는 바와 같이 효과적으로 감소시킨 한편, 비-내분비 (CHGA-) 하위집단을 증가시켰다 (58.1 대 23.4). 유동 세포측정법으로부터의 데이터는 3가지 인자의 조합 (AHW)이 비-내분비 (CHGA-) 하위집단의 생산에 영향을 미치지 않으면서 PEC 내의 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)의 분화를 일반적으로 지연 또는 억제시켰다는 QPCR로부터의 데이터를 지지하고 이와 일관된다. 시험관내에서의 이러한 유전자들의 지연된 발현은 생체내 포유동물 췌장 발생에서의 이들의 개시 (또는 지연)과 일관되어, 내분비 분화에서의 NGN3 발현은 비-내분비 (CHGA-) 하위집단에서의 PDX1 및 NKX6.1 발현의 개시 이후에 발생한다. 추가적으로, PEC 질량 및 수율에서의 절충이 없었다.
<표 15>
단계 3에서의 액티빈, 헤레귤린 및 Wnt (AHW)가 내분비 하위집단을 감소시키고 비-내분비 (CHGA-) 하위집단을 증가시킨다
Figure pct00039
액티빈, 헤레귤린 및 Wnt의 조합물을 사용한 결과를 고려하여, 액티빈이 사용될 수 있는 농도의 범위를 확립하기 위해 단계 3에서 액티빈 수준을 다시 적정하였다. 테스트된 액티빈 농도는 단계 3 동안의 50 ng/mL의 Wnt 및 5 ng/mL의 헤레귤린과 함께 약 0, 25, 50, 75 및 100 ng/mL 범위였다. 단계 4 동안 액티빈은 5 ng/mL로, 헤레귤린은 5 ng/mL로 감소되었고, Wnt는 포함되지 않았따. 단계 4의 마지막 (제13일)에 세포가 영상화되었고, 도 12 (하부 패널)에서 제시된다. 더 높은 액티빈 농도, 예를 들어 75 내지 100 ng/mL에서 세포 상실이 다시 명백하였다 (도 12D & E, 하부 패널). 중요하게, 단계 3에 WNT를 포함하는 것이 세포 상실로 인해 가능할 것보다 더욱 더 높은 농도의 액티빈을 단계 3에서 사용하는 것을 허용하였다.
단계 4 동안의 계속된 액티빈 및 헤레귤린의 효과를 테스트하기 위해, 단계 3의 액티빈, 헤레귤린 및 Wnt의 상황에서, 3가지 조건을 사용하여 인간 ESC가 분화되었다: (i) 표준 프로토콜 (표 8; 또는 표 17의 1번 프로토콜 참조); (ii) 단계 3의 액티빈 (75 ng/mL), 헤레귤린 (5 ng/mL) 및 Wnt (50 ng/mL)의 조합에 표준 단계 4 인자들이 이어짐; 및 (iii) 단계 3의 액티빈 (75 ng/mL), 헤레귤린 (5 ng/mL) 및 Wnt (50 ng/mL)의 조합에, 단계 4 동안 추가적인 액티빈 (5 ng/mL) 및 헤레귤린 (5 ng/mL)이 이어짐 (표 17 참조). 3가지 조건 모두에 대해 단계 4 후에 유동 세포측정법을 수행하였고, PEC 세포 조성이 표 17에서 제시된다. 단계 3의 AHW는 대조군과 비교하여 내분비 계통으로 수임된 세포를 감소시키고, 비-내분비 (CHGA-) 하위집단 함량을 증가시키며 (내분비 계통으로 수임된 세포 하위집단에 대해 21.8 대 42.2; 비-내분비 (CHGA-) 하위집단에 대해 40.1 대 27.6), 단계 4의 추가적인 AH 처리는 내분비 계통으로 수임된 세포를 추가로 감소시키고, 비-내분비 (CHGA-) 하위집단 함량을 추가로 증가시킨다 (내분비 계통으로 수임된 세포에 대해 6.46 대 21.8; 비-내분비 (CHGA-) 선조 하위집단에 대해 72.7 대 40.1).
<표 16>
단계 3 및 4의 액티빈, 헤레귤린 및 Wnt가 내분비 하위집단을 감소시키고 비-내분비 (CHGA-) 하위집단을 증가시킨다
Figure pct00040
실시예 10
액티빈 , 헤레귤린 및 WNT 조합물을 사용하여 생산된 PEC 이식편은 생체내에서의 글루코스 반응성 기능이 개선되었다
실시예 9는 형태학 (예를 들어, 분화된 세포 응집체의 저배율 현미경 영상), QPCR 및 유동 세포측정법 데이터를 기초로, 액티빈, 헤레귤린 및 Wnt의 조합물 ("AHW")이 NGN3 및 NKX2.2 발현의 억압에 의해 관찰되는 바와 같이 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+) 분화를 효과적으로 억압할 수 있고, 비-내분비 (CHGA-) 하위집단을 유지 또는 증가시킬 수 있는 한편, 동시에 세포 질량 또는 수율에 대한 해로운 효과가 없거나 또는 이를 개선시키는 것으로 보인다는 것을 나타냈다. 이러한 변화가 글루코스-반응성 인슐린 분비 세포의 궁극적인 발달 및 성숙에 대한 효과가 있는지를 결정하기 위해, 표 8에 따른 표준 프로토콜 또는 표 17의 1번 프로토콜로부터 제조된 PEC와 함께, AHW-유래 PEC 응집체를 동물 내로 이식하였다.
구체적으로, 단계 3에 3가지 인자의 조합물 (AHW)을 사용하고, 단계 4에 액티빈 및 헤레귤린만 사용하여, 인간 만능 줄기 세포가 분화되었다. 실질적으로 표 8에 따라 PEC가 제조되었다. 세포 응집체를 도 14에 제시된 바와 같이 제8일, 제10일, 제12일 및 제14일에 QPCR로 분석하였다. 대조군 및 변형 AHW 프로토콜 양쪽 모두 NKX6.1 발현에 의해 관찰되는 바와 같이 PEC를 생산하였지만 (도 14a), 제14일에 (단계 4 후에) AHW를 사용하면 더욱 강건한 NKX6.1 발현이 있다. 동시에, 대조군 프로토콜과 비교하여, 특히 제8일에, NGN3 발현의 억압에 의해 관찰되는 바와 같이 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)의 분화가 AHW 프로토콜로 고도로 억제되었다 (도 14b).
양쪽 방법으로부터의 PEC 응집체를 이전에 기재된 바와 같이 분화 제14일에 출원인의 특허권이 있는 이식가능한 반투과성 캡슐화 장치에 로딩하고 SCID-베이지 마우스 내로 이식하였다 (AHW 및 대조군 방법 각각에 대해 n = 동물 5마리, n = 총 10마리). 이식 11주 후에, AHW 프로토콜을 사용하여 생산된 PEC는 글루코스 챌린지 1시간 (60') 후에 평균 약 900 pM의 C-펩티드인 한편, 대조군 PEC는 평균 약 400 pM의 C-펩티드였다. AHW 동물 대 대조군을 비교하는 도 15를 참조한다. 구체적으로, 이식 11주 후에, AHW 이식편이 있는 마우스 5마리 중 3마리가 평균 1200 pM 초과의 인간 C-펩티드인 한편 (도 15, 동물 번호 3514, 3516, 및 3518), 대조군 동물의 C-펩티드 수준은 유의하게 더 낮았다. 실제로, 대조군 동물 5마리 중 1마리만 수준이 600 pM에 가까웠다 (도 15, 동물 번호 3524). 따라서, C-펩티드 수준을 기초로, 이식 11주 후에, 글루코스 자극 후의 인간 C-펩티드 수준에 의해 측정된 바와 같이, AHW 프로토콜은 생체내에서의 기능이 적어도 2배 개선된 PEC 집단을 생산할 수 있었다. 이는 잠재적으로 더 빠른 성숙 시간과 상호관련된다.
이식 14주 후에, AHW PEC 이식편은 계속 대조군 이식편을 능가하였고, 인슐린 분비 반응 시간이 더 빨랐는데, 이는 AHW PEC 이식편에 대한 글루코스 챌린지 30분 후의 C-펩티드가 대조군 이식편에 대한 챌린지 60분 후의 값보다 더 높았기 때문이다 (도 16). 구체적으로, 평균 약 2300 pM이었지만 글루코스 챌린지 60분 후인 상위 3마리의 대조군 동물과 비교하여, AHW PEC 이식편이 있는 동물 4마리 중 3마리가 글루코스 챌린지 30분 후에 평균 3500 pM 초과의 C-펩티드였다 (도 16). 이러한 데이터는 더 잘 수행하거나 (즉, 이식된 AHW-유래 PEC 생착물로부터의 더욱 신속한 글루코스 반응성을 가리키는 글루코스 챌린지 30분 후의 증가된 혈청 C-펩티드 수준) 또는 연구된 시점에 표준 PEC 프로토콜보다 잠재적으로 더욱 강력한 PEC 집단을 3가지 성장 인자의 조합물 (AHW)을 사용하는 분화가 생산할 수 있다는 것을 입증한다. 본원을 어느 한 이론에 제한하지 않으면서, AHW PEC 이식편에서의 증가된 효능은 AHW 조합물이 (1) PEC 내의 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)의 분화를 지연시키거나 억압하였고, (2) PEC 내의 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단을 증가시켰으며, (3) 양호한 세포 질량을 유지시켰다는 사실에 기인하는 것으로 여겨진다.
실시예 11
시험관내의 췌장 내분비 세포 배양물
실시예 9 및 10은 단계 3 및 4의 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)의 분화의 의도적인 지연, 억압, 억제 또는 저해를 기재한다. 시험관내에서 발생적으로 진행된 내분비 세포 전구체 또는 내분비 세포를 생산하기 위한 노력으로, 출원인은 단계 5, 6 및/또는 7 동안의 다양한 방법을 테스트하였다. 예를 들어, 출원인은 어떤 성장 인자가 단독으로 또는 조합되어 내분비 분화를 자극 또는 유도할 수 있는지, 즉 NGN3 발현을 유도할 수 있는지를 테스트하였다.
하기의 표 17은 PEC를 생산하기 위한 표준 프로토콜 (1번 프로토콜) 및 AHW PEC를 생산하는데 사용된 프로토콜 (2번 프로토콜)과 함께 내분비 생산을 위한 다양한 방법을 요약한다. 표 17의 3번 프로토콜은 특정 일수 및 단계의 다수의 성장 인자를 가리키지만, 모든 성장 인자가 단독으로 또는 조합되어 정확한 지시된 일수/단계에 사용되어야 하지는 않다는 것을 출원인이 테스트하였고, 통상의 기술자는 이러한 것을 이해할 것이다. 따라서, 표 17은 출원인이 테스트한 다수의 반복 (예를 들어, 성장 인자, 기간 등)을 나타낸다.
<표 17>
시험관내에서 PEC 및 내분비 세포를 생산하는 방법
Figure pct00041
Figure pct00042
hESC Agg.: hESC 응집체; XF HA: 10％ v/v의 제노-프리 녹아웃 혈청 교체물, 1％ v/v 비-필수 아미노산, 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 1％ v/v 페니실린/스트렙토마이신 (모두 라이프 테크놀러지스), 10 ng/mL 헤레귤린-1b (페프로테크) 및 10 ng/mL 액티빈 A (R&D 시스템즈)가 보충된, 글루타맥스를 함유하는 DMEM/F12; SP: 스템프로® hESC SFM (라이프 테크놀러지스); r0.2FBS: RPMI 1640 (미디어테크); 0.2％ FBS (하이클론), 1× 글루타맥스-1 (라이프 테크놀러지스), 1％ v/v 페니실린/스트렙토마이신; cb: CMRL: CMRL 1066, 1× 글루타맥스, 1％ v/v 페니실린/스트렙토마이신, 2％ B-27; db: 0.5× B-27 보충물 (라이프 테크놀러지스), 1× 글루타맥스, 및 1％ v/v 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 하이 글루코스 (하이클론); A100, A50, A5: 100 ng/mL, 50 ng/mL, 5 ng/mL 재조합 인간 액티빈 A (R&D 시스템즈); BMP20, BMP10: 20 ng/mL, 10 ng/mL BMP4 (페프로테크); CTT3: 0.25 mM KAAD-시클로파민 (토론토 리서치 케미컬즈) 및 3 nM TTNPB (시그마-알드리치); E50: 50 ng/mL 재조합 인간 EGF (R&D 시스템즈); H10, H5: 10 ng/mL, 5 ng/mL 헤레귤린1b; IGF25: 25 ng/mL IGF2 (페프로테크); ITS: 1:5000 또는 1:1000 희석된 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (라이프 테크놀러지스); IV: 2.5 mM TGF-b RI 키나제 억제제 IV (이엠디 바이오사이언스); K50, K25: 50 ng/mL, 25 ng/mL 재조합 인간 KGF (R&D 시스템즈, 또는 페프로테크); MG0.05: 0.05％ 매트리겔 (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)); N50: 50 ng/mL 재조합 인간 노긴 (R&D 시스템즈); NC10: 10 mM 니코틴아미드; PDGF10: 10 ng/mL 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF, R&D 시스템즈); RO1: 감마-세크레타제 억제제, RO4929097, 1 mM; SHH100: 100 ng/mL 소닉 헤지호그; TTNPB1: 1 nM TTNPB (시그마-알드리치); W50: 50 ng/mL 재조합 마우스 Wnt3A (R&D 시스템즈); Y10: 10 mM Y-27632 (토크리스 바이오사이언스(Tocris Bioscience))
기존에, 출원인은 미국 특허 번호 8,129,182 (영문 명칭이 "ENDOCRINE PROGENITOR/PRECURSOR CELLS, PANCREATIC HORMONE EXPRESSING CELLS AND METHODS OF PRODUCTION"이고, 2012년 3월 6일 허여됨)에서 내분비 선조/전구체의 생산을 위한 감마 세크레타제 억제제의 용도를 개시하였다. '182 특허에 기재되고 청구된 바와 같이, 내분비-계통을 향한 PDX1 양성 췌장 내배엽 세포 분화를 더 유도하기 위해, 노치 신호전달을 억제한 성장 인자 또는 작용제가 해명되었다. 이는 감마 세크레타제의 억제제 (예를 들어 DAPT 또는 N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르 및 관련된 유사체)의 적용에 의해 달성되었다. 감마-세크레타제 억제제는 노치 분자의 막내 절단을 차단함으로써, 활성화된 노치 세포내 도메인의 방출을 방해한다. 감마 세크레타제 억제제 DAPT를 2일 내지 4일 동안, 예를 들어, 레틴산 첨가 마지막 날에 또는 레틴산 회수 직후에 적용하는 것이 NGN3 발현을 유도하는데 사용되었다. 이때, 또 다른 감마-세크레타제 억제제인 RO44929097이 단계 5 동안 사용되었다. 표 17 참조.
표 17에서 지시된 바와 같이, 내분비 계통으로의 분화 및/또는 내분비 계통의 성숙을 구동시키기 위해, 단계 6 및 7 동안, BMP4 ("BMP"), 소닉 헤지호그 ("SHH"), 혈소판-유래 성장 인자 ("PDGF"), FGF2 ("FGF"), 레틴산 및/또는 레틴산 유사체 예컨대 TTNPB ("TTNPB"), 인슐린-유사 성장 인자 I (IGF-I 또는 "IGF1") 및 -II (IGF-II 또는 "IGF2"), 비타민 B3 유도체, 니코틴아미드 ("NC") 또는 이러한 성장 인자들 중 하나 이상의 조합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 성장 인자들의 조합물이 적용되었다. 한 이같은 조합물이 표 17의 3번 프로토콜에 기재되어 있다.
예를 들어, 실질적으로 상기 실시예 10에서 기재된 바와 같이 AHW 프로토콜로부터 제조된 PEC를 표 17의 3번 프로토콜에 따라 전형적으로 2일 동안 1 μM의 감마-세크레타제 억제제 RO4929097 ("R01")로 단계 5 (제13일 및 제14일)에 추가로 처리하였다. 이러한 단계 5 처리는 NGN3 발현, 그리고 이어서 내분비 분화의 유도를 초래한다. 추가적으로, NGN3 발현 또는 내분비 분화를 또한 유도하도록 니코틴아미드가 단계 5 및 6 동안 포함되었다. 단계 4 후 (제13일 배양물), 단계 5 후 (제15일 배양물), 및 단계 6 2일 후에 mRNA의 나노스트링 검출에 의해 NGN3 유전자 발현이 분석되었다. 도 17에 제시된 바와 같이, 감마-세크레타제 억제제가 단계 4 마지막 (제13일)의 NGN3의 저수준 발현에 비교하여 단계 5 후에 제15일에 NGN3 발현을 강력하게 유도하였다. 제15일 (단계 6의 첫날)에 감마-세크레타제 억제제를 제거한 후에, NGN3 발현이 제17일에 관찰되었을 때 감소되었다 (도 17). 단계 5 동안의 NGN3 발현의 이러한 일시적인 증가는 생체내 베타 세포 발달 동안 관찰된 이의 일시적인 발현과 일관된다. 상기 문헌 [Jorgensen et al. (2007)] 참조.
임의의 단계에 대한 총 일수가 변할 수 있고, 변하며, 예를 들어, 단계 5, 6 및/또는 7이 일수 면에서 짧아지거나 길어질 수 있다는 것에 주의한다. 이는 더 이전의 단계 1, 2, 3 및 4에 또한 적용된다.
추가적으로, rho-키나제 억제제가 세포-생존 및 세포 질량 및 수율을 촉진하기 위해 단계 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7 중 어느 하나 동안 분화 배지에 지속적으로 또는 간헐적으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 단계 1, 2 및 4의 rho-키나제 억제제는 예를 들어 세포 질량 및 수율의 유지에 의해 유도형 만능 줄기 세포 분화를 촉진하는 것으로 보인다.
또한, 약 제20일 (즉, 표 17의 3번 프로토콜의 단계 6 및 7 사이의 시기)에, 세포 응집체가 해리 및 재응집될 수 있다. 이러한 해리 및 재응집은 특정 세포 하위집단을 제거하여, 주로 내분비 및/또는 내분비 선조/전구체/선조 (CHGA+) 세포 집단을 남겼다. 이러한 물리적인 조작은 또한 내분비 집단의 분석을 용이하게 하고, 필요하다면 정제 단계를 구성한다. 더 많은 상세사항에 대해 실시예 14를 참조한다.
또한, 단계 6에서 시작하여 단계 7까지, 필요하다면, 매우 낮은 농도, 예를 들어 약 0.05％의 매트리겔이 세포 응집체를 유지시키고/시키거나 내분비 세포가 세포 응집체로부터 이동하는 것을 방지하는 것을 돕는데 사용될 수 있다. 매트리겔 또는 임의의 기타 복합 세포 매트릭스의 사용은 구체적인 세포 응집체 자체 (예를 들어 PEC 응집체, 하기 기재된 바와 같은 내분비 선조/전구 세포 응집체 등)에, 그리고 잠재적으로는 세포 응집체가 유래된 PSC 세포주에 좌우될 수 있다. 기타 복합 매트릭스 또는 규정 매트릭스, 예를 들어 혈청, 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 및 기타 세포외 매트릭스 단백질이 실질적으로 유사한 기능을 수행하는데 사용될 수 있는 것이 가능하다. 더 많은 상세사항에 대해 실시예 14를 참조한다.
인슐린-유사 성장 인자 (IGF) 1 및/또는 2 (IGF1 또는 IGF2)의 첨가가 단계 6 또는 7에 또는 단계 6 동안에, 예를 들어 제16일, 제17일 또는 제18일에 시작하여 첨가될 수 있다. 50 또는 200 ng/mL의 IGF1 또는 25 또는 100 ng/mL의 IGF2가 단계 6 동안, 구체적으로는 제17일에 약 3일 동안 세포 배양물에 첨가된 것을 제외하고는, 실질적으로 표 17에 따라 상기 기재된 바와 같이 만능 줄기 세포가 분화되었다. 단계 6 후에 (제20일), 나노스트링을 사용하여 세포 응집체를 mRNA에 대해 분석하였다. 이러한 예비 연구는 IGF1보다 IGF2가 INS 발현을 더 유도할 수 있었음을 나타냈지만 (데이터는 제시되지 않음), 더 긴 처리는 IGF2 단독 또는 IGF1 또는 2가지의 조합으로부터 더욱 강건한 효과를 일으킬 수 있었다.
표 17은 특정 농도의 다양한 성장 인자의 사용을 기재하지만, 통상의 기술자는 성장 인자 농도의 변형이 관련 기술분야에서 표준이고, 실제로 적어도 액티빈 및 헤레귤린 수준에서의 변화 및 세포 분화 및 조성에 대한 이들의 효과와 함께 상기 실시예에 기재되어 있다는 것을 인지할 것이기 때문에, 본 발명은 본원에 기재된 구체적인 농도에 제한되지 않는다. 본원에서의 변화는 5, 10, 20, 50 내지 100 ng/mL의 액티빈; 5, 25, 50 내지 75 ng/mL의 Wnt; 2, 5, 10, 30 ng/mL의 헤레귤린; 10 내지 200 ng/mL의 소닉 헤지호그 (SHH); 10 내지 100 ng/mL의 PDGF; 10 내지 20 ng/mL의 BMP; 2 내지 20 ng/mL의 FGF2; 및 25 내지 200 ng/mL의 IGF1 및/또는 IGF2를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가적으로, 이러한 인자들의 임의의 조합물이 사용될 수 있고, 기재된 발명을 벗어나지 않으면서 이들이 사용되는 단계 또는 기간이, 심지어 유의하게, 변할 수 있다.
실시예 12
췌장 내분비 세포의 생체내 기능
현재까지, PSC로부터 시험관내에서 생산된 내분비 세포의 강화 집단은 생체내에서 글루코스-반응성 인슐린-분비 베타 세포를 초래하지 않았다. 따라서, 출원인은 표 17에 따르고 상기 실시예 11에 기재된 상기 방법이 생체내에서 글루코스 반응성인 최초의 시험관내 내분비 세포를 생산할 수 있는지 여부를 테스트하였다.
인간 만능 줄기 세포가 단계 1-5에 대해서는 표 17의 3번 프로토콜에 따라 분화되었지만, 단계 6 및 7에는, FBS, 매트리겔 및 rho-키나제 억제제만 B-27 보충물이 있는 기재 DMEM 배지에 더하여 사용되었다. 단계 5 (d13) 및 6 (d15)을 시작할 때, 및 단계 6 (d20) 및 7 (d26)의 마지막의 시점에 나노스트링에 의해 RNA 발현을 분석하였다. 도 18a-d 및 19a-d는 PDX1, NKX6.1, SOX9, 및 PTF1A를 포함하는 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 마커, 및 인슐린 (INS), 글루카곤 (GCG), 소마토스타틴 (SST) 및 그렐린 (GHRL)을 포함하는 내분비 세포 마커에 대한 상대적인 mRNA 발현 수준을 나타낸다. 단계 4의 마지막 (제13일)에, PDX1, SOX9, NKX6.1 및 PTF1A가 모두 고도로 발현되었다. 이러한 마커들은 내분비 분화 또는 유도가 발생함에 따라 단계 5 동안 모두 감소되었다 (제15일). 그리고, 단계 6의 마지막 (제20일) 또는 단계 7을 시작할 때, PDX1, NKX6.1 및 PTF1A의 mRNA 수준이 감소된 한편, 동시에 INS, GCG, GHRL 및 SST의 mRNA 수준은 증가되고 있었다 (도 18a-d 및 도 19a-d, 제20일을 비교한다). 구체적으로, 단계 5 내지 6에 걸친 PDX1 및 PFT1A 발현의 감소 및 INS, GCG, GHRL 및 SST의 상대적인 mRNA 발현의 극적인 동반 증가는 단계 3 및 4의 액티빈, 헤레귤린 및 Wnt의 조합물 (AHW), 특히 액티빈에 기인한다. 즉, 단계 3 및 4에 액티빈을 포함하는 것이 단계 3 및 4의 내분비 분화를 억압한 한편, 단계 5의 감마-세크레타제는 단계 5, 6 및 7에서 내분비 분화를 유도하였다. 제시된 더 이전의 시점과 비교하여 제20일 및 제26일 (단계 6 및 7)의 유사한 수준의 NKX6.1 발현은 이러한 마커가 췌장 내분비 세포, 뿐만 아니라 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단에서 발현된다는 것과 일관된다. 따라서, 이후의 단계 (예를 들어 단계 5, 6 및 7)에서, 세포가 내분비 분화를 향해 지시된 한편, 이들이 이전 단계인 단계 3 및 4에서 동일하게 행하는 것이 억제되었다.
대략적으로 단계 6 후에, 세포 응집체가 해리 및 재응집되었고 (하기 실시예 14에 더욱 상세하게 기재됨), 이는 특정 PEC 하위집단, 예를 들어 비-내분비 (CHGA-) 세포를 포함하여 단계 3 및 4 동안 제조된 일부 세포 유형을 제거하였다. 비-내분비 (CHGA-) 하위집단 및/또는 외분비 및/또는 외분비 선조 세포 및/또는 관 및/또는 관 선조 세포의 제거를 재응집 후의 SOX9 및 PTF1A의 극적인 증가에 의해 볼 수 있다 (도 18, 제20일을 제26일과 비교한다). 단계 7 후, 내분비 세포를 제26일에 장치 내로 로딩하였고, 실질적으로 SCID-베이지 마우스 내로의 이식 (또는 삽입)에 대해 이전에 기재된 바와 같이 제27일에 RAG2 마우스 내로 이식하였다. 도 20은 공복 및 글루코스 투여 또는 챌린지 1시간 (60') 후의 혈청 인간 C-펩티드 수준을 나타낸다. 이식 10주 후에, 인간 혈청 C-펩티드에 의해 관찰된 바와 같이 5마리 동물 모두가 인슐린을 생산하고 있었다. 이식 15주 후에 (도 21), 모든 동물이 이식 10주 후 수준과 비교하여 증가된 수준의 인슐린 생산을 나타냈고, 5마리의 동물 중 2마리는 평균 1500 pM의 C-펩티드였으며, 이는 생체내에서의 강건한 글루코스 반응성의 증거이다.
제26일에 장치 내로 내분비 세포를 로딩하기 전에, 기능성 베타 세포가 단계 6 및 7로부터의 이식된 내분비 세포, 예를 들어, 임의의 잔존하는 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단으로부터 발달, 성숙 및 생성되었는지 아닌지를 확인하기 위해 샘플을 취하였다. 내분비 및 비-내분비 마커 양쪽 모두를 사용하는 면역세포화학을 샘플에 수행하였다. 제26일 샘플의 동결 절편을 DAPI (도 22a), NKX6.1 및 크로모그라닌 A (도 22b)를 사용하여 항체로 공동-염색하였다. 대부분의 NKX6.1 양성 (적색) 세포가 내분비 마커인 크로모그라닌에 대해 또한 양성으로 염색된다 (CHGA+)는 것이 명확하다. 따라서, 비-내분비 다능 췌장 선조 세포는, CHGA-/NKX6.1+ 세포의 결여로 제시되는 바와 같이, 이러한 내분비 세포 제제 내에 임의의 유의한 개수로 존재하지 않는 것으로 보인다.
이러한 동일한 내분비 세포 응집체의 샘플들이 INS, NKX6.1 및 PDX1에 대해 또한 공동-염색되었다 (도 23a-b). 도 23a-b는 대부분의 인슐린-발현 세포가 NKX6.1 및 PDX1을 또한 발현한다는 것을 나타냈다. PSC로부터의 시험관내-유래 인슐린 발현 세포가 NKX6.1 및/또는 PDX1을 공발현하지 않았다는 이전에 공개된 보고서를 생각하면 이는 뜻밖의 결과이다. 미국 특허 7,033,831 및 관련 출원 (제론 코포레이션) 및 문헌 [Jiang et al. (2007), Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells, Stem Cells 2007 Aug;25(8):1940-53. Epub 2007 May 17]을 참조한다.
총괄적으로, 이러한 데이터는 최초로, 시험관내 PSC-유래 내분비 세포 배양물이 (1) 시험관내에서 INS, PDX1 및 NKX6.1을 공발현하고, 시험관내에서 글루코스 반응성일 것이며; (2) 생체내에서 글루코스-반응성 인슐린-분비 세포를 초래할 수 있다는 설득력있는 증거를 제공한다.
실시예 13
레틴산 , 니코틴아미드 및 BMP가 내분비 세포에서의 PDX1 및 NKX6 .1 발현을 증가시킨다
성숙 베타 세포의 홀마크는 PEC의 비-내분비 (CHGA-) 하위집단에서 나타나는 수준과 비교하여 이들이 개별적인 세포 수준에서 NKX6.1 및 PDX1을 상향조절시킨다는 것이다. 실시예 11 및 12는 대다수의 세포가 PEC의 비-내분비 (CHGA-) 하위집단에 대해 관찰되는 것과 NKX6.1 및 PDX1 발현 수준이 유사한 내분비 세포 생산을 기재하였다. 따라서, 인슐린 양성 내분비 세포에서의 적어도 이러한 2개의 마커의 발현을 특이적으로 강화시키는 성장 인자를 확인하는 것이 바람직하다.
2개의 후보 인자는 레틴산 또는 레티노이드 유사체인 TTNPB, 및 전환 성장 인자-베타 슈퍼패밀리의 일부인 골 형태형성 단백질 패밀리의 구성원인 BMP4를 포함한다. TTNPB 및 BMP4를 다양한 조합으로 단계 6 및 7에서 다양한 농도로 테스트하였지만, 전형적으로는 각각 0.5 nM 및 10 ng/mL였다. 도 24에서의 나노스트링 mRNA 분석에 나타난 바와 같이, 단계 6 및 7의 BMP, 단계 7 단독의 BMP, 또는 TTNPB와 조합된 BMP는 동시에 인슐린 및 PDX1 발현을 증가시킬 수 있었다 (도 24a & c). 대조적으로, 동일한 단계 (단계 6 & 7, 및 단계 7 단독)에서의 TTNPB 단독은 PDX1 발현을 증가시키는 것으로 보이지 않았고, 심지어 BMP 단독과 비교하여 PDX1 발현을 약간 감소시키는 것으로 보였다 (도 24c의 칼럼 4 & 5를 칼럼 2 & 3과 비교한다). 모든 조건 (BMP 단독, TTNPB 단독, BMP 및 TTNPB 조합 각각을 단계 6 & 7, 또는 단계 7 단독에 처리함) 하에 NKX6.1 발현이 상대적으로 안정적이어서, NKX6.1 발현에 대한 BMP의 효과는 덜 명확하였다. BMP 특이성의 추가적인 지표로서, BMP는 BMP4를 포함하는 TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원에 의해 조절되는 것으로 공지된 분화 억제제 (ID) 유전자 발현 (예를 들어, ID1)을 상향 조절하는 것으로 또한 관찰되었다 (도 24d). 따라서, 본원을 어느 한 이론에 제한하지 않으면서, BMP가 PDX1, 및 ID1의 상향 조절을 선택적으로 유도하는 인자인 것으로 보인다.
이러한 마커 중 몇몇이 임의의 한 세포에서 공발현되었는지 여부를 결정하기 위해, 내분비 세포 응집체를 분화 제27일 (단계 7 후)에 고정시키고, 냉동 절편을 제조하고, C-펩티드, NKX6.1 및 PDX1에 대해 면역세포화학 (ICC)에 의해 염색하였다. 도 25-28 참조. 이때, INS로 염색하는 대신, 세포를 프로-인슐린의 중심 단편인 C-펩티드에 대한 항체로 염색하였고, 따라서 이러한 염색은 인슐린 발현 세포를 또한 가리킨다 (도 25). ICC 결과는 상기 나노스트링 데이터와 일관되었고, 즉 단계 6 및 7 또는 단계 7 단독의 BMP 단독 또는 TTNPB와 조합된 BMP가 인슐린 (C-펩티드) 발현 세포에서 PDX1 발현을 유도할 수 있었다 (도 25 및 26).
mRNA 데이터가 단독이거나 조합된 BMP 및 TTNPB가 NKX6.1 발현에 대한 효과가 거의 없었음을 시사하였다는 사실에도 불구하고, ICC 연구는 세포 수준에서, NKX6.1 및 C-펩티드 (또는 인슐린) 발현 세포의 공발현이 꽤 강건하다는 것을 나타냈고 (도 27 및 28), 즉 NKX6.1 염색이 밝았으며, 또한 종종 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단에서 관찰되는 것보다 더 밝았다. 따라서, NKX6.1 발현이 우세하게 C-펩티드 (또는 인슐린) 발현 세포와 공발현되는 것으로 보인다. 조합된 mRNA (나노스트링) 및 단백질 (ICC) 데이터는 특정 상황에서 최초로 세포 유형을 특성화하기 위해 1개의 방법만 사용하는 것에 한계가 있을 수 있다는 것을 또한 입증한다. 따라서, ICC 데이터는 단계 6 및 7 또는 단계 7 단독의 BMP 단독 또는 TTNPB와 조합된 BMP가 C-펩티드 (또는 인슐린) 발현 세포에서 PDX1 및 NKX6.1의 수준을 증가시킬 수 있었음을 입증하였다 (도 27 및 28). 2개의 인자가 조합되어 사용된 경우에 가장 강한 효과가 수득되지만, BMP 단독 또한 동일하게 가능할 수 있다. TTNPB 또한 독립적으로 PDX1 및 NKX6.1을 조절할 수 있다. 예를 들어, 단계 7 동안의 수 일, 예를 들어, 2일, 3일 또는 4일 동안의 TTNPB 처리가 BMP의 부재 하에 NKX6.1 발현을 유도할 수 있었다 (데이터는 제시되지 않음). 따라서, 이러한 성장 인자들의 사용은, 특히 TTNPB의 경우에, 시간 의존적일 수 있다.
구체적으로 니코틴아미드를 언급하면, 도 29는 단계 6 배양 조건에서의 니코틴아미드가 INS를 증가시키고 GCG 발현을 감소시켜, INS/GCG 발현비의 3배 증가를 초래한다는 것을 나타낸다. 니코틴아미드의 기능은 불명확하지만, 니코틴아미드가 PARP-1 (폴리 (아데노신 트리포스페이트 [ADP]-리보스) 폴리머라제-1)의 억제, 및 NAD+ 고갈을 방지하는 것에 의해 스트렙토조토신 처리로부터 초래된 설치류에서의 베타 세포 상실을 방지한다는 것이 보고되었다. 문헌 [Masiello, P. et al. (1998) Experimental NIDDM Development of a New Model in Adult Rats Administered Streptozotocin and Nicotinamide, Diabetes, 47(2):224-9] 참조. 니코틴아미드는 인간 태아 섬에서의 내분비 분화 및 인슐린 함량을 또한 증가시킬 수 있다. 문헌 [Otonkoski T. et al. (1993), Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells. J Clin Invest 92:1459-1466] 참조.
또 다시, 생체내의 성숙 베타 세포는 고수준의 PDX1 및 NKX6.1을 발현하고, 고수준의 PDX1 및 NKX6.1이 정확한 기능에 필수적이다. 따라서, BMP, 및 TTNPB와 조합된 BMP는, 인슐린 양성 세포에서의 양쪽 마커의 높은 발현을 유도하는 것에 의해, 최초로, 생체내에서만이 아니라 잠재적으로 시험관내에서도 글루코스-반응성인 내분비 세포를 제조할 수 있다는 것을 가리켰다.
앞서 언급된 바와 같이, 단계 6 및 7의 일수는 엄격하지 않고, 짧아지거나 심지어 길어질 수 있으며, 통상의 기술자는 이를 인지할 것인데, 단계 6 및 7에 대한 5일 및 10일 각각이 쉽게 조작될 수 있기 때문이다; 특히, 실질적으로 동일한 성장 인자가 본원에 기재된 바와 같이, 그리고 표 17에 따라 사용되는 경우에 그러하다.
실시예 14
매트리겔이 단독으로 또는 rho 키나제 억제제와 조합되어 PEC 및 내분비 세포 응집체의 세포 부착을 개선시킨다
상기 실시예 11에서, 세포 응집체가 단계 6과 7 사이에 해리 및 재응집 또는 재회합되었다. 실질적으로 상기 문헌 [Schulz et al.]에 기재된 바와 같이, 해리는 제20일 또는 대략 제20일에 아큐타제를 사용하여 수행되었고, 회전 배양에서 재응집되었다. 상기 문헌 [Kelly et al. (2011)]에 더욱 상세히 기재된 바와 같이 재응집은 임의의 나머지 비-내분비 (CHGA-) 하위집단을 포함하는 특정 PEC 하위집단, 뿐만 아니라 기타 비-내분비 세포를 제거한다. 내분비 세포는 서로에 대한 친화력이 있지만, 시험관내에서의 이러한 상호작용은 비교적 약하고, 단계 6/7의 재응집된 세포조차도 느슨하게만 회합되었다. 따라서, 다양한 인자 및 작용제를 내분비 세포 응집체 내의 세포-대-세포 상호작용을 증가시키는 이들의 능력에 대해 테스트하기 위해 연구가 수행되었다.
rho-키나제 억제제인 Y-27632 및 희석된 매트리겔 (0.05％ v/v)의 첨가가 재응집된 내분비 세포 응집체의 더욱 단단한 세포 회합을 촉진할 수 있었다는 것이 발견되었다. Y-27632 및 매트리겔의 조합은 적어도 예를 들어 세포 응집체의 세포-대-세포 상호작용을 어느 한쪽 성분 단독보다 증가시켰다.
제20일의 실질적으로 실시예 12에 기재된 바와 같이 생산된 분화된 배양물을 아큐타제로 해리시키고, db + 5％ FBS (더 낮은 농도의 FBS, 즉 2％ 또는 1％ 또한 효과적임) 및 DNAse에서 재응집시켰다. Y-27632는 재응집 배지에 포함되지 않았는데, 이는 그렇게 하는 것이 새롭게 형성된 응집체 내로의 비-내분비 (CHGA-) 하위집단, 뿐만 아니라 기타 비-내분비 세포의 혼입을 초래할 것이기 때문이었다. 다음날 및 이후의 각각의 날에, 세포 응집체를 Y-27632 또는 매트리겔 또는 양쪽 성분으로 처리하였다. 도 30에 나타난 바와 같이 응집 1일, 2일 및 3일 후에 입체현미경 영상을 찍었다. 도 30은 매트리겔, Y-27632 및 db-FBS의 조합이 가장 효과적이었음을 나타낸다. 이러한 조합은 db-FBS를 단독으로 또는 db-FBS 및 매트리겔 또는 db-FBS 및 Y-27632를 사용하는 것보다 더욱 효과적이었다 (도 30a-d를 비교한다). 조합된 작용제들을 사용한 세포 응집체는 모든 다른 샘플보다 형태학적으로 더 단단한 것으로 나타났다 (도 30D). 작용제들이 세포-대-세포 접촉 및 세포와 매트릭스 간의 상호작용을 개선시킬 것이지만; FBS 부재 하에 매트리겔 및 Y-27632만 있는 추후의 실험이 동일한 결과를 제공하였다. 이러한 더 단단한 세포 응집체는 더욱 형태학적으로 장기 조직과 유사한 것으로 보인다. 이는 세포 응집체가 회전 배양, 장치 내로의 로딩, 운송을 위한 취급의 스트레스를 더 양호하게 견딜 수 있고, 시험관내 및 생체내 발달 및 성숙이 개선될 수 있는 것 등이므로 유리하다.
실시예 15
노긴 없음이 내분비 세포 함량이 제한되고 PEC 집단의 분획화 또는 정제를 필요로 하지 않는, 비-내분비 다능 선조 하위집단에 대해 강화된 PEC를 생산한다
상기 기재된 바와 같이, 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단 (CHGA-)에 대해 고도로 강화되었지만 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)가 상대적으로 충분한 PEC 집단 (단계 4)의 생산이 바람직하다. 이같은 세포 집단은, 예를 들어, 이의 내분비 계통 세포로의 분화를 특이적으로 유도하는 분자 또는 조건을 스크리닝하는데 유용할 수 있다. 이러한 활성이 있는 화합물은 생체내에서 또는 생체 외에서 췌장 베타 세포를 포함하는 내분비 세포를 생성시키기 위한 재생 의학 용도에 유용할 수 있다. 더욱 복합적인 세포 혼합물로부터의 특정 세포 집단의 분획화 및 정제는 세포 사망 및 기타 이유로 인해 효율 상실이 부수적인 것으로 공지되어 있기 때문에, 효율적인 지향성 분화 단독을 통해, 따라서 정제 단계를 필요로 하지 않으면서 원하는 표현형에 대한 고도로 강화된 세포 집단을 제조할 수 있는 것이 이롭다.
단계 3의 3일 동안, 4가지 상이한 조건이 비교된 것을 제외하고는 실질적으로 단계 1-4에 대한 표 17의 1번 프로토콜 및 상기 문헌 [Schulz et al. (2012)]에 기재된 바와 같이 미분화 인간 ESC가 확장 및 분화되었다: (i) 3일 모두 동안 0 노긴 ("노긴 없음"); (ii) 50 ng/mL의 노긴 1일 및 추가적인 노긴이 없는 2일; (iii) 50 ng/mL의 노긴 2일 및 추가적인 노긴이 없는 1일; 및 (iv) 50 ng/mL의 노긴 3일. 단계 3 후에, 이러한 조건 (i) 내지 (iv) 각각에 표 8 및 표 17에 따른 표준 단계 4 분화 배지 칵테일이 제공되었지만, 추가적인 노긴은 없었다. 단계 4 후의 유동 세포측정법 분석은 노긴 없음이 5％ 미만의 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)가 있는 90％ 초과의 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단을 생산하였음을 입증하였다. 표 17 참조. 또한, 각각의 추가적인 노긴 처리일로, 더 적은 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단이 생산되었다 (노긴 없음의 90.6％을 3일 노긴 처리의 64.6％와 비교한다). 반대로, 각각의 추가적인 노긴 처리일은 내분비 계통으로 수임된 세포 (CHGA+)의 생산 수준을 증가시켰다.
<표 18>
증가된 노긴 기간이 PEC의 내분비 대 비-내분비 세포 하위집단에 영향을 미친다
Figure pct00043
단계 4 후 (제12일)의 세포 배양물의 QPCR 분석은 각각의 추가적인 노긴 처리일로 NKX2.2 및 INS를 포함하는 내분비 계통 마커 발현의 수준 증가가 있었음을 나타냈고 (도 31b 및 d), 이는 표 18의 유동 세포측정법으로부터의 데이터와 일관된다. 대조적으로, NKX6.1 (및 PDX1)을 포함하는 비-내분비 다능 췌장 선조 하위집단에 대한 마커 유전자의 발현 수준은 임의의 노긴 처리 기간에 대해 상대적으로 풍부하였다.
실시예 16
단계 7에서 췌장 계통 유전자의 발현을 조정하는 작용제
다음으로, 췌장 계통 유전자 발현의 임의의 추가적인 조정인자가 있는지 여부를 평가하였다. 실시예 13 및 14에 기재된 것과 실질적으로 유사한 분화 방법을 수행하였다 (즉 단계 3의 AHW, 단계 4의 AH, 단계 5의 감마 세크레타제 및 rho-키나제 억제제, 단계 6 및 7의 매트리겔 및 rho-키나제 억제제). 또한, 단계 7 동안 제30일-제35일에 BMP, 노긴, FGF1, FGF2, FGF7, EGF, Hrg, HGF, SCF, 또는 TTNPB를 포함하는 기타 작용제들을 유전자 발현을 조정하는 이들의 능력에 대해 테스트하였다. 확장된 단계 7의 마지막 (d35)에 RNA 발현을 나노스트링으로 분석하였다. 도 32a-c는, 도 24에서 제시되고 실시예 13에서 상세히 기재된 데이터와 일관되게, BMP가 INS, PDX1 및 ID1의 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸다. BMP는 또한 GHRL 발현을 감소시켰다. FGF1 (산성 FGF)은 GCG 및 SST를 상향조절하였다. 놀랍게도, 단계 7의 제30일-제35일의 FGF2는 다른 호르몬 유전자 (예를 들어, INS, GCG, GHRL)의 동반 저해 또는 억제와 함께 SST 발현의 유의한 증가를 초래하였다 (도 32b, SST 패널).
이러한 연구들은 특정 작용제들이 이러한 더욱 분화/수임된 세포의 유전자 발현, 따라서 세포 배양물 분화 및 생성된 세포 유형을 여전히 조정하고 영향을 미칠 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 17
세포 배양물의 해리 및 재응집이 비-내분비 ( CHGA -)를 감소시키고 정확하게 특정된 내분비 ( CHGA +) 하위집단을 증가시킨다
세포 배양물의 해리 및 재응집이 재응집되었을 때 특정 세포 하위집단의 존재를 효과적으로 고갈 또는 감소시킬 수 있고, 결과적으로 재응집이 특정 세포 하위집단을 강화하는데 사용될 수 있다는 것이 기존에 언급되었다. 하위집단, 이러한 경우에는 내분비 (CHGA+) 하위집단이 강화된 재응집된 세포 배양물의 효과 (존재한다면)를 결정하기 위해 연구가 디자인되었다. (실시예 14 참조).
분화 방법은 단계 7 전 (d20)의 hES-유래 세포 응집체의 해리 및 재응집을 포함하여 실시예 14에 기재된 것과 실질적으로 유사하였다. 도 33a-c는 PTF1A, SOX9, PDX1 및 NKX6.1 (도 33a)를 포함하는 마커 조합물을 사용한 나노스트링 분석에 의해 입증되는 바와 같이, 재응집된 세포 배양물에서 비-내분비 (CHGA-) 하위집단이 유의하게 감소되었음을 나타내는 단계 7 후 (약 d29)의 RNA 분석을 나타낸다. 도 33b 또한 재응집이 INS, GCG, 췌장 폴리펩티드 (PPY), GHRL, 용질 운반체 패밀리 30 구성원 8 (SLC30A8), 글루코스-6-포스파타제 2 (G6PC2), 프로호르몬 컨버타제 1 (PCSK1) 및 글루코키나제 (GCK)를 포함하는 내분비 및 췌장 섬 세포 마커의 증가를 초래하였음을 나타낸다.
단독으로, 이러한 마커들은 다른 세포 유형에서 관찰되고, 예를 들어, PTF1A는 외분비 세포에서, SOX9는 관 세포에서, PDX1 및 NKX6.1은 베타 세포에서 또한 발현된다. 따라서, 출원인은 임의의 한 마커 발현의 유의성을 결정하기 위한 기준물로서 다양한 PE, 내분비 및 섬 마커로부터의 데이터를 수득하였다. 그리고, 4개의 PE 및 비-내분비 (CHGA-) 마커가 검정되었지만 (PTF1A, SOX9, PDX1 및 NKX6.1), PTF1A 및 SOX9 하위집단만 단계 7의 마지막 (약 d25, d26, d27, d28, d29, d30 및 이를 초과하는 일수)에 재응집된 세포 배양물로부터 고갈되었다. 대조적으로, 베타 세포 및 췌장 내분비에서 또한 관찰된 PDX1 및 NKX6.1 발현은 단계 7 후에 여전히 높았다. 도 33a 참조.
유사하게, SLC30A8, G6PC2, PCSK1 및 GCK를 포함하는 다른 내분비 (예를 들어 베타 및 알파 세포) 마커가 해리 및 재응집되지 않은 배양물 (또는 "비-재응집")과 비교하여 d20 재응집 세포 배양물에서 더 높은 발현 수준으로 관찰되었다. 도 33c 참조. SLC30A8는, 예를 들어, 인슐린 분비와 관련된 아연 수송체이고, SL30A8의 특정 대립유전자는 2형 당뇨병이 발달될 위험을 증가시킬 수 있으며; 글루코스-6-포스파타제 2 (G6PC2)는 췌장 섬에서 발견되는 효소이고; 프로호르몬 컨버타제 1 (PCSK1)은, PCSK2와 함께, 췌장 섬에서 프로인슐린을 인슐린으로 프로세싱하고; 마지막으로 글루코키나제 (GCK)는 글루코스의 글루코스-6-포스페이트로의 인산화를 용이하게 하고, 간, 췌장, 장 및 뇌 내의 세포에서 발현되고, 이러한 장소에서 글루코스 센서로 작용하고, 식사 후에 또는 공복 시에 발생하는 바와 같은 글루코스 수준 상승 또는 하락에 반응하여 대사 또는 세포 기능의 이동을 촉발함으로써, 탄수화물 대사를 조절한다. GCK의 돌연변이는 이상 형태의 당뇨병 또는 저혈당을 야기할 수 있다. 단계 7의 이러한 마커들의 발현 증가는 세포 배양물의 해리 및 재응집이 효과적으로 비-내분비 (CHGA-) 하위집단을 고갈 또는 감소시키고 내분비 (CHGA+) 하위집단을 증가시킨다는 것을 가리킨다. 따라서, 출원인은 이제 생체내 기능을 위해 시험관내의 정확하게 특정된 내분비 세포를 생산하는 방법을 더 정련하였다.
단계 1-7 세포 배양물의 유동 세포측정법 분석에서, 상기와 같은 세포 배양물의 해리 및 재응집이 세포의 비-내분비 (CHGA-) 하위집단 또는 PE 하위집단의 동반 감소와 함께 전체 내분비 하위집단을 증가시킨다는 것 (CHGA+ 세포의 강화)이 또한 확증되었다. 하기 표 19 참조.
<표 19>
재응집된 세포 배양물이 단계 7 후에 총 내분비 (CHGA+)를 증가시키고 비-내분비 (CHGA-) 하위집단을 감소시킨다
Figure pct00044
현재까지, 기능성 베타-세포는 생체내 이식 단계를 통해서만 분화될 수 있었고, 완전한 시험관내의 진실한 기능성 베타-세포는 기재되지 않았다. 문헌 [Zhou, et al. (2008), Nature 455, 627-632] 참조. 따라서, 최초로, 출원인은 10％ 미만의 비-내분비 세포 (CHIGA-)가 있고 정확하게 특정된 내분비 세포 (CHGA+)의 50％를 초과하는 시험관내 세포 집단을 입증하였다. 이같은 세포는 생체내에서 진실한 기능성 베타 세포 및 섬으로 발달 및 성숙될 수 있다; 하기 실시예 18 참조.
실시예 18
내분비 ( CHGA +) 하위집단으로부터의 생체내 인슐린 생산
실시예 17에 대한 후속 연구로서, 내분비 (CHGA+) 하위집단이 강화된 재응집된 세포 배양물의 생체내 효과 (존재한다면)을 결정하기 위한 연구를 수행하였다.
단계 7을 시작할 때쯤에 (약 d20), 배양물을 풀링(pooling)하고, 1) 해리 및 재응집된 세포 응집체 ("재응집된 세포 배양물") 및 2) 해리 및 재응집되지 않은 세포 응집체 (대조군)의 2개의 샘플로 분리한 것을 제외하고는, 상기 실시예 12-14 및 16 및 상기 문헌 [Schulz et al. (2012)]에 기재된 것과 실질적으로 유사하게 인간 만능 줄기 세포 배양물이 확장 및 분화되었다. 추가로, 양쪽 샘플은 BMP, RA 또는 RA 유사체인 TTNPB, 및 rho-키나제 억제제 및 0.05％ 매트리겔을 단계 7 (d20 내지 d28 세포 배양물) 동안 추가로 포함하였다. 샘플을 이식하기 전에, 나노스트링 및 유동 세포측정법 분석을 위해 샘플을 취하였다 (상기 표 19). 표 19는 약 d29의 재응집된 세포 배양물이 대조군보다 약 11％ 더 많은 내분비 (CHGA+) 하위집단을 함유하였음을 나타낸다. 중요하게, 재응집된 샘플은 재응집되지 않은 샘플보다 9.25％ 더 적은 비-내분비 (CHGA-) 또는 PE 유형 세포 (오직 1.45％)를 함유하였다.
2개의 샘플을 따로따로 출원인의 반투과성, 생체적합성 ENCAPTRA® EN20™ 약물 전달 장치 (동물 크기 연구 장치)에 로딩하여 캡슐화하고, 실질적으로 상기 실시예 10에 기재된 바와 같이 총 10마리의 SCID-베이지 마우스 내로 피하 이식하였다 (5마리의 동물에게 재응집된 세포 배양물을 제공하였고, 5마리의 동물에게 대조군 세포 배양물을 제공하였다).
도 34는 이식 21주 후 또는 생전의, 공복 후 (각각의 동물에 대해 3개의 막대 중 왼쪽에 첫번째), 글루코스 투여 또는 챌린지 30분 후 (30'; 두번째 막대) 및 1시간 후 (60'; 세번째 막대)의 혈청 인간 C-펩티드 수준을 나타낸다. 이식 21주 후 시점에, 2마리 (동물 번호 4317 및 4323; 각각의 코호트로부터의 1마리)를 제외한 모든 동물이 대부분 932 내지 2691 pM을 초과하는 인간 혈청 C-펩티드에 의해 관찰되는 바와 같이 강건한 수준의 인슐린을 생산하였다. 그러나, 자극 지수가 2개의 군 사이에서 비교되는 경우 (30' 또는 60' C-펩티드 혈청 수준과 공복 혈청 C-펩티드 수준 사이의 차이), 재응집된 세포 배양물과 대조군 코호트 사이에 생체내 기능에서의 유의한 차이가 없었다. 따라서, 이식된 배양물 또는 이식편이 약 98％ 내분비/CHGA+ 재응집 세포 배양물로 이루어졌든 또는 약 87％ 내분비/CHGA+ (대조군)로 이루어졌든, 양쪽 모두 생체내 기능이 있는 것으로 보인다. 따라서, 출원인은 시험관내 내분비 (CHGA+) 세포 집단 (정확하게 특정된 내분비 세포)이 이식되었을 때 생리학적으로 기능성인 인슐린 분비 세포를 초래할 수 있다는 것을 최초로 입증하였다.
따라서, 최초로, 출원인은 이식되었을 때 혈액 글루코스에 반응하여 인슐린을 분비하는 기능성 췌장 섬 세포로 발달 및 성숙되는 정확하게 특정된 내분비 세포의 시험관내 집단을 입증하였다. 추가로, 생체내 기능이 기존에 PEC에 대해 출원인에 의해 기재되고 상기 문헌 [Schulz et al. (2012)]에서 보고된 것과 유사하다. 또한, 정확하게 특정된 내분비 세포가 본원에 기재된 방법에 의해 단계 1-7을 통해 제조되는 한, 해리 및 재응집을 통한 내분비 세포의 추가적인 강화 (또는 비-내분비 세포의 고갈)가 생체내 기능에 필수적이거나 요구되지 않는 것으로 보인다. 본 발명의 이러한 측면은 지금까지 결코 입증된 적이 없었다. 지금까지는, 출원인 등은 내분비 세포 집단이 아니라 췌장 선조 집단 세포 집단을 사용하여 생체내 기능을 입증했을 뿐이었다. 실제로, 상기 문헌 [Kelly et al. (2011)]에 기재된 바와 같이, PEC 또는 췌장 선조 제제의 내분비 (CHGA+) 하위집단은 생체내 기능을 초래하지 않았다.
실시예 19
내분비 세포를 배양하기 위한 복합 기본 배지
복합 기본 배지 예컨대 CMRL 및 RMPI가 섬 세포를 배양하고 섬 세포 질량을 보존하는데 광범위하게 사용된다. CMRL 배지는 전형적으로 RPMI보다 더욱 복합적이다 (더 많은 구성요소 또는 성분). 그리고 CMRL 및 RMPI 양쪽 모두 세포 배양을 위한 통상적으로 사용되고 덜 복합적인 배지인 DMEM보다 더욱 복합적이다. 따라서, 출원인은 이같은 복합 기본 배지가 후기 분화 단계, 예를 들어, 단계 6 및 7 동안 내분비 세포를 유지시키는데 이로울 것인지 여부를 탐구하였다.
섬 이식은 적합한 섬 세포 질량 및 최소 독성의 섬의 배양 및 생착을 필요로 한다. 단기 섬 배양은 급속한 분해, 및 생육력 및 글루코스 제어의 상실에 연결되었다. 문헌 [S. Matsumoto, et al. (2003), A comparative evaluation of culture conditions for short-term maintenance (<24 hr.) of human islets isolated using the Edmonton protocol, Cell Tissue Banking, 4, p. 85.]; 및 [N.J.M. London, et al. (1998), Isolation, Culture and Functional Evaluation of Islets of Langerhans, Diabetes & Metabolism, 23, 200-207] 참조. 1978년에, 앤더슨(Andersson) 등 (1978)의 연구에서 마우스 섬을 배양하는 것에 대한 TCM, RPMI, CMRL, DMEM 및 햄(Ham) F10의 효과가 비교되었다. 문헌 [Andersson A. (1978) Isolated mouse pancreatic islets in culture: Effects of serum and different culture media on the insulin production of the islets, Diabetelogia, 14, 397-404] 참조. 앤더슨의 결과는 햄 F10이 섬 배양물에 대부분의 인슐린 함량을 제공하였지만, RMPI가 가장 양호한 인슐린 생합성율을 배양물에 제공하였다는 것과 이는 아마도 배지 내의 높은 글루코스 및 니코틴아미드에 기인하였다는 것을 나타냈다. 또다른 연구원 예컨대 다발리(Davalli) 등 (1992)은 아데노신 포스페이트 및 크산틴이 있는 TCM이 돼지 섬을 배양하는데 CMRL 및 RMPI보다 더 양호하였음을 나타냈다. 문헌 [Davalli, A.M. et al. (1992), In vitro function of adult pig islets: Effect of culture in different media, Transplantation, 60, 854-860] 참조. 다발리 등은 햄 F10 및 RMPI에서 발견되는 고 글루코스가 아마도 돼지 섬에 독성이었다는 것을 추가로 시사하였다. 따라서, 상이한 종으로부터의 섬은 상이한 배양 요건이 있을 수 있고, 모든 내분비 및 섬 세포에 적절한 하나의 처방이 없다. 상기 문헌 [Andersson (1978), p.4] 참조.
하기 표 20은 각각의 배지 유형에서 다른, CMRL, RPMI 및 DMEM 배지에서 발견되는 성분들만 기재하고, 즉 표 20은 3가지 유형의 기본 배지 모두에서 공유되는 성분을 열거하지 않고, CMRL에 함유되지만 RPMI 및/또는 DMEM에는 함유되지 않은 성분만 열거한다. 표 20은 CMRL이 가장 복합적 (성분 개수가 가장 큼)이고, DMEM이 가장 덜 복합적 (성분 개수가 가장 적음)이라는 것을 나타낸다. Y는 이러한 기본 배지 내의 이러한 성분의 존재를 가리키고, N는 성분이 배지 내에 존재하지 않는다는 것을 가리킨다. 간략하게, CMRL 및 RPMI에 존재하는 약 7개의 성분 (N, 음영 상자)이 DMEM에서 결여된다.
<표 20>
CMRL, RPMI 및 DMEM 세포 배양 배지의 비교
Figure pct00045
내분비 세포 배양물의 제조 방법은 단계 6 (d15), 또는 단계 7 중간 (d23), 또는 단계 7 중간 (d26), 또는 단계 6 및 7 (d15 내지 d25) 동안, DMEM 또는 CMRL 기본 복합 배지가 사용된 것을 제외하고는 상기 기재된 것과 실질적으로 유사하였다. 또한, 일부 배양물에 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 니코틴아미드 (NC), 글루코스 (Glc), 및/또는 rho-키나제 억제제 (Y-27632)가 제공되었다.
한 실험에서, 약 d23에 시작하여, 단계 7 세포가 CMRL 또는 DMEM 기본 배지 + B27 보충물, 매트리겔, BMP, IGF 및 Y-27632에서 배양되었다. d26 (단계 7) 샘플의 나노스트링 분석은, 일반적으로, CMRL에서 배양된 단계 7 세포가 DMEM에서 배양된 경우의 동일한 단계의 세포와 비교하여 호르몬 및 췌장 내분비 마커 양쪽 모두의 비-특이적 유전자 발현이 증가되었음을 나타냈다. 도 35a-c 참조. 따라서, CMRL이 내분비 세포 유지에 중요할 수 있다.
상응하는 연구가 DMEM 및 CMRL-기재 배지와 비교하여 RPMI를 사용하여 또한 수행되었다 (데이터는 제시되지 않음). CMRL 및 RMPI 배지는 세포 배양물에 대한 효과가 유사하였고, 양쪽 모두 DMEM보다 개선시켰고, 따라서 환원형 글루타티온, 아미노산, 히드록실-L-프롤린, L-프롤린, L-아스파르트산, L-글루탐산 및 비타민, 비오틴 및 파라-아미노벤조산을 포함하여 DMEM에 존재하지 않고 CMRL 및 RPMI 양쪽 모두에 존재하는 성분(들)이 단계 6 및/또는 7 동안의 내분비 세포 유지에 중요할 수 있다.
실시예 20
냉동보존이 내분비 세포 개수를 감소시키지 않는다
상업적으로 실행가능한 세포 요법은 세포 생성물의 제작 규모 증가 및 맞춤형 환자 요구를 위해 생성물을 장기 보관하는 수단을 필요로 할 것이다. 따라서, 임의의 세포 생성물이, 세포 단독이든 또는 캡슐화된 세포, 예컨대 ENCAPTRA® 약물 장치이든, 세포에 대한 해롭거나 독성인 효과 없이, 그리고 세포의 치료 효과 또는 이러한 경우에는 혈액 글루코스에 반응한 생체내에서의 인슐린 생산에 영향을 미치지 않으면서, 냉동보존되거나 또는 장기 보관을 위한 다른 수단이 있는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 출원인은 출원인의 미국 특허 번호 8,278,106 및 8,425,928 (양쪽 모두 영문 명칭이 "ENCAPSULATION OF PANCREATIC CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS"이고, 각각 2012년 10월 2일 및 2013년 4월 23일 허여됨); 및 미국 출원 61/775,480 (영문 명칭이 "CRYOPRESERVATION, HIBERNATION AND ROOM TERMPERATURE STORAGE OF ENCAPSULATED PANCREATIC ENDODERM CELL AGGREGATES"이고, 2013년 3월 7일 출원됨), 및 상기 문헌 [Kroon et al (2008)]에 상세하게 기재된 바와 같이 신선한 PEC (냉동보존되지 않음) 및 냉동보존된 PEC에 대해 관찰된 것과 유사하게 냉동보존된 단계 7 내분비 세포가 생체내에서 발달되어 기능하는 이의 능력을 유지하는지 여부를 탐구하였다.
세포 배양물이 모두 단계 7 동안 CMRL 기재 배지 내에 있었고 하기의 샘플로 분할된 것을 제외하고는 내분비 세포 배양물의 제조 방법은 상기 기재된 것과 실질적으로 유사하였다: 1) 해리 또는 재응집되지 않았지만, 약 제23일에 수시간 동안 냉동보존된 후, 해동되고, CMRL 기본 배지 +B27 보충물, BMP, TTNPB, 및 rho-키나제 억제제에서 수일 동안 배양됨 (비-재응집/냉동보존); 2) 해리 또는 재응집되지 않았고, 냉동보존되지 않음 (비-재응집/비-냉동보존); 및 3) 해리 및 재응집되었고, 냉동보존되지 않음 (재응집/비-냉동보존). 상기 3개의 샘플 모두를 동일한 단계 7 배지 조건에서 배양하였다. 제27일에 유동 세포측정법으로 샘플을 분석하였다. 하기 표 21 참조.
<표 21>
냉동보존, 신선 및 재응집 단계 7 내분비 세포의 유동 세포측정법 분석
Figure pct00046
표 21의 유동 세포측정법 분석을 기초로, 해리 또는 재응집되지 않은 배양물 (샘플 1 및 2)의 경우, 세포의 냉동보존 (샘플 2)이 신선한 세포 (샘플 1)와 비교하여 내분비 (CHGA+) 세포의 총수를 감소시키지 않았다 (88.57 대 89.97). 예상대로, 총 내분비 (CHGA+) 집단이 해리 및 재응집되고 냉동보존되지 않은 배양물에서 더 높았다 (92.85). 따라서, 해리 및 재응집이 실시예 17에서 상기 기재된 바와 ?이 내분비 (CHGA+) 세포 개수에 영향을 미치지만, 단계 7 배양물을 냉동보존하는 것은 세포 조성을 변경시키는 것으로 보이지 않는다.
추가로, 샘플을 NKX6.1, C-펩티드, INS, 및 GCG 염색으로 세포 면역조직화학을 사용하여 분석하였다. 도 36a-b 참조. 단계 7로부터의 내분비 (CHGA+) 세포 응집체 (비-재응집/비-냉동보존; 샘플 2)는 NKX6.1 (핵) 및 C-펩티드 (세포질) 공발현 또는 공동-염색을 나타냈다 (도 36a-c). 단계 4 분화 프로토콜로부터의 PEC의 유사한 분석에서는 공동-염색이 관찰되지 않았다. INS (36A; 세포질) 및 GCG (36B; 세포질) 세포의 분리된 염색을 나타내는 도 36a-c에서 볼 수 있듯이, 단계 7로부터의 세포 배양물은 또한 주로 단일 호르몬성이었고, 즉 대다수의 개별적인 세포들이 단계 4로부터의 PEC의 내분비 (CHGA+) 하위집단에서 나타난 바와 같이 INS 및 GCG를 공발현하지 않았다. 도 37은 유사한 염색 패턴이지만 단계 7을 시작할 때 해리 및 재응집된 세포 배양물로부터의 것인 현미경사진을 나타낸다.
도 37은 상기 표 20의 세포 배양물 1 및 3으로부터의 이식편 기능을 비교한다. 12주의 동물의 양쪽 코호트의 이식된 단계 7 이식편의 생체내 기능의 분석은 냉동보존되었지만 재응집되지 않은 배양물 (샘플 1)이 냉동보존되지 않았지만 재응집된 배양물 (샘플 3)과 비교하여 글루코스 챌린지 30분 후 및 60분 후의 혈청 C-펩티드 수준이 유사하였음을 나타냈다. 이러한 C-펩티드 수준은 도 20 및 21에서 제10주 및 제15주에 관찰된 것에 필적하였다 (예를 들어, 제15주에, 평균 C-펩티드 수준은 글루코스 투여 60분 후에 995 pM이었다). 따라서, 실시예 18에서 기재되고 도 34에서 관찰된 것과 유사하게 C-펩티드 수준이 대부분의 동물에서 글루코스 자극 30 및/또는 60분 후에 1000 pM 초과로 증가될 것임을 추후의 분석이 나타낼 것으로 예측 및 예상된다. 실제로, 동물 번호 4490, 샘플 1 이식편은 12주에 혈청 C-펩티드 수준이 이식 21주 후의 실시예 18에서의 동물 번호 4320 (도 34)에 필적하였다.
따라서, 단계 7 내분비 세포를 냉동보존하는 것은 이의 생체내 기능에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다.
실시예 21
글루코스 농도를 증가시키는 것이 호르몬 발현에 영향을 미치지 않는다
세포 배양물 제제 내의 글루코스 수준은 1 g/L (5.5 mM) 내지 10 g/L (55 mM)이고, 일부 배지에는 생체내에서의 정상 혈당 수준에 가까운 약 5.5 mM 글루코스가 있다. 10 mM에 육박하는 글루코스 수준은 전-당뇨병 수준이고, 10 mM 초과는 당뇨병 상태와 유사하다. 또 다른 방식으로 말하면, 10 mM 초과의 글루코스는 생체내에서의 고혈당 상태를 모방한다. 고-글루코스는, 예를 들어, 당화, 글리콕시드화 및 카르보닐 스트레스를 포함하는 번역후 2차 변형을 야기할 수 있다. 시험관내에서의 여러 세포 유형에 대한 고-글루코스의 효과의 보고가 다양하기 때문에, 출원인은 단계 6 및/또는 7 내분비 세포에 대한 고-글루코스 (즉 4.5 g/L 또는 24.98 mM 글루코스)의 효과를 연구하려고 노력하였다.
글루코스는 에임스(Ames) 배지; 이글(Eagle) 기본 배지 (BME); BGJb 배지 피튼-잭슨(Fitton-Jackson) 변형; 클릭(Click) 배지; CMRL-1066 배지; 둘베코((Dulbecco) 변형 이글 배지 (DMEM); DMEM/햄 영양소 혼합물 F-12 (50:50); F-12 쿤(Coon) 변형; 피셔 배지; H-Y 배지 (Hybri-Max®); 이스코브(Iscove) 변형 둘베코 배지 (IMDM); 맥코이(McCoy) 5A 변형 배지; MCDB 배지; 배지 199; 이글 최소 필수 배지 (EMEM); NCTC 배지; 영양소 혼합물, 햄 F-10; 영양소 혼합물, 햄 F-12; 영양소 혼합물 햄 F-12 카인(Kaighn) 변형 (F12K); RPMI-1640; 무혈청/무단백질 하이브리도마 배지; 웨이마우스(Waymouth) 배지 MB; 윌리암스(Williams) 배지 E 및 다양한 특허권 배지를 포함하는 모든 세포 배양 배지에 첨가되는 가용성 6탄당이다. L-15 배지는 글루코스 대신 갈락토스를 함유한다. sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/glucose.html의 월드와이드에서 입수가능한 <Sigma-Aldrich Media Expert>를 참조한다.
10 mM를 초과하는 수준의 글루코스 보충물을 함유하는 배지는 DMEM/햄 영양소 혼합물 F-12 (50:50) (17.5 mM의 글루코스를 함유함); DMEM (하이 글루코스), GMEM 및 IMDM (모두 25 mM 수준의 글루코스를 함유함); 및 H-Y 배지 (Hybri-Max®) 및 무혈청/무단백질 하이브리도마 배지 (각각 22.6 및 28.9 mM 글루코스를 함유함)를 적어도 포함한다. sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/glucose.html의 월드와이드에서 입수가능한 <Sigma-Aldrich Media Expert>를 참조한다. 상이한 세포 배양 배지들이 광범위하게 상이한 수준의 글루코스를 함유하고, 글루코스의 효과는 일반적으로 세포 배양 시스템마다 다르기 때문에, 내분비 세포에 대한 고-글루코스의 효과를 연구하였다.
또 다시, 단계 6 및/또는 7 동안, 세포 배양물이 외인성 고-글루코스 (총 글루코스 농도 4.5 g/L, 또는 25 mM)가 있는 CMRL 기본 배지 또는 외인성 고-글루코스가 없는 CMRL 기본 배지로 처리되는 것을 제외하고는, 내분비 세포 배양물의 제조 방법은 상기 기재된 것과 실질적으로 유사하였다. 따라서, 이는 CMRL 배지에서 이미 확인되는 1000 mg/L 또는 1 g/L (5.5 mM)의 글루코스에 더하여 3.5 g/L였다. 외인성 글루코스가 있는 조건 및 없는 조건 양쪽 모두를 니코틴아미드, BMP, RA (또는 TTNPB) 및 대안적으로 rho-키나제 억제제 및 매트리겔을 포함하는 동일한 성장 인자로 처리하였다. 나노스트링 분석은 고-글루코스가 단계 6을 시작할 때 첨가된 경우에, 단계 6의 마지막에 INS, GCG 및 SST의 발현 증가 및 GHRL의 발현 감소가 있었음을 나타냈다 (도 39a 및 b). 따라서, 단계 6 및 7 동안의 외인성 글루코스 증가는, 그렐린을 제외하고, 호르몬 발현을 증가시킨다.
실시예 22
미성숙 베타-세포의 생산
실시예 8-21은 단계 3에서 고-액티빈을 단독으로 또는 Wnt 및/또는 헤레귤린과 조합하여 사용하는 것; 단계 4에서 저-액티빈을 단독으로 또는 헤레귤린과 조합하여 사용하는 것; 단계 5에서 노긴 및 감마 세크레타제 억제제를 KGF, EGF 및 rho-키나제 억제제의 존재 또는 부재 하에 사용하는 것; 및 단계 6-7에 니코틴아미드, 레틴산, BMP 및 매트리겔 중 하나 이상을 사용하는 것을 포함하여, 시험관내에서의 내분비 세포의 생산을 위한 다양한 반복적 방법을 기재한다. 이같은 방법으로부터 생산된 내분비 세포 집단은 단일 호르몬성일뿐만 아니라 (예를 들어 INS 단독, GCG 단독 또는 SST 단독; 도 39 참조), 또한 NKX6.1 및 PDX1을 포함하는 기타 미성숙 내분비 세포 마커를 공발현한다.
유동 세포측정법 분석을 INS, SST 및 GCG 호르몬 염색을 사용하여 2가지 상이한 단계 7 배양물에 수행하였다 (데이터 세트 A 및 데이터 세트 B). 한 데이터 세트 (A)는 다수의 반복된 단계 1-7이 시험된 후에 수행되었고, 다른 데이터 세트 (B)는 더 이른 시간에, 예를 들어, 니코틴아미드, BMP, CMRL 등의 부재 하에 수행되었다. 하기 표 22 참조. 표 22는 INS, SST 및 GCG 양성 염색의 총 백분율 (왼쪽 5개의 열 참조), 총 INS, SST 및 GCG 음성 염색 (오른쪽의 5개의 열 참조), 및 단일 호르몬 염색 (중앙의 열 참조)을 나타낸다. 이러한 2개의 데이터 세트 (A 및 B)로부터의 호르몬 염색을 약 제26일까지 배양에서 유지된 단계 4 PEC 배양물로부터 수득된 것과 비교하였다.
<표 22>
단계 7 및 단계 4 (PEC)로부터의 호르몬 발현 세포의 비교
Figure pct00047
일반적으로, 총 INS 양성 하위집단 (단일 INS-양성 + INS/SST 공동-양성 + INS/GCG 공동-양성 + INS/SST/GCG 공동-양성의 합계)이 단계 7 내분비 배양물에서 단계 4 PEC 배양물에서보다 3배만큼 더 크다 (49.3 대 22.7 대 15.8). 따라서, 총 INS 단독 (SST 또는 GCG의 공동 발현 없음) 하위집단이 단계 7 내분비 배양물에 대해 단계 4 PEC 배양물에 대한 것보다 또한 더 높다 (22.7 대 12.9 대 3.7). 중요하게, 단계 4 PEC 배양물 (3.7/15.8=23％)과 비교하여 단계 7 배양물은 총 INS 집단의 백분율로서 더 많은 단일 호르몬 발현 INS 세포가 있다 (A: 22.7/49.3= 46％ 및 B: 12.7/22.7 = ~57％). 따라서, 단계 7 내분비 세포 배양물이 단계 4 PEC 배양물보다 더 많은 단일 호르몬 발현 세포, 특히 INS 단독 발현 세포로 이루어지는 것으로 보인다. 그리고, 적어도 실시예 18 및 20은 단계 7 내분비 세포가, 여전히 미성숙이지만, 이식되었을 때 혈액 글루코스에 반응하여 인슐린을 분비할 수 있는 생리학적으로 기능성인 췌장 섬으로 발달 및 성숙된다는 것을 입증한다; 반면에 단계 4 PEC 배양물의 내분비 (CHGA+) 하위집단은 생체내에서 동일하게 가능하지 않다. 더 많은 상세사항에 대해 도 44 및 45 및 상기 실시예를 참조한다.
실시예 23
단계 7 및 4 ( PEC ) 로부터의 내분비 ( CHGA +) 세포가 서로 구별된다
단계 7 (정확하게 특정된 내분비) 및 단계 4 (PEC) 배양물의 분석이 세포 염색 및 분석을 위해 동일한 항체 (예를 들어 CHGA, INS, NKX6.1)를 사용하지만, 단계 7 및 4 (PEC)로부터의 정확하게 특정된 내분비 (CHGA+) 세포 하위집단은 동일하지 않다.
이전에, 출원인은 단계 4 PEC 배양물의 이식 후에 관찰된 기능성 베타 세포의 기원이 췌장 선조 또는 비-내분비 (CHGA-) 세포에 기인하였고 일차 내분비 (CHGA+) 세포로부터의 것이 아니였음을 보고하였다. 상기 문헌 [Kelly et al. (2011)]에서, PEC 배양물이 내분비 (CHGA+) 하위집단에 대해 강화 (정제)되고 이식되었을 때, 강화되지 않은 PEC 배양물과 비교하여 이들이 기능성 췌장 섬 또는 베타 세포를 초래하지 않았다는 것이 입증되었다. 문헌 [Kelly et al (2011), pp.3-4, 도 4 및 부록 표 1]; 상기 문헌 [Schulz et al. (2012)]; 및 미국 특허 7,534,608; 7,695,965; 7993920; 및 8,278,106 참조. 실시예 17 및 18 및 표 19는 이식되었을 때 생체내에서 강건한 기능성 이식편을 초래한 단계 7로부터의 거의 순수한 (98.2％) 내분비 (CHGA+) 세포 배양물을 기재하였다 (도 34). 실시예 17 및 18 및 본원에 기재된 기타 결과를 고려하여, 단계 7 배양물의 기능성 집단은 단계 7로부터의 내분비 (CHGA+) 세포이고, 유의하게 더 작은 백분율의 비-내분비 (CHGA-) 세포 (2.08％)가 아니다. 이는 생체내 기능이 비-내분비 (CHGA-) 하위집단에 기인하는, 출원인이 이전 개시물에서 상세하게 보고한 단계 4 PEC 배양물과 대조적이다. 따라서, 일반적으로, 단계 7 및 4로부터의 내분비 하위집단은 유사하거나 동일하지 않다.
표 23은 단계 7로부터의 총 내분비 (CHGA+) 및 비-내분비 (CHGA-) 하위집단 (정확하게 특정된 내분비) 및 단계 4 (PEC)를 비교하는 유동 세포측정법 데이터를 나타내고, 하위집단들이 등가이지 않으며 서로 구별된다는 것을 입증한다. 예를 들어, CHGA+ 하위집단의 총 백분율이 단계 4 배양물과 비교하여 단계 7에 대해 유의하게 더 높았다 (85.2 대 39.4). 따라서, CHGA- 하위집단의 총 백분율이 단계 4 배양물과 비교하여 단계 7에 대해 유의하게 더 낮았다 (14.8 대 60.1). 추가로, 진정한 내분비 세포, 예를 들어 베타 세포는 CHGA+만 발현하는 것이 아니라 적어도 INS 및 NKX6.1을 또한 공발현한다. 따라서, 진정한 내분비 세포는 CHGA+/INS+/NKX6.1+를 발현하고 (삼중 양성), 생체내에서 기능할 수 있다. 표 23은 단계 7 배양물에 단계 4 배양물보다 거의 5배 더 많은 CHGA+/INS+/NKX6.1+ (삼중 양성) 세포가 있다는 것을 나타내고 (37.8 대 7.8); 단계 4 CHGA+/INS+/NKX6.1+ 하위집단이 정확하게 특정된 것으로 보일 수 있지만, 상기 논의된 바와 같이, 단계 4로부터의 이러한 내분비 하위집단은 이식되었을 때 생체내에서 기능하지 않는 한편, 단계 4로부터의 비-내분비 (CHGA-) 하위집단은 생체내에서 성숙되고 기능한다. 따라서, 출원인은 단계 7 내분비 세포를 내분비 선조/전구 세포가 아니라 "미성숙 내분비 세포" 또는 "미성숙 베타 세포"로 지칭하였는데, 이러한 세포는 생체내에서 성숙 베타 세포가 되도록 발생적으로 수임되기 때문이다.
<표 23>
단계 7 및 단계 4 (PEC)로부터의 내분비 (CHGA+) 및 비-내분비 (CHGA-) 세포의 비교
Figure pct00048
실시예 24
아연 센서를 사용한 단계 7 세포 집단으로부터의 내분비 세포의 정제
베타 세포 분비 소포는 고농도의 아연을 함유한다. 아연은 적어도 아연 수송체 SLC30A8 (또는 ZnT8)의 작용에 의해 소포 내에 축적된다. 아연-결합 형광 프로브는 아연이 없을 때보다 아연과 결합했을 때 특정 파장에서 더 많은 빛을 흡수 및 방출하는 것에 의해 세포 내의 아연을 가시화하는데 사용되었다. 그러나, 대부분의 프로브가 베타 세포 소포 내의 아연을 검출하도록 정확하게 국소화될 수 없다는 것이 보고서에서 나타났다. 흥미롭게, PyDPy1 (또는 Py1; 문헌 [Chemical Communications, 2011, 47:7107-9])이 소포 내로 들어갈 수 있지만, 현재까지는 베타 세포와 함께 사용되지 않았다. Py1는 Zn2+에 결합했을 때 형광 강도를 50-80× 증가시킨다. 출원인은 생체내 기능이 가능한 내분비 세포 집단 또는 미성숙 베타 세포 집단의 생산을 최초로 입증하였다. 따라서, 추가적인 시험관내 분석의 목적을 위해, 스크리닝 도구로서 사용하기 위해, 또는 이식용의 강화된 미성숙 베타 세포 집단을 제공하기 위해, 이러한 집단을 추가로 강화하는 수단이 있는 것이 유리하다.
단계 7 내분비 세포, 또는 미성숙 베타 세포를 Py1로 처리하였고, 높은 아연 함량을 함유하는 것들에 대한 형광을 통해 세포를 분류하였다. Py1 아연 센서 (케모제닉스 바이오파마(ChemoGenics Biopharma) (노스 캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크)에 의해 맞춤 합성됨)를 DMSO에 10 mM로 재현탁시키고, DPBS(-/-)/ 0.25％ BSA (완충제 A)에서 5 마이크로몰 최종 농도로 희석하였다 (염색 용액). 분화된 단계 7 세포 응집체를 DPBS(-/-)로 2회 세정하고, 아쿠맥스(Accumax)로 해리시켰다. B-27을 함유하는 기본 배지를 첨가하여 아쿠맥스를 켄칭시켰다. 생성된 세포 현탁액을 40 마이크로미터 메시로 여과하고, 원심분리하고, 완충제 A로 세정하고, 염색 용액에 재현탁시켰다. 15분 동안 계속 염색하고, 세포를 원심분리하고, 완충제 A로 세정하고, 분류를 위해 완충제 A에 재현탁시켰다. 세포를 4℃에서 CMRL/50％ FBS 내로 유동 세포측정법에 의해 분류하였다. 분류 후에, 세포를 원심분리하고, RNA 단리 완충제에 재현탁시켰다.
도 40에 제시된 결과에서, 다각형에 포함되거나 게이팅된 세포는 아연에 결합된 Py1 센서의 존재로 인해 형광이 증가된 살아 있는 세포이다. 이러한 세포 집단이 이의 형광 강도에 따라 2개의 거의 동일한 게이트로 추가로 나뉘었고, 밝음 및 어두움으로 명명된 2개의 튜브 내로 분류되었다. 세포로부터 RNA를 제조하고, 나노스트링 분석에 적용하였다.
도 42a-c에 나타난 바와 같이, 어두움 집단은 INS, IAPP, PDX1, NKX6.1, PAX4, PCSK1, G6PC2, GCK 및 SLC30A8와 같은 베타 세포 계통의 마커가 강화된다. 이는 베타 세포 또는 미성숙 베타 세포가 아연 센서를 사용하여 단계 7 세포 집단으로부터 정제될 수 있다는 것을 가리킨다. 이전의 실험에서, 나노스트링에 의한 630,000 INS mRNA 단위가 유동 세포측정법에 의한 약 49％ INS-양성 세포에 상응하는 것으로 결정되었다 (데이터는 제시되지 않음). 따라서, INS 나노스트링 값이 1,200,000인 정제된 어두움 집단은 약 93％ INS-양성 세포 (1,200,000/630,000 × 49％)에 상응할 것이다.
반대로, 밝음으로 분류된 집단은 GCG, ARX 및 SLC30A8와 같은 알파 세포 계통의 마커가 강화되었다 (도 41, 42, 43). 베타 세포와 유사하게, 글루카곤 세포 또한 아연을 흡수하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, Py1 센서가 베타 및 글루카곤 세포 양쪽 모두에서 아연에 결합하는데 사용될 수 있지만, 이들의 상이한 형광 수준에 의해 분리 또는 분류될 수 있다.
PEC (단계 1-4) 내분비 세포 (단계 1-7) 배양물의 제조 방법의 요약
요약하면, 본원에 기재된 발명은 적어도 PEC 및 미성숙 내분비 세포 및 PEC 생산을 위한 단계 1-4 및 내분비 세포 생산을 위한 단계 1-7을 적어도 포함하는 이같은 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 도 43, 44 및 45는 본원에 기재된 출원인의 세포 조성물 및 생산 방법의 특정 측면을 요약하는 도표이다.
출원인은 단계 4 분화 프로토콜을 따른 내분비 (CHGA+) 하위집단이 이식되었을 때 생체내에서 성숙한 기능성 췌장 섬 세포로 발달되지 않는다고 기존에 보고하였다. 도 43 및 44의 단계 4 이후의 "EN" 세포 유형을 참조한다. 이러한 내분비 (CHGA+) 하위집단은 초기 또는 조기 NGN3 발현 (PDX1 및 NKX6.1 공발현 이전의 NGN3 발현)이 있었다. 상기 문헌 [Rukstalis et al. (2009)]을 또한 참조한다. 대조적으로, NGN3을 발현하지 않은 PEC의 비-내분비 (CHGA-) 하위집단은 생체내에서 내분비 세포로 발달 및 성숙된다. PEC의 비-내분비 (CHGA-) 하위집단의 생체내 성숙 후까지의 이러한 지연된 NGN3 발현이 실시예 10 (도 15-16)에서 제시되었고, 이때 액티빈, Wnt 및 헤레귤린의 조합이 대조군과 비교하여 NGN3을 효과적으로 억압하였고, 대조군과 비교하여 이러한 PEC의 이식은 생체내 기능의 개선을 초래하였다. 도 15-16 참조.
그 후, 출원인은 생체내에서 췌장 섬으로 발달 및 성숙될 수 있고 PEC, 특히 PEC의 비-내분비 (CHGA-) 하위집단의 모든 경우에 관찰되는 것과 유사하게 혈액 글루코스 수준에 반응하여 인슐린을 만들 수 있는 정확하게 특정된 내분비 세포 배양물을 수득하려고 노력하였다. 이를 위해, 출원인은 단계 3 및 4에 NGN3 발현을 억제 또는 저해하기 위한 다수의 반복 실험을 수행하였다. 실시예 8-11은 출원인이 NGN3 발현 또는 억제에 영향을 미치기 위해 액티빈을 단독으로 또는 Wnt 및 헤레귤린과 같은 다른 작용제와 조합하여, 그리고 다양한 농도에서 사용한 것을 상세하게 기재한다. 도 44 또한 단계 3 및 4의 액티빈의 효과를 요약한다.
NGN3 발현이 지연될 수 있었고, 이는 생체내 기능에 영향을 미치지 않았다는 것이 입증되자, 출원인은 PEC (단계 4) 형성 후의 단계에서 내분비 마커의 발현을 유도하는 방법을 탐구하였다. 실시예 11-14 및 16-22는 생체내 기능을 초래할 수 있는 정확하게 특정된 내분비 집단을 생산하기 위해 배양 조건을 최적화하는데 사용된 다수의 반복 및 방법을 기재한다. 구체적으로, 출원인은 단계 5에서 감마 세크레타제 억제제를 사용하여 NGN3 발현 및 내분비 분화를 유도하였다. 출원인은 단계 6 및 7에 CMRL과 같은 시약을 사용하여 내분비 마커 발현을 증가시켰고, BMP를 사용하여 INS 및 PDX1을 증가시켰다. 도 44 및 45에서 이러한 노력이 요약 및 기재된다.
초기에 다중 방법론의 사용이 세포를 특성화 및 확인하는데 요구된다는 것이 이해될 것이다 (예를 들어 Q-PCR, ICC, 유동 세포측정법 분석, C-펩티드 검정법 등). 특정 세포 분화 배양 조건 하에서 이같은 세포가 충분히 특성화 및 확인된 후에는, 이같은 세포 유형이 수득되었는지 여부를 분석하기 위한 유일한 방법으로서 Q-PCR 및 나노스트링 멀티플렉스 RNA가 종종 사용되었다.
본원에 기재된 방법, 조성물 및 장치는 현재 바람직한 실시양태를 대표하고 있고, 예시적이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 취지 내에 포함되고 개시내용의 범주에 의해 규정되는 그 안에서의 변화 및 기타 용도가 통상의 기술자에게 일어날 것이다. 따라서, 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 다양한 치환 및 변형이 본원에 개시된 발명에 이루어질 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
하기 청구항에서, 그리고 개시내용 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, "본질적으로 ~로 이루어지는"이라는 구절은 이러한 구절 뒤에 열거된 임의의 요소를 포함하는 것을 의미하고, 열거된 요소들에 대해 개시내용에 상술된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 이에 기여하는 다른 요소에 제한된다. 따라서, "본질적으로 ~로 이루어지는"이라는 구절은 열거된 요소들이 필요하거나 필수적이지만, 다른 요소들이 선택적이고, 이들이 열거된 요소들의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 또는 그렇지 않은지 여부에 따라 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다는 것을 가리킨다. 또한, 수치, 예컨대 양, 농도, 백분율, 비율 또는 범위가 열거된 실시양태에서, 언급된 값은 "적어도 대략적인" 그러한 수치, "대략적인" 그러한 수치 또는 "적어도" 그러한 수치일 수 있다는 것이 이해될 것이다.
실시양태
실시양태 1. 시험관내 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, INS 및 NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, 성숙 베타 세포로 분화될 수 있는 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 4. 실시양태 3에 있어서, 상기 분화가 생체내에서의 분화인 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 5. 실시양태 1에 있어서, 세포 집단의 일부를 형성하는 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 6. 실시양태 5에 있어서, 상기 세포 집단의 10％ 이상이 미성숙 베타 세포인 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 7. 실시양태 5에 있어서, 상기 세포 집단의 20％ 이상이 미성숙 베타 세포인 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 8. 실시양태 5에 있어서, 상기 세포 집단의 30％ 이상이 미성숙 베타 세포인 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 9. 실시양태 5에 있어서, 상기 세포 집단의 40％ 이상이 미성숙 베타 세포인 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 10. 실시양태 5에 있어서, 상기 세포 집단의 50％ 이상이 미성숙 베타 세포인 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 11. 실시양태 5에 있어서, 상기 세포 집단의 60％ 이상이 미성숙 베타 세포인 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 12. 실시양태 5에 있어서, 상기 세포 집단의 80％ 이상이 미성숙 베타 세포인 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 13. 실시양태 5에 있어서, 상기 세포 집단의 90％ 이상이 미성숙 베타 세포인 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 14. 실시양태 5에 있어서, 상기 세포 집단의 98％ 이상이 미성숙 베타 세포인 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 15. 실시양태 1에 있어서, 단일 호르몬성인 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 16. 실시양태 1에 있어서, MAFB를 발현하는 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 17. 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원 및 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시킴으로써 미성숙 베타 세포를 생성시키는 것을 포함하는, 단능 인간 미성숙 베타 세포를 생산하는 방법.
실시양태 18. 실시양태 4에 있어서, 상기 단능 인간 미성숙 베타 세포가 INS, NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는 것인 방법.
실시양태 19. 실시양태 4에 있어서, TGFβ 슈퍼패밀리 구성원이 노달, 액티빈 A, 액티빈 B, BMP2, BMP4, GDF8, GDF-10, GDF-11 및 GDF-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 20. 실시양태 4에 있어서, 시험관내에서 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 ERRB 수용체 키나제 활성화제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 21. 실시양태 4에 있어서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자가 액티빈 A인 방법.
실시양태 22. 실시양태 4에 있어서, Wnt 패밀리 구성원이 Wnt3a인 방법.
실시양태 23. 실시양태 6에 있어서, ERBB 수용체 키나제 활성화제가 헤레귤린인 방법.
실시양태 24. 실시양태 4에 있어서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자가 BMP인 방법.
실시양태 25. 실시양태 4에 있어서, 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 니코틴아미드, 레틴산 또는 레틴산 유사체, rho 키나제 억제제 또는 감마 세크레타제 억제제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 26. 실시양태 25에 있어서, 레틴산이 올-트랜스-레틴산 (RA), 13-시스-레틴산 (13-시스-RA), 및 아로티노이드산 (TTNPB)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 27. 실시양태 26에 있어서, 레틴산이 올-트랜스 레틴산 (RA)인 방법.
실시양태 28. 실시양태 26에 있어서, 레틴산이 13-시스-레틴산 (13-시스-RA)인 방법.
실시양태 29. 실시양태 26에 있어서, 레틴산이 아로티노이드산 (TTNPB)인 방법.
실시양태 30. 실시양태 25에 있어서, rho 키나제 억제제가 Y-27632, 파수딜, H-1152P, Wf-536 및 Y-30141로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 31. 실시양태 30에 있어서, rho 키나제 억제제가 Y-27632인 방법.
실시양태 32. 실시양태 25에 있어서, 감마 세크레타제 억제제가 감마 세크레타제 억제제 I (GSI I), 감마 세크레타제 억제제 II (GSI II), 감마 세크레타제 억제제 III (GSI III), 감마 세크레타제 억제제 IV (GSI IV), 감마 세크레타제 억제제 V (GSI V), 감마 세크레타제 억제제 VI (GSI VI), 감마 세크레타제 억제제 VII (GSI VII), 감마 세크레타제 억제제 IX (GSI IX), (DAPT), 감마 세크레타제 억제제 XI (GSI XI), 감마 세크레타제 억제제 XII, (GSI XII), 감마 세크레타제 억제제 XIII (GSI XIII), 감마 세크레타제 억제제 XIV (GSI XIV), 감마 세크레타제 억제제 XVI (GSI XVI), 감마 세크레타제 억제제 XVII (GSI XVII), 감마 세크레타제 억제제 XIX (GSI XIX), 감마 세크레타제 억제제 XX (GSI XX), 감마 세크레타제 억제제 XXI (GSI XXI), 감마40 세크레타제 억제제 I, 감마40 세크레타제 억제제 II 및 RO4929097로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 33. 실시양태 32에 있어서, 감마 세크레타제 억제제가 RO4929097인 방법.
실시양태 34. 실시양태 32에 있어서, 감마 세크레타제 억제제가 GSI IV인 방법.
실시양태 35. a. 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원 및 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시킴으로써, 미성숙 베타 세포를 생성시키는 단계; b. 단계 (a)의 미성숙 베타 세포를 포유동물 대상체 내로 이식하는 단계; 및 c. 생체내에서 미성숙 베타 세포가 분화되게 하여 성숙 베타 세포를 포함하는 세포들의 집단을 생산하는 단계를 포함하는, 생체내에서 성숙 베타 세포를 생산하는 방법.
실시양태 36. 실시양태 10에 있어서, 상기 성숙 베타 세포가 글루코스 자극에 반응하여 인슐린을 생산하게 하는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 37. 실시양태 10에 있어서, 상기 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자가 노달, 액티빈 A 및 액티빈 B, GDF-8, GDF-11 및 GDF-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 38. 실시양태 10에 있어서, 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 39. 실시양태 10에 있어서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자가 액티빈 A인 방법.
실시양태 40. 실시양태 10에 있어서, Wnt 패밀리 구성원이 Wnt3a인 방법.
실시양태 41. 실시양태 37에 있어서, ERBB 수용체 키나제 활성화제가 헤레귤린인 방법.
실시양태 42. 1에 있어서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 25 ng/mL 이상의 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자와 접촉시키는 것인 방법.
실시양태 43. 10에 있어서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 50 ng/mL 이상의 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자와 접촉시키는 것인 방법.
실시양태 44. 10에 있어서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 75 ng/mL 이상의 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자와 접촉시키는 것인 방법.
실시양태 45. 10에 있어서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 25 ng/mL 이상의 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시키는 것인 방법.
실시양태 46. 10에 있어서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 50 ng/mL 이상의 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시키는 것인 방법.
실시양태 47. 10에 있어서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 75 ng/mL 이상의 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시키는 것인 방법.
실시양태 48. 실시양태 37에 있어서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자 및 Wnt 패밀리 구성원보다 5-15배 더 적은 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉시키는 것인 방법.
실시양태 49. 실시양태 10에 있어서, 상기 세포 집단의 10％ 이상이 미성숙 베타 세포인 방법.
실시양태 50. 실시양태 10에 있어서, 상기 세포 집단의 20％ 이상이 미성숙 베타 세포인 방법.
실시양태 51. 실시양태 10에 있어서, 상기 세포 집단의 30％ 이상이 미성숙 베타 세포인 방법.
실시양태 52. 실시양태 10에 있어서, 상기 세포 집단의 40％ 이상이 미성숙 베타 세포인 방법.
실시양태 53. 실시양태 10에 있어서, 상기 세포 집단의 50％ 이상이 미성숙 베타 세포인 방법.
실시양태 54. 실시양태 10에 있어서, 상기 세포 집단의 60％ 이상이 미성숙 베타 세포인 방법.
실시양태 55. 실시양태 10에 있어서, 상기 세포 집단의 70％ 이상이 미성숙 베타 세포인 방법.
실시양태 56. 실시양태 10에 있어서, 상기 세포 집단의 80％ 이상이 미성숙 베타 세포인 방법.
실시양태 57. 실시양태 10에 있어서, 상기 세포 집단의 90％ 이상이 미성숙 베타 세포인 방법.
실시양태 58. 실시양태 10에 있어서, 미성숙 베타 세포가 INS 및 NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는 것인 방법.
실시양태 59. 실시양태 10에 있어서, 미성숙 베타 세포가 INS, NKX6.1 및 MFAB를 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는 것인 방법.
실시양태 60. INS 및 NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는 시험관내 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 61. 실시양태 60에 있어서, 성숙 베타 세포로 성숙될 수 있는 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 62. 실시양태 60에 있어서, MAFB를 추가로 발현하는 단능 인간 미성숙 베타 세포.
실시양태 63. 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원 및 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시킴으로써 단능 인간 미성숙 베타 세포를 생산하는 것을 포함하는, 단능 인간 미성숙 베타 세포를 생산하는 방법.
실시양태 64. 실시양태 63에 있어서, 상기 단능 인간 미성숙 베타 세포가 INS, NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는 것인 방법.
실시양태 65. 실시양태 63에 있어서, 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 66. 실시양태 63에 있어서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자가 액티빈 A인 방법.
실시양태 67. 실시양태 63에 있어서, Wnt 패밀리 구성원이 Wnt3a인 방법.
실시양태 68. 실시양태 65에 있어서, ERBB 수용체 키나제 활성화제가 헤레귤린인 방법.
실시양태 69. a. 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원 및 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시킴으로써 미성숙 베타 세포를 생성시키는 단계; b. 단계 (a)의 미성숙 베타 세포를 포유동물 대상체 내로 이식하는 단계; 및 c. 미성숙 베타 세포가 생체내에서 성숙되게 하여 인슐린 분비 베타 세포를 포함하는 세포들의 집단을 생산하는 단계를 포함하는, 생체내에서 성숙 베타 세포를 생산하는 방법.
실시양태 70. 실시양태 69에 있어서, 시험관내의 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 71. 실시양태 69에 있어서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자가 액티빈 A인 방법.
실시양태 72. 실시양태 69에 있어서, Wnt 패밀리 구성원이 Wnt3a인 방법.
실시양태 73. 실시양태 70에 있어서, ERBB 수용체 키나제 활성화제가 헤레귤린인 방법.
실시양태 74. 실시양태 69에 있어서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 50 ng/mL 이상의 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자와 접촉시키는 것인 방법.
실시양태 75. 실시양태 69에 있어서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 25 ng/mL 이상의 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시키는 것인 방법.
실시양태 76. 실시양태 70에 있어서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자 및 Wnt 패밀리 구성원보다 5-15배 더 적은 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉시키는 것인 방법.
실시양태 77. 실시양태 69에 있어서, 미성숙 베타 세포가 INS 및 NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는 것인 방법.
실시양태 78. 실시양태 69에 있어서, 미성숙 베타 세포가 INS, NKX6.1 및 MAFB를 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는 것인 방법.

Claims (19)

  1. INS 및 NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는 시험관내 단능 인간 미성숙 베타 세포.
  2. 제1항에 있어서, 성숙 베타 세포로 성숙될 수 있는 단능 인간 미성숙 베타 세포.
  3. 제1항에 있어서, MAFB를 추가로 발현하는 단능 인간 미성숙 베타 세포.
  4. 시험관내에서 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원 및 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시킴으로써 단능 인간 미성숙 베타 세포를 생산하는 것을 포함하는, 단능 인간 미성숙 베타 세포를 생산하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단능 인간 미성숙 베타 세포가 INS, NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 시험관내에서 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자가 액티빈 A인 방법.
  8. 제4항에 있어서, Wnt 패밀리 구성원이 Wnt3a인 방법.
  9. 제6항에 있어서, ERBB 수용체 키나제 활성화제가 헤레귤린인 방법.
  10. a. 시험관내에서 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원 및 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시킴으로써 미성숙 베타 세포를 생성시키는 단계;
    b. 단계 (a)의 미성숙 베타 세포를 포유동물 대상체 내로 이식하는 단계; 및
    c. 미성숙 베타 세포가 생체내에서 성숙되게 하여 인슐린 분비 베타 세포를 포함하는 세포들의 집단을 생산하는 단계
    를 포함하는, 생체내에서 성숙 베타 세포를 생산하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 시험관내에서 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자가 액티빈 A인 방법.
  13. 제10항에 있어서, Wnt 패밀리 구성원이 Wnt3a인 방법.
  14. 제11항에 있어서, ERBB 수용체 키나제 활성화제가 헤레귤린인 방법.
  15. 제10항에 있어서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 50 ng/mL 이상의 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자와 접촉시키는 것인 방법.
  16. 제10항에 있어서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 25 ng/mL 이상의 Wnt 패밀리 구성원과 접촉시키는 것인 방법.
  17. 제11항에 있어서, 인간의 확정적 내배엽 계통 세포를 TGFβ 슈퍼패밀리 성장 인자 및 Wnt 패밀리 구성원보다 5-15배 더 적은 ERBB 수용체 키나제 활성화제와 접촉시키는 것인 방법.
  18. 제10항에 있어서, 미성숙 베타 세포가 INS 및 NKX6.1을 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는 것인 방법.
  19. 제10항에 있어서, 미성숙 베타 세포가 INS, NKX6.1 및 MAFB를 발현하고, NGN3을 실질적으로 발현하지 않는 것인 방법.
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