JP2018183142A

JP2018183142A - 多能性幹細胞の膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）および内分泌細胞へのｉｎｖｉｔｒｏ分化

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Publication number: JP2018183142A
Application number: JP2018111865A
Authority: JP
Inventors: アランアグルニック、; Agulnick Alan; ケビンダムール、; D'amour Kevin
Original assignee: Viacyte Inc
Current assignee: Viacyte Inc
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2018-06-12
Publication date: 2018-11-22
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: AU2014243791B2; KR102288191B1; KR102328311B1; CA3204013A1; KR20200138434A; AU2021202943C1; KR20210142763A; US11446335B2; US8859286B2; JP2018007670A; US20230165908A1; US20150017135A1; IL294691A; ES2739082T3; AU2019202849A1; WO2014160413A1; AU2019202849B2; JP2022017361A; JP2016513972A; RU2015137400A

Abstract

【課題】多能性幹細胞を、哺乳動物に埋め込んだ後にｉｎｖｉｖｏでグルコース刺激に応答してインスリンを生成する内分泌細胞に、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて分化させるための細胞培養物の提供。【解決手段】ヒト細胞であって、前記ヒト細胞の少なくとも１０％が、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を同時発現する未成熟ベータ細胞である、ヒト細胞と、ｉｎｖｉｔｒｏ細胞培養物において前記未成熟ベータ細胞の生存を促進させる有効量のＹ−２７６３２とを含む、ｉｎｖｉｔｒｏ細胞培養物。【選択図】図４５

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、その開示全体が本明細書に組み込まれる、２０１３年３月１４日出願の米国特許仮出願第６１／７８１，００５号および２０１３年１２月１３日出願の米国実用出願第１４／１０６，３３０号の優先権を主張するものである。

本発明は、一般に、細胞培養物の単離、維持、および使用に関する。より具体的には、本発明は、多能性幹細胞を、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）が濃縮されているが、内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）が比較的豊富な膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）培養物にｉｎｖｉｔｒｏにおいて分化させるための細胞組成物および方法に関する。本明細書には、初めて、多能性幹細胞を、哺乳動物に埋め込んだ後にｉｎｖｉｖｏでグルコース刺激に応答してインスリンを生成する内分泌細胞に、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて分化させるための細胞組成物および方法も記載されている。本明細書には、多能性幹細胞を、ｉｎｖｉｔｒｏでインスリンを生成する内分泌細胞にｉｎｖｉｔｒｏにおいて分化させるための細胞組成物および方法も記載されている。

細胞移植に使用することができるヒト膵臓β細胞の拡張集団の開発は糖尿病研究の主要な目標である。近年は、多能性幹細胞をβ細胞の潜在的な再生可能供給源として使用することに注目が集まっている。膵内分泌系分化は性質が複雑であるので、現在のところまだ解明されておらず、多能性幹細胞から成熟かつ機能的なβ細胞への分化はｉｎｖｉｔｒｏにおいて効率的に実現されていない。現在まで、膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）などの前駆細胞のみがげっ歯類に移植されており、８〜１２週間後に、ヒト特異的β細胞機能が実証されている。ＰＥＣ細胞集団は、少なくとも２種の細胞集団：非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）および内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）を含む。ＰＥＣを埋め込んだ際にｉｎｖｉｖｏで成熟しβ細胞を形成するのは非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）であることが発見された。ＰＥＣ細胞集団の移植には、ｉｎｖｉｖｏにおける長い成熟化時間が必要であり（８〜１２週間）、これは、（ａ）ｉｎｖｉｔｒｏＰＥＣ集団がｉｎｖｉｖｏでβ細胞に成熟する細胞型（すなわち、非内分泌多分化能膵臓前駆細胞（ＣＨＧＡ−））をより多く含有する場合、（ｂ）最終（β細胞）分化がｉｎｖｉｔｒｏで実現される場合、または（ｃ）現在使用されているものよりもさらに分化経路に沿って進んだｉｎｖｉｔｒｏ前駆体集団、すなわち、発生的に進歩した細胞集団が同定される場合に、短縮または排除することができる。

本出願をいかなる理論の１つに限定するものではないが、なぜ多能性幹細胞がｉｎｖｉｔｒｏにおいて十分に機能的なβ細胞に成熟しないかに関する可能性のある説明は、ｉｎｖｉｔｒｏで導出された細胞は、ｉｎｖｉｖｏにおける哺乳動物の膵臓発生と同じ時点で同じマーカーの発現を有さないことである。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏにおける分化の間のＮＧＮ３発現はｉｎｖｉｖｏにおける哺乳動物の膵臓発生よりも前に起こる。実際に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる出願人の多くの刊行物および特許に記載されている従来の４ステージ分化プロトコルでは、ＰＥＣ集団はＮＧＮ３およびＫＸ２．２を発現することが観察されている。したがって、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１同時陽性（ｃｏ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団の分化が発現される後までＮＧＮ３発現を抑制または阻害することは、ｉｎｖｉｔｒｏにおける多能性幹細胞から成熟かつ機能的なβ細胞への分化、あるいは、内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）と比較して非内分泌多分化能膵臓前駆細胞（ＣＨＧＡ−）をより多く含有するＰＥＣ集団の分化を実現することにおける重要なステップである。

ＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２の発現を遅延させるプロトコルの同定は、自明なことではない。なぜならば、その分化プロトコルにより、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）の形成が撹乱されるべきではなく、好ましくはそれが増加するべきであり、また、細胞の損失が最小限になるべきであり、あるいは最低でも適切な細胞質量および細胞収量（すなわち、細胞のマイクログラム数、グラム数、キログラム数）が維持されるべきだからである。

さらに、ＮＧＮ３発現は内分泌細胞分化の開始、膵島細胞の成熟化の促進および島機能の維持に必要であるので、内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）におけるＮＧＮ３発現の刺激または誘導は、ｉｎｖｉｔｒｏにおける多能性幹細胞から成熟かつ機能的なβ細胞への分化を実現することにおける重要なステップである。

一態様では、ヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を生成するｉｎｖｉｔｒｏにおける方法が提供される。当該方法は、胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅｅｎｄｏｄｅｒｍ）系列細胞を含む細胞集団をＴＧＦβスーパーファミリー成長因子およびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を生じさせるステップを含む。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＧＤＦ８、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１およびＧＤＦ−１５からなる群から選択される。複数の実施形態では、当該方法は、胚体内胚葉系列細胞を含む細胞集団をＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子はアクチビンＡである。複数の実施形態では、ＷｎｔファミリーメンバーはＷｎｔ３ａである。複数の実施形態では、ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質はヘレグリンである。

複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる。

複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる。

複数の実施形態では、細胞集団をＴＧＦβスーパーファミリー成長因子およびＷｎｔファミリーメンバーのそれぞれの５分の１〜１５分の１のＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させる。複数の実施形態では、前記ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団の少なくとも約５０％がＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞である。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団の少なくとも約６０％がＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞である。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団の少なくとも約７０％がＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞である。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団の少なくとも約８０％がＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞である。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団の少なくとも約９０％がＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞である。

複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞は、ＮＫＸ６．１をさらに発現し、ＮＧＮ３は実質的に発現しない。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞はＣＨＧＡを発現しない。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞は、ＮＫＸ６．１およびＰＦＴ１Ａをさらに発現し、ＮＧＮ３は実質的に発現しない。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞は単能性の未成熟ベータ細胞に分化することができる多分化能細胞である。

一態様では、胚体内胚葉系列細胞ならびにＴＧＦβスーパーファミリー成長因子およびＷｎｔファミリーメンバーを含むヒト膵臓内胚葉細胞培養物が提供される。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＧＤＦ８、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１およびＧＤＦ−１５からなる群から選択される。複数の実施形態では、当該方法は、胚体内胚葉系列細胞を含む細胞集団をＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子はアクチビンＡである。複数の実施形態では、ＷｎｔファミリーメンバーはＷｎｔ３ａである。複数の実施形態では、ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質はヘレグリンである。

別の態様では、ｉｎｖｉｔｒｏ単能性ヒト未成熟ベータ細胞が提供される。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞はＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞は、成熟ベータ細胞に分化することができる。複数の実施形態では、分化はｉｎｖｉｖｏにおけるものである。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞は、細胞集団の一部を形成する。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも１０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも２０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも３０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも４０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも５０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも６０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも８０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも９０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも９８％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、ヒト未成熟ベータ細胞は単一ホルモン性（ｓｉｎｇｌｙｈｏｒｍｏｎａｌ）である。複数の実施形態では、単能性ヒト細胞はＭＡＦＢを発現する。

一態様では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成する方法が提供される。当該方法は、ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞を生じさせるステップを含む。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞はＩＮＳ、ＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーは、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＧＤＦ８、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１およびＧＤＦ−１５からなる群から選択される。複数の実施形態では、当該方法は、ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子はアクチビンＡである。複数の実施形態では、ＷｎｔファミリーメンバーはＷｎｔ３ａである。複数の実施形態では、ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質はヘレグリンである。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子はＢＭＰである。

複数の実施形態では、当該方法は、ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでニコチンアミド、レチノイン酸もしくはレチノイン酸類似体、ｒｈｏキナーゼ阻害剤またはガンマセレクターゼ阻害剤と接触させるステップをさらに含む。複数の実施形態では、レチノイン酸は、オールトランス−レチノイン酸（ＲＡ）、１３−シス−レチノイン酸（１３−シス−ＲＡ）、およびアロチノイド酸（ＴＴＮＰＢ）からなる群から選択される。複数の実施形態では、レチノイン酸はオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）である。複数の実施形態では、レチノイン酸は１３−シス−レチノイン酸（１３−シス−ＲＡ）である。複数の実施形態では、レチノイン酸はアロチノイド酸（ＴＴＮＰＢ）である。複数の実施形態では、ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６およびＹ−３０１４１からなる群から選択される。複数の実施形態では、ｒｈｏキナーゼ阻害剤はＹ−２７６３２である。

複数の実施形態では、ガンマセレクターゼ阻害剤は、ガンマセレクターゼ阻害剤Ｉ（ＧＳＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＩ（ＧＳＩＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＩＩ（ＧＳＩＩＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＶ（ＧＳＩＩＶ）、ガンマセレクターゼ阻害剤Ｖ（ＧＳＩＶ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＶＩ（ＧＳＩＶＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＶＩＩ（ＧＳＩＶＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＸ（ＧＳＩＩＸ）、（ＤＡＰＴ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩ（ＧＳＩＸＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＩ、（ＧＳＩＸＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＩＩ（ＧＳＩＸＩＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＶ（ＧＳＩＸＩＶ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＶＩ（ＧＳＩＸＶＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＶＩＩ（ＧＳＩＸＶＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＸ（ＧＳＩＸＩＸ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＸ（ＧＳＩＸＸ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＸＩ（ＧＳＩＸＸＩ）、ガンマ４０セレクターゼ阻害剤Ｉ、ガンマ４０セレクターゼ阻害剤ＩＩおよびＲＯ４９２９０９７からなる群から選択される。複数の実施形態では、ガンマセレクターゼ阻害剤はＲＯ４９２９０９７である。複数の実施形態では、ガンマセレクターゼ阻害剤はＧＳＩＩＶである。

別の態様では、成熟ベータ細胞をｉｎｖｉｖｏで生成するための方法が提供される。当該方法は、（ａ）ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞を生じさせるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の未成熟ベータ細胞を哺乳動物対象に移植するステップと、未成熟ベータ細胞をｉｎｖｉｖｏで分化させて成熟ベータ細胞を含む細胞の集団を生成するステップとを含む。複数の実施形態では、当該方法は、成熟ベータ細胞に、グルコース刺激に応じてインスリンを生成させることをさらに含む。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡおよびアクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１およびＧＤＦ−１５からなる群から選択される。複数の実施形態では、当該方法は、ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子はアクチビンＡである。複数の実施形態では、ＷｎｔファミリーメンバーはＷｎｔ３ａである。複数の実施形態では、ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質はヘレグリンである。

複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる。複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる。複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる。

複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる。複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる。複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる。

複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞をＴＧＦβスーパーファミリー成長因子およびＷｎｔファミリーメンバーの５分の１〜１５分の１のＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させる。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも１０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも２０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも３０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも４０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも５０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも６０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも７０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも８０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも９０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、未成熟ベータ細胞はＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。複数の実施形態では、未成熟ベータ細胞はＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。

一態様では、ｉｎｖｉｔｒｏ単能性ヒト未成熟ベータ細胞が提供される。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞はＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞は、成熟ベータ細胞へと成熟することができる。

一態様では、成熟ベータ細胞をｉｎｖｉｖｏで生成するための方法が提供される。当該方法は、ａ．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞を生じさせるステップと、ｂ．ステップ（ａ）の未成熟ベータ細胞を哺乳動物対象に移植するステップと、ｃ．未成熟ベータ細胞をｉｎｖｉｖｏで成熟させて、インスリン分泌性ベータ細胞を含む細胞の集団を生成するステップとを含む。

一態様では、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない単能性ヒト未成熟ベータ細胞が提供される。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞は、成熟ベータ細胞へと成熟することができる。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞はＭＡＦＢをさらに発現する。

一態様では、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しないｉｎｖｉｔｒｏ単能性ヒト未成熟ベータ細胞が提供される。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞は、成熟ベータ細胞へと成熟することができる。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞はＭＡＦＢをさらに発現する。

一態様では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成する方法が提供される。当該方法は、ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成するステップを含む。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞はＩＮＳ、ＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。複数の実施形態では、当該方法は、ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子はアクチビンＡである。複数の実施形態では、ＷｎｔファミリーメンバーはＷｎｔ３ａである。複数の実施形態では、ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質はヘレグリンである。

一態様では、成熟ベータ細胞をｉｎｖｉｖｏで生成するための方法が提供される。当該方法は、ａ．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞を生じさせるステップと、ｂ．ステップ（ａ）の未成熟ベータ細胞を哺乳動物対象に移植するステップと、ｃ．未成熟ベータ細胞をｉｎｖｉｖｏで成熟させて、インスリン分泌性ベータ細胞を含む細胞の集団を生成するステップとを含む。複数の実施形態では、当該方法は、ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子はアクチビンＡである。複数の実施形態では、ＷｎｔファミリーメンバーはＷｎｔ３ａである。複数の実施形態では、ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質はヘレグリンである。複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる。複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる。複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞をＴＧＦβスーパーファミリー成長因子およびＷｎｔファミリーメンバーの５分の１〜１５分の１のＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させる。複数の実施形態では、未成熟ベータ細胞は、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。複数の実施形態では、未成熟ベータ細胞は、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。

一実施形態では、多能性幹細胞または多能性幹細胞から導出された先駆細胞を、内分泌集団および非内分泌集団に分化させるための組成物および方法が提供される。一態様では、内分泌細胞は少なくともＣＨＧＡを発現し（またはＣＨＧＡ＋）、非内分泌細胞はＣＨＧＡを発現しない（またはＣＨＧＡ−）。一態様では、これらの細胞集団は内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団および非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団、または単にＣＨＧＡ＋亜集団もしくはＣＨＧＡ−亜集団、または単に内分泌亜集団および非内分泌亜集団と称される。別の態様では、これらの内分泌亜集団および非内分泌亜集団は、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団または内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団などの多分化能前駆体／先駆体亜集団であってもよく、未成熟内分泌細胞、好ましくは未成熟ベータ細胞、未成熟グルカゴン細胞などの単能性亜集団であってもよい。

一実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、内分泌亜集団と非内分泌亜集団の両方を含む膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）培養物であって、ＮＧＮ３の発現が抑制されている膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）培養物に分化させるための組成物および方法が提供される。一態様では、ＰＥＣ培養物においてＮＫＸ２．２の発現も抑制されている。一態様では、ＰＥＣ培養物においてＣＨＧＡの発現も抑制されている。一態様では、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１の発現はＰＥＣ培養物中の単一細胞での同時発現である。一態様では、ＰＥＣ培養物中の細胞の５０％未満、好ましくは４０％未満、３０％、より好ましくは２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満がＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２またはＣＨＧＡを発現する。一態様では、ＰＥＣ培養物は非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）が濃縮されている。一態様では、ＰＥＣ培養物では、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）のマーカー（ＰＤＸ１および／またはＮＫＸ６．１）が発現されている。一態様では、豊富な非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を伴うＰＥＣ培養物を哺乳動物宿主に埋め込み、移植片を成熟させ、ｉｎｖｉｖｏにおいてグルコースに応答してインスリンを生成させる。一態様では、豊富な非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を伴うＰＥＣ培養物は、ｉｎｖｉｖｏにおいて、豊富な非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を伴わないＰＥＣ培養物よりも速い速度で成熟する。一態様では、豊富な非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を伴う埋め込まれたＰＥＣ培養物は、埋め込み後約１０週間または約１２週間の時点で、グルコース刺激に応答したＣ−ペプチド（インスリン）生成によって測定されるｉｎｖｉｖｏの機能が、豊富な非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を伴わない埋め込まれたＰＥＣ培養物の少なくとも２倍に改善されている。

一実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏで多能性ヒト幹細胞を分化させるための組成物および方法であって、内分泌系の分化および発生に典型的なＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２などの遺伝子の発現が、非内分泌性多分化能膵臓前駆体（ＣＨＧＡ−かつＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１同時発現）の生成後まで抑制される組成物および方法が提供される。

一実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、ＰＥＣ培養物に分化させるための方法であって、（ａ）ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団を得るステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞集団を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質と接触させ、それにより、ＣＨＧＡ、ＮＧＮ３またはＮＫＸ２．２を含む群から選択されるマーカーを実質的に発現しないＰＥＣを含む細胞培養物を生じさせるステップとを含む方法が提供される。一態様では、ＰＥＣは、ＰＤＸ１とＮＫＸ６．１を同時発現する細胞の亜集団を含む。一態様では、ＰＥＣは、非内分泌性多分化能膵臓前駆体（ＣＨＧＡ−）細胞の亜集団を含む。一態様では、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＧＤＦ８、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１５およびその混合物からなる群から選択される。一態様では、アクチビンＡをステージ３に１００ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬで添加し、ステージ４に１５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、アクチビンＡをＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団に添加することによって形成されたＰＥＣ培養物は、グルコース刺激に応答したＣ−ペプチド（インスリン）生成によって測定されるｉｎｖｉｖｏの機能が、豊富な非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を伴わないＰＥＣ培養物の少なくとも２倍に改善されている。

一態様では、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を伴うＰＥＣ培養物は、グルコース刺激に応答したインスリン生成によって測定されるｉｎｖｉｖｏの機能が、豊富な非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を伴わないＰＥＣ細胞培養物の少なくとも２倍に改善されている。

一実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、ＰＥＣを含む細胞集団に分化させるための方法であって、（ａ）ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団を得るステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞集団を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質と接触させ、それにより、ＣＨＧＡ、ＮＧＮ３またはＮＫＸ２．２を含む群から選択されるマーカーを実質的に発現しないＰＥＣ集団を生じさせるステップとを含む方法が提供される。一態様では、ＰＥＣ集団は、ＰＤＸ１とＮＫＸ６．１を同時発現する細胞を含む。一態様では、ＰＥＣ集団は、非内分泌多分化能膵臓前駆細胞（ＣＨＧＡ−）を含む。一態様では、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＧＤＦ８、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１５およびその混合物からなる群から選択される。一態様では、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質はアクチビンＡである。一態様では、アクチビンＡをステージ３に１００ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬで添加し、ステージ４に１５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、ＥＧＦファミリーリガンドは、ヘレグリン（ニューレグリン１（ＮＲＧ１）としても公知である）、ニューレグリン２（ＮＲＧ２）、ニューレグリン３（ＮＲＧ３）、ニューレグリン４（ＮＲＧ４）、ＥＧＦ（上皮成長因子）およびベータセルリンを含む群から選択される。一態様では、ＥＧＦファミリーリガンドはヘレグリンである。一態様では、ヘレグリンを２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬまたは８０ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、アクチビンＡおよびヘレグリンをＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団に添加することによって形成されたＰＥＣ培養物は、グルコース刺激に応答したＣ−ペプチド（インスリン）生成によって測定されるｉｎｖｉｖｏの機能が、豊富な非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を伴わないＰＥＣ培養物の少なくとも２倍に改善されている。

一実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、ＰＥＣを含む細胞培養物に分化させるための方法であって、（ａ）ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団を得るステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞集団を、少なくとも、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質、ＥＧＦファミリーリガンドまたはＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する作用物質と、単独でまたは組み合わせて接触させ、それにより、ＣＨＧＡ、ＮＧＮ３またはＮＫＸ２．２を含む群から選択されるマーカーを実質的に発現しないＰＥＣを含む細胞培養物を生じさせるステップとを含む方法が提供される。一態様では、ＰＥＣ培養物は、ＰＤＸ１とＮＫＸ６．１を同時発現する細胞を含む。一態様では、ＰＥＣ細胞培養物は、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を含む。一態様では、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＧＤＦ８、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１５およびその混合物からなる群から選択される。一態様では、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質はアクチビンＡである。一態様では、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する作用物質は、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６およびＷｎｔ３Ａを含む群から選択されるＷｎｔファミリーメンバーである。一態様では、ＷｎｔファミリーメンバーはＷｎｔ３Ａである。一態様では、アクチビンＡをステージ３に１００ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬで添加し、ステージ４に１５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、ヘレグリンを２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬまたは８０ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、ＷＮＴを５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ〜７５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬで添加する。

一態様では、ステージ３にアクチビンＡを単独でまたはＷＮＴと組み合わせて添加する。別の態様では、ステージ３にアクチビンＡをＷＮＴまたはＷＮＴおよびヘレグリンと一緒に添加する。さらにもう１つの態様では、ステージ４にアクチビンＡを単独でまたはヘレグリンと組み合わせて添加する。

一態様では、細胞集団内の細胞の１０％超、好ましくは２０％超、３０％超、４０％超、より好ましくは５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超または１００％が非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）である。一態様では、アクチビンＡ、ヘレグリンおよびＷＮＴをＰＤＸ１−陰性前腸内胚葉細胞集団に添加することによって形成されたＰＥＣ細胞培養物は、グルコース刺激に応答したインスリン生成によって測定されるｉｎｖｉｖｏの機能が、豊富な非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を伴わないＰＥＣ細胞培養物の少なくとも２倍に改善されている。

一実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、内分泌系列に傾倒した最小限の細胞（ＣＨＧＡ＋）を含むＰＥＣ培養物に分化させるための組成物および方法が提供される。一態様では、内分泌系列に傾倒した細胞は、ＣＨＧＡの発現を特徴とする。一態様では、ＰＥＣ培養物中の細胞の５０％未満、好ましくは４０％未満、３０％未満、より好ましくは２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満が内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）である。

一実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、実質的なＰＥＣ培養物に分化させ、ｉｎｖｉｔｒｏでＰＥＣ培養物を内分泌細胞にさらに分化させるための組成物および方法が提供される。一態様では、内分泌細胞はＣＨＧＡを発現する。一態様では、内分泌細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてインスリンを生成することができる。一態様では、ｉｎｖｉｔｒｏ内分泌インスリン分泌細胞は、グルコース刺激に応答してインスリンを生成することができる。一態様では、細胞集団内の細胞の１０％超、好ましくは２０％超、３０％超、４０％超、より好ましくは５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超または１００％が内分泌細胞である。

一実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、内分泌細胞に分化させるための方法であって、（ａ）ＰＥＣを含む細胞集団を得るステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞集団を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ヘッジホッグ阻害剤、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー、レチノイド、インスリン成長因子１および２（ＩＧＦ１およびＩＧＦ２）ならびにニコチンアミドからなる群から選択される成長因子と接触させ、それにより、内分泌細胞を生じさせるステップとを含む方法が提供される。一態様では、内分泌細胞はＣＨＧＡを発現する。一態様では、内分泌細胞はｉｎｖｉｔｒｏにおける未成熟インスリン生成ベータ細胞である。一態様では、内分泌細胞は、埋め込み型半透性封入デバイスにローディングされた、成熟しており、ｉｎｖｉｖｏでグルコース刺激に応答してインスリンを生成することができるものである。一態様では、細胞集団内の細胞の１０％超、好ましくは２０％超、３０％超、４０％超、より好ましくは５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超または１００％が内分泌細胞である。一態様では、ＳＳＨを１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、ＰＤＧＦを１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、ＢＭＰを１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、ＦＧＦ２を２ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２を２５ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、上記の化合物を互いと組み合わせて添加する。一態様では、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーはＦＧＦ２である。一態様では、レチノイドは、レチノイン酸および／またはＴＴＮＰＢもしくはＴＴ３などのレチノイン酸類似体、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ１）およびインスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩもしくはＩＧＦ２）である。一態様では、骨形成タンパク質はＢＭＰ４である。一態様では、ヘッジホッグ阻害剤は、ソニックヘッジホッグ、ＫＡＡＤ−シクロパミン、ＫＡＡＤ−シクロパミン類似体、ジェルビン、ジェルビン類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体および当業者に公知の任意の他のヘッジホッグ経路機能の阻害剤である。

一実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、内分泌細胞に分化させるための方法であって、（ａ）ＰＥＣを含む細胞集団を得るステップと、（ｂ）ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、ステップ（ａ）の細胞集団を、ガンマセレクターゼ阻害剤と接触させ、それにより、内分泌細胞を作製するステップとを含む方法が提供される。一態様では、内分泌細胞はＣＨＧＡを発現する。一態様では、内分泌細胞はｉｎｖｉｔｒｏにおける未成熟インスリン生成ベータ細胞である。一態様では、内分泌細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏでグルコース刺激に応答してインスリンを生成するインスリン分泌細胞である。一態様では、内分泌細胞は、埋め込み型半透性封入デバイスにローディングされた、成熟しており、ｉｎｖｉｖｏでグルコース刺激に応答してインスリンを生成することができるものである。一態様では、ガンマセレクターゼ阻害剤は、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）、ＲＯ４４９２９０９７、１−（Ｓ）−ｅｎｄｏ−Ｎ−（１，３，３）−トリメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−イル）−４−フルオロフェニルスルホンアミド、ＷＰＥ−ＩＩＩ３１Ｃ、Ｓ−３−［Ｎ’−（３，５−ジフルオロフェニル−α−ヒドロキシアセチル）−Ｌ−アラニリル］アミノ−２，３−ジヒドロ−１−メチル−５−フェニル−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン、（Ｎ）−［（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−メチル−ブチリル］−１−（Ｌ−アラニニル）−（Ｓ）−１−アミノ−３−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−３−ベンゾアゼピン−２−オン、ＢＭＳ−７０８１６３（Ａｖａｇａｃｅｓｔａｔ）、ＢＭＳ−７０８１６３、Ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ（ＬＹ４５０１３９）、Ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ（ＬＹ４５０１３９）、ＭＫ−０７５２、ＭＫ−０７５２、ＹＯ−０１０２７、ＹＯ−０１０２７（ジベンザゼピン、ＤＢＺ）、ＬＹ−４１１５７５、ＬＹ−４１１５７５、またはＬＹ２８１１３７６を含む群から選択される。一部の実施形態では、ガンマセレクターゼ阻害剤は、細胞培養物または細胞集団中に約０．０１μＭから約１０００μＭまでにわたる濃度で存在する。好ましい実施形態では、ガンマセレクターゼ阻害剤は、細胞培養物または細胞集団中に約０．１μＭから約１００μＭまでにわたる濃度で存在する。一態様では、ガンマセレクターゼ阻害剤を、添加後に除去する。

本明細書に記載の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏで多能性ヒト幹細胞を内分泌細胞に分化させる組成物および方法が提供される。一態様では、内分泌細胞はＣＨＧＡを発現する。一態様では、内分泌細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてインスリンを生成することができる。一態様では、内分泌細胞は未成熟ベータ細胞などの未成熟内分泌細胞である。一態様では、ｉｎｖｉｔｒｏインスリン生成細胞は、グルコース刺激に応答してインスリンを生成することができる。

一実施形態では、哺乳動物においてｉｎｖｉｖｏでインスリンを生成させるための方法であって、（ａ）内分泌細胞集団を埋め込み型半透性デバイスにローディングするステップと、（ｂ）内分泌細胞を伴うデバイスを哺乳動物宿主に埋め込むステップと、（ｃ）前記デバイス中の内分泌細胞集団をｉｎｖｉｖｏで成熟させるステップとを含み、内分泌細胞の少なくとも一部がｉｎｖｉｖｏでグルコース刺激に応答してインスリンを生成するインスリン分泌細胞であり、それにより、哺乳動物においてｉｎｖｉｖｏでインスリンが生成される方法が提供される。一態様では、内分泌細胞は、より多くの非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を伴うＰＥＣを含む細胞組成物から導出される。別の態様では、内分泌細胞は、内分泌亜集団（ＣＨＧＡ＋）が少ないＰＥＣを含む細胞組成物から導出される。別の態様では、内分泌細胞は、未成熟内分泌細胞、好ましくは未成熟ベータ細胞である。

一態様では、内分泌細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏでＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉集団、またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１陽性である非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団と比較してＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１をより多く発現する多能性幹細胞から作製される。一態様では、内分泌細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏでＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１をＰＥＣ非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）よりも比較的多く発現する多能性幹細胞から作製される。一態様では、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）およびレチノイン酸（ＲＡ）類似体を、単独でまたは組み合わせて細胞培養物に添加して、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１の発現がＰＥＣ非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）と比較して増加している内分泌細胞を得る。一態様では、ＢＭＰは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８およびＢＭＰ４を含む群から選択され、ＢＭＰ４であることがより好ましい。一態様では、レチノイン酸類似体は、オールトランスレチノイン酸およびＴＴＮＰＢ（４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−ｌ−プロペニル］安息香酸アロチノイド酸）、または０．１〜１０μＭのＡＭ−５８０（４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキシアミド］安息香酸）を含む群から選択され、ＴＴＮＰＢであることがより好ましい。

一実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、内分泌細胞および未成熟内分泌細胞、好ましくは未成熟ベータ細胞に分化させるための方法であって、凝集体を解離させ再会合させることを含む方法が提供される。一態様では、解離および再会合は、ステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、ステージ５、ステージ６またはステージ７またはこれらの組合せにおいて起こる。一態様では、胚体内胚葉、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＥＣ、および／または内分泌細胞および内分泌前駆／先駆細胞を解離させ、再会合させる。一態様では、ステージ７において、内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団と比較して少ない非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団からなる細胞凝集体を解離させ、再凝集させる。一態様では、細胞集団内の細胞の１０％超、好ましくは２０％超、３０％超、４０％超、より好ましくは５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超または１００％が内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞である。

一実施形態では、ステージ４ＰＥＣ生成の間に作製された内分泌細胞を除去し、それにより、ＰＤＸ１＋かつＮＫＸ６．１＋である非内分泌性多分化能膵臓前駆体（ＣＨＧＡ−）亜集団を濃縮することによって、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、内分泌細胞に分化させるための方法が提供される。

一実施形態では、表１７において定義されるステージ６細胞およびステージ７細胞を約０．０２％〜２％、好ましくは約０．０２％〜０．０５％、好ましくは約０．０５％〜１％、好ましくは０．０５％の低レベルのマトリゲルで培養する、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、内分泌細胞に分化させるための方法が提供される。

一実施形態では、細胞培養物をマトリゲルおよびｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤で処理することによってＰＥＣと内分泌細胞凝集体の細胞接着を改善するための方法が提供される。一態様では、ｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤はＹ−２７６３２である。

一実施形態では、非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）が濃縮されたＰＥＣ培養物を、ステージ３および／またはステージ４にノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）ファミリーメンバーを添加しないことによって作製する。一実施形態では、内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）が比較的豊富なＰＥＣ培養物を、ステージ３および／またはステージ４にノギンファミリーメンバーを添加しないことによって作製する。一態様では、ノギンファミリーメンバーは、ノギン、コーディン、フォリスタチン、フォリスタチン様タンパク質、ケルベロス、ココ、ダン、グレムリン、スクレロスチン、ＰＲＤＣ（ダンおよびケルベロスに関連するタンパク質）を含む群から選択される化合物である。

一実施形態では、培養物中の内分泌細胞を、高レベルの外因性グルコースを含む培地であって、添加される外因性グルコースが約１ｍＭ〜２５ｍＭ、約１ｍＭ〜２０ｍＭ、約５ｍＭ〜１５ｍＭ、約５ｍＭ〜１０ｍＭ、約５ｍＭ〜８ｍＭである培地で培養することによって維持するための方法が提供される。一態様では、培地は、ＤＭＥＭ、ＣＭＲＬまたはＲＰＭＩに基づく培地である。

一実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、細胞凝集体の解離と再会合を伴って、およびそれを伴わないで、内分泌細胞に分化させるための方法が提供される。一態様では、ステージ６および／またはステージ７に、内分泌細胞のｉｎｖｉｖｏの機能に影響を及ぼすことなく、解離していないまたは解離し再会合した細胞凝集体を凍結保存または凍結する。一態様では、凍結保存した内分泌細胞培養物を解凍し、培養し、移植すると、それはｉｎｖｉｖｏで機能する。

別の実施形態では、多能性幹細胞を内分泌細胞に分化させるための培養系であって、少なくとも、分化の初期に内分泌遺伝子発現を抑制または阻害することができる作用物質および分化の後期に内分泌遺伝子発現を誘導することができる作用物質を含む培養系が提供される。一態様では、内分泌遺伝子発現を抑制または阻害することができる作用物質を膵臓ＰＤＸ１陰性前腸細胞からなる培養系に添加する。一態様では、内分泌遺伝子発現を誘導することができる作用物質をＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉前駆体またはＰＥＣからなる培養系に添加する。一態様では、内分泌遺伝子発現を抑制または阻害することができる作用物質はＴＧＦベータ受容体ファミリーを活性化する作用物質であり、アクチビンであることが好ましく、高レベルのアクチビン、その後に低レベルのアクチビンであることが好ましい。一態様では、内分泌遺伝子発現を誘導することができる作用物質は、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）、ＲＯ４４９２９０９７、ＤＡＰＴ（Ｎ−−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル）、１−（Ｓ）−ｅｎｄｏ−Ｎ−（１，３，３）−トリメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−イル）−４−フルオロフェニルスルホンアミド、ＷＰＥ−ＩＩＩ３１Ｃ、Ｓ−３−［Ｎ’−（３，５−ジフルオロフェニル−α−ヒドロキシアセチル）−Ｌ−アラニリル］アミノ−２，３−ジヒドロ−１−メチル−５−フェニル−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン、（Ｎ）−［（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−メチル−ブチリル］−１−（Ｌ−アラニニル）−（Ｓ）−１−アミノ−３−メチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−３−ベンゾアゼピン−２−オン、ＢＭＳ−７０８１６３（Ａｖａｇａｃｅｓｔａｔ）、ＢＭＳ−７０８１６３、Ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ（ＬＹ４５０１３９）、Ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ（ＬＹ４５０１３９）、ＭＫ−０７５２、ＭＫ−０７５２、ＹＯ−０１０２７、ＹＯ−０１０２７（ジベンザゼピン、ＤＢＺ）、ＬＹ−４１１５７５、ＬＹ−４１１５７５、またはＬＹ２８１１３７６からなる群から選択されるガンマセレクターゼ阻害剤である。一態様では、高レベルのアクチビンとは、４０ｎｇ／ｍＬ超、５０ｎｇ／ｍＬ超、および７５ｎｇ／ｍＬ超のレベルを意味する。一態様では、ステージ３の間または膵臓前腸内胚葉細胞の生成前に高レベルのアクチビンを使用する。一態様では、低レベルのアクチビンとは、３０ｎｇ／ｍＬ未満、２０ｎｇ／ｍＬ未満、１０ｎｇ／ｍＬ未満および５ｎｇ／ｍＬ未満を意味する。一態様では、ステージ４の間またはＰＥＣを生成するために低レベルのアクチビンを使用する。一態様では、阻害または誘導される内分泌遺伝子はＮＧＮ３である。別の態様では、内分泌発現を阻害するため、好ましくは、膵臓前腸内胚葉細胞の生成前、または好ましくはステージ３の間にＮＧＮ３発現を阻害するために、アクチビンＡおよびＷｎｔ３Ａを単独でまたは組み合わせて使用する。一態様では、ＰＥＣの生成後、または好ましくはステージ５、ステージ６および／またはステージ７の間に内分泌遺伝子発現の発現を誘導するために、ガンマセレクターゼ阻害剤、好ましくはＲＯ４４９２９０９７またはＤＡＰＴを培養系に使用する。

内分泌細胞を含むｉｎｖｉｔｒｏ細胞培養物であって、前記ヒト細胞の少なくとも５％が、インスリン（ＩＮＳ）、ＮＫ６ホメオボックス１（ＮＫＸ６．１）、膵臓および十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）、転写遺伝子関連遺伝子座（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｌａｔｅｄｌｏｃｕｓ）２（ＮＫＸ２．２）、ペアードボックス４（ＰＡＸ４）、神経原性分化（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１（ＮＥＵＲＯＤ）、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）、フォークヘッドボックスＡ２（ＦＯＸＡ２）、スネイルファミリージンクフィンガー（ｓｎａｉｌｆａｍｉｌｙｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒ）２（ＳＮＡＩＬ２）、および筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ファミリー（ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａｏｎｃｏｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ）ＡおよびＢ（ＭＡＦＡおよびＭＡＦＢ）からなる群から選択される内分泌マーカーを発現し、かつ、ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）、アイレット１（ＩＳＬ１）、肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）、ＧＡＴＡ結合性タンパク質４（ＧＡＴＡ４）、ＧＡＴＡ結合性タンパク質６（ＧＡＴＡ６）、膵臓特異的転写因子（ｐａｎｃｒｅａｓｓｐｅｃｉｆｉｃｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）Ｉａ（ＰＴＦ１Ａ）およびＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−９（ＳＯＸ９）からなる群から選択されるマーカーを実質的に発現せず、前記内分泌細胞が単能性であり、膵ベータ細胞に成熟することができる、細胞培養物。

内分泌細胞は未成熟ベータ細胞であることが好ましい。

前記ヒト細胞の少なくとも１０％が未成熟ベータ細胞であることが好ましい。

前記ヒト細胞の少なくとも２０％が未成熟ベータ細胞であることが好ましい。

前記ヒト細胞の少なくとも５０％が未成熟ベータ細胞であることが好ましい。

細胞は非組換え型であることが好ましい。

細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、単為生殖生物細胞、胚性癌腫細胞（ＥＣ）細胞、中内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸｌ−１陰性膵臓前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓前腸内胚葉細胞、および膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）からなる群から選択されるヒト多能性幹細胞から導出されたことが好ましい。

未成熟ベータ細胞を生成するための方法であって、ａ）ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する因子と接触させ、それにより、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞集団を生成するステップと、ｂ）ＰＤＸ陽性膵臓内胚葉細胞集団をガンマセレクターゼ阻害剤と接触させ、それにより、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現する未成熟ベータ細胞を生成するステップとを含む方法。

ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団をＷｎｔファミリーメンバーおよびヘレグリンファミリーメンバーと接触させることが好ましい。

ＴＧＦベータ受容体ファミリーメンバーは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１およびＧＤＦ１５からなる群から選択されることが好ましい。

ＴＧＦベータ受容体ファミリーメンバーは、アクチビンＡ、ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１であることが好ましい。

ＴＧＦベータ受容体ファミリーメンバーはアクチビンＡであることが好ましい。

Ｗｎｔファミリーメンバーは、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択されることが好ましい。

ＷｎｔファミリーメンバーはＷｎｔ３ａであることが好ましい。

ヘレグリン（ＨＲＧ）ファミリーメンバーはＨＲＧ１、ＨＲＧ２、ＨＲＧ３およびＨＲＧ４であることが好ましい。

ＨＲＧファミリーメンバーはＨＲＧ１およびＨＲＧ２であることが好ましい。

ｉｎｖｉｖｏでインスリンを生成させるための方法であって、ａ）ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する因子と接触させ、それにより、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞集団を生成するステップと、ｂ）ＰＤＸ陽性膵臓内胚葉細胞集団をガンマセレクターゼ阻害剤と接触させ、それにより、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現する未成熟ベータ細胞を生成するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）からの未成熟ベータ細胞を埋め込むステップと、ｄ）細胞を、ｉｎｖｉｖｏでグルコース刺激に応答してインスリンを分泌する成熟ベータ細胞に成熟させるステップとを含む方法。

本発明の好ましい特徴および態様は以下の通りである。

ステージ７において、なお作用物質により遺伝子発現を調節することができる。ステージ７にＦＧＦスーパーファミリーのメンバーを添加することが好ましい。ステージ７にＦＧＦ２を添加することが好ましい。ＦＧＦ２により、ＳＳＴ発現を増加させ、かつ／またはＩＮＳ発現、ＧＣＧ発現またはＧＨＲＬ発現を抑制することができる。ステージ７にＢＭＰを添加することが好ましい。ＢＭＰにより、ＩＮＳ発現、ＰＤＸ１発現またはＩＤＩ発現を増加させることができる。

ｉｎｖｉｖｏの機能を生じさせる未成熟ベータ細胞集団。未成熟ベータ集団はＣＨＧＡ＋であることが好ましい。未成熟ベータ細胞集団は、ｉｎｖｉｖｏで機能することができる、すなわち、移植されると血中グルコースに応答してインスリンを分泌することが好ましい。内分泌細胞集団は、移植されると、機能的な膵島細胞に発達および成熟することができるものであることが好ましい。未成熟ベータ細胞集団は内分泌細胞が濃縮された（または非内分泌細胞を枯渇させた）ものであることが好ましい。好ましい実施形態では、未成熟ベータ細胞集団内の細胞の約５０％超がＣＨＧＡ＋である。より好ましい実施形態では、未成熟ベータ細胞集団内の細胞の約６０％超または７０％超または８０％超または９０％超または９５％超または９８％超または１００％がＣＨＧＡ＋である。好ましい実施形態では、未成熟ベータ細胞集団内の細胞の約５０％未満がＣＨＧＡ−である。より好ましい実施形態では、未成熟ベータ細胞集団内の細胞の約１５％未満がＣＨＧＡ−である。より好ましい実施形態では、未成熟ベータ細胞集団内の細胞の約１０％未満または５％未満または３％未満または２％未満または１％未満または０．５％未満または０％がＣＨＧＡ−である。さらに、ＮＧＮ３発現などのある特定のマーカーの発現を、ステージ３中、未成熟ベータ細胞の生成の間、抑制することができる。未成熟ベータ細胞集団は単一ホルモン性（例えば、ＩＮＳのみ）であることが好ましい。未成熟ベータ細胞集団は、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を含めた他の細胞マーカーを同時発現することが好ましい。未成熟ベータ細胞集団は、単一ホルモン性であり、かつＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を含めた他の細胞マーカーを同時発現することが好ましい。未成熟ベータ細胞集団は、全ＩＮＳ集団に対する百分率としてより多くの単一ホルモン発現ＩＮＳ細胞を有することが好ましい。未成熟ベータ細胞集団は、全ＩＮＳ集団に対する百分率として少なくとも５０％の単一ホルモン発現ＩＮＳ細胞を有することが好ましい。未成熟ベータ細胞集団はＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）であることが好ましい。好ましい実施形態では、未成熟ベータ細胞集団内の細胞の約２５％超がＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）である。好ましい実施形態では、未成熟ベータ細胞集団内の細胞の約３０％超または４０％超または５０％超または６０％超または７０％超または８０％超または９０％超または９５％超または１００％がＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）である。

濃縮された未成熟ベータ細胞集団は、細胞凝集体を解離させ、再凝集させることによって作製される。濃縮された未成熟ベータ細胞集団をステージ７において解離させ、再凝集させることが好ましい。未成熟ベータ細胞集団を約２５日目または２６日目または２７日目または２８日目または２９日目または３０日目またはそれ以降に解離させ、再凝集させることが好ましい。

内分泌細胞を維持するためには複合培地が重要である。複合培地はＣＭＲＬまたはＲＰＭＩであることが好ましい。ステージ６もしくはステージ７において、またはステージ６およびステージ７の両方において複合培地を使用することが好ましい。ＣＭＲＬにより内分泌マーカーの発現が増加する。ＲＰＭＩにより内分泌マーカーの発現が増加する。

ステージ７において凍結保存により未成熟ベータ細胞集団は減少しない。ステージ７において凍結保存によりＣＨＧＡ＋発現は低下しない。

ステージ７細胞はＮＫＸ６．１陽性である。ステージ７細胞はＣ−ペプチド陽性である。ステージ７細胞はＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチド同時陽性である。ステージ７細胞は単一ホルモン性である。ステージ７細胞は、ＩＮＳおよびＧＣＧを単独で発現する。

ステージ７細胞の解離および再凝集はｉｎｖｉｖｏの機能に影響を及ぼさない。

ステージ７細胞の凍結保存はｉｎｖｉｖｏの機能に影響を及ぼさない。

ステージ７細胞は凍結保存することができ、それらのｉｎｖｉｖｏの機能は保持される。

グルコース濃度を上昇させるとＩＮＳ発現、ＧＣＧ発現またはＳＳＴ発現が増加する。ステージ６もしくはステージ７またはその両方においてグルコース濃度を上昇させることが好ましい。グルコース濃度が上昇するに伴ってＧＨＲＬ発現が減少することが好ましい。

単一ホルモン性（ＩＮＳのみ）であるｉｎｖｉｔｒｏ未成熟ベータ細胞。

ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を同時発現するｉｎｖｉｔｒｏ未成熟ベータ細胞。

単一ホルモン性（ＩＮＳのみ）であり、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を同時発現するｉｎｖｉｔｒｏ未成熟ベータ細胞。

単一ホルモン性（ＩＮＳのみ）であり、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を同時発現し、血中グルコースに応答してインスリンを分泌することができる細胞にｉｎｖｉｖｏで成熟することができるｉｎｖｉｔｒｏ未成熟ベータ細胞。

血中グルコースに応答してインスリンを分泌することができる細胞にｉｎｖｉｖｏで成熟することができるｉｎｖｉｔｒｏ未成熟ベータ細胞。

ＣＨＧＡ＋、ＩＮＳ＋およびＮＫＸ６．１＋であるｉｎｖｉｔｒｏ未成熟ベータ細胞。全ｉｎｖｉｔｒｏ細胞集団の１０％超が、ＣＨＧＡ＋、ＩＮＳ＋およびＮＫＸ６．１＋である未成熟ベータ細胞を含むことが好ましい。全ｉｎｖｉｔｒｏ細胞集団の５０％超が、ＣＨＧＡ＋、ＩＮＳ＋およびＮＫＸ６．１＋である未成熟ベータ細胞を含む未成熟ベータである。全ｉｎｖｉｔｒｏ細胞集団の８０％超が、ＣＨＧＡ＋、ＩＮＳ＋およびＮＫＸ６．１＋である未成熟ベータ細胞を含む未成熟ベータである。

精製された未成熟ベータ細胞。精製された未成熟ベータ細胞先駆体。未成熟ベータ細胞またはベータ細胞先駆体を、亜鉛センサーを使用してステージ７細胞集団から精製することが好ましい。亜鉛と結合したＰｙ１センサーの存在に起因するかすかな蛍光がベータ細胞に関して濃縮されることが好ましい。亜鉛と結合したＰｙ１センサーの存在に起因する明るい蛍光がアルファ細胞に関して濃縮されることが好ましい。亜鉛センサーを使用してベータ細胞を精製するための方法。亜鉛センサーを使用してアルファ細胞を精製するための方法。精製されたアルファ細胞。精製されたアルファ細胞先駆体。

ＩＮＳ、ＩＡＰＰ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＣＳＫ１、Ｇ６ＰＣ２、ＧＣＫ、またはＳＬＣ３０Ａ８などのベータ細胞系列のマーカーを発現する濃縮された細胞集団。

ＧＣＧ、ＡＲＸ、またはＳＬＣ３０Ａ８などのアルファ細胞系列のマーカーを発現する濃縮された細胞集団。

細胞の５０％超がＩＮＳ陽性である、濃縮された細胞集団。細胞集団は９０％超のＩＮＳ陽性細胞を有することが好ましい。好ましい実施形態では、細胞の５０％〜９９％がＩＮＳ陽性細胞である。

ｉｎｖｉｖｏでインスリンを生成させるための方法であって、ａ）ｉｎｖｉｔｒｏでＣＨＧＡ＋細胞の集団を得るステップと、ｂ）ＣＨＧＡ＋細胞を移植し、それにより、ｉｎｖｉｖｏでインスリンを生成させるステップとを含む方法。

ＣＨＧＡ＋細胞をステージ７において解離させ、再凝集させることが好ましい。

ＣＨＧＡ＋細胞は、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を発現することが好ましい

ＣＨＧＡ＋細胞は、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現することが好ましい。

ＣＨＧＡ＋細胞をＣＭＲＬまたはＲＰＭＩで培養することが好ましい。

ＣＨＧＡ＋細胞を移植前に凍結保存し、解凍することが好ましい。

ＣＨＧＡ＋細胞を高グルコース含有培地で培養することが好ましい。

生理的に機能的なインスリン分泌細胞をｉｎｖｉｖｏで生じさせることができるｉｎｖｉｔｒｏ内分泌細胞。

生理的に機能的なインスリン分泌細胞をｉｎｖｉｖｏで生じさせることができる、ｉｎｖｉｔｒｏ適正に特定された未成熟ベータ細胞。

適正に特定された未成熟ベータ細胞をステージ７において解離させ、再凝集させることが好ましい。

適正に特定された未成熟ベータ細胞は、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を発現することが好ましい。

適正に特定された未成熟ベータ細胞は、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現することが好ましい。

適正に特定された未成熟ベータ細胞をＣＭＲＬまたはＲＰＭＩで培養することが好ましい。

適正に特定された未成熟ベータ細胞を移植前に凍結保存し、解凍することが好ましい。

適正に特定された未成熟ベータ細胞を高グルコース含有培地で培養することが好ましい。

ＣＨＧＡ＋細胞の集団を得、選別するステップを含む、濃縮された未成熟ベータ細胞集団をｉｎｖｉｔｒｏで生成するための方法。ＣＨＧＡ＋細胞の集団を得、選別するステップを含む、ＩＮＳ、ＩＡＰＰ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１またはＰＡＸ４を発現する濃縮された細胞集団をｉｎｖｉｔｒｏで生成するための方法。

ＣＨＧＡ＋細胞の集団を得、選別するステップを含む、濃縮されたアルファ細胞集団をｉｎｖｉｔｒｏで生成するための方法。

ＣＨＧＡ＋細胞の集団を得、選別するステップを含む、ＧＣＧまたはＡＲＸを発現する濃縮された細胞集団をｉｎｖｉｔｒｏで生成するための方法。

アルファ細胞またはベータ細胞の濃縮された集団を、Ｐｙ１亜鉛センサーを使用して選別することが好ましい。

複数の実施形態では、未成熟ベータ細胞はＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。複数の実施形態では、未成熟ベータ細胞は、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。

脱分化し、再プログラミングされた細胞、または本明細書でｉＰＳ細胞とも呼ばれる細胞の凝集懸濁培養の写真画像である。実施例１参照。

ＯＣＴ４（図２Ａ）、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ（図２Ｂ）、ＣＥＲ１（図２Ｃ）、ＧＳＣ（図２Ｄ）、ＦＯＸＡ２（図２Ｅ）、ＦＯＸＡ１（図２Ｆ）、ＨＮＦ６（図２Ｇ）、ＰＤＸ１（図２Ｈ）、ＰＴＦ１Ａ（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）、ＮＧＮ３（図２Ｋ）およびＩＮＳ（図２Ｌ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子、サイクロフィリンＧおよびＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）発現の平均発現レベルに標準化される。グラフは、データセット中の最も低いデータポイントからの上方制御倍率を表す。実施例１参照。

（パネルＡ）ＰＤＸ−１、（パネルＢ）ＮＫＸ６．１、（パネルＣ）ＰＴＦ１Ａおよび（パネルＤ）Ｄａｐｉに特異的な抗体を使用した、ステージ４分化（ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞）からのヒトｉＰＳ細胞（Ｇ４ｈＩＰＳ細胞系を使用したＥ２０２１）培養の免疫細胞化学（ＩＣＣ）の顕微鏡写真である。実施例２参照。

（パネルＡ）グルカゴン、（パネルＢ）インスリン、（パネルＣ）ソマトスタチンおよび（パネルＤ）Ｄａｐｉに特異的なリガンドを使用した、ステージ５分化からのｉＰＳ細胞培養（Ｇ４ｈＩＰＳ細胞系を使用したＥ２０２１）の免疫細胞化学（ＩＣＣ）の写真である。実施例２参照。

Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓからのＰｒｏｔｅｏｍｅＰｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ヒトホスホＲＴＫ抗体アレイで提供されるアレイ位置図およびアレイキーを示す図である。図５Ａの位置図は、ＲＴＫ抗体の座標または位置を示す。ＲＴＫファミリーおよび抗体のアイデンティティまたは名前は、図５Ｂのキーに記載される。したがって、現像したフィルムで観察される陽性シグナルは、図５Ａのように透明画をオーバレイし、図５ＢのＲＴＫの名前でオーバレイ（図５Ａ）の上の座標を参照することによってシグナルを同定することによって、同定することができる。実施例４参照。

４つの異なる条件（実施例５に記載されるパネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）下のｉＰＳ細胞導出膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）のＲＴＫアレイ分析を示す図である。特定のＲＴＫのチロシンリン酸化が、高強度から低強度のシグナルの同定によって観察される。ＩＧＦ１Ｒ／ＩＲおよびＥＲＢＢ（ＥＧＦＲ）ファミリーメンバーが同定されるか、四角で囲まれる。実施例５参照。

実験Ｅ２３１４、Ｅ２３５６およびＥ２３８０（図７Ａ）、Ｅ２３４７（図７Ｂ）ならびにＥ２３５４（図７Ｃ）の移植されたマウスの血清中のヒトＣペプチドおよびインスリンの濃度を示すグラフである。図７Ａ：ｉｎｖｉｔｒｏでのヘレグリンによるＰＤＸ１発現細胞の処置は、ｉｎｖｉｖｏで移植および成熟後のグルコース刺激インスリン分泌を向上させる。図７Ｂ：マウス糖尿病モデルのＳＴＺ誘導より３週前の、移植後２３週のグルコース刺激Ｃペプチドレベル。空腹時、ならびに腹腔内グルコース投与の３０分および６０分後に、ＰＥＣを移植したマウスを示された移植後時点においてヒトＣペプチドの血清レベルについて分析した。図７Ｃでは、細胞封入デバイス（Ｅｎｃａｐｔｒａ（登録商標）ＥＮ２０またはＥＮ２０、ＶｉａＣｙｔｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）でＰＥＣを封入し、一部の場合には、デバイスは微穿孔を有した（ｐＥＮ２０、ＶｉａＣｙｔｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）。そのようなデバイスは、米国特許第８，２７８、１０６号に記載されている。実施例７参照。

実験＃２３４７のＳＴＺ処置マウスの血中グルコース分析の結果を示すグラフである。移植されたｉＰＥＣから導出されたグルコース応答性インスリン分泌ベータ細胞がＳＴＺ誘導糖尿病モデルにおいて血中グルコースを制御することを示す。図８Ａ：１３匹の各マウスの血中グルコースを示す（ヘレグリンの有る無しによるベースライン）。図８Ｂは、各処置の合わせた平均測定値を示す（ヘレグリンの有る無しによるベースライン）。ＳＴＺによる処置（０日目）の最大で１４日前までにｉＰＥＣ移植片を移植した１３匹のマウスについて、および同じマウスについてＳＴＺ処置の後、および移植片を外植した後の、ランダムな非絶食血中グルコースレベルの測定値を示す。ＳＴＺ処置動物は、移植片の移植から約２６週後にＳＴＺを与えられた（０日目）。移植片移植から２８週後、ＳＴＺ処置の開始からおよそ２週後に、ｉＰＥＣ移植片を外植した（取り出した）。各動物につき、非絶食血中グルコース測定値を経時的に収集した。実施例７参照。

ＰＤＸ１（図９Ａ）、ＮＫＸ６．１（図９Ｂ）、ＰＴＦ１Ａ（図９Ｃ）、ＮＫＸ２．２（図９Ｄ）およびＮＧＮ３（図９Ｅ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。実施例８参照。

ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞（ステージ２）が５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの添加によってＰＤＸ１陽性前腸内胚葉（ステージ３）に分化した、凝集懸濁培養の写真画像である。実施例８参照。

ステージ３で５ｎｇ／ｍＬ（ＡＣＴ５）もしくは１０ｎｇ／ｍＬ（ＡＣＴ１０）のアクチビンＡ；またはステージ３および４で５ｎｇ／ｍＬのアクチビン（ＡＣＴ５）を使用した、ステージ３（８日目、上パネル）およびステージ４（１２日目、下パネル）の終わりの凝集懸濁培養の写真画像である。実施例８参照。

ステージ４の間（Ａ〜Ｅ、上パネル）、またはステージ４の終わり（Ａ〜Ｅ、下パネル）の凝集懸濁培養の写真画像である。上パネルは、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび２ｎｇ／ｍＬのヘレグリン（ＡＣＴ１０ＨＧＮ２）、または２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび２ｎｇ／ｍＬのヘレグリン（ＡＣＴ２０ＨＧＮ２）、または２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび１０ｎｇ／ｍＬのヘレグリン（ＡＣＴ２０ＨＧＮ１０）、または１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２ｎｇ／ｍＬのヘレグリンおよび５０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ（ＡＣＴ１０ＨＧＮ２ＷＮＴ５０）がステージ３で加えられたことを示す。下パネルは、２５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＣＴ２５）、５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＣＴ５０）、７５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＣＴ７５）または１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＣＴ１００）がステージ３で加えられたことを示す。全ての状態は、ステージ４で低いアクチビンおよびヘレグリンを受けた。実施例９参照。

実施例９に記載される通り、アクチビン、ヘレグリンおよびＷＮＴ（ＡＨＷ）がステージ３で加えられ、ステージ４でアクチビンおよびヘレグリン（ＡＨ）が加えられたときのＮＧＮ３（図１３Ａ）、ＮＫＸ２．２（図１３Ｂ）およびＮＫＸ６．１（図１３Ｃ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。

実施例１０に記載される通り、アクチビン、ヘレグリンおよびＷＮＴ（ＡＨＷ）がステージ３で加えられ、ステージ４でアクチビンおよびヘレグリン（ＡＨ）が加えられたときのＮＫＸ６．１（図１４Ａ）およびＮＧＮ３（図１４Ｂ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。

封入されたＰＥＣ（対照）および封入された改変ＰＥＣ（ステージ３でアクチビン、ヘレグリンおよびＷＮＴ（ＡＨＷ）を使用し、ステージ４でアクチビンおよびヘレグリン（ＡＨ）を使用して生成された）を移植したマウスの血清中のヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである。移植から１１週後に、空腹時、腹腔内グルコース投与から３０分後、および６０分後に発現レベルを分析した。実施例１０参照。

封入されたＰＥＣ（対照）および封入された改変ＰＥＣ（ステージ３でアクチビン、ヘレグリンおよびＷＮＴ（ＡＨＷ）を使用し、ステージ４でアクチビンおよびヘレグリン（ＡＨ）を加えて生成された）を移植したマウスの血清中のヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである。移植から１４週後に、空腹時、腹腔内グルコース投与から３０分後、および６０分後に発現レベルを分析した。実施例１０参照。

実施例１１に記載の通り、ステージ５でのガンマセクレターゼ阻害剤による処置から１３、１５および１７日目の、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。

ステージ１〜５については表１７による分化の後の、ＰＤＸ１（図１８Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１８Ｂ）、ＳＯＸ９（図１８Ｃ）およびＰＴＦ１Ａ（図１８Ｄ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフであり、ステージ６および７については、実施例１２に記載の通り、基礎ＤＭＥＭ媒体に加えてＦＢＳ、マトリゲルおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤だけを使用した。

実施例１２に記載の通り、および図１８と同じ分化条件下での、ＩＮＳ（図１９Ａ）、ＧＣＧ（図１９Ｂ）、ＧＨＲＬ（図１９Ｃ）およびＳＳＴ（図１９Ｄ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。

実施例１２に記載の通りに作製された、封入された内分泌物を移植したマウスの血清中のヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである（Ｅ２３９５、Ｒａｇ２、１０週ＧＳＩＳ）。移植から１０週後に、空腹時、および腹腔内グルコース投与から６０分後に発現レベルを分析した。実施例１２参照。

実施例１２に記載の通りに作製された、封入された内分泌物を移植したマウスの血清中のヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである（Ｅ２３９５、Ｒａｇ２、１５週ＧＳＩＳ）。移植から１５週後に、空腹時、および腹腔内グルコース投与から６０分後に発現レベルを分析した。実施例１２参照。

実施例１２に記載の通り、ｉｎｖｉｖｏで分化、成熟した内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真である。細胞の視野は、ＤＡＰＩ（図２２Ａ）またはＮＫＸ６．１に対する抗体（図２２Ｂと図２２Ｃ、核染色法）およびクロモグラニンＡ（図２２Ｂと図２２Ｄ、細胞質）で染色する。全ての画像で同じ視野を示している。実施例１２参照。

実施例１２に記載の通り、内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真である。図２３Ａは、ＩＮＳ（細胞質）およびＮＫＸ６．１（核）について染色した細胞の視野を示す。図２３Ｂは、ＩＮＳ（細胞質）およびＰＤＸ１（核）について染色した細胞の同じ視野を示す。図２３Ｃは、ＤＡＰＩで染色した細胞の同じ視野を示す。実施例１２参照。

実施例１３に記載される分化条件下のＩＮＳ（図２４Ａ）、ＮＫＸ６．１（図２４Ｂ）、ＰＤＸ１（図２４Ｃ）およびＩＤ１（図２４Ｄ）の相対的な遺伝子発現レベルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇｍＲＮＡデータを示す棒グラフである。

実施例１３に記載の通り、内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真である。図２５ＡはＴＴおよびＢＭＰを加えない対照であり、図２５Ｂはステージ７でのＴＴの添加を示し、図２５Ｃはステージ７でのＢＭＰの添加を示す。図２５Ａ〜Ｃは、Ｃペプチド（細胞質）およびＰＤＸ１（核）についての染色を示す。

実施例１３に記載の通り、内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真である。図２６Ａはステージ６および７においてＴＴおよびＢＭＰで処置し、図２６Ｂはステージ７でのＴＴおよびＢＭＰの添加を示す。図２６Ａおよび２６Ｂは、Ｃペプチド（細胞質）およびＰＤＸ１（核）についての染色を示す。

実施例１３に記載の通り内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真であり、図２５と同じ視野を表す。図２７ＡはＴＴおよびＢＭＰを加えない対照であり、図２７Ｂはステージ７でのＴＴの添加を示し、図２７Ｃはステージ７でのＢＭＰの添加を示す。図２７Ａ〜Ｃは、Ｃペプチド（細胞質）およびＮＫＸ６．１（核）についての染色を示す。

実施例１３に記載の通り内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真であり、図２６と同じ視野を表す。図２８Ａはステージ６および７においてＴＴおよびＢＭＰで処置し、図２８Ｂはステージ７でのＴＴおよびＢＭＰの添加を示す。図２８Ａおよび２８Ｂは、Ｃペプチド（細胞質）およびＮＫＸ６．１（核）についての染色を示す。

実施例１３に記載の通りステージ６においてニコチンアミドで処置し（右棒；ｄ２１ｇｉ−ｄ１３〜ｄ１５）、またはニコチンアミド処置なしで（左棒；ｄ２１ｇｉ−ｄ１３〜ｄ１５＋ＮＩＣｄ１５）、２１日目に分析した、内分泌凝集体の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。

実施例１４に記載の通り、ステージ７の初めに解離および再凝集を行い、その後、ＦＢＳ単独、ＦＢＳ（パネルＡ）および０．０５％マトリゲル（ＭＧ；パネルＢ）の両方、ＦＢＳおよび１０μΜ Ｙ−２７６３２（Ｙ；パネルＣ）の両方、またはＦＢＳ、０．０５％マトリゲル（ＭＧ）および１０μΜ Ｙ−２７６３２（Ｙ；パネルＤ）の３つ全てを添加した、内分泌細胞凝集懸濁培養の写真画像（２１、２２および２３日目）を示す。

１、２および３日の間、ノギンの有る無しでの分化状態を比較した、ＮＫＸ６．１（図３１Ａ）、ＮＫＸ２．２（図３１Ｂ）、ＰＤＸ１（図３１Ｃ）およびＩＮＳ（図３１Ｄ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。実施例１５参照。

示された因子が及ぼす遺伝子発現への影響を記載する、ＩＮＳおよびＧＣＧ（図３２Ａ）、ＧＨＲＬおよびＳＳＴ（図３２Ｂ）ならびにＰＤＸ１およびＩＤ１（図３２Ｃ）の相対的な遺伝子発現レベルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇｍＲＮＡデータを示す棒グラフである。実施例１６参照。

非再凝集培養と比較した再凝集培養での内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団および非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団を記載した、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＳＯＸ９（図３３Ａ）；ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＰＰＹ、ＧＨＲＬ（図３３Ｂ）およびＰＣＳＫ１、ＧＣＫ、ＳＬＣ３０Ａ８、Ｇ６ＰＣ２（図３３Ｃ）の相対的な遺伝子発現レベルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇｍＲＮＡデータを示す棒グラフである。実施例１７参照。

同様に分化させたが再凝集させなかった細胞（対照試料）と比較して、実施例１８に記載の通りステージ７の開始時に解離および再凝集によって内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞型を濃縮させて作製した封入内分泌細胞（ｒｅ−ａｇｇ試料）を移植したマウスの血清中のヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである。移植から２１週後に、空腹時、腹腔内グルコース投与から３０分後、および６０分後に発現レベルを分析した。実施例１８参照。

ステージ７の間のＤＭＥＭおよびＣＭＲＬベースの培地の影響を記載する、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＰＰＹ、ＳＳＴ（図３５Ａ）；ＧＣＫ、Ｇ６ＣＰ２、ＵＣＮ３、ＰＣＳＫ１（図３５Ｂ）；ＨＮＦ１ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＣＡＤＨ１（図３５Ｃ）の相対的な遺伝子発現レベルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇｍＲＮＡデータを示す棒グラフである。実施例１９参照。

実施例２０に記載の通り、ステージ７の内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真である。凝集体は、ステージ７で再凝集していない。図３６Ａおよび図３６Ｂの同じ視野を、それぞれＩＮＳ（細胞質）およびＧＣＧ（細胞質）について染色し；図３６Ｃは、ＮＫＸ６．１（核）およびＣペプチド（細胞質）について染色している。

実施例２０に記載の通り、ステージ７の内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真である。凝集体は、ステージ７で再凝集している。図３７Ａおよび図３７Ｂの同じ視野を、それぞれＩＮＳ（細胞質）およびＧＣＧ（細胞質）について染色し；図３７Ｃは、ＮＫＸ６．１（核）およびＣペプチド（細胞質）について染色している。

ステージ７の開始時に細胞培養を冷凍（低温保存）および解凍し（Ｆ／Ｔ）、解離、再凝集させなかったか（左側）、または、それらを冷凍せず（新鮮）、解離、再凝集させて（右側）、実施例２０に記載の通りに作製した、封入された内分泌細胞を移植したマウスの血清中のヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである。移植から１２週後に、空腹時、腹腔内グルコース投与から３０分後および６０分後に発現レベルを分析した。実施例２１参照。

内分泌ホルモン発現に及ぼすステージ６の間の外因性高グルコースの影響を記載する、ＩＮＳ、ＧＣＧ（図３９Ａ）およびＳＳＴ、ＧＨＲＬ（図３９Ｂ）の相対的な遺伝子発現レベルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇｍＲＮＡデータを示す棒グラフである。実施例２１参照。

実施例２１に記載の通り、ステージ７の間に外因性高グルコースを伴うステージ７の内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真である。図４０ＡはＩＮＳ（細胞質）についての染色を示し、図４０ＢはＧＣＧ（細胞質）についての染色を示す。

先ず亜鉛結合剤であるＰｙ１で処置し、蛍光で選別した、ステージ７からの未熟内分泌ベータ細胞の濃縮を示すフローサイトメトリーグラフである。実施例２４参照。

亜鉛選別から濃縮された細胞を特徴付け、同定する、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＳＳＴおよびＳＳＴ（図４２Ａ）；ＰＡＸ４、ＰＤＸ１、ＡＲＸ、ＮＫＸ６．１（図４２Ｂ）；ならびにＰＣＳＫ１、ＧＣＫ、Ｇ６ＰＣ２およびＳＬＣ３０Ａ８（図４２Ｃ）の相対的な遺伝子発現レベルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇｍＲＮＡデータを示す棒グラフである。実施例２４参照。

ｉｎｖｉｔｒｏでの膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）の生成ならびにｉｎｖｉｖｏでのインスリン分泌ベータ細胞への発達および成熟のためのステージ１〜４の概略図である。図は、ＰＥＣの２つの主な亜集団、内分泌（ＣＨＧＡ＋）および非内分泌（ＣＨＧＡ−）細胞も表す。胚性幹細胞（ＥＳＣ）、内胚葉系中胚葉（ＭＥ）、胚体内胚葉（ＤＥ）、前腸（ＦＧ）、後部前腸（ｐＦＧ）、および膵臓上皮または膵臓内胚葉（ＰＥ）。

ｉｎｖｉｔｒｏでの内分泌細胞の生成のためのステージ１〜７の概略図である。図は、高レベルのアクチビン（ステージ３）と続く低レベルのアクチビンおよびＷＮＴの除去（ステージ４）が、ＮＧＮ３の発現を抑制または阻害することも表し、それは、ガンマセクレターゼ阻害剤の添加によって後にステージ５の間に発現させられる。胚性幹細胞（ＥＳＣ）、内胚葉系中胚葉（ＭＥ）、胚体内胚葉（ＤＥ）、前腸（ＦＧ）、後部前腸（ｐＦＧ）、および膵臓上皮または膵臓内胚葉（ＰＥ）。

ｉｎｖｉｔｒｏでの内分泌細胞の生成のためのステージ１〜７の概略図である。図は、ステージ、成長因子、細胞型および各細胞型：胚性幹細胞（ＥＳＣ）、内胚葉系中胚葉（ＭＥ）、胚体内胚葉（ＤＥ）、前腸（ＦＧ）、後部前腸（ｐＦＧ）、膵臓上皮または膵臓内胚葉（ＰＥ）、プレベータ細胞（プレ−Ｂ；または未熟ベータ細胞）、およびベータ細胞（β細胞）のシグネチャーマーカーも示す。

（詳細な説明）
本発明は、本明細書に含まれる本発明の好ましい実施形態および実施例の以下の発明の詳細な説明を参照することによって容易に理解することができる。しかし、本化合物、組成物、および方法の開示および記載の前に、本発明は、特定の細胞型、特定のフィーダー細胞層、特定の条件、または特定の方法などに限定されず、それ自体変動し得ることが理解されるべきである。多数の改変および変形が当業者には明らかになるであろう。本明細書において使用される用語法は、単に特定の実施形態を記載するためのものであり、限定的なものではないことも理解されるべきである。特許および非特許刊行物参考文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

多能性幹細胞から導出された種々の細胞組成物は本明細書に記載されており、また、出願人の米国特許出願第１０／４８６，４０８号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＣＵＬＴＵＲＥＯＦＨＥＳＣＯＮＦＥＥＤＥＲＣＥＬＬＳ、２００２年８月６日出願；同第１１／０２１，６１８号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００４年１２月２３日出願；同第１１／１１５，８６８号、表題ＰＤＸ１ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００５年４月２６日出願；同第１１／１６５，３０５号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧＦＡＣＴＯＲＳＦＯＲＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＮＧＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００５年６月２３日出願；同第１１／５７３，６６２号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮＯＦＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＨＵＭＡＮＥＭＢＲＹＯＮＩＣＳＴＥＭＣＥＬＬＳＷＩＴＨＰＩ−３ＫＩＮＡＳＥＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ、２００５年８月１５日出願；同第１２／７２９，０８４号、表題ＰＤＸ１ −ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＤＯＲＳＡＬＡＮＤＶＥＮＴＲＡＬＦＯＲＥＧＵＴＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００５年１０月２７日出願；同第１２／０９３，５９０号、表題ＭＡＲＫＥＲＳＯＦＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００５年１１月１４日出願；同第１１／９９３，３９９号、表題ＥＭＢＲＹＯＮＩＣＳＴＥＭＣＥＬＬＣＵＬＴＵＲＥＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＵＳＥＴＨＥＲＥＯＦ、２００６年６月２０日出願；同第１１／５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１ −ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＤＯＲＳＡＬＡＮＤＶＥＮＴＲＡＬＦＯＲＥＧＵＴＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００６年１０月２７日出願；同第１１／６８１，６８７号、表題ＥＮＤＯＣＲＩＮＥＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲ／ＰＲＥＣＵＲＳＯＲＣＥＬＬＳ、ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥ−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＣＥＬＬＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ、２００７年３月２日出願；同第１１／８０７，２２３号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＣＵＬＴＵＲＥＡＮＤＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮＯＦＳＩＮＧＬＥＣＥＬＬＰＯＰＵＬＡＴＩＯＮＳＯＦＨＥＳＣ、２００７年５月２４日出願；同第１１／７７３，９４４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＳ、２００７年７月５日出願；１１／８６０，４９４、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ、２００７年９月２４日出願；同第１２／０９９，７５９号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＳ、２００８年４月８日出願；同第１２／１０７，０２０号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＰＵＲＩＦＹＩＮＧＥＮＤＯＤＥＲＭＡＮＤＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＯＲＭＨＵＭＡＮＥＭＢＲＹＯＮＩＣＳＴＥＭＣＥＬＬＳ、２００８年４月２１日出願；同第１２／６１８，６５９号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＬＩＮＥＡＧＥＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＵＭＡＮＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＳ、２００９年１１月１３日出願；同第１２／７６５，７１４号および同第１３／７６１，０７８号、どちらも表題ＣＥＬＬＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＲＯＭＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＥＤＲＥＰＲＯＧＲＡＭＭＥＤＣＥＬＬＳ、２０１０年４月２２日および２０１３年２月６日出願；同第１１／８３８，０５４号、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＵＳＥＦＵＬＦＯＲＣＵＬＴＵＲＩＮＧＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＢＬＥＣＥＬＬＳ、２００７年８月１３日出願；同第１２／２６４，７６０号、表題ＳＴＥＭＣＥＬＬＡＧＧＲＥＧＡＴＥＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮＴＨＥＲＥＯＦ、２００８年１１月４日出願；同第１３／２５９，１５号、表題ＳＭＡＬＬＭＯＬＥＣＵＬＥＳＳＵＰＰＯＲＴＩＮＧＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＣＥＬＬＧＲＯＷＴＨ、２０１０年４月２７日出願；ＰＣＴ／ＵＳ１１／２５６２８、表題ＬＯＡＤＩＮＧＳＹＳＴＥＭＦＯＲＡＮＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＤＥＶＩＣＥ、２０１１年２月２１日出願；同第１３／９９２，９３１号、表題ＡＧＥＮＴＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＩＮＨＩＢＩＴＩＮＧＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＳ、２０１０年１２月２８日出願；および米国意匠出願第２９／４０８，３６６号、２０１１年１２月１２日出願；同第２９／４０８，３６８号、２０１１年１２月１２日出願；同第２９／４２３，３６５号、２０１２年５月３１日出願；および同第２９／４４７，９４４号、２０１３年３月１３日出願；および米国特許仮出願第６１／７７４，４４３号、表題ＳＥＭＩＰＥＲＭＥＡＢＬＥＭＡＣＲＯＩＭＰＬＡＮＴＡＢＬＥＣＥＬＬＵＬＡＲＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＤＥＶＩＣＥＳ、２０１３年１１月７日出願；同第６１／７７５，４８０号、表題ＣＲＹＯＰＲＥＳＥＲＶＡＴＩＯＮ、ＨＩＢＥＲＮＡＴＩＯＮＡＮＤＲＯＯＭＴＥＭＰＥＲＡＴＵＲＥＳＴＯＲＡＧＥＯＦＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＥＤＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＡＧＧＲＥＧＡＴＥＳ、２０１３年３月８日出願；および６１／７８１，００５、表題ＩＮＶＩＴＲＯＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮＯＦＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＳＴＯＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳ（ＰＥＣ）ＡＮＤＥＮＤＯＣＲＩＮＥＣＥＬＬＳ、２０１３年３月１４日出願において見ることができる。

定義
本明細書で表される数値範囲は、記載されている両端点を含み、示された数値範囲の両端点間の全ての整数を記載するものであることが理解されよう。

特に断りのない限り、本明細書で使用される用語は、当業者による従来の使用に従って理解される。また、本明細書および添付の特許請求の範囲の目的に関して、別段に特定されていない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される成分の分量、材料の百分率または割合、反応条件を表す数、および他の数値は全て、全ての場合に「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、それに反する指示がない限り、以下の明細書および添付されている特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、本発明によって得られるべき所望の性質に応じて変動し得る近似値である。最低限、かつ特許請求の範囲への均等論の適用を限定しようとするものではなく、各数値パラメータは、少なくとも示されている有効数字に照らして、および通常の四捨五入を適用することによって、解釈されるべきである。

本明細書に記載の実施形態の実施には、別段に特定されていない限り、細胞生物学、分子生物学、遺伝学、化学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法が使用される。

「細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、個々の細胞、細胞系、またはそのような細胞から導出される培養物を指す。「培養物」とは、同じまたは異なる種類の単離された細胞を含む組成物を指す。「培養物」、「集団」または「細胞集団」とは、本明細書で使用される場合、互換的に使用することができ、また互換的に使用され、その意味は文脈に応じて明らかになる。例えば、「集団」という用語は、識別特性が同じである２つ以上の細胞の細胞培養物を指す、または、識別特性が異なる２つ以上の細胞型の培養物であってよく、例えば、ある文脈における集団は、別の文脈では亜集団であり得る。「亜集団」という用語は、細胞培養物または細胞集団中のある特定の細胞型を記載するために使用される場合、細胞培養物または細胞集団のサブセットを指す。

本明細書で使用される場合、「全能性幹細胞」という句は、卵細胞と精子細胞の融合から生成する細胞などの、生物体を構成する全ての細胞に分化する能力を有する細胞を指す。受精卵の最初の数回の分裂によって生成する細胞も全能性であり得る。これらの細胞は、胚性細胞および胚体外細胞型に分化することができる。例えばＥＳ細胞などの多能性幹細胞は、いかなる胎児または成体の細胞型も生じ得る。しかし、これらは、胚体外組織に発達する潜在性を欠くので、単独では胎児または成体動物に発達することはできない。胚体外組織は、一部において、胚体外内胚葉から導出され、遠位内胚葉（ｐａｒｉｅｔａｌｅｎｄｏｄｅｒｍ）（ライヘルト膜）および近位内胚葉（ｖｉｓｃｅｒａｌｅｎｄｏｄｅｒｍ）（卵黄嚢の一部を形成する）にさらに分類することができる。遠位内胚葉および近位内胚葉はどちらも胚の発生を支持するが、それら自体は胚構造を形成しない。胚体外中胚葉および胚体外外胚葉を含めた他の胚体外組織も存在する。

一部の実施形態では、「多能性細胞」を、内胚葉系列、より詳細には、膵臓内胚葉型細胞に分化させるための出発材料として使用する。本明細書で使用される場合、「多能性」または「多能性細胞」またはその等価物とは、細胞培養物中で増殖することができ、かつ多分化能の性質を示す、系列が制限された種々の細胞集団に分化することができる細胞を指し、例えば、多能性ＥＳ細胞および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞はどちらも、３種の胚細胞系列のそれぞれを生じ得る。しかし、多能性細胞は、生物体全体を生成することはできない。すなわち、多能性細胞は全能性ではない。

ある特定の実施形態では、出発材料として使用される多能性細胞は、ｈＥＳ細胞、ｈＥＧ細胞、ｉＰＳ細胞、さらには単為発生細胞などを含めた幹細胞である。本明細書で使用される場合、「胚性（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」とは、単一の接合体から始まって、発生した配偶子細胞を除いてもはや多能性または全能性細胞を含まない多細胞構造で終わる、生物体の発生ステージの一領域を指す。「胚性（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」という用語は、配偶子融合によって導出された胚に加えて、体細胞核移植によって導出された胚も指す。さらに別の実施形態では、多能性細胞は胚から導出されるまたは直接導出されたものではなく、例えば、ｉＰＳ細胞は、非多能性細胞、例えば多分化能細胞または最終分化した細胞から導出されたものである。本明細書で使用されるヒト多能性幹細胞株は、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣ、例えば、ＣｙＴ４９、ＣｙＴ２５、ＣｙＴ２０３、ＣｙＴ２１２、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、または表４および表５に列挙されているもののいずれか、または現在公知であるもしくは公的に入手可能であるまたは後に作製されるもののいずれかを含む。

ヒト多能性幹細胞は、分化を導く遺伝子の抑制および多能性の維持を確実にするコア調節複合体を形成する転写因子Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ−２を含めた、いくつかの転写因子および細胞表面タンパク質、ならびに糖脂質ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびケラチン硫酸抗原、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１、およびアルカリホスファターゼなどの細胞表面抗原の存在によっても定義され、あるいは特徴付けられ得る。

本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」または「ｉＰＳＣ」という句は、非多能性細胞、一般には成体の体細胞、または、例えば線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞などの最終分化した細胞から、再プログラミング因子と称される特定の遺伝子または遺伝子産物を挿入することによって人工的に調製された多能性幹細胞の一種を指す。Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、１３１：８６１−８７２（２００７）；Ｗｅｒｎｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４４８：３１８−３２４（２００７）；Ｐａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ、４５１：１４１−１４６（２００８）を参照されたい。ｉＰＳＣを作製するための、これらおよびその後に公知になった方法は周知であり、ｉＰＳＣがどのように導出されたまたは生成されたものであるかは本発明を限定するものではない。人工多能性幹細胞は、ｈＥＳ細胞などの天然のヒト多能性幹細胞と、ある特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚葉体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、ならびに発生能および分化可能性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｂｉｌｉｔｙ）を含めた多くの点で実質的に類似している。ヒトｉＰＳ細胞により、胚の使用を伴うことなく多能性幹細胞の供給源がもたらされる。

本明細書で使用される場合、「再プログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）」、「再プログラミングされる（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）」またはその等価物は、細胞の、少なくとも１種の新しい細胞型の後代を形成する能力が、培養物中またはｉｎｖｉｖｏにおいて、その細胞が再プログラミングを伴わない同じ条件下で有するものよりも測定可能な程度に増大するプロセスを指す。本明細書に記載されているある特定の実施形態では、体細胞が多能性細胞に「再プログラミングされる」。ある特定の態様では、体細胞が、十分な増殖後に、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏ細胞培養物のいずれかにおいて、測定可能な割合の細胞で新しい多能性細胞型の表現型特性を示した場合に、再プログラミングされたこととなる。再プログラミングされなければ、そのような体細胞は新しい多能性細胞型の表現型特性を示す後代を生じない。もし、再プログラミングなしでも体細胞が新しい多能性細胞型の表現型特性を示す後代を生じさせることができるとすれば、これらの体細胞由来の、新しい多能性細胞型の表現型特性を示す後代の割合は再プログラミング前よりも測定可能な程度で上昇する。

本明細書で使用される場合、「分化プログラミング」という句は、細胞を、培養物またはｉｎｖｉｖｏのいずれかにおいて、分化再プログラミングを伴わない同じ条件のものと比べて、新しい分化の状態を伴う少なくとも１種の新しい細胞型の後代を形成するように変化させるプロセスを指す。このプロセスは、分化、脱分化および分化転換を含む。したがって、本明細書で使用される場合、「分化」という句は、より低度に特殊化した細胞がより高度に特殊化した細胞型になるプロセスを指す。対照的に、「脱分化」という句は、部分的または最終的に分化した細胞が、多能性または多分化能を有する細胞などの、より初期の発生ステージに戻る細胞のプロセスを指す。さらに対照的に、「分化転換」という句は、ある分化した細胞型が別の分化した細胞型に転換されるプロセスを指す。

本明細書で使用される場合、「多分化能」または「多分化能細胞」またはその等価物は、限られた数の他の特定の細胞型を生じさせることができる細胞型を指す。すなわち、多分化能細胞は１つまたは複数の胚細胞の運命に傾倒し、したがって、多能性細胞とは対照的に、３種の胚細胞系列のそれぞれ、ならびに胚体外細胞を生じさせることができない。多分化能体細胞は、多能性細胞よりも分化しているが、最終分化はしていない。したがって、多能性細胞の発生能は多分化能細胞よりも高い。体細胞を再プログラミングすることまたはｉＰＳ細胞を生じさせるために使用することができる発生能決定因子としては、これだけに限定されないが、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、ＦｏｘＤ３、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｒｅｘｌ、ＺＮＦ２０６、Ｓｏｘｌ５、Ｍｙｂｌ２、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、ＤＰＰＡ２、ＥＳＧ１、Ｏｔｘ２またはこれらの組合せなどの因子が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「単能性の（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）」または「単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｃｙ）」または「単能性細胞」またはその等価物は、他の系列細胞を１種のみ生じさせることができる細胞型を指す。例えば、本明細書に記載の未成熟ベータ細胞は、インスリンベータ細胞のみに分化する能力を有し、例えばグルカゴン（アルファ）細胞、ソマトスタチン（デルタ）細胞および膵臓ポリペプチド（ガンマ）細胞に分化する潜在性を有さない。対照的に、内分泌先駆細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、または中内胚葉細胞、およびｈＥＳ細胞は全て、膵臓アルファ、ベータ、デルタおよびガンマ膵島細胞のそれぞれを生じさせることができる多分化能または多能性（ｈＥＳＣ）細胞である。同様に、膵臓アルファ、ベータ、デルタおよびガンマ膵島細胞は、内分泌先駆細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、または中内胚葉細胞、およびｈＥＳ細胞の系列細胞である。

本明細書で使用される場合、「単一ホルモン性」および「複数ホルモン性（ｐｏｌｙｈｏｒｍｏｎａｌ）」細胞とは、ホルモンを１種のみ発現する細胞（例えば、未成熟ベータ細胞およびベータ細胞は、インスリンタンパク質のみを発現し、グルカゴンまたはソマトスタチンタンパク質は発現しない）、または２種以上もしくは多数種のホルモン（例えば、同じ細胞上で２種、３種または４種またはそれ以上のホルモンを発現する細胞の亜集団を有する内分泌先駆体または前駆細胞）を発現する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質」とは、これだけに限定されないが、ＥＲＢＢ受容体に結合する少なくとも１６種の異なるＥＧＦファミリーリガンド：ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＡＧまたはＡＲＥＧ（アンフィレギュリン）、およびＴＧＦ−アルファ（形質転換成長因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合性ＥＧＦ）、およびＥｒｅｇ（エピレギュリン））、ニューレグリン−１、−２、−３および−４（またはヘレグリン−１、−２、−３および−４などのニューグレリン（またはヘレグリン）を含む。しかし、本発明では、４種のＥＲＢＢ受容体のいずれか１つまたはこれらの組合せに結合して、内因性キナーゼドメインの活性化およびその後のリン酸化を導くホモ二量体受容体複合体およびヘテロ二量体受容体複合体の形成を誘導することができる任意のリガンドが意図されている。表１３も参照されたい。

「細胞系列」という用語は、本明細書で使用される場合、最初期の先駆細胞から完全に成熟した細胞（すなわち、特殊化した細胞）までの、細胞型の発生のステージの全てを指す。例えば、「胚体内胚葉系列細胞」または「ＰＤＸ１陰性内胚葉系列細胞」または「ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉系列細胞」または「内分泌先駆体系列細胞」または「内分泌系列細胞」または「未成熟ベータ系列細胞」などは、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞などから導出されたまたは分化した細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、その先駆体のうちの１つである中内胚葉細胞の系列である。ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉細胞は、その先駆体のうちの１つである胚体内胚葉細胞の系列である。ＰＤＸ１陽性膵臓細胞、胚体内胚葉細胞および中内胚葉細胞の系列内の内分泌先駆体は全て、その先駆体である。内分泌先駆細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓細胞、胚体内胚葉細胞および中内胚葉細胞の系列内の未成熟ベータ細胞は全て、その先駆体である。ベータ細胞は、例えば未成熟ベータ細胞の唯一の系列である。さらに、明細書に記載の内胚葉系列細胞は全てｈＥＳ系列細胞である。

「先駆細胞」または「前駆細胞」とは、本明細書で使用される場合、一般に、細胞分化経路内の、より成熟した細胞に分化することができる任意の細胞であってよい。そのように、先駆細胞は、多能性細胞であってもよく、部分的に分化した多分化能細胞または可逆的に分化した細胞であってもよい。「先駆細胞集団」という用語は、より成熟または分化した細胞型に発達することができる細胞の群を指す。先駆細胞集団は、多能性の細胞、幹細胞系列に制限された細胞（すなわち、外胚葉系列の全てには発達できない細胞、または、例えばニューロン系列の細胞にのみ発達することができる細胞）、および可逆的に幹細胞系列に制限された細胞を含み得る。したがって、「前駆細胞」または「先駆細胞」という用語は、「多能性細胞」または「多分化能細胞」であり得る。

「内分泌前駆／先駆細胞」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも、ニューロゲニン３（ＮＥＵＲＯＧ３）、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＳＯＸ９、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１ｂ、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ６、ＭＹＴ１、ＩＳＬＥＴ１、ＮＥＵＲＯＤ、ＳＮＡＩＬ２、ＭＮＸ１、ＩＡ１、ＲＦＸ６、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＮＫＸ２．２、ＭＡＦＡおよびＭＡＦＢからなる一覧からのマーカーを発現する胚体内胚葉系列の多分化能細胞を指し、これは、これだけに限定されないが、膵島ホルモン発現細胞を含めた内分泌系の細胞にさらに分化することができる。内分泌前駆／先駆細胞は、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞または胚体内胚葉細胞または中内胚葉細胞などのより低度に特異的に分化した胚体内胚葉系列細胞と比較して多くの異なる細胞、組織および／または器官型に分化することはできない。内分泌前駆／先駆細胞は、少なくとも出願人の米国特許第８，１２９、１８２号に詳しく記載されている。

本明細書で使用される場合、「多能性細胞から発達する」、「多能性細胞から分化する」、「多能性細胞から成熟する」または「多能性細胞から生成する」、「多能性細胞から導出された」、「多能性細胞から分化する」という用語および等価の表現は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１５５３６号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＳに記載の、ｉｎｖｉｖｏにおいて移植されたＰＤＸ１膵臓内胚葉細胞から成熟する内分泌細胞の場合では、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏにおいて多能性細胞から分化した細胞型が生成することを指す。そのような用語は全て、少なくとも２種の異なる細胞系列に分化する潜在性を有するステージから特殊化および最終分化した細胞になるまでの細胞の進行を指す。そのような用語は、本出願の目的に関して互換的に使用することができる。本明細書に記載の実施形態では、そのような分化を可逆的なものにし、したがって、多能性または少なくとも２種以上の細胞系列に分化する能力を選択的に元に戻すことができるような培養条件が意図されている。

「フィーダー細胞」という用語は、ｉｎｖｉｔｒｏで成長し、少なくとも１種の因子を細胞培養中に分泌し、また、培養物中の別の目的の細胞の成長を支持するために使用することができる細胞培養物を指す。本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞層」は、「フィーダー細胞」という用語と互換的に使用され得る。フィーダー細胞は、互いに重なり合って成長し始める前には一完全層で培養皿の表面を覆う単層を含んでもよく、あるいは細胞のクラスターを含んでもよい。好ましい実施形態では、フィーダー細胞は、接着性の単層を含む。

同様に、多能性細胞培養物または多能性凝集懸濁培養物をフィーダー細胞の使用を伴わない規定された条件または培養系において成長させる実施形態は「フィーダーフリー」である。フィーダーフリー培養方法では、多能性細胞培養物のスケーラビリティおよび再現性が増し、例えばフィーダー細胞または他の動物を供給源とする培養物構成成分に由来する感染因子によるコンタミネーションのリスクが低下する。フィーダーフリー方法は、Ｂｏｄｎａｒらに対する米国特許第６，８００，４８０号（ＧｅｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭｅｎｌｏＰａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに譲渡された）にも記載されている。しかし、米国特許第６，８００，４８０号特許とは対照的に、本明細書に記載の実施形態は、多能性細胞培養物、多分化能細胞培養物または分化した細胞培養物のいずれであるかにかかわらず、フィーダーフリーであり、内在性または外因性の細胞外マトリックスをさらに含有しない；すなわち、本明細書に記載の培養物は、フィーダーフリーであるだけでなく、細胞外マトリックスフリーでもある。例えば、米国特許第６，８００，４８０号では、線維芽細胞を培養し、線維芽細胞をｉｎｓｉｔｕで溶解し、次いで、溶解後に残ったものを洗浄することによって細胞外マトリックスが調製される。あるいは、米国特許第６，８００，４８０号では、コラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、メロシン、テネイシン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグリカン、ビグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンから選択される単離されたマトリックス構成成分または構成成分の組合せからも細胞外マトリックスが調製され得る。本明細書に記載の実施形態では、フィーダー層または線維芽細胞層を成長させ、細胞を溶解して細胞外マトリックスを生成することによって細胞外マトリックスを生成することもなく、最初にコラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、メロシン、テネイシン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグリカン、ビグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンから選択される細胞外マトリックス構成成分または細胞外マトリックス構成成分の組合せを用いて組織培養容器をコーティングする必要もない。したがって、多能性細胞、多分化能細胞および分化した細胞用の本明細書に記載の凝集懸濁培養物には、フィーダー層、溶解したフィーダー細胞、または細胞外マトリックスコーティングを生成する線維芽細胞、外因的に添加された細胞外マトリックスまたはマトリックス構成成分は必要なく、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６、表題ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＯＲＦＥＥＤＥＲ−ＦＲＥＥＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＭＥＤＩＡＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧＨＵＭＡＮＳＥＲＵＭに記載されたように、可溶性ヒト血清構成成分の使用により、フィーダー細胞またはフィーダー単層の必要性を克服し、同様に、フィーダー細胞もしくは線維芽細胞または外因的に添加された細胞外マトリックス構成成分に由来する内在性の細胞外マトリックスの必要性も克服される。

本明細書で使用される場合、「クラスター」および「凝集塊」または「凝集体」という用語は互換的に使用することができ、一般に、単一の細胞に解離した後にクラスターが形成されるようにまたは密接な細胞間接触を有するように凝集したものではない細胞の群を指す。「再凝集」という用語は、本明細書で使用される場合、クラスター、凝集塊および／もしくは凝集体をより小さなクラスター、凝集塊および／もしくは凝集体または単一の細胞に解離させ、次いで、クラスター、凝集塊および／もしくは凝集体を再凝集させることによって新しい細胞間接触を形成する場合を指す。この解離は、典型的には、手作業の性質のものである（例えばＰａｓｔｅｕｒピペットの使用など）が、他の解離の手段が考えられている。凝集懸濁多能性細胞または多分化能細胞培養物は、実質的に国際公開ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＣＵＬＴＵＲＩＮＧＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬＣＥＬＬＳ」およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８２３５６、表題「ＳＴＥＭＣＥＬＬＡＧＧＲＥＧＡＴＥＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮＴＨＥＲＥＯＦに記載の通りである。

「単一細胞懸濁液」という用語またはその等価物は、多能性、多分化能もしくは最終分化した単一細胞懸濁液、または多能性細胞もしくは多分化能細胞から任意の機械的手段または化学的手段によって導出された単一細胞懸濁液を指す。一次組織、付着した培養物中の細胞、および凝集体から細胞クラスターを解離させて単一細胞懸濁液を形成するためのいくつかの方法、例えば、物理的な力（細胞スクレーパー、口径が狭いピペットを通しての粉砕、細針穿刺吸引、ボルテックスによる脱凝集および細かいナイロンメッシュまたはステンレス鋼メッシュを通した強制的な濾過などの機械的解離）、酵素（例えばトリプシン、コラゲナーゼ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）などの酵素による解離）、またはその両方の組合せが存在する。さらに、多能性細胞、多分化能細胞または分化した細胞の単一細胞への解離を支持することができる方法および培養培地条件は、多ウェルプレートアッセイのための拡張、細胞選別、および規定された播種のために有用であり、また、培養手順およびクローン拡張の自動化を可能にする。

好ましい実施形態では、培養方法または培養系は、動物を供給源とする製品を含まない。別の好ましい実施形態では、培養方法はゼノフリーである。さらに好ましい実施形態では、本明細書に記載の培養方法は、ヒト細胞治療薬の商業的な製造のための１つまたは複数の条件または要件を満たすまたはそれを上回る。

多能性細胞の集団をある特定の補足的な成長因子の存在下でさらに培養して、異なる細胞系列であるまたはそれに発達する細胞の集団を得ることができる、または、異なる細胞系列に発達することが可能になるように選択的に逆転させることができる。「補足的な成長因子」という用語は、その最も広範な文脈で使用され、多能性細胞の成長を促進するため、細胞の生存を維持するため、細胞の分化を刺激するため、および／または、細胞の分化の逆転を刺激するために有効である物質を指す。さらに、補足的な成長因子は、フィーダー細胞からその培地中に分泌される物質であってよい。そのような物質としては、これだけに限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、小分子、中和抗体、およびタンパク質が挙げられる。成長因子は、細胞の発生および維持ならびに組織の形態および機能を制御する細胞間シグナル伝達ポリペプチドも含んでよい。好ましい実施形態では、補足的な成長因子は、スチール細胞因子（steel cell factor）（ＳＣＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）と可溶性インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）の組合せ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む群から選択される。

本明細書に記載の細胞を生成するためのある特定のプロセスでは、成長因子を、添加後に細胞培養物または細胞集団から除去する。例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８、またはＧＤＦ−１１などの成長因子を添加し、それらを添加してから約１日以内、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日以内または約１０日以内に除去することができる。一部の実施形態では、分化因子を細胞培養物からそれ自体を除去することはしないが、それらを細胞培養培地から省くこと、例えば、アクチビンを含有していた細胞培養培地を、アクチビンを含有しない培地に変えることが除去の手段である。

分化プロセスの効率は、これだけに限定されないが、細胞の成長条件、成長因子濃度および培養ステップのタイミングを含めたある特定のパラメータを改変することによって調整することができるので、本明細書に記載の分化手順により、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９５％以上の、人工多能性細胞を含む多能性細胞から多分化能細胞または分化した細胞、例えば胚体内胚葉への変換をもたらすことができる。さらに、変換率または効率は、１つの型の多分化能細胞から、さらに分化した多分化能細胞への分化、例えば、胚体内胚葉から前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１同時陽性膵臓内胚葉、内分泌前駆体／先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２同時陽性内分泌前駆体／先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞への分化を指す場合もある。前原条（ｐｒｅｐｒｉｍｉｔｉｖｅｓｔｒｅａｋ）細胞または中内胚葉細胞の単離を使用するプロセスでは、実質的に純粋な前原条細胞または中内胚葉細胞集団を回収することができる。

ｈＥＳ細胞から導出された内胚葉系列細胞を生成するための一般的な方法は、上記の関連する米国特許出願、ならびにＤ’Ａｍｏｕｒら、２００５ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１５３４−４１、２００５年１０月２８日オンライン出版；Ｄ’Ａｍｏｕｒら、２００６ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（１１）：１３９２−４０１、２００６年１０月１９日オンライン出版；Ｋｒｏｏｎら（２００８）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（４）：４４３−４５２、２００８年２月２０日オンライン出版；Ｋｅｌｌｙら（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（８）：７５０−６、２０１１年７月３１日オンライン出版；およびＳｃｈｕｌｚら（２０１２）ＰＬｏｓＯｎｅ、７（５）：ｅ３７００４、２０１２年５月１８日オンライン出版に記載されている。Ｄ’Ａｍｏｕｒらにより、５段階の分化プロトコル：ステージ１（大部分は胚体内胚葉生成がもたらされる）、ステージ２（大部分はＰＤＸ１陰性前腸内胚葉生成がもたらされる）、ステージ３（大部分はＰＤＸ１陽性前腸内胚葉生成がもたらされる）、ステージ４（大部分は膵臓内胚葉または膵臓内分泌前駆体生成がもたらされる）およびステージ５（大部分はホルモン発現内分泌細胞生成がもたらされる）が記載されている。

「栄養外胚葉」という用語は、ＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢ遺伝子を含む群から選択されるマーカーの発現が、非栄養外胚葉細胞または細胞集団におけるＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢの発現レベルと比較して相対的に高い多分化能細胞を指す。

「胚体外内胚葉」という用語は、ＳＯＸ７遺伝子、ＳＯＸ１７遺伝子、ＴＨＢＤ遺伝子、ＳＰＡＲＣ遺伝子、ＤＡＢ１遺伝子、またはＡＦＰ遺伝子を含む群から選択されるマーカーの発現レベルが、非胚体外内胚葉細胞または細胞集団におけるＳＯＸ７、ＳＯＸ１７、ＴＨＢＤ、ＳＰＡＲＣ、ＤＡＢ１、またはＡＦＰの発現レベルと比較して相対的に高い多分化能細胞を指す。

「前原条細胞」という用語は、ＦＧＦ８マーカー遺伝子および／またはＮＯＤＡＬマーカー遺伝子の発現レベルが、ＢＲＡＣＨＵＲＹｌｏｗ、ＦＧＦ４ｌｏｗ、ＳＮＡＩ１ｌｏｗ、ＳＯＸ１７ｌｏｗ、ＦＯＸＡ２ｌｏｗ、ＳＯＸ７ｌｏｗおよびＳＯＸ１ｌｏｗと比較して相対的に高い多分化能細胞を指す。

「中内胚葉細胞」という用語は、ｂｒａｃｈｙｕｒｙマーカー遺伝子、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＭＩＸＬ１および／またはＷＮＴ３マーカー遺伝子の発現レベルが、ＳＯＸ１７ｌｏｗ、ＣＸＣＲ４ｌｏｗ、ＦＯＸＡ２ｌｏｗ、ＳＯＸ７ｌｏｗおよびＳＯＸ１ｌｏｗと比較して相対的に高い多分化能細胞を指す。

「胚体内胚葉（ＤＥ）」という用語は、腸管または腸管から導出された器官の細胞に分化することができる多分化能内胚葉系列細胞を指す。ある特定の実施形態によると、胚体内胚葉細胞は哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞はヒト細胞である。本発明の一部の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ある特定のマーカーを発現する、またはある特定のマーカーを有意に発現することができない。一部の実施形態では、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１から選択される１種または複数種のマーカーが胚体内胚葉細胞において発現される。他の実施形態では、ＯＣＴ４、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＳＰＡＲＣ、ＳＯＸ７およびＨＮＦ４アルファから選択される１種または複数種のマーカーが胚体内胚葉細胞において発現されないまたは有意には発現されない。胚体内胚葉細胞集団およびそれを生成する方法は、米国特許出願第１１／０２１，６１８号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００４年１２月２３日出願にも記載されている。

「ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」または「前腸内胚葉細胞」という用語またはその等価物は、ＳＯＸ１７マーカー、ＨＮＦ１β（ＨＮＦ１Ｂ）マーカー、ＨＮＦ４アルファ（ＨＮＦ４Ａ）マーカーおよびＦＯＸＡ１マーカーを発現するが、ＰＤＸ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、またはＳＯＸ１を実質的に発現しない細胞である。ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団およびそれを生成する方法は、米国特許出願第１１／５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｄｏｒｓａｌａｎｄｖｅｎｔｒａｌｆｏｒｅｇｕｔｅｎｄｏｄｅｒｍ、２００６年１０月２７日出願にも記載されている。

「ＰＤＸ１陽性、背側に偏向性前腸内胚葉細胞」（背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞）または、単に「ＰＤＸ１陽性内胚葉」という用語またはその等価物は、関連する米国特許出願第１１／５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＤＯＳＡＬＡＮＤＶＥＮＴＲＡＬＦＯＲＥＧＵＴＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００６年１０月２７日出願、および米国特許出願第１１／１１５，８６８号、表題ＰＤＸ１−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｅｎｄｏｄｅｒｍ、２００５年４月２６日出願にも記載されている、表１から選択される１種もしくは複数種のマーカーおよび／または表２から選択される１種もしくは複数種のマーカーを発現する細胞である。

「膵臓内胚葉」、「膵臓上皮（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）」、「膵臓上皮（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）」（全て「ＰＥ」と省略することができる）、「膵臓前駆体」、「ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉」という用語または「膵臓内胚葉細胞」（ＰＥＣ）などのその等価物は全て、先駆または前駆膵臓細胞である。本明細書に記載のＰＥＣは、ステージ４分化（約１２〜１４日目）後の前駆細胞集団であり、少なくとも２つの主要な別個の集団：ｉ）ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を発現するが、ＣＨＧＡを発現しない（あるいはＣＨＧＡ陰性、ＣＨＧＡ−）膵臓前駆細胞、または「非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）」、または「非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団」または「非内分泌（ＣＨＧＡ−）細胞」またはその等価物；およびｉｉ）ＣＨＧＡを発現する複数ホルモン性内分泌細胞（ＣＨＧＡ陽性、ＣＨＧＡ＋）、または「内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ＋）」、または「内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団」または「内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞」またはその等価物を含む。ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を発現するが、ＣＨＧＡを発現しないＰＥＣ膵臓前駆体亜集団は、「非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）」または「非内分泌前駆体亜集団」、「非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団」、「非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団」、「多分化能前駆体亜集団」などとも称される。ＣＨＧＡを発現するＰＥＣ複数ホルモン性内分泌細胞亜集団は「内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）もしくは内分泌細胞」または「ＣＨＧＡ＋細胞」などとも称される。理論に束縛されることなく、ＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない細胞集団は、より活性かつ治療的なＰＥＣ構成成分であると仮定され、一方、ＣＨＧＡ陽性複数ホルモン性内分泌細胞の集団はｉｎｖｉｖｏでグルカゴン発現膵島細胞にさらに分化および成熟すると仮定される。Ｋｅｌｌｙら（２０１１）Ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃｅｌｌｔｙｐｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（８）：７５０−７５６、２０１１年７月３１日オンライン出版およびＳｃｈｕｌｚら（２０１２）、ＡＳｃａｌａｂｌｅＳｙｓｔｅｍｆｏｒＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＰａｎｃｒｅａｔｉｃＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓｆｒｏｍＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ、ＰＬｏｓＯｎｅ７（５）：１−１７、ｅ３７００４を参照されたい。

さらに、時には、膵臓内胚葉細胞は、すぐ上に記載したＰＥＣを指すのではなく、一般に少なくともステージ３およびステージ４型細胞を指して使用される。この使用および意味は文脈から明らかになろう。このように多能性幹細胞、ならびに少なくともｈＥＳ細胞およびｈＩＰＳ細胞から導出される膵臓内胚葉は、他の内胚葉系の系列細胞型とは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ１、ｃＭＹＣ、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸおよびＮＫＸ２．２マーカーから選択されるマーカーの発現が示差的または高いレベルに基づいて区別されるが、膵臓内分泌細胞の特質である遺伝子、例えばＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＭＡＦＡ、ＰＣＳＫ１およびＧＬＵＴ１は実質的に発現しない。さらに、ＮＧＮ３を発現するいくつかの「内分泌前駆細胞」は他の非膵臓構造（例えば、十二指腸）に分化することができる。膵臓内胚葉または内分泌前駆細胞集団およびその方法は、米国特許出願第１１／７７３，９４４号、表題Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐａｎｃｒｅａｔｉｃｈｏｒｍｏｎｅｓ、２００７年７月５日出願、および米国特許出願第１２／１０７，０２０号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＰＵＲＩＦＹＩＮＧＥＮＤＯＤＥＲＭＡＮＤＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＯＲＭＨＵＭＡＮＥＭＢＲＹＯＮＩＣＳＴＥＭＣＥＬＬＳ、２００８年４月２１日出願にも記載されている。

「内分泌細胞」または「膵島ホルモン発現細胞」、「膵臓内分泌細胞」、「膵島細胞」、「膵島」という用語またはその等価物は、複数ホルモン性または単一ホルモン性であり得る細胞を指す。したがって、当該細胞は、ヒト膵島細胞の機能の少なくとも一部を有する１種または複数種の膵臓ホルモンを発現することができる。膵島ホルモン発現細胞は成熟であっても未成熟であってよく、それらが由来する内分泌前駆体／先駆体型細胞よりもさらに分化しており、またはさらに発生的に傾倒している。

本明細書で使用される場合、「適正に特定された内分泌細胞」もしくは「ステージ７培養物」、または「未成熟ベータ細胞」を含めた「未成熟内分泌細胞」という句とは、ｉｎｖｉｖｏで機能することができる、ｉｎｖｉｔｒｏで作製された内分泌細胞集団、例えば移植されると血中グルコースに応答してインスリンを分泌する未成熟ベータ細胞を指す。適正に特定された内分泌細胞またはステージ７培養物は以下を含めた付加的な特性を有し得る：移植されると、適正に特定された内分泌細胞は、機能的な膵島細胞に発達および成熟することができる。適正に特定された内分泌細胞は、内分泌細胞が濃縮された（または非内分泌細胞を枯渇させた）ものであり得る。好ましい実施形態では、適正に特定された内分泌細胞集団内の細胞の約５０％超がＣＨＧＡ＋である。より好ましい実施形態では、適正に特定された内分泌細胞集団内の細胞の約６０％超または７０％超または８０％超または９０％超または９５％超または９８％超または１００％がＣＨＧＡ＋である。好ましい実施形態では、適正に特定された内分泌細胞集団内の細胞の約５０％未満がＣＨＧＡ−である。より好ましい実施形態では、適正に特定された内分泌細胞集団内の細胞の約１５％未満がＣＨＧＡ−である。より好ましい実施形態では、適正に特定された内分泌細胞集団内の細胞の約１０％未満または５％未満または３％未満または２％未満または１％未満または０．５％未満または０％がＣＨＧＡ−である。さらに、ステージ３の間に、適正に特定された内分泌細胞においてＮＧＮ３発現などのある特定のマーカーの発現が抑制され得る。ステージ５において、適正に特定された内分泌細胞におけるＮＧＮ３の発現は増加され得る。適正に特定された内分泌細胞は単一ホルモン性（例えば、ＩＮＳのみ、ＧＣＧのみまたはＳＳＴのみ）であり得る。適正に特定された内分泌細胞は、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を含めた他の未成熟内分泌細胞マーカーを同時発現し得る。適正に特定された内分泌細胞は、単一ホルモン性であり、かつＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を含めた他の未成熟内分泌細胞マーカーを同時発現し得る。適正に特定された内分泌細胞は、全ＩＮＳ集団に対する百分率として、より多くの単一ホルモン発現ＩＮＳ細胞を有し得る。好ましい実施形態では、適正に特定された内分泌細胞は、全ＩＮＳ集団に対する百分率として、単一ホルモン発現ＩＮＳ細胞を少なくとも５０％を有する。適正に特定された内分泌細胞は、ＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）であり得る。好ましい実施形態では、細胞集団内の細胞の約２５％超がＣＨＧＡ＋／ＴＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）である。好ましい実施形態では、細胞集団内の細胞の約３０％超または４０％超または５０％超または６０％超または７０％超または８０％超または９０％超または９５％超または１００％がＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）である。

「未成熟内分泌細胞」、特に「未成熟ベータ細胞」という用語またはその等価物は、少なくとも、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＮＥＵＲＯＤ、ＭＮＸ１、ＮＫＸ２．２、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＳＮＡＩＬ２、ＦＯＸＡ１またはＦＯＸＡ２からなる群から選択されるマーカーを発現する、内分泌前駆／先駆細胞、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞、膵臓前腸細胞、胚体内胚葉細胞、中内胚葉細胞または後で記載されるそれ以前に導出された任意の細胞を含めた、任意の他の内分泌細胞先駆体から導出された細胞を指す。本明細書に記載の未成熟ベータ細胞はＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を発現することが好ましく、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を同時発現することがより好ましい。「未成熟内分泌細胞」、「未成熟膵臓ホルモン発現細胞」または「未成熟膵島」という用語またはその等価物は、例えば、少なくとも、単能性の未成熟ベータ細胞、または図４５に記載の通りプレベータ細胞を指し、他の未成熟細胞は含まず、例えば、この用語は、未成熟アルファ（グルカゴン）細胞、または未成熟デルタ（ソマトスタチン）細胞、または未成熟イプシロン（グレリン）細胞、または未成熟膵臓ポリペプチド（ＰＰ）を含まない。

本明細書に記載の実施形態では、限定培地、馴化培地、フィーダーフリー培地、無血清培地などを含めた多くの幹細胞培地培養物または成長環境が構想される。本明細書で使用される場合、「成長環境」または「環境」という用語またはその等価物は、未分化の幹細胞または分化した幹細胞（例えば、霊長類胚性幹細胞）がｉｎｖｉｔｒｏで増殖する環境である。環境の特徴は、細胞を培養する培地、および存在する場合には支持構造（例えば、固体表面上の基質など）を含む。多能性細胞を培養または維持するためおよび／または多能性細胞を分化させるための方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＵＳＥＦＵＬＦＯＲＣＵＬＴＵＲＩＮＧＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＢＬＥＣＥＬＬＳ、２００７年２月２３日出願；米国特許出願第１１／９９３，３９９号、表題ＥＭＢＲＹＯＮＩＣＳＴＥＭＣＥＬＬＣＵＬＴＵＲＥＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＵＳＥＴＨＥＲＥＯＦ、２００７年１２月２０日出願；および米国特許出願第１１／８７５，０５７号、表題Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｍｅｄｉａｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ、２００７年１０月１９日出願にも記載されている。

「基本的に」または「実質的に」という用語は、大部分のまたはｄｅｍｉｎｉｍｕｓまたは低下した量の、任意の細胞集団または細胞培養物、例えば本明細書に記載の未成熟ベータ細胞培養物中に存在する構成成分または細胞が「基本的にまたは実質的に細胞」である、または「基本的または実質的にＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を発現し、基本的または実質的にＮＧＮ３を発現しない未成熟ベータ細胞」であることを意味する。他の例としては、これだけに限定されないが、「基本的にまたは実質的にｈＥＳ細胞」、「基本的にまたは実質的に胚体内胚葉細胞」、「基本的にまたは実質的に前腸内胚葉細胞」、「基本的にまたは実質的にＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」、「基本的にまたは実質的にＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞」、「基本的にまたは実質的に膵臓内分泌先駆細胞」、「基本的にまたは実質的に膵臓内分泌細胞」などが挙げられる。

細胞培養中または細胞集団内の細胞に関して、「を実質的に含まない」という用語は、その細胞培養物または細胞集団に含まれないと特定された細胞型が、その細胞培養物または細胞集団中に存在する細胞の総数の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満の量で存在することを意味する。

「減少された血清」または「無血清」という用語またはその等価物は、培地中で成長させる細胞培養物が含有する血清が減少されていることまたは血清を実質的に含まないことまたは血清を全く含まないことを指す。ある特定の培養条件下で、血清濃度は約０％（ｖ／ｖ）から約１０％（ｖ／ｖ）までにわたる。例えば、いくつかの分化プロセスでは、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％未満（ｖ／ｖ）、約２％未満（ｖ／ｖ）、約３％未満（ｖ／ｖ）、約４％未満（ｖ／ｖ）、約５％未満（ｖ／ｖ）、約６％未満（ｖ／ｖ）、約７％未満（ｖ／ｖ）、約８％未満（ｖ／ｖ）、約９％未満（ｖ／ｖ）または約１０％（ｖ／ｖ）未満であってよい。いくつかのプロセスでは、血清を用いずに、または血清代替物を用いずに前原条細胞を成長させる。さらに他のプロセスでは、Ｂ２７の存在下で前原条細胞を成長させる。そのようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は約０．１％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）までにわたってよい。

さらに他のプロセスでは、Ｂ２７の存在下で細胞培養物を成長させる。そのようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は約０．１％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）までにわたってもよく、約２０％（ｖ／ｖ）を超える濃度であってもよい。ある特定のプロセスでは、培地中のＢ２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）または約２０％（ｖ／ｖ）である。あるいは、添加するＢ２７サプリメントの濃度は、市販のＢ２７ストック溶液の強度の倍数として測定することができる。例えば、Ｂ２７はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から５０×ストック溶液として入手可能である。十分な量のこのストック溶液を十分な体積の成長培地に添加することにより、所望の量のＢ２７が補充された培地を生成する。例えば、５０×Ｂ２７ストック溶液１０ｍｌを成長培地９０ｍｌに添加することにより、５×Ｂ２７が補充された成長培地を生成することになる。培地中のＢ２７サプリメントの濃度は、約０．１×、約０．２×、約０．３×、約０．４×、約０．５×、約０．６×、約０．７×、約０．８×、約０．９×、約１×、約１．１×、約１．２×、約１．３×、約１．４×、約１．５×、約１．６×、約１．７×、約１．８×、約１．９×、約２×、約２．５×、約３×、約３．５×、約４×、約４．５×、約５×、約６×、約７×、約８×、約９×、約１０×、約１１×、約１２×、約１３×、約１４×、約１５×、約１６×、約１７×、約１８×、約１９×、約２０×、および約２０×超であり得る。

さらに別の態様では、分化のためのインスリンレベル要件が低い場合、Ｂ２７は高レベルのインスリンを含有するので、Ｂ２７は使用しない。例えば、出願人は、１００×のＢ２７ストックおよびＩＴＳストック、ならびにそれぞれのＲＰＭＩ中１×ワーキングストック溶液中のインスリンレベルを決定した。インスリンレベルはＭｅｒｃｏｄｉａＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅＩｎｓｕｌｉｎＥＬＩＳＡキットを製造者の説明書に従って決定した。どちらもＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した未開封の１００×および５０×Ｂ２７ストックおよびＩＴＳストックに対してそれぞれアッセイを実施した。アッセイから生じた結果が以下の表３に示されている。

表３には、１×Ｂ２７中および１×ＩＴＳ中にそれぞれ約３μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬのインスリンが存在することが示されている。さらに、ＩＴＳの１００×ストック中のインスリン濃度は、製造者により記載されたインスリン濃度と一致する。ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは５０×Ｂ２７についてのインスリン濃度は提供しておらず、したがって、製造者により示されたインスリンレベルとの比較はないが、上記の約１６０μｇ／ｍＬのインスリン濃度は、同時に実施した１００×ＩＴＳストックの正確な測定に基づいて、かつ、インスリンおよびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）がどちらもＰＩ３−キナーゼ依存性シグナル伝達のよく確立されたアゴニストであることが示され、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤（例えば、ＬＹ２９４００２）によりインスリン／ＩＧＦのエフェクターが阻害されることによって胚体内胚葉形成が促進されることが示唆されているＭｃＬｅａｎら（２００７）上記に基づいて、正確である。図６Ａおよび図６Ｂを参照されたい。特に、ＳＯＸ１７発現は１μｇ／ｍＬのインスリンで４分の１に低下する。インスリンおよび／またはＩＧＦは、ＫＳＲ、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、Ｂ２７およびＳｔｅｍＰｒｏ３４などの種々の培地補充物質中に生物学的に活性なレベルで存在し、そのような培養条件下では胚体内胚葉分化を阻害する可能性がある、例えば、Ｊｉａｎｇら（２００７）上記。

本明細書で使用される場合、例えば作用物質、構成成分、成長因子、分化因子などの「外因性」または「外因的に添加された」化合物とは、培養物または馴化培地に関しては、培養物または培地にすでに存在していてもしていなくてもよい任意の化合物または成長因子を補うために培養物または培地に添加される化合物を指す。例えば、一部の実施形態では、細胞培養物および／または細胞集団は、外因的に添加されたレチノイドを含まない。

本明細書で使用される場合、「レチノイド」とは、レチノール、レチナールまたはレチノイン酸ならびにこれらの化合物のいずれかの誘導体を指す。好ましい実施形態では、レチノイドはレチノイン酸である。

「ＦＧＦファミリー成長因子」、「線維芽細胞成長因子」または「線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー」という用語は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２およびＦＧＦ２３を含む群から選択されるＦＧＦを意味する。一部の実施形態では、「ＦＧＦファミリー成長因子」、「線維芽細胞成長因子」または「線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー」とは、公知の線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーとの相同性および／またはそれと同様の機能を有する任意の成長因子を意味する。

「ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子」または「ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド」または「ＴＧＦβＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路活性化因子」という用語またはその等価物は、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＦ−ベータ３、ＧＤＦ−１５、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−３、ＧＤＦ−１０、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンベータＣ、アクチビンベータＥ、アクチビンベータＡおよびアクチビンベータＢ、ＢＭＰ−１４、ＧＤＦ−１４、ＭＩＳ、インヒビンアルファ、Ｌｅｆｔｙ１、Ｌｅｆｔｙ２、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、パーセフィンおよびアルテミンのサブファミリーを含めた、３０種超の構造的に関連するタンパク質を指す。Ｃｈａｎｇら（２００２）ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖ．２３（６）：７８７−８２３を参照されたい。これらのリガンドは、一般には、およそ４００〜５００アミノ酸（ａａ）のプレプロペプチドとして合成され、「ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子」または「ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド」または「ＴＧＦβＴＧＦ−ベータシグナル伝達経路活性化因子」またはその等価物は全長のタンパク質であってもそのタンパク質分解によるペプチドであってもよい。

「ＥＲＢＢリガンド」という用語は、ＥｒｂＢ受容体のいずれか１つに結合し、それが今度は別のＥｒｂＢ受容体と二量体を形成し得、または単量体として機能し得、それによってＥｒｂＢ部分単量体もしくは二量体またはヘテロ二量体受容体のチロシンキナーゼ活性を活性化する、リガンドを指す。ＥｒｂＢリガンドの非限定的な例としては、ニューレグリン−１；これだけに限定されないが、ＨＲＧ−β、ＨＲＧ−α、Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）、グリア細胞成長因子２（ＧＧＦ２）、および感覚ニューロンおよび運動ニューロン由来因子（ＳｅｎｓｏｒｙＡｎｄＭｏｔｏｒＮｅｕｒｏｎ−ＤｅｒｉｖｅｄＦａｃｔｏｒ）（ＳＭＤＦ）を含めたニューレグリン−１のスプライスバリアントおよびアイソフォーム；ニューレグリン−２；これだけに限定されないが、ＮＲＧ２−βを含めたニューレグリン−２のスプライスバリアントおよびアイソフォーム；エピレギュリン；およびビレギュリン（Ｂｉｒｅｇｕｌｉｎ）が挙げられる。

「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、材料または物質の生成ならびに材料または物質の生成のレベルまたは量を指す。したがって、特定のマーカーの発現を決定することとは、発現されるマーカーの相対量または絶対量を検出することまたは単にマーカーが存在するかしないかを検出することを指す。

「マーカー」という用語は、本明細書で使用される場合、観察または検出することができる任意の分子を指す。例えば、マーカーとしては、これだけに限定されないが、特定の遺伝子の転写物などの核酸、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質または小分子（例えば、分子量が１０，０００ａｍｕ未満の分子）を挙げることができる。

本明細書に記載の大多数のマーカーについて、公式のＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＨＵＧＯ）遺伝子記号が提供される。ＨＵＧＯＧｅｎｅＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅにより開発されるそのような記号により、命名されたヒト遺伝子および遺伝子産物のそれぞれに対して固有の略語が提供される。当業者はこれらの遺伝子記号を容易に認識することができ、また、対応する固有のヒト遺伝子および／またはタンパク質配列と容易に関連付けることができる。

ＨＵＧＯによる名称によると、以下の遺伝子記号は次のように定義される：ＧＨＲＬ−グレリン；ＩＡＰＰ−島アミロイドポリペプチド；ＩＮＳ−インスリン；ＧＣＧ−グルカゴン；ＩＳＬ１−ＩＳＬ１転写因子；ＰＡＸ６−ペアードボックス遺伝子６；ＰＡＸ４−ペアードボックス遺伝子４；ＮＥＵＲＯＧ３−ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）；ＮＫＸ２−２−ＮＫＸ２転写因子関連遺伝子座２（ＮＫＸ２．２）；ＮＫＸ６−１−ＮＫＸ６転写因子関連遺伝子座１（ＮＫＸ６．１）；ＩＰＦ１−インスリンプロモーター因子１（ＰＤＸ１）；ＯＮＥＣＵＴ１−ワンカットドメイン、ファミリーメンバー１（ＨＮＦ６）；ＨＬＸＢ９−ホメオボックスＢ９（ＨＢ９）；ＴＣＦ２−転写因子２、肝臓（ＨＮＦ１ｂ）；ＦＯＸＡ１−フォークヘッドボックスＡ１；ＨＧＦ−肝細胞成長因子；ＩＧＦ１−インスリン様成長因子１；ＰＯＵ５Ｆ１−ＰＯＵドメイン、クラス５、転写因子１（ＯＣＴ４）；ＮＡＮＯＧ−Ｎａｎｏｇホメオボックス；ＳＯＸ２−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２；ＣＤＨ１−カドヘリン１、１型、Ｅ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）；Ｔ−ｂｒａｃｈｙｕｒｙホモログ（ＢＲＡＣＨ）；ＦＧＦ４−線維芽細胞成長因子４；ＷＮＴ３−無翅型ＭＭＴＶ組み込み部位ファミリー、メンバー３；ＳＯＸ１７−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス１７；ＧＳＣ−グースコイド；ＣＥＲ１−（ケルベロス１、システインノットスーパーファミリー、ホモログ（ＣＥＲ）；ＣＸＣＲ４−ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４；ＦＧＦ１７−線維芽細胞成長因子１７；ＦＯＸＡ２−フォークヘッドボックスＡ２；ＳＯＸ７−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス７；ＳＯＸ１−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス１；ＡＦＰ−アルファ−フェトプロテイン；ＳＰＡＲＣ−分泌タンパク質、酸性、システインリッチ（オステオネクチン）；およびＴＨＢＤ−トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＮＣＡＭ−神経系細胞接着分子；ＳＹＰ−シナプトフィジン；ＺＩＣ１−Ｚｉｃファミリーメンバー１；ＮＥＦ３−神経フィラメント３（ＮＦＭ）；ＳＳＴ−ソマトスタチン；ＭＡＦＡ−ｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＡ；ＭＡＦＢ−ｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＢ；ＳＹＰ−シナプトフィジン；ＣＨＧＡ−クロモグラニンＡ（副甲状腺分泌型タンパク質１）；ＮＧＮ３−ニューロゲニン３、ＮＫＸ２．２−ＮＫ２ホメオボックス２；ＮＫＸ６．１−ＮＫ６ホメオボックス１；ＩＤ１−ＤＮＡ結合性１、ＧＨＲＬ−グレリン／オベスタチンプレプロペプチドの阻害剤、ＧＳＫ−グリコーゲンシンターゼキナーゼ、Ｇ６ＰＣ２−グルコース−６−ホスファターゼ、ＵＣＮ３−ウロコルチン３、ＰＣＳＫ１−プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン１型、ＳＬＣ３０Ａ８−溶質輸送体ファミリー３０（亜鉛輸送体）、メンバー８、およびＣＡＤＨ１−Ｅ−カドヘリン。線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ７）およびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）という用語は同義である。

多能性細胞から種々の多分化能および／または分化した細胞への進行は、遺伝子、または遺伝子マーカーの相対的な発現量、特定の細胞の特性を、第２の遺伝子または対照遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子の発現と比較して決定することによってモニタリングすることができる。いくつかのプロセスでは、ある特定のマーカーの発現を、マーカーが存在するかしないかを検出することによって決定する。あるいは、ある特定のマーカーの発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞中でマーカーが存在するレベルを測定することによって決定することができる。そのようなプロセスでは、マーカーの発現の測定は定性的であっても定量的であってもよい。マーカー遺伝子によって生成するマーカーの発現を定量化する１つの方法は、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用することによるものである。Ｑ−ＰＣＲを実施する方法は当技術分野で周知である。当技術分野で公知の他の方法も、マーカー遺伝子発現を定量化するために使用することができる。例えば、マーカー遺伝子の発現産物は、目的のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を使用することによって検出することができる。

多くの遺伝子を高い感度および効率で解析するために、さらなる多重化アッセイおよび／または方法体系が利用可能である。例えば、少なくとも、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）により提供されるｎＣｏｕｎｔｅｒＳｙｓｔｅｍを用いて、使用者は現在のところ８００種に至るまでの遺伝子の発現レベルを同時に、定量的ＰＣＲ系に匹敵する感度で、かつ１５分未満の反応当たりの実践時間で解析することができる。したがって、試料（例えば、それぞれステージ４ＰＥＣおよびステージ７内分泌前駆体／先駆体および内分泌細胞培養物）のいずれかの中の全ＲＮＡを、６１００核酸抽出器（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して単離することができ（例えば、３連で）、ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇｎＣｏｕｎｔｅｒｓｙｓｔｅｍを使用して遺伝子発現を定量化するためには反応当たり約１００ｎｇが必要である。また、アナログ検出の代わりに、ｎＣｏｕｎｔｅｒｓｙｓｔｅｍではデジタル検出を使用し、それにより、各遺伝子転写物を、有色のフルオロフォアの固有の連なり（分子バーコード）に付着したＤＮＡのセグメントに結合したプローブによって検出する。したがって、その転写物の同定は連なり上の蛍光体の強度ではなく蛍光体の順序のみに依存する。第２に、試料中の全転写物の数を、特定の蛍光体の連なり（バーコード）が検出される総回数を計数することによって数量化する。さらに、この方法は、標的ｍＲＮＡの増幅を必要とせず、したがって、その範囲は発現の生物学的範囲、一般には、３桁にわたるものである。現在この系では、細胞当たり２０コピー（１０ｆＭ）の単一の転写物のわずか１．２倍の変化を、統計的有意性（ｐ＜０．０５）を伴って測定することができる。細胞当たり０．５コピーから２０コピーの間のレベルで発現される遺伝子については、発現レベルの１．５倍の差異が同じレベルの信頼度で検出可能である。

いくつかのプロセスでは、他の遺伝子の低発現と比較した以下の遺伝子の高発現により、細胞のある特定の集団が示される。例えば、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＡＦＰまたはＴＨＢＤにより胚体外内胚葉が示され、ＮＯＤＡＬおよび／またはＦＧＦ８により前原条が示され、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１および／またはＷＮＴ３により中内胚葉が示され、ＣＥＲ、ＧＳＣ、ＣＸＣＲ４、ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２により胚体内胚葉細胞が示され、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１ＢおよびＨＮＦ４Ａにより前腸内胚葉（またはＰＤＸ１陰性内胚葉）が示され、ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＳＯＸ９およびＰＲＯＸ１によりＰＤＸ１陽性内胚葉が示され；ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦＡ１、ＣＰＡおよびｃＭＹＣにより膵臓上皮（ＰＥまたは膵臓前駆体）が示され、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸおよびＮＫＸ２．２により内分泌前駆／先駆細胞が示され、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴおよびＰＰにより種々の内分泌細胞が示され、ＭＡＦＡ遺伝子発現がＭＡＦＢ遺伝子発現に対して相対的に高いことにより、インスリン分泌内分泌細胞が示され、ＭＡＦＡ遺伝子発現に対するＭＡＦＢの相対的な高発現により、グルカゴン分泌内分泌細胞が示される。さらにある特定の図には、特定の系列の特定の細胞型に典型的なこれらの「シグネチャー」または「重要な」マーカーのみが示されている。他のマーカーまたは遺伝子、例えば、構成的に発現される、またはある特定の系列もしくは全ての系列の全てもしくは大部分もしくは大多数の細胞型において発現される遺伝子が発現されているが、示されていないまたは記載されていないことが当業者にはよく理解されるであろう。

人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成するための方法
本明細書に記載の実施形態は、いかなる１つの型のｉＰＳ細胞にも、いかなる１つのｉＰＳ細胞の生成方法にも限定されない。種々の方法が存在するので、実施形態は限定的なものではない、またはｉＰＳ細胞の生成の効率のレベルに左右される。本明細書に記載の実施形態はｉＰＳ細胞の内胚葉系列細胞への分化およびその使用にあてはまる。

ある特定の核再プログラミング因子を使用した研究により、多能性幹細胞または多能性様幹細胞を患者自身の体細胞から導出することが可能になった。これらの細胞は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞とも称される。本発明では、ＳｈｉｎｙａＹａｍａｎａｋａ、ＫｙｏｔｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより提供された種々のｉＰＳ細胞株について記載されている。しかし、他のｉＰＳ細胞株、例えばＪａｍｅｓＴｈｏｍｓｏｎら、Ａ１．に記載されているものは本発明によるものである。米国特許出願公開第２００９００４７２６３号、国際公開ＷＯ２００５／８０５９８、米国特許出願公開第２００８０２３３６１０号および国際公開ＷＯ２００８／１１８８２を参照されたい。したがって、本明細書で使用される場合、「人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞」とは、他の多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞、ｈＥＧ細胞、ｐＰＳ（霊長類多能性幹）細胞、単為発生細胞などと同様の性質を有する細胞を意味する。

核プログラミング因子は、米国特許出願公開第２００９００４７２６３号、国際公開ＷＯ２００５／８０５９８、米国特許出願公開第２００８０２３３６１０号および国際公開ＷＯ２００８／１１８８２に記載されており、卵、胚、またはＥＳ細胞を使用せずに、分化した細胞の再プログラミングを誘導するために使用される。本発明で使用され、記載されているものと同様の核再プログラミング因子を使用することによって体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を調製するための方法は特に限定されない。好ましい実施形態では、体細胞および人工多能性幹細胞が増殖し得る環境で、核再プログラミング因子を体細胞と接触させる。本明細書に記載のある特定の実施形態の利点は、卵、胚、または胚性幹（ＥＳ）細胞の不在下で核再プログラミング因子を体細胞と接触させることによって人工多能性幹細胞を調製することができることである。核再プログラミング因子を使用することによって、体細胞の核を再プログラミングしてｉＰＳ細胞または「ＥＳ様細胞」を得ることができる。

本明細書に記載の多能性幹細胞は、ｈＥＳ細胞であるかｉＰＳ細胞であるかにかかわらず、これだけに限定されないが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；ＡＢＣＧ２；ステージ特異的胚抗原−１（ＳＳＥＡ−１）；ＳＳＥＡ−３；ＳＳＥＡ−４；ＴＲＡ−１−６０；ＴＲＡ−１−８１；Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ；ＥＲａｓ／ＥＣＡＴ５、Ｅ−カドヘリン；．β．ＩＩＩ−チューブリン；．アルファ．−平滑筋アクチン（アルファ．−ＳＭＡ）；線維芽細胞成長因子４（Ｆｇｆ４）、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、Ｄａｘ１；ジンクフィンガータンパク質２９６（Ｚｆｐ２９６）；Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１（Ｎａｔ１）；（ＥＳ細胞関連転写物１（ＥＣＡＴ１）；ＥＳＧ１／ＤＰＰＡ５／ＥＣＡＴ２；ＥＣＡＴ３；ＥＣＡＴ６；ＥＣＡＴ７；ＥＣＡＴ８；ＥＣＡＴ９；ＥＣＡＴ１０；ＥＣＡＴ１５−１；ＥＣＡＴ１５−２；Ｆｔｈｌ１７；Ｓａｌｌ４；未分化胚細胞転写因子（Ｕｔｆ１）；Ｒｅｘ１；ｐ５３；Ｇ３ＰＤＨ；ＴＥＲＴを含めたテロメラーゼ；サイレントＸ染色体遺伝子；Ｄｎｍｔ３ａ；Ｄｎｍｔ３ｂ；ＴＲＩＭ２８；Ｆ−ボックス含有タンパク質１５（Ｆｂｘ１５）；Ｎａｎｏｇ／ＥＣＡＴ４；Ｏｃｔ３／４；Ｓｏｘ２；Ｋｌｆ４；ｃ−Ｍｙｃ；Ｅｓｒｒｂ；ＴＤＧＦ１；ＧＡＢＲＢ３；Ｚｆｐ４２、ＦｏｘＤ３；ＧＤＦ３；ＣＹＰ２５Ａ１；発生多能性関連２（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ２）（ＤＰＰＡ２）；Ｔ細胞リンパ腫ブレイクポイント１（Ｔ−ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ１）（Ｔｃｌ１）；ＤＰＰＡ３／Ｓｔｅｌｌａ；ＤＰＰＡ４などを含めた任意の数の多能性細胞マーカーを発現し得る。本発明は本明細書において列挙されているマーカーに限定されず、細胞表面マーカー、抗原、ならびにＥＳＴ、ＲＮＡ（マイクロＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含む）、ＤＮＡ（遺伝子およびｃＤＮＡを含む）およびその一部を含めた他の遺伝子産物などのマーカーを包含することが理解される。

一実施形態では、本明細書で使用されるｉＰＳ細胞株は、以下の核再プログラミング因子遺伝子を含有する：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、およびＳｏｘファミリー遺伝子。ある１つのｉＰＳ細胞株では、以下の３種類の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、およびＳｏｘ２のそれぞれが提供される。以下の３種類の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃのそれぞれの他のｉＰＳ細胞株遺伝子産物を使用した。したがって、核再プログラミング因子はＭｙｃファミリー遺伝子を伴ってもよく伴わなくてもよいことが理解される。

本明細書に記載されており、当技術分野でも公知の核再プログラミング因子は、分化した成体の体細胞からｉＰＳ細胞を生じさせるために使用することができ、また、これは再プログラミングされる体細胞の型に限定されない、すなわち、任意の種類の体細胞を再プログラミングまたは脱分化させることができる。体細胞の再プログラミングには卵および／または胚が必要ないので、ｉＰＳ細胞は哺乳動物細胞であってよく、したがって、患者または疾患に特異的な多能性幹細胞を生じさせる機会がもたらされる。

アデノウイルス、プラスミド、またはＣｒｅ−ｌｏｘＰ３もしくはｐｉｇｇｙＢＡＣ転位を使用した再プログラミング因子の切除を使用する、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生じさせるためのウイルスによる方法、ウイルスによらない方法および非組込み型ウイルスによる方法が記載されている。Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２、９４５−９４９（２００８）；Ｏｋｉｔａ，Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２、９４９−９５３（２００８）；Ｋａｊｉ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ４５８、７７１−７７５（２００９）；Ｓｏｌｄｎｅｒ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ１３６、９６４−９７７（２００９）；およびＷｏｌｔｊｅｎ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ４５８、７６６−７７０（２００９）を参照されたい。同様に、Ｍａｃｋ，Ａ．らに対する米国特許出願公開第２０１００００３７５７号（２０１０年１月７日公開）およびＳｈｉらに対するＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３７４２９も参照されたい。しかし、これらの方法の再プログラミング効率は低く（＜０．００３％）、切除にもかかわらずベクター配列が残留する可能性があり、それにより、それらの治療への適用が限定される。例えば、上記の転写因子の宿主ゲノムへのウイルスによる組み込みおよび過剰発現は腫瘍形成に関連付けられており、導入遺伝子の発現が残留することは、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を区別する潜在的な特徴である。Ｓｏｌｄｅｒ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ１３６：９６４−９７７（２００９）；Ｆｏｓｔｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２４：１４９１−１５００（２００５）；およびＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ１２１：４６５−４７７（２００５）を参照されたい。

本発明の他の実施形態では、ｉＰＳＣを生じさせるための方法はエプスタイン・バーウイルスから導出されたエピソームベクターを含む。Ｙｕ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４、７９７−８０１（２００９）およびＭａｃｋ，Ａ．らに対する米国特許出願公開第２０１００００３７５７号、２０１０年１月７日公開を参照されたい。これらの方法では、癌遺伝子ＳＶ４０を含めた７種の因子の組合せを有する３つの別々のプラスミドが必要である。

本発明の別の実施形態では、ｉＰＳＣを生じさせるための方法は、マウス細胞およびヒト胎児細胞および新生児細胞由来のタンパク質に基づくｉＰＳＣを含む。Ｚｈｏｕ，Ｈ．ら、ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ４、３８１−３８４（２００９）；およびＫｉｍ，Ｄ．ら、ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ４、４７２−４７６（２００９）を参照されたい。これらの方法体系は、化学的処理（例えば、Ｚｈｏｕら、２００９、上記の場合ではバルプロ酸）または多数回の処理（Ｋｉｍら、２００９、上記）を使用して実現される。

本発明の別の実施形態では、細菌の複製開始点および抗生物質耐性遺伝子を欠く高次コイルＤＮＡ分子であるミニサークルベクターまたはプラスミドを使用することができる。Ｃｈｅｎ、Ｚ．−Ｙ．ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８、４９５−５００（２００３）；Ｃｈｅｎ、Ｚ．−Ｙ．ら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１６、１２６−１３１（２００５）；およびＪｉａ，Ｆら、ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓＡｄｖａｎｃｅＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＯｎｌｉｎｅ７Ｆｅｂｒｕａｒｙ２０１０を参照されたい。これらの方法体系では、外因性サイレンシング機構の活性化が低いので、高いトランスフェクション効率およびより長い異所性発現でｉＰＳＣが生じる。

本発明のさらに別の実施形態では、糖尿病患者、ＡＬＳ、脊椎筋ジストロフィーおよびパーキンソン患者を含めた種々の疾患のヒト患者からｉＰＳ細胞を生じさせることができる。Ｍａｅｈｒら、ＰＮＡＳＵＳＡ１０６（３７）：１５７６８−７３（２００９）；Ｄｉｍｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１：１２１８−２１（２００８）；Ｅｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ４５７：２７７−８０（２００９）；Ｐａｒｋら、Ｃｅｌｌ１３４：８７７−８８６（２００８）；およびＳｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ１３６：９６４−９７７を参照されたい。特定の疾患を有する患者からｈＩＰＳ細胞を生成することの少なくとも１つの利点は、導出された細胞がヒト疾患の遺伝子型および細胞応答を含有することである。現存するヒトｉＰＳ細胞株の少なくとも一部が列挙されている表４も参照されたい。この情報は、文献および例えばＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙ，ｔｈｅＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙを含めた公的に利用可能なデータベースから導出されたものである。これらのデータベースは、細胞株が利用可能になり登録が得られた時に定期的に更新されている。

本明細書に記載の組成物および方法の複数の実施形態では、これだけに限定されないが、ＣｙＴ４９、ＣｙＴ２１２、ＣｙＴ２０３、ＣｙＴ２５、（少なくとも本出願の出願時に、ＶｉａＣｙｔｅＩｎｃ．、３５５０ＧｅｎｅｒａｌＡｔｏｍｉｃｓＣｏｕｒｔ、ＳａｎＤｉｅｇｏＣＡ９２１２１から市販されていた）、ＢＧＯ１、ＢＧ０２およびＭＥＬ１を含めたｈＥＳＣなどのヒト多能性幹細胞、ならびにｉＰＳＣ−４８２ｃ７およびｉＰＳＣ−６０３（ＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから市販されている）、ならびにｉＰＳＣ−Ｇ４（以下「Ｇ４」）およびｉＰＳＣ−Ｂ７（以下、「Ｂ７」）（ＳｈｉｎｙａＹａｍａｎａｋａ、ＣｅｎｔｅｒｆｏｒｉＰＳＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ、ＫｙｏｔｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙから市販されている）などの人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含めた種々の分化可能な霊長類多能性幹細胞の使用が意図されており、これらおよび他のヒトｉＰＳ細胞を使用した試験は、米国特許出願第１２／７６５，７１４号および同第１３／７６１，０７８号、どちらも表題「ＣＥＬＬＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＲＯＭＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＥＤＲＥＰＲＯＧＲＡＭＭＥＤＣＥＬＬＳ」、それぞれ２０１０年４月２２日および２０１３年２月６日出願に詳しく記載されている。ある特定のこれらのヒト多能性幹細胞はＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）などの国際登録機関に登録され、ＮＩＨＨｕｍａｎＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙに列挙されている（例えば、ＣｙＴ４９の登録番号は００４１である）。他の入手可能な細胞株はｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙのワールドワイドウェブにも見出すことができる。さらに他の細胞株、例えば、ＢＧ０１およびＢＧＯ１ｖは、それぞれＷｉｓｃｏｎｓｉｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｔｅｍＣｅｌｌ（ＷＩＳＣ）Ｂａｎｋの関係団体であるＷｉＣｅｌｌ（登録商標）（カタログ名、ＢＧ０１）およびＡＴＣＣ（カタログ番号ＳＣＲＣ−２００２）によって第三者に商業的に販売および配布されている。本明細書に記載の他の細胞株はＷｉＣｅｌｌ（登録商標）またはＡＴＣＣなどの生物学的リポジトリによって登録または配布されていない場合があるが、そのような細胞株は原理研究者、研究室および／または施設から直接または間接的に公に市販されている。細胞株および試薬の公開要求は、例えば生命科学の当業者にとっては通例である。一般には、これらの細胞または材料の譲渡は、細胞株または材料の所有者と受取人の間の標準の材料譲渡契約を介する。これらの型の材料譲渡は、特に生命科学における研究環境では頻繁に生じる。実際、出願人は、ＣｙＴ４９（２００６）、ＣｙＴ２０３（２００５）、Ｃｙｔ２１２（２００９）、ＣｙＴ２５（２００２）、ＢＧ０１（２００１）、ＢＧ０２（２００１）、ＢＧ０３（２００１）およびＢＧＯｌｖ（２００４）を含めた細胞が導出され特徴付けられた時から、営利および非営利産業パートナーおよび共同研究者とのそのような契約を通じて常套的に細胞の譲渡を受けてきた。前記の一覧の各細胞株の隣の括弧内の年は、細胞株または材料が公的に入手可能かつ不死のものになった（例えば細胞バンクが作製された）年を示し、したがって、組成物を作製するためおよび本明細書に記載の方法を実施するためにこれらの細胞株が樹立された時から別の胚の破壊は実施または要求されていない。

表４および表５は、それぞれ、ある特定のｉＰＳＣおよびｈＥＳＣの包括的ではない一覧であり、研究目的および／または商業目的で世界的に利用可能であり、本発明の方法および組成物での使用に適している。表３および表４の情報は、文献および例えばＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）ＨｕｍａｎＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙ、ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙを含めた公的に利用可能なデータベースから導出されたものである。これらのデータベースは、細胞株が利用可能になり登録が得られた時に定期的に更新されている。

本明細書に記載のヒトｉＰＳＣ（少なくともｉＰＳＣ−６０３およびｉＰＳＣ−４８２−ｃ７）はＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）により提供されたものである。

ｈＩＰＳを使用することの別の利点は、そのようなｈＩＰＳ細胞が免疫学的に適合した自己細胞集団であり、患者に特異的な細胞により、疾患の起源および進行を試験することが可能になることである。したがって、疾患の根本原因を理解することが可能であり、それにより、疾患に対する予防的処置および治療的処置の開発を導く洞察がもたらされ得る。

多能性ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞
一部の実施形態は、胚体内胚葉細胞および最終的には、これだけに限定されないが、前腸内胚葉、膵臓内胚葉、内分泌前駆／先駆細胞および／または膵島ホルモン発現細胞を含めた任意の内胚葉系列由来細胞型を、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を出発材料として使用して導出するための方法を対象とする。これらのｈＥＳ細胞は、桑実胚、胚内部細胞塊または胚の生殖隆起から得られるものを起源とする細胞であってよい。ヒト胚性幹細胞は、当技術分野で公知の方法を使用して、培養物中、実質的な分化を伴わずに多能性の状態で維持することができる。そのような方法は、例えば、米国特許第５，４５３，３５７号；同第５，６７０，３７２号；同第５，６９０，９２６号；同第５，８４３，７８０号；同第６，２００，８０６号および同第６，２５１，６７１号に記載されている。

いくつかのプロセスでは、多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞は、フィーダー層上で維持される。そのようなプロセスでは、多能性細胞を多能性の状態で維持することを可能にする任意のフィーダー層を使用することができる。ヒト胚性幹細胞の培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）に一般に使用されるフィーダー層の１つは、マウス線維芽細胞の層である。つい最近、多能性細胞の培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）において使用するためのヒト線維芽細胞フィーダー層が開発された（米国特許出願公開第２００２／００７２１１７号）。代替のプロセスでは、フィーダー層を使用せずに多能性細胞を維持することが可能になる。

本明細書に記載の多能性細胞は、血清を伴うまたは伴わない、細胞外マトリックスを伴うまたは伴わない、ＦＧＦを伴うまたは伴わない培養物中で維持することができる。いくつかの多能性細胞の維持手順では、血清代替物を使用する。多能性細胞または多分化能細胞を培養し、分化させるためのこれらおよび他の方法は、それぞれ、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、２００７年２月２３日出願、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＣＵＬＴＵＲＩＮＧＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬＣＥＬＬＳおよびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６、２００８年１０月２０日出願、表題ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＯＲＦＥＥＤＥＲ−ＦＲＥＥＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＭＥＤＩＡＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧＨＵＭＡＮＳＥＲＵＭに記載されている。

本明細書に記載の発明は全てのｈＥＳ細胞株、および少なくとも、識別されている企業から市販されているまたはＷｉＣｅｌｌからワールドワイドウェブｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ／ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅｓ／ｏｒｄｅｒ−ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅｓ／ｏｂｔａｉｎ−ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅｓ．ｃｍｓｘで市販されているものである、表５に列挙されているものと共に有用である。この情報は、文献および例えば、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙ、ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙを含めた公的に利用可能なデータベースから導出されたものである。これらのデータベースは、細胞株が利用可能になり登録が得られた時に定期的に更新されている。ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｇｉｓｔｒｙには少なくとも２５４種のｉＰＳＣ市販株が列挙されており、１２１１種のｈＥＳＣ株が市販されている。以下の表５は列挙されているｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの全てを含むものではなく、潜在的に入手可能な多能性幹細胞の例である。

多能性幹細胞を導出するための代替方法
胚を破壊せずに哺乳動物ＥＳ細胞などの多能性幹細胞を導出するための方法が存在する。簡単に述べると、ＡｄｖａｎｃｅｄＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により、胚をインタクトなままにし、したがってその破壊を引き起こさずに単一の割球からマウスＥＳ細胞およびヒトＥＳ細胞を導出することについて記載されている３件の科学論文が公開された。２００５年の後期に、Ｃｈｕｎｇらにより、マウスＥＳ細胞を単一の割球から作製するための方法が最初に記載された。Ｃｈｕｎｇら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４３９：２１６−２１９、２００５年１０月１６日オンライン出版。Ｃｈｕｎｇら（２００６）により、着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）に使用される技法と同様の顕微操作技法を使用した胚からの生検材料の取得が記載された。２１７頁を参照されたい。その時にはＣｈｕｎｇら（２００６）は割球細胞株を他の胚性幹細胞と共培養したが、後に開発された方法ではこれは必要なくなった。Ｃｈｕｎｇら（２００８）、ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌＬｉｎｅｓＧｅｎｅｒａｔｅｄｗｉｔｈｏｕｔＥｍｂｒｙｏＤｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ２：１１３−１１７を参照されたい。

着床前の胚における遺伝子異常を分析するために、着床前遺伝子診断が使用されている。当該方法は、両親の遺伝子インプットを試験することができる時期にある初期の正常に発達している胚（例えば、８細胞期）に対して透明帯に穴を開け、その開口から１つまたは２つの割球を吸引または押出しまたは切離することによって実施される。ＰＧＤでは、染色体異常および単一遺伝子障害を分析するために、それぞれ蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した遺伝子解析が一般に使用される。その後、遺伝子異常がなければ、残りのインタクトな胚を女性患者に正常な妊娠期間に着床させる。着床前遺伝子診断技法は、既に２００４年にＳｔａｅｓｓｅｎ，Ｃら（２００４）、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｔｒａｎｓｆｅｒｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｉｃｄｉａｇｎｏｓｉｓｆｏｒａｎｅｕｐｌｏｉｄｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｉｎｃｏｕｐｌｅｓｗｉｔｈａｄｖａｎｃｅｄｍａｔｅｒｎａｌａｇｅ：ａｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｒａｎｄｏｍｉｚｅｄｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｔｒｉａｌ、Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１９：２８４９−２８５８およびＭｏｎｎｉら（２００４）Ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｉｃｄｉａｇｎｏｓｉｓｆｏｒｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ：ｔｈｅＳａｒｄｉｎｉａｎｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．ＰｒｅｎａｔＤｉａｇｎ２４：９４９−９５４を含めた種々のグループによって報告された。したがって、Ｃｈｕｎｇら（２００６）は、単に胚を破壊せずに初期胚から割球を抽出するために利用可能な方法を記載しただけである。

さらに、２００６年８月に、Ｃｈｕｎｇら（２００６）の刊行物の第２著者であり、同じくＡｄｖａｎｃｅｄＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＫｌｉｍａｎｓｋａｙａらにより、効率的ではないが（単離された割球の２％のみからｈＥＳ細胞株が生じた）、同様のＰＧＤ技法により、ヒトＥＳ細胞株を単一の割球から導出することが可能になり、Ｃｈｕｎｇら（２００６）上記に最初に記載されたものと有意に異ならないことが実証された手順が記載された。Ｋｌｉｍａｎｓｋａｎｙａら（２００６）Ｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｓｉｎｇｌｅｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ４４４、４８１−４８５を参照されたい。Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａらは、新しく導出されたｈＥＳ細胞株と他のＥＳ細胞を共培養物し、これは、Ｃｈｕｎｇら（２００６）が重要であり得ると述べたことである。Ｃｈｕｎｇら（２００６）は、「ｉｔｉｓｕｎｃｌｅａｒｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓｏｆｔｈｅＥＳｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍｉｎ［ｈｉｓ］ｓｔｕｄｙｉｓａｔｔｒｉｂｕｔａｂｌｅｔｏｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙｔｈｅＥＳｃｅｌｌｓｏｒｉｆｃｅｌｌ−ｃｅｌｌｃｏｎｔａｃｔｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄ」と述べた。Ｃｈｕｎｇら（２００６）、上記、２１８頁、右の欄を参照されたい。しかし、後の２００８年に、同じくＣｈｕｎｇら、上記の研究により、単離された割球を、ラミニンを伴う培地で培養することによりｈＥＳＣを生じさせる能力が増強されるので、ｈＥＳ細胞株にはＥＳ細胞と共培養する必要が全くないことが実証された。Ｃｈｕｎｇら（２００８）、ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌＬｉｎｅｓＧｅｎｅｒａｔｅｄｗｉｔｈｏｕｔＥｍｂｒｙｏＤｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ（２）：１１３−１１７、１１６頁、２００８年１月１０日オンライン出版を参照されたい。さらに、このように得られたｈＥＳ細胞は、未分化の状態で６ヶ月超にわたって維持できることを含めた、ｈＥＳ細胞を含めた他のヒト多能性幹細胞と同じ特性を有し、また、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｎａｎｏｇおよびアルカリホスファターゼを含めた多能性のマーカーの正常な核型および発現を示し、そしてｉｎｖｉｔｒｏ、およびｉｎｖｉｖｏでの奇形腫の形態のどちらにおいても３つ全ての胚性生殖層の誘導体を分化し形成することができる。

したがって、Ｃｈｕｎｇら（２００６）によって最初に仮定されたように、単一の割球を他のＥＳ細胞と共培養することは重大ではない場合、単一の割球を単に、多くの細胞外マトリックスの一般的な構成成分であり（市販されており、かつ／または例えばフィーダー細胞を溶解することにより作製される）、一般に使用されており、哺乳動物細胞を成長させることが公知であったラミニンと培養することなどは、Ｃｈｕｎｇの２００６年の刊行物によりマウスＥＳ細胞株を単一の割球から導出することが最初に示された時に公知かつ利用可能であった。したがって、当業者がＣｈｕｎｇら（２００６）上記の方法体系を取り、Ｓｔｒａｅｓｓｅｎら（２００４）上記によって以前に記載された利用可能な知見を使用して、胚を保存するまたはその破壊を防止する一方でｈＥＳ細胞株を単一の割球から導出することができた可能性は十分にある。

多能性幹細胞および多能性幹細胞から導出された細胞の凝集懸濁液
個々の細胞をポリマースキャフォールド、マトリックスおよび／またはゲルに播種することに基づく、以前に公知の組織工学の方法とは対照的に、本明細書に記載の実施形態では、多能性幹細胞から形成された細胞凝集懸濁液、単一細胞懸濁液またはそれから導出された分化した単一細胞懸濁液を使用することができる。幹細胞凝集懸濁液の処理および／または製造方法ならびにその細胞の分化は、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、２００７年２月２３日出願、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＣＵＬＴＵＲＩＮＧＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬＣＥＬＬＳ、現在は米国特許第８，２１１，６９９号および同第８，４１５，１５８号；およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６、２００８年１０月２０日出願、表題ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＦＯＲＦＥＥＤＥＲ−ＦＲＥＥＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＭＥＤＩＡＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧＨＵＭＡＮＳＥＲＵＭ、現在は米国特許第８，３３４，１３８号、およびＳｃｈｕｌｚＴ．ら（２０１２）、上記に記載されている。

本明細書に記載の実施形態は、多能性細胞を、未分化の状態での拡張を可能にする接着性成長培養条件で培養し、その接着性多能性細胞培養物を単一細胞懸濁培養物に解離させ、その単一細胞懸濁培養物が懸濁液中に多能性由来細胞凝集体を形成する期間にいたるまでその単一細胞懸濁培養物を撹拌することによって、懸濁液中にｈＥＳ由来細胞凝集体の形成を可能にする第１の分化培養条件に単一細胞懸濁培養物を接触させ、それにより、懸濁液中の多能性由来細胞凝集体を生じさせることによって、多能性接着培養物から懸濁液中の多能性細胞凝集体を生じさせるための方法に関する。好ましい実施形態では、単一細胞懸濁培養物の撹拌は、約８０ｒｐｍ〜１６０ｒｐｍで回転させることによって実施する。本明細書に記載のある特定の他の実施形態では、多能性幹細胞の凝集、成長、増殖、拡張および／または細胞塊を促進するために、ｒｈｏキナーゼ阻害剤を使用する。

「実質的に均一な」または「サイズおよび形状が実質的に均一な」という句またはその等価物は、凝集体の均一性の広がりを指し、約２０％以下である。別の実施形態では、凝集体の均一性の広がりは約１５％以下、約１０％以下または約５％以下である。

さらに別の実施形態では、ｈＥＳ細胞凝集懸濁液を、血清を実質的に含まない培地中、さらに、外因的に添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の不在下で培養した。これは、血清を伴わないが、ＦＧＦを含めた外因的に添加された成長因子を含有する培地中でｈＥＳ細胞を培養することが必要なＴｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．に対する米国特許第７，００５，２５２号とは区別される。一部の実施形態では、ｉＰＳ細胞凝集懸濁液を、血清を実質的に含まない培地中で、かつ／または、さらに、外因的に添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の不在下で培養する。

凝集体当たりの細胞の正確な数は重要ではないが、各凝集体のサイズ（したがって、凝集体当たりの細胞の数）は、酸素および栄養分が中心細胞に拡散する最大限度によって限定されること、およびこの数は細胞型およびその細胞型の栄養素の要件に応じても変動し得ることが当業者には理解されよう。細胞凝集体は、凝集体当たり最小数の細胞（例えば、２つまたは３つの細胞）を含んでもよく、凝集体当たり何百ものまたは何千もの細胞を含んでもよい。一般には、細胞凝集体は、凝集体当たり何百から何千もの細胞を含む。本発明の目的上、細胞凝集体は、一般には約５０ミクロンから約６００ミクロンまでのサイズであるが、細胞型に応じて、サイズはこの範囲を下回ることも上回ることもある。一実施形態では、細胞凝集体は、約５０ミクロンから約２５０ミクロンまでのサイズ、または約７５〜２００ミクロンのサイズであり、約１００〜１５０ミクロンのサイズであることが好ましい。

さらに他の方法では胚様体（ＥＢ）の作製が記載されている。本明細書で使用される場合、「胚様体」、「凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｂｏｄｙ）」という用語またはその等価物は、ＥＳ細胞が単層培養物中で過成長した際、または、未定義の培地中の懸濁培養物中で維持されたまたは非定方向プロトコルによって多数の胚葉組織に分化した際に生じる分化した細胞および未分化の細胞の凝集体を指す。すなわち、ＥＢは、本明細書に記載の多能性幹細胞の単一細胞懸濁液から形成されることもなく、ＥＢは、多能性由来多分化能細胞の接着培養物から形成されることもない。これらの特徴単独により、本発明は胚葉体から明白に区別される。

分化した細胞と未分化の細胞の混合物であり、一般にはいくつかの胚葉由来の細胞からなり、ランダムな分化をたどる胚様体とは対照的に、本明細書に記載の細胞凝集体は、基本的にまたは実質的に均一な細胞であり、多能性、多分化能、二分化能、または単能性型の細胞、例えば、胚細胞、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉、膵臓内分泌細胞などの凝集体として存在する。

本明細書に記載の方法では、例えば、Ｂｏｄｎａｒらに対するものであり、ＧｅｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡された米国特許第６，８００，４８０号に記載の通り最初に培養容器を細胞外マトリックスでコーティングする必要は全くない。本明細書に記載の一部の実施形態では、ｉＰＳ細胞を、出願人の米国特許第８，３３４号、１３８；およびＳｃｈｕｌｚＴ．ら（２０１２）上記に実質的に記載されている通り他の多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を、可溶性ヒト血清を使用して培養するのと同様に培養することができる。

本明細書に記載の方法では、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．に対するものであり、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＡｌｕｍｎｉＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷＡＲＦ）に譲渡された米国特許第７，００５，２５２号に記載の通り単に線維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給される外因的に添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は全く必要ない。

多分化能および分化した細胞組成物
本明細書に記載の方法によって生成する細胞組成物は、多能性幹細胞、前原条、中内胚葉、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１同時陽性膵臓内胚葉、内分泌前駆体／先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２同時陽性内分泌前駆体／先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞を含む細胞培養物を含み、培養物中の細胞の少なくとも約５〜９０％が、生成された前原条、中内胚葉、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１同時陽性膵臓内胚葉、内分泌前駆体／先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２同時陽性内分泌前駆体／先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞である。

本明細書に記載の一部の実施形態は、幹細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性細胞と、前原条、中内胚葉または胚体内胚葉などの多分化能細胞の両方、ならびに、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１同時陽性膵臓内胚葉、内分泌前駆体／先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２同時陽性内分泌前駆体／先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞などの、より分化しているが、なお潜在的に多分化能である細胞を含む細胞集団および細胞培養物などの組成物に関する。例えば、本明細書に記載の方法を使用して、多能性幹細胞および他の多分化能細胞または分化した細胞の混合物を含む組成物を生成することができる。一部の実施形態では、約９５の多能性細胞ごとに少なくとも約５の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物が生成する。他の実施形態では、約５の多能性細胞ごとに少なくとも約９５の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物が生成する。さらに、他の比の多分化能細胞または分化した細胞と多能性細胞を含む組成物が考えられている。例えば、約１，０００，０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１００，０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１０，０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約５００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１０の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約５の多能性細胞ごと、および約１までの多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、および約１の多能性細胞ごとに少なくとも約１，０００，０００の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物が考えられている。

本明細書に記載の一部の実施形態は、少なくとも約５％の多分化能細胞または分化した細胞から少なくとも約９９％の多分化能細胞または分化した細胞までを含む細胞培養物または細胞集団に関する。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団は哺乳動物細胞を含む。好ましい実施形態では、細胞培養物または細胞集団はヒト細胞を含む。例えば、ある特定の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物であって、ヒト細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約９９％が多分化能細胞または分化した細胞である細胞培養物に関する。他の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物であって、ヒト細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または９９％超が多分化能細胞または分化した細胞である細胞培養物に関する。細胞培養物または細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む複数の実施形態では、細胞培養中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに上記の百分率を算出する。

本明細書に記載の組成物および方法には、いくつかの有用な特徴がある。例えば、多分化能細胞、例えば、前原条細胞および／または中内胚葉細胞を含む細胞培養物および細胞集団、ならびにそのような細胞培養物および細胞集団を生成するための方法は、ヒト発生の初期をモデリングするために有用である。さらに、本明細書に記載の組成物および方法は、真性糖尿病などの病態への治療介入としても機能し得る。例えば、前原条細胞および／または中内胚葉細胞は限られた数の組織のみの供給源として機能するので、純粋な組織または細胞の型の発生において使用することができる。前原条細胞を生成するためのいくつかのプロセスでは、出発材料として使用される多能性細胞は、多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞、ｈＥＧ細胞またはｉＰＳ細胞である。

栄養外胚葉細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、栄養外胚葉細胞を含む組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する栄養外胚葉細胞集団または細胞培養物では、ＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢ遺伝子を含む群から選択されるマーカーの発現が、非栄養外胚葉細胞または細胞集団におけるＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢの発現レベルと比較して実質的に高い。

前原条細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、前原条細胞を含む組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する前原条細胞集団または細胞培養物は、ＦＧＦ８マーカー遺伝子および／またはＮＯＤＡＬマーカー遺伝子を、ＢＲＡＣＨＵＲＹｌｏｗ、ＦＧＦ４ｌｏｗ、ＳＮＡＩ１ｌｏｗ、ＳＯＸ１７ｌｏｗ、ＦＯＸＡ２ｌｏｗ、ＳＯＸ７ｌｏｗおよびＳＯＸ１ｌｏｗと比較して実質的に発現する。前原条細胞および前原条細胞を生成する方法は、出願人の米国特許第７，９５８，５８５号、ＰＲＥＰＲＩＭＩＴＩＶＥＳＴＲＥＡＫＡＮＤＭＥＳＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳ、２０１１年７月２６日発行に詳しく記載されている。

胚体外細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、胚体外細胞を含む組成物を生成することができる。原始内胚葉細胞、近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞は胚体外細胞である。原始内胚葉細胞は近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞を生じる。近位内胚葉細胞は、卵黄嚢の一部を形成する内胚葉細胞である。近位内胚葉細胞は、栄養分の取り込みおよび輸送の両方において機能する。遠位内胚葉細胞は、ライヘルト膜として公知の胚体外組織と近接している。遠位内胚葉細胞の役割のうちの１つは、基底膜の構成成分の生成である。まとめると、近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞は、多くの場合、胚体外内胚葉と称されるものを形成する。名称に示されている通り、胚体外内胚葉細胞は発生の間に形成される胚構造を生じない。対照的に、本明細書に記載の胚体内胚葉細胞および他の内胚葉系列または膵臓の系列細胞は、胚性であるまたは胚細胞から導出されたものであり、胚発生の間に形成される腸管から導出された組織を生じる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する胚体外細胞集団または細胞培養物では、ＳＯＸ７遺伝子、ＳＯＸ１７遺伝子、ＴＨＢＤ遺伝子、ＳＰＡＲＣ遺伝子、ＤＡＢ１遺伝子、ＦＴＮＦ４ａｌｐｈａ遺伝子またはＡＦＰ遺伝子を含む群から選択されるマーカーの発現が、少なくとも、他の細胞型または細胞集団、例えば胚体内胚葉では発現されないＳＯＸ７、ＳＯＸ１７、ＴＨＢＤ、ＳＰＡＲＣ、ＤＡＢ１、またはＡＦＰの発現レベルと比較して実質的に高い。

中内胚葉細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、中内胚葉細胞を含む組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する中内胚葉細胞集団または細胞培養物は、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＭＩＸＬ１および／またはＷＮＴ３マーカー遺伝子を含む群から選択されるマーカーの発現が、ＳＯＸ１７ｌｏｗ、ＣＸＣＲ４ｌｏｗ、ＦＯＸＡ２ｌｏｗ、ＳＯＸ７ｌｏｗおよびＳＯＸ１ｌｏｗと比較して実質的に高い。中内胚葉細胞および中内胚葉細胞を生成する方法は、出願人の米国特許第７，９５８，５８５号、ＰＲＥＰＲＩＭＩＴＩＶＥＳＴＲＥＡＫＡＮＤＭＥＳＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳ、２０１１年７月２６日発行に詳しく記載されている。

スクリーニング方法
一部の実施形態では、スクリーニング方法を使用して、ヒト多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、前原条細胞、中内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉またはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉またはＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞または膵臓前駆細胞、内分泌前駆／先駆細胞、および／または内分泌細胞などの多能性細胞、多分化能細胞および／または分化した細胞を含むある特定の細胞集団を得る。次いで、細胞集団に候補分化因子をもたらす。候補分化因子をもたらす前またはそれとほぼ同時である第１の時点で、マーカーの発現を決定する。あるいは、候補分化因子をもたらした後にマーカーの発現を決定することができる。第１の時点の後であり、かつ候補分化因子を細胞集団にもたらすステップの後である第２の時点で、同じマーカーの発現を再度決定する。候補分化因子が膵臓先駆細胞の分化を促進することができるかどうかを、第１の時点におけるマーカーの発現と第２の時点におけるマーカーの発現を比較することによって決定する。第２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点におけるマーカーの発現と比較して増加または減少した場合、当該候補分化因子は膵臓前駆細胞の分化を促進することができることになる。

本明細書に記載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、ヒト胚体内胚葉、ＰＤＸ−１陰性前腸内胚葉、ＰＤＸ−１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉、または膵臓前駆体または内分泌前駆／先駆細胞を含む細胞集団または細胞培養物を利用する。例えば、細胞集団は、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞の実質的に精製された集団であってよい。例えば、細胞集団はヒト膵臓前駆細胞の濃縮された集団であってよく、細胞集団内のヒト細胞の少なくとも約５０％〜９７％がヒト膵臓前駆細胞であり、残りは、内分泌前駆体／先駆体または内分泌細胞および他の細胞型で構成される。膵臓前駆体集団の濃縮は、出願人の米国特許出願第１２／１０７，０２０号、表題ＭＥＴＨＯＤＦＯＲＰＵＲＩＦＹＩＮＧＥＮＤＯＤＥＲＭＡＮＤＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＵＭＡＮＥＭＢＲＹＯＮＩＣＳＴＥＭＣＥＬＬＳ、２００８年４月２１日出願、現在は米国特許第８，３３８、１７０号および対応する刊行物Ｋｅｌｌｙら（２０１１）、上記に詳細に記載されている。

本明細書に記載のスクリーニング方法の複数の実施形態では、細胞集団を候補（試験）分化因子と接触させる、または他のやり方で候補（試験）分化因子をもたらす。候補分化因子は、上記の細胞のいずれか、例えばヒト膵臓前駆細胞の分化を促進する潜在性を有し得る任意の分子を含んでよい。本明細書に記載の一部の実施形態では、候補分化因子は、細胞の１種または複数種の型に対する分化因子であることが分かっている分子を含む。代替の実施形態では、候補分化因子は、細胞分化を促進することが分かっていない分子を含む。好ましい実施形態では、候補分化因子は、ヒト膵臓前駆細胞の分化を促進することが分かっていない分子を含む。胚体内胚葉を分化させる因子に対するスクリーニングは、例えば、出願人の米国特許出願第１２／０９３，５９０号、表題ＭＡＲＫＥＲＳＯＦＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００８年７月２１日出願に詳細に記載されている。

少なくとも１種のマーカーの発現を第１の時点で決定することに加えて、本明細書に記載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、少なくとも１種のマーカーの発現を、第１の時点の後であり、かつ細胞集団に候補分化因子をもたらした後である第２の時点で決定することが意図されている。そのような実施形態では、第１の時点と第２の時点の両方で同じマーカーの発現を決定する。一部の実施形態では、第１の時点と第２の時点の両方で複数種のマーカーの発現を決定する。そのような実施形態では、第１の時点と第２の時点の両方で同じ複数種のマーカーの発現を決定する。一部の実施形態では、それぞれが第１の時点の後であり、かつそれぞれが細胞集団に候補分化因子をもたらした後である複数の時点でマーカーの発現を決定する。ある特定の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲによってマーカーの発現を決定する。他の実施形態では、免疫細胞化学によってマーカーの発現を決定する。

本明細書に記載のスクリーニング方法のある特定の実施形態では、第１の時点および第２の時点において発現が決定されるマーカーは、膵臓前駆細胞から膵島組織を構成する最終分化した細胞の先駆体である細胞への分化に関連するマーカーである。そのような細胞としては、未成熟膵島ホルモン発現細胞を挙げることができる。

本明細書に記載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、細胞集団に候補分化因子をもたらすステップと第２の時点におけるマーカーの発現を決定するステップの間に十分な時間を経過させる。細胞集団に候補分化因子をもたらすステップと第２の時点におけるマーカーの発現を決定するステップの間の十分な時間は、約１時間の短さから約１０日間の長さまでであってよい。一部の実施形態では、少なくとも１種のマーカーの発現を、細胞集団に候補分化因子をもたらした後に多数回決定する。一部の実施形態では、十分な時間は、少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、または少なくとも約８週間である。

本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、第２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点におけるこのマーカーの発現と比較して増加または減少したかどうかをさらに決定する。少なくとも１種のマーカーの発現の増加または減少により、候補分化因子が内分泌前駆／先駆細胞の分化を促進することができることが示される。同様に、複数種のマーカーの発現を決定する場合、第２の時点における複数種のマーカーの発現が第１の時点におけるこの複数種のマーカーの発現と比較して増加または減少したかどうかをさらに決定する。マーカーの発現の増加または減少は、第１の時点および第２の時点での細胞集団におけるマーカーの量、レベルまたは活性を測定することまたは他のやり方で評価することによって決定することができる。そのような決定は、他のマーカー、例えばハウスキーピング遺伝子発現との比較的なものであってもよく、絶対的なものであってもよい。第２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点と比較して増加するある特定の実施形態では、増加の量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍または少なくとも約１００倍超である。一部の実施形態では、増加の量は、２倍未満である。第２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点と比較して減少する実施形態では、減少の量は、少なくとも約２分の１、少なくとも約５分の１、少なくとも約１０分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも約３０分の１、少なくとも約４０分の１、少なくとも約５０分の１、少なくとも約６０分の１、少なくとも約７０分の１、少なくとも約８０分の１、少なくとも約９０分の１、少なくとも約１００分の１または少なくとも約１００分の１未満である。一部の実施形態では、減少の量は２分の１を下回らない。

多分化能細胞または分化した細胞の生成のモニタリング
多能性細胞から多分化能細胞、多分化能細胞から膵臓前駆体またはホルモン内分泌細胞などのさらに多分化能の細胞または分化した細胞への進行は、内分泌細胞における島ホルモンの発現およびプロインスリンからインスリンおよびＣペプチドへのプロセシングなどの遺伝子マーカーおよび表現型マーカーを含めた特定の細胞に特有のマーカーの発現を決定することによってモニタリングすることができる。いくつかのプロセスでは、ある特定のマーカーの発現を、マーカーが存在するかしないかを検出することによって決定する。あるいは、ある特定のマーカーの発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞中でマーカーが存在するレベルを測定することによって決定することができる。例えば、ある特定のプロセスでは、未成熟膵島ホルモン発現細胞に特有のマーカーの発現ならびに多能性細胞、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、内分泌前駆体／先駆体、胚体外内胚葉、中胚葉、外胚葉、成熟膵島ホルモン発現細胞および／または他の細胞型に特有のマーカーの有意な発現の欠如を決定する。

他の胚体内胚葉系列の分化の程度がより低い細胞型の生成のモニタリングに関連して記載されている通り、ブロット転写法および免疫細胞化学などの定性的技法または半定量的技法を使用して、マーカーの発現を測定することができる。あるいは、マーカーの発現は、Ｑ−ＰＣＲまたはＮａｎｏｓｔｒｉｎｇのｎＣｏｕｎｔｅｒ、または数百以上のマーカーを同時に分析およびアッセイすることができる関連するハイスループットなマルチプレックス技術などの技法を使用することによって正確に定量化することができる。さらに、ポリペプチドレベルでは、膵島ホルモン発現細胞のマーカーの多くは分泌タンパク質であることが理解されよう。このように、ＥＬＩＳＡなどの細胞外マーカー含有量を測定するための技法を利用することができる。

他の実施形態では、免疫組織化学的検査を使用して、上記の遺伝子によって発現されるタンパク質を検出する。さらに他の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲを免疫組織化学的な技法またはフローサイトメトリー技法と併せて使用して、細胞型を有効かつ正確に特徴付け、同定し、目的の細胞型におけるそのようなマーカーの量および相対的割合の両方を決定することができる。一実施形態では、Ｑ−ＰＣＲにより、細胞が混在する集団を含有する細胞培養物におけるＲＮＡ発現のレベルを数量化することができる。しかし、Ｑ−ＰＣＲでは、目的のマーカーまたはタンパク質が同じ細胞で同時発現されるかどうかをもたらすまたは認定することはできない。別の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲをフローサイトメトリー法と併せて使用して細胞型を特徴付け、同定する。したがって、本明細書に記載の方法と、例えば上記のものなどを組み合わせて使用することによって、内胚葉系列型細胞を含めた種々の細胞型の完全な特徴付けおよび同定を実現および実証することができる。

例えば、好ましい一実施形態では、膵臓前駆体または膵臓内胚葉またはＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉は、Ｑ−ＰＣＲおよび／またはＩＣＣによって実証される通り少なくともＰＤＸ１、Ｎｋｘ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡおよび／またはｃＭＹＣを発現するが、そのような細胞は、ＰＤＸ１陽性発現細胞と同定されるためには、ＩＣＣによって実証される通り少なくともＰＤＸ１およびＮｋｘ６．１を同時発現し、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、またはＣＥＲを含めた他のマーカーを発現しない。同様に、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで成熟ホルモン分泌膵臓細胞を適切に同定するために、例えばインスリン分泌細胞において、Ｃ−ペプチド（成熟かつ機能性のβ細胞におけるプロインスリンの適切なプロセシングの産物）およびインスリンが同時発現されることがＩＣＣによって実証される。

さらに、当技術分野で公知の他の方法も、マーカー遺伝子発現を定量化するために使用することができる。例えば、マーカー遺伝子産物の発現は、目的のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を使用することによって検出することができる（例えば、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー分析など）。ある特定のプロセスでは、ｈＥＳ由来細胞に特有のマーカー遺伝子の発現ならびにｈＥＳ由来細胞に特有のマーカー遺伝子の有意な発現の欠如。ｈＥＳ由来細胞型を特徴付け、同定するためのさらに別の方法は、上に示されている関連出願に記載されている。

ｉｎｖｉｖｏにおけるＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉（ステージ１〜４）の生成およびインスリン生成の要約
ある特定の内胚葉系列細胞および膵臓内胚葉系列細胞を生成するための方法は本明細書において提供され、米国特許第７，５３４，６０８号；同第７，６９５，９６５号；および同第７，９９３，９２０号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＳ；および米国特許第８，１２９，１８２号、表題ＥＮＤＯＣＲＩＮＥＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲ／ＰＲＥＣＵＲＳＯＲＣＥＬＬＳ、ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥ−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＣＥＬＬＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮなどの関連出願の他の箇所で考察されている。表１７および図４２、図４３および図４４も参照されたい。

簡単に述べると、多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞に関する本発明の定方向分化法は、所望の最終ステージの細胞培養物（ＰＥＣ細胞または内分泌細胞）に応じて少なくとも４つまたは５つまたは６つまたは７つのステージで説明することができる。ステージ１は、多能性幹細胞からの胚体内胚葉の生成であり、約２〜５日、好ましくは２日または３日かかる。多能性幹細胞を、ＲＰＭＩ、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバー成長因子、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−１１など（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＷｎｔファミリーメンバーまたはＷｎｔ経路活性化因子、例えばＷｎｔ３ａなど（２５ｎｇ／ｍＬ）、あるいは、成長、および／または生存および／または増殖、および／または細胞間接着を増強するためにｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤、例えばＹ−２７６３２など（１０μＭ）を含む培地に懸濁させる。約２４時間後に、培地を、ＲＰＭＩを含み、血清、例えば０．２％ＦＢＳなど、およびＴＧＦβスーパーファミリーメンバー成長因子、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−１１など（１００ｎｇ／ｍＬ）、あるいはｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤を伴う培地と交換し、さらに２４時間（１日目）〜４８時間（２日目）置く。あるいは、アクチビン／Ｗｎｔ３ａを含む培地中に約２４時間置いた後、その後の２４時間、アクチビンを単独で含む培地（すなわち、培地はＷｎｔ３ａを含まない）で細胞を培養する。重要なことに、胚体内胚葉の生成には、低血清含有量、およびそれにより、低インスリンまたはインスリン様成長因子含有量の細胞培養条件が必要である。ＭｃＬｅａｎら（２００７）ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２５：２９−３８を参照されたい。ＭｃＬｅａｎらにより、ステージ１においてｈＥＳ細胞をわずか０．２μｇ／ｍＬの濃度のインスリンと接触させることは、胚体内胚葉の生成にとって有害であり得ることも示された。また別の当業者により、多能性細胞から胚体内胚葉へのステージ１分化が実質的に本明細書およびＤ’Ａｍｏｕｒら（２００５）に記載の通り改変された。例えば、少なくとも、Ａｇａｒｗａｌら、ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｆｒｏｍＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ（２００８）２６：１１１７−１１２７；Ｂｏｒｏｗｉａｋら、ＳｍａｌｌＭｏｌｅｃｕｌｅｓＥｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙＤｉｒｅｃｔＥｎｄｏｄｅｒｍａｌＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＭｏｕｓｅおよびＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ、（２００９）ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ４：３４８−３５８；およびＢｒｕｎｎｅｒら、ＤｉｓｔｉｎｃｔＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｈｕｍａｎｆｅｔａｌｌｉｖｅｒ、（２００９）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．１９：１０４４−１０５６。他の内胚葉系列細胞を導出するためには胚体内胚葉の適切な分化、特定化、特徴付けおよび同定が必要である。このステージにおける胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７およびＨＮＦ３β（ＦＯＸＡ２）を同時発現し、少なくともＨＮＦ４アルファ、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＳＯＸ６、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ３、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＳＣ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、またはＰＰは評価できるほどには発現しない。胚体内胚葉においてＦＴＮＦ４アルファ発現が存在しないことは、少なくともＤｕｎｃａｎら（１９９４）、「ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＦＴＮＦ−４ｉｎｔｈｅｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃｅｎｄｏｄｅｒｍ，ｇｕｔ，ａｎｄｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃｔｉｓｓｕｅｏｆｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏ：ＦＴＮＦ−４ｉｓａｍａｒｋｅｒｆｏｒｐｒｉｍａｒｙｅｎｄｏｄｅｒｍｉｎｔｈｅｉｍｐｌａｎｔｉｎｇｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９１：７５９８−７６０２およびＳｉ−Ｔａｙｅｂら（２０１０）、「ＨｉｇｈｌｙＥｆｆｉｃｉｅｎｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ＬｉｋｅｃｅｌｌｓｆｒｏｍＩｎｄｕｃｅｄＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓ」、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ５１：２９７−３０５において裏付けられ、詳しく記載されている。

ステージ２では、ステージ１から胚体内胚葉細胞培養物を取得し、懸濁培養物を、ＩＴＳの１：１０００希釈物中０．２％ＦＢＳなどの低血清レベル、２５ｎｇのＫＧＦ（またはＦＧＦ７）、あるいはＲＯＣＫ阻害剤を伴うＲＰＭＩと一緒に２４時間（２日目〜３日目）インキュベートすることによって前腸内胚葉またはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉を生成する。２４時間後に（３日目〜４日目）、培地を、ＴＧＦβ阻害剤を含まないが、その代わりに、細胞の成長、生存および増殖を増強するためにＲＯＣＫ阻害剤をなお含む同じ培地と交換し、さらに２４時間（４日目〜５日目）〜４８時間（６日目）置く。前腸内胚葉を適切に特定化するための重要なステップはＴＧＦβファミリー成長因子の除去である。したがって、２．５μＭのＴＧＦβ阻害剤番号４またはＴＧＦβＩ型受容体であるアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）の特異的な阻害剤である５μＭのＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβ阻害剤をステージ２細胞培養物に添加することができる。ステージ２で生成した前腸内胚葉またはＰＤＸ１−陰性前腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１βおよびＨＮＦ４アルファを同時発現し、胚体内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞または内分泌前駆体／先駆体ならびに一般には、複数ホルモン型細胞の特質である、少なくともＳＯＸ１７およびＨＮＦ３β（ＦＯＸＡ２）も、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＳＯＸ６、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ３、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＳＣ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、またはＰＰも評価できるほどには同時発現しない。

ＰＥＣ生成のステージ３（５〜８日目）では、ステージ２から前腸内胚葉細胞培養物を取得し、１％Ｂ２７、０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミン、０．２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイドまたは３ｎＭのＴＴＮＰＢ（もしくはＫＡＡＤシクロパミンとＴＴＮＰＢの組合せであるＣＴＴ３）などのレチノイン酸類似体、および５０ｎｇ／ｍＬのノギン中ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩにより、約２４時間（７日目）〜４８時間（８日目）にわたってＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を生成する。具体的には、出願人らは、およそ２００３年からＤＭＥＭ−高グルコースを使用しており、その時点の全ての特許および非特許開示物では、「ＤＭＥＭ−高グルコース」などの言及がなくてもＤＭＥＭ−高グルコースが使用されている。これは、一部において、Ｇｉｂｃｏなどの製造者がそれらのＤＭＥＭをそのように名付けておらず、例えばＤＭＥＭ（Ｃａｔ番号１１９６０）およびＫｎｏｃｋｏｕｔＤＭＥＭ（Ｃａｔ番号１０８２９）などであることが理由である。本出願の出願日時点で、ＧｉｂｃｏはさらなるＤＭＥＭ製品を提供しているが、従来通り、例えばＫｎｏｃｋｏｕｔＤＭＥＭ（Ｃａｔ番号１０８２９−０１８）など、それらの高グルコースを含有するある特定のＤＭＥＭ産物に「高グルコース」と付けていないことに注目すべきである。したがって、ＤＭＥＭが記載されているそれぞれの場合に、高グルコースを伴うＤＭＥＭを意味すると推定することができ、これは、この分野における研究開発を行っている他者には明らかなことであった。外因性高グルコースの使用を記載しているさらなる詳細は実施例２１に記載されている。さらに、ＲＯＣＫ阻害剤またはｒｈｏキナーゼ阻害剤、例えばＹ−２７６３２などを使用して、成長、生存、増殖を増強することおよび細胞間接着を促進することができる。ステージ３で生成したＰＤＸ１陽性前腸細胞は、ＰＤＸ１およびＨＮＦ６、ならびにＳＯＸ９およびＰＲＯＸを同時発現し、上のステージ１およびステージ２に記載されている胚体内胚葉細胞もしくは前腸内胚葉（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）細胞またはＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を示すマーカーは評価できるほどには同時発現しない。

上記のステージ３の方法は、ＰＥＣを生成するための４つのステージのうちの１つである。下の実施例９〜２４に詳細に記載されている通り、内分泌前駆体／先駆体および内分泌細胞を生成するために、ノギン、ＫＡＡＤ−シクロパミンおよびレチノイドに加えて、アクチビン、Ｗｎｔおよびヘレグリンを単独でおよび／または組み合わせて使用して、ＮＧＮ３発現を抑制する一方で良好な細胞凝集塊を維持する。実施例８、実施例９および実施例１０を参照されたい。

ステージ４（８〜１４日目）ＰＥＣ生成では、ステージ３から培地を取得し、それを、１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＢ２７サプリメント、それに加えて５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦおよび５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、および時にはさらに５０ｎｇ／ｍＬのノギンおよびＲＯＣＫ阻害剤中ＤＭＥＭを含有し、さらにアクチビンを単独でまたはヘレグリンと組み合わせて含む培地と交換する。これらの新しい方法では、少なくともＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１ならびにＰＴＦ１Ａを同時発現する膵臓前駆細胞が生じる。これらの細胞は、上のステージ１、ステージ２およびステージ３に記載の胚体内胚葉または前腸内胚葉（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）細胞を示すマーカーは評価できるほどには発現しない。図４４を参照されたい。

あるいは、ステージ４からの細胞を、ステージ５において、ＤＭＥＭを含有し、１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＢ２７サプリメントを伴う培地で約１〜６日間（好ましくは約２日間、すなわち、１３〜１５日目）にわたってさらに分化させて、内分泌前駆体／先駆体または前駆体型細胞ならびに／または単一ホルモン性膵臓内分泌型細胞および複数ホルモン性膵臓内分泌型細胞を生成することができる。ステージ５で生成した内分泌前駆体／先駆体は、少なくともＣＨＧＡ、ＮＧＮ３およびＮｋｘ２．２を同時発現し、ＰＥＣ生成について上のステージ１、ステージ２、ステージ３およびステージ４に記載の胚体内胚葉または前腸内胚葉（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）を示すマーカーは評価できるほどには発現しない。図４４を参照されたい。

ＰＥＣ生成のために、ステージ４で生成したＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉をマクロ封入デバイスにローディングし、完全に含有させ、患者に移植し、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞をｉｎｖｉｖｏで膵臓ホルモン分泌細胞、または膵島、例えばインスリン分泌性ベータ細胞に成熟させる（「ｉｎｖｉｖｏの機能」とも称される）。ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の封入およびｉｎｖｉｖｏにおけるインスリンの生成は、米国特許出願第１２／６１８，６５９号（‘６５９出願）、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＬＩＮＥＡＧＥＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＵＭＡＮＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＳ、２００９年１１月１３日出願に詳細に記載されている。‘６５９出願は、仮特許出願第６１／１１４，８５７号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＥＳＣＥＬＬＳ、２００８年１１月１４日出願；および米国特許仮出願第６１／１２１，０８４号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳ、２００８年１２月９日出願；現在は米国特許第８，２７８、１０６号および同第８，４２４，９２８号の優先権を主張するものである。本明細書に記載の方法、組成物およびデバイスは、現在、好ましい実施形態を表し、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。その変化および他の使用は本発明の主旨の範囲内に包含され、本開示の範囲によって定義されることが当業者には想起されよう。したがって、本明細書に開示されている発明に対して、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく様々な置換および改変を行うことができることが当業者には明らかになろう。

例えば、多能性細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞から胚体内胚葉を生成するために、成長因子またはシグナル伝達タンパク質のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーであるアクチビンＡが使用されるが、他のＴＧＦβスーパーファミリーメンバー、例えばＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１を、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５６８６号、表題ＧＲＯＷＴＨＦＡＣＴＯＲＳＦＯＲＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮＯＦＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００８年６月３日出願に記載されているものなどの胚体内胚葉を生成するために使用することができる。

異なる状況においてでも、アクチビン単独により、またはＷｎｔおよびヘレグリンと組み合わせて、高レベルおよび低レベルで、ＮＧＮ３の発現を抑制および阻害することができる；低レベルで、単独で、またはヘレグリンと組み合わせて、あるいは高レベルでＷＮＴおよびヘレグリンと組み合わせて、細胞塊、したがって収量を維持することができる。実施例８、実施例９および実施例１０を参照されたい。

ＰＥＣ生成のために、ステージ２のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞をステージ３のＰＤＸ１陽性前腸細胞に分化させるためにレチノイン酸（ＲＡ）を使用する。しかし、４−［（Ｅ）−２−（５、６、７、８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸（またはＴＴＮＰＢ）などの他のレチノイドまたはレチノイン酸類似体および同様の類似体（例えば、４−ＨＢＴＴＮＰＢ）を使用することができる。内分泌細胞および内分泌前駆／先駆細胞生成のために、レチノイン酸またはその類似体のいずれかをステージ６および／またはステージ７の間に添加してホルモン遺伝子発現を誘導することもできる。実施例１３および実施例１６を参照されたい。

ノギンは、例えば、骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）などのＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達タンパク質のメンバーを不活化するタンパク質である。しかし、コーディンおよびねじれ原腸形成（ＴｗｉｓｔｅｄＧａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）（Ｔｓｇ）などの他のＢＭＰ４阻害剤または抗ＢＭＰ中和抗体によっても、ＢＭＰとその細胞表面受容体の結合を妨げ、それにより、ＢＭＰシグナル伝達を有効に阻害することができる。あるいは、ヒトノギンの遺伝子はクローニングされ、配列決定されている。米国特許第６，０７５，００７号を参照されたい。ノギン配列の解析により、Ｋｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤との相同性を有するカルボキシ末端領域が示され、これにより、潜在的に他のＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤がＢＭＰの阻害に関して同様の効果を有し得ることが示されている。実施例１５では、非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団の生成を増加させるためのノギンの使用が記載されている。

最後に、本明細書および‘６５９出願；米国意匠登録出願第２９／４４７，９４４号；同第２９／４０８，３６６号；同第２９／４０８，３６８号；同第２９／４２３，３６５号；および同第６１／７７４，４４３号、表題ＳＥＭＩＰＥＲＭＥＡＢＬＥＭＡＣＲＯＩＭＰＬＡＮＴＡＢＬＥＣＥＬＬＵＬＡＲＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＤＥＶＩＣＥＳ、２０１３年３月７日出願に記載されているマクロ封入デバイスは、再度、単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。特に、デバイスのサイズ、デバイス内のチャンバーまたは亜区画が複数であること、またはポートが複数であること、さらにはデバイスのローディングおよび抽出の機構などのデバイス設計の変化は全て本発明の主旨の範囲内に包含される。したがって、本明細書に記載の分化方法への種々の置換および改変だけでなく、封入デバイスへの種々の置換および改変も同様に、本明細書に開示されている発明に対して、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく行うことができることが当業者には明らかになろう。実施例１０、実施利１２および実施例１８を参照されたい。

多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるためのプロセスの一部に関して、上記の成長因子が細胞にもたらされ、したがって、成長因子が培養物中に、多能性細胞の少なくとも一部分から胚体内胚葉細胞および膵臓の系列細胞への分化を促進するために十分な濃度で存在する。いくつかのプロセスでは、上記の成長因子は、細胞培養物中に少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍＬまたは約５０００ｎｇ／ｍＬ超の濃度で存在する。さらに他の作用物質または成長因子は、細胞培養物中に少なくとも０．１ｍＭまたは１０ｍＭまたはそれ以上の濃度で存在する。

ある特定のプロセスでは、多能性幹細胞分化作用物質および／または成長因子を、添加後に細胞培養物から除去する。例えば、成長因子を添加してから約１日以内、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日以内または約１０日以内にそれらを除去することができる。好ましいプロセスでは、成長因子を添加した約４日後にそれらを除去する。作用物質および／もしくは成長因子の除去は、作用物質および／もしくは成長因子の不在化で培地を変えること、またはその作用物質および／もしくは成長因子の機能を阻害する別の作用物質を使用することによって実現することができる。

好ましい一実施形態では、ステージ３細胞培養物は、これだけに限定されないが、内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）を阻止、抑制、阻害などすることができる作用物質などを含む。そのような作用物質は、アクチビン、ヘレグリンおよびＷＮＴおよびこれら３つの組合せも、分化を促進し、かつ／または非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を示すマーカーの発現を誘導し、かつ内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）のマーカーの発現を阻止するもしくは最小限にするために有効な量で含む。内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）を示すマーカーとしては、これだけに限定されないが、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２およびその他が挙げられる。

別の好ましい実施形態では、ステージ４細胞培養物は、これだけに限定されないが、内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）を阻止、抑制、阻害などすることができる作用物質を含む。そのような作用物質は、アクチビンおよびヘレグリンおよびこれら２つの組合せも、分化を促進し、かつ／または非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を示すマーカーの発現を誘導し、かつ内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）のマーカーの発現を阻止するもしくは最小限にするために有効な量で含む。内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）を示すマーカーとしては、これだけに限定されないが、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２およびその他が挙げられる。少なくともＮＧＮ３をステージ３およびステージ４の間抑制する手段は、下の実施例８〜２１に詳しく記載されている。

一実施形態では、ステージ４細胞培養物を、ステージ５において、少なくともノギン、ＫＧＦ、ＥＧＦ、およびＮｏｔｃｈシグナル伝達または経路阻害剤を用いてさらに分化させる。内分泌分化を示すマーカーとしては、これだけに限定されないが、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２およびその他が挙げられる。好ましい実施形態では、ｉｎｖｉｖｏ発生試験において観察されるものをｉｎｖｉｔｒｏでシミュレートするまたは有効に模倣する作用物質をステージ１〜７において使用する。例えば、本発明および表１７によるステージ３およびステージ４では、内分泌分化を遅延させることができる作用物質、阻止することができる作用物質、抑制することができる作用物質および／もしくは阻害ことができる作用物質、または、これだけに限定されないが、ＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２を含めた、内分泌分化を示すマーカーを遅延させることができる作用物質、阻止することができる作用物質、抑制することができる作用物質および／もしくは阻害ことができる作用物質を使用する。ステージ５、ステージ６、および／またはステージ７の間に、細胞培養物を、内分泌分化を誘導することができる作用物質、増加させることができる作用物質および／または促進することができる作用物質を用いて、例えば、ガンマセレクターゼ阻害剤などのＮｏｔｃｈ経路阻害剤を使用することによって処理する。要するに、ステージ３およびステージ４の細胞培養条件により、内分泌表現型が抑制されるが、ステージ５、ステージ６、および／またはステージ７からの細胞培養条件により、これだけに限定されないが、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、グレリン（ＧＨＲＬ）、溶質輸送体ファミリー３０メンバー８（ＳＬＣ３０Ａ８）、グルコース−６−ホスファターゼ２（Ｇ６ＰＣ２）、プロホルモン転換酵素１（ＰＣＳＫ１）およびグルコースキナーゼ（ＧＣＫ）を含めた内分泌表現型が次第に誘導される。

一実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を、単独で、またはレチノイン酸などのレチノイドと組み合わせて使用されるＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤、例えばＲ０４９２９０９７などのガンマセレクターゼ阻害剤の存在下でインキュベートし続けることによってＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を内分泌細胞および内分泌前駆／先駆細胞に分化させる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤が存在することにより、ステージ５の間にＮＧＮ３の発現が誘導される。他の実施形態では、分化プロセスの開始時、例えば、多能性ステージにおいてガンマセレクターゼ阻害剤がもたらされ、これは膵島ホルモン発現細胞への分化全体を通して細胞培養物中に残留する。さらに他の実施形態では、分化が開始された後であるが、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉のステージに分化する前にガンマセレクターゼ阻害剤を添加する。好ましい実施形態では、細胞培養物または細胞集団に、胚体内胚葉からＰＤＸ１陽性内胚葉への変換を促進する分化因子をもたらすのとほぼ同じ時間にガンマセレクターゼ阻害剤をもたらす。他の好ましい実施形態では、細胞培養物または細胞集団に、細胞培養物または細胞集団中の細胞の実質的な部分がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化した後にガンマセレクターゼ阻害剤をもたらす。

別の実施形態では、ステージ５からの細胞培養物をステージ６およびステージ７においてさらに分化させる。これらのステージの間に、より発生的に進歩し、かつ／または成熟した内分泌細胞にｉｎｖｉｖｏで分化させるための内分泌前駆体／先駆体または前駆細胞を適正に特定化することができる作用物質を使用する。そのような作用物質としては、これだけに限定されないが、レチノイドまたはレチノイン酸、ＢＭＰ、ニコチンアミド、ＩＧＦ、ヘッジホッグタンパク質などが挙げられる。好ましい実施形態では、ＴＴＮＰＢ（４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸またはアロチノイド酸）が、核転写因子であるレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）α、β、およびγに対する親和性を有する選択的かつ非常に強力なレチノイン酸類似体である。ＴＴＮＰＢおよび他のレチノイン酸もしくはレチノイン酸類似体により、レチノイン酸応答性エレメントを有する遺伝子のリガンドにより活性化される転写が生じる。したがって、レチノイン酸応答性エレメントを活性化することができるまたはＲＡＲのいずれかに結合することができる他の作用物質またはリガンドは、内分泌細胞分化を促進するために、本発明に対して潜在的に有用であり、修正可能である。

別の実施形態では、ステージ５またはステージ６またはステージ７からの細胞培養物を、細胞接着を改善するために、マトリゲルを単独で、またはｒｈｏキナーゼ阻害剤と組み合わせて用いてさらに処理することができる。あるいは、ステージ５、ステージ６、またはステージ７のいずれかのステージで、ｒｈｏキナーゼ阻害剤を、細胞生存、細胞塊および収量を促進するために十分な濃度で添加することができる。あるいは、ステージ６およびステージ７の間、またはステージ６とステージ７のとの間に細胞培養物を引き離し、再会合させて、これだけに限定されないが、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）を含めた、望ましくない細胞型を除去するまたは枯渇させることができる。実施例１４を参照されたい。

さらに別の実施形態では、ステージ１〜７のいずれかは、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日またはそれ以上延長することもでき、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日またはそれ以上短縮することもできる。例えば、好ましい一実施形態および表１７によると、ステージ６は約６日間にわたって起こり、ステージ７は約９日間にわたって起こる。しかし、これらのステージはどちらも、内分泌前駆体／先駆体の生成を適応させるために短縮することができ、例えば、より発生的に進歩した内分泌細胞を生成するために２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日またはそれ以上長くし、延長することができる。

別の実施形態では、より発生的に進歩したＰＥＣまたは膵臓内分泌前駆体／先駆体または膵臓内分泌細胞を生成するための方法が提供される。本発明の一態様では、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に関して同時陽性である単一膵臓ホルモン発現内分泌細胞、例えば、ＩＮＳ、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を同時発現している未成熟ベータ細胞が提供される。別の態様では、発生的に進歩した細胞は、少なくともＰＤＸおよびＮＫＸ６．１を発現する非内分泌膵臓前駆細胞から主になるが、少なくともＣＨＧＡ＋、ＮＧＮ３および／またはＮＫＸ２．２を発現する内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）からはならないまたはそれから最低限なるＰＥＣ培養物であってよい。これらのＰＥＣ培養物は、膵臓分化の発生試験においてｉｎｖｉｖｏで見られるものにより類似していると考えられるので、発生的に進歩している。Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら（２００７）、ＡｎＩｌｌｕｓｔｒａｔｅｄＲｅｖｉｅｗｏｆＥａｒｌｙＰａｎｃｒｅａｓＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｔｈｅＭｏｕｓｅ、ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖｉｅｗｓ２８（６）：６８５−７０５およびＲｕｋｓｔａｌｉｓおよびＨａｂｅｎｅｒ（２００９）、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３：Ａｍａｓｔｅｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、Ｉｓｌｅｔｓ１（３）：１７７−１８４を参照されたい。発生的に進歩した細胞または細胞培養物の別の例は、引き離し、再凝集または再会合させ、したがって、より均一な細胞の集団からなる再凝集した細胞培養物である。このより均一な細胞の集団は、本発明の一態様では、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に関して同時陽性であるが、ステージ３およびステージ４からの細胞もしくは亜集団、または、これだけに限定されないが、非内分泌性多分化能膵臓前駆体（ＣＨＧＡ−）細胞、もしくは残留／三重陰性細胞（ＣＨＧＡ−／ＰＤＸ１−／ＮＫＸ６．１−）など、もしくは多ホルモン（ｍｕｌｔｉ−ｈｏｒｍｏｎｅ）発現細胞（すなわち、いずれの１つの細胞型においても２種以上のホルモンを発現している細胞）を含めたＰＥＣもしくはＰＥＣ亜集団を含まない単一のホルモン発現細胞で主に構成される、より早いステージの細胞型、例えば、膵臓内分泌前駆体／先駆体または内分泌細胞を含まない。

別の実施形態では、本発明で提供される細胞培養物は、適正に特定化されることが好ましく、これは発生生物学の分野において特異的かつある特定の意味を有する。発生生物学に関しては、それは細胞が別個の運命を得るまたは特定化または適正に特定化される機構である。ｉｎｖｉｔｒｏにおける細胞培養物の分化ではｉｎｖｉｖｏ発生試験に典型的な時間的な組織化およびきっかけが欠けるので、細胞マーカー（転写因子などの表面マーカーまたは内部マーカー）、特に、特定の細胞型を示すシグネチャーまたは顕著な細胞マーカーの使用および信頼性が必須である。したがって、適正に特定化された細胞、細胞培養、亜集団および集団への言及は、それらの細胞が別個の運命を有し、それらの運命がそれらのマーカーの発現、それらが発現するマーカーのプロファイル、および、重要であれば、それらが発現しないマーカーに基づいてより確実になり、決定されることを意味する。ｉｎｖｉｔｒｏにおける細胞培養物の適切な特定化は同様の細胞のｉｎｖｉｖｏ発生試験に依存し、したがって、好ましい一実施形態では、ｉｎｖｉｖｏ発生試験はｉｎｖｉｔｒｏ分化および適正に特定化された細胞の特徴付けに対する指針である。

本明細書に記載の本発明の一部の実施形態では、分化する細胞培養物または細胞集団に、ガンマセレクターゼ阻害剤とほぼ同じ時間にエキセンディン４をもたらす。ある特定の実施形態では、エキセンディン４を、細胞培養物または細胞集団中に少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬから、１０００ｎｇ／ｍＬまでの濃度で存在するようにもたらす。

ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、内分泌前駆／先駆細胞において分化の状態に応じて様々な異なるレベルにわたって誘導されることが理解されよう。そのように、本明細書に記載の一部の実施形態では、内分泌前駆／先駆細胞または細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌前駆／先駆細胞または細胞集団、例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未成熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞および／または外胚葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現の少なくとも約２倍〜少なくとも約１０，０００倍である。他の実施形態では、内分泌前駆／先駆細胞または細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌前駆／先駆細胞または細胞集団、例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未成熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞および／または外胚葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現の少なくとも約４倍、少なくとも約６倍〜１０，０００倍である。一部の実施形態では、内分泌前駆／先駆細胞または細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌前駆／先駆細胞または細胞集団、例えば、多能性細胞様ｉＰＳ細胞およびｈＥＳ細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未成熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞および／または外胚葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現よりもはるかに高い。

本発明の別の実施形態は、ヒト内分泌前駆／先駆細胞を含めたヒト細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％においてＮＧＮ３マーカーの発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい組成物に関する。他の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％〜９８％においてＮＧＮ３マーカーの発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団中の、ＮＧＮ３の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きいヒト細胞の百分率は、フィーダー細胞を考慮せずに算出する。

本発明の一部の実施形態は、ヒト内分泌前駆／先駆細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％から少なくとも約９８％超までにおいてＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい組成物に関することが理解されよう。一部の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％〜ヒト細胞の９８％においてＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団中の、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きいヒト細胞の百分率は、フィーダー細胞を考慮せずに算出する。

本明細書に記載のプロセスを使用して、他の細胞型を実質的に含まない、内分泌前駆／先駆細胞を含む組成物を生成することができる。本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する内分泌前駆／先駆細胞集団または細胞培養物は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーを有意に発現する細胞を実質的に含まない。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する細胞培養物の内分泌前駆／先駆細胞集団は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーを有意に発現する細胞を実質的に含まない。

本明細書に開示されている未成熟膵島ホルモン発現細胞を生成するための、さらに他のプロセスでは、ＨＧＦを細胞にもたらし、したがって、細胞培養物または細胞集団中に、内分泌前駆／先駆細胞の少なくとも一部分から未成熟膵島ホルモン発現細胞への分化を促進するために十分な濃度で存在するようにする。一部の実施形態では、ＨＧＦは、細胞培養物または細胞集団中に、少なくとも約１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。

本明細書に開示されている未成熟膵島ホルモン発現細胞を生成するためのさらに他のプロセスでは、ＩＧＦ１を細胞にもたらし、したがって、細胞培養物または細胞集団中に、内分泌前駆／先駆細胞の少なくとも一部分から未成熟膵島ホルモン発現細胞への分化を促進するために十分な濃度で存在するようにする。一部の実施形態では、ＩＧＦ１は、細胞培養物または細胞集団中に少なくとも約１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。

本明細書に記載の未成熟膵島ホルモン発現細胞を生成するためのプロセスのある特定の実施形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種または複数種を、前にもたらした１種または複数種の分化因子を細胞培養物から除去した後にもたらす。他の実施形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種または複数種を、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種または複数種よりも前にもたらされた、またはほぼ同時にもたらされた１種または複数種の分化因子を含む細胞培養物または細胞集団にもたらす。好ましい実施形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種または複数種よりも前にもたらされる、またはほぼ同時にもたらされる分化因子としては、これだけに限定されないが、ＤＡＰＴ、ＦＧＦ−１０、ＫＡＡＤ−シクロパミン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４および／またはＲＡが挙げられる。

本発明の別の実施形態は、ヒト未成熟膵島ホルモン発現細胞を含めたヒト細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％においてＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ、および／またはＣ−ペプチドマーカーの発現がＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーの発現よりも大きい組成物に関する。他の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％において、ヒト細胞の少なくとも約１０％〜ヒト細胞の９５％においてまたはヒト細胞の少なくとも約９８％においてＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ、および／またはＣ−ペプチドマーカーの発現がＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーの発現よりも大きい。

本発明のある特定の実施形態では、未成熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞培養物および／または細胞集団は、グレリン、インスリン、ソマトスタチンおよび／またはグルカゴンから選択される、１種または複数種の分泌されたホルモンを含む培地も含む。他の実施形態では、培地は、Ｃ−ペプチドを含む。好ましい実施形態では、培地中の１種または複数種の分泌されたホルモンまたはＣ−ペプチドの濃度は、細胞内ＤＮＡ１μｇ当たり少なくとも約１ｐｍｏｌのグレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンまたはＣ−ペプチドから、細胞内ＤＮＡ１μｇ当たり少なくとも約１０００ピコモル（ｐｍｏｌ）のグレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンまたはＣ−ペプチドまでにわたる。

インスリンをｉｎｖｉｖｏで生成させる方法
一部の実施形態では、上記のｉｎｖｉｔｒｏで導出された膵臓前駆細胞またはＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉型細胞またはその等価物を哺乳動物対象に移植する。これらの方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１５５３６号、表題「ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＳ」、およびＫｒｏｏｎら（２００８）上記に詳しく記載されている。好ましい実施形態では、哺乳動物対象はヒト対象である。特に好ましい対象は、生理的に高い血中グルコース濃度に応答して十分なレベルのインスリンを生成する対象の能力が限定される状態を有すると同定された対象である。任意の特定の哺乳動物種についての生理的に高い血中グルコースレベルを構成する血中グルコースレベルの範囲は、当業者には容易に決定することができる。認識される疾患または状態をもたらすいかなる持続的な血中グルコースレベルも、生理的に高い血中グルコースレベルとみなされる。

本発明のさらなる実施形態は、ｉｎｖｉｔｒｏ多能性幹細胞またはその後代、例えば、ＰＤＸ−１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉もしくは膵臓前駆細胞、ＮＧＮ３陽性内分泌前駆体／先駆体などの内分泌前駆体／先駆体などの多分化能細胞、またはインスリン分泌細胞、グルカゴン分泌細胞、ソマトスタチン分泌細胞、グレリン分泌細胞、もしくは膵臓ポリペプチド分泌細胞などの機能的な分化したホルモン分泌細胞から導出されるｉｎｖｉｖｏインスリン分泌細胞に関する。上記の最終分化した細胞または多分化能細胞のいずれも、宿主、または哺乳動物に移植し、宿主血中グルコースレベルに応答してインスリンを分泌する細胞などの生理的に機能的なホルモン分泌細胞に成熟させることができる。好ましい実施形態では、細胞はｉｎｖｉｖｏで奇形腫を形成せず、そのように形成された場合には、移植の領域に局在したままであり、容易に切除または除去することができる。特に好ましい実施形態では、細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏにおける分化プロセスの間、または哺乳動物にｉｎｖｉｖｏで移植された際、またはｉｎｖｉｖｏで機能的な島に成熟および発達する際に、いかなる核型異常も含有しない。

さらに、本明細書に記載の実施形態は、工学的に操作されたまたは遺伝子組換えされた、多能性細胞、ヒトｉＰＳ細胞などの多能性細胞から本明細書において提供される説明に基づいて導出された多分化能細胞または分化した細胞に関するが、ｉＰＳ細胞では、ｈＥＳ細胞およびｈＥＳ由来細胞と同様の生理機能および遺伝子マーカーの発現プロファイルが実証されるので、ｉＰＳ細胞はｉｎｖｉｖｏにおける同様の生理的特性を有することが予測される。

膵臓前駆体を封入する方法
一部の実施形態では、本明細書に記載の多能性細胞、多分化能細胞および分化した細胞組成物を生物学的および／または非生物学的機械デバイスに封入することができ、封入されたデバイスにより、細胞組成物が宿主から分離および／または隔離される。

封入の方法は、米国特許出願６１／１１４，８５７、２００８年１１月１４日出願、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＥＳＣＥＬＬＳ、および米国特許出願第６１／１２１，０８６号、２００８年１２月１２日出願、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳに詳しく記載されている。

一実施形態では、封入デバイスは、多能性由来細胞、例えば、ＰＤＸ−１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉もしくは前駆細胞、ＮＧＮ３陽性内分泌前駆体／先駆体などの内分泌もしくは内分泌前駆体／先駆体、または、インスリン分泌細胞、グルカゴン分泌細胞、ソマトスタチン分泌細胞、グレリン分泌細胞、もしくは膵臓ポリペプチド分泌細胞などの機能的な分化したホルモン分泌細胞を、移植された細胞集団が通過するのを防ぎ、それらをデバイス内に保持すると同時に、ある特定の分泌されたポリペプチド、例えばインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、膵臓ポリペプチドなどの通過を可能にする半透膜の中に含有する。あるいは、デバイスは血管化膜を含めた複数の膜を有する。

ヒト多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を増強および促進するための作用物質の使用
膜を渡る細胞外シグナルの伝達により細胞調節に影響を及ぼし、今度はそれにより、細胞内の生化学的な経路をモジュレートすることができる。タンパク質のリン酸化は、細胞内シグナルが分子から分子へ伝搬され、最終的に細胞の応答がもたらされる１つの経過を表すものである。これらのシグナルトランスダクションカスケードは、高度に調節されており、多くの場合、多くのプロテインキナーゼならびにホスファターゼが存在することによって証明されるように、重複している。ヒトにおいて、タンパク質チロシンキナーゼは、糖尿病、がんを含めた多くの病態の発生において重要な役割を有することが分かっていることが報告されており、また、多種多様な先天性の症候群に関連付けられている。セリントレオニンキナーゼ、例えばＲｈｏキナーゼは、阻害した場合に、糖尿病、がん、および種々の炎症性心血管障害およびＡＩＤＳを含めたヒト疾患の治療と関連し得る酵素のクラスである。現在までに同定されている大多数の阻害剤は、ＡＴＰ結合部位で作用する。そのようなＡＴＰ競合阻害剤は、ＡＴＰ結合部位のあまり保存されていない領域を標的とするそれらの能力による選択性が実証されている。

低分子ＧＴＰ結合性タンパク質のＲｈｏキナーゼファミリーは、ＲｈｏＡ〜ＥおよびＲｈｏＧ、Ｒａｃ１およびＲａｃ２、Ｃｄｃ４２、およびＴＣ１０を含む少なくとも１０種のメンバーを含有する。阻害剤は、多くの場合、ＲＯＫ阻害剤もしくはＲＯＣＫ阻害剤またはＲｈｏキナーゼ阻害剤と称され、これらは、本明細書では互換的に使用される。ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣのエフェクタードメインは同じアミノ酸配列を有し、同様の細胞内標的を有すると思われる。ＲｈｏキナーゼはＲｈｏの最初の下流メディエーターとして作動し、２つのアイソフォーム：α（ＲＯＣＫ２）およびβ（ＲＯＣＫ１）として存在する。Ｒｈｏキナーゼファミリータンパク質は、それらのＮ末端ドメイン内に触媒（キナーゼ）ドメインを有し、その中央部分にコイルドコイルドメインを有し、それらのＣ末端領域内に推定プレクストリン相同性（ＰＨ）ドメインを有する。ＲＯＣＫのＲｈｏ結合性ドメインはコイルドコイルドメインのＣ末端部分に局在し、ＧＴＰと結合した形態のＲｈｏとの結合により、キナーゼ活性の増強がもたらされる。Ｒｈｏ／Ｒｈｏキナーゼ媒介性経路は、アンジオテンシンＩＩ、セロトニン、トロンビン、エンドセリン−１、ノルエピネフリン、血小板由来成長因子、ＡＴＰ／ＡＤＰおよび細胞外ヌクレオチド、およびウロテンシンＩＩを含めた多くのアゴニストによって開始されるシグナルトランスダクションにおいて重要な役割を果たす。Ｒｈｏキナーゼは、その標的エフェクター／基質のモジュレーションを通じて、平滑筋収縮、アクチン細胞骨格組織化、細胞の接着および運動性ならびに遺伝子発現を含めた種々の細胞機能において重要な役割を果たす。動脈硬化症の発病と関連すると認知されているいくつもの細胞機能の媒介においてＲｈｏキナーゼタンパク質が果たす役割により、これらのキナーゼの阻害剤も種々の動脈硬化性心血管疾患を治療または予防するために有用であり得、また、内皮収縮に関与する。

一部の実施形態では、これだけに限定されないが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２、ファスジル（ＨＡ１０７７とも称される）、Ｈ−１１５２ＰおよびＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／セレン；Ｇｉｂｃｏ）、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１（米国特許第５，４７８，８３８号に記載されている）およびそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ｓｃＦＶ断片、ドミナントネガティブバリアントおよびその発現ベクターを含めた、細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を促進し、かつ／または支持する作用物質を種々の細胞培養培地条件に添加する。さらに、ＲＯＣＫ阻害剤として他の低分子化合物が公知であるので、そのような化合物またはその誘導体も本発明において使用することができる（例えば、米国特許出願第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号および同第２００３００８７９１９、ならびに国際特許公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号および同第２００４／０３９７９６号を参照されたい）。

本発明では、１種または２種またはそれ以上のＲＯＣＫ阻害剤の組合せも使用することができる。これらの作用物質は、一部において、解離したｈＥＳ細胞、ｉＰＳまたは分化した細胞培養物、例えば、胚体内胚葉、前腸内胚葉、膵臓内胚葉、膵臓上皮、膵臓前駆体集団、内分泌前駆体および集団などの再会合を促進することによって機能する。同様に、作用物質は、細胞解離が行われない場合にも機能し得る。ヒト多能性幹細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着の増大は、細胞が懸濁液中の細胞凝集体から生成したものであるか、または接着プレート培養物（細胞外マトリックスの構成成分を伴ってまたは伴わずに、血清を伴ってまたは伴わずに、線維芽細胞フィーダーを伴ってまたは伴わずに、ＦＧＦを伴ってまたは伴わずに、アクチビンを伴ってまたは伴わずに）から生成したものであるかとは独立して実現された。これらの細胞集団の生存の増加により、細胞選別機を使用する精製系が容易になり、改善され、したがって、細胞の回収の改善が可能になる。Ｙ２７６３２などのＲｈｏキナーゼ阻害剤の使用により、解離した単一細胞の段階的な継代の間、または低温保存からのそれらの生存が促進されることにより、分化した細胞型の増大も可能になり得る。Ｙ２７６３２などのＲｈｏキナーゼ阻害剤はヒト多能性幹細胞（例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞）およびそれが分化した細胞に対して試験されてきたが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、他の細胞型、例えば、一般に、これだけに限定されないが、腸、肺、胸腺、腎臓ならびに網膜色素上皮と同様の神経系細胞型を含めた上皮細胞に適用することができる。

細胞培養培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、その濃度により所望の効果が実現される、例えば、細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着の増強、増加、および／または促進が実現される限りは、下記の実施例に記載されているものに限定されない。種々のＲＯＣＫ阻害剤を種々の条件下で最適化することが必要な場合があることが当業者には理解されよう。例えば、Ｙ−２７６３２を使用する場合、好ましい濃度は、約０．０１〜約１０００μＭ、より好ましくは約０．１〜約１００μＭ、なおより好ましくは約１．０〜約５０μＭ、最も好ましくは約５〜２０μＭにわたり得る。ファスジル／ＨＡ１０７７を使用する場合、上述のＹ−２７６３２濃度の約２倍または３倍で使用することができる。Ｈ−１１５２を使用する場合、上述のＹ−２７６３２濃度の量のおよその分数、例えば、約１／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０または１／６０で使用することができる。使用するＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、一部において、阻害剤の生物活性および効力ならびにそれが使用される条件に左右される。

ＲＯＣＫ阻害剤を用いて処理する時間および期間は、成長、生存、増殖（細胞集団）および細胞間接着の増強、増加、および／または促進などの所望の効果に応じて限定される場合もされない場合もある。しかし、ＲＯＣＫ阻害剤の添加は、実施例７によりよく記載されている通り、驚くべき様式で分化にも影響を及ぼし得る。下記の実施例には、約１２時間、２４時間、４８時間、またはそれ以上にわたって処理されたヒト多能性幹細胞培養物および／または分化した細胞培養物が記載されている。

ＲＯＣＫ阻害剤を用いて処理されるヒト多能性幹細胞培養物の密度も同様に、それが、細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着の増強、増加、および／または促進などの所望の効果が実現される密度である限りは限定されない。播種される細胞の細胞密度は、これだけに限定されないが、接着培養物または懸濁培養物の使用、使用する細胞培養培地の特定のレシピ、成長条件および培養細胞の意図された使用を含めた種々の因子に応じて調整することができる。細胞培養物の密度の例としては、これだけに限定されないが、１ｍｌ当たり細胞０．０１×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞０．０５×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞０．１×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞０．５×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞１．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞１．２×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞１．４×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞１．６×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞１．８×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞２．０×１０^５、１ｍｌ当たり細胞３．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞４．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞５．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞６．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞７．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞８．０×１０^５個、１ｍｌ当たり細胞９．０×１０^５個、または１ｍｌ当たり細胞１０．０×１０^５個、またはそれ以上、例えば、１ｍＬ細胞５×１０^７個まで、またはそれ以上、または間の任意の値が挙げられ、良好な細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を伴って培養された。

ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質の使用
さらに別の実施形態では、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質は、成長因子のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーを含み、本明細書に記載されている。本明細書で使用される場合、「ＴＧＦβスーパーファミリーメンバー」またはその等価物とは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＦ−β３、ＧＤＦ−１５、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−３、ＧＤＦ−１０、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンβＣ、βΕ、βΑおよびβΒ、ＢＭＰ−１４、ＧＤＦ−１４、ＭＩＳ、インヒビンアルファ、Ｌｅｆｔｙ１、Ｌｅｆｔｙ２、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、パーセフィンおよびアルテミンを含めたサブファミリーを含めた３０種を超える構造的に関連するタンパク質を指す。Ｃｈａｎｇら（２００２）ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖ．２３（６）：７８７−８２３を参照されたい。

ＴＧＦβファミリーメンバーは、ＴＧＦβファミリーメンバーに応答して細胞の性質の変化を伝達するまたは他のやり方でもたらすことに関与するポリペプチドまたは相互作用の１種または複数種を刺激する化合物であるＴＧＦβシグナル伝達経路活性化因子によって置き換えること、またはそれと併せて使用することができる。ＴＧＦβシグナル伝達経路はＴＧＦβファミリーメンバー自体を含む。ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーは、ＩＩ型およびＩ型セリン−トレオニンキナーゼ受容体およびＳｍａｄとして公知の細胞内エフェクターを通じたシグナル伝達によってシグナルを核に伝達する。これらの受容体は、協同的に作用してリガンドに結合し、シグナルを伝達するＩ型受容体およびＩＩ型受容体として公知の２つのサブファミリーに入る（Ａｔｔｉｓａｎｏら、ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１６（３）、１０６６−１０７３（１９９６））。リガンドはＩ型受容体およびＩＩ受容体の細胞表面に結合し、リン酸化によるＩ型受容体の活性化を促進する。この活性化された複合体が今度は細胞内Ｓｍａｄを活性化し、それが転写を調節する多サブユニット複合体に集合する。ＴＧＦベータスーパーファミリーのメンバーは、２つのシグナル伝達サブグループ：ＴＧＦβ／アクチビンと機能的に関連するもの、およびＢＭＰ／ＧＤＦサブファミリーと関連するものに分けられる。大部分のＴＧＦβリガンドは、最初にＩＩ型受容体に結合し、次いで、このリガンド／ＩＩ型受容体複合体がＩ型受容体を動員またはリン酸化すると考えられている（Ｍａｔｈｅｗｓ，ＬＳ、ＥｎｄｏｃｒＲｅｖ１５：３１０−３２５（１９９４）；Ｍａｓｓａｇｕｅ、ＮａｔｕｒｅＲｅｖ：ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ．１、１６９−１７８（２０００））。ＩＩ型受容体キナーゼは、Ｉ型受容体キナーゼをリン酸化および活性化することにより、次いで、Ｓｍａｄタンパク質をリン酸化および活性化する。ＴＧＦβ／アクチビンリガンドはＴＧＦβおよびアクチビンＩＩ型受容体に結合し、このアクチビン型経路を通じてＳｍａｄ−２、Ｓｍａｄ−３、ＮｏｄａｌおよびＬｅｆｔｙシグナルを活性化することができる。ＢＭＰ／ＧＤＦリガンドはＢＭＰＩＩ型受容体に結合し、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８を活性化することができる。Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒら、Ｃｅｌｌ９５、７３７−７４０（１９９８）を参照されたい。リガンド刺激の際、Ｓｍａｄは核内に移動し、転写複合体の構成成分として機能する。

ＴＧＦβシグナル伝達は、種々の機構を通じて正におよび負に調節される。陽性調節では、シグナルが生物学的活性のために十分なレベルまで増幅される。ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドがＩＩ型受容体に結合し、これによりＩ型受容体が動員およびリン酸化される。次いで、Ｉ型受容体により、受容体により調節されるＳＭＡＤ（Ｒ−ＳＭＡＤ、例えばＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、およびＳＭＡＤ８）がリン酸化され、そこで共通のメディエーターＳｍａｄまたはｃｏ−ＳＭＡＤに結合することができる。Ｒ−ＳＭＡＤ／ｃｏＳＭＡＤ複合体は核内に蓄積され、そこで転写因子としての機能を果たし、標的遺伝子発現の調節に関与する。例えば、成長分化因子は１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、および１５を含む。また、好ましい一実施形態では、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１はＴＧＦβファミリーメンバーであり、同様にＴＧＦβシグナル伝達経路活性化因子（陽性調節）でもあり、ＡｃｔＲＩＩ受容体の細胞外リガンド結合性ドメイン部分に結合し、次いでＡｃｔＲＩと複合体を形成し、それによりＳｍａｄ７負の制御因子の阻害およびＳｍａｄ２／Ｓｍａｄ３複合体のリン酸化を導くことによって作用する。Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ３複合体はＳｍａｄ４と会合して特定の遺伝子の発現を調節する。

任意の作用物質の使用と同様に、細胞培養培地中の任意のＴＧＦβスーパーファミリーメンバーの濃度は、その濃度により、例えばＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーが活性化されることなどの所望の効果を実現することができる限りは、下記の実施例に記載されているものに限定されない。例えば、アクチビン、例えば、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢ、またはＧＤＦ８およびＧＤＦ−１１を使用する場合、好ましい濃度は、約１０〜約３００ｎＭ、より好ましくは約５０〜約２００ｎＭ、なおより好ましくは約７５〜約１５０ｎＭ、最も好ましくは約１００〜１２５ｎＭにわたり得る。当業者は、任意の濃度を容易に試験することができ、当技術分野における標準の技法を使用して、そのような濃度の有効性を決定すること、例えば、任意の細胞型について遺伝子マーカーのパネルの発現および非発現を決定することによって分化を評価することができる。

内分泌細胞を生成するための作用物質の使用
一実施形態では、本発明は、これだけに限定されないが、ガンマセレクターゼ阻害剤を含めたＮｏｔｃｈ経路阻害剤を、内分泌分化を促進し、かつ／または内分泌細胞の特質であり、内分泌分化を示すある特定のマーカーの発現を誘導するために有効な量で使用して、膵臓内胚葉系列型集団および／または亜集団、特にＰＥＣおよび／または膵臓内分泌系列細胞を作製する方法を提供する。多数のガンマセレクターゼ阻害剤が記載されている。例えば、米国特許第６，７５６，５１１号；同第６，８９０，９５６号；同第６，９８４，６２６号；同第７，０４９，２９６号；同第７，１０１，８９５号；同第７、１３８，４００号；同第７、１４４，９１０号；同第および７、１８３，３０３号を参照されたい。ガンマセレクターゼ阻害剤は、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ）から容易に入手可能である：ガンマセレクターゼ阻害剤Ｉ、（ＧＳＩＩ）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ノルロイシン−ＣＨＯ；ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＩ；ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＩＩ、（ＧＳＩＩＩＩ）、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌｅｕ−ロイシナール；ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＶ、（ＧＳＩＩＶ）、Ｎ−（２−ナフトイル）−Ｖａｌ−フェニルアラニナール；ガンマセレクターゼ阻害剤Ｖ、（ＧＳＩＶ）、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌｅｕ−フェニルアラニナール；ガンマセレクターゼ阻害剤ＶＩ、（ＧＳＩＶＩ）、１−（Ｓ）−エンド−Ｎ−（１，３，３）−トリメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−イル）−４−フルオロフェニルスルホンアミド；ガンマセレクターゼ阻害剤ＶＩＩ、（ＧＳＩＶＩＩ）、メチルオキシカルボニル−ＬＬ−ＣＨＯ；ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＸ、（ＧＳＩＩＸ）、（ＤＡＰＴ）、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル；ガンマセレクターゼ阻害剤Ｘ、（ＧＳＩＸ）、｛１Ｓ−ベンジル−４Ｒ−［１−（１Ｓ−カルバモイル−２−フェネチルカルバモイル）−１Ｓ−３−メチルブチルカルバモイル］−２Ｒ−ヒドロキシ−５−フェニルペンチル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル；ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩ、（ＧＳＩＸＩ）、７−アミノ−４−クロロ−３−メトキシイソクマリン；ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＩ、（ＧＳＩＸＩＩ）、Ｚ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ；ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＩＩ、（ＧＳＩＸＩＩＩ）、Ｚ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ；ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＶ、（ＧＳＩＸＩＶ）、Ｚ−Ｃｙｓ（ｔ−Ｂｕ）−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ；ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＶＩ、（ＧＳＩＸＶＩ）、Ｎ−［Ｎ−３，５−ジフルオロフェンアセチル］−Ｌ−アラニル−Ｓ−フェニルグリシンメチルエステル；ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＶＩＩ、（ＧＳＩＸＶＩＩ）、ＷＰＥ−ＩＩＩ−３１Ｃ）；ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＸ、（ＧＳＩＸＩＸ）、（２Ｓ，３Ｒ）−３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−（４−フルオロフェニル）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（（３Ｓ）−２−オキソ−−５−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼピン−３−イル）−ブチルアミド；ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＸ、（ＧＳＩＸＸ）、（ジベンザゼピン（ＤＢＺ））、（Ｓ，Ｓ）−２−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）アセチルアミノ］−Ｎ−（５−メチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル）プロピオンアミド、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＸＩ、（ＧＳＩＸＸＩ）、（Ｓ，Ｓ）−２−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−アセチルアミノ］−Ｎ−（１−メチル−２−オキソ−５−フェニル−２−，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼピン−３−イル）−プロピオンアミド；ガンマ４０セレクターゼ阻害剤Ｉ、Ｎ−トランス−３，５−ジメトキシシンナモイル−Ｉｌｅ−ロイシナール；ガンマ４０セレクターゼ阻害剤ＩＩ、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−バリナール（Ｖａｌｉｎａｌ）；およびイソバレリル−Ｖ−Ｖ−Ｓｔａ−Ａ−Ｓｔａ−ＯＣ_３。

一態様では、ガンマセレクターゼ阻害剤は、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ノルロイシン−ＣＨＯ、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌｅｕ−ロイシナール、Ｎ−（２−ナフトイル）−Ｖａｌ−フェニルアラニナール、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌｅｕ−フェニルアラニナール、１−（Ｓ）−ｅｎｄｏ−Ｎ−（１，３，３）トリメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−イル）−４−フルオロフェニルスルホンアミド、メンチルオキシカルボニル−ＬＬ−ＣＨＯ、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル、｛１Ｓ−ベンジル−４Ｒ−［１−（１Ｓ−カルバモイル−２−フェネチルカルバモイル）−１Ｓ−３−メチルブチルカルバモイル］−２Ｒ−ヒドロキシ−５−フェニルペンチル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、７−アミノ−４−クロロ−３−メトキシイソクマリン、Ｚ−ｌｌｅ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ、Ｚ−Ｔｙｒ−ｌｌｅ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ、Ｚ−Ｃｙｓ（ｔ−Ｂｕ）−ｌｌｅ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ、Ｎ−［Ｎ−３，５−ジフルオロフェナセチル］−Ｌ−アラニル−Ｓ−フェニルグリシンメチルエステル、（２Ｓ，３Ｒ）−３−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−（４−フルオロフェニル）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（（３Ｓ）−２−オキソ−−５−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼピン−３−イル）−ブチルアミド、（Ｓ，Ｓ）−２−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）−アセチルアミノ］−Ｎ−（１−メチル−２−オキソ−５−フェニル−２−，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼピン−３−イル）−プロピオンアミド、Ｎ−ｔｒａｎｓ−３，５−ジメトキシシンナモイル−ｌｌｅ−ロイシナール、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−バリナール、イソバレリル−Ｖ−Ｖ−Ｓｔａ−Ａ−Ｓｔａ−ＯＣＨ_３のうちの１つまたは複数からなる群から選択され、腎疾患は糸球体腎疾患または尿細管腎疾患である。本発明の一態様では、本明細書に記載されており、表８および表１７によるステージ１〜７のいずれかまたは全てにおいて、約０．５〜１０ｍＭ、０．５〜５ｍＭ、０．５〜３ｍＭ、好ましくは０．５〜１ｍＭのガンマセレクターゼ阻害剤を使用する。

一実施形態では、インスリン成長因子（ＩＧＦ）は、細胞がそれらの生理的環境との情報交換に使用する複合体系の一部であり、したがって、ＰＳＣをＰＥＣおよび／または膵臓内分泌系列細胞に分化させるために使用することができる。この複合体系（多くの場合、ＩＧＦ「軸」と称される）は、２つの細胞表面受容体（ＩＧＦ１ＲおよびＩＧＦ２Ｒ）、２つのリガンド（インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）およびインスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２））、６種の高親和性ＩＧＦ結合性タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１〜ＩＧＦＢＰ−６）のファミリーからなり、また、集合的にプロテアーゼと称されるＩＧＦＢＰ分解酵素と関連する。ＩＧＦは、ＩＧＦ１Ｒ、インスリン受容体、ＩＧＦ−２受容体、インスリン関連受容体およびおそらく他の受容体に結合することが知られている。したがって、本発明の一態様では、これらの受容体に結合する成長因子として、これらの受容体のいずれかまたは組合せに結合する任意の成長因子、作用物質またはモルフォゲンは本明細書に記載および予測されているものと潜在的に同じ生理作用を有するので、これだけに限定されないが、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２が挙げられる。本発明の一態様では、本明細書に記載されており、表８および表１７によるステージ１〜７のいずれかまたは全てにおいて、約５〜２００ｎｇ／ｍＬ、１０〜１００ｎｇ／ｍＬ、１０〜７５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０〜５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦを使用する。

一実施形態では、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を使用して、ＰＳＣをＰＥＣおよび／または内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）に分化させる。ＰＤＧＦは、多数種の細胞の強力なマイトジェンとして広範に記載されている主要なタンパク質成長因子である。ＰＤＧＦは、異なるチロシンキナーゼ受容体：ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βを通じて作用するポリペプチド鎖、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの二量体アイソフォームのファミリーに属する。本発明の一態様では、リガンドは、これだけに限定されないが、２つの型の受容体に結合するＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂを含めた、ＰＤＧＦまたはその機能的等価物である。本発明の一態様では、本明細書に記載されており、表８および表１７によるステージ１〜７のいずれかまたは全てにおいて、約５〜１００ｎｇ／ｍＬ、１０〜７５ｎｇ／ｍＬ、１０〜５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜２０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦを使用する。

一実施形態では、ニコチン酸（ビタミンＢ３／ナイアシン）のアミドである、ナイアシンアミドおよびニコチン酸アミドとしても公知のニコチンアミドを、ＰＳＣをＰＥＣおよび／または膵臓内分泌系列細胞に分化させるために使用する。ナイアシンとしても公知のニコチン酸は、ｉｎｖｉｖｏでニコチンアミドに変換され、ナイアシンとニコチンアミドのビタミン機能は同一であるが、ニコチンアミドは、ナイアシンと同じ薬理作用および毒作用を有さない。したがって、ニコチンアミドと同様に機能する他のビタミンＢまたはビタミンＢ誘導体は本発明に組み入れられる。本発明の一態様では、本明細書に記載されており、表８および表１７によるステージ１〜７のいずれかまたは全てにおいて、約５〜１００ｎｇ／ｍＬ、１０〜７５ｎｇ／ｍＬ、１０〜５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜２０ｎｇ／ｍＬのニコチンアミドを使用する。

別の実施形態では、タンパク質のヘッジホッグファミリーを、ＰＳＣをＰＥＣおよび／または膵臓内分泌系列細胞に分化させるために使用する。本発明によって提供される脊椎動物細胞間シグナル伝達分子のヘッジホッグファミリーは、これだけに限定されないが、デザートヘッジホッグ（Ｄｅｓｅｒｔｈｅｄｇｅｈｏｇ）（Ｄｈｈ）、ソニックヘッジホッグ（Ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇ）（Ｓｈｈ）、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）およびムーンラットヘッジホッグ（Ｍｏｏｎｒａｔｈｅｄｇｅｈｏｇ）（Ｍｈｈ）を含めた少なくとも４種のメンバーからなる。一態様では、本明細書に記載されており、表８および表１７によるステージ１〜７のいずれかまたは全てにおいて、約５〜２００ｎｇ／ｍＬ、１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、１０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍＬのヘッジホッグタンパク質を使用する。

本発明を一般に記載したが、本明細書において提供される、単に例示するためのものであり、限定するものではないある特定の実施例を参照することにより、さらなる理解を得ることができる。

上述のものが本発明の好ましい実施形態に関連すること、および本発明の範囲を逸脱しないでそこに多数の変更を加えることができることも理解するべきである。本発明は以下の実施例でさらに例示されるが、それらはその範囲に制限を加えるものと決して解釈されてはならない。逆に、様々な他の実施形態、改変形およびその同等物に頼ることができることを明らかに理解するべきであり、それらは、本明細書の説明を読んだ後ならば、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲を逸脱しないで、当業者が思いつくことができる。

（実施例１）
胚体内胚葉および内胚葉中間体を経た膵臓の前駆体および内分泌細胞へのヒトｉＰＳ細胞の分化
膵臓前駆体、内分泌前駆体およびホルモン発現内分泌細胞を含む膵臓細胞型の集団を生成するために、約２週（または１４日）にわたる四（４）ステージ手順を使用して、懸濁凝集体でヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を分化させた。本明細書で用いたヒトｉＰＳ細胞系は、Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ、ＫｙｏｔｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＪａｐａｎおよびＣｅｌｌｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（ＣＤＩ）によって提供された。

本明細書に記載されるｉＰＳ細胞は、ＳｈｉｎｙａＹａｍａｎａｋａによって最初に、その後ＣＤＩによって提供された。未分化ｉＰＳ細胞は、２０％ノックアウト血清代替物を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２において、有糸分裂不活性化マウス胚線維芽細胞で、または好ましくはフィーダーフリー（線維芽細胞フィーダー細胞層なし）で増殖させた。Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して未分化ｉＰＳ細胞を単細胞に解離させることによって分化を開始し、ＲＮＡの単離と分析のために細胞試料をとった。細胞は、１：５０００希釈のインスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ｗｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびロー−キナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤、Ｙ−２７６３２を１０μΜで含有するＲＰＭＩ＋０．２容量／容量％ＦＢＳに、１ミリリットルにつき細胞数１，０００，０００〜２，０００，０００で再懸濁させ、回転プラットホームの上に置いた超低付着６ウェルプレートに入れ、約１００ｒｐｍで回転させた。分化プロセスの残りの間、培地を毎日交換して培養を１００ｒｐｍで回転させた。ｉＰＳＣの成長、継代および増殖は、実質的に米国特許第７，９６１，４０２号および第８，２１１、６９９号に記載されている通りである。

多能性細胞、例えばｈＥＳまたはｉＰＳ細胞、および多能性細胞から導出された細胞の凝集懸濁培養を生成するための本明細書に記載の方法は、実質的に、２００７年２月２３日に出願された表題がＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｃｕｌｔｕｒｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｓであるＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、および２００８年１０月２０日に出願された表題がＭｅｔｈｏｄｓａｎｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｍｅｄｉａｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｈｕｍａｎｓｅｒｕｍであるＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６に記載されている通りである。

本明細書に記載される方法は、例えば、ＧｅｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに帰属する、Ｂｏｄｎａｒらへの米国特許第６，８００，４８０号に記載のように、培養容器を細胞外基質で先ずコーティングすることによって促進することができる。他の多能性幹細胞、例えばｈＥＳおよびｉＰＳ細胞を培養するための他の方法と同様に、この方法は、実質的に２００８年１０月２０日に出願された表題がＭｅｔｈｏｄｓａｎｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｍｅｄｉａｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｈｕｍａｎｓｅｒｕｍである米国特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６に記載されるように、可溶性ヒト血清を使用して培養することができる。

本明細書に記載される方法は、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＡｌｕｍｎｉＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷＡＲＦ）に帰属する、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．への米国特許第７，００５，２５２号に記載されるように、線維芽細胞フィーダー層だけ以外の供給源から供給される、外部から加えられた線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）によって促進することができる。

回転の最初の約２４時間の間に、互いに付着した単細胞は細胞凝集体を形成し、ＲＮＡの単離と分析のために十分な細胞試料をとった。細胞凝集体は、直径が約６０ミクロンから１２０ミクロンであった。ｉＰＳ細胞試料を回転プラットホームに置いてから約１日（または２４時間）後に、培養に、１：５０００希釈のＩＴＳ、アクチビンＡ（１００〜２００ｎｇ／ｍＬ）、およびＷｎｔ３ａ（５０〜１００ｎｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ＋０．２容量／容量％ＦＢＳを約１日間（０日目から１日目まで）およびさらなる１日間、またはＷｎｔ３ａのないこと以外は同じ培地で（１日目から２日目）与えた。ＲＮＡの単離および分析のために毎日の細胞試料をとった。２日間の分化の後、培養に、１：１０００希釈のＩＴＳ、ＫＧＦ（またはＦＧＦ７、２５ｎｇ／ｍＬ）およびＴＧＦβ阻害剤ｎｏ．４（２．５μＭ）を含有するＲＰＭＩ＋０．２容量／容量％ＦＢＳを１日間（または２４時間、２日目から３日目まで）与えた。次の２日間（３日目から５日目）、ＴＧＦβ阻害剤を培地から除いたこと以外は同じ成長因子カクテル培地をｉＰＳ細胞凝集懸濁液に与えた。再び、このステージ（ステージ２または５日目）の終わりに、ＲＮＡ単離のために細胞試料をとった。ステージ３（５日目から８日目）については、ＴＴＮＰＢ［４−［Ｅ−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸］（３ｎＭ）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μΜ）およびノギン（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ＋１容量／容量％Ｂ２７補助剤に細胞培養培地を代えた。再び、このステージ（ステージ３または８日目）の終わりに、ＲＮＡの単離と分析のために細胞試料をとった。ステージ４（８日目から１４日目）については、ノギン（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ＋１容量／容量％Ｂ２７補助剤に培地を代えた。再び、ステージ４（または１４日目）の終わりに、ＲＮＡの単離と分析のために細胞試料をとった。

分化中の様々なマーカー遺伝子の遺伝子発現を測定するために、リアルタイムＰＣＲを実施した。特異的マーカーまたは遺伝子の遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子、サイクロフィリンＧおよびＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）発現の平均発現レベルに先ず標準化した。標準化した相対的な遺伝子発現は、未分化ｉＰＳ細胞での発現レベルに対して棒グラフに次に表示させ、したがって様々な分化マーカーの上方制御倍率を表す。ＯＣＴ４については、データセットで最低の試料（１４日目）を設定するために遺伝子発現を標準化し、したがって分化中の下方制御倍率を表す。

図２Ａ〜Ｌは、未分化ｉＰＳ細胞中の同じ遺伝子の発現レベルと比較した、同定された遺伝子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｃｅｒ１、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３およびＩＮＳ）の相対的な遺伝子発現を示す棒グラフである。遺伝子の発現レベルをハウスキーピング遺伝子（対照）のセットに標準化し、２つの異なる時点で遺伝子発現レベルを比較することは、その遺伝子または発現マーカーの上方制御か下方制御があることを示した。ＯＣＴ４（図２Ａ）については、遺伝子発現を標準化し、最低レベルの発現の試料は１に設定した（１４日目）。したがって、図２Ａによって示されるように、ＯＣＴ４の相対的な発現レベルは、分化中（Ｘ軸、ステージ０から４、または０日目から１４日目）の下方制御倍率（ｙ軸）を表す。

図２Ａに示すように、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）は未分化ｉＰＳ細胞において高レベルで発現され、分化中（０日目から１４日目）に以降の下方制御を示す。１４日目までには、ＯＣＴ４発現レベルは未分化細胞で観察される発現レベルから３０００倍を超えて減少した。対照的に、最初の２日間（１日目および２日目）中にｂｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、図２Ｂ）発現の一過性の上方制御があった。ｂｒａｃｈｙｕｒｙの一過性の上方制御は、アクチビンＡおよびｗｎｔ３ａの適用による多能性／ｉＰＳ細胞の内胚葉系中胚葉への誘導された分化の結果であった。３日目のステージ１の終わりまでのＣＥＲ１、ＧＳＣおよびＦＯＸＡ２の上方制御によって示されるように（図２Ｃ〜Ｅ）、内胚葉系中胚葉はアクチビンＡへの連続曝露によって２日目および３日目の間に胚体内胚葉にさらに分化した。分化の６日目までのＦＯＸＡ１の上方制御、ＦＯＸＡ２発現の維持ならびにＣＥＲ１およびＧＳＣの下方制御によって示されるように（図２Ｃ〜Ｆ）、ステージ２の間に、胚体内胚葉は腸管内胚葉に分化するようにさらに誘導された。８日目までのＨＮＦ６およびＰＤＸ１の上方制御によって示されるように（図２Ｇ〜Ｈ）、ステージ３の間、レチノイド、シクロパミンおよびノギンへの曝露の結果、腸管内胚葉は後部前腸／ＰＤＸ１発現内胚葉に分化するようにさらに誘導された。１４日目までのＰＴＦ１Ａ、ＮＫＸ６−１、ＮＧＮ３およびＩＮＳの上方制御によって示されるように（図２Ｉ〜Ｌ）、ステージ４の間、ＫＧＦおよびＥＧＦへの曝露の結果、後部前腸／ＰＤＸ１発現内胚葉は、膵臓前駆体、内分泌前駆体およびホルモン発現内分泌細胞に分化するようにさらに誘導された。

（実施例２）
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、ｉＰＳ細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を促進する
様々なｈＥＳおよびｉＰＳ細胞系を分化させる方法は、実質的にここで、および実施例１に記載される通りである。分化の間の成長、生存、増殖および細胞間接着を増強および促進するために、ステージ１、２、３、４および５について記載される培養条件に加えて、アポトーシス阻害剤および／またはＲｈｏキナーゼもしくはＲＯＣＫ阻害剤を培地に加えた。一般的に約１０μΜのＲｈｏキナーゼ阻害剤、例えばＹ−２７６３２を、各ステージで細胞培養に加えた。あるいは、少なくともステージ１および２、ならびにステージ４および５、またはその任意の組合せでＲｈｏキナーゼ阻害剤を加えた。分化したｉＰＳ懸濁液（凝集体）細胞培養の形態および遺伝子マーカー発現プロファイルは、ｈＥＳ細胞から導出された懸濁細胞培養のそれに実質的に類似する。

図３および４は、それぞれステージ４と５からのｉＰＳ細胞培養の免疫細胞化学（ＩＣＣ）を示す。図３は、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１同時陽性細胞を含むＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉（膵臓上皮または膵臓前駆体とも呼ばれる）を特徴とする典型的な遺伝子マーカーを発現する、ステージ４からの細胞凝集体を示す。図３に示されていないが、ステージ４細胞は、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）および膵臓ポリペプチド（ＰＰ）などのステージ５細胞の特色をより示すホルモン分泌タンパク質または遺伝子マーカーを発現しない。図４は、ステージ５からのホルモン発現細胞の細胞凝集体を示す。これらのＩＣＣ結果は、ＱＰＣＲを使用してさらに確認された。しかし、ＱＰＣＲは試料または細胞培養で発現されるＲＮＡの全レベルの全集団研究であるので、それは任意の１つの細胞が複数のマーカーを発現することを確定的に示すことができない。

（実施例３）
ＩＰＳ導出膵臓前駆体の封入
現在まで、ｉＰＳ細胞の生成方法およびｉＰＳ細胞の生成のための供給源が報告されている。しかし、特定の疾患、例えば糖尿病を処置するための細胞療法での潜在的使用のための、任意の機能する分化細胞への任意のｉＰＳ細胞の分化に関する十分な記載がない。

ヒトｉＰＳ細胞から導出されたステージ４のＰＤＸ１陽性の膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞培養が、グルコース感受性インスリン分泌細胞にｉｎｖｉｖｏで発達および成熟することが完全に可能かどうか判定するために、実質的に実施例１および２に記載のような膵臓前駆体集団を、２００９年１１月１３日に出願された米国特許出願１２／６１８，６５９、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＬＩＮＥＡＧＥＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＵＭＡＮＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＳ；ならびに米国特許第７，５３４，６０８号および第７，６９５，９６５号、表題ＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＩＮＧＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＳに記載のものに実質的に類似のマクロ封入デバイスに加えた。簡潔には、実質的に約３×１０^６細胞数を有する、５−１０−２０μＬの重力沈殿細胞懸濁凝集体を各デバイスに加えた。

哺乳動物、例えば免疫不全ＳＣＩＤ／Ｂｇマウスへの移植のために次にデバイス内の封入細胞を調製したが、ラット、ブタ、サルまたはヒト患者を含むより大きな動物に移植することができる。封入細胞を移植する方法およびデバイスは、実質的に、米国特許出願第１２／６１８，６５９号、米国特許第７，５３４，６０８号および第７，６９５，９６５号に記載のものであり、ＧＥＬＦＯＡＭマトリックスに移植され、精巣上体の脂肪パッド（ＥＦＰ）の下に移植される膵臓前駆細胞を含む。

これらの研究で免疫抑制は必要でなかったが、デバイス内の前駆体が完全に成熟してグルコースに応答性になるまで、最初の中間期間の間特定の哺乳動物のために免疫抑制が必要とされることがある。一部の哺乳動物では、免疫抑制レジメンは約１、２、３、４、５、６週間以上であってもよく、哺乳動物次第である。

移植された細胞は、ｉｎｖｉｖｏで分化させ、さらに成熟させた。例えば移植された細胞が天然に存在するベータ細胞として正常な生理機能を有するかどうか判定するために、ヒトＣペプチドのレベルの検査によってヒトインスリンのレベルを判定する。ヒトＣペプチドはヒトプロインスリンから切断または処理され、したがって、内因性マウスＣペプチドでなくヒトＣペプチドの特異的検出は、インスリン分泌が移植された（外因性）細胞から導出されたことを示す。移植片を有する動物は、それらへのアルギニンまたはグルコース、好ましくはグルコースのボーラス注射によって、２、３または４週ごとにヒトＣペプチドのレベルを検査する。その後成熟したベータ細胞（分化した多能性ｉＰＳ細胞から導出された）は、天然に存在するか内因性のベータ細胞と同様に生理的に機能的であるべきで、グルコースに応答性であるべきである。一般的に、５０ｐＭまたは平均基礎（閾値）レベルを上回るヒトＣペプチドの量は、移植された前駆体から今ではベータ細胞となったものの機能の指標である。

Ｋｒｏｏｎら（２００８）、前掲、米国特許出願１２／６１８，６５９、米国特許第７，５３４，６０８号；第７，６９５，９６５号および第７，９９３，９２０号に記載のものと同様に、ｈＩＰＳ細胞から導出された封入膵臓前駆体は、天然に存在する島のそれと同様の内分泌、腺房および管細胞を有する、機能する膵島クラスターに成熟することが予想される。移植前のｈＩＰＳ細胞から導出された精製または濃縮された膵臓前駆体も、機能する膵島に成熟および発達し、ｉｎｖｉｖｏでインスリンを生成することも予期される。様々な分化した細胞集団を精製、濃縮するための特定の実施形態は、２００８年４月８日に出願された米国特許出願１２／１０７，０２０、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＰＵＲＩＦＹＩＮＧＥＮＤＯＤＥＲＭＡＮＤＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＥＳＣＥＬＬＳ、現在の米国特許第８，３３８，１７０号にさらに詳細に記載される。低温保存されたｈＩＰＳ細胞から導出された膵臓前駆体を移植の前に解凍し、培養に適合させることができ、したがって、ｉｎｖｉｖｏで成熟してインスリンを生成することができることがさらに予期される。ｈＩＰＳ細胞から導出された移植された膵臓前駆体を有する糖尿病誘導動物では、低血糖を改善することができる。

要約すると、マクロ封入デバイス中のｈＩＰＳ細胞から導出された完全封入膵臓前駆細胞は、生理的に機能的な膵島に成熟し、ｉｎｖｉｖｏでグルコースに応答してインスリンを生成することが予想される。

（実施例４）
膵臓前駆体およびホルモン分泌細胞組成物
それぞれ表６ａ、６ｂおよび７に示すように、フローサイトメトリーを用いて、分化したｈＩＰＳ細胞集団を、ＰＤＸ１陽性の膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞（ステージ４）；および内分泌または内分泌前駆／先駆細胞（ステージ５）のそれらの含有量について分析した。表６ｂは表６ａのそれと同じデータセットであるが、比較のために表１０のそれと同様に提示する。全体のＰＤＸ１＋およびＮＫＸ６．１＋数はＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋／ＣＨＧＡ−細胞集団（表６ａの第５列）のそれと重複するので、表６ａ集団は互いと重複する、例えば全細胞数は１００％を超える。表６ｂはＰＤＸ１＋だけおよび三重陰性（残留）データを含み、それは表６ａでは示されない。ｉｎｖｉｖｏ機能を判定するために、これらのｉＰＥＣ移植片の特定のもの、ならびに実質的に類似の処方を使用する他のものを動物に移植したが、ヒト血清Ｃペプチドのレベルは任意の潜在的治療目的のために十分に頑強でなかった（データは示さず）。示す値は、所与の集団に属する全細胞の百分率である。懸濁細胞凝集体中にある膵臓前駆体（ＮＫＸ６．１（＋）／ＰＤＸ１（＋）／クロモグラニンＡ（−））の数およびＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１−／ＣＨＧＡ−の非常に小さい集団は、ｈＥＳ細胞から導出された膵臓前駆細胞懸濁凝集体で観察されたものと一貫し、２００８年１１月４日に出願された米国特許出願１２／２６４，７６０、表題ＳＴＥＭＣＥＬＬＡＧＧＲＥＧＡＴＥＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮＴＨＥＲＥＯＦに記載の通り、ＥＳＣステージで凝集した。内分泌物および／または内分泌前駆／先駆細胞のレベルも、２００８年４月８日に出願された米国特許出願１２／１０７，０２０、表題ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＰＵＲＩＦＹＩＮＧＥＮＤＯＤＥＲＭＡＮＤＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＥＳＣＥＬＬＳ中のｈＥＳ導出細胞培養で得られたものと実質的に一貫していた。ｈＥＳ導出細胞懸濁凝集体と同様に、分化の特定のステージ（例えば、ステージ４）で培地中の異なる成長因子の濃度を変化させることは、膵臓内胚葉、内分泌、ＰＤＸ１陽性の内胚葉または非膵臓細胞型の特定の集団を増加および／または減少させるはずである。

（実施例５）
ＰＥＣ受容体チロシンキナーゼ
上記の方法は、上記のＳｃｈｕｌｚら（２０１２）から変更した下の表８に記載されるものと実質的に同じである。本明細書に記載されるこれらおよび他の方法は、米国特許第７，９６４，４０２号；第８，２１１，６９９号；第８，３３４，１３８号；第８，００８，０７号；および第８，１５３，４２９号を含む、出願人の多くの特許および非特許公開文書に見出すことができる。

動物に移植されたｉＰＳ細胞および膵臓前駆体に上の方法を適用したとき、同じ方法をｈＥＳＣおよびｈＥＳ導出膵臓前駆体に適用したときと比較して、出願人は同じ頑強なｉｎｖｉｖｏ機能を一貫して得たとは限らない。ｉＰＳ細胞がｈＥＳＣの形態および遺伝子発現パターンを有し、ｉｎｖｉｔｒｏで胚様体およびｉｎｖｉｖｏでテラトーマを形成することができるヒト多能性幹細胞であり、それらが全ての３つの胚葉から細胞を形成することができることを示していることを考慮すると、これは意外であった。少なくとも、例えばＹｕら（２００７）；米国特許出願公開第２００９／００４７２６３号、国際特許出願公開ＷＯ２００５／８０５９８；米国特許出願公開第２００８／０２３３６１０号；および国際特許出願公開ＷＯ２００８／１１８８２、上記を参照。これらの参考文献は、ｉＰＳ細胞がＥＳＣの定義基準を満たすことを記載する。したがって、完全に機能するグルコース応答性細胞にｉｎｖｉｖｏでさらに成熟および発達する、ｈＥＳから導出された膵臓前駆細胞を与えるｉｎｖｉｔｒｏ分化プロトコルにおいて、ｉＰＳ細胞がＥＳＣの代用となることができることが予想される。しかし、上の方法を使用する一貫しないｉｎｖｉｖｏ機能データを考慮し、出願人は、膵臓前駆体および／または膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）、すなわち、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣで一貫して観察されているｉｎｖｉｖｏ機能の実質的に類似の頑強なレベルを提供することが可能であるｈｉＰＳＣ（または「ｉＰＥＣ」）からのステージ４導出細胞に特異である分化培地処方を探索しようと努めた。

出願人は、ＰＥＣに存在する内分泌（ＣＨＧＡ＋細胞）細胞が多ホルモン内分泌細胞であり、ｉｎｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞を有する島を生成するＰＥＣ中の細胞の亜集団でないことを前に報告した。上記Ｋｅｌｌｙら（２０１１）を参照する。むしろ、それは、非内分泌細胞集団（ＣＨＧＡ−細胞）、特に、ｉｎｖｉｖｏで機能する島を実際に生成するＰＥＣであると考えられている、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ−１を同時発現するものである。したがって、出願人は、内分泌および非内分泌亜集団の相対比をモジュレートするか、変化させるか、シフトすることが、後のｉｎｖｉｖｏ機能に影響を及ぼすかどうかを探索した。

ｈＥＳＣで受容体−リガンドシグナル伝達を解読する以前の努力は、自己複製を促進する成長因子の同定に成功を収め、規定の培地培養条件の開発を可能にした。上記Ｗａｎｇら（２００７）を参照する。Ｗａｎｇらは、ＥＲＢＢ３に結合してＥＲＢＢ２との二量体化を誘導し、その場面でｈＥＳＣの自己複製に影響を及ぼすリガンドとしてヘレグリン−１βを同定した。ＥＲＢＢは受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、ＲＴＫは、成長因子および他の細胞外シグナル伝達分子の受容体として作用する、広く発現される膜貫通タンパク質である。リガンド結合の結果、それらは細胞質テール中の特定の残基でチロシンリン酸化を受け、ＲＴＫ媒介シグナル伝達に関与する他のタンパク質基質の結合のためのシグナル伝達カスケードを始動する。細胞の生存、増殖および運動性の調節を含むいくつかの発達過程におけるＲＴＫ機能、およびがん形成でのそれらの役割は文書で十分に立証されている。ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体は、発達中の胎児のヒト膵臓全体で発現されることも知られていたが、特定のＥＲＢＢ受容体およびそれらのリガンドの特異的役割は知られていない。Ｍａｒｉ−ＡｎｎｅＨｕｏｔａｒｉら（２００２）ＥＲＢＢＳｉｇｎａｌｉｎｇＲｅｇｕｌａｔｅｓＬｉｎｅａｇｅＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＤｅｖｅｌｏｐｉｎｇＰａｎｃｒｅａｔｉｃＩｓｌｅｔＣｅｌｌｓｉｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１４３（１１）：４４３７〜４４４６頁を参照。

上記Ｗａｎｇら（２００７）によって実証される胎児のヒト膵臓での多能性幹細胞の自己複製およびそれらの発現、ならびにヒト胎児膵臓でのＥＲＢＢＲＴＫ発現でのＥＲＢＢＲＴＫシグナル伝達の役割のために、次に出願人は、分化の間のＰＥＣ特定化、または自己複製の促進による増大、または生理的に機能する島ホルモン分泌細胞へのｉｎｖｉｖｏ成熟を促進するいくつかの他の未知の機構を向上させる可能性がある受容体およびリガンドを同定する努力の中で、ｈＥＳＣから導出されたｉｎｖｉｔｒｏの膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）でＲＴＫの潜在的な活性化の調査に取りかかった。以下の変更を除いて実質的に表８に記載のように、分化凝集体の懸濁液でＰＥＣを生成した。

ＲＴＫブロット分析のために、４つのＰＥＣ試料を生成した。ｄｂ−Ｎ５０Ｋ５０Ｅ５０でのＰＥＣ凝集体の「定常状態」試料を、ステージ４の終わり（またはｄ１３）に収集した。「絶食させた」試料は、ｄｂ（ＤＭＥＭ高グルコースまたは０．５×Ｂ−２７補助剤（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加したＤＭＥＭ高グルコース）培地だけ（成長因子なし）を与え、ｄ１３に収集した、ｄ１２ＰＥＣ凝集体を表した。２つの「パルス投与」試料は、ｄ１２にｄｂ培地を与えてそこで培養し、次にｄ１３に、収集する前に１５分間、ｄｂ−Ｋ５０Ｅ５０培地または２％ＦＢＳ含有ｄｂ培地のいずれかを与えた。そのような条件は、ステージ４条件で活性であったＲＴＫの検出、ならびにＫＧＦ、ＥＧＦおよびインスリン（Ｂ２７補助剤に存在する）または血清のパルス投与でどのような応答を導き出すことができるか検出することを意図した。血清パルス投与は、ＰＥＣに存在し、本ステージ４条件で活性化することができるが刺激されないＲＴＫを潜在的に同定する、広域な成長因子刺激を意図した。

ＲＴＫ分析は、事実上前掲のＷａｎｇら（２００７）で前に記載される通りに実施した。簡潔には、ＰｒｏｔｅｏｍｅＰｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ヒトホスホＲＴＫ抗体アレイ（Ｒ＆ＤＳｙｓｙｔｅｍｓ）を、製造業者の指示通りに使用した。１％ＮＰ−４０、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、２．０ｍＭＥＤＴＡ、１．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、および１０μｇ／ｍＬロイペプチンでタンパク質溶解物を調製した。５００μｇの新鮮なタンパク質溶解物を、４２個の抗ＲＴＫ抗体および５つの陰性対照抗体のための重複スポット、ならびに８つの抗ホスホチロシン陽性対照スポットの点在するニトロセルロース膜と一晩インキュベートした（図５Ａ）。配列された抗体はリン酸化および非リン酸化ＲＴＫの細胞外ドメインを捕捉し、結合したホスホＲＴＫは、化学発光を使用して西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされた汎抗ホスホチロシン抗体で検出される。ＲＴＫアレイレイアウトについては図５を、ならびにアレイ中のＲＴＫの一覧については下の表９を参照する。

ＲＴＫブロット（図６Ａ）は、ｈＥＳＣで以前に観察されたものと同様に、インスリン受容体およびＩＧＦ１受容体（それぞれＩＲ、ＩＧＦ１Ｒ）が全ての条件でリン酸化され、活性化されたことを示した。上記Ｗａｎｇら（２００７）参照。ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ１としても知られる）は定常状態条件でリン酸化されたが、それはステージ４培地中のＥＧＦの存在を考慮すると予想されていた。実際、ＥＲＢＢ２の低レベルのリン酸化が、定常状態および絶食条件の両方で検出された。ＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ２の両方のリン酸化は各パルス投与条件で上昇し、リガンドのパルス投与に応答する活性化を検出するアッセイの能力を確認した。リン酸化されたＶＥＧＦＲ３も全ての条件で検出され、パルス投与試料で上昇した。このことは、ＰＥＣが内因性ＶＥＧＦＲ３リガンドを生成することを示唆し、可能な候補はＶＥＧＦ−ＣおよびＤであった。血清パルス投与は、低レベルのＥＲＢＢ３リン酸化を含め、さらなる受容体を活性化するようであった。リン酸化ＥＲＢＢ２／３の検出は、ヘレグリン様ＥＧＦファミリーメンバーがＰＥＣでシグナル伝達を活性化することができることを示唆する。ＴＩＥ−２は２つのアンギオポエチン受容体の１つであり、血清に応答して低いレベルでリン酸化されるようであった。アンギオポエチン１およびアンギオポエチン４はＴｉｅ−２のリガンドを活性化することが公知であるが、アンギオポエチン２およびアンギオポエチン３は、場面依存性競合的アンタゴニストとして機能する。ＨＧＦ受容体（ＨＧＦＲ）も血清パルス投与に応答してリン酸化され、肝細胞成長因子もＰＥＣでシグナル伝達を導き出すことができることを示唆した。最後に、エフリンＢ２ＲＴＫ（ＥＰＨＢ２）の低レベルのリン酸化が検出されたが、エフリン／Ｅｐｈシグナル伝達は膜結合細胞間シグナル伝達系であり、ＰＥＣ分化で容易に活用される可能性はない。興味深いことに、ＥＲＢＢ４はリン酸化されなかった。したがって、ＲＴＫ分析は、ＰＥＣでリン酸化されるか、または異なる条件、例えば血清に応答してリン酸化することができるいくつかの受容体を鮮明にした。これらの結果は、いくつかの可溶性リガンドがＰＥＣでＲＴＫシグナル伝達を導き出すことができ、細胞の増殖、分化および／または特定化に潜在的に影響を与え、したがって、機能する膵臓の島への後のｉｎｖｉｖｏ成熟に潜在的に影響を及ぼすことができることを示唆する。

（実施例６）
ヘレグリンおよびＦＧＦ２成長因子は、ｈＥＳＣ組成物から導出されたＰＥＣに影響を及ぼす
上の実施例５に記載のように特定の条件下で特定のＲＴＫが活性化（またはリン酸化）されることを実証したＲＴＫ分析を考慮し、かつ、少なくともＥＲＢＢ２およびＥＲＢＢ３がＰＥＣで活性化される（ステージ１〜４から１３日間の分化後に）ようであったので、出願人はステージ３および４の細胞に適用したときのヘレグリンの影響を判定しようと努めた。

ヘレグリンおよびＦＧＦを使用して予備研究を実施した。これらの研究の特定のものに、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２が含まれた。これらの予備研究は、１０ｎｇ／ｍＬヘレグリン−１β（Ｗａｎｇら（２００７）に開示されるのと同じ濃度およびヘレグリン異性体）によるステージ１での１日間の多能性幹細胞の処置は、ヘレグリン−１β（Ｈｒｇ１β）のない懸濁培養でのｈＥＳ導出細胞凝集体の凝集体サイズと比較して、懸濁培養でｈＥＳ導出細胞凝集体の細胞凝集体サイズを増加させた。細胞凝集体サイズの増加は、動物での後の移植および機能検査のためにより大きな細胞量をもたらす点で有利である。さらに、Ｈｒｇ１βがステージ３で１０ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬに増加したとき、凝集体ディスクサイズが増加した。この結果は、ＦＧＦ２の不在下での培養と比較して５０ｎｇ／ｍＬの別の成長因子、ＦＧＦ２がステージ３で使用されたときも観察された。細胞凝集体サイズの増加は、ステージ３培養をＦＧＦ２曝露にさらなる日数、例えば２日間と比較して３日間の５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２に曝露させたときも観察された。

表１０は、ステージ３にＨｒｇ１βおよびＦＧＦ２で処置したＰＥＣ細胞のフローサイトメトリー分析の要約を提供する。内分泌細胞はＣＨＧＡ陽性（またはＣＨＧＡ＋）細胞と表し、非内分泌細胞はＣＨＧＡ陰性（またはＣＨＧＡ−）細胞と表す。内分泌物（ＣＨＧＡ＋）および非内分泌細胞（ＣＨＧＡ−）は、他のマーカーに陽性に染色することができ、例えばＰＤＸ１および／またはＮＫＸ６．１に陽性に染色される。試験したマーカーのいずれにも染色しない細胞は、三重陰性細胞または残留細胞（ＣＨＧＡ−／ＮＫＸ６．１−／ＰＤＸ１）と表す。

細胞凝集体サイズの増加がＰＥＣ亜集団に影響を及ぼすかどうか判定するために、ＰＥＣ集団の組成物をフローサイトメトリーによって分析した。細胞を分化するためにＨｒｇ１βおよびＦＧＦ２が使用されなかった対照培養と比較して、ＰＥＣ非内分泌亜集団（ＣＨＧＡ−）は、ステージ３で１０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βの添加により５４．０１％から６１．２％に増加し、ステージ３で５０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βの添加により５４．０１％から６４．２％に増加した。内分泌亜集団（ＣＨＧＡ＋）は、１０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βの処置であまり影響を受けなかったが、５０ｎｇ／ｍＬでよりそうであった。一方、残留細胞の相対レベルは減少し、５０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βでより減少した。したがって、Ｈｒｇ１β処置による細胞凝集体サイズの増加は、内分泌および残留亜集団と比較して非内分泌亜集団の増加に大部分帰された。

ステージ３培養でのＦＧＦ２の影響も同様であったが、Ｈｒｇ１βのそれよりさらに顕著であった。例えば、ＰＥＣ非内分泌亜集団（ＣＨＧＡ−）は、Ｈｒｇ１βでそうしたように増加した。これらの培養でのＦＧＦ２の主要な影響は、内分泌亜集団の実質的な減少であった。ある場合には、これらの細胞は、３日間の処置でほとんど検出不能であった（３２．９％から０．３３％）。したがって、ＦＧＦ２で処置した培養の細胞凝集体サイズの増加は、非内分泌、一部の場合には残留細胞亜集団の増加に大部分帰された（ステージ３の３日間で１３．１％から２２．７％）。

したがって、ヘレグリンおよび／またはＦＧＦ２は、ＰＥＣ集団での細胞の特定化において役割を果たすようである。多能性幹細胞との関連で使用されるとき、ヘレグリン単独で細胞更新において役割を果たすと上記のＷａｎｇら（２００７）が報告したことを考慮すると、これは意外である。

（実施例７）
ヘレグリンによるＩＰＳ導出細胞培養の処置によってＰＥＣのｉｎｖｉｖｏ移植片機能を向上させる方法
ｉＰＥＣを生成するためにｉＰＳＣに適用したときの表８による方法は、動物で頑強なｉｎｖｉｖｏ機能を提供しなかったので、出願人はｉＰＥＣ生成のための他の方法を探索した。表８に示す標準方法の変更には、限定されずに以下のものが含まれる：任意のｉＰＳＣの継代回数の最適化；ＢＭＰシグナル伝達のレベルをモジュレートすること；増大および分化の間のｉＰＳＣ懸濁凝集パラメータをモジュレートすること（例えばせん断力、回転速度等）；成長因子、例えばＷｎｔ、アクチビンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の濃度、使用時期および使用期間の最適化；ならびに、分化プロトコルの１から４の様々なステージでの、細胞の質量、増殖、分化、生存等を向上させるための候補としての他の成長因子による処置（例えばＥＲＢＢリガンド）。ステージ１〜４の間のｉＰＳＣの分化方法をどのように最適化することができるか判断するために、これらの多くの反復実験を単独で、または組合せで検証した。そのような最適化された分化方法は、移植したときに、ｈＥＳＣについて観察および報告されたものに類似の頑強なグルコース応答性インスリン分泌細胞をｉｎｖｉｖｏでもたらしたｉＰＥＣ集団を生成する。下の表１１は、後にｉｎｖｉｖｏでグルコース応答性島細胞に成熟したｉＰＥＣにｉＰＳＣを分化させることが実証された、ヘレグリンの有る無しのベースライン条件を記載する。ベースライン条件は、ヘレグリンがステージ３および４で加えられたこと以外、本明細書の実施例１、２および５ならびに表８に記載されるものに類似していた。３０ｎｇ／ｍＬのΗｒｇ１βを使用したが、１０ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬの濃度、または５０ｎｇ／ｍＬを超える濃度でさえも適する。さらに、実施例２に記載の通り、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙー２７６３２の添加が分化培養で維持された。

ステージ３および４の細胞亜集団に及ぼすヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の添加の影響を判定するために、ｉＰＥＣ集団をフローサイトメトリーによって分析した。表１２は、表１１に示す製剤、ならびにアクチビン濃度を２００ｎｇ／ｍＬに増加させることによって改変した製剤を使用した、様々なｉＰＥＣ集団のフローサイトメトリー分析の要約を提供する。さらに、表１２は、各セットの実験（ヘレグリンの有る無しのベースライン）で用いた一般的な条件、およびｉＰＥＣ集団中の細胞型（内分泌、非内分泌、ＰＤＸ１だけおよび三重陰性または残留性の細胞亜集団）の相対的百分率を示す。表１２は、各実験で生成された細胞のｉｎｖｉｖｏ機能に関するデータも開示する。

特定の条件では、ＰＥＣ（ｈＥＳＣ、Ｅ２３５４）およびｉＰＥＣ（Ｅ２３１４、Ｅ２３４４、Ｅ２３４７）集団中の細胞亜集団の比を変更した。例えば、時には、ベースライン（ヘレグリンなし）条件と比較して、内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞の百分率は減少し、非内分泌細胞（ＣＨＧＡ−／ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋）の百分率は増加した。実験＃２３８０（Ｅ２３８０）で、ヘレグリンがこれらのＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団中の非内分泌細胞と比較した内分泌細胞の割合の変化の原因となるようであったが、ヘレグリンの添加によって内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞のレベルは減少せずに増加した。

ＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団の構成の変化がｉｎｖｉｖｏ機能に影響を及ぼしたかどうかを判定するために、表１２に記載される大部分の実験からのＰＥＣおよびｉＰＥＣ移植片を、実質的に本明細書ならびに上記のＳｃｈｕｌｚら（２０１２）およびＫｒｏｏｎら（２００８）、および上記の米国特許第７，５３４，６０８号；第７，６９５，９６５号；第７，９９３，９２０号および第８，２７８，１０６号を含む出願人の他の特許および非特許出版物に前述の通り、マウスに移植した。簡潔には、ＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団を生分解性の半透過性細胞封入デバイスに全て封入し、そのいくつかは微穿孔を含んでいた。デバイスは出願人によって製造され、２００９年１１月１３日に出願された米国特許第８，２７８，１０６号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＣＥＬＬＳＦＲＯＭＨＵＭＡＮＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＳで詳細に記載される。グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイを、移植の約５６日後から実施した。グルコース投与の前（空腹時）、およびその３０分後および／または６０分後の組合せで血液を収集した。グルコース投与に応答した血清中のヒトＣペプチド濃度を測定することによって、移植片機能を評価した。

血清に放出されるヒトＣペプチドの量は、放出されるインスリンの量の指標となる。ＣペプチドはプロインスリンおよびプレプロインスリンのＡおよびＢ鎖を接続または連結する短い３１アミノ酸ペプチドであり、機能するベータまたはインスリン分泌細胞によって分泌される。上記Ｋｒｏｏｎら（２００８）および他によって前述される通り、ヒトＣペプチドの測定は、移植細胞による新規生成インスリンの放出の評価に適当である。したがって、これらの動物の血清中のヒトＣペプチドのレベルは、成熟したＰＥＣおよびｉＰＥＣ移植片のｉｎｖｉｖｏ機能の尺度である。ヒトＣペプチドは、移植後少なくとも８週までに血清で検出された。追加の数週の移植および絶食により、グルコース刺激Ｃペプチドレベルは増加し、Ｃペプチドのピークレベルはグルコース投与の６０分後から３０分後にシフトし、それは、インスリン細胞の成熟に従う、グルコース投与へのより速い応答の指標となる。機能を示すことができなかったか、不良な健康状態のために屠殺された少数のマウスがいた。しかし、これらのマウスはさもなければ高機能動物を示したコホート中にあり、したがって、移植細胞が分化して機能する能力がないことよりも移植の失敗を示唆した。

図７Ａ〜Ｃは、Ｅ２３４４以外の表１２に示す実験の全てについての、グルコース投与後の血清中のヒトＣペプチドレベルを示す。図７Ａ〜Ｃは、ベースライン対照と比較して、ヘレグリン処置からもたらされた移植片が血清中ヒトＣペプチドのより高いレベルを一般に有したことを示す。例えば、図７Ａで実験２３８０において、ヘレグリンなしで調製したもの（ベースライン）と比較して、ヘレグリン処置からもたらされた移植片の約５倍の増加（グルコース投与の６０分後に９３３ｐＭ：２００ｐＭ）がある。実験２３５４（図７Ｃ）はベースライン対照と比較してヘレグリン処置からもたらされた移植片で血清Ｃペプチドのより高いレベルを示さないので、ヘレグリンは、ｈＥＳＣから生成されるＰＥＣにより少ない影響を及ぼすようである。さらに、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣ（ＣｙＴ２０３）とｉＰＳＣから導出されたｉＰＥＣを比較すると、ｉＰＥＣ移植片は、ＰＥＣ移植片と同等の機能をｉｎｖｉｖｏで有する（例えば、図７Ａおよび図７Ｂ（ｉＰＳＣ移植片）を図７Ｃ（ＣｙＴ２０３ｈＥＳＣ）と比較する）。このように、ｉＰＥＣ移植片は、ＰＥＣ移植片と同じくらい頑強である。さらに、内分泌および非内分泌亜集団で同じシフトを有しなかったＥ２３８０からのｉＰＥＣも優れた機能を示したので、ｉＰＥＣ集団のいくつか（例えばＥ２３１４、Ｅ２３４７およびＥ２３５４）に影響を及ぼすように見えた、内分泌細胞対非内分泌細胞の相対比は、ｉｎｖｉｖｏ機能に影響を及ぼさないようであった（図７Ａ〜Ｃを参照）。

グルコース刺激インスリン分泌を試験することに加えて、宿主動物のベータ細胞を破壊した場合に、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣによって維持される正常血糖と同様の正常血糖をそれらが単独で維持することができるかどうか判定するために、成熟したｉＰＥＣ移植片を試験した。これは、ヒトベータ細胞と比較してマウスベータ細胞に対してより強い細胞毒性を示すベータ細胞毒素、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を使用して、移植されたマウスのベータ細胞を破壊することを必要とした。ＳＴＺ処置の前後に各マウスについて、ランダムな非絶食血中グルコースを測定した。ＳＴＺ処置から１３日目のｉＰＥＣ移植片の外植の結果、高血糖が再開した（血中グルコースの急騰を記す）が、それは内因性マウス膵臓ではなくｉＰＥＣ移植片による血糖症の制御を実証する（図８Ａおよび図８Ｂを参照する）。

さらに、分化のステージ１〜４の間にヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤を提供したときに、相乗効果があるようであった（表１１を参照する）。例えば、ｒｈｏキナーゼ阻害剤なしでステージ３および４でヘレグリンによって処置したｉＰＳＣは、目にみえて劣る細胞量をもたらし、移植を不可能にした。ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の相乗効果のさらなる傍証が、実験のいくつか、例えばＥ２３５６、Ｅ２３８０で明白であったが、そこではｒｈｏキナーゼ阻害剤単独によるベースライン条件は、ｒｈｏキナーゼ阻害剤とヘレグリンによる移植片と同じくらい頑強には機能しなかった（図７ＡおよびＢを参照する）。ヘレグリン単独の添加が提供した細胞量は移植に不十分であり、ｒｈｏキナーゼ阻害剤単独の添加（ベースライン条件）は不良なｉｎｖｉｖｏ機能を有したので、ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤による処置は相加的でなかったようである。このように、ヘレグリンだけまたはｒｈｏキナーゼ阻害剤だけの提供は、２つを組み合わせた合計の影響に実質的に類似していない。すなわち、単独ではいずれもｉｎｖｉｖｏで頑強なグルコース応答性をもたらさないが、組み合わせるとそれらはｈＥＳ導出細胞のそれに類似のグルコース応答性をもたらす。したがって、ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の両方の提供は、それらの組み合わせた影響が各々別々の影響の合計より大きいので相乗的であるようであった。すなわち、ｒｈｏキナーゼ阻害剤およびヘレグリンで処置したｉＰＥＣはｉｎｖｉｖｏで成熟してグルコース刺激インスリン分泌を示し、糖尿病マウスモデルで正常血糖を維持することができた（図７Ａ〜Ｂおよび図８Ａ〜Ｂを参照する）。

ＥＲＢＢ機能性は、リガンド結合、受容体二量体化および受容体輸送を必要とする。各過程での変動性は、受容体およびそれらが制御する下流シグナルの差別的調節をもたらすことができる。例えば、異なるＥＲＢＢリガンドはＥＲＢＢ受容体に異なる親和性で結合し、それによってＥＲＢＢ二量体構成体のパターンおよび動態力学を変化させる。表１３は、リガンドおよび受容体結合複合体の多くの可能な異なる組合せを示す。この系の複雑性に関するレビューは、Ｏｄａら（２００５）Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｐａｔｈｗａｙｍａｐｏｆｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．、１（２００５）およびＬａｚｚａｒａら（２００９）ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｍｏｄｅｌｉｎｇｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｏｎｔｈｅＥＲＢＢｓｙｓｔｅｍｏｆｃｅｌｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ３１５（４）：７１７〜７２５頁によって提供される。

Ｈｕｏｔａｒｉらは、ニューレグリン−４がグルカゴン（アルファ）細胞を代償にしてソマトスタチン（デルタ）細胞の数を増加させることによって内分泌細胞亜集団の相対レベルをモジュレートすることができること、およびニューレグリン−４は、外分泌（例えば、アミラーゼ）細胞対内分泌（例えば、β−インスリン、α−グルカゴン、δ−ソマトスタチン、ＰＰ−膵臓ポリペプチド）細胞の比に影響を及ぼさないことを示唆した。しかし、これらの研究は、Ｅ１２．５日目のマウスから得られたホールマウント器官組織培養の上でニューレグリン−４をインキュベートすることによって実施された。これらのマウス外植細胞集団は、本明細書に記載されるステージ３（例えばＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）および／またはステージ４（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）細胞集団よりさらに分化していた。ニューレグリン−４はＥＲＢＢ４ＲＴＫだけに結合するので、ホールマウントマウス培養の内分泌亜集団だけをこの関係においてニューレグリン−４によってモジュレートすることができる。したがって、Ｈｒｇ１はＥＲＢＢ３に結合してＥＲＢＢ２／３の二量体化を誘導することが既に示されているので、異なるＥＲＢＢリガンド、例えばＨｒｇ１による本明細書に記載のステージ３（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）および／またはステージ４（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）細胞の処置は、Ｈｕｏｔａｒｉにおけるように相対的な内分泌亜集団をモジュレートするとは予想されない。しかし、図６に示すようにＰＥＣでのＥＲＢＢ２および３の低レベルの発現のために、ステージ３および４型の細胞が低いか高いレベルのＥＲＢＢ２および３を発現してＨｒｇ１に結合するかどうかは不明であった。

さらに、異なる場面で、出願人はＨｒｇ１がＥＲＢＢ２／３に結合して、多能性幹細胞の自己複製を促進したことを記載していた（Ｗａｎｇら（２００７）を参照する）。Ｈｒｇ１がステージ３および４の場面で同じ能力で作用することができる可能性はあるが、出願人はＰＥＣの生成のための大部分の細胞増大が多能性幹細胞ステージ（ステージ０）で起こることを以前に記載した。ステージ０の間、ｈＥＳＣは約二（２）週の間成長、継代および増大させられる。したがって、細胞増大または細胞増大をもたらす自己複製のほとんどは、ステージ１〜４の間には起こらない。上記Ｓｃｈｕｌｚら（２０１２）を参照する。さらに、ＥＲＢＢ２／３がステージ３および４の間に存在すると仮定すると、誘導される分化に影響を与えるのと反対に多能性幹細胞と同様の効果（自己複製）をヘレグリンが有すると予想できる可能性がある。次に、機能の差は場面に、すなわち多能性幹細胞対内胚葉または膵臓系列の細胞型に依存するようである。

要約すると、前腸内胚葉（ステージ３）およびＰＤＸ１発現膵臓内胚葉細胞（ステージ３およびステージ４の終わり）へのヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤のｉｎｖｉｔｒｏでの提供は、移植されたときにｉｎｖｉｖｏで成熟してグルコース応答性インスリン分泌細胞に発達するＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団を生成した（図７および８を参照する）。ヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤のそのような使用は、ここで初めて報告された。そのような使用および影響は、特許または非特許文献で前に記載されたものから識別できない。

（実施例８）
アクチビンは膵臓の内胚葉細胞（ＰＥＣ）培養でＮＧＮ３発現および内分泌系列に傾倒した細胞の生成を抑制する
膵臓内胚葉細胞、または「ＰＥＣ」は、２つの異なる亜集団で主に構成される膵臓の細胞集団である：（ｉ）ｉｎｖｉｖｏで発達および成熟してグルコース応答性インスリン分泌ベータ細胞を生成する、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）（以降、「非内分泌（ＣＨＧＡ−）」）；および（ｉｉ）ｉｎｖｉｖｏ成熟の間他の非インスリン分泌細胞または島支持細胞を生成することができる、内分泌系列に傾倒した細胞の亜集団（ＣＨＧＡ＋）（以降、「内分泌物（ＣＨＧＡ＋）」）。非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団はＣＨＧＡ陰性かつＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に支配的に陽性であるが、内分泌系列に傾倒した細胞の亜集団はＣＨＧＡ陽性かつＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に大部分陰性である。非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団は、ｉｎｖｉｖｏでインスリン応答の全身検出（ＣペプチドのためのＥＬＩＳＡによって検定される）を可能にする量でグルコース応答性インスリン分泌ベータ細胞に発達および成熟するのに、約８〜１２週以上を要する。しかし、正常な胚発達の間にｉｎｖｉｖｏでグルコース応答性細胞が発達および成熟するのに８週未満しか要しない。したがって、以下を得ることが今でも望ましい。（１）増加した非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団を有するＰＥＣ集団、および／または（２）ｉｎｖｉｔｒｏでグルコース応答性であり、および／または発達が進行した集団（例えば適切に特定化し、ｉｎｖｉｖｏで類似の膵臓集団について記載のものと一貫した特定のシグネチャーマーカーを有する）である真の内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞集団、および／または（３）ｉｎｖｉｖｏで発達および成熟期間の短縮および／または低減が可能である前駆細胞集団。

第１の目標に関して、非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団が無傷のままであると同時に、内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）への分化がｉｎｖｉｖｏで天然に起こるものと同様に抑制されるＰＥＣ集団を得ることが望ましい。下記の実施例は、そのようなＰＥＣ集団の生成方法を記載する。

正常なｉｎｖｉｖｏ発達の間、転写因子ニューロゲニン−３（ＮＧＮ３）は内分泌細胞発達のマスター調節因子であり、ＮＧＮ３の発現は、例えばｉｎｖｉｖｏでの膵臓内胚葉系列細胞でのＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１の上方制御の後まで起こらないと考えられている。ＲｕｋｓｔａｌｉｓおよびＨａｂｅｎｅｒ（２００９）、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３：Ａｍａｓｔｅｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、Ｉｓｌｅｔｓ１（３）：１７７〜１８４頁を参照。表８により、ステージ３において、ＰＤＸ１発現を誘導するために、レチノイン酸（ＲＡ）またはレチノイド類似体、４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸または「ＴＴＮＰＢ」（または表８で「ＴＴ３」）が使用される。しかし、同時に、レチノイン酸は、内分泌特定化を開始するＮＧＮ３発現を早期に誘導もする。これ故、ステージ３および／またはステージ４の間のＮＧＮ３の抑制、抑圧または阻害は、ＰＥＣで内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）亜集団に傾倒した細胞を最少化するための、および／または発達の後期にｉｎｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎｖｉｖｏで内分泌細胞を得るための１つの手がかりを提供することができる。重要なことに、ＮＧＮ３のいかなるサプレッサー、リプレッサーまたは阻害剤も、同時に非内分泌物（ＣＨＧＡ−）を抑制、抑圧または阻害してはならず、好ましくはＰＥＣのｉｎｖｉｔｒｏ生成の間にこの亜集団を増加させる。

ステージ３および４の間にＮＧＮ３などの遺伝子を抑制するそれらの能力について、様々な成長因子を調査した。１つの候補成長因子は、幹細胞の増大および分化において多様な機能を有するアクチビンであった。例えば、低いレベル（例えば１０ｎｇ／ｍＬ）では、アクチビンは多能性幹細胞の多能性および細胞増殖の維持を助ける。より高いレベル（例えば１００ｎｇ／ｍＬ）では、アクチビンはステージ１の胚体内胚葉生成を担う分化成長因子として作用する（例えば表８を参照）。ＰＥＣ形成の間に内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞の抑圧に対するその影響を試験するために、出願人は標準の接着分化で約５０ｎｇ／ｍＬの中央レベル濃度のアクチビンを先ず試験した。このレベルで、アクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ、ＡＣＴ）はＰＥＣでＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１遺伝子発現を抑制することなく、ＮＧＮ３発現を抑制することができた（図９Ｄ〜Ｅを図９Ａ〜Ｂと比較する）。しかし、ステージ３の間により拡大縮小可能な細胞凝集懸濁培養で同じレベルのアクチビンを使用したときは、全体の細胞量は大幅に減少し、一部の場合には、細胞凝集体は消滅した（図１０の対照とアクチビン処置細胞凝集体を比較する）。５０ｎｇ／ｍＬと同様に２５ｎｇ／ｍＬのアクチビンについて細胞凝集体の類似の減少が観察された（データ示さず）。

これらの結果を考慮して、アクチビンのより低い濃度（例えば５ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬ）をステージ３および４で試験した。図１１に示すように、より低いアクチビン濃度で、細胞凝集体は、対照と比較して細胞の質量および収量を維持することができた（８日目の図１１Ｂ〜Ｃおよび１２日目の図１１Ｂ〜Ｄを８日目および１２日目の図１１Ａの対照と比較する）。したがって、約２５ｎｇ／ｍＬ未満のアクチビンレベルは、細胞の質量および収量を維持するために許容される。ステージ３および４の間に低いレベルのアクチビンが細胞凝集組成物に影響を及ぼしたかどうか判定するために、出願人は次にこれらの細胞培養でフローサイトメトリー分析を実施した。表１４を参照する。表１４は、アクチビンの低いレベルは非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団の生成を減少させないこと、および、処置をステージ３および４の両方で適用するときに、それはこの亜集団を実際に増加させることができることを示す（表１４Ａ５のＳｔｇ（ステージ）３＆４の結果を参照する）。しかし、アクチビンの有り無しで見られる非常に類似した百分率の内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞を考えると、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞への分化がかなりなお誘導されているようである（表１３内分泌の欄を参照）。したがって、ＱＰＣＲで観察されるようにアクチビンはＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２発現を抑制または阻害することができるが、より低いレベル（細胞質量の維持を可能にする）では、ステージ４の終わりに分析するとき、それは内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した亜集団を低減しない。有利には、特にアクチビンをステージ３および４で使用するときに、対照と比較してＰＤＸ１だけおよび三重に陰性の亜集団が低減される。

（実施例９）
アクチビン、ヘレグリンおよびＷＮＴは、ＰＥＣ培養で内分泌系列に傾倒した細胞の生成を抑制する
実施例８は、ステージ３および４の間の中レベルのアクチビン（例えば、５０ｎｇ／ｍＬ）が、ＮＧＮ３発現を抑制または抑圧することができた（図９）が、これらの同じレベルは細胞質量を維持しなかったことを示した。内分泌系列細胞（ＣＨＧＡ＋）の百分率は、対照（表１４、ＣＨＧＡ＋の欄）および前の実施例に記載されるものに実質的に類似のままだったので、より低いレベルのアクチビン（例えば、５および１０ｎｇ／ｍＬ）は細胞質量を維持することができた（図１１）が、ステージ４の間に内分泌の分化を抑圧し続けるのに十分でなかった。したがって、ステージ４までのこの亜集団の分化の連続抑制がなお必要であると思われるので、これらの低いレベルで主にステージ３の間に、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞への分化を抑制することは十分でないようである。上記Ｒｕｋｓｔａｌｉｓら（２００９）を参照する。したがって、同時に非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団の生成に影響を及ぼさず、内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）の分化を抑制しつつ、細胞の減少および収量を阻止することが可能である（すなわち、中から高のアクチビンレベルの影響に対抗する）、さらなる成長因子を探索した。

ヘレグリンがステージ３および４の間に３０ｎｇ／ｍＬでＰＥＣの内分泌（ＣＨＧＡ＋）および非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団の相対レベルをしばしば変化させることを記載する上の実施例を考慮して、出願人は、アクチビンと組み合わせたときにヘレグリンの濃度の低減がＰＥＣ生成にどんな影響を及ぼす可能性があるのかについて試験した。

表８により標準プロトコルを使用して多能性幹細胞を分化させたが、ステージ３の間、２ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬのヘレグリンと一緒にアクチビンが１０ｎｇ／ｍＬまたは２０ｎｇ／ｍＬで含まれ；ステージ４の間には、アクチビンは５ｎｇ／ｍＬに低減され、ヘレグリンは１ｎｇ／ｍＬで２日間、その後１０ｎｇ／ｍＬであった。図１２（１０日目の画像；上パネル）に示すように、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンおよび２ｎｇ／ｍＬのヘレグリンは対照と比較して細胞の多少の減少を示した（図１２ＡおよびＢを比較する、上パネル）。ヘレグリンを同じ２ｎｇ／ｍＬのままにしてアクチビンを２０ｎｇ／ｍＬに増加させることは、細胞減少を悪化させた（図１２ＢおよびＣを比較する、上パネル）。しかし、２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンの場面でヘレグリンを１０ｎｇ／ｍＬに増加させることによって、アクチビンのより高い濃度（２０ｎｇ／ｍＬ）でのより高い細胞減少の阻止が可能であった（図１２ＤおよびＣを比較する、上パネル）。したがって、ヘレグリンレベルが低すぎる場合はかなりの細胞減少が観察されるが、ヘレグリンレベルを上昇させると、例えば少なくとも２０ｎｇ／ｍＬでは、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）亜集団と比較した非内分泌細胞（ＣＨＧＡ−）の百分率の変化がある。

アクチビンおよびヘレグリンの上の組合せで分化の８日目、１０日目および１２日目の遺伝子発現の相対レベルを判定するために、定量的ＰＣＲ分析を実施した（図１３）。実施例８（図９）に示すものと同様に、１０および２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンは、ＮＫＸ６．１発現を減らすことなくＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２（別の内分泌分化マーカー）を抑圧することが可能であった（図１３ＡおよびＢをＣのそれと比較する）。ＮＫＸ６．１発現が高いままであるという事実は、非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団の生成が不変のままであるか影響を受けていないことを示す。しかし、具体的には、２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンおよび１０ｎｇ／ｍＬのヘレグリン、または１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンおよび２ｎｇ／ｍＬのヘレグリンでは、アクチビンが２５ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬ（図１０）で使用されたときに前に観察されたアクチビン依存性の細胞減少が非常に低減された（図１２のＤとＥ、上パネル）。したがって、ヘレグリンは、ステージ３でのアクチビンの使用によって当初観察された細胞減少を効果的に打ち消すようである。かつ、多少のＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２誘導がなお起こるが（すなわち、実施例８、図９の接着ベースの分化でステージ３および４で５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンが使用されたときに観察されたほど強く抑圧されていない）、標準の条件と比較してそれはかなり低減されている（図１３ＡおよびＢの対照条件（Ｃｏｎ）およびＡ２０Ｈ１０条件を比較する）。

２０ｎｇ／ｍＬを超えるアクチビンはマーカーＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２をさらに抑圧し、したがってさらなる内分泌分化を抑圧するが、高い濃度のアクチビンの投与の影響をオフセットするために細胞質量を維持するために、より高いレベルのヘレグリンが次に必要とされよう。上の実施例で観察されるようなヘレグリンのさらにより高いレベルは、ＰＥＣの内分泌（ＣＨＧＡ＋）および非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団の相対的な生成を変化させることができる。さらに、ＮＧＮ３発現の抑圧に及ぼすアクチビンのより高いレベルの影響がなお必要とされた。したがって、出願人は、前部および後部の内胚葉消長を実行することができ、発達の他の態様を制御することができる、それらに限定されないがＷＮＴ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、レチノイン酸（ＲＡまたはＴＴＮＰＢ）、ＢＭＰ、ｈｅｄｇｅｈｏｇ、ＥＧＦ、ＩＧＦ等を含む、追加の成長因子またはモルフォゲンを探索した。

詳細には、ステージ３および／または４でアクチビンおよびヘレグリン分化培地にＷｎｔ３Ａを加えることによって、正規のＷｎｔシグナル伝達経路に影響を及ぼすことを調査した。再び、いかなる組合せも、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団に影響を及ぼさないと同時に、ＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２発現の抑圧を通して観察されるように内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞の分化を抑制し、優れた細胞質量を維持する（すなわち、細胞質量の限定的減少）必要がある。試験したそのような混合物の１つは、ステージ３での１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンおよび２ｎｇ／ｍＬのヘレグリンと一緒の５０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ；ならびに上のように、ステージ４の間の、５ｎｇ／ｍＬのアクチビンと１ｎｇ／ｍＬのヘレグリンを二（２）日間、その後は５ｎｇ／ｍＬのアクチビンおよび１０ｎｇ／ｍＬのヘレグリンであった。これは、同じ濃度のアクチビンおよびヘレグリンだけより大きな細胞（ＰＥＣ）質量をもたらし（図１２ＤおよびＥを比較する、上パネル）、対照よりさらに大きな細胞質量になった（図１２ＡおよびＥを比較する、上パネル）。これらの条件（例えば、ステージ３でのアクチビン、ヘレグリンおよびＷｎｔの組合せ、ならびにステージ４でのアクチビンおよびヘレグリン）の下での細胞凝集体のＱＰＣＲ分析は、ステージ３および４、特に８日目、１０日目および１２日目のＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２発現の減少によって観察されるように（図１３ＡおよびＢ）、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）分化に傾倒した細胞の有意な抑制があることを示した。さらに、ＮＫＸ６．１発現は、８日目に当初抑圧されたが、１０日目および１２日目（ステージ４）までに有意に上昇した（図１３Ｃ）。したがって、非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団の発達はＷｎｔの添加で損なわれず、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞の分化は遅れるか抑制されるようであって、細胞質量の明らかな減少はなかった。

ステージ３の間、アクチビン、ヘレグリンおよびＷｎｔの組合せでＰＥＣ集団の細胞構成を判定するために、ステージ４の後にフローサイトメトリーを実施し、ＰＥＣ細胞構成を表１４に示す。示すように、組み合わせた成長因子（アクチビン、ヘレグリンおよびＷｎｔ、または「ＡＨＷ」）は、標準プロトコルの下での対照細胞培養と比較して、その亜集団の百分率の低下（１５．６対５８．８）によって観察されたように内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞の分化を効果的に低減したが、非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団を増加させた（５８．１対２３．４）（表８）。フローサイトメトリーからのデータは、３つの因子（ＡＨＷ）の組合せが、非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団の生成に影響を及ぼすことなく、ＰＥＣの内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞の分化を一般に遅らすか抑制した、ＱＰＣＲからのデータを支え、一貫している。ｉｎｖｉｔｒｏでのこれらの遺伝子の遅れた発現は、内分泌分化でのＮＧＮ３発現が、非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団でのＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１発現の開始の後に起こる、ｉｎｖｉｖｏでの哺乳動物の膵臓発達でのそれらの開始（または遅れ）と一貫している。さらに、ＰＥＣ質量および収量に障害はなかった。

アクチビン、ヘレグリンおよびＷｎｔの組合せを使用した結果を考慮して、アクチビンを使用することができる濃度範囲を確立するために、ステージ３でアクチビンレベルを再び滴定した。試験したアクチビン濃度は、ステージ３の間、約０、２５、５０、７５および１００ｎｇ／ｍＬで、Ｗｎｔは５０ｎｇ／ｍＬ、ヘレグリンは５ｎｇ／ｍＬであった。ステージ４の間、アクチビンは５ｎｇ／ｍＬに、ヘレグリンは５ｎｇ／ｍＬに低減し、Ｗｎｔは含まれなかった。ステージ４の終わり（１３日目）に細胞を画像化し、図１２に示した（下パネル）。より高いアクチビン濃度、例えば７５〜１００ｎｇ／ｍＬで、細胞減少が再び明らかだった（図１２ＤとＥ、下パネル）。重要なことに、ステージ３でのＷＮＴの組入れは、さもなければ細胞減少のために可能であるよりステージ３で非常により高い濃度のアクチビンの使用を可能にする。

ステージ３でのアクチビン、ヘレグリンおよびＷｎｔとの関連で、ステージ４の間の連続したアクチビンおよびヘレグリンの影響を試験するために、下の３つの条件を使用してヒトＥＳＣを分化させた：（ｉ）標準プロトコル（表８を参照；または表１７のプロトコル番号１）；（ｉｉ）ステージ３でアクチビン（７５ｎｇ／ｍＬ）、ヘレグリン（５ｎｇ／ｍＬ）およびＷｎｔ（５０ｎｇ／ｍＬ）の組合せ、続いて標準のステージ４の因子；ならびに（ｉｉｉ）ステージ３でアクチビン（７５ｎｇ／ｍＬ）、ヘレグリン（５ｎｇ／ｍＬ）およびＷｎｔ（５０ｎｇ／ｍＬ）の組合せ、続いてステージ４の間の追加のアクチビン（５ｎｇ／ｍＬ）およびヘレグリン（５ｎｇ／ｍＬ）、表１７を参照する。全ての３つの条件のためにステージ４の後にフローサイトメトリーを実施し、ＰＥＣ細胞構成を表１７に示す。ステージ３でのＡＨＷは、対照と比較して内分泌系列に傾倒した細胞を減少させ、非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団含有量を増加させ（内分泌系列亜集団に関与する細胞については２１．８対４２．２；非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団については４０．１対２７．６）、ステージ４でのＡＨによる追加処置は、内分泌系列に傾倒した細胞をさらに減少させ、非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団含有量をさらに増加させる（内分泌系列に傾倒した細胞については６．４６対２１．８；非内分泌（ＣＨＧＡ−）父親亜集団については７２．７対４０．１）。

（実施例１０）
アクチビン、ヘレグリンおよびＷＮＴの組合せを用いて生成されたＰＥＣ移植片は、ｉｎｖｉｖｏでグルコース応答機能を向上させた
実施例９は、形態（例えば、分化細胞凝集体の低倍率鏡検像）、ＱＰＣＲおよびフローサイトメトリーデータに基づくと、アクチビン、ヘレグリンおよびＷｎｔの組合せ（「ＡＨＷ」）が、同時に細胞質量または収量に有害作用を有しないか向上させずに、ＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２発現の抑圧によって観察されるように内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）分化に傾倒した細胞を効果的に抑圧し、非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団を維持または増加させることができるようであることを示した。これらの変化がグルコース応答性インスリン分泌細胞の最終的な発達および成熟に影響を及ぼすかどうか判定するために、表８による標準プロトコルまたは表１７のプロトコル番号１から作製されたＰＥＣと一緒に、ＡＨＷ導出ＰＥＣ凝集体を動物に移植した。

具体的には、ステージ３で３つの因子（ＡＨＷ）の組合せ、次にステージ４でアクチビンおよびヘレグリンだけを使用して、ヒト多能性幹細胞を分化させた。対照ＰＥＣは、実質的に表８に従って作製した。図１４に示すように、８、１０、１２および１４日目に細胞凝集体をＱＰＣＲによって分析した。ＮＫＸ６．１発現（図１４Ａ）によって観察されるように対照（Ｃｏｎ）および改変ＡＨＷプロトコルの両方はＰＥＣを生成したが、１４日目（ステージ４の後）にＡＨＷを使用するとより頑強なＮＫＸ６．１発現がある。同時に、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞の分化は、対照プロトコルと比較して、特に８日目にＮＧＮ３発現の抑圧によって観察されるようにＡＨＷプロトコルで高度に抑制された（図１４Ｂ）。

分化の１４日目に両方の方法からのＰＥＣ凝集体を出願人が所有権を有する植込み型半透過性封入デバイスに詰め、実質的に前述の通りにＳＣＩＤベージュマウスに移植した（ＡＨＷおよび対照方法の各々のためにｎ＝５動物、合計ｎ＝１０）。移植から１１週間後に、ＡＨＷプロトコルを用いて生成されたＰＥＣはグルコース投与から１時間（６０分）後にＣペプチドが平均約９００ｐＭであったが、対照ＰＥＣはＣペプチドが平均４００ｐＭであった。ＡＨＷ動物を対照のそれと比較する図１５を参照。具体的には、移植から１１週間後に、ＡＨＷ移植片を有する５匹のマウスのうちの３匹はヒトＣペプチドが平均１２００ｐＭ以上（図１５、動物番号３５１４、３５１６および３５１８）であったが、対照動物のＣペプチドのレベルは有意により低かった。実際、５匹の対照動物のうちのわずか１匹が６００ｐＭ近くのレベルを有した（図１５、動物番号３５２４）。したがって、Ｃペプチドレベルに基づくと、移植から１１週間後に、グルコース刺激の後のヒトＣペプチドのレベルによって測定したときに、ＡＨＷプロトコルはｉｎｖｉｖｏ機能が少なくとも２倍向上したＰＥＣ集団を生成することができた。これは、より速い熟成時間と潜在的に相関する。

移植の１４週間後に、ＡＨＷＰＥＣ移植片は対照の移植片に優る性能を示し続け、ＡＨＷＰＥＣ移植片についてのグルコース投与の３０分後のＣペプチド値が、対照移植片についての投与後６０分の値より高かったので、インスリン分泌応答時間はより速かった（図１６）。具体的には、グルコース投与から６０分後であったが平均約２３００ｐＭであった上位３匹の対照動物と比較して、グルコース投与の３０分後に、ＡＨＷＰＥＣ移植片を有する４匹の動物のうちの３匹は、Ｃペプチドが平均３５００ｐＭ以上であった（図１６）。このデータは、３つの成長因子（ＡＨＷ）の組合せを使用する分化が、試験時点で性能が優れている（つまり、移植されたＡＨＷ導出ＰＥＣ移植片からのより速いグルコース応答性を示す、グルコース投与の３０分後の増加した血清Ｃペプチドレベル）か、標準ＰＥＣプロトコルより潜在的に強力であるＰＥＣ集団を生成することが可能なことを実証する。いかなる１つの理論にも本出願を限定することなく、ＡＨＷＰＥＣ移植片の効力の増加は、ＡＨＷの組合せが（１）ＰＥＣで内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞の分化を遅らせるか抑圧した、（２）ＰＥＣで非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団を増加させた、および（３）優れた細胞質量を維持したという事実に帰されると考えられている。

（実施例１１）
膵臓内分泌細胞のｉｎｖｉｔｒｏ培養
実施例９および１０は、ステージ３および４での内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞の分化の故意の遅れ、抑圧、抑制または阻害を記載する。ｉｎｖｉｔｒｏで発達が進行した内分泌細胞先駆体または内分泌細胞を生成する努力の中で、出願人はステージ５、６および／または７の間に様々な方法を試験した。例えば、出願人は、どの成長因子が単独または併用で、内分泌の分化を刺激または誘導、すなわちＮＧＮ３発現を誘導することが可能であるかについて試験した。

下記の表１７は、ＰＥＣを生成する標準プロトコル（プロトコル番号１）およびＡＨＷＰＥＣを生成するために使用されるプロトコル（プロトコル番号２）と一緒に、内分泌生成のための様々な方法を要約する。しかし、表１７、プロトコル番号３は、特定の日およびステージでのいくつかの成長因子を示し、全ての成長因子を単独あるいは併用で、指示される正確な日／ステージで使用する必要があるとは限らないことを、出願人は試験し、当業者は理解する。したがって、表１７は、出願人によって試験された多くの繰り返し（例えば成長因子、持続時間等）を表す。

以前、２０１２年３月６日に発行された米国特許第８，１２９，１８２号、ＥＮＤＯＣＲＩＮＥＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲ／ＰＲＥＣＵＲＳＯＲＣＥＬＬＳ，ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＨＯＲＭＯＮＥＥＸＰＲＥＳＩＮＧＣＥＬＬＳＡＮＤＭＥＴＨＯＤＳＯＦＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮにおいて、出願人は内分泌前駆体／先駆体の生成のためのガンマセクレターゼ阻害剤の使用を開示した。‘１８２号の特許に記載され、請求されるように、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞分化を内分泌系列にさらに誘導するために、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害する成長因子または作用物質を解明した。これは、ガンマセクレターゼの阻害剤（例えば、ＤＡＰＴまたはＮ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステルおよび関連類似体）の適用によって達成された。ガンマセクレターゼ阻害剤は、Ｎｏｔｃｈ分子の膜内切断をブロックし、それによって活性化されたＮｏｔｃｈ細胞内ドメインの放出を妨げる。ＮＧＮ３発現を誘導するために、例えば、レチノイン酸添加の最終日またはレチノイン酸中止の直後におけるガンマセクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴの２〜４日間の適用が使用された。ここでは、ステージ５において別のガンマセクレターゼ阻害剤ＲＯ４４９２９０９７が使用された。表１７を参照。

表１７に示すように、内分泌系列への分化および／またはその成熟を推進するため、ステージ６および７の間、それらに限定されないが、ＢＭＰ４（「ＢＭＰ」）、ＳｏｎｉｃＨｅｄｇｅｈｏｇ（「ＳＨＨ」）、血小板由来成長因子（「ＰＤＧＦ」）、ＦＧＦ２（「ＦＧＦ」）、レチノイン酸および／またはレチノイン酸類似体、例えばＴＴＮＰＢ（「ＴＴＮＰＢ」）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉまたは「ＩＧＦ１」）および−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩまたは「ＩＧＦ２」）、ビタミンＢ３誘導体、ニコチンアミド（「ＮＣ」）またはこれらの成長因子の１つまたは複数の組合せを含む成長因子の組合せを適用した。そのような組合せの１つは、表１７プロトコル番号３に記載される。

例えば、実質的に実施例１０において上に記載のようにＡＨＷプロトコルから作製されたＰＥＣは、表１７プロトコル番号３に従って、一般的に２日間、ステージ５（１３日目および１４日目）において１μＭのガンマセクレターゼ阻害剤（ＲＯ４９２９０９７（「Ｒ０１」）でさらに処置した。このステージ５の処置は、ＮＧＮ３発現の誘導およびその後の内分泌分化をもたらす。さらに、ＮＧＮ３発現または内分泌分化を誘導するために、ステージ５および６の間にニコチンアミドが含まれた。ＮＧＮ３遺伝子発現は、ステージ４の後（１３日目の培養）、ステージ５の後（１５日目の培養）およびステージ６の２日後に、ｍＲＮＡのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ検出によって分析した。図１７に示すように、ガンマセクレターゼ阻害剤は、ステージ４の終わり（１３日目）のＮＧＮ３の低レベル発現と比較して、１５日目のステージ５の後にＮＧＮ３発現を強く誘導した。１５日目（ステージ６の初日）のガンマセクレターゼ阻害剤の除去の後、１７日目に観察されるようにＮＧＮ３発現は減少する（図１７）。ステージ５の間のＮＧＮ３発現のこの一過性の増加は、ｉｎｖｉｖｏでのベータ細胞発達の間に観察されるその一過性発現と一貫している。上記Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら（２００７）を参照する。

ステージのいずれの全日数も変化させることができるし、実際変化し、例えばステージ５、６および／または７は日数を短くすることができるか、長くすることができる。これは、より初期のステージ１、２、３および４にも同様に適用される。

さらに、細胞生存および細胞質量および収量を促進するために、ステージ１、２、３、４、５、６および７のいずれかの間にｒｈｏキナーゼ阻害剤を連続的または断続的に分化培地に加えてもよい。ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、例えばステージ１、２および４で、例えば細胞質量および収量の維持によって人工多能性幹細胞の分化を促進するようである。

さらに、約２０日目に（すなわち表１７のプロトコル番号３のステージ６と７の間の接続部）、細胞凝集体を解離および再凝集させることができる。この解離および再凝集は特定の細胞亜集団を取り除き、こうして主に内分泌および／または内分泌前駆体／先駆体／前駆（ＣＨＧＡ＋）細胞集団を残した。この物理的操作は内分泌集団の分析も容易にし、必要に応じて精製ステップを構成する。詳細については実施例１４を参照する。

さらに、ステージ６から開始してステージ７まで、必要に応じて、細胞凝集体を維持し、および／または内分泌細胞が細胞凝集体から移動するのを防ぐのを助けるために、非常に低い濃度、例えば約０．０５％のマトリゲルを使用してもよい。マトリゲルまたは任意の他の複合細胞基質の使用は、特定の細胞凝集体自体（例えば下記のようにＰＥＣ凝集体、内分泌前駆／先駆細胞凝集体等）、および潜在的には細胞凝集体が導出したＰＳＣ系に依存してもよい。実質的に同様の機能を実行するために、他の複合基質または規定の基質、例えば血清、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンおよび他の細胞外基質タンパク質を使用することができる可能性がある。詳細については実施例１４を参照する。

ステージ６または７で、またはステージ６の間、例えば１６日目、１７日目または１８日目から開始して、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）１および／または２（ＩＧＦ１またはＩＧＦ２）を添加してもよい。表１７に従って実質的に上記のように多能性幹細胞を分化させたが、ステージ６の間、特に１７日目に約３日間に、５０もしくは２００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、または２５もしくは１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ２を細胞培養に加えた。ステージ６の後（２０日目）、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇを使用してｍＲＮＡについて細胞凝集体を分析した。これらの予備研究は、ＩＧＦ２がＩＧＦ１よりＩＮＳ発現を誘導する能力が高い（データ示さず）ことを示したが、より長い処置はＩＧＦ２だけまたはＩＧＦ１または２つの組合せからより頑強な影響を生成することができた。

表１７は特定の濃度での様々な成長因子の使用を記載するが、本発明は、本明細書に記載される特定の濃度に限定されず、その理由は、成長因子濃度の改変は当技術分野で標準であり、実際、少なくともアクチビンおよびヘレグリンレベルの変化ならびに細胞の分化および構成に及ぼすそれらの影響により上の実施例に記載されていることを当業技術者が認めるからである。本明細書の改変には、限定されずに、５、１０、２０、５０から１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン；５、２５、５０から７５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ；２、５、１０、３０ｎｇ／ｍＬのヘレグリン；１０から２００ｎｇ／ｍＬのｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）；１０から１００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ；１０から２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ；２から２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２；ならびに２５から２００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１および／またはＩＧＦ２が含まれる。さらに、これらの因子の組合せのいずれも使用することができ、それらが使用されるステージまたは期間は、記載される本発明から逸脱せずにかなりの程度でさえ変化させることができる。

（実施例１２）
膵臓内分泌細胞のｉｎｖｉｖｏ機能
今日まで、ＰＳＣからｉｎｖｉｔｒｏで生成された内分泌細胞の濃縮集団は、ｉｎｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌ベータ細胞を生成していない。したがって、出願人は、表１７による、上の実施例１１で記載される上の方法が、ｉｎｖｉｖｏでグルコース応答性である最初のｉｎｖｉｔｒｏ内分泌細胞を生成することができるかどうか試験した。

ステージ１〜５について表１７のプロトコル番号３に従ってヒト多能性幹細胞を分化させたが、ステージ６および７では、Ｂ−２７補助剤を有する基礎ＤＭＥＭ培地に加えてＦＢＳ、マトリゲルおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤だけを使用した。ステージ５（ｄ１３）および６（ｄ１５）の最初、ならびにステージ６（ｄ２０）および７（ｄ２６）の最後の時点で、ＲＮＡ発現をＮａｎｏｓｔｒｉｎｇによって分析した。図１８Ａ〜Ｄおよび１９Ａ〜Ｄは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＳＯＸ９およびＰＴＦ１Ａを含む非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団マーカー、ならびにインスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）およびグレリン（ＧＨＲＬ）を含む内分泌細胞マーカーの相対的なｍＲＮＡ発現レベルを示す。ステージ４の終わりに（１３日目）、ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＮＫＸ６．１およびＰＴＦ１Ａは全て高度に発現された。内分泌の分化または誘導が起こるに従い（１５日目）、これらのマーカーは全てステージ５の間に低減する。さらに、ステージ６の終わり（２０日目）またはステージ７の開始までに、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１およびＰＴＦ１ＡのｍＲＮＡレベルは減少していたが、同時にＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬおよびＳＳＴのｍＲＮＡレベルは増加していた（２０日目の図１８Ａ〜Ｄおよび図１９Ａ〜Ｄを比較する）。具体的には、ステージ５および６を通してのＰＤＸ１およびＰＦＴ１Ａ発現の減少、ならびにＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬおよびＳＳＴの相対的なｍＲＮＡ発現の劇的な付随する増加は、ステージ３および４でのアクチビン、ヘレグリンおよびＷｎｔの組合せ（ＡＨＷ）、特にアクチビンに起因する。すなわち、ステージ３および４へのアクチビンの組入れは、ステージ３および４で内分泌分化を抑圧したが、ステージ５でのガンマセクレターゼはステージ５、６および７で内分泌分化を誘導した。示したより早い時点と比較したときの２０日目および２６日目（ステージ６および７）のＮＫＸ６．１発現の類似のレベルは、このマーカーが膵臓内分泌細胞ならびに非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団で発現されることと一貫している。したがって、後のステージ（例えばステージ５、６および７）では、細胞は内分泌分化の方に誘導されたが、より早いステージのステージ３および４ではそれらは内分泌分化が抑制された。

ステージ６の後、細胞凝集体は解離され、再凝集されたが（下の実施例１４でさらに詳細に記載される）、そのことは特定のＰＥＣ亜集団、例えば非内分泌（ＣＨＧＡ−）細胞を含む、ステージ３および４の間に作製される一部の細胞型を除去した。非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団および／または外分泌および／または外分泌前駆細胞および／または管および／または管前駆細胞の除去は、再凝集の後のＳＯＸ９およびＰＴＦ１Ａの劇的な減少によって確かめることができる（図１８、２０日目と２６日目を比較する）。ステージ７の後、２６日目に内分泌細胞をデバイスに詰め、実質的にＳＣＩＤベージュマウスへの移植（または埋め込み）について前述の通りに、２７日目にＲＡＧ２マウスに移植した。図２０は、絶食およびグルコース投与またはチャレンジから１時間（６０分）後の、血清中のヒトＣペプチドレベルを示す。ヒト血清Ｃペプチドによって観察されるように、移植後１０週時に、全ての５匹の動物はインスリンを生成していた。移植後１５週時に（図２１）、移植後１０週時のレベルと比較して全ての動物はインスリン生成レベルの増加を示し、５匹の動物のうちの２匹はＣペプチドが平均１５００ｐＭであって、それはｉｎｖｉｖｏでの頑強なグルコース応答性の証拠である。

２６日目にデバイスに内分泌細胞を詰める前に、例えば、いかなる残りの非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団からではなく、ステージ６および７からの移植内分泌細胞から機能的ベータ細胞が発達し、成熟し、生じたことを検証するために、試料をとった。内分泌および非内分泌マーカーの両方を使用する免疫細胞化学を、試料で実施した。ＤＡＰＩ（図２２Ａ）、ＮＫＸ６．１およびクロモグラニンＡ（図２２Ｂ）を使用して、２６日目の試料の凍結切片を抗体で同時染色した（図２２Ｂ）。大多数のＮＫＸ６．１陽性（赤色）細胞は、内分泌マーカークロモグラニン（ＣＨＧＡ＋）に対しても陽性に染色されることは明らかである。したがって、ＣＨＧＡ−／ＮＫＸ６．１＋細胞の欠如が示すように、非内分泌多分化能膵臓前駆細胞は、これらの内分泌細胞調製物中にはいかなる有意な数でも存在しないように見える。

これらの同じ内分泌細胞凝集体の試料も、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１について同時染色した（図２３Ａ〜Ｂ）。図２３Ａ〜Ｂは、大部分のインスリン発現細胞もＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を発現することを示した。ＰＳＣからのｉｎｖｉｔｒｏ導出インスリン発現細胞の以前に公表された報告が、ＮＫＸ６．１および／またはＰＤＸ１を同時発現しなかったことを考慮すると、これは意外な結果である。ＧｅｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＪｉａｎｇら（２００７）への米国特許第７，０３３，８３１号および関連出願、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｉｓｌｅｔ−ｌｉｋｅｃｌｕｓｔｅｒｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２００７Ａｕｇ；２５（８）：１９４０〜５３頁を参照。Ｅｐｕｂ２００７Ｍａｙ１７。

総合すると、このデータは、初めて、ｉｎｖｉｔｒｏのＰＳＣ導出内分泌細胞培養が、（１）ｉｎｖｉｔｒｏでＩＮＳ、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を同時発現することができ、ｉｎｖｉｔｒｏでグルコース応答性のようであり；かつ（２）ｉｎｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞を生成することができるという動かぬ証拠を提供する。

（実施例１３）
レチノイン酸、ニコチンアミドおよびＢＭＰは、内分泌細胞でＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１の発現を増加させる
成熟したベータ細胞の特質は、ＰＥＣの非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団で見られるレベルに対して、個々の細胞レベルでそれらがＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を上方制御するということである。実施例１１および１２は、大部分の細胞がＰＥＣの非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団で観察されるものに類似したＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１の発現レベルを有する、内分泌細胞生成を記載した。したがって、インスリン陽性の内分泌細胞で少なくともこれらの２つのマーカーの発現を特異的に増強する成長因子を同定することが望ましい。

２つの候補因子には、ＴＴＮＰＢ、レチノイン酸またはレチノイド類似体、およびＢＭＰ４、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの一部である骨形成タンパク質ファミリーのメンバーを含む。ＴＴＮＰＢおよびＢＭＰ４は、ステージ６および７で様々な組合せで、および様々な濃度で試験されたが、一般的にはそれぞれ０．５ｎＭおよび１０ｎｇ／ｍＬであった。図２４のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇｍＲＮＡ分析によって示すように、ステージ６および７、もしくはステージ７だけでのＢＭＰ、またはＴＴＮＰＢと組み合わせたＢＭＰは、インスリンおよびＰＤＸ１の発現を同時に増加させることができる（図２４ＡとＣ）。対照的に、これらの同じステージ（ステージ６と７およびステージ７だけ）での単独のＴＴＮＰＢは、単独のＢＭＰと比較してＰＤＸ１発現を増加させないようであり、わずかにＰＤＸ１発現を減少させるようでさえある（図２４Ｃの４欄および５欄を２欄および３欄と比較する）。全ての条件（ＢＭＰだけ、ＴＴＮＰＢだけ、ＢＭＰおよびＴＴＮＰＢの組合せ、各処置はステージ６と７、またはステージ７だけ）下で、ＮＫＸ６．１発現は比較的安定しているので、ＮＫＸ６．１発現に及ぼすＢＭＰの影響は不明瞭である。ＢＭＰ特異性のさらなる指標として、ＢＭＰは、ＢＭＰ４を含むＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーによって調節されることが知られている分化阻害剤（ＩＤ）遺伝子発現（例えば、ＩＤ１）を上方制御することも観察された（図２４Ｄ）。したがって、いかなる１つの理論にも本出願を限定することなく、ＢＭＰはＰＤＸ１およびＩＤ１の上方制御を選択的に誘導する因子のようである。

これらのマーカーのあるものが任意の１つの細胞で同時発現されたかどうか判定するために、内分泌細胞凝集体を分化の２７日目（ステージ７の後）に固定し、凍結切片を調製して、Ｃペプチド、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１のために免疫細胞化学（ＩＣＣ）によって染色した。図２５〜２８を参照する。ここでは、ＩＮＳによる染色の代わりに、細胞をＣペプチド、プロインスリンの中央断片に対する抗体で染色し、したがって、この染色はインスリン発現細胞の指標ともなる（図２５）。ＩＣＣの結果は上のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇのデータと一貫していた、すなわち、ステージ６および７、またはステージ７だけでの単独の、またはＴＴＮＰＢと組み合わせたＢＭＰは、インスリン（Ｃペプチド）発現細胞でＰＤＸ１発現を誘導することが可能であった（図２５および２６）。

ｍＲＮＡのデータが、単独または組み合わせたＢＭＰおよびＴＴＮＰＢがＮＫＸ６．１発現にほとんど影響を及ぼさなかったことを示唆したという事実にもかかわらず、ＩＣＣ研究は、細胞レベルにおいてＮＫＸ６．１およびＣペプチド（またはインスリン）発現細胞の同時発現がかなり頑強であること（図２７および２８）、すなわち、ＮＫＸ６．１染色が明るく、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団で観察されるものよりしばしば明るくもあることを示した。したがって、ＮＫＸ６．１発現は、大部分Ｃペプチド（またはインスリン）発現細胞と同時発現されるようである。合わせたｍＲＮＡ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）およびタンパク質（ＩＣＣ）データは、特定の場面では、細胞型を初期に特徴付けるためにただ１つの方法論を使用することに限界がある可能性も実証する。したがって、ＩＣＣデータは、ステージ６および７またはステージ７だけでの単独またはＴＴＮＰＢと組み合わせたＢＭＰが、Ｃペプチド（またはインスリン）発現細胞でＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１のレベルを増加させることが可能であったことを実証した（図２７および２８）。２つの因子を組み合わせて使用するときに最も強力な影響が観察されるが、ＢＭＰ単独でも同じことが可能である。ＴＴＮＰＢも、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を独立して調節している可能性がある。例えば、ステージ７の間でより少ない日数、例えば２、３または４日間のＴＴＮＰＢ処置は、ＢＭＰの存在なしでＮＫＸ６．１の発現を誘導することができた（データ示さず）。したがって、これらの成長因子の使用は、特にＴＴＮＰＢについては、時間依存性である可能性がある。

特にニコチンアミドに関して、図２９は、ステージ６の培養条件でのニコチンアミドが、ＩＮＳを増加させ、ＧＣＧ発現を減少させて、ＩＮＳ／ＧＣＧ発現比の３倍の増加をもたらすことを示す。ニコチンアミドの機能は不明であるが、ＰＡＲＰ−１、ポリ（アデノシン三リン酸［ＡＤＰ］−リボース）ポリメラーゼ−１の阻害によって、およびＮＡＤ＋消失を阻止することによって、ストレプトゾトシン処置から生じる齧歯動物でのベータ細胞減少をニコチンアミドが阻止すると報告されている。Ｍａｓｉｅｌｌｏ、Ｐ．ら（１９９８）ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＮＩＤＤＭＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａＮｅｗＭｏｄｅｌｉｎＡｄｕｌｔＲａｔｓＡｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄＳｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎａｎｄＮｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４７（２）：２２４〜９頁を参照。ニコチンアミドは、ヒト胎児の島で内分泌の分化およびインスリン含有量を増加させることもできる。ＯｔｏｎｋｏｓｋｉＴ．ら（１９９３）、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅｉｓａｐｏｔｅｎｔｉｎｄｕｃｅｒｏｆｅｎｄｏｃｒｉｎｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｈｕｍａｎｆｅｔａｌｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ９２：１４５９〜１４６６頁を参照。

さらに、成熟したベータ細胞は高レベルのＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１をｉｎｖｉｖｏで発現し、高レベルのＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１は適切な機能のために必要である。したがって、ＢＭＰおよびＴＴＮＰＢと組み合わせたＢＭＰは、インスリン陽性細胞で両方のマーカーの高い発現を誘導することによって、ｉｎｖｉｖｏだけでなく潜在的にｉｎｖｉｔｒｏでもグルコース応答性である内分泌細胞を作製することが可能であることを初めて示す。

上記のように、ステージ６および７のための日数は厳格でなく、短くするか、または長くすることさえでき、特に、本明細書に記載されるのと、および表１７によるのと実質的に同じ成長因子を使用する場合には、それぞれステージ６および７のための５日間および１０日間は容易に操作することができるので、当業技術者はこれを認識する。

（実施例１４）
マトリゲルは、単独でおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤と一緒に、ＰＥＣおよび内分泌細胞凝集体の細胞接着を向上させる
上の実施例１１では、細胞凝集体は、ステージ６と７の間で解離および再凝集または再結合された。実質的に上記Ｓｃｈｕｌｚらに記載されるように、解離は２０日目または２０日目頃にＡｃｃｕｔａｓｅを使用して実施し、回転培養で再凝集させた。上記Ｋｅｌｌｙら（２０１１）により詳細に記載されるように、再凝集は、特定のＰＥＣ亜集団、例えば任意の残りの非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団ならびに他の非内分泌細胞を取り除く。内分泌細胞は互いに親和性を有するが、この相互作用はｉｎｖｉｔｒｏで比較的弱く、ステージ６／７での再凝集細胞でさえゆるく結合しているだけだった。したがって、内分泌細胞凝集体の中で細胞間相互作用を増加させるそれらの能力について様々な因子および作用物質を試験するための研究を実施した。

Ｙ−２７６３２、ｒｈｏキナーゼ阻害剤、および希釈マトリゲル（０．０５ｖ／ｖ％）の添加は、再凝集内分泌細胞凝集体のよりタイトな細胞結合を促進することができることが発見された。Ｙ−２７６３２とマトリゲルの組合せは、いずれかの構成要素単独より、少なくとも例えば細胞凝集体の細胞間相互作用を増加させた。

２０日目に実質的に実施例１２に記載されているように生成された分化培養を、Ａｃｃｕｔａｓｅで解離し、５％ＦＢＳ（ＦＢＳのより低い濃度、すなわち２％または１％も有効である）およびＤＮアーゼによってｄｂで再凝集させた。Ｙ−２７６３２は再凝集培地に含まれなかったが、その理由は、そうすることが新たに形成された凝集体への非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団ならびに他の非内分泌細胞の組込みをもたらすからである。次の日とその後の毎日、細胞凝集体をＹ−２７６３２またはマトリゲルまたは両構成要素で処置した。図３０に示す通り、凝集から１、２および３日後に立体顕微鏡画像をとった。図３０は、マトリゲル、Ｙ−２７６３２およびｄｂ−ＦＢＳの組合せが最も有効だったことを実証する。この組合せは、ｄｂ−ＦＢＳだけ、またはｄｂ−ＦＢＳおよびマトリゲル、またはｄｂ−ＦＢＳおよびＹ−２７６３２の使用より有効であった（図３０Ａ〜Ｄを比較する）。組み合わせた作用物質を使用した細胞凝集体は、全ての他の試料より形態学的にタイトであるようだった（図３０Ｄ）。作用物質が細胞間接触および細胞と基質の間の相互作用を向上させる可能性があるが、ＦＢＳがなく、マトリゲルおよびＹ−２７６３２だけでの後の実験は、同じ結果を提供した。これらのよりタイトな細胞凝集体は、形態学的により器官組織様に見える。これは有利であり、その結果、回転培養、デバイスへの詰め込み、移植のための処理からくるストレスに細胞凝集体はより耐えることができ、向上したｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでの発達ならびに成熟等を有する。

（実施例１５）
いかなるノギンも、限定的内分泌細胞含有量で、およびＰＥＣ集団の分別または精製の必要なしに、非内分泌多分化能前駆体亜集団が濃縮されたＰＥＣを生成しない
上記のように、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ−）が高度に濃縮されているが、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞が比較的豊富であるＰＥＣ集団（ステージ４）の生成が望ましい。そのような細胞集団は、例えば、内分泌系列細胞へのそれらの分化を特異的に誘導する分子または条件についてスクリーニングするのに有益である可能性がある。この活性を有する化合物は、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏでの膵臓ベータ細胞を含む内分泌細胞を生成するための再生医療適用に有益である可能性がある。細胞死および他の理由のために、より複雑な細胞混合物からの特定の細胞集団の分別および精製は効率の減少を伴うことが知られているので、効率的な誘導分化だけを通し、したがって精製ステップを必要とせずに、所望の表現型のために高度に濃縮された細胞集団を作製することができることが有益である。

実質的にステージ１〜４のために表１７のプロトコル番号１で、および上記Ｓｃｈｕｌｚら（２０１２）に上記の通りに、未分化ヒトＥＳＣを増殖、分化させたが、ステージ３、４の三（３）日間に以下の異なる条件を比較した：（ｉ）全３日間に０ノギン（「ノギンなし」）；（ｉｉ）５０ｎｇ／ｍＬのノギンを１日、および追加のノギンなしが２日間；（ｉｉｉ）５０ｎｇ／ｍＬのノギンを２日、および追加のノギンなしが１日間；および（ｉｖ）５０ｎｇ／ｍＬのノギンを３日間。ステージ３の後、これらの条件（ｉ）から（ｉｖ）の各々は、追加のノギンのない、表８および表１７による標準のステージ４分化培地カクテルを次に受けた。ステージ４の後のフローサイトメトリー分析は、ノギンなしが、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞が５％未満の、９０％を超える非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団を生成することを実証した。表１７を参照する。さらに、ノギン処置の各追加日では、より少ない非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団が生成された（ノギンなしの９０．６％と３日間のノギン処置の６４．６％を比較する）。反対に、ノギン処置の各追加日は、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞の生成レベルを増加させた。

ステージ４の後（１２日目）の細胞培養のＱＰＣＲ分析は、ノギン処置の各追加日で、ＮＫＸ２．２およびＩＮＳを含む内分泌系列マーカー発現のレベルの増加があったことを示し（図３１ＢおよびＤ）、そのことは表１８のフローサイトメトリーからのデータと一貫している。対照的に、ＮＫＸ６．１（およびＰＤＸ１）を含む非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団のためのマーカー遺伝子の発現レベルは、ノギン処置のいかなる期間でも比較的豊富であった。

（実施例１６）
ステージ７で膵臓系列の遺伝子の発現をモジュレートする作用物質
次に、膵臓系列遺伝子の発現の何らかの追加のモジュレーターがあるかどうかについて評価した。実施例１３および１４に記載されるものに実質的に類似の分化方法を実施した（すなわち、ステージ３でＡＨＷ、ステージ４でＡＨ、ステージ５でガンマセクレターゼおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤、ステージ６および７でマトリゲルおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤）。さらに、ステージ７の間、３０〜３５日目に、ＢＭＰ、ノギン、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＥＧＦ、Ｈｒｇ、ＨＧＦ、ＳＣＦまたはＴＴＮＰＢを含む他の作用物質を、遺伝子発現をモジュレートするそれらの能力について試験した。延長ステージ７の終わり（ｄ３５）に、ＲＮＡ発現をＮａｎｏｓｔｒｉｎｇによって分析した。図３２Ａ〜Ｃは、ＢＭＰがＩＮＳ、ＰＤＸ１およびＩＤ１の発現を増加させることを示し、このことは図２４に示し、実施例１３で詳述されるデータと一貫している。ＢＭＰは、ＧＨＲＬ発現を減少させもした。ＦＧＦ１（酸性ＦＧＦ）は、ＧＣＧおよびＳＳＴを上方制御した。驚くべきことに、ステージ７の３０〜３５日目のＦＧＦ２はＳＳＴ発現の有意な増加をもたらし、他のホルモン遺伝子の阻害または抑制が付随した（例えば、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ；図３２Ｂ、ＳＳＴパネル）。

これらの研究は、特定の作用物質が遺伝子発現を、したがって細胞培養分化およびその結果としてのこれらのより分化した／傾倒した細胞の細胞型をなおモジュレートし、影響を及ぼすことができることを実証する。

（実施例１７）
細胞培養の解離および再凝集は、非内分泌（ＣＨＧＡ−）を低減し、適切に特定化された内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団を増加させる
細胞培養の解離および再凝集は、再凝集するときに細胞の特定の亜集団の存在を効果的に減少または低減することができ、結果として、再凝集は、細胞の特定の亜集団を濃縮するために使用することができることが前に記された。もしあるならば、それらの濃縮された亜集団、この場合には内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団を有する再凝集細胞培養の影響を判定するように、研究が設計された（実施例１４を参照する）。

分化の方法は、ステージ７（ｄ２０）の前のｈＥＳ導出細胞凝集体の解離および再凝集を含む実施例１４に記載されるものに実質的に類似していた。図３３Ａ〜Ｃは、ＰＴＦ１Ａ、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を含むマーカーの組合せを使用したＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析によって実証されるように、再凝集細胞培養において非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団は有意に減少していた（図３３Ａ）ことを実証するステージ７後（約ｄ２９）のＲＮＡ分析を示す。図３３Ｂは、再凝集が、ＩＮＳ、ＧＣＧ、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）、ＧＨＲＬ、溶質担体ファミリー３０のメンバー８（ＳＬＣ３０Ａ８）、グルコース−６−ホスファターゼ２（Ｇ６ＰＣ２）、ホルモン前駆体コンベルターゼ１（ＰＣＳＫ１）およびグルコキナーゼ（ＧＣＫ）を含む内分泌および膵臓の島細胞マーカーの増加をもたらしたことも示す。

単独で、これらのマーカーは他の細胞型で観察され、例えば、ＰＴＦ１Ａは外分泌細胞、ＳＯＸ９は管細胞、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１はベータ細胞でも発現される。したがって、出願人は、任意の１つのマーカー発現の有意性を判定する参照として、様々なＰＥ、内分泌物および島マーカーからデータを得た。さらに、４つのＰＥおよび非内分泌（ＣＨＧＡ−）マーカーを分析した（ＰＴＦ１Ａ、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１）が、ＰＴＦ１ＡおよびＳＯＸ９亜集団だけがステージ７の終わり（約ｄ２５、ｄ２６、ｄ２７、ｄ２８、ｄ２９、ｄ３０およびそれ以上）の再凝集細胞培養から減少していた。対照的に、ベータ細胞および膵臓内分泌物でも観察されるＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１発現は、ステージ７の後にも高いままだった。図３３Ａを参照する。

同様に、ＳＬＣ３０Ａ８、Ｇ６ＰＣ２、ＰＣＳＫ１およびＧＣＫを含む他の内分泌（例えばベータおよびアルファ細胞）マーカーが、解離および再凝集されなかった（または「ｎｏ−ｒｅａｇｇ」）培養と比較してｄ２０再凝集細胞培養でより高い発現レベルで観察された。図３３Ｃを参照する。例えば、ＳＬＣ３０Ａ８はインスリン分泌に関係がある亜鉛輸送体であり、ＳＬ３０Ａ８の特定の対立遺伝子は２型糖尿病の発症の危険を増加させることができ；グルコース−６−ホスファターゼ２（Ｇ６ＰＣ２）は膵島で見出される酵素であり；ホルモン前駆体コンベルターゼ１（ＰＣＳＫ１）は、ＰＣＳＫ２とともに、膵島でプロインスリンをプロセシングしてインスリンにし；最後に、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）は、グルコース−６−リン酸へのグルコースのリン酸化を促進し、肝臓、膵臓、腸および脳の細胞で発現され、それは、グルコースセンサーとして作用するか、食後または絶食時に起こるようなグルコースレベルの上下に応答して代謝または細胞機能のシフトを誘発することによって、炭水化物代謝を調節する。ＧＣＫの突然変異は、糖尿病または低血糖の異常な形を引き起こすことができる。ステージ７でのこれらのマーカーの発現の増加は、細胞培養の解離および再再凝集が非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団を効果的に減少または低減させ、内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団を増加させることを示す。したがって、出願人は今や、ｉｎｖｉｖｏ機能のためにｉｎｖｉｔｒｏで適切に特定化された内分泌細胞を生成する方法をさらに洗練した。

ステージ１〜７細胞培養のフローサイトメトリー分析は、上のような細胞培養の解離および再凝集が、全内分泌亜集団を増加させ（ＣＨＧＡ＋細胞の濃縮）、細胞の非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団またはＰＥ亜集団が付随して減少することも確認する。下記の表１９を参照する。

今日まで、機能的ベータ細胞はｉｎｖｉｖｏ移植ステップを通して分化することができるだけであり、ｉｎｖｉｔｒｏで完全な真実の機能的ベータ細胞はまだ記載されていない。Ｚｈｏｕら（２００８）、Ｎａｔｕｒｅ４５５、６２７〜６３２頁を参照する。したがって、初めて、出願人は１０％未満の非内分泌細胞（ＣＨＩＧＡ−）を有し、適切に特定化された、内分泌細胞（ＣＨＧＡ＋）の５０％を超えるｉｎｖｉｔｒｏ細胞集団を実証した。さらに、そのような細胞は、ｉｎｖｉｖｏで真実の機能的ベータ細胞および島に発達および成熟することができる；下記の実施例１８を参照する。

（実施例１８）
内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団からのｉｎｖｉｖｏインスリン生成
実施例１７への後続研究として、もしあるならば、それらの濃縮された内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団を有する再凝集細胞培養のｉｎｖｉｖｏ影響を判定するように、研究が設計された。

上の実施例１２〜１４および１６と上記Ｓｃｈｕｌｚら（２０１２）に記載のものと実質的に同様に、ヒト多能性幹細胞培養を増殖、分化させたが、ステージ７の開始の頃（約ｄ２０）に、培養をプールして、以下の２つの試料に分けた：１）細胞凝集体を解離し、再凝集させた（「再凝集細胞培養」）；および２）解離されず、再凝集しなかった細胞凝集体（対照）。さらに、ステージ７の間に、両方の試料はＢＭＰ、ＲＡまたはＲＡ類似体、ＴＴＮＰＢ、およびｒｈｏキナーゼ阻害剤および０．０５％マトリゲルをさらに含んだ（ｄ２０からｄ２８の細胞培養）。試料を移植する前に、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇおよびフローサイトメトリー分析のための試料をとった（上の表１９）。表１９は、ｄ２９の頃の再凝集細胞培養は、対照より約１１％多くの内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団を含有したことを示す。重要なことに、再凝集試料は、再凝集しなかった試料より９．２５％少ない非内分泌物（ＣＨＧＡ−）またはＰＥ型の細胞（わずか１．４５％）を含有した。

出願人の半透性で生体適合性のＥＮＣＡＰＴＲＡ（登録商標）ＥＮ２０（商標）薬物送達デバイス（動物サイズ調査デバイス）に２つの試料を別々に詰め、封入し、実質的に上の実施例１０に記載されているように、合計１０匹のＳＣＩＤベージュマウス（５匹の動物は再凝集細胞培養を受け；５匹の動物は対照の細胞培養を受けた）に対して皮下に移植した。

図３４は、移植から２１週後、または生存中の、絶食後（各動物について左から３本の棒の最初）、グルコース投与またはチャレンジの３０分後（３０分；２番目の棒）および１時間後（６０分；３番目の棒）の血清中のヒトＣペプチドレベルを示す。移植から２１週後、２匹の動物（動物番号４３１７および４３２３；各コホートから１匹）以外の全動物は、大部分は９３２から２６９１ｐＭを超えるヒト血清Ｃペプチドによって観察されるように、頑強なレベルのインスリンを生成した。しかし、２つの群の間で刺激指数を比較したとき（絶食血清中Ｃペプチドレベルでのそれに対する３０分または６０分のＣペプチド血清中レベルの差）、再凝集細胞培養と対照コホートの間にｉｎｖｉｖｏ機能の有意な差はなかった。したがって、移植された培養または移植片が約９８％の内分泌／ＣＨＧＡ＋再凝集細胞培養または約８７％の内分泌／ＣＨＧＡ＋（対照）からなったかどうかにかかわらず、両方ともｉｎｖｉｖｏ機能を有するようである。したがって、出願人は初めて、ｉｎｖｉｔｒｏ内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞集団（適切に特定化された内分泌細胞）は、移植したときに生理的に機能的なインスリン分泌細胞を生成することができることを実証した。

したがって、出願人は初めて、適切に特定化された内分泌細胞のｉｎｖｉｔｒｏ集団は、移植したときに、血中グルコースに応答してインスリンを分泌する機能的膵島細胞に発達および成熟することを実証した。さらに、ｉｎｖｉｖｏ機能は、ＰＥＣについて出願人によって前に記載され、上記Ｓｃｈｕｌｚら（２０１２）で報告されたものに類似している。さらに、適切に特定化された内分泌細胞がステージ１〜７を通して本明細書に記載される方法によって作製される限り、解離および再凝集による内分泌細胞の追加の濃縮（または非内分泌細胞の消失）はｉｎｖｉｖｏ機能のために不要であるか必要とされないようである。本発明のこれらの態様は、これまで実証されていない。これまで、出願人他は、膵臓前駆体集団細胞集団を使用し、内分泌細胞集団なしでｉｎｖｉｖｏ機能を実証しただけであった。実際、上記Ｋｅｌｌｙら（２０１１）に記載されるように、ＰＥＣの内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団または膵臓の前駆体調製物はｉｎｖｉｖｏ機能を生成しなかった。

（実施例１９）
内分泌細胞を培養するための錯塩基培地
ＣＭＲＬおよびＲＭＰＩなどの錯塩基培地は、島細胞を培養し、島細胞質量を保存するために広く使用されている。ＣＭＲＬ培地は、ＲＰＭＩより一般的により複雑（より多くの構成要素または成分）である。さらに、ＣＭＲＬおよびＲＭＰＩの両方は、細胞培養のために通常使用され、より複雑でない培地であるＤＭＥＭより複雑である。したがって、出願人は、そのような錯塩基培地が分化の後期、例えばステージ６および７の間に内分泌細胞を維持するのに有益となるのかどうかについて調査した。

島移植は、十分な島細胞質量および最小限の毒性での島の培養および移植を必要とする。短期の島培養は、急速な劣化、ならびに生存力およびグルコース制御の減少と関連付けられている。Ｓ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら（２００３）、Ａｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ（＜２４ｈｒ．）ｏｆｈｕｍａｎｉｓｌｅｔｓｉｓｏｌａｔｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅＥｄｍｏｎｔｏｎｐｒｏｔｏｃｏｌ、ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＢａｎｋｉｎｇ、４、８５頁；およびＮ．Ｊ．Ｍ．Ｌｏｎｄｏｎら（１９９８）、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ＣｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＩｓｌｅｔｓｏｆＬａｎｇｅｒｈａｎｓ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ＆Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２３、２００〜２０７頁を参照。１９７８年に、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら（１９７８）による研究は、マウスの島を培養するための、ＴＣＭ、ＲＰＭＩ、ＣＭＲＬ、ＤＭＥＭおよびＨａｍｓＦ１０の有効性を比較した。ＡｎｄｅｒｓｓｏｎＡ．（１９７８）Ｉｓｏｌａｔｅｄｍｏｕｓｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔｓｉｎｃｕｌｔｕｒｅ：Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｅｒｕｍａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａｏｎｔｈｅｉｎｓｕｌｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｓｌｅｔｓ、Ｄｉａｂｅｔｅｌｏｇｉａ、１４、３９７〜４０４頁を参照。Ａｎｄｅｒｓｓｏｎの結果は、ＨａｍのＦ１０は島培養に最大のインスリン含有量を提供したが、ＲＭＰＩは培養に最良のインスリン生合成速度を提供し；これはおそらく培地中の高いグルコースおよびニコチンアミドに起因したことを示した。Ｄａｖａｌｌｉら（１９９２）などのさらに他の研究者は、ブタの島を培養するためには、アデノシンリン酸およびキサンチンを有するＴＣＭがＣＭＲＬおよびＲＭＰＩより優れていたことを示した。Ｄａｖａｌｌｉ，Ａ．Ｍ．ら（１９９２）、Ｉｎｖｉｔｒｏｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆａｄｕｌｔｐｉｇｉｓｌｅｔｓ：Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｕｌｔｕｒｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉａ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６０、８５４〜８６０頁を参照。Ｄａｖａｌｉｉらは、ＨａｍのＦ１０およびＲＭＰＩで見出された高いグルコースは、ブタの島におそらく毒性であることをさらに示唆した。したがって、異なる種からの島は異なる培養必要条件を有する可能性があり、全ての内分泌および島細胞に適する１つの処方があるとは限らない。上記Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ（１９７８）、４頁を参照する。

下の表２０は、ＣＭＲＬ、ＲＰＭＩおよびＤＭＥＭ培地で見出される、各培地タイプの間で異なる構成要素だけを記載し、すなわち、表２０は、塩基培地の全ての３つのタイプで共有される構成要素を掲載しないが、ＣＭＲＬに含有されるがＲＰＭＩおよび／またはＤＭＥＭに含有されない構成要素だけを掲載する。表２０は、ＣＭＲＬが最も複雑（最大数の構成要素）であり、ＤＭＥＭが最も複雑でない（最少数の構成要素）であることを示す。Ｙは、その塩基培地でのその構成要素の存在を示し；Ｎは、その構成要素が培地に存在しないことを示す。手短に言えば、ＤＭＥＭは、ＣＭＲＬおよびＲＰＭＩに存在する約７つの構成要素（Ｎ、陰影のついたボックス）を欠いている。

内分泌細胞培養を作製する方法は、上記のものに実質的に類似していたが、ステージ６（ｄ１５）、または中間ステージ７（ｄ２３）、または中間ステージ７（ｄ２６）、またはステージ６および７（ｄ１５からｄ２５）の間は、ＤＭＥＭまたはＣＭＲＬ塩基培地を使用した。さらに、一部の培養は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ニコチンアミド（ＮＣ）、グルコース（Ｇｌｃ）および／またはｒｈｏキナーゼ阻害剤（Ｙ−２７６３２）を受けた。

１つの実験では、ｄ２３頃に始まるステージ７細胞を、Ｂ２７補助剤、マトリゲル、ＢＭＰ、ＩＧＦおよびＹ−２７６３２を有するＣＭＲＬまたはＤＭＥＭ塩基培地で培養した。ｄ２６（ステージ７）試料のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析は、一般に、ＣＭＲＬで培養したステージ７細胞は、ＤＭＥＭで培養したときの同じステージの細胞と比較して、ホルモンおよび膵臓内分泌マーカーの非特異的遺伝子発現を増加させたことを示した。図３５Ａ〜Ｃを参照する。したがって、ＣＭＲＬは内分泌細胞の維持にとって重要である可能性がある。

ＤＭＥＭおよびＣＭＲＬをベースとした培地と比較してＲＰＭＩを使用して、対応する研究も実施した（データ示さず）。ＣＭＲＬおよびＲＭＰＩ培地は細胞培養に類似の影響を及ぼし、両方ともＤＭＥＭのそれより向上しており、したがって、還元グルタチオン、アミノ酸、ヒドロキシル−Ｌ−プロリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸およびビタミン、ビオチンおよびｐ−アミノ安息香酸を含む、ＤＭＥＭに存在せずにＣＭＲＬおよびＲＰＭＩの両方に存在する構成要素（複数可）が、ステージ６および／または７の間の内分泌細胞の維持にとって重要である可能性がある。

（実施例２０）
凍結保存は、内分泌細胞数を低減しない
商業的に存続可能な細胞療法は、細胞生成物のスケールアップ製造、およびオンデマンドの患者ニーズのために生成物を長期保存するための手段を必要とする。したがって、それが単独の細胞単独であれ封入細胞、例えばＥＮＣＡＰＴＲＡ（登録商標）薬物送達デバイスであれ、いかなる細胞生成物も低温保存が必要であるか、細胞に有害または毒性の影響がなく、かつ、細胞の治療効果、またはこの場合、血中グルコースに応答するインスリンのｉｎｖｉｖｏ生成に影響を及ぼすことのない、長期保管のための他の手段が必要であろう。したがって、２０１２年１０月２日および２０１３年４月２３日にそれぞれ発行された、両方ともＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮＯＦＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＣＥＬＬＳＤＥＲＩＶＥＤＦＲＯＭＨＵＭＡＮＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴＳＴＥＭＣＥＬＬＳという表題の出願人の米国特許第８，２７８，１０６号および第８，４２５，９２８号；ならびに２０１３年３月７日に出願の米国出願第６１／７７５，４８０号、表題ＣＲＹＯＰＲＥＳＥＲＶＡＴＩＯＮ，ＨＩＢＥＲＮＡＴＩＯＮＡＮＤＲＯＯＭＴＥＲＭＰＥＲＡＴＵＲＥＳＴＯＲＡＧＥＯＦＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＥＤＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣＥＮＤＯＤＥＲＭＣＥＬＬＡＧＧＲＥＧＡＴＥＳ、およびＫｒｏｏｎら（２００８）で詳述されるように、新鮮な（非低温保存）、および低温保存されたＰＥＣで観察されるものと同様にｉｎｖｉｖｏで発達および機能するそれらの能力を、低温保存されたステージ７内分泌細胞が維持するかどうかを出願人は調査した。

内分泌細胞培養を作製する方法は上記のものに実質的に類似していたが、ステージ７の間、細胞培養は全てＣＭＲＬをベースとした培地中にあり、以下の試料に分割した：１）解離、再凝集されないが、２３日目頃に数時間低温保存され、その後解凍され、Ｂ２７補助剤、ＢＭＰ、ＴＴＮＰＢおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤を有するＣＭＲＬ塩基培地で数日間培養した（ｒｅ−ａｇｇなし／低温保存された）；２）解離、再凝集されず、低温保存されない（ｒｅａｇｇなし／低温保存なし）；３）解離、再凝集され、低温保存されない（Ｒｅ−ａｇｇ／低温保存なし）。上の全ての３つの試料は、同じステージ７培地条件で培養した。２７日目に、試料をフローサイトメトリーによって分析した。下の表２１を参照する。

表２１のフローサイトメトリー分析に基づいて、解離、再凝集されなかった培養（試料１および２）については、細胞の低温保存（試料２）は、新鮮な細胞（試料１）と比較して内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞の総数を低減しない（８８．５７対８９．９７）。予想通りに、全内分泌（ＣＨＧＡ＋）集団は、解離、再凝集され、低温保存されていない培養でより高い（９２．８５）。したがって、上の実施例１７に記載のように解離、再凝集は内分泌細胞（ＣＨＧＡ＋）数に影響を及ぼすが、ステージ７培養の低温保存は、細胞構成を変化させないようである。

さらに、細胞免疫組織化学を使用して、試料をＮＫＸ６．１、Ｃペプチド、ＩＮＳおよびＧＣＧ染色で分析した。図３６Ａ〜Ｂを参照する。ステージ７からの内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞凝集体（ｒｅ−ａｇｇなし／低温保存なし；試料２）は、ＮＫＸ６．１（核）およびＣペプチド（細胞質）同時発現または同時染色を示した（図３６Ａ〜Ｃ）。同時染色は、ステージ４分化プロトコルからのＰＥＣの類似した分析で観察されなかった。ＩＮＳ（３６Ａ；細胞質）およびＧＣＧ（３６Ｂ；細胞質）細胞の別々の染色を示す図３６Ａ〜Ｃで分かるように、ステージ７からの細胞培養も主に単一ホルモン性であり、すなわち、ステージ４からのＰＥＣの内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団で見られるように、大部分の個々の細胞はＩＮＳおよびＧＣＧを同時発現しなかった。図３７は、類似の染色パターンを有するが、ステージ７の開始時に解離、再凝集された細胞培養からの、顕微鏡写真を示す。

図３７は、上の表２０の細胞培養１および３からの移植片機能を比較する。１２週時の両コホートの動物の移植されたステージ７移植片のｉｎｖｉｖｏ機能の分析は、低温保存されたが再凝集されなかった培養（試料１）が、低温保存されなかったが再凝集された培養（試料３）と比較して、グルコース投与の３０および６０分後に類似の血清中Ｃペプチドレベルを有することを示した。これらのＣペプチドレベルは、図２０および２１の１０週目および１５週目で観察されるものと同等である（例えば１５週時には、グルコース投与の６０分後の平均Ｃペプチドレベルは９９５ｐＭであった）。したがって、後の分析が、大部分の動物では、実施例１８に記載され、図３４で観察されるものと同様に、グルコース刺激から３０分および／または６０分後に、Ｃペプチドレベルが約１０００ｐＭまで増加することを示すことが予想され、予期される。実際、動物番号４４９０、試料１移植片は、移植後２１週時の実施例１８の動物番号４３２０（図３４）と同等だった血清Ｃペプチドレベルを１２週時に有していた。

したがって、ステージ７内分泌細胞の低温保存は、それらのｉｎｖｉｖｏ機能に影響を及ぼさないようである。

（実施例２１）
グルコース濃度を増加させることは、ホルモン発現に影響を及ぼす
細胞培養製剤中のグルコースレベルは、１ｇ／Ｌ（５．５ｍＭ）から１０ｇ／Ｌ（５５ｍＭ）であり、一部の培地はｉｎｖｉｖｏの正常な血糖レベルに近似する約５．５ｍＭグルコースを有する。１０ｍＭに近づくグルコースレベルは前糖尿病レベルであり、１０ｍＭを上回るレベルは糖尿病状態に類似している。換言すると、１０ｍＭを上回るグルコースはｉｎｖｉｖｏ高血糖状態を模倣する。高グルコースは、例えば、グリケーション、糖酸化（glyoxidation）およびカルボニルストレスを含む翻訳後の二次改変を引き起こすことができる。異なる細胞型にｉｎｖｉｔｒｏで及ぼす高グルコースの影響に関する報告は様々であるので、出願人はステージ６および／または７の内分泌細胞に及ぼす高グルコース（すなわち４．５ｇ／Ｌまたは２４．９８ｍＭグルコース）の影響を研究しようと努めた。

グルコースは、以下を含む全ての細胞培養培地に加えられる可溶性ヘキソース糖である；エイムス培地、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）；ＢＧＪｂ培地フィットン−ジャクソン改変；クリック培地；ＣＭＲＬ−１０６６培地；ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）；ＤＭＥＭ／Ｈａｍの栄養素混合液Ｆ−１２（５０：５０）；Ｆ−１２クーン改変；フィッシャー培地；Ｈ−Ｙ培地（Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（登録商標））；イスコフの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）；マッコイの５Ａ改変培地；ＭＣＤＢ培地；培地１９９；最少必須培地イーグル（ＥＭＥＭ）；ＮＣＴＣ培地；栄養素混合液、ＨａｍのＦ−１０；栄養素混合液、ＨａｍのＦ−１２；栄養素混合液ＨａｍのＦ−１２カインの改変（Ｆ１２Ｋ）；ＲＰＭＩ−１６４０；無血清／無タンパク質ハイブリドーマ培地；ウェイマウス培地ＭＢ；ウィリアムズ培地Ｅおよび様々な所有権付きの培地。Ｌ−１５培地は、グルコースの代わりにガラクトースを含有する。ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｅｌｌ−ｃｕｌｔｕｒｅ／ｌｅａｒｎｉｎｇ−ｃｅｎｔｅｒ／ｍｅｄｉａ−ｅｘｐｅｒｔ／ｇｌｕｃｏｓｅ．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブで入手できるＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＭｅｄｉａＥｘｐｅｒｔを参照。

１０ｍＭを超えるレベルのグルコース補給を含有する培地には、少なくとも以下が含まれる：ＤＭＥＭ／Ｈａｍの栄養素混合液Ｆ−１２（５０：５０）は１７．５ｍＭのグルコースを含有する；ＤＭＥＭ（高グルコース）、ＧＭＥＭおよびＩＭＤＭは全て２５ｍＭレベルのグルコースを含有する；Ｈ−Ｙ培地（Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（登録商標））および無血清／無タンパク質ハイブリドーマ培地はそれぞれ２２．６および２８．９ｍＭのグルコースを含有する。ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｅｌｌ−ｃｕｌｔｕｒｅ／ｌｅａｒｎｉｎｇ−ｃｅｎｔｅｒ／ｍｅｄｉａ−ｅｘｐｅｒｔ／ｇｌｕｃｏｓｅ．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブで入手できるＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＭｅｄｉａＥｘｐｅｒｔを参照。異なる細胞培養培地は広く異なるレベルのグルコースを含有し、グルコースの影響は一般に培養系の間で異なるので、内分泌細胞に及ぼす高グルコースの影響を研究した。

再び、内分泌細胞培養を作製する方法は、上記のものに実質的に類似していたが、ステージ６および／または７の間に、細胞培養を外因性の高グルコース（総グルコース濃度４．５ｇ／Ｌまたは２５ｍＭ）の有る無しのＣＭＲＬ塩基培地で処置した。したがって、これは、ＣＭＲＬ培地に既に見出される１０００ｍｇ／Ｌまたは１ｇ／Ｌ（５．５ｍＭ）のグルコースにさらに加えた３．５ｇ／Ｌである。外因性グルコースの有る無しの両条件を、ニコチンアミド、ＢＭＰ、ＲＡ（またはＴＴＮＰＢ）、あるいはｒｈｏキナーゼ阻害剤およびマトリゲルを含む同じ成長因子で処置した。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析は、ステージ６の開始時に高グルコースを加えたとき、ステージ６の終わりまでに、ＩＮＳ、ＧＣＧおよびＳＳＴの発現増加、およびＧＨＲＬの発現の減少があったことを示した（図３９ＡおよびＢ）。したがって、ステージ６および７の間の外因性グルコースの増加は、グレリンを除いてホルモン発現を増加させる。

（実施例２２）
未熟なベータ細胞の生成
実施例８〜２１は、ｉｎｖｉｔｒｏでの内分泌細胞の生成のための、ステージ３での単独またはＷｎｔおよび／またはヘレグリンと組み合わせた高アクチビン；ステージ４での単独またはヘレグリンと組み合わせた低アクチビン；ステージ５でのＫＧＦ、ＥＧＦおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の有る無しのノギンおよびガンマセクレターゼ阻害剤；ならびにステージ６〜７での以下のニコチンアミド、レチノイン酸、ＢＭＰおよびマトリゲルの１つまたは複数の使用を含む、様々な反復法を記載する。そのような方法から生成される内分泌細胞集団は、単一ホルモン性（例えば、ＩＮＳだけ、ＧＣＧだけまたはＳＳＴだけ；図３９を参照する）であるだけでなく、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を含む他の未熟な内分泌細胞マーカーを同時発現する。

ＩＮＳ、ＳＳＴおよびＧＣＧホルモン染色を使用して、２つの異なるステージ７培養でフローサイトメトリー分析を実施した（データセットＡおよびデータセットＢ）。ステージ１〜７の多くの繰り返しを検討した後に、データ（Ａ）の１セットを実施し、より早い時期に、例えばニコチンアミド、ＢＭＰ、ＣＭＲＬ等の不在下で、データ（Ｂ）の他のセットを実施した。下記の表２２を参照する。表２２は、ＩＮＳ、ＳＳＴおよびＧＣＧ陽性染色（５つの左の欄を参照）、全ＩＮＳ、ＳＳＴおよびＧＣＧ陰性染色（５つの右の欄を参照）および単一ホルモン染色（中央の欄を参照）の全体の百分率を示す。これらの２つのデータセット（ＡおよびＢ）からのホルモン染色を、約２６日目まで培養で維持されていたステージ４のＰＥＣ培養から得られたものと比較する。

一般に、全ＩＮＳ陽性亜集団（単独ＩＮＳ陽性プラスＩＮＳ／ＳＳＴ同時陽性プラスＩＮＳ／ＧＣＧ同時陽性プラスＩＮＳ／ＳＳＴ／ＧＣＧ同時陽性の合計）は、ステージ４のＰＥＣ培養よりステージ７の内分泌培養で３倍大きい（４９．３対２２．７対１５．８）。したがって、全ＩＮＳ単独（ＳＳＴまたはＧＣＧとの同時発現のない）亜集団も、ステージ４のＰＥＣ培養よりステージ７の内分泌培養でより高い（２２．７対１２．９対３．７）。重要なことに、ステージ７培養は、ステージ４のＰＥＣ培養（３．７／１５．８＝２３％）と比較した全ＩＮＳ集団（Ａでは２２．７／４９．３＝４６％、Ｂでは１２．７／２２．７＝約５７％）の百分率として、より多くの単一ホルモン発現ＩＮＳ細胞を有する。したがって、ステージ７の内分泌細胞培養は、ステージ４のＰＥＣ培養より、より多くの単一ホルモン発現細胞、特にＩＮＳ単独発現細胞からなるようである。さらに、少なくとも実施例１８および２０は、なお未熟であるステージ７内分泌細胞は、移植したときに、血中グルコースに応答してインスリンを分泌することが可能な生理的に機能的な膵島に発達および成熟するが、ステージ４のＰＥＣ培養の内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団は、ｉｎｖｉｖｏで同じことが可能でないことを実証する。さらなる詳細については、上の図４４および４５と実施例を参照する。

（実施例２３）
ステージ７およびステージ４（ＰＥＣ）からの内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞は、互いから区別される
ステージ７（適切に特定化された内分泌）およびステージ４（ＰＥＣ）培養の分析は細胞染色および分析のために同じ抗体（例えばＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１）を使用するが、ステージ７および４（ＰＥＣ）からの適切に特定化された内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞亜集団は同じでない。
より初期に、出願人は、ステージ４のＰＥＣ培養の移植後に観察された機能的ベータ細胞の起源は、膵臓の前駆体または非内分泌（ＣＨＧＡ−）細胞に起因し、一次内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞からではないことを報告した。上記Ｋｅｌｌｙら（２０１１）は、ＰＥＣ培養で内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団を濃縮（精製）し、移植したときに、それらは、非濃縮ＰＥＣ培養と比較して機能的膵島またはベータ細胞を生成しなかったことを実証した。Ｋｅｌｌｙら（２０１１）、３〜４頁、図４および付表１；上記Ｓｃｈｕｌｚら（２０１２）；ならびに米国特許第７，５３４，６０８号；第７，６９５，９６５号；第７，９９３，９２０号および第８，２７８，１０６号を参照。実施例１７、１８および表１９は、移植したときに頑強な機能的移植片をｉｎｖｉｖｏでもたらした、ステージ７からのほぼ純粋な（９８．２％）内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞培養を記載した（図３４）。本明細書に記載される実施例１７、１８および他の結果を考慮すると、ステージ７培養の機能的集団は、ステージ７からの内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞であって、かなりより小さい百分率の非内分泌（ＣＨＧＡ−）細胞（２．０８％）ではない。これは、ｉｎｖｉｖｏ機能が非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団に帰せられる、出願人が先の開示で詳細に報告したステージ４のＰＥＣ培養と対照的である。したがって、一般に、ステージ７および４からの内分泌亜集団は同等でないか、同じでない。

表２３は、ステージ７（適切に特定化された内分泌）およびステージ４（ＰＥＣ）からの全内分泌（ＣＨＧＡ＋）および非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団を比較し、亜集団が同等物でなく、互いから区別されることを実証する、フローサイトメトリーデータを示す。例えば、ＣＨＧＡ＋亜集団の全体の百分率は、ステージ４培養と比較してステージ７で有意により高かった（８５．２対３９．４）。したがって、ＣＨＧＡ−亜集団の全体の百分率は、ステージ４培養と比較してステージ７で有意により低かった（１４．８対６０．１）。さらに、真の内分泌細胞、例えばベータ細胞は、ＣＨＧＡ＋を発現するだけでなく、少なくともＩＮＳおよびＮＫＸ６．１も同時発現する。したがって、真の内分泌細胞はＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）を発現し、ｉｎｖｉｖｏで機能することができる。表２３は、ステージ７培養がステージ４培養よりほぼ５倍多くのＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）細胞を有したことを示し（３７．８対７．８）；ステージ４のＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋亜集団は上記のように適切に特定化されているように見える可能性があるが、移植したとき、ステージ４からのこれらの内分泌亜集団はｉｎｖｉｖｏで機能せず、ステージ４からの非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団はｉｎｖｉｖｏで成熟し、機能する。したがって、これらの細胞はｉｎｖｉｖｏで成熟したベータ細胞になることに発生的に傾倒しているので、出願人はステージ７の内分泌細胞を内分泌前駆／先駆細胞ではなく、「未熟な内分泌細胞」または「未熟なベータ細胞」と呼ぶ。

（実施例２４）
亜鉛センサーを使用するステージ７細胞集団からの内分泌細胞の精製
ベータ細胞分泌性小胞は、高濃度の亜鉛を含有する。亜鉛は、少なくとも亜鉛輸送体ＳＬＣ３０Ａ８（またはＺｎＴ８）の作用によって小胞に蓄積される。亜鉛なしでよりも亜鉛と結合したときに特定の波長でより多くの光を吸収、放射することによって細胞中の亜鉛を可視化するために、亜鉛結合蛍光プローブが使用されている。今のところ、報告は、大部分のプローブはベータ細胞小胞内の亜鉛を検出するために適切に局在化することができないことを示す。興味深いことには、ＰｙＤＰｙ１（またはＰｙ１；ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１１、４７：７１０７〜９頁）は小胞に入ることができるが、今までベータ細胞で使用されたことはない。Ｚｎ２＋に結合するとき、Ｐｙ１は蛍光強度を５０〜８０倍増加させる。初めて、出願人は、ｉｎｖｉｖｏ機能が可能な内分泌細胞または未熟ベータ細胞集団の生成を実証した。したがって、さらなるｉｎｖｉｔｒｏ分析のために、スクリーニングツールとして用いるために、または移植のために濃縮された未熟ベータ細胞集団を提供するために、この集団をさらに濃縮するための手段を有することが有利である。

ステージ７の内分泌細胞、または未熟ベータ細胞をＰｙ１で処置し、高亜鉛含有量のものについて細胞を蛍光によって選別した。Ｐｙ１亜鉛センサー（ＣｈｅｍｏＧｅｎｉｃｓＢｉｏｐｈａｒｍａ、ＲｅｓｅａｒｃｈＴｒｉａｎｇｌｅＰａｒｋ、ＮＣによって注文合成された）をＤＭＳＯに１０ｍＭで再懸濁させ、５ミクロモルの最終濃度までＤＰＢＳ（−／−）／０．２５％ＢＳＡ（緩衝液Ａ）に希釈した（染色液）。分化したステージ７細胞凝集体をＤＰＢＳ（−／−）で二回洗浄し、Ａｃｃｕｍａｘで解離させた。Ｂ−２７を含有する塩基培地の添加でＡｃｃｕｍａｘをクエンチした。生じた細胞懸濁液を４０ミクロンメッシュによって濾過し、遠心分離し、緩衝液Ａで洗浄し、染色液に再懸濁させた。染色は１５分間継続し、細胞を遠心分離し、緩衝液Ａで洗浄し、選別のために緩衝液Ａに再懸濁させた。４℃でフローサイトメトリーによって細胞を選別し、ＣＭＲＬ／５０％ＦＢＳに入れた。選別の後、細胞を遠心分離し、ＲＮＡ単離緩衝液に再懸濁させた。

図４０に示す結果では、多角形で包囲されているか囲まれている細胞は、亜鉛に結合したＰｙ１センサーの存在のために蛍光が増加した生細胞である。この細胞集団は２つのほぼ等しいゲートにさらに分割し、それらの蛍光強度によって明るいおよび薄暗いと命名した２つの管に選別した。ＲＮＡを細胞から調製し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析にかけた。

図４２Ａ〜Ｃに見られるように、薄暗い集団は、ＩＮＳ、ＩＡＰＰ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＣＳＫ１、Ｇ６ＰＣ２、ＧＣＫおよびＳＬＣ３０Ａ８などのベータ細胞系列のマーカーが濃縮される。これは、亜鉛センサーを使用して、ステージ７細胞集団からベータ細胞または未熟なベータ細胞を精製することができることを示す。以前の実験は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇによる６３０，０００個のＩＮＳｍＲＮＡ単位がフローサイトメトリーによる約４９％のＩＮＳ陽性細胞に対応すると判定した（データ示さず）。したがって、１，２００，０００個のＩＮＳＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ値を有する精製された薄暗い集団は、約９３％のＩＮＳ陽性細胞（１，２００，０００／６３０，０００×４９％）に対応するであろう。

反対に、明るい選別集団は、ＧＣＧ、ＡＲＸおよびＳＬＣ３０Ａ８などのα細胞系列のマーカーが濃縮された（図４１、４２、４３）。ベータ細胞と同様に、グルカゴン細胞も亜鉛を取り込むことが知られており、したがってベータ細胞とグルカゴン細胞の両方で亜鉛に結合するためにＰｙ１センサーを使用することができるが、それらの異なるレベルの蛍光によって分離または選別される。

ＰＥＣ（ステージ１〜４）内分泌細胞（ステージ１〜７）培養を作製するための方法の要約
要約すると、本明細書に記載される本発明は、少なくともＰＥＣおよび未熟内分泌細胞、ならびにＰＥＣ生成のためにステージ１〜４および内分泌細胞の生成のためにステージ１〜７を少なくとも含むそのような細胞の作製方法を目的とする。図４３、４４および４５は、出願人の細胞組成物および本明細書に記載される生成方法の特定の態様を要約する図である。

出願人は、ｉｎｖｉｖｏ移植したとき、ステージ４分化プロトコルの後の内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団は、成熟した機能する膵島細胞に発達しないことを前に報告した。図４３および４４のステージ４の後の「ＥＮ」細胞型を参照する。これらの内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団は、早期または成熟前のＮＧＮ３発現（ＰＤＸ１およびＫＸ６．１同時発現の前のＮＧＮ３発現）を有した。上記、Ｒｕｋｓｔａｌｉｓら（２００９）も参照。対照的に、ＮＧＮ３を発現しなかったＰＥＣの非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団は、ｉｎｖｉｖｏで内分泌細胞に発達および成熟する。ＰＥＣの非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団のｉｎｖｉｖｏ成熟の後までのこの遅れたＮＧＮ３発現は、実施例１０（図１５〜１６）に示したが、そこでは、アクチビン、Ｗｎｔおよびヘレグリンの組合せが対照と比較してＮＧＮ３を効果的に抑圧し、対照と比較したこのＰＥＣの移植は、ｉｎｖｉｖｏ機能を向上させた。図１５〜１６を参照する。

次に出願人は、ｉｎｖｉｖｏで膵島に発達および成熟することが可能で、ＰＥＣ、特にＰＥＣの非内分泌（ＣＨＧＡ−）亜集団の全ての場合に観察されたものと同様に血中グルコースレベルに応答してインスリンを作製する、適切に特定化された内分泌細胞培養を得ようと努力した。この目的のために、ステージ３および４でＮＧＮ３発現を抑制または阻害するために、出願人は多くの反復実験を実施した。実施例８〜１１は、ＮＧＮ３発現または抑制に影響を及ぼすために、出願人による、単独、またはＷｎｔおよびヘレグリンなどの他の作用物質と一緒の、様々な濃度でのアクチビンの使用を詳述する。図４４は、ステージ３および４でのアクチビンの影響も要約する。

ＮＧＮ３発現を遅らせることができ、それはｉｎｖｉｖｏ機能に影響を及ぼさないことが実証されると、出願人は、ＰＥＣ（ステージ４）形成後のステージで内分泌マーカーの発現を誘導する方法を探索した。実施例１１〜１４および１６〜２２は、ｉｎｖｉｖｏ機能を生成することができた適切に特定化された内分泌集団を生成する培養条件を最適化するために用いた、多くの反復および方法を記載する。具体的には、出願人は、ＮＧＮ３発現および内分泌分化を誘導するために、ステージ５でガンマセクレターゼ阻害剤を使用した。出願人は、内分泌マーカー発現を増加させるためにステージ６および７でＣＭＲＬなどの試薬を；ＩＮＳおよびＰＤＸ１を増加させるためにＢＭＰを使用した。図４４および４５は、これらの努力を要約し、記載する。

当初、細胞を特徴付けして同定するために、複数の方法論を使用する必要があることは理解されよう（例えばＱ−ＰＣＲ、ＩＣＣ、フローサイトメトリー分析、Ｃペプチドアッセイ等）。特定の細胞分化培養条件の下でそのような細胞を完全に特徴付けして同定した後に、そのような細胞型が得られたかどうか分析する唯一の方法として、Ｑ−ＰＣＲおよびＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ多重ＲＮＡがしばしば使用された。

本明細書に記載される方法、組成物およびデバイスは、現在好ましい実施形態の代表であり、例示的であり、本発明の範囲を限定することを意図していない。本発明の精神に包含され、開示の範囲によって規定される、それへの変更および他の使用は当業者に思いつくであろう。したがって、本発明の範囲および精神を逸脱しない範囲で、様々な置換および改変を本明細書に開示される本発明に加えることができることは、当業技術者に明らかになる。

下の請求項およびこの開示全体で用いられるように、語句「から事実上なる」は、語句の後に掲載される任意の要素を含むことを意味し、掲載される要素について開示で特定される活性または作用に干渉しないか寄与しない他の要素に限定される。したがって、語句「から事実上なる」は、掲載される要素は必要とされるか必須であるが、他の要素は任意選択であり、掲載される要素の活性か作用にそれらが影響を及ぼすかどうかによって存在しても存在しなくてもよいことを示す。さらに、数値、例えば量、濃度、百分率、割合または範囲が列挙される実施形態では、言及される値は、「少なくとも約」その数値、「約」その数値、または「少なくとも」その数値であってもよいことが理解される。

実施形態
実施形態１．ｉｎｖｉｔｒｏ単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態２．ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、実施形態１に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態３．成熟ベータ細胞に分化することができる、実施形態１に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態４．前記分化がｉｎｖｉｖｏにおけるものである、実施形態３に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態５．細胞集団の一部を形成する、実施形態１に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態６．前記細胞集団の少なくとも１０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態５に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態７．前記細胞集団の少なくとも２０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態５に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態８．前記細胞集団の少なくとも３０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態５に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態９．前記細胞集団の少なくとも４０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態５に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態１０．前記細胞集団の少なくとも５０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態５に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態１１．前記細胞集団の少なくとも６０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態５に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態１２．前記細胞集団の少なくとも８０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態５に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態１３．前記細胞集団の少なくとも９０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態５に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態１４．前記細胞集団の少なくとも９８％が未成熟ベータ細胞である、実施形態５に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態１５．単一ホルモン性である、実施形態１に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態１６．ＭＡＦＢを発現する、実施形態１に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態１７．単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成する方法であって、ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞を生じさせるステップを含む方法。

実施形態１８．前記単能性ヒト未成熟ベータ細胞が、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、実施形態４に記載の方法。

実施形態１９．ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーが、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＧＤＦ８、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１およびＧＤＦ−１５からなる群から選択される、実施形態４に記載の方法。

実施形態２０．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＥＲＲＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む、実施形態４に記載の方法。

実施形態２１．ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡである、実施形態４に記載の方法。

実施形態２２．ＷｎｔファミリーメンバーがＷｎｔ３ａである、実施形態４に記載の方法。

実施形態２３．ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質がヘレグリンである、実施形態６に記載の方法。

実施形態２４．ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がＢＭＰである、実施形態４に記載の方法。

実施形態２５．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでニコチンアミド、レチノイン酸またはレチノイン酸類似体、ｒｈｏキナーゼ阻害剤またはガンマセレクターゼ阻害剤と接触させるステップをさらに含む、実施形態４に記載の方法。

実施形態２６．レチノイン酸が、オールトランス−レチノイン酸（ＲＡ）、１３−シス−レチノイン酸（１３−シス−ＲＡ）、およびアロチノイド酸（ＴＴＮＰＢ）からなる群から選択される、実施形態２５に記載の方法。

実施形態２７．レチノイン酸がオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）である、実施形態２６に記載の方法。

実施形態２８．レチノイン酸が１３−シス−レチノイン酸（１３−シス−ＲＡ）である、実施形態２６に記載の方法。

実施形態２９．レチノイン酸がアロチノイド酸（ＴＴＮＰＢ）である、実施形態２６に記載の方法。

実施形態３０．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６およびＹ−３０１４１からなる群から選択される、実施形態２５に記載の方法。

実施形態３１．ｒｈｏキナーゼ阻害剤がＹ−２７６３２である、実施形態３０に記載の方法。

実施形態３２．ガンマセレクターゼ阻害剤が、ガンマセレクターゼ阻害剤Ｉ（ＧＳＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＩ（ＧＳＩＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＩＩ（ＧＳＩＩＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＶ（ＧＳＩＩＶ）、ガンマセレクターゼ阻害剤Ｖ（ＧＳＩＶ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＶＩ（ＧＳＩＶＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＶＩＩ（ＧＳＩＶＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＸ（ＧＳＩＩＸ）、（ＤＡＰＴ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩ（ＧＳＩＸＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＩ（ＧＳＩＸＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＩＩ（ＧＳＩＸＩＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＶ（ＧＳＩＸＩＶ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＶＩ（ＧＳＩＸＶＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＶＩＩ（ＧＳＩＸＶＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＸ（ＧＳＩＸＩＸ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＸ（ＧＳＩＸＸ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＸＩ（ＧＳＩＸＸＩ）、ガンマ４０セレクターゼ阻害剤Ｉ、ガンマ４０セレクターゼ阻害剤ＩＩおよびＲＯ４９２９０９７からなる群から選択される、実施形態２５に記載の方法。

実施形態３３．ガンマセレクターゼ阻害剤がＲＯ４９２９０９７である、実施形態３２に記載の方法。

実施形態３４．ガンマセレクターゼ阻害剤がＧＳＩＩＶである、実施形態３２に記載の方法。

実施形態３５．成熟ベータ細胞をｉｎｖｉｖｏで生成するための方法であって、ａ．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞を生じさせるステップと、ｂ．ステップ（ａ）の未成熟ベータ細胞を哺乳動物対象に移植するステップと、ｃ．未成熟ベータ細胞をｉｎｖｉｖｏで分化させて、成熟ベータ細胞を含む細胞の集団を生成するステップとを含む方法。

実施形態３６．前記成熟ベータ細胞に、グルコース刺激に応答してインスリンを生成させるステップをさらに含む、実施形態１０に記載の方法。

実施形態３７．前記ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子が、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡおよびアクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１およびＧＤＦ−１５からなる群から選択される、実施形態１０に記載の方法。

実施形態３８．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む、実施形態１０に記載の方法。

実施形態３９．ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡである、実施形態１０に記載の方法。

実施形態４０．ＷｎｔファミリーメンバーがＷｎｔ３ａである、実施形態１０に記載の方法。

実施形態４１．ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質がヘレグリンである、実施形態３７に記載の方法。

実施形態４２．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる、実施形態１に記載の方法。

実施形態４３．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる、実施形態１０に記載の方法。

実施形態４４．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる、実施形態１０に記載の方法。

実施形態４５．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる、実施形態１０に記載の方法。

実施形態４６．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる、実施形態１０に記載の方法。

実施形態４７．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる、実施形態１０に記載の方法。

実施形態４８．ヒト胚体内胚葉系列細胞をＴＧＦβスーパーファミリー成長因子およびＷｎｔファミリーメンバーの５分の１〜１５分の１のＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させる、実施形態３７に記載の方法。

実施形態４９．前記細胞集団の少なくとも１０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態１０に記載の方法。

実施形態５０．前記細胞集団の少なくとも２０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態１０に記載の方法。

実施形態５１．前記細胞集団の少なくとも３０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態１０に記載の方法。

実施形態５２．前記細胞集団の少なくとも４０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態１０に記載の方法。

実施形態５３．前記細胞集団の少なくとも５０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態１０に記載の方法。

実施形態５４．前記細胞集団の少なくとも６０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態１０に記載の方法。

実施形態５５．前記細胞集団の少なくとも７０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態１０に記載の方法。

実施形態５６．前記細胞集団の少なくとも８０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態１０に記載の方法。

実施形態５７．前記細胞集団の少なくとも９０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態１０に記載の方法。

実施形態５８．未成熟ベータ細胞が、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、実施形態１０に記載の方法。

実施形態５９．未成熟ベータ細胞が、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＭＦＡＢを発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、実施形態１０に記載の方法。

実施形態６０．ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、ｉｎｖｉｔｒｏ単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態６１．成熟ベータ細胞へと成熟することができる、実施形態６０に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態６２．ＭＡＦＢをさらに発現する、実施形態６０に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。

実施形態６３．単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成する方法であって、ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成するステップを含む方法。

実施形態６４．前記単能性ヒト未成熟ベータ細胞が、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、実施形態６３に記載の方法。

実施形態６５．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む、実施形態６３に記載の方法。

実施形態６６．ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡである、実施形態６３に記載の方法。

実施形態６７．ＷｎｔファミリーメンバーがＷｎｔ３ａである、実施形態６３に記載の方法。

実施形態６８．ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質がヘレグリンである、実施形態６５に記載の方法。

実施形態６９．成熟ベータ細胞をｉｎｖｉｖｏで生成するための方法であって、ａ．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞を生じさせるステップと、ｂ．ステップ（ａ）の未成熟ベータ細胞を哺乳動物対象に移植するステップと、ｃ．未成熟ベータ細胞をｉｎｖｉｖｏで成熟させて、インスリン分泌ベータ細胞を含む細胞の集団を生成するステップとを含む方法。

実施形態７０．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む、実施形態６９に記載の方法。

実施形態７１．ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡである、実施形態６９に記載の方法。

実施形態７２．ＷｎｔファミリーメンバーがＷｎｔ３ａである、実施形態６９に記載の方法。

実施形態７３．ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質がヘレグリンである、実施形態７０に記載の方法。

実施形態７４．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる、実施形態６９に記載の方法。

実施形態７５．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる、実施形態６９に記載の方法。

実施形態７６．ヒト胚体内胚葉系列細胞をＴＧＦβスーパーファミリー成長因子およびＷｎｔファミリーメンバーの５分の１〜１５分の１ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させる、実施形態７０に記載の方法。

実施形態７７．未成熟ベータ細胞が、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、実施形態６９に記載の方法。

実施形態７８．未成熟ベータ細胞が、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、実施形態６９に記載の方法。

実施例１３に記載される分化条件下のＩＮＳ（図２４Ａ）、ＰＤＸ１（図２４Ｂ）、ＮＫＸ６．１（図２４Ｃ）およびＩＤ１（図２４Ｄ）の相対的な遺伝子発現レベルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇｍＲＮＡデータを示す棒グラフである。

Claims

ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、ｉｎｖｉｔｒｏ単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
成熟ベータ細胞へと成熟することができる、請求項１に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
ＭＡＦＢをさらに発現する、請求項１に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成する方法であって、ヒト胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅｅｎｄｏｄｅｒｍ）系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成するステップを含む方法。
前記単能性ヒト未成熟ベータ細胞が、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、請求項４に記載の方法。
ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡである、請求項４に記載の方法。
ＷｎｔファミリーメンバーがＷｎｔ３ａである、請求項４に記載の方法。
ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質がヘレグリンである、請求項６に記載の方法。
成熟ベータ細胞をｉｎｖｉｖｏで生成するための方法であって、
ａ．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞を生じさせるステップと、
ｂ．ステップ（ａ）の未成熟ベータ細胞を哺乳動物対象に移植するステップと、
ｃ．未成熟ベータ細胞をｉｎｖｉｖｏで成熟させて、インスリン分泌性ベータ細胞を含む細胞の集団を生成するステップと
を含む方法。
ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡである、請求項１０に記載の方法。
ＷｎｔファミリーメンバーがＷｎｔ３ａである、請求項１０に記載の方法。
ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質がヘレグリンである、請求項１１に記載の方法。
ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる、請求項１０に記載の方法。
ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる、請求項１０に記載の方法。
ヒト胚体内胚葉系列細胞をＴＧＦβスーパーファミリー成長因子およびＷｎｔファミリーメンバーの５分の１〜１５分の１のＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させる、請求項１１に記載の方法。
未成熟ベータ細胞がＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、請求項１０に記載の方法。
未成熟ベータ細胞がＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、請求項１０に記載の方法。