RU2391401C2 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОПУЛЯЦИИ CD4+CD25+Foxp3+ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ex vivo, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОПУЛЯЦИИ CD4+CD25+Foxp3+ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ex vivo, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2391401C2 RU2391401C2 RU2008104682/13A RU2008104682A RU2391401C2 RU 2391401 C2 RU2391401 C2 RU 2391401C2 RU 2008104682/13 A RU2008104682/13 A RU 2008104682/13A RU 2008104682 A RU2008104682 A RU 2008104682A RU 2391401 C2 RU2391401 C2 RU 2391401C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- regulatory
- population
- amount
- lymphocytes
- Prior art date
Links
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 6
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 title description 54
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 title description 54
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 title description 53
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 8
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 6
- 101001092200 Mus musculus RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 71
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 65
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 17
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 9
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 9
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 8
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 6
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 5
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 5
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 description 3
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 3
- 229940099456 transforming growth factor beta 1 Drugs 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000010910 CD28 Antigens Human genes 0.000 description 2
- 101100166600 Homo sapiens CD28 gene Proteins 0.000 description 2
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 2
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- 108010062433 CD28 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 101150027879 FOXP3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 108010032774 Interleukin-2 Receptor alpha Subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000016551 L-selectin Human genes 0.000 description 1
- 206010050551 Lupus-like syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000000428 immunological synapse Anatomy 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению клеточных популяций Т-лимфоцитов, и может быть использовано в медицине. Способ предусматривает выделение из периферической крови пациента популяции СВ4+Т-клеток и культивирование их в ростовой среде, содержащей моноклональные антитела к CD28 (анти-СВ28) в количестве от 0,5 до 10 мкг/мл и к CD3 (анти-СD3) в количестве от 0,5 до 10 мкг/мл, TGF-бета 1 (1-50 нг на мл) и интерлейкин-2 (IL-2) в количестве от 10 до 1000 единиц/мл. Полученную популяцию СВ4+Т-клеток используют в способе лечения заболеваний, характеризующихся выраженным снижением количества и/или функциональной активности регуляторных Т-клеток. Изобретение позволяет получить ех vivo обогащенную регуляторными Т-клетками популяцию лимфоцитов. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 6 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области клеточной биотехнологии, фармакологии и медицины и может быть использовано как в научных целях, так и в практической медицине - при лечении заболеваний, для которых характерно снижение количества и/или функциональной активности регуляторных Т-клеток. К таким заболеваниям относится ряд аутоиммунных заболеваний (системная красная волчанка, ревматоидный артрит, псориаз и другие), аллергические заболевания, отторжение трансплантата, реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ), развивающаяся у ряда больных при неродственной пересадке костного мозга, и т.д. Изобретение относится к способу получения композиции и способу лечения указанных заболеваний с использованием такой композиции.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Большинство Т клеток, обладающих регуляторной активностью, принадлежат к субпопуляции CD4+ лимфоцитов. Характерным признаком CD4+ Трег является экспрессия на их поверхности α-цепи рецептора интерлейкина-2 (IL-2). CD25 может также экспрессироваться при активации лимфоцитов, однако при этом количество рецепторов на одной клетке невелико, и, следовательно, при обработке такой клетки антителами с клеткой свяжется малое количество молекул флуоресцентного красителя; при флуоресцентном анализе это будет выражаться в относительно слабом свечении (флуоресценции) клетки. Такие клетки обычно называют CD25low или CD25dim. Если же на одной клетке находится много рецепторов, то при анализе такие клетки светятся ярко, и их называют CD25hi или CD25bright; именно такими СD25hi клетками являются Трег. Для активации, развития и осуществления функции Трег необходима также инициация ядерного фактора транскрипции, связанного с Х-хромосомой (Foxp3), который считается уникальным цитоплазматическим маркером Т-регуляторов [1].
Трег экспрессируют также широкий спектр маркеров, характерных как для поздней стадии дифференцировки Т-клеток, так и для их активации. К таким маркерам относятся CD45RO (маркер клеток памяти), маркер активации CD69, GITR (глюкокортикоид-индуцированный рецептор фактора некроза опухоли), CD62L (L-селектин, маркер недавно активированных покоящихся клеток), цитотоксическая молекула CTLA-4 (CD152), с помощью которой, возможно, осуществляются ингибиторные функции Трег [2].
Трег также отличаются выраженной функциональной активностью - способностью подавлять in vitro пролиферацию и функцию клеток-мишеней, к которым могут относиться CD4+, CD4+CD25- или CD8+ клетки, а также NK- и В-лимфоциты [3].
После культивирования в условиях ex vivo Трег могут быть введены больному для коррекции количественных и/или функциональных патологий Т-регуляторов [4].
Необходимо подчеркнуть, что наиболее актуальной является задача культивирования регуляторных Т-клеток самого пациента (аутологичных), а не донора (аллогенных), так как трансплантация аллогенных клеток может сопровождаться их быстрым отторжением и требует применения иммуносупрессивной терапии, что неприемлемо для больных с уже подавленным собственным иммунитетом. Кроме того, в настоящее время к донорским препаратам крови и других тканей установлены очень высокие требования по безопасности их использования.
Содержание CD4+CD25+Foxp3+ Трег в периферической крови здорового донора в среднем составляет 3,8±1,3% от общего содержания Т-клеток. При ряде патологий, например при системной красной волчанке, наряду со снижением функциональной активности Трег их количество снижается (до 0,5-0,9%) [5]. В силу этого возможность увеличить количество Трег, выделяемых из небольшого количества биологического материала самого пациента, культивированием их в условиях ех vivo имеет большую практическую значимость.
Основной проблемой культивирования регуляторных Т-клеток с характеристиками CD4+CD25hlFoxp3+ является их анергичность, то есть неспособность отвечать пролиферацией на стимуляцию Т-клеточного рецептора (TCR). Таким образом для достижения поставленных целей необходимо преодолеть указанную анергичность, но при этом получаемые в результате клетки должны стабильно экспрессировать характерные для Трег маркеры и, кроме того, сохранять свою функциональную активность.
Раскрытие настоящего изобретения
Изобретательской задачей является расширение арсенала технических средств данного назначения и устранение отмеченных недостатков, присущих известным техническим решениям, за счет поиска нового, более эффективного способа получения популяции Т-лимфоцитов, обогащенной регуляторными Т-клетками (Трег) со стабильными характеристиками, и применения такой популяции для лечения ряда заболеваний, характеризующихся выраженным снижением количества и/или функциональной активности клеток-регуляторов.
Изобретательская задача решается тем, что предлагается способ увеличения количества регуляторных Т-клеток пациента ex vivo путем выделения из периферической крови пациента исходной популяции CD4+ Т-клеток и культивирования их в ростовой среде, содержащей специально подобранную смесь цитокинов и антител, способную индуцировать образование и быструю пролиферацию Трег со стабильными характеристиками. Указанная смесь цитокинов и антител состоит из интерлейкина-2 (IL-2), моноклональных антител к CD3-антигену человека (анти-CD3), моноклональных антител к СD28-антигену человека (анти-СD28) и трансформирующего ростового фактора-β 1 (TGF-βl) в следующих концентрациях:
| IL-2 | 10-1000 единиц |
| TGF-β1 | 1-50 нг |
| Анти-СD3 | 0.5-10 мкг |
| Анти-СD28 | 0.1-10 мкг |
| на 1 мл ростовой среды. |
Более конкретно, изобретение относится к способу получения и культивирования регуляторных Т-клеток (Трег) с использованием специально подобранной смеси на основе цитокинов и антител, способной индуцировать генерацию и быструю пролиферацию Трег со стабильными характеристиками.
Интерлейкин-2 (IL-2) отвечает за множество иммунологических функций, из которых наиболее известна его способность вызывать пролиферацию и созревание активированных Т-клеток. IL-2 активируется после связывания со сложным рецепторным комплексом, одним из компонентов которого является CD25 - рецептор α-цепи IL-2 CD25 [6].
Моноклональные антитела к СD3-рецептору (анти-СD3) связываются с CD3-рецептором, который является частью комплекса TCR - Т-клеточного рецептора, который экспрессируется на зрелых клетках и тимоцитах. Связывание рецептора с антителами приводит к неспецифической активации и пролиферации CD3+ Т-клеток [7].
Моноклональные антитела к молекуле CD28 (анти-СD28) связываются с CD28-антигеном, который является костимулируемой молекулой при активации TCR. CD28 усиливает пролиферацию Т-клеток за счет усиления транскрипции и увеличения стабильности мРНК [8].
Трансформирующий ростовой фактор бета 1 (TGF - бета 1) - это иммунорегуляторный цитокин, который участвует в поддержании Т-клеточного гомеостаза, задействован в функционировании регуляторных и эффекторных Т-клеток [9], и, кроме того, TGF - бета 1 модулирует экспрессию белка регуляторных Т-клеток Fохр3 [10].
Настоящее изобретение относится также к использованию полученной в соответствии с предложенным способом обогащенной регуляторными Т-клетками популяции аутологичных лимфоцитов для осуществления способа лечения заболеваний, характеризующихся выраженным снижением количества и/или функциональной активности регуляторных Т-клеток. Такой способ предусматривает введение пациенту, у которого ранее были отобраны исходные CD4+ Т-лимфоциты, обогащенной регуляторными Т-клетками популяции лимфоцитов, полученной путем обработки исходных клеток смесью цитокинов и антител в соответствии со способом по п.1.
Изобретательский уровень достигается тем, что, используя известные цитокины и антитела в определенном диапазоне концентраций для обработки CD4+ Т-лимфоцитов ех vivo, неожиданно достигается высокая гомогенность (более 88%) получаемой популяции лимфоцитов, что позволяет уменьшить необходимый объем забираемого у пациента исходного клеточного материала и повысить эффективность лечения.
При осуществлении способа по п.1 Т-клетки активируют путем добавления в ростовую среду анти-CD28 в количестве от 0, 5 до 10 мкг/ мл, анти-CD3 в количестве от 0,5 до 10 мкг/ мл, TGF-бета 1 (1-50 нг на мл) и интерлейкина - 2 (от 10 до 1000 единиц/мл). При использовании перечисленных цитокинов и антител с концентрациями в указанных интервалах уже к 8-му дню культивирования количество Трег-клеток увеличивается не менее чем в 122 раза. При указанных условиях культивирования 99,7% клеток экспрессируют CD4+CD25+, FOXP3 + коэкспресируется в 88,6% Т-клеток. Достигнутая высокая скорость пролиферации клеток позволила ограничить время культивирования клеток до 7-9 суток и избежать таким образом проблем, связанных с длительным культивированием клеток (например, инфицирования культуры, злокачественной трансформации клеток).
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 представлен пример экспрессии маркеров регуляторных Т-клеток в суспензии мононуклеарных клеток здорового донора. (А) CD4+CD25+ и CD4+CD25hi; (Б) Foxp3; (В) CD152 (CTLA-4). (А) 12,6% CD4+ Т-клеток коэкспрессирует также маркер CD25+. При этом у 5,9% таких CD4+CD25+ клеток наблюдалось яркое свечение маркера CD25+, позволившее обозначить клетки как CD4+CD25hi. Кроме того, 4,4% CD4+CD25+ Т-клеток коэкспрессируют также маркер Foxp3 (Б), а 5,1% - маркер CD152 (В).
На фигуре 2 представлен пример экспрессии маркеров Трег в популяции выделенных методом магнитной сепарации CD4+ Т-лимфоцитов периферической крови (до культивирования). (А) CD4+CD25+ и CD4+CD25hi; (Б) Foxp3; (В) CD152 (CTLA-4). (А) 29,7% CD4+ Т-клеток коэкспрессирует также маркер CD25+, а 14,4% таких CD4+CD25+ клеток являются CD4+CD25hi. Кроме того, 6,9% CD4+CD25+ Т-клеток коэкспрессирует также маркер Foxp3 (Б), а 7,2% - маркер CD152 (В).
На фигуре 3 представлен пример экспрессии маркеров Трег в популяции выделенных методом магнитной сепарации CD4+ Т-лимфоцитов после культивирования в течение 7 суток. (А) CD4+CD25+ и CD4+CD25hi; (Б) Foxp3; (В) CD152 (CTLA-4). (А) После культивирования 99,9% CD4+ клеток коэкспрессирует CD25+ причем 99,7% из них являются CD4+CD25hi. После культивирования Foxp3 коэкспрессируется на 88,6% (Б), а CTLA-4 - на 94,4% (В) CD4+CD25+ клеток. Таким образом, полученные после культивирования клетки имеют характерный для Т-регуляторов фенотип.
На фигуре 4 показано изменение общего количества клеток (серые столбики диаграммы) и количества Трег (заштрихованные столбики диаграммы) в культуре в зависимости от срока культивирования. На 6 сутки культивирования общее количество клеток увеличивалось в 10,0±4,9 раза, количество Трег - в 41,2±37,4 раза. К 8 дню культивирования кратность увеличения составляла 21,2±4,3 и 122,2±27,9 соответственно.
На фигуре 5 представлен пример цитометрического анализа функциональной активности Трег. (А) Пролиферация клеток-мишеней в отсутствие и (Б) в присутствии регуляторных Т-клеток.
На фигуре 6 представлен результат исследования супрессорной активности культивированных Трег (заштрихованные столбики соответствуют пролиферации клеток-мишеней в отсутствие Трег, а серые - в присутствии равного (1:1) количества Трег). В случае использования в качестве клеток-мишеней CD44 (А) нативные Трег подавляли пролиферацию на 76,3%, а культивированные - на 82,4%; в случае использования CD4+CD25- (Б) эти цифры составляли 87,9% и 86,7% соответственно.
Осуществление изобретения
Способ выделения и культивирования CD4+CD25+
Все процедуры проводили в ламинарных шкафах II класса биологической защиты, расположенных в стерильном блоке с подачей воздуха по регламенту GMP, с использованием стерильной одноразовой пластиковой посуды и стерильных реагентов.
Периферическую кровь из локтевой вены пациента забирали в стерильные пробирки, содержащие антикоагулянт К2-ЭДТА, ЭДТА или раствор гепарина. Кровь также собирали в сухие пробирки, не содержащие активаторов свертывания, для получения аутологичной сыворотки крови пациента. Содержимое пробирок с кровью и антикоагулянтом тщательно перемешивали, аккуратно переворачивая пробирку пробкой вниз несколько раз.
Для получения сыворотки крови больного пробирки с кровью без антикоагулянта выдерживали в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте. Пробирки центрифугировали при 580g в течение 10 минут, надосадочную жидкость (сыворотку крови) собирали в стерильные пробирки и инкубировали в течение 40 минут на водяной бане при температуре 56°С для инактивации компонентов комплемента. Сыворотку разливали в криопробирки в объеме 1 мл и замораживали.
Выделение мононуклеарных клеток (МНК)
Кровь из пробирок с антикоагулянтом переносили в стерильную пробирку емкостью 50 мл. Кровь разводили в соотношении 1:1 фосфатным буферным раствором (PBS) без ионов кальция и магния (PBS Ca2+Mg2+ free, Gibco, Великобритания) и затем для выделения лимфоцитов наслаивали на градиентный раствор LimphoSep (d=1,077 g/ml, MP Biomedicals, США) в пробирках емкостью 50 мл.
Пробирки центрифугировали при 400g в течение 30 мин при 20°С; в результате центрифугирования в градиенте фиколла эритроциты и гранулоциты опускались на дно пробирки, а фракция мононуклеарных клеток в виде плотного кольца концентрировалась между двумя слоями на поверхности градиента. Фракцию МНК отбирали пипеткой, разводили PBS и два раза отмывали центрифугированием в течение 10 минут (300g, 20°С). Супернатант отбрасывали.
Осадок клеток разводили в 10 мл PBS, 0,5 мл клеток отбирали для подсчета количества выделенных МНК и проведения их цитометрического анализа.
Для определения количества живых МНК к 20 мкл клеточной суспензии добавляли 20 мкл красителя Трипановый синий (Gibco, Великобритания). Подсчет клеток производили в гемоцитометре, процент живых клеток составлял не менее 95%.
Для оценки количества клеток CD4+CD25+, CD4+CD25hi, CD4+CD25+Foxp3+ в мононуклеарной фракции клеточную суспензию окрашивали соотвествующими антителами и процент указанных выше клеток в исходной клеточной взвеси определяли на приборе FACSCalibw (BD Bioscience).
Пример экспрессии характерных для Трег маркеров в МНК здорового донора представлен на фигуре 1.
Сепарация CD4+ из МНК на колонках в магнитном поле по методике MACS (Miltenyi Biotec, Германия)
Суспензию МНК осаждали центрифугированием (10 минут, 300g, 20°С), после чего клетки отмывали 1 раз в течение 10 минут при 300g и температуре 4°С, используя 10 мл буфера, содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,5% антикоагулянтного раствора цитрата декстрозы в растворе PBS (буфер ACD-A).
Осадок клеток разводили ACD-A из расчета 0,08 мл буфера на 1×107 клеток. В полученную суспензию добавляли коллоидные парамагнитные микрочастицы, конъюгированные с моноклональным мышиным антителом против рецептора CD4 лимфоцитов человека (Miltenyi Biotec, Германия) из расчета 0,02 мл микрочастиц на 1×107 клеток. Полученную смесь инкубировали в течение 15 минут при 4°С.
После инкубации к суспензии клеток добавляли 10 мл ACD-A и центрифугировали 10 минут при 300g и 4°С. Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в ACD-A из расчета 0,5 мл буфера на 1×108 клеток и наносили на требуемую колонку для позитивной селекции, находившуюся в магнитном поле.
Колонку промывали соответствующим ей количеством ACD-A, выносили из магнитного поля и поршнем выдавливали позитивную фракцию, содержавшую CD4+ клетки, в стерильную пробирку. Часть клеток (0,1 мл) отбирали для подсчета количества выделенных позитивных клеток и определения чистоты клеточной суспензии.
Для оценки чистоты суспензии выделенных CD4+ клеток их окрашивали соответствующими антителами и анализировали методом проточной цитометрии. Степень чистоты CD4+ клеток составляла в среднем 94±4% (n=19).
На фигуре 2 на примере периферической крови донора показана экспрессия характерных для Трег маркеров в популяции выделенных CD4+ Т-клеток. Повышенные значения экспрессии каждого из маркеров по сравнению с таковыми, представленными на фигуре 1, объясняются тем, что на фигуре 1 процент экспрессии дан относительно всей популяции МНК, а на фигуре 2 - относительно популяции выделенных из них CD4+ клеток, которые, в среднем, составляют около 40% от МНК. Таким образом, если количество CD4+CD25+ клеток во фракции МНК составляет 12,6% (фигура 1А), то количество тех же клеток относительно фракции CD4+ составляет 29,7% (фигура 2А).
Получение ex vivo (генерация и экспансия) клеток CD4+CD25+
Жидкая культуральная система состояла из среды RPMI-1640, содержащей феноловый красный, L-глутамин и 25 мМ HEPES (Gibco, Великобритания) с добавлением 5-10% аутологичной сыворотки и 1% раствора пенициллина-стрептомицина (Gibco, Великобритания). В культуральную среду добавляли трансформирующий ростовой фактор-β1 (TGF-β1) в концентрации 1-50 нг/мл (R&D Systems, Великобритания), 10-1000 единиц/мл интерлейкина-2 (IL-2, R&D Systems, Великобритания), 0,5-10 мкг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому рецептору CD3 (МедБиоСпектр, Россия) и 0,1-10 мкг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому рецептору CD28 (BD Pharmingen, США).
Клетки культивировали во флаконах площадью 25 см2 или 75 см2 в СO2-инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% СО2. Свежую среду и ростовые факторы добавляли каждые 3-4 суток. Время культивирования составляло 7-12 суток.
Фенотипические характеристики Т-регуляторных клеток после культивирования
В Таблице представлены результаты цитометрического анализа CD4+ Т-клеток до начала и после 7 суток культивирования.
| Таблица | ||
| Фенотипические характеристики популяции CD4+ Т-клеток до начала и после 7 суток культивирования | ||
| До культивирования | После культивирования | |
| CD4+ | 93,9±4,5 | 99,8±0,2 |
| CD4+CD25+ | 28,4±8,3 | 97,9±1,7 |
| CD4+CD25hi | 15,7±4,0 | 95,9±2,4 |
| CD4+CD25+CD62L+ | 18,8±9,0 | 54,6±3,8 |
| CD4+CD25+Foxp3+ | 6,1±4,8 | 89,6±3,2 |
| CD4+CD25+CD152+ | 5,4±2,7 | 93,8±3,0 |
Характерный пример экспрессии маркеров регуляторных Т-клеток после 7 суток культивирования проиллюстрирован фигурой 3.
Экспансия Т-регуляторных клеток
По прошествии 6-8 суток культивирования общее количество клеток увеличивалось в среднем по группе в 14,2±9,9 раза, а количество CD4+CD25+Foxp3+ регуляторных Т-клеток - в 60,3±42,6 раза. На фигуре 4 показано увеличение общего количества (серые столбики диаграммы) и количества Трег (заштрихованные столбики диаграммы) в зависимости от срока культивирования. Так, если на 6 сутки культивирования общее количество клеток увеличивается в 10,0±4,9 раза, а количество Трег - в 41,2±37,4 раза, то на 8 сутки культивирования кратность увеличения составляла 21,2±4,3 и 122,2±27,9 соответственно.
Оценка супрессорной активности регуляторных Т-клеток до и после культивирования
Функциональную активность нативных и культивированных Трег сравнивали по их способности ингибировать пролиферацию клеток-мишеней в смешанной культуре лимфоцитов. Для этого аутологичные клетки-мишени CD4+, CD4+CD25-, выделенные методом магнитной сепарации и окрашенные витальным красителем сукцидимидным эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE, Fluka, США), инкубировали в отсутствие или в присутствии равного (1:1) количества нативных (свежевыделенных) или культивированных Трег. Стимуляцию пролиферации производили аллогенными антиген-презентирующими клетками (обработанными митомицином С мононуклеарными клетками с удаленными методом магнитной сепарации CD3+ Т-лимфоцитами) в присутствии 5 мкг/мл моноклональных антител против CD3-антигена. Инкубацию проводили в течение 5-6 суток в 96-луночных круглодонных стерильных планшетах в СО2-инкубаторе. По окончании инкубации клетки из лунок собирали, отмывали от среды, окрашивали антителами против антигенов CD25 и CD4 и анализировали на проточном цитофлуориметре.
Характерные примеры пролиферации клеток-мишеней (CD4+CD25-) в отсутствие (А) и в присутствии (Б) регуляторных Т-клеток приведены на фигуре 5.
Вычисляли индекс пролиферации (ИП) клеток-мишеней в каждом из типов лунок. Для этого учитывали количество клеток в каждом поколении (M1-М6 на фигуре 5), а вычисление ИП производили делением суммы клеток во всех поколениях на сумму родительских клеток-предшественников. Количество родительских клеток-предшественников вычисляли делением количества клеток в данном поколении на 2х, где х - номер поколения. Чем индекс пролиферации выше, тем сильнее пролиферируют клетки.
На фигуре 6 представлены результаты исследования супрессорной активности регуляторных клеток до и после 7 суток культивирования. Показана пролиферация CD4+ (А) и CD4+CD25- клеток (Б) в присутствии или в отсутствие культивированных или нативных Т-регуляторов. Видно, что пролиферация клеток-мишеней была сильно подавлена при культивировании их в присутствии Трег (серые столбики), причем супрессорная активность нативных и культивированных Трег практически не отличалась, а сами супрессорные клетки не пролиферировали.
Список литературы
1. Baratelli et al. Prostaglandin E2 induces FOXP3 gene expression and Т regulatory cell function in human CD4+ Т cells. J. Immunol., 2005, 175(3): 1483-90.
2. Cao et al. Hepatocellular carcinoma cell supernatants increase expansion and function ofCD4(+)CD25(+) regulatory Т cells. Lab. Invest., 2007, 87(6): 582-90.
3. Earle et al. In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory Т cells suppress effector Т cell proliferation. Clin. Immunol., 2005, 115(1): 3-9.
4. Masteller et al. Antigen-specific regulatory Т cells - Ex vivo expansion and therapeutic potential. Semin. ImmunoL, 2006, 18: 103-10.
5. Lin et al. The quantitative analysis of peripheral blood FOXP3-expressing Т cells in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis patients. Eur. J. Clin. Invest., 2007, 37(12): 987-96.
6. Nelson. IL-2, regulatory Т cells, and tolerance. J. ImmunoL, 2004, 172(7): 3983-8.
7. Bluestone and Tang. Therapeutic vaccination using CD4+CD25+ antigen-specific regulatory Т cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101 Suppl 2: 14622-6.
8. Pentcheva-Hoang et al. B7-1 and B7-2 selectively recruit CTLA-4 and CD28 to the immunological synapse. Immunity, 2004, 21(3): 401-13.
9. Bommireddy and Doetschman. TGFbetal and T(reg) cells: alliance for tolerance. Trends Mol. Med., 2007, 13(11): 492-501.
10. Pyzik and Piccirillo. TGF-betal modulates Foxp3 expression and regulatory activity in distinct CD4+ Т cell subsets. J. Leukoc. Biol, 2007, 82(2): 335-46.
11. Zheng et al. CD4+ and CD8+ regulatory Т cells generated ex vivo with IL-2 and TGF-beta suppress a stimulatory graft-versus-host disease with a lupus-like syndrome. J Immunol, 2004, 172, 1531-9.
12. Morgan et al. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory Т cells. Arthritis Rheum, 2005, 52, 2212-21.
13. Nardelli et al. CD4(+) CD25(+) Т cells prevent arthritis associated with Borrelia vaccination and infection. Clin Diagn Lab Immunol, 2005, 12, 786-92.
14. De Boer et al. Low numbers of FOXP3 positive regulatory Т cells are present in all developmental stages of human atherosclerotic lesions. PLoS ONE, 2007, 2, e779.
15. Cohen et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory Т Cells: new therapeutics for graft-versus-host disease. J Exp Med, 2005, 196, 401-6.
16. Trenado et al. Ex vivo-expanded CD4+CD25+ immunoregulatory Т cells prevent graft-versus-host-disease by inhibiting activation/differentiation of pathogenic Т cells. J Immunol, 2006, 176, 1266-73.
Claims (2)
1. Способ получения ex vivo обогащенной регуляторными СD3+СD28+Fохр3+Т-клетками (Трег) популяции лимфоцитов человека, предусматривающий выделение из периферической крови пациента популяции СВ4+Т-клеток и культивирование их в ростовой среде, содержащей моноклональные антитела к СВ28(анти-СD28) и к CD3 (анти-CD3), TGF-бета 1 и интерлейкин-2 (IL-2), отличающийся тем, что добавляют в ростовую среду анти-СD28 в количестве от 0,5 до 10 мкг/мл, анти-СD3 в количестве от 0,5 до 10 мкг/мл, TGF-бета 1 (1-50 нг на мл) и интерлейкин IL-2 в количестве от 10 до 1000 ед./мл.
2. Способ лечения заболеваний, характеризующихся выраженным снижением количества и/или функциональной активности регуляторных Т-клеток, предусматривающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, обогащенной регуляторными Т-клетками популяции аутологичных лимфоцитов, полученной в соответствии со способом по п.1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008104682/13A RU2391401C2 (ru) | 2008-02-12 | 2008-02-12 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОПУЛЯЦИИ CD4+CD25+Foxp3+ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ex vivo, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008104682/13A RU2391401C2 (ru) | 2008-02-12 | 2008-02-12 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОПУЛЯЦИИ CD4+CD25+Foxp3+ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ex vivo, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008104682A RU2008104682A (ru) | 2010-02-27 |
| RU2391401C2 true RU2391401C2 (ru) | 2010-06-10 |
Family
ID=42127430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008104682/13A RU2391401C2 (ru) | 2008-02-12 | 2008-02-12 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОПУЛЯЦИИ CD4+CD25+Foxp3+ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ex vivo, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2391401C2 (ru) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013014535A1 (en) * | 2011-07-22 | 2013-01-31 | Evrogen Joint Stock Company | Methods and compositions for enhancing t cell diversity |
| RU2514653C1 (ru) * | 2012-12-28 | 2014-04-27 | Елена Владимировна Мартынова | Способ получения лимфоцитов из тонкого кишечника мыши |
| RU2670064C2 (ru) * | 2013-03-14 | 2018-10-17 | Виасайт, Инк. | Дифференцировка in vitro плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические эндодермальные клетки (пэк) и эндокринные клетки |
| US11697688B2 (en) | 2018-03-13 | 2023-07-11 | Tusk Therapeutics Ltd. | Anti-CD25 for tumour specific cell depletion |
| US11879014B2 (en) | 2017-03-17 | 2024-01-23 | Tusk Therapeutics Ltd. | Method of treating cancer or depleting regulatory T cells in a subject by administering a human IGG1 anti-CD25 antibody |
| RU2813668C2 (ru) * | 2014-06-06 | 2024-02-15 | 2сэвэнти био, Инк. | Способ производства t-клеток |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10092597B2 (en) | 2014-01-14 | 2018-10-09 | The University Of Hong Kong | Human CD8+ regulatory T cells inhibit GVHD and preserve general immunity in humanized mice |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2209633C2 (ru) * | 1997-09-19 | 2003-08-10 | Юниверсити Оф Саузерн Калифорниа | Т-клеточная вакцина для лечения рассеянного склероза |
| WO2007110785A2 (en) * | 2006-02-15 | 2007-10-04 | Invitrogen Dynal As | Methods and materials for the generation of regulatory t cells |
-
2008
- 2008-02-12 RU RU2008104682/13A patent/RU2391401C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2209633C2 (ru) * | 1997-09-19 | 2003-08-10 | Юниверсити Оф Саузерн Калифорниа | Т-клеточная вакцина для лечения рассеянного склероза |
| WO2007110785A2 (en) * | 2006-02-15 | 2007-10-04 | Invitrogen Dynal As | Methods and materials for the generation of regulatory t cells |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ELPEK K.G. et al., Ex vivo expansion of CD4+CD25+FoxP3+Т regulatory cells based on synergy between IL-2 and 4-1BB signaling, J. Immunol., 2007, v.179, n.11, p.7295-7304. * |
| PALLANDRE J.R. et al. Role of STATS in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory lymphocyte generation: implications in graft-versus-host disease and antitumor immunity, J. Immunol, 2007, v.179, n.11, p.7593-7604. FU S. et al., TGF-beta induces Foxp3 + T-regulatory cells from CD4 + CD25 - precursors, Am. J. Transplant., 2004, v.4, n.10, p. 1614-1627. ПУХАЛЬСКИЙ А.Л. И ДР. Особенности воспалительного процесса у больных муковисцидозом, Пульмонология, 2006, Приложение. БЫКОВСКАЯ С.Н. и др. Роль дефектов иммуносупрессии в развитии аутоиммунных заболеваний. Научно-практическая ревматология, 2005, N4, с.81-84. * |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013014535A1 (en) * | 2011-07-22 | 2013-01-31 | Evrogen Joint Stock Company | Methods and compositions for enhancing t cell diversity |
| RU2514653C1 (ru) * | 2012-12-28 | 2014-04-27 | Елена Владимировна Мартынова | Способ получения лимфоцитов из тонкого кишечника мыши |
| RU2670064C2 (ru) * | 2013-03-14 | 2018-10-17 | Виасайт, Инк. | Дифференцировка in vitro плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические эндодермальные клетки (пэк) и эндокринные клетки |
| RU2813668C2 (ru) * | 2014-06-06 | 2024-02-15 | 2сэвэнти био, Инк. | Способ производства t-клеток |
| US11879014B2 (en) | 2017-03-17 | 2024-01-23 | Tusk Therapeutics Ltd. | Method of treating cancer or depleting regulatory T cells in a subject by administering a human IGG1 anti-CD25 antibody |
| US11802161B2 (en) | 2018-03-13 | 2023-10-31 | Tusk Therapeutics Ltd. | Anti-CD25 for tumour specific cell depletion |
| US11802160B2 (en) | 2018-03-13 | 2023-10-31 | Tusk Therapeutics Ltd. | Anti-CD25 antibody agents |
| US11814434B2 (en) | 2018-03-13 | 2023-11-14 | Tusk Therapeutics Ltd. | Anti-CD25 for tumour specific cell depletion |
| US11851494B2 (en) | 2018-03-13 | 2023-12-26 | Tusk Therapeutics Ltd. | Anti-CD25 for tumour specific cell depletion |
| US11873341B2 (en) | 2018-03-13 | 2024-01-16 | Tusk Therapeutics Ltd. | Anti-CD25 for tumour specific cell depletion |
| US11787866B2 (en) | 2018-03-13 | 2023-10-17 | Tusk Therapeutics Ltd. | Anti-CD25 antibody agents |
| US11697688B2 (en) | 2018-03-13 | 2023-07-11 | Tusk Therapeutics Ltd. | Anti-CD25 for tumour specific cell depletion |
| US11919960B2 (en) | 2018-03-13 | 2024-03-05 | Tusk Therapeutics Ltd. | Anti-CD25 antibody agents |
| RU2843220C2 (ru) * | 2018-03-13 | 2025-07-08 | Таск Терапьютикс Лтд | Антитело против cd25 для опухоль-специфической клеточной деплеции |
| RU2834232C1 (ru) * | 2019-09-03 | 2025-02-04 | Аллоджен Терапьютикс, Инк. | Способы получения t-клеток для t-клеточной терапии |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2008104682A (ru) | 2010-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Berg et al. | Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells | |
| Trickett et al. | T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads | |
| US9114100B2 (en) | Methods of treatment using ex vivo expansion of cord blood T cells | |
| Torelli et al. | A good manufacturing practice method to ex vivo expand natural killer cells for clinical use | |
| CA2988050A1 (en) | Methods for the production of tcr gamma delta+ t cells | |
| JP6073417B2 (ja) | 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物 | |
| KR20120091012A (ko) | 내추럴킬러 세포의 제조방법 | |
| RU2391401C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОПУЛЯЦИИ CD4+CD25+Foxp3+ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ex vivo, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ | |
| Gregori et al. | Isolation, expansion, and characterization of human natural and adaptive regulatory T cells | |
| Adnan et al. | Human tolerogenic dendritic cells generated with protein kinase C inhibitor are optimal for functional regulatory T cell induction—a comparative study | |
| Chen et al. | Cross regulation by IL-10 and IL-2/IL-12 of the helper T cells and the cytolytic activity of lymphocytes from malignant effusions of lung cancer patients | |
| Davis et al. | Interleukin-7 permits Th1/Tc1 maturation and promotes ex vivo expansion of cord blood T cells: a critical step toward adoptive immunotherapy after cord blood transplantation | |
| US20240398695A1 (en) | Methods of T Cell Expansion and Activation | |
| Bagheri et al. | Current progress in cancer immunotherapy based on natural killer cells | |
| Mazur et al. | Ex vivo expansion and Th1/Tc1 maturation of umbilical cord blood T cells by CD3/CD28 costimulation | |
| Otto et al. | Human γδ T cells from G-CSF-mobilized donors retain strong tumoricidal activity and produce immunomodulatory cytokines after clinical-scale isolation | |
| CA2405050C (en) | Production of tcr gamma delta t cells | |
| Al-Kadhimi et al. | Enrichment of innate immune cells from PBMC followed by triple cytokine activation for adoptive immunotherapy | |
| RU2437933C1 (ru) | СПОСОБ ОБОГАЩЕНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ CD4+CD25+FOXP3+T-КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ex vivo | |
| AU2001248162A1 (en) | Production of TcR gamma delta T cells | |
| Prinz et al. | Therapeutic potential of induced and natural FoxP3+ regulatory T cells for the treatment of Graft-versus-host disease | |
| WO2012018930A1 (en) | Methods of isolating and expanding human t regulatory cells and uses thereof for cellular therapy | |
| WO1990004633A1 (en) | ACTIVATION AND GROWTH OF HUMAN TUMOR-INFILTRATING LYMPHOCYTES USING ANTIBODIES TO CD3 OR TcR | |
| Kellner et al. | Ex vivo generation of umbilical cord blood T regulatory cells expressing the homing markers CD62L and cutaneous lymphocyte antigen | |
| US20030157060A1 (en) | Production of tcr gamma delta t cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110213 |