RU2437933C1 - СПОСОБ ОБОГАЩЕНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ CD4+CD25+FOXP3+T-КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ex vivo - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Способ обогащения регуляторными CD4+CD25+FOXP3+ Т-клеток человека ex vivo заключается в выделении из периферической крови пациента популяции CD4+ Т-клеток и культивировании их в ростовой среде, содержащей 5-10% аутологичной сыворотки, 10-1000 единиц/мл интерлейкина-2, 0,5-10 мкг/мл моноклональных антител против CD3-антигена человека, 0,1-10 мкг/мл моноклональных антител против СБ28-антигена человека и 1-50 нг/мл трансформирующего ростового фактора-бета1 на 1 мл ростовой среды. Изобретение позволяет получить богатую регуляторными Т-клетками популяцию аутологичных лимфоцитов, пригодную для лечения заболеваний, характеризующихся выраженным снижением количества и/или функциональной активности регуляторных Т-клеток. 6 ил., 1 табл.

Description

Изобретение относится к области клеточной биотехнологии, фармакологии и медицины и может быть использовано как в научных целях, так и в практической медицине - при лечении заболеваний, для которых характерно снижение количества и/или функциональной активности регуляторных Т-клеток. К таким заболеваниям относится ряд аутоиммунных заболеваний (рассеянный склероз, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, псориаз и другие), аллергические заболевания, отторжение трансплантата, реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ), развивающаяся у ряда больных при неродственной пересадке костного мозга, и т.д.

Большинство Т-клеток, обладающих регуляторной активностью, принадлежат к субпопуляции CD4⁺ лимфоцитов. Характерным признаком CD4⁺ Т_рег является экспрессия на их поверхности α-цепи рецептора интерлейкина-2 (IL-2). CD25 может также экспрессироваться при активации лимфоцитов, однако при этом количество рецепторов на одной клетке невелико, и, следовательно, при обработке такой клетки антителами, с клеткой свяжется малое количество молекул флуоресцентного красителя; при флуоресцентном анализе это будет выражаться в относительно слабом свечении (флуоресценции) клетки. Такие клетки обычно называют CD25^low или CD25^dim. Если же на одной клетке находится много рецепторов, то при анализе такие клетки светятся ярко и их называют CD25^hi или CD25^bright; именно такими CD25^hi клетками являются Т_рег. Для активации, развития и осуществления функции Т_рег необходима также инициация ядерного фактора транскрипции, связанного с Х-хромосомой (Foxp3), который считается уникальным цитоплазматическим маркером Т-регуляторов [1].

Т_рег экспрессируют также широкий спектр маркеров, характерных как для поздней стадии дифференцировки Т-клеток, так и для их активации. К таким маркерам относятся CD45RO (маркер клеток памяти), маркер активации CD69, GITR (глюкокортикоид-индуцированный рецептор фактора некроза опухоли), CD62L (L-селектин, маркер недавно активированных покоящихся клеток), цитотоксическая молекула CTLA-4 (CD 152), с помощью которой, возможно, осуществляются ингибиторные функции Т_рег [2].

Т_рег также отличаются выраженной функциональной активностью - способностью подавлять in vitro пролиферацию и функцию клеток-мишеней, к которым могут относиться CD4⁺, CD4⁺CD25^- или CD8⁺ клетки, а также NK- и В-лимфоциты [3].

После культивирования в условиях ex vivo Т_рег могут быть введены больному для коррекции количественных и/или функциональных патологий Т-регуляторов [4].

Необходимо подчеркнуть, что наиболее актуальной является задача культивирования регуляторных Т-клеток самого пациента (аутологичных), а не донора (аллогенных), так как трансплантация аллогенных клеток может сопровождаться их быстрым отторжением и требует применения иммуносупрессивной терапии, что неприемлемо для больных с уже подавленным собственным иммунитетом. Кроме того, в настоящее время к донорским препаратам крови и других тканей установлены очень высокие требования по безопасности их использования.

Содержание CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Т_рег в периферической крови здорового донора в среднем составляет 3,8±1,3% от общего содержания Т-клеток. При ряде патологий, например при системной красной волчанке, наряду со снижением функциональной активности Т_рег их количество снижается (до 0,5-0,9%) [5]. В силу этого возможность увеличить количество Т_рег, выделяемых из небольшого количества биологического материала самого пациента, культивированием их в условиях ex vivo имеет большую практическую значимость.

Основной проблемой культивирования регуляторных Т-клеток с характеристиками CD4⁺CD25^hiFoxp3⁺ является их анергичность, то есть неспособность отвечать пролиферацией на стимуляцию Т-клеточного рецептора (TCR). Таким образом для достижения поставленных целей необходимо преодолеть указанную анергичность, но при этом получаемые в результате клетки должны стабильно экспрессировать характерные для Т_рег маркеры и, кроме того, сохранять свою функциональную активность.

Задача изобретения - способ обогащения популяции Т-лимфоцитов регуляторными Т-клетками (Т_рег) со стабильными характеристиками.

Поставленная задача решается способом обогащения регуляторных CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ Т-клеток человека ex vivo, заключающимся в том, что из периферической крови пациента выделяют популяцию CD4⁺ Т-клеток и культивируют их в ростовой среде, содержащей 5-10% аутологичной сыворотки, 10-1000 единиц/мл интерлейкина-2, 0,5-10 мкг/мл моноклональных антител против CD3-антигена человека, 0,1-10 мкг/мл моноклональных антител против CD28-антигена человека и 1-50 нг/мл трансформирующего ростового фактора-β1 на 1 мл ростовой среды с последующим концентрированием клеток центрифугированием и отмыванием физиологическим раствором.

Интерлейкин-2 (IL-2) отвечает за множество иммунологических функций, из которых наиболее известна его способность вызывать пролиферацию и созревание активированных Т-клеток. IL-2 активируется после связывания со сложным рецепторным комплексом, одним из компонентов которого является CD25 - рецептор α-цепи IL-2 CD25 [6].

Моноклональные антитела к CD3-рецептору (анти-СD3) связываются с CD3-рецептором, который является частью комплекса TCR - Т-клеточного рецептора, который экспрессирован на зрелых Т-клетках и тимоцитах. Связывание рецептора с антителами приводит к неспецифической активации и пролиферации CD3⁺ Т-клеток [7].

Моноклональные антитела к молекуле CD28 (анти-СЭ28) связываются с CD28-антигеном, который является костимуляторной молекулой при активации TCR. CD28 усиливает пролиферацию Т-клеток за счет увеличения транскрипции и стабильности мPHK IL-2 [8].

Трансформирующий ростовой фактор-β1 (TGF-β1) - это иммунорегуляторный цитокин, который участвует в поддержании Т-клеточного гомеостаза, задействован в функционировании регуляторных и эффекторных Т-клеток [9], кроме того, TGF-β1 модулирует экспрессию Т_рег белка Foxp3 [10].

Изобретение может быть использовано в полученной в соответствии с раскрытым выше способом обогащения регуляторными Т-клетками (Т_рег) популяции аутологичных лимфоцитов для лечения заболевания, характеризующегося выраженным снижением количества и/или функциональной активности регуляторных Т-клеток. Такой способ предусматривает введение пациенту, у которого ранее были отобраны исходные CD4⁺ Т-лимфоциты, обогащенной Т_рег популяции лимфоцитов, полученной путем обработки исходных клеток раскрытой выше смесью цитокинов и антител. Заболевания, которые могут подвергаться лечению в соответствии с указанным способом в т.ч., включают в себя аутоиммунные заболевания (рассеянный склероз, системная красная волчанка [11], ревматоидный артрит [12, 13], псориаз [14] и другие), аллергические заболевания, отторжение трансплантата, реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [15, 16] и т.д.

Изобретательский уровень работы обеспечивается тем, что, используя известные цитокины и антитела в определенном диапазоне концентраций для обработки CD4⁺ Т-лимфоцитов ex vivo, автор добился высокой гомогенности (более 88%) получаемой популяции регуляторных Т-клеток, что позволит уменьшить необходимый объем забираемого у пациента исходного клеточного материала и при этом повысить эффективность лечения. Кроме того, как результат данного технического решения была достигнута высокая скорость пролиферации клеток, что позволило ограничить время культивирования клеток до 7-9 суток и избежать таким образом проблем, связанных с длительным культивированием клеток.

На фигуре 1 представлен пример экспрессии маркеров регуляторных Т-клеток в суспензии мононуклеарных клетках здорового донора. (A) CD4⁺CD25⁺ и CD4⁺CD25^hi; (Б) Foxp3; (В) CD 152 (CTLA-4). (А) 12,6% CD4⁺ Т-клеток коэкспрессирует также маркер CD25⁺. При этом у 5,9% таких CD4⁺CD25⁺ клеток наблюдалось яркое свечение маркера CD25, позволившее обозначить клетки как CD4⁺CD25^hi. Кроме того, 4,4% CD4⁺CD25⁺ Т-клеток коэкспрессируют также маркер Foxp3 (Б), а 5,1% - маркер CD152 (В).

На фигуре 2 представлен пример экспрессии маркеров Т_рег в популяции CD4⁺ Т-лимфоцитов. (A) CD4⁺CD25⁺ и CD4⁺CD25^hi; (Б) Foxp3; (В) CD152 (CTLA-4). (А) 29,7% CD4⁺ Т-клеток коэкспрессирует также маркер CD25⁺, а 14,4% таких CD4⁺CD25⁺ клеток являются CD4⁺CD25^hi. Кроме того, 6,9% CD4⁺CD25⁺ Т-клеток коэкспрессирует также маркер Foxp3 (Б), а 7,2% - маркер CD152 (В).

На фигуре 3 представлен пример экспрессии маркеров Т_рег в клетках после культивирования в течение 7 суток. (A) CD4⁺CD25⁺ и CD4⁺CD25^hi; (Б) Foxp3; (В) CD152 (CTLA-4). (А) После культивирования 99,9% CD4⁺ клеток коэкспрессирует CD25⁺, причем 99,7% из них являются CD4⁺CD25^hi. После культивирования Foxp3 коэкспрессируется на 88,6% (Б), a CTLA-4 - на 94,4% (В) CD4⁺CD25⁺ клеток. Таким образом, полученные после культивирования клетки имеют характерный для Т-регуляторов фенотип.

На фигуре 4 показано изменение общего количества клеток (серые столбики диаграммы) и количества Т_рег (заштрихованные столбики диаграммы) в культуре в зависимости от срока культивирования. На 6 сутки культивирования общее количество клеток увеличивалось в 10,0±4,9 раза, количество Т_рег - в 41,2±37,4 раза. К 8 дню культивирования кратность увеличения составляла 21,2±4,3 и 122,2±27,9 соответственно.

На фигуре 5 представлен пример цитометрического анализа функциональной активности Т_рег.(А) Пролиферация клеток-мишеней в отсутствие и (Б) в присутствии регуляторных Т-клеток.

На фигуре 6 представлен результат исследования супрессорной активности культивированных Т_рег. В случае использования в качестве клеток-мишеней CD4⁺ (А) нативные Т_рег подавляли пролиферацию на 76,3%, а культивированные - на 82,4%; в случае использования CD4⁺CD25^- (Б) эти цифры составляли 87,9% и 86,7% соответственно.

Выделение и культивирование CD4⁺CD25⁺

Все процедуры проводили в ламинарных шкафах II класса биологической защиты, расположенных в стерильном блоке с подачей воздуха по регламенту GМP, с использованием стерильной одноразовой пластиковой посуды и стерильных реагентов.

Периферическую кровь из локтевой вены пациента забирали в стерильные пробирки, содержащие антикоагулянт К₂-ЭДТА, ЭДТА или раствор гепарина. Кровь также собирали в сухие пробирки, не содержащие активаторов свертывания, для получения аутологичной сыворотки крови пациента. Содержимое пробирок с кровью и антикоагулянтом тщательно перемешивали, аккуратно переворачивая пробирку пробкой вниз несколько раз.

Для получения сыворотки крови больного пробирки с кровью без антикоагулянта выдерживали в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте. Пробирки центрифугировали при 580 g в течение 10 минут, надосадочную жидкость (сыворотку крови) собирали в стерильные пробирки и инкубировали в течение 40 минут на водяной бане при температуре 56°C для инактивации компонентов комплемента. Сыворотку разливали в криопробирки в объеме 1 мл и замораживали.

Выделение мононуклеарных клеток (MHK)

Кровь из пробирок с антикоагулянтом переносили в стерильную пробирку емкостью 50 мл. Кровь разводили в соотношении 1:1 фосфатным буферным раствором (PBS) без ионов кальция и магния (PBS Ca²⁺Mg²⁺free, Gibco, Великобритания) и затем для выделения лимфоцитов наслаивали на градиентный раствор LimphoSep (d=1,077 g/ml, MP Biomedicals, США) в пробирках емкостью 50 мл.

Пробирки центрифугировали при 400 g в течение 30 мин при 20°C; в результате центрифугирования в градиенте фиколла эритроциты и гранулоциты опускались на дно пробирки, а фракция мононуклеарных клеток в виде плотного кольца концентрировалась между двумя слоями на поверхности градиента. Фракцию МНК отбирали пипеткой, разводили PBS и два раза отмывали центрифугированием в течение 10 минут (300 g, 20°C). Супернатант отбрасывали.

Осадок клеток разводили в 10 мл PBS, 0,5 мл клеток отбирали для подсчета количества выделенных МНК и проведения их цитометрического анализа.

Для определения количества живых МНК к 20 мкл клеточной суспензии добавляли 20 мкл красителя Трипановый синий (Gibco, Великобритания). Подсчет клеток производили в гемоцитометре, процент живых клеток составлял не менее 95%.

Для оценки количества клеток CD4⁺CD25⁺, CD4⁺CD25^hi, CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ в мононуклеарной фракции клеточную суспензию окрашивали соотвествующими антителами и процент указанных выше клеток в исходной клеточной взвеси определяли на приборе FACSCalibur (BD Bioscience).

Пример экспрессии характерных для Т_рег маркеров в МНК здорового донора представлен на фигуре 1.

Сепарация СD4⁺ из МНК на колонках в магнитном поле по методике MACS (Miltenyi Biotec, Германия)

Суспензию МНК осаждали центрифугированием (10 минут, 300 g, 20°C), после чего клетки отмывали 1 раз в течение 10 минут при 300 g и температуре 4°C, используя 10 мл буфера, содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,5% антикоагулянтного раствора цитрата декстрозы в растворе PBS (буфер ACD-A).

Осадок клеток разводили ACD-A из расчета 0,08 мл буфера на 1×10⁷ клеток. В полученную суспензию добавляли коллоидные парамагнитные микрочастицы, конъюгированные с моноклональным мышиным антителом против рецептора CD4 лимфоцитов человека (Miltenyi Biotec, Германия) из расчета 0,02 мл микрочастиц на 1×10⁷ клеток. Полученную смесь инкубировали в течение 15 минут при 4°C.

После инкубации к суспензии клеток добавляли 10 мл ACD-A и центрифугировали 10 минут при 300 g и 4°C. Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в ACD-A из расчета 0,5 мл буфера на 1×10⁸ клеток и наносили на требуемую колонку для позитивной селекции, находившуюся в магнитном поле.

Колонку промывали соответствующим ей количеством ACD-A, выносили из магнитного поля и поршнем выдавливали позитивную фракцию, содержавшую CD4⁺ клетки, в стерильную пробирку. Часть клеток (0,1 мл) отбирали для подсчета количества выделенных позитивных клеток и определения чистоты клеточной суспензии.

Для оценки чистоты суспензии выделенных CD4⁺  клеток их окрашивали соответствующими антителами и анализировали методом проточной цитометрии. Степень чистоты CD4⁺  клеток составляла в среднем 94±4% (n=19).

На фигуре 2 на примере периферической крови донора показана экспрессия характерных для Т_рег маркеров в популяции выделенных CD4⁺ Т-клеток. Повышенные значения экспрессии каждого из маркеров по сравнению с таковыми, представленными на фигуре 1, объясняются тем, что на фигуре 1 процент экспрессии дан относительно всей популяции МНК, а на фигуре 2 - относительно популяции выделенных из них CD4⁺ клеток, которые, в среднем, составляют около 40% от МНК. Таким образом, если количество CD4⁺CD25⁺ клеток во фракции МНК составляет 12,6% (фигура 1А), то количество тех же клеток относительно фракции CD4⁺ составляет 29,7% (фигура 2А).

Получение ex vivo (генерация и экспансия) клеток CD4⁺CD25⁺

Жидкая культуральная система состояла из среды RPMI-1640, содержащей феноловый красный, L-глутамин и 25 мМ HEPES (Gibco, Великобритания) с добавлением 5-10% аутологичной сыворотки и 1% раствора пенициллина-стрептомицина (Gibco, Великобритания). В культуральную среду добавляли трансформирующий ростовой фактор-β1 (TGF-β1) в концентрации 1-50 нг/мл (R&D Systems, Великобритания), 10-1000 единиц/мл интерлейкина-2 (IL-2, R&D Systems, Великобритания), 0,5-10 мкг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому рецептору CD3 (МедБиоСпектр, Россия) и 0,1-10 мкг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому рецептору CD28 (BD Pharmingen, США).

Клетки культивировали во флаконах площадью 25 см² или 75 см² в CO₂-инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Свежую среду и ростовые факторы добавляли каждые 3-4 суток. Время культивирования составляло 7-12 суток.

Фенотипические характеристики Т-регуляторных клеток после культивирования

В Таблице 1 представлены результаты цитометрического анализа CD4⁺ T-клеток до начала и через 7 суток культивирования.

Таблица 1
Фенотипические характеристики популяции CD4+ Т-клеток до начала и через 7 суток культивирования
	До культивирования	После культивирования
CD4+	93,9±4,5	99,8±0,2
CD4+CD25+	28,4±8,3	97,9±1,7
CD4+CD25hi	15,7±4,0	95,9±2,4
CD4+CD25+CD62L+	18,8±9,0	54,6±3,8
CD4+CD25+Foxp3+	6,1±4,8	89,6±3,2
CD4+CD25+CD152+	5,4±2,7	93,8±3,0

Характерный пример экспрессии маркеров регуляторных Т-клеток после 7 суток культивирования проиллюстрирован фигурой 3.

Экспансия Т-регуляторных клеток

По прошествии 6-8 суток культивирования общее количество клеток увеличивалось в среднем по группе в 14,2±9,9 раза, а количество CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ регуляторных Т-клеток - в 60,3±42,6 раза. На фигуре 4 показано увеличение общего количества (серые столбики диаграммы) и количества Т_рег (заштрихованные столбики диаграммы) в зависимости от срока культивирования. Так, если на 6 сутки культивирования общее количество клеток увеличивается в 10,0±4,9 раза, а количество Т_рег - в 41,2±37,4 раза, то на 8 сутки культивирования кратность увеличения составляла 21,2±4,3 и 122,2±27,9 соответственно.

Оценка супрессорной активности регуляторных Т-клеток до и после культивирования

Функциональную активность нативных и культивированных Т_рег сравнивали по их способности ингибировать пролиферацию клеток-мишеней в смешанной культуре лимфоцитов. Для этого аутологичные клетки-мишени CD4⁺, CD4⁺CD25^-, выделенные методом магнитной сепарации и окрашенные витальным красителем сукцидимидным эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE, Fluka, США), инкубировали в отсутствие или в присутствии равного (1:1) количества нативных (свежевы деленных) или культивированных Т_рег. Стимуляцию пролиферации производили аллогенными антиген-презентирующими клетками (обработанными митомицином С мононуклеарными клетками с удаленными методом магнитной сепарации CD3⁺ Т-лимфоцитами) в присутствии 5 мкг/мл моноклональных антител против СD3-антигена. Инкубацию проводили в течение 5-6 суток в 96-луночных круглодонных стерильных планшетах в CO₂-инкубаторе. По окончании инкубации клетки из лунок собирали, отмывали от среды, окрашивали антителами против антигенов CD25 и CD4 и анализировали на проточном цитофлуориметре.

Характерные примеры пролиферации клеток-мишеней (CD4⁺CD25^-) в отсутствие (А) и в присутствии (Б) регуляторных Т-клеток приведены на фигуре 5.

Вычисляли индекс пролиферации (ИП) клеток-мишеней в каждом из типов лунок. Для этого учитывали количество клеток в каждом поколении (M1-М6 на фигуре 5), а вычисление ИП производили делением суммы клеток во всех поколениях на сумму родительских клеток-предшественников. Количество родительских клеток-предшественников вычисляли делением количества клеток в данном поколении на 2^х, где x - номер поколения. Чем индекс пролиферации выше, тем сильнее пролиферируют клетки.

На фигуре 6 представлены результаты исследования супрессорной активности регуляторных клеток до и после 7 суток культивирования. Показана пролиферация CD4⁺(А) и CD4⁺CD25^- клеток (Б) в присутствии или в отсутствие культивированных или нативных Т-регуляторов. Видно, что пролиферация клеток-мишеней была сильно подавлена при культивировании их в присутствии Т_рег (серые столбики), причем супрессорная активность нативных и культивированных Т_рег практически не отличалась, а сами супрессорные клетки не пролиферировали.

Пример конкретного осуществления способа:

Культуральная система состоит из среды RPMI-1640, содержащей феноловый красный, L-глутамин и 25 мМ HEPES (Gibco, Великобритания) с добавлением 5% аутологичной сыворотки и 1% раствора пенициллина-стрептомицина (Gibco, Великобритания). В культуральную среду добавляют трансформирующий ростовой фактор-β1 (TGF-β1) в концентрации 40 нг/мл (R&D Systems, Великобритания), 10 единиц/мл интерлейкина-2 (IL-2, R&D Systems, Великобритания), 100 нг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому рецептору CD3 (МедБиоСпектр, Россия) и 0,5 мкг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому рецептору CD28 (BD Pharmingen, США).

Клетки культивируют во флаконах площадью 25 см² или 75 см² в CO₂-инкубаторе при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Свежую среду и ростовые факторы добавляют каждые 3-4 суток. Время культивирования составляло 9 суток.

Способ изобретения позволяет повысить количество регуляторных Т-клеток в среднем в 60 раз.

Источники информации

1. Baratelli et al. Prostaglandin E2 induces FOXP3 gene expression and T regulatory cell function in human CD4+ T cells. J. Immunol., 2005, 175 (3): 1483-90.

2. Cao et al. Hepatocellular carcinoma cell supernatants increase expansion and function of CD4(+)CD25(+) regulatory T cells. Lab. Invest., 2007, 87 (6):582-90.

3. Earle et al. In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells suppress effector T cell proliferation. Clin. Immunol., 2005, 115(l):3-9.

4. Masteller et al. Antigen-specific regulatory T cells - Ex vivo expansion and therapeutic potential. Semin. Immunol., 2006, 18:103-10.

5. Lin et al. The quantitative analysis of peripheral blood FOXP3-expressing T cells in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis patients. Eur. J. Clin. Invest., 2007, 37 (12):987-96.

6. Nelson. IL-2, regulatory T cells, and tolerance. J. Immunol., 2004, 172 (7):3983-8.

7. Bluestone and Tang. Therapeutic vaccination using CD4+CD25+ antigen-specific regulatory T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101 Suppl 2:14622-6.

8. Pentcheva-Hoang et al. B7-1 and B7-2 selectively recruit CTLA-4 and CD28 to the immunological synapse. Immunity, 2004, 21(3):401-13.

9. Bommireddy and Doetschman. TGFbeta1 and T(reg) cells: alliance for tolerance. Trends Mol. Med., 2007, 13 (11):492-501.

10. Pyzik and Piccirillo. TGF-beta1 modulates Foxp3 expression and regulatory activity in distinct CD4+T cell subsets. J. Leukoc. Biol., 2007, 82 (2): 335-46.

11. Zheng et al. CD4+ and CD8+ regulatory T cells generated ex vivo with IL-2 and TGF-beta suppress a stimulatory graft-versus-host disease with a lupus-like syndrome. J Immunol, 2004, 172, 1531-9.

12. Morgan et al. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis Rheum, 2005, 52, 2212-21.

13. Nardelli et al. CD4(+) CD25(+) T cells prevent arthritis associated with Borrelia vaccination and infection. Clin Diagn Lab Immunol, 2005, 12, 786-92.

14. de Boer et al. Low numbers of FOXP3 positive regulatory T cells are present in all developmental stages of human atherosclerotic lesions. PLoS ONE, 2007, 2, e779.

15. Cohen et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T Cells: new therapeutics for graft-versus-host disease. J Exp Med, 2005, 196, 401-6.

16. Trenado et al. Ex vivo-expanded CD4+CD25+ immunoregulatory T cells prevent graft-versus-host-disease by inhibiting activation/differentiation of pathogenic T cells. J Immunol, 2006, 176, 1266-73.

Claims (1)

1. Способ обогащения регуляторных CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ Т-клеток человека ex vivo, заключающийся в том, что из периферической крови пациента выделяют популяцию CD4⁺ Т-клеток и культивируют их в ростовой среде, содержащей 5-10% аутологичной сыворотки, 10-1000 единиц/мл интерлейкина-2, 0,5-10 мкг/мл моноклональных антител против CD3-антигена человека, 0,1-10 мкг/мл моноклональных антител против CD28-антигена человека и 1-50 нг/мл трансформирующего ростового фактора-β1 на 1 мл ростовой среды с последующим концентрированием клеток центрифугированием и отмыванием физиологическим раствором.

Images