JP2022017361A - 多能性幹細胞の膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）および内分泌細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化 - Google Patents

多能性幹細胞の膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）および内分泌細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化 Download PDF

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Abstract

【課題】ヒト未成熟内分泌細胞集団を作製する方法を提供する。【解決手段】単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成する方法であって、ヒト胚体内胚葉系列細胞をインビトロでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生じさせることを含み、ここで、前記単能性ヒト未成熟ベータ細胞はＩＮＳ、ＮＫＸ６．１、およびＭＡＦＢを発現しＮＧＮ３を実質的に発現しない、方法である。【選択図】図４５

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、その開示全体が本明細書に組み込まれる、２０１３年３月１４日出願の米国
特許仮出願第６１／７８１，００５号および２０１３年１２月１３日出願の米国実用出願
第１４／１０６，３３０号の優先権を主張するものである。
本発明は、一般に、細胞培養物の単離、維持、および使用に関する。より具体的には、
本発明は、多能性幹細胞を、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）が濃縮さ
れているが、内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）が比較的豊富な膵臓内胚葉細胞（
ＰＥＣ）培養物にｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分化させるための細胞組成物および方法に関
する。本明細書には、初めて、多能性幹細胞を、哺乳動物に埋め込んだ後にｉｎ ｖｉｖ
ｏでグルコース刺激に応答してインスリンを生成する内分泌細胞に、ｉｎ ｖｉｔｒｏに
おいて分化させるための細胞組成物および方法も記載されている。本明細書には、多能性
幹細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでインスリンを生成する内分泌細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏにお
いて分化させるための細胞組成物および方法も記載されている。
細胞移植に使用することができるヒト膵臓β細胞の拡張集団の開発は糖尿病研究の主要
な目標である。近年は、多能性幹細胞をβ細胞の潜在的な再生可能供給源として使用する
ことに注目が集まっている。膵内分泌系分化は性質が複雑であるので、現在のところまだ
解明されておらず、多能性幹細胞から成熟かつ機能的なβ細胞への分化はｉｎ ｖｉｔｒ
ｏにおいて効率的に実現されていない。現在まで、膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）などの前駆
細胞のみがげっ歯類に移植されており、８～１２週間後に、ヒト特異的β細胞機能が実証
されている。ＰＥＣ細胞集団は、少なくとも２種の細胞集団：非内分泌多分化能膵臓前駆
体亜集団（ＣＨＧＡ－）および内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）を含む。ＰＥＣ
を埋め込んだ際にｉｎ ｖｉｖｏで成熟しβ細胞を形成するのは非内分泌多分化能膵臓前
駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）であることが発見された。ＰＥＣ細胞集団の移植には、ｉｎ
ｖｉｖｏにおける長い成熟化時間が必要であり（８～１２週間）、これは、（ａ）ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ＰＥＣ集団がｉｎ ｖｉｖｏでβ細胞に成熟する細胞型（すなわち、非内分
泌多分化能膵臓前駆細胞（ＣＨＧＡ－））をより多く含有する場合、（ｂ）最終（β細胞
）分化がｉｎ ｖｉｔｒｏで実現される場合、または（ｃ）現在使用されているものより
もさらに分化経路に沿って進んだｉｎ ｖｉｔｒｏ前駆体集団、すなわち、発生的に進歩
した細胞集団が同定される場合に、短縮または排除することができる。
本出願をいかなる理論の１つに限定するものではないが、なぜ多能性幹細胞がｉｎ ｖ
ｉｔｒｏにおいて十分に機能的なβ細胞に成熟しないかに関する可能性のある説明は、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで導出された細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける哺乳動物の膵臓発生と同じ
時点で同じマーカーの発現を有さないことである。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分
化の間のＮＧＮ３発現はｉｎ ｖｉｖｏにおける哺乳動物の膵臓発生よりも前に起こる。
実際に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる出願人の多くの刊行物および
特許に記載されている従来の４ステージ分化プロトコルでは、ＰＥＣ集団はＮＧＮ３およ
びＫＸ２．２を発現することが観察されている。したがって、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１同
時陽性（ｃｏ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団の分化が発現さ
れる後までＮＧＮ３発現を抑制または阻害することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける多能性
幹細胞から成熟かつ機能的なβ細胞への分化、あるいは、内分泌系列に傾倒した細胞（Ｃ
ＨＧＡ＋）と比較して非内分泌多分化能膵臓前駆細胞（ＣＨＧＡ－）をより多く含有する
ＰＥＣ集団の分化を実現することにおける重要なステップである。
ＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２の発現を遅延させるプロトコルの同定は、自明なことでは
ない。なぜならば、その分化プロトコルにより、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（Ｃ
ＨＧＡ－）の形成が撹乱されるべきではなく、好ましくはそれが増加するべきであり、ま
た、細胞の損失が最小限になるべきであり、あるいは最低でも適切な細胞質量および細胞
収量（すなわち、細胞のマイクログラム数、グラム数、キログラム数）が維持されるべき
だからである。
さらに、ＮＧＮ３発現は内分泌細胞分化の開始、膵島細胞の成熟化の促進および島機能
の維持に必要であるので、内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）におけるＮＧＮ３発
現の刺激または誘導は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける多能性幹細胞から成熟かつ機能的なβ
細胞への分化を実現することにおける重要なステップである。
一態様では、ヒトＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を生成するｉｎ ｖｉｔ
ｒｏにおける方法が提供される。当該方法は、胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎ
ｄｏｄｅｒｍ）系列細胞を含む細胞集団をＴＧＦβスーパーファミリー成長因子およびＷ
ｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細
胞集団を生じさせるステップを含む。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー
成長因子は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＧＤＦ８
、ＧＤＦ－１０、ＧＤＦ－１１およびＧＤＦ－１５からなる群から選択される。複数の実
施形態では、当該方法は、胚体内胚葉系列細胞を含む細胞集団をＥＲＢＢ受容体キナーゼ
活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む。複数の実施形態では、ＴＧＦβスー
パーファミリー成長因子はアクチビンＡである。複数の実施形態では、Ｗｎｔファミリー
メンバーはＷｎｔ３ａである。複数の実施形態では、ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用
物質はヘレグリンである。
複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を少なくとも２５ｎ
ｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる。複数の実施形態では、Ｐ
ＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパ
ーファミリー成長因子と接触させる。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞
を含む細胞集団を少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接
触させる。
複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を少なくとも２５ｎ
ｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性
膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバー
と接触させる。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を少な
くとも７５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる。
複数の実施形態では、細胞集団をＴＧＦβスーパーファミリー成長因子およびＷｎｔフ
ァミリーメンバーのそれぞれの５分の１～１５分の１のＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作
用物質と接触させる。複数の実施形態では、前記ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞
集団の少なくとも約５０％がＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞である。複数の実施形態では、
ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団の少なくとも約６０％がＰＤＸ１陽性膵臓内
胚葉細胞である。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団の少
なくとも約７０％がＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞である。複数の実施形態では、ＰＤＸ１
陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団の少なくとも約８０％がＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞
である。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団の少なくとも
約９０％がＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞である。
複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞は、ＮＫＸ６．１をさらに発現し、
ＮＧＮ３は実質的に発現しない。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞はＣ
ＨＧＡを発現しない。複数の実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞は、ＮＫＸ６．
１およびＰＦＴ１Ａをさらに発現し、ＮＧＮ３は実質的に発現しない。複数の実施形態で
は、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞は単能性の未成熟ベータ細胞に分化することができる多
分化能細胞である。
一態様では、胚体内胚葉系列細胞ならびにＴＧＦβスーパーファミリー成長因子および
Ｗｎｔファミリーメンバーを含むヒト膵臓内胚葉細胞培養物が提供される。複数の実施形
態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビ
ンＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＧＤＦ８、ＧＤＦ－１０、ＧＤＦ－１１およびＧＤＦ－１５
からなる群から選択される。複数の実施形態では、当該方法は、胚体内胚葉系列細胞を含
む細胞集団をＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む
。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子はアクチビンＡである。複
数の実施形態では、ＷｎｔファミリーメンバーはＷｎｔ３ａである。複数の実施形態では
、ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質はヘレグリンである。
別の態様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ単能性ヒト未成熟ベータ細胞が提供される。複数の実
施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞はＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ
３を実質的に発現しない。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞は、成熟ベ
ータ細胞に分化することができる。複数の実施形態では、分化はｉｎ ｖｉｖｏにおける
ものである。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞は、細胞集団の一部を形
成する。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも１０％が未成熟ベータ細胞である。
複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも２０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実
施形態では、細胞集団の少なくとも３０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態で
は、細胞集団の少なくとも４０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞
集団の少なくとも５０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少
なくとも６０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも
８０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも９０％が
未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも９８％が未成熟ベ
ータ細胞である。複数の実施形態では、ヒト未成熟ベータ細胞は単一ホルモン性（ｓｉｎ
ｇｌｙ ｈｏｒｍｏｎａｌ）である。複数の実施形態では、単能性ヒト細胞はＭＡＦＢを
発現する。
一態様では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成する方法が提供される。当該方法は、
ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよ
びＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞を生じさせるス
テップを含む。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞はＩＮＳ、ＮＫＸ６．
１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーフ
ァミリーメンバーは、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、
ＧＤＦ８、ＧＤＦ－１０、ＧＤＦ－１１およびＧＤＦ－１５からなる群から選択される。
複数の実施形態では、当該方法は、ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＲＢ
Ｂ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む。複数の実施形態で
は、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子はアクチビンＡである。複数の実施形態では、
ＷｎｔファミリーメンバーはＷｎｔ３ａである。複数の実施形態では、ＥＲＢＢ受容体キ
ナーゼ活性化作用物質はヘレグリンである。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファ
ミリー成長因子はＢＭＰである。
複数の実施形態では、当該方法は、ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでニコ
チンアミド、レチノイン酸もしくはレチノイン酸類似体、ｒｈｏキナーゼ阻害剤またはガ
ンマセレクターゼ阻害剤と接触させるステップをさらに含む。複数の実施形態では、レチ
ノイン酸は、オールトランス－レチノイン酸（ＲＡ）、１３－シス－レチノイン酸（１３
－シス－ＲＡ）、およびアロチノイド酸（ＴＴＮＰＢ）からなる群から選択される。複数
の実施形態では、レチノイン酸はオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）である。複数の実
施形態では、レチノイン酸は１３－シス－レチノイン酸（１３－シス－ＲＡ）である。複
数の実施形態では、レチノイン酸はアロチノイド酸（ＴＴＮＰＢ）である。複数の実施形
態では、ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、ファスジル、Ｈ－１１５２Ｐ、Ｗｆ
－５３６およびＹ－３０１４１からなる群から選択される。複数の実施形態では、ｒｈｏ
キナーゼ阻害剤はＹ－２７６３２である。
複数の実施形態では、ガンマセレクターゼ阻害剤は、ガンマセレクターゼ阻害剤Ｉ（Ｇ
ＳＩ Ｉ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＩ（ＧＳＩ ＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害
剤ＩＩＩ（ＧＳＩ ＩＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＶ（ＧＳＩ ＩＶ）、ガンマ
セレクターゼ阻害剤Ｖ（ＧＳＩ Ｖ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＶＩ（ＧＳＩ ＶＩ）
、ガンマセレクターゼ阻害剤ＶＩＩ（ＧＳＩ ＶＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＸ
（ＧＳＩ ＩＸ）、（ＤＡＰＴ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩ（ＧＳＩ ＸＩ）、ガ
ンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＩ、（ＧＳＩ ＸＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＩ
Ｉ（ＧＳＩ ＸＩＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＶ（ＧＳＩ ＸＩＶ）、ガンマ
セレクターゼ阻害剤ＸＶＩ（ＧＳＩ ＸＶＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＶＩＩ（Ｇ
ＳＩ ＸＶＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＸ（ＧＳＩ ＸＩＸ）、ガンマセレク
ターゼ阻害剤ＸＸ（ＧＳＩ ＸＸ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＸＩ（ＧＳＩ ＸＸＩ
）、ガンマ４０ セレクターゼ阻害剤Ｉ、ガンマ４０セレクターゼ阻害剤ＩＩおよびＲＯ
４９２９０９７からなる群から選択される。複数の実施形態では、ガンマセレクターゼ阻
害剤はＲＯ４９２９０９７である。複数の実施形態では、ガンマセレクターゼ阻害剤はＧ
ＳＩ ＩＶである。
別の態様では、成熟ベータ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで生成するための方法が提供される。
当該方法は、（ａ）ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファ
ミリーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ
細胞を生じさせるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の未成熟ベータ細胞を哺乳動物対象
に移植するステップと、未成熟ベータ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで分化させて成熟ベータ細胞
を含む細胞の集団を生成するステップとを含む。複数の実施形態では、当該方法は、成熟
ベータ細胞に、グルコース刺激に応じてインスリンを生成させることをさらに含む。複数
の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡお
よびアクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１およびＧＤＦ－１５からなる群から選択さ
れる。複数の実施形態では、当該方法は、ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで
ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む。複数の実施
形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子はアクチビンＡである。複数の実施形態
では、ＷｎｔファミリーメンバーはＷｎｔ３ａである。複数の実施形態では、ＥＲＢＢ受
容体キナーゼ活性化作用物質はヘレグリンである。
複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ
スーパーファミリー成長因子と接触させる。複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細
胞を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる。複
数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスー
パーファミリー成長因子と接触させる。
複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔフ
ァミリーメンバーと接触させる。複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なく
とも５０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる。複数の実施形態では、ヒ
ト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触さ
せる。
複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞をＴＧＦβスーパーファミリー成長因子
およびＷｎｔファミリーメンバーの５分の１～１５分の１のＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性
化作用物質と接触させる。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも１０％が未成熟ベ
ータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも２０％が未成熟ベータ細胞
である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも３０％が未成熟ベータ細胞である。
複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも４０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実
施形態では、細胞集団の少なくとも５０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態で
は、細胞集団の少なくとも６０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞
集団の少なくとも７０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少
なくとも８０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の少なくとも
９０％が未成熟ベータ細胞である。複数の実施形態では、未成熟ベータ細胞はＩＮＳおよ
びＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。複数の実施形態では、未成熟
ベータ細胞はＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現し
ない。
一態様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ単能性ヒト未成熟ベータ細胞が提供される。複数の実施
形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞はＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３
を実質的に発現しない。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞は、成熟ベー
タ細胞へと成熟することができる。
一態様では、成熟ベータ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで生成するための方法が提供される。当
該方法は、ａ．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリ
ーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞
を生じさせるステップと、ｂ．ステップ（ａ）の未成熟ベータ細胞を哺乳動物対象に移植
するステップと、ｃ．未成熟ベータ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで成熟させて、インスリン分泌
性ベータ細胞を含む細胞の集団を生成するステップとを含む。
一態様では、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない単能
性ヒト未成熟ベータ細胞が提供される。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細
胞は、成熟ベータ細胞へと成熟することができる。複数の実施形態では、単能性ヒト未成
熟ベータ細胞はＭＡＦＢをさらに発現する。
一態様では、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しないｉｎ
ｖｉｔｒｏ単能性ヒト未成熟ベータ細胞が提供される。複数の実施形態では、単能性ヒ
ト未成熟ベータ細胞は、成熟ベータ細胞へと成熟することができる。複数の実施形態では
、単能性ヒト未成熟ベータ細胞はＭＡＦＢをさらに発現する。
一態様では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成する方法が提供される。当該方法は、
ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよ
びＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生
成するステップを含む。複数の実施形態では、単能性ヒト未成熟ベータ細胞はＩＮＳ、Ｎ
ＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。複数の実施形態では、当該方法は
、ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質
と接触させるステップをさらに含む。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー
成長因子はアクチビンＡである。複数の実施形態では、ＷｎｔファミリーメンバーはＷｎ
ｔ３ａである。複数の実施形態では、ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質はヘレグリ
ンである。
一態様では、成熟ベータ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで生成するための方法が提供される。当
該方法は、ａ．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリ
ーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞
を生じさせるステップと、ｂ．ステップ（ａ）の未成熟ベータ細胞を哺乳動物対象に移植
するステップと、ｃ．未成熟ベータ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで成熟させて、インスリン分泌
性ベータ細胞を含む細胞の集団を生成するステップとを含む。複数の実施形態では、当該
方法は、ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作
用物質と接触させるステップをさらに含む。複数の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファ
ミリー成長因子はアクチビンＡである。複数の実施形態では、Ｗｎｔファミリーメンバー
はＷｎｔ３ａである。複数の実施形態では、ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質はヘ
レグリンである。複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも５０ｎｇ／
ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子と接触させる。複数の実施形態では、ヒト胚
体内胚葉系列細胞を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接触させる
。複数の実施形態では、ヒト胚体内胚葉系列細胞をＴＧＦβスーパーファミリー成長因子
およびＷｎｔファミリーメンバーの５分の１～１５分の１のＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性
化作用物質と接触させる。複数の実施形態では、未成熟ベータ細胞は、ＩＮＳおよびＮＫ
Ｘ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。複数の実施形態では、未成熟ベータ
細胞は、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない
。
一実施形態では、多能性幹細胞または多能性幹細胞から導出された先駆細胞を、内分泌
集団および非内分泌集団に分化させるための組成物および方法が提供される。一態様では
、内分泌細胞は少なくともＣＨＧＡを発現し（またはＣＨＧＡ＋）、非内分泌細胞はＣＨ
ＧＡを発現しない（またはＣＨＧＡ－）。一態様では、これらの細胞集団は内分泌（ＣＨ
ＧＡ＋）亜集団および非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団、または単にＣＨＧＡ＋亜集団もし
くはＣＨＧＡ－亜集団、または単に内分泌亜集団および非内分泌亜集団と称される。別の
態様では、これらの内分泌亜集団および非内分泌亜集団は、非内分泌多分化能膵臓前駆体
亜集団または内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団などの多分化能前駆体／先駆体亜集団であ
ってもよく、未成熟内分泌細胞、好ましくは未成熟ベータ細胞、未成熟グルカゴン細胞な
どの単能性亜集団であってもよい。
一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、内分泌亜集団と非内分
泌亜集団の両方を含む膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）培養物であって、ＮＧＮ３の発現が抑制
されている膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）培養物に分化させるための組成物および方法が提供
される。一態様では、ＰＥＣ培養物においてＮＫＸ２．２の発現も抑制されている。一態
様では、ＰＥＣ培養物においてＣＨＧＡの発現も抑制されている。一態様では、ＰＤＸ１
およびＮＫＸ６．１の発現はＰＥＣ培養物中の単一細胞での同時発現である。一態様では
、ＰＥＣ培養物中の細胞の５０％未満、好ましくは４０％未満、３０％、より好ましくは
２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満がＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２また
はＣＨＧＡを発現する。一態様では、ＰＥＣ培養物は非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団
（ＣＨＧＡ－）が濃縮されている。一態様では、ＰＥＣ培養物では、非内分泌多分化能膵
臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）のマーカー（ＰＤＸ１および／またはＮＫＸ６．１）が発
現されている。一態様では、豊富な非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）を伴う
ＰＥＣ培養物を哺乳動物宿主に埋め込み、移植片を成熟させ、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてグ
ルコースに応答してインスリンを生成させる。一態様では、豊富な非内分泌多分化能膵臓
前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）を伴うＰＥＣ培養物は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、豊富な非
内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）を伴わないＰＥＣ培養物よりも速い速度で成
熟する。一態様では、豊富な非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）を伴う埋め込
まれたＰＥＣ培養物は、埋め込み後約１０週間または約１２週間の時点で、グルコース刺
激に応答したＣ－ペプチド（インスリン）生成によって測定されるｉｎ ｖｉｖｏの機能
が、豊富な非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）を伴わない埋め込まれたＰ
ＥＣ培養物の少なくとも２倍に改善されている。
一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで多能性ヒト幹細胞を分化させるための組成物およ
び方法であって、内分泌系の分化および発生に典型的なＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２など
の遺伝子の発現が、非内分泌性多分化能膵臓前駆体（ＣＨＧＡ－かつＰＤＸ１／ＮＫＸ６
．１同時発現）の生成後まで抑制される組成物および方法が提供される。
一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、ＰＥＣ培養物に分化さ
せるための方法であって、（ａ）ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団を得るステップと、（
ｂ）ステップ（ａ）の細胞集団を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用
物質と接触させ、それにより、ＣＨＧＡ、ＮＧＮ３またはＮＫＸ２．２を含む群から選択
されるマーカーを実質的に発現しないＰＥＣを含む細胞培養物を生じさせるステップとを
含む方法が提供される。一態様では、ＰＥＣは、ＰＤＸ１とＮＫＸ６．１を同時発現する
細胞の亜集団を含む。一態様では、ＰＥＣは、非内分泌性多分化能膵臓前駆体（ＣＨＧＡ
－）細胞の亜集団を含む。一態様では、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する
作用物質は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＧＤＦ８
、ＧＤＦ－１０、ＧＤＦ－１１、ＧＤＦ－１５およびその混合物からなる群から選択され
る。一態様では、アクチビンＡをステージ３に１００ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、５０
ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬで添加し、ステージ４に１５ｎｇ／ｍ
Ｌ、１０ｎｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、アクチビンＡをＰＤＸ
１陰性前腸内胚葉細胞集団に添加することによって形成されたＰＥＣ培養物は、グルコー
ス刺激に応答したＣ－ペプチド（インスリン）生成によって測定されるｉｎ ｖｉｖｏの
機能が、豊富な非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）を伴わないＰＥＣ培養物の
少なくとも２倍に改善されている。
一態様では、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）を伴うＰＥＣ培養物は
、グルコース刺激に応答したインスリン生成によって測定されるｉｎ ｖｉｖｏの機能が
、豊富な非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）を伴わないＰＥＣ細胞培養物の少
なくとも２倍に改善されている。
一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、ＰＥＣを含む細胞集団
に分化させるための方法であって、（ａ）ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団を得るステッ
プと、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞集団を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化
する作用物質と接触させ、それにより、ＣＨＧＡ、ＮＧＮ３またはＮＫＸ２．２を含む群
から選択されるマーカーを実質的に発現しないＰＥＣ集団を生じさせるステップとを含む
方法が提供される。一態様では、ＰＥＣ集団は、ＰＤＸ１とＮＫＸ６．１を同時発現する
細胞を含む。一態様では、ＰＥＣ集団は、非内分泌多分化能膵臓前駆細胞（ＣＨＧＡ－）
を含む。一態様では、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質は、Ｎｏ
ｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＧＤＦ８、ＧＤＦ－１０、
ＧＤＦ－１１、ＧＤＦ－１５およびその混合物からなる群から選択される。一態様では、
ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質はアクチビンＡである。一態様
では、アクチビンＡをステージ３に１００ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ
、２５ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬで添加し、ステージ４に１５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎ
ｇ／ｍＬまたは５ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、ＥＧＦファミリーリガンドは、ヘ
レグリン（ニューレグリン１（ＮＲＧ１）としても公知である）、ニューレグリン２（Ｎ
ＲＧ２）、ニューレグリン３（ＮＲＧ３）、ニューレグリン４（ＮＲＧ４）、ＥＧＦ（上
皮成長因子）およびベータセルリンを含む群から選択される。一態様では、ＥＧＦファミ
リーリガンドはヘレグリンである。一態様では、ヘレグリンを２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍ
Ｌ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍ
Ｌ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬまたは８０ｎｇ／ｍＬで添加する
。一態様では、アクチビンＡおよびヘレグリンをＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団に添加
することによって形成されたＰＥＣ培養物は、グルコース刺激に応答したＣ－ペプチド（
インスリン）生成によって測定されるｉｎ ｖｉｖｏの機能が、豊富な非内分泌多分化能
前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）を伴わないＰＥＣ培養物の少なくとも２倍に改善されている
。
一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、ＰＥＣを含む細胞培養
物に分化させるための方法であって、（ａ）ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団を得るステ
ップと、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞集団を、少なくとも、ＴＧＦβ受容体ファミリーメ
ンバーを活性化する作用物質、ＥＧＦファミリーリガンドまたはＷｎｔシグナル伝達経路
を活性化する作用物質と、単独でまたは組み合わせて接触させ、それにより、ＣＨＧＡ、
ＮＧＮ３またはＮＫＸ２．２を含む群から選択されるマーカーを実質的に発現しないＰＥ
Ｃを含む細胞培養物を生じさせるステップとを含む方法が提供される。一態様では、ＰＥ
Ｃ培養物は、ＰＤＸ１とＮＫＸ６．１を同時発現する細胞を含む。一態様では、ＰＥＣ細
胞培養物は、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）を含む。一態様では、Ｔ
ＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、
アクチビンＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＧＤＦ８、ＧＤＦ－１０、ＧＤＦ－１１、ＧＤＦ－
１５およびその混合物からなる群から選択される。一態様では、ＴＧＦβ受容体ファミリ
ーメンバーを活性化する作用物質はアクチビンＡである。一態様では、Ｗｎｔシグナル伝
達経路を活性化する作用物質は、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３
Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８
Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、
ＷＮＴ１６およびＷｎｔ３Ａを含む群から選択されるＷｎｔファミリーメンバーである。
一態様では、ＷｎｔファミリーメンバーはＷｎｔ３Ａである。一態様では、アクチビンＡ
をステージ３に１００ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬま
たは１０ｎｇ／ｍＬで添加し、ステージ４に１５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬまたは５ｎ
ｇ／ｍＬで添加する。一態様では、ヘレグリンを２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ
／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ
／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬまたは８０ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では
、ＷＮＴを５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ～７５ｎｇ／ｍＬ、より好ま
しくは５０ｎｇ／ｍＬで添加する。
一態様では、ステージ３にアクチビンＡを単独でまたはＷＮＴと組み合わせて添加する
。別の態様では、ステージ３にアクチビンＡをＷＮＴまたはＷＮＴおよびヘレグリンと一
緒に添加する。さらにもう１つの態様では、ステージ４にアクチビンＡを単独でまたはヘ
レグリンと組み合わせて添加する。
一態様では、細胞集団内の細胞の１０％超、好ましくは２０％超、３０％超、４０％超
、より好ましくは５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８
％超または１００％が非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）である。一態様では
、アクチビンＡ、ヘレグリンおよびＷＮＴをＰＤＸ１－陰性前腸内胚葉細胞集団に添加す
ることによって形成されたＰＥＣ細胞培養物は、グルコース刺激に応答したインスリン生
成によって測定されるｉｎ ｖｉｖｏの機能が、豊富な非内分泌多分化能前駆体亜集団（
ＣＨＧＡ－）を伴わないＰＥＣ細胞培養物の少なくとも２倍に改善されている。
一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、内分泌系列に傾倒した
最小限の細胞（ＣＨＧＡ＋）を含むＰＥＣ培養物に分化させるための組成物および方法が
提供される。一態様では、内分泌系列に傾倒した細胞は、ＣＨＧＡの発現を特徴とする。
一態様では、ＰＥＣ培養物中の細胞の５０％未満、好ましくは４０％未満、３０％未満、
より好ましくは２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満が内分泌系列に
傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）である。
一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、実質的なＰＥＣ培養物
に分化させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＥＣ培養物を内分泌細胞にさらに分化させるための組
成物および方法が提供される。一態様では、内分泌細胞はＣＨＧＡを発現する。一態様で
は、内分泌細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてインスリンを生成することができる。一態
様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌インスリン分泌細胞は、グルコース刺激に応答してイン
スリンを生成することができる。一態様では、細胞集団内の細胞の１０％超、好ましくは
２０％超、３０％超、４０％超、より好ましくは５０％超、６０％超、７０％超、８０％
超、９０％超、９５％超、９８％超または１００％が内分泌細胞である。
一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、内分泌細胞に分化させ
るための方法であって、（ａ）ＰＥＣを含む細胞集団を得るステップと、（ｂ）ステップ
（ａ）の細胞集団を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ヘッジホッグ阻害剤、血小板由来成
長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー、レチノイド、インスリ
ン成長因子１および２（ＩＧＦ１およびＩＧＦ２）ならびにニコチンアミドからなる群か
ら選択される成長因子と接触させ、それにより、内分泌細胞を生じさせるステップとを含
む方法が提供される。一態様では、内分泌細胞はＣＨＧＡを発現する。一態様では、内分
泌細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける未成熟インスリン生成ベータ細胞である。一態様では
、内分泌細胞は、埋め込み型半透性封入デバイスにローディングされた、成熟しており、
ｉｎ ｖｉｖｏでグルコース刺激に応答してインスリンを生成することができるものであ
る。一態様では、細胞集団内の細胞の１０％超、好ましくは２０％超、３０％超、４０％
超、より好ましくは５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９
８％超または１００％が内分泌細胞である。一態様では、ＳＳＨを１０ｎｇ／ｍＬ～１０
０ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、ＰＤＧＦを１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬで
添加する。一態様では、ＢＭＰを１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様で
は、ＦＧＦ２を２ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、ＩＧＦ１または
ＩＧＦ２を２５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬで添加する。一態様では、上記の化合物を
互いと組み合わせて添加する。一態様では、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーは
ＦＧＦ２である。一態様では、レチノイドは、レチノイン酸および／またはＴＴＮＰＢも
しくはＴＴ３などのレチノイン酸類似体、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ－Ｉもしくは
ＩＧＦ１）およびインスリン様成長因子－ＩＩ（ＩＧＦ－ＩＩもしくはＩＧＦ２）である
。一態様では、骨形成タンパク質はＢＭＰ４である。一態様では、ヘッジホッグ阻害剤は
、ソニックヘッジホッグ、ＫＡＡＤ－シクロパミン、ＫＡＡＤ－シクロパミン類似体、ジ
ェルビン、ジェルビン類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体および当業者に公知の任意の他
のヘッジホッグ経路機能の阻害剤である。
一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、内分泌細胞に分化させ
るための方法であって、（ａ）ＰＥＣを含む細胞集団を得るステップと、（ｂ）ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏにおいて、ステップ（ａ）の細胞集団を、ガンマセレクターゼ阻害剤と接触させ
、それにより、内分泌細胞を作製するステップとを含む方法が提供される。一態様では、
内分泌細胞はＣＨＧＡを発現する。一態様では、内分泌細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける
未成熟インスリン生成ベータ細胞である。一態様では、内分泌細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
でグルコース刺激に応答してインスリンを生成するインスリン分泌細胞である。一態様で
は、内分泌細胞は、埋め込み型半透性封入デバイスにローディングされた、成熟しており
、ｉｎ ｖｉｖｏでグルコース刺激に応答してインスリンを生成することができるもので
ある。一態様では、ガンマセレクターゼ阻害剤は、Ｎ－［Ｎ－（３，５－ジフルロフェナ
セチル－Ｌ－アラニル）］－Ｓ－フェニルグリシンｔ－ブチルエステル（ＤＡＰＴ）、Ｒ
Ｏ４４９２９０９７、１－（Ｓ）－ｅｎｄｏ－Ｎ－（１，３，３）－トリメチルビシクロ
［２．２．１］ヘプタ－２－イル）－４－フルオロフェニルスルホンアミド、ＷＰＥ－Ｉ
ＩＩ３１Ｃ、Ｓ－３－［Ｎ’－（３，５－ジフルオロフェニル－α－ヒドロキシアセチル
）－Ｌ－アラニリル］アミノ－２，３－ジヒドロ－１－メチル－５－フェニル－１Ｈ－１
，４－ベンゾジアゼピン－２－オン、（Ｎ）－［（Ｓ）－２－ヒドロキシ－３－メチル－
ブチリル］－１－（Ｌ－アラニニル）－（Ｓ）－１－アミノ－３－メチル－４，５，６，
７－テトラヒドロ－２Ｈ－３－ベンゾアゼピン－２－オン、ＢＭＳ－７０８１６３（Ａｖ
ａｇａｃｅｓｔａｔ）、ＢＭＳ－７０８１６３、Ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ（ＬＹ４５０
１３９）、Ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ（ＬＹ４５０１３９）、ＭＫ－０７５２、ＭＫ－０
７５２、ＹＯ－０１０２７、ＹＯ－０１０２７（ジベンザゼピン、ＤＢＺ）、ＬＹ－４１
１５７５、ＬＹ－４１１５７５、またはＬＹ２８１１３７６を含む群から選択される。一
部の実施形態では、ガンマセレクターゼ阻害剤は、細胞培養物または細胞集団中に約０．
０１μＭから約１０００μＭまでにわたる濃度で存在する。好ましい実施形態では、ガン
マセレクターゼ阻害剤は、細胞培養物または細胞集団中に約０．１μＭから約１００μＭ
までにわたる濃度で存在する。一態様では、ガンマセレクターゼ阻害剤を、添加後に除去
する。
本明細書に記載の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで多能性ヒト幹細胞を内分泌細胞に
分化させる組成物および方法が提供される。一態様では、内分泌細胞はＣＨＧＡを発現す
る。一態様では、内分泌細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてインスリンを生成することが
できる。一態様では、内分泌細胞は未成熟ベータ細胞などの未成熟内分泌細胞である。一
態様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏインスリン生成細胞は、グルコース刺激に応答してインスリ
ンを生成することができる。
一実施形態では、哺乳動物においてｉｎ ｖｉｖｏでインスリンを生成させるための方
法であって、（ａ）内分泌細胞集団を埋め込み型半透性デバイスにローディングするステ
ップと、（ｂ）内分泌細胞を伴うデバイスを哺乳動物宿主に埋め込むステップと、（ｃ）
前記デバイス中の内分泌細胞集団をｉｎ ｖｉｖｏで成熟させるステップとを含み、内分
泌細胞の少なくとも一部がｉｎ ｖｉｖｏでグルコース刺激に応答してインスリンを生成
するインスリン分泌細胞であり、それにより、哺乳動物においてｉｎ ｖｉｖｏでインス
リンが生成される方法が提供される。一態様では、内分泌細胞は、より多くの非内分泌多
分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）を伴うＰＥＣを含む細胞組成物から導出される。
別の態様では、内分泌細胞は、内分泌亜集団（ＣＨＧＡ＋）が少ないＰＥＣを含む細胞組
成物から導出される。別の態様では、内分泌細胞は、未成熟内分泌細胞、好ましくは未成
熟ベータ細胞である。
一態様では、内分泌細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＤＸ－１陽性膵臓内胚葉集団、また
はＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１陽性である非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団と比較してＰＤＸ１
およびＮＫＸ６．１をより多く発現する多能性幹細胞から作製される。一態様では、内分
泌細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１をＰＥＣ非内分泌多分化能膵
臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）よりも比較的多く発現する多能性幹細胞から作製される。
一態様では、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）およびレチノイン酸（ＲＡ）類似体を、単
独でまたは組み合わせて細胞培養物に添加して、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１の発現がＰ
ＥＣ非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）と比較して増加している内分泌細胞を
得る。一態様では、ＢＭＰは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８およ
びＢＭＰ４を含む群から選択され、ＢＭＰ４であることがより好ましい。一態様では、レ
チノイン酸類似体は、オールトランスレチノイン酸およびＴＴＮＰＢ（４－［（Ｅ）－２
－（５，６，７，８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル－２－ナフタレニル
）－ｌ－プロペニル］安息香酸アロチノイド酸）、または０．１～１０μＭのＡＭ－５８
０（４－［（５，６，７，８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル－２－ナフ
タレニル）カルボキシアミド］安息香酸）を含む群から選択され、ＴＴＮＰＢであること
がより好ましい。
一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、内分泌細胞および未成
熟内分泌細胞、好ましくは未成熟ベータ細胞に分化させるための方法であって、凝集体を
解離させ再会合させることを含む方法が提供される。一態様では、解離および再会合は、
ステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、ステージ５、ステージ６またはステ
ージ７またはこれらの組合せにおいて起こる。一態様では、胚体内胚葉、ＰＤＸ１陰性前
腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＥＣ、および／または内分泌細胞および内分泌前
駆／先駆細胞を解離させ、再会合させる。一態様では、ステージ７において、内分泌（Ｃ
ＨＧＡ＋）亜集団と比較して少ない非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団からなる細胞凝集体を
解離させ、再凝集させる。一態様では、細胞集団内の細胞の１０％超、好ましくは２０％
超、３０％超、４０％超、より好ましくは５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９
０％超、９５％超、９８％超または１００％が内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞である。
一実施形態では、ステージ４ＰＥＣ生成の間に作製された内分泌細胞を除去し、それに
より、ＰＤＸ１＋かつＮＫＸ６．１＋である非内分泌性多分化能膵臓前駆体（ＣＨＧＡ－
）亜集団を濃縮することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、内分泌
細胞に分化させるための方法が提供される。
一実施形態では、表１７において定義されるステージ６細胞およびステージ７細胞を約
０．０２％～２％、好ましくは約０．０２％～０．０５％、好ましくは約０．０５％～１
％、好ましくは０．０５％の低レベルのマトリゲルで培養する、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおい
て、多能性幹細胞を、内分泌細胞に分化させるための方法が提供される。
一実施形態では、細胞培養物をマトリゲルおよびｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤
で処理することによってＰＥＣと内分泌細胞凝集体の細胞接着を改善するための方法が提
供される。一態様では、ｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤はＹ－２７６３２である。
一実施形態では、非内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）が濃縮されたＰＥＣ培
養物を、ステージ３および／またはステージ４にノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）ファミリーメン
バーを添加しないことによって作製する。一実施形態では、内分泌系列に傾倒した細胞（
ＣＨＧＡ＋）が比較的豊富なＰＥＣ培養物を、ステージ３および／またはステージ４にノ
ギンファミリーメンバーを添加しないことによって作製する。一態様では、ノギンファミ
リーメンバーは、ノギン、コーディン、フォリスタチン、フォリスタチン様タンパク質、
ケルベロス、ココ、ダン、グレムリン、スクレロスチン、ＰＲＤＣ（ダンおよびケルベロ
スに関連するタンパク質）を含む群から選択される化合物である。
一実施形態では、培養物中の内分泌細胞を、高レベルの外因性グルコースを含む培地で
あって、添加される外因性グルコースが約１ｍＭ～２５ｍＭ、約１ｍＭ～２０ｍＭ、約５
ｍＭ～１５ｍＭ、約５ｍＭ～１０ｍＭ、約５ｍＭ～８ｍＭである培地で培養することによ
って維持するための方法が提供される。一態様では、培地は、ＤＭＥＭ、ＣＭＲＬまたは
ＲＰＭＩに基づく培地である。
一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、多能性幹細胞を、細胞凝集体の解離と再
会合を伴って、およびそれを伴わないで、内分泌細胞に分化させるための方法が提供され
る。一態様では、ステージ６および／またはステージ７に、内分泌細胞のｉｎ ｖｉｖｏ
の機能に影響を及ぼすことなく、解離していないまたは解離し再会合した細胞凝集体を凍
結保存または凍結する。一態様では、凍結保存した内分泌細胞培養物を解凍し、培養し、
移植すると、それはｉｎ ｖｉｖｏで機能する。
別の実施形態では、多能性幹細胞を内分泌細胞に分化させるための培養系であって、少
なくとも、分化の初期に内分泌遺伝子発現を抑制または阻害することができる作用物質お
よび分化の後期に内分泌遺伝子発現を誘導することができる作用物質を含む培養系が提供
される。一態様では、内分泌遺伝子発現を抑制または阻害することができる作用物質を膵
臓ＰＤＸ１陰性前腸細胞からなる培養系に添加する。一態様では、内分泌遺伝子発現を誘
導することができる作用物質をＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉前駆体またはＰＥＣからなる培養
系に添加する。一態様では、内分泌遺伝子発現を抑制または阻害することができる作用物
質はＴＧＦベータ受容体ファミリーを活性化する作用物質であり、アクチビンであること
が好ましく、高レベルのアクチビン、その後に低レベルのアクチビンであることが好まし
い。一態様では、内分泌遺伝子発現を誘導することができる作用物質は、Ｎ－［Ｎ－（３
，５－ジフルロフェナセチル－Ｌ－アラニル）］－Ｓ－フェニルグリシンｔ－ブチルエス
テル（ＤＡＰＴ）、ＲＯ４４９２９０９７、ＤＡＰＴ（Ｎ－－［Ｎ－（３，５－ジフルオ
ロフェナセチル－Ｌ－アラニル）］－Ｓ－フェニルグリシンｔ－ブチルエステル）、１－
（Ｓ）－ｅｎｄｏ－Ｎ－（１，３，３）－トリメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２
－イル）－４－フルオロフェニルスルホンアミド、ＷＰＥ－ＩＩＩ３１Ｃ、Ｓ－３－［Ｎ
’－（３，５－ジフルオロフェニル－α－ヒドロキシアセチル）－Ｌ－アラニリル］アミ
ノ－２，３－ジヒドロ－１－メチル－５－フェニル－１Ｈ－１，４－ベンゾジアゼピン－
２－オン、（Ｎ）－［（Ｓ）－２－ヒドロキシ－３－メチル－ブチリル］－１－（Ｌ－ア
ラニニル）－（Ｓ）－１－アミノ－３－メチル－４，５，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－
３－ベンゾアゼピン－２－オン、ＢＭＳ－７０８１６３（Ａｖａｇａｃｅｓｔａｔ）、Ｂ
ＭＳ－７０８１６３、Ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ（ＬＹ４５０１３９）、Ｓｅｍａｇａｃ
ｅｓｔａｔ（ＬＹ４５０１３９）、ＭＫ－０７５２、ＭＫ－０７５２、ＹＯ－０１０２７
、ＹＯ－０１０２７（ジベンザゼピン、ＤＢＺ）、ＬＹ－４１１５７５、ＬＹ－４１１５
７５、またはＬＹ２８１１３７６からなる群から選択されるガンマセレクターゼ阻害剤で
ある。一態様では、高レベルのアクチビンとは、４０ｎｇ／ｍＬ超、５０ｎｇ／ｍＬ超、
および７５ｎｇ／ｍＬ超のレベルを意味する。一態様では、ステージ３の間または膵臓前
腸内胚葉細胞の生成前に高レベルのアクチビンを使用する。一態様では、低レベルのアク
チビンとは、３０ｎｇ／ｍＬ未満、２０ｎｇ／ｍＬ未満、１０ｎｇ／ｍＬ未満および５ｎ
ｇ／ｍＬ未満を意味する。一態様では、ステージ４の間またはＰＥＣを生成するために低
レベルのアクチビンを使用する。一態様では、阻害または誘導される内分泌遺伝子はＮＧ
Ｎ３である。別の態様では、内分泌発現を阻害するため、好ましくは、膵臓前腸内胚葉細
胞の生成前、または好ましくはステージ３の間にＮＧＮ３発現を阻害するために、アクチ
ビンＡおよびＷｎｔ３Ａを単独でまたは組み合わせて使用する。一態様では、ＰＥＣの生
成後、または好ましくはステージ５、ステージ６および／またはステージ７の間に内分泌
遺伝子発現の発現を誘導するために、ガンマセレクターゼ阻害剤、好ましくはＲＯ４４９
２９０９７またはＤＡＰＴを培養系に使用する。
内分泌細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物であって、前記ヒト細胞の少なくとも５
％が、インスリン（ＩＮＳ）、ＮＫ６ホメオボックス１（ＮＫＸ６．１）、膵臓および十
二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）、転写遺伝子関連遺伝子座（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｌｏｃｕｓ）２（ＮＫＸ２．２）、ペアードボ
ックス４（ＰＡＸ４）、神経原性分化（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ
ｔｉｏｎ）１（ＮＥＵＲＯＤ）、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）、フォーク
ヘッドボックスＡ２（ＦＯＸＡ２）、スネイルファミリージンクフィンガー（ｓｎａｉｌ
ｆａｍｉｌｙ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）２（ＳＮＡＩＬ２）、および筋腱膜線維肉腫
癌遺伝子ファミリー（ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍ
ａ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）ＡおよびＢ（ＭＡＦＡおよびＭＡＦＢ）からなる
群から選択される内分泌マーカーを発現し、かつ、ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）、アイ
レット１（ＩＳＬ１）、肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）、ＧＡＴＡ結合性タンパク質４（Ｇ
ＡＴＡ４）、ＧＡＴＡ結合性タンパク質６（ＧＡＴＡ６）、膵臓特異的転写因子（ｐａｎ
ｃｒｅａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）Ｉａ（Ｐ
ＴＦ１Ａ）およびＳＲＹ（性決定領域Ｙ）－９（ＳＯＸ９）からなる群から選択されるマ
ーカーを実質的に発現せず、前記内分泌細胞が単能性であり、膵ベータ細胞に成熟するこ
とができる、細胞培養物。
内分泌細胞は未成熟ベータ細胞であることが好ましい。
前記ヒト細胞の少なくとも１０％が未成熟ベータ細胞であることが好ましい。
前記ヒト細胞の少なくとも２０％が未成熟ベータ細胞であることが好ましい。
前記ヒト細胞の少なくとも５０％が未成熟ベータ細胞であることが好ましい。
細胞は非組換え型であることが好ましい。
細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、単為生殖生物
細胞、胚性癌腫細胞（ＥＣ）細胞、中内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸｌ－１陰性膵
臓前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓前腸内胚葉細胞、および膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）
からなる群から選択されるヒト多能性幹細胞から導出されたことが好ましい。
未成熟ベータ細胞を生成するための方法であって、ａ）ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集
団を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する因子と接触させ、それにより、Ｐ
ＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞集団を生成するステップと、ｂ）ＰＤＸ陽性膵臓内胚葉細胞集
団をガンマセレクターゼ阻害剤と接触させ、それにより、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発
現する未成熟ベータ細胞を生成するステップとを含む方法。
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団をＷｎｔファミリーメンバーおよびヘレグリンファミ
リーメンバーと接触させることが好ましい。
ＴＧＦベータ受容体ファミリーメンバーは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、Ｎｏｄａｌ
、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１０、ＧＤＦ－１１およびＧＤＦ１５からなる群から選択される
ことが好ましい。
ＴＧＦベータ受容体ファミリーメンバーは、アクチビンＡ、ＧＤＦ－８およびＧＤＦ－
１１であることが好ましい。
ＴＧＦベータ受容体ファミリーメンバーはアクチビンＡであることが好ましい。
Ｗｎｔファミリーメンバーは、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３
Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８
Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、
ＷＮＴ１６およびＷＮＴ３Ａからなる群から選択されることが好ましい。
ＷｎｔファミリーメンバーはＷｎｔ３ａであることが好ましい。
ヘレグリン（ＨＲＧ）ファミリーメンバーはＨＲＧ１、ＨＲＧ２、ＨＲＧ３およびＨＲ
Ｇ４であることが好ましい。
ＨＲＧファミリーメンバーはＨＲＧ１およびＨＲＧ２であることが好ましい。
ｉｎ ｖｉｖｏでインスリンを生成させるための方法であって、ａ）ＰＤＸ１陰性前腸
内胚葉細胞集団を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する因子と接触させ、そ
れにより、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞集団を生成するステップと、ｂ）ＰＤＸ陽性膵臓
内胚葉細胞集団をガンマセレクターゼ阻害剤と接触させ、それにより、ＩＮＳおよびＮＫ
Ｘ６．１を発現する未成熟ベータ細胞を生成するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）からの
未成熟ベータ細胞を埋め込むステップと、ｄ）細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏでグルコース刺激
に応答してインスリンを分泌する成熟ベータ細胞に成熟させるステップとを含む方法。
本発明の好ましい特徴および態様は以下の通りである。
ステージ７において、なお作用物質により遺伝子発現を調節することができる。ステー
ジ７にＦＧＦスーパーファミリーのメンバーを添加することが好ましい。ステージ７にＦ
ＧＦ２を添加することが好ましい。ＦＧＦ２により、ＳＳＴ発現を増加させ、かつ／また
はＩＮＳ発現、ＧＣＧ発現またはＧＨＲＬ発現を抑制することができる。ステージ７にＢ
ＭＰを添加することが好ましい。ＢＭＰにより、ＩＮＳ発現、ＰＤＸ１発現またはＩＤＩ
発現を増加させることができる。
ｉｎ ｖｉｖｏの機能を生じさせる未成熟ベータ細胞集団。未成熟ベータ集団はＣＨＧ
Ａ＋であることが好ましい。未成熟ベータ細胞集団は、ｉｎ ｖｉｖｏで機能することが
できる、すなわち、移植されると血中グルコースに応答してインスリンを分泌することが
好ましい。内分泌細胞集団は、移植されると、機能的な膵島細胞に発達および成熟するこ
とができるものであることが好ましい。未成熟ベータ細胞集団は内分泌細胞が濃縮された
（または非内分泌細胞を枯渇させた）ものであることが好ましい。好ましい実施形態では
、未成熟ベータ細胞集団内の細胞の約５０％超がＣＨＧＡ＋である。より好ましい実施形
態では、未成熟ベータ細胞集団内の細胞の約６０％超または７０％超または８０％超また
は９０％超または９５％超または９８％超または１００％がＣＨＧＡ＋である。好ましい
実施形態では、未成熟ベータ細胞集団内の細胞の約５０％未満がＣＨＧＡ－である。より
好ましい実施形態では、未成熟ベータ細胞集団内の細胞の約１５％未満がＣＨＧＡ－であ
る。より好ましい実施形態では、未成熟ベータ細胞集団内の細胞の約１０％未満または５
％未満または３％未満または２％未満または１％未満または０．５％未満または０％がＣ
ＨＧＡ－である。さらに、ＮＧＮ３発現などのある特定のマーカーの発現を、ステージ３
中、未成熟ベータ細胞の生成の間、抑制することができる。未成熟ベータ細胞集団は単一
ホルモン性（例えば、ＩＮＳのみ）であることが好ましい。未成熟ベータ細胞集団は、Ｎ
ＫＸ６．１およびＰＤＸ１を含めた他の細胞マーカーを同時発現することが好ましい。未
成熟ベータ細胞集団は、単一ホルモン性であり、かつＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を含め
た他の細胞マーカーを同時発現することが好ましい。未成熟ベータ細胞集団は、全ＩＮＳ
集団に対する百分率としてより多くの単一ホルモン発現ＩＮＳ細胞を有することが好まし
い。未成熟ベータ細胞集団は、全ＩＮＳ集団に対する百分率として少なくとも５０％の単
一ホルモン発現ＩＮＳ細胞を有することが好ましい。未成熟ベータ細胞集団はＣＨＧＡ＋
／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）であることが好ましい。好ましい実施形態では
、未成熟ベータ細胞集団内の細胞の約２５％超がＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋
（三重陽性）である。好ましい実施形態では、未成熟ベータ細胞集団内の細胞の約３０％
超または４０％超または５０％超または６０％超または７０％超または８０％超または９
０％超または９５％超または１００％がＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽
性）である。
濃縮された未成熟ベータ細胞集団は、細胞凝集体を解離させ、再凝集させることによっ
て作製される。濃縮された未成熟ベータ細胞集団をステージ７において解離させ、再凝集
させることが好ましい。未成熟ベータ細胞集団を約２５日目または２６日目または２７日
目または２８日目または２９日目または３０日目またはそれ以降に解離させ、再凝集させ
ることが好ましい。
内分泌細胞を維持するためには複合培地が重要である。複合培地はＣＭＲＬまたはＲＰ
ＭＩであることが好ましい。ステージ６もしくはステージ７において、またはステージ６
およびステージ７の両方において複合培地を使用することが好ましい。ＣＭＲＬにより内
分泌マーカーの発現が増加する。ＲＰＭＩにより内分泌マーカーの発現が増加する。
ステージ７において凍結保存により未成熟ベータ細胞集団は減少しない。ステージ７に
おいて凍結保存によりＣＨＧＡ＋発現は低下しない。
ステージ７細胞はＮＫＸ６．１陽性である。ステージ７細胞はＣ－ペプチド陽性である
。ステージ７細胞はＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド同時陽性である。ステージ７細胞は
単一ホルモン性である。ステージ７細胞は、ＩＮＳおよびＧＣＧを単独で発現する。
ステージ７細胞の解離および再凝集はｉｎ ｖｉｖｏの機能に影響を及ぼさない。
ステージ７細胞の凍結保存はｉｎ ｖｉｖｏの機能に影響を及ぼさない。
ステージ７細胞は凍結保存することができ、それらのｉｎ ｖｉｖｏの機能は保持され
る。
グルコース濃度を上昇させるとＩＮＳ発現、ＧＣＧ発現またはＳＳＴ発現が増加する。
ステージ６もしくはステージ７またはその両方においてグルコース濃度を上昇させること
が好ましい。グルコース濃度が上昇するに伴ってＧＨＲＬ発現が減少することが好ましい
。
単一ホルモン性（ＩＮＳのみ）であるｉｎ ｖｉｔｒｏ未成熟ベータ細胞。
ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を同時発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ未成熟ベータ細胞。
単一ホルモン性（ＩＮＳのみ）であり、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を同時発現するｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ未成熟ベータ細胞。
単一ホルモン性（ＩＮＳのみ）であり、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を同時発現し、血
中グルコースに応答してインスリンを分泌することができる細胞にｉｎ ｖｉｖｏで成熟
することができるｉｎ ｖｉｔｒｏ未成熟ベータ細胞。
血中グルコースに応答してインスリンを分泌することができる細胞にｉｎ ｖｉｖｏで
成熟することができるｉｎ ｖｉｔｒｏ未成熟ベータ細胞。
ＣＨＧＡ＋、ＩＮＳ＋およびＮＫＸ６．１＋であるｉｎ ｖｉｔｒｏ未成熟ベータ細胞
。全ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団の１０％超が、ＣＨＧＡ＋、ＩＮＳ＋およびＮＫＸ６．１
＋である未成熟ベータ細胞を含むことが好ましい。全ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団の５０％
超が、ＣＨＧＡ＋、ＩＮＳ＋およびＮＫＸ６．１＋である未成熟ベータ細胞を含む未成熟
ベータである。全ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団の８０％超が、ＣＨＧＡ＋、ＩＮＳ＋および
ＮＫＸ６．１＋である未成熟ベータ細胞を含む未成熟ベータである。
精製された未成熟ベータ細胞。精製された未成熟ベータ細胞先駆体。未成熟ベータ細胞
またはベータ細胞先駆体を、亜鉛センサーを使用してステージ７細胞集団から精製するこ
とが好ましい。亜鉛と結合したＰｙ１センサーの存在に起因するかすかな蛍光がベータ細
胞に関して濃縮されることが好ましい。亜鉛と結合したＰｙ１センサーの存在に起因する
明るい蛍光がアルファ細胞に関して濃縮されることが好ましい。亜鉛センサーを使用して
ベータ細胞を精製するための方法。亜鉛センサーを使用してアルファ細胞を精製するため
の方法。精製されたアルファ細胞。精製されたアルファ細胞先駆体。
ＩＮＳ、ＩＡＰＰ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＣＳＫ１、Ｇ６ＰＣ２、Ｇ
ＣＫ、またはＳＬＣ３０Ａ８などのベータ細胞系列のマーカーを発現する濃縮された細胞
集団。
ＧＣＧ、ＡＲＸ、またはＳＬＣ３０Ａ８などのアルファ細胞系列のマーカーを発現する
濃縮された細胞集団。
細胞の５０％超がＩＮＳ陽性である、濃縮された細胞集団。細胞集団は９０％超のＩＮ
Ｓ陽性細胞を有することが好ましい。好ましい実施形態では、細胞の５０％～９９％がＩ
ＮＳ陽性細胞である。
ｉｎ ｖｉｖｏでインスリンを生成させるための方法であって、ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ
でＣＨＧＡ＋細胞の集団を得るステップと、ｂ）ＣＨＧＡ＋細胞を移植し、それにより、
ｉｎ ｖｉｖｏでインスリンを生成させるステップとを含む方法。
ＣＨＧＡ＋細胞をステージ７において解離させ、再凝集させることが好ましい。
ＣＨＧＡ＋細胞は、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を発現することが好ましい
ＣＨＧＡ＋細胞は、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現することが好ましい。
ＣＨＧＡ＋細胞をＣＭＲＬまたはＲＰＭＩで培養することが好ましい。
ＣＨＧＡ＋細胞を移植前に凍結保存し、解凍することが好ましい。
ＣＨＧＡ＋細胞を高グルコース含有培地で培養することが好ましい。
生理的に機能的なインスリン分泌細胞をｉｎ ｖｉｖｏで生じさせることができるｉｎ
ｖｉｔｒｏ内分泌細胞。
生理的に機能的なインスリン分泌細胞をｉｎ ｖｉｖｏで生じさせることができる、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ適正に特定された未成熟ベータ細胞。
適正に特定された未成熟ベータ細胞をステージ７において解離させ、再凝集させること
が好ましい。
適正に特定された未成熟ベータ細胞は、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を発現することが
好ましい。
適正に特定された未成熟ベータ細胞は、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現することが好
ましい。
適正に特定された未成熟ベータ細胞をＣＭＲＬまたはＲＰＭＩで培養することが好まし
い。
適正に特定された未成熟ベータ細胞を移植前に凍結保存し、解凍することが好ましい。
適正に特定された未成熟ベータ細胞を高グルコース含有培地で培養することが好ましい
。
ＣＨＧＡ＋細胞の集団を得、選別するステップを含む、濃縮された未成熟ベータ細胞集
団をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するための方法。ＣＨＧＡ＋細胞の集団を得、選別するステ
ップを含む、ＩＮＳ、ＩＡＰＰ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１またはＰＡＸ４を発現する濃縮
された細胞集団をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するための方法。
ＣＨＧＡ＋細胞の集団を得、選別するステップを含む、濃縮されたアルファ細胞集団を
ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するための方法。
ＣＨＧＡ＋細胞の集団を得、選別するステップを含む、ＧＣＧまたはＡＲＸを発現する
濃縮された細胞集団をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するための方法。
アルファ細胞またはベータ細胞の濃縮された集団を、Ｐｙ１亜鉛センサーを使用して選
別することが好ましい。
複数の実施形態では、未成熟ベータ細胞はＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ
３を実質的に発現しない。複数の実施形態では、未成熟ベータ細胞は、ＩＮＳ、ＮＫＸ６
．１およびＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない。
脱分化し、再プログラミングされた細胞、または本明細書でｉＰＳ細胞とも呼ばれる細胞の凝集懸濁培養の写真画像である。実施例１参照。
ＯＣＴ４（図２Ａ）、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ（図２Ｂ）、ＣＥＲ１（図２Ｃ）、ＧＳＣ（図２Ｄ）、ＦＯＸＡ２（図２Ｅ）、ＦＯＸＡ１（図２Ｆ）、ＨＮＦ６（図２Ｇ）、ＰＤＸ１（図２Ｈ）、ＰＴＦ１Ａ（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）、ＮＧＮ３（図２Ｋ）およびＩＮＳ（図２Ｌ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子、サイクロフィリンＧおよびＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）発現の平均発現レベルに標準化される。グラフは、データセット中の最も低いデータポイントからの上方制御倍率を表す。実施例１参照。
（パネルＡ）ＰＤＸ－１、（パネルＢ）ＮＫＸ６．１、（パネルＣ）ＰＴＦ１Ａおよび（パネルＤ）Ｄａｐｉに特異的な抗体を使用した、ステージ４分化（ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞）からのヒトｉＰＳ細胞（Ｇ４ ｈＩＰＳ細胞系を使用したＥ２０２１）培養の免疫細胞化学（ＩＣＣ）の顕微鏡写真である。実施例２参照。
（パネルＡ）グルカゴン、（パネルＢ）インスリン、（パネルＣ）ソマトスタチンおよび（パネルＤ）Ｄａｐｉに特異的なリガンドを使用した、ステージ５分化からのｉＰＳ細胞培養（Ｇ４ ｈＩＰＳ細胞系を使用したＥ２０２１）の免疫細胞化学（ＩＣＣ）の写真である。実施例２参照。
Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓからのＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ヒトホスホＲＴＫ抗体アレイで提供されるアレイ位置図およびアレイキーを示す図である。図５Ａの位置図は、ＲＴＫ抗体の座標または位置を示す。ＲＴＫファミリーおよび抗体のアイデンティティまたは名前は、図５Ｂのキーに記載される。したがって、現像したフィルムで観察される陽性シグナルは、図５Ａのように透明画をオーバレイし、図５ＢのＲＴＫの名前でオーバレイ（図５Ａ）の上の座標を参照することによってシグナルを同定することによって、同定することができる。実施例４参照。
４つの異なる条件（実施例５に記載されるパネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）下のｉＰＳ細胞導出膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）のＲＴＫアレイ分析を示す図である。特定のＲＴＫのチロシンリン酸化が、高強度から低強度のシグナルの同定によって観察される。ＩＧＦ １Ｒ／ＩＲおよびＥＲＢＢ（ＥＧＦＲ）ファミリーメンバーが同定されるか、四角で囲まれる。実施例５参照。
実験Ｅ２３１４、Ｅ２３５６およびＥ２３８０（図７Ａ）、Ｅ２３４７（図７Ｂ）ならびにＥ２３５４（図７Ｃ）の移植されたマウスの血清中のヒトＣペプチドおよびインスリンの濃度を示すグラフである。図７Ａ：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヘレグリンによるＰＤＸ１発現細胞の処置は、ｉｎ ｖｉｖｏで移植および成熟後のグルコース刺激インスリン分泌を向上させる。図７Ｂ：マウス糖尿病モデルのＳＴＺ誘導より３週前の、移植後２３週のグルコース刺激Ｃペプチドレベル。空腹時、ならびに腹腔内グルコース投与の３０分および６０分後に、ＰＥＣを移植したマウスを示された移植後時点においてヒトＣペプチドの血清レベルについて分析した。図７Ｃでは、細胞封入デバイス（Ｅｎｃａｐｔｒａ（登録商標）ＥＮ２０またはＥＮ２０、ＶｉａＣｙｔｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でＰＥＣを封入し、一部の場合には、デバイスは微穿孔を有した（ｐＥＮ２０、ＶｉａＣｙｔｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。そのようなデバイスは、米国特許第８，２７８、１０６号に記載されている。実施例７参照。
実験＃２３４７のＳＴＺ処置マウスの血中グルコース分析の結果を示すグラフである。移植されたｉＰＥＣから導出されたグルコース応答性インスリン分泌ベータ細胞がＳＴＺ誘導糖尿病モデルにおいて血中グルコースを制御することを示す。図８Ａ：１３匹の各マウスの血中グルコースを示す（ヘレグリンの有る無しによるベースライン）。図８Ｂは、各処置の合わせた平均測定値を示す（ヘレグリンの有る無しによるベースライン）。ＳＴＺによる処置（０日目）の最大で１４日前までにｉＰＥＣ移植片を移植した１３匹のマウスについて、および同じマウスについてＳＴＺ処置の後、および移植片を外植した後の、ランダムな非絶食血中グルコースレベルの測定値を示す。ＳＴＺ処置動物は、移植片の移植から約２６週後にＳＴＺを与えられた（０日目）。移植片移植から２８週後、ＳＴＺ処置の開始からおよそ２週後に、ｉＰＥＣ移植片を外植した（取り出した）。各動物につき、非絶食血中グルコース測定値を経時的に収集した。実施例７参照。
ＰＤＸ１（図９Ａ）、ＮＫＸ６．１（図９Ｂ）、ＰＴＦ１Ａ（図９Ｃ）、ＮＫＸ２．２（図９Ｄ）およびＮＧＮ３（図９Ｅ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。実施例８参照。
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞（ステージ２）が５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの添加によってＰＤＸ１陽性前腸内胚葉（ステージ３）に分化した、凝集懸濁培養の写真画像である。実施例８参照。
ステージ３で５ｎｇ／ｍＬ（ＡＣＴ５）もしくは１０ｎｇ／ｍＬ（ＡＣＴ１０）のアクチビンＡ；またはステージ３および４で５ｎｇ／ｍＬのアクチビン（ＡＣＴ５）を使用した、ステージ３（８日目、上パネル）およびステージ４（１２日目、下パネル）の終わりの凝集懸濁培養の写真画像である。実施例８参照。
ステージ４の間（Ａ～Ｅ、上パネル）、またはステージ４の終わり（Ａ～Ｅ、下パネル）の凝集懸濁培養の写真画像である。上パネルは、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび２ｎｇ／ｍＬのヘレグリン（ＡＣＴ１０ ＨＧＮ２）、または２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび２ｎｇ／ｍＬのヘレグリン（ＡＣＴ２０ ＨＧＮ２）、または２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび１０ｎｇ／ｍＬのヘレグリン（ＡＣＴ２０ ＨＧＮ１０）、または１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２ｎｇ／ｍＬのヘレグリンおよび５０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ（ＡＣＴ１０ ＨＧＮ２ ＷＮＴ５０）がステージ３で加えられたことを示す。下パネルは、２５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＣＴ２５）、５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＣＴ５０）、７５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＣＴ７５）または１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＣＴ１００）がステージ３で加えられたことを示す。全ての状態は、ステージ４で低いアクチビンおよびヘレグリンを受けた。実施例９参照。
実施例９に記載される通り、アクチビン、ヘレグリンおよびＷＮＴ（ＡＨＷ）がステージ３で加えられ、ステージ４でアクチビンおよびヘレグリン（ＡＨ）が加えられたときのＮＧＮ３（図１３Ａ）、ＮＫＸ２．２（図１３Ｂ）およびＮＫＸ６．１（図１３Ｃ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。
実施例１０に記載される通り、アクチビン、ヘレグリンおよびＷＮＴ（ＡＨＷ）がステージ３で加えられ、ステージ４でアクチビンおよびヘレグリン（ＡＨ）が加えられたときのＮＫＸ６．１（図１４Ａ）およびＮＧＮ３（図１４Ｂ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。
封入されたＰＥＣ（対照）および封入された改変ＰＥＣ（ステージ３でアクチビン、ヘレグリンおよびＷＮＴ（ＡＨＷ）を使用し、ステージ４でアクチビンおよびヘレグリン（ＡＨ）を使用して生成された）を移植したマウスの血清中のヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである。移植から１１週後に、空腹時、腹腔内グルコース投与から３０分後、および６０分後に発現レベルを分析した。実施例１０参照。
封入されたＰＥＣ（対照）および封入された改変ＰＥＣ（ステージ３でアクチビン、ヘレグリンおよびＷＮＴ（ＡＨＷ）を使用し、ステージ４でアクチビンおよびヘレグリン（ＡＨ）を加えて生成された）を移植したマウスの血清中のヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである。移植から１４週後に、空腹時、腹腔内グルコース投与から３０分後、および６０分後に発現レベルを分析した。実施例１０参照。
実施例１１に記載の通り、ステージ５でのガンマセクレターゼ阻害剤による処置から１３、１５および１７日目の、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。
ステージ１～５については表１７による分化の後の、ＰＤＸ１（図１８Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１８Ｂ）、ＳＯＸ９（図１８Ｃ）およびＰＴＦ１Ａ（図１８Ｄ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフであり、ステージ６および７については、実施例１２に記載の通り、基礎ＤＭＥＭ媒体に加えてＦＢＳ、マトリゲルおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤だけを使用した。
実施例１２に記載の通り、および図１８と同じ分化条件下での、ＩＮＳ（図１９Ａ）、ＧＣＧ（図１９Ｂ）、ＧＨＲＬ（図１９Ｃ）およびＳＳＴ（図１９Ｄ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。
実施例１２に記載の通りに作製された、封入された内分泌物を移植したマウスの血清中のヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである（Ｅ２３９５、Ｒａｇ２、１０週 ＧＳＩＳ）。移植から１０週後に、空腹時、および腹腔内グルコース投与から６０分後に発現レベルを分析した。実施例１２参照。
実施例１２に記載の通りに作製された、封入された内分泌物を移植したマウスの血清中のヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである（Ｅ２３９５、Ｒａｇ２、１５週 ＧＳＩＳ）。移植から１５週後に、空腹時、および腹腔内グルコース投与から６０分後に発現レベルを分析した。実施例１２参照。
実施例１２に記載の通り、ｉｎ ｖｉｖｏで分化、成熟した内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真である。細胞の視野は、ＤＡＰＩ（図２２Ａ）またはＮＫＸ６．１に対する抗体（図２２Ｂと図２２Ｃ、核染色法）およびクロモグラニンＡ（図２２Ｂと図２２Ｄ、細胞質）で染色する。全ての画像で同じ視野を示している。実施例１２参照。
実施例１２に記載の通り、内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真である。図２３Ａは、ＩＮＳ（細胞質）およびＮＫＸ６．１（核）について染色した細胞の視野を示す。図２３Ｂは、ＩＮＳ（細胞質）およびＰＤＸ１（核）について染色した細胞の同じ視野を示す。図２３Ｃは、ＤＡＰＩで染色した細胞の同じ視野を示す。実施例１２参照。
実施例１３に記載される分化条件下のＩＮＳ（図２４Ａ）、ＮＫＸ６．１（図２４Ｂ）、ＰＤＸ１（図２４Ｃ）およびＩＤ１（図２４Ｄ）の相対的な遺伝子発現レベルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｍＲＮＡデータを示す棒グラフである。
実施例１３に記載の通り、内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真である。図２５ＡはＴＴおよびＢＭＰを加えない対照であり、図２５Ｂはステージ７でのＴＴの添加を示し、図２５Ｃはステージ７でのＢＭＰの添加を示す。図２５Ａ～Ｃは、Ｃペプチド（細胞質）およびＰＤＸ１（核）についての染色を示す。
実施例１３に記載の通り、内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真である。図２６Ａはステージ６および７においてＴＴおよびＢＭＰで処置し、図２６Ｂはステージ７でのＴＴおよびＢＭＰの添加を示す。図２６Ａおよび２６Ｂは、Ｃペプチド（細胞質）およびＰＤＸ１（核）についての染色を示す。
実施例１３に記載の通り内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真であり、図２５と同じ視野を表す。図２７ＡはＴＴおよびＢＭＰを加えない対照であり、図２７Ｂはステージ７でのＴＴの添加を示し、図２７Ｃはステージ７でのＢＭＰの添加を示す。図２７Ａ～Ｃは、Ｃペプチド（細胞質）およびＮＫＸ６．１（核）についての染色を示す。
実施例１３に記載の通り内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真であり、図２６と同じ視野を表す。図２８Ａはステージ６および７においてＴＴおよびＢＭＰで処置し、図２８Ｂはステージ７でのＴＴおよびＢＭＰの添加を示す。図２８Ａおよび２８Ｂは、Ｃペプチド（細胞質）およびＮＫＸ６．１（核）についての染色を示す。
実施例１３に記載の通りステージ６においてニコチンアミドで処置し（右棒；ｄ２１ｇｉ－ｄ１３～ｄ１５）、またはニコチンアミド処置なしで（左棒；ｄ２１ｇｉ－ｄ１３～ｄ１５＋ＮＩＣｄ１５）、２１日目に分析した、内分泌凝集体の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。
実施例１４に記載の通り、ステージ７の初めに解離および再凝集を行い、その後、ＦＢＳ単独、ＦＢＳ（パネルＡ）および０．０５％マトリゲル（ＭＧ；パネルＢ）の両方、ＦＢＳおよび１０μΜ Ｙ－２７６３２（Ｙ；パネルＣ）の両方、またはＦＢＳ、０．０５％マトリゲル（ＭＧ）および１０μΜ Ｙ－２７６３２（Ｙ；パネルＤ）の３つ全てを添加した、内分泌細胞凝集懸濁培養の写真画像（２１、２２および２３日目）を示す。
１、２および３日の間、ノギンの有る無しでの分化状態を比較した、ＮＫＸ６．１（図３１Ａ）、ＮＫＸ２．２（図３１Ｂ）、ＰＤＸ１（図３１Ｃ）およびＩＮＳ（図３１Ｄ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。実施例１５参照。
示された因子が及ぼす遺伝子発現への影響を記載する、ＩＮＳおよびＧＣＧ（図３２Ａ）、ＧＨＲＬおよびＳＳＴ（図３２Ｂ）ならびにＰＤＸ１およびＩＤ１（図３２Ｃ）の相対的な遺伝子発現レベルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｍＲＮＡデータを示す棒グラフである。実施例１６参照。
非再凝集培養と比較した再凝集培養での内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団および非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団を記載した、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＳＯＸ９（図３３Ａ）；ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＰＰＹ、ＧＨＲＬ（図３３Ｂ）およびＰＣＳＫ１、ＧＣＫ、ＳＬＣ３０Ａ８、Ｇ６ＰＣ２（図３３Ｃ）の相対的な遺伝子発現レベルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｍＲＮＡデータを示す棒グラフである。実施例１７参照。
同様に分化させたが再凝集させなかった細胞（対照試料）と比較して、実施例１８に記載の通りステージ７の開始時に解離および再凝集によって内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞型を濃縮させて作製した封入内分泌細胞（ｒｅ－ａｇｇ試料）を移植したマウスの血清中のヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである。移植から２１週後に、空腹時、腹腔内グルコース投与から３０分後、および６０分後に発現レベルを分析した。実施例１８参照。
ステージ７の間のＤＭＥＭおよびＣＭＲＬベースの培地の影響を記載する、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＰＰＹ、ＳＳＴ（図３５Ａ）；ＧＣＫ、Ｇ６ＣＰ２、ＵＣＮ３、ＰＣＳＫ１（図３５Ｂ）；ＨＮＦ１ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＳＬＣ３０Ａ８、ＣＡＤＨ１（図３５Ｃ）の相対的な遺伝子発現レベルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｍＲＮＡデータを示す棒グラフである。実施例１９参照。
実施例２０に記載の通り、ステージ７の内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真である。凝集体は、ステージ７で再凝集していない。図３６Ａおよび図３６Ｂの同じ視野を、それぞれＩＮＳ（細胞質）およびＧＣＧ（細胞質）について染色し；図３６Ｃは、ＮＫＸ６．１（核）およびＣペプチド（細胞質）について染色している。
実施例２０に記載の通り、ステージ７の内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真である。凝集体は、ステージ７で再凝集している。図３７Ａおよび図３７Ｂの同じ視野を、それぞれＩＮＳ（細胞質）およびＧＣＧ（細胞質）について染色し；図３７Ｃは、ＮＫＸ６．１（核）およびＣペプチド（細胞質）について染色している。
ステージ７の開始時に細胞培養を冷凍（低温保存）および解凍し（Ｆ／Ｔ）、解離、再凝集させなかったか（左側）、または、それらを冷凍せず（新鮮）、解離、再凝集させて（右側）、実施例２０に記載の通りに作製した、封入された内分泌細胞を移植したマウスの血清中のヒトＣペプチドの濃度を示すグラフである。移植から１２週後に、空腹時、腹腔内グルコース投与から３０分後および６０分後に発現レベルを分析した。実施例２１参照。
内分泌ホルモン発現に及ぼすステージ６の間の外因性高グルコースの影響を記載する、ＩＮＳ、ＧＣＧ（図３９Ａ）およびＳＳＴ、ＧＨＲＬ（図３９Ｂ）の相対的な遺伝子発現レベルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｍＲＮＡデータを示す棒グラフである。実施例２１参照。
実施例２１に記載の通り、ステージ７の間に外因性高グルコースを伴うステージ７の内分泌細胞凝集体を示す顕微鏡写真である。図４０ＡはＩＮＳ（細胞質）についての染色を示し、図４０ＢはＧＣＧ（細胞質）についての染色を示す。
先ず亜鉛結合剤であるＰｙ１で処置し、蛍光で選別した、ステージ７からの未熟内分泌ベータ細胞の濃縮を示すフローサイトメトリーグラフである。実施例２４参照。
亜鉛選別から濃縮された細胞を特徴付け、同定する、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＳＳＴおよびＳＳＴ（図４２Ａ）；ＰＡＸ４、ＰＤＸ１、ＡＲＸ、ＮＫＸ６．１（図４２Ｂ）；ならびにＰＣＳＫ１、ＧＣＫ、Ｇ６ＰＣ２およびＳＬＣ３０Ａ８（図４２Ｃ）の相対的な遺伝子発現レベルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｍＲＮＡデータを示す棒グラフである。実施例２４参照。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）の生成ならびにｉｎ ｖｉｖｏでのインスリン分泌ベータ細胞への発達および成熟のためのステージ１～４の概略図である。図は、ＰＥＣの２つの主な亜集団、内分泌（ＣＨＧＡ＋）および非内分泌（ＣＨＧＡ－）細胞も表す。胚性幹細胞（ＥＳＣ）、内胚葉系中胚葉（ＭＥ）、胚体内胚葉（ＤＥ）、前腸（ＦＧ）、後部前腸（ｐＦＧ）、および膵臓上皮または膵臓内胚葉（ＰＥ）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの内分泌細胞の生成のためのステージ１～７の概略図である。図は、高レベルのアクチビン（ステージ３）と続く低レベルのアクチビンおよびＷＮＴの除去（ステージ４）が、ＮＧＮ３の発現を抑制または阻害することも表し、それは、ガンマセクレターゼ阻害剤の添加によって後にステージ５の間に発現させられる。胚性幹細胞（ＥＳＣ）、内胚葉系中胚葉（ＭＥ）、胚体内胚葉（ＤＥ）、前腸（ＦＧ）、後部前腸（ｐＦＧ）、および膵臓上皮または膵臓内胚葉（ＰＥ）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの内分泌細胞の生成のためのステージ１～７の概略図である。図は、ステージ、成長因子、細胞型および各細胞型：胚性幹細胞（ＥＳＣ）、内胚葉系中胚葉（ＭＥ）、胚体内胚葉（ＤＥ）、前腸（ＦＧ）、後部前腸（ｐＦＧ）、膵臓上皮または膵臓内胚葉（ＰＥ）、プレベータ細胞（プレ－Ｂ；または未熟ベータ細胞）、およびベータ細胞（β細胞）のシグネチャーマーカーも示す。
（詳細な説明）
本発明は、本明細書に含まれる本発明の好ましい実施形態および実施例の以下の発明の
詳細な説明を参照することによって容易に理解することができる。しかし、本化合物、組
成物、および方法の開示および記載の前に、本発明は、特定の細胞型、特定のフィーダー
細胞層、特定の条件、または特定の方法などに限定されず、それ自体変動し得ることが理
解されるべきである。多数の改変および変形が当業者には明らかになるであろう。本明細
書において使用される用語法は、単に特定の実施形態を記載するためのものであり、限定
的なものではないことも理解されるべきである。特許および非特許刊行物参考文献は全て
、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
多能性幹細胞から導出された種々の細胞組成物は本明細書に記載されており、また、出
願人の米国特許出願第１０／４８６，４０８号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＣＵＬＴ
ＵＲＥ ＯＦ ＨＥＳＣ ＯＮ ＦＥＥＤＥＲ ＣＥＬＬＳ、２００２年８月６日出願；
同第１１／０２１，６１８号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００４
年１２月２３日出願；同第１１／１１５，８６８号、表題ＰＤＸ１ ＥＸＰＲＥＳＳＩＮ
Ｇ ＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００５年４月２６日出願；同第１１／１６５，３０５号、表題
ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ ＦＡＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＤＩＦＦ
ＥＲＥＮＴＩＡＴＩＮＧ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００５年６月２
３日出願；同第１１／５７３，６６２号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＮＣＲＥＡＳ
ＩＮＧ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ
ＯＦ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＨＵＭＡＮ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ
Ｓ ＷＩＴＨ ＰＩ－３ ＫＩＮＡＳＥ ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ、２００５年８月１５日
出願；同第１２／７２９，０８４号、表題ＰＤＸ１ －ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＤＯＲＳ
ＡＬ ＡＮＤ ＶＥＮＴＲＡＬ ＦＯＲＥＧＵＴ ＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００５年１０月
２７日出願；同第１２／０９３，５９０号、表題ＭＡＲＫＥＲＳ ＯＦ ＤＥＦＩＮＩＴ
ＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００５年１１月１４日出願；同第１１／９９３，３９９号
、表題ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩ
ＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦ、２００６年６月２０
日出願；同第１１／５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１ －ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＤＯＲ
ＳＡＬ ＡＮＤ ＶＥＮＴＲＡＬ ＦＯＲＥＧＵＴ ＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００６年１０
月２７日出願；同第１１／６８１，６８７号、表題ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ ＰＲＯＧＥＮＩ
ＴＯＲ／ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ ＣＥＬＬＳ、ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥ－Ｅ
ＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯ
Ｎ、２００７年３月２日出願；同第１１／８０７，２２３号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯ
Ｒ ＣＵＬＴＵＲＥ ＡＮＤ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＳＩＮＧＬＥ ＣＥＬＬ
ＰＯＰＵＬＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＨＥＳＣ、２００７年５月２４日出願；同第１１／７７
３，９４４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ
ＨＯＲＭＯＮＥＳ、２００７年７月５日出願；１１／８６０，４９４、表題ＭＥＴＨＯ
ＤＳ ＦＯＲ ＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧ ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＰＲ
ＯＤＵＣＴＩＯＮ、２００７年９月２４日出願；同第１２／０９９，７５９号、表題ＭＥ
ＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥＳ、２
００８年４月８日出願；同第１２／１０７，０２０号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ Ｐ
ＵＲＩＦＹＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＡＮＤ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲ
Ｍ ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＯＲＭ ＨＵＭＡＮ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥ
Ｍ ＣＥＬＬＳ、２００８年４月２１日出願；同第１２／６１８，６５９号、表題ＥＮＣ
ＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＬＩＮＥＡＧＥ ＣＥＬＬＳ Ｄ
ＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＨＵＭＡＮ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ
、２００９年１１月１３日出願；同第１２／７６５，７１４号および同第１３／７６１，
０７８号、どちらも表題ＣＥＬＬ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＲＯＭ ＤＥＤＩＦＦ
ＥＲＥＮＴＩＡＴＥＤ ＲＥＰＲＯＧＲＡＭＭＥＤ ＣＥＬＬＳ、２０１０年４月２２日
および２０１３年２月６日出願；同第１１／８３８，０５４号、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩ
ＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＵＳＥＦＵＬ ＦＯＲ ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ ＤＩＦ
ＦＥＲＥＮＴＩＡＢＬＥ ＣＥＬＬＳ、２００７年８月１３日出願；同第１２／２６４，
７６０号、表題ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮ ＣＯ
ＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯ
Ｎ ＴＨＥＲＥＯＦ、２００８年１１月４日出願；同第１３／２５９，１５号、表題ＳＭ
ＡＬＬ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ ＳＵＰＰＯＲＴＩＮＧ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＣＥＬ
Ｌ ＧＲＯＷＴＨ、２０１０年４月２７日出願；ＰＣＴ／ＵＳ１１／２５６２８、表題Ｌ
ＯＡＤＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ ＦＯＲ ＡＮ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＤＥＶＩＣ
Ｅ、２０１１年２月２１日出願；同第１３／９９２，９３１号、表題ＡＧＥＮＴＳ ＡＮ
Ｄ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＮＨＩＢＩＴＩＮＧ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥ
Ｍ ＣＥＬＬＳ、２０１０年１２月２８日出願；および米国意匠出願第２９／４０８，３
６６号、２０１１年１２月１２日出願；同第２９／４０８，３６８号、２０１１年１２月
１２日出願；同第２９／４２３，３６５号、２０１２年５月３１日出願；および同第２９
／４４７，９４４号、２０１３年３月１３日出願；および米国特許仮出願第６１／７７４
，４４３号、表題ＳＥＭＩＰＥＲＭＥＡＢＬＥ ＭＡＣＲＯ ＩＭＰＬＡＮＴＡＢＬＥ
ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＤＥＶＩＣＥＳ、２０１３年１１月７
日出願；同第６１／７７５，４８０号、表題ＣＲＹＯＰＲＥＳＥＲＶＡＴＩＯＮ、ＨＩＢ
ＥＲＮＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＲＯＯＭ ＴＥＭＰＥＲＡＴＵＲＥ ＳＴＯＲＡＧＥ ＯＦ
ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＥＤ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬ Ａ
ＧＧＲＥＧＡＴＥＳ、２０１３年３月８日出願；および６１／７８１，００５、表題ＩＮ
ＶＩＴＲＯ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴ
ＥＭ ＣＥＬＬＳ ＴＯ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ（ＰＥ
Ｃ）ＡＮＤ ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ ＣＥＬＬＳ、２０１３年３月１４日出願において見る
ことができる。
定義
本明細書で表される数値範囲は、記載されている両端点を含み、示された数値範囲の両
端点間の全ての整数を記載するものであることが理解されよう。
特に断りのない限り、本明細書で使用される用語は、当業者による従来の使用に従って
理解される。また、本明細書および添付の特許請求の範囲の目的に関して、別段に特定さ
れていない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される成分の分量、材料の
百分率または割合、反応条件を表す数、および他の数値は全て、全ての場合に「約」とい
う用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、それに反する指示
がない限り、以下の明細書および添付されている特許請求の範囲に記載されている数値パ
ラメータは、本発明によって得られるべき所望の性質に応じて変動し得る近似値である。
最低限、かつ特許請求の範囲への均等論の適用を限定しようとするものではなく、各数値
パラメータは、少なくとも示されている有効数字に照らして、および通常の四捨五入を適
用することによって、解釈されるべきである。
本明細書に記載の実施形態の実施には、別段に特定されていない限り、細胞生物学、分
子生物学、遺伝学、化学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法が使用さ
れる。
「細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、個々の細胞、細胞系、またはその
ような細胞から導出される培養物を指す。「培養物」とは、同じまたは異なる種類の単離
された細胞を含む組成物を指す。「培養物」、「集団」または「細胞集団」とは、本明細
書で使用される場合、互換的に使用することができ、また互換的に使用され、その意味は
文脈に応じて明らかになる。例えば、「集団」という用語は、識別特性が同じである２つ
以上の細胞の細胞培養物を指す、または、識別特性が異なる２つ以上の細胞型の培養物で
あってよく、例えば、ある文脈における集団は、別の文脈では亜集団であり得る。「亜集
団」という用語は、細胞培養物または細胞集団中のある特定の細胞型を記載するために使
用される場合、細胞培養物または細胞集団のサブセットを指す。
本明細書で使用される場合、「全能性幹細胞」という句は、卵細胞と精子細胞の融合か
ら生成する細胞などの、生物体を構成する全ての細胞に分化する能力を有する細胞を指す
。受精卵の最初の数回の分裂によって生成する細胞も全能性であり得る。これらの細胞は
、胚性細胞および胚体外細胞型に分化することができる。例えばＥＳ細胞などの多能性幹
細胞は、いかなる胎児または成体の細胞型も生じ得る。しかし、これらは、胚体外組織に
発達する潜在性を欠くので、単独では胎児または成体動物に発達することはできない。胚
体外組織は、一部において、胚体外内胚葉から導出され、遠位内胚葉（ｐａｒｉｅｔａｌ
ｅｎｄｏｄｅｒｍ）（ライヘルト膜）および近位内胚葉（ｖｉｓｃｅｒａｌ ｅｎｄｏ
ｄｅｒｍ）（卵黄嚢の一部を形成する）にさらに分類することができる。遠位内胚葉およ
び近位内胚葉はどちらも胚の発生を支持するが、それら自体は胚構造を形成しない。胚体
外中胚葉および胚体外外胚葉を含めた他の胚体外組織も存在する。
一部の実施形態では、「多能性細胞」を、内胚葉系列、より詳細には、膵臓内胚葉型細
胞に分化させるための出発材料として使用する。本明細書で使用される場合、「多能性」
または「多能性細胞」またはその等価物とは、細胞培養物中で増殖することができ、かつ
多分化能の性質を示す、系列が制限された種々の細胞集団に分化することができる細胞を
指し、例えば、多能性ＥＳ細胞および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞はどちらも、３種の胚
細胞系列のそれぞれを生じ得る。しかし、多能性細胞は、生物体全体を生成することはで
きない。すなわち、多能性細胞は全能性ではない。
ある特定の実施形態では、出発材料として使用される多能性細胞は、ｈＥＳ細胞、ｈＥ
Ｇ細胞、ｉＰＳ細胞、さらには単為発生細胞などを含めた幹細胞である。本明細書で使用
される場合、「胚性（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」とは、単一の接合体から始まって、発生し
た配偶子細胞を除いてもはや多能性または全能性細胞を含まない多細胞構造で終わる、生
物体の発生ステージの一領域を指す。「胚性（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」という用語は、配
偶子融合によって導出された胚に加えて、体細胞核移植によって導出された胚も指す。さ
らに別の実施形態では、多能性細胞は胚から導出されるまたは直接導出されたものではな
く、例えば、ｉＰＳ細胞は、非多能性細胞、例えば多分化能細胞または最終分化した細胞
から導出されたものである。本明細書で使用されるヒト多能性幹細胞株は、ｈＥＳＣおよ
びｉＰＳＣ、例えば、ＣｙＴ４９、ＣｙＴ２５、ＣｙＴ２０３、ＣｙＴ２１２、ＢＧ０１
、ＢＧ０２、ＢＧ０３、または表４および表５に列挙されているもののいずれか、または
現在公知であるもしくは公的に入手可能であるまたは後に作製されるもののいずれかを含
む。
ヒト多能性幹細胞は、分化を導く遺伝子の抑制および多能性の維持を確実にするコア調
節複合体を形成する転写因子Ｏｃｔ－４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ－２を含めた、いく
つかの転写因子および細胞表面タンパク質、ならびに糖脂質ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およ
びケラチン硫酸抗原、Ｔｒａ－１－６０およびＴｒａ－１－８１、およびアルカリホスフ
ァターゼなどの細胞表面抗原の存在によっても定義され、あるいは特徴付けられ得る。
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」または「ｉＰ
ＳＣ」という句は、非多能性細胞、一般には成体の体細胞、または、例えば線維芽細胞、
造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞などの最終分化した細胞から、再プログラミン
グ因子と称される特定の遺伝子または遺伝子産物を挿入することによって人工的に調製さ
れた多能性幹細胞の一種を指す。Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、１３１ ：８６１－
８７２（２００７）；Ｗｅｒｎｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４４８：３１８－３２４（２００
７）；Ｐａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ、４５１：１４１－１４６（２００８）を参照されたい
。ｉＰＳＣを作製するための、これらおよびその後に公知になった方法は周知であり、ｉ
ＰＳＣがどのように導出されたまたは生成されたものであるかは本発明を限定するもので
はない。人工多能性幹細胞は、ｈＥＳ細胞などの天然のヒト多能性幹細胞と、ある特定の
幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚葉体
形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、ならびに発生能および分化可能性（ｄｉｆｆ
ｅｒｅｎｔｉａｂｉｌｉｔｙ）を含めた多くの点で実質的に類似している。ヒトｉＰＳ細
胞により、胚の使用を伴うことなく多能性幹細胞の供給源がもたらされる。
本明細書で使用される場合、「再プログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）」、
「再プログラミングされる（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）」またはその等価物は、細胞の
、少なくとも１種の新しい細胞型の後代を形成する能力が、培養物中またはｉｎ ｖｉｖ
ｏにおいて、その細胞が再プログラミングを伴わない同じ条件下で有するものよりも測定
可能な程度に増大するプロセスを指す。本明細書に記載されているある特定の実施形態で
は、体細胞が多能性細胞に「再プログラミングされる」。ある特定の態様では、体細胞が
、十分な増殖後に、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物のいずれかにおい
て、測定可能な割合の細胞で新しい多能性細胞型の表現型特性を示した場合に、再プログ
ラミングされたこととなる。再プログラミングされなければ、そのような体細胞は新しい
多能性細胞型の表現型特性を示す後代を生じない。もし、再プログラミングなしでも体細
胞が新しい多能性細胞型の表現型特性を示す後代を生じさせることができるとすれば、こ
れらの体細胞由来の、新しい多能性細胞型の表現型特性を示す後代の割合は再プログラミ
ング前よりも測定可能な程度で上昇する。
本明細書で使用される場合、「分化プログラミング」という句は、細胞を、培養物また
はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかにおいて、分化再プログラミングを伴わない同じ条件のもの
と比べて、新しい分化の状態を伴う少なくとも１種の新しい細胞型の後代を形成するよう
に変化させるプロセスを指す。このプロセスは、分化、脱分化および分化転換を含む。し
たがって、本明細書で使用される場合、「分化」という句は、より低度に特殊化した細胞
がより高度に特殊化した細胞型になるプロセスを指す。対照的に、「脱分化」という句は
、部分的または最終的に分化した細胞が、多能性または多分化能を有する細胞などの、よ
り初期の発生ステージに戻る細胞のプロセスを指す。さらに対照的に、「分化転換」とい
う句は、ある分化した細胞型が別の分化した細胞型に転換されるプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、「多分化能」または「多分化能細胞」またはその等価物は
、限られた数の他の特定の細胞型を生じさせることができる細胞型を指す。すなわち、多
分化能細胞は１つまたは複数の胚細胞の運命に傾倒し、したがって、多能性細胞とは対照
的に、３種の胚細胞系列のそれぞれ、ならびに胚体外細胞を生じさせることができない。
多分化能体細胞は、多能性細胞よりも分化しているが、最終分化はしていない。したがっ
て、多能性細胞の発生能は多分化能細胞よりも高い。体細胞を再プログラミングすること
またはｉＰＳ細胞を生じさせるために使用することができる発生能決定因子としては、こ
れだけに限定されないが、Ｏｃｔ－４、Ｓｏｘ２、ＦｏｘＤ３、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ
、Ｒｅｘｌ、ＺＮＦ２０６、Ｓｏｘｌ５、Ｍｙｂｌ２、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、ＤＰＰ
Ａ２、ＥＳＧ１、Ｏｔｘ２またはこれらの組合せなどの因子が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「単能性の（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）」または「単能性（ｕ
ｎｉｐｏｔｅｎｃｙ）」または「単能性細胞」またはその等価物は、他の系列細胞を１種
のみ生じさせることができる細胞型を指す。例えば、本明細書に記載の未成熟ベータ細胞
は、インスリンベータ細胞のみに分化する能力を有し、例えばグルカゴン（アルファ）細
胞、ソマトスタチン（デルタ）細胞および膵臓ポリペプチド（ガンマ）細胞に分化する潜
在性を有さない。対照的に、内分泌先駆細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞、胚体内胚葉
細胞、または中内胚葉細胞、およびｈＥＳ細胞は全て、膵臓アルファ、ベータ、デルタお
よびガンマ膵島細胞のそれぞれを生じさせることができる多分化能または多能性（ｈＥＳ
Ｃ）細胞である。同様に、膵臓アルファ、ベータ、デルタおよびガンマ膵島細胞は、内分
泌先駆細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、または中内胚葉細胞、およ
びｈＥＳ細胞の系列細胞である。
本明細書で使用される場合、「単一ホルモン性」および「複数ホルモン性（ｐｏｌｙｈ
ｏｒｍｏｎａｌ）」細胞とは、ホルモンを１種のみ発現する細胞（例えば、未成熟ベータ
細胞およびベータ細胞は、インスリンタンパク質のみを発現し、グルカゴンまたはソマト
スタチンタンパク質は発現しない）、または２種以上もしくは多数種のホルモン（例えば
、同じ細胞上で２種、３種または４種またはそれ以上のホルモンを発現する細胞の亜集団
を有する内分泌先駆体または前駆細胞）を発現する細胞を指す。本明細書で使用される場
合、「ＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質」とは、これだけに限定されない
が、ＥＲＢＢ受容体に結合する少なくとも１６種の異なるＥＧＦファミリーリガンド：Ｅ
ＧＦ（上皮成長因子）、ＡＧまたはＡＲＥＧ（アンフィレギュリン）、およびＴＧＦ－ア
ルファ（形質転換成長因子－アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパ
リン結合性ＥＧＦ）、およびＥｒｅｇ（エピレギュリン））、ニューレグリン－１、－２
、－３および－４（またはヘレグリン－１、－２、－３および－４などのニューグレリン
（またはヘレグリン）を含む。しかし、本発明では、４種のＥＲＢＢ受容体のいずれか１
つまたはこれらの組合せに結合して、内因性キナーゼドメインの活性化およびその後のリ
ン酸化を導くホモ二量体受容体複合体およびヘテロ二量体受容体複合体の形成を誘導する
ことができる任意のリガンドが意図されている。表１３も参照されたい。
「細胞系列」という用語は、本明細書で使用される場合、最初期の先駆細胞から完全に
成熟した細胞（すなわち、特殊化した細胞）までの、細胞型の発生のステージの全てを指
す。例えば、「胚体内胚葉系列細胞」または「ＰＤＸ１陰性内胚葉系列細胞」または「Ｐ
ＤＸ１陽性膵臓内胚葉系列細胞」または「内分泌先駆体系列細胞」または「内分泌系列細
胞」または「未成熟ベータ系列細胞」などは、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性内胚葉細胞
、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞などから導出されたまたは分化した細胞を指す。胚体内胚
葉細胞は、その先駆体のうちの１つである中内胚葉細胞の系列である。ＰＤＸ－１陽性膵
臓内胚葉細胞は、その先駆体のうちの１つである胚体内胚葉細胞の系列である。ＰＤＸ１
陽性膵臓細胞、胚体内胚葉細胞および中内胚葉細胞の系列内の内分泌先駆体は全て、その
先駆体である。内分泌先駆細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓細胞、胚体内胚葉細胞および中内胚葉
細胞の系列内の未成熟ベータ細胞は全て、その先駆体である。ベータ細胞は、例えば未成
熟ベータ細胞の唯一の系列である。さらに、明細書に記載の内胚葉系列細胞は全てｈＥＳ
系列細胞である。
「先駆細胞」または「前駆細胞」とは、本明細書で使用される場合、一般に、細胞分化
経路内の、より成熟した細胞に分化することができる任意の細胞であってよい。そのよう
に、先駆細胞は、多能性細胞であってもよく、部分的に分化した多分化能細胞または可逆
的に分化した細胞であってもよい。「先駆細胞集団」という用語は、より成熟または分化
した細胞型に発達することができる細胞の群を指す。先駆細胞集団は、多能性の細胞、幹
細胞系列に制限された細胞（すなわち、外胚葉系列の全てには発達できない細胞、または
、例えばニューロン系列の細胞にのみ発達することができる細胞）、および可逆的に幹細
胞系列に制限された細胞を含み得る。したがって、「前駆細胞」または「先駆細胞」とい
う用語は、「多能性細胞」または「多分化能細胞」であり得る。
「内分泌前駆／先駆細胞」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも、ニューロゲ
ニン３（ＮＥＵＲＯＧ３）、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＳＯＸ９、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１
ｂ、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ６、ＭＹＴ１、ＩＳＬＥ
Ｔ１、ＮＥＵＲＯＤ、ＳＮＡＩＬ２、ＭＮＸ１、ＩＡ１、ＲＦＸ６、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６
、ＮＫＸ２．２、ＭＡＦＡおよびＭＡＦＢからなる一覧からのマーカーを発現する胚体内
胚葉系列の多分化能細胞を指し、これは、これだけに限定されないが、膵島ホルモン発現
細胞を含めた内分泌系の細胞にさらに分化することができる。内分泌前駆／先駆細胞は、
ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞または胚体内胚葉細胞または中内胚葉細胞などのより低度に
特異的に分化した胚体内胚葉系列細胞と比較して多くの異なる細胞、組織および／または
器官型に分化することはできない。内分泌前駆／先駆細胞は、少なくとも出願人の米国特
許第８，１２９、１８２号に詳しく記載されている。
本明細書で使用される場合、「多能性細胞から発達する」、「多能性細胞から分化する
」、「多能性細胞から成熟する」または「多能性細胞から生成する」、「多能性細胞から
導出された」、「多能性細胞から分化する」という用語および等価の表現は、例えば、国
際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１５５３６号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲ
ＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥＳに記載の、ｉｎ ｖｉｖｏに
おいて移植されたＰＤＸ１膵臓内胚葉細胞から成熟する内分泌細胞の場合では、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて多能性細胞から分化した細胞型が生成することを
指す。そのような用語は全て、少なくとも２種の異なる細胞系列に分化する潜在性を有す
るステージから特殊化および最終分化した細胞になるまでの細胞の進行を指す。そのよう
な用語は、本出願の目的に関して互換的に使用することができる。本明細書に記載の実施
形態では、そのような分化を可逆的なものにし、したがって、多能性または少なくとも２
種以上の細胞系列に分化する能力を選択的に元に戻すことができるような培養条件が意図
されている。
「フィーダー細胞」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長し、少なくとも１種の因子
を細胞培養中に分泌し、また、培養物中の別の目的の細胞の成長を支持するために使用す
ることができる細胞培養物を指す。本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞層」は
、「フィーダー細胞」という用語と互換的に使用され得る。フィーダー細胞は、互いに重
なり合って成長し始める前には一完全層で培養皿の表面を覆う単層を含んでもよく、ある
いは細胞のクラスターを含んでもよい。好ましい実施形態では、フィーダー細胞は、接着
性の単層を含む。
同様に、多能性細胞培養物または多能性凝集懸濁培養物をフィーダー細胞の使用を伴わ
ない規定された条件または培養系において成長させる実施形態は「フィーダーフリー」で
ある。フィーダーフリー培養方法では、多能性細胞培養物のスケーラビリティおよび再現
性が増し、例えばフィーダー細胞または他の動物を供給源とする培養物構成成分に由来す
る感染因子によるコンタミネーションのリスクが低下する。フィーダーフリー方法は、Ｂ
ｏｄｎａｒらに対する米国特許第６，８００，４８０号（Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに譲渡された）にも記載されてい
る。しかし、米国特許第６，８００，４８０号特許とは対照的に、本明細書に記載の実施
形態は、多能性細胞培養物、多分化能細胞培養物または分化した細胞培養物のいずれであ
るかにかかわらず、フィーダーフリーであり、内在性または外因性の細胞外マトリックス
をさらに含有しない；すなわち、本明細書に記載の培養物は、フィーダーフリーであるだ
けでなく、細胞外マトリックスフリーでもある。例えば、米国特許第６，８００，４８０
号では、線維芽細胞を培養し、線維芽細胞をｉｎ ｓｉｔｕで溶解し、次いで、溶解後に
残ったものを洗浄することによって細胞外マトリックスが調製される。あるいは、米国特
許第６，８００，４８０号では、コラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、ラ
ミニン、メロシン、テネイシン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、
アグリカン、ビグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンから選
択される単離されたマトリックス構成成分または構成成分の組合せからも細胞外マトリッ
クスが調製され得る。本明細書に記載の実施形態では、フィーダー層または線維芽細胞層
を成長させ、細胞を溶解して細胞外マトリックスを生成することによって細胞外マトリッ
クスを生成することもなく、最初にコラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、
ラミニン、メロシン、テネイシン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸
、アグリカン、ビグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンから
選択される細胞外マトリックス構成成分または細胞外マトリックス構成成分の組合せを用
いて組織培養容器をコーティングする必要もない。したがって、多能性細胞、多分化能細
胞および分化した細胞用の本明細書に記載の凝集懸濁培養物には、フィーダー層、溶解し
たフィーダー細胞、または細胞外マトリックスコーティングを生成する線維芽細胞、外因
的に添加された細胞外マトリックスまたはマトリックス構成成分は必要なく、国際出願Ｐ
ＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩ
ＯＮＳ ＦＯＲ ＦＥＥＤＥＲ－ＦＲＥＥ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬ
Ｌ ＭＥＤＩＡ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＨＵＭＡＮ ＳＥＲＵＭに記載されたように、
可溶性ヒト血清構成成分の使用により、フィーダー細胞またはフィーダー単層の必要性を
克服し、同様に、フィーダー細胞もしくは線維芽細胞または外因的に添加された細胞外マ
トリックス構成成分に由来する内在性の細胞外マトリックスの必要性も克服される。
本明細書で使用される場合、「クラスター」および「凝集塊」または「凝集体」という
用語は互換的に使用することができ、一般に、単一の細胞に解離した後にクラスターが形
成されるようにまたは密接な細胞間接触を有するように凝集したものではない細胞の群を
指す。「再凝集」という用語は、本明細書で使用される場合、クラスター、凝集塊および
／もしくは凝集体をより小さなクラスター、凝集塊および／もしくは凝集体または単一の
細胞に解離させ、次いで、クラスター、凝集塊および／もしくは凝集体を再凝集させるこ
とによって新しい細胞間接触を形成する場合を指す。この解離は、典型的には、手作業の
性質のものである（例えばＰａｓｔｅｕｒピペットの使用など）が、他の解離の手段が考
えられている。凝集懸濁多能性細胞または多分化能細胞培養物は、実質的に国際公開ＰＣ
Ｔ／ＵＳ２００７／０６２７５５、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯ
ＤＳ ＦＯＲ ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬ ＣＥＬＬＳ」およびＰ
ＣＴ／ＵＳ２００８／０８２３５６、表題「ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ
ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ Ｄ
ＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ ＴＨＥＲＥＯＦに記載の通りである。
「単一細胞懸濁液」という用語またはその等価物は、多能性、多分化能もしくは最終分
化した単一細胞懸濁液、または多能性細胞もしくは多分化能細胞から任意の機械的手段ま
たは化学的手段によって導出された単一細胞懸濁液を指す。一次組織、付着した培養物中
の細胞、および凝集体から細胞クラスターを解離させて単一細胞懸濁液を形成するための
いくつかの方法、例えば、物理的な力（細胞スクレーパー、口径が狭いピペットを通して
の粉砕、細針穿刺吸引、ボルテックスによる脱凝集および細かいナイロンメッシュまたは
ステンレス鋼メッシュを通した強制的な濾過などの機械的解離）、酵素（例えばトリプシ
ン、コラゲナーゼ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）などの酵素による解離）、またはその両方
の組合せが存在する。さらに、多能性細胞、多分化能細胞または分化した細胞の単一細胞
への解離を支持することができる方法および培養培地条件は、多ウェルプレートアッセイ
のための拡張、細胞選別、および規定された播種のために有用であり、また、培養手順お
よびクローン拡張の自動化を可能にする。
好ましい実施形態では、培養方法または培養系は、動物を供給源とする製品を含まない
。別の好ましい実施形態では、培養方法はゼノフリーである。さらに好ましい実施形態で
は、本明細書に記載の培養方法は、ヒト細胞治療薬の商業的な製造のための１つまたは複
数の条件または要件を満たすまたはそれを上回る。
多能性細胞の集団をある特定の補足的な成長因子の存在下でさらに培養して、異なる細
胞系列であるまたはそれに発達する細胞の集団を得ることができる、または、異なる細胞
系列に発達することが可能になるように選択的に逆転させることができる。「補足的な成
長因子」という用語は、その最も広範な文脈で使用され、多能性細胞の成長を促進するた
め、細胞の生存を維持するため、細胞の分化を刺激するため、および／または、細胞の分
化の逆転を刺激するために有効である物質を指す。さらに、補足的な成長因子は、フィー
ダー細胞からその培地中に分泌される物質であってよい。そのような物質としては、これ
だけに限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、小分子、中和抗体、およびタンパク
質が挙げられる。成長因子は、細胞の発生および維持ならびに組織の形態および機能を制
御する細胞間シグナル伝達ポリペプチドも含んでよい。好ましい実施形態では、補足的な
成長因子は、スチール細胞因子（steel cell factor）（ＳＣＦ）、オンコスタチンＭ（
ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）と可溶
性インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）の組合せ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）
、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、および顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を含む群から選択される。
本明細書に記載の細胞を生成するためのある特定のプロセスでは、成長因子を、添加後
に細胞培養物または細胞集団から除去する。例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤ
Ｆ－８、またはＧＤＦ－１１などの成長因子を添加し、それらを添加してから約１日以内
、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日
以内、約９日以内または約１０日以内に除去することができる。一部の実施形態では、分
化因子を細胞培養物からそれ自体を除去することはしないが、それらを細胞培養培地から
省くこと、例えば、アクチビンを含有していた細胞培養培地を、アクチビンを含有しない
培地に変えることが除去の手段である。
分化プロセスの効率は、これだけに限定されないが、細胞の成長条件、成長因子濃度お
よび培養ステップのタイミングを含めたある特定のパラメータを改変することによって調
整することができるので、本明細書に記載の分化手順により、約５％、約１０％、約１５
％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５
％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５
％、または約９５％以上の、人工多能性細胞を含む多能性細胞から多分化能細胞または分
化した細胞、例えば胚体内胚葉への変換をもたらすことができる。さらに、変換率または
効率は、１つの型の多分化能細胞から、さらに分化した多分化能細胞への分化、例えば、
胚体内胚葉から前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰ
ＤＸ１／ＮＫＸ６．１同時陽性膵臓内胚葉、内分泌前駆体／先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫ
Ｘ２．２同時陽性内分泌前駆体／先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、
ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞への分化を指す場合もある。前原条
（ｐｒｅｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｓｔｒｅａｋ）細胞または中内胚葉細胞の単離を使用する
プロセスでは、実質的に純粋な前原条細胞または中内胚葉細胞集団を回収することができ
る。
ｈＥＳ細胞から導出された内胚葉系列細胞を生成するための一般的な方法は、上記の関
連する米国特許出願、ならびにＤ’Ａｍｏｕｒら、２００５ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．２３：１５３４－４１、２００５年１０月２８日オンライン出版；Ｄ’Ａｍｏｕｒ
ら、２００６ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（１１）：１３９２－４０１、２０
０６年１０月１９日オンライン出版；Ｋｒｏｏｎら（２００８）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．２６（４）：４４３－４５２、２００８年２月２０日オンライン出版；Ｋｅｌｌ
ｙら（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（８）：７５０－６、２０１１年
７月３１日オンライン出版；およびＳｃｈｕｌｚら（２０１２）ＰＬｏｓＯｎｅ、７（５
）：ｅ３７００４、２０１２年５月１８日オンライン出版に記載されている。Ｄ’Ａｍｏ
ｕｒらにより、５段階の分化プロトコル：ステージ１（大部分は胚体内胚葉生成がもたら
される）、ステージ２（大部分はＰＤＸ１陰性前腸内胚葉生成がもたらされる）、ステー
ジ３（大部分はＰＤＸ１陽性前腸内胚葉生成がもたらされる）、ステージ４（大部分は膵
臓内胚葉または膵臓内分泌前駆体生成がもたらされる）およびステージ５（大部分はホル
モン発現内分泌細胞生成がもたらされる）が記載されている。
「栄養外胚葉」という用語は、ＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、Ｈ
ＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲ
ＢＢ遺伝子を含む群から選択されるマーカーの発現が、非栄養外胚葉細胞または細胞集団
におけるＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳ
Ｇ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢの発現レベルと比較
して相対的に高い多分化能細胞を指す。
「胚体外内胚葉」という用語は、ＳＯＸ７遺伝子、ＳＯＸ１７遺伝子、ＴＨＢＤ遺伝子
、ＳＰＡＲＣ遺伝子、ＤＡＢ１遺伝子、またはＡＦＰ遺伝子を含む群から選択されるマー
カーの発現レベルが、非胚体外内胚葉細胞または細胞集団におけるＳＯＸ７、ＳＯＸ１７
、ＴＨＢＤ、ＳＰＡＲＣ、ＤＡＢ１、またはＡＦＰの発現レベルと比較して相対的に高い
多分化能細胞を指す。
「前原条細胞」という用語は、ＦＧＦ８マーカー遺伝子および／またはＮＯＤＡＬマー
カー遺伝子の発現レベルが、ＢＲＡＣＨＵＲＹ ｌｏｗ、ＦＧＦ４ ｌｏｗ、ＳＮＡＩ１
ｌｏｗ、ＳＯＸ１７ ｌｏｗ、ＦＯＸＡ２ ｌｏｗ、ＳＯＸ７ ｌｏｗおよびＳＯＸ１
ｌｏｗと比較して相対的に高い多分化能細胞を指す。
「中内胚葉細胞」という用語は、ｂｒａｃｈｙｕｒｙマーカー遺伝子、ＦＧＦ４、ＳＮ
ＡＩ１、ＭＩＸＬ１および／またはＷＮＴ３マーカー遺伝子の発現レベルが、ＳＯＸ１７
ｌｏｗ、ＣＸＣＲ４ ｌｏｗ、ＦＯＸＡ２ ｌｏｗ、ＳＯＸ７ ｌｏｗおよびＳＯＸ１
ｌｏｗと比較して相対的に高い多分化能細胞を指す。
「胚体内胚葉（ＤＥ）」という用語は、腸管または腸管から導出された器官の細胞に分
化することができる多分化能内胚葉系列細胞を指す。ある特定の実施形態によると、胚体
内胚葉細胞は哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞はヒト細胞で
ある。本発明の一部の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ある特定のマーカーを発現する
、またはある特定のマーカーを有意に発現することができない。一部の実施形態では、Ｓ
ＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、Ｖ
ＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１から選択される１種また
は複数種のマーカーが胚体内胚葉細胞において発現される。他の実施形態では、ＯＣＴ４
、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＳＰＡＲＣ、
ＳＯＸ７およびＨＮＦ４アルファから選択される１種または複数種のマーカーが胚体内胚
葉細胞において発現されないまたは有意には発現されない。胚体内胚葉細胞集団およびそ
れを生成する方法は、米国特許出願第１１／０２１，６１８号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶ
Ｅ ＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００４年１２月２３日出願にも記載されている。
「ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」または「前腸内胚葉細胞」という用語またはその等価
物は、ＳＯＸ１７マーカー、ＨＮＦ１β（ＨＮＦ１Ｂ）マーカー、ＨＮＦ４アルファ（Ｈ
ＮＦ４Ａ）マーカーおよびＦＯＸＡ１マーカーを発現するが、ＰＤＸ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ
７、またはＳＯＸ１を実質的に発現しない細胞である。ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団
およびそれを生成する方法は、米国特許出願第１１／５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１－
ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｄｏｒｓａｌ ａｎｄ ｖｅｎｔｒａｌ ｆｏｒｅｇｕｔ ｅｎ
ｄｏｄｅｒｍ、２００６年１０月２７日出願にも記載されている。
「ＰＤＸ１陽性、背側に偏向性前腸内胚葉細胞」（背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞）
または、単に「ＰＤＸ１陽性内胚葉」という用語またはその等価物は、関連する米国特許
出願第１１／５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１ ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＤＯＳＡＬ Ａ
ＮＤ ＶＥＮＴＲＡＬ ＦＯＲＥＧＵＴ ＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００６年１０月２７日出
願、および米国特許出願第１１／１１５，８６８号、表題ＰＤＸ１－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎ
ｇ ｅｎｄｏｄｅｒｍ、２００５年４月２６日出願にも記載されている、表１から選択さ
れる１種もしくは複数種のマーカーおよび／または表２から選択される１種もしくは複数
種のマーカーを発現する細胞である。
Figure 2022017361000002
Figure 2022017361000003
Figure 2022017361000004
Figure 2022017361000005
Figure 2022017361000006
Figure 2022017361000007
「膵臓内胚葉」、「膵臓上皮（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）」、「
膵臓上皮（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）」（全て「ＰＥ」と省略する
ことができる）、「膵臓前駆体」、「ＰＤＸ－１陽性膵臓内胚葉」という用語または「膵
臓内胚葉細胞」（ＰＥＣ）などのその等価物は全て、先駆または前駆膵臓細胞である。本
明細書に記載のＰＥＣは、ステージ４分化（約１２～１４日目）後の前駆細胞集団であり
、少なくとも２つの主要な別個の集団：ｉ）ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を発現するが、
ＣＨＧＡを発現しない（あるいはＣＨＧＡ陰性、ＣＨＧＡ－）膵臓前駆細胞、または「非
内分泌多分化能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）」、または「非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団
」または「非内分泌（ＣＨＧＡ－）細胞」またはその等価物；およびｉｉ）ＣＨＧＡを発
現する複数ホルモン性内分泌細胞（ＣＨＧＡ陽性、ＣＨＧＡ＋）、または「内分泌多分化
能前駆体亜集団（ＣＨＧＡ＋）」、または「内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団」または「内分
泌（ＣＨＧＡ＋）細胞」またはその等価物を含む。ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を発現す
るが、ＣＨＧＡを発現しないＰＥＣ膵臓前駆体亜集団は、「非内分泌多分化能膵臓前駆体
亜集団（ＣＨＧＡ－）」または「非内分泌前駆体亜集団」、「非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜
集団」、「非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団」、「多分化能前駆体亜集団」などとも称され
る。ＣＨＧＡを発現するＰＥＣ複数ホルモン性内分泌細胞亜集団は「内分泌系列に傾倒し
た細胞（ＣＨＧＡ＋）もしくは内分泌細胞」または「ＣＨＧＡ＋細胞」などとも称される
。理論に束縛されることなく、ＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない細胞集団
は、より活性かつ治療的なＰＥＣ構成成分であると仮定され、一方、ＣＨＧＡ陽性複数ホ
ルモン性内分泌細胞の集団はｉｎ ｖｉｖｏでグルカゴン発現膵島細胞にさらに分化およ
び成熟すると仮定される。Ｋｅｌｌｙら（２０１１）Ｃｅｌｌ－ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒ
ｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃｅｌ
ｌ ｔｙｐｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅ
ｍ ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（８）：７５０－７５６、２０１
１年７月３１日オンライン出版およびＳｃｈｕｌｚら（２０１２）、Ａ Ｓｃａｌａｂｌ
ｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐａ
ｎｃｒｅａｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉ
ｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ＰＬｏｓＯｎｅ ７（５）：１－１７、ｅ３７００４を参照
されたい。
さらに、時には、膵臓内胚葉細胞は、すぐ上に記載したＰＥＣを指すのではなく、一般
に少なくともステージ３およびステージ４型細胞を指して使用される。この使用および意
味は文脈から明らかになろう。このように多能性幹細胞、ならびに少なくともｈＥＳ細胞
およびｈＩＰＳ細胞から導出される膵臓内胚葉は、他の内胚葉系の系列細胞型とは、ＰＤ
Ｘ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ１、ｃＭＹＣ、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸお
よびＮＫＸ２．２マーカーから選択されるマーカーの発現が示差的または高いレベルに基
づいて区別されるが、膵臓内分泌細胞の特質である遺伝子、例えばＣＨＧＡ、ＩＮＳ、Ｇ
ＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＭＡＦＡ、ＰＣＳＫ１およびＧＬＵＴ１は実質的に発現しない
。さらに、ＮＧＮ３を発現するいくつかの「内分泌前駆細胞」は他の非膵臓構造（例えば
、十二指腸）に分化することができる。膵臓内胚葉または内分泌前駆細胞集団およびその
方法は、米国特許出願第１１／７７３，９４４号、表題Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｒｏｄ
ｕｃｉｎｇ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅｓ、２００７年７月５日出願、およ
び米国特許出願第１２／１０７，０２０号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＹ
ＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＡＮＤ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬ
ＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＯＲＭ ＨＵＭＡＮ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬ
ＬＳ、２００８年４月２１日出願にも記載されている。
「内分泌細胞」または「膵島ホルモン発現細胞」、「膵臓内分泌細胞」、「膵島細胞」
、「膵島」という用語またはその等価物は、複数ホルモン性または単一ホルモン性であり
得る細胞を指す。したがって、当該細胞は、ヒト膵島細胞の機能の少なくとも一部を有す
る１種または複数種の膵臓ホルモンを発現することができる。膵島ホルモン発現細胞は成
熟であっても未成熟であってよく、それらが由来する内分泌前駆体／先駆体型細胞よりも
さらに分化しており、またはさらに発生的に傾倒している。
本明細書で使用される場合、「適正に特定された内分泌細胞」もしくは「ステージ７培
養物」、または「未成熟ベータ細胞」を含めた「未成熟内分泌細胞」という句とは、ｉｎ
ｖｉｖｏで機能することができる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製された内分泌細胞集団、例
えば移植されると血中グルコースに応答してインスリンを分泌する未成熟ベータ細胞を指
す。適正に特定された内分泌細胞またはステージ７培養物は以下を含めた付加的な特性を
有し得る：移植されると、適正に特定された内分泌細胞は、機能的な膵島細胞に発達およ
び成熟することができる。適正に特定された内分泌細胞は、内分泌細胞が濃縮された（ま
たは非内分泌細胞を枯渇させた）ものであり得る。好ましい実施形態では、適正に特定さ
れた内分泌細胞集団内の細胞の約５０％超がＣＨＧＡ＋である。より好ましい実施形態で
は、適正に特定された内分泌細胞集団内の細胞の約６０％超または７０％超または８０％
超または９０％超または９５％超または９８％超または１００％がＣＨＧＡ＋である。好
ましい実施形態では、適正に特定された内分泌細胞集団内の細胞の約５０％未満がＣＨＧ
Ａ－である。より好ましい実施形態では、適正に特定された内分泌細胞集団内の細胞の約
１５％未満がＣＨＧＡ－である。より好ましい実施形態では、適正に特定された内分泌細
胞集団内の細胞の約１０％未満または５％未満または３％未満または２％未満または１％
未満または０．５％未満または０％がＣＨＧＡ－である。さらに、ステージ３の間に、適
正に特定された内分泌細胞においてＮＧＮ３発現などのある特定のマーカーの発現が抑制
され得る。ステージ５において、適正に特定された内分泌細胞におけるＮＧＮ３の発現は
増加され得る。適正に特定された内分泌細胞は単一ホルモン性（例えば、ＩＮＳのみ、Ｇ
ＣＧのみまたはＳＳＴのみ）であり得る。適正に特定された内分泌細胞は、ＮＫＸ６．１
およびＰＤＸ１を含めた他の未成熟内分泌細胞マーカーを同時発現し得る。適正に特定さ
れた内分泌細胞は、単一ホルモン性であり、かつＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を含めた他
の未成熟内分泌細胞マーカーを同時発現し得る。適正に特定された内分泌細胞は、全ＩＮ
Ｓ集団に対する百分率として、より多くの単一ホルモン発現ＩＮＳ細胞を有し得る。好ま
しい実施形態では、適正に特定された内分泌細胞は、全ＩＮＳ集団に対する百分率として
、単一ホルモン発現ＩＮＳ細胞を少なくとも５０％を有する。適正に特定された内分泌細
胞は、ＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）であり得る。好ましい実施形
態では、細胞集団内の細胞の約２５％超がＣＨＧＡ＋／ＴＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重
陽性）である。好ましい実施形態では、細胞集団内の細胞の約３０％超または４０％超ま
たは５０％超または６０％超または７０％超または８０％超または９０％超または９５％
超または１００％がＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）である。
「未成熟内分泌細胞」、特に「未成熟ベータ細胞」という用語またはその等価物は、少
なくとも、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＮＥＵＲＯＤ、ＭＮＸ１、ＮＫＸ２．２、
ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、ＳＮＡＩＬ２、ＦＯＸＡ１またはＦＯＸＡ２からなる群から選択さ
れるマーカーを発現する、内分泌前駆／先駆細胞、膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞、膵臓前腸細
胞、胚体内胚葉細胞、中内胚葉細胞または後で記載されるそれ以前に導出された任意の細
胞を含めた、任意の他の内分泌細胞先駆体から導出された細胞を指す。本明細書に記載の
未成熟ベータ細胞はＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を発現することが好ましく、Ｉ
ＮＳおよびＮＫＸ６．１を同時発現することがより好ましい。「未成熟内分泌細胞」、「
未成熟膵臓ホルモン発現細胞」または「未成熟膵島」という用語またはその等価物は、例
えば、少なくとも、単能性の未成熟ベータ細胞、または図４５に記載の通りプレベータ細
胞を指し、他の未成熟細胞は含まず、例えば、この用語は、未成熟アルファ（グルカゴン
）細胞、または未成熟デルタ（ソマトスタチン）細胞、または未成熟イプシロン（グレリ
ン）細胞、または未成熟膵臓ポリペプチド（ＰＰ）を含まない。
本明細書に記載の実施形態では、限定培地、馴化培地、フィーダーフリー培地、無血清
培地などを含めた多くの幹細胞培地培養物または成長環境が構想される。本明細書で使用
される場合、「成長環境」または「環境」という用語またはその等価物は、未分化の幹細
胞または分化した幹細胞（例えば、霊長類胚性幹細胞）がｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖する環
境である。環境の特徴は、細胞を培養する培地、および存在する場合には支持構造（例え
ば、固体表面上の基質など）を含む。多能性細胞を培養または維持するためおよび／また
は多能性細胞を分化させるための方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、表題Ｃ
ＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＵＳＥＦＵＬ ＦＯＲ ＣＵＬＴＵ
ＲＩＮＧ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＢＬＥ ＣＥＬＬＳ、２００７年２月２３日出願；米
国特許出願第１１／９９３，３９９号、表題ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ
ＣＵＬＴＵＲＥ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ
ＴＨＥＲＥＯＦ、２００７年１２月２０日出願；および米国特許出願第１１／８７５，０
５７号、表題Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｅｅｄｅ
ｒ－ｆｒｅｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａ ｃｏｎｔａ
ｉｎｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ、２００７年１０月１９日出願にも記載されている
。
「基本的に」または「実質的に」という用語は、大部分のまたはｄｅ ｍｉｎｉｍｕｓ
または低下した量の、任意の細胞集団または細胞培養物、例えば本明細書に記載の未成熟
ベータ細胞培養物中に存在する構成成分または細胞が「基本的にまたは実質的に細胞」で
ある、または「基本的または実質的にＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を発現し、基
本的または実質的にＮＧＮ３を発現しない未成熟ベータ細胞」であることを意味する。他
の例としては、これだけに限定されないが、「基本的にまたは実質的にｈＥＳ細胞」、「
基本的にまたは実質的に胚体内胚葉細胞」、「基本的にまたは実質的に前腸内胚葉細胞」
、「基本的にまたは実質的にＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」、「基本的にまたは実質的に
ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞」、「基本的にまたは実質的に膵臓内分泌先駆細胞」、「基
本的にまたは実質的に膵臓内分泌細胞」などが挙げられる。
細胞培養中または細胞集団内の細胞に関して、「を実質的に含まない」という用語は、
その細胞培養物または細胞集団に含まれないと特定された細胞型が、その細胞培養物また
は細胞集団中に存在する細胞の総数の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未
満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満の
量で存在することを意味する。
「減少された血清」または「無血清」という用語またはその等価物は、培地中で成長さ
せる細胞培養物が含有する血清が減少されていることまたは血清を実質的に含まないこと
または血清を全く含まないことを指す。ある特定の培養条件下で、血清濃度は約０％（ｖ
／ｖ）から約１０％（ｖ／ｖ）までにわたる。例えば、いくつかの分化プロセスでは、培
地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％
（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（
ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ
／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％未満（ｖ／ｖ）、約２％未満（ｖ／ｖ）
、約３％未満（ｖ／ｖ）、約４％未満（ｖ／ｖ）、約５％未満（ｖ／ｖ）、約６％未満（
ｖ／ｖ）、約７％未満（ｖ／ｖ）、約８％未満（ｖ／ｖ）、約９％未満（ｖ／ｖ）または
約１０％（ｖ／ｖ）未満であってよい。いくつかのプロセスでは、血清を用いずに、また
は血清代替物を用いずに前原条細胞を成長させる。さらに他のプロセスでは、Ｂ２７の存
在下で前原条細胞を成長させる。そのようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は
約０．１％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）までにわたってよい。
さらに他のプロセスでは、Ｂ２７の存在下で細胞培養物を成長させる。そのようなプロ
セスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は約０．１％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）ま
でにわたってもよく、約２０％（ｖ／ｖ）を超える濃度であってもよい。ある特定のプロ
セスでは、培地中のＢ２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約
０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／
ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（
ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）
、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０
％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）または約２０％（ｖ／ｖ）である。あるいは、添加す
るＢ２７サプリメントの濃度は、市販のＢ２７ストック溶液の強度の倍数として測定する
ことができる。例えば、Ｂ２７はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から
５０×ストック溶液として入手可能である。十分な量のこのストック溶液を十分な体積の
成長培地に添加することにより、所望の量のＢ２７が補充された培地を生成する。例えば
、５０×Ｂ２７ストック溶液１０ｍｌを成長培地９０ｍｌに添加することにより、５×Ｂ
２７が補充された成長培地を生成することになる。培地中のＢ２７サプリメントの濃度は
、約０．１×、約０．２×、約０．３×、約０．４×、約０．５×、約０．６×、約０．
７×、約０．８×、約０．９×、約１×、約１．１×、約１．２×、約１．３×、約１．
４×、約１．５×、約１．６×、約１．７×、約１．８×、約１．９×、約２×、約２．
５×、約３×、約３．５×、約４×、約４．５×、約５×、約６×、約７×、約８×、約
９×、約１０×、約１１×、約１２×、約１３×、約１４×、約１５×、約１６×、約１
７×、約１８×、約１９×、約２０×、および約２０×超であり得る。
さらに別の態様では、分化のためのインスリンレベル要件が低い場合、Ｂ２７は高レベ
ルのインスリンを含有するので、Ｂ２７は使用しない。例えば、出願人は、１００×のＢ
２７ストックおよびＩＴＳストック、ならびにそれぞれのＲＰＭＩ中１×ワーキングスト
ック溶液中のインスリンレベルを決定した。インスリンレベルはＭｅｒｃｏｄｉａ Ｕｌ
ｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡキットを製造者の説明書に従っ
て決定した。どちらもＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ）から購入した未開封の１００×および５０×Ｂ２７ストックおよびＩＴ
Ｓストックに対してそれぞれアッセイを実施した。アッセイから生じた結果が以下の表３
に示されている。
Figure 2022017361000008
表３には、１×Ｂ２７中および１×ＩＴＳ中にそれぞれ約３μｇ／ｍＬおよび１０μｇ
／ｍＬのインスリンが存在することが示されている。さらに、ＩＴＳの１００×ストック
中のインスリン濃度は、製造者により記載されたインスリン濃度と一致する。Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは５０×Ｂ２７についてのインスリン濃度は提供しておらず、
したがって、製造者により示されたインスリンレベルとの比較はないが、上記の約１６０
μｇ／ｍＬのインスリン濃度は、同時に実施した１００×ＩＴＳストックの正確な測定に
基づいて、かつ、インスリンおよびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）がどちらもＰＩ３－
キナーゼ依存性シグナル伝達のよく確立されたアゴニストであることが示され、ＰＩ３－
キナーゼ阻害剤（例えば、ＬＹ２９４００２）によりインスリン／ＩＧＦのエフェクター
が阻害されることによって胚体内胚葉形成が促進されることが示唆されているＭｃＬｅａ
ｎら（２００７）上記に基づいて、正確である。図６Ａおよび図６Ｂを参照されたい。特
に、ＳＯＸ１７発現は１μｇ／ｍＬのインスリンで４分の１に低下する。インスリンおよ
び／またはＩＧＦは、ＫＳＲ、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、Ｂ２
７およびＳｔｅｍＰｒｏ３４などの種々の培地補充物質中に生物学的に活性なレベルで存
在し、そのような培養条件下では胚体内胚葉分化を阻害する可能性がある、例えば、Ｊｉ
ａｎｇら（２００７）上記。
本明細書で使用される場合、例えば作用物質、構成成分、成長因子、分化因子などの「
外因性」または「外因的に添加された」化合物とは、培養物または馴化培地に関しては、
培養物または培地にすでに存在していてもしていなくてもよい任意の化合物または成長因
子を補うために培養物または培地に添加される化合物を指す。例えば、一部の実施形態で
は、細胞培養物および／または細胞集団は、外因的に添加されたレチノイドを含まない。
本明細書で使用される場合、「レチノイド」とは、レチノール、レチナールまたはレチ
ノイン酸ならびにこれらの化合物のいずれかの誘導体を指す。好ましい実施形態では、レ
チノイドはレチノイン酸である。
「ＦＧＦファミリー成長因子」、「線維芽細胞成長因子」または「線維芽細胞成長因子
ファミリーのメンバー」という用語は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧ
Ｆ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２
、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ
１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２およびＦＧＦ２３を含む群から選択されるＦ
ＧＦを意味する。一部の実施形態では、「ＦＧＦファミリー成長因子」、「線維芽細胞成
長因子」または「線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー」とは、公知の線維芽細胞成
長因子ファミリーのメンバーとの相同性および／またはそれと同様の機能を有する任意の
成長因子を意味する。
「ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子」または「ＴＧＦβスーパーファミリーリガン
ド」または「ＴＧＦβＴＧＦ－ベータシグナル伝達経路活性化因子」という用語またはそ
の等価物は、ＴＧＦ－ベータ１、ＴＧＦ－ベータ２、ＴＦ－ベータ３、ＧＤＦ－１５、Ｇ
ＤＦ－９、ＢＭＰ－１５、ＢＭＰ－１６、ＢＭＰ－３、ＧＤＦ－１０、ＢＭＰ－９、ＢＭ
Ｐ－１０、ＧＤＦ－６、ＧＤＦ－５、ＧＤＦ－７、ＢＭＰ－５、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７
、ＢＭＰ－８、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＧＤＦ－３、ＧＤＦ－１、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ
８、アクチビンベータＣ、アクチビンベータＥ、アクチビンベータＡおよびアクチビンベ
ータＢ、ＢＭＰ－１４、ＧＤＦ－１４、ＭＩＳ、インヒビンアルファ、Ｌｅｆｔｙ１、Ｌ
ｅｆｔｙ２、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、パーセフィンおよびアルテミンのサブファミリ
ーを含めた、３０種超の構造的に関連するタンパク質を指す。Ｃｈａｎｇら（２００２）
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ． ２３（６）：７８７－８２３を参照されたい。これらの
リガンドは、一般には、およそ４００～５００アミノ酸（ａａ）のプレプロペプチドとし
て合成され、「ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子」または「ＴＧＦβスーパーファミ
リーリガンド」または「ＴＧＦβＴＧＦ－ベータシグナル伝達経路活性化因子」またはそ
の等価物は全長のタンパク質であってもそのタンパク質分解によるペプチドであってもよ
い。
「ＥＲＢＢリガンド」という用語は、ＥｒｂＢ受容体のいずれか１つに結合し、それが
今度は別のＥｒｂＢ受容体と二量体を形成し得、または単量体として機能し得、それによ
ってＥｒｂＢ部分単量体もしくは二量体またはヘテロ二量体受容体のチロシンキナーゼ活
性を活性化する、リガンドを指す。ＥｒｂＢリガンドの非限定的な例としては、ニューレ
グリン－１；これだけに限定されないが、ＨＲＧ－β、ＨＲＧ－α、Ｎｅｕ分化因子（Ｎ
ＤＦ）、アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）、グリア細胞成長因子２（ＧＧＦ２
）、および感覚ニューロンおよび運動ニューロン由来因子（Ｓｅｎｓｏｒｙ Ａｎｄ Ｍ
ｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｆａｃｔｏｒ）（ＳＭＤＦ）を含めたニュー
レグリン－１のスプライスバリアントおよびアイソフォーム；ニューレグリン－２；これ
だけに限定されないが、ＮＲＧ２－βを含めたニューレグリン－２のスプライスバリアン
トおよびアイソフォーム；エピレギュリン；およびビレギュリン（Ｂｉｒｅｇｕｌｉｎ）
が挙げられる。
「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、材料または物質の生成ならびに材
料または物質の生成のレベルまたは量を指す。したがって、特定のマーカーの発現を決定
することとは、発現されるマーカーの相対量または絶対量を検出することまたは単にマー
カーが存在するかしないかを検出することを指す。
「マーカー」という用語は、本明細書で使用される場合、観察または検出することがで
きる任意の分子を指す。例えば、マーカーとしては、これだけに限定されないが、特定の
遺伝子の転写物などの核酸、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖
タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質または小分子（例えば、分子量が
１０，０００ａｍｕ未満の分子）を挙げることができる。
本明細書に記載の大多数のマーカーについて、公式のＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｒ
ｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＨＵＧＯ）遺伝子記号が提供される。ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏ
ｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより開発されるそのような記号により、命
名されたヒト遺伝子および遺伝子産物のそれぞれに対して固有の略語が提供される。当業
者はこれらの遺伝子記号を容易に認識することができ、また、対応する固有のヒト遺伝子
および／またはタンパク質配列と容易に関連付けることができる。
ＨＵＧＯによる名称によると、以下の遺伝子記号は次のように定義される：ＧＨＲＬ－
グレリン；ＩＡＰＰ－島アミロイドポリペプチド；ＩＮＳ－インスリン；ＧＣＧ－グルカ
ゴン；ＩＳＬ１－ＩＳＬ１転写因子；ＰＡＸ６－ペアードボックス遺伝子６；ＰＡＸ４－
ペアードボックス遺伝子４；ＮＥＵＲＯＧ３－ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）；ＮＫＸ２
－２－ＮＫＸ２転写因子関連遺伝子座２（ＮＫＸ２．２）；ＮＫＸ６－１－ＮＫＸ６転写
因子関連遺伝子座１（ＮＫＸ６．１）；ＩＰＦ１－インスリン プロモーター 因子１（Ｐ
ＤＸ１）；ＯＮＥＣＵＴ１－ワンカットドメイン、ファミリーメンバー１（ＨＮＦ６）；
ＨＬＸＢ９－ホメオボックスＢ９（ＨＢ９）；ＴＣＦ２－転写因子２、肝臓（ＨＮＦ１ｂ
）；ＦＯＸＡ１－フォークヘッドボックスＡ１；ＨＧＦ－肝細胞成長因子；ＩＧＦ１－イ
ンスリン様成長因子１；ＰＯＵ５Ｆ１－ＰＯＵドメイン、クラス５、転写因子１（ＯＣＴ
４）；ＮＡＮＯＧ－Ｎａｎｏｇホメオボックス；ＳＯＸ２－ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）－ボ
ックス２；ＣＤＨ１－カドヘリン１、１型、Ｅ－カドヘリン（ＥＣＡＤ）；Ｔ－ｂｒａｃ
ｈｙｕｒｙホモログ（ＢＲＡＣＨ）；ＦＧＦ４－線維芽細胞成長因子４；ＷＮＴ３－無翅
型ＭＭＴＶ組み込み部位ファミリー、メンバー３；ＳＯＸ１７－ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）
－ボックス１７；ＧＳＣ－グースコイド；ＣＥＲ１－（ケルベロス１、システインノット
スーパーファミリー、ホモログ（ＣＥＲ）；ＣＸＣＲ４－ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチー
フ）受容体４；ＦＧＦ１７－線維芽細胞成長因子１７；ＦＯＸＡ２－フォークヘッドボッ
クスＡ２；ＳＯＸ７－ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）－ボックス７；ＳＯＸ１－ＳＲＹ（性決定
領域Ｙ）－ボックス１；ＡＦＰ－アルファ－フェトプロテイン；ＳＰＡＲＣ－分泌タンパ
ク質、酸性、システインリッチ（オステオネクチン）；およびＴＨＢＤ－トロンボモジュ
リン（ＴＭ）、ＮＣＡＭ－神経系細胞接着分子；ＳＹＰ－シナプトフィジン；ＺＩＣ１－
Ｚｉｃファミリーメンバー１；ＮＥＦ３－神経フィラメント３（ＮＦＭ）；ＳＳＴ－ソマ
トスタチン；ＭＡＦＡ－ｖ－ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＡ；ＭＡＦＢ－ｖ－
ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＢ；ＳＹＰ－シナプトフィジン；ＣＨＧＡ－クロ
モグラニンＡ（副甲状腺分泌型タンパク質１）；ＮＧＮ３－ニューロゲニン３、ＮＫＸ２
．２－ＮＫ２ホメオボックス２；ＮＫＸ６．１－ＮＫ６ホメオボックス１；ＩＤ１－ＤＮ
Ａ結合性１、ＧＨＲＬ－グレリン／オベスタチンプレプロペプチドの阻害剤、ＧＳＫ－グ
リコーゲンシンターゼキナーゼ、Ｇ６ＰＣ２－グルコース－６－ホスファターゼ、ＵＣＮ
３－ウロコルチン３、ＰＣＳＫ１－プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン１型
、ＳＬＣ３０Ａ８－溶質輸送体ファミリー３０（亜鉛輸送体）、メンバー８、およびＣＡ
ＤＨ１－Ｅ－カドヘリン。線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ７）およびケラチノサイト成長
因子（ＫＧＦ）という用語は同義である。
多能性細胞から種々の多分化能および／または分化した細胞への進行は、遺伝子、また
は遺伝子マーカーの相対的な発現量、特定の細胞の特性を、第２の遺伝子または対照遺伝
子、例えばハウスキーピング遺伝子の発現と比較して決定することによってモニタリング
することができる。いくつかのプロセスでは、ある特定のマーカーの発現を、マーカーが
存在するかしないかを検出することによって決定する。あるいは、ある特定のマーカーの
発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞中でマーカーが存在するレベルを測定すること
によって決定することができる。そのようなプロセスでは、マーカーの発現の測定は定性
的であっても定量的であってもよい。マーカー遺伝子によって生成するマーカーの発現を
定量化する１つの方法は、定量的ＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）を使用することによるものである
。Ｑ－ＰＣＲを実施する方法は当技術分野で周知である。当技術分野で公知の他の方法も
、マーカー遺伝子発現を定量化するために使用することができる。例えば、マーカー遺伝
子の発現産物は、目的のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を使用することによって検出
することができる。
多くの遺伝子を高い感度および効率で解析するために、さらなる多重化アッセイおよび
／または方法体系が利用可能である。例えば、少なくとも、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ（Ｓｅ
ａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）により提供されるｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いて
、使用者は現在のところ８００種に至るまでの遺伝子の発現レベルを同時に、定量的ＰＣ
Ｒ系に匹敵する感度で、かつ１５分未満の反応当たりの実践時間で解析することができる
。したがって、試料（例えば、それぞれステージ４ＰＥＣおよびステージ７内分泌前駆体
／先駆体および内分泌細胞培養物）のいずれかの中の全ＲＮＡを、６１００核酸抽出器（
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使
用して単離することができ（例えば、３連で）、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅ
ｒ ｓｙｓｔｅｍを使用して遺伝子発現を定量化するためには反応当たり約１００ｎｇが
必要である。また、アナログ検出の代わりに、ｎＣｏｕｎｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍではデジ
タル検出を使用し、それにより、各遺伝子転写物を、有色のフルオロフォアの固有の連な
り（分子バーコード）に付着したＤＮＡのセグメントに結合したプローブによって検出す
る。したがって、その転写物の同定は連なり上の蛍光体の強度ではなく蛍光体の順序のみ
に依存する。第２に、試料中の全転写物の数を、特定の蛍光体の連なり（バーコード）が
検出される総回数を計数することによって数量化する。さらに、この方法は、標的ｍＲＮ
Ａの増幅を必要とせず、したがって、その範囲は発現の生物学的範囲、一般には、３桁に
わたるものである。現在この系では、細胞当たり２０コピー（１０ｆＭ）の単一の転写物
のわずか１．２倍の変化を、統計的有意性（ｐ＜０．０５）を伴って測定することができ
る。細胞当たり０．５コピーから２０コピーの間のレベルで発現される遺伝子については
、発現レベルの１．５倍の差異が同じレベルの信頼度で検出可能である。
いくつかのプロセスでは、他の遺伝子の低発現と比較した以下の遺伝子の高発現により
、細胞のある特定の集団が示される。例えば、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＡＦＰまたはＴＨ
ＢＤにより胚体外内胚葉が示され、ＮＯＤＡＬおよび／またはＦＧＦ８により前原条が示
され、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１および／またはＷＮＴ３により中内胚
葉が示され、ＣＥＲ、ＧＳＣ、ＣＸＣＲ４、ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２により胚体内胚
葉細胞が示され、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１ＢおよびＨＮＦ４Ａに
より前腸内胚葉（またはＰＤＸ１陰性内胚葉）が示され、ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＳＯＸ９
およびＰＲＯＸ１によりＰＤＸ１陽性内胚葉が示され；ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ
Ａ１、ＣＰＡおよびｃＭＹＣにより膵臓上皮（ＰＥまたは膵臓前駆体）が示され、ＮＧＮ
３、ＰＡＸ４、ＡＲＸおよびＮＫＸ２．２により内分泌前駆／先駆細胞が示され、ＩＮＳ
、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴおよびＰＰにより種々の内分泌細胞が示され、ＭＡＦＡ遺伝
子発現がＭＡＦＢ遺伝子発現に対して相対的に高いことにより、インスリン分泌内分泌細
胞が示され、ＭＡＦＡ遺伝子発現に対するＭＡＦＢの相対的な高発現により、グルカゴン
分泌内分泌細胞が示される。さらにある特定の図には、特定の系列の特定の細胞型に典型
的なこれらの「シグネチャー」または「重要な」マーカーのみが示されている。他のマー
カーまたは遺伝子、例えば、構成的に発現される、またはある特定の系列もしくは全ての
系列の全てもしくは大部分もしくは大多数の細胞型において発現される遺伝子が発現され
ているが、示されていないまたは記載されていないことが当業者にはよく理解されるであ
ろう。
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成するための方法
本明細書に記載の実施形態は、いかなる１つの型のｉＰＳ細胞にも、いかなる１つのｉ
ＰＳ細胞の生成方法にも限定されない。種々の方法が存在するので、実施形態は限定的な
ものではない、またはｉＰＳ細胞の生成の効率のレベルに左右される。本明細書に記載の
実施形態はｉＰＳ細胞の内胚葉系列細胞への分化およびその使用にあてはまる。
ある特定の核再プログラミング因子を使用した研究により、多能性幹細胞または多能性
様幹細胞を患者自身の体細胞から導出することが可能になった。これらの細胞は人工多能
性幹（ｉＰＳ）細胞とも称される。本発明では、Ｓｈｉｎｙａ Ｙａｍａｎａｋａ、Ｋｙ
ｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより提供された種々のｉＰＳ細胞株について記載されて
いる。しかし、他のｉＰＳ細胞株、例えばＪａｍｅｓ Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ａ１．に記載
されているものは本発明によるものである。米国特許出願公開第２００９００４７２６３
号、国際公開ＷＯ２００５／８０５９８、米国特許出願公開第２００８０２３３６１０号
および国際公開ＷＯ２００８／１１８８２を参照されたい。したがって、本明細書で使用
される場合、「人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞」とは、他の多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細
胞、ｈＥＧ細胞、ｐＰＳ（霊長類多能性幹）細胞、単為発生細胞などと同様の性質を有す
る細胞を意味する。
核プログラミング因子は、米国特許出願公開第２００９００４７２６３号、国際公開Ｗ
Ｏ２００５／８０５９８、米国特許出願公開第２００８０２３３６１０号および国際公開
ＷＯ２００８／１１８８２に記載されており、卵、胚、またはＥＳ細胞を使用せずに、分
化した細胞の再プログラミングを誘導するために使用される。本発明で使用され、記載さ
れているものと同様の核再プログラミング因子を使用することによって体細胞から誘導さ
れたｉＰＳ細胞を調製するための方法は特に限定されない。好ましい実施形態では、体細
胞および人工多能性幹細胞が増殖し得る環境で、核再プログラミング因子を体細胞と接触
させる。本明細書に記載のある特定の実施形態の利点は、卵、胚、または胚性幹（ＥＳ）
細胞の不在下で核再プログラミング因子を体細胞と接触させることによって人工多能性幹
細胞を調製することができることである。核再プログラミング因子を使用することによっ
て、体細胞の核を再プログラミングしてｉＰＳ細胞または「ＥＳ様細胞」を得ることがで
きる。
本明細書に記載の多能性幹細胞は、ｈＥＳ細胞であるかｉＰＳ細胞であるかにかかわら
ず、これだけに限定されないが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；ＡＢＣＧ２；ステー
ジ特異的胚抗原－１（ＳＳＥＡ－１）；ＳＳＥＡ－３；ＳＳＥＡ－４；ＴＲＡ－１－６０
；ＴＲＡ－１－８１；Ｔｒａ－２－４９／６Ｅ；ＥＲａｓ／ＥＣＡＴ５、Ｅ－カドヘリン
；．β．ＩＩＩ－チューブリン；．アルファ．－平滑筋アクチン（アルファ．－ＳＭＡ）
；線維芽細胞成長因子４（Ｆｇｆ４）、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、Ｄａｘ１；ジンクフ
ィンガータンパク質２９６（Ｚｆｐ２９６）；Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ－１（Ｎ
ａｔ１）；（ＥＳ細胞関連転写物１（ＥＣＡＴ１）；ＥＳＧ１／ＤＰＰＡ５／ＥＣＡＴ２
；ＥＣＡＴ３；ＥＣＡＴ６；ＥＣＡＴ７；ＥＣＡＴ８；ＥＣＡＴ９；ＥＣＡＴ１０；ＥＣ
ＡＴ１５－１；ＥＣＡＴ１５－２；Ｆｔｈｌ１７；Ｓａｌｌ４；未分化胚細胞転写因子（
Ｕｔｆ１）；Ｒｅｘ１；ｐ５３；Ｇ３ＰＤＨ；ＴＥＲＴを含めたテロメラーゼ；サイレン
トＸ染色体遺伝子；Ｄｎｍｔ３ａ；Ｄｎｍｔ３ｂ；ＴＲＩＭ２８；Ｆ－ボックス含有タン
パク質１５（Ｆｂｘ１５）；Ｎａｎｏｇ／ＥＣＡＴ４；Ｏｃｔ３／４；Ｓｏｘ２；Ｋｌｆ
４；ｃ－Ｍｙｃ；Ｅｓｒｒｂ；ＴＤＧＦ１；ＧＡＢＲＢ３；Ｚｆｐ４２、ＦｏｘＤ３；Ｇ
ＤＦ３；ＣＹＰ２５Ａ１；発生多能性関連２（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｌｕｒｉ
ｐｏｔｅｎｃｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ２）（ＤＰＰＡ２）；Ｔ細胞リンパ腫ブレイク
ポイント１（Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ １）（Ｔｃｌ１
）；ＤＰＰＡ３／Ｓｔｅｌｌａ；ＤＰＰＡ４などを含めた任意の数の多能性細胞マーカー
を発現し得る。本発明は本明細書において列挙されているマーカーに限定されず、細胞表
面マーカー、抗原、ならびにＥＳＴ、ＲＮＡ（マイクロＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ
を含む）、ＤＮＡ（遺伝子およびｃＤＮＡを含む）およびその一部を含めた他の遺伝子産
物などのマーカーを包含することが理解される。
一実施形態では、本明細書で使用されるｉＰＳ細胞株は、以下の核再プログラミング因
子遺伝子を含有する：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、およびＳｏｘ
ファミリー遺伝子。ある１つのｉＰＳ細胞株では、以下の３種類の遺伝子：Ｏｃｔ３／４
、Ｋｌｆ４、およびＳｏｘ２のそれぞれが提供される。以下の３種類の遺伝子：Ｏｃｔフ
ァミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子、例えば、Ｏ
ｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃのそれぞれの他のｉＰＳ細胞株遺伝子産物を使用
した。したがって、核再プログラミング因子はＭｙｃファミリー遺伝子を伴ってもよく伴
わなくてもよいことが理解される。
本明細書に記載されており、当技術分野でも公知の核再プログラミング因子は、分化し
た成体の体細胞からｉＰＳ細胞を生じさせるために使用することができ、また、これは再
プログラミングされる体細胞の型に限定されない、すなわち、任意の種類の体細胞を再プ
ログラミングまたは脱分化させることができる。体細胞の再プログラミングには卵および
／または胚が必要ないので、ｉＰＳ細胞は哺乳動物細胞であってよく、したがって、患者
または疾患に特異的な多能性幹細胞を生じさせる機会がもたらされる。
アデノウイルス、プラスミド、またはＣｒｅ－ｌｏｘＰ３もしくはｐｉｇｇｙ ＢＡＣ
転位を使用した再プログラミング因子の切除を使用する、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）
を生じさせるためのウイルスによる方法、ウイルスによらない方法および非組込み型ウイ
ルスによる方法が記載されている。Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２
２、９４５－９４９（２００８）；Ｏｋｉｔａ，Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２、９４
９－９５３（２００８）；Ｋａｊｉ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４５８、７７１－７７５（
２００９）；Ｓｏｌｄｎｅｒ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ １３６、９６４－９７７（２００９）
；およびＷｏｌｔｊｅｎ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４５８、７６６－７７０（２００９）
を参照されたい。同様に、Ｍａｃｋ，Ａ．らに対する米国特許出願公開第２０１００００
３７５７号（２０１０年１月７日公開）およびＳｈｉらに対するＰＣＴ／ＵＳ２００９／
０３７４２９も参照されたい。しかし、これらの方法の再プログラミング効率は低く（＜
０．００３％）、切除にもかかわらずベクター配列が残留する可能性があり、それにより
、それらの治療への適用が限定される。例えば、上記の転写因子の宿主ゲノムへのウイル
スによる組み込みおよび過剰発現は腫瘍形成に関連付けられており、導入遺伝子の発現が
残留することは、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を区別する潜在的な特徴である。Ｓｏｌｄｅ
ｒ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ １３６：９６４－９７７（２００９）；Ｆｏｓｔｅｒら、Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ ２４：１４９１－１５００（２００５）；およびＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ
，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ １２１：４６５－４７７（２００５）を参照されたい。
本発明の他の実施形態では、ｉＰＳＣを生じさせるための方法はエプスタイン・バーウ
イルスから導出されたエピソームベクターを含む。Ｙｕ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４
、７９７－８０１（２００９）およびＭａｃｋ，Ａ．らに対する米国特許出願公開第２０
１００００３７５７号、２０１０年１月７日公開を参照されたい。これらの方法では、癌
遺伝子ＳＶ４０を含めた７種の因子の組合せを有する３つの別々のプラスミドが必要であ
る。
本発明の別の実施形態では、ｉＰＳＣを生じさせるための方法は、マウス細胞およびヒ
ト胎児細胞および新生児細胞由来のタンパク質に基づくｉＰＳＣを含む。Ｚｈｏｕ，Ｈ．
ら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４、３８１－３８４（２００９）；およびＫｉｍ，
Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４、４７２－４７６（２００９）を参照された
い。これらの方法体系は、化学的処理（例えば、Ｚｈｏｕら、２００９、上記の場合では
バルプロ酸）または多数回の処理（Ｋｉｍら、２００９、上記）を使用して実現される。
本発明の別の実施形態では、細菌の複製開始点および抗生物質耐性遺伝子を欠く高次コ
イルＤＮＡ分子であるミニサークルベクターまたはプラスミドを使用することができる。
Ｃｈｅｎ、Ｚ．－Ｙ．ら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ８、４９５－５００（２００３）；Ｃ
ｈｅｎ、Ｚ．－Ｙ．ら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １６、１２６－１３１（２０
０５）；およびＪｉａ，Ｆら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｄｖａｎｃｅ Ｐｕｂ
ｌｉｃａｔｉｏｎ Ｏｎｌｉｎｅ ７ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０を参照されたい。こ
れらの方法体系では、外因性サイレンシング機構の活性化が低いので、高いトランスフェ
クション効率およびより長い異所性発現でｉＰＳＣが生じる。
本発明のさらに別の実施形態では、糖尿病患者、ＡＬＳ、脊椎筋ジストロフィーおよび
パーキンソン患者を含めた種々の疾患のヒト患者からｉＰＳ細胞を生じさせることができ
る。Ｍａｅｈｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０６（３７）：１５７６８－７３（２００９）
；Ｄｉｍｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１：１２１８－２１（２００８）；Ｅｂｅｒｔら
、Ｎａｔｕｒｅ ４５７：２７７－８０（２００９）；Ｐａｒｋら、Ｃｅｌｌ １３４：
８７７－８８６（２００８）；およびＳｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ １３６：９６４－９
７７を参照されたい。特定の疾患を有する患者からｈＩＰＳ細胞を生成することの少なく
とも１つの利点は、導出された細胞がヒト疾患の遺伝子型および細胞応答を含有すること
である。現存するヒトｉＰＳ細胞株の少なくとも一部が列挙されている表４も参照された
い。この情報は、文献および例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈ
ｅａｌｔｈ（ＮＩＨ） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ，ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ
Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｗｏｒｃｅｓ
ｔｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔ
ｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙを含めた公的に利用可能なデータベースから導出され
たものである。これらのデータベースは、細胞株が利用可能になり登録が得られた時に定
期的に更新されている。
本明細書に記載の組成物および方法の複数の実施形態では、これだけに限定されないが
、ＣｙＴ４９、ＣｙＴ２１２、ＣｙＴ２０３、ＣｙＴ２５、（少なくとも本出願の出願時
に、ＶｉａＣｙｔｅ Ｉｎｃ．、３５５０ Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｔｏｍｉｃｓ Ｃｏｕｒ
ｔ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ ９２１２１から市販されていた）、ＢＧＯ１、ＢＧ０２
およびＭＥＬ１を含めたｈＥＳＣなどのヒト多能性幹細胞、ならびにｉＰＳＣ－４８２ｃ
７およびｉＰＳＣ－６０３（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから市販されている）、なら
びにｉＰＳＣ－Ｇ４（以下「Ｇ４」）およびｉＰＳＣ－Ｂ７（以下、「Ｂ７」）（Ｓｈｉ
ｎｙａ Ｙａｍａｎａｋａ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｉＰＳ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ、Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから市販されている）などの人工多能性幹（ｉＰ
Ｓ）細胞を含めた種々の分化可能な霊長類多能性幹細胞の使用が意図されており、これら
および他のヒトｉＰＳ細胞を使用した試験は、米国特許出願第１２／７６５，７１４号お
よび同第１３／７６１，０７８号、どちらも表題「ＣＥＬＬ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ
ＦＲＯＭ ＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＥＤ ＲＥＰＲＯＧＲＡＭＭＥＤ ＣＥＬＬ
Ｓ」、それぞれ２０１０年４月２２日および２０１３年２月６日出願に詳しく記載されて
いる。ある特定のこれらのヒト多能性幹細胞はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）などの国際登録機関に登録され、ＮＩＨ Ｈｕｍａｎ
Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙに列挙されている（例えば、ＣｙＴ４９の登録番
号は００４１である）。他の入手可能な細胞株はｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙのワールドワイドウェブにも見出すことができる。
さらに他の細胞株、例えば、ＢＧ０１およびＢＧＯ１ｖは、それぞれＷｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（ＷＩＳＣ）Ｂａｎｋの関係団体で
あるＷｉＣｅｌｌ（登録商標）（カタログ名、ＢＧ０１）およびＡＴＣＣ（カタログ番号
ＳＣＲＣ－２００２）によって第三者に商業的に販売および配布されている。本明細書に
記載の他の細胞株はＷｉＣｅｌｌ（登録商標）またはＡＴＣＣなどの生物学的リポジトリ
によって登録または配布されていない場合があるが、そのような細胞株は原理研究者、研
究室および／または施設から直接または間接的に公に市販されている。細胞株および試薬
の公開要求は、例えば生命科学の当業者にとっては通例である。一般には、これらの細胞
または材料の譲渡は、細胞株または材料の所有者と受取人の間の標準の材料譲渡契約を介
する。これらの型の材料譲渡は、特に生命科学における研究環境では頻繁に生じる。実際
、出願人は、ＣｙＴ４９（２００６）、ＣｙＴ２０３（２００５）、Ｃｙｔ２１２（２０
０９）、ＣｙＴ２５（２００２）、ＢＧ０１（２００１）、ＢＧ０２（２００１）、ＢＧ
０３（２００１）およびＢＧＯｌｖ（２００４）を含めた細胞が導出され特徴付けられた
時から、営利および非営利産業パートナーおよび共同研究者とのそのような契約を通じて
常套的に細胞の譲渡を受けてきた。前記の一覧の各細胞株の隣の括弧内の年は、細胞株ま
たは材料が公的に入手可能かつ不死のものになった（例えば細胞バンクが作製された）年
を示し、したがって、組成物を作製するためおよび本明細書に記載の方法を実施するため
にこれらの細胞株が樹立された時から別の胚の破壊は実施または要求されていない。
表４および表５は、それぞれ、ある特定のｉＰＳＣおよびｈＥＳＣの包括的ではない一
覧であり、研究目的および／または商業目的で世界的に利用可能であり、本発明の方法お
よび組成物での使用に適している。表３および表４の情報は、文献および例えばＮａｔｉ
ｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ
ＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、Ｕ
ＳＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙを含め
た公的に利用可能なデータベースから導出されたものである。これらのデータベースは、
細胞株が利用可能になり登録が得られた時に定期的に更新されている。
本明細書に記載のヒトｉＰＳＣ（少なくともｉＰＳＣ－６０３およびｉＰＳＣ－４８２
－ｃ７）はＣｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ
．（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）により提供されたものである。
Figure 2022017361000009
Figure 2022017361000010
Figure 2022017361000011
Figure 2022017361000012
Figure 2022017361000013
Figure 2022017361000014
Figure 2022017361000015
Figure 2022017361000016
Figure 2022017361000017
ｈＩＰＳを使用することの別の利点は、そのようなｈＩＰＳ細胞が免疫学的に適合した
自己細胞集団であり、患者に特異的な細胞により、疾患の起源および進行を試験すること
が可能になることである。したがって、疾患の根本原因を理解することが可能であり、そ
れにより、疾患に対する予防的処置および治療的処置の開発を導く洞察がもたらされ得る
。
多能性ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞
一部の実施形態は、胚体内胚葉細胞および最終的には、これだけに限定されないが、前
腸内胚葉、膵臓内胚葉、内分泌前駆／先駆細胞および／または膵島ホルモン発現細胞を含
めた任意の内胚葉系列由来細胞型を、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を出発材料として使用し
て導出するための方法を対象とする。これらのｈＥＳ細胞は、桑実胚、胚内部細胞塊また
は胚の生殖隆起から得られるものを起源とする細胞であってよい。ヒト胚性幹細胞は、当
技術分野で公知の方法を使用して、培養物中、実質的な分化を伴わずに多能性の状態で維
持することができる。そのような方法は、例えば、米国特許第５，４５３，３５７号；同
第５，６７０，３７２号；同第５，６９０，９２６号；同第５，８４３，７８０号；同第
６，２００，８０６号および同第６，２５１，６７１号に記載されている。
いくつかのプロセスでは、多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞は、フィーダー層上で維持
される。そのようなプロセスでは、多能性細胞を多能性の状態で維持することを可能にす
る任意のフィーダー層を使用することができる。ヒト胚性幹細胞の培養（ｃｕｌｔｉｖａ
ｔｉｏｎ）に一般に使用されるフィーダー層の１つは、マウス線維芽細胞の層である。つ
い最近、多能性細胞の培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）において使用するためのヒト線維
芽細胞フィーダー層が開発された（米国特許出願公開第２００２／００７２１１７号）。
代替のプロセスでは、フィーダー層を使用せずに多能性細胞を維持することが可能になる
。
本明細書に記載の多能性細胞は、血清を伴うまたは伴わない、細胞外マトリックスを伴
うまたは伴わない、ＦＧＦを伴うまたは伴わない培養物中で維持することができる。いく
つかの多能性細胞の維持手順では、血清代替物を使用する。多能性細胞または多分化能細
胞を培養し、分化させるためのこれらおよび他の方法は、それぞれ、ＰＣＴ／ＵＳ２００
７／０６２７５５、２００７年２月２３日出願、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ
ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬ ＣＥＬＬ
ＳおよびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６、２００８年１０月２０日出願、表題ＭＥ
ＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＦＥＥＤＥＲ－ＦＲＥＥ Ｐ
ＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＭＥＤＩＡ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＨＵ
ＭＡＮ ＳＥＲＵＭに記載されている。
本明細書に記載の発明は全てのｈＥＳ細胞株、および少なくとも、識別されている企業
から市販されているまたはＷｉＣｅｌｌからワールドワイドウェブｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ
／ｈｏｍｅ／ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｌｉｎｅｓ／ｏｒｄｅｒ－ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｌｉ
ｎｅｓ／ｏｂｔａｉｎ－ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｌｉｎｅｓ．ｃｍｓｘで市販されているも
のである、表５に列挙されているものと共に有用である。この情報は、文献および例えば
、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ） Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ
ＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、Ｕ
ＳＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙを含め
た公的に利用可能なデータベースから導出されたものである。これらのデータベースは、
細胞株が利用可能になり登録が得られた時に定期的に更新されている。Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙには少なくとも２５４種のｉＰＳＣ
市販株が列挙されており、１２１１種のｈＥＳＣ株が市販されている。以下の表５は列挙
されているｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの全てを含むものではなく、潜在的に入手可能な多能
性幹細胞の例である。
Figure 2022017361000018
Figure 2022017361000019
Figure 2022017361000020
Figure 2022017361000021
Figure 2022017361000022
Figure 2022017361000023
Figure 2022017361000024
Figure 2022017361000025
Figure 2022017361000026
多能性幹細胞を導出するための代替方法
胚を破壊せずに哺乳動物ＥＳ細胞などの多能性幹細胞を導出するための方法が存在する
。簡単に述べると、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗｏｒｃｅｓ
ｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により、胚をインタクトなままにし、し
たがってその破壊を引き起こさずに単一の割球からマウスＥＳ細胞およびヒトＥＳ細胞を
導出することについて記載されている３件の科学論文が公開された。２００５年の後期に
、Ｃｈｕｎｇらにより、マウスＥＳ細胞を単一の割球から作製するための方法が最初に記
載された。Ｃｈｕｎｇら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４３９：２１６－２１９、２００５
年１０月１６日オンライン出版。Ｃｈｕｎｇら（２００６）により、着床前遺伝子診断（
ＰＧＤ）に使用される技法と同様の顕微操作技法を使用した胚からの生検材料の取得が記
載された。２１７頁を参照されたい。その時にはＣｈｕｎｇら（２００６）は割球細胞株
を他の胚性幹細胞と共培養したが、後に開発された方法ではこれは必要なくなった。Ｃｈ
ｕｎｇら（２００８）、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎ
ｅｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｅｍｂｒｙｏ Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、
Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：１１３－１１７を参照されたい。
着床前の胚における遺伝子異常を分析するために、着床前遺伝子診断が使用されている
。当該方法は、両親の遺伝子インプットを試験することができる時期にある初期の正常に
発達している胚（例えば、８細胞期）に対して透明帯に穴を開け、その開口から１つまた
は２つの割球を吸引または押出しまたは切離することによって実施される。ＰＧＤでは、
染色体異常および単一遺伝子障害を分析するために、それぞれ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブ
リダイゼーション（ＦＩＳＨ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した遺伝子
解析が一般に使用される。その後、遺伝子異常がなければ、残りのインタクトな胚を女性
患者に正常な妊娠期間に着床させる。着床前遺伝子診断技法は、既に２００４年にＳｔａ
ｅｓｓｅｎ，Ｃら（２００４）、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ
ｔｒａｎｓｆｅｒ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｆｏｒ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｓｃｒｅｅｎ
ｉｎｇ ｉｎ ｃｏｕｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｔｅｒｎａｌ ａｇ
ｅ：ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒ
ｉａｌ、Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． １９：２８４９－２８５８およびＭｏｎｎｉら（２
００４）Ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｆｏ
ｒ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ：ｔｈｅ Ｓａｒｄｉｎｉａｎ ｅｘｐｅｒｉ
ｅｎｃｅ． Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ ２４：９４９－９５４を含めた種々のグループ
によって報告された。したがって、Ｃｈｕｎｇら（２００６）は、単に胚を破壊せずに初
期胚から割球を抽出するために利用可能な方法を記載しただけである。
さらに、２００６年８月に、Ｃｈｕｎｇら（２００６）の刊行物の第２著者であり、同
じくＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＫｌｉｍａｎｓｋａｙａらに
より、効率的ではないが（単離された割球の２％のみからｈＥＳ細胞株が生じた）、同様
のＰＧＤ技法により、ヒトＥＳ細胞株を単一の割球から導出することが可能になり、Ｃｈ
ｕｎｇら（２００６）上記に最初に記載されたものと有意に異ならないことが実証された
手順が記載された。Ｋｌｉｍａｎｓｋａｎｙａら（２００６）Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏ
ｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ
ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ ４４４、４８１－４８５を参照されたい。Ｋｌ
ｉｍａｎｓｋａｙａらは、新しく導出されたｈＥＳ細胞株と他のＥＳ細胞を共培養物し、
これは、Ｃｈｕｎｇら（２００６）が重要であり得ると述べたことである。Ｃｈｕｎｇら
（２００６）は、「ｉｔ ｉｓ ｕｎｃｌｅａｒ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｓｕｃｃｅ
ｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ＥＳ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ［ｈｉｓ］
ｓｔｕｄｙ ｉｓ ａｔｔｒｉｂｕｔａｂｌｅ ｔｏ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｓｅｃｒ
ｅｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｏｒ ｉｆ ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｃｏｎ
ｔａｃｔ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ」と述べた。Ｃｈｕｎｇら（２００６）、上記、２１
８頁、右の欄を参照されたい。しかし、後の２００８年に、同じくＣｈｕｎｇら、上記の
研究により、単離された割球を、ラミニンを伴う培地で培養することによりｈＥＳＣを生
じさせる能力が増強されるので、ｈＥＳ細胞株にはＥＳ細胞と共培養する必要が全くない
ことが実証された。Ｃｈｕｎｇら（２００８）、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔ
ｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｅｍｂｒｙｏ Ｄ
ｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２）：１１３－１１７、１１６
頁、２００８年１月１０日オンライン出版を参照されたい。さらに、このように得られた
ｈＥＳ細胞は、未分化の状態で６ヶ月超にわたって維持できることを含めた、ｈＥＳ細胞
を含めた他のヒト多能性幹細胞と同じ特性を有し、また、Ｏｃｔ－４、ＳＳＥＡ－３、Ｓ
ＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、Ｎａｎｏｇおよびアルカリホスファ
ターゼを含めた多能性のマーカーの正常な核型および発現を示し、そしてｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ、およびｉｎ ｖｉｖｏでの奇形腫の形態のどちらにおいても３つ全ての胚性生殖層の
誘導体を分化し形成することができる。
したがって、Ｃｈｕｎｇら（２００６）によって最初に仮定されたように、単一の割球
を他のＥＳ細胞と共培養することは重大ではない場合、単一の割球を単に、多くの細胞外
マトリックスの一般的な構成成分であり（市販されており、かつ／または例えばフィーダ
ー細胞を溶解することにより作製される）、一般に使用されており、哺乳動物細胞を成長
させることが公知であったラミニンと培養することなどは、Ｃｈｕｎｇの２００６年の刊
行物によりマウスＥＳ細胞株を単一の割球から導出することが最初に示された時に公知か
つ利用可能であった。したがって、当業者がＣｈｕｎｇら（２００６）上記の方法体系を
取り、Ｓｔｒａｅｓｓｅｎら（２００４）上記によって以前に記載された利用可能な知見
を使用して、胚を保存するまたはその破壊を防止する一方でｈＥＳ細胞株を単一の割球か
ら導出することができた可能性は十分にある。
多能性幹細胞および多能性幹細胞から導出された細胞の凝集懸濁液
個々の細胞をポリマースキャフォールド、マトリックスおよび／またはゲルに播種する
ことに基づく、以前に公知の組織工学の方法とは対照的に、本明細書に記載の実施形態で
は、多能性幹細胞から形成された細胞凝集懸濁液、単一細胞懸濁液またはそれから導出さ
れた分化した単一細胞懸濁液を使用することができる。幹細胞凝集懸濁液の処理および／
または製造方法ならびにその細胞の分化は、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、２０
０７年２月２３日出願、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯ
Ｒ ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬ ＣＥＬＬＳ、現在は米国特許第８
，２１１，６９９号および同第８，４１５，１５８号；およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０
８０５１６、２００８年１０月２０日出願、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳ
ＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＦＥＥＤＥＲ－ＦＲＥＥ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ
ＣＥＬＬ ＭＥＤＩＡ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＨＵＭＡＮ ＳＥＲＵＭ、現在は米国特
許第８，３３４，１３８号、およびＳｃｈｕｌｚ Ｔ．ら（２０１２）、上記に記載され
ている。
本明細書に記載の実施形態は、多能性細胞を、未分化の状態での拡張を可能にする接着
性成長培養条件で培養し、その接着性多能性細胞培養物を単一細胞懸濁培養物に解離させ
、その単一細胞懸濁培養物が懸濁液中に多能性由来細胞凝集体を形成する期間にいたるま
でその単一細胞懸濁培養物を撹拌することによって、懸濁液中にｈＥＳ由来細胞凝集体の
形成を可能にする第１の分化培養条件に単一細胞懸濁培養物を接触させ、それにより、懸
濁液中の多能性由来細胞凝集体を生じさせることによって、多能性接着培養物から懸濁液
中の多能性細胞凝集体を生じさせるための方法に関する。好ましい実施形態では、単一細
胞懸濁培養物の撹拌は、約８０ｒｐｍ～１６０ｒｐｍで回転させることによって実施する
。本明細書に記載のある特定の他の実施形態では、多能性幹細胞の凝集、成長、増殖、拡
張および／または細胞塊を促進するために、ｒｈｏキナーゼ阻害剤を使用する。
「実質的に均一な」または「サイズおよび形状が実質的に均一な」という句またはその
等価物は、凝集体の均一性の広がりを指し、約２０％以下である。別の実施形態では、凝
集体の均一性の広がりは約１５％以下、約１０％以下または約５％以下である。
さらに別の実施形態では、ｈＥＳ細胞凝集懸濁液を、血清を実質的に含まない培地中、
さらに、外因的に添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の不在下で培養した。これは
、血清を伴わないが、ＦＧＦを含めた外因的に添加された成長因子を含有する培地中でｈ
ＥＳ細胞を培養することが必要なＴｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．に対する米国特許第７，００５，
２５２号とは区別される。一部の実施形態では、ｉＰＳ細胞凝集懸濁液を、血清を実質的
に含まない培地中で、かつ／または、さらに、外因的に添加された線維芽細胞成長因子（
ＦＧＦ）の不在下で培養する。
凝集体当たりの細胞の正確な数は重要ではないが、各凝集体のサイズ（したがって、凝
集体当たりの細胞の数）は、酸素および栄養分が中心細胞に拡散する最大限度によって限
定されること、およびこの数は細胞型およびその細胞型の栄養素の要件に応じても変動し
得ることが当業者には理解されよう。細胞凝集体は、凝集体当たり最小数の細胞（例えば
、２つまたは３つの細胞）を含んでもよく、凝集体当たり何百ものまたは何千もの細胞を
含んでもよい。一般には、細胞凝集体は、凝集体当たり何百から何千もの細胞を含む。本
発明の目的上、細胞凝集体は、一般には約５０ミクロンから約６００ミクロンまでのサイ
ズであるが、細胞型に応じて、サイズはこの範囲を下回ることも上回ることもある。一実
施形態では、細胞凝集体は、約５０ミクロンから約２５０ミクロンまでのサイズ、または
約７５～２００ミクロンのサイズであり、約１００～１５０ミクロンのサイズであること
が好ましい。
さらに他の方法では胚様体（ＥＢ）の作製が記載されている。本明細書で使用される場
合、「胚様体」、「凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｂｏｄｙ）」という用語またはその等
価物は、ＥＳ細胞が単層培養物中で過成長した際、または、未定義の培地中の懸濁培養物
中で維持されたまたは非定方向プロトコルによって多数の胚葉組織に分化した際に生じる
分化した細胞および未分化の細胞の凝集体を指す。すなわち、ＥＢは、本明細書に記載の
多能性幹細胞の単一細胞懸濁液から形成されることもなく、ＥＢは、多能性由来多分化能
細胞の接着培養物から形成されることもない。これらの特徴単独により、本発明は胚葉体
から明白に区別される。
分化した細胞と未分化の細胞の混合物であり、一般にはいくつかの胚葉由来の細胞から
なり、ランダムな分化をたどる胚様体とは対照的に、本明細書に記載の細胞凝集体は、基
本的にまたは実質的に均一な細胞であり、多能性、多分化能、二分化能、または単能性型
の細胞、例えば、胚細胞、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉、膵臓内分
泌細胞などの凝集体として存在する。
本明細書に記載の方法では、例えば、Ｂｏｄｎａｒらに対するものであり、Ｇｅｒｏｎ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡された米国特許第６，８００，４８０号に記載の通り最
初に培養容器を細胞外マトリックスでコーティングする必要は全くない。本明細書に記載
の一部の実施形態では、ｉＰＳ細胞を、出願人の米国特許第８，３３４号、１３８；およ
びＳｃｈｕｌｚ Ｔ．ら（２０１２）上記に実質的に記載されている通り他の多能性幹細
胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を、可溶性ヒト血清を使用して培養するのと同様
に培養することができる。
本明細書に記載の方法では、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．に対するものであり、Ｗｉｓｃｏｎ
ｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷＡＲＦ）に譲渡さ
れた米国特許第７，００５，２５２号に記載の通り単に線維芽細胞フィーダー層以外の供
給源から供給される外因的に添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は全く必要ない。
多分化能および分化した細胞組成物
本明細書に記載の方法によって生成する細胞組成物は、多能性幹細胞、前原条、中内胚
葉、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉または
ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１同時陽性膵臓内胚葉、内分泌前駆体／先駆体またはＮＧＮ３／Ｎ
ＫＸ２．２同時陽性内分泌前駆体／先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ
、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞を含む細胞培養物を含み、培養物
中の細胞の少なくとも約５～９０％が、生成された前原条、中内胚葉、胚体内胚葉、前腸
内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．
１同時陽性膵臓内胚葉、内分泌前駆体／先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２同時陽性内
分泌前駆体／先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、
ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞である。
本明細書に記載の一部の実施形態は、幹細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性細胞と、前
原条、中内胚葉または胚体内胚葉などの多分化能細胞の両方、ならびに、ＰＤＸ１陽性前
腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１同時陽性膵臓内胚葉、
内分泌前駆体／先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２同時陽性内分泌前駆体／先駆体、お
よびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内
分泌細胞などの、より分化しているが、なお潜在的に多分化能である細胞を含む細胞集団
および細胞培養物などの組成物に関する。例えば、本明細書に記載の方法を使用して、多
能性幹細胞および他の多分化能細胞または分化した細胞の混合物を含む組成物を生成する
ことができる。一部の実施形態では、約９５の多能性細胞ごとに少なくとも約５の多分化
能細胞または分化した細胞を含む組成物が生成する。他の実施形態では、約５の多能性細
胞ごとに少なくとも約９５の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物が生成する。
さらに、他の比の多分化能細胞または分化した細胞と多能性細胞を含む組成物が考えられ
ている。例えば、約１，０００，０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細
胞または分化した細胞を含む組成物、約１００，０００の多能性細胞ごとに少なくとも約
１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１０，０００の多能性細胞ごとに
少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１０００の多能性細
胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約５００の多
能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１０
０の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、
約１０の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成
物、約５の多能性細胞ごと、および約１までの多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化
能細胞または分化した細胞を含む組成物、および約１の多能性細胞ごとに少なくとも約１
，０００，０００の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物が考えられている。
本明細書に記載の一部の実施形態は、少なくとも約５％の多分化能細胞または分化した
細胞から少なくとも約９９％の多分化能細胞または分化した細胞までを含む細胞培養物ま
たは細胞集団に関する。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団は哺乳動物細胞
を含む。好ましい実施形態では、細胞培養物または細胞集団はヒト細胞を含む。例えば、
ある特定の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物であって、ヒト細胞の少なくとも約５
％～少なくとも約９９％が多分化能細胞または分化した細胞である細胞培養物に関する。
他の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物であって、ヒト細胞の少なくとも約５％、少
なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少
なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少
なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少
なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少
なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、ま
たは９９％超が多分化能細胞または分化した細胞である細胞培養物に関する。細胞培養物
または細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む複数の実施形態では、細胞培養中のヒトフィ
ーダー細胞を考慮せずに上記の百分率を算出する。
本明細書に記載の組成物および方法には、いくつかの有用な特徴がある。例えば、多分
化能細胞、例えば、前原条細胞および／または中内胚葉細胞を含む細胞培養物および細胞
集団、ならびにそのような細胞培養物および細胞集団を生成するための方法は、ヒト発生
の初期をモデリングするために有用である。さらに、本明細書に記載の組成物および方法
は、真性糖尿病などの病態への治療介入としても機能し得る。例えば、前原条細胞および
／または中内胚葉細胞は限られた数の組織のみの供給源として機能するので、純粋な組織
または細胞の型の発生において使用することができる。前原条細胞を生成するためのいく
つかのプロセスでは、出発材料として使用される多能性細胞は、多能性幹細胞、例えばｈ
ＥＳ細胞、ｈＥＧ細胞またはｉＰＳ細胞である。
栄養外胚葉細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、栄養外胚葉細胞を
含む組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に
記載の方法によって生成する栄養外胚葉細胞集団または細胞培養物では、ＨＡＮＤ１、Ｅ
ｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬ
Ｘ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢ遺伝子を含む群から選択されるマーカーの発
現が、非栄養外胚葉細胞または細胞集団におけるＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、
ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ
２、およびＥＲＢＢの発現レベルと比較して実質的に高い。
前原条細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、前原条細胞を含む
組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記載
の方法によって生成する前原条細胞集団または細胞培養物は、ＦＧＦ８マーカー遺伝子お
よび／またはＮＯＤＡＬマーカー遺伝子を、ＢＲＡＣＨＵＲＹｌｏｗ、ＦＧＦ４ ｌｏｗ
、ＳＮＡＩ１ ｌｏｗ、ＳＯＸ１７ ｌｏｗ、ＦＯＸＡ２ ｌｏｗ、ＳＯＸ７ ｌｏｗお
よびＳＯＸ１ ｌｏｗと比較して実質的に発現する。前原条細胞および前原条細胞を生成
する方法は、出願人の米国特許第７，９５８，５８５号、ＰＲＥＰＲＩＭＩＴＩＶＥ Ｓ
ＴＲＥＡＫ ＡＮＤ ＭＥＳＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ、２０１１年７月２６日発行
に詳しく記載されている。
胚体外細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、胚体外細胞を含む
組成物を生成することができる。原始内胚葉細胞、近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞
は胚体外細胞である。原始内胚葉細胞は近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞を生じる。
近位内胚葉細胞は、卵黄嚢の一部を形成する内胚葉細胞である。近位内胚葉細胞は、栄養
分の取り込みおよび輸送の両方において機能する。遠位内胚葉細胞は、ライヘルト膜とし
て公知の胚体外組織と近接している。遠位内胚葉細胞の役割のうちの１つは、基底膜の構
成成分の生成である。まとめると、近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞は、多くの場合
、胚体外内胚葉と称されるものを形成する。名称に示されている通り、胚体外内胚葉細胞
は発生の間に形成される胚構造を生じない。対照的に、本明細書に記載の胚体内胚葉細胞
および他の内胚葉系列または膵臓の系列細胞は、胚性であるまたは胚細胞から導出された
ものであり、胚発生の間に形成される腸管から導出された組織を生じる。本明細書に記載
の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する胚体外細胞集団または細
胞培養物では、ＳＯＸ７遺伝子、ＳＯＸ１７遺伝子、ＴＨＢＤ遺伝子、ＳＰＡＲＣ遺伝子
、ＤＡＢ１遺伝子、ＦＴＮＦ４ａｌｐｈａ遺伝子またはＡＦＰ遺伝子を含む群から選択さ
れるマーカーの発現が、少なくとも、他の細胞型または細胞集団、例えば胚体内胚葉では
発現されないＳＯＸ７、ＳＯＸ１７、ＴＨＢＤ、ＳＰＡＲＣ、ＤＡＢ１、またはＡＦＰの
発現レベルと比較して実質的に高い。
中内胚葉細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、中内胚葉細胞を含
む組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記
載の方法によって生成する中内胚葉細胞集団または細胞培養物は、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１
、ＭＩＸＬ１および／またはＷＮＴ３マーカー遺伝子を含む群から選択されるマーカーの
発現が、ＳＯＸ１７ ｌｏｗ、ＣＸＣＲ４ ｌｏｗ、ＦＯＸＡ２ ｌｏｗ、ＳＯＸ７ ｌ
ｏｗおよびＳＯＸ１ ｌｏｗと比較して実質的に高い。中内胚葉細胞および中内胚葉細胞
を生成する方法は、出願人の米国特許第７，９５８，５８５号、ＰＲＥＰＲＩＭＩＴＩＶ
Ｅ ＳＴＲＥＡＫ ＡＮＤ ＭＥＳＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ、２０１１年７月２６
日発行に詳しく記載されている。
スクリーニング方法
一部の実施形態では、スクリーニング方法を使用して、ヒト多能性幹細胞、人工多能性
幹細胞、前原条細胞、中内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉またはＰＤＸ１陰性前
腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉またはＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞または膵臓前
駆細胞、内分泌前駆／先駆細胞、および／または内分泌細胞などの多能性細胞、多分化能
細胞および／または分化した細胞を含むある特定の細胞集団を得る。次いで、細胞集団に
候補分化因子をもたらす。候補分化因子をもたらす前またはそれとほぼ同時である第１の
時点で、マーカーの発現を決定する。あるいは、候補分化因子をもたらした後にマーカー
の発現を決定することができる。第１の時点の後であり、かつ候補分化因子を細胞集団に
もたらすステップの後である第２の時点で、同じマーカーの発現を再度決定する。候補分
化因子が膵臓先駆細胞の分化を促進することができるかどうかを、第１の時点におけるマ
ーカーの発現と第２の時点におけるマーカーの発現を比較することによって決定する。第
２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点におけるマーカーの発現と比較して増加ま
たは減少した場合、当該候補分化因子は膵臓前駆細胞の分化を促進することができること
になる。
本明細書に記載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、ヒト胚体内胚葉、ＰＤＸ
－１陰性前腸内胚葉、ＰＤＸ－１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ－１陽性膵臓内胚葉、または膵
臓前駆体または内分泌前駆／先駆細胞を含む細胞集団または細胞培養物を利用する。例え
ば、細胞集団は、ＰＤＸ－１陽性膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞の実質的に精製された集
団であってよい。例えば、細胞集団はヒト膵臓前駆細胞の濃縮された集団であってよく、
細胞集団内のヒト細胞の少なくとも約５０％～９７％がヒト膵臓前駆細胞であり、残りは
、内分泌前駆体／先駆体または内分泌細胞および他の細胞型で構成される。膵臓前駆体集
団の濃縮は、出願人の米国特許出願第１２／１０７，０２０号、表題ＭＥＴＨＯＤ ＦＯ
Ｒ ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＡＮＤ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯ
ＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＨＵＭＡＮ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ
ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ、２００８年４月２１日出願、現在は米国特許第８，３３８、１７
０号および対応する刊行物Ｋｅｌｌｙら（２０１１）、上記に詳細に記載されている。
本明細書に記載のスクリーニング方法の複数の実施形態では、細胞集団を候補（試験）
分化因子と接触させる、または他のやり方で候補（試験）分化因子をもたらす。候補分化
因子は、上記の細胞のいずれか、例えばヒト膵臓前駆細胞の分化を促進する潜在性を有し
得る任意の分子を含んでよい。本明細書に記載の一部の実施形態では、候補分化因子は、
細胞の１種または複数種の型に対する分化因子であることが分かっている分子を含む。代
替の実施形態では、候補分化因子は、細胞分化を促進することが分かっていない分子を含
む。好ましい実施形態では、候補分化因子は、ヒト膵臓前駆細胞の分化を促進することが
分かっていない分子を含む。胚体内胚葉を分化させる因子に対するスクリーニングは、例
えば、出願人の米国特許出願第１２／０９３，５９０号、表題ＭＡＲＫＥＲＳ ＯＦ Ｄ
ＥＦＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００８年７月２１日出願に詳細に記載されて
いる。
少なくとも１種のマーカーの発現を第１の時点で決定することに加えて、本明細書に記
載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、少なくとも１種のマーカーの発現を、第
１の時点の後であり、かつ細胞集団に候補分化因子をもたらした後である第２の時点で決
定することが意図されている。そのような実施形態では、第１の時点と第２の時点の両方
で同じマーカーの発現を決定する。一部の実施形態では、第１の時点と第２の時点の両方
で複数種のマーカーの発現を決定する。そのような実施形態では、第１の時点と第２の時
点の両方で同じ複数種のマーカーの発現を決定する。一部の実施形態では、それぞれが第
１の時点の後であり、かつそれぞれが細胞集団に候補分化因子をもたらした後である複数
の時点でマーカーの発現を決定する。ある特定の実施形態では、Ｑ－ＰＣＲによってマー
カーの発現を決定する。他の実施形態では、免疫細胞化学によってマーカーの発現を決定
する。
本明細書に記載のスクリーニング方法のある特定の実施形態では、第１の時点および第
２の時点において発現が決定されるマーカーは、膵臓前駆細胞から膵島組織を構成する最
終分化した細胞の先駆体である細胞への分化に関連するマーカーである。そのような細胞
としては、未成熟膵島ホルモン発現細胞を挙げることができる。
本明細書に記載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、細胞集団に候補分化因子
をもたらすステップと第２の時点におけるマーカーの発現を決定するステップの間に十分
な時間を経過させる。細胞集団に候補分化因子をもたらすステップと第２の時点における
マーカーの発現を決定するステップの間の十分な時間は、約１時間の短さから約１０日間
の長さまでであってよい。一部の実施形態では、少なくとも１種のマーカーの発現を、細
胞集団に候補分化因子をもたらした後に多数回決定する。一部の実施形態では、十分な時
間は、少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約
１６時間、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも
約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも
約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なく
とも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１週間、
少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、
少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、または少なくとも約８週間である。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、第２の時点におけるマーカーの発現が第
１の時点におけるこのマーカーの発現と比較して増加または減少したかどうかをさらに決
定する。少なくとも１種のマーカーの発現の増加または減少により、候補分化因子が内分
泌前駆／先駆細胞の分化を促進することができることが示される。同様に、複数種のマー
カーの発現を決定する場合、第２の時点における複数種のマーカーの発現が第１の時点に
おけるこの複数種のマーカーの発現と比較して増加または減少したかどうかをさらに決定
する。マーカーの発現の増加または減少は、第１の時点および第２の時点での細胞集団に
おけるマーカーの量、レベルまたは活性を測定することまたは他のやり方で評価すること
によって決定することができる。そのような決定は、他のマーカー、例えばハウスキーピ
ング遺伝子発現との比較的なものであってもよく、絶対的なものであってもよい。第２の
時点におけるマーカーの発現が第１の時点と比較して増加するある特定の実施形態では、
増加の量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約
２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約
６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約
１００倍または少なくとも約１００倍超である。一部の実施形態では、増加の量は、２倍
未満である。第２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点と比較して減少する実施形
態では、減少の量は、少なくとも約２分の１、少なくとも約５分の１、少なくとも約１０
分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも約３０分の１、少なくとも約４０分の１、
少なくとも約５０分の１、少なくとも約６０分の１、少なくとも約７０分の１、少なくと
も約８０分の１、少なくとも約９０分の１、少なくとも約１００分の１または少なくとも
約１００分の１未満である。一部の実施形態では、減少の量は２分の１を下回らない。
多分化能細胞または分化した細胞の生成のモニタリング
多能性細胞から多分化能細胞、多分化能細胞から膵臓前駆体またはホルモン内分泌細胞
などのさらに多分化能の細胞または分化した細胞への進行は、内分泌細胞における島ホル
モンの発現およびプロインスリンからインスリンおよびＣペプチドへのプロセシングなど
の遺伝子マーカーおよび表現型マーカーを含めた特定の細胞に特有のマーカーの発現を決
定することによってモニタリングすることができる。いくつかのプロセスでは、ある特定
のマーカーの発現を、マーカーが存在するかしないかを検出することによって決定する。
あるいは、ある特定のマーカーの発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞中でマーカー
が存在するレベルを測定することによって決定することができる。例えば、ある特定のプ
ロセスでは、未成熟膵島ホルモン発現細胞に特有のマーカーの発現ならびに多能性細胞、
胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、内分泌前駆体／先駆体、胚体外内胚
葉、中胚葉、外胚葉、成熟膵島ホルモン発現細胞および／または他の細胞型に特有のマー
カーの有意な発現の欠如を決定する。
他の胚体内胚葉系列の分化の程度がより低い細胞型の生成のモニタリングに関連して記
載されている通り、ブロット転写法および免疫細胞化学などの定性的技法または半定量的
技法を使用して、マーカーの発現を測定することができる。あるいは、マーカーの発現は
、Ｑ－ＰＣＲまたはＮａｎｏｓｔｒｉｎｇのｎＣｏｕｎｔｅｒ、または数百以上のマーカ
ーを同時に分析およびアッセイすることができる関連するハイスループットなマルチプレ
ックス技術などの技法を使用することによって正確に定量化することができる。さらに、
ポリペプチドレベルでは、膵島ホルモン発現細胞のマーカーの多くは分泌タンパク質であ
ることが理解されよう。このように、ＥＬＩＳＡなどの細胞外マーカー含有量を測定する
ための技法を利用することができる。
他の実施形態では、免疫組織化学的検査を使用して、上記の遺伝子によって発現される
タンパク質を検出する。さらに他の実施形態では、Ｑ－ＰＣＲを免疫組織化学的な技法ま
たはフローサイトメトリー技法と併せて使用して、細胞型を有効かつ正確に特徴付け、同
定し、目的の細胞型におけるそのようなマーカーの量および相対的割合の両方を決定する
ことができる。一実施形態では、Ｑ－ＰＣＲにより、細胞が混在する集団を含有する細胞
培養物におけるＲＮＡ発現のレベルを数量化することができる。しかし、Ｑ－ＰＣＲでは
、目的のマーカーまたはタンパク質が同じ細胞で同時発現されるかどうかをもたらすまた
は認定することはできない。別の実施形態では、Ｑ－ＰＣＲをフローサイトメトリー法と
併せて使用して細胞型を特徴付け、同定する。したがって、本明細書に記載の方法と、例
えば上記のものなどを組み合わせて使用することによって、内胚葉系列型細胞を含めた種
々の細胞型の完全な特徴付けおよび同定を実現および実証することができる。
例えば、好ましい一実施形態では、膵臓前駆体または膵臓内胚葉またはＰＤＸ－１陽性
膵臓内胚葉は、Ｑ－ＰＣＲおよび／またはＩＣＣによって実証される通り少なくともＰＤ
Ｘ１、Ｎｋｘ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡおよび／またはｃＭＹＣを発現するが、そのよ
うな細胞は、ＰＤＸ１陽性発現細胞と同定されるためには、ＩＣＣによって実証される通
り少なくともＰＤＸ１およびＮｋｘ６．１を同時発現し、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、また
はＣＥＲを含めた他のマーカーを発現しない。同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖ
ｉｖｏで成熟ホルモン分泌膵臓細胞を適切に同定するために、例えばインスリン分泌細胞
において、Ｃ－ペプチド（成熟かつ機能性のβ細胞におけるプロインスリンの適切なプロ
セシングの産物）およびインスリンが同時発現されることがＩＣＣによって実証される。
さらに、当技術分野で公知の他の方法も、マーカー遺伝子発現を定量化するために使用
することができる。例えば、マーカー遺伝子産物の発現は、目的のマーカー遺伝子産物に
特異的な抗体を使用することによって検出することができる（例えば、ウエスタンブロッ
ト、フローサイトメトリー分析など）。ある特定のプロセスでは、ｈＥＳ由来細胞に特有
のマーカー遺伝子の発現ならびにｈＥＳ由来細胞に特有のマーカー遺伝子の有意な発現の
欠如。ｈＥＳ由来細胞型を特徴付け、同定するためのさらに別の方法は、上に示されてい
る関連出願に記載されている。
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉（ステージ１～４）の生成およびイン
スリン生成の要約
ある特定の内胚葉系列細胞および膵臓内胚葉系列細胞を生成するための方法は本明細書
において提供され、米国特許第７，５３４，６０８号；同第７，６９５，９６５号；およ
び同第７，９９３，９２０号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮ
ＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥＳ；および米国特許第８，１２９，１８２号、表題ＥＮ
ＤＯＣＲＩＮＥ ＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲ／ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ ＣＥＬＬＳ、ＰＡＮＣＲ
ＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥ－ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯ
ＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮなどの関連出願の他の箇所で考察されている。表１７
および図４２、図４３および図４４も参照されたい。
簡単に述べると、多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞に関する本発明の
定方向分化法は、所望の最終ステージの細胞培養物（ＰＥＣ細胞または内分泌細胞）に応
じて少なくとも４つまたは５つまたは６つまたは７つのステージで説明することができる
。ステージ１は、多能性幹細胞からの胚体内胚葉の生成であり、約２～５日、好ましくは
２日または３日かかる。多能性幹細胞を、ＲＰＭＩ、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバ
ー成長因子、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８またはＧＤＦ－１１など（
１００ｎｇ／ｍＬ）、ＷｎｔファミリーメンバーまたはＷｎｔ経路活性化因子、例えばＷ
ｎｔ３ａなど（２５ｎｇ／ｍＬ）、あるいは、成長、および／または生存および／または
増殖、および／または細胞間接着を増強するためにｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤
、例えばＹ－２７６３２など（１０μＭ）を含む培地に懸濁させる。約２４時間後に、培
地を、ＲＰＭＩを含み、血清、例えば０．２％ＦＢＳなど、およびＴＧＦβスーパーファ
ミリーメンバー成長因子、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８またはＧＤＦ
－１１など（１００ｎｇ／ｍＬ）、あるいはｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤を伴う
培地と交換し、さらに２４時間（１日目）～４８時間（２日目）置く。あるいは、アクチ
ビン／Ｗｎｔ３ａを含む培地中に約２４時間置いた後、その後の２４時間、アクチビンを
単独で含む培地（すなわち、培地はＷｎｔ３ａを含まない）で細胞を培養する。重要なこ
とに、胚体内胚葉の生成には、低血清含有量、およびそれにより、低インスリンまたはイ
ンスリン様成長因子含有量の細胞培養条件が必要である。ＭｃＬｅａｎら（２００７）Ｓ
ｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５：２９－３８を参照されたい。ＭｃＬｅａｎらにより、ステー
ジ１においてｈＥＳ細胞をわずか０．２μｇ／ｍＬの濃度のインスリンと接触させること
は、胚体内胚葉の生成にとって有害であり得ることも示された。また別の当業者により、
多能性細胞から胚体内胚葉へのステージ１分化が実質的に本明細書およびＤ’Ａｍｏｕｒ
ら（２００５）に記載の通り改変された。例えば、少なくとも、Ａｇａｒｗａｌら、Ｅｆ
ｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｈｅ
ｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ
ｓ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（２００８）２６：１１１７－１１２７；Ｂｏｒｏｗｉａｋら
、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｎｄｏ
ｄｅｒｍａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｏｕｓｅおよびＨｕｍａｎ
Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、（２００９）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌ
ｌ ４：３４８－３５８；およびＢｒｕｎｎｅｒら、Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＤＮＡ ｍｅｔ
ｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｅｖ
ｅｌｏｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ、（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒ
ｅｓ． １９：１０４４－１０５６。他の内胚葉系列細胞を導出するためには胚体内胚葉
の適切な分化、特定化、特徴付けおよび同定が必要である。このステージにおける胚体内
胚葉細胞は、ＳＯＸ１７およびＨＮＦ３β（ＦＯＸＡ２）を同時発現し、少なくともＨＮ
Ｆ４アルファ、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＳＯＸ６、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭ
ＹＣ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ３、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＳＣ、Ｇ
ＨＲＬ、ＳＳＴ、またはＰＰは評価できるほどには発現しない。胚体内胚葉においてＦＴ
ＮＦ４アルファ発現が存在しないことは、少なくともＤｕｎｃａｎら（１９９４）、「Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＦＴＮＦ－４
ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｅｎｄｏｄｅｒｍ， ｇｕｔ， ａｎ
ｄ ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍ
ｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ： ＦＴＮＦ－４ ｉｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｐｒｉｍ
ａｒｙ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｐｌａｎｔｉｎｇ ｂｌａｓｔｏｃｙｓ
ｔ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９１：７５９８－７６０２およびＳｉ－
Ｔａｙｅｂら（２０１０）、「Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ－Ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｉｎ
ｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ
５１：２９７－３０５において裏付けられ、詳しく記載されている。
ステージ２では、ステージ１から胚体内胚葉細胞培養物を取得し、懸濁培養物を、ＩＴ
Ｓの１：１０００希釈物中０．２％ＦＢＳなどの低血清レベル、２５ｎｇのＫＧＦ（また
はＦＧＦ７）、あるいはＲＯＣＫ阻害剤を伴うＲＰＭＩと一緒に２４時間（２日目～３日
目）インキュベートすることによって前腸内胚葉またはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉を生成す
る。２４時間後に（３日目～４日目）、培地を、ＴＧＦβ阻害剤を含まないが、その代わ
りに、細胞の成長、生存および増殖を増強するためにＲＯＣＫ阻害剤をなお含む同じ培地
と交換し、さらに２４時間（４日目～５日目）～４８時間（６日目）置く。前腸内胚葉を
適切に特定化するための重要なステップはＴＧＦβファミリー成長因子の除去である。し
たがって、２．５μＭのＴＧＦβ阻害剤番号４またはＴＧＦβＩ型受容体であるアクチビ
ン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）の特異的な阻害剤である５μＭのＳＢ４３１５４２などの
ＴＧＦβ阻害剤をステージ２細胞培養物に添加することができる。ステージ２で生成した
前腸内胚葉またはＰＤＸ１－陰性前腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１βおよびＨＮ
Ｆ４アルファを同時発現し、胚体内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞ま
たは内分泌前駆体／先駆体ならびに一般には、複数ホルモン型細胞の特質である、少なく
ともＳＯＸ１７およびＨＮＦ３β（ＦＯＸＡ２）も、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＳＯＸ６、Ｐ
ＲＯＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ３、ＡＲＸ
、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＳＣ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、またはＰＰも評価できるほどには
同時発現しない。
ＰＥＣ生成のステージ３（５～８日目）では、ステージ２から前腸内胚葉細胞培養物を
取得し、１％Ｂ２７、０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミン、０．２μＭのレチノイン酸
（ＲＡ）などのレチノイドまたは３ｎＭのＴＴＮＰＢ（もしくはＫＡＡＤシクロパミンと
ＴＴＮＰＢの組合せであるＣＴＴ３）などのレチノイン酸類似体、および５０ｎｇ／ｍＬ
のノギン中ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩにより、約２４時間（７日目）～４８時間（８日目）
にわたってＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を生成する。具体的には、出願人らは、およそ２
００３年からＤＭＥＭ－高グルコースを使用しており、その時点の全ての特許および非特
許開示物では、「ＤＭＥＭ－高グルコース」などの言及がなくてもＤＭＥＭ－高グルコー
スが使用されている。これは、一部において、Ｇｉｂｃｏなどの製造者がそれらのＤＭＥ
Ｍをそのように名付けておらず、例えばＤＭＥＭ（Ｃａｔ番号１１９６０）およびＫｎｏ
ｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ（Ｃａｔ番号１０８２９）などであることが理由である。本出願の
出願日時点で、ＧｉｂｃｏはさらなるＤＭＥＭ製品を提供しているが、従来通り、例えば
Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ（Ｃａｔ番号１０８２９－０１８）など、それらの高グルコ
ースを含有するある特定のＤＭＥＭ産物に「高グルコース」と付けていないことに注目す
べきである。したがって、ＤＭＥＭが記載されているそれぞれの場合に、高グルコースを
伴うＤＭＥＭを意味すると推定することができ、これは、この分野における研究開発を行
っている他者には明らかなことであった。外因性高グルコースの使用を記載しているさら
なる詳細は実施例２１に記載されている。さらに、ＲＯＣＫ阻害剤またはｒｈｏキナーゼ
阻害剤、例えばＹ－２７６３２などを使用して、成長、生存、増殖を増強することおよび
細胞間接着を促進することができる。ステージ３で生成したＰＤＸ１陽性前腸細胞は、Ｐ
ＤＸ１およびＨＮＦ６、ならびにＳＯＸ９およびＰＲＯＸを同時発現し、上のステージ１
およびステージ２に記載されている胚体内胚葉細胞もしくは前腸内胚葉（ＰＤＸ１陰性前
腸内胚葉）細胞またはＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を示すマーカーは評価できるほどには
同時発現しない。
上記のステージ３の方法は、ＰＥＣを生成するための４つのステージのうちの１つであ
る。下の実施例９～２４に詳細に記載されている通り、内分泌前駆体／先駆体および内分
泌細胞を生成するために、ノギン、ＫＡＡＤ－シクロパミンおよびレチノイドに加えて、
アクチビン、Ｗｎｔおよびヘレグリンを単独でおよび／または組み合わせて使用して、Ｎ
ＧＮ３発現を抑制する一方で良好な細胞凝集塊を維持する。実施例８、実施例９および実
施例１０を参照されたい。
ステージ４（８～１４日目）ＰＥＣ生成では、ステージ３から培地を取得し、それを、
１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＢ２７サプリメント、それに加えて５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦおよび
５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、および時にはさらに５０ｎｇ／ｍＬのノギンおよびＲＯＣＫ阻
害剤中ＤＭＥＭを含有し、さらにアクチビンを単独でまたはヘレグリンと組み合わせて含
む培地と交換する。これらの新しい方法では、少なくともＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１な
らびにＰＴＦ１Ａを同時発現する膵臓前駆細胞が生じる。これらの細胞は、上のステージ
１、ステージ２およびステージ３に記載の胚体内胚葉または前腸内胚葉（ＰＤＸ１陰性前
腸内胚葉）細胞を示すマーカーは評価できるほどには発現しない。図４４を参照されたい
。
あるいは、ステージ４からの細胞を、ステージ５において、ＤＭＥＭを含有し、１％ｖ
ｏｌ／ｖｏｌのＢ２７サプリメントを伴う培地で約１～６日間（好ましくは約２日間、す
なわち、１３～１５日目）にわたってさらに分化させて、内分泌前駆体／先駆体または前
駆体型細胞ならびに／または単一ホルモン性膵臓内分泌型細胞および複数ホルモン性膵臓
内分泌型細胞を生成することができる。ステージ５で生成した内分泌前駆体／先駆体は、
少なくともＣＨＧＡ、ＮＧＮ３およびＮｋｘ２．２を同時発現し、ＰＥＣ生成について上
のステージ１、ステージ２、ステージ３およびステージ４に記載の胚体内胚葉または前腸
内胚葉（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）を示すマーカーは評価できるほどには発現しない。図
４４を参照されたい。
ＰＥＣ生成のために、ステージ４で生成したＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉をマクロ封入デバ
イスにローディングし、完全に含有させ、患者に移植し、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を
ｉｎ ｖｉｖｏで膵臓ホルモン分泌細胞、または膵島、例えばインスリン分泌性ベータ細
胞に成熟させる（「ｉｎ ｖｉｖｏの機能」とも称される）。ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細
胞の封入およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるインスリンの生成は、米国特許出願第１２／６１
８，６５９号（‘６５９出願）、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＡＮＣＲＥ
ＡＴＩＣ ＬＩＮＥＡＧＥ ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＨＵＭＡＮ ＰＬ
ＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ、２００９年１１月１３日出願に詳細に記載
されている。‘６５９出願は、仮特許出願第６１／１１４，８５７号、表題ＥＮＣＡＰＳ
ＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲＳ ＤＥＲＩＶＥ
Ｄ ＦＲＯＭ ＨＥＳ ＣＥＬＬＳ、２００８年１１月１４日出願；および米国特許仮出
願第６１／１２１，０８４号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＡＮＣＲＥＡ
ＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ、２００８年１２月９日出願；現在は米国特許第
８，２７８、１０６号および同第８，４２４，９２８号の優先権を主張するものである。
本明細書に記載の方法、組成物およびデバイスは、現在、好ましい実施形態を表し、例示
的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。その変化および他の使用は本発
明の主旨の範囲内に包含され、本開示の範囲によって定義されることが当業者には想起さ
れよう。したがって、本明細書に開示されている発明に対して、本発明の範囲および主旨
から逸脱することなく様々な置換および改変を行うことができることが当業者には明らか
になろう。
例えば、多能性細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞から胚体内胚葉を生成するた
めに、成長因子またはシグナル伝達タンパク質のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー
であるアクチビンＡが使用されるが、他のＴＧＦβスーパーファミリーメンバー、例えば
ＧＤＦ－８およびＧＤＦ－１１を、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５６８６
号、表題ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＦ
ＩＮＩＴＩＶＥ ＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００８年６月３日出願に記載されているものなど
の胚体内胚葉を生成するために使用することができる。
異なる状況においてでも、アクチビン単独により、またはＷｎｔおよびヘレグリンと組
み合わせて、高レベルおよび低レベルで、ＮＧＮ３の発現を抑制および阻害することがで
きる；低レベルで、単独で、またはヘレグリンと組み合わせて、あるいは高レベルでＷＮ
Ｔおよびヘレグリンと組み合わせて、細胞塊、したがって収量を維持することができる。
実施例８、実施例９および実施例１０を参照されたい。
ＰＥＣ生成のために、ステージ２のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞をステージ３のＰＤＸ
１陽性前腸細胞に分化させるためにレチノイン酸（ＲＡ）を使用する。しかし、４－［（
Ｅ）－２－（５、６、７、８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル－２－ナフ
タレニル）－１－プロペニル］安息香酸（またはＴＴＮＰＢ）などの他のレチノイドまた
はレチノイン酸類似体および同様の類似体（例えば、４－ＨＢＴＴＮＰＢ）を使用するこ
とができる。内分泌細胞および内分泌前駆／先駆細胞生成のために、レチノイン酸または
その類似体のいずれかをステージ６および／またはステージ７の間に添加してホルモン遺
伝子発現を誘導することもできる。実施例１３および実施例１６を参照されたい。
ノギンは、例えば、骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）などのＴＧＦβスーパーファミ
リーシグナル伝達タンパク質のメンバーを不活化するタンパク質である。しかし、コーデ
ィンおよびねじれ原腸形成（Ｔｗｉｓｔｅｄ Ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）（Ｔｓｇ）な
どの他のＢＭＰ４阻害剤または抗ＢＭＰ中和抗体によっても、ＢＭＰとその細胞表面受容
体の結合を妨げ、それにより、ＢＭＰシグナル伝達を有効に阻害することができる。ある
いは、ヒトノギンの遺伝子はクローニングされ、配列決定されている。米国特許第６，０
７５，００７号を参照されたい。ノギン配列の解析により、Ｋｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ
阻害剤との相同性を有するカルボキシ末端領域が示され、これにより、潜在的に他のＫｕ
ｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤がＢＭＰの阻害に関して同様の効果を有し得ることが示さ
れている。実施例１５では、非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団の生成を増加させるためのノ
ギンの使用が記載されている。
最後に、本明細書および‘６５９出願；米国意匠登録出願第２９／４４７，９４４号；
同第２９／４０８，３６６号；同第２９／４０８，３６８号；同第２９／４２３，３６５
号；および同第６１／７７４，４４３号、表題ＳＥＭＩＰＥＲＭＥＡＢＬＥ ＭＡＣＲＯ
ＩＭＰＬＡＮＴＡＢＬＥ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＤＥＶＩ
ＣＥＳ、２０１３年３月７日出願に記載されているマクロ封入デバイスは、再度、単に例
示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。特に、デバイスのサイズ、デ
バイス内のチャンバーまたは亜区画が複数であること、またはポートが複数であること、
さらにはデバイスのローディングおよび抽出の機構などのデバイス設計の変化は全て本発
明の主旨の範囲内に包含される。したがって、本明細書に記載の分化方法への種々の置換
および改変だけでなく、封入デバイスへの種々の置換および改変も同様に、本明細書に開
示されている発明に対して、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく行うことがで
きることが当業者には明らかになろう。実施例１０、実施利１２および実施例１８を参照
されたい。
多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるためのプロセスの一部に関して、上記の成長
因子が細胞にもたらされ、したがって、成長因子が培養物中に、多能性細胞の少なくとも
一部分から胚体内胚葉細胞および膵臓の系列細胞への分化を促進するために十分な濃度で
存在する。いくつかのプロセスでは、上記の成長因子は、細胞培養物中に少なくとも約５
ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約
５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬ、少なく
とも約２００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍ
Ｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２
０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍＬ
、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍＬまたは約５０００ｎｇ／ｍＬ超の濃度で存在する。さ
らに他の作用物質または成長因子は、細胞培養物中に少なくとも０．１ｍＭまたは１０ｍ
Ｍまたはそれ以上の濃度で存在する。
ある特定のプロセスでは、多能性幹細胞分化作用物質および／または成長因子を、添加
後に細胞培養物から除去する。例えば、成長因子を添加してから約１日以内、約２日以内
、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日
以内または約１０日以内にそれらを除去することができる。好ましいプロセスでは、成長
因子を添加した約４日後にそれらを除去する。作用物質および／もしくは成長因子の除去
は、作用物質および／もしくは成長因子の不在化で培地を変えること、またはその作用物
質および／もしくは成長因子の機能を阻害する別の作用物質を使用することによって実現
することができる。
好ましい一実施形態では、ステージ３細胞培養物は、これだけに限定されないが、内分
泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）を阻止、抑制、阻害などすることができる作用物質
などを含む。そのような作用物質は、アクチビン、ヘレグリンおよびＷＮＴおよびこれら
３つの組合せも、分化を促進し、かつ／または非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨ
ＧＡ－）を示すマーカーの発現を誘導し、かつ内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）
のマーカーの発現を阻止するもしくは最小限にするために有効な量で含む。内分泌系列に
傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）を示すマーカーとしては、これだけに限定されないが、ＮＧ
Ｎ３、ＮＫＸ２．２およびその他が挙げられる。
別の好ましい実施形態では、ステージ４細胞培養物は、これだけに限定されないが、内
分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）を阻止、抑制、阻害などすることができる作用物
質を含む。そのような作用物質は、アクチビンおよびヘレグリンおよびこれら２つの組合
せも、分化を促進し、かつ／または非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）を
示すマーカーの発現を誘導し、かつ内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）のマーカー
の発現を阻止するもしくは最小限にするために有効な量で含む。内分泌系列に傾倒した細
胞（ＣＨＧＡ＋）を示すマーカーとしては、これだけに限定されないが、ＮＧＮ３、ＮＫ
Ｘ２．２およびその他が挙げられる。少なくともＮＧＮ３をステージ３およびステージ４
の間抑制する手段は、下の実施例８～２１に詳しく記載されている。
一実施形態では、ステージ４細胞培養物を、ステージ５において、少なくともノギン、
ＫＧＦ、ＥＧＦ、およびＮｏｔｃｈシグナル伝達または経路阻害剤を用いてさらに分化さ
せる。内分泌分化を示すマーカーとしては、これだけに限定されないが、ＮＧＮ３、ＮＫ
Ｘ２．２およびその他が挙げられる。好ましい実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ発生試験に
おいて観察されるものをｉｎ ｖｉｔｒｏでシミュレートするまたは有効に模倣する作用
物質をステージ１～７において使用する。例えば、本発明および表１７によるステージ３
およびステージ４では、内分泌分化を遅延させることができる作用物質、阻止することが
できる作用物質、抑制することができる作用物質および／もしくは阻害ことができる作用
物質、または、これだけに限定されないが、ＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２を含めた、内分
泌分化を示すマーカーを遅延させることができる作用物質、阻止することができる作用物
質、抑制することができる作用物質および／もしくは阻害ことができる作用物質を使用す
る。ステージ５、ステージ６、および／またはステージ７の間に、細胞培養物を、内分泌
分化を誘導することができる作用物質、増加させることができる作用物質および／または
促進することができる作用物質を用いて、例えば、ガンマセレクターゼ阻害剤などのＮｏ
ｔｃｈ経路阻害剤を使用することによって処理する。要するに、ステージ３およびステー
ジ４の細胞培養条件により、内分泌表現型が抑制されるが、ステージ５、ステージ６、お
よび／またはステージ７からの細胞培養条件により、これだけに限定されないが、インス
リン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、膵臓ポリペプチド
（ＰＰ）、グレリン（ＧＨＲＬ）、溶質輸送体ファミリー３０メンバー８（ＳＬＣ３０Ａ
８）、グルコース－６－ホスファターゼ２（Ｇ６ＰＣ２）、プロホルモン転換酵素１（Ｐ
ＣＳＫ１）およびグルコースキナーゼ（ＧＣＫ）を含めた内分泌表現型が次第に誘導され
る。
一実施形態では、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を、単独で、またはレチノイン酸などの
レチノイドと組み合わせて使用されるＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤、例えばＲ０４９２
９０９７などのガンマセレクターゼ阻害剤の存在下でインキュベートし続けることによっ
てＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を内分泌細胞および内分泌前駆／先駆細胞に分化させる。
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤が存在することにより、ステージ５の間にＮＧＮ３の発現
が誘導される。他の実施形態では、分化プロセスの開始時、例えば、多能性ステージにお
いてガンマセレクターゼ阻害剤がもたらされ、これは膵島ホルモン発現細胞への分化全体
を通して細胞培養物中に残留する。さらに他の実施形態では、分化が開始された後である
が、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉のステージに分化する前にガンマセレクターゼ阻害剤を添加
する。好ましい実施形態では、細胞培養物または細胞集団に、胚体内胚葉からＰＤＸ１陽
性内胚葉への変換を促進する分化因子をもたらすのとほぼ同じ時間にガンマセレクターゼ
阻害剤をもたらす。他の好ましい実施形態では、細胞培養物または細胞集団に、細胞培養
物または細胞集団中の細胞の実質的な部分がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化した後に
ガンマセレクターゼ阻害剤をもたらす。
別の実施形態では、ステージ５からの細胞培養物をステージ６およびステージ７におい
てさらに分化させる。これらのステージの間に、より発生的に進歩し、かつ／または成熟
した内分泌細胞にｉｎ ｖｉｖｏで分化させるための内分泌前駆体／先駆体または前駆細
胞を適正に特定化することができる作用物質を使用する。そのような作用物質としては、
これだけに限定されないが、レチノイドまたはレチノイン酸、ＢＭＰ、ニコチンアミド、
ＩＧＦ、ヘッジホッグタンパク質などが挙げられる。好ましい実施形態では、ＴＴＮＰＢ
（４－［（Ｅ）－２－（５，６，７，８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル
－２－ナフタレニル）－１－プロペニル］安息香酸またはアロチノイド酸）が、核転写因
子であるレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）α、β、およびγに対する親和性を有する選択的
かつ非常に強力なレチノイン酸類似体である。ＴＴＮＰＢおよび他のレチノイン酸もしく
はレチノイン酸類似体により、レチノイン酸応答性エレメントを有する遺伝子のリガンド
により活性化される転写が生じる。したがって、レチノイン酸応答性エレメントを活性化
することができるまたはＲＡＲのいずれかに結合することができる他の作用物質またはリ
ガンドは、内分泌細胞分化を促進するために、本発明に対して潜在的に有用であり、修正
可能である。
別の実施形態では、ステージ５またはステージ６またはステージ７からの細胞培養物を
、細胞接着を改善するために、マトリゲルを単独で、またはｒｈｏキナーゼ阻害剤と組み
合わせて用いてさらに処理することができる。あるいは、ステージ５、ステージ６、また
はステージ７のいずれかのステージで、ｒｈｏキナーゼ阻害剤を、細胞生存、細胞塊およ
び収量を促進するために十分な濃度で添加することができる。あるいは、ステージ６およ
びステージ７の間、またはステージ６とステージ７のとの間に細胞培養物を引き離し、再
会合させて、これだけに限定されないが、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ
－）を含めた、望ましくない細胞型を除去するまたは枯渇させることができる。実施例１
４を参照されたい。
さらに別の実施形態では、ステージ１～７のいずれかは、１日、２日、３日、４日、５
日、６日、７日、８日、９日、１０日またはそれ以上延長することもでき、１日、２日、
３日、４日、５日、６日、７日またはそれ以上短縮することもできる。例えば、好ましい
一実施形態および表１７によると、ステージ６は約６日間にわたって起こり、ステージ７
は約９日間にわたって起こる。しかし、これらのステージはどちらも、内分泌前駆体／先
駆体の生成を適応させるために短縮することができ、例えば、より発生的に進歩した内分
泌細胞を生成するために２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３
６日、３７日、３８日、３９日、４０日またはそれ以上長くし、延長することができる。
別の実施形態では、より発生的に進歩したＰＥＣまたは膵臓内分泌前駆体／先駆体また
は膵臓内分泌細胞を生成するための方法が提供される。本発明の一態様では、ＰＤＸ１お
よびＮＫＸ６．１に関して同時陽性である単一膵臓ホルモン発現内分泌細胞、例えば、Ｉ
ＮＳ、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を同時発現している未成熟ベータ細胞が提供される。
別の態様では、発生的に進歩した細胞は、少なくともＰＤＸおよびＮＫＸ６．１を発現す
る非内分泌膵臓前駆細胞から主になるが、少なくともＣＨＧＡ＋、ＮＧＮ３および／また
はＮＫＸ２．２を発現する内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）からはならないまた
はそれから最低限なるＰＥＣ培養物であってよい。これらのＰＥＣ培養物は、膵臓分化の
発生試験においてｉｎ ｖｉｖｏで見られるものにより類似していると考えられるので、
発生的に進歩している。Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら（２００７）、Ａｎ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔ
ｅｄ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｐａｎｃｒｅａｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｉｎ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８（６）：６８５
－７０５およびＲｕｋｓｔａｌｉｓおよびＨａｂｅｎｅｒ（２００９）、Ｎｅｕｒｏｇｅ
ｎｉｎ３：Ａ ｍａｓｔｅｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓ
ｌｅｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、Ｉｓｌ
ｅｔｓ １（３）：１７７－１８４を参照されたい。発生的に進歩した細胞または細胞培
養物の別の例は、引き離し、再凝集または再会合させ、したがって、より均一な細胞の集
団からなる再凝集した細胞培養物である。このより均一な細胞の集団は、本発明の一態様
では、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に関して同時陽性であるが、ステージ３およびステー
ジ４からの細胞もしくは亜集団、または、これだけに限定されないが、非内分泌性多分化
能膵臓前駆体（ＣＨＧＡ－）細胞、もしくは残留／三重陰性細胞（ＣＨＧＡ－／ＰＤＸ１
－／ＮＫＸ６．１－）など、もしくは多ホルモン（ｍｕｌｔｉ－ｈｏｒｍｏｎｅ）発現細
胞（すなわち、いずれの１つの細胞型においても２種以上のホルモンを発現している細胞
）を含めたＰＥＣもしくはＰＥＣ亜集団を含まない単一のホルモン発現細胞で主に構成さ
れる、より早いステージの細胞型、例えば、膵臓内分泌前駆体／先駆体または内分泌細胞
を含まない。
別の実施形態では、本発明で提供される細胞培養物は、適正に特定化されることが好ま
しく、これは発生生物学の分野において特異的かつある特定の意味を有する。発生生物学
に関しては、それは細胞が別個の運命を得るまたは特定化または適正に特定化される機構
である。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞培養物の分化ではｉｎ ｖｉｖｏ発生試験に典型
的な時間的な組織化およびきっかけが欠けるので、細胞マーカー（転写因子などの表面マ
ーカーまたは内部マーカー）、特に、特定の細胞型を示すシグネチャーまたは顕著な細胞
マーカーの使用および信頼性が必須である。したがって、適正に特定化された細胞、細胞
培養、亜集団および集団への言及は、それらの細胞が別個の運命を有し、それらの運命が
それらのマーカーの発現、それらが発現するマーカーのプロファイル、および、重要であ
れば、それらが発現しないマーカーに基づいてより確実になり、決定されることを意味す
る。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞培養物の適切な特定化は同様の細胞のｉｎ ｖｉｖｏ
発生試験に依存し、したがって、好ましい一実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ発生試験はｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ分化および適正に特定化された細胞の特徴付けに対する指針である。
本明細書に記載の本発明の一部の実施形態では、分化する細胞培養物または細胞集団に
、ガンマセレクターゼ阻害剤とほぼ同じ時間にエキセンディン４をもたらす。ある特定の
実施形態では、エキセンディン４を、細胞培養物または細胞集団中に少なくとも約０．１
ｎｇ／ｍＬから、１０００ｎｇ／ｍＬまでの濃度で存在するようにもたらす。
ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、内分泌前駆／先駆
細胞において分化の状態に応じて様々な異なるレベルにわたって誘導されることが理解さ
れよう。そのように、本明細書に記載の一部の実施形態では、内分泌前駆／先駆細胞また
は細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、
非内分泌前駆／先駆細胞または細胞集団、例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤ
Ｘ１陽性前腸内胚葉細胞、未成熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚
体外内胚葉細胞、中胚葉細胞および／または外胚葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２
および／またはＰＡＸ４マーカーの発現の少なくとも約２倍～少なくとも約１０，０００
倍である。他の実施形態では、内分泌前駆／先駆細胞または細胞集団におけるＮＧＮ３、
ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌前駆／先駆細胞または
細胞集団、例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未成
熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞お
よび／または外胚葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカ
ーの発現の少なくとも約４倍、少なくとも約６倍～１０，０００倍である。一部の実施形
態では、内分泌前駆／先駆細胞または細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／
またはＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌前駆／先駆細胞または細胞集団、例えば、多
能性細胞様ｉＰＳ細胞およびｈＥＳ細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞
、未成熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉
細胞および／または外胚葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４
マーカーの発現よりもはるかに高い。
本発明の別の実施形態は、ヒト内分泌前駆／先駆細胞を含めたヒト細胞を含む細胞培養
物または細胞集団などの組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％においてＮＧＮ３
マーカーの発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、
ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現
よりも大きい組成物に関する。他の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％～９８％
においてＮＧＮ３マーカーの発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、Ｍ
ＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ
６マーカーの発現よりも大きい。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団中の、
ＮＧＮ３の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、
ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現
よりも大きいヒト細胞の百分率は、フィーダー細胞を考慮せずに算出する。
本発明の一部の実施形態は、ヒト内分泌前駆／先駆細胞を含む細胞培養物または細胞集
団などの組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％から少なくとも約９８％超までに
おいてＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩ
Ｃ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、およ
び／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい組成物に関することが理解されよう。一
部の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％～ヒト細胞の９８％においてＮＫＸ２．
２および／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、Ｍ
ＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ
６マーカーの発現よりも大きい。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団中の、
ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、
ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／ま
たはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きいヒト細胞の百分率は、フィーダー細胞を考慮せ
ずに算出する。
本明細書に記載のプロセスを使用して、他の細胞型を実質的に含まない、内分泌前駆／
先駆細胞を含む組成物を生成することができる。本発明の一部の実施形態では、本明細書
に記載の方法によって生成する内分泌前駆／先駆細胞集団または細胞培養物は、ＡＦＰ、
ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーを有意に発現する細胞を実
質的に含まない。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する細胞培養
物の内分泌前駆／先駆細胞集団は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、Ｍ
ＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ
６マーカーを有意に発現する細胞を実質的に含まない。
本明細書に開示されている未成熟膵島ホルモン発現細胞を生成するための、さらに他の
プロセスでは、ＨＧＦを細胞にもたらし、したがって、細胞培養物または細胞集団中に、
内分泌前駆／先駆細胞の少なくとも一部分から未成熟膵島ホルモン発現細胞への分化を促
進するために十分な濃度で存在するようにする。一部の実施形態では、ＨＧＦは、細胞培
養物または細胞集団中に、少なくとも約１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ～１０
００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。
本明細書に開示されている未成熟膵島ホルモン発現細胞を生成するためのさらに他のプ
ロセスでは、ＩＧＦ１を細胞にもたらし、したがって、細胞培養物または細胞集団中に、
内分泌前駆／先駆細胞の少なくとも一部分から未成熟膵島ホルモン発現細胞への分化を促
進するために十分な濃度で存在するようにする。一部の実施形態では、ＩＧＦ１は、細胞
培養物または細胞集団中に少なくとも約１ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在
する。
本明細書に記載の未成熟膵島ホルモン発現細胞を生成するためのプロセスのある特定の
実施形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種
または複数種を、前にもたらした１種または複数種の分化因子を細胞培養物から除去した
後にもたらす。他の実施形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩ
ＧＦ１のうちの１種または複数種を、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよび
ＩＧＦ１のうちの１種または複数種よりも前にもたらされた、またはほぼ同時にもたらさ
れた１種または複数種の分化因子を含む細胞培養物または細胞集団にもたらす。好ましい
実施形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種
または複数種よりも前にもたらされる、またはほぼ同時にもたらされる分化因子としては
、これだけに限定されないが、ＤＡＰＴ、ＦＧＦ－１０、ＫＡＡＤ－シクロパミン、アク
チビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４および／またはＲＡが挙げられる。
本発明の別の実施形態は、ヒト未成熟膵島ホルモン発現細胞を含めたヒト細胞を含む細
胞培養物または細胞集団などの組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％においてＭ
ＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ
１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ、および／またはＣ－
ペプチドマーカーの発現がＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦ
Ｐ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーの発現よりも大きい組
成物に関する。他の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％において、ヒト細胞の少
なくとも約１０％～ヒト細胞の９５％においてまたはヒト細胞の少なくとも約９８％にお
いてＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、
ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ、および／また
はＣ－ペプチドマーカーの発現がＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１
、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーの発現よりも大
きい。
本発明のある特定の実施形態では、未成熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞培養物およ
び／または細胞集団は、グレリン、インスリン、ソマトスタチンおよび／またはグルカゴ
ンから選択される、１種または複数種の分泌されたホルモンを含む培地も含む。他の実施
形態では、培地は、Ｃ－ペプチドを含む。好ましい実施形態では、培地中の１種または複
数種の分泌されたホルモンまたはＣ－ペプチドの濃度は、細胞内ＤＮＡ１μｇ当たり少な
くとも約１ｐｍｏｌのグレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンまたはＣ－ペ
プチドから、細胞内ＤＮＡ１μｇ当たり少なくとも約１０００ピコモル（ｐｍｏｌ）のグ
レリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンまたはＣ－ペプチドまでにわたる。
インスリンをｉｎ ｖｉｖｏで生成させる方法
一部の実施形態では、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏで導出された膵臓前駆細胞またはＰＤＸ
－１陽性膵臓内胚葉型細胞またはその等価物を哺乳動物対象に移植する。これらの方法は
、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１５５３６号、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ Ｐ
ＲＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥＳ」、およびＫｒｏｏｎら（
２００８）上記に詳しく記載されている。好ましい実施形態では、哺乳動物対象はヒト対
象である。特に好ましい対象は、生理的に高い血中グルコース濃度に応答して十分なレベ
ルのインスリンを生成する対象の能力が限定される状態を有すると同定された対象である
。任意の特定の哺乳動物種についての生理的に高い血中グルコースレベルを構成する血中
グルコースレベルの範囲は、当業者には容易に決定することができる。認識される疾患ま
たは状態をもたらすいかなる持続的な血中グルコースレベルも、生理的に高い血中グルコ
ースレベルとみなされる。
本発明のさらなる実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ多能性幹細胞またはその後代、例えば
、ＰＤＸ－１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ－１陽性膵臓内胚葉もしくは膵臓前駆細胞、Ｎ
ＧＮ３陽性内分泌前駆体／先駆体などの内分泌前駆体／先駆体などの多分化能細胞、また
はインスリン分泌細胞、グルカゴン分泌細胞、ソマトスタチン分泌細胞、グレリン分泌細
胞、もしくは膵臓ポリペプチド分泌細胞などの機能的な分化したホルモン分泌細胞から導
出されるｉｎ ｖｉｖｏインスリン分泌細胞に関する。上記の最終分化した細胞または多
分化能細胞のいずれも、宿主、または哺乳動物に移植し、宿主血中グルコースレベルに応
答してインスリンを分泌する細胞などの生理的に機能的なホルモン分泌細胞に成熟させる
ことができる。好ましい実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｖｏで奇形腫を形成せず、その
ように形成された場合には、移植の領域に局在したままであり、容易に切除または除去す
ることができる。特に好ましい実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化プ
ロセスの間、または哺乳動物にｉｎ ｖｉｖｏで移植された際、またはｉｎ ｖｉｖｏで
機能的な島に成熟および発達する際に、いかなる核型異常も含有しない。
さらに、本明細書に記載の実施形態は、工学的に操作されたまたは遺伝子組換えされた
、多能性細胞、ヒトｉＰＳ細胞などの多能性細胞から本明細書において提供される説明に
基づいて導出された多分化能細胞または分化した細胞に関するが、ｉＰＳ細胞では、ｈＥ
Ｓ細胞およびｈＥＳ由来細胞と同様の生理機能および遺伝子マーカーの発現プロファイル
が実証されるので、ｉＰＳ細胞はｉｎ ｖｉｖｏにおける同様の生理的特性を有すること
が予測される。
膵臓前駆体を封入する方法
一部の実施形態では、本明細書に記載の多能性細胞、多分化能細胞および分化した細胞
組成物を生物学的および／または非生物学的機械デバイスに封入することができ、封入さ
れたデバイスにより、細胞組成物が宿主から分離および／または隔離される。
封入の方法は、米国特許出願 ６１／１１４，８５７、２００８年１１月１４日出願、
表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲ
Ｓ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＨＥＳ ＣＥＬＬＳ、および米国特許出願第６１／１２
１，０８６号、２００８年１２月１２日出願、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ
ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳに詳しく記載されている。
一実施形態では、封入デバイスは、多能性由来細胞、例えば、ＰＤＸ－１陽性前腸内胚
葉細胞、ＰＤＸ－１陽性膵臓内胚葉もしくは前駆細胞、ＮＧＮ３陽性内分泌前駆体／先駆
体などの内分泌もしくは内分泌前駆体／先駆体、または、インスリン分泌細胞、グルカゴ
ン分泌細胞、ソマトスタチン分泌細胞、グレリン分泌細胞、もしくは膵臓ポリペプチド分
泌細胞などの機能的な分化したホルモン分泌細胞を、移植された細胞集団が通過するのを
防ぎ、それらをデバイス内に保持すると同時に、ある特定の分泌されたポリペプチド、例
えばインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、膵臓ポリペプチドなどの通過
を可能にする半透膜の中に含有する。あるいは、デバイスは血管化膜を含めた複数の膜を
有する。
ヒト多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の成長、生存、増殖および細胞
間接着を増強および促進するための作用物質の使用
膜を渡る細胞外シグナルの伝達により細胞調節に影響を及ぼし、今度はそれにより、細
胞内の生化学的な経路をモジュレートすることができる。タンパク質のリン酸化は、細胞
内シグナルが分子から分子へ伝搬され、最終的に細胞の応答がもたらされる１つの経過を
表すものである。これらのシグナルトランスダクションカスケードは、高度に調節されて
おり、多くの場合、多くのプロテインキナーゼならびにホスファターゼが存在することに
よって証明されるように、重複している。ヒトにおいて、タンパク質チロシンキナーゼは
、糖尿病、がんを含めた多くの病態の発生において重要な役割を有することが分かってい
ることが報告されており、また、多種多様な先天性の症候群に関連付けられている。セリ
ントレオニンキナーゼ、例えばＲｈｏキナーゼは、阻害した場合に、糖尿病、がん、およ
び種々の炎症性心血管障害およびＡＩＤＳを含めたヒト疾患の治療と関連し得る酵素のク
ラスである。現在までに同定されている大多数の阻害剤は、ＡＴＰ結合部位で作用する。
そのようなＡＴＰ競合阻害剤は、ＡＴＰ結合部位のあまり保存されていない領域を標的と
するそれらの能力による選択性が実証されている。
低分子ＧＴＰ結合性タンパク質のＲｈｏキナーゼファミリーは、Ｒｈｏ Ａ～Ｅおよび
ＲｈｏＧ、Ｒａｃ１およびＲａｃ２、Ｃｄｃ４２、およびＴＣ１０を含む少なくとも１０
種のメンバーを含有する。阻害剤は、多くの場合、ＲＯＫ阻害剤もしくはＲＯＣＫ阻害剤
またはＲｈｏキナーゼ阻害剤と称され、これらは、本明細書では互換的に使用される。Ｒ
ｈｏＡ、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣのエフェクタードメインは同じアミノ酸配列を有し、
同様の細胞内標的を有すると思われる。ＲｈｏキナーゼはＲｈｏの最初の下流メディエー
ターとして作動し、２つのアイソフォーム：α（ＲＯＣＫ２）およびβ（ＲＯＣＫ１）と
して存在する。Ｒｈｏキナーゼファミリータンパク質は、それらのＮ末端ドメイン内に触
媒（キナーゼ）ドメインを有し、その中央部分にコイルドコイルドメインを有し、それら
のＣ末端領域内に推定プレクストリン相同性（ＰＨ）ドメインを有する。ＲＯＣＫのＲｈ
ｏ結合性ドメインはコイルドコイルドメインのＣ末端部分に局在し、ＧＴＰと結合した形
態のＲｈｏとの結合により、キナーゼ活性の増強がもたらされる。Ｒｈｏ／Ｒｈｏキナー
ゼ媒介性経路は、アンジオテンシンＩＩ、セロトニン、トロンビン、エンドセリン－１、
ノルエピネフリン、血小板由来成長因子、ＡＴＰ／ＡＤＰおよび細胞外ヌクレオチド、お
よびウロテンシンＩＩを含めた多くのアゴニストによって開始されるシグナルトランスダ
クションにおいて重要な役割を果たす。Ｒｈｏキナーゼは、その標的エフェクター／基質
のモジュレーションを通じて、平滑筋収縮、アクチン細胞骨格組織化、細胞の接着および
運動性ならびに遺伝子発現を含めた種々の細胞機能において重要な役割を果たす。動脈硬
化症の発病と関連すると認知されているいくつもの細胞機能の媒介においてＲｈｏキナー
ゼタンパク質が果たす役割により、これらのキナーゼの阻害剤も種々の動脈硬化性心血管
疾患を治療または予防するために有用であり得、また、内皮収縮に関与する。
一部の実施形態では、これだけに限定されないが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ－２７６３
２、ファスジル（ＨＡ１０７７とも称される）、Ｈ－１１５２ＰおよびＩＴＳ（インスリ
ン／トランスフェリン／セレン；Ｇｉｂｃｏ）、Ｗｆ－５３６、Ｙ－３０１４１（米国特
許第５，４７８，８３８号に記載されている）およびそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫ
に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、競合的ペプ
チド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体－ｓｃＦＶ断片、ドミナントネガティ
ブバリアントおよびその発現ベクターを含めた、細胞の成長、生存、増殖および細胞間接
着を促進し、かつ／または支持する作用物質を種々の細胞培養培地条件に添加する。さら
に、ＲＯＣＫ阻害剤として他の低分子化合物が公知であるので、そのような化合物または
その誘導体も本発明において使用することができる（例えば、米国特許出願第２００５０
２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第
２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４
４号および同第２００３００８７９１９、ならびに国際特許公開第２００３／０６２２２
７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／
０７６９７６号および同第２００４／０３９７９６号を参照されたい）。
本発明では、１種または２種またはそれ以上のＲＯＣＫ阻害剤の組合せも使用すること
ができる。これらの作用物質は、一部において、解離したｈＥＳ細胞、ｉＰＳまたは分化
した細胞培養物、例えば、胚体内胚葉、前腸内胚葉、膵臓内胚葉、膵臓上皮、膵臓前駆体
集団、内分泌前駆体および集団などの再会合を促進することによって機能する。同様に、
作用物質は、細胞解離が行われない場合にも機能し得る。ヒト多能性幹細胞の成長、生存
、増殖および細胞間接着の増大は、細胞が懸濁液中の細胞凝集体から生成したものである
か、または接着プレート培養物（細胞外マトリックスの構成成分を伴ってまたは伴わずに
、血清を伴ってまたは伴わずに、線維芽細胞フィーダーを伴ってまたは伴わずに、ＦＧＦ
を伴ってまたは伴わずに、アクチビンを伴ってまたは伴わずに）から生成したものである
かとは独立して実現された。これらの細胞集団の生存の増加により、細胞選別機を使用す
る精製系が容易になり、改善され、したがって、細胞の回収の改善が可能になる。Ｙ２７
６３２などのＲｈｏキナーゼ阻害剤の使用により、解離した単一細胞の段階的な継代の間
、または低温保存からのそれらの生存が促進されることにより、分化した細胞型の増大も
可能になり得る。Ｙ２７６３２などのＲｈｏキナーゼ阻害剤はヒト多能性幹細胞（例えば
ｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞）およびそれが分化した細胞に対して試験されてきたが、Ｒ
ｈｏキナーゼ阻害剤は、他の細胞型、例えば、一般に、これだけに限定されないが、腸、
肺、胸腺、腎臓ならびに網膜色素上皮と同様の神経系細胞型を含めた上皮細胞に適用する
ことができる。
細胞培養培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、その濃度により所望の効果が実現される、
例えば、細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着の増強、増加、および／または促進が
実現される限りは、下記の実施例に記載されているものに限定されない。種々のＲＯＣＫ
阻害剤を種々の条件下で最適化することが必要な場合があることが当業者には理解されよ
う。例えば、Ｙ－２７６３２を使用する場合、好ましい濃度は、約０．０１～約１０００
μＭ、より好ましくは約０．１～約１００μＭ、なおより好ましくは約１．０～約５０μ
Ｍ、最も好ましくは約５～２０μＭにわたり得る。ファスジル／ＨＡ１０７７を使用する
場合、上述のＹ－２７６３２濃度の約２倍または３倍で使用することができる。Ｈ－１１
５２を使用する場合、上述のＹ－２７６３２濃度の量のおよその分数、例えば、約１／１
０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０または１／６０で使用することができる。
使用するＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、一部において、阻害剤の生物活性および効力ならびに
それが使用される条件に左右される。
ＲＯＣＫ阻害剤を用いて処理する時間および期間は、成長、生存、増殖（細胞集団）お
よび細胞間接着の増強、増加、および／または促進などの所望の効果に応じて限定される
場合もされない場合もある。しかし、ＲＯＣＫ阻害剤の添加は、実施例７によりよく記載
されている通り、驚くべき様式で分化にも影響を及ぼし得る。下記の実施例には、約１２
時間、２４時間、４８時間、またはそれ以上にわたって処理されたヒト多能性幹細胞培養
物および／または分化した細胞培養物が記載されている。
ＲＯＣＫ阻害剤を用いて処理されるヒト多能性幹細胞培養物の密度も同様に、それが、
細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着の増強、増加、および／または促進などの所望
の効果が実現される密度である限りは限定されない。播種される細胞の細胞密度は、これ
だけに限定されないが、接着培養物または懸濁培養物の使用、使用する細胞培養培地の特
定のレシピ、成長条件および培養細胞の意図された使用を含めた種々の因子に応じて調整
することができる。細胞培養物の密度の例としては、これだけに限定されないが、１ｍｌ
当たり細胞０．０１×１０５個、１ｍｌ当たり細胞０．０５×１０５個、１ｍｌ当たり細
胞０．１×１０５個、１ｍｌ当たり細胞０．５×１０５個、１ｍｌ当たり細胞１．０×１
０５個、１ｍｌ当たり細胞１．２×１０５個、１ｍｌ当たり細胞１．４×１０５個、１ｍ
ｌ当たり細胞１．６×１０５個、１ｍｌ当たり細胞１．８×１０５個、１ｍｌ当たり細胞
２．０×１０５、１ｍｌ当たり細胞３．０×１０５個、１ｍｌ当たり細胞４．０×１０５
個、１ｍｌ当たり細胞５．０×１０５個、１ｍｌ当たり細胞６．０×１０５個、１ｍｌ当
たり細胞７．０×１０５個、１ｍｌ当たり細胞８．０×１０５個、１ｍｌ当たり細胞９．
０×１０５個、または１ｍｌ当たり細胞１０．０×１０５個、またはそれ以上、例えば、
１ｍＬ細胞５×１０７個まで、またはそれ以上、または間の任意の値が挙げられ、良好な
細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を伴って培養された。
ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質の使用
さらに別の実施形態では、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質は
、成長因子のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーを含み、本明細書に記載されている
。本明細書で使用される場合、「ＴＧＦβスーパーファミリーメンバー」またはその等価
物とは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＦ－β３、ＧＤＦ－１５、ＧＤＦ－９、ＢＭＰ－１
５、ＢＭＰ－１６、ＢＭＰ－３、ＧＤＦ－１０、ＢＭＰ－９、ＢＭＰ－１０、ＧＤＦ－６
、ＧＤＦ－５、ＧＤＦ－７、ＢＭＰ－５、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－８、ＢＭＰ
－２、ＢＭＰ－４、ＧＤＦ－３、ＧＤＦ－１、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンβＣ、
βΕ、βΑおよびβΒ、ＢＭＰ－１４、ＧＤＦ－１４、ＭＩＳ、インヒビンアルファ、Ｌ
ｅｆｔｙ１、Ｌｅｆｔｙ２、ＧＤＮＦ、ニュールツリン、パーセフィンおよびアルテミン
を含めたサブファミリーを含めた３０種を超える構造的に関連するタンパク質を指す。Ｃ
ｈａｎｇら（２００２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．２３（６）：７８７－８２３を参
照されたい。
ＴＧＦβファミリーメンバーは、ＴＧＦβファミリーメンバーに応答して細胞の性質の
変化を伝達するまたは他のやり方でもたらすことに関与するポリペプチドまたは相互作用
の１種または複数種を刺激する化合物であるＴＧＦβシグナル伝達経路活性化因子によっ
て置き換えること、またはそれと併せて使用することができる。ＴＧＦβシグナル伝達経
路はＴＧＦβファミリーメンバー自体を含む。ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーは、
ＩＩ型およびＩ型セリン－トレオニンキナーゼ受容体およびＳｍａｄとして公知の細胞内
エフェクターを通じたシグナル伝達によってシグナルを核に伝達する。これらの受容体は
、協同的に作用してリガンドに結合し、シグナルを伝達するＩ型受容体およびＩＩ型受容
体として公知の２つのサブファミリーに入る（Ａｔｔｉｓａｎｏら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ １６（３）、１０６６－１０７３（１９９６））。リガンドはＩ型受容体およ
びＩＩ受容体の細胞表面に結合し、リン酸化によるＩ型受容体の活性化を促進する。この
活性化された複合体が今度は細胞内Ｓｍａｄを活性化し、それが転写を調節する多サブユ
ニット複合体に集合する。ＴＧＦベータスーパーファミリーのメンバーは、２つのシグナ
ル伝達サブグループ：ＴＧＦβ／アクチビンと機能的に関連するもの、およびＢＭＰ／Ｇ
ＤＦサブファミリーと関連するものに分けられる。大部分のＴＧＦβリガンドは、最初に
ＩＩ型受容体に結合し、次いで、このリガンド／ＩＩ型受容体複合体がＩ型受容体を動員
またはリン酸化すると考えられている（Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｌ Ｓ、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ
１５：３１０－３２５（１９９４）；Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ：Ｍｏ
ｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１、１６９－１７８（２０００））。ＩＩ型受容体キナーゼは
、Ｉ型受容体キナーゼをリン酸化および活性化することにより、次いで、Ｓｍａｄタンパ
ク質をリン酸化および活性化する。ＴＧＦβ／アクチビンリガンドはＴＧＦβおよびアク
チビンＩＩ型受容体に結合し、このアクチビン型経路を通じてＳｍａｄ－２、Ｓｍａｄ－
３、ＮｏｄａｌおよびＬｅｆｔｙシグナルを活性化することができる。ＢＭＰ／ＧＤＦリ
ガンドはＢＭＰ ＩＩ型受容体に結合し、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８を
活性化することができる。Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒら、Ｃｅｌｌ ９５、７３７－７４０（１
９９８）を参照されたい。リガンド刺激の際、Ｓｍａｄは核内に移動し、転写複合体の構
成成分として機能する。
ＴＧＦβシグナル伝達は、種々の機構を通じて正におよび負に調節される。陽性調節で
は、シグナルが生物学的活性のために十分なレベルまで増幅される。ＴＧＦβスーパーフ
ァミリーリガンドがＩＩ型受容体に結合し、これによりＩ型受容体が動員およびリン酸化
される。次いで、Ｉ型受容体により、受容体により調節されるＳＭＡＤ（Ｒ－ＳＭＡＤ、
例えばＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、およびＳＭＡＤ８）がリン酸
化され、そこで共通のメディエーターＳｍａｄまたはｃｏ－ＳＭＡＤに結合することがで
きる。Ｒ－ＳＭＡＤ／ｃｏＳＭＡＤ複合体は核内に蓄積され、そこで転写因子としての機
能を果たし、標的遺伝子発現の調節に関与する。例えば、成長分化因子は１、２、３、５
、６、７、８、９、１０、１１、および１５を含む。また、好ましい一実施形態では、Ｇ
ＤＦ８およびＧＤＦ１１はＴＧＦβファミリーメンバーであり、同様にＴＧＦβシグナル
伝達経路活性化因子（陽性調節）でもあり、ＡｃｔＲＩＩ受容体の細胞外リガンド結合性
ドメイン部分に結合し、次いでＡｃｔＲＩと複合体を形成し、それによりＳｍａｄ７負の
制御因子の阻害およびＳｍａｄ２／Ｓｍａｄ３複合体のリン酸化を導くことによって作用
する。Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ３複合体はＳｍａｄ４と会合して特定の遺伝子の発現を調節
する。
任意の作用物質の使用と同様に、細胞培養培地中の任意のＴＧＦβスーパーファミリー
メンバーの濃度は、その濃度により、例えばＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーが活性化
されることなどの所望の効果を実現することができる限りは、下記の実施例に記載されて
いるものに限定されない。例えば、アクチビン、例えば、アクチビンＡおよび／またはア
クチビンＢ、またはＧＤＦ８およびＧＤＦ－１１を使用する場合、好ましい濃度は、約１
０～約３００ｎＭ、より好ましくは約５０～約２００ｎＭ、なおより好ましくは約７５～
約１５０ｎＭ、最も好ましくは約１００～１２５ｎＭにわたり得る。当業者は、任意の濃
度を容易に試験することができ、当技術分野における標準の技法を使用して、そのような
濃度の有効性を決定すること、例えば、任意の細胞型について遺伝子マーカーのパネルの
発現および非発現を決定することによって分化を評価することができる。
内分泌細胞を生成するための作用物質の使用
一実施形態では、本発明は、これだけに限定されないが、ガンマセレクターゼ阻害剤を
含めたＮｏｔｃｈ経路阻害剤を、内分泌分化を促進し、かつ／または内分泌細胞の特質で
あり、内分泌分化を示すある特定のマーカーの発現を誘導するために有効な量で使用して
、膵臓内胚葉系列型集団および／または亜集団、特にＰＥＣおよび／または膵臓内分泌系
列細胞を作製する方法を提供する。多数のガンマセレクターゼ阻害剤が記載されている。
例えば、米国特許第６，７５６，５１１号；同第６，８９０，９５６号；同第６，９８４
，６２６号；同第７，０４９，２９６号；同第７，１０１，８９５号；同第７、１３８，
４００号；同第７、１４４，９１０号；同第および７、１８３，３０３号を参照されたい
。ガンマセレクターゼ阻害剤は、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ
ｌｉｆ）から容易に入手可能である：ガンマセレクターゼ阻害剤Ｉ、（ＧＳＩ Ｉ）、Ｚ
－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－ノルロイシン－ＣＨＯ；ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＩ；ガンマセレ
クターゼ阻害剤ＩＩＩ、（ＧＳＩ ＩＩＩ）、Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌｅｕ－
ロイシナール；ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＶ、（ＧＳＩ ＩＶ）、Ｎ－（２－ナフトイ
ル）－Ｖａｌ－フェニルアラニナール；ガンマセレクターゼ阻害剤Ｖ、（ＧＳＩ Ｖ）、
Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌｅｕ－フェニルアラニナール；ガンマセレクターゼ阻
害剤ＶＩ、（ＧＳＩ ＶＩ）、１－（Ｓ）－エンド－Ｎ－（１，３，３）－トリメチルビ
シクロ［２．２．１］ヘプタ－２－イル）－４－フルオロフェニルスルホンアミド；ガン
マセレクターゼ阻害剤ＶＩＩ、（ＧＳＩ ＶＩＩ）、メチルオキシカルボニル－ＬＬ－Ｃ
ＨＯ；ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＸ、（ＧＳＩ ＩＸ）、（ＤＡＰＴ）、Ｎ－［Ｎ－（
３，５－ジフルオロフェンアセチル－Ｌ－アラニル）］－Ｓ－フェニルグリシンｔ－ブチ
ルエステル；ガンマセレクターゼ阻害剤Ｘ、（ＧＳＩ Ｘ）、｛１Ｓ－ベンジル－４Ｒ－
［１－（１Ｓ－カルバモイル－２－フェネチルカルバモイル）－１Ｓ－３－メチルブチル
カルバモイル］－２Ｒ－ヒドロキシ－５－フェニルペンチル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブ
チル エステル；ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩ、（ＧＳＩ ＸＩ）、７－アミノ－４－
クロロ－３－メトキシイソクマリン；ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＩ、（ＧＳＩ ＸＩ
Ｉ）、Ｚ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－ＣＨＯ；ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＩＩ、（ＧＳＩ Ｘ
ＩＩＩ）、Ｚ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－ＣＨＯ；ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＶ、（
ＧＳＩ ＸＩＶ）、Ｚ－Ｃｙｓ（ｔ－Ｂｕ）－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－ＣＨＯ；ガンマセレクタ
ーゼ阻害剤ＸＶＩ、（ＧＳＩ ＸＶＩ）、Ｎ－［Ｎ－３，５－ジフルオロフェンアセチル
］－Ｌ－アラニル－Ｓ－フェニルグリシンメチルエステル；ガンマセレクターゼ阻害剤Ｘ
ＶＩＩ、（ＧＳＩ ＸＶＩＩ）、ＷＰＥ－ＩＩＩ－３１Ｃ）；ガンマセレクターゼ阻害剤
ＸＩＸ、（ＧＳＩ ＸＩＸ）、（２Ｓ，３Ｒ）－３－（３，４－ジフルオロフェニル）－
２－（４－フルオロフェニル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（（３Ｓ）－２－オキソ－－５－
フェニル－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼピン－３－イル）－
ブチルアミド；ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＸ、（ＧＳＩ ＸＸ）、（ジベンザゼピン（
ＤＢＺ））、（Ｓ，Ｓ）－２－［２－（３，５－ジフルオロフェニル）アセチルアミノ］
－Ｎ－（５－メチル－６－オキソ－６，７－ジヒドロ－－５Ｈ－ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼ
ピン－７－イル）プロピオンアミド、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＸＩ、（ＧＳＩ ＸＸ
Ｉ）、（Ｓ，Ｓ）－２－［２－（３，５－ジフルオロフェニル）－アセチルアミノ］－Ｎ
－（１－メチル－２－オキソ－５－フェニル－２－，３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］
［１，４］ジアゼピン－３－イル）－プロピオンアミド；ガンマ４０セレクターゼ阻害剤
Ｉ、Ｎ－トランス－３，５－ジメトキシシンナモイル－Ｉｌｅ－ロイシナール；ガンマ４
０ セレクターゼ阻害剤ＩＩ、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル－Ｇｌｙ－Ｖａｌ
－バリナール（Ｖａｌｉｎａｌ）；およびイソバレリル－Ｖ－Ｖ－Ｓｔａ－Ａ－Ｓｔａ－
ＯＣ３。
一態様では、ガンマセレクターゼ阻害剤は、Ｚ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－ノルロイシン－ＣＨ
Ｏ、Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌｅｕ－ロイシナール、Ｎ－（２－ナフトイル）－
Ｖａｌ－フェニルアラニナール、Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌｅｕ－フェニルアラ
ニナール、１－（Ｓ）－ｅｎｄｏ－Ｎ－（１，３，３）トリメチルビシクロ［２．２．１
］ヘプタ－２－イル）－４－フルオロフェニルスルホンアミド、メンチルオキシカルボニ
ル－ＬＬ－ＣＨＯ、Ｎ－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェナセチル－Ｌ－アラニル）］－
Ｓ－フェニルグリシンｔ－ブチルエステル、｛１Ｓ－ベンジル－４Ｒ－［１－（１Ｓ－カ
ルバモイル－２－フェネチルカルバモイル）－１Ｓ－３－メチルブチルカルバモイル］－
２Ｒ－ヒドロキシ－５－フェニルペンチル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステル、７
－アミノ－４－クロロ－３－メトキシイソクマリン、Ｚ－ｌｌｅ－Ｌｅｕ－ＣＨＯ、Ｚ－
Ｔｙｒ－ｌｌｅ－Ｌｅｕ－ＣＨＯ、Ｚ－Ｃｙｓ（ｔ－Ｂｕ）－ｌｌｅ－Ｌｅｕ－ＣＨＯ、
Ｎ－［Ｎ－３，５－ジフルオロフェナセチル］－Ｌ－アラニル－Ｓ－フェニルグリシンメ
チルエステル、（２Ｓ，３Ｒ）－３－（３，４－ジフルオロフェニル）－２－（４－フル
オロフェニル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（（３Ｓ）－２－オキソ－－５－フェニル－２，
３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼピン－３－イル）－ブチルアミド、
（Ｓ，Ｓ）－２－［２－（３，５－ジフルオロフェニル）－アセチルアミノ］－Ｎ－（１
－メチル－２－オキソ－５－フェニル－２－，３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］［１，
４］ジアゼピン－３－イル）－プロピオンアミド、Ｎ－ｔｒａｎｓ－３，５－ジメトキシ
シンナモイル－ｌｌｅ－ロイシナール、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル－Ｇｌｙ
－Ｖａｌ－バリナール、イソバレリル－Ｖ－Ｖ－Ｓｔａ－Ａ－Ｓｔａ－ＯＣＨ３のうちの
１つまたは複数からなる群から選択され、腎疾患は糸球体腎疾患または尿細管腎疾患であ
る。本発明の一態様では、本明細書に記載されており、表８および表１７によるステージ
１～７のいずれかまたは全てにおいて、約０．５～１０ｍＭ、０．５～５ｍＭ、０．５～
３ｍＭ、好ましくは０．５～１ｍＭのガンマセレクターゼ阻害剤を使用する。
一実施形態では、インスリン成長因子（ＩＧＦ）は、細胞がそれらの生理的環境との情
報交換に使用する複合体系の一部であり、したがって、ＰＳＣをＰＥＣおよび／または膵
臓内分泌系列細胞に分化させるために使用することができる。この複合体系（多くの場合
、ＩＧＦ「軸」と称される）は、２つの細胞表面受容体（ＩＧＦ１ＲおよびＩＧＦ２Ｒ）
、２つのリガンド（インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）およびインスリン様成長因子
２（ＩＧＦ－２））、６種の高親和性ＩＧＦ結合性タンパク質（ＩＧＦＢＰ－１～ＩＧＦ
ＢＰ－６）のファミリーからなり、また、集合的にプロテアーゼと称されるＩＧＦＢＰ分
解酵素と関連する。ＩＧＦは、ＩＧＦ１Ｒ、インスリン受容体、ＩＧＦ－２受容体、イン
スリン関連受容体およびおそらく他の受容体に結合することが知られている。したがって
、本発明の一態様では、これらの受容体に結合する成長因子として、これらの受容体のい
ずれかまたは組合せに結合する任意の成長因子、作用物質またはモルフォゲンは本明細書
に記載および予測されているものと潜在的に同じ生理作用を有するので、これだけに限定
されないが、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２が挙げられる。本発明の一態様では、本明細書に記
載されており、表８および表１７によるステージ１～７のいずれかまたは全てにおいて、
約５～２００ｎｇ／ｍＬ、１０～１００ｎｇ／ｍＬ、１０～７５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは
１０～５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０～５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦを使用する。
一実施形態では、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を使用して、ＰＳＣをＰＥＣおよび
／または内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）に分化させる。ＰＤＧＦは、多数種の
細胞の強力なマイトジェンとして広範に記載されている主要なタンパク質成長因子である
。ＰＤＧＦは、異なるチロシンキナーゼ受容体：ＰＤＧＦＲ－αおよびＰＤＧＦＲ－βを
通じて作用するポリペプチド鎖、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの二量体アイソフォームのファミリ
ーに属する。本発明の一態様では、リガンドは、これだけに限定されないが、２つの型の
受容体に結合するＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂを含めた、ＰＤＧＦま
たはその機能的等価物である。本発明の一態様では、本明細書に記載されており、表８お
よび表１７によるステージ１～７のいずれかまたは全てにおいて、約５～１００ｎｇ／ｍ
Ｌ、１０～７５ｎｇ／ｍＬ、１０～５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０～２０ｎｇ／ｍＬの
ＰＤＧＦを使用する。
一実施形態では、ニコチン酸（ビタミンＢ３／ナイアシン）のアミドである、ナイアシ
ンアミドおよびニコチン酸アミドとしても公知のニコチンアミドを、ＰＳＣをＰＥＣおよ
び／または膵臓内分泌系列細胞に分化させるために使用する。ナイアシンとしても公知の
ニコチン酸は、ｉｎ ｖｉｖｏでニコチンアミドに変換され、ナイアシンとニコチンアミ
ドのビタミン機能は同一であるが、ニコチンアミドは、ナイアシンと同じ薬理作用および
毒作用を有さない。したがって、ニコチンアミドと同様に機能する他のビタミンＢまたは
ビタミンＢ誘導体は本発明に組み入れられる。本発明の一態様では、本明細書に記載され
ており、表８および表１７によるステージ１～７のいずれかまたは全てにおいて、約５～
１００ｎｇ／ｍＬ、１０～７５ｎｇ／ｍＬ、１０～５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０～２
０ｎｇ／ｍＬのニコチンアミドを使用する。
別の実施形態では、タンパク質のヘッジホッグファミリーを、ＰＳＣをＰＥＣおよび／
または膵臓内分泌系列細胞に分化させるために使用する。本発明によって提供される脊椎
動物細胞間シグナル伝達分子のヘッジホッグファミリーは、これだけに限定されないが、
デザートヘッジホッグ（Ｄｅｓｅｒｔ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）（Ｄｈｈ）、ソニックヘッジ
ホッグ（Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）（Ｓｈｈ）、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈ
ｈ）およびムーンラットヘッジホッグ（Ｍｏｏｎｒａｔ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）（Ｍｈｈ）
を含めた少なくとも４種のメンバーからなる。一態様では、本明細書に記載されており、
表８および表１７によるステージ１～７のいずれかまたは全てにおいて、約５～２００ｎ
ｇ／ｍＬ、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、１０～１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０～１００
ｎｇ／ｍＬのヘッジホッグタンパク質を使用する。
本発明を一般に記載したが、本明細書において提供される、単に例示するためのもので
あり、限定するものではないある特定の実施例を参照することにより、さらなる理解を得
ることができる。
上述のものが本発明の好ましい実施形態に関連すること、および本発明の範囲を逸脱し
ないでそこに多数の変更を加えることができることも理解するべきである。本発明は以下
の実施例でさらに例示されるが、それらはその範囲に制限を加えるものと決して解釈され
てはならない。逆に、様々な他の実施形態、改変形およびその同等物に頼ることができる
ことを明らかに理解するべきであり、それらは、本明細書の説明を読んだ後ならば、本発
明の精神および／または添付の特許請求の範囲を逸脱しないで、当業者が思いつくことが
できる。
（実施例１）
胚体内胚葉および内胚葉中間体を経た膵臓の前駆体および内分泌細胞へのヒトｉＰＳ細
胞の分化
膵臓前駆体、内分泌前駆体およびホルモン発現内分泌細胞を含む膵臓細胞型の集団を生
成するために、約２週（または１４日）にわたる四（４）ステージ手順を使用して、懸濁
凝集体でヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を分化させた。本明細書で用いたヒトｉＰＳ細
胞系は、Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ、Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｊａｐａｎおよび
Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（ＣＤＩ
）によって提供された。
本明細書に記載されるｉＰＳ細胞は、Ｓｈｉｎｙａ Ｙａｍａｎａｋａによって最初に
、その後ＣＤＩによって提供された。未分化ｉＰＳ細胞は、２０％ノックアウト血清代替
物を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２において、有糸分裂不活性化マウス胚線維芽細胞で、また
は好ましくはフィーダーフリー（線維芽細胞フィーダー細胞層なし）で増殖させた。Ａｃ
ｃｕｔａｓｅを使用して未分化ｉＰＳ細胞を単細胞に解離させることによって分化を開始
し、ＲＮＡの単離と分析のために細胞試料をとった。細胞は、１：５０００希釈のインス
リン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ｗｎ
ｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびロー－キナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤、Ｙ－２７６３２
を１０μΜで含有するＲＰＭＩ＋０．２容量／容量％ＦＢＳに、１ミリリットルにつき細
胞数１，０００，０００～２，０００，０００で再懸濁させ、回転プラットホームの上に
置いた超低付着６ウェルプレートに入れ、約１００ｒｐｍで回転させた。分化プロセスの
残りの間、培地を毎日交換して培養を１００ｒｐｍで回転させた。ｉＰＳＣの成長、継代
および増殖は、実質的に米国特許第７，９６１，４０２号および第８，２１１、６９９号
に記載されている通りである。
多能性細胞、例えばｈＥＳまたはｉＰＳ細胞、および多能性細胞から導出された細胞の
凝集懸濁培養を生成するための本明細書に記載の方法は、実質的に、２００７年２月２３
日に出願された表題がＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃ
ｕｌｔｕｒｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌｓであるＰＣＴ／ＵＳ２００７
／０６２７５５、および２００８年１０月２０日に出願された表題がＭｅｔｈｏｄｓ ａ
ｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔ
ｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｓｅｒ
ｕｍであるＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６に記載されている通りである。
本明細書に記載される方法は、例えば、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに帰属す
る、Ｂｏｄｎａｒらへの米国特許第６，８００，４８０号に記載のように、培養容器を細
胞外基質で先ずコーティングすることによって促進することができる。他の多能性幹細胞
、例えばｈＥＳおよびｉＰＳ細胞を培養するための他の方法と同様に、この方法は、実質
的に２００８年１０月２０日に出願された表題がＭｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓ
ｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ
ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍである米国特許
出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６に記載されるように、可溶性ヒト血清を使用し
て培養することができる。
本明細書に記載される方法は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷＡＲＦ）に帰属する、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．への米国特許第
７，００５，２５２号に記載されるように、線維芽細胞フィーダー層だけ以外の供給源か
ら供給される、外部から加えられた線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）によって促進すること
ができる。
回転の最初の約２４時間の間に、互いに付着した単細胞は細胞凝集体を形成し、ＲＮＡ
の単離と分析のために十分な細胞試料をとった。細胞凝集体は、直径が約６０ミクロンか
ら１２０ミクロンであった。ｉＰＳ細胞試料を回転プラットホームに置いてから約１日（
または２４時間）後に、培養に、１：５０００希釈のＩＴＳ、アクチビンＡ（１００～２
００ｎｇ／ｍＬ）、およびＷｎｔ３ａ（５０～１００ｎｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ＋
０．２容量／容量％ＦＢＳを約１日間（０日目から１日目まで）およびさらなる１日間、
またはＷｎｔ３ａのないこと以外は同じ培地で（１日目から２日目）与えた。ＲＮＡの単
離および分析のために毎日の細胞試料をとった。２日間の分化の後、培養に、１：１００
０希釈のＩＴＳ、ＫＧＦ（またはＦＧＦ７、２５ｎｇ／ｍＬ）およびＴＧＦβ阻害剤ｎｏ
．４（２．５μＭ）を含有するＲＰＭＩ＋０．２容量／容量％ＦＢＳを１日間（または２
４時間、２日目から３日目まで）与えた。次の２日間（３日目から５日目）、ＴＧＦβ阻
害剤を培地から除いたこと以外は同じ成長因子カクテル培地をｉＰＳ細胞凝集懸濁液に与
えた。再び、このステージ（ステージ２または５日目）の終わりに、ＲＮＡ単離のために
細胞試料をとった。ステージ３（５日目から８日目）については、ＴＴＮＰＢ［４－［Ｅ
－２－（５，６，７，８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル－２－ナフタレ
ニル）－１－プロペニル］安息香酸］（３ｎＭ）、ＫＡＡＤ－シクロパミン（０．２５μ
Μ）およびノギン（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ＋１容量／容量％Ｂ２７補助剤
に細胞培養培地を代えた。再び、このステージ（ステージ３または８日目）の終わりに、
ＲＮＡの単離と分析のために細胞試料をとった。ステージ４（８日目から１４日目）につ
いては、ノギン（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＥＧＦ（５０ｎｇ
／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ＋１容量／容量％Ｂ２７補助剤に培地を代えた。再び、ステ
ージ４（または１４日目）の終わりに、ＲＮＡの単離と分析のために細胞試料をとった。
分化中の様々なマーカー遺伝子の遺伝子発現を測定するために、リアルタイムＰＣＲを
実施した。特異的マーカーまたは遺伝子の遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子、サイ
クロフィリンＧおよびＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）発現の平均発現レベルに先ず標
準化した。標準化した相対的な遺伝子発現は、未分化ｉＰＳ細胞での発現レベルに対して
棒グラフに次に表示させ、したがって様々な分化マーカーの上方制御倍率を表す。ＯＣＴ
４については、データセットで最低の試料（１４日目）を設定するために遺伝子発現を標
準化し、したがって分化中の下方制御倍率を表す。
図２Ａ～Ｌは、未分化ｉＰＳ細胞中の同じ遺伝子の発現レベルと比較した、同定された
遺伝子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｃｅｒ１、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＦＯ
ＸＡ１、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３およびＩＮＳ）の相
対的な遺伝子発現を示す棒グラフである。遺伝子の発現レベルをハウスキーピング遺伝子
（対照）のセットに標準化し、２つの異なる時点で遺伝子発現レベルを比較することは、
その遺伝子または発現マーカーの上方制御か下方制御があることを示した。ＯＣＴ４（図
２Ａ）については、遺伝子発現を標準化し、最低レベルの発現の試料は１に設定した（１
４日目）。したがって、図２Ａによって示されるように、ＯＣＴ４の相対的な発現レベル
は、分化中（Ｘ軸、ステージ０から４、または０日目から１４日目）の下方制御倍率（ｙ
軸）を表す。
図２Ａに示すように、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）は未分化ｉＰＳ細胞において高レベル
で発現され、分化中（０日目から１４日目）に以降の下方制御を示す。１４日目までには
、ＯＣＴ４発現レベルは未分化細胞で観察される発現レベルから３０００倍を超えて減少
した。対照的に、最初の２日間（１日目および２日目）中にｂｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子（
ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、図２Ｂ）発現の一過性の上方制御があった。ｂｒａｃｈｙｕｒｙの
一過性の上方制御は、アクチビンＡおよびｗｎｔ３ａの適用による多能性／ｉＰＳ細胞の
内胚葉系中胚葉への誘導された分化の結果であった。３日目のステージ１の終わりまでの
ＣＥＲ１、ＧＳＣおよびＦＯＸＡ２の上方制御によって示されるように（図２Ｃ～Ｅ）、
内胚葉系中胚葉はアクチビンＡへの連続曝露によって２日目および３日目の間に胚体内胚
葉にさらに分化した。分化の６日目までのＦＯＸＡ１の上方制御、ＦＯＸＡ２発現の維持
ならびにＣＥＲ１およびＧＳＣの下方制御によって示されるように（図２Ｃ～Ｆ）、ステ
ージ２の間に、胚体内胚葉は腸管内胚葉に分化するようにさらに誘導された。８日目まで
のＨＮＦ６およびＰＤＸ１の上方制御によって示されるように（図２Ｇ～Ｈ）、ステージ
３の間、レチノイド、シクロパミンおよびノギンへの曝露の結果、腸管内胚葉は後部前腸
／ＰＤＸ１発現内胚葉に分化するようにさらに誘導された。１４日目までのＰＴＦ１Ａ、
ＮＫＸ６－１、ＮＧＮ３およびＩＮＳの上方制御によって示されるように（図２Ｉ～Ｌ）
、ステージ４の間、ＫＧＦおよびＥＧＦへの曝露の結果、後部前腸／ＰＤＸ１発現内胚葉
は、膵臓前駆体、内分泌前駆体およびホルモン発現内分泌細胞に分化するようにさらに誘
導された。
（実施例２）
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、ｉＰＳ細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を促進する
様々なｈＥＳおよびｉＰＳ細胞系を分化させる方法は、実質的にここで、および実施例
１に記載される通りである。分化の間の成長、生存、増殖および細胞間接着を増強および
促進するために、ステージ１、２、３、４および５について記載される培養条件に加えて
、アポトーシス阻害剤および／またはＲｈｏキナーゼもしくはＲＯＣＫ阻害剤を培地に加
えた。一般的に約１０μΜのＲｈｏキナーゼ阻害剤、例えばＹ－２７６３２を、各ステー
ジで細胞培養に加えた。あるいは、少なくともステージ１および２、ならびにステージ４
および５、またはその任意の組合せでＲｈｏキナーゼ阻害剤を加えた。分化したｉＰＳ懸
濁液（凝集体）細胞培養の形態および遺伝子マーカー発現プロファイルは、ｈＥＳ細胞か
ら導出された懸濁細胞培養のそれに実質的に類似する。
図３および４は、それぞれステージ４と５からのｉＰＳ細胞培養の免疫細胞化学（ＩＣ
Ｃ）を示す。図３は、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１同時陽性細胞を含むＰＤＸ１陽性膵臓内胚
葉（膵臓上皮または膵臓前駆体とも呼ばれる）を特徴とする典型的な遺伝子マーカーを発
現する、ステージ４からの細胞凝集体を示す。図３に示されていないが、ステージ４細胞
は、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）および膵
臓ポリペプチド（ＰＰ）などのステージ５細胞の特色をより示すホルモン分泌タンパク質
または遺伝子マーカーを発現しない。図４は、ステージ５からのホルモン発現細胞の細胞
凝集体を示す。これらのＩＣＣ結果は、ＱＰＣＲを使用してさらに確認された。しかし、
ＱＰＣＲは試料または細胞培養で発現されるＲＮＡの全レベルの全集団研究であるので、
それは任意の１つの細胞が複数のマーカーを発現することを確定的に示すことができない
。
（実施例３）
ＩＰＳ導出膵臓前駆体の封入
現在まで、ｉＰＳ細胞の生成方法およびｉＰＳ細胞の生成のための供給源が報告されて
いる。しかし、特定の疾患、例えば糖尿病を処置するための細胞療法での潜在的使用のた
めの、任意の機能する分化細胞への任意のｉＰＳ細胞の分化に関する十分な記載がない。
ヒトｉＰＳ細胞から導出されたステージ４のＰＤＸ１陽性の膵臓内胚葉または膵臓前駆
細胞培養が、グルコース感受性インスリン分泌細胞にｉｎ ｖｉｖｏで発達および成熟す
ることが完全に可能かどうか判定するために、実質的に実施例１および２に記載のような
膵臓前駆体集団を、２００９年１１月１３日に出願された米国特許出願１２／６１８，６
５９、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＬＩＮＥＡＧＥ
ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＨＵＭＡＮ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴ
ＥＭ ＣＥＬＬＳ；ならびに米国特許第７，５３４，６０８号および第７，６９５，９６
５号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＨＯＲ
ＭＯＮＥＳに記載のものに実質的に類似のマクロ封入デバイスに加えた。簡潔には、実質
的に約３×１０６細胞数を有する、５－１０－２０μＬの重力沈殿細胞懸濁凝集体を各デ
バイスに加えた。
哺乳動物、例えば免疫不全ＳＣＩＤ／Ｂｇマウスへの移植のために次にデバイス内の封
入細胞を調製したが、ラット、ブタ、サルまたはヒト患者を含むより大きな動物に移植す
ることができる。封入細胞を移植する方法およびデバイスは、実質的に、米国特許出願第
１２／６１８，６５９号、米国特許第７，５３４，６０８号および第７，６９５，９６５
号に記載のものであり、ＧＥＬＦＯＡＭマトリックスに移植され、精巣上体の脂肪パッド
（ＥＦＰ）の下に移植される膵臓前駆細胞を含む。
これらの研究で免疫抑制は必要でなかったが、デバイス内の前駆体が完全に成熟してグ
ルコースに応答性になるまで、最初の中間期間の間特定の哺乳動物のために免疫抑制が必
要とされることがある。一部の哺乳動物では、免疫抑制レジメンは約１、２、３、４、５
、６週間以上であってもよく、哺乳動物次第である。
移植された細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで分化させ、さらに成熟させた。例えば移植された
細胞が天然に存在するベータ細胞として正常な生理機能を有するかどうか判定するために
、ヒトＣペプチドのレベルの検査によってヒトインスリンのレベルを判定する。ヒトＣペ
プチドはヒトプロインスリンから切断または処理され、したがって、内因性マウスＣペプ
チドでなくヒトＣペプチドの特異的検出は、インスリン分泌が移植された（外因性）細胞
から導出されたことを示す。移植片を有する動物は、それらへのアルギニンまたはグルコ
ース、好ましくはグルコースのボーラス注射によって、２、３または４週ごとにヒトＣペ
プチドのレベルを検査する。その後成熟したベータ細胞（分化した多能性ｉＰＳ細胞から
導出された）は、天然に存在するか内因性のベータ細胞と同様に生理的に機能的であるべ
きで、グルコースに応答性であるべきである。一般的に、５０ｐＭまたは平均基礎（閾値
）レベルを上回るヒトＣペプチドの量は、移植された前駆体から今ではベータ細胞となっ
たものの機能の指標である。
Ｋｒｏｏｎら（２００８）、前掲、米国特許出願１２／６１８，６５９、米国特許第７
，５３４，６０８号；第７，６９５，９６５号および第７，９９３，９２０号に記載のも
のと同様に、ｈＩＰＳ細胞から導出された封入膵臓前駆体は、天然に存在する島のそれと
同様の内分泌、腺房および管細胞を有する、機能する膵島クラスターに成熟することが予
想される。移植前のｈＩＰＳ細胞から導出された精製または濃縮された膵臓前駆体も、機
能する膵島に成熟および発達し、ｉｎ ｖｉｖｏでインスリンを生成することも予期され
る。様々な分化した細胞集団を精製、濃縮するための特定の実施形態は、２００８年４月
８日に出願された米国特許出願１２／１０７，０２０、表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ Ｐ
ＵＲＩＦＹＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＡＮＤ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲ
Ｍ ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＨＥＳ ＣＥＬＬＳ、現在の米国特許第８
，３３８，１７０号にさらに詳細に記載される。低温保存されたｈＩＰＳ細胞から導出さ
れた膵臓前駆体を移植の前に解凍し、培養に適合させることができ、したがって、ｉｎ
ｖｉｖｏで成熟してインスリンを生成することができることがさらに予期される。ｈＩＰ
Ｓ細胞から導出された移植された膵臓前駆体を有する糖尿病誘導動物では、低血糖を改善
することができる。
要約すると、マクロ封入デバイス中のｈＩＰＳ細胞から導出された完全封入膵臓前駆細
胞は、生理的に機能的な膵島に成熟し、ｉｎ ｖｉｖｏでグルコースに応答してインスリ
ンを生成することが予想される。
（実施例４）
膵臓前駆体およびホルモン分泌細胞組成物
それぞれ表６ａ、６ｂおよび７に示すように、フローサイトメトリーを用いて、分化し
たｈＩＰＳ細胞集団を、ＰＤＸ１陽性の膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞（ステージ４）；
および内分泌または内分泌前駆／先駆細胞（ステージ５）のそれらの含有量について分析
した。表６ｂは表６ａのそれと同じデータセットであるが、比較のために表１０のそれと
同様に提示する。全体のＰＤＸ１＋およびＮＫＸ６．１＋数はＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１
＋／ＣＨＧＡ－細胞集団（表６ａの第５列）のそれと重複するので、表６ａ集団は互いと
重複する、例えば全細胞数は１００％を超える。表６ｂはＰＤＸ１＋だけおよび三重陰性
（残留）データを含み、それは表６ａでは示されない。ｉｎ ｖｉｖｏ機能を判定するた
めに、これらのｉＰＥＣ移植片の特定のもの、ならびに実質的に類似の処方を使用する他
のものを動物に移植したが、ヒト血清Ｃペプチドのレベルは任意の潜在的治療目的のため
に十分に頑強でなかった（データは示さず）。示す値は、所与の集団に属する全細胞の百
分率である。懸濁細胞凝集体中にある膵臓前駆体（ＮＫＸ６．１（＋）／ＰＤＸ１（＋）
／クロモグラニンＡ（－））の数およびＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１－／ＣＨＧＡ－の非常
に小さい集団は、ｈＥＳ細胞から導出された膵臓前駆細胞懸濁凝集体で観察されたものと
一貫し、２００８年１１月４日に出願された米国特許出願１２／２６４，７６０、表題Ｓ
ＴＥＭ ＣＥＬＬ ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯ
ＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ ＴＨＥＲＥＯ
Ｆに記載の通り、ＥＳＣステージで凝集した。内分泌物および／または内分泌前駆／先駆
細胞のレベルも、２００８年４月８日に出願された米国特許出願１２／１０７，０２０、
表題ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＡＮＤ ＰＡＮ
ＣＲＥＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬＳ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＨＥＳ
ＣＥＬＬＳ中のｈＥＳ導出細胞培養で得られたものと実質的に一貫していた。ｈＥＳ導出
細胞懸濁凝集体と同様に、分化の特定のステージ（例えば、ステージ４）で培地中の異な
る成長因子の濃度を変化させることは、膵臓内胚葉、内分泌、ＰＤＸ１陽性の内胚葉また
は非膵臓細胞型の特定の集団を増加および／または減少させるはずである。
Figure 2022017361000027
Figure 2022017361000028
（実施例５）
ＰＥＣ受容体チロシンキナーゼ
上記の方法は、上記のＳｃｈｕｌｚら（２０１２）から変更した下の表８に記載される
ものと実質的に同じである。本明細書に記載されるこれらおよび他の方法は、米国特許第
７，９６４，４０２号；第８，２１１，６９９号；第８，３３４，１３８号；第８，００
８，０７号；および第８，１５３，４２９号を含む、出願人の多くの特許および非特許公
開文書に見出すことができる。
Figure 2022017361000029
動物に移植されたｉＰＳ細胞および膵臓前駆体に上の方法を適用したとき、同じ方法を
ｈＥＳＣおよびｈＥＳ導出膵臓前駆体に適用したときと比較して、出願人は同じ頑強なｉ
ｎ ｖｉｖｏ機能を一貫して得たとは限らない。ｉＰＳ細胞がｈＥＳＣの形態および遺伝
子発現パターンを有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚様体およびｉｎ ｖｉｖｏでテラトーマを
形成することができるヒト多能性幹細胞であり、それらが全ての３つの胚葉から細胞を形
成することができることを示していることを考慮すると、これは意外であった。少なくと
も、例えばＹｕら（２００７）；米国特許出願公開第２００９／００４７２６３号、国際
特許出願公開ＷＯ２００５／８０５９８；米国特許出願公開第２００８／０２３３６１０
号；および国際特許出願公開ＷＯ２００８／１１８８２、上記を参照。これらの参考文献
は、ｉＰＳ細胞がＥＳＣの定義基準を満たすことを記載する。したがって、完全に機能す
るグルコース応答性細胞にｉｎ ｖｉｖｏでさらに成熟および発達する、ｈＥＳから導出
された膵臓前駆細胞を与えるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化プロトコルにおいて、ｉＰＳ細胞がＥ
ＳＣの代用となることができることが予想される。しかし、上の方法を使用する一貫しな
いｉｎ ｖｉｖｏ機能データを考慮し、出願人は、膵臓前駆体および／または膵臓内胚葉
細胞（ＰＥＣ）、すなわち、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣで一貫して観察されているｉ
ｎ ｖｉｖｏ機能の実質的に類似の頑強なレベルを提供することが可能であるｈｉＰＳＣ
（または「ｉＰＥＣ」）からのステージ４導出細胞に特異である分化培地処方を探索しよ
うと努めた。
出願人は、ＰＥＣに存在する内分泌（ＣＨＧＡ＋細胞）細胞が多ホルモン内分泌細胞で
あり、ｉｎ ｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞を有する島を生成するＰＥ
Ｃ中の細胞の亜集団でないことを前に報告した。上記Ｋｅｌｌｙら（２０１１）を参照す
る。むしろ、それは、非内分泌細胞集団（ＣＨＧＡ－細胞）、特に、ｉｎ ｖｉｖｏで機
能する島を実際に生成するＰＥＣであると考えられている、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ－
１を同時発現するものである。したがって、出願人は、内分泌および非内分泌亜集団の相
対比をモジュレートするか、変化させるか、シフトすることが、後のｉｎ ｖｉｖｏ機能
に影響を及ぼすかどうかを探索した。
ｈＥＳＣで受容体－リガンドシグナル伝達を解読する以前の努力は、自己複製を促進す
る成長因子の同定に成功を収め、規定の培地培養条件の開発を可能にした。上記Ｗａｎｇ
ら（２００７）を参照する。Ｗａｎｇらは、ＥＲＢＢ３に結合してＥＲＢＢ２との二量体
化を誘導し、その場面でｈＥＳＣの自己複製に影響を及ぼすリガンドとしてヘレグリン－
１βを同定した。ＥＲＢＢは受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、ＲＴＫは、成長
因子および他の細胞外シグナル伝達分子の受容体として作用する、広く発現される膜貫通
タンパク質である。リガンド結合の結果、それらは細胞質テール中の特定の残基でチロシ
ンリン酸化を受け、ＲＴＫ媒介シグナル伝達に関与する他のタンパク質基質の結合のため
のシグナル伝達カスケードを始動する。細胞の生存、増殖および運動性の調節を含むいく
つかの発達過程におけるＲＴＫ機能、およびがん形成でのそれらの役割は文書で十分に立
証されている。ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体は、発達中の胎児のヒト膵臓全体で発現
されることも知られていたが、特定のＥＲＢＢ受容体およびそれらのリガンドの特異的役
割は知られていない。Ｍａｒｉ－Ａｎｎｅ Ｈｕｏｔａｒｉら（２００２）ＥＲＢＢ Ｓ
ｉｇｎａｌｉｎｇ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｉｓｌｅｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ
Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １
４３（１１）：４４３７～４４４６頁を参照。
上記Ｗａｎｇら（２００７）によって実証される胎児のヒト膵臓での多能性幹細胞の自
己複製およびそれらの発現、ならびにヒト胎児膵臓でのＥＲＢＢ ＲＴＫ発現でのＥＲＢ
Ｂ ＲＴＫシグナル伝達の役割のために、次に出願人は、分化の間のＰＥＣ特定化、また
は自己複製の促進による増大、または生理的に機能する島ホルモン分泌細胞へのｉｎ ｖ
ｉｖｏ成熟を促進するいくつかの他の未知の機構を向上させる可能性がある受容体および
リガンドを同定する努力の中で、ｈＥＳＣから導出されたｉｎ ｖｉｔｒｏの膵臓内胚葉
細胞（ＰＥＣ）でＲＴＫの潜在的な活性化の調査に取りかかった。以下の変更を除いて実
質的に表８に記載のように、分化凝集体の懸濁液でＰＥＣを生成した。
ＲＴＫブロット分析のために、４つのＰＥＣ試料を生成した。ｄｂ－Ｎ５０ Ｋ５０
Ｅ５０でのＰＥＣ凝集体の「定常状態」試料を、ステージ４の終わり（またはｄ１３）に
収集した。「絶食させた」試料は、ｄｂ（ＤＭＥＭ高グルコースまたは０．５×Ｂ－２７
補助剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加したＤＭＥＭ高グルコース）培地
だけ（成長因子なし）を与え、ｄ１３に収集した、ｄ１２ＰＥＣ凝集体を表した。２つの
「パルス投与」試料は、ｄ１２にｄｂ培地を与えてそこで培養し、次にｄ１３に、収集す
る前に１５分間、ｄｂ－Ｋ５０ Ｅ５０培地または２％ＦＢＳ含有ｄｂ培地のいずれかを
与えた。そのような条件は、ステージ４条件で活性であったＲＴＫの検出、ならびにＫＧ
Ｆ、ＥＧＦおよびインスリン（Ｂ２７補助剤に存在する）または血清のパルス投与でどの
ような応答を導き出すことができるか検出することを意図した。血清パルス投与は、ＰＥ
Ｃに存在し、本ステージ４条件で活性化することができるが刺激されないＲＴＫを潜在的
に同定する、広域な成長因子刺激を意図した。
ＲＴＫ分析は、事実上前掲のＷａｎｇら（２００７）で前に記載される通りに実施した
。簡潔には、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ヒトホスホＲＴＫ抗体アレイ
（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｙｔｅｍｓ）を、製造業者の指示通りに使用した。１％ＮＰ－４０、２
０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２
．０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍＬアプロ
チニン、および１０μｇ／ｍＬロイペプチンでタンパク質溶解物を調製した。５００μｇ
の新鮮なタンパク質溶解物を、４２個の抗ＲＴＫ抗体および５つの陰性対照抗体のための
重複スポット、ならびに８つの抗ホスホチロシン陽性対照スポットの点在するニトロセル
ロース膜と一晩インキュベートした（図５Ａ）。配列された抗体はリン酸化および非リン
酸化ＲＴＫの細胞外ドメインを捕捉し、結合したホスホＲＴＫは、化学発光を使用して西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされた汎抗ホスホチロシン抗体で
検出される。ＲＴＫアレイレイアウトについては図５を、ならびにアレイ中のＲＴＫの一
覧については下の表９を参照する。
Figure 2022017361000030
Figure 2022017361000031
ＲＴＫブロット（図６Ａ）は、ｈＥＳＣで以前に観察されたものと同様に、インスリン
受容体およびＩＧＦ１受容体（それぞれＩＲ、ＩＧＦ１Ｒ）が全ての条件でリン酸化され
、活性化されたことを示した。上記Ｗａｎｇら（２００７）参照。ＥＧＦ受容体（ＥＧＦ
Ｒ、ＥＲＢＢ１としても知られる）は定常状態条件でリン酸化されたが、それはステージ
４培地中のＥＧＦの存在を考慮すると予想されていた。実際、ＥＲＢＢ２の低レベルのリ
ン酸化が、定常状態および絶食条件の両方で検出された。ＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ２の両
方のリン酸化は各パルス投与条件で上昇し、リガンドのパルス投与に応答する活性化を検
出するアッセイの能力を確認した。リン酸化されたＶＥＧＦＲ３も全ての条件で検出され
、パルス投与試料で上昇した。このことは、ＰＥＣが内因性ＶＥＧＦＲ３リガンドを生成
することを示唆し、可能な候補はＶＥＧＦ－ＣおよびＤであった。血清パルス投与は、低
レベルのＥＲＢＢ３リン酸化を含め、さらなる受容体を活性化するようであった。リン酸
化ＥＲＢＢ２／３の検出は、ヘレグリン様ＥＧＦファミリーメンバーがＰＥＣでシグナル
伝達を活性化することができることを示唆する。ＴＩＥ－２は２つのアンギオポエチン受
容体の１つであり、血清に応答して低いレベルでリン酸化されるようであった。アンギオ
ポエチン１およびアンギオポエチン４はＴｉｅ－２のリガンドを活性化することが公知で
あるが、アンギオポエチン２およびアンギオポエチン３は、場面依存性競合的アンタゴニ
ストとして機能する。ＨＧＦ受容体（ＨＧＦＲ）も血清パルス投与に応答してリン酸化さ
れ、肝細胞成長因子もＰＥＣでシグナル伝達を導き出すことができることを示唆した。最
後に、エフリンＢ２ ＲＴＫ（ＥＰＨＢ２）の低レベルのリン酸化が検出されたが、エフ
リン／Ｅｐｈシグナル伝達は膜結合細胞間シグナル伝達系であり、ＰＥＣ分化で容易に活
用される可能性はない。興味深いことに、ＥＲＢＢ４はリン酸化されなかった。したがっ
て、ＲＴＫ分析は、ＰＥＣでリン酸化されるか、または異なる条件、例えば血清に応答し
てリン酸化することができるいくつかの受容体を鮮明にした。これらの結果は、いくつか
の可溶性リガンドがＰＥＣでＲＴＫシグナル伝達を導き出すことができ、細胞の増殖、分
化および／または特定化に潜在的に影響を与え、したがって、機能する膵臓の島への後の
ｉｎ ｖｉｖｏ成熟に潜在的に影響を及ぼすことができることを示唆する。
（実施例６）
ヘレグリンおよびＦＧＦ２成長因子は、ｈＥＳＣ組成物から導出されたＰＥＣに影響を
及ぼす
上の実施例５に記載のように特定の条件下で特定のＲＴＫが活性化（またはリン酸化）
されることを実証したＲＴＫ分析を考慮し、かつ、少なくともＥＲＢＢ２およびＥＲＢＢ
３がＰＥＣで活性化される（ステージ１～４から１３日間の分化後に）ようであったので
、出願人はステージ３および４の細胞に適用したときのヘレグリンの影響を判定しようと
努めた。
ヘレグリンおよびＦＧＦを使用して予備研究を実施した。これらの研究の特定のものに
、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ－２７６３２が含まれた。これらの予備研究は、１０ｎｇ／
ｍＬヘレグリン－１β（Ｗａｎｇら（２００７）に開示されるのと同じ濃度およびヘレグ
リン異性体）によるステージ１での１日間の多能性幹細胞の処置は、ヘレグリン－１β（
Ｈｒｇ１β）のない懸濁培養でのｈＥＳ導出細胞凝集体の凝集体サイズと比較して、懸濁
培養でｈＥＳ導出細胞凝集体の細胞凝集体サイズを増加させた。細胞凝集体サイズの増加
は、動物での後の移植および機能検査のためにより大きな細胞量をもたらす点で有利であ
る。さらに、Ｈｒｇ１βがステージ３で１０ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬに増加したと
き、凝集体ディスクサイズが増加した。この結果は、ＦＧＦ２の不在下での培養と比較し
て５０ｎｇ／ｍＬの別の成長因子、ＦＧＦ２がステージ３で使用されたときも観察された
。細胞凝集体サイズの増加は、ステージ３培養をＦＧＦ２曝露にさらなる日数、例えば２
日間と比較して３日間の５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２に曝露させたときも観察された。
表１０は、ステージ３にＨｒｇ１βおよびＦＧＦ２で処置したＰＥＣ細胞のフローサイ
トメトリー分析の要約を提供する。内分泌細胞はＣＨＧＡ陽性（またはＣＨＧＡ＋）細胞
と表し、非内分泌細胞はＣＨＧＡ陰性（またはＣＨＧＡ－）細胞と表す。内分泌物（ＣＨ
ＧＡ＋）および非内分泌細胞（ＣＨＧＡ－）は、他のマーカーに陽性に染色することがで
き、例えばＰＤＸ１および／またはＮＫＸ６．１に陽性に染色される。試験したマーカー
のいずれにも染色しない細胞は、三重陰性細胞または残留細胞（ＣＨＧＡ－／ＮＫＸ６．
１－／ＰＤＸ１）と表す。
Figure 2022017361000032
細胞凝集体サイズの増加がＰＥＣ亜集団に影響を及ぼすかどうか判定するために、ＰＥ
Ｃ集団の組成物をフローサイトメトリーによって分析した。細胞を分化するためにＨｒｇ
１βおよびＦＧＦ２が使用されなかった対照培養と比較して、ＰＥＣ非内分泌亜集団（Ｃ
ＨＧＡ－）は、ステージ３で１０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βの添加により５４．０１％から
６１．２％に増加し、ステージ３で５０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βの添加により５４．０１
％から６４．２％に増加した。内分泌亜集団（ＣＨＧＡ＋）は、１０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ
１βの処置であまり影響を受けなかったが、５０ｎｇ／ｍＬでよりそうであった。一方、
残留細胞の相対レベルは減少し、５０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βでより減少した。したがっ
て、Ｈｒｇ１β処置による細胞凝集体サイズの増加は、内分泌および残留亜集団と比較し
て非内分泌亜集団の増加に大部分帰された。
ステージ３培養でのＦＧＦ２の影響も同様であったが、Ｈｒｇ１βのそれよりさらに顕
著であった。例えば、ＰＥＣ非内分泌亜集団（ＣＨＧＡ－）は、Ｈｒｇ１βでそうしたよ
うに増加した。これらの培養でのＦＧＦ２の主要な影響は、内分泌亜集団の実質的な減少
であった。ある場合には、これらの細胞は、３日間の処置でほとんど検出不能であった（
３２．９％から０．３３％）。したがって、ＦＧＦ２で処置した培養の細胞凝集体サイズ
の増加は、非内分泌、一部の場合には残留細胞亜集団の増加に大部分帰された（ステージ
３の３日間で１３．１％から２２．７％）。
したがって、ヘレグリンおよび／またはＦＧＦ２は、ＰＥＣ集団での細胞の特定化にお
いて役割を果たすようである。多能性幹細胞との関連で使用されるとき、ヘレグリン単独
で細胞更新において役割を果たすと上記のＷａｎｇら（２００７）が報告したことを考慮
すると、これは意外である。
（実施例７）
ヘレグリンによるＩＰＳ導出細胞培養の処置によってＰＥＣのｉｎ ｖｉｖｏ移植片機
能を向上させる方法
ｉＰＥＣを生成するためにｉＰＳＣに適用したときの表８による方法は、動物で頑強な
ｉｎｖｉｖｏ機能を提供しなかったので、出願人はｉＰＥＣ生成のための他の方法を探索
した。表８に示す標準方法の変更には、限定されずに以下のものが含まれる：任意のｉＰ
ＳＣの継代回数の最適化；ＢＭＰシグナル伝達のレベルをモジュレートすること；増大お
よび分化の間のｉＰＳＣ懸濁凝集パラメータをモジュレートすること（例えばせん断力、
回転速度等）；成長因子、例えばＷｎｔ、アクチビンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の濃度
、使用時期および使用期間の最適化；ならびに、分化プロトコルの１から４の様々なステ
ージでの、細胞の質量、増殖、分化、生存等を向上させるための候補としての他の成長因
子による処置（例えばＥＲＢＢリガンド）。ステージ１～４の間のｉＰＳＣの分化方法を
どのように最適化することができるか判断するために、これらの多くの反復実験を単独で
、または組合せで検証した。そのような最適化された分化方法は、移植したときに、ｈＥ
ＳＣについて観察および報告されたものに類似の頑強なグルコース応答性インスリン分泌
細胞をｉｎ ｖｉｖｏでもたらしたｉＰＥＣ集団を生成する。下の表１１は、後にｉｎ
ｖｉｖｏでグルコース応答性島細胞に成熟したｉＰＥＣにｉＰＳＣを分化させることが実
証された、ヘレグリンの有る無しのベースライン条件を記載する。ベースライン条件は、
ヘレグリンがステージ３および４で加えられたこと以外、本明細書の実施例１、２および
５ならびに表８に記載されるものに類似していた。３０ｎｇ／ｍＬのΗｒｇ１βを使用し
たが、１０ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬの濃度、または５０ｎｇ／ｍＬを超える濃度で
さえも適する。さらに、実施例２に記載の通り、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙー２７６３２
の添加が分化培養で維持された。
Figure 2022017361000033
ステージ３および４の細胞亜集団に及ぼすヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキ
ナーゼ阻害剤の添加の影響を判定するために、ｉＰＥＣ集団をフローサイトメトリーによ
って分析した。表１２は、表１１に示す製剤、ならびにアクチビン濃度を２００ｎｇ／ｍ
Ｌに増加させることによって改変した製剤を使用した、様々なｉＰＥＣ集団のフローサイ
トメトリー分析の要約を提供する。さらに、表１２は、各セットの実験（ヘレグリンの有
る無しのベースライン）で用いた一般的な条件、およびｉＰＥＣ集団中の細胞型（内分泌
、非内分泌、ＰＤＸ１だけおよび三重陰性または残留性の細胞亜集団）の相対的百分率を
示す。表１２は、各実験で生成された細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能に関するデータも開示す
る。
Figure 2022017361000034
特定の条件では、ＰＥＣ（ｈＥＳＣ、Ｅ２３５４）およびｉＰＥＣ（Ｅ２３１４、Ｅ２
３４４、Ｅ２３４７）集団中の細胞亜集団の比を変更した。例えば、時には、ベースライ
ン（ヘレグリンなし）条件と比較して、内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞の百分率は減少し、非
内分泌細胞（ＣＨＧＡ－／ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋）の百分率は増加した。実験＃２
３８０（Ｅ２３８０）で、ヘレグリンがこれらのＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団中の非内分泌
細胞と比較した内分泌細胞の割合の変化の原因となるようであったが、ヘレグリンの添加
によって内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞のレベルは減少せずに増加した。
ＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団の構成の変化がｉｎ ｖｉｖｏ機能に影響を及ぼしたかどう
かを判定するために、表１２に記載される大部分の実験からのＰＥＣおよびｉＰＥＣ移植
片を、実質的に本明細書ならびに上記のＳｃｈｕｌｚら（２０１２）およびＫｒｏｏｎら
（２００８）、および上記の米国特許第７，５３４，６０８号；第７，６９５，９６５号
；第７，９９３，９２０号および第８，２７８，１０６号を含む出願人の他の特許および
非特許出版物に前述の通り、マウスに移植した。簡潔には、ＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団を
生分解性の半透過性細胞封入デバイスに全て封入し、そのいくつかは微穿孔を含んでいた
。デバイスは出願人によって製造され、２００９年１１月１３日に出願された米国特許第
８，２７８，１０６号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ
ＣＥＬＬＳ ＦＲＯＭ ＨＵＭＡＮ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ
で詳細に記載される。グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイを、移植の約
５６日後から実施した。グルコース投与の前（空腹時）、およびその３０分後および／ま
たは６０分後の組合せで血液を収集した。グルコース投与に応答した血清中のヒトＣペプ
チド濃度を測定することによって、移植片機能を評価した。
血清に放出されるヒトＣペプチドの量は、放出されるインスリンの量の指標となる。Ｃ
ペプチドはプロインスリンおよびプレプロインスリンのＡおよびＢ鎖を接続または連結す
る短い３１アミノ酸ペプチドであり、機能するベータまたはインスリン分泌細胞によって
分泌される。上記Ｋｒｏｏｎら（２００８）および他によって前述される通り、ヒトＣペ
プチドの測定は、移植細胞による新規生成インスリンの放出の評価に適当である。したが
って、これらの動物の血清中のヒトＣペプチドのレベルは、成熟したＰＥＣおよびｉＰＥ
Ｃ移植片のｉｎ ｖｉｖｏ機能の尺度である。ヒトＣペプチドは、移植後少なくとも８週
までに血清で検出された。追加の数週の移植および絶食により、グルコース刺激Ｃペプチ
ドレベルは増加し、Ｃペプチドのピークレベルはグルコース投与の６０分後から３０分後
にシフトし、それは、インスリン細胞の成熟に従う、グルコース投与へのより速い応答の
指標となる。機能を示すことができなかったか、不良な健康状態のために屠殺された少数
のマウスがいた。しかし、これらのマウスはさもなければ高機能動物を示したコホート中
にあり、したがって、移植細胞が分化して機能する能力がないことよりも移植の失敗を示
唆した。
図７Ａ～Ｃは、Ｅ２３４４以外の表１２に示す実験の全てについての、グルコース投与
後の血清中のヒトＣペプチドレベルを示す。図７Ａ～Ｃは、ベースライン対照と比較して
、ヘレグリン処置からもたらされた移植片が血清中ヒトＣペプチドのより高いレベルを一
般に有したことを示す。例えば、図７Ａで実験２３８０において、ヘレグリンなしで調製
したもの（ベースライン）と比較して、ヘレグリン処置からもたらされた移植片の約５倍
の増加（グルコース投与の６０分後に９３３ｐＭ：２００ｐＭ）がある。実験２３５４（
図７Ｃ）はベースライン対照と比較してヘレグリン処置からもたらされた移植片で血清Ｃ
ペプチドのより高いレベルを示さないので、ヘレグリンは、ｈＥＳＣから生成されるＰＥ
Ｃにより少ない影響を及ぼすようである。さらに、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣ（Ｃｙ
Ｔ２０３）とｉＰＳＣから導出されたｉＰＥＣを比較すると、ｉＰＥＣ移植片は、ＰＥＣ
移植片と同等の機能をｉｎ ｖｉｖｏで有する（例えば、図７Ａおよび図７Ｂ（ｉＰＳＣ
移植片）を図７Ｃ（ＣｙＴ２０３ ｈＥＳＣ）と比較する）。このように、ｉＰＥＣ移植
片は、ＰＥＣ移植片と同じくらい頑強である。さらに、内分泌および非内分泌亜集団で同
じシフトを有しなかったＥ２３８０からのｉＰＥＣも優れた機能を示したので、ｉＰＥＣ
集団のいくつか（例えばＥ２３１４、Ｅ２３４７およびＥ２３５４）に影響を及ぼすよう
に見えた、内分泌細胞対非内分泌細胞の相対比は、ｉｎ ｖｉｖｏ機能に影響を及ぼさな
いようであった（図７Ａ～Ｃを参照）。
グルコース刺激インスリン分泌を試験することに加えて、宿主動物のベータ細胞を破壊
した場合に、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣによって維持される正常血糖と同様の正常血
糖をそれらが単独で維持することができるかどうか判定するために、成熟したｉＰＥＣ移
植片を試験した。これは、ヒトベータ細胞と比較してマウスベータ細胞に対してより強い
細胞毒性を示すベータ細胞毒素、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を使用して、移植された
マウスのベータ細胞を破壊することを必要とした。ＳＴＺ処置の前後に各マウスについて
、ランダムな非絶食血中グルコースを測定した。ＳＴＺ処置から１３日目のｉＰＥＣ移植
片の外植の結果、高血糖が再開した（血中グルコースの急騰を記す）が、それは内因性マ
ウス膵臓ではなくｉＰＥＣ移植片による血糖症の制御を実証する（図８Ａおよび図８Ｂを
参照する）。
さらに、分化のステージ１～４の間にヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤を提供し
たときに、相乗効果があるようであった（表１１を参照する）。例えば、ｒｈｏキナーゼ
阻害剤なしでステージ３および４でヘレグリンによって処置したｉＰＳＣは、目にみえて
劣る細胞量をもたらし、移植を不可能にした。ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の
相乗効果のさらなる傍証が、実験のいくつか、例えばＥ２３５６、Ｅ２３８０で明白であ
ったが、そこではｒｈｏキナーゼ阻害剤単独によるベースライン条件は、ｒｈｏキナーゼ
阻害剤とヘレグリンによる移植片と同じくらい頑強には機能しなかった（図７ＡおよびＢ
を参照する）。ヘレグリン単独の添加が提供した細胞量は移植に不十分であり、ｒｈｏキ
ナーゼ阻害剤単独の添加（ベースライン条件）は不良なｉｎ ｖｉｖｏ機能を有したので
、ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤による処置は相加的でなかったようである。こ
のように、ヘレグリンだけまたはｒｈｏキナーゼ阻害剤だけの提供は、２つを組み合わせ
た合計の影響に実質的に類似していない。すなわち、単独ではいずれもｉｎ ｖｉｖｏで
頑強なグルコース応答性をもたらさないが、組み合わせるとそれらはｈＥＳ導出細胞のそ
れに類似のグルコース応答性をもたらす。したがって、ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ
阻害剤の両方の提供は、それらの組み合わせた影響が各々別々の影響の合計より大きいの
で相乗的であるようであった。すなわち、ｒｈｏキナーゼ阻害剤およびヘレグリンで処置
したｉＰＥＣはｉｎ ｖｉｖｏで成熟してグルコース刺激インスリン分泌を示し、糖尿病
マウスモデルで正常血糖を維持することができた（図７Ａ～Ｂおよび図８Ａ～Ｂを参照す
る）。
ＥＲＢＢ機能性は、リガンド結合、受容体二量体化および受容体輸送を必要とする。各
過程での変動性は、受容体およびそれらが制御する下流シグナルの差別的調節をもたらす
ことができる。例えば、異なるＥＲＢＢリガンドはＥＲＢＢ受容体に異なる親和性で結合
し、それによってＥＲＢＢ二量体構成体のパターンおよび動態力学を変化させる。表１３
は、リガンドおよび受容体結合複合体の多くの可能な異なる組合せを示す。この系の複雑
性に関するレビューは、Ｏｄａら（２００５）Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｐａｔ
ｈｗａｙ ｍａｐ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅ
ｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．、１（２００５）および
Ｌａｚｚａｒａら（２００９）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｐｅｒｓ
ｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＥＲＢＢ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｅｌｌ ｒｅｇｕ
ｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ ３１５（４）：７１７～７２５頁によって提供される。
Figure 2022017361000035
Ｈｕｏｔａｒｉらは、ニューレグリン－４がグルカゴン（アルファ）細胞を代償にして
ソマトスタチン（デルタ）細胞の数を増加させることによって内分泌細胞亜集団の相対レ
ベルをモジュレートすることができること、およびニューレグリン－４は、外分泌（例え
ば、アミラーゼ）細胞対内分泌（例えば、β－インスリン、α－グルカゴン、δ－ソマト
スタチン、ＰＰ－膵臓ポリペプチド）細胞の比に影響を及ぼさないことを示唆した。しか
し、これらの研究は、Ｅ１２．５日目のマウスから得られたホールマウント器官組織培養
の上でニューレグリン－４をインキュベートすることによって実施された。これらのマウ
ス外植細胞集団は、本明細書に記載されるステージ３（例えばＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）
および／またはステージ４（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）細胞集団よりさらに分化していた
。ニューレグリン－４はＥＲＢＢ４ ＲＴＫだけに結合するので、ホールマウントマウス
培養の内分泌亜集団だけをこの関係においてニューレグリン－４によってモジュレートす
ることができる。したがって、Ｈｒｇ１はＥＲＢＢ３に結合してＥＲＢＢ２／３の二量体
化を誘導することが既に示されているので、異なるＥＲＢＢリガンド、例えばＨｒｇ１に
よる本明細書に記載のステージ３（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）および／またはステージ４
（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）細胞の処置は、Ｈｕｏｔａｒｉにおけるように相対的な内分
泌亜集団をモジュレートするとは予想されない。しかし、図６に示すようにＰＥＣでのＥ
ＲＢＢ２および３の低レベルの発現のために、ステージ３および４型の細胞が低いか高い
レベルのＥＲＢＢ２および３を発現してＨｒｇ１に結合するかどうかは不明であった。
さらに、異なる場面で、出願人はＨｒｇ１がＥＲＢＢ２／３に結合して、多能性幹細胞
の自己複製を促進したことを記載していた（Ｗａｎｇら（２００７）を参照する）。Ｈｒ
ｇ１がステージ３および４の場面で同じ能力で作用することができる可能性はあるが、出
願人はＰＥＣの生成のための大部分の細胞増大が多能性幹細胞ステージ（ステージ０）で
起こることを以前に記載した。ステージ０の間、ｈＥＳＣは約二（２）週の間成長、継代
および増大させられる。したがって、細胞増大または細胞増大をもたらす自己複製のほと
んどは、ステージ１～４の間には起こらない。上記Ｓｃｈｕｌｚら（２０１２）を参照す
る。さらに、ＥＲＢＢ２／３がステージ３および４の間に存在すると仮定すると、誘導さ
れる分化に影響を与えるのと反対に多能性幹細胞と同様の効果（自己複製）をヘレグリン
が有すると予想できる可能性がある。次に、機能の差は場面に、すなわち多能性幹細胞対
内胚葉または膵臓系列の細胞型に依存するようである。
要約すると、前腸内胚葉（ステージ３）およびＰＤＸ１発現膵臓内胚葉細胞（ステージ
３およびステージ４の終わり）へのヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻
害剤のｉｎ ｖｉｔｒｏでの提供は、移植されたときにｉｎ ｖｉｖｏで成熟してグルコ
ース応答性インスリン分泌細胞に発達するＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団を生成した（図７お
よび８を参照する）。ヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤のそのよ
うな使用は、ここで初めて報告された。そのような使用および影響は、特許または非特許
文献で前に記載されたものから識別できない。
（実施例８）
アクチビンは膵臓の内胚葉細胞（ＰＥＣ）培養でＮＧＮ３発現および内分泌系列に傾倒
した細胞の生成を抑制する
膵臓内胚葉細胞、または「ＰＥＣ」は、２つの異なる亜集団で主に構成される膵臓の細
胞集団である：（ｉ）ｉｎ ｖｉｖｏで発達および成熟してグルコース応答性インスリン
分泌ベータ細胞を生成する、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）（以降、
「非内分泌（ＣＨＧＡ－）」）；および（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｖｏ成熟の間他の非インスリ
ン分泌細胞または島支持細胞を生成することができる、内分泌系列に傾倒した細胞の亜集
団（ＣＨＧＡ＋）（以降、「内分泌物（ＣＨＧＡ＋）」）。非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集
団はＣＨＧＡ陰性かつＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に支配的に陽性であるが、内分泌系列
に傾倒した細胞の亜集団はＣＨＧＡ陽性かつＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に大部分陰性で
ある。非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団は、ｉｎ ｖｉｖｏでインスリン応答の全身検出（
ＣペプチドのためのＥＬＩＳＡによって検定される）を可能にする量でグルコース応答性
インスリン分泌ベータ細胞に発達および成熟するのに、約８～１２週以上を要する。しか
し、正常な胚発達の間にｉｎ ｖｉｖｏでグルコース応答性細胞が発達および成熟するの
に８週未満しか要しない。したがって、以下を得ることが今でも望ましい。（１）増加し
た非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団を有するＰＥＣ集団、および／または（２）ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでグルコース応答性であり、および／または発達が進行した集団（例えば適切に特
定化し、ｉｎ ｖｉｖｏで類似の膵臓集団について記載のものと一貫した特定のシグネチ
ャーマーカーを有する）である真の内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞集団、および／または（３
）ｉｎ ｖｉｖｏで発達および成熟期間の短縮および／または低減が可能である前駆細胞
集団。
第１の目標に関して、非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団が無傷のままであると同時に、内
分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）への分化がｉｎ ｖｉｖｏで天然に起こるものと
同様に抑制されるＰＥＣ集団を得ることが望ましい。下記の実施例は、そのようなＰＥＣ
集団の生成方法を記載する。
正常なｉｎ ｖｉｖｏ発達の間、転写因子ニューロゲニン－３（ＮＧＮ３）は内分泌細
胞発達のマスター調節因子であり、ＮＧＮ３の発現は、例えばｉｎ ｖｉｖｏでの膵臓内
胚葉系列細胞でのＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１の上方制御の後まで起こらないと考えられ
ている。ＲｕｋｓｔａｌｉｓおよびＨａｂｅｎｅｒ（２００９）、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ
３：Ａ ｍａｓｔｅｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、Ｉｓｌｅｔｓ
１（３）：１７７～１８４頁を参照。表８により、ステージ３において、ＰＤＸ１発現
を誘導するために、レチノイン酸（ＲＡ）またはレチノイド類似体、４－［（Ｅ）－２－
（５，６，７，８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル－２－ナフタレニル）
－１－プロペニル］安息香酸または「ＴＴＮＰＢ」（または表８で「ＴＴ３」）が使用さ
れる。しかし、同時に、レチノイン酸は、内分泌特定化を開始するＮＧＮ３発現を早期に
誘導もする。これ故、ステージ３および／またはステージ４の間のＮＧＮ３の抑制、抑圧
または阻害は、ＰＥＣで内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）亜集団に傾倒した細胞を最少化するた
めの、および／または発達の後期にｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで内
分泌細胞を得るための１つの手がかりを提供することができる。重要なことに、ＮＧＮ３
のいかなるサプレッサー、リプレッサーまたは阻害剤も、同時に非内分泌物（ＣＨＧＡ－
）を抑制、抑圧または阻害してはならず、好ましくはＰＥＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ生成の間
にこの亜集団を増加させる。
ステージ３および４の間にＮＧＮ３などの遺伝子を抑制するそれらの能力について、様
々な成長因子を調査した。１つの候補成長因子は、幹細胞の増大および分化において多様
な機能を有するアクチビンであった。例えば、低いレベル（例えば１０ｎｇ／ｍＬ）では
、アクチビンは多能性幹細胞の多能性および細胞増殖の維持を助ける。より高いレベル（
例えば１００ｎｇ／ｍＬ）では、アクチビンはステージ１の胚体内胚葉生成を担う分化成
長因子として作用する（例えば表８を参照）。ＰＥＣ形成の間に内分泌系列（ＣＨＧＡ＋
）に傾倒した細胞の抑圧に対するその影響を試験するために、出願人は標準の接着分化で
約５０ｎｇ／ｍＬの中央レベル濃度のアクチビンを先ず試験した。このレベルで、アクチ
ビン（Ａｃｔｉｖｉｎ、ＡＣＴ）はＰＥＣでＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１遺伝子発現を抑
制することなく、ＮＧＮ３発現を抑制することができた（図９Ｄ～Ｅを図９Ａ～Ｂと比較
する）。しかし、ステージ３の間により拡大縮小可能な細胞凝集懸濁培養で同じレベルの
アクチビンを使用したときは、全体の細胞量は大幅に減少し、一部の場合には、細胞凝集
体は消滅した（図１０の対照とアクチビン処置細胞凝集体を比較する）。５０ｎｇ／ｍＬ
と同様に２５ｎｇ／ｍＬのアクチビンについて細胞凝集体の類似の減少が観察された（デ
ータ示さず）。
これらの結果を考慮して、アクチビンのより低い濃度（例えば５ｎｇ／ｍＬおよび１０
ｎｇ／ｍＬ）をステージ３および４で試験した。図１１に示すように、より低いアクチビ
ン濃度で、細胞凝集体は、対照と比較して細胞の質量および収量を維持することができた
（８日目の図１１Ｂ～Ｃおよび１２日目の図１１Ｂ～Ｄを８日目および１２日目の図１１
Ａの対照と比較する）。したがって、約２５ｎｇ／ｍＬ未満のアクチビンレベルは、細胞
の質量および収量を維持するために許容される。ステージ３および４の間に低いレベルの
アクチビンが細胞凝集組成物に影響を及ぼしたかどうか判定するために、出願人は次にこ
れらの細胞培養でフローサイトメトリー分析を実施した。表１４を参照する。表１４は、
アクチビンの低いレベルは非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団の生成を減少させないこと、お
よび、処置をステージ３および４の両方で適用するときに、それはこの亜集団を実際に増
加させることができることを示す（表１４ Ａ５のＳｔｇ（ステージ）３＆４の結果を参
照する）。しかし、アクチビンの有り無しで見られる非常に類似した百分率の内分泌（Ｃ
ＨＧＡ＋）細胞を考えると、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞への分化がかなり
なお誘導されているようである（表１３内分泌の欄を参照）。したがって、ＱＰＣＲで観
察されるようにアクチビンはＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２発現を抑制または阻害すること
ができるが、より低いレベル（細胞質量の維持を可能にする）では、ステージ４の終わり
に分析するとき、それは内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した亜集団を低減しない。有利
には、特にアクチビンをステージ３および４で使用するときに、対照と比較してＰＤＸ１
だけおよび三重に陰性の亜集団が低減される。
Figure 2022017361000036
（実施例９）
アクチビン、ヘレグリンおよびＷＮＴは、ＰＥＣ培養で内分泌系列に傾倒した細胞の生
成を抑制する
実施例８は、ステージ３および４の間の中レベルのアクチビン（例えば、５０ｎｇ／ｍ
Ｌ）が、ＮＧＮ３発現を抑制または抑圧することができた（図９）が、これらの同じレベ
ルは細胞質量を維持しなかったことを示した。内分泌系列細胞（ＣＨＧＡ＋）の百分率は
、対照（表１４、ＣＨＧＡ＋の欄）および前の実施例に記載されるものに実質的に類似の
ままだったので、より低いレベルのアクチビン（例えば、５および１０ｎｇ／ｍＬ）は細
胞質量を維持することができた（図１１）が、ステージ４の間に内分泌の分化を抑圧し続
けるのに十分でなかった。したがって、ステージ４までのこの亜集団の分化の連続抑制が
なお必要であると思われるので、これらの低いレベルで主にステージ３の間に、内分泌系
列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞への分化を抑制することは十分でないようである。上記
Ｒｕｋｓｔａｌｉｓら（２００９）を参照する。したがって、同時に非内分泌多分化能膵
臓前駆体亜集団の生成に影響を及ぼさず、内分泌系列に傾倒した細胞（ＣＨＧＡ＋）の分
化を抑制しつつ、細胞の減少および収量を阻止することが可能である（すなわち、中から
高のアクチビンレベルの影響に対抗する）、さらなる成長因子を探索した。
ヘレグリンがステージ３および４の間に３０ｎｇ／ｍＬでＰＥＣの内分泌（ＣＨＧＡ＋
）および非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団の相対レベルをしばしば変化させることを記載す
る上の実施例を考慮して、出願人は、アクチビンと組み合わせたときにヘレグリンの濃度
の低減がＰＥＣ生成にどんな影響を及ぼす可能性があるのかについて試験した。
表８により標準プロトコルを使用して多能性幹細胞を分化させたが、ステージ３の間、
２ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬのヘレグリンと一緒にアクチビンが１０ｎｇ／ｍＬま
たは２０ｎｇ／ｍＬで含まれ；ステージ４の間には、アクチビンは５ｎｇ／ｍＬに低減さ
れ、ヘレグリンは１ｎｇ／ｍＬで２日間、その後１０ｎｇ／ｍＬであった。図１２（１０
日目の画像；上パネル）に示すように、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンおよび２ｎｇ／ｍＬ
のヘレグリンは対照と比較して細胞の多少の減少を示した（図１２ＡおよびＢを比較する
、上パネル）。ヘレグリンを同じ２ｎｇ／ｍＬのままにしてアクチビンを２０ｎｇ／ｍＬ
に増加させることは、細胞減少を悪化させた（図１２ＢおよびＣを比較する、上パネル）
。しかし、２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンの場面でヘレグリンを１０ｎｇ／ｍＬに増加させ
ることによって、アクチビンのより高い濃度（２０ｎｇ／ｍＬ）でのより高い細胞減少の
阻止が可能であった（図１２ＤおよびＣを比較する、上パネル）。したがって、ヘレグリ
ンレベルが低すぎる場合はかなりの細胞減少が観察されるが、ヘレグリンレベルを上昇さ
せると、例えば少なくとも２０ｎｇ／ｍＬでは、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）亜集団と比較
した非内分泌細胞（ＣＨＧＡ－）の百分率の変化がある。
アクチビンおよびヘレグリンの上の組合せで分化の８日目、１０日目および１２日目の
遺伝子発現の相対レベルを判定するために、定量的ＰＣＲ分析を実施した（図１３）。実
施例８（図９）に示すものと同様に、１０および２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンは、ＮＫＸ
６．１発現を減らすことなくＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２（別の内分泌分化マーカー）を
抑圧することが可能であった（図１３ＡおよびＢをＣのそれと比較する）。ＮＫＸ６．１
発現が高いままであるという事実は、非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団の生成が不変のまま
であるか影響を受けていないことを示す。しかし、具体的には、２０ｎｇ／ｍＬのアクチ
ビンおよび１０ｎｇ／ｍＬのヘレグリン、または１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンおよび２ｎ
ｇ／ｍＬのヘレグリンでは、アクチビンが２５ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬ（図１０
）で使用されたときに前に観察されたアクチビン依存性の細胞減少が非常に低減された（
図１２のＤとＥ、上パネル）。したがって、ヘレグリンは、ステージ３でのアクチビンの
使用によって当初観察された細胞減少を効果的に打ち消すようである。かつ、多少のＮＧ
Ｎ３およびＮＫＸ２．２誘導がなお起こるが（すなわち、実施例８、図９の接着ベースの
分化でステージ３および４で５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンが使用されたときに観察された
ほど強く抑圧されていない）、標準の条件と比較してそれはかなり低減されている（図１
３ＡおよびＢの対照条件（Ｃｏｎ）およびＡ２０Ｈ１０条件を比較する）。
２０ｎｇ／ｍＬを超えるアクチビンはマーカーＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２をさらに抑
圧し、したがってさらなる内分泌分化を抑圧するが、高い濃度のアクチビンの投与の影響
をオフセットするために細胞質量を維持するために、より高いレベルのヘレグリンが次に
必要とされよう。上の実施例で観察されるようなヘレグリンのさらにより高いレベルは、
ＰＥＣの内分泌（ＣＨＧＡ＋）および非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団の相対的な生成を変
化させることができる。さらに、ＮＧＮ３発現の抑圧に及ぼすアクチビンのより高いレベ
ルの影響がなお必要とされた。したがって、出願人は、前部および後部の内胚葉消長を実
行することができ、発達の他の態様を制御することができる、それらに限定されないがＷ
ＮＴ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、レチノイン酸（ＲＡまたはＴＴＮＰＢ）、ＢＭＰ、ｈｅｄｇｅ
ｈｏｇ、ＥＧＦ、ＩＧＦ等を含む、追加の成長因子またはモルフォゲンを探索した。
詳細には、ステージ３および／または４でアクチビンおよびヘレグリン分化培地にＷｎ
ｔ３Ａを加えることによって、正規のＷｎｔシグナル伝達経路に影響を及ぼすことを調査
した。再び、いかなる組合せも、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団に影響を及ぼさない
と同時に、ＮＧＮ３およびＮＫＸ２．２発現の抑圧を通して観察されるように内分泌系列
（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞の分化を抑制し、優れた細胞質量を維持する（すなわち、
細胞質量の限定的減少）必要がある。試験したそのような混合物の１つは、ステージ３で
の１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンおよび２ｎｇ／ｍＬのヘレグリンと一緒の５０ｎｇ／ｍＬ
のＷｎｔ；ならびに上のように、ステージ４の間の、５ｎｇ／ｍＬのアクチビンと１ｎｇ
／ｍＬのヘレグリンを二（２）日間、その後は５ｎｇ／ｍＬのアクチビンおよび１０ｎｇ
／ｍＬのヘレグリンであった。これは、同じ濃度のアクチビンおよびヘレグリンだけより
大きな細胞（ＰＥＣ）質量をもたらし（図１２ＤおよびＥを比較する、上パネル）、対照
よりさらに大きな細胞質量になった（図１２ＡおよびＥを比較する、上パネル）。これら
の条件（例えば、ステージ３でのアクチビン、ヘレグリンおよびＷｎｔの組合せ、ならび
にステージ４でのアクチビンおよびヘレグリン）の下での細胞凝集体のＱＰＣＲ分析は、
ステージ３および４、特に８日目、１０日目および１２日目のＮＧＮ３およびＮＫＸ２．
２発現の減少によって観察されるように（図１３ＡおよびＢ）、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋
）分化に傾倒した細胞の有意な抑制があることを示した。さらに、ＮＫＸ６．１発現は、
８日目に当初抑圧されたが、１０日目および１２日目（ステージ４）までに有意に上昇し
た（図１３Ｃ）。したがって、非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団の発達はＷｎｔの添加で損
なわれず、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞の分化は遅れるか抑制されるようで
あって、細胞質量の明らかな減少はなかった。
ステージ３の間、アクチビン、ヘレグリンおよびＷｎｔの組合せでＰＥＣ集団の細胞構
成を判定するために、ステージ４の後にフローサイトメトリーを実施し、ＰＥＣ細胞構成
を表１４に示す。示すように、組み合わせた成長因子（アクチビン、ヘレグリンおよびＷ
ｎｔ、または「ＡＨＷ」）は、標準プロトコルの下での対照細胞培養と比較して、その亜
集団の百分率の低下（１５．６対５８．８）によって観察されたように内分泌系列（ＣＨ
ＧＡ＋）に傾倒した細胞の分化を効果的に低減したが、非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団を
増加させた（５８．１対２３．４）（表８）。フローサイトメトリーからのデータは、３
つの因子（ＡＨＷ）の組合せが、非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団の生成に影響を及ぼすこ
となく、ＰＥＣの内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞の分化を一般に遅らすか抑制
した、ＱＰＣＲからのデータを支え、一貫している。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのこれらの遺伝
子の遅れた発現は、内分泌分化でのＮＧＮ３発現が、非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団での
ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１発現の開始の後に起こる、ｉｎ ｖｉｖｏでの哺乳動物の膵
臓発達でのそれらの開始（または遅れ）と一貫している。さらに、ＰＥＣ質量および収量
に障害はなかった。
Figure 2022017361000037
アクチビン、ヘレグリンおよびＷｎｔの組合せを使用した結果を考慮して、アクチビン
を使用することができる濃度範囲を確立するために、ステージ３でアクチビンレベルを再
び滴定した。試験したアクチビン濃度は、ステージ３の間、約０、２５、５０、７５およ
び１００ｎｇ／ｍＬで、Ｗｎｔは５０ｎｇ／ｍＬ、ヘレグリンは５ｎｇ／ｍＬであった。
ステージ４の間、アクチビンは５ｎｇ／ｍＬに、ヘレグリンは５ｎｇ／ｍＬに低減し、Ｗ
ｎｔは含まれなかった。ステージ４の終わり（１３日目）に細胞を画像化し、図１２に示
した（下パネル）。より高いアクチビン濃度、例えば７５～１００ｎｇ／ｍＬで、細胞減
少が再び明らかだった（図１２ＤとＥ、下パネル）。重要なことに、ステージ３でのＷＮ
Ｔの組入れは、さもなければ細胞減少のために可能であるよりステージ３で非常により高
い濃度のアクチビンの使用を可能にする。
ステージ３でのアクチビン、ヘレグリンおよびＷｎｔとの関連で、ステージ４の間の連
続したアクチビンおよびヘレグリンの影響を試験するために、下の３つの条件を使用して
ヒトＥＳＣを分化させた：（ｉ）標準プロトコル（表８を参照；または表１７のプロトコ
ル番号１）；（ｉｉ）ステージ３でアクチビン（７５ｎｇ／ｍＬ）、ヘレグリン（５ｎｇ
／ｍＬ）およびＷｎｔ（５０ｎｇ／ｍＬ）の組合せ、続いて標準のステージ４の因子；な
らびに（ｉｉｉ）ステージ３でアクチビン（７５ｎｇ／ｍＬ）、ヘレグリン（５ｎｇ／ｍ
Ｌ）およびＷｎｔ（５０ｎｇ／ｍＬ）の組合せ、続いてステージ４の間の追加のアクチビ
ン（５ｎｇ／ｍＬ）およびヘレグリン（５ｎｇ／ｍＬ）、表１７を参照する。全ての３つ
の条件のためにステージ４の後にフローサイトメトリーを実施し、ＰＥＣ細胞構成を表１
７に示す。ステージ３でのＡＨＷは、対照と比較して内分泌系列に傾倒した細胞を減少さ
せ、非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団含有量を増加させ（内分泌系列亜集団に関与する細胞
については２１．８対４２．２；非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団については４０．１対２
７．６）、ステージ４でのＡＨによる追加処置は、内分泌系列に傾倒した細胞をさらに減
少させ、非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団含有量をさらに増加させる（内分泌系列に傾倒し
た細胞については６．４６対２１．８；非内分泌（ＣＨＧＡ－）父親亜集団については７
２．７対４０．１）。
Figure 2022017361000038
（実施例１０）
アクチビン、ヘレグリンおよびＷＮＴの組合せを用いて生成されたＰＥＣ移植片は、ｉ
ｎ ｖｉｖｏでグルコース応答機能を向上させた
実施例９は、形態（例えば、分化細胞凝集体の低倍率鏡検像）、ＱＰＣＲおよびフロー
サイトメトリーデータに基づくと、アクチビン、ヘレグリンおよびＷｎｔの組合せ（「Ａ
ＨＷ」）が、同時に細胞質量または収量に有害作用を有しないか向上させずに、ＮＧＮ３
およびＮＫＸ２．２発現の抑圧によって観察されるように内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）分化
に傾倒した細胞を効果的に抑圧し、非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団を維持または増加させ
ることができるようであることを示した。これらの変化がグルコース応答性インスリン分
泌細胞の最終的な発達および成熟に影響を及ぼすかどうか判定するために、表８による標
準プロトコルまたは表１７のプロトコル番号１から作製されたＰＥＣと一緒に、ＡＨＷ導
出ＰＥＣ凝集体を動物に移植した。
具体的には、ステージ３で３つの因子（ＡＨＷ）の組合せ、次にステージ４でアクチビ
ンおよびヘレグリンだけを使用して、ヒト多能性幹細胞を分化させた。対照ＰＥＣは、実
質的に表８に従って作製した。図１４に示すように、８、１０、１２および１４日目に細
胞凝集体をＱＰＣＲによって分析した。ＮＫＸ６．１発現（図１４Ａ）によって観察され
るように対照（Ｃｏｎ）および改変ＡＨＷプロトコルの両方はＰＥＣを生成したが、１４
日目（ステージ４の後）にＡＨＷを使用するとより頑強なＮＫＸ６．１発現がある。同時
に、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞の分化は、対照プロトコルと比較して、特
に８日目にＮＧＮ３発現の抑圧によって観察されるようにＡＨＷプロトコルで高度に抑制
された（図１４Ｂ）。
分化の１４日目に両方の方法からのＰＥＣ凝集体を出願人が所有権を有する植込み型半
透過性封入デバイスに詰め、実質的に前述の通りにＳＣＩＤベージュマウスに移植した（
ＡＨＷおよび対照方法の各々のためにｎ＝５動物、合計ｎ＝１０）。移植から１１週間後
に、ＡＨＷプロトコルを用いて生成されたＰＥＣはグルコース投与から１時間（６０分）
後にＣペプチドが平均約９００ｐＭであったが、対照ＰＥＣはＣペプチドが平均４００ｐ
Ｍであった。ＡＨＷ動物を対照のそれと比較する図１５を参照。具体的には、移植から１
１週間後に、ＡＨＷ移植片を有する５匹のマウスのうちの３匹はヒトＣペプチドが平均１
２００ｐＭ以上（図１５、動物番号３５１４、３５１６および３５１８）であったが、対
照動物のＣペプチドのレベルは有意により低かった。実際、５匹の対照動物のうちのわず
か１匹が６００ｐＭ近くのレベルを有した（図１５、動物番号３５２４）。したがって、
Ｃペプチドレベルに基づくと、移植から１１週間後に、グルコース刺激の後のヒトＣペプ
チドのレベルによって測定したときに、ＡＨＷプロトコルはｉｎ ｖｉｖｏ機能が少なく
とも２倍向上したＰＥＣ集団を生成することができた。これは、より速い熟成時間と潜在
的に相関する。
移植の１４週間後に、ＡＨＷ ＰＥＣ移植片は対照の移植片に優る性能を示し続け、Ａ
ＨＷ ＰＥＣ移植片についてのグルコース投与の３０分後のＣペプチド値が、対照移植片
についての投与後６０分の値より高かったので、インスリン分泌応答時間はより速かった
（図１６）。具体的には、グルコース投与から６０分後であったが平均約２３００ｐＭで
あった上位３匹の対照動物と比較して、グルコース投与の３０分後に、ＡＨＷ ＰＥＣ移
植片を有する４匹の動物のうちの３匹は、Ｃペプチドが平均３５００ｐＭ以上であった（
図１６）。このデータは、３つの成長因子（ＡＨＷ）の組合せを使用する分化が、試験時
点で性能が優れている（つまり、移植されたＡＨＷ導出ＰＥＣ移植片からのより速いグル
コース応答性を示す、グルコース投与の３０分後の増加した血清Ｃペプチドレベル）か、
標準ＰＥＣプロトコルより潜在的に強力であるＰＥＣ集団を生成することが可能なことを
実証する。いかなる１つの理論にも本出願を限定することなく、ＡＨＷ ＰＥＣ移植片の
効力の増加は、ＡＨＷの組合せが（１）ＰＥＣで内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細
胞の分化を遅らせるか抑圧した、（２）ＰＥＣで非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団を増
加させた、および（３）優れた細胞質量を維持したという事実に帰されると考えられてい
る。
（実施例１１）
膵臓内分泌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養
実施例９および１０は、ステージ３および４での内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した
細胞の分化の故意の遅れ、抑圧、抑制または阻害を記載する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで発達が
進行した内分泌細胞先駆体または内分泌細胞を生成する努力の中で、出願人はステージ５
、６および／または７の間に様々な方法を試験した。例えば、出願人は、どの成長因子が
単独または併用で、内分泌の分化を刺激または誘導、すなわちＮＧＮ３発現を誘導するこ
とが可能であるかについて試験した。
下記の表１７は、ＰＥＣを生成する標準プロトコル（プロトコル番号１）およびＡＨＷ
ＰＥＣを生成するために使用されるプロトコル（プロトコル番号２）と一緒に、内分泌
生成のための様々な方法を要約する。しかし、表１７、プロトコル番号３は、特定の日お
よびステージでのいくつかの成長因子を示し、全ての成長因子を単独あるいは併用で、指
示される正確な日／ステージで使用する必要があるとは限らないことを、出願人は試験し
、当業者は理解する。したがって、表１７は、出願人によって試験された多くの繰り返し
（例えば成長因子、持続時間等）を表す。
Figure 2022017361000039
Figure 2022017361000040
Figure 2022017361000041
以前、２０１２年３月６日に発行された米国特許第８，１２９，１８２号、ＥＮＤＯＣ
ＲＩＮＥ ＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲ／ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ ＣＥＬＬＳ，ＰＡＮＣＲＥＡＴ
ＩＣ ＨＯＲＭＯＮＥ ＥＸＰＲＥＳＩＮＧ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ Ｏ
Ｆ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮにおいて、出願人は内分泌前駆体／先駆体の生成のためのガン
マセクレターゼ阻害剤の使用を開示した。‘１８２号の特許に記載され、請求されるよう
に、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞分化を内分泌系列にさらに誘導するために、Ｎｏｔｃｈ
シグナル伝達を阻害する成長因子または作用物質を解明した。これは、ガンマセクレター
ゼの阻害剤（例えば、ＤＡＰＴまたはＮ－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェンアセチル）
－Ｌ－アラニル］－Ｓ－フェニルグリシンｔ－ブチルエステルおよび関連類似体）の適用
によって達成された。ガンマセクレターゼ阻害剤は、Ｎｏｔｃｈ分子の膜内切断をブロッ
クし、それによって活性化されたＮｏｔｃｈ細胞内ドメインの放出を妨げる。ＮＧＮ３発
現を誘導するために、例えば、レチノイン酸添加の最終日またはレチノイン酸中止の直後
におけるガンマセクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴの２～４日間の適用が使用された。ここでは
、ステージ５において別のガンマセクレターゼ阻害剤ＲＯ４４９２９０９７が使用された
。表１７を参照。
表１７に示すように、内分泌系列への分化および／またはその成熟を推進するため、ス
テージ６および７の間、それらに限定されないが、ＢＭＰ４（「ＢＭＰ」）、Ｓｏｎｉｃ
Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（「ＳＨＨ」）、血小板由来成長因子（「ＰＤＧＦ」）、ＦＧＦ２（
「ＦＧＦ」）、レチノイン酸および／またはレチノイン酸類似体、例えばＴＴＮＰＢ（「
ＴＴＮＰＢ」）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ－Ｉまたは「ＩＧＦ１」）および－Ｉ
Ｉ（ＩＧＦ－ＩＩまたは「ＩＧＦ２」）、ビタミンＢ３誘導体、ニコチンアミド（「ＮＣ
」）またはこれらの成長因子の１つまたは複数の組合せを含む成長因子の組合せを適用し
た。そのような組合せの１つは、表１７プロトコル番号３に記載される。
例えば、実質的に実施例１０において上に記載のようにＡＨＷプロトコルから作製され
たＰＥＣは、表１７プロトコル番号３に従って、一般的に２日間、ステージ５（１３日目
および１４日目）において１μＭのガンマセクレターゼ阻害剤（ＲＯ４９２９０９７（「
Ｒ０１」）でさらに処置した。このステージ５の処置は、ＮＧＮ３発現の誘導およびその
後の内分泌分化をもたらす。さらに、ＮＧＮ３発現または内分泌分化を誘導するために、
ステージ５および６の間にニコチンアミドが含まれた。ＮＧＮ３遺伝子発現は、ステージ
４の後（１３日目の培養）、ステージ５の後（１５日目の培養）およびステージ６の２日
後に、ｍＲＮＡのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ検出によって分析した。図１７に示すように、ガ
ンマセクレターゼ阻害剤は、ステージ４の終わり（１３日目）のＮＧＮ３の低レベル発現
と比較して、１５日目のステージ５の後にＮＧＮ３発現を強く誘導した。１５日目（ステ
ージ６の初日）のガンマセクレターゼ阻害剤の除去の後、１７日目に観察されるようにＮ
ＧＮ３発現は減少する（図１７）。ステージ５の間のＮＧＮ３発現のこの一過性の増加は
、ｉｎ ｖｉｖｏでのベータ細胞発達の間に観察されるその一過性発現と一貫している。
上記Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら（２００７）を参照する。
ステージのいずれの全日数も変化させることができるし、実際変化し、例えばステージ
５、６および／または７は日数を短くすることができるか、長くすることができる。これ
は、より初期のステージ１、２、３および４にも同様に適用される。
さらに、細胞生存および細胞質量および収量を促進するために、ステージ１、２、３、
４、５、６および７のいずれかの間にｒｈｏキナーゼ阻害剤を連続的または断続的に分化
培地に加えてもよい。ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、例えばステージ１、２および４で、例え
ば細胞質量および収量の維持によって人工多能性幹細胞の分化を促進するようである。
さらに、約２０日目に（すなわち表１７のプロトコル番号３のステージ６と７の間の接
続部）、細胞凝集体を解離および再凝集させることができる。この解離および再凝集は特
定の細胞亜集団を取り除き、こうして主に内分泌および／または内分泌前駆体／先駆体／
前駆（ＣＨＧＡ＋）細胞集団を残した。この物理的操作は内分泌集団の分析も容易にし、
必要に応じて精製ステップを構成する。詳細については実施例１４を参照する。
さらに、ステージ６から開始してステージ７まで、必要に応じて、細胞凝集体を維持し
、および／または内分泌細胞が細胞凝集体から移動するのを防ぐのを助けるために、非常
に低い濃度、例えば約０．０５％のマトリゲルを使用してもよい。マトリゲルまたは任意
の他の複合細胞基質の使用は、特定の細胞凝集体自体（例えば下記のようにＰＥＣ凝集体
、内分泌前駆／先駆細胞凝集体等）、および潜在的には細胞凝集体が導出したＰＳＣ系に
依存してもよい。実質的に同様の機能を実行するために、他の複合基質または規定の基質
、例えば血清、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンおよび他の細胞外基質タンパク
質を使用することができる可能性がある。詳細については実施例１４を参照する。
ステージ６または７で、またはステージ６の間、例えば１６日目、１７日目または１８
日目から開始して、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）１および／または２（ＩＧＦ１また
はＩＧＦ２）を添加してもよい。表１７に従って実質的に上記のように多能性幹細胞を分
化させたが、ステージ６の間、特に１７日目に約３日間に、５０もしくは２００ｎｇ／ｍ
ＬのＩＧＦ１、または２５もしくは１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ２を細胞培養に加えた。ス
テージ６の後（２０日目）、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇを使用してｍＲＮＡについて細胞凝集
体を分析した。これらの予備研究は、ＩＧＦ２がＩＧＦ１よりＩＮＳ発現を誘導する能力
が高い（データ示さず）ことを示したが、より長い処置はＩＧＦ２だけまたはＩＧＦ１ま
たは２つの組合せからより頑強な影響を生成することができた。
表１７は特定の濃度での様々な成長因子の使用を記載するが、本発明は、本明細書に記
載される特定の濃度に限定されず、その理由は、成長因子濃度の改変は当技術分野で標準
であり、実際、少なくともアクチビンおよびヘレグリンレベルの変化ならびに細胞の分化
および構成に及ぼすそれらの影響により上の実施例に記載されていることを当業技術者が
認めるからである。本明細書の改変には、限定されずに、５、１０、２０、５０から１０
０ｎｇ／ｍＬのアクチビン；５、２５、５０から７５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ；２、５、１０
、３０ｎｇ／ｍＬのヘレグリン；１０から２００ｎｇ／ｍＬのｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈ
ｏｇ（ＳＨＨ）；１０から１００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ；１０から２０ｎｇ／ｍＬのＢＭ
Ｐ；２から２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２；ならびに２５から２００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１お
よび／またはＩＧＦ２が含まれる。さらに、これらの因子の組合せのいずれも使用するこ
とができ、それらが使用されるステージまたは期間は、記載される本発明から逸脱せずに
かなりの程度でさえ変化させることができる。
（実施例１２）
膵臓内分泌細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能
今日まで、ＰＳＣからｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された内分泌細胞の濃縮集団は、ｉｎ
ｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌ベータ細胞を生成していない。したがって、
出願人は、表１７による、上の実施例１１で記載される上の方法が、ｉｎ ｖｉｖｏでグ
ルコース応答性である最初のｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌細胞を生成することができるかどう
か試験した。
ステージ１～５について表１７のプロトコル番号３に従ってヒト多能性幹細胞を分化さ
せたが、ステージ６および７では、Ｂ－２７補助剤を有する基礎ＤＭＥＭ培地に加えてＦ
ＢＳ、マトリゲルおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤だけを使用した。ステージ５（ｄ１３）お
よび６（ｄ１５）の最初、ならびにステージ６（ｄ２０）および７（ｄ２６）の最後の時
点で、ＲＮＡ発現をＮａｎｏｓｔｒｉｎｇによって分析した。図１８Ａ～Ｄおよび１９Ａ
～Ｄは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＳＯＸ９およびＰＴＦ１Ａを含む非内分泌多分化能膵
臓前駆体亜集団マーカー、ならびにインスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ソマ
トスタチン（ＳＳＴ）およびグレリン（ＧＨＲＬ）を含む内分泌細胞マーカーの相対的な
ｍＲＮＡ発現レベルを示す。ステージ４の終わりに（１３日目）、ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、
ＮＫＸ６．１およびＰＴＦ１Ａは全て高度に発現された。内分泌の分化または誘導が起こ
るに従い（１５日目）、これらのマーカーは全てステージ５の間に低減する。さらに、ス
テージ６の終わり（２０日目）またはステージ７の開始までに、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１
およびＰＴＦ１ＡのｍＲＮＡレベルは減少していたが、同時にＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ
およびＳＳＴのｍＲＮＡレベルは増加していた（２０日目の図１８Ａ～Ｄおよび図１９Ａ
～Ｄを比較する）。具体的には、ステージ５および６を通してのＰＤＸ１およびＰＦＴ１
Ａ発現の減少、ならびにＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬおよびＳＳＴの相対的なｍＲＮＡ発現
の劇的な付随する増加は、ステージ３および４でのアクチビン、ヘレグリンおよびＷｎｔ
の組合せ（ＡＨＷ）、特にアクチビンに起因する。すなわち、ステージ３および４へのア
クチビンの組入れは、ステージ３および４で内分泌分化を抑圧したが、ステージ５でのガ
ンマセクレターゼはステージ５、６および７で内分泌分化を誘導した。示したより早い時
点と比較したときの２０日目および２６日目（ステージ６および７）のＮＫＸ６．１発現
の類似のレベルは、このマーカーが膵臓内分泌細胞ならびに非内分泌多分化能膵臓前駆体
亜集団で発現されることと一貫している。したがって、後のステージ（例えばステージ５
、６および７）では、細胞は内分泌分化の方に誘導されたが、より早いステージのステー
ジ３および４ではそれらは内分泌分化が抑制された。
ステージ６の後、細胞凝集体は解離され、再凝集されたが（下の実施例１４でさらに詳
細に記載される）、そのことは特定のＰＥＣ亜集団、例えば非内分泌（ＣＨＧＡ－）細胞
を含む、ステージ３および４の間に作製される一部の細胞型を除去した。非内分泌（ＣＨ
ＧＡ－）亜集団および／または外分泌および／または外分泌前駆細胞および／または管お
よび／または管前駆細胞の除去は、再凝集の後のＳＯＸ９およびＰＴＦ１Ａの劇的な減少
によって確かめることができる（図１８、２０日目と２６日目を比較する）。ステージ７
の後、２６日目に内分泌細胞をデバイスに詰め、実質的にＳＣＩＤベージュマウスへの移
植（または埋め込み）について前述の通りに、２７日目にＲＡＧ２マウスに移植した。図
２０は、絶食およびグルコース投与またはチャレンジから１時間（６０分）後の、血清中
のヒトＣペプチドレベルを示す。ヒト血清Ｃペプチドによって観察されるように、移植後
１０週時に、全ての５匹の動物はインスリンを生成していた。移植後１５週時に（図２１
）、移植後１０週時のレベルと比較して全ての動物はインスリン生成レベルの増加を示し
、５匹の動物のうちの２匹はＣペプチドが平均１５００ｐＭであって、それはｉｎ ｖｉ
ｖｏでの頑強なグルコース応答性の証拠である。
２６日目にデバイスに内分泌細胞を詰める前に、例えば、いかなる残りの非内分泌多分
化能膵臓前駆体亜集団からではなく、ステージ６および７からの移植内分泌細胞から機能
的ベータ細胞が発達し、成熟し、生じたことを検証するために、試料をとった。内分泌お
よび非内分泌マーカーの両方を使用する免疫細胞化学を、試料で実施した。ＤＡＰＩ（図
２２Ａ）、ＮＫＸ６．１およびクロモグラニンＡ（図２２Ｂ）を使用して、２６日目の試
料の凍結切片を抗体で同時染色した（図２２Ｂ）。大多数のＮＫＸ６．１陽性（赤色）細
胞は、内分泌マーカークロモグラニン（ＣＨＧＡ＋）に対しても陽性に染色されることは
明らかである。したがって、ＣＨＧＡ－／ＮＫＸ６．１＋細胞の欠如が示すように、非内
分泌多分化能膵臓前駆細胞は、これらの内分泌細胞調製物中にはいかなる有意な数でも存
在しないように見える。
これらの同じ内分泌細胞凝集体の試料も、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１につい
て同時染色した（図２３Ａ～Ｂ）。図２３Ａ～Ｂは、大部分のインスリン発現細胞もＮＫ
Ｘ６．１およびＰＤＸ１を発現することを示した。ＰＳＣからのｉｎ ｖｉｔｒｏ導出イ
ンスリン発現細胞の以前に公表された報告が、ＮＫＸ６．１および／またはＰＤＸ１を同
時発現しなかったことを考慮すると、これは意外な結果である。Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎおよびＪｉａｎｇら（２００７）への米国特許第７，０３３，８３１号およ
び関連出願、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｉｓ
ｌｅｔ－ｌｉｋｅ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓ
ｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００７ Ａｕｇ；２５（８）：１９４０
～５３頁を参照。Ｅｐｕｂ ２００７ Ｍａｙ １７。
総合すると、このデータは、初めて、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＳＣ導出内分泌細胞培養が
、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＮＳ、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を同時発現することが
でき、ｉｎ ｖｉｔｒｏでグルコース応答性のようであり；かつ（２）ｉｎ ｖｉｖｏで
グルコース応答性インスリン分泌細胞を生成することができるという動かぬ証拠を提供す
る。
（実施例１３）
レチノイン酸、ニコチンアミドおよびＢＭＰは、内分泌細胞でＰＤＸ１およびＮＫＸ６
．１の発現を増加させる
成熟したベータ細胞の特質は、ＰＥＣの非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団で見られるレベ
ルに対して、個々の細胞レベルでそれらがＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を上方制御すると
いうことである。実施例１１および１２は、大部分の細胞がＰＥＣの非内分泌（ＣＨＧＡ
－）亜集団で観察されるものに類似したＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１の発現レベルを有す
る、内分泌細胞生成を記載した。したがって、インスリン陽性の内分泌細胞で少なくとも
これらの２つのマーカーの発現を特異的に増強する成長因子を同定することが望ましい。
２つの候補因子には、ＴＴＮＰＢ、レチノイン酸またはレチノイド類似体、およびＢＭ
Ｐ４、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの一部である骨形成タンパク
質ファミリーのメンバーを含む。ＴＴＮＰＢおよびＢＭＰ４は、ステージ６および７で様
々な組合せで、および様々な濃度で試験されたが、一般的にはそれぞれ０．５ｎＭおよび
１０ｎｇ／ｍＬであった。図２４のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｍＲＮＡ分析によって示すよ
うに、ステージ６および７、もしくはステージ７だけでのＢＭＰ、またはＴＴＮＰＢと組
み合わせたＢＭＰは、インスリンおよびＰＤＸ１の発現を同時に増加させることができる
（図２４ＡとＣ）。対照的に、これらの同じステージ（ステージ６と７およびステージ７
だけ）での単独のＴＴＮＰＢは、単独のＢＭＰと比較してＰＤＸ１発現を増加させないよ
うであり、わずかにＰＤＸ１発現を減少させるようでさえある（図２４Ｃの４欄および５
欄を２欄および３欄と比較する）。全ての条件（ＢＭＰだけ、ＴＴＮＰＢだけ、ＢＭＰお
よびＴＴＮＰＢの組合せ、各処置はステージ６と７、またはステージ７だけ）下で、ＮＫ
Ｘ６．１発現は比較的安定しているので、ＮＫＸ６．１発現に及ぼすＢＭＰの影響は不明
瞭である。ＢＭＰ特異性のさらなる指標として、ＢＭＰは、ＢＭＰ４を含むＴＧＦ－βス
ーパーファミリーのメンバーによって調節されることが知られている分化阻害剤（ＩＤ）
遺伝子発現（例えば、ＩＤ１）を上方制御することも観察された（図２４Ｄ）。したがっ
て、いかなる１つの理論にも本出願を限定することなく、ＢＭＰはＰＤＸ１およびＩＤ１
の上方制御を選択的に誘導する因子のようである。
これらのマーカーのあるものが任意の１つの細胞で同時発現されたかどうか判定するた
めに、内分泌細胞凝集体を分化の２７日目（ステージ７の後）に固定し、凍結切片を調製
して、Ｃペプチド、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１のために免疫細胞化学（ＩＣＣ）によっ
て染色した。図２５～２８を参照する。ここでは、ＩＮＳによる染色の代わりに、細胞を
Ｃペプチド、プロインスリンの中央断片に対する抗体で染色し、したがって、この染色は
インスリン発現細胞の指標ともなる（図２５）。ＩＣＣの結果は上のＮａｎｏｓｔｒｉｎ
ｇのデータと一貫していた、すなわち、ステージ６および７、またはステージ７だけでの
単独の、またはＴＴＮＰＢと組み合わせたＢＭＰは、インスリン（Ｃペプチド）発現細胞
でＰＤＸ１発現を誘導することが可能であった（図２５および２６）。
ｍＲＮＡのデータが、単独または組み合わせたＢＭＰおよびＴＴＮＰＢがＮＫＸ６．１
発現にほとんど影響を及ぼさなかったことを示唆したという事実にもかかわらず、ＩＣＣ
研究は、細胞レベルにおいてＮＫＸ６．１およびＣペプチド（またはインスリン）発現細
胞の同時発現がかなり頑強であること（図２７および２８）、すなわち、ＮＫＸ６．１染
色が明るく、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団で観察されるものよりしばしば明るくも
あることを示した。したがって、ＮＫＸ６．１発現は、大部分Ｃペプチド（またはインス
リン）発現細胞と同時発現されるようである。合わせたｍＲＮＡ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ
）およびタンパク質（ＩＣＣ）データは、特定の場面では、細胞型を初期に特徴付けるた
めにただ１つの方法論を使用することに限界がある可能性も実証する。したがって、ＩＣ
Ｃデータは、ステージ６および７またはステージ７だけでの単独またはＴＴＮＰＢと組み
合わせたＢＭＰが、Ｃペプチド（またはインスリン）発現細胞でＰＤＸ１およびＮＫＸ６
．１のレベルを増加させることが可能であったことを実証した（図２７および２８）。２
つの因子を組み合わせて使用するときに最も強力な影響が観察されるが、ＢＭＰ単独でも
同じことが可能である。ＴＴＮＰＢも、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を独立して調節して
いる可能性がある。例えば、ステージ７の間でより少ない日数、例えば２、３または４日
間のＴＴＮＰＢ処置は、ＢＭＰの存在なしでＮＫＸ６．１の発現を誘導することができた
（データ示さず）。したがって、これらの成長因子の使用は、特にＴＴＮＰＢについては
、時間依存性である可能性がある。
特にニコチンアミドに関して、図２９は、ステージ６の培養条件でのニコチンアミドが
、ＩＮＳを増加させ、ＧＣＧ発現を減少させて、ＩＮＳ／ＧＣＧ発現比の３倍の増加をも
たらすことを示す。ニコチンアミドの機能は不明であるが、ＰＡＲＰ－１、ポリ（アデノ
シン三リン酸［ＡＤＰ］－リボース）ポリメラーゼ－１の阻害によって、およびＮＡＤ＋
消失を阻止することによって、ストレプトゾトシン処置から生じる齧歯動物でのベータ細
胞減少をニコチンアミドが阻止すると報告されている。Ｍａｓｉｅｌｌｏ、Ｐ．ら（１９
９８）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＮＩＤＤＭ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｎ
ｅｗ Ｍｏｄｅｌ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｒａｔｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ ａｎｄ Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４７（
２）：２２４～９頁を参照。ニコチンアミドは、ヒト胎児の島で内分泌の分化およびイン
スリン含有量を増加させることもできる。Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉ Ｔ．ら（１９９３）、Ｎ
ｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｆ
ｅｔａｌ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９２：１
４５９～１４６６頁を参照。
さらに、成熟したベータ細胞は高レベルのＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１をｉｎ ｖｉｖ
ｏで発現し、高レベルのＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１は適切な機能のために必要である。
したがって、ＢＭＰおよびＴＴＮＰＢと組み合わせたＢＭＰは、インスリン陽性細胞で両
方のマーカーの高い発現を誘導することによって、ｉｎ ｖｉｖｏだけでなく潜在的にｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでもグルコース応答性である内分泌細胞を作製することが可能であること
を初めて示す。
上記のように、ステージ６および７のための日数は厳格でなく、短くするか、または長
くすることさえでき、特に、本明細書に記載されるのと、および表１７によるのと実質的
に同じ成長因子を使用する場合には、それぞれステージ６および７のための５日間および
１０日間は容易に操作することができるので、当業技術者はこれを認識する。
（実施例１４）
マトリゲルは、単独でおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤と一緒に、ＰＥＣおよび内分泌細胞
凝集体の細胞接着を向上させる
上の実施例１１では、細胞凝集体は、ステージ６と７の間で解離および再凝集または再
結合された。実質的に上記Ｓｃｈｕｌｚらに記載されるように、解離は２０日目または２
０日目頃にＡｃｃｕｔａｓｅを使用して実施し、回転培養で再凝集させた。上記Ｋｅｌｌ
ｙら（２０１１）により詳細に記載されるように、再凝集は、特定のＰＥＣ亜集団、例え
ば任意の残りの非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団ならびに他の非内分泌細胞を取り除く。内
分泌細胞は互いに親和性を有するが、この相互作用はｉｎ ｖｉｔｒｏで比較的弱く、ス
テージ６／７での再凝集細胞でさえゆるく結合しているだけだった。したがって、内分泌
細胞凝集体の中で細胞間相互作用を増加させるそれらの能力について様々な因子および作
用物質を試験するための研究を実施した。
Ｙ－２７６３２、ｒｈｏキナーゼ阻害剤、および希釈マトリゲル（０．０５ｖ／ｖ％）
の添加は、再凝集内分泌細胞凝集体のよりタイトな細胞結合を促進することができること
が発見された。Ｙ－２７６３２とマトリゲルの組合せは、いずれかの構成要素単独より、
少なくとも例えば細胞凝集体の細胞間相互作用を増加させた。
２０日目に実質的に実施例１２に記載されているように生成された分化培養を、Ａｃｃ
ｕｔａｓｅで解離し、５％ＦＢＳ（ＦＢＳのより低い濃度、すなわち２％または１％も有
効である）およびＤＮアーゼによってｄｂで再凝集させた。Ｙ－２７６３２は再凝集培地
に含まれなかったが、その理由は、そうすることが新たに形成された凝集体への非内分泌
（ＣＨＧＡ－）亜集団ならびに他の非内分泌細胞の組込みをもたらすからである。次の日
とその後の毎日、細胞凝集体をＹ－２７６３２またはマトリゲルまたは両構成要素で処置
した。図３０に示す通り、凝集から１、２および３日後に立体顕微鏡画像をとった。図３
０は、マトリゲル、Ｙ－２７６３２およびｄｂ－ＦＢＳの組合せが最も有効だったことを
実証する。この組合せは、ｄｂ－ＦＢＳだけ、またはｄｂ－ＦＢＳおよびマトリゲル、ま
たはｄｂ－ＦＢＳおよびＹ－２７６３２の使用より有効であった（図３０Ａ～Ｄを比較す
る）。組み合わせた作用物質を使用した細胞凝集体は、全ての他の試料より形態学的にタ
イトであるようだった（図３０Ｄ）。作用物質が細胞間接触および細胞と基質の間の相互
作用を向上させる可能性があるが、ＦＢＳがなく、マトリゲルおよびＹ－２７６３２だけ
での後の実験は、同じ結果を提供した。これらのよりタイトな細胞凝集体は、形態学的に
より器官組織様に見える。これは有利であり、その結果、回転培養、デバイスへの詰め込
み、移植のための処理からくるストレスに細胞凝集体はより耐えることができ、向上した
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの発達ならびに成熟等を有する。
（実施例１５）
いかなるノギンも、限定的内分泌細胞含有量で、およびＰＥＣ集団の分別または精製の
必要なしに、非内分泌多分化能前駆体亜集団が濃縮されたＰＥＣを生成しない
上記のように、非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団（ＣＨＧＡ－）が高度に濃縮されて
いるが、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞が比較的豊富であるＰＥＣ集団（ステ
ージ４）の生成が望ましい。そのような細胞集団は、例えば、内分泌系列細胞へのそれら
の分化を特異的に誘導する分子または条件についてスクリーニングするのに有益である可
能性がある。この活性を有する化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの膵臓
ベータ細胞を含む内分泌細胞を生成するための再生医療適用に有益である可能性がある。
細胞死および他の理由のために、より複雑な細胞混合物からの特定の細胞集団の分別およ
び精製は効率の減少を伴うことが知られているので、効率的な誘導分化だけを通し、した
がって精製ステップを必要とせずに、所望の表現型のために高度に濃縮された細胞集団を
作製することができることが有益である。
実質的にステージ１～４のために表１７のプロトコル番号１で、および上記Ｓｃｈｕｌ
ｚら（２０１２）に上記の通りに、未分化ヒトＥＳＣを増殖、分化させたが、ステージ３
、４の三（３）日間に以下の異なる条件を比較した：（ｉ）全３日間に０ノギン（「ノギ
ンなし」）；（ｉｉ）５０ｎｇ／ｍＬのノギンを１日、および追加のノギンなしが２日間
；（ｉｉｉ）５０ｎｇ／ｍＬのノギンを２日、および追加のノギンなしが１日間；および
（ｉｖ）５０ｎｇ／ｍＬのノギンを３日間。ステージ３の後、これらの条件（ｉ）から（
ｉｖ）の各々は、追加のノギンのない、表８および表１７による標準のステージ４分化培
地カクテルを次に受けた。ステージ４の後のフローサイトメトリー分析は、ノギンなしが
、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞が５％未満の、９０％を超える非内分泌多分
化能膵臓前駆体亜集団を生成することを実証した。表１７を参照する。さらに、ノギン処
置の各追加日では、より少ない非内分泌多分化能膵臓前駆体亜集団が生成された（ノギン
なしの９０．６％と３日間のノギン処置の６４．６％を比較する）。反対に、ノギン処置
の各追加日は、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に傾倒した細胞の生成レベルを増加させた。
Figure 2022017361000042
ステージ４の後（１２日目）の細胞培養のＱＰＣＲ分析は、ノギン処置の各追加日で、
ＮＫＸ２．２およびＩＮＳを含む内分泌系列マーカー発現のレベルの増加があったことを
示し（図３１ＢおよびＤ）、そのことは表１８のフローサイトメトリーからのデータと一
貫している。対照的に、ＮＫＸ６．１（およびＰＤＸ１）を含む非内分泌多分化能膵臓前
駆体亜集団のためのマーカー遺伝子の発現レベルは、ノギン処置のいかなる期間でも比較
的豊富であった。
（実施例１６）
ステージ７で膵臓系列の遺伝子の発現をモジュレートする作用物質
次に、膵臓系列遺伝子の発現の何らかの追加のモジュレーターがあるかどうかについて
評価した。実施例１３および１４に記載されるものに実質的に類似の分化方法を実施した
（すなわち、ステージ３でＡＨＷ、ステージ４でＡＨ、ステージ５でガンマセクレターゼ
およびｒｈｏキナーゼ阻害剤、ステージ６および７でマトリゲルおよびｒｈｏキナーゼ阻
害剤）。さらに、ステージ７の間、３０～３５日目に、ＢＭＰ、ノギン、ＦＧＦ１、ＦＧ
Ｆ２、ＦＧＦ７、ＥＧＦ、Ｈｒｇ、ＨＧＦ、ＳＣＦまたはＴＴＮＰＢを含む他の作用物質
を、遺伝子発現をモジュレートするそれらの能力について試験した。延長ステージ７の終
わり（ｄ３５）に、ＲＮＡ発現をＮａｎｏｓｔｒｉｎｇによって分析した。図３２Ａ～Ｃ
は、ＢＭＰがＩＮＳ、ＰＤＸ１およびＩＤ１の発現を増加させることを示し、このことは
図２４に示し、実施例１３で詳述されるデータと一貫している。ＢＭＰは、ＧＨＲＬ発現
を減少させもした。ＦＧＦ１（酸性ＦＧＦ）は、ＧＣＧおよびＳＳＴを上方制御した。驚
くべきことに、ステージ７の３０～３５日目のＦＧＦ２はＳＳＴ発現の有意な増加をもた
らし、他のホルモン遺伝子の阻害または抑制が付随した（例えば、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨ
ＲＬ；図３２Ｂ、ＳＳＴパネル）。
これらの研究は、特定の作用物質が遺伝子発現を、したがって細胞培養分化およびその
結果としてのこれらのより分化した／傾倒した細胞の細胞型をなおモジュレートし、影響
を及ぼすことができることを実証する。
（実施例１７）
細胞培養の解離および再凝集は、非内分泌（ＣＨＧＡ－）を低減し、適切に特定化され
た内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団を増加させる
細胞培養の解離および再凝集は、再凝集するときに細胞の特定の亜集団の存在を効果的
に減少または低減することができ、結果として、再凝集は、細胞の特定の亜集団を濃縮す
るために使用することができることが前に記された。もしあるならば、それらの濃縮され
た亜集団、この場合には内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団を有する再凝集細胞培養の影響を判
定するように、研究が設計された（実施例１４を参照する）。
分化の方法は、ステージ７（ｄ２０）の前のｈＥＳ導出細胞凝集体の解離および再凝集
を含む実施例１４に記載されるものに実質的に類似していた。図３３Ａ～Ｃは、ＰＴＦ１
Ａ、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１を含むマーカーの組合せを使用したＮａｎｏ
ｓｔｒｉｎｇ分析によって実証されるように、再凝集細胞培養において非内分泌（ＣＨＧ
Ａ－）亜集団は有意に減少していた（図３３Ａ）ことを実証するステージ７後（約ｄ２９
）のＲＮＡ分析を示す。図３３Ｂは、再凝集が、ＩＮＳ、ＧＣＧ、膵臓ポリペプチド（Ｐ
ＰＹ）、ＧＨＲＬ、溶質担体ファミリー３０のメンバー８（ＳＬＣ３０Ａ８）、グルコー
ス－６－ホスファターゼ２（Ｇ６ＰＣ２）、ホルモン前駆体コンベルターゼ１（ＰＣＳＫ
１）およびグルコキナーゼ（ＧＣＫ）を含む内分泌および膵臓の島細胞マーカーの増加を
もたらしたことも示す。
単独で、これらのマーカーは他の細胞型で観察され、例えば、ＰＴＦ１Ａは外分泌細胞
、ＳＯＸ９は管細胞、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１はベータ細胞でも発現される。したが
って、出願人は、任意の１つのマーカー発現の有意性を判定する参照として、様々なＰＥ
、内分泌物および島マーカーからデータを得た。さらに、４つのＰＥおよび非内分泌（Ｃ
ＨＧＡ－）マーカーを分析した（ＰＴＦ１Ａ、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１）
が、ＰＴＦ１ＡおよびＳＯＸ９亜集団だけがステージ７の終わり（約ｄ２５、ｄ２６、ｄ
２７、ｄ２８、ｄ２９、ｄ３０およびそれ以上）の再凝集細胞培養から減少していた。対
照的に、ベータ細胞および膵臓内分泌物でも観察されるＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１発現
は、ステージ７の後にも高いままだった。図３３Ａを参照する。
同様に、ＳＬＣ３０Ａ８、Ｇ６ＰＣ２、ＰＣＳＫ１およびＧＣＫを含む他の内分泌（例
えばベータおよびアルファ細胞）マーカーが、解離および再凝集されなかった（または「
ｎｏ－ｒｅａｇｇ」）培養と比較してｄ２０再凝集細胞培養でより高い発現レベルで観察
された。図３３Ｃを参照する。例えば、ＳＬＣ３０Ａ８はインスリン分泌に関係がある亜
鉛輸送体であり、ＳＬ３０Ａ８の特定の対立遺伝子は２型糖尿病の発症の危険を増加させ
ることができ；グルコース－６－ホスファターゼ２（Ｇ６ＰＣ２）は膵島で見出される酵
素であり；ホルモン前駆体コンベルターゼ１（ＰＣＳＫ１）は、ＰＣＳＫ２とともに、膵
島でプロインスリンをプロセシングしてインスリンにし；最後に、グルコキナーゼ（ＧＣ
Ｋ）は、グルコース－６－リン酸へのグルコースのリン酸化を促進し、肝臓、膵臓、腸お
よび脳の細胞で発現され、それは、グルコースセンサーとして作用するか、食後または絶
食時に起こるようなグルコースレベルの上下に応答して代謝または細胞機能のシフトを誘
発することによって、炭水化物代謝を調節する。ＧＣＫの突然変異は、糖尿病または低血
糖の異常な形を引き起こすことができる。ステージ７でのこれらのマーカーの発現の増加
は、細胞培養の解離および再再凝集が非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団を効果的に減少また
は低減させ、内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団を増加させることを示す。したがって、出願人
は今や、ｉｎ ｖｉｖｏ機能のためにｉｎ ｖｉｔｒｏで適切に特定化された内分泌細胞
を生成する方法をさらに洗練した。
ステージ１～７細胞培養のフローサイトメトリー分析は、上のような細胞培養の解離お
よび再凝集が、全内分泌亜集団を増加させ（ＣＨＧＡ＋細胞の濃縮）、細胞の非内分泌（
ＣＨＧＡ－）亜集団またはＰＥ亜集団が付随して減少することも確認する。下記の表１９
を参照する。
Figure 2022017361000043
今日まで、機能的ベータ細胞はｉｎ ｖｉｖｏ移植ステップを通して分化することがで
きるだけであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで完全な真実の機能的ベータ細胞はまだ記載されてい
ない。Ｚｈｏｕら（２００８）、Ｎａｔｕｒｅ ４５５、６２７～６３２頁を参照する。
したがって、初めて、出願人は１０％未満の非内分泌細胞（ＣＨＩＧＡ－）を有し、適切
に特定化された、内分泌細胞（ＣＨＧＡ＋）の５０％を超えるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞集団
を実証した。さらに、そのような細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで真実の機能的ベータ細胞およ
び島に発達および成熟することができる；下記の実施例１８を参照する。
（実施例１８）
内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団からのｉｎ ｖｉｖｏインスリン生成
実施例１７への後続研究として、もしあるならば、それらの濃縮された内分泌（ＣＨＧ
Ａ＋）亜集団を有する再凝集細胞培養のｉｎ ｖｉｖｏ影響を判定するように、研究が設
計された。
上の実施例１２～１４および１６と上記Ｓｃｈｕｌｚら（２０１２）に記載のものと実
質的に同様に、ヒト多能性幹細胞培養を増殖、分化させたが、ステージ７の開始の頃（約
ｄ２０）に、培養をプールして、以下の２つの試料に分けた：１）細胞凝集体を解離し、
再凝集させた（「再凝集細胞培養」）；および２）解離されず、再凝集しなかった細胞凝
集体（対照）。さらに、ステージ７の間に、両方の試料はＢＭＰ、ＲＡまたはＲＡ類似体
、ＴＴＮＰＢ、およびｒｈｏキナーゼ阻害剤および０．０５％マトリゲルをさらに含んだ
（ｄ２０からｄ２８の細胞培養）。試料を移植する前に、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇおよびフ
ローサイトメトリー分析のための試料をとった（上の表１９）。表１９は、ｄ２９の頃の
再凝集細胞培養は、対照より約１１％多くの内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団を含有したこと
を示す。重要なことに、再凝集試料は、再凝集しなかった試料より９．２５％少ない非内
分泌物（ＣＨＧＡ－）またはＰＥ型の細胞（わずか１．４５％）を含有した。
出願人の半透性で生体適合性のＥＮＣＡＰＴＲＡ（登録商標）ＥＮ２０（商標）薬物送
達デバイス（動物サイズ調査デバイス）に２つの試料を別々に詰め、封入し、実質的に上
の実施例１０に記載されているように、合計１０匹のＳＣＩＤベージュマウス（５匹の動
物は再凝集細胞培養を受け；５匹の動物は対照の細胞培養を受けた）に対して皮下に移植
した。
図３４は、移植から２１週後、または生存中の、絶食後（各動物について左から３本の
棒の最初）、グルコース投与またはチャレンジの３０分後（３０分；２番目の棒）および
１時間後（６０分；３番目の棒）の血清中のヒトＣペプチドレベルを示す。移植から２１
週後、２匹の動物（動物番号４３１７および４３２３；各コホートから１匹）以外の全動
物は、大部分は９３２から２６９１ｐＭを超えるヒト血清Ｃペプチドによって観察される
ように、頑強なレベルのインスリンを生成した。しかし、２つの群の間で刺激指数を比較
したとき（絶食血清中Ｃペプチドレベルでのそれに対する３０分または６０分のＣペプチ
ド血清中レベルの差）、再凝集細胞培養と対照コホートの間にｉｎ ｖｉｖｏ機能の有意
な差はなかった。したがって、移植された培養または移植片が約９８％の内分泌／ＣＨＧ
Ａ＋再凝集細胞培養または約８７％の内分泌／ＣＨＧＡ＋（対照）からなったかどうかに
かかわらず、両方ともｉｎ ｖｉｖｏ機能を有するようである。したがって、出願人は初
めて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞集団（適切に特定化された内分泌細胞
）は、移植したときに生理的に機能的なインスリン分泌細胞を生成することができること
を実証した。
したがって、出願人は初めて、適切に特定化された内分泌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ集団
は、移植したときに、血中グルコースに応答してインスリンを分泌する機能的膵島細胞に
発達および成熟することを実証した。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ機能は、ＰＥＣについて出
願人によって前に記載され、上記Ｓｃｈｕｌｚら（２０１２）で報告されたものに類似し
ている。さらに、適切に特定化された内分泌細胞がステージ１～７を通して本明細書に記
載される方法によって作製される限り、解離および再凝集による内分泌細胞の追加の濃縮
（または非内分泌細胞の消失）はｉｎ ｖｉｖｏ機能のために不要であるか必要とされな
いようである。本発明のこれらの態様は、これまで実証されていない。これまで、出願人
他は、膵臓前駆体集団細胞集団を使用し、内分泌細胞集団なしでｉｎ ｖｉｖｏ機能を実
証しただけであった。実際、上記Ｋｅｌｌｙら（２０１１）に記載されるように、ＰＥＣ
の内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団または膵臓の前駆体調製物はｉｎ ｖｉｖｏ機能を生成し
なかった。
（実施例１９）
内分泌細胞を培養するための錯塩基培地
ＣＭＲＬおよびＲＭＰＩなどの錯塩基培地は、島細胞を培養し、島細胞質量を保存する
ために広く使用されている。ＣＭＲＬ培地は、ＲＰＭＩより一般的により複雑（より多く
の構成要素または成分）である。さらに、ＣＭＲＬおよびＲＭＰＩの両方は、細胞培養の
ために通常使用され、より複雑でない培地であるＤＭＥＭより複雑である。したがって、
出願人は、そのような錯塩基培地が分化の後期、例えばステージ６および７の間に内分泌
細胞を維持するのに有益となるのかどうかについて調査した。
島移植は、十分な島細胞質量および最小限の毒性での島の培養および移植を必要とする
。短期の島培養は、急速な劣化、ならびに生存力およびグルコース制御の減少と関連付け
られている。Ｓ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら（２００３）、Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅ
ｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｈｏｒ
ｔ－ｔｅｒｍ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ（＜２４ｈｒ．）ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｓｌｅｔ
ｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｄｍｏｎｔｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ、Ｃ
ｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋｉｎｇ、４、８５頁；およびＮ．Ｊ．Ｍ．Ｌｏｎｄｏｎ
ら（１９９８）、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｓｌｅｔｓ ｏｆ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ、Ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２３、２００～２０７頁を参照。１９７８年に、
Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら（１９７８）による研究は、マウスの島を培養するための、ＴＣＭ
、ＲＰＭＩ、ＣＭＲＬ、ＤＭＥＭおよびＨａｍｓ Ｆ１０の有効性を比較した。Ａｎｄｅ
ｒｓｓｏｎ Ａ．（１９７８）Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ
ｉｓｌｅｔｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｄ
ｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｐｒ
ｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｌｅｔｓ、Ｄｉａｂｅｔｅｌｏｇｉａ、１４、３
９７～４０４頁を参照。Ａｎｄｅｒｓｓｏｎの結果は、ＨａｍのＦ１０は島培養に最大の
インスリン含有量を提供したが、ＲＭＰＩは培養に最良のインスリン生合成速度を提供し
；これはおそらく培地中の高いグルコースおよびニコチンアミドに起因したことを示した
。Ｄａｖａｌｌｉら（１９９２）などのさらに他の研究者は、ブタの島を培養するために
は、アデノシンリン酸およびキサンチンを有するＴＣＭがＣＭＲＬおよびＲＭＰＩより優
れていたことを示した。Ｄａｖａｌｌｉ，Ａ．Ｍ．ら（１９９２）、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｐｉｇ ｉｓｌｅｔｓ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃ
ｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｄｉａ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏ
ｎ、６０、８５４～８６０頁を参照。Ｄａｖａｌｉｉらは、ＨａｍのＦ１０およびＲＭＰ
Ｉで見出された高いグルコースは、ブタの島におそらく毒性であることをさらに示唆した
。したがって、異なる種からの島は異なる培養必要条件を有する可能性があり、全ての内
分泌および島細胞に適する１つの処方があるとは限らない。上記Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ（１
９７８）、４頁を参照する。
下の表２０は、ＣＭＲＬ、ＲＰＭＩおよびＤＭＥＭ培地で見出される、各培地タイプの
間で異なる構成要素だけを記載し、すなわち、表２０は、塩基培地の全ての３つのタイプ
で共有される構成要素を掲載しないが、ＣＭＲＬに含有されるがＲＰＭＩおよび／または
ＤＭＥＭに含有されない構成要素だけを掲載する。表２０は、ＣＭＲＬが最も複雑（最大
数の構成要素）であり、ＤＭＥＭが最も複雑でない（最少数の構成要素）であることを示
す。Ｙは、その塩基培地でのその構成要素の存在を示し；Ｎは、その構成要素が培地に存
在しないことを示す。手短に言えば、ＤＭＥＭは、ＣＭＲＬおよびＲＰＭＩに存在する約
７つの構成要素（Ｎ、陰影のついたボックス）を欠いている。
Figure 2022017361000044
内分泌細胞培養を作製する方法は、上記のものに実質的に類似していたが、ステージ６
（ｄ１５）、または中間ステージ７（ｄ２３）、または中間ステージ７（ｄ２６）、また
はステージ６および７（ｄ１５からｄ２５）の間は、ＤＭＥＭまたはＣＭＲＬ塩基培地を
使用した。さらに、一部の培養は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ニコチンアミド（
ＮＣ）、グルコース（Ｇｌｃ）および／またはｒｈｏキナーゼ阻害剤（Ｙ－２７６３２）
を受けた。
１つの実験では、ｄ２３頃に始まるステージ７細胞を、Ｂ２７補助剤、マトリゲル、Ｂ
ＭＰ、ＩＧＦおよびＹ－２７６３２を有するＣＭＲＬまたはＤＭＥＭ塩基培地で培養した
。ｄ２６（ステージ７）試料のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析は、一般に、ＣＭＲＬで培養し
たステージ７細胞は、ＤＭＥＭで培養したときの同じステージの細胞と比較して、ホルモ
ンおよび膵臓内分泌マーカーの非特異的遺伝子発現を増加させたことを示した。図３５Ａ
～Ｃを参照する。したがって、ＣＭＲＬは内分泌細胞の維持にとって重要である可能性が
ある。
ＤＭＥＭおよびＣＭＲＬをベースとした培地と比較してＲＰＭＩを使用して、対応する
研究も実施した（データ示さず）。ＣＭＲＬおよびＲＭＰＩ培地は細胞培養に類似の影響
を及ぼし、両方ともＤＭＥＭのそれより向上しており、したがって、還元グルタチオン、
アミノ酸、ヒドロキシル－Ｌ－プロリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グル
タミン酸およびビタミン、ビオチンおよびｐ－アミノ安息香酸を含む、ＤＭＥＭに存在せ
ずにＣＭＲＬおよびＲＰＭＩの両方に存在する構成要素（複数可）が、ステージ６および
／または７の間の内分泌細胞の維持にとって重要である可能性がある。
（実施例２０）
凍結保存は、内分泌細胞数を低減しない
商業的に存続可能な細胞療法は、細胞生成物のスケールアップ製造、およびオンデマン
ドの患者ニーズのために生成物を長期保存するための手段を必要とする。したがって、そ
れが単独の細胞単独であれ封入細胞、例えばＥＮＣＡＰＴＲＡ（登録商標）薬物送達デバ
イスであれ、いかなる細胞生成物も低温保存が必要であるか、細胞に有害または毒性の影
響がなく、かつ、細胞の治療効果、またはこの場合、血中グルコースに応答するインスリ
ンのｉｎ ｖｉｖｏ生成に影響を及ぼすことのない、長期保管のための他の手段が必要で
あろう。したがって、２０１２年１０月２日および２０１３年４月２３日にそれぞれ発行
された、両方ともＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ ＣＥＬＬ
Ｓ ＤＥＲＩＶＥＤ ＦＲＯＭ ＨＵＭＡＮ ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ ＳＴＥＭ ＣＥ
ＬＬＳという表題の出願人の米国特許第８，２７８，１０６号および第８，４２５，９２
８号；ならびに２０１３年３月７日に出願の米国出願第６１／７７５，４８０号、表題Ｃ
ＲＹＯＰＲＥＳＥＲＶＡＴＩＯＮ，ＨＩＢＥＲＮＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＲＯＯＭ ＴＥＲ
ＭＰＥＲＡＴＵＲＥ ＳＴＯＲＡＧＥ ＯＦ ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＥＤ ＰＡＮＣＲＥ
ＡＴＩＣ ＥＮＤＯＤＥＲＭ ＣＥＬＬ ＡＧＧＲＥＧＡＴＥＳ、およびＫｒｏｏｎら（
２００８）で詳述されるように、新鮮な（非低温保存）、および低温保存されたＰＥＣで
観察されるものと同様にｉｎ ｖｉｖｏで発達および機能するそれらの能力を、低温保存
されたステージ７内分泌細胞が維持するかどうかを出願人は調査した。
内分泌細胞培養を作製する方法は上記のものに実質的に類似していたが、ステージ７の
間、細胞培養は全てＣＭＲＬをベースとした培地中にあり、以下の試料に分割した：１）
解離、再凝集されないが、２３日目頃に数時間低温保存され、その後解凍され、Ｂ２７補
助剤、ＢＭＰ、ＴＴＮＰＢおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤を有するＣＭＲＬ塩基培地で数日
間培養した（ｒｅ－ａｇｇなし／低温保存された）；２）解離、再凝集されず、低温保存
されない（ｒｅａｇｇなし／低温保存なし）；３）解離、再凝集され、低温保存されない
（Ｒｅ－ａｇｇ／低温保存なし）。上の全ての３つの試料は、同じステージ７培地条件で
培養した。２７日目に、試料をフローサイトメトリーによって分析した。下の表２１を参
照する。
Figure 2022017361000045
表２１のフローサイトメトリー分析に基づいて、解離、再凝集されなかった培養（試料
１および２）については、細胞の低温保存（試料２）は、新鮮な細胞（試料１）と比較し
て内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞の総数を低減しない（８８．５７対８９．９７）。予想通り
に、全内分泌（ＣＨＧＡ＋）集団は、解離、再凝集され、低温保存されていない培養でよ
り高い（９２．８５）。したがって、上の実施例１７に記載のように解離、再凝集は内分
泌細胞（ＣＨＧＡ＋）数に影響を及ぼすが、ステージ７培養の低温保存は、細胞構成を変
化させないようである。
さらに、細胞免疫組織化学を使用して、試料をＮＫＸ６．１、Ｃペプチド、ＩＮＳおよ
びＧＣＧ染色で分析した。図３６Ａ～Ｂを参照する。ステージ７からの内分泌（ＣＨＧＡ
＋）細胞凝集体（ｒｅ－ａｇｇなし／低温保存なし；試料２）は、ＮＫＸ６．１（核）お
よびＣペプチド（細胞質）同時発現または同時染色を示した（図３６Ａ～Ｃ）。同時染色
は、ステージ４分化プロトコルからのＰＥＣの類似した分析で観察されなかった。ＩＮＳ
（３６Ａ；細胞質）およびＧＣＧ（３６Ｂ；細胞質）細胞の別々の染色を示す図３６Ａ～
Ｃで分かるように、ステージ７からの細胞培養も主に単一ホルモン性であり、すなわち、
ステージ４からのＰＥＣの内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団で見られるように、大部分の個々
の細胞はＩＮＳおよびＧＣＧを同時発現しなかった。図３７は、類似の染色パターンを有
するが、ステージ７の開始時に解離、再凝集された細胞培養からの、顕微鏡写真を示す。
図３７は、上の表２０の細胞培養１および３からの移植片機能を比較する。１２週時の
両コホートの動物の移植されたステージ７移植片のｉｎ ｖｉｖｏ機能の分析は、低温保
存されたが再凝集されなかった培養（試料１）が、低温保存されなかったが再凝集された
培養（試料３）と比較して、グルコース投与の３０および６０分後に類似の血清中Ｃペプ
チドレベルを有することを示した。これらのＣペプチドレベルは、図２０および２１の１
０週目および１５週目で観察されるものと同等である（例えば１５週時には、グルコース
投与の６０分後の平均Ｃペプチドレベルは９９５ｐＭであった）。したがって、後の分析
が、大部分の動物では、実施例１８に記載され、図３４で観察されるものと同様に、グル
コース刺激から３０分および／または６０分後に、Ｃペプチドレベルが約１０００ｐＭま
で増加することを示すことが予想され、予期される。実際、動物番号４４９０、試料１移
植片は、移植後２１週時の実施例１８の動物番号４３２０（図３４）と同等だった血清Ｃ
ペプチドレベルを１２週時に有していた。
したがって、ステージ７内分泌細胞の低温保存は、それらのｉｎ ｖｉｖｏ機能に影響
を及ぼさないようである。
（実施例２１）
グルコース濃度を増加させることは、ホルモン発現に影響を及ぼす
細胞培養製剤中のグルコースレベルは、１ｇ／Ｌ（５．５ｍＭ）から１０ｇ／Ｌ（５５
ｍＭ）であり、一部の培地はｉｎ ｖｉｖｏの正常な血糖レベルに近似する約５．５ｍＭ
グルコースを有する。１０ｍＭに近づくグルコースレベルは前糖尿病レベルであり、１０
ｍＭを上回るレベルは糖尿病状態に類似している。換言すると、１０ｍＭを上回るグルコ
ースはｉｎ ｖｉｖｏ高血糖状態を模倣する。高グルコースは、例えば、グリケーション
、糖酸化（glyoxidation）およびカルボニルストレスを含む翻訳後の二次改変を引き起こ
すことができる。異なる細胞型にｉｎ ｖｉｔｒｏで及ぼす高グルコースの影響に関する
報告は様々であるので、出願人はステージ６および／または７の内分泌細胞に及ぼす高グ
ルコース（すなわち４．５ｇ／Ｌまたは２４．９８ｍＭグルコース）の影響を研究しよう
と努めた。
グルコースは、以下を含む全ての細胞培養培地に加えられる可溶性ヘキソース糖である
；エイムス培地、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）；ＢＧＪｂ培地フィットン－ジャクソン改
変；クリック培地；ＣＭＲＬ－１０６６培地；ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ
）；ＤＭＥＭ／Ｈａｍの栄養素混合液Ｆ－１２（５０：５０）；Ｆ－１２クーン改変；フ
ィッシャー培地；Ｈ－Ｙ培地（Ｈｙｂｒｉ－Ｍａｘ（登録商標））；イスコフの改変ダル
ベッコ培地（ＩＭＤＭ）；マッコイの５Ａ改変培地；ＭＣＤＢ培地；培地１９９；最少必
須培地イーグル（ＥＭＥＭ）；ＮＣＴＣ培地；栄養素混合液、ＨａｍのＦ－１０；栄養素
混合液、ＨａｍのＦ－１２；栄養素混合液ＨａｍのＦ－１２カインの改変（Ｆ１２Ｋ）；
ＲＰＭＩ－１６４０；無血清／無タンパク質ハイブリドーマ培地；ウェイマウス培地ＭＢ
；ウィリアムズ培地Ｅおよび様々な所有権付きの培地。Ｌ－１５培地は、グルコースの代
わりにガラクトースを含有する。ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉ
ｅｎｃｅ／ｃｅｌｌ－ｃｕｌｔｕｒｅ／ｌｅａｒｎｉｎｇ－ｃｅｎｔｅｒ／ｍｅｄｉａ－
ｅｘｐｅｒｔ／ｇｌｕｃｏｓｅ．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブで入手できるＳｉｇｍ
ａ－ＡｌｄｒｉｃｈＭｅｄｉａＥｘｐｅｒｔを参照。
１０ｍＭを超えるレベルのグルコース補給を含有する培地には、少なくとも以下が含ま
れる：ＤＭＥＭ／Ｈａｍの栄養素混合液Ｆ－１２（５０：５０）は１７．５ｍＭのグルコ
ースを含有する；ＤＭＥＭ（高グルコース）、ＧＭＥＭおよびＩＭＤＭは全て２５ｍＭレ
ベルのグルコースを含有する；Ｈ－Ｙ培地（Ｈｙｂｒｉ－Ｍａｘ（登録商標））および無
血清／無タンパク質ハイブリドーマ培地はそれぞれ２２．６および２８．９ｍＭのグルコ
ースを含有する。ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｅ
ｌｌ－ｃｕｌｔｕｒｅ／ｌｅａｒｎｉｎｇ－ｃｅｎｔｅｒ／ｍｅｄｉａ－ｅｘｐｅｒｔ／
ｇｌｕｃｏｓｅ．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブで入手できるＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉ
ｃｈＭｅｄｉａＥｘｐｅｒｔを参照。異なる細胞培養培地は広く異なるレベルのグルコー
スを含有し、グルコースの影響は一般に培養系の間で異なるので、内分泌細胞に及ぼす高
グルコースの影響を研究した。
再び、内分泌細胞培養を作製する方法は、上記のものに実質的に類似していたが、ステ
ージ６および／または７の間に、細胞培養を外因性の高グルコース（総グルコース濃度４
．５ｇ／Ｌまたは２５ｍＭ）の有る無しのＣＭＲＬ塩基培地で処置した。したがって、こ
れは、ＣＭＲＬ培地に既に見出される１０００ｍｇ／Ｌまたは１ｇ／Ｌ（５．５ｍＭ）の
グルコースにさらに加えた３．５ｇ／Ｌである。外因性グルコースの有る無しの両条件を
、ニコチンアミド、ＢＭＰ、ＲＡ（またはＴＴＮＰＢ）、あるいはｒｈｏキナーゼ阻害剤
およびマトリゲルを含む同じ成長因子で処置した。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析は、ステー
ジ６の開始時に高グルコースを加えたとき、ステージ６の終わりまでに、ＩＮＳ、ＧＣＧ
およびＳＳＴの発現増加、およびＧＨＲＬの発現の減少があったことを示した（図３９Ａ
およびＢ）。したがって、ステージ６および７の間の外因性グルコースの増加は、グレリ
ンを除いてホルモン発現を増加させる。
（実施例２２）
未熟なベータ細胞の生成
実施例８～２１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの内分泌細胞の生成のための、ステージ３での
単独またはＷｎｔおよび／またはヘレグリンと組み合わせた高アクチビン；ステージ４で
の単独またはヘレグリンと組み合わせた低アクチビン；ステージ５でのＫＧＦ、ＥＧＦお
よびｒｈｏキナーゼ阻害剤の有る無しのノギンおよびガンマセクレターゼ阻害剤；ならび
にステージ６～７での以下のニコチンアミド、レチノイン酸、ＢＭＰおよびマトリゲルの
１つまたは複数の使用を含む、様々な反復法を記載する。そのような方法から生成される
内分泌細胞集団は、単一ホルモン性（例えば、ＩＮＳだけ、ＧＣＧだけまたはＳＳＴだけ
；図３９を参照する）であるだけでなく、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ１を含む他の未熟な
内分泌細胞マーカーを同時発現する。
ＩＮＳ、ＳＳＴおよびＧＣＧホルモン染色を使用して、２つの異なるステージ７培養で
フローサイトメトリー分析を実施した（データセットＡおよびデータセットＢ）。ステー
ジ１～７の多くの繰り返しを検討した後に、データ（Ａ）の１セットを実施し、より早い
時期に、例えばニコチンアミド、ＢＭＰ、ＣＭＲＬ等の不在下で、データ（Ｂ）の他のセ
ットを実施した。下記の表２２を参照する。表２２は、ＩＮＳ、ＳＳＴおよびＧＣＧ陽性
染色（５つの左の欄を参照）、全ＩＮＳ、ＳＳＴおよびＧＣＧ陰性染色（５つの右の欄を
参照）および単一ホルモン染色（中央の欄を参照）の全体の百分率を示す。これらの２つ
のデータセット（ＡおよびＢ）からのホルモン染色を、約２６日目まで培養で維持されて
いたステージ４のＰＥＣ培養から得られたものと比較する。
Figure 2022017361000046
一般に、全ＩＮＳ陽性亜集団（単独ＩＮＳ陽性プラスＩＮＳ／ＳＳＴ同時陽性プラスＩ
ＮＳ／ＧＣＧ同時陽性プラスＩＮＳ／ＳＳＴ／ＧＣＧ同時陽性の合計）は、ステージ４の
ＰＥＣ培養よりステージ７の内分泌培養で３倍大きい（４９．３対２２．７対１５．８）
。したがって、全ＩＮＳ単独（ＳＳＴまたはＧＣＧとの同時発現のない）亜集団も、ステ
ージ４のＰＥＣ培養よりステージ７の内分泌培養でより高い（２２．７対１２．９対３．
７）。重要なことに、ステージ７培養は、ステージ４のＰＥＣ培養（３．７／１５．８＝
２３％）と比較した全ＩＮＳ集団（Ａでは２２．７／４９．３＝４６％、Ｂでは１２．７
／２２．７＝約５７％）の百分率として、より多くの単一ホルモン発現ＩＮＳ細胞を有す
る。したがって、ステージ７の内分泌細胞培養は、ステージ４のＰＥＣ培養より、より多
くの単一ホルモン発現細胞、特にＩＮＳ単独発現細胞からなるようである。さらに、少な
くとも実施例１８および２０は、なお未熟であるステージ７内分泌細胞は、移植したとき
に、血中グルコースに応答してインスリンを分泌することが可能な生理的に機能的な膵島
に発達および成熟するが、ステージ４のＰＥＣ培養の内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団は、ｉ
ｎ ｖｉｖｏで同じことが可能でないことを実証する。さらなる詳細については、上の図
４４および４５と実施例を参照する。
（実施例２３）
ステージ７およびステージ４（ＰＥＣ）からの内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞は、互いから
区別される
ステージ７（適切に特定化された内分泌）およびステージ４（ＰＥＣ）培養の分析は細
胞染色および分析のために同じ抗体（例えばＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１）を使用す
るが、ステージ７および４（ＰＥＣ）からの適切に特定化された内分泌（ＣＨＧＡ＋）細
胞亜集団は同じでない。
より初期に、出願人は、ステージ４のＰＥＣ培養の移植後に観察された機能的ベータ細
胞の起源は、膵臓の前駆体または非内分泌（ＣＨＧＡ－）細胞に起因し、一次内分泌（Ｃ
ＨＧＡ＋）細胞からではないことを報告した。上記Ｋｅｌｌｙら（２０１１）は、ＰＥＣ
培養で内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団を濃縮（精製）し、移植したときに、それらは、非濃
縮ＰＥＣ培養と比較して機能的膵島またはベータ細胞を生成しなかったことを実証した。
Ｋｅｌｌｙら（２０１１）、３～４頁、図４および付表１；上記Ｓｃｈｕｌｚら（２０１
２）；ならびに米国特許第７，５３４，６０８号；第７，６９５，９６５号；第７，９９
３，９２０号および第８，２７８，１０６号を参照。実施例１７、１８および表１９は、
移植したときに頑強な機能的移植片をｉｎ ｖｉｖｏでもたらした、ステージ７からのほ
ぼ純粋な（９８．２％）内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞培養を記載した（図３４）。本明細書
に記載される実施例１７、１８および他の結果を考慮すると、ステージ７培養の機能的集
団は、ステージ７からの内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞であって、かなりより小さい百分率の
非内分泌（ＣＨＧＡ－）細胞（２．０８％）ではない。これは、ｉｎ ｖｉｖｏ機能が非
内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団に帰せられる、出願人が先の開示で詳細に報告したステージ
４のＰＥＣ培養と対照的である。したがって、一般に、ステージ７および４からの内分泌
亜集団は同等でないか、同じでない。
表２３は、ステージ７（適切に特定化された内分泌）およびステージ４（ＰＥＣ）から
の全内分泌（ＣＨＧＡ＋）および非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団を比較し、亜集団が同等
物でなく、互いから区別されることを実証する、フローサイトメトリーデータを示す。例
えば、ＣＨＧＡ＋亜集団の全体の百分率は、ステージ４培養と比較してステージ７で有意
により高かった（８５．２対３９．４）。したがって、ＣＨＧＡ－亜集団の全体の百分率
は、ステージ４培養と比較してステージ７で有意により低かった（１４．８対６０．１）
。さらに、真の内分泌細胞、例えばベータ細胞は、ＣＨＧＡ＋を発現するだけでなく、少
なくともＩＮＳおよびＮＫＸ６．１も同時発現する。したがって、真の内分泌細胞はＣＨ
ＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）を発現し、ｉｎ ｖｉｖｏで機能するこ
とができる。表２３は、ステージ７培養がステージ４培養よりほぼ５倍多くのＣＨＧＡ＋
／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋（三重陽性）細胞を有したことを示し（３７．８対７．８）
；ステージ４のＣＨＧＡ＋／ＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋亜集団は上記のように適切に特定
化されているように見える可能性があるが、移植したとき、ステージ４からのこれらの内
分泌亜集団はｉｎ ｖｉｖｏで機能せず、ステージ４からの非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集
団はｉｎ ｖｉｖｏで成熟し、機能する。したがって、これらの細胞はｉｎ ｖｉｖｏで
成熟したベータ細胞になることに発生的に傾倒しているので、出願人はステージ７の内分
泌細胞を内分泌前駆／先駆細胞ではなく、「未熟な内分泌細胞」または「未熟なベータ細
胞」と呼ぶ。
Figure 2022017361000047
（実施例２４）
亜鉛センサーを使用するステージ７細胞集団からの内分泌細胞の精製
ベータ細胞分泌性小胞は、高濃度の亜鉛を含有する。亜鉛は、少なくとも亜鉛輸送体Ｓ
ＬＣ３０Ａ８（またはＺｎＴ８）の作用によって小胞に蓄積される。亜鉛なしでよりも亜
鉛と結合したときに特定の波長でより多くの光を吸収、放射することによって細胞中の亜
鉛を可視化するために、亜鉛結合蛍光プローブが使用されている。今のところ、報告は、
大部分のプローブはベータ細胞小胞内の亜鉛を検出するために適切に局在化することがで
きないことを示す。興味深いことには、ＰｙＤＰｙ１（またはＰｙ１；Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１１、４７：７１０７～９頁）は小胞に入ること
ができるが、今までベータ細胞で使用されたことはない。Ｚｎ２＋に結合するとき、Ｐｙ
１は蛍光強度を５０～８０倍増加させる。初めて、出願人は、ｉｎ ｖｉｖｏ機能が可能
な内分泌細胞または未熟ベータ細胞集団の生成を実証した。したがって、さらなるｉｎ
ｖｉｔｒｏ分析のために、スクリーニングツールとして用いるために、または移植のため
に濃縮された未熟ベータ細胞集団を提供するために、この集団をさらに濃縮するための手
段を有することが有利である。
ステージ７の内分泌細胞、または未熟ベータ細胞をＰｙ１で処置し、高亜鉛含有量のも
のについて細胞を蛍光によって選別した。Ｐｙ１亜鉛センサー（Ｃｈｅｍｏ Ｇｅｎｉｃ
ｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、ＮＣによっ
て注文合成された）をＤＭＳＯに１０ｍＭで再懸濁させ、５ミクロモルの最終濃度までＤ
ＰＢＳ（－／－）／０．２５％ＢＳＡ（緩衝液Ａ）に希釈した（染色液）。分化したステ
ージ７細胞凝集体をＤＰＢＳ（－／－）で二回洗浄し、Ａｃｃｕｍａｘで解離させた。Ｂ
－２７を含有する塩基培地の添加でＡｃｃｕｍａｘをクエンチした。生じた細胞懸濁液を
４０ミクロンメッシュによって濾過し、遠心分離し、緩衝液Ａで洗浄し、染色液に再懸濁
させた。染色は１５分間継続し、細胞を遠心分離し、緩衝液Ａで洗浄し、選別のために緩
衝液Ａに再懸濁させた。４℃でフローサイトメトリーによって細胞を選別し、ＣＭＲＬ／
５０％ＦＢＳに入れた。選別の後、細胞を遠心分離し、ＲＮＡ単離緩衝液に再懸濁させた
。
図４０に示す結果では、多角形で包囲されているか囲まれている細胞は、亜鉛に結合し
たＰｙ１センサーの存在のために蛍光が増加した生細胞である。この細胞集団は２つのほ
ぼ等しいゲートにさらに分割し、それらの蛍光強度によって明るいおよび薄暗いと命名し
た２つの管に選別した。ＲＮＡを細胞から調製し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析にかけた。
図４２Ａ～Ｃに見られるように、薄暗い集団は、ＩＮＳ、ＩＡＰＰ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ
６．１、ＰＡＸ４、ＰＣＳＫ１、Ｇ６ＰＣ２、ＧＣＫおよびＳＬＣ３０Ａ８などのベータ
細胞系列のマーカーが濃縮される。これは、亜鉛センサーを使用して、ステージ７細胞集
団からベータ細胞または未熟なベータ細胞を精製することができることを示す。以前の実
験は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇによる６３０，０００個のＩＮＳ ｍＲＮＡ単位がフローサ
イトメトリーによる約４９％のＩＮＳ陽性細胞に対応すると判定した（データ示さず）。
したがって、１，２００，０００個のＩＮＳ Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ値を有する精製され
た薄暗い集団は、約９３％のＩＮＳ陽性細胞（１，２００，０００／６３０，０００×４
９％）に対応するであろう。
反対に、明るい選別集団は、ＧＣＧ、ＡＲＸおよびＳＬＣ３０Ａ８などのα細胞系列の
マーカーが濃縮された（図４１、４２、４３）。ベータ細胞と同様に、グルカゴン細胞も
亜鉛を取り込むことが知られており、したがってベータ細胞とグルカゴン細胞の両方で亜
鉛に結合するためにＰｙ１センサーを使用することができるが、それらの異なるレベルの
蛍光によって分離または選別される。
ＰＥＣ（ステージ１～４）内分泌細胞（ステージ１～７）培養を作製するための方法の
要約
要約すると、本明細書に記載される本発明は、少なくともＰＥＣおよび未熟内分泌細胞
、ならびにＰＥＣ生成のためにステージ１～４および内分泌細胞の生成のためにステージ
１～７を少なくとも含むそのような細胞の作製方法を目的とする。図４３、４４および４
５は、出願人の細胞組成物および本明細書に記載される生成方法の特定の態様を要約する
図である。
出願人は、ｉｎ ｖｉｖｏ移植したとき、ステージ４分化プロトコルの後の内分泌（Ｃ
ＨＧＡ＋）亜集団は、成熟した機能する膵島細胞に発達しないことを前に報告した。図４
３および４４のステージ４の後の「ＥＮ」細胞型を参照する。これらの内分泌（ＣＨＧＡ
＋）亜集団は、早期または成熟前のＮＧＮ３発現（ＰＤＸ１およびＫＸ６．１同時発現の
前のＮＧＮ３発現）を有した。上記、Ｒｕｋｓｔａｌｉｓら（２００９）も参照。対照的
に、ＮＧＮ３を発現しなかったＰＥＣの非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団は、ｉｎ ｖｉｖ
ｏで内分泌細胞に発達および成熟する。ＰＥＣの非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団のｉｎ
ｖｉｖｏ成熟の後までのこの遅れたＮＧＮ３発現は、実施例１０（図１５～１６）に示し
たが、そこでは、アクチビン、Ｗｎｔおよびヘレグリンの組合せが対照と比較してＮＧＮ
３を効果的に抑圧し、対照と比較したこのＰＥＣの移植は、ｉｎ ｖｉｖｏ機能を向上さ
せた。図１５～１６を参照する。
次に出願人は、ｉｎ ｖｉｖｏで膵島に発達および成熟することが可能で、ＰＥＣ、特
にＰＥＣの非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団の全ての場合に観察されたものと同様に血中グ
ルコースレベルに応答してインスリンを作製する、適切に特定化された内分泌細胞培養を
得ようと努力した。この目的のために、ステージ３および４でＮＧＮ３発現を抑制または
阻害するために、出願人は多くの反復実験を実施した。実施例８～１１は、ＮＧＮ３発現
または抑制に影響を及ぼすために、出願人による、単独、またはＷｎｔおよびヘレグリン
などの他の作用物質と一緒の、様々な濃度でのアクチビンの使用を詳述する。図４４は、
ステージ３および４でのアクチビンの影響も要約する。
ＮＧＮ３発現を遅らせることができ、それはｉｎ ｖｉｖｏ機能に影響を及ぼさないこ
とが実証されると、出願人は、ＰＥＣ（ステージ４）形成後のステージで内分泌マーカー
の発現を誘導する方法を探索した。実施例１１～１４および１６～２２は、ｉｎ ｖｉｖ
ｏ機能を生成することができた適切に特定化された内分泌集団を生成する培養条件を最適
化するために用いた、多くの反復および方法を記載する。具体的には、出願人は、ＮＧＮ
３発現および内分泌分化を誘導するために、ステージ５でガンマセクレターゼ阻害剤を使
用した。出願人は、内分泌マーカー発現を増加させるためにステージ６および７でＣＭＲ
Ｌなどの試薬を；ＩＮＳおよびＰＤＸ１を増加させるためにＢＭＰを使用した。図４４お
よび４５は、これらの努力を要約し、記載する。
当初、細胞を特徴付けして同定するために、複数の方法論を使用する必要があることは
理解されよう（例えばＱ－ＰＣＲ、ＩＣＣ、フローサイトメトリー分析、Ｃペプチドアッ
セイ等）。特定の細胞分化培養条件の下でそのような細胞を完全に特徴付けして同定した
後に、そのような細胞型が得られたかどうか分析する唯一の方法として、Ｑ－ＰＣＲおよ
びＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ多重ＲＮＡがしばしば使用された。
本明細書に記載される方法、組成物およびデバイスは、現在好ましい実施形態の代表で
あり、例示的であり、本発明の範囲を限定することを意図していない。本発明の精神に包
含され、開示の範囲によって規定される、それへの変更および他の使用は当業者に思いつ
くであろう。したがって、本発明の範囲および精神を逸脱しない範囲で、様々な置換およ
び改変を本明細書に開示される本発明に加えることができることは、当業技術者に明らか
になる。
下の請求項およびこの開示全体で用いられるように、語句「から事実上なる」は、語句
の後に掲載される任意の要素を含むことを意味し、掲載される要素について開示で特定さ
れる活性または作用に干渉しないか寄与しない他の要素に限定される。したがって、語句
「から事実上なる」は、掲載される要素は必要とされるか必須であるが、他の要素は任意
選択であり、掲載される要素の活性か作用にそれらが影響を及ぼすかどうかによって存在
しても存在しなくてもよいことを示す。さらに、数値、例えば量、濃度、百分率、割合ま
たは範囲が列挙される実施形態では、言及される値は、「少なくとも約」その数値、「約
」その数値、または「少なくとも」その数値であってもよいことが理解される。
実施形態
実施形態１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
実施形態２．ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、実
施形態１に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
実施形態３．成熟ベータ細胞に分化することができる、実施形態１に記載の単能性ヒト
未成熟ベータ細胞。
実施形態４．前記分化がｉｎ ｖｉｖｏにおけるものである、実施形態３に記載の単能
性ヒト未成熟ベータ細胞。
実施形態５．細胞集団の一部を形成する、実施形態１に記載の単能性ヒト未成熟ベータ
細胞。
実施形態６．前記細胞集団の少なくとも１０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態５
に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
実施形態７．前記細胞集団の少なくとも２０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態５
に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
実施形態８．前記細胞集団の少なくとも３０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態５
に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
実施形態９．前記細胞集団の少なくとも４０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態５
に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
実施形態１０．前記細胞集団の少なくとも５０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態
５に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
実施形態１１．前記細胞集団の少なくとも６０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態
５に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
実施形態１２．前記細胞集団の少なくとも８０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態
５に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
実施形態１３．前記細胞集団の少なくとも９０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態
５に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
実施形態１４．前記細胞集団の少なくとも９８％が未成熟ベータ細胞である、実施形態
５に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
実施形態１５．単一ホルモン性である、実施形態１に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細
胞。
実施形態１６．ＭＡＦＢを発現する、実施形態１に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞
。
実施形態１７．単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成する方法であって、ヒト胚体内胚葉
系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよびＷｎｔファミ
リーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞を生じさせるステップを含む方
法。
実施形態１８．前記単能性ヒト未成熟ベータ細胞が、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１を発現し、
ＮＧＮ３を実質的に発現しない、実施形態４に記載の方法。
実施形態１９．ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーが、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、
アクチビンＢ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＧＤＦ８、ＧＤＦ－１０、ＧＤＦ－１１およびＧＤ
Ｆ－１５からなる群から選択される、実施形態４に記載の方法。
実施形態２０．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＲＲＢ受容体キナーゼ
活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む、実施形態４に記載の方法。
実施形態２１．ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡである、実施形態
４に記載の方法。
実施形態２２．ＷｎｔファミリーメンバーがＷｎｔ３ａである、実施形態４に記載の方
法。
実施形態２３．ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質がヘレグリンである、実施形態
６に記載の方法。
実施形態２４．ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がＢＭＰである、実施形態４に記
載の方法。
実施形態２５．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでニコチンアミド、レチノ
イン酸またはレチノイン酸類似体、ｒｈｏキナーゼ阻害剤またはガンマセレクターゼ阻害
剤と接触させるステップをさらに含む、実施形態４に記載の方法。
実施形態２６．レチノイン酸が、オールトランス－レチノイン酸（ＲＡ）、１３－シス
－レチノイン酸（１３－シス－ＲＡ）、およびアロチノイド酸（ＴＴＮＰＢ）からなる群
から選択される、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２７．レチノイン酸がオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）である、実施形態
２６に記載の方法。
実施形態２８．レチノイン酸が１３－シス－レチノイン酸（１３－シス－ＲＡ）である
、実施形態２６に記載の方法。
実施形態２９．レチノイン酸がアロチノイド酸（ＴＴＮＰＢ）である、実施形態２６に
記載の方法。
実施形態３０．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、ファスジル、Ｈ－１１５２
Ｐ、Ｗｆ－５３６およびＹ－３０１４１からなる群から選択される、実施形態２５に記載
の方法。
実施形態３１．ｒｈｏキナーゼ阻害剤がＹ－２７６３２である、実施形態３０に記載の
方法。
実施形態３２．ガンマセレクターゼ阻害剤が、ガンマセレクターゼ阻害剤Ｉ（ＧＳＩ
Ｉ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＩ（ＧＳＩ ＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＩ
Ｉ（ＧＳＩ ＩＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＶ（ＧＳＩ ＩＶ）、ガンマセレク
ターゼ阻害剤Ｖ（ＧＳＩ Ｖ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＶＩ（ＧＳＩ ＶＩ）、ガン
マセレクターゼ阻害剤ＶＩＩ（ＧＳＩ ＶＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＩＸ（ＧＳ
Ｉ ＩＸ）、（ＤＡＰＴ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩ（ＧＳＩ ＸＩ）、ガンマセ
レクターゼ阻害剤ＸＩＩ（ＧＳＩ ＸＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＩＩ（ＧＳ
Ｉ ＸＩＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＶ（ＧＳＩ ＸＩＶ）、ガンマセレクタ
ーゼ阻害剤ＸＶＩ（ＧＳＩ ＸＶＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＶＩＩ（ＧＳＩ Ｘ
ＶＩＩ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＩＸ（ＧＳＩ ＸＩＸ）、ガンマセレクターゼ阻
害剤ＸＸ（ＧＳＩ ＸＸ）、ガンマセレクターゼ阻害剤ＸＸＩ（ＧＳＩ ＸＸＩ）、ガン
マ４０セレクターゼ阻害剤Ｉ、ガンマ４０セレクターゼ阻害剤ＩＩおよびＲＯ４９２９０
９７からなる群から選択される、実施形態２５に記載の方法。
実施形態３３．ガンマセレクターゼ阻害剤がＲＯ４９２９０９７である、実施形態３２
に記載の方法。
実施形態３４．ガンマセレクターゼ阻害剤がＧＳＩ ＩＶである、実施形態３２に記載
の方法。
実施形態３５．成熟ベータ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで生成するための方法であって、ａ．
ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよ
びＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞を生じさせるス
テップと、ｂ．ステップ（ａ）の未成熟ベータ細胞を哺乳動物対象に移植するステップと
、ｃ．未成熟ベータ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで分化させて、成熟ベータ細胞を含む細胞の集
団を生成するステップとを含む方法。
実施形態３６．前記成熟ベータ細胞に、グルコース刺激に応答してインスリンを生成さ
せるステップをさらに含む、実施形態１０に記載の方法。
実施形態３７．前記ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子が、Ｎｏｄａｌ、アクチビン
ＡおよびアクチビンＢ、ＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１およびＧＤＦ－１５からなる群から選
択される、実施形態１０に記載の方法。
実施形態３８．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ
活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む、実施形態１０に記載の方法。
実施形態３９．ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡである、実施形態
１０に記載の方法。
実施形態４０．ＷｎｔファミリーメンバーがＷｎｔ３ａである、実施形態１０に記載の
方法。
実施形態４１．ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質がヘレグリンである、実施形態
３７に記載の方法。
実施形態４２．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパ
ーファミリー成長因子と接触させる、実施形態１に記載の方法。
実施形態４３．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパ
ーファミリー成長因子と接触させる、実施形態１０に記載の方法。
実施形態４４．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパ
ーファミリー成長因子と接触させる、実施形態１０に記載の方法。
実施形態４５．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリ
ーメンバーと接触させる、実施形態１０に記載の方法。
実施形態４６．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリ
ーメンバーと接触させる、実施形態１０に記載の方法。
実施形態４７．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリ
ーメンバーと接触させる、実施形態１０に記載の方法。
実施形態４８．ヒト胚体内胚葉系列細胞をＴＧＦβスーパーファミリー成長因子および
Ｗｎｔファミリーメンバーの５分の１～１５分の１のＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用
物質と接触させる、実施形態３７に記載の方法。
実施形態４９．前記細胞集団の少なくとも１０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態
１０に記載の方法。
実施形態５０．前記細胞集団の少なくとも２０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態
１０に記載の方法。
実施形態５１．前記細胞集団の少なくとも３０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態
１０に記載の方法。
実施形態５２．前記細胞集団の少なくとも４０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態
１０に記載の方法。
実施形態５３．前記細胞集団の少なくとも５０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態
１０に記載の方法。
実施形態５４．前記細胞集団の少なくとも６０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態
１０に記載の方法。
実施形態５５．前記細胞集団の少なくとも７０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態
１０に記載の方法。
実施形態５６．前記細胞集団の少なくとも８０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態
１０に記載の方法。
実施形態５７．前記細胞集団の少なくとも９０％が未成熟ベータ細胞である、実施形態
１０に記載の方法。
実施形態５８．未成熟ベータ細胞が、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を
実質的に発現しない、実施形態１０に記載の方法。
実施形態５９．未成熟ベータ細胞が、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＭＦＡＢを発現し、
ＮＧＮ３を実質的に発現しない、実施形態１０に記載の方法。
実施形態６０．ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
実施形態６１．成熟ベータ細胞へと成熟することができる、実施形態６０に記載の単能
性ヒト未成熟ベータ細胞。
実施形態６２．ＭＡＦＢをさらに発現する、実施形態６０に記載の単能性ヒト未成熟ベ
ータ細胞。
実施形態６３．単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成する方法であって、ヒト胚体内胚葉
系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよびＷｎｔファミ
リーメンバーと接触させ、それにより、単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成するステップ
を含む方法。
実施形態６４．前記単能性ヒト未成熟ベータ細胞が、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１を発現し、
ＮＧＮ３を実質的に発現しない、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ
活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６６．ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡである、実施形態
６３に記載の方法。
実施形態６７．ＷｎｔファミリーメンバーがＷｎｔ３ａである、実施形態６３に記載の
方法。
実施形態６８．ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質がヘレグリンである、実施形態
６５に記載の方法。
実施形態６９．成熟ベータ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで生成するための方法であって、ａ．
ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバーおよ
びＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞を生じさせるス
テップと、ｂ．ステップ（ａ）の未成熟ベータ細胞を哺乳動物対象に移植するステップと
、ｃ．未成熟ベータ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで成熟させて、インスリン分泌ベータ細胞を含
む細胞の集団を生成するステップとを含む方法。
実施形態７０．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ
活性化作用物質と接触させるステップをさらに含む、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７１．ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡである、実施形態
６９に記載の方法。
実施形態７２．ＷｎｔファミリーメンバーがＷｎｔ３ａである、実施形態６９に記載の
方法。
実施形態７３．ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質がヘレグリンである、実施形態
７０に記載の方法。
実施形態７４．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパ
ーファミリー成長因子と接触させる、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７５．ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリ
ーメンバーと接触させる、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７６．ヒト胚体内胚葉系列細胞をＴＧＦβスーパーファミリー成長因子および
Ｗｎｔファミリーメンバーの５分の１～１５分の１ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物
質と接触させる、実施形態７０に記載の方法。
実施形態７７．未成熟ベータ細胞が、ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を
実質的に発現しない、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７８．未成熟ベータ細胞が、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＭＡＦＢを発現し、
ＮＧＮ３を実質的に発現しない、実施形態６９に記載の方法。
実施例１３に記載される分化条件下のＩＮＳ（図２４Ａ）、ＰＤＸ１（図２４Ｂ）、ＮＫＸ６．１（図２４Ｃ）およびＩＤ１（図２４Ｄ）の相対的な遺伝子発現レベルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｍＲＮＡデータを示す棒グラフである。

Claims (19)

  1. ＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しない、ｉｎ ｖｉｔｒ
    ｏ単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
  2. 成熟ベータ細胞へと成熟することができる、請求項１に記載の単能性ヒト未成熟ベータ
    細胞。
  3. ＭＡＦＢをさらに発現する、請求項１に記載の単能性ヒト未成熟ベータ細胞。
  4. 単能性ヒト未成熟ベータ細胞を生成する方法であって、ヒト胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉ
    ｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ）系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリ
    ーメンバーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、単能性ヒト未成熟
    ベータ細胞を生成するステップを含む方法。
  5. 前記単能性ヒト未成熟ベータ細胞が、ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質
    的に発現しない、請求項４に記載の方法。
  6. ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質
    と接触させるステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
  7. ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡである、請求項４に記載の方法。
  8. ＷｎｔファミリーメンバーがＷｎｔ３ａである、請求項４に記載の方法。
  9. ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質がヘレグリンである、請求項６に記載の方法。
  10. 成熟ベータ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで生成するための方法であって、
    ａ．ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＧＦβスーパーファミリーメンバ
    ーおよびＷｎｔファミリーメンバーと接触させ、それにより、未成熟ベータ細胞を生じさ
    せるステップと、
    ｂ．ステップ（ａ）の未成熟ベータ細胞を哺乳動物対象に移植するステップと、
    ｃ．未成熟ベータ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで成熟させて、インスリン分泌性ベータ細胞を
    含む細胞の集団を生成するステップと
    を含む方法。
  11. ヒト胚体内胚葉系列細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質
    と接触させるステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子がアクチビンＡである、請求項１０に記載の方法
    。
  13. ＷｎｔファミリーメンバーがＷｎｔ３ａである、請求項１０に記載の方法。
  14. ＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質がヘレグリンである、請求項１１に記載の方法
    。
  15. ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβスーパーファミリー成
    長因子と接触させる、請求項１０に記載の方法。
  16. ヒト胚体内胚葉系列細胞を少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＷｎｔファミリーメンバーと接
    触させる、請求項１０に記載の方法。
  17. ヒト胚体内胚葉系列細胞をＴＧＦβスーパーファミリー成長因子およびＷｎｔファミリ
    ーメンバーの５分の１～１５分の１のＥＲＢＢ受容体キナーゼ活性化作用物質と接触させ
    る、請求項１１に記載の方法。
  18. 未成熟ベータ細胞がＩＮＳおよびＮＫＸ６．１を発現し、ＮＧＮ３を実質的に発現しな
    い、請求項１０に記載の方法。
  19. 未成熟ベータ細胞がＩＮＳ、ＮＫＸ６．１およびＭＡＦＢを発現し、ＮＧＮ３を実質的
    に発現しない、請求項１０に記載の方法。
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