ES2739082T3 - Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes a células endodérmicas pancreáticas (PEC) y células endocrinas - Google Patents

Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes a células endodérmicas pancreáticas (PEC) y células endocrinas Download PDF

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Abstract

Un método para producir una célula beta inmadura humana unipotente que comprende: poner en contacto células del linaje endodérmico definitivo humano in vitro con un miembro de la superfamilia de TGFß y un miembro de la familia de Wnt, produciendo así una célula beta inmadura humana unipotente.

Description

DESCRIPCIÓN
Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes a células endodérmicas pancreáticas (PEC) y células endocrinas
Campo de la invención
La presente invención se refiere, en general, al aislamiento, mantenimiento y uso de cultivos celulares. De manera más específica, se refiere a composiciones celulares y a métodos para diferenciar células madre pluripotentes in vitro a cultivos de células endodérmicas pancreáticas (PEC) enriquecidas en una subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina (CHGA-), pero relativamente repleta de células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+). La memoria descriptiva también describe, por primera vez, composiciones celulares y métodos para diferenciar células madre pluripotentes in vitro a células endocrinas que, tras la implantación en un mamífero, producen insulina en respuesta a la estimulación con glucosa in vivo. La memoria descriptiva también describe, composiciones celulares y métodos para diferenciar células madre pluripotentes in vitro a células endocrinas que producen insulina in vitro.
Antecedentes
El desarrollo de poblaciones expandidas de células p pancreáticas humanas que se pueden usar para el trasplante de células es un objetivo importante de la investigación de la diabetes. En los últimos años, la atención se ha centrado en el uso de células madre pluripotentes como una posible fuente renovable para las células p. Debido a la naturaleza compleja de la diferenciación endocrina pancreática, que, en la actualidad, aún no se ha dilucidado, la diferenciación de las células madre pluripotentes a células p maduras y funcionales no se ha logrado de manera eficaz in vitro. Hasta ahora, solo las células progenitoras, tales como las células del endodermo pancreático (PEC), se han trasplantado a roedores y, tras de 8 a 12 semanas, demuestran la función de las células p específicas del ser humano. Las poblaciones de células PEC comprenden al menos dos poblaciones de células: una subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina (CHGA-) y células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+). Se descubrió que, tras la implantación de PEC, es la subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina (CHGA-) la que madura y forma las células p in vivo. El trasplante de poblaciones de células PEC requiere un largo tiempo de maduración in vivo (8-12 semanas) que puede acortarse o eliminarse si: (a) las poblaciones de PEC in vitro contienen más del tipo de células que madura en células p in vivo (es decir, células progenitoras pancreáticas multipotentes no endocrinas (CHGA-)), (b) se logra la diferenciación terminal (célula p) in vitro; o (c) se identifica una población progenitora in vitro que se encuentra más lejos a lo largo de la vía de diferenciación que la que se usa actualmente, es decir, población de células de desarrollo avanzado.
Aunque la presente solicitud no se limita a ninguna teoría, una posible explicación de por qué las células madre pluripotentes no maduran para convertirse en células p totalmente funcionales in vitro es que las células derivadas in vitro no tienen la misma expresión de marcadores en los mismos puntos de tiempo que durante el desarrollo pancreático in vivo de mamíferos. Por ejemplo, la expresión de NGN3 durante la diferenciación in vitro ocurre antes que en el desarrollo pancreático de mamíferos in vivo. De hecho, se ha observado que, en los protocolos tradicionales de diferenciación de 4 etapas, como se describe en las numerosas publicaciones y patentes del solicitante, las poblaciones de PEC expresan NGN3 y NKX2.2. Por lo tanto, la supresión o inhibición de la expresión de NGN3 hasta después de la expresión de la diferenciación de la subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina copositiva PDX1 / NKX6.1 es una etapa importante para lograr la diferenciación in vitro de células madre pluripotentes a células p maduras y funcionales o la diferenciación de poblaciones de PEC que contienen más células progenitoras pancreáticas multipotentes no endocrinas (CHGA-) que células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+).
La identificación de un protocolo que retrase la expresión de NGN3 y NKX2.2 no es evidente, porque el protocolo de diferenciación no debe interrumpir, y preferentemente aumenta, la formación de la subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina (CHGA-) y debe minimizar la pérdida de células; o al menos mantener una masa celular adecuada y el rendimiento celular (es decir, microgramos, gramos, kilogramos de células).
Además, ya que la expresión de NGN3 es necesaria para iniciar la diferenciación de las células endocrinas, potenciar la maduración de las células de los islotes y mantener la función de los islotes, la estimulación o inducción de la expresión de NGN3 en células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) es una etapa importante para lograr la diferenciación in vitro de células madre pluripotentes a células p maduras y funcionales.
Sumario de la invención
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas, con características preferidas y opcionales establecidas en las reivindicaciones dependientes. Se desvela un método in vitro para producir una población celular que incluye células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 humanas. El método puede incluir poner en contacto una población celular que incluya células de linaje endodérmico definitivo con un factor de crecimiento de la superfamilia de TGFp y un miembro de la familia de Wnt, generando así la población celular que incluye células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1. El factor de crecimiento de la superfamilia de TGFp puede seleccionarse del grupo que consiste en Nodal, Activina A, Activina B, BMP2, BMP4, GDF8, GDF-10, GDF-11 y GDF-15. El método puede incluir además poner en contacto la población celular que incluye células de linaje endodérmico definitivo con una Heregulina. El factor de crecimiento de la superfamilia de TGFp puede ser Activina A. El miembro de la familia de Wnt puede ser Wnt3a.
La población celular que incluye células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 puede ponerse en contacto con al menos 25 ng/ml del miembro de la superfamilia de TGFp. En las realizaciones, la población celular que incluye células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 se pone en contacto con al menos 50 ng/ml del factor de crecimiento de la superfamilia de TGFp. En las realizaciones, la población celular que incluye células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 se pone en contacto con al menos 75 ng/ml del miembro de la superfamilia de TGFp.
La población celular que incluye células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 puede ponerse en contacto con al menos 25 ng/ml del miembro de la familia de Wnt. La población celular que incluye células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 puede ponerse en contacto con al menos 50 ng/ml del miembro de la familia de Wnt. La población celular que incluye células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 puede ponerse en contacto con al menos 75 ng/ml del miembro de la familia de Wnt.
La población celular puede ponerse en contacto con 5-15 veces menos de Heregulina que cada uno de los miembros de la superfamilia de TGFp y el miembro de la familia de Wnt. Al menos aproximadamente el 50 % de dicha población celular que incluye células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 puede ser células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1. Al menos aproximadamente el 60% de la población celular que incluye células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 puede ser células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1. Al menos aproximadamente el 70 % de la población celular que incluye células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 puede ser células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1. Al menos aproximadamente el 80 % de la población celular que incluye células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 pueden ser células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1. Al menos aproximadamente el 90% de la población celular que incluye células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 pueden ser células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1.
Las células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 pueden expresar además NKX6.1 y podrían no expresar sustancialmente NGN3. Las células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 no necesitan expresar CHGA. Las células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 pueden expresar además NKX6.1 y PFT1A y no necesitan expresar sustancialmente NGN3. Las células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 pueden ser células multipotentes que pueden diferenciarse en células beta inmaduras unipotentes.
Se desvela un cultivo de células endodérmicas pancreáticas humanas que incluye una célula de linaje endodérmico definitivo, y un miembro de la superfamilia de TGFp y un miembro de la familia de Wnt. El miembro de la superfamilia de TGFp puede seleccionarse del grupo que consiste en Nodal, Activina A, Activina B, BMP2, BMP4, GDF8, GDF-10, GDF-11 y GDF-15. El método puede incluir además poner en contacto la población celular que incluye células de linaje endodérmico definitivo con una Heregulina. El miembro de la superfamilia de TGFp puede ser Activina A. El miembro de la familia de Wnt puede ser Wnt3a.
Se desvela una célula beta inmadura humana unipotente in vitro. La célula beta inmadura humana unipotente puede expresar INS y NKX6.1, y no necesita expresar sustancialmente NGN3. La célula beta inmadura humana unipotente puede ser capaz de diferenciarse a una célula beta madura. La diferenciación puede ser in vivo. La célula beta inmadura humana unipotente puede formar parte de una población celular. Al menos el 10 % de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 20 % de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 30 % de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 40 % de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 50 % de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 60 % de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 80 % de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 90 % de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 98 % de la población celular puede ser células beta inmaduras. La célula beta inmadura humana puede ser solo hormonal. La célula humana unipotente puede expresar MAFB.
Se desvela un método para producir una célula beta inmadura humana unipotente. El método puede incluir poner en contacto células del linaje endodérmico definitivo humano in vitro con un miembro de la superfamilia de TGFp y un miembro de la familia de Wnt, generando así células beta inmaduras. La célula beta inmadura humana unipotente puede expresar INS, NKX6.1 y no necesita expresar sustancialmente NGN3. El miembro de la superfamilia de TGFp puede seleccionarse del grupo que consiste en Nodal, Activina A, Activina B, BMP2, BMP4, GDf 8, GDF-10, GDF-11 y GDF-15. El método puede incluir además poner en contacto las células del linaje endodérmico definitivo humano in vitro con una Heregulina. El miembro de la superfamilia de TGFp puede ser Activina A. El miembro de la familia de Wnt puede ser Wnt3a. El miembro de la superfamilia de TGFp puede ser BMP.
El método puede incluir además poner en contacto las células del linaje endodérmico definitivo humano in vitro con nicotinamida, un ácido retinoico o análogo del ácido retinoico, un inhibidor de la rho quinasa o un inhibidor de la gamma secretasa. El ácido retinoico se puede seleccionar del grupo que consiste en ácido todo-trans-retinoico (RA), ácido 13-cis-retinoico (13-cis-RA) y ácido arotinoide (TTNPB). El ácido retinoico puede ser ácido retinoico todo-trans (RA). El ácido retinoico puede ser ácido 13-cis-retinoico (13-cis-RA). El ácido retinoico puede ser ácido arotinoide (TTNPB). El inhibidor de la rho quinasa puede seleccionarse del grupo que consiste en Y-27632, Fasudilo, H-1152P, Wf-536 e Y-30141. El inhibidor de la rho quinasa puede ser Y-27632.
El inhibidor de la gamma secretasa puede seleccionarse del grupo que consiste en inhibidor de la gamma secretasa I (GSI I), inhibidor de la gamma secretasa II (GSI II), inhibidor de la gamma secretasa III (GSI III), inhibidor de la gamma secretasa IV (GSI IV), inhibidor de la gamma secretasa V (GSI V), inhibidor de la gamma secretasa VI (GSI VI), inhibidor de la gamma secretasa VII (GSI VII), inhibidor de la gamma secretasa IX (GSI IX), (DAPT), inhibidor de la gamma secretasa XI (GSI XI), inhibidor de la gamma secretasa XII, (GSI XII), inhibidor de la gamma secretasa XIII (GSI XIII), inhibidor de la gamma secretasa XIV (GSI XIV), inhibidor de la gamma secretasa XVI (GSI XVI), inhibidor de la gamma secretasa XVII (GSI XVII), inhibidor de la gamma secretasa XIX (GSI XIX), inhibidor de la gamma secretasa XX (GSI XX), inhibidor de la gamma secretasa XXI (GSI XXI), inhibidor de la gamma40 secretasa I, inhibidor de la gamma40 secretasa II y RO4929097. El inhibidor de la gamma secretasa puede ser RO4929097. El inhibidor de la gamma secretasa puede ser GSI IV.
Se desvela un método para producir células beta maduras in vivo. El método puede incluir, (a) poner en contacto células humanas del linaje endodérmico definitivo in vitro con un miembro de la superfamilia de TGFp y un miembro de la familia de Wnt, generando así células beta inmaduras; (b) trasplantar las células beta inmaduras de la etapa (a) en un sujeto mamífero; y permitir que las células beta inmaduras se diferencien in vivo para producir una población de células que incluya células beta maduras. El método puede incluir además permitir que las células beta maduras produzcan insulina en respuesta a la estimulación con glucosa. El miembro de la superfamilia de TGFp puede seleccionarse del grupo que consiste en Nodal, Activina A y Activina B, GDF-8, GDF-11 y GDF-15. El método puede incluir además poner en contacto las células del linaje endodérmico definitivo humano in vitro con una Heregulina. El miembro de la superfamilia de TGFp puede ser Activina A. El miembro de la familia de Wnt puede ser Wnt3a.
Las células del linaje endodérmico definitivo humano pueden ponerse en contacto con al menos 25 ng/ml del miembro de la superfamilia de TGFp. Las células del linaje endodérmico definitivo humano pueden ponerse en contacto con al menos 5o ng/ml del miembro de la superfamilia de TGFp. Las células del linaje endodérmico definitivo humano pueden ponerse en contacto con al menos 75 ng/ml del miembro de la superfamilia de TGFp.
Las células del linaje endodérmico definitivo humano pueden ponerse en contacto con al menos 25 ng/ml del miembro de la familia de Wnt. Las células del linaje endodérmico definitivo humano pueden ponerse en contacto con al menos 50 ng/ml del miembro de la familia de Wnt. Las células del linaje endodérmico definitivo humano pueden ponerse en contacto con al menos 75 ng/ml del miembro de la familia de Wnt.
Las células del linaje endodérmico definitivo humano pueden ponerse en contacto con 5-15 veces menos de Heregulina que el miembro de la superfamilia de TGFp y el miembro de la familia de Wnt. Al menos el 10 % de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 20 % de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 30% de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 40% de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 50 % de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 60% de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 70% de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 80 % de la población celular puede ser células beta inmaduras. Al menos el 90 % de la población celular puede ser células beta inmaduras. Las células beta inmaduras pueden expresar INS y NKX6.1, y no necesitan expresar sustancialmente NGN3. Las células beta inmaduras pueden expresar INS, NKX6.1 y MAFB, y no necesitan expresar sustancialmente NGN3.
Se desvela una célula beta inmadura humana unipotente in vitro. La célula beta inmadura humana unipotente puede expresar INS y NKX6.1, y no necesita expresar sustancialmente NGN3. La célula beta inmadura humana unipotente puede ser capaz de madurar y convertirse en una célula beta madura.
Se desvela un método para producir células beta maduras in vivo. El método incluye: a. poner en contacto células del linaje endodérmico definitivo humano in vitro con un miembro de la superfamilia de TGFp y un miembro de la familia de Wnt, generando así células beta inmaduras; b. trasplantar las células beta inmaduras de la etapa (a) en un sujeto mamífero; y c. permitiendo que las células beta inmaduras maduren in vivo para producir una población de células que incluya células beta secretoras de insulina.
Se desvela una célula beta inmadura humana unipotente que expresa INS y NKX6.1, y que no expresa sustancialmente NGN3. La célula beta inmadura humana unipotente puede ser capaz de madurar y convertirse en una célula beta madura. La célula beta inmadura humana unipotente puede expresar además MAFB.
Se desvela una célula beta inmadura humana unipotente in vitro que expresa INS y NKX6.1, y que no expresa sustancialmente NGN3. La célula beta inmadura humana unipotente puede ser capaz de madurar y convertirse en una célula beta madura. La célula beta inmadura humana unipotente puede expresar además MAFB.
Se desvela un método para producir una célula beta inmadura humana unipotente. El método incluye poner en contacto células del linaje endodérmico definitivo humano in vitro con un miembro de la superfamilia de TGFp y un miembro de la familia de Wnt, produciendo así una célula beta inmadura humana unipotente. La célula beta inmadura humana unipotente puede expresar INS, NKX6.1 y no necesita expresar sustancialmente NGN3. El método puede incluir además poner en contacto las células del linaje endodérmico definitivo humano in vitro con una Heregulina. El miembro de la superfamilia de TGFp puede ser Activina A. El miembro de la familia de Wnt puede ser Wnt3a.
Se desvela un método para producir células beta maduras in vivo. El método incluye: a. poner en contacto células del linaje endodérmico definitivo humano in vitro con un miembro de la superfamilia de TGFp y un miembro de la familia de Wnt, generando así células beta inmaduras; b. trasplantar las células beta inmaduras de la etapa (a) en un sujeto mamífero; y c. permitiendo que las células beta inmaduras maduren in vivo para producir una población de células que incluya células beta secretoras de insulina. El método puede incluir además poner en contacto las células del linaje endodérmico definitivo humano in vitro con una Heregulina. El miembro de la superfamilia de TGFp puede ser Activina A. El miembro de la familia de Wnt puede ser Wnt3a. Las células del linaje endodérmico definitivo humano pueden ponerse en contacto con al menos 50 ng/ml del miembro de la superfamilia de TGFp. Las células del linaje endodérmico definitivo humano pueden ponerse en contacto con al menos 25 ng/ml del miembro de la familia de Wnt. Las células del linaje endodérmico definitivo humano pueden ponerse en contacto con 5-15 veces menos de Heregulina que el miembro de la superfamilia de TGFp y el miembro de la familia de Wnt. Las células beta inmaduras pueden expresar INS y NKX6.1, y no necesitan expresar sustancialmente NGN3. Las células beta inmaduras pueden expresar iNs, NKX6.1 y MAFB, y no necesitan expresar sustancialmente NGN3.
Se desvelan una composición y un método para diferenciar células madre pluripotentes o células precursoras derivadas de células madre pluripotentes a poblaciones endocrinas y no endocrinas. Las células endocrinas pueden expresar al menos CHGA (o CHGa ), y las no endocrinas no necesitan expresar CHGA (o CHGA-). Estas poblaciones de células pueden denominarse subpoblaciones endocrinas (CHGA+) y no endocrinas (CHGA-), o simplemente subpoblaciones CHGA+ o CHGA-, o simplemente subpoblaciones endocrinas y no endocrinas. Estas subpoblaciones endocrinas y no endocrinas pueden ser subpoblaciones progenitoras/precursoras multipotentes, tales como subpoblaciones progenitoras pancreáticas multipotentes no endocrinas o subpoblaciones progenitoras pancreáticas multipotentes endocrinas; o pueden ser subpoblaciones unipotentes, tales como células endocrinas inmaduras, preferentemente, células beta inmaduras, células de glucagón inmaduras y similares.
Se desvelan una composición y un método para diferenciar células madre pluripotentes in vitro a cultivos de células endodérmicas pancreáticas (PEC) que comprenden subpoblaciones tanto endocrinas como no endocrinas, en las que se suprime la expresión de NGN3. La expresión de NKX2.2 también se puede suprimir en el cultivo de PEC. La expresión de CHGA también se puede suprimir en el cultivo de PEC. La expresión de PDX1 y NKX6.1 se puede expresar simultáneamente en una sola célula en el cultivo de PEC. Menos del 50 %, preferentemente menos del 40 %, 30 %, más preferentemente menos del 20 %, 10 %, 5 %, 2 %, 1 % de las células del cultivo de PEC puede expresar NGN3, NKX2.2 o CHGA. El cultivo de PEC puede ester enriquecido en la subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina (CHGA-). El cultivo de PEC puede expresar marcadores (PDX1 y/o NKX6.1) para la subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina (CHGA-). El cultivo de PEC con abundante subpoblación progenitora multipotente no endocrina (CHGA-) se puede implantar en un hospedador mamífero, madurando del injerto y produciendo insulina in vivo en respuesta a la glucosa. El cultivo de PEC con abundante subpoblación progenitora pancreática no endocrina multipotente (CHGA-) puede madurar in vivo a una velocidad más rápida que los cultivos PEC sin una subpoblación progenitora multipotente no endocrina abundante (CHGA-). El cultivo de PEC implantado con una subpoblación progenitora multipotente no endocrina (CHGA-) abundante puede tener al menos una mejora del doble de la función in vivo medida mediante la producción de péptido C (insulina) en respuesta a la estimulación con glucosa aproximadamente 10 semanas o aproximadamente 12 semanas después del implante que los cultivos de PEC implantados sin una subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina abundante (CHGA).
Se desvelan una composición y un método para diferenciar células madre pluripotentes humanas in vitro, en las que la expresión de genes típicos de la diferenciación y del desarrollo endocrinos, tales como NGN3 y NKX2.2, se suprimen hasta después de la producción de células progenitoras pancreáticas multipotentes no endocrinas (expresión simultánea de CHGA y PDX1/NKX6.1).
Se desvela un método para diferenciar células madre pluripotentes in vitro a los cultivos de PEC que comprende las etapas de: (a) obtener una población de células endodérmicas del tracto digestivo superior negativas en PDX1; (b) poner en contacto la población celular de la etapa (a) con un agente que active un miembro de la familia de receptores de TGFp, generando así un cultivo celular que comprenda PEC, en el que las PEC no expresen sustancialmente un marcador seleccionado del grupo que comprende CHGA, NGN3 o NKX2.2. Las PEC pueden comprender una subpoblación de células que expresan simultáneamente PDX1 y NKX6.1. Las PEC pueden comprender una subpoblación de células progenitoras pancreáticas multipotentes no endocrinas (CHGA-). El agente que activa un miembro de la familia de receptores de TGFp puede seleccionarse del grupo que consiste en Nodal, Activina A, Activina B, BMP2, BMP4, GDF8, GDF-10, g Df -11, GDF-15 y una mezcla de los mismos. La Activina A se puede añadir a 100 ng/ml, 75 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml o 10 ng/ml en la fase 3; y 15 ng/ml, 10 ng/ml o 5 ng/ml en la fase 4. El cultivo de PEC formado mediante la adición de Activina A a una población de células endodérmicas del tracto digestivo superior negativas en PDX1 puede tener al menos una mejora del doble de la función in vivo medida mediante la producción de péptido C (insulina) en respuesta a la estimulación con glucosa que los cultivos de PEC sin una subpoblación progenitora multipotente no endocrina (CHGA-) abundante.
El cultivo de PEC con una subpoblación progenitora pancreáticas multipotente no endocrina (CHGA-) puede tener al menos una mejora del doble de la función in vivo medida mediante la producción de insulina en respuesta a la estimulación con glucosa que los cultivos de células PEC sin subpoblaciones progenitoras multipotentes no endocrinas (CHGA-) abundantes.
Se desvela un método para diferenciar células madre pluripotentes in vitro a una población celular que comprende PEC que comprende las etapas de: (a) obtener una población de células endodérmicas del tracto digestivo superior negativas en PDX1; (b) poner en contacto a población celular de la etapa (a) con un agente que active un miembro de la familia de receptores de TGFp, generando así una población de p Ec , en el que la población de PEC no expresa sustancialmente un marcador seleccionado del grupo que comprende CHGA, NGN3 o NKX2.2. La población de PEC puede comprender células que expresen simultáneamente PDX1 y NKX6.1. La población de PEC puede comprender células progenitoras pancreáticas multipotentes no endocrinas (CHGA-). El agente que activa un miembro de la familia de receptores de TGFp puede seleccionarse del grupo que consiste en Nodal, Activina A, Activina B, BMP2, BMP4, GDF8, GDF-10, GDF-11, GDF-15 y una mezcla de los mismos. El agente que activa un miembro de la familia de receptores de TGFp puede ser Activina A. La Activina A se puede añadir a 100 ng/ml, 75 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml o 10 ng/ml en la fase 3; y 15 ng/ml, 10 ng/ml o 5 ng/ml en la fase 4. El ligando de la familia de EGF puede seleccionarse del grupo que comprende Heregulina (también conocida como Neuregulina1 (NRG1)), Neuregulina2 (NRG2), Neuregulina3 (NRG3), Neuregulina4 (NRG4), EGF (factor de crecimiento epidérmico) y betacelulina. La Heregulina se puede añadir a 2 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 15 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml u 80 ng/ml. El cultivo de PEC formado mediante la adición de Activina A y Heregulina a una población de células endodérmicas del tracto digestivo superior negativas en PDX1 puede tener al menos una mejora del doble de la función in vivo medida mediante la producción de péptido C (insulina) en respuesta a la estimulación con glucosa que los cultivos de PEC sin subpoblaciones progenitoras multipotentes no endocrinas (CHGA-) abundantes.
Se desvela un método para diferenciar células madre pluripotentes in vitro a un cultivo celular que comprende PEC que comprende las etapas de: (a) obtener una población de células endodérmicas del tracto digestivo superior negativas en PDX1; (b) poner en contacto la población celular de la etapa (a) con al menos un agente que active un miembro de la familia de receptores de TGFp, un ligando de la familia de EGF o un agente que active una vía de señalización de Wnt, solo o en combinación, generando así un cultivo celular que comprenda p Ec , en el que las PEC no expresan sustancialmente un marcador seleccionado del grupo que comprende CHGA, NGN3 o NKX2.2. El cultivo de PEC puede comprender células que expresen simultáneamente PDX1 y NKX6.1. El cultivo de células PEC puede comprender una subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina (CHGA-). El agente que activa un miembro de la familia de receptores de TGFp puede seleccionarse del grupo que consiste en Nodal, Activina A, Activina B, BMP2, BMP4, GDF8, GDF-10, g Df -11, GDF-15 y una mezcla de los mismos. El agente que activa un miembro de la familia de receptores de TGFp puede ser Activina A. Un agente que activa una vía de señalización de Wnt puede ser un miembro de la familia de Wnt seleccionado del grupo que comprende WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16 y Wnt3A. El miembro de la familia de Wnt puede ser Wnt3A. La Activina A se puede añadir a 100 ng/ml, 75 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml o 10 ng/ml en la fase 3; y 15 ng/ml, 10 ng/ml o 5 ng/ml en la fase 4. La Heregulina se puede añadir a 2 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 15 ng/ml, 30 ng/ml, 40 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml u 80 ng/ml. WNT se puede añadir a 5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml a 75 ng/ml, más preferentemente a 50 ng/ml.
La Activina A se puede añadir sola o combinada con WNT en la fase 3. La Activina A se puede añadir con WNT o WNT y Heregulina en la fase 3. La Activina A se puede añadir sola o combinada con Heregulina en la fase 4.
Más del 10 %, preferentemente más del 20 %, 30 %, 40 % y más preferentemente más del 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de las células de la población celular puede ser la subpoblación progenitora multipotente no endocrina (CHGA-). El cultivo de células de PEC formado mediante la adición de Activina A, Heregulina y WNT a una población de células endodérmicas del tracto digestivo superior negativa en PDX1 puede tener al menos una mejora del doble de la función in vivo medida mediante la producción de insulina en respuesta a la estimulación con glucosa que los cultivos de células PEC sin una subpoblación progenitora multipotente no endocrina (CHGA-) abundante.
Se desvelan una composición y un método para diferenciar células madre pluripotentes in vitro a cultivos de PEC que comprenden células mínimas comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+). Las células comprometidas con el linaje endocrino pueden caracterizarse por la expresión de CHGA. Menos del 50 %, preferentemente menos del 40 %, 30 %, más preferentemente menos del 20 %, 10 %, 5 %, 2 %, 1 % de las células del cultivo de PEC pueden ser células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+).
Se desvelan una composición y un método para diferenciar células madre pluripotentes in vitro esencialmente a cultivos de PEC y para diferenciar además el cultivo de PEC a células endocrinas in vitro. Las células endocrinas pueden expresar CHGA. Las células endocrinas pueden producir insulina in vitro. Las células secretoras de insulina endocrinas in vitro pueden producir insulina en respuesta a la estimulación con glucosa. Más del 10%, preferentemente más del 20 %, 30 %, 40 % y más preferentemente más del 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de las células de la población de células puede ser células endocrinas.
Se desvela un método para diferenciar células madre pluripotentes in vitro a células endocrinas que comprenden las etapas de: (a) obtener una población celular que comprenda PEC; (b) poner en contacto la población celular de la etapa (a) con factores de crecimiento seleccionados del grupo que consiste en una proteína morfogenética ósea (BMP), un inhibidor de proteína hedgehog, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), miembro de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos, un retinoide, factor de crecimiento de insulina 1 y 2 (IGF1 e IGF2) y nicotinamida, generándose así células endocrinas. Las células endocrinas pueden expresar CHGA. Las células endocrinas pueden ser células beta inmaduras productoras de insulina in vitro. Las células endocrinas pueden cargarse en un dispositivo de encapsulación semipermeable implantable, madurar y ser capaces de producir insulina en respuesta a la estimulación con glucosa in vivo. Más del 10 %, preferentemente más del 20 %, 30 %, 40 % y más preferentemente más del 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de las células de la población celular pueden ser células endocrinas. SSH se puede añadir a de 10 g/ml a 100 ng/ml. PDGF se puede añadir a de 10 ng/ml a 100 ng/ml. BMP se puede añadir a de 10 g/ml a 20 ng/ml. FGF2 se puede añadir a de 2 ng/ml a 20 ng/ml. IGF1 o IGF2 se pueden añadir a de 25 ng/ml a 100 ng/ml. Los compuestos anteriores se pueden añadir en combinación entre sí. El miembro de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos puede ser FGF2. El retinoide puede ser ácido retinoico y/o análogos del ácido retinoico, tales como TTNPB o TT3, factor de crecimiento de tipo insulina I (IGF-I o IGF1) y -II (IGF-II o IGF2). La proteína morfogenética ósea puede ser BMP4. El inhibidor de la proteína hedgehog puede ser una Hedgehog sónica, KAAD-ciclopamina, análogos de KAAD-ciclopamina, jervine, análogos de jervine, anticuerpos que bloquean la vía de hedgehog y cualquier otro inhibidor de la función de la vía de hedgehog conocido por los expertos en la materia.
Se desvela un método para diferenciar células madre pluripotentes in vitro a células endocrinas que comprenden las etapas de: (a) obtener una población celular que comprenda PEC; (b) poner en contacto la población celular de la etapa (a) con un inhibidor de la gamma secretasa, formando así células endocrinas in vitro. Las células endocrinas pueden expresar CHGA. Las células endocrinas pueden ser células beta inmaduras productoras de insulina in vitro. Las células endocrinas pueden ser células secretoras de insulina que producen insulina en respuesta a la estimulación con glucosa in vitro. Las células endocrinas pueden cargarse en un dispositivo de encapsulación semipermeable implantable, madurar y ser capaces de producir insulina en respuesta a la estimulación con glucosa in vivo. El inhibidor de la gamma secretasa puede seleccionarse del grupo que comprende éster t-butílico de W-[A/-(3,5-diflurofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina (DAPT), RO44929097, 1-(S)-endo-N-(1,3,3)-Trimetilbiciclo[2.2.1]hept-2-il)-4-fluorofenilsulfonamida, WPE-III31C, S-3-[W’-(3,5-difluorofenil-alfa-hidroxiacetil)-L-alanilil]amino-2,3-dihidro-1-metil-5-fenil-1H-1,4-benzodiazepin-2-ona, (A/)-[(S)-2-hidroxi-3-metilbutiril]-1-(L-alaninil)-(S)-1-amino-3-metil-4,5,6,7-tetrahidro-2H-3-benzazepin-2-ona, BMS-708163 (Avagacestat), BMS-708163, Semagacestat (LY450139), Semagacestat (LY450139), MK-0752, MK-0752, YO-01027, YO-01027 (Dibenzazepina, DBZ), LY-411575, LY-411575 o LY2811376. El inhibidor de la gamma secretasa puede estar presente en el cultivo celular o en la población celular a una concentración que varía entre aproximadamente 0,01 pM y aproximadamente 1.000 pM. El inhibidor de la gamma secretasa puede estar presente en el cultivo celular o en la población celular a una concentración que varía entre aproximadamente 0,1 pM y aproximadamente 100 pM. El inhibidor de la gamma secretasa se puede eliminar tras su adición.
Se desvelan composiciones y métodos para diferenciar células madre pluripotentes humanas in vitro a células endocrinas. Las células endocrinas pueden expresar CHGA. Las células endocrinas pueden producir insulina in vitro. Las células endocrinas pueden ser células endocrinas inmaduras, tales como células beta inmaduras. Las células productoras de insulina in vitro pueden producir insulina en respuesta a la estimulación con glucosa.
Se desvela un método para producir insulina in vivo en un mamífero, comprendiendo dicho método: (a) cargar una población de células endocrinas en un dispositivo semipermeable implantable; (b) implantar el dispositivo con la célula endocrina en un hospedador mamífero; y (c) madurar la población de células endocrinas en dicho dispositivo in vivo, en el que al menos algunas de las células endocrinas son células secretoras de insulina que producen insulina en respuesta a la estimulación con glucosa in vivo, produciendo así insulina in vivo para el mamífero. La célula endocrina puede derivarse de una composición celular que comprende PEC con una subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina (CHGA-) más alta. La célula endocrina puede derivarse de una composición celular que comprenda PEC con una subpoblación endocrina (CHGA+) reducida. La célula endocrina puede ser una célula endocrina inmadura, preferentemente, una célula beta inmadura.
Las células endocrinas creadas in vitro a partir de las células madre pluripotentes pueden expresar más PDX1 y NKX6.1 en comparación con las poblaciones endodérmicas pancreáticas positivas en PDX-1, o las subpoblaciones no endocrinas (CHGA-) que son positivas en PDX1/NKX6.1. Las células endocrinas creadas in vitro a partir de las células madre pluripotentes pueden expresar PDX1 y NKX6.1 relativamente más que la subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina de PEC (CHGA-). Una proteína morfogénica ósea (BMP) y un análogo del ácido retinoico (RA) solo o en combinación se pueden añadir al cultivo celular para obtener células endocrinas con una mayor expresión de PDX1 y NKX6.1 en comparación con la subpoblación progenitora multipotente no endocrina de PEC (CHGA-). BMP puede seleccionarse del grupo que comprende BMP2, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8 y BMP4, y más preferentemente BMP4. El análogo del ácido retinoico se puede seleccionar del grupo que comprende ácido retinoico todo trans y TTNPB (Ácido arotinoide del ácido 4-[(£)-2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2 naftalenil)-1-propenil]benzoico, o AM-580 0,1-10 pM (ácido 4-[(5,6,7,8-Tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil(carboxamido]benzoico) y más preferentemente TTNPB.
Se desvela un método para diferenciar células madre pluripotentes in vitro a células endocrinas y endocrinas inmaduras, preferentemente, células beta inmaduras, que comprende disociar y volver a asociar los agregados. La disociación y la reasociación pueden ocurrir en la fase 1, fase 2, fase 3, fase 4, fase 5, fase 6 o fase 7, o combinaciones de las mismas. Las células endodérmicas definitivas, endodérmicas del tracto digestivo superior negativas en PDX1, endodérmicas del tracto digestivo superior positivas en PDX1, PEC y/o progenitoras/precursoras endocrinas y endocrinas pueden disociarse y volverse a asociar. Los agregados de células disociadas y vueltas a agregar de la fase 7 pueden consistir en menos subpoblaciones no endocrinas (CHGA-) en comparación con las subpoblaciones endocrinas (CHGA+). Más del 10%, preferentemente más del 20%, 30%, 40% y más preferentemente más del 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 100 % de las células de la población celular puede ser células endocrinas (CHGA+).
Se desvela un método para diferenciar células madre pluripotentes in vitro a células endocrinas mediante la eliminación de las células endocrinas producidas durante la producción de PEC de la fase 4, enriqueciendo así en subpoblación progenitora pancreática no endocrina (CHGA-) que es PDX1+ y NKX6.1+.
Se desvela un método para diferenciar células madre pluripotentes in vitro a células endocrinas, en el que las células de la fase 6 y fase 7, según lo definido en la Tabla 17, se cultivan a niveles bajos de Matrigel del aproximadamente 0,02 % al 2 %, preferentemente del aproximadamente 0,02 % al 0,05 %, preferentemente del aproximadamente 0,05 % al 1 %, preferentemente 0,05 %.
Se desvela un método para mejorar la adhesión celular de PEC y agregados de células endocrinas mediante el tratamiento de cultivos celulares con Matrigel y un inhibidor de la rho-quinasa o ROCK. El inhibidor de la rho-quinasa o ROCK puede ser Y-27632.
Los cultivos de PEC enriquecidos en la subpoblación progenitora multipotente no endocrina (CHGA-) se pueden preparar sin añadir un miembro de la familia de la nogina en la fase 3 y/o la fase 4. Los cultivos de PEC que están relativamente repletos de células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) se pueden preparar sin añadir un miembro de la familia de la nogina en la fase 3 y/o la fase 4. El miembro de la familia de la nogina puede ser un compuesto seleccionado del grupo que comprende nogina, cordina, Folistatina, Proteínas similares a la folistatina, Cerberus, Coco, Dan, Gremlina, Esclerostina, PRDC (proteína relacionada con Dan y Cerberus).
Se desvela un método para mantener células endocrinas en cultivo cultivándolas en un medio que comprende niveles exógenos altos de glucosa, en el que la glucosa exógena añadida es de aproximadamente 1 mM a 25 mM, de aproximadamente 1 mM a 20 mM, de aproximadamente 5 mM a 15 mM, de aproximadamente 5 mM a 10 mM, de aproximadamente 5 mM a 8 mM. Los medios pueden ser un medio a base de DMEM, a base de CMRL o a base de RPMI.
Se desvela un método para diferenciar células madre pluripotentes in vitro a células endocrinas con y sin disociar y volver a asociar los agregados celulares. Los agregados celulares no disociados o disociados y reasociados se pueden crioconservar o congelar en la fase 6 y/o la fase 7 sin afectar a la función in vivo de las células endocrinas. Los cultivos de células endocrinas crioconservadas pueden descongelarse, cultivarse y, cuando se trasplantan, funcionan in vivo.
Se desvela un sistema de cultivo para diferenciar células madre pluripotentes a células endocrinas, el sistema de cultivo que comprende al menos un agente capaz de suprimir o inhibir la expresión génica endocrina durante las primeras fases de diferenciación y un agente capaz de inducir la expresión génica endocrina durante fases posteriores de diferenciación. Se puede añadir un agente capaz de suprimir o inhibir la expresión génica endocrina al sistema de cultivo que consista en células del tracto digestivo superior pancreáticas negativas en PDX1. Se puede añadir un agente capaz de inducir la expresión génica endocrina al sistema de cultivo que consista en células progenitoras endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 o PEC. Un agente capaz de suprimir o inhibir la expresión génica endocrina puede ser un agente que active una familia de receptores de TGFbeta, preferentemente es Activina, preferentemente, es altos niveles de Activina, seguido de bajos niveles de Activina. Un agente capaz de inducir la expresión génica endocrina puede ser un inhibidor de la gamma secretasa seleccionado de un grupo que consiste en éster t-butílico de N-[N-(3,5-diflurofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina (DAPT), RO44929097, DAPT (éster t-butílico de N-[N-(3,5-difluorofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina), 1-(S)-endo-N-(1,3,3)-trimetilbiciclo [2.2.1]hept-2-il)-4-fluorofenilsulfonamida, WPE-III31C, S-3-[N’-(3,5-difluorofenil-alfa-hidroxiacetil)-L-alanilil]amino-2,3-dihidro-1-metil-5-fenil-1H-1,4-benzodiazepin-2-ona, (N-[((S)-2-hidroxi-3-metil-butiril]-1-(L-alaninil)-(S)-1-amino-3-metil-4,5,6,7-tetrahidro-2H-3-benzazepin-2-ona, BMS-708163 (Avagacestat), BMS-708163, Semagacestat (LY450139), Semagacestat (LY450139), MK-0752, MK-0752, YO-01027, YO-01027 (Dibenzazepina, DBZ), LY-411575, LY-411575 o LY2811376. Altos niveles de Activina significan niveles superiores a 40 ng/ml, 50 ng/ml y 75 ng/ml. Se pueden usar niveles altos de Activina durante la fase 3 o antes de la producción de células endodérmicas pancreáticas del tracto digestivo superior. Bajos niveles de Activina significan menos de 30 ng/ml, 20 ng/ml, 10 ng/ml y 5 ng/ml. Se pueden usar niveles bajos de Activina durante la fase 4 o para la producción de PEC. El gen endocrino que se inhibe o se induce puede ser NGN3. La Activina A y Wnt3A se pueden usar solas o en combinación para inhibir la expresión endocrina, preferentemente, para inhibir la expresión de NGN3 antes de la producción de células endodérmicas pancreáticas del tracto digestivo superior, o preferentemente durante la fase 3. Se puede usar un inhibidor de la gamma-secretasa, preferentemente RO44929097 o DAPT, en el sistema de cultivo para inducir la expresión génica endocrina tras la producción de PEC, o preferentemente durante las fases 5, 6 y/o 7.
Se desvela un cultivo celular in vitro que comprende células endocrinas en las que al menos el 5 % de dichas células humanas expresa un marcador endocrino seleccionado del grupo que consiste en insulina (INS), caja homeótica 1 de NK6 (NKX6.1), caja homeótica pancreática y duodenal 1 (PDX1), locus relacionado con el factor de transcripción 2 (NKX2.2), caja pareada 4 (PAX4), diferenciación neurogénica 1 (NEUROD), caja Forkhead A1 (FOXA1), caja Forkhead A2 (FOXA2), dedo de cinc de la familia del caracol 2 (SNAIL2) y familia A y B de oncogenes de fibrosarcoma musculoaponeurótico (MAFA y MAFB), y no expresa esencialmente un marcador seleccionado del grupo que consiste en neurogenina 3 (NGN3), islote 1 (ISL1), factor 6 nuclear de hepatocitos (HNF6), Proteína de unión a GATA 4 (GATA4), proteína de unión a GATA 6 (GATA6), factor de transcripción específico del páncreas 1a (PTF1A) y SRY (región determinante del sexo Y)-9 (SOX9), en el que dichas células endocrinas son unipotentes y pueden madurar a células beta pancreáticas.
Las células endocrinas pueden ser células beta inmaduras.
Al menos el 10 % de dichas células humanas puede ser células beta inmaduras.
Al menos el 20 % de dichas células humanas puede ser células beta inmaduras.
Al menos el 50 % de dichas células humanas puede ser células beta inmaduras.
Las células pueden ser no recombinantes.
Las células pueden derivarse de células madre pluripotentes humanas seleccionadas de un grupo que consiste en células madre embrionarias humanas (hESC), células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células del partenote, células de carcinoma embrionario (EC), células mesendodérmicas, células endodérmicas definitivas, células endodérmicas pancreáticas del tracto digestivo superior negativas en PDX1-1, células endodérmicas pancreáticas del tracto digestivo superior positivas en PDX1 y células endodérmicas pancreáticas (PEC).
Se desvela un método para producir una célula beta inmadura, comprendiendo dicho método las etapas de: a) poner en contacto una población de células endodérmicas del tracto digestivo superior negativas en PDX1 con un factor que active un miembro de la familia de receptores de TGFp, produciendo así una población de células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1; y b) poner en contacto la población de células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX con un inhibidor de la gamma secretasa, produciendo así una célula beta inmadura que expresa INS y NKX6.1 La población de células endodérmicas del tracto digestivo superior negativas en PDX1 puede ponerse en contacto con un miembro de la familia de Wnt y las Heregulinas.
El miembro de la familia de receptores de TGFbeta se puede seleccionar de un grupo que consiste en Activina A, Activina B, Nodal, GDF-8, GDF-10, GDF-11 y GDF15.
El miembro de la familia de receptores de TGFbeta puede ser Actina A, GDF-8 o GDF-11.
El miembro de la familia de receptores de TGFbeta puede ser Activina A.
El miembro de la familia de Wnt puede seleccionarse de un grupo que consiste en WNT 1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16 y WNT3A.
El miembro de la familia de Wnt puede ser Wnt3a.
El miembro de la familia de las Heregulinas (HRG) puede ser HRG1, HRG 2, HRG 3 y HRG4.
El miembro de la familia de HRG puede ser HRG1 y HRG2.
Se desvela un método para producir insulina in vivo, comprendiendo dicho método las etapas de: a) poner en contacto una población de células endodérmicas del tracto digestivo superior negativas en PDX1 con un factor que active un miembro de la familia de receptores de TGFp, produciendo así una población de células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1; y b) poner en contacto la población de células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX con un inhibidor de la gamma secretasa, produciendo así células beta inmaduras que expresan INS y NKX6.1; c) implantar las células beta inmaduras de la etapa (b); y d) madurar las células a células beta maduras que secretan insulina in vivo en respuesta a la estimulación con glucosa.
En la fase 7, los agentes todavía pueden modular la expresión génica. Se puede añadir un miembro de la superfamilia de FGF en la fase 7. Se puede añadir FGF2 en la fase 7. FGF2 puede aumentar la expresión de SST y/o suprimir la expresión de INS, GCG o GHRL. Se puede añadir BMP en la fase 7. BMP puede aumentar la expresión de INS, PDX1 o IDI.
Se desvela una población de células beta inmaduras que da lugar a la función in vivo. La población beta inmadura puede ser CHGA+. La población de células beta inmaduras puede ser capaz de funcionar in vivo, es decir, cuando se trasplanta, se secreta insulina en respuesta a la glucosa en sangre. La población de células endocrinas, cuando se trasplanta, puede desarrollarse y madurar hasta convertirse en células funcionales de los islotes pancreáticos. La población de células beta inmaduras puede enriquecerse en células endocrinas (o agotarse de células no endocrinas). Más del 50 % de las células de la población de células beta inmaduras puede ser CHGA+. Más del 60 % o 70 % u 80 % o 90 % o 95 % o 98 % o 100 % de las células de la población de células beta inmaduras puede ser CHGA-. Menos de aproximadamente el 50 % de las células de la población de células beta inmaduras puede ser CHGA-. Menos de aproximadamente el 15% de las células de la población de células beta inmaduras puede ser CHGA-. Menos de aproximadamente el 10 % o 5 % o 3 % o 2 % o 1 % o 0,5 % o 0 % de las células de la población de células beta inmaduras puede ser CHGA-. Además, la expresión de ciertos marcadores puede suprimirse durante la producción de células beta inmaduras, tal como la expresión de NGN3 durante la fase 3. La población de células beta inmaduras puede ser solo hormonal (por ejemplo, solo INS). La población de células beta inmaduras puede expresar conjuntamente otros marcadores celulares, incluyendo NKX6.1 y PDX1. La población de células beta inmaduras puede tanto expresar la hormona de forma individual como expresar conjuntamente otros marcadores celulares, incluyendo NKX6.1 y PDX1. La población de células beta inmaduras puede tener más células INS que expresan la hormona de forma individual como porcentaje de la población total de INS. La población de células beta inmaduras puede tener al menos un 50 % de células INS que expresan la hormona de forma individual como porcentaje de la población total de INS. La población de células beta inmaduras puede ser CHGA+/INS /NKX6.1+ (triple positiva). Más del 25 % de las células de la población de células beta inmaduras puede ser CHGA+/INS+/NKX6.1+ (triple positiva). Más del 30 % o 40 % o 50 % o 60 % o 70 % u 80 % o 90 % o 95 % o 100 % de las células de la población de células beta inmaduras pueden ser CHGA+/INS+/NKX6.1+ (triple positiva).
Se desvela una población de células beta inmaduras enriquecidas formada por disociación y reagregación de los agregados celulares. La población de células beta inmaduras enriquecida puede disociarse y volverse a agregar en la fase 7. La población de células beta inmaduras puede disociarse y volverse a agregar en aproximadamente el día 25, el día 26, el día 27 o el día 28 o el día 29 o el día 30 o más.
Los medios complejos son importantes para el mantenimiento de las células endocrinas. Los medios complejos pueden ser CMRL o RPMI. Los medios complejos se pueden usar en la fase 6 o en la fase 7, o tanto en la fase 6 como en la fase 7. El CMRL aumentó la expresión del marcador endocrino. El RPMI aumentó la expresión del marcador endocrino.
La crioconservación no reduce las poblaciones de células beta inmaduras en la fase 7. La crioconservación no reduce la expresión de CHGA+ en la fase 7.
Las células de la fase 7 son positivas en NKX6.1. Las células de la fase 7 son positivas en péptido C. Las células de la fase 7 son positivas tanto en NKX6.1 como en péptido C. Las células de la fase 7 son de una sola hormona. Las células de la fase 7 expresan individualmente INS y GCG.
La disociación y la reagregación de las células en fase 7 no afecta la función in vivo.
La crioconservación de células en la fase 7 no afecta a la función in vivo.
Las células de la fase 7 pueden ser crioconservadas y conservar su función in vivo.
El aumento de la concentración de glucosa aumenta la expresión de INS, GCG o SST. Se prefiere que la concentración de glucosa se aumente en la fase 6 o en la fase 7, o en ambas. Se prefiere que la expresión de GHRL disminuya con el aumento de la concentración de glucosa.
Se desvela una célula beta inmadura in vitro que es de una sola hormona (solo INS).
Se desvela una célula beta inmadura in vitro que expresa conjuntamente NKX6.1 y PDX1.
Se desvela una célula beta inmadura in vitro de una sola hormona (solo INS) y que expresa conjuntamente NKX6.1 y PDX1.
Se desvela una célula beta inmadura in vitro que es de una sola hormona (solo INS), que expresa conjuntamente NKX6.1 y PDX1, y puede madurar in vivo a una célula que puede secretar insulina en respuesta a la glucosa en sangre.
Se desvela una célula beta inmadura in vitro que puede madurar in vivo a una célula que puede secretar insulina en respuesta a la glucosa en sangre.
Se desvela una célula beta inmadura in vitro que es CHGA+, INS+ y NKX6.1 . Más del 10 % de la población celular in vitro total puede comprender células beta inmaduras que son CHGA+, INS+ y NKX6.1+. Es beta inmadura si más del 50 % de la población celular in vitro total comprende células beta inmaduras que son CHGA+, INS+ y NKX6.1+. Es beta inmadura si más del 80 % de la población celular in vitro total comprende células beta inmaduras que son CHGA+, INS+ y NKX6.1+.
Se desvelan células beta inmaduras purificadas. Se desvelan precursores de células beta inmaduras purificados. Las células beta inmaduras o los precursores de células beta pueden purificarse de las poblaciones de células en fase 7 usando un sensor de cinc. La fluorescencia oscura debida a la presencia de un sensor Py 1 unido al cinc se puede enriquecer en células beta. La fluorescencia brillante debida a la presencia de un sensor Py 1 unido al cinc se puede enriquecer en células alfa. Se desvela un método para purificar células beta usando un sensor de cinc. Se desvela un método para purificar células alfa usando un sensor de cinc. Se desvelan células alfa purificadas. Se desvelan precursores de células alfa purificados.
Se desvela una población celular enriquecida que expresa marcadores del linaje de las células beta, tal como el INS, IAPP, PDX1, NKX6.1, PAX4, PCSK1, G6PC2, GCK o SLC30A8.
Se desvela una población celular enriquecida que expresa marcadores del linaje de células alfa, tal como GCG, ARX o SLC30A8.
Se desvela una población celular enriquecida, en la que más del 50 % de las células son positivas en INS. La población celular puede tener más del 90 % de células positivas en INS. Del 50 % al 99 % de las células puede ser células positivas en INS.
Se desvela un método para producir insulina in vivo que comprende: a) obtener una población de células CHGA+ in vitro; y b) trasplantar las células CHGA+ produciendo insulina in vivo.
Las células CHGA+ pueden disociarse y reagregarse en la fase 7.
Las células CHGA+ pueden expresar PDX1 y NKX6.1
Las células CHGA+ pueden expresar INS y NKX6.1.
Las células CHGA+ pueden cultivarse en CMRL o RPMI.
Las células CHGA+ pueden ser crioconservadas y descongeladas antes del trasplante.
Las células CHGA+ pueden cultivarse en medios que contengan un alto contenido de glucosa.
Se desvela una célula endocrina in vitro que puede dar lugar a una célula secretora de insulina fisiológicamente funcional in vivo.
Se desvela una célula beta inmadura especificada adecuadamente in vitro que puede dar lugar a una célula secretora de insulina fisiológicamente funcional in vivo.
Las células beta inmaduras adecuadamente especificadas pueden disociarse y reagregarse en la fase 7.
Las células beta inmaduras adecuadamente especificadas pueden expresar PDX1 y NKX6.1
Las células beta inmaduras adecuadamente especificadas pueden expresar INS y NKX6.1.
Las células beta inmaduras adecuadamente especificadas pueden cultivarse en CMRL o RPMI.
Las células beta inmaduras adecuadamente especificadas pueden ser crioconservadas y descongeladas antes del trasplante.
Las células beta inmaduras adecuadamente especificadas pueden cultivarse en medios que contengan un alto contenido de glucosa.
Se desvela un método para producir una población de células beta inmaduras enriquecidas in vitro que comprende: obtener una población de células CHGA+ y clasificarla. Se desvela un método para producir una población celular enriquecida que expresa INS, IAPP, PDX1, NKX6.1 o PAX4 in vitro que comprende: obtener una población de células CHGA+ y clasificarla.
Se desvela un método para producir una población de células alfa enriquecida in vitro que comprende: obtener una población de células CHGA+ y clasificarla.
Se desvela un método para producir una población celular enriquecida que expresa GCG o ARX in vitro que comprende: obtener una población de células CHGA+ y clasificarla.
Las poblaciones enriquecidas de células alfa o beta pueden clasificarse usando un sensor de cinc Py 1.
Las células beta inmaduras pueden expresar INS y NKX6.1, y no necesitan expresar sustancialmente NGN3. Las células beta inmaduras pueden expresar INS, NKX6.1 y MAFB, y no necesitan expresar sustancialmente NGN3.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es una imagen fotográfica de un cultivo en suspensión de agregados de células reprogramadas desdiferenciadas, o también denominadas en el presente documento, células iPS. Véase el Ejemplo 1.
Las FIG. 2A-L son gráficos de barras que muestran los niveles relativos de expresión génica de OCT4 (FIG.2A), BRAQUIURIA (FIG.2B), CER1 (FIG.2C), GSC (FIG.2D), FOXA2 (FIG.2E), FOXA1 (FIG.2F), HNF6 (FIG.2G), PDX1 (FIG.2H), PTF1A (FIG.2I), NKX6.1 (FIG.2J), NGN3 (FIG.2K) e INS (FIG.2L). Los niveles de expresión se normalizan con respecto a los niveles de expresión medios de los genes constitutivos, la ciclofilina G y la expresión de proteínas de unión a TATA (TBP). Los gráficos representan la regulación positiva en el punto de datos más bajo del conjunto de datos. Véase el Ejemplo 1.
Las FIG. 3 son fotomicrografías de inmunocitoquímica (ICC) de cultivos de células iPS humanas (E2021 usando la estirpe celular hIPS G4) de diferenciación en fase 4 (células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1) que usan anticuerpos específicos de PDX-1 (panel A); NKX6.1 (panel B); PTF1A (panel C); y Dapi (panel D). Véase el Ejemplo 2.
La FIG. 4 son imágenes de inmunocitoquímica (ICC) de cultivos de células iPS (E2021 usando la estirpe celular G4 hIPS) de la diferenciación en fase 5 usando ligandos específicos para el glucagón (panel A); la insulina (panel B); la Somatostatina (panel C); y Dapi (panel D). Véase el Ejemplo 2.
Las FIG. 5A-B es un mapa de ubicación de matrices y la leyenda de las matrices provista en las matrices de anticuerpos de fosfo-RTK humano Proteome Profiler™ de R&D Systems. El mapa de ubicación de la FIG. 5A muestra las coordenadas o la ubicación de los anticuerpos RTK. La identidad o el nombre de la familia de RTK y los anticuerpos se describen en la leyenda, FIG.5B. Las señales positivas observadas en la película revelada, por lo tanto, pueden identificarse superponiendo una transparencia como en la FIG. 5A e identificando las señales en referencia a las coordenadas en la superposición (FIG. 5A) con el nombre del RTK de la FIG. 5B. Véase el Ejemplo 4.
La FIG. 6 son un análisis de matrices de RTK de células endodérmicas pancreáticas derivadas de células iPS (PEC) en cuatro condiciones diferentes (paneles A, B, C y D descritos en el Ejemplo 5. Se observa la fosforilación de la tirosina de ciertos RTK mediante la identificación de señales de alta a baja intensidad. Los miembros de la familia IGF1R/IR y ERBB (EGFR) están identificados o encuadrados. Véase el Ejemplo 5.
Las FIG.7A-C son gráficos que muestran las concentraciones de péptido C humano e insulina en sueros de ratones implantados para los experimentos E2314, E2356 y E2380 (FIG.7A), E2347 (FIG.7B) y E2354 (FIG.7C). FIG.7A: El tratamiento de las células que expresan PDX1 con heregulina in vitro mejora la secreción de insulina estimulada con glucosa tras el trasplante y la maduración in vivo. FIG.7B: Niveles de péptido C estimulados con glucosa a las 23 semanas del trasplante, 3 semanas antes de la inducción con STZ del modelo de diabetes de ratón. Los ratones implantados con PEC se analizaron en los tiempos indicados tras el injerto para determinar los niveles de péptido C humano en suero en ayunas, y 30 min y 60 min después de la administración de glucosa intraperitoneal. En la FIG. 7C, PEC se encapsuló con dispositivos de encapsulación de células (Encaptra® EN20 o EN20, ViaCyte, San Diego, CA) y, en algunos casos, los dispositivos tenían microperforaciones (pEN20, ViaCyte, San Diego, CA). Dichos dispositivos se han descrito en la patente de EE.UU. n° 8.278.106. Véase el Ejemplo 7.
Las FIG. 8A-B son gráficos que muestran los resultados de los análisis de glucosa en sangre de ratones tratados con STZ para el Experimento n.° 2347. Se muestran las células beta secretoras de insulina sensibles a la glucosa derivadas de la glucosa en sangre de control de iPEC implantado en el modelo de diabetes inducida por STZ. FIG.8A: muestra la glucosa en sangre para cada uno de los 13 ratones (momento basal con y sin Heregulina). La Figura 8B muestra las mediciones medias combinadas para cada tratamiento (momento basal con y sin Heregulina). Se muestran las mediciones de los niveles de glucosa en sangre no en ayunas aleatorios para los 13 ratones implantados con injertos de iPEC hasta 14 días antes de ser tratados con STZ (día 0), y para los mismos ratones tras el tratamiento con STZ y tras explantarse los injertos. Los animales tratados con STZ recibieron STZ aproximadamente 26 semanas después del trasplante del injerto (día 0). A las 28 semanas del trasplante del injerto, aproximadamente 2 semanas después del inicio del tratamiento con STZ, se explantaron los injertos de iPEC (se retiraron). Las mediciones de glucosa en sangre no en ayunas se recogieron a lo largo del tiempo para cada uno de los animales. Véase el Ejemplo 7.
Las FIG. 9A-E son gráficos de barras que muestran los niveles relativos de expresión génica de PDX1 (FIG. 9A), NKX6.1 (FIG. 9B), PTF1A (FIG. 9C), NKX2.2 (FIG. 9D) y NGN3 (FIG. 9E). Véase el Ejemplo 8.
La FIG. 10 es una imagen fotográfica de un cultivo en suspensión de agregados en el que las células endodérmicas del tracto digestivo superior negativas en PDX1 (fase 2) se diferenciaron a células endodérmicas del tracto digestivo superior positivas en PDX1 (fase 3) con la adición de 50 ng/ml de Activina A. Véase el Ejemplo 8.
La FIG. 11 es una imagen fotográfica de cultivos en suspensión de agregados al final de la fase 3 (día 8, panel superior) y 4 (día 12, panel inferior) usando 5 ng/ml (ACT5) o 10 ng/ml (ACT10) de Activina A en la fase 3; o 5 ng/ml (ACT5) de Activina en las fases 3 y 4. Véase el Ejemplo 8.
La FIG. 12 son imágenes fotográficas de cultivos en suspensión durante la fase 4 (A-E, panel superior) o al final de la fase 4 (A-E, panel inferior). El panel superior muestra la adición de 10 ng/ml de Activina A y 2 ng/ml de Heregulina (ACT 10 HGN 2) o 20 ng/ml de Activina A y 2 ng/ml de Heregulina (ACT 20 HGN 2), o 20 ng/ml de Activina A y 10 ng/ml de Heregulina (ACT 20 HGN 10) o 10 ng/ml de Activina A, 2 ng/ml de Heregulina y 50 ng/ml de WNT (ACT 10 HGN 2 WNT 50) en la fase 3. El panel inferior muestra la adición de 25 ng/ml de Activina A (ACT 25), 50 ng/ml de Activina A (ACT 50), 75 ng/ml de Activina A (ACT 75) o 100 ng/ml de Activina A (ACT 100) en la fase 3. Todas las condiciones recibieron un bajo nivel de Activina y Heregulina en la fase 4. Véase el Ejemplo 9.
Las FIG. 13A-C son gráficos de barras que muestran los niveles relativos de expresión génica de NGN3 (FIG.13A), NKX2.2 (FIG.13B) y NKX6.1 (FIG.13C) cuando se añadieron Activina, Heregulina y WNT (AHW) en la fase 3, y cuando se añadieron Activina y Heregulina (AH) en la fase 4 como se describe en el Ejemplo 9.
Las FIG. 14A-B son gráficos de barras que muestran los niveles relativos de expresión génica de NKX6.1 (FIG.14A) y NGN3 (FIG.14B) cuando se añaden Activina, Heregulina y WNT (AHW) en la fase 3, y cuando se añadieron Activina y Heregulina (AH) en la fase 4 como se describe en el Ejemplo 10.
La FIG. 15 es un gráfico que muestra las concentraciones de péptido C humano en sueros de ratones implantados con PEC encapsuladas (control) y PEC modificadas encapsuladas (producidas usando Activina, Heregulina y WNT (AHW) en la fase 3, y Activina y Heregulina (AH) en fase 4). Los niveles de expresión se analizaron 11 semanas después del injerto en ayunas, 30 min y 60 min después de la administración de glucosa intraperitoneal. Véase el Ejemplo 10.
La FIG. 16 es un gráfico que muestra la adición de las concentraciones de péptido C humano en sueros de ratones implantados con PEC encapsuladas (control) y PEC modificadas encapsuladas (producidas usando Activina, Heregulina y WNT (AHW) en la fase 3, y Activina y Heregulina (AH) en la fase 4). Los niveles de expresión se analizaron 14 semanas después del injerto en ayunas, 30 min y 60 min después de la administración de glucosa intraperitoneal. Véase el Ejemplo 10.
La FIG. 17 es un gráfico de barras que muestra los niveles de expresión génica relativos de la Neurogenina 3 en los días 13, 15 y 17 después del tratamiento con un inhibidor de la gamma secretasa en la fase 5 como se describe en el Ejemplo 11.
Las FIG. 18A-D son gráficos de barras que muestran los niveles relativos de expresión génica de PDX1 (FIG.18A), NKX6.1 (FIG.18B), SOX9 (FIG.18C) y PTF1A (FIG.18D) tras la diferenciación de acuerdo con la Tabla 17 para las fases 1-5, para las fases 6 y 7, solo FBS, Se usó Matrigel y un inhibidor de la rho-quinasa además del medio DMEM base como se describe en el Ejemplo 12.
Las FIG. 19A-D son gráficos de barras que muestran los niveles relativos de expresión génica de INS (FIG. 19A), GCG (FIG.19B), GHRL (FIG. 19C) y SST (FIG. 19D) en las mismas condiciones de diferenciación que en la FIG.
18 y como se describe en el Ejemplo 12.
La FIG.20 es un gráfico que muestra las concentraciones de péptido C humano en sueros de ratones implantados con células endocrinas encapsuladas, según lo descrito en el Ejemplo 12 (E2395, Rag 2, semana 10 GSIS). Los niveles de expresión se analizaron 10 semanas después del injerto en ayunas y 60 min después de la administración de glucosa intraperitoneal. Véase el Ejemplo 12.
La FIG.21 es un gráfico que muestra las concentraciones de péptido C humano en sueros de ratones implantados con células endocrinas encapsuladas, según lo descrito en el Ejemplo 12 (E2395, Rag 2, semana 15 GSIS). Los niveles de expresión se analizaron 15 semanas después del injerto en ayunas y 60 min después de la administración de glucosa intraperitoneal. Véase el Ejemplo 12.
Las FIG. 22A-D son micrografías fotográficas que muestran agregados de células endocrinas diferenciados y madurados in vivo como se describe en el Ejemplo 12. El campo de las células se tiñe con DAPI (FIG. 22A) o anticuerpos contra NKX6.1 (FIG. 22B y FIG. 22C, tinción nuclear), y cromogranina A (FIG. 22B y FIG. 22D, citoplasmática). El mismo campo se muestra en todas las imágenes. Véase el Ejemplo 12.
Las FIG. 23A-C son micrografías fotográficas que muestran agregados de células endocrinas como se describe en el Ejemplo 12. La FIG. 23A muestra un campo de células teñidas para INS (citoplasmático) y NKX6.1 (nuclear). La FIG. 23B muestra el mismo campo de células teñidas para INS (citoplasmático) y PDX1 (nuclear). La FIG. 23C muestra el mismo campo de células teñidas con DAPI. Véase el Ejemplo 12.
Las FIG. 24A-D son gráficos de barras que muestran datos de ARNm Nanostring de los niveles de expresión génica relativos de INS (FIG. 24A), NKX6.1 (FIG.24B), PDX1 (FIG. 24C) e ID1 (FIG. 24D) en las condiciones de diferenciación descritas en el Ejemplo 13.
Las FIG. 25A-C son micrografías fotográficas que muestran agregados de células endocrinas como se describe en el Ejemplo 13. La FIG. 25A es un control sin adición de TT o BMP, La FIG. 25B muestra la adición de TT en la fase 7, La FIG. 25C muestra la adición de BMP en la fase 7. Las FIG. 25A-C muestran tinción para el péptido C (citoplasmático) y PDX1 (nuclear).
Las FIG. 26A-B son micrografías fotográficas que muestran agregados de células endocrinas como se describe en el Ejemplo 13. La FIG. 26A se trata con TT y BMP en las etapas 6 y 7, y la FIG. 26B muestra la adición de TT y BMP en la fase 7. Las FIG. 26A y B muestran la tinción para el péptido C (citoplasmático) y PDX1 (nuclear).
Las FIG. 27A-C son micrografías fotográficas que muestran agregados de células endocrinas como se describe en el Ejemplo 13 y representan los mismos campos que en la FIG.25. La FIG. 27A es un control sin adición de TT o BMP, La FIG. 27B muestra la adición de TT en la fase 7, La FIG. 27C muestra la adición de BMP en la fase 7. Las FIG. 27A-C muestran tinción para el péptido C (citoplasmático) y NKX6.1 (nuclear).
Las FIG. 28A-B son micrografías fotográficas que muestran agregados de células endocrinas como se describe en el Ejemplo 13 y representan los mismos campos que en la FIG.26. La FIG. 28A se trata con TT y BMP en las fases 6 y 7, y la FIG. 28B muestra la adición de Tt y BMP en la fase 7. Las FIG. 28A y B muestran la tinción para el péptido C (citoplasmático) y NKX6.1 (nuclear).
Las FIG. 29A-E son gráficos de barras que muestran los niveles relativos de expresión génica de los agregados endocrinos tratados con (barra derecha; d21 gi- d13-d15) o sin tratar (barra derecha; d21 gi- d13-d15+NIC d15) nicotinamida en la fase 6 y analizados el día 21 como se describe en el Ejemplo 13.
La FIG. 30 muestra imágenes fotográficas (días 21, 22 y 23) de cultivos en suspensión de agregados de células endocrinas disociados y reagregados al comienzo de la fase 7, seguido de la adición de FBS solo, tanto FBS (panel A) como Matrigel al 0,05 % (MG; panel B), tanto FBS como Y-27632 10 pM (Y; panel C) o los tres, FBS, Matrigel (Mg ) al 0,05 % y Y-27632 10 pM (Y; panel D) como se describe en el Ejemplo 14.
Las FIG. 31A-D son gráficos de barras que muestran los niveles relativos de expresión génica de NKX6.1 (FIG.31A), NKX2.2 (FIG.31B), PDX1 (FIG. 31C) e INS (FIG. 31D) que comparan las condiciones de diferenciación con y sin Nogina durante 1, 2 y 3 días. Véase el Ejemplo 15.
Las FIG. 32A-C son gráficos de barras que muestran datos de ARNm Nanostring de los niveles de expresión génica relativos de INS y GCG (FIG. 32A), GHRL y SST (FIG. 32B) y PDX1 e ID1 (FIG. 32C) que describen el efecto sobre la expresión génica por los factores indicados. Véase el Ejemplo 16.
Las FIG. 33A-C son gráficos de barras que muestran datos de ARNm Nanostring de los niveles de expresión génica relativos de PDX1, NKX6.1, PTF1A, SOX9 (FIG. 33A); INS, GCG, PPY, GHRL (FIG. 33B) y PCSK1, GCK, SLC30A8, G6PC2 (FIG.33C) que describe las subpoblaciones endocrinas (CHGA+) y las subpoblaciones no endocrinas (CHGA-) en cultivos reagregados en comparación con los cultivos no reagregados. Véase el Ejemplo 17.
La FIG.34 es un gráfico que muestra las concentraciones de péptido C humano en sueros de ratones implantados con células endocrinas encapsuladas, según lo descrito en el Ejemplo 18, donde los tipos de células endocrinas (CHGA+) se enriquecieron por disociación y reagregación al inicio de la fase 7 (muestra reagregada) y en comparación con las células diferenciadas de la misma manera pero no reagregadas (muestra de control). Los niveles de expresión se analizaron 21 semanas después del injerto en ayunas, 30 min y 60 min después de la administración de glucosa intraperitoneal. Véase el Ejemplo 18.
Las FIG. 35A-C son gráficos de barras que muestran los datos de ARNm Nanostring de los niveles de expresión génica relativos de CHGA, INS, GCG, GHRL, PPY, SST (FIG. 35A); GCK, G6CP2, UCN3, PCSK1 (FIG. 35B); HNF1a, HNF4A, SLC30A8, CADH1 (FIG. 35C) que describe el efecto de los medios basados en DMEM y CMRL durante la fase 7. Véase el Ejemplo 19.
Las FIG. 36A-C son micrografías fotográficas que muestran los agregados de células endocrinas de la fase 7 como se describe en el Ejemplo 20. Los agregados no se han vuelto a agregar en la fase 7. El mismo campo en la FIG.
36A y en la FIG. 36B se tiñen para INS (citoplasmático) y GCG (citoplasmático), respectivamente; y la FIG.36C se tiñe para NKX6.1 (nuclear) y péptido C (citoplasmático).
Las FIG. 37A-C son micrografías fotográficas que muestran los agregados de células endocrinas de la fase 7 como se describe en el Ejemplo 20. Los agregados se han vuelto a agregar en la fase 7. El mismo campo en la FIG. 37A y la FIG. 37B se tiñen para INS (citoplasmático) y GCG (citoplasmático), respectivamente; y la FIG.37C se tiñe para NKX6.1 (nuclear) y péptido C (citoplasmático).
La FIG.38 es un gráfico que muestra las concentraciones de péptido C humano en sueros de ratones implantados con células endocrinas encapsuladas, según lo descrito en el Ejemplo 20, mediante lo que los cultivos celulares se congelaron (crioconservaron) y se descongelaron (F/T), y no se disociaron ni reagregaron (lado izquierdo), o no se congelaron (recién preparados) y se disociaron y reagregaron al inicio de la fase 7 (lado derecho). Los niveles de expresión se analizaron 12 semanas después del injerto en ayunas, 30 min y 60 min después de la administración de glucosa intraperitoneal. Véase el Ejemplo 21.
Las FIG. 39A-B son gráficos de barras que muestran datos de ARNm Nanostring de los niveles de expresión génica relativos de INS, GCG (FIG. 39A) y SST, GHRL (FIG. 39B) que describen el efecto del alto contenido de glucosa exógena durante la fase 6 en la expresión de la hormona endocrina. Véase el Ejemplo 21.
Las FIG. 40A-B es una micrografía fotográfica que muestra los agregados de células endocrinas de la fase 7 como se describe en el Ejemplo 21 con un alto contenido de glucosa exógena durante la fase 7. La FIG. 40A muestra la tinción para INS (citoplasmática) y la FIG. 40B para GCG (citoplasmática).
La FIG. 41 muestra un gráfico de citometría de flujo que muestra el enriquecimiento de células beta endocrinas inmaduras de la fase 7 tratadas primero con Py1, un agente de unión al cinc, y se clasifica por fluorescencia. Véase el Ejemplo 24.
Las FIG. 42A-C son gráficos de barras que muestran datos de ARNm Nanostring de los niveles de expresión génica relativos de INS, GCG, GHRL, IAPP, SST y SST (FIG. 42A); PAX4, PDX1, ARX, NKX6.1 (FIG.42B); y PCSK1, GCK, G6PC2 y SLC30A8 (FIG. 42C) que caracterizan e identifican las células enriquecidas a partir del tipo de cinc. Véase el Ejemplo 24.
La FIG.43 es un diagrama esquemático de las fases 1-4 para la producción de células endodérmicas pancreáticas (PEC) in vitro, y el desarrollo y la maduración de células beta secretoras de insulina in vivo. El diagrama también muestra las dos subpoblaciones principales de PEC, células endocrinas (CHGA+) y no endocrinas (CHGA-). Células madre embrionarias (ESC), mesendodermo (ME), endodermo definitivo (DE), tracto digestivo superior (FG), tracto digestivo superior posterior (pFG) y epitelio pancreático o endodermo pancreático (PE).
La FIG. 44 es un diagrama esquemático de las fases 1-7 para la producción de células endocrinas in vitro. El diagrama también muestra que los altos niveles de Activina (fase 3) seguidos de los bajos niveles de Activina y la eliminación de WNT (fase 4) reprimen o inhiben la expresión de NGN3, que luego se expresa durante la fase 5 con la adición de un inhibidor de la gamma secretasa. Células madre embrionarias (ESC), mesendodermo (ME), endodermo definitivo (DE), tracto digestivo superior (FG), tracto digestivo superior posterior (pFG) y epitelio pancreático o endodermo pancreático (PE).
La FIG. 45 es un diagrama esquemático de las fases 1-7 para la producción de células endocrinas in vitro. El diagrama también muestra las fases, los factores de crecimiento, los tipos de células y marcadores distintivos de cada tipo de célula: células madre embrionarias (ESC), mesendodermo (ME), endodermo definitivo (DE), tracto digestivo superior (FG), tracto digestivo superior posterior (pFG), epitelio pancreático o endodermo pancreático (PE), célula pre-beta (pre-B; o célula beta inmadura) y célula beta (célula p).
Descripción detallada de la invención
La presente invención se puede entender más rápidamente con referencia a la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención y los ejemplos incluidos en la misma. Sin embargo, antes de desvelarse y describirse los presentes compuestos, composiciones y métodos, ha de comprenderse que la presente invención no se limita a tipos de células específicos, capas de células alimentadoras específicas, condiciones específicas o métodos específicos, etc., y como tal, puede variar. Numerosas modificaciones y variaciones en la misma serán evidentes para los expertos en la materia. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones específicas, y no se pretende que sea limitante.
En el presente documento, se describen varias composiciones celulares derivadas de células madre pluripotentes, y se pueden encontrar en las solicitudes de patente de EE. UU. del solicitante n.°: 10/486.408, titulada "MEt Ho DS Fo R CULTURE OF HESC ON FEEDER CELLS", presentada el martes 6 de agosto de 2002; 11/021.618, titulada "DEFINITIVE ENDODERM", presentada el jueves 23 de diciembre de 2004; 11/115.868, titulada "PDX1 EXPRESSING ENDODERM", presentada el martes 26 de abril de 2005; 11/165.305, titulada "METHODS FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DIFFERENTIATING DEFINITIVE ENDODERM", presentada el jueves 23 de junio de 2005; 11/573.662, titulada "METHODS FOR INCREASING DEFINITIVE ENDODERM DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS WITH PI-3 KINASE INHIBITORS", presentada el lunes 15 de agosto de 2005; 12/729.084, titulada "PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM", presentada el jueves 27 de octubre de 2005; 12/093.590, titulada "MARKERS OF DEFINITIVE ENDODERM", presentada el lunes 14 de noviembre de 2005; 11/993.399, titulada "EMBRYONIC STEM CELL CULTURE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF", presentada el martes 20 de junio de 2006; 11/588.693, titulada "PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM", presentada el viernes 27 de octubre de 2006; 11/681.687, titulada "ENDOCRINE PROGENITOR/PRECURSOR CELLS", "PANCREATIC HORMONE-EXPRESSING CELLS AND METHODS OF PRODUCTION", presentada el viernes 2 de marzo de 2007; 11/807.223, titulada "METHODS FOR CULTURE AND PRODUCTION OF SINGLE CELL POPULATIONS OF HESC", presentada el jueves 24 de mayo de 2007; 11/773.944, titulada "METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES", presentada el jueves 5 de julio de 2007; 11/860.494, titulada "METHODS FOR INCREASING DEFINITIVE ENDODERM PRODUCTION", presentada el lunes 24 de septiembre de 2007; 12/099.759, titulada "METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES", presentada el martes 8 de abril de 2008; 12/107.020, titulada "METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FORM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS", presentada el lunes 21 de abril de 2008; 12/618.659, titulada "ENCAPSULATION OF PANCREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS", presentada el viernes 13 de noviembre de 2009; 12/765.714 y 13/761.078, ambas tituladas "CELL COMPOSITIONS FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLS", presentada el 22 de abril de 2010 y el 6 de febrero de 2013; 11/838.054, titulada "COMPOSITIONS AND METHODS USEFUL FOR CULTURING DIFFERENTIABLE CELLS", presentada el lunes 13 de agosto de 2007; 12/264.760, titulada "STEM CELL AGGREGATE SUSPENSION COMPOSITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATION THEREOF", presentada el martes 4 de noviembre de 2008; 13/259.15, titulada "SMALL MOLECULES SUPPORTING PLURIPOTENT CELL GROWTH", presentada el martes 27 de abril de 2010; PCT/US11/25628, titulada "LOADING SYSTEM FOR AN ENCAPSULATION DEVICE", presentada el lunes 21 de febrero de 2011; 13/992.931, titulada "AGENTS AND METHODS FOR INHIBITING PLURIPOTENT STEM CELLS", presentada el martes 28 de diciembre de 2010; y la solicitudes de diseño de EE.UU. n.°: 29/408.366, presentada el 12 de diciembre de 2011; 29/408.368, presentada el 12 de diciembre de 2011; 29/423.365, presentada el jueves 31 de mayo de 2012; n.° 29/447.944, presentada el miércoles 13 de marzo de 2013; y las solicitudes provisionales de EE.UU. n.°: 61/774.443, titulada "SEMIPERMEABLE MACRO IMPLANTABLE CELLULAR ENCAPSULATION DEVICES", presentada el jueves 7 de marzo de 2013; 61/775.480, titulada "CRYOPRESERVATION, HIBERNATION AND ROOM TEMPERATURE STORAGE OF ENCAPSULATED PANCREATIC ENDODERM CELL AGGREGATES", presentada el viernes 8 de marzo de 2013; y 61/781.005, titulada "IN VITRO DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS TO PANCREATIC ENDODERM CELLS (PEC) AND ENDOCRINE CELLS", presentada el jueves 14 de marzo de 2013.
Definiciones
Se apreciará que los intervalos numéricos expresados en el presente documento incluyen los puntos finales establecidos y describen todos los números enteros entre los puntos finales del intervalo numérico establecido.
A menos que se indique lo contrario, los términos usados en el presente documento deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la materia pertinente. Asimismo, a los efectos de la presente memoria descriptiva y de las reivindicaciones adjuntas, salvo que se indique lo contrario, se comprende que todos los números que expresan cantidades de ingredientes, porcentajes o proporciones de materiales, condiciones de reacción y otros valores numéricos usados en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la siguiente memoria descriptiva y reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener mediante la presente invención. Como mínimo, y no en un intento de limitar la aplicación de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe interpretarse al menos a la luz del número de dígitos significativos indicados y mediante la aplicación de técnicas de redondeo habituales.
La práctica de las realizaciones descritas en el presente documento emplea, salvo que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, biología molecular, la genética, química, microbiología, ADN recombinante e inmunología.
El término "célula", como se usa en el presente documento, también se refiere a células individuales, estirpes celulares o cultivos derivados de dichas células. Un "cultivo" se refiere a una composición que comprende células aisladas del mismo tipo o de un tipo diferente. "Cultivo", "población" o "población celular", como se usan en el presente documento, pueden ser y se usan indistintamente, y su significado será evidente dependiendo del contexto. Por ejemplo, el término "población" puede ser un cultivo celular de más de una célula que tenga las mismas características de identificación o puede ser un cultivo de más de un tipo de célula que tenga diferentes características de identificación, por ejemplo, una población, en un contexto, puede ser una subpoblación en otro contexto. El término "subpoblación" se refiere a un subconjunto de un cultivo o de una población de células cuando se usa para describir ciertos tipos de células dentro del cultivo celular o de la población celular.
Como se usa en el presente documento, la expresión "células madre totipotentes" se refiere a las células que tienen la capacidad de diferenciarse en todas las células que constituyen un organismo, tales como las células que se producen a partir de la fusión de un óvulo y un espermatozoide. Las células producidas por las primeras divisiones del óvulo fertilizado también pueden ser totipotentes. Estas células pueden diferenciarse en tipos de células embrionarias y extraembrionarias. Las células madre pluripotentes, tales como las células ES, por ejemplo, pueden dar lugar a cualquier tipo de células fetales o adultas. Sin embargo, solas no pueden convertirse en un animal fetal o adulto, porque carecen del potencial para desarrollar tejido extraembrionario. El tejido extraembrionario es, en parte, derivado del endodermo extraembrionario, y se puede clasificar además en endodermo parietal (membrana de Reichert) y endodermo visceral (forma parte del saco vitelino). Tanto el endodermo parietal como el visceral apoyan los desarrollos del embrión, pero no forman estructuras embrionarias. También existen otros tejidos extraembrionarios, que incluyen el mesodermo extraembrionario y el ectodermo extraembrionario.
En algunas realizaciones, se usa una "célula pluripotente" como material de partida para la diferenciación al linaje endodérmico, o más particularmente, a las células de tipo endodermo pancreático. Como se usa en el presente documento, "pluripotencia" o "células pluripotentes" o equivalentes de las mismas se refieren a las células que son capaces de proliferar en el cultivo celular y de diferenciarse hacia variosvarias poblaciones de células de linaje restringido que presentan propiedades multipotentes, por ejemplo, tanto las células Es pluripotentes como las células madre pluripotentes inducidas (iPS) pueden dar lugar a cada uno de los tres linajes de células embrionarias. Las células pluripotentes, sin embargo, no son capaces de producir un organismo completo. Es decir, las células pluripotentes no son totipotentes.
En determinadas realizaciones, las células pluripotentes usadas como material de partida son células madre, entre las que se incluyen las células hES, células hEG, células iPS, incluso células partenogénicas y similares. Como se usa en el presente documento, "embrionario" puede referirse a un intervalo de fases del desarrollo de un organismo que comienza con un solo cigoto y termina con una estructura multicelular que ya no comprende células pluripotentes o totipotentes distintas de las células gaméticas desarrolladas. Las células pluripotentes no se derivan o no se derivan inmediatamente de embriones, por ejemplo, las células iPS se derivan de una célula no pluripotente, por ejemplo, una célula multipotente o célula diferenciada terminalmente. Las estirpes de células madre pluripotentes humanas usadas en el presente documento incluyen hESC e iPSC, o cualquiera de las enumeradas en la Tabla 4.
Las células madre pluripotentes humanas también se pueden definir o caracterizar por la presencia de varios factores de transcripción y proteínas de la superficie celular, incluyendo los factores de transcripción Oct-4, Nanog y Sox-2, que forman el complejo regulador central que garantiza la supresión de los genes que conducen a la diferenciación y al mantenimiento de la pluripotencia; y antígenos de la superficie celular, tales como los glicolípidos SSEA3, SSEA4 y los antígenos de sulfato de queratina, Tra-1-60 y Tra-1-81, y fosfatasa alcalina.
Como se usa en el presente documento, la expresión "células madre pluripotentes inducidas" o "células iPS" o "iPSC", se refiere a un tipo de célula madre pluripotente preparada artificialmente a partir de una célula no pluripotente, normalmente, una célula somática adulta o célula diferenciada terminalmente, tal como un fibroblasto, una célula hematopoyética, un miocito, una neurona, una célula epidérmica o similares, insertando ciertos genes o productos genéticos, denominados factores de reprogramación. Véase Takahashi et al., Cell 131:861-872 (2007); Wernig et al., Nature 448:318-324 (2007); Park et al., Nature 451:141-146 (2008). Estos y otros métodos conocidos posteriores para la preparación de iPSC son bien conocidos, y la forma en que se derivan o producen iPSC no es limitante de la presente invención. Las células madre pluripotentes inducidas son esencialmente similares a las células madre pluripotentes humanas naturales, tales como las células hES, en muchos aspectos incluyendo, la expresión de ciertos genes y proteínas de células madre, patrones de metilación de la cromatina, tiempo de duplicado, formación de cuerpos embrionarios, formación del teratomas, formación de quimeras viables, y potencia y capacidad de diferenciación. Las células iPS humanas proporcionan una fuente de células madre pluripotentes sin el uso asociado de embriones.
Como se usa en el presente documento, el término "reprogramación", "reprogramados" o sus equivalentes, se refiere a un proceso que confiere a una célula una capacidad considerablemente superior para formar una progenie de al menos un nuevo tipo de célula, ya sea en cultivo o in vivo, de lo que tendría en las mismas condiciones sin reprogramación. En ciertas realizaciones descritas en el presente documento, Las células somáticas se "reprograman" a células pluripotentes. En determinados aspectos, las células somáticas se reprograman cuando, tras suficiente proliferación, una proporción medible de células, ya sea in vivo o en un cultivo celular in vitro, muestra características fenotípicas del nuevo tipo de célula pluripotente. Sin reprogramación, dichas células somáticas no darían lugar a una progenie que presentara características fenotípicas del nuevo tipo de célula pluripotente. Si, incluso sin reprogramación, las células somáticas pudieran dar lugar a una progenie con características fenotípicas del nuevo tipo de célula pluripotente, la proporción de la progenie de estas células somáticas que muestra características fenotípicas del nuevo tipo de célula pluripotente es considerablemente mayor que antes de la reprogramación.
Como se usa en el presente documento, la expresión "programación de diferenciación" se refiere a un proceso que cambia una célula para formar una progenie de al menos un nuevo tipo de célula con un nuevo estado de diferenciación, ya sea en cultivo o in vivo, del que tendría en las mismas condiciones sin reprogramación de la diferenciación. Este proceso incluye la diferenciación, desdiferenciación y transdiferenciación. Por consiguiente, como se usa en el presente documento, la expresión "diferenciación" se refiere al proceso mediante el que una célula menos especializada se convierte en un tipo de célula más especializada. Por el contrario, la expresión "desdiferenciación" se refiere a un proceso celular en el que una célula diferenciada de manera parcial o terminal vuelve a una etapa de desarrollo anterior, tal como una célula que tiene pluripotencia o multipotencia. En mayor contraste, la expresión "transdiferenciación" se refiere a un proceso de transformación de un tipo de célula diferenciada en otro tipo de célula diferenciada.
Como se usa en el presente documento, "multipotencia" o "célula multipotente" o sus equivalentes se refieren a un tipo de célula que puede dar lugar a un número limitado de otros tipos de células en particular. Es decir, las células multipotentes se comprometen con uno o más destinos de células embrionarias, y por lo tanto, en contraste con las células pluripotentes, no pueden dar lugar a cada uno de los tres linajes de células embrionarias, ni a células extraembrionarias. Las células somáticas multipotentes son más diferenciadas en relación con las células pluripotentes, pero no se diferencian terminalmente. Las células pluripotentes, por lo tanto, tienen una mayor potencia que las células multipotentes. Los factores determinantes de la potencia que pueden reprogramar células somáticas o que se usan para generar células iPS incluyen, pero sin limitación, factores tales como Oct-4, Sox2, FoxD3, UTF1, Stella, Rex1, ZNF206, Sox15, Myb12, Lin28, Nanog, DPPA2, ESG1, Otx2 o combinaciones de los mismos.
Como se usa en el presente documento, "unipotente" o "unipotencia" o "célula unipotente" o sus equivalentes, se refiere a un tipo de célula que puede dar lugar a una sola célula de otro linaje. Por ejemplo, las células beta inmaduras según lo descrito en el presente documento tienen la capacidad de diferenciarse solo en células beta de insulina, y no tienen el potencial de diferenciarse en células de glucagón (alfa), células de somatostatina (delta) y células de polipéptido pancreático (gamma), por ejemplo. Por el contrario, las células precursoras endocrinas, las células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1, las células endodérmicas definitivas o las células mesendodérmicas, y las células hES son todas células multipotentes o pluripotentes (hESC) que pueden dar lugar a cada una de entre células de los islotes pancreáticos alfa, beta, delta y gamma. De forma similar, las células de los islotes pancreáticos alfa, beta, delta y gamma son células de linaje de células precursoras endocrinas, células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1, células endodérmicas definitivas o células mesendodérmicas, y células hES.
Como se usa en el presente documento, las células "de una sola hormona" y "polihormonales" se refieren a células que expresan solo una hormona (por ejemplo, las células beta inmaduras y las células beta expresan solo la proteína insulina, y no la proteína glucagón o somatostatina), o expresan más de una o múltiples hormonas (por ejemplo, las células precursoras endocrinas o células progenitoras tienen subpoblaciones de células que expresan 2, 3 o 4 o más hormonas en la misma célula). Como se usa en el presente documento, El "agente activador de la tirosina quinasa del receptor de ERBB" incluye, pero sin limitación, al menos 16 ligandos de la familia de EGF diferentes que se unen a los receptores de ERBB: e Gf (factor de crecimiento epidérmico), AG o AREG (Anfirregulina) y TGF-Alfa (factor de crecimiento transformante alfa), Btc (Betacelulina), HBEGF (EGF de unión a heparina) y Ereg (epirregulina), Neuregulinas (o Heregulinas) tales como Neuregulina-1, -2, -3 y -4 (o Heregulina-1, -2, -3 y -4). Sin embargo, la presente invención contempla cualquier ligando que sea capaz de unirse a uno cualquiera de los cuatro receptores de ERBB o una combinación de los mismos para inducir la formación de complejos de receptores homodiméricos y heterodímeros que conducen a la activación del dominio de la quinasa intrínseca y la posterior fosforilación. Véase también la Tabla 13.
La expresión "linaje celular", como se usa en el presente documento, se refiere a todas las fases del desarrollo de un tipo celular, desde la célula precursora más antigua hasta una célula completamente madura (es decir, una célula especializada). Por ejemplo, una "célula de linaje endodérmico definitivo" o una "célula de linaje endodérmico negativa en PDX1" o una "célula de linaje endodérmico pancreático positiva en PDX1" o una "célula de linaje precursor endocrino" o una "célula de linaje endocrino" o una "célula de linaje beta inmaduro" y similares se refieren a células derivadas de o diferenciadas de una célula endodérmica definitiva, una célula endodérmica negativa en PDX1, una célula endodérmica pancreática positiva en PDX1 y similares. una célula endodérmica definitiva es un linaje de una célula mesendodérmica, uno de sus precursores. Una célula endodérmica pancreática positiva en PDX-1 es un linaje de una célula endodérmica definitiva, uno de sus precursores. Un precursor endocrino en el linaje de una célula pancreática positiva en PDX1, una célula endodérmica definitiva y una célula mesendodérmica, todos son sus precursores. Una célula beta inmadura en un linaje de una célula precursora endocrina, una célula pancreática positiva en PDX1, una célula endodérmica definitiva y una célula mesendodérmica, todos son sus precursores. Una célula beta es el único linaje, por ejemplo, de una célula beta inmadura. No obstante, todas las células del linaje endodérmico descritas en el presente documento son células del linaje hES.
Una "célula precursora" o "célula progenitora", como se usa en el presente documento, en general, puede ser cualquier célula de una vía de diferenciación celular que sea capaz de diferenciarse en una célula más madura. Como tales, una célula precursora puede ser una célula pluripotente, o puede ser una célula multipotente parcialmente diferenciada o una célula diferenciada reversiblemente. La expresión "población de células precursoras" se refiere a un grupo de células capaces de desarrollarse en un tipo de célula más maduro o diferenciado. Una población de células precursoras puede comprender células que sean pluripotentes, células que tengan un linaje de células madre restringido (es decir, células capaces de desarrollarse en menos de todos los linajes ectodérmicos, o en, por ejemplo, solo células de linaje neuronal), y células que están reversiblemente restringidas al linaje de células madre. Por lo tanto, el término "célula progenitora" o "célula precursora" puede ser una "célula pluripotente" o "célula multipotente".
Una "célula progenitora/precursora endocrina", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula multipotente del linaje endodérmico definitivo que expresa al menos un marcador de la lista que consiste en neurogenina 3 (NEUROG3), PDX1, PTF1A, SOX9, NKX6.1, HNF1b, GATA4, HNF6, FOXA1, FOXA2, GATA6, MYT1, ISLET1, NEUROD, SNAIL2, MNX1, IA1, RFX6, PAX4, PAX6, NKX2.2, MAFA y MAFB, que pueden diferenciarse aún más en células del sistema endocrino, incluyendo, pero sin limitación, células que expresan la hormona del islote pancreático. Las células progenitoras/precursoras endocrinas no pueden diferenciarse en tantas células diferentes, tipos de tejidos y/u órganos en comparación con las células del linaje endodérmico definitivo diferenciadas menos específicamente, tales como las células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 o las células endodérmicas definitivas o las células mesendodérmicas. Las células progenitoras/precursoras endocrinas se describen en detalle en al menos la patente de EE. UU. n.° 8.129.182.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "desarrollarse a partir de células pluripotentes", "diferenciarse de las células pluripotentes", "madurar a partir de células pluripotentes" o "producirse a partir de células pluripotentes", "derivarse de células pluripotentes", "diferenciarse de células pluripotentes" y las expresiones equivalentes se refieren a la producción de un tipo de células diferenciadas a partir de células pluripotentes in vitro o in vivo, por ejemplo, en el caso de células endocrinas maduradas a partir de células endodérmicas pancreáticas PDX1 trasplantadas in vivo como se describe en la solicitud de patente internacional n.° PCT/US2007/015536, titulada "METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES". Todos estos términos y expresiones se refieren a la progresión de una célula desde la fase de tener el potencial de diferenciarse en al menos dos linajes celulares diferentes para convertirse en una célula especializada y diferenciada terminalmente. Dichos términos se pueden usar indistintamente para los fines de la presente solicitud. Las realizaciones descritas en el presente documento contemplan condiciones de cultivo que permiten que dicha diferenciación sea reversible, de modo que se pueda recuperar selectivamente la pluripotencia o al menos la capacidad de diferenciarse en más de un linaje celular.
La expresión "célula alimentadora" se refiere a un cultivo de células que crece in vitro y secreta al menos un factor en el medio de cultivo, y que se puede usar para apoyar el crecimiento de otra célula de interés en el cultivo. Como se usa en el presente documento, una "capa de células alimentadoras" se puede usar indistintamente con el término "célula alimentadora". Una célula alimentadora puede comprender una monocapa, en la que las células alimentadoras cubren la superficie de la placa de cultivo con una capa completa antes de crecer una encima de la otra, o pueden comprender grupos de células. En una realización preferida, la célula alimentadora comprende una monocapa adherente.
De forma similar, las realizaciones en las que los cultivos de células pluripotentes o los cultivos en suspensión pluripotentes agregados se hacen crecer en condiciones o sistemas de cultivo definidos sin el uso de células alimentadoras están "exentos de células alimentadoras". Los métodos de cultivo exentos de células alimentadoras aumentan la escalabilidad y reproducibilidad del cultivo de células pluripotentes y reduce el riesgo de contaminación, por ejemplo, mediante agentes infecciosos de las células alimentadoras u otros componentes de cultivo de origen animal. Los métodos exentos de células alimentadoras también se describen en la patente de EE. UU. n.° 6.800.480 de Bodnar et al., (asignado a Geron Corporation, Menlo Park, California). Sin embargo, y en contraste con la patente de EE.UU. n.° 6.800.480, las realizaciones descritas en el presente documento, ya sean cultivos de células pluripotentes, multipotentes o diferenciadas, están exentos de células alimentadoras y no contienen además una matriz extracelular endógena o exógena; es decir, los cultivos descritos en el presente documento están exentos de matriz extracelular, además de estar exentos de células alimentadoras. Por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.° 6.800.480, la matriz extracelular se prepara mediante el cultivo de fibroblastos, lisando los fibroblastos in situ y luego lavando lo que queda tras la lisis. Como alternativa, en la patente de EE.UU. n.° 6.800.480, la matriz extracelular también se puede preparar a partir de un componente de matriz aislado o una combinación de componentes seleccionados entre colágeno, matriz placentaria, fibronectina, laminina, merosina, tenascina, sulfato de heparina, sulfato de condroitina, dermatán sulfato, agrecán, biglicano, trombospondina, vitronectina y decorina. Las realizaciones descritas en el presente documento ni producen una matriz extracelular mediante el crecimiento de una capa alimentadora o de fibroblastos y el lisado de las células para producir la matriz extracelular; ni requieren primero recubrir el vaso de cultivo tisular con un componente de matriz extracelular o una combinación de componentes de matriz extracelular seleccionados entre colágeno, matriz placentaria, fibronectina, laminina, merosina, tenascina, sulfato de heparina, sulfato de condroitina, dermatán sulfato, agrecán, biglicano, trombospondina, vitronectina y decorina. Por consiguiente, los cultivos en suspensión de agregados descritos en el presente documento para células pluripotentes, multipotentes y diferenciadas no requieren una capa alimentadora, una célula alimentadora o fibroblástica lisada para producir un recubrimiento de matriz extracelular, una matriz extracelular o componente de matriz añadido exógenamente; en cambio, el uso de un componente de suero humano soluble como se describe en la solicitud internacional PCT/US2008/080516, titulada "METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIPOTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HUMAN SERUM", cubre la necesidad de una célula alimentadora o una monocapa alimentadora, cubriendo a la vez la necesidad de una matriz extracelular endógena de una célula alimentadora o fibroblástica o de componentes de matriz extracelular añadidos exógenamente.
Como se usan en el presente documento, los términos "agrupación" y "grupo" o "agregado" se pueden usar indistintamente, y, en general, se refieren a un grupo de células que no se han disociado en células individuales y que luego se han agregado formando agrupaciones o, que tienen contacto cercano de célula a célula. El término "reagregarse", como se usa en el presente documento, se refiere a cuando las agrupaciones, grupos y/o agregados se disocian en agrupaciones, grupos y/o agregados menores, o células individuales y luego forman nuevos contactos de célula a célula mediante la agregación en agrupaciones, grupos y/o agregados. Esta disociación normalmente es de naturaleza manual (tal como usando una pipeta Pasteur), pero se contemplan otros medios de disociación. Los cultivos de células pluripotentes o multipotentes en suspensión agregadas son esencialmente como se describe en las publicaciones internacionales PCT/US2007/062755, titulada "COMPOSITIONS AND METHODS FOR CULTURING DIFFERENTIAL CELLS" y PCT/US2008/082356, titulada "STEM CELL AGGREGATE SUSPENSION COMPOSITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATION THEREOF".
La expresión "suspensión de una sola célula" o sus equivalentes se refiere a una suspensión de una sola célula pluripotente, multipotente o diferenciada terminalmente, o una suspensión de una sola célula derivada de una célula pluripotente o multipotente, mediante cualquier medio mecánico o químico. Existen varios métodos para disociar agrupaciones de células para formar suspensiones de una sola célula de tejidos primarios, células unidas en cultivo y agregados, por ejemplo, fuerzas físicas (disociación mecánica tal como raspador de células, trituración a través de una pipeta de orificio estrecho, aspiración con aguja fina, desagregación vorticial y filtración forzada a través de una malla fina de nylon o acero inoxidable), enzimas (disociación enzimática tal como tripsina, colagenasa, Accutase™ y similares), o una combinación de ambos. Además, métodos y condiciones de medios de cultivo capaces de soportar la disociación en células individuales de células pluripotentes, multipotentes o diferenciadas son útiles para la expansión, la clasificación celular y la siembra definida para los ensayos de placas de múltiples pocillos y permiten la automatización de los procedimientos de cultivo y la expansión clónica.
En realizaciones preferidas, los métodos de cultivo o los sistemas de cultivo están exentos de productos de origen animal. En otra realización preferida, los métodos de cultivo son exentos de xeno. En realizaciones aún más preferidas, una o más condiciones o requisitos para la fabricación comercial de productos terapéuticos de células humanas cumplían o superaban los métodos de cultivo descritos en el presente documento.
La población de células pluripotentes se puede cultivar además en presencia de ciertos factores de crecimiento suplementarios para obtenerse una población de células que se desarrollan o se desarrollarán en diferentes linajes celulares, o se puedan revertir selectivamente para poder desarrollarse en diferentes linajes celulares. La expresión "factor de crecimiento suplementario" se usa en su contexto más amplio, y se refiere a una sustancia que es eficaz para potenciar el crecimiento de una célula pluripotente, mantener la supervivencia de una célula, estimular la diferenciación de una célula y/o estimular la reversión de la diferenciación de una célula. Además, un factor de crecimiento suplementario puede ser una sustancia que sea secretada por una célula alimentadora en su medio. Dichas sustancias incluyen, pero sin limitación, citocinas, quimiocinas, moléculas pequeñas, anticuerpos neutralizantes y proteínas. Los factores de crecimiento también pueden incluir polipéptidos de señalización intercelular, que controlan el desarrollo y el mantenimiento de las células, así como la forma y función de los tejidos. En realizaciones preferidas, el factor de crecimiento suplementario se selecciona del grupo que comprende el factor de células madre (SCF), oncostatina M (OSM), factor neurotrófico ciliar (CNTF), interleucina-6 (IL-6) en combinación con el receptor de interleucina-6 soluble (IL-6R), un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), una proteína morfogenética ósea (BMP), factor de necrosis tumoral (TNF) y factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF).
En ciertos procesos para producir las células como se describe en el presente documento, los factores de crecimiento se retiran del cultivo celular o de la población celular tras su adición. Por ejemplo, el factor de crecimiento, tal como la Activina A, Activina B, GDF-8 o GDF-11 se pueden añadir y retirar en aproximadamente un día, aproximadamente dos días, aproximadamente tres días, aproximadamente cuatro días, aproximadamente cinco días, aproximadamente seis días, aproximadamente siete días, aproximadamente ocho días, aproximadamente nueve días o aproximadamente diez días tras su adición. En algunas realizaciones, los factores de diferenciación no se retiran del cultivo celular en sí, pero su omisión del medio de cultivo celular es un medio de eliminación, por ejemplo, el cambio de un medio de cultivo celular que contenía Activina a uno que no contenía Activina.
Debido a que la eficiencia del proceso de diferenciación se puede ajustar modificando ciertos parámetros, que incluyen, pero sin limitación, condiciones de crecimiento celular, concentraciones de factores de crecimiento y la duración de las etapas de cultivo, los procedimientos de diferenciación descritos en el presente documento pueden dar lugar al aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o más del aproximadamente 95 % de conversión de las células pluripotentes, que incluye células pluripotentes inducidas, a células multipotentes o diferenciadas, por ejemplo, endodermo definitivo. Por otra parte, la tasa de conversión o la tasa de eficiencia también pueden referirse a la diferenciación de un tipo de célula multipotente en una célula multipotente diferenciada adicional, por ejemplo, de endodérmicas definitivas a endodérmicas del tracto digestivo superior, endodérmicas del tracto digestivo superior positivas en PDX1, endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 o endodérmicas pancreáticas positivas tanto en PDX1 como en NKX6.1, progenitoras/precursoras endocrinas o progenitoras/precursoras endocrinas positivas tanto en NGN3 como en NKX2.2 y células endocrinas secretoras de hormonas o células endocrinas positivas solo en INS, GCG, GHRL, SST, PP. En los procesos en los que se emplea el aislamiento de células mesendodérmicas o en estrías preprimitivas, se puede recuperar una población de células mesendodérmicas o en estrías preprimitivas pura.
Los métodos generales para la producción de células del linaje endodérmico derivadas de células hES se describen en las solicitudes de EE.UU. relacionadas como se ha indicado anteriormente, y D'Amour et al. 2005 Nat Biotechnol.
23:1534-41, publicado en línea el viernes 28 de octubre de 2005; D'Amour et al. 2006 Nat Biotechnol. 24(11):1392-401, publicado en línea el jueves 19 de octubre de 2006; Kroon et al. (2008) Nat Biotechnol. 26 (4):443-452, publicado en línea el miércoles 20 de febrero de 2008; Kelly et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29(8):750-6, publicado en línea el domingo 31 de julio de 2011; y Schulz et al. (2012) PLosOne, 7(5): e37004, publicado en línea el viernes 18 de mayo de 2012. D'Amour et al. Describen un protocolo de diferenciación de 5 etapas: fase 1 (da lugar a la mayoría de la producción endodérmica definitiva), fase 2 (da lugar a la mayoría de la producción endodérmica del tracto digestivo superior negativa en PDX1), fase 3 (da lugar a la mayoría de la producción endodérmica del tracto digestivo superior positiva en PDX-1), fase 4 (da lugar a la mayoría de la producción endodérmica pancreática o progenitora endocrina pancreática) y fase 5 (da lugar a la mayoría de la producción de células endocrinas que expresan hormonas).
El término "trofectodermo" se refiere a una célula multipotente que tiene la expresión relativa alta de marcadores seleccionados del grupo que comprende genes HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2 y ERBB en comparación con los niveles de expresión de HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2 y ERBB en células o poblaciones de células no trofectodérmicas.
La expresión "endodérmica extraembrionaria" se refiere a una célula multipotente que tiene niveles de expresión relativa altos de marcadores seleccionados del grupo que comprende genes SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1 o AFP en comparación con los niveles de expresión de SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1 o AFP en células o poblaciones de células endodérmicas no extraembrionarias.
La expresión "células en estrías preprimitivas" se refiere a una célula multipotente que tiene niveles de expresión relativa altos de los genes de marcadores FGF8 y/o NODAL, en comparación con un bajo nivel de BRAQUIURIA, bajo nivel de FGF4, bajo nivel de SNAI1, bajo nivel de SOX17, bajo nivel de FOXA2, bajo nivel de SOX7 y bajo nivel de SOX1.
La expresión "célula mesendodérmica" se refiere a una célula multipotente que tiene niveles de expresión relativa altos de genes de marcadores braquiuria, FGF4, SNAI1 MIXL1 y/o WNT3, en comparación con bajo nivel de SOX17, bajo nivel de CXCR4, bajo nivel de FOXA2, bajo nivel de SOX7 y bajo nivel de SOX1.
La expresión "célula endodérmica definitiva (DE)" se refiere a una célula de linaje endodérmico multipotente que puede diferenciarse en células del tubo intestinal u órganos derivados del tubo intestinal. De acuerdo con determinadas realizaciones, las células endodérmicas definitivas son células de mamíferos, y en una realización preferida, las células endodérmicas definitivas son células humanas. En algunas realizaciones de la presente invención, las células endodérmicas definitivas expresan o no expresan significativamente ciertos marcadores. En algunas realizaciones, uno o más marcadores seleccionados de SOX17, CXCR4, MIXL1, GATA4, HNF3p, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 y CRIP1 se expresan en células endodérmicas definitivas. En otras realizaciones, uno o más marcadores seleccionados de OCT4, alfa-fetoproteína (AFP), Trombomodulina (TM), SPARC, SOX7 y HNF4alfa no se expresan o expresan significativamente en células endodérmicas definitivas. Las poblaciones de células endodérmicas definitivas y sus métodos de producción también se describen en la solicitud de EE. UU. n.° 11/021.618, titulada "DEFINITIVE En Do DERM", presentada el jueves 23 de diciembre de 2004.
La expresión "células endodérmicas del tracto digestivo superior negativas en PDX1" o "células endodérmicas del tracto digestivo superior" o equivalentes de las mismas son células que expresan marcadores SOX17, HNF1p (HNF1B), HNF4alfa (HNF4A) y FOXA1, pero no expresan sustancialmente PDX1, AFP, SOX7 o SOX1. Las poblaciones de células endodérmicas del tracto digestivo superior negativas en PDX1 y los métodos de producción de las mismas también se describen en la solicitud de EE.u U. n.° 11/588.693, Titulada "PDX1-expressing dorsal and ventral foregut endoderm", presentada el viernes 27 de octubre de 2006.
La expresión "células endodérmicas del tracto digestivo superior, con sesgo dorsal, positivas en PDX1" (células endodérmicas del tracto digestivo superior positivas en PDX1 dorsales) o simplemente "endodérmicas positivas en PDX1" o los equivalentes de las mismas son células que expresan uno o más marcadores seleccionados de la Tabla 1 y/o uno o más marcadores seleccionados de la Tabla 2, también descrito en la solicitud de EE. UU. relacionada 11/588.693, titulada "PDX1 EXPRESSING DOSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM", presentada el 27 de octubre de 2006 y también en la solicitud de EE.UU. n.° 11/115.868, titulada "PDX1-expressing endoderm", presentada el martes 26 de abril de 2005.
Tabla 1: Marcadores expresados en endodermo de tracto digestivo superior positivo en PDX1 tanto dorsal como ventral
Figure imgf000022_0001
(continuación)
Figure imgf000023_0001
T l 2: M r r x r n n rm i iv ri r iiv n PDX1 n r l.
Figure imgf000023_0002
(continuación)
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La expresión "endodermo pancreático" "epitelio pancreático" "epitelio pancreático" (todos pueden abreviarse como "PE"), "progenitor pancreático", "endodermo pancreático positivo en p DX-1" o sus equivalentes, tales como "células endodérmicas pancreáticas" (PEC), son todos células pancreáticas precursoras o progenitoras. La PEC como se describe en el presente documento es una población de células progenitoras posterior a la diferenciación de fase 4 (aproximadamente día 12-14), e incluye al menos dos poblaciones distintas principales: i) células progenitoras pancreáticas que expresan PDX1 y NKX6.1, pero no expresan CHGA (o negativas en CHGA, CHGA-), o "subpoblaciones progenitoras multipotentes no endocrinas (CHGA-)", o "subpoblaciones no endocrinas (CHGA-)" o "células no endocrinas (CHGA-)" o equivalentes de las mismas; e ii) células endocrinas polihormonales que expresan CHGA (positivas en CHGA, CHGA+) o "subpoblaciones progenitoras multipotentes endocrinas (CHGA+)", o "subpoblaciones endocrinas (CHGA+)" o "células endocrinas (CHGA+)" o equivalentes de las mismas. La subpoblación progenitora pancreáticas PEC que expresa PDX1 y NKX6.1, pero no expresa CHGA también se conoce como "subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina (CHGA-)" o "subpoblación progenitora no endocrina", "subpoblación no endocrina (CHGA-)", "subpoblación no endocrina (CHGA-)", "subpoblación progenitora multipotente" y similares. La subpoblación de células endocrinas polihormonales PEC que expresa CHGA también se conoce como "células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+)" o "células endocrinas "o "células CHGA+" y similares. Sin quedar ligados a teoría alguna, la población celular que expresa NKX6.1, pero no CHGA se supone que es el componente más activo o terapéutico de PEC, mientras que se supone que la población de células endocrinas polihormonales positivas en CHGA se diferencia más y madura in vivo en células de los islotes que expresan glucagón.
Véase Kelly et al. (2011) "Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells", Nat Biotechnol. 29(8):750-756, publicado en línea el 31 de julio de 2011 y Schulz et al. (2012), "A Scalable System for Production of Functional Pancreatic Progenitors from Human Embryonic Stem Cells", PLosOne 7(5): 1-17, e37004.
Aun así, a veces, las células endodérmicas pancreáticas se usan sin referencia a PEC como se acaba de describir, pero para referirse al menos a las células en fase 3 y 4 en general. El uso y el significado serán evidentes a partir del contexto. El endodermo pancreático derivado de células madre pluripotentes, y al menos células hES y hIPS, de esta manera, se distingue de otros tipos de células de linaje endodérmico en función de los niveles de expresión diferenciales o altos de marcadores seleccionados entre marcador PDX1, NKX6.1, PTF1A, CPA1, cMYC, NGN3, PAX4, ARX y NKX2.2, pero no expresan sustancialmente genes que sean el sello distintivo de las células endocrinas pancreáticas, por ejemplo, CHGA, INS, GCG, GHRL, SST, MAfA, PCSK1 y GLUT1. Además, Algunas las "células progenitoras endocrinas" que expresan NGN3 pueden diferenciarse en otras estructuras no pancreáticas (por ejemplo, duodeno). Las poblaciones de células endodérmicas pancreáticas o progenitoras endocrinas, y sus métodos también se describen en la solicitud de patente de EE.UU. n.° 11/773.944, titulada "Methods of producing pancreatic hormones", presentada el 5 de julio de 2007 y la solicitud de patente de EE.UU. n.° 12/107.020, titulada "METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FORM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS", presentada el lunes 21 de abril de 2008.
La expresión "célula endocrina" o "célula que expresa la hormona del islote pancreático", "célula endocrina pancreática", "célula de los islotes pancreáticos", "islotes pancreáticos" o equivalentes de las mismas se refieren a una célula, que puede ser polihormonal o de una sola hormona. Las células pueden, por tanto, expresar una o más hormonas pancreáticas que tengan al menos algunas de las funciones de una célula de islote pancreático humana. Las células que expresan hormonas de islote pancreático pueden ser maduras o inmaduras, y diferenciarse posteriormente o comprometerse evolutivamente posteriormente en comparación con una célula de tipo progenitor/precursor endocrino de la que derivan.
Como se usa en el presente documento, la expresión "células endocrinas adecuadamente especificadas" o "cultivos en fase 7" o "células endocrinas inmaduras" que incluyen "células beta inmaduras" se refiere a poblaciones de células endocrinas fabricadas in vitro que son capaces de funcionar in vivo, por ejemplo, las células beta inmaduras, cuando se trasplantan, secretan insulina en respuesta a la glucosa en sangre. Las células endocrinas o los cultivos en fase 7 adecuadamente especificados pueden tener características adicionales que incluyen las siguientes: cuando se trasplantan, las células endocrinas adecuadamente especificadas pueden desarrollarse y madurar hasta convertirse en células funcionales de los islotes pancreáticos. Las células endocrinas especificadas adecuadamente pueden enriquecerse en células endocrinas (o agotarse de células no endocrinas). En una realización preferida, más del 50 % de las células de la población de células endocrinas adecuadamente especificadas son CHGA+. En una realización más preferida, más del aproximadamente 60 % o 70 % u 80 % o 90 % o 95 % o 98 % o 100 % de las células de la población de células endocrinas especificadas apropiadamente son CHGA+. En una realización preferida, menos del aproximadamente 50 % de las células de la población de células endocrinas adecuadamente especificadas son CHGA-. En una realización más preferida, menos del aproximadamente 15 % de las células de la población de células endocrinas adecuadamente especificadas son CHGA-. En una realización más preferida, menos del aproximadamente 10 % o 5 % o 3 % o 2 % o 1 % o 0,5 % o 0 % de las células de la población de células endocrinas adecuadamente especificadas son CHGA-. Además, la expresión de ciertos marcadores puede suprimirse en células endocrinas debidamente especificadas, tales como la expresión de NGN3 durante la fase 3. Las células endocrinas adecuadamente especificadas pueden tener una mayor expresión de NGN3 en la fase 5. Las células endocrinas especificadas adecuadamente pueden ser de una sola hormona (por ejemplo, solo INS, solo GCG o solo SST). Las células endocrinas especificadas adecuadamente pueden expresar conjuntamente otros marcadores de células endocrinas inmaduras, incluyendo NKX6.1 y PDX1. Las células endocrinas especificadas adecuadamente pueden tanto expresar una sola hormona como expresar conjuntamente otros marcadores de células endocrinas inmaduras, incluyendo NKX6.1 y PDX1. Las células endocrinas especificadas adecuadamente pueden tener más células que solo expresan la hormona INS como porcentaje de la población total de INS. En una realización preferida, las células endocrinas especificadas apropiadamente tienen al menos un 50 % de células que expresan una sola hormona INS como porcentaje de la población total de INS. Las células endocrinas especificadas adecuadamente pueden ser CHGA+/INS+/NKX6.1+ (triple positivas). En una realización preferida, más del aproximadamente 25 % de las células de la población celular son CHGA+/INS+/NKX6.1+ (triple positivas). En una realización preferida, más del aproximadamente 30 % o 40 % o 50 % o 60 % o 70 % u 80 % o 90 % o 95 % 100 % de las células de la población celular son CHGA+/INS+/NKX6.1+ (triple positivas).
La expresión "célula endocrina inmadura", específicamente una "célula beta inmadura" o sus equivalentes se refieren a una célula derivada de cualquier otro precursor de células endocrinas que incluya una célula progenitora/precursora endocrina, una célula endodérmica pancreática (PE), una célula pancreática del tracto digestivo superior, una célula endodérmica definitiva, una célula mesendodérmica o cualquier otra célula derivada descrita más adelante, que expresa al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en INS, NKX6.1, PDX1, NEUROD, MNX1, n Kx 2.2, MAFA, PAX4, SNAIL2, FOXA1 o FOXA2. Preferentemente, una célula beta inmadura descrita en el presente documento expresa INS, NKX6.1 y PDX1, y más preferentemente expresa conjuntamente INS y NKX6.1. Las expresiones "célula endocrina inmadura", "célula inmadura que expresa hormonas pancreáticas" o "islote pancreático inmaduro" o sus equivalentes se refieren, por ejemplo, a al menos una célula beta inmadura unipotente o célula pre­ beta como se describe en la FIG.45, y no incluyen otras células inmaduras, por ejemplo, las expresiones no incluyen una célula alfa (glucagón) inmadura o una célula delta inmadura (somatostatina) o una célula épsilon inmadura (grelina) o un polipéptido pancreático inmaduro (PP).
En las realizaciones descritas en el presente documento, se contemplan muchos medios de cultivo o entornos de crecimiento de células madre, incluyendo los medios definidos, medios condicionados, medios exentos de células alimentadoras, medios sin suero y similares. Como se usa en el presente documento, la expresión "entorno de crecimiento" o "medio ambiente" o equivalentes de las mismas es un entorno en el que las células madre indiferenciadas o diferenciadas (por ejemplo, células madre embrionarias de primate) proliferarán in vitro. Las características del entorno incluyen el medio en el que se cultivan las células y una estructura de soporte (tal como un sustrato sobre una superficie sólida) si está presente. Los métodos para cultivar o mantener células pluripotentes y/o diferenciar células pluripotentes también se describen en el documento PCT/US2007/062755 titulado "COMPOSITIONS AND METHODS USEFUL FOR CULTURING DIFFERENTIABLE CELLS", presentado el viernes 23 de febrero de 2007; la solicitud de EE.UU. n.° 11/993.399, titulada "EMBRYONIC STEM CELL CULTURE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF", presentada el jueves 20 de diciembre de 2007; la solicitud de EE.UU. n.° 11/875.057, titulada" Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum", presentada el viernes 19 de octubre de 2007.
El término "esencialmente" o "sustancialmente" significa, en su mayoría o un mínimo o una cantidad reducida de un componente o de una célula presentes en cualquier población celular o cultivo, por ejemplo, los cultivos de células beta inmaduras descritos en el presente documento son "esencial o sustancialmente células" o son "esencial o sustancialmente células beta inmaduras que expresan INS, NKX6.1 y PDX1, y que no expresan esencial o sustancialmente NGN3". Otros ejemplos incluyen, pero sin limitación, "esencial o sustancialmente células HES ", "esencial o sustancialmente células endodérmicas definidas", "esencial o sustancialmente células endodérmicas de tracto digestivo superior", "esencial o sustancialmente células endodérmicas de tracto digestivo superior negativas en PDX1", "esencial o sustancialmente células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1", "esencial o sustancialmente células precursoras endocrinas pancreáticas", "esencial o sustancialmente células endocrinas pancreáticas" y similares.
Con respecto a las células de cultivos celulares o poblaciones celulares, la expresión "sustancialmente exento de" significa que el tipo de célula especificado del que está exento el cultivo celular o la población celular, está presente en una cantidad inferior a aproximadamente el 10 %, inferior a aproximadamente el 9 %, inferior a aproximadamente el 8 %, inferior a aproximadamente el 7 %, inferior a aproximadamente el 6 %, inferior a aproximadamente el 5 %, inferior a aproximadamente el 4 %, inferior a aproximadamente el 3 %, inferior a aproximadamente el 2 % o inferior a aproximadamente el 1 % del número total de células presentes en el cultivo celular o la población celular.
La expresión "de suero reducido" o "sin suero" o sus equivalentes se refiere a cultivos celulares desarrollados en un medio que contiene suero reducido o que está sustancialmente exento de suero o que no contiene suero en absoluto. En ciertas condiciones de cultivo, las concentraciones sérica pueden variar entre aproximadamente el 0 % (v/v) y aproximadamente el 10 % (v/v). Por ejemplo, en algunos procesos de diferenciación, la concentración sérica del medio puede ser inferior a aproximadamente el 0,05% (v/v), inferior a aproximadamente el 0,1% (v/v), inferior a aproximadamente el 0,2 % (v/v), inferior a aproximadamente el 0,3 % (v/v), inferior a aproximadamente el 0,4 % (v/v), inferior a aproximadamente el 0,5 % (v/v), inferior a aproximadamente el 0,6 % (v/v), inferior a aproximadamente el 0,7 % (v/v), inferior a aproximadamente el 0,8 % (v/v), inferior a aproximadamente el 0,9 % (v/v), inferior a aproximadamente el 1 % (v/v), inferior a aproximadamente el 2 % (v/v), inferior a aproximadamente el 3 % (v/v), inferior a aproximadamente el 4 % (v/v), inferior a aproximadamente el 5 % (v/v), inferior a aproximadamente el 6 % (v/v), inferior a aproximadamente el 7 % (v/v), inferior a aproximadamente el 8 % (v/v), inferior a aproximadamente el 9 % (v/v) o inferior a aproximadamente el 10 % (v/v). En algunos procesos, las células en estrías preprimitivas se cultivan sin suero o sin reemplazo de suero. En otros procesos, las células en estrías preprimitivas se cultivan en presencia de B27. En dichos procesos, la concentración de suplemento B27 puede variar de aproximadamente el 0,1 % (v/v) a aproximadamente el 20 % (v/v).
En otros procesos, los cultivos celulares se cultivan en presencia de B27. En dichos procesos, la concentración del suplemento B27 puede variar de aproximadamente el 0,1% (v/v) a aproximadamente el 20% (v/v) o en concentraciones superiores a aproximadamente el 20 % (v/v). En determinados procesos, la concentración de B27 en el medio es de aproximadamente el 0,1 % (v/v), aproximadamente el 0,2% (v/v), aproximadamente el 0,3% (v/v), aproximadamente el 0,4 % (v/v), aproximadamente el 0,5 % (v/v), aproximadamente el 0,6 % (v/v), aproximadamente el 0,7% (v/v), aproximadamente el 0,8% (v/v), aproximadamente el 0,9% (v/v), aproximadamente el 1 % (v/v), aproximadamente el 2 % (v/v), aproximadamente el 3 % (v/v), aproximadamente el 4 % (v/v), aproximadamente el 5 % (v/v), aproximadamente el 6 % (v/v), aproximadamente el 7 % (v/v), aproximadamente el 8 % (v/v), aproximadamente el 9 % (v/v), aproximadamente el 10 % (v/v), aproximadamente el 15 % (v/v) o aproximadamente el 20 % (v/v). Como alternativa, la concentración del suplemento b27 añadido se puede medir en términos de múltiplos de la concentración de una solución madre de B27 disponible en el mercado. Por ejemplo, B27 está disponible en Invitrogen (Carlsbad, CA) como una solución madre x50. La adición de una cantidad suficiente de esta solución madre a un volumen suficiente de medio de crecimiento produce un medio complementado con la cantidad deseada de B27. Por ejemplo, la adición de 10 ml de solución madre x50 de B27 a 90 ml de medio de crecimiento produciría un medio de crecimiento suplementado con B27 x5. La concentración de suplemento B27 en el medio puede ser de aproximadamente x0,1, aproximadamente x0,2, aproximadamente x0,3, aproximadamente x0,4, aproximadamente x0,5, aproximadamente x0,6, aproximadamente x0,7, aproximadamente x0,8, aproximadamente x0,9, aproximadamente x1, aproximadamente x1,1, aproximadamente x1,2, aproximadamente x1,3, aproximadamente x1,4, aproximadamente x1,5, aproximadamente x1,6, aproximadamente x1,7, aproximadamente x1,8, aproximadamente x1,9, aproximadamente x2, aproximadamente x2,5, aproximadamente x3, aproximadamente x3,5, aproximadamente x4, aproximadamente x4,5, aproximadamente x5, aproximadamente x6, aproximadamente x7, aproximadamente x8, aproximadamente x9, aproximadamente x10, aproximadamente x11, aproximadamente x12, aproximadamente x13, aproximadamente x14, aproximadamente x15, aproximadamente x16, aproximadamente x17, aproximadamente x18, aproximadamente x19, aproximadamente x20 y superior a aproximadamente x20.
En otro aspecto más, en el que los requisitos de nivel de insulina para la diferenciación son bajos, B27 no se emplea, porque B27 contiene altos niveles de insulina. Por ejemplo, el solicitante determinó los niveles de insulina en soluciones madre de B27 e ITS x100 y en soluciones madre de trabajo x1 de cada uno en RPMI. Los niveles de insulina se determinaron usando un kit de ELISA de insulina ultrasensible de Mercodia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ensayos se realizaron en soluciones madre x100 y x50 de B27 e ITS sin abrir, respectivamente, ambos adquiridos en Life Technologies (Carlsbad, California). Los resultados generados a partir del ensayo se muestran a continuación en la Tabla 3.
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La Tabla 3 muestra que hay aproximadamente 3 jg/m l y 10|jg/ml de insulina presentes en lxB27 y lxITS, respectivamente. Además, la concentración de insulina en la solución madre x100 de ITS coincide con la concentración de insulina indicada por el fabricante. Life Technologies no proporciona la concentración de insulina para B27 x50, por lo que no hay comparación con los niveles de insulina indicados por el fabricante; sin embargo, la concentración de insulina anterior de aproximadamente 160 jg/m l es exacta en función de la medición exacta de la solución madre x100 de ITS que se realizó al mismo tiempo y según McLean et al. (2007) supra, que mostró que tanto la insulina como el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) son agonistas bien establecidos de la señalización dependiente de la PI3-quinasa, lo que sugiere que un inhibidor de la PI3-quinasa (por ejemplo, LY 294002) potenciaría la formación definitiva del endodermo al inhibir los efectores de la insulina/IGF. Véase FIG.6A y B, específicamente, la expresión de SOX17 se reduce 4 veces con 1 jg/m l de insulina. La insulina y/o el IGF están presentes a niveles biológicamente activos en varios suplementos de medios tales como KSR, FCS (suero de ternera fetal), FBS (suero bovino fetal), B27 y StemPro34, y pueden inhibir la diferenciación del endodermo definitivo en dichas condiciones de cultivo, por ejemplo, Jiang et al. (2007) supra.
Como se usa en el presente documento, "exógeno" o "añadido exógenamente", compuestos tales como agentes, componentes, factores de crecimiento, factores de diferenciación, y similares, en el contexto de los cultivos o medios condicionados, se refiere a lo que se añade a los cultivos o medios para complementar cualquier compuesto o factor de crecimiento que puede o no estar ya presente en el cultivo o en los medios. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los cultivos celulares y/o las poblaciones celulares no incluyen un retinoide añadido exógenamente.
Como se usa en el presente documento, "retinoide" se refiere a retinol, ácido retiniano o retinoico, así como derivados de cualquiera de estos compuestos. En una realización preferida, el retinoide es el ácido retinoico.
El término "factor de crecimiento de la familia de los FGF" "un factor de crecimiento de fibroblastos" o "miembro de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos" significa un FGF seleccionado del grupo que comprende FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22 y FGF23. En algunas realizaciones, "factor de crecimiento de la familia de los FGF", "un factor de crecimiento de fibroblastos" o "miembro de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos" significa cualquier factor de crecimiento que tenga homología y/o función similar a un miembro conocido de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos.
La expresión "miembro de la superfamilia de TGFp" o "ligando de la superfamilia de TGFp" o "activador de la vía de señalización de TGFp TGF-beta" o equivalentes de las mismas se refiere a más de 30 proteínas relacionadas estructuralmente, incluyendo las subfamilias de TGF-beta1, TGF-beta2, TF-beta3, GDF-15, GDF-9, BMP-15, BMP-16, BMP-3, GDF-10, BMP-9, BMP-10, GDF-6, GDF-5, GDF-7, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-2, BMP-4, GDF-3, GDF-1, GDF 11, GDF8, Activinas betaC, betaE, betaA y betaB, BMP-14, GDF-14, MIS, Inhibina alfa, Leftyl, Lefty2, GDNF, Neurteurina, Persefina y Artemina. Véase Chang et al. (2002) Endocrine Rev. 23(6):787-823. Estos ligandos normalmente se sintetizan como prepropéptidos de aproximadamente 400-500 aminoácidos (aa), y un "miembro de la superfamilia de TGFp" o "ligando de la superfamilia de TGFp" o "activador de la vía de señalización de TGFp TGF-beta" o sus equivalentes pueden ser la proteína de longitud completa o un péptido proteolítico de la misma.
La expresión "ligando de ERBB" se refiere a un ligando que se une a cualquiera de los receptores de ErbB, que, a su vez, puede dimerizarse con otro receptor de ErbB, o puede funcionar como un monómero, activando así la actividad tirosina quinasa del monómero de la porción ErbB o un dímero o un receptor heterodimérico. Los ejemplos no limitantes de ligandos de ErbB incluyen neuregulina-1; variantes de corte y empalme e ¡soformas de la Neurregulina-1, incluyendo, pero sin limitación, HRG-p, HRG-a, factor de diferenciación de Neu (NDF), actividad inductora del receptor de acetilcolina (ARIA), factor de crecimiento glial 2 (GGF2) y factor derivado de las neuronas sensoriales y motoras (SMDF); Neurregulina-2; variantes de corte y empalme e isoformas de la Neuregulina-2, incluyendo, pero sin limitación, antagonistas de NRG2-p; Epirregulina; y Birregulina.
El término "expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a la producción de un material o de una sustancia, así como al nivel o a la cantidad de producción de un material o de una sustancia. Por lo tanto, la determinación de la expresión de un marcador específico se refiere a detectar la cantidad relativa o absoluta del marcador que se expresa o simplemente detectar la presencia o ausencia del marcador.
El término "marcador", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula que pueda observarse 0 detectarse. Por ejemplo, un marcador puede incluir, pero sin limitación, un ácido nucleico, tal como una transcripción de un gen específico, un producto polipeptídico de un gen, un polipéptido producto no génico, una glicoproteína, un carbohidrato, un glicolípido, un lípido, una lipoproteína o una molécula pequeña (por ejemplo, moléculas que tienen un peso molecular inferior a 10.000 uma).
Para la mayoría de los marcadores descritos en el presente documento, se proporciona el símbolo oficial del gen de la Organización del Genoma Humano (HUGO). Dichos símbolos, que son desarrollados por el Comité de Nomenclatura de Genes HUGO, proporcionan abreviaturas únicas para cada uno de los genes y productos génicos humanos nombrados. Los expertos en la materia reconocen fácilmente estos símbolos génicos y pueden asociarse fácilmente con una secuencia génica y/o proteica humana única correspondiente.
De acuerdo con las designaciones HUGO, los siguientes símbolos génicos se definen de la siguiente manera: GHRL-grelina; lAPP-polipéptido amiloide de los islotes; INS - insulina; GCG - glucagón; ISL1 -factor de transcripción ISL1; PAX6 - gen de caja pareada 6; PAX4 - gen de caja pareada 4; NEUROG3 - neurogenina 3 (NGN3); NKX2-2 - factor de transcripción de NKX2 relacionado, locus 2 (n Kx 2.2); NKX6-1 - factor de transcripción de NKX6 relacionado, locus 1 (NKX6.1); IPF1 - factor promotor de la insulina 1 (PDXl); ONECUT1 - un dominio de corte, miembro de la familia 1 (HNF6); HLXB9 - caja homeótica B9 (HB9); TCF2 - factor de transcripción 2, hepático (HNF1b); FOXA1- caja Forkhead A1; HGF - factor de crecimiento de hepatocitos; IGF1 - factor de crecimiento de tipo insulina 1; POU5F1 - Dominio POU, clase 5, factor de transcripción 1 (OCT4); NANOG - caja homeótica de Nanog; SOX2 - SRY (región Y de determinación del sexo)-caja 2; CDH1 - cadherina 1, tipo 1, E-cadherina (ECAD); T - homólogo de braquiuria (BRACH); FGF4 - factor de crecimiento de fibroblastos 4; WNT3 - familia de sitios de integración de MMTV de tipo wingless, miembro 3; SOX17 - SRY (región Y de determinación del sexo)-caja 17; GSC - goosecoid; CER1 - (cerberus 1, superfamilia del nudo de cisteína, homólogo (CER); CXCR4 - receptor 4 de quimiocinas (motivo C-X-C); FGF17 - factor de crecimiento de fibroblastos 17; FOXA2 - caja forkhead A2; SOX7 - SRY (región Y de determinación del sexo)-caja 7; SOX1 - SRY (región Y de determinación del sexo)-caja 1; AFP - alfa-fetoproteína; SPARC - proteína secretada, ácido, rica en cisteína (osteonectina); y THBD-trombomodulina (TM), NCAM - molécula de adhesión a células neuronales; SYP - sinaptofisina; ZIC1 - miembro 1 de la familia de Zic; NEF3 - neurofilamento 3 (NFM); SST -somatostatina; MAFA - homólogo A del oncogén de fibrosarcoma musculoaponeurótico v-maf; MAFB - homólogo B de oncogén de fibrosarcoma musculoaponeurótico v-maf; SYP - sinaptofisina; CHGA - cromogranina A (proteína secretora de paratiroides 1); NGN3 - Neurogenina 3, NKX2.2 - Caja homeótica 2 de NK2; NKX6.1- Caja homeótica 1 de NK6; ID1 - Inhibidor de la unión al ADN 1, GHRL - Prepropéptido de Grelina/Obestatina, GSK - sintasa quinasa de glicógeno, G6PC2 - glucosa-6-fosfatasa, UCN3 - urocortina 3, PCSK1 - proproteína convertasa subtilisina/kexina de tipo 1, SLC30A8 - familia de transportadores de solutos 30 (transportador de cinc), miembro 8 y CADH1 - E-Cadherina.
Las expresiones factor de crecimiento de fibroblastos 7 (FGF7) y factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) son sinónimos.
La progresión de las células pluripotentes a varias células multipotentes y/o diferenciadas se puede monitorizar determinando la expresión relativa de los genes o marcadores de genes, característica de una célula específica, en comparación con la expresión de un segundo gen o gen de control, por ejemplo, genes constitutivos. En algunos procesos, La expresión de ciertos marcadores se determina detectando la presencia o ausencia del marcador. Como alternativa, la expresión de ciertos marcadores puede determinarse midiendo el nivel al que el marcador está presente en las células del cultivo celular o la población celular. En dichos procesos, la medida de la expresión del marcador puede ser cualitativa o cuantitativa. Un método para cuantificar la expresión de marcadores producidos por genes marcadores es mediante el uso de PCR cuantitativa (Q-PCR). Los métodos para realizar la Q-PCR son bien conocidos en la técnica. También se pueden usar otros métodos que se conocen en la técnica para cuantificar la expresión del gen marcador. Por ejemplo, la expresión de un producto génico marcador puede detectarse usando anticuerpos específicos para el producto génico marcador de interés.
Además, se dispone de ensayos y/o metodologías de multiplexación para analizar muchos genes con alta sensibilidad y eficacia. Por ejemplo, con al menos el sistema nCounter provisto por Nanostring (Seattle, WA, EE.UU.), en la actualidad, los usuarios pueden analizar los niveles de expresión de hasta 800 genes simultáneamente, con una sensibilidad comparable a la de los sistemas de PCR cuantitativos y con menos de 15 minutos de tiempo práctico por reacción. Por consiguiente, el ARN total en cualquiera de las muestras (por ejemplo, cultivos de células PEC en fase 4 y progenitoras/precursoras endocrinas y endocrinas en fase 7, respectivamente) se puede aislar (por ejemplo, por triplicado) usando el extractor de ácido nucleico 6100 (Applied Biosystems; Foster City, CA, EE.UU.); y se requieren aproximadamente 100 ng por reacción para la cuantificación de la expresión génica usando el Sistema nCounter de Nanostring. Y en lugar de la detección analógica, el sistema nCounter usa la detección digital, por lo que cada transcripción del gen es detectada por una sonda unida a un segmento de ADN que está unido a una cadena única de fluoróforos de colores (el código de barras molecular). La identificación de esa transcripción, por lo tanto, depende solo del orden de los flúor de la cadena, en lugar de las intensidades de los flúor. En segundo lugar, el número de transcripciones totales en una muestra se cuantifica contando el número total de veces que se detecta una determinada cadena de flúor (código de barras). Además, este método no requiere la amplificación del ARNm diana, por tanto, el intervalo es el intervalo biológico de expresión, normalmente, de tres órdenes de magnitud. Actualmente, el sistema puede medir tan solo 1,2 veces los cambios de una sola transcripción a 20 copias por célula (10 fM) con significación estadística (p < 0,05). Para los genes expresados a niveles de entre 0,5 y 20 copias por célula, las diferencias de 1,5 veces en los niveles de expresión son detectables con el mismo nivel de confianza.
En algunos procesos, la expresión más alta de los siguientes genes en comparación con la expresión más baja de otros genes es indicativa de ciertas poblaciones de células, por ejemplo: SOX17, SOX7, AFP o THBD son indicativos de endodermo extraembrionario; NODAL y/o FGF8 son indicativos de estrías preprimitivas; braquiuria, FGF4, SNAI1 y/o WNT3 son indicativos de mesendodermo; CER, GSC, CXCR4, SOX17 y FOXA2 son indicativos de células endodérmicas definitivas; SOX17, FOXA2, FOXA1, HNF1B y HNF4A son indicativos de endodermo de tubo digestivo posterior (o endodermo negativo en PDX1); PDX1, HNF6, SOX9 y PROX1 son indicativos de endodermo positivo en PDX1; PDX1, NKX6.1, PTFA1, CPA y cMYC son indicativos de epitelio pancreático (PE o progenitor pancreático); NGN3, PAX4, ARX y NKX2.2 son indicativos de células progenitoras/precursoras endocrinas; e INS, Gc G, GHr L, SST y PP son indicativos de las diversas células endocrinas; la expresión relativa alta de los genes MAFA a MAFB es indicativa de células endocrinas secretoras de insulina; y la expresión relativa alta de MAFB con respecto a la expresión del gen MAFA es indicativa de células endocrinas secretoras de glucagón. No obstante, en ciertas figuras y dibujos solo se muestran los marcadores de "distintivos" o "clave" típicos de ese tipo de célula en particular de un determinado linaje. Como entenderá el experto en la materia, esos otros marcadores o genes se expresan, pero no se muestran ni describen, por ejemplo, los genes que se expresan de forma constitutiva o se expresan en todos o mayor parte o la mayoría de los tipos de células de un determinado linaje o todos los linajes.
Métodos para la producción de células madre pluripotentes inducidas (iPS)
Las realizaciones descritas en el presente documento no se limitan a un tipo de célula iPS ni a un método para producir la célula iPS. Las realizaciones no están limitadas ni dependen de los niveles de eficacia de producción de las células iPS, porque existen varios métodos. Las realizaciones descritas en el presente documento se aplican a la diferenciación de las células iPS en células de linaje endodérmico y a usos de las mismas.
Los estudios que usan ciertos factores de reprogramación nuclear han permitido que las células madre pluripotentes o las células madre similares a las pluripotentes se deriven de las propias células somáticas del paciente. Estas células también se denominan células madre pluripotentes inducidas (iPS). La presente invención describe diversas estirpes de células iPS proporcionadas por Shinya Yamanaka, Universidad de Kioto. Sin embargo, otras estirpes de células iPS, por ejemplo, las descritas por James Thomson et al., están englobadas por la invención en el presente documento. Véase la publicación de EE.u U. 20090047263, la publicación internacional WO2005/80598, la publicación de EE.UU.
20080233610 y la publicación internacional WO2008/11882. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, "células madre pluripotentes inducidas (iPS)" significa células que tienen propiedades similares a otras células madre pluripotentes, por ejemplo, células hES, células hEG, células pPS (madre pluripotentes de primate), células partenogénicas y similares.
Los factores de programación nuclear se describen en la publicación de EE.UU. 20090047263, la publicación internacional WO2005/80598, la publicación de EE.UU. 20080233610 y la publicación internacional WO2008/11882, y se usaron para inducir la reprogramación de una célula diferenciada sin usar óvulos, embriones o células ES. Los métodos para preparar células iPS inducidas a partir de células somáticas usando el factor de reprogramación nuclear similar al usado y descrito en la presente invención no están particularmente limitados. En realizaciones preferidas, el factor de reprogramación nuclear entra en contacto con las células somáticas en un entorno en el que pueden proliferar las células somáticas y células madre pluripotentes inducidas. Una ventaja de las ciertas realizaciones descritas en el presente documento es que se puede preparar una célula madre pluripotente inducida poniendo en contacto un factor de reprogramación nuclear con una célula somática en ausencia de óvulos, embriones o células madre embrionarias (ES). Mediante el uso de un factor de reprogramación nuclear, se puede reprogramar el núcleo de una célula somática, obteniéndose una célula iPS o una "célula similar a ES".
Las células madre pluripotentes descritas en el presente documento, ya sean células hES o células iPS, pueden expresar cualquier número de marcadores de células pluripotentes, incluyendo, pero sin limitación: fosfatasa alcalina (AP); ABCG2; antígeno 1 embrionario específico de fase (SSEA-1); Ss Ea -3; SSEA-4; TRA-1-60; TRA-1-81; Tra-2-49/6E; ERas/ECAT5, E-cadherina; .p.III-tubulina; a-actina del músculo liso (a-SMA); factor de crecimiento de fibroblastos 4 (Fgf4), Cripto, Dax1; proteína de dedo de cinc 296 (Zfp296); N-acetiltransferasa 1 (Nati); (transcripción asociada a células ES 1 (ECAT1); ESG1/DPPA5/ECAT2; ECAT3; ECAT6; ECAT7; ECAT8; ECAT9; ECAT10; ECAT15-1; ECAT15-2; Fthl17; Sal14; factor de transcripción de células embrionarias indiferenciadas (Utf1); Rex1; p53; G3PDH; telomerasa, incluyendo TERT; genes del cromosoma X silenciosos; Dnmt3a; Dnmt3b; TRIM28; Caja F que contiene proteína 15 (Fbx15); Nanog/ECAT4; Oct3/4; Sox2; Klf4; c-Myc; Esrrb; TDGF1; GABRB3; Zfp42, FoxD3; GDF3; CYP25A1; pluripotencia del desarrollo asociada 2 (DPPA2); Punto de rotura del linfoma de linfocitos T 1 (Tel1); DPPA3/Stella; DPPA4 y similares. Se entiende que la presente invención no se limita a los marcadores enumerados en el presente documento, y abarca marcadores tales como marcadores de superficie celular, antígenos y otros productos génicos, incluyendo los EST, ARN (incluyendo microARN y ARN antisentido), ADN (incluyendo genes y ADNc) y sus partes.
En una realización, las estirpes de células iPS usadas en el presente documento contienen los siguientes genes de factor de reprogramación nuclear: un gen de la familia de Oct, un gen de la familia de Klf y un gen de la familia de Sox. En una estirpe de células iPS, se proporcionan cada uno de los siguientes tres tipos de genes: Oct3/4, Klf4 y Sox2. Se emplearon otros productos génicos de estirpes de células iPS de cada uno de los siguientes tres tipos de genes: un gen de la familia de Oct, un gen de la familia de Klf y un gen de la familia de Myc, por ejemplo, Oct3/4, Klf4 y c-Myc. Por consiguiente, se entiende que el factor de reprogramación nuclear puede ser con o sin el gen de la familia de Myc.
Los factores de reprogramación nuclear descritos en el presente documento y también conocidos en la técnica, pueden usarse para generar células iPS a partir de células somáticas adultas diferenciadas, y no están limitados por el tipo de células somáticas que se vayan a reprogramar, es decir, se puede reprogramar o desdiferenciar cualquier tipo de célula somática. Debido a que la reprogramación de una célula somática no requiere un óvulo ni/o un embrión, una célula iPS puede ser una célula de mamífero, por lo tanto, brindando la oportunidad de generar células madre pluripotentes específicas para el paciente o la enfermedad.
Se han descrito métodos víricos, no víricos y no integrales para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSC) usando adenovirus, plásmidos o la escisión de los factores de reprogramación usando la transposición Cre-loxP3 o piggy BAC. Véase Stadtfeld, M., et al., Science 322, 945-949 (2008); Okita, K. et al., Science 322, 949-953 (2008); Kaji, K. et al. Nature 458, 771-775 (2009); Soldner, F. et al. Cell 136, 964-977 (2009); y Woltjen, K. et al. Nature 458, 766-770 (2009). Asimismo, véase la patente de EE.UU. n.° 20100003757 de Mack, A. et al. (publicado el 7 de enero de 2010) y el n.°: PCT/US2009/037429 de Shi et al. Estos métodos, sin embargo, tienen eficiencias de reprogramación bajas (< 0,003 %), y pueden dejar secuencias de vectores residuales a pesar de la escisión, lo que limita sus aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, la integración vírica en el genoma del hospedador y la sobreexpresión de los factores de transcripción anteriores se han asociado a la tumorigénesis; y una expresión de transgén residual es potencialmente la característica que distingue las células ES y las células iPS. Véase Solder, F. et al., Cell 136:964-977 (2009); Foster et al., Oncogene 24:1491-1500 (2005); y Hochedlinger, K. et al., Cell 121:465-477 (2005).
En otras realizaciones de la invención, los métodos para generar iPSC incluyen vectores episómicos derivados del virus de Epstein-Barr. Véase Yu, J. et al. Science 324, 797-801 (2009) y la solicitud de EE. UU. 20100003757 de Mack, A. et al. publicada el 7 de enero de 2010. Estos métodos requieren tres plásmidos separados que portan una combinación de siete factores, incluyendo el oncogén SV40.
En otra realización de la invención, los métodos para generar iPSC incluyen iPSC basadas en proteínas de células fetales y neonatales humanas y de ratón. Véase Zhou H. et al. Cell Stem Cell 4, 381-384 (2009); y Kim, D. et al. Cell Stem Cell 4, 472-476 (2009). Estas metodologías se realizan usando un tratamiento químico (por ejemplo, ácido valproico en el caso de Zhou et al. 2009 supra) o varias series de tratamiento (Kim et al. 2009, supra).
En otra realización de la invención, se pueden usar vectores de minicírculo o plásmidos, que son moléculas de ADN superenrolladas que carecen de un origen de replicación bacteriano y genes de resistencia a los antibióticos. Véase Chen Z.-Y. et al., Mol. Ther. 8, 495-500 (2003); Chen, Z.-Y. et al., Hum. Gene Ther. 16, 126-131 (2005); y Jia, F. et al., "Nature Methods Advance Publication" en línea 7 de febrero de 2010. Estas metodologías generan iPSC con abundantes eficiencias de transfección y una expresión ectópica más larga, porque tienen una activación más baja de los mecanismos de silenciamiento exógenos.
En otra realización más de la invención, las células iPS pueden generarse a partir de pacientes humanos con diversas enfermedades, entre los que se incluyen pacientes diabéticos, pacientes de ELA, pacientes de distrofia muscular espinal y Parkinson. Véase Maehr et al. PNAS EE.UU. 106(37):15768-73 (2009); Dimos et al., Science, 321:1218-21 (2008); Ebert et al. Nature 457:277-80 (2009); Park et al. Cell 134:877-886 (2008); y Soldner et al., Cell 136:964-977. Al menos una ventaja de producir células hIPS de pacientes con enfermedades específicas es que la célula derivada contendría el genotipo y las respuestas celulares de la enfermedad humana. Asimismo, véase la Tabla 4 que enumera al menos algunas estirpes de células iPS humanas existentes. Esta información se derivó del material publicado y de las bases de datos disponibles públicamente, entre las que se incluyen, por ejemplo, el Registro de Células Madre de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH), el Registro de Células Madre Embrionarias Humanas y el Registro Internacional de Células Madre ubicado en la Escuela de Medicina de la Universidad de Massachusetts, Worcester, Massachusetts, EE.UU. Estas bases de datos se actualizan periódicamente a medida que las estirpes de células están disponibles y se obtiene el registro.
Las composiciones de referencia y los métodos descritos en el presente documento contemplan el uso de diversas células madre pluripotentes de primate diferenciables, incluyendo células madre pluripotentes humanas, tales como hESC, incluyendo, pero sin limitación, CyT49, CyT212, CyT203, CyT25, (disponibles en el mercado al menos en el momento de la presentación de la presente solicitud de ViaCyte Inc. ubicada en 3550 General Atomics Court, San Diego CA 92121) BGO1, BG02 y m El 1, y células madre pluripotentes inducidas (iPS) tales como iPSC-482c7 e iPSC-603 (disponibles en el mercado en Cellular Dynamics International, Inc., Madison, Wisconsin) e iPSC-G4 (de aquí en adelante "G4") e iPSC-B7 (de aquí en adelante, "B7") (disponibles en el mercado en Shinya Yamanaka, Center for iPS Cell Research, Universidad de Kioto); los estudios que usan estas y otras células iPS humanas se describen en detalle en las solicitudes de patente de EE.UU. 12/765.714 y 13/761.078, ambas tituladas "CELL COMPOSITIONS FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLS", presentadas el 22 de abril de 2010 y el 6 de febrero de 2013, respectivamente. Algunas de estas células madre pluripotentes humanas están registradas en registros nacionales como los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) y se enumeran en el Registro de Células Madre Humanas NIH (por ejemplo, registro de CyT49 n.° 0041). También se puede encontrar información sobre CyT49, otras estirpes de células disponibles en la web mundial stemcells.nih.gov/research/registry. Otras estirpes de células más, por ejemplo, BG01 y BG01v, se venden en el mercado y se distribuyen a terceros por WiCell®, una filial del Banco Internacional de Células Madre de Wisconsin (WISC) (nombre del catálogo, BG01) y ATCC (n.° de catálogo SCRC-2002), respectivamente. Mientras que otras estirpes de células descritas en el presente documento pueden no estar registradas ni distribuidas por un repositorio biológico, tal como WiCell® o ATCC, dichas estirpes de células están disponibles en el mercado para el público en general directa o indirectamente a partir de los principales investigadores, laboratorios e/o instituciones. Las solicitudes públicas de estirpes de células y reactivos, por ejemplo, son habituales para los expertos en el campo de las ciencias de la vida. Por lo general, la transferencia de estas células o materiales se realiza mediante un acuerdo convencional de transferencia de materiales entre el propietario de la estirpe celular o el material y el destinatario. Estos tipos de transferencias de materiales ocurren con frecuencia en un entorno de investigación, en particular, en las ciencias de la vida. De hecho, el solicitante ha transferido células de manera habitual desde el momento en que se derivaron y se caracterizaron, incluyendo CyT49 (2006), CyT203 (2005), Cyt212 (2009), CyT25 (2002), BG01 (2001), BG02 (2001), BG03 (2001) y Bg 01v (2004), a través de acuerdos con socios comerciales, y organizaciones y colaboradores sin ánimo de lucro. El año entre paréntesis junto a cada estirpe celular de la lista anterior indica el año en el que las estirpes de células o los materiales se hicieron públicos e inmortales (por ejemplo, se crearon bancos de células) y, por lo tanto, no se ha realizado o requerido la destrucción de otro embrión desde el establecimiento de estas estirpes de células para la preparación de las composiciones y la puesta en práctica de los métodos descritos en el presente documento.
Las Tablas 4 y 5 son listas no exhaustivas de ciertas iPSC y hESC, respectivamente, que están disponibles en todo el mundo para fines de investigación y/o comerciales, y son adecuados para su uso en los métodos y las composiciones de la presente divulgación. La información de las Tablas 3 y 4 se obtuvo del material publicado y las bases de datos disponibles para el público en general, que incluyen: por ejemplo, el Registro de Células Madre Humanas de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH), el Registro de Células Madre Embrionarias Humanas y el Registro Internacional de Células Madre ubicado en la Escuela de Medicina de la Universidad de Massachusetts, Worcester, Massachusetts, EE.UU. Estas bases de datos se actualizan periódicamente a medida que las estirpes de células están disponibles y se obtiene el registro.
La iPSC humana descrita en el presente documento (al menos iPSC-603 e iPSC-482-c7) fue proporcionada por Cellular Dynamics International, Inc. (Madison, Wisconsin, EE.UU.).
T l 4: Li ir l l m r l ri n in i r l r h m n hIP
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Otra ventaja de usar células hIPS es que dichas células hIPS serían una población de células autólogas emparejadas inmunológicamente; y las células específicas del paciente permitirían estudiar el origen y la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, es posible entender las causas de una enfermedad, que puede proporcionar información que conduzca al desarrollo de tratamientos profilácticos y terapéuticos para la enfermedad.
Células madre embrionarias humanas (hES) pluripotentes (ejemplos de referencia)
Se desvelan métodos de referencia para la obtención de células endodérmicas definitivas y, en última instancia, cualquier tipo de célula derivado del linaje endodérmico, incluyendo, pero sin limitación, endodermo del tracto digestivo superior, endodermo pancreático, células progenitoras/precursoras endocrinas y/o células que expresan hormonas del islote pancreático usando células madre embrionarias humanas (hES) como material de partida. Estas células hES pueden ser células que se originan a partir de la mórula, masa celular interna embrionaria o las obtenidas de crestas gonadales embrionarias. Las células madre embrionarias humanas pueden mantenerse en cultivo en un estado pluripotente sin diferenciación sustancial usando métodos que se conocen en la técnica. Dichos métodos se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n° 5.453.357; 5.670.372; 5.690.926; 5.843.780; 6.200.806 y 6.251.671.
En algunos procesos, se mantienen células madre pluripotentes, por ejemplo, células hES, en una capa alimentadora. En dichos procesos, se puede usar cualquier capa alimentadora que permita que la célula pluripotente se mantenga en un estado pluripotente. Una capa alimentadora comúnmente usada para el cultivo de células madre embrionarias humanas es una capa de fibroblastos de ratón. Más recientemente, se han desarrollado capas alimentadoras de fibroblastos humanos para su uso en el cultivo de células pluripotentes (véase la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2002/0072117). Los procesos alternativos permiten el mantenimiento de células pluripotentes sin el uso de una capa alimentadora.
Las células pluripotentes descritas en el presente documento pueden mantenerse en cultivo con o sin suero, con o sin matriz extracelular, con o sin FGF. En algunos procedimientos de mantenimiento de células pluripotentes, se usa reemplazo de suero. Estos y otros métodos para el cultivo y la diferenciación de células pluripotentes o multipotentes, respectivamente, se describen en el documento PCT/US2007/062755, presentado el 23 de febrero de 2007, y titulado "COMPOSITIONS AND METHODS FOR CULTURING DIFFERENTIAL CELLS" y el documento PCT/US2008/080516, presentado el 20 de octubre de 2008, y titulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIPOTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HUMAN SERUM".
Los métodos de referencia descritos en el presente documento son útiles con todas las estirpes de células hES, y al menos las enumeradas en la Tabla 5, que están disponibles en el mercado en la compañía identificada o para adquirirse en el mercado de WiCell por Internet en wicell.org/home/stem-cell-lines/order-stem-cell-lines/obtain-stemcell-lines.cmsx. Esta información se derivó del material publicado y de las bases de datos disponibles públicamente, entre las que se incluyen, por ejemplo, el Registro de Células Madre de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH), el Registro de Células Madre Embrionarias Humanas y el Registro Internacional de Células Madre ubicado en la Escuela de Medicina de la Universidad de Massachusetts, Worcester, Massachusetts, EE.UU. Estas bases de datos se actualizan periódicamente a medida que las estirpes de células están disponibles y se obtiene el registro. Hay al menos 254 estirpes de iPSC disponibles en el mercado con el Registro Internacional de Células Madre y 1.211 estirpes de hESC disponibles en el mercado. La siguiente Tabla 5 no incluye todas las hESC e iPSC que se enumeran, sino que, más bien, son ejemplos de las células madre pluripotentes de las que se puede disponer.
Tabla 5: Listado de estir es de células madre embrionarias humanas hES
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Métodos alternativos para la obtención e células madre pluripotentes
Existen métodos para la obtención de células madre pluripotentes, tales como las células ES de mamíferos, sin la destrucción del embrión. En resumen, Advanced Cell Technology (Worcester, Massachusetts, EE. UU.) publicó 3 artículos de revistas científicas que describían la obtención de células ES de ratón y ser humano a partir de blastómeros individuales dejando el embrión intacto y, por lo tanto, sin causar su destrucción. A finales de 2005, Chung et al. Describió por primera vez métodos para la creación de células ES de ratón a partir de un solo blastómero. Véase Chung et al. (2006) Nature 439: 216-219, publicado en línea el domingo 16 de octubre de 2005. Chung et al. (2006) describieron la toma de biopsias de un embrión usando técnicas de micromanipulación similares a las usadas para el diagnóstico genético preimplantacional (PGD); véase la página 217. En ese momento, Chung et al. (2006) cultivaron conjuntamente las estirpes de blastómeros con otras células madre embrionarias, pero posteriormente se desarrollaron métodos en los que esto no era necesario. Véase Chung et al. (2008) "Human Embryonic Stem Cell Lines Generated without Embryo Destruction", Cell Stem Cell 2: 113-117.
El diagnóstico genético previo a la implantación se usa para analizar las anomalías genéticas de los embriones antes de su implantación. El método se realiza en embriones en desarrollo normal en fase temprana (por ejemplo, la fase de las ocho células), cuando se puede estudiar el aporte genético de ambos padres, perforando la zona pelúcida y aspirando o extruyendo o diseccionando uno o dos blastómeros a través de la abertura. El análisis genético que usa la hibridación in situ fluorescente (FISH) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es lo que se usa comúnmente en la DGP para analizar las anomalías cromosómicas y los trastornos monogénicos, respectivamente. Posteriormente, Si no hay anomalías genéticas, se implanta el embrión intacto en la paciente para el período de gestación normal. Las técnicas de diagnóstico genético previas a la implantación se empezaron a publicar a partir de 2004 por parte de varios grupos, entre los que se incluye Staessen, C. et al. (2004), "Comparison of blastocyst transfer with or without preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening in couples with advanced maternal age: un ensayo controlado aleatorio prospectivo", Hum. Reprod. 19: 2849-2858 y Monni et al. (2004) "reimplantation genetic diagnosis for beta-thalassaemia: the Sardinian experience". Prenat Diagn 24: 949-954. Por tanto, Chung et al. (2006) se limitaron a describir los métodos disponibles para extraer blastómeros de embriones en etapas iniciales sin destruir el embrión.
Además, en agosto de 2006, Klimanskaya et al., El 2° autor de la publicación de Chung et al. (2006) y también de Advanced Cell Technology, describió un procedimiento, que aunque no fue eficaz (solo el 2% de los blastómeros aislados generó una estirpe de células hES), consiguió demostrar que técnicas de PGD similares hicieron posible la obtención de estirpes de células ES humanas a partir de un solo blastómero; no significativamente diferente del descrito por primera vez por Chung et al. (2006) supra. Véase Klimanskanya et al. (2006) "Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres", Nature 444, 481-485. Klimanskaya et al. "co-cultured the newly derived hES cell lines with other ES cells", que según lo afirmado por Chung et al. (2006), puede ser fundamental. Chung et al. (2006) afirmaron que "no está claro si el éxito del sistema de cultivo conjunto de ES en (su) estudio es atribuible a sustancias secretadas por las células ES o si se requiere contacto célula-célula". Véase Chung et al. (2006) supra, pág. 218, columna derecha. Pero un estudio posterior de 2008 realizado por los mismos Chung. et al., supra, demostró que las estirpes de células hES no requerían el cultivo conjunto con células ES en absoluto, porque el cultivo de blastómeros aislados en medio con laminina mejoró su capacidad para dar lugar a hESC. Véase Chung et al. (2008), "Human Embryonic Stem Cell Lines Generated without Embryo Destruction", Cell Stem Cell (2):113-117, pág.116, publicado en línea el jueves 10 de enero de 2008. Además, que las células hES obtenidas de esta manera tuvieran las mismas características que otras células madre pluripotentes humanas, incluyendo las células hES, siendo capaces incluso de mantener un estado indiferenciado durante más de seis (6) meses, y mostrando un cariotipo normal y la expresión de marcadores de pluripotencia, incluyendo Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Nanog y fosfatasa alcalina; y puede diferenciar y formar derivados de las tres (3) capas germinales embrionarias tanto in vitro como en teratomas in vivo.
Por lo tanto, si el cultivo conjunto de blastómeros individuales con otras células ES no es fundamental como postulan por primera vez Chung et al. (2006), y que cultivarlos solo en laminen, que es un componente común de muchas matrices extracelulares (disponibles en el mercado y/o fabricadas mediante lisis de células alimentadoras, por ejemplo), y fue comúnmente usado y conocido para cultivar células de mamíferos, y tal fue conocido y disponible en el momento de la primera demostración de la obtención de estirpes de células de ratón ES de un solo blastómero según la publicación de Chung en 2006. Por lo tanto, es completamente posible que un experto en la materia sea capaz de adoptar las metodologías de Chung et al. (2006) supra y usar los conocimientos de los que disponga según lo descrito anteriormente por Straessen et al. (2004) supra para la obtención de una estirpe de células hES a partir de un solo blastómero al tiempo que conserva el embrión o evita su destrucción.
Suspensión de agregados de células madre pluripotentes y células derivadas de células madre pluripotentes
A diferencia de los métodos de ingeniería de tejidos conocidos anteriormente, que se basan en sembrar células individuales en armazones poliméricos, matrices y/o geles, las realizaciones descritas en el presente documento pueden usar suspensiones de agregados celulares formadas a partir de células madre pluripotentes, suspensiones de células individuales o suspensiones de células individuales diferenciadas derivadas de las mismas. Los métodos de procesamiento y/o fabricación de la suspensión de agregados de células madre y la diferenciación de las células de los mismos se describen en el documento PCT/US2007/062755, presentado el 23 de abril de 2007, y titulado "COMPOSITIONS AND METHODS FOR CULTURING DIFFERENTIAL CELLS", y, ahora, las patentes de EE.UU. n.° 8.211.699 y 8.415.158; y el documento PCT/US2008/080516, presentado el 2o de octubre de 2008, y titulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIPOTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HUMAN SERUM", y ahora la patente de EE.UU. n.° 8.334.138, y Schulz T. et al. (2012) supra.
Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren a métodos para generar un agregado de células pluripotentes en suspensión a partir de un cultivo adherente pluripotente, cultivando una célula pluripotente en una condición de cultivo de crecimiento adherente que permita la expansión en un estado indiferenciado; Disociando el cultivo de células pluripotentes adherentes en un cultivo de suspensión de células individuales; poniendo en contacto el cultivo de suspensión de células individuales con una primera condición de cultivo de diferenciación que permita la formación de agregados de células derivadas de hES en suspensión agitando el cultivo de suspensión de células individuales hasta un período de tiempo tal que el cultivo de suspensión de células individuales forme un agregado de células derivadas de pluripotentes en suspensión, y generando así un agregado de células derivadas de pluripotentes en suspensión. En realizaciones preferidas, la agitación del cultivo en suspensión de células individuales se realiza mediante rotación a de aproximadamente 80 rpm a 160 rpm. En otras ciertas realizaciones descritas en el presente documento, se usa un inhibidor de la rho-quinasa para facilitar la agregación, el crecimiento, la proliferación, la expansión y/o la masa celular de células madre pluripotentes.
La expresión "sustancialmente uniforme" o "sustancialmente uniforme en tamaño y forma" o sus equivalentes, se refiere a la propagación en uniformidad de los agregados y no es superior al aproximadamente 20 %. En otra realización, la propagación en uniformidad de los agregados no es superior al aproximadamente 15 %, 10 % o 5 %.
En otra realización más, las suspensiones de agregados de células hES se cultivaron en un medio sustancialmente exento de suero y, además, en ausencia de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) añadido exógenamente. Esto se distingue de la patente de EE. UU. n.° 7.005.252 de Thomson, J., que requiere cultivar células hES en un medio sin suero pero que contenga factores de crecimiento añadidos exógenamente, incluyendo FGF. En algunas realizaciones, las suspensiones de agregados de células iPS se cultivan en un medio sustancialmente exento de suero y/o, además, en ausencia de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) añadido exógenamente.
Aunque el número exacto de células por agregado es irrelevante, los expertos en la materia reconocerán que el tamaño de cada agregado (y, por lo tanto, el número de células por agregado) está limitado por la capacidad del oxígeno y los nutrientes para difundirse en las células centrales, y que este número también puede variar dependiendo del tipo de célula y de las necesidades nutricionales de ese tipo de célula. Los agregados celulares pueden comprender un número mínimo de células (por ejemplo, dos o tres células) por agregado, o pueden comprender muchos cientos o miles de células por agregado. Por lo general, los agregados de células comprenden de cientos a miles de células por agregado. Para los fines de la presente invención, los agregados celulares normalmente son de aproximadamente 50 micrómetros a aproximadamente 600 micrómetros de tamaño, aunque, dependiendo del tipo de célula, el tamaño puede ser inferior o superior a este intervalo. En una realización, los agregados celulares son de aproximadamente 50 micrómetros a aproximadamente 250 micrómetros de tamaño, o de aproximadamente 75 a 200 micrómetros de tamaño, y preferentemente tienen un tamaño de aproximadamente 100 a 150 micrómetros.
Otros métodos describen la creación de cuerpos embrioides (EB). Como se usa en el presente documento, la expresión "cuerpos embrioides", "cuerpos agregados" o sus equivalentes, se refieren a agregados de células diferenciadas e indiferenciadas que aparecen cuando las células ES crecen en exceso en cultivos de monocapa, o se mantienen en cultivos en suspensión en medios indefinidos o se diferencian a través de protocolos no dirigidos hacia tejidos de múltiples capas germinales. Es decir, Los EB no se forman a partir de una suspensión de células individuales de células madre pluripotentes como se desvela en el presente documento; tampoco se forman EB a partir de cultivos adherentes de células multipotentes derivadas de pluripotentes. Solo estas características hacen que la presente invención se distinga claramente de un cuerpo embrioide.
En contraste con los cuerpos embrioides, que son una mezcla de células diferenciadas e indiferenciadas y que normalmente consisten en células de varias capas germinales y pasan por una diferenciación aleatoria, los agregados celulares descritos en el presente documento son esencialmente o sustancialmente homocelulares, existiendo como agregados de células pluripotentes, multipotentes, bipotentes o unipotentes, por ejemplo, células embrionarias, endodermo definitivo, endodermo del tracto digestivo superior, endodermo pancreático positivo en PDX1, células endocrinas pancreáticas y similares.
Los métodos descritos en el presente documento de ninguna manera requieren primero recubrir los vasos de cultivo con una matriz extracelular, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. n.° 6.800.480 de Bodnar et al. y asignada a Geron Corporation. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las células iPS se pueden cultivar de la misma manera que otras células madre pluripotentes, por ejemplo, las células hES e iPS se cultivan usando suero humano soluble como se describe esencialmente en la patente de EE.UU. n.° 8.334.138 del solicitante; y Schulz T. et al. (2012) supra.
Los métodos descritos en el presente documento de ninguna manera requieren que se añada de manera exógena el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) suministrado desde una fuente que no sea solo una capa alimentadora de fibroblastos como se describe en la patente de EE.UU. 7.005.252 de Thomson, J. y asignada a Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF).
Composiciones celulares multipotentes y diferenciadas
Las composiciones celulares producidas mediante los métodos descritos en el presente documento incluyen cultivos celulares que comprenden células madre pluripotentes, en estrías preprimitivas, mesendodérmicas, endodérmicas definitivas, endodérmicas del tracto digestivo superior, endodérmicas del tracto digestivo superior positivas en PDX1, endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 o endodérmicas pancreáticas positivas tanto en PDX1 como en NKX6.1, progenitoras/precursoras endocrinas o progenitoras/precursoras endocrinas positivas tanto en NGN3 como en NKX2.2 y células endocrinas secretoras de hormonas o INS, GCG, GHRL, SST, células endocrinas positivas únicamente en PP, en las que al menos aproximadamente 5-90 % de las células en cultivo son células en estrías preprimitivas, mesendodérmicas, endodérmicas definitivas, endodérmicas del tracto digestivo superior, endodérmicas del tracto digestivo superior positivas en PDX1, endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 o endodérmicas pancreáticas positivas tanto en PDX1 como en NKX6.1, progenitoras/precursoras endocrinas o progenitoras/precursoras endocrinas positivas tanto en NGN3 como en NKX2.2 y células endocrinas secretoras de hormonas o células endocrinas positivas únicamente en INS, GCG, GHRL, SST, Pp producidas.
Algunas realizaciones descritas en el presente documento se refieren a composiciones, tales como poblaciones celulares y cultivos celulares que comprenden tanto células pluripotentes, tales como células madre y células iPS, como células multipotentes, tales como células en estrías preprimitivas, mesendodérmicas o endodérmicas definitivas, así como células más diferenciadas, pero todavía potencialmente multipotentes, tales como células endodérmicas del tracto digestivo superior positivas en PDX1, endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 o endodérmicas pancreáticas positivas tanto en PDX1 como en NKX6.1, progenitoras/precursoras endocrinas o progenitoras/precursoras endocrinas positivas tanto en NGN3 como en NKX2.2 y células endocrinas secretoras de hormonas o células endocrinas positivas solo en INS, GCG, GHRL, SST, PP. Por ejemplo, usando los métodos descritos en el presente documento, se pueden producir composiciones que comprendan mezclas de células madre pluripotentes y otras células multipotentes o diferenciadas. En algunas realizaciones, se producen composiciones que comprenden al menos aproximadamente 5 células multipotentes o diferenciadas por aproximadamente cada 95 células pluripotentes. En otras realizaciones, se producen composiciones que comprenden al menos aproximadamente 95 células multipotentes o diferenciadas por aproximadamente cada 5 células pluripotentes.
Además, se contemplan composiciones que comprenden otras proporciones de las células multipotentes o diferenciadas con respecto a las células pluripotentes. Por ejemplo, se contemplan composiciones que comprenden al menos aproximadamente 1 célula multipotente o diferenciada por aproximadamente cada 1.000.000 de células pluripotentes, al menos aproximadamente 1 célula multipotente o diferenciada por cada 100.000 células pluripotentes, al menos aproximadamente 1 célula multipotente o diferenciada por cada 10.000 células pluripotentes, al menos aproximadamente 1 célula multipotente o diferenciada por cada 1000 células pluripotentes, al menos aproximadamente 1 célula multipotente o diferenciada por cada 500 células pluripotentes, al menos aproximadamente
1 célula multipotente o diferenciada por cada 100 células pluripotentes, al menos aproximadamente 1 célula multipotente o diferenciada por cada 10 células pluripotentes, al menos aproximadamente 1 célula multipotente o diferenciada por aproximadamente cada 5 células pluripotentes, y hasta aproximadamente 1 célula pluripotente y al menos aproximadamente 1.000.000 de células multipotentes o diferenciadas por aproximadamente 1 célula pluripotente.
Algunas realizaciones descritas en el presente documento se refieren a cultivos celulares o poblaciones celulares que comprenden de al menos aproximadamente el 5 % de células multipotentes o diferenciadas hasta al menos aproximadamente el 99 % de células multipotentes o diferenciadas. En algunas realizaciones, los cultivos celulares o las poblaciones celulares comprenden células de mamífero. En realizaciones preferidas, los cultivos celulares o poblaciones celulares comprenden células humanas. Por ejemplo, ciertas realizaciones específicas se refieren a cultivos celulares que comprenden células humanas, en las que desde al menos aproximadamente el 5 % hasta al menos aproximadamente el 99 % de las células humanas son células multipotentes o diferenciadas. Otras realizaciones se refieren a cultivos celulares que comprenden células humanas, en los que al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 % aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o más del 99 % de las células humanas son células multipotentes o diferenciadas. En realizaciones en las que los cultivos celulares o las poblaciones celulares comprenden células alimentadoras humanas, los porcentajes anteriores se calculan con respecto a las células alimentadoras humanas en los cultivos celulares.
Las composiciones y los métodos descritos en el presente documento tienen varias características útiles. Por ejemplo, los cultivos celulares y las poblaciones celulares que comprenden células multipotentes, por ejemplo, células en estrías preprimitivas y/o células mesendodérmicas, así como los métodos para producir dichos cultivos celulares y poblaciones celulares, son útiles para modelar las primeras fases del desarrollo humano. Asimismo, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento también pueden servir para la intervención terapéutica en estados patológicos, tales como la diabetes mellitus. Por ejemplo, ya que las células en estrías preprimitivas y/o las células mesendodérmicas sirven como fuente para solo un número limitado de tejidos, se pueden usar en el desarrollo de tejidos o tipos de células puros. En algunos procesos de producción de células de estrías preprimitivas, las células pluripotentes usadas como material de partida son células madre pluripotentes, por ejemplo, células hES, hEG o iPS.
Células trofectodérmicas
Usando los métodos descritos en el presente documento, se pueden producir composiciones que comprenden células trofectodérmicas esencialmente libres de otros tipos de células. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las poblaciones de células trofectodérmicas o los cultivos celulares producidos mediante los métodos descritos en el presente documento tienen una alta expresión de marcadores seleccionados del grupo que comprende HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2 y ERBB en comparación con los niveles de expresión de HAND1, Eomes, MASH2, ESXL1, HCG, KRT18, PSG3, SFXN5, DLX3, PSX1, ETS2 y ERBB en células o poblaciones de células no trofectodérmicas.
Células en estrías preprimitivas
Usando los métodos descritos en el presente documento, se pueden producir composiciones que comprendan células en estrías preprimitivas sustancialmente exentas de otros tipos de células. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las poblaciones de células en estrías preprimitivas o los cultivos celulares producidos mediante los métodos descritos en el presente documento expresan esencialmente genes marcadores FGF8 y/o NODAL en comparación con un bajo nivel de BRAQUIURIA, bajo nivel de FGF4, bajo nivel de SNAI1, bajo nivel de SOX17, bajo nivel de FOXA2, bajo nivel de SOX7 y bajo nivel de SOX1. Las células en estrías preprimitivas y los métodos para producir células en estrías preprimitivas se describen en detalle en la patente de EE. UU. del solicitante n.° 7.958.585, "PREPRIMITIVE STREAK AND MESENDODERM CELLS", concedida el martes 26 de julio de 2011.
Células extraembrionarias
Usando los métodos descritos en el presente documento, se pueden producir composiciones que comprendan células extraembrionarias sustancialmente libres de otros tipos de células. las células del endodermo primitivo, visceral y parietal son células extraembrionarias. Las células del endodermo primitivo dan lugar a células del endodermo visceral y parietal. Las células del endodermo visceral son células endodérmicas que forman parte del saco vitelino. Las células del endodermo visceral funcionan tanto en la absorción como en el transporte de nutrientes. Las células del endodermo parietal son contiguas a un tejido extraembrionario conocido como membrana de Reichert. Una de las funciones de las células del endodermo parietal es producir componentes de la membrana basal. Conjuntamente, las células del endodermo visceral y las células del endodermo parietal forman lo que a menudo se denomina endodermo extraembrionario. Como su nombre lo sugiere, las células endodérmicas extraembrionarias no dan lugar a estructuras embrionarias formadas durante el desarrollo. Por el contrario, las células endodérmicas definitivas y otras células de linaje endodérmico o pancreático descritas en el presente documento son embrionarias o derivadas de células embrionarias y dan lugar a tejidos que derivan del tubo digestivo que se forma durante el desarrollo embrionario. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las poblaciones de células extraembrionarias o los cultivos celulares producidos mediante los métodos descritos en el presente documento tienen una alta expresión de marcadores seleccionados del grupo que comprende los genes SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1, HNF4alfa o AFP en comparación con los niveles de expresión de al menos SOX7, SOX17, THBD, SPARC, DAB1 o AFP, que no se expresa en otros tipos de células o poblaciones celulares, por ejemplo, endodermo definitivo.
Células mesendodérmicas
Usando los métodos descritos en el presente documento, se pueden producir composiciones que comprenden células mesendodérmicas sustancialmente libres de otros tipos de células. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las poblaciones de células mesendodérmicas o los cultivos celulares producidos mediante los métodos descritos en el presente documento tienen una alta expresión de marcadores seleccionados del grupo que comprende los genes FGF4, SNAI1 MIXL1 y/o WNT3, en comparación con bajo nivel de SOX17, bajo nivel de CXCR4, bajo nivel de FOXA2, bajo nivel de SOX7 y bajo nivel de SOX1. Las células mesendodérmicas y los métodos para producir células mesendodérmicas se describen en detalle en la patente de EE. UU. del solicitante n.° 7.958.585, "PREPRIMITIVE STREAK AND MESENDODERM CELLS", concedida el martes 26 de julio de 2011.
Método de cribado sistemático
En algunas realizaciones, se emplean métodos de cribado sistemático para obtener ciertas poblaciones celulares que comprenden células multipotentes y/o diferenciadas, pluripotentes, tales como células madre pluripotentes humanas, células madre pluripotentes inducidas, células sembradas en estrías preprimitivas, células mesendodérmicas, células endodérmicas definitivas, células endodérmicas del tracto digestivo superior o células endodérmicas del tracto digestivo superior negativas en PDX1, células endodérmicas del tracto digestivo superior positivas en PDX1 o células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 o células progenitoras pancreáticas, células progenitoras/precursoras endocrinas y/o células endocrinas. A la población celular se le proporciona luego un factor de diferenciación candidato. En un primer punto de tiempo, que es anterior o aproximadamente igual al tiempo en el que se proporciona el factor de diferenciación candidato, se determina la expresión de un marcador. Como alternativa, La expresión del marcador se puede determinar después de proporcionar el factor de diferenciación candidato. En un segundo punto de tiempo, que es posterior al primer punto de tiempo y posterior a la etapa de proporcionar el factor de diferenciación candidato a la población celular, se determina nuevamente la expresión del mismo marcador. Se determina si el factor de diferenciación candidato es capaz de potenciar la diferenciación de las células precursoras pancreáticas comparando la expresión del marcador en el primer punto de tiempo con la expresión del marcador en el segundo punto de tiempo. Si la expresión del marcador en el segundo punto de tiempo aumenta o disminuye en comparación con la expresión del marcador en el primer punto de tiempo, entonces, el factor de diferenciación candidato es capaz de potenciar la diferenciación de las células progenitoras pancreáticas.
Algunas realizaciones de los métodos de cribado sistemático descritos en el presente documento utilizan poblaciones celulares o cultivos celulares que comprenden células endodérmicas definitivas humanas, células endodérmicas del tracto digestivo superior negativas en PDX-1, células endodérmicas del tracto digestivo superior positivas en PDX-1, células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX-1 o células progenitoras pancreáticas o progenitoras/precursoras endocrinas. Por ejemplo, la población celular puede ser una población esencialmente purificada de células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX-1-o células progenitoras pancreáticas. Por ejemplo, la población celular puede ser una población enriquecida de células progenitoras pancreáticas humanas, en la que al menos aproximadamente del 50 % a 97 % de las células humanas de la población celular son células progenitoras pancreáticas humanas, comprendiendo el resto células progenitoras/precursoras endocrinas o células endocrinas y otros tipos de células. El enriquecimiento de las poblaciones progenitoras pancreáticas se describe en detalle en la solicitud de patente de EE. UU. n.° 12/107.020 del solicitante, Titulada "METHOD FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS", presentada el 21 de abril de 2008, ahora la patente de EE.UU. de 8.338.170 y la publicación correspondiente de Kelly et al. (2011) supra.
En realizaciones de los métodos de cribado sistemático descritos en el presente documento, la población celular se pone en contacto o recibe de otro modo un factor de diferenciación candidato (prueba). El factor de diferenciación candidato puede comprender cualquier molécula que pueda tener el potencial de promover la diferenciación de cualquiera de las células mencionadas anteriormente, por ejemplo, células progenitoras pancreáticas humanas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el factor de diferenciación candidato comprende una molécula que se sabe que es un factor de diferenciación para uno o más tipos de células. En realizaciones alternativas, el factor de diferenciación candidato comprende una molécula que no se conoce por potenciar la diferenciación celular. En realizaciones preferidas, el factor de diferenciación candidato comprende una molécula que no se conoce por potenciar la diferenciación de las células progenitoras pancreáticas humanas. La cribado sistemático de factores que diferencian el endodermo definitivo, por ejemplo, se describe en detalle en la solicitud de patente de EE.UU. N.° 12/093.590, Titulada "MARKERS OF DEFINITIVE ENDODERM", presentada el 21 de julio de 2008.
Además de determinar la expresión de al menos un marcador en un primer punto de tiempo, algunas realizaciones de los métodos de cribado sistemático descritos en el presente documento contemplan determinar la expresión de al menos un marcador en un segundo punto de tiempo que sea posterior al primer punto de tiempo y que sea posterior a proporcionar a la población celular el factor de diferenciación candidato. En dichas realizaciones, se determina la expresión del mismo marcador en el primer y el segundo punto de tiempo. En algunas realizaciones, se determina la expresión de una pluralidad de marcadores en el primer y el segundo punto de tiempo. En dichas realizaciones, se determina la expresión de la misma pluralidad de marcadores en el primer y el segundo punto de tiempo. En algunas realizaciones, la expresión del marcador se determina en una pluralidad de puntos de tiempo, cada uno de los cuales es posterior al primer punto de tiempo, y cada uno de los cuales es posterior a proporcionar a la población celular el factor de diferenciación candidato. En determinadas realizaciones, La expresión del marcador se determina mediante Q-PCR. En otras realizaciones, La expresión del marcador se determina por inmunocitoquímica.
En determinadas realizaciones de los métodos de cribado sistemático descritos en el presente documento, el marcador que tiene su expresión determinada en el primer y segundo punto de tiempo es un marcador que está asociado a la diferenciación de células progenitoras pancreáticas a células que son las precursoras de células diferenciadas terminalmente que forman los tejidos de los islotes pancreáticos. Dichas células pueden incluir células inmaduras que expresan la hormona del islote pancreático.
En algunas realizaciones de los métodos de cribado sistemático descritos en el presente documento, se deja pasar suficiente tiempo entre el suministro a la población celular del factor de diferenciación candidato y la determinación de la expresión del marcador en el segundo punto de tiempo. El tiempo suficiente entre el suministro a la población celular del factor de diferenciación candidato y la determinación de la expresión del marcador en el segundo punto de tiempo puede ser tan corto como de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 10 días. En algunas realizaciones, la expresión de al menos un marcador se determina varias veces después de proporcionar a la población celular el factor de diferenciación candidato. En algunas realizaciones, el tiempo suficiente es de al menos aproximadamente 1 hora, al menos aproximadamente 6 horas, al menos aproximadamente 12 horas, al menos aproximadamente 16 horas, al menos aproximadamente 1 día, al menos aproximadamente 2 días, al menos aproximadamente 3 días, al menos aproximadamente 4 días, al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 6 días, al menos aproximadamente 7 días, al menos aproximadamente 8 días, al menos aproximadamente 9 días, al menos aproximadamente 10 días, al menos aproximadamente 11 días, al menos aproximadamente 12 días, al menos aproximadamente 13 días, al menos aproximadamente 14 días, al menos aproximadamente 1 semana, al menos aproximadamente 2 semanas, al menos aproximadamente 3 semanas, al menos aproximadamente 4 semanas, al menos aproximadamente 5 semanas, al menos aproximadamente 6 semanas, al menos aproximadamente 7 semanas o al menos aproximadamente 8 semanas.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, además, se determina si la expresión del marcador en el segundo punto de tiempo ha aumentado o disminuido en comparación con la expresión de este marcador en el primer punto de tiempo. Un aumento o una disminución de la expresión de al menos un marcador indica que el factor de diferenciación candidato es capaz de potenciar la diferenciación de las células progenitoras/precursoras endocrinas. De manera similar, si se determina la expresión de una pluralidad de marcadores, se determina además si la expresión de la pluralidad de marcadores en el segundo punto de tiempo ha aumentado o disminuido en comparación con la expresión de esta pluralidad de marcadores en el primer punto de tiempo. Un aumento o una disminución en la expresión del marcador se puede determinar midiendo o evaluando la cantidad, el nivel o la actividad del marcador en la población celular en el primer y segundo punto de tiempo. Dicha determinación puede ser relativa a otros marcadores, por ejemplo, la expresión de genes constitutivos, o absoluta. En determinadas realizaciones, en las que la expresión del marcador aumenta en el segundo punto de tiempo en comparación con el primer punto de tiempo, la cantidad de aumento es de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 60 veces, al menos aproximadamente 70 veces, al menos aproximadamente 80 veces, al menos aproximadamente 90 veces, al menos aproximadamente 100 veces o más de aproximadamente 100 veces. En algunas realizaciones, la cantidad de aumento es inferior a 2 veces. En realizaciones en las que la expresión del marcador disminuye en el segundo punto de tiempo en comparación con el primer punto de tiempo, la cantidad de disminución es de al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 60 veces, al menos aproximadamente 70 veces, al menos aproximadamente 80 veces, al menos aproximadamente 90 veces, al menos aproximadamente 100 veces o más de aproximadamente 100 veces. En algunas realizaciones, la cantidad de disminución es inferior a 2 veces.
Control de la producción de células multipotentes o diferenciadas
La progresión de células pluripotentes a células multipotentes a células multipotentes o células diferenciadas adicionales, tales como células progenitoras pancreáticas o células secretoras endocrinas hormonales, se puede controlar determinando la expresión de marcadores característicos de las células específicas, incluyendo marcadores genéticos y marcadores fenotípicos, tales como la expresión de las hormonas de los islotes y el procesamiento de proinsulina en insulina y péptido C en células endocrinas. En algunos procesos, la expresión de ciertos marcadores se determina detectando la presencia o ausencia del marcador. Como alternativa, la expresión de ciertos marcadores puede determinarse midiendo el nivel al que está presente el marcador en las células del cultivo celular o la población celular. Por ejemplo, en determinados procesos, se determina la expresión de marcadores característicos de células inmaduras que expresan hormonas de islote pancreático, así como la falta de expresión significativa de marcadores característicos de células pluripotentes, endodérmicas definitivas, endodérmicas del tracto digestivo superior, endodérmicas del tracto digestivo superior positivas en PDX1, progenitoras/precursoras endocrinas, endodérmicas extraembrionarias, mesodérmicas, ectodérmicas, células maduras que expresan hormonas de islote pancreático y/u otros tipos de células.
Como se describe en relación con el control de la producción de otros tipos de células menos diferenciadas del linaje endodérmico definitivo, se pueden usar técnicas cualitativas o semicuantitativas, tales como los métodos de transferencia puntual y de inmunocitoquímica, para medir la expresión del marcador. Como alternativa, la expresión del marcador se puede cuantificar con precisión mediante el uso de una técnica tal como la Q-PCR o nCounter mediante Nanostring o tecnologías multiplex de alto rendimiento relacionadas, capaces de analizar y evaluar cientos o más marcadores simultáneamente. Además, se apreciará que, a nivel de polipéptido, muchos de los marcadores de las células que expresan hormonas de islote pancreático son proteínas secretadas. Como tales, se pueden utilizar técnicas para medir el contenido de marcadores extracelulares, tales como ELISA.
En otras realizaciones, se usa la inmunohistoquímica para detectar las proteínas expresadas por los genes mencionados anteriormente. En otras realizaciones más, se puede usar la Q-PCR junto con técnicas de inmunohistoquímica o técnicas de citometría de flujo para caracterizar e identificar con precisión y exactitud los tipos de células y determinar tanto la cantidad como las proporciones relativas de dichos marcadores en un tipo de célula objeto de estudio. En una realización, la Q-PCR puede cuantificar los niveles de expresión de ARN en un cultivo celular que contenga una población mixta de células. Sin embargo, la Q-PCR no puede proporcionar ni calificar si los marcadores o las proteínas del sujeto se expresan simultáneamente en la misma célula. En otra realización, la Q-PCR se usa junto con los métodos de citometría de flujo para caracterizar e identificar los tipos de células. Por lo tanto, mediante el uso de una combinación de los métodos descritos en el presente documento, y tal como los descritos anteriormente, se puede realizar y demostrar la caracterización e identificación completa de diversos tipos de células, incluyendo células de tipo linaje endodérmico.
Por ejemplo, en una realización preferida, las células progenitoras pancreáticas o endodérmicas pancreáticas o endodérmicas pancreáticas positivas en PDX-1, expresan al menos PDX1, Nkx6.1, PTF1A, CPA y/o cMYC según lo demostrado por Q-PCR y/o ICC, pero dicha célula expresa conjuntamente al menos PDX1 y Nkx6.1 según lo demostrado mediante ICC y no expresa otros marcadores, incluyendo SOX17 CXCR4 o CER, para ser identificada como una célula que expresa PDX1-positivo. De manera similar, para la identificación adecuada de una célula pancreática secretora de hormona madura, in vitro o in vivo, por ejemplo, se ha demostrado que el péptido C (un producto del procesamiento adecuado de la proinsulina en una célula p madura y funcional) y la insulina se expresan conjuntamente mediante ICC en la célula secretora de insulina.
Aun así, también se pueden usar otros métodos que se conocen en la técnica para cuantificar la expresión del gen marcador. Por ejemplo, la expresión de un producto genético marcador puede detectarse usando anticuerpos específicos para el producto génico marcador de interés (por ejemplo, transferencia Western, análisis de citometría de flujo y similares). En determinados procesos, la expresión de los genes marcadores característicos de las células derivadas de hES, así como la falta de expresión significativa de los genes marcadores característicos de las células derivadas de hES. Otros métodos adicionales para caracterizar e identificar tipos de células derivados de hES se describen en solicitudes relacionadas como se ha indicado anteriormente.
Resumen de la producción células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 (Fases 1 a 4) y producción de insulina in vivo
Los métodos para la producción de ciertas células del linaje endodérmico y células del linaje endodérmico pancreático se proporcionan en el presente documento, y se analizan en otras partes en solicitudes relacionadas tales como las patentes de EE.UU. n.° 7.534.608; 7.695.965; y 7.993.920, Tituladas "METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES"; y la patente de EE.UU. n.° 8.129.182, titulada "ENDOCRINE PROGENITOR/PRECURSOR CELLS, PANCREATIC HORMONE-EXPRESSING CELLS AND METHODS OF PRODUCTION". Véase también la Tabla 17 y las FIG. 42, 43 y 44.
En resumen, los métodos de diferenciación dirigida del presente documento para células madre pluripotentes, por ejemplo, células hES e iPS, se pueden describir en al menos cuatro o cinco o seis o siete fases, dependiendo de la fase final del cultivo celular deseado (PEC o células endocrinas). La Fase 1 es la producción de células endodérmicas definitivas a partir de células madre pluripotentes y tarda de aproximadamente 2 a 5 días, preferentemente 2 o 3 días. Las células madre pluripotentes se suspenden en medios que comprenden RPMI, un factor de crecimiento de los miembros de la superfamilia de TGFp, tal como Activina A, Activina B, GDF-8 o GDF-11 (100 ng/ml), un miembro de la familia de Wnt o un activador de la vía de Wnt, tal como Wnt3a (25 ng/ml), y como alternativa, un inhibidor de la rhoquinasa o ROCK, tal como Y-27632 (10 j M) para potenciar el crecimiento y/o la supervivencia y/o la proliferación, y/o la adhesión entre las células. Después de aproximadamente 24 horas, los medios se intercambian por medios que comprenden RPMI con suero, tales como FBS al 0,2 % y un factor de crecimiento de miembros de la superfamilia de TGFp, tal como Activina A, Activina B, GDF-8 o GDF-11 (100 ng/ml) y, como alternativa, un inhibidor de la rho-quinasa o ROCK durante otras 24 (día 1) a 48 horas (día 2). Como alternativa, después de aproximadamente 24 horas en un medio que comprende Activina/Wnt3a, las células se cultivan durante las siguientes 24 horas en un medio que comprende Activina sola (es decir, el medio no incluye Wnt3a). De manera importante, la producción de endodermo definitivo requiere condiciones de cultivo celular bajas en contenido de suero y, por lo tanto, bajas en insulina o en contenido de factor de crecimiento similar a la insulina. Véase McLean et al. (2007) Stem Cells 25: 29-38. McLean et al. también muestran que poner en contacto las células hES con insulina a concentraciones tan bajas como de 0,2 jg/m l en la Fase 1 puede ser perjudicial para la producción del endodermo definitivo. Otros expertos en la materia han modificado la diferenciación de la Fase 1 de células pluripotentes a células endodérmicas definitivas esencialmente como se describe en el presente documento y en D'Amour et al. (2005), por ejemplo, al menos, Agarwal et al., "Efficient Differentiation of Functional Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells", Stem Cells (2008) 26:1117-1127; Borowiak et al., "Small Molecules Efficiently Direct Endodermal Differentiation of Mouse and Human Embryonic Stem Cells", (2009) Cell Stem Cell 4:348-358; y Brunner et al., "Distinct DNA methylation patterns characterize differentiated human embryonic stem cells and developing human fetal liver", (2009) Genome Res.
19:1044-1056. La diferenciación, especificación, caracterización e identificación adecuadas de las células definitivas son necesarias para obtener otras células del linaje endodérmico. Las células endodérmicas definitivas en esta fase expresan conjuntamente SOX17 y HNF3p (FOXA2), y no expresan apreciablemente al menos HNF4alfa, HNF6, PDX1, SOX6, PROX1, PTF1A, CPA, cMYC, NKX6.1, NGN3, PAX3, ARX, NKX2.2, INS, GSC, GHRL, SST o PP. La ausencia de expresión de HNF4alfa en el endodermo definitivo se apoya y describe en detalle al menos en Duncan et al. (1994), "Expression of transcription factor HNF-4 in the extraembryonic endoderm, gut, and nephrogenic tissue of the developing mouse embryo: HNF-4 is a marker for primary endoderm in the implanting blastocyst", Proc. Natl. Acad. Sci, 91:7598-7602 y Si-Tayeb et al. (2010), "Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-Like cells from Induced Pluripotent Stem Cells", Hepatology 51:297-305.
La fase 2 toma el cultivo de células endodérmicas definitivas de la Fase 1 y produce endodermo del tracto digestivo superior o endodermo del tracto digestivo superior negativo en PDX1 incubando los cultivos en suspensión con RPMI con niveles séricos bajos, tales como FBS al 0,2 %, en una dilución de 1:1.000 de ITS, 25 ng KGF (o FGF7), y como alternativa, un inhibidor de ROCK durante 24 horas (del día 2 al día 3). Después de 24 horas (del día 3 al día 4), los medios se intercambian por el mismo medio menos un inhibidor de TGFp, pero, como alternativa, sigue siendo un inhibidor de ROCK para potenciar el crecimiento, la supervivencia y la proliferación de las células, durante otros 24 (días 4 a 5) a 48 horas (día 6). Una etapa fundamental para la especificación adecuada del endodermo del tracto digestivo superior es la eliminación de los factores de crecimiento de la familia de TGFp. Por consiguiente, se puede añadir un inhibidor de TGFp a los cultivos de células de la Fase 2, tales como el inhibidor de TGFp 2,5 pM n.° 4 o SB4315425 pM, un inhibidor específico de la quinasa similar al receptor de Activina (ALK), que es un receptor de tipo I de TGFp. Las células endodérmicas de tracto digestivo superior o endodérmicas de tracto digestivo superior negativas en PDX1 producidas a partir de la Fase 2 expresan conjuntamente SOX17, HNF1p y HNF4alfa y no expresan conjuntamente apreciablemente al menos SOX17 y HNF3p (FOXA2), ni HNF6, PDX1, SOX6, PROX1, PTF1A, CPA, cMYC, NKX6.1, NGN3, PAX3, ARX, NKX2.2, INS, GSC, GHRL, SST o PP, que son el sello distintivo de las células endodérmicas definitivas, las células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 o las células progenitoras pancreáticas o progenitoras/precursoras endocrinas, así como normalmente, las células de tipo polihormonal.
La Fase 3 (días 5-8) para la producción de PEC toma el cultivo de células endodérmicas de tracto digestivo superior de la Fase 2 y produce una célula endodérmica de tracto digestivo superior positiva en PDX1 mediante DMEM o RPMI en B27 al 1 %, ciclopamina de KAAD 0,25 pM, un retinoide, tal como el ácido retinoico (RA) 0,2 pM o un análogo del ácido retinoico tal como 3 nM de TTNPB (o CTT3, que es la combinación de ciclopamina de KAAD y TTNPB), y 50 ng/ml de Nogina durante aproximadamente 24 (día 7) a 48 horas (día 8). Específicamente, Los solicitantes han usado DMEM con alto contenido de glucosa desde aproximadamente el año 2003, y todas las divulgaciones de patentes y no patentes hasta ese momento emplearon DMEM con alto contenido de glucosa, incluso si no se menciona como "DMEM con alto nivel de glucosa" y similares. Esto es, en parte, porque fabricantes tales como Gibco no nombraron a su DMEM como tal, por ejemplo, DMEM (n.° de cat 11960) y d Me M con desactivación (n.° de cat. 10829). Cabe destacar, que a partir de la fecha de presentación de la presente solicitud, Gibco ofrece más productos de DMEM, pero sigue sin poner "alto contenido de glucosa" en algunos de sus productos de DMEM que contienen alto contenido de glucosa, por ejemplo, un DMEM con desactivación (n.° de cat. 10829-018). Por lo tanto, se puede suponer que, en cada caso, en el que se describe el DMEM, significa DMEM con alto contenido de glucosa, y esto fue evidente por otros que están realizando la investigación y el desarrollo en este campo. En el Ejemplo 21, se describen más detalles que describen el uso de alto contenido de glucosa exógeno. De nuevo, se puede usar un inhibidor de ROCK o un inhibidor de la rho-quinasa tal como el Y-27632 para potenciar el crecimiento, la supervivencia, la proliferación y la potenciación de la adhesión célula-célula. Las células de tracto digestivo superior positivas en PDX1 producidas a partir de la Fase 3 expresan conjuntamente PDX1 y HNF6, así como SOX9 y PROX, y no expresan conjuntamente de manera apreciable marcadores indicativos de células endodérmicas definitivas o células endodérmicas de tracto digestivo superior (células endodérmicas de tracto digestivo superior negativas en PDX1) o células endodérmicas de tracto digestivo superior positivas en PDX1 como se describe anteriormente en las Fases 1 y 2.
El método de la Fase 3 anterior es aquel de cuatro fases para la producción de PEC. Para la producción de células progenitoras/precursoras endocrinas y endocrinas como se describe en detalle en los Ejemplos 9-24 a continuación, además de Nogina, se usan ciclopamina de KAAD y Retinoide; Activina, Wnt y Heregulina, solas y/o combinadas, para suprimir la expresión de NGN3 mientras se mantiene una buena masa de agregados celulares. Véanse los Ejemplos 8, 9 y 10.
La producción de PEC DE Fase 4 (días 8-14) toma los medios de la Fase 3 y los intercambia por medios que contienen DMEM en un suplemento B27 al 1 % vol/vol, más 50 ng/ml de KGF y 50 ng/ml de EGF y algunas veces también Nogina a 50 ng/ml y un inhibidor de ROCK, y además incluye Activina sola o combinada con Heregulina. Estos nuevos métodos dan lugar a células progenitoras pancreáticas que expresan conjuntamente al menos PDX1 y NKX6.1, así como PTF1A. Estas células no expresan de manera apreciable marcadores indicativos de células endodérmicas definitivas o células endodérmicas de tracto digestivo superior (endodérmicas de tracto digestivo superior negativas en PDX1) como se describe anteriormente en las Fases 1,2 y 3. Véase la FIG. 44.
Como alternativa, las células de la Fase 4 pueden diferenciarse aún más en la Fase 5 para producir células de tipo progenitor o progenitoras/precursoras endocrinas y/o células endocrinas pancreáticas de una sola hormona o de varias hormonas en un medio que contiene DMEM con suplemento de B27 al 1 % vol/vol durante aproximadamente 1 a 6 días (preferentemente aproximadamente 2 días, es decir, los días 13-15). Las progenitoras/precursoras endocrinas producidas a partir de la Fase 5 expresan conjuntamente al menos CHGA, NGN3 y Nkx2.2, y no expresan de manera apreciable los marcadores indicativos de endodermo definitivo o endodermo de tracto digestivo superior (endodermo de tracto digestivo superior negativo en PDX1) como se describe anteriormente en las Fases 1, 2, 3 y 4 para la producción de PEC. Véase la FIG. 44.
Para la producción de PEC, las células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 producidas en la Fase 4 se cargan e introducen por completo en un dispositivo de macroencapsulación, y se trasplantan en un paciente, y las células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 maduran a células secretoras de hormonas pancreáticas o islotes pancreáticos, por ejemplo, células beta secretoras de insulina, in vivo (que también se conoce como " función in vivo "). La encapsulación de las células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 y la producción de insulina in vivo se describen detalladamente en la solicitud de EE. UU. N.° 12/618.659 (la Solicitud 659), titulada "ENCAPSULATION OF PANCREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS", presentada el viernes 13 de noviembre de 2009. La Solicitud 659 reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional n.° 61/114.857, Titulada "ENCAPSULATION OF PANCREATIC PROGENITORS DERIVED FROM HES CELLS", presentada el viernes 14 de noviembre de 2008; y la solicitud de patente provisional de EE.UU. n.° 61/121.084, titulada" ENCAPSULATION OF PANCREATIC ENDODERM CELLS", presentada el martes 9 de diciembre de 2008; y ahora la patente de EE.UU. n.° 8.278.106 y 8.424.928. Los métodos, las composiciones y los dispositivos descritos en el presente documento son actualmente representativos de realizaciones preferidas, y son ilustrativos y no pretenden ser limitaciones en el alcance de la invención. A los expertos en la materia se les ocurrirán cambios y otros usos que están definidos por el alcance de la divulgación. Por consiguiente, será evidente para un experto en la materia que pueden realizarse sustituciones y modificaciones variables de la invención desvelada en el presente documento.
Por ejemplo, se usa la Activina A, un miembro de la superfamilia de TGFp de factores de crecimiento o proteínas de señalización, para producir endodermo definitivo a partir de células pluripotentes, por ejemplo, células hES y células iPS; sin embargo, se pueden usar otros miembros de la superfamilia de TGFp, por ejemplo, GDF-8 y GDF-11, para producir un endodermo definitivo como los descritos en la solicitud internacional PCT/US2008/065686, titulada" GROWTH FACTORS FOR PRODUCTION OF DEFINITIVE ENDODERM", presentada el martes 3 de junio de 2008.
Todavía en un contexto diferente, la Activina sola o en combinación con Wnt y Heregulina es capaz de suprimir e inhibir la expresión de NGN3 en niveles altos y bajos; a niveles bajos solo o en combinación con Heregulina, o como alternativa, a niveles altos en combinación con w Nt y Heregulina, masa celular y, por lo tanto, se puede mantener el rendimiento. Véanse los Ejemplos 8, 9 y 10.
Para la producción de PEC, se usa ácido retinoico (RA) para diferenciar las células endodérmicas de tracto digestivo superior negativas en PDX1 en la Fase 2 a las células de tracto digestivo superior positivas en PDX1 en la Fase 3. Sin embargo, se pueden usar otros retinoides o análogos de ácido retinoico tales como el ácido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)-1-propenil]benzoico (o TTNPB) y análogos similares (por ejemplo, 4-HBT-TNPB). Para la producción de células progenitoras/precursoras endocrinas y células endocrinas, también se puede añadir ácido retinoico o cualquiera de sus análogos durante las Fases 6 y/o 7 para inducir la expresión génica de hormonas. Véanse los Ejemplos 13 y 16.
La nogina es una proteína que, por ejemplo, inactiva a los miembros de las proteínas de señalización de la superfamilia de TGFp, tales como la proteína morfogenética ósea 4 (BMP4). Sin embargo, otros inhibidores de BMP4 tales como Cordina y Gastrulación retorcida (Tsg) o anticuerpos neutralizantes anti-BMP pueden prevenir la unión de BMP a sus receptores de la superficie celular, inhibiendo así de manera eficaz la señalización de BMP. Como alternativa, se ha clonado y secuenciado el gen para la Nogina humana. Véase la patente de EE.UU. n.° 6.075.007. El análisis de la secuencia de Nogina muestra una región terminal carboxi que tiene homología con un inhibidor de la proteasa de tipo Kunitz, lo que indica que potencialmente otros inhibidores de la proteasa de tipo Kunitz pueden tener un efecto similar en la inhibición de BMP. El Ejemplo 15 describe el uso de Nogina para aumentar la producción de subpoblaciones no endocrinas (CHGA-).
Finalmente, los dispositivos de macroencapsulación descritos en el presente documento y en la Solicitud 659; las solicitudes de diseño de EE.UU. 29/447.944; 29/408.366; 29/408.368; 29/423.365; y 61/774.443, tituladas "SEMIPERMEABLE MACRO IMPLANTABLE CELLULAR ENCAPSULATION DEVICES", presentada el jueves 7 de marzo de 2013, de nuevo, son solo ejemplos, y no pretenden ser limitaciones del alcance de la invención. En particular, Todos los cambios en el diseño del dispositivo, tales como el tamaño del dispositivo, la pluralidad de cámaras o subcompartimientos en el dispositivo, o la pluralidad de puertos, o incluso los mecanismos para cargar y extraer el dispositivo están englobados. Por consiguiente, será evidente para un experto en la materia que se pueden realizar sustituciones y modificaciones variables no solo de los métodos de diferenciación descritos en el presente documento, sino también del dispositivo de encapsulación, en la invención develada en el presente documento. Véanse los Ejemplos 10, 12 y 18.
Con respecto a algunos de los procesos para la diferenciación de células pluripotentes a células endodérmicas definitivas, los factores de crecimiento mencionados anteriormente se proporcionan a las células para que los factores de crecimiento estén presentes en los cultivos a concentraciones suficientes para potenciar la diferenciación de al menos una parte de las células pluripotentes a células endodérmicas definitivas y células de linaje pancreático. En algunos procesos, los factores de crecimiento mencionados anteriormente están presentes en el cultivo celular a una concentración de al menos aproximadamente 5 ng/ml, al menos aproximadamente 10 ng/ml, al menos aproximadamente 25 ng/ml, al menos aproximadamente 50 ng/ml, al menos aproximadamente 75 ng/ml, al menos aproximadamente 100 ng/ml, al menos aproximadamente 200 ng/ml, al menos aproximadamente 300 ng/ml, al menos aproximadamente 400 ng/ml, al menos aproximadamente 500 ng/ml, al menos aproximadamente 1.000 ng/ml, al menos aproximadamente 2.000 ng/ml, al menos aproximadamente 3.000 ng/ml, al menos aproximadamente 4.000 ng/ml, al menos aproximadamente 5.000 ng/ml o más de aproximadamente 5.000 ng/ml. Otros agentes o factores de crecimiento más están presentes en cultivos celulares a una concentración de al menos 0,1 mM o 10 mM, o más.
En determinados procesos, Los agentes de diferenciación de células madre pluripotentes y/o los factores de crecimiento se eliminan del cultivo celular después de su adición. Por ejemplo, Los factores de crecimiento pueden eliminarse en aproximadamente un día, Aproximadamente dos días, aproximadamente tres días, aproximadamente cuatro días, aproximadamente cinco días, aproximadamente seis días, aproximadamente siete días, aproximadamente ocho días, aproximadamente nueve días o aproximadamente diez días tras su adición. En un proceso preferido, Los factores de crecimiento se eliminan aproximadamente cuatro días después de su adición. La eliminación del agente y/o el factor de crecimiento se puede realizar cambiando los medios en ausencia del agente y/o factor de crecimiento, o usando otro agente que inhiba la función de ese agente y/o factor de crecimiento.
En una realización preferida, los cultivos celulares en Fase 3 incluyen, pero sin limitación, agentes capaces de reprimir, suprimir, Inhibir y similares, células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+). Dichos agentes también incluyen Activina, Heregulina y WNT, y combinaciones de los tres en cantidades eficaces para potenciar la diferenciación y/o inducir la expresión de marcadores que son indicativos de la subpoblación de células progenitoras pancreáticas multipotentes no endocrinas (CHGA-) y reprimir o minimizar la expresión de marcadores de células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+). Los marcadores indicativos de células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) incluyen, pero sin limitación, NGN3, NKX2.2 y otros.
En otra realización preferida, los cultivos celulares en Fase 4 incluyen, pero sin limitación, agentes capaces de reprimir, suprimir, Inhibir y similares, células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+). Dichos agentes también incluyen Activina y Heregulina y combinaciones de las dos en cantidades eficaces para potenciar la diferenciación y/o inducir la expresión de marcadores que son indicativos de una subpoblación de células progenitoras pancreáticas multipotentes no endocrinas (CHGA-) y reprimir o minimizar la expresión de marcadores celulares comprometidos con el linaje endocrino (CHGA+). Los marcadores indicativos de células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) incluyen, pero sin limitación, NGN3, NKX2.2 y otros. Los medios para suprimir al menos NGN3 durante las fases 3 y 4 se describen en detalle en los siguientes Ejemplos 8-21.
En una realización, los cultivos celulares en fase 4 se diferencian aún más en la fase 5 con al menos Nogina, KGF, EGF y un inhibidor de señalización o de la vía de Notch. Los marcadores indicativos de la diferenciación endocrina incluyen, pero sin limitación, NGN3, NKX2.2 y otros. En una realización preferida, los agentes se usan en las fases 1­ 7 que simulan o imitan eficazmente in vitro lo que se observa en los estudios de desarrollo in vivo. Por ejemplo, las fases 3 y 4 del presente documento y de acuerdo con la Tabla 17, usan agentes que son capaces de retrasar, reprimir, suprimir y/o inhibir la diferenciación endocrina, o retrasar, reprimir, suprimir y/o inhibir marcadores indicativos de la diferenciación endocrina, incluyendo, pero sin limitación, NGN3 y NKX2.2. Durante las fases 5, 6 y/o 7, los cultivos celulares se tratan con agentes que son capaces de inducir, aumentar y/o potenciar la diferenciación endocrina, por ejemplo, mediante el uso de un inhibidor de la vía de Notch, tal como un inhibidor de la gamma secretasa. En fases cortas, las condiciones de cultivo celular de las fases 3 y 4 suprimen los fenotipos endocrinos, mientras que las condiciones de cultivo celular de las fases 5, 6 y/o 7 inducen progresivamente fenotipos endocrinos que incluyen, pero sin limitación, insulina (INS), glucagón (GCG), somatostatina (SST), polipéptido pancreático (PP), grelina (GHRL), miembro 8 de la familia 30 de vehículos de solutos (SLC30A8), Glucosa-6-fosfatasa 2 (G6PC2), prohormona convertasa 1 (PCSK1) y glucosa quinasa (GCK).
En una realización, las células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 se diferencian a las células progenitoras/precursoras endocrinas y endocrinas al continuar la incubación de células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 en presencia de un inhibidor de la señalización de Notch, por ejemplo, un inhibidor de gamma secretasa tal como R04929097, usado solo o en combinación con retinoides tales como el ácido retinoico. La presencia de un inhibidor de la señalización de Notch induce la expresión de NGN3 durante la fase 5. En otras realizaciones, el inhibidor de la gamma secretasa se proporciona al inicio del proceso de diferenciación, por ejemplo, en la fase pluripotente, y permanece en el cultivo celular a lo largo de la diferenciación a células que expresan hormonas del islote pancreático. En otras realizaciones más, el inhibidor de la gamma secretasa se añade después del inicio de la diferenciación, pero antes de la diferenciación a la fase de endodermo de tracto digestivo superior positivo en PDX1. En realizaciones preferidas, el inhibidor de la gamma secretasa se proporciona al cultivo celular o a la población celular aproximadamente al mismo tiempo que se proporcionan los factores de diferenciación que potencian la conversión del endodermo definitivo en endodermo positivo en PDX1. En otras realizaciones preferidas, el inhibidor de la gamma secretasa se proporciona al cultivo celular o a la población celular después de que una parte sustancial de las células del cultivo celular o de la población celular se haya diferenciado a células endodérmicas de tracto digestivo superior positivas en PDX1.
En otra realización, Los cultivos celulares de la fase 5 se diferencian aún más en las fases 6 y 7. Durante estas fases, se usan agentes que son capaces de especificar adecuadamente células progenitoras/precursoras endocrinas o células progenitoras para diferenciarse in vivo a células endocrinas más avanzadas evolutivamente y/o maduras. Dichos agentes incluyen, pero sin limitación, un retinoide o ácido retinoico, BMP, Nicotinamida, IGF, proteínas Hedgehog y similares. En una realización preferida, el TTNPB (ácido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)-1-propenil]benzoico o Arotinoide) es un análogo de ácido retinoico selectivo y altamente potente con afinidad por los receptores de ácido retinoico (RAR) a, p y y, que son factores de transcripción nuclear. El TTNPB y otro ácido retinoico y análogos del ácido retinoico producen la transcripción activada por ligando de genes que poseen elementos sensibles al ácido retinoico. Por consiguiente, otros agentes o ligandos capaces de activar elementos sensibles al ácido retinoico o unirse a cualquiera de los RAR son potencialmente útiles para y adaptables a la presente invención para potenciar la diferenciación de las células endocrinas.
En otra realización, los cultivos celulares de la fase 5 o la fase 6 o la fase 7 pueden tratarse además con Matrigel solo o en combinación con un inhibidor de la rho-quinasa para mejorar la adhesión celular. Como alternativa, se puede añadir un inhibidor de la rho-quinasa en las fases 5, 6 o 7 a concentraciones suficientes para potenciar la supervivencia celular, la masa celular y el rendimiento. Como alternativa, los cultivos celulares pueden disociarse y volver a asociarse durante o entre las fases 6 y 7 para eliminar o agotar los tipos de células no deseados que incluyen, pero sin limitación, la subpoblación de progenitores pancreáticos multipotentes no endocrinos (CHGA-). Véase el ejemplo 14.
En otra realización más, cualquiera de las fases 1-7 puede prolongarse 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 días más o acortarse en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días. Por ejemplo, en una realización preferida y de acuerdo con la Tabla 17, la fase 6 ocurre durante aproximadamente 6 días y la fase 7 durante aproximadamente 9 días. Sin embargo, ambas fases pueden acortarse para adaptarse a la producción de un progenitor/precursor endocrino, por ejemplo, para alargar y prolongar a 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más días a fin de producir una célula endocrina con un desarrollo más avanzado.
En otra realización, se proporcionan métodos para producir una PEC más avanzada en el desarrollo, o célula progenitora/precursora endocrina pancreática o endocrina pancreática. En un aspecto de la invención, se proporciona una célula endocrina que expresa únicamente una hormona pancreática que es positiva tanto en PDX1 como en NKX6.1, por ejemplo, una célula beta inmadura que expresa conjuntamente INS, PDX1 y NKX6.1. En otro aspecto, una célula avanzada evolutivamente puede ser un cultivo de PEC que consista principalmente en células progenitoras pancreáticas no endocrinas que expresen al menos PDX y NKX6.1, pero que no consista o que consiste mínimamente en células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) que expresen al menos CHGA+, NGN3 y/o NKX2.2. Estos cultivos de PEC están avanzadas evolutivamente, porque se consideran más similares a las que se han observado in vivo en los estudios de desarrollo de la diferenciación pancreática. Véase Jorgensen et al. (2007), "An Illustrated Review of Early Pancreas Development in the Mouse", Endocrine Reviews 28(6):685-705, y Rukstalis y Habener (2009), "Neurogenin3: A master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration", Islets 1(3): 177-184. Otro ejemplo de una célula o un cultivo celular avanzado evolutivamente es aquel que se ha disociado y reagregado o reasociado de manera que el cultivo celular reagregado consiste en una población de células más homogénea. Esta población de células más homogénea, en un aspecto de la invención, no comprende tipos de células en fases anteriores, por ejemplo, las células progenitoras/precursoras endocrinas pancreáticas o endocrinas que comprenden principalmente células que expresan una sola hormona que son positivas tanto en PDX1 como en NKX6.1, pero que no comprenden células o subpoblaciones en las fases 3 y 4 o subpoblaciones de PEC o PEC, que incluyen, pero sin limitación, células progenitoras pancreáticas multipotentes no endocrinas (CHGA-), o células triple negativas/residuales (CHGA-/PDX1-/NKX6.1-) y similares, o células que expresan múltiples hormonas (es decir, células que expresan más de una hormona en cualquier tipo de célula).
En otra realización, los cultivos celulares proporcionados en el presente documento preferentemente se especifican adecuadamente, lo que tiene un significado específico y cierto en la técnica de la biología evolutiva. En el contexto de la biología evolutiva, es el mecanismo mediante el que las células obtienen destinos distintos o se especifican o se especifican correctamente. Dado que la diferenciación del cultivo celular in vitro carece de organización temporal y de señales típicas de los estudios evolutivos in vivo, el uso y la dependencia de marcadores celulares (marcadores de superficie o internos tales como factores de transcripción), en particular, los marcadores celulares distintivos o salientes indicativos de un tipo de célula específico, son esenciales. Por lo tanto, la referencia a células debidamente especificadas, cultivos celulares, subpoblaciones y poblaciones significa que esas células tienen destinos distintos, y que esos destinos son más seguros y están determinados en función de la expresión de su marcador, del perfil de los marcadores que expresan e, igualmente importante, de los marcadores que no expresan. La especificación adecuada de los cultivos celulares in vitro depende de los estudios evolutivos in vivo de células similares, por lo tanto, en una realización preferida, los estudios evolutivos in vivo son una guía para la diferenciación y caracterización in vitro de células adecuadamente especificadas.
En algunas realizaciones de la invención descritas en el presente documento, se proporciona exendina 4 al cultivo celular o a la población celular de diferenciación aproximadamente al mismo tiempo que el inhibidor de la gamma secretasa. En determinadas realizaciones, la exendina 4 se proporciona para estar presente en el cultivo celular o en la población celular a una concentración de al menos aproximadamente 0,1 ng/ml a 1.000 ng/ml.
Se apreciará que la expresión de los marcadores NGN3, NKX2.2 y/o PAX4 se induce en un intervalo de diferentes niveles en las células progenitoras/precursoras endocrinas dependiendo de las condiciones de diferenciación. Como tales, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, la expresión del marcador NGN3, NKX2.2 y/o PAX4 en células o en poblaciones de células progenitoras/precursoras endocrinas es de al menos aproximadamente 2 veces superior a al menos aproximadamente 10.000 veces superior a la expresión del marcador NGN3, NKX2.2 y/o PAX4 en células o poblaciones de células progenitoras/precursoras no endocrinas, por ejemplo, células madre pluripotentes, células endodérmicas definitivas, células endodérmicas de tracto digestivo superior positivas en PDX1, células inmaduras que expresan hormona del islote pancreático, células maduras que expresan hormonas del islote pancreático, células endodérmicas extraembrionarias, células mesodérmicas y/o células ectodérmicas. En otras realizaciones, la expresión del marcador NGN3, NKX2.2 y/o PAX4 en células o en poblaciones celulares progenitoras/precursoras endocrinas es de al menos aproximadamente 4 veces superior, de al menos aproximadamente 6 veces superior a 10.000 veces superior a la expresión del marcador NGN3, NKX2.2 y/o PAX4 en células o poblaciones de células progenitoras/precursoras no endocrinas, por ejemplo, células madre pluripotentes, células endodérmicas definitivas, células endodérmicas de tracto digestivo superior positivas en PDX1, células inmaduras que expresan hormona del islote pancreático, células maduras que expresan hormonas del islote pancreático, células endodérmicas extraembrionarias, células mesodérmicas y/o células ectodérmicas. En algunas realizaciones, la expresión del marcador NGN3, NKX2.2 y/o PAX4 en células o en poblaciones de células progenitoras/precursoras endocrinas es infinitamente superior a la expresión del marcador NGN3, NKX2.2 y/o PAX4 en células o poblaciones de células progenitoras/precursoras no endocrinas, por ejemplo, células pluripotentes como células iPS y células hES, células endodérmicas definitivas, células endodérmicas de tracto digestivo superior positivas en PDX1, células inmaduras que expresan hormona del islote pancreático, células maduras que expresan hormonas del islote pancreático, células endodérmicas extraembrionarias, células mesodérmicas y/o células ectodérmicas.
Otras realizaciones de la presente invención se refieren a composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones celulares, que comprenden células humanas, incluyendo células progenitoras/precursoras endocrinas humanas, en las que la expresión del marcador NGN3 es superior a la expresión del marcador AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL y/o PAX6 en al menos aproximadamente el 2 % de las células humanas. En otras realizaciones, la expresión del marcador NGN3 es superior a la expresión del marcador AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL y/o PAX6 en al menos aproximadamente del 5 % a 98 % de las células humanas. En algunas realizaciones, el porcentaje de células humanas en los cultivos o las poblaciones de células, en los que la expresión de NGN3 es superior a la expresión del marcador AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL y/o Pa X6, se calcula sin tener en cuenta las células alimentadoras.
Se apreciará que algunas realizaciones de la presente invención se refieren a composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones celulares, que comprenden células progenitoras/precursoras endocrinas humanas, en las que la expresión de NKX2.2 y/o PAX4 es superior a la expresión del marcador AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, Ma Fa , SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL y/o PAX6 en del al menos aproximadamente 2 % hasta más que al menos aproximadamente el 98 % de las células humanas. En algunas realizaciones, la expresión de NKX2.2 y/o PAX4 es superior a la expresión del marcador AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL y/o pAX6 en al menos del aproximadamente 5 % de las células humanas al 98 % de las células humanas. En algunas realizaciones, el porcentaje de células humanas en los cultivos o las poblaciones de células, en las que la expresión de NKX2.2 y/o PAX4 es superior a la expresión del marcador AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL y/o PAX6, se calcula sin tener en cuenta las células alimentadoras.
Usando los procesos descritos en el presente documento, se pueden producir composiciones que comprenden células progenitoras/precursoras endocrinas sustancialmente exentas de otros tipos de células. En algunas realizaciones de la presente invención, las poblaciones de células o los cultivos de células progenitoras/precursoras endocrinas producidas mediante los métodos descritos en el presente documento están sustancialmente exentas de células que expresan significativamente los marcadores AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 y/o NFM. En algunas realizaciones, las poblaciones de células progenitoras/precursoras endocrinas de cultivos celulares producidos mediante los métodos descritos en el presente documento están sustancialmente exentas de células que expresan significativamente los marcadores AFP, SOX7, SOX1, ZIC1, NFM, MAFA, SYP, CHGA, INS, GCG, SST, GHRL y/o PAX6.
En otros procesos más para la producción de células inmaduras que expresan hormonas de islote pancreático desveladas en el presente documento, se proporciona HGF a las células de modo que esté presente en el cultivo celular o en la población celular a concentraciones suficientes para potenciar la diferenciación de al menos una parte de las células progenitoras/precursoras endocrinas a células inmaduras que expresan hormonas del islote pancreático. En algunas realizaciones, El HGF está presente en el cultivo celular o en la población celular a una concentración de al menos aproximadamente 1 ng/ml, de al menos aproximadamente 5 ng/ml a 1.000 ng/ml.
En otros procesos más para la producción de células inmaduras de hormonas de islote pancreático descritas en el presente documento, se proporciona IGF1 a las células de modo que esté presente en el cultivo celular o en la población celular a concentraciones suficientes para potenciar la diferenciación de al menos una parte de las células progenitoras/precursoras endocrinas a células inmaduras que expresan hormonas de islote pancreático. En algunas realizaciones, IGF1 está presente en el cultivo celular o en la población celular a una concentración de al menos aproximadamente 1 ng/ml a 1.000 ng/ml.
En ciertas realizaciones de los procesos para producir células inmaduras que expresan hormonas de islote pancreático como se describe en el presente documento, se proporcionan uno o más de entre nicotinamida, exendina 4, HGF e IGF1 después de que uno o más factores de diferenciación proporcionados previamente hayan sido retirados de los cultivos celulares. En otras realizaciones, se proporcionan uno o más de nicotinamida, exendina 4, HGF e IGF1 a un cultivo celular o a una población celular que comprende uno o más factores de diferenciación que se proporcionaron o proporcionaron anteriormente casi al mismo tiempo que uno o más de nicotinamida, exendina 4, HGF e IGF1. En realizaciones preferidas, los factores de diferenciación que se proporcionaron anteriormente o que se proporcionaron aproximadamente al mismo tiempo que uno o más de nicotinamida, exendina 4, HGF e IGF1 incluyen, pero sin limitación, DAPT, FGF-10, KAAD-ciclopamina, Activina A, Activina B, BMP4 y/o RA.
Otras realizaciones de la presente invención se refieren a composiciones, tales como cultivos celulares o poblaciones celulares, que comprenden células humanas, incluyendo células humanas inmaduras que expresan hormonas del islote pancreático, en las que la expresión del marcador MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, Pa X6, NEUROD, PDX1, HB9, GHRL, IAPP, INS GCG, SST, PP y/o péptido C es superior a la expresión del marcador NGN3, MAFA, MOX1, CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIc 1 y/o Nf M en al menos aproximadamente el 2 % de las células humanas. En otras realizaciones, la expresión del marcador MAFB, SYP, CHGA, NKX2.2, ISL1, PAX6, NEUROD, PDX1, HB9, GHRL, IAPP INS GCG, SST, PP y/o péptido C es superior a la expresión del marcador NGN3, MAFA, MOX1, CER, POU5F1, AFP, SOX7, SOX1, ZIC1 y/o NFM en al menos aproximadamente el 5% de las células humanas, en al menos del aproximadamente 10 % de las células humanas al 95 % de las células humanas o en al menos aproximadamente el 98 % de las células humanas.
En determinadas realizaciones de la presente invención, los cultivos celulares y/o las poblaciones celulares que comprenden células inmaduras que expresan hormonas de islote pancreático también incluyen un medio que comprende una o más hormonas secretadas seleccionadas de grelina, insulina, somatostatina y/o glucagón. En otras realizaciones, el medio comprende péptido C. En una realización preferida, la concentración de una o más hormonas o péptido C secretados en el medio varía de al menos aproximadamente 1 pmol de ghrelina, insulina, somatostatina, glucagón o péptido C/pg de ADN celular a al menos aproximadamente 1.000 picomoles (pmol) de grelina, insulina, somatostatina, glucagón o péptido C/pg de ADN celular.
Método de producción de insulina in vivo
En algunas realizaciones, se trasplantan progenitoras pancreáticas derivadas in vitro o células de tipo endodérmico pancreático positivas en PDX-1 o equivalentes de las mismas descritas anteriormente en un sujeto mamífero. Estos métodos se describen en detalle en la solicitud internacional PCT/US2007/015536, titulada "METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES", y Kroon et al. (2008) supra. En una realización preferida, el sujeto mamífero es un sujeto humano. Los sujetos particularmente preferidos son aquellos que se han identificado por tener una afección que limita la capacidad del sujeto para producir niveles suficientes de insulina en respuesta a concentraciones fisiológicamente altas de glucosa en sangre. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente un intervalo de niveles de glucosa en sangre que constituya un nivel fisiológicamente alto de glucosa en sangre para cualquier especie de mamífero en particular. Cualquier nivel persistente de glucosa en sangre que produzca una enfermedad o afección reconocida se considera un nivel fisiológicamente alto de glucosa en sangre.
Realizaciones adicionales de la presente invención se refieren a una célula secretora de insulina in vivo que se deriva de una célula madre pluripotente in vitro o de su progenie, por ejemplo, células multipotentes, tales como células endodérmicas de tracto digestivo superior positivas en PDX-1, célula progenitora pancreática o endodérmica pancreática positiva en PDX-1, una célula progenitora/precursora endocrina, tal como una célula progenitora/precursora endocrina positiva en NGN3 o una célula secretora de hormona diferenciada funcional, tal como una insulina, glucagón, somatostatina, grelina o célula secretora de polipéptido pancreático. Cualquiera de las células multipotentes o diferenciadas terminalmente descritas anteriormente se pueden trasplantar al hospedador o mamífero, y madurar en células secretoras de hormonas fisiológicamente funcionales, tales como células secretoras de insulina, en respuesta a los niveles de glucosa en sangre del hospedador. En realizaciones preferidas, la célula no forma un teratoma in vivo, y si lo forma así, permanece localizado en el área del trasplante y se puede extirpar o retirar fácilmente. En realizaciones especialmente preferidas, la célula no contiene ninguna anomalía cariotípica durante el proceso de diferenciación in vitro, o cuando se trasplanta al mamífero in vivo, o al madurar y desarrollarse en islotes funcionales in vivo.
Además, aunque las realizaciones descritas en el presente documento se refieren a una célula pluripotente genéticamente modificada o modificada por ingeniería genética, célula multipotente o diferenciada derivada de la célula pluripotente, tal como una célula iPS humana, basándose en la descripción proporcionada en el presente documento, se anticipa que, debido a que las células iPS muestran una fisiología similar y perfiles de expresión de marcadores de genes en comparación con las células hES y las células derivadas de hES, tendrán características fisiológicas similares in vivo.
Método de encapsulación de progenitores pancreáticos
En algunas realizaciones, la composición celular pluripotente, multipotente y diferenciada descrita en el presente documento puede ser encapsulada en un dispositivo mecánico biológico y/o no biológico, en el que el dispositivo encapsulado separa y/o aísla las composiciones celulares del hospedador.
Los métodos de encapsulación se describen en detalle en la solicitud de EE.UU. 61/114.857, presentada el viernes 14 de noviembre de 2008, titulada "ENCAPSULATION OF PANCREATIC PROGENITORS DERIVED FROM HES CELLS", y la solicitud de EE.UU. n. 61/121.086, presentada el 12 de diciembre de 2008, titulada "ENCAPSULATION OF PANCREATIC ENDODERM CELLS".
En una realización, el dispositivo de encapsulación contiene las células derivadas pluripotentes, por ejemplo, célula endodérmica de tracto digestivo superior positiva en PDX-1, célula progenitora o endodérmica pancreática positiva en PDX-1, una célula endocrina o progenitora/precursora endocrina, tal como una célula progenitora/precursora endocrina positiva en NGN3 o una célula secretora de hormona diferenciada funcional, tal como una insulina, glucagón, somatostatina, grelina o célula secretora de polipéptido pancreático, en una membrana semipermeable que impide el paso de la población de células trasplantadas, reteniéndolas en el dispositivo, mientras que, al mismo tiempo, permite el paso de ciertos polipéptidos secretados, por ejemplo, insulina, glucagón, somatostatina, ghrelina, polipéptido pancreático y similares. Como alternativa, el dispositivo tiene una pluralidad de membranas, incluyendo una membrana vascularizante.
Uso de agentes para potenciar y promover el crecimiento, la supervivencia, la proliferación y la adhesión célula-célula de células madre pluripotentes humanas, por ejemplo, células hES y células iPS
La regulación celular puede verse afectada a través de la transducción de señales extracelulares a través de la membrana que, a su vez, modula las vías bioquímicas dentro de la célula. La fosforilación de proteínas representa un curso mediante el que las señales intracelulares se propagan de una molécula a otra, lo que finalmente produce una respuesta celular. Estas cascadas de transducción de señales están altamente reguladas y, a menudo, se solapan, como lo demuestra la existencia de muchas proteínas quinasas y fosfatasas. Se ha informado que, en los seres humanos, se sabe que las proteínas tirosina quinasas tienen un papel importante en el desarrollo de muchos estados patológicos, incluyendo la diabetes, el cáncer, y también se han relacionado con una amplia variedad de síndromes congénitos. Las serina/treonina quinasas, por ejemplo, las Rho quinasas, son una clase de enzimas, que, si son inhibidas, pueden tener relevancia para el tratamiento de enfermedades humanas, incluyendo diabetes, cáncer, y varios trastornos cardiovasculares inflamatorios y SIDA. La mayoría de los inhibidores identificados hasta la fecha actúan en el sitio de unión a ATP. Dichos inhibidores competitivos con el ATP han demostrado selectividad en virtud de su capacidad para dirigirse a las áreas más pobremente conservadas del sitio de unión a ATP.
La familia de Rho quinasas de pequeñas proteínas de unión a GTP contiene al menos 10 miembros, incluyendo Rho A-E y G, Rac 1 y 2, Cdc42 y TC10. Los inhibidores se suelen denominar inhibidores de ROK o ROCK, o inhibidores de Rho-quinasa, y se usan indistintamente en el presente documento. Los dominios efectores de RhoA, RhoB y RhoC tienen la misma secuencia de aminoácidos y parecen tener dianas intracelulares similares. La Rho quinasa funciona como un mediador de cadena abajo primario de Rho y existe como dos isoformas: a (ROCK2) y p (ROCK1). Las proteínas de la familia Rho quinasa tienen un dominio catalítico (quinasa) en su dominio N-terminal, un dominio superenrollado en su parte media y un dominio homólogo a la pleckstrina (PH) putativo en su región C-terminal. El dominio de unión a Rho de ROCK se ubica en la porción C-terminal del dominio superenrollado, y la unión de la forma unida a GTP de Rho produce un aumento de la actividad de la quinasa. La vía mediada por Rho/Rho-quinasa desempeña un papel importante en la transducción de señales iniciada por muchos agonistas, incluyendo angiotensina II, serotonina, trombina, endotelina-1, norepinefrina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, ATP/ADP y nucleótidos extracelulares, y urotensina II. A través de la modulación de sus efectores/sustratos diana, la Rho quinasa desempeña un papel importante en diversas funciones celulares, incluyendo la contracción del músculo liso, la organización del citoesqueleto de actina, la adhesión celular, y motilidad y expresión génica. En virtud del papel que desempeñan las proteínas Rho quinasas en la mediación de una serie de funciones celulares que se consideran asociadas a la patogénesis de la arteriosclerosis, los inhibidores de estas quinasas también pueden ser útiles para el tratamiento o la prevención de diversas enfermedades cardiovasculares arterioscleróticas y que participan en la contracción endotelial.
En algunas realizaciones, los agentes que potencian y/o apoyan el crecimiento celular, la supervivencia, la proliferación y la adhesión célula-célula se añaden a diversas condiciones de medios de cultivo celular, incluyendo, pero sin limitación, inhibidores de la Rho-quinasa Y-27632, Fasudilo (también conocido como HA1077), H-1152P e ITS (insulina/transferrina/selenio; Gibco), Wf-536, Y-30141 (descrito en la patente de EE.UU. n.° 5.478.838) y sus derivados, y ácido nucleico no codificante para ROCK, ácido nucleico que induce la interferencia del ARN (por ejemplo, ARNip), péptidos competitivos, péptidos antagonistas, anticuerpos inhibidores, fragmentos ScFV de anticuerpo, variantes negativas dominantes y vectores de expresión de las mismas. Además, ya que hay otros compuestos de bajo peso molecular que son conocidos como inhibidores de ROCK, dichos compuestos o derivados de los mismos también se pueden usar en la presente invención (por ejemplo, véanse las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 20050209261, 20050192304, 20040014755, 20040002508, 20040002507, 20030125344 y 20030087919, y las publicaciones de patente internacional n.° 2003/062227, 2003./059913, 2003/062225, 2002/076976 y 2004/039796).
En la presente invención, también se puede usar una combinación de uno o dos o más de los inhibidores de ROCK.
Estos agentes funcionan, en parte, potenciando la reasociación de cultivos de células hES disociadas, de iPS o de células diferenciadas, por ejemplo, endodérmicas definitivas, endodérmicas del tracto digestivo superior, endodérmicas pancreáticas, de epitelio pancreático, poblaciones progenitoras pancreáticas, poblaciones progenitoras endocrinas y similares. Asimismo, los agentes pueden funcionar cuando no se realiza la disociación celular. El aumento del crecimiento, de la supervivencia, de la proliferación y de la adhesión célula-célula de las células madre pluripotentes humanas se lograron independientemente de si las células se produjeron a partir de agregados celulares en suspensión o de cultivos de placas adherentes (con o sin componentes de la matriz extracelular, con o sin suero, con o sin alimentadores de fibroblastos, con o sin FGF, con o sin Activina). El aumento de la supervivencia de estas poblaciones celulares facilita y mejora los sistemas de purificación usando un clasificador de células y, por lo tanto, permite una mejor recuperación de las células. El uso de inhibidores de la Rho quinasa tales como Y27632 puede permitir la expansión de tipos de células diferenciadas al potenciar su supervivencia durante el pase en serie de células individuales disociadas o de preservación criogénica. Aunque los inhibidores de la Rho quinasa tales como Y27632 se han probado en células madre pluripotentes humanas (por ejemplo, células hES e iPS) y células diferenciadas de las mismas, los inhibidores de la Rho quinasa se pueden aplicar a otros tipos de células, por ejemplo, en general, células epiteliales que incluyen, pero no se limitan a intestinales, pulmonares, de timo, de riñón y los tipos de células neuronales tales como el epitelio retiniano pigmentado.
La concentración del inhibidor de ROCK en el medio de cultivo celular no se limita a lo que se describe en los siguientes ejemplos, siempre que la concentración pueda lograr los efectos deseados, tales como la potenciación, el aumento y/o el fomento del crecimiento, de la supervivencia, de la proliferación y de la adhesión de célula-célula de las células. Un experto en la materia reconocerá que puede ser necesaria la optimización de diversos inhibidores de ROCK en diversas condiciones. Por ejemplo, cuando se emplea Y-27632, una concentración preferible puede variar entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1.000 pM, más preferentemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 pM, e incluso más preferentemente de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 50 pM, y lo más preferentemente de aproximadamente 5 a 20 pM. Cuando se usa Fasudilo/HA1077, se puede usar a aproximadamente dos o tres veces la concentración de Y-27632 mencionada anteriormente. Cuando se usa H-1152, se puede usar en aproximadamente una fracción, por ejemplo, Aproximadamente 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50 o 1/60 de la cantidad de la concentración anteriormente mencionada de Y-27632. La concentración de inhibidor de ROCK usada dependerá, en parte, de la bioactividad y la potencia del inhibidor, y de las condiciones en que se use.
El tiempo y el período de tratamiento con el inhibidor de ROCK pueden o no estar limitados dependiendo de los efectos deseados, tales como la potenciación, el aumento y/o el fomento del crecimiento, la supervivencia, la proliferación (masa celular) y la adhesión célula-célula. Sin embargo, la adición de un inhibidor de ROCK también puede afectar a la diferenciación de maneras sorprendentes, como se describe mejor en el Ejemplo 7. Los siguientes ejemplos describen cultivos de células madre pluripotentes humanos y/o cultivos de células diferenciadas tratados durante aproximadamente 12 horas, 24 horas, 48 horas o más.
La densidad de los cultivos de células madre pluripotentes humanos tratados con el inhibidor de ROCK tampoco está limitada en la medida en que sea una densidad en la que se logren los efectos deseados, tales como la potenciación, el aumento y/o el fomento del crecimiento, de la supervivencia, de la proliferación y de la adhesión de célula-célula de las células. La densidad celular de las células sembradas puede ajustarse dependiendo de varios factores, incluyendo, pero sin limitación, el uso de cultivos adherentes o en suspensión, la receta específica del medio de cultivo celular usado, las condiciones de crecimiento y el uso contemplado de las células cultivadas. Los ejemplos de densidades de cultivos celulares incluyen, pero sin limitación, 0,01 x 105 células/ml, 0,05 x 105 células/ml, 0,1 x 105 células/ml, 0,5 x 105 células/ml, 1,0 x 105 células/ml, 1,2 x 105 células/ml, 1,4 x 105 células/ml, 1,6 x 105 células/ml, 1,8 x 105 células/ml, 2,0 x 105 células/ml, 3,0 x 105 células/ml, 4,0 x 105 células/ml, 5,0 x 105 células/ml, 6,0 x 105 células/ml, 7,0 x 105 células/ml, 8,0 x 105 células/ml, 9,0 x 105 células o 10,0 x 105 células/ml o más, por ejemplo, hasta 5 x 107 células/ml o más, o cualquier valor intermedio, se han cultivado con buen crecimiento, supervivencia, proliferación y adhesión célula-célula de las células.
Uso de agentes que activan los miembros de la familia de receptores de TGFB
En otra realización más, los agentes que activan el miembro de la familia de receptores de TGFp incluyen miembros de la superfamilia de factores de crecimiento TGFp, se describen en el presente documento. Como se usa en el presente documento, "miembro de la superfamilia de TGFp" o equivalentes de los mismos se refiere a más de 30 proteínas relacionadas estructuralmente, incluyendo las subfamilias que incluyen TGFp1, TGFp2, TF-p3, GDF-15, GDF-9, BMP-15, BMP-16, BMP-3, GDF-10, BMP-9, BMP-10, GDF-6, GDF-5, GDF-7, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-2, BMP-4, GDF-3, GDF-1, GDF 11, GDF8, Activinas pC, pE, pA y pB, BMP-14, GDF-14, MIS, Inhibina alfa, Lefty1, Lefty2, GDNF, Neurteurina, Persefina y Artemina. Véase Chang et al. (2002) Endocnne Rev. 23(6):787-823.
Un miembro de la familia de TGFp puede ser reemplazado por, o usado en combinación con, un activador de la vía de señalización de TGFp, que es un compuesto que estimula uno o más de los polipéptidos o interacciones que participan en la transducción o la realización de otros cambios en las propiedades de una célula en respuesta a un miembro de la familia de TGFp. Una vía de señalización de TGFp incluye a los propios miembros de la familia de TGFp. Los miembros de la superfamilia de TGFp transmiten señales al núcleo mediante la señalización a través de receptores de serina-treonina quinasa de tipo II e I y efectores intracelulares conocidos como Smads. Estos receptores se dividen en dos subfamilias conocidas como receptores de tipo I y tipo II que actúan cooperativamente para unirse al ligando y transducir la señal (Attisano et al., Mol Cell Biol 16 (3), 1066-1073 (1996)). Los ligandos se unen a los receptores de tipo I y II en la superficie celular, potenciando la activación del receptor de tipo I a través de la fosforilación. Este complejo activado, a su vez, activa Smads intracelular, que ensamblan complejos de múltiples subunidades que regulan la transcripción. Los miembros de la superfamilia de TGFbeta se dividen en dos subgrupos de señalización: aquellos relacionados funcionalmente con TGFp/Activina y aquellos relacionados con la subfamilia de BMP/GDF. Se piensa que la mayoría de los ligandos de TGFp se unen primero a un receptor de tipo II, y este complejo de ligando/receptor de tipo II luego recluta o fosforila un receptor de tipo I (Mathews, L S, Endocr Rev 15:310-325 (1994); Massague, Nature Rev: Mol Cell Biol. 1, 169-178 (2000)). La quinasa receptora de tipo II mediante la fosforilación y activación de la quinasa receptora de tipo I, que luego fosforila y activa las proteínas Smad. Los ligandos de TGFp/Activina se unen a los receptores de TGFp y de Activina de tipo II y pueden activar Smad-2 y-3. Nodal y Lefty señalizan a través de esta vía de tipo Activina. Los ligandos de BMP/GDF se unen a los receptores de BMP de tipo II y pueden activar a Smads 1,5 y 8. Véase Derynck, R et al. Cell 95, 737-740 (1998)). Tras la estimulación del ligando, las proteínas Smads se mueven hacia el núcleo y funcionan como componentes de complejos de transcripción.
La señalización de TGFp está regulada positiva y negativamente a través de diversos mecanismos. La regulación positiva amplifica las señales a un nivel suficiente para la actividad biológica. Los ligandos de la superfamilia de TGFp se unen a un receptor de tipo II, que recluta y fosforila un receptor de tipo I. El receptor de tipo I luego fosforila las SMAD reguladas por receptores (R-SMAD, por ejemplo, SMAD1, SMAd 2, SMAD3, SMAD5 y SMAD8) que entonces pueden enlazar el mediador común Smad o co-SMAD. Los complejos de R-SMAD/coSMAD se acumulan en el núcleo, en el que actúan como factores de transcripción y participan en la regulación de la expresión del gen diana. Por ejemplo, los factores de diferenciación del crecimiento incluyen 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 15. Y, en una realización preferida, GDF8 y GDF11, son miembros de la familia de TGFp que también son activadores de la vía de señalización de TGFp (regulación positiva) y actúan uniéndose a la parte del dominio de unión al ligando extracelular del receptor ActRII y luego formando un complejo con ActRI, que conduce a la inhibición del regulador negativo de Smad7 y la fosforilación del complejo de Smad2/Smad3. El complejo de Smad2/Smad3 se asocia con Smad4 para regular la expresión de ciertos genes.
Al igual que con el uso de cualquier agente, la concentración de cualquier miembro de la superfamilia de TGFp en el medio de cultivo celular no se limita a la descrita en los siguientes ejemplos, siempre que la concentración pueda lograr los efectos deseados para activar un miembro de la familia de receptores de TGFp, por ejemplo. Por ejemplo, cuando se emplean Activinas, por ejemplo, Activina A y/o B, o GDF8 y GDF-11, una concentración preferible puede variar de aproximadamente 10 a aproximadamente 300 nM, más preferentemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 nM, e incluso más preferentemente de aproximadamente 75 a aproximadamente 150 nM, y lo más preferentemente, de aproximadamente 100 a 125 nM. Un experto en la materia puede probar fácilmente cualquier concentración y el uso de técnicas convencionales en la materia puede determinar la eficacia de dicha concentración, por ejemplo, evaluando la diferenciación mediante la determinación de la expresión y la no expresión de un panel de marcadores génicos para cualquier tipo de célula.
Uso de agentes para producir células endocrinas
En una realización, la presente invención proporciona métodos para crear poblaciones y/o subpoblaciones de tipo linaje endodérmico pancreático, específicamente PEC y/o células de linaje endocrino pancreático, usando un inhibidor de la vía Notch, incluyendo, pero sin limitación, un inhibidor de gamma secretasa, en una cantidad eficaz para potenciar la diferenciación endocrina y/o inducir la expresión de ciertos marcadores que son distintivos de las células endocrinas y son indicativos de la diferenciación endocrina. Se han descrito numerosos inhibidores de gamma secretasa. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 6.756.511; 6.890.956; 6.984.626; 7.049.296; 7.101.895; 7.138.400; 7.144.910; y 7.183.303. Los inhibidores de la gamma secretasa se pueden obtener fácilmente, por ejemplo, en Calbiochem (La Jolla, California): inhibidor de gamma secretasa I, (GSI I), Z-Leu-Leu-Norleucina-CHO; inhibidor de la gammasecretasa II; inhibidor de la gamma secretasa III, (GSI III), N-Benciloxicarbonil-Leu-leucinal; inhibidor de la gamma secretasa IV, (GSI IV), N-(2-Naftoil)-Val-fenilalaninal; inhibidor de la gamma secretasa V, (GSI V), N-benciloxicarbonil-Leu-fenilalaninal; inhibidor de la gamma secretasa VI, (GSI VI), 1-(S)-endo-N-(1,3,3)-Trimetilbiciclo[2.2.1]hept-2-il)-4-fluorofenil-sulfonamida; inhibidor de la gamma secretasa VII, (GSI VII), Mentiloxicarbonil-LL-CHO; inhibidor de la gamma secretasa IX, (GSI IX), (DAPT), éster t-butílico de N-[N-(3,5-difluorofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina; inhibidor de la gamma secretasa X, (GSI X), Éster terc-butílico de ácido {1 S-bencil-4R-[1-(1 S-carbamoil-2-fenetilcarbamoil)-1 S-3-metilbutilcarbamoil]-2R-hidroxi-5-fenilpentil}carbámico; inhibidor de la gamma secretasa XI, (GSI XI), 7-amino-4-cloro-3-metoxiisocumarina; inhibidor de la gamma secretasa XII, (GSI XII), Z-Ile-Leu-CHO; inhibidor de la gamma secretasa XIII, (GSI XIII), Z-Tyr-Ile-Leu-CHO; inhibidor de la gamma secretasa XIV, (GSI XIV), Z-Cys (t-Bu)-Ile-Leu-CHO; inhibidor de la gamma secretasa XVI, (GSI XVI), Éster metílico de N-[N-3,5-difluorofenacetil]-L-alanil-S-fenilglicina; inhibidor de la gamma secretasa XVII, (GSI XVII), WPE-III-31C); inhibidor de la gamma secretasa XIX, (GSI XIX), (2S,3R)-3-(3,4-Difluorofenil)-2-(4-fluorofenil)-4-hidroxi-N-((3S)-2-oxo-5-fenil-2,3-dihidro-1H-benzo[e][1,4]diazepin-3-il)-butiramida; inhibidor de gamma secretasa XX, (GSI XX), (Dibenzazepina (DBZ)), (S,S)-2-[2-(3,5-Difluorofenil)acetilamino]-N-(5-metil-6-oxo-6,7-dihidro--5H-dibenzo[6,d]azepin-7-il)propionamida, inhibidor de la gamma secretasa XXI, (GSI XXI), (S,S)-2-[2-(3,5-Difluorofenil)-acetilamino]-N-(1-metil-2-oxo-5-fenil-2,3-dihidro-1H-benzo[e][1,4]diazepin-3-il)-propionamida; inhibidor de la gamma40 secretasa I, N-trans-3,5-Dimetoxicinamoil-Ileleucinal; inhibidor de la gamma40 secretasa II, N-terc-butiloxicarbonil-Gly-Val-Valinal; e isovaleril-V-V-Sta-A-Sta-OC3.
En un aspecto, el inhibidor de la gamma secretasa se selecciona del grupo que consiste en uno o más de: Z-Leu-Leu-Norleucina-CHO, N-Benciloxicarbonil-Leu-leucinal, N-(2-Naftoil)-Val-fenilalaninal, N-Benciloxicarbonil-Leufenilalaninal,1-(S)-endo-N-(1,3,3)Trimetilbiciclo[2.2.1]hept-2-il)-4-fluorofenil-sulfonamida, Mentiloxicarbonil-LL-CHO, éster f-butílico de N-[N-(3,5-difluorofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina, Éster ferc-butílico de ácido {1S-bencil-4R-[1-(1S-carbamoil-2-fenetilcarbamoil)-1S-3-metilbutilcarbamoil]-2R-hidroxi-5-fenilpentil}carbámico, 7-amino-4-cloro-3-metoxiisocumarina, Z-lle-Leu-CHO, Z-Tyr-lle-Leu-cHo, Z-Cys(t-Bu)-lle-Leu-CHO, Éster metílico de N-[N-3,5-difluorofenacetil]-L-alanil-S-fenilglicina, (2S,3R)-3-(3,4-Difluorofenil)-2-(4-fluorofenil)-4-hidroxi-N-((3S)-2-oxo-5-fenil-2,3-dihidro-1H-benzo[e][1,4]diazepin-3-il)-butiramida, (S,S)-2-[2-(3,5-Difluorofenil)-acetilamino]-N-(1-metil-2-oxo-5-fenil-2-,3-dihidro-1H-benzo[e][1,4]diazepin-3-il)-propionamida, N-frans-3,5-Dimetoxicinamoil-Ile-leucinal, N-fercbutiloxicarbonil-Gly-Val-Valinal, Isovaleril-V-V-Sta-A-Sta-OCH3 , y en el que la enfermedad renal es una enfermedad renal glomerular o una enfermedad renal tubular. En otro aspecto de la presente invención, de aproximadamente 0,5 a 10 mM, de 0,5 a 5 mM, de 0,5 a 3 mM, preferentemente, de 0,5 a 1 mM de inhibidor de gamma secretasa se usa en cualquiera o en todas las fases 1-7 descritas en el presente documento y de acuerdo con la Tabla 8 y 17.
En una realización, el factor de crecimiento de insulina (IGF) es parte de un sistema complejo que las células usan para comunicarse con su entorno fisiológico y, por lo tanto, se puede usar para diferenciar células PSC a PEC y/o células del linaje endocrino pancreático. Este sistema complejo (a menudo denominado "eje" de IGF) consiste en dos receptores de la superficie celular (IGF1R y IGF2R), dos ligandos (factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1) y factor de crecimiento de tipo insulina 2 (IGF-2)), una familia de seis proteínas de unión a IGF de alta afinidad (IGFBP-1 a IGFBP-6), así como enzimas de degradación de IGFBP asociadas, denominadas colectivamente proteasas. Se sabe que los IGF se unen al IGF1R, el receptor de insulina, el receptor de IGF-2, el receptor relacionado con la insulina y posiblemente otros receptores. Por lo tanto, en un aspecto de la presente invención, los factores de crecimiento que se unen a estos receptores incluyen, pero sin limitación, IGF1 e iGF2, ya que cualquier factor de crecimiento, agente o morfógeno que se una a cualquiera o a una combinación de estos receptores tiene potencialmente el mismo efecto fisiológico que el descrito y anticipado en el presente documento. En otro aspecto de la presente invención, se usan de aproximadamente 5 a 200 ng/ml, de 10 a 100ng/ml, de 10 a 75 ng/ml, preferentemente 10 a 50 ng/ml, preferentemente de 20 a 50 ng/ml de IGF en cualquiera o en todas las fases 1-7 descritas en el presente documento, y de acuerdo con la Tabla 8 y 17.
En una realización, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) se usa para diferenciar células PSC a PEC y/o células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+). El PDGF es un importante factor de crecimiento de proteínas que se ha descrito ampliamente como un potente mitógeno de numerosos tipos de células. El PDGF pertenece a una familia de isoformas diméricas de cadenas polipeptídicas, A, B, C y D que actúan a través de diferentes receptores de tirosina quinasa: PDGFR-a y PDGFR-p. En un aspecto de la invención, el ligando es un PDGF o equivalente funcional del mismo que incluye, pero no se limita a PDGFaa, PDGFab o PDGFbb, que se unen a los dos tipos de receptores. En otro aspecto de la presente invención, se usan de aproximadamente 5 a 100 ng/ml, de 10 a 75 ng/ml, de 10 a 50 ng/ml, preferentemente de 10 a 20 ng/ml de PDGF en cualquiera o en todas las fases 1-7 descritas en el presente documento, y de acuerdo con la Tabla 8 y 17.
En una realización, la Nicotinamida, también conocida como niacinamida y amida del ácido nicotínico, es la amida del ácido nicotínico (vitamina B3/niacina), se usa para diferenciar células PSC a PEC y/o células de linaje endocrino pancreático. El ácido nicotínico, también conocido como niacina, se convierte en nicotinamida in vivo, y, aunque la niacina y la nicotinamida son idénticas en sus funciones vitamínicas, la nicotinamida no tiene los mismos efectos farmacológicos y tóxicos de la niacina. Por consiguiente, otros derivados de vitamina B o la vitamina B que funcionan de manera similar a la nicotinamida se realizan en la presente invención. En otro aspecto de la presente invención, se usan de aproximadamente 5 a 100 ng/ml, de 10 a 75 ng/ml, de 10 a 50 ng/ml, preferentemente de 10 a 20 ng/ml de nicotinamida en cualquiera o todas las fases 1-7 descritas en el presente documento y de acuerdo con las tablas 8 y 17.
En otra realización, se usa la familia de proteínas Hedgehog para diferenciar células PSC a PEC y/o células de linaje endocrino pancreático. La familia hedgehog de moléculas de señalización intercelular de vertebrados proporcionada por la presente invención consiste en al menos cuatro miembros, incluyendo, pero sin limitación, Desert hedgehog (Dhh), Sonic hedgehog (Shh), Indian hedgehog (Ihh) y Moonrat hedgehog (Mhh). En un aspecto, se usan de aproximadamente 5 a 200 ng/ml, 10 a 200 ng/ml, 10 a 150 ng/ml, preferentemente de 10 a 100 ng/ml de una proteína hedgehog en cualquiera o en todas las fases 1-7 descritas en el presente documento y de acuerdo con la Tabla 8 y 17.
Habiendo descrito la presente invención en general, se puede comprender mejor haciendo referencia a ciertos ejemplos específicos que se proporcionan en el presente documento con fines meramente ilustrativos, y que no pretenden ser limitantes.
Ejemplos
También debe entenderse que lo anterior se refiere a realizaciones preferidas de la presente invención, y que pueden realizarse numerosos cambios en las mismas sin apartarse del alcance de la invención. La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse de ninguna manera como limitaciones al alcance de la misma. Por el contrario, Debe entenderse además que puede recurrirse a otras diversas realizaciones, modificaciones y equivalentes de las mismas, que, después de leer la descripción contenida en el presente documento, se pueden sugerir a los expertos en la materia.
Ejemplo 1
DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS iPS HUMANAS A CÉLULAS PROGENITORAS PANCREÁTICAS Y CÉLULAS ENDOCRINAS A TRAVÉS DE PRODUCTOS ENDODÉRMICOS DEFINITIVOS E INTERMEDIOS
Se diferenciaron células madre pluripotentes (iPS) inducidas por el ser humano en agregados en suspensión usando un procedimiento de cuatro (4) fases en el transcurso de aproximadamente 2 semanas (o 14 días) para generar una población de tipos de células pancreáticas, incluyendo células progenitoras pancreáticas, células progenitoras endocrinas y células endocrinas que expresan hormonas. Las estirpes de células iPS humanas empleadas en el presente documento fueron proporcionadas por S. Yamanaka, Universidad de Kioto, Japón y Cellular Dynamics International, Inc. (CDI).
Las células iPS descritas en el presente documento fueron proporcionadas primero por Shinya Yamanaka y luego por el CDI. Se cultivaron células iPS indiferenciadas en fibroblastos de embrión de ratón inactivados mitóticamente o, preferentemente, exentos de alimentadora (sin capa de células alimentadoras de fibroblastos) en DMEM/F12 que contenía reemplazo de suero desactivado al 20 %. La diferenciación se inició al disociar las células iPS indiferenciadas en células individuales usando Accutase, Se tomaron muestras de células para el aislamiento y análisis del ARN. Las células se volvieron a suspender a 1-2 millones de células por mililitro en RPMI+ FBS al 0,2 % vol/vol que contenía una dilución a 1:5.000 de insulina-transferrina-selenio (ITS), Activina A (100 ng/ml), wnt3a (50 ng/ml) y rho-quinasa o inhibidor de ROCK, Y-27632, a 10 pM, se colocaron en una placa de 6 pocillos de fijación ultra baja, se colocaron en una plataforma de rotación y se centrifugaron a aproximadamente 100 rpm. Se centrifugaron los cultivos a 100 rpm durante el resto del proceso de diferenciación con el intercambio diario del medio. El crecimiento, el paso y la proliferación de iPSC es esencialmente como se describe en las patentes de EE. UU. n.°. 7.961.402 y 8.211.699.
Los métodos descritos en el presente documento para producir cultivos de suspensión de agregados de células pluripotentes, por ejemplo, células hES o iPS, y células derivadas de células pluripotentes, se describen esencialmente en el documento PCT/US2007/062755, presentado el 23 de febrero de 2007 y titulado "Compositions and methods for culturing differential cells", y el documento PCT/US2008/080516, presentado el 20 de octubre de 2008, y titulado "Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum".
Los métodos descritos en el presente documento pueden facilitarse recubriendo primero los vasos de cultivo con una matriz extracelular, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. n.° 6.800.480 de Bodnar et al. y asignada a Geron Corporation. Los métodos, como otros métodos para cultivar otras células madre pluripotentes, por ejemplo, células hES e iPS, puede realizarse usando suero humano soluble como se describe esencialmente en la solicitud de EE. UU. PCT/US2008/080516, presentada el 20 de octubre de 2008, y titulada "Methods and compositions for feederfree pluripotent stem cell media containing human serum".
Los métodos descritos en el presente documento se pueden facilitar mediante la adición de manera exógena del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) suministrado desde una fuente que no sea solo una capa alimentadora de fibroblastos como se describe en la patente de EE.UU. 7.005.252 de Thomson, J. y asignada a Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF).
Durante aproximadamente las primeras 24 horas de rotación, las células individuales se adhirieron entre sí formando agregados celulares, y se tomaron muestras celulares suficientes para el aislamiento y análisis del ARN. Los agregados celulares variaron entre aproximadamente 60 micrómetros y 120 micrómetros de diámetro. Aproximadamente 1 día (o 24 horas) después de colocarse las muestras de células iPS en la plataforma de rotación, los cultivos se alimentaron con RPMI+ FBS al 0,2 % vol/vol que contenía una dilución a 1:5000 de ITS, Activina A (100­ 200 ng/ml) y Wnt3a (50-100 ng/ml, o aproximadamente un día (tiempo 0 a día 1) y un día más o en el mismo medio, pero sin Wnt3a (día 1 a día 2). Se tomaron muestras celulares diarias para el aislamiento y análisis del ARN. Tras 2 días de diferenciación, los cultivos se alimentaron con RPMI+ FBS al 0,2 % vol/vol que contenía una dilución a 1:1000 de ITS, KGF (o FGF7, 25 ng/ml) e inhibidor de TGFp n.° 4 (2,5 pM) durante un día (o 24 horas, del día 2 al día 3). Durante los dos días siguientes (del día 3 al día 5), las suspensiones de agregados de células iPS se alimentaron con los mismos medios de cóctel de factores de crecimiento, con la excepción de que el inhibidor de TGFp se eliminó de los medios de cultivo. De nuevo, se tomaron muestras de células para el aislamiento de ARN al final de esta fase (fase 2 o día 5). Para la fase 3 (del día 5 al día 8), los medios de cultivo celular se cambiaron a DMEM suplemento B27 al 1 % vol/vol que contenía TTNPB [ácido 4-[E-2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)-1-propenil]benzoico] (3 nM), KAAD-ciclopamina (0,25 pM) y nogina (50 ng/ml). De nuevo, se tomaron muestras de células para el aislamiento y análisis del ARN al final de esta fase (fase 3, día 8). Para la fase 4 (días 8 a 14), el medio se cambió a DMEM+ suplemento B27 al 1 % vol/vol que contiene Nogina (50 ng/ml), KGF (50 ng/ml) y Eg F (50 ng/ml). De nuevo, se tomaron muestras de células para el aislamiento y análisis del ARN al final de la fase 4 (o día 14).
Se realizó una PCR en tiempo real para medir la expresión génica de varios genes marcadores durante el curso de la diferenciación. La expresión génica de los marcadores o genes específicos primero se normalizó a los niveles de expresión medios de los genes constitutivos, ciclofilina G y expresión de la proteína de unión a TATA (TBP). La expresión génica relativa normalizada se mostró luego en los gráficos de barras en relación con el nivel de expresión en las células iPS indiferenciadas y, por lo tanto, representa la regulación por aumento para los distintos marcadores de diferenciación. En el caso de OCT4, la expresión génica se normalizó para establecer la muestra más baja en el conjunto de datos (día 14) y, por lo tanto, representa la regulación a la baja durante el curso de la diferenciación.
Las FIG. 2A-L son gráficos de barras que muestran la expresión génica relativa del gen identificado (por ejemplo, Oct4, Braquiuria, Cer1, GSC, FOXA2, FOXA1, HNF6, PDX1, PTF1A, NKX6.1, NGN3 e INS) en relación con el nivel de expresión del mismo gen en las células iPS no diferenciadas. El nivel de expresión de los genes se normalizó con respecto a un conjunto de genes constitutivos (control), y la comparación del nivel de expresión génica en los dos puntos de tiempo diferentes indicó si había una regulación al alza o a la baja para ese gen o marcador de expresión. Para OCT4 (FIG. 2A), la expresión génica se normalizó y la muestra de expresión de nivel más bajo se estableció en 1 (día 14). Por consiguiente, como se indica en la FIG.2A, los niveles de expresión relativa de OCT4 representan la regulación a la baja (eje Y) durante el curso de la diferenciación (eje X, fase 0 a 4, o día 0 a día 14).
Como se muestra en la FIG. 2A, OCT4 (POU5F1) se expresa en niveles altos en las células iPS no diferenciadas y muestra una regulación a la baja posterior durante el curso de la diferenciación (del día 0 al día 14). En el día 14, los niveles de expresión de OCT4 se redujeron en más de 3.000 veces en comparación con los niveles de expresión observados en células no diferenciadas. Por el contrario, hubo una regulación al alza transitoria de la expresión del gen braquiuria (BRAQUIURIA, FIG.2B) durante los primeros 2 días (día 1 y día 2). La regulación al alza transitoria de la braquiuria fue el resultado de la diferenciación dirigida de células pluripotentes/iPS en mesendodermo mediante la aplicación de Activina A y wnt3a. El mesendodermo se diferenciaba además en endodermo definitivo durante los días 2 y 3, ya que la exposición continuada a la Activina A se indicó mediante la regulación al alza de CER1, GSC y FOXA2 al final de la fase 1 en el día 3 (FIG. 2C-E). Durante la fase 2, el endodermo definitivo se dirigió además para diferenciarse al endodermo del tracto digestivo como lo indica la regulación al alza de FOXA1, el mantenimiento de la expresión de FOXA2 y la regulación a la baja de CER1 y GSC en el día 6 de la diferenciación (FIG. 2C-F). Durante la fase 3, tras la exposición al retinoide, ciclopamina y nogina, el endodermo del tracto intestinal se dirigió además a diferenciarse al endodermo que expresaba PDX1/de tracto digestivo superior posterior, según lo indicado por la regulación al alza de HNF6 y PDX1 en el día 8 (Figura 2G-H). Durante la fase 4, tras la exposición a KGF y EGF, el endodermo de tracto digestivo superior posterior/con expresión de PDX1 se dirigió además a diferenciarse a células progenitoras pancreáticas, progenitoras endocrinas y células endocrinas que expresaban hormonas como lo indica la regulación al alza de PTF1A, NKX6-1, NGN3 e INS al día 14 (FIG. 2I-L).
Ejemplo 2
LOS INHIBIDORES DE RHO-QUINASA POTENCIAN EL CRECIMIENTO, LA SUPERVIVENCIA, LA PROLIFERACIÓN Y LA ADHESIÓN DE CÉLULA-CÉLULA DE CÉLULAS iPS
Los métodos para diferenciar varias estirpes celulares de hES e iPS son esencialmente como se describen en el presente documento y en el Ejemplo 1. Además de las condiciones de cultivo descritas para las fases 1, 2, 3, 4 y 5, se añadió inhibidor apoptótico e/o inhibidor de Rho-quinasa o ROCK a los medios de cultivo para mejorar y potenciar el crecimiento, la supervivencia, la proliferación y la adhesión célula-célula durante la diferenciación. Normalmente, se añadieron aproximadamente 10 pM de un inhibidor de la Rho-quinasa, por ejemplo, Y-27632, a los cultivos celulares en cada una de las fases. Como alternativa, se añadió un inhibidor de la Rho-quinasa hasta al menos las fases 1 y 2 y las fases 4 y 5, o cualquier combinación de las mismas. La morfología y los perfiles de expresión de marcadores génicos de los cultivos celulares de suspensión (agregados) de iPS diferenciadas son esencialmente similares a los de los cultivos celulares de suspensión derivados de células hES.
Las FIG. 3 y 4 muestran la inmunocitoquímica (ICC) de cultivos de células iPS de las fases 4 y 5, respectivamente. La FIG. 3 muestra un agregado celular de la Fase 4 que expresa marcadores genéticos típicos del endodermo pancreático positivo en PDX1 (también conocido como epitelio pancreático o progenitores pancreáticos) que incluye células positivas tanto en PDX1 como en NKX6.1. Aunque no se muestran en la FIG. 3, las células de la Fase 4 no expresan proteínas secretoras de hormonas o marcadores génicos más típicos de las células de la Fase 5 tales como insulina (INS), glucagón (GCG), somatostatina (SST) y polipéptido pancreático (PP). La FIG. 4 muestra el agregado celular de células que expresan hormonas de la Fase 5. Estos resultados de ICC se confirmaron adicionalmente usando QPCR. Sin embargo, dado que la QPCR es un estudio de población total del nivel total de ARN expresado en la muestra o en el cultivo celular, no se puede demostrar de forma definitiva que una sola célula exprese múltiples marcadores.
Ejemplo 3
ENCAPSULACIÓN DE PROGENITORES PANCREÁTICOS DERIVADOS A iPS
Hasta ahora, se han publicado métodos para la producción de células iPS y fuentes para la producción de células iPS. Sin embargo, no hay una descripción suficiente de la diferenciación de ninguna célula iPS a cualquier célula diferenciada que funcione para su uso potencial en una terapia celular para tratar una enfermedad en particular, por ejemplo, la diabetes.
Para determinar si los cultivos de células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 en Fase 4 o de células progenitoras pancreáticas derivados de células iPS humanas eran completamente capaces de desarrollarse y madurar in vivo a células secretoras de insulina sensibles a la glucosa, se cargaron poblaciones de células progenitoras pancreáticas esencialmente como se describe en los Ejemplos 1 y 2 en dispositivos de macroencapsulación esencialmente similares a los descritos en la solicitud de EE.UU. n.° 12/618.659, titulada" ENCAPSULATION OF PANCREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS", presentada el viernes 13 de noviembre de 2009; y las patentes de EE. UU. n.° 7.534.608 y 7.695.965, tituladas "METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONES". En resumen, en cada dispositivo, se cargaron aproximadamente 5-10-20 pl de agregados de suspensión celular sedimentados por gravedad, que tenían esencialmente aproximadamente 3 x 106 células.
Las células encapsuladas en el dispositivo se prepararon para su implantación en un mamífero, por ejemplo, un ratón SCID/Bg inmunocomprometido, pero se pueden implantar en animales más grandes, incluyendo ratas, cerdos, monos o pacientes humanos. Los métodos para implantar las células encapsuladas y el dispositivo son esencialmente como los descritos en la solicitud de patente de EE.UU. n.° 12/618.659, las patentes de Estados Unidos n.° 7.534.608 y 7.695.965, incluyendo células progenitoras pancreáticas implantadas en una matriz de GELFOAM e implantadas debajo de la capa grasa del epidídimo (EFP).
No fue necesaria la inmunosupresión en estos estudios, sin embargo, la inmunosupresión puede ser necesaria para ciertos mamíferos durante un período intermedio inicial hasta que los progenitores dentro del dispositivo maduren completamente y respondan a la glucosa. En algunos mamíferos, los regímenes de inmunosupresión pueden durar aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6 o más semanas, y dependerán del mamífero.
Las células trasplantadas se dejaron diferenciar y madurar adicionalmente in vivo. Para determinar si las células trasplantadas tenían una función fisiológica normal como una célula beta natural, por ejemplo, se determinarán los niveles de insulina humana analizando los niveles de péptido C humano. El péptido C humano se escinde o se procesa a partir de la proinsulina humana, por tanto, la detección de péptido C humano específicamente, y no péptido C de ratón endógeno, indica que la secreción de insulina se deriva de las células injertadas (exógenas). Los animales con implantes se someterán a ensayo para determinar los niveles de péptido C humano aproximadamente cada dos, tres o cuatro semanas inyectándoles un bolo de arginina o glucosa, preferentemente, glucosa. Las células beta entonces maduras (derivadas de células iPS pluripotentes diferenciadas) deben ser fisiológicamente funcionales y ser sensibles a la glucosa, a diferencia de las células beta naturales o endógenas. Por lo general, las cantidades de péptido C humano por encima de 50 pM o el nivel basal (umbral) medio, es un indicador de la función de las células ahora beta de los progenitores trasplantados.
De manera similar a lo descrito en Kroon et al. (2008) supra, la solicitud de EE.UU. n.° 12/618.659, las patentes de EE.UU. n.° 7.534.608; 7.695.965 y 7.993.920, se espera que las células progenitoras pancreáticas encapsuladas derivadas de células hIPS maduren y se conviertan en grupos de islotes pancreáticos en funcionamiento que tengan células endocrinas, células acinares y ductales que no difieran de las de los islotes naturales. También se anticipa que las células progenitoras pancreáticas purificadas o enriquecidas derivadas de células hIPS antes del trasplante también madurarán y se convertirán en islotes pancreáticos funcionales y producirán insulina in vivo. Ciertas realizaciones para purificar y enriquecer varias poblaciones celulares diferenciadas se describen con más detalle en la solicitud de EE.UU. n.° 12/107.020, titulada "METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FROM HES CELLS", presentada el martes 8 de abril de 2008, ahora la patente de EE.UU. n.° 8.338.170. Se anticipa además que las células progenitoras pancreáticas derivadas de células hIPS que se hayan crioconservado se puedan descongelar y adaptar en cultivo antes del trasplante, y por consiguiente, madurar y producir insulina in vivo. Y esa hipoglucemia puede mejorarse en animales con diabetes inducida que tengan células progenitoras pancreáticas trasplantadas derivadas de células hIPS.
En resumen, células progenitoras pancreáticas totalmente encapsuladas derivadas de células hIPS en un dispositivo de macroencapsulación maduran en islotes pancreáticos fisiológicamente funcionales y se espera que produzcan insulina en respuesta a la glucosa in vivo.
Ejemplo 4
COMPOSICIONES DE CÉLULAS PROGENITORAS PANCREÁTICAS Y SECRETORAS DE HORMONAS
Las poblaciones de células hIPS diferenciadas se analizaron mediante citometría de flujo para determinar su contenido de células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 o células progenitoras pancreáticas (en fase 4); y células progenitoras/precursoras endocrinas o endocrinas (en fase 5) como se muestra en las Tablas 6a, 6b y 7, respectivamente. La Tabla 6b es el mismo conjunto de datos que figura en la Tabla 6a, pero presentado similar al de la Tabla 10 para comparación. Las poblaciones de la Tabla 6a se superponen entre sí, por ejemplo, el número total de células es superior al 100 %, porque los números totales de PDX1+ y NKX6.1+ se superponen con el de la población de células NKX6.1+/PDX1+/CHGA- ( 5a columna de la Tabla 6a). La Tabla 6b incluye solo PDX1+ y datos triple negativos (residuales), que no se muestran en la Tabla 6a. Ciertos de estos injertos de iPEC, así como otros que usan formulaciones esencialmente similares, se implantaron en animales para determinar la función in vivo; sin embargo, los niveles de péptido C en suero humano no fueron lo suficientemente robustos para un posible propósito terapéutico (datos no mostrados). Los valores mostrados son el porcentaje del total de células que pertenecen a una población dada. Los números de las células progenitoras pancreáticas (NKX6.1 (+)/PDX1 (+)/CromograninA (-)) y una población muy pequeña de NKX6.1+/PDX1-/CHGA- que están en los agregados de células en suspensión coincidieron con los observados en agregados de suspensión de células progenitoras pancreáticas derivadas de células hES y agregadas en la fase ESC como se describe en la solicitud de EE.UU. n.° 12/264.760, titulada "STEM CELL a Gg REGATE SUSPENSIONCOMPOSITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATION THEREOF", presentada el martes 4 de noviembre de 2008. Los niveles de células progenitoras/precursoras endocrinas y/o endocrinas también coincidieron esencialmente con los obtenidos en cultivos de células derivados de hES en la solicitud de EE. UU. n.° 12/107.020, titulada "METHODS FOR PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FROM HES CELLS", presentada el martes 8 de abril de 2008. Similar a los agregados en suspensión de células derivadas de hES, la variación de las concentraciones de diferentes factores de crecimiento en el medio de cultivo en ciertas fases de diferenciación (por ejemplo., fase 4) debería aumentar y/o disminuir ciertas poblaciones endodérmicas pancreáticas, endocrinas, endodérmicas positivas en PDX1 o tipos de células no pancreáticas.
T l : m i i n l l r ni r n r i n f 4 r n l l l
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T l : m i i n l l r ni r n r i n f 4 r n l l l
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Tabla 7: m i i n l l n rin n f r n l l totales)
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Ejemplo 5
TIROSINA QUINASAS RECEPTORAS DE PEC
Los métodos descritos anteriormente son esencialmente similares a los descritos en la siguiente Tabla 8, adaptada de Schulz et al., (2012), supra. Estos y otros métodos descritos en el presente documento se pueden encontrar en las numerosas publicaciones de patentes y no patentes del solicitante, incluyendo las patentes de EE. UU. n.° 7.964.402; 8.211.699; 8.334.138; 8.008.07; y 8.153.429.
Tabla 8: Método de fabricación convencional para crear células endodérmicas pancreáticas (PEC) derivadas de hESC
Punto de Fase Condición de los medios Velocidad del frasco Velocidad de la bandeja de 6 tiempo (1-4) rotatorio pocillos
(día) (rpm) (rpm)
d(-1) hESC XF HA; PU 5-10 95
Ag.
d0 1 r0.2FBS-ITS1:5000 A100 5-10 95
W50
d1 r0.2FBS-ITS1:5000 A100 5-10 95
d2 r0.2FBS-ITS1:1000 K25 IV 5-10 95
d3 r0.2FBS-ITS1:1000 K25 5-10 95
d4 r0.2FBS-ITS1:1000 K25 5-10 105
d5 3 db-CTT3 N50 5-10 105
d6 db-CTT3 N50 5-10 105
d7 db-CTT3 N50 5-10 105
d8 4 db-N50 K50 E50 5-10 105
d9 db-N50 K50 E50 5-10 95
d10 db-N50 K50 E50 (o sin 5-10 95
alimentación)
d11 db-N50 K50 E50 5-10 95
d12 db-N50 K50 E50 5-10 95
hESC Ag.: agregados de hESC; XF HA: DMEM/F12 que contiene GlutaMAX, suplementado con 10% v/v de reemplazo de suero desactivado sin Xeno, aminoácidos no esenciales al 1 % v/v, 2-mercaptoetanol 0,1 mM, penicilina/estreptomicina al 1 % v/v (todas de Life Technologies), 10 ng/ml de Heregulina-1p (Peprotech) y 10 ng/ml de Activina A (R&D Systems); SP: hESC SFM StemPro® (Life Technologies); r0.2FBS: Rp M i 1640 (Mediatech); FBS al 0,2 % (HyClone), 1 x GlutaMAX-1 (Life Technologies), penicilina/estreptomicina al 1 % v/v; ITS: Insulina-transferrinaselenio (Life Technologies) diluida a 1:5.000 o 1:1.000; A100: Activina A humana recombinante a 100 ng/ml (R&D Systems); W50: Wnt3A de ratón recombinante a 50 ng/ml (R&D Systems); K25: KGF humano recombinante a 25 ng/ml (R&D Systems); IV: Inhibidor de RI quinasa de TGF-p IV 2,5 pM (Em D Bioscience); db: DMEM de alto nivel de glucosa (HyClone) suplementado con suplemento B-27 x0,5 (Life Technologies), GlutaMAX x1 y penicilina/estreptomicina al 1 % v/v; CTT3: KAAD-Ciclopamina 0,25 pM (Toronto Research Chemicals) y TTNPB 3 nM (Sigma-Aldrich); N50:
Nogina humana recombinante a 50 ng/ml (R&D Systems); K50: KGF humano recombinante a 50 ng/ml (R&D Systems); E50: EGF humano recombinante a 50 ng/ml (R&D Systems); sin alimentación: indica que las células no se volvieron a alimentar en el día indicado; db, DMEM (alto contenido de glucosa).
Cuando los métodos anteriores se aplicaron a las células iPS y las células progenitoras pancreáticas trasplantadas en animales, el solicitante no obtuvo sistemáticamente la misma función consistente in vivo en comparación con la aplicación de los mismos métodos a las células progenitoras pancreáticas derivadas de hESC y hES. Esto fue sorprendente, dado que las células iPS son células madre pluripotentes humanas que tienen la morfología y el patrón de expresión génica de las hESC, y pueden formar cuerpos embrioides in vitro y teratomas in vivo, lo que indica que pueden formar células de las tres capas germinales. Véase al menos, por ejemplo, Yu et al. (2007); publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2009/0047263, publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO2005/80598; publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2008/0233610; publicación de solicitud de patente internacional n.° WO2008/11882, supra. Estas referencias describen que las células iPS cumplen con los criterios de definición de ESC. Por consiguiente, existe la expectativa de que las células iPS puedan sustituir a las ESC en un protocolo de diferenciación in vitro que produzca células progenitoras pancreáticas derivadas de hES que maduren aún más y se conviertan en células sensibles a la glucosa completamente funcionales in vivo. Sin embargo, dados los datos de funcionamiento in vivo inconsistentes usando los métodos anteriores, los solicitantes buscaron explorar una formulación de medios de diferenciación única para las células progenitoras pancreáticas y/o las células endodérmicas pancreáticas (PEC), es decir, las células derivadas de la fase 4 de hiPSC (o "iPEC") que son capaces de proporcionar niveles robustos esencialmente similares de función in vivo que se han observado de forma constante para la PEC derivada de hESC.
Los solicitantes informaron previamente que las células endocrinas (células CHGA+) presentes en PEC son células endocrinas polihormonales, y no son la subpoblación de células en PEC que dan lugar a islotes que tienen células secretoras de insulina sensibles a la glucosa in vivo. Véase Kelly et. al. (2011) supra. Más bien, es la población de células no endocrinas (células CHGA-), especialmente aquellas que expresan conjuntamente NKX6.1 y PDX-1, que se cree que son las PEC que, en realidad, dan lugar a los islotes en funcionamiento in vivo. Por lo tanto, El solicitante exploró si la modulación, el cambio o el desplazamiento de las proporciones relativas de subpoblaciones endocrinas y no endocrinas puede afectar a la posterior función in vivo.
Los esfuerzos anteriores para descifrar la señalización del receptor-ligando en hESC identificaron con éxito los factores de crecimiento que potenciaron la autorrenovación y permitieron el desarrollo de condiciones definidas de cultivo de medios. Véase Wang et al (2007) supra. Wang et al. Identificaron la Heregulina-1p como el ligando que se unió a ERBB3 e indujo la dimerización con ERBB2 para afectar la autorrenovación de hESC en ese contexto. ERBB es una tirosina quinasa receptora (RTK) y RTK son proteínas transmembrana que se expresan ampliamente y actúan como receptores de los factores de crecimiento y otras moléculas de señalización extracelular. Tras la unión del ligando, se someten a fosforilación de tirosina en restos específicos de la cola citoplasmática y activan una cascada de señalización para la unión de otros sustratos de proteínas que participan en la transducción de señales mediada por RTK. La función de RTK en varios procesos evolutivos, incluyendo la regulación de la supervivencia, la proliferación y la motilidad de las células, y su papel en la formación del cáncer está bien documentada. También se sabía que las tirosina quinasa receptoras de ERBB se expresaban en todo el páncreas humano fetal en desarrollo, aunque se desconocen las funciones específicas de ciertos receptores ERBB y sus ligandos. Véase Mari-Anne Huotari et al. (2002) "ERBB Signaling Regulates Lineage Determination of Developing Pancreatic Islet Cells in Embryonic Organ Culture", Endocrinology 143(11): 4437-4446.
Debido al papel de RTK de ERBB en la autorrenovación de células madre pluripotentes y su expresión en el páncreas humano fetal, como lo demuestran Wang et al. (2007) supra y la expresión de RTK de ERBB en el páncreas fetal humano, los solicitantes volvieron a investigar la posible activación de RTK en células endodérmicas pancreáticas in vitro (PEC) derivadas de hESC en un esfuerzo por identificar receptores y ligandos que pudieran mejorar la especificación de PEC durante la diferenciación, o la expansión a través del fomento de la autorrenovación, o algún otro mecanismo desconocido que potencie la maduración de las células secretoras de hormonas de los islotes que funcionan fisiológicamente in vivo. Las PEC se generaron en suspensión en agregados diferenciadores, esencialmente como se describe en la Tabla 8, excepto con las siguientes modificaciones.
Se generaron cuatro muestras de PEC para el análisis de transferencia de RTK. Al final de la fase 4 (o d13), se recogió una muestra "en estado estacionario" de agregados de PEC en db-N50 K50 E50. Una muestra "en inanición" representó agregados de PEC d12 que se alimentaron con medio de db (DMEM alto en glucosa o DMEM alto en glucosa suplementado con Suplemento B-27 x0,5 (Life Technologies)) solo (sin factores de crecimiento) y se recogieron el d13. Se cargaron dos muestras "pulsadas" y se cultivaron en medios db en d12, luego en d13, se cargaron con medio db-K50 E50 o medio db que contenía FBS al 2 %, durante 15 minutos antes de la cosecha. Estas condiciones pretendían detectar las RTK que estaban activas en las condiciones de la fase 4, y qué respuesta podría obtenerse con un pulso de KGF, EGF e insulina (presente en el suplemento B27) o suero. El pulso sérico fue pensado como estímulos del factor de crecimiento de amplio espectro, potencialmente identificando las RTK que están presentes en PEC y pueden activarse, pero no se estimulan con las presentes condiciones de la fase 4.
El análisis de RTK se realizó esencialmente como se describe anteriormente en Wang et al., (2007) supra. En resumen, se usaron matrices de anticuerpos fosfo-RTK humanos Proteome Profiler™ (R&D Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se prepararon lisados de proteína en NP-40 al 1 %, Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 137 mM, glicerol al 10 %, EDTA 2,0 mM, ortovanadato sódico 1,0 mM, aprotinina a 10 pg/ml y leupeptina a 10 pg/ml. Se incubaron 500 pg de lisados de proteínas recién preparados durante la noche con membranas de nitrocelulosa salpicadas de manchas por duplicado para 42 anticuerpos anti-RTK y 5 anticuerpos de control negativo, así como 8 manchas de control positivas en anti-fosfotirosina (FlG. 5A). Los anticuerpos dispuestos capturan los dominios extracelulares de las RTK fosforiladas y no fosforiladas, y las fosfo-RTK unidas se detectan con un anticuerpo antifosfo-tirosina pan conjugado a la peroxidasa de rábano picante (HRP) usando quimioluminiscencia. Véase la FIG. 5 para el diseño de la matriz de r Tk , así como la Tabla 9 que se presenta a continuación para la lista de RTK en la matriz.
Tabla 9: Listado de la tirosina uinasa rece tora RTK ara el análisis de RTK de PEC
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(continuación)
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De las transferencias de RTK (Figura 6A) indicaron que los receptores de insulina e IGF1 (IR, IGF1R, respectivamente) fueron fosforilados y activados en todas las condiciones, de manera similar a lo observado previamente con hESC. Véase Wang et al (2007) supra. El receptor de EGF (EGFR, también conocido como ERBB1) se fosforiló en condiciones de estado estacionario, lo que era de esperar, dada la presencia de EGF en el medio de la fase 4. De hecho, la fosforilación de bajo nivel de ERBB2 se detectó tanto en el estado estacionario como en las condiciones de inanición. La fosforilación de EGFR y ERBB2 se elevó en cada una de las condiciones pulsadas, confirmando la capacidad del ensayo para detectar la activación en respuesta a un pulso de ligando. El VEGFR3 fosforilado también se detectó en todas las condiciones y se elevó en las muestras pulsadas. Esto sugirió que PEC produce un ligando VEGFR3 endógeno, los posibles candidatos son VEGF-C y D. El pulso sérico pareció activar receptores adicionales, incluyendo bajos niveles de fosforilación de ERBB3. La detección de ERBB2/3 fosforilado sugiere que un miembro de la familia de EGF de tipo Heregulina podría activar la señalización en PEC. TIE-2 es uno de los dos receptores de angiopoyetina, y parece estar fosforilado en un nivel bajo en respuesta al suero. Se sabe que la angiopoyetina 1 y la angiopoyetina 4 son ligandos activadores de Tie-2, mientras que la angiopoyetina 2 y la angiopoyetina 3 funcionan como antagonistas competitivos dependientes del contexto. El receptor de HGF (HGFR) también se fosforiló en respuesta al pulso sérico, lo que sugiere que el factor de crecimiento de hepatocitos también podría provocar señalización en PEC. Finalmente, aunque se detectó una fosforilación de bajo nivel de la efrina B2 RTK (EPHB2), la señalización de efroma/Eph es un sistema de señalización célula-célula unido a la membrana, y no es probable que se pueda aprovechar fácilmente en la diferenciación de PEC. Curiosamente, ERBB4 no fue fosforilado. Por lo tanto, el análisis de RTK destacó varios receptores que están fosforilados en PEC, o que pueden fosforilarse en respuesta a diferentes condiciones, por ejemplo, suero. Estos resultados sugieren que varios ligandos solubles pueden provocar la señalización de RTK en PEC y pueden impactar en la proliferación, diferenciación y/o especificación celulares, y por tanto, puede afectar a la posterior maduración para que funcionen en los islotes pancreáticos in vivo.
Ejemplo 6
LOS FACTORES DE CRECIMIENTO DE HEREGULINA Y FGF2 AFECTAN A LA PEC DERIVADA DE LAS COMPOSICIONES DE HESC
En vista de los análisis de las RTK, que demostraron que ciertas RTK se activaron (o fosforilaron) en ciertas condiciones como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 5, y dado que parecía que al menos se activaron ERBB2 y ERBB3 en PEC (después de 13 días de diferenciación de las fases 1-4), el solicitante intentó determinar el efecto de la Heregulina cuando se aplicó a las células en fase 3 y 4.
Los estudios preliminares se realizaron con Heregulina y FGF. En algunos de estos estudios, se incluyeron inhibidores de Rho-quinasa, Y-27632. Estos estudios preliminares mostraron que el tratamiento de células madre pluripotentes durante un día en la fase 1 con 10 ng/ml de Heregulina-1p (la misma concentración e isómero de Heregulina que se desvela en Wang et al. (2007)) aumentó el tamaño de los agregados celulares derivados de hES en cultivo en suspensión en comparación con el tamaño de los agregados celulares derivados de hES en cultivo en suspensión sin Heregulina-1p (Hrg1p). Un aumento en el tamaño del agregado celular es ventajoso, porque da como resultado una mayor masa celular para su posterior implantación y prueba de la función en animales. Además, el tamaño del disco agregado aumentó cuando Hrg1p aumentó de 10 ng/ml a 50 ng/ml en la fase 3. Este resultado también se observó cuando se usaron 50 ng/ml de otro factor de crecimiento, FGF2, en la fase 3 en comparación con cultivos en ausencia de FGF2. También se observó un aumento en el tamaño de los agregados celulares cuando los cultivos en fase 3 se expusieron a días adicionales de exposición a FGF2, por ejemplo, 3 días de FGF2 a 50 ng/ml en comparación con 2 días.
La Tabla 10 proporciona un resumen del análisis de citometría de flujo de células PEC tratadas con Hrg1p y FGF2 en la fase 3. Las células endocrinas se denotan como CHGA positivas (o CHGA+) y las células no endocrinas se denotan como CHGA negativas (o CHGA-). Las células endocrinas (CHGA+) y no endocrinas (CHGA-) pueden teñirse positivamente para otros marcadores, por ejemplo, positivas en PDX1 y/o NKX6.1. Las células que no se tiñen con ninguno de los marcadores probados se denominan células triple negativas o células residuales (CHGA-/NKX6.1-/PDX1).
T l 1 : An li i i m rí fl PE riv hE r n H r lin F F2
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Para determinar si el aumento en el tamaño de los agregados celulares afectó a las subpoblaciones de PEC, la composición de las poblaciones de PEC se analizó mediante citometría de flujo. En comparación con los cultivos de control, por lo que no se usaron Hrglp y FGF2 para diferenciar las células, la subpoblación no endocrina de PEC (CHGA-) aumentó del 54,01 % al 61,2 % con la adición de 10 ng/ml de Hrglp en la fase 3, y aumentó del 54,01 % al 64,2 % con la adición de 50 ng/ml de Hrg1p en la fase 3. La subpoblación endocrina (CHGA+) no se vio afectada significativamente con el tratamiento de 10 ng/ml de Hrg1p, pero más aún con 50 ng/ml. En paralelo, los niveles relativos de células residuales disminuyeron y más aún con 50 ng/ml de Hrg1p. Por tanto, el aumento en el tamaño de los agregados celulares con el tratamiento con Hrg1p se atribuyó principalmente al aumento en las subpoblaciones no endocrinas en relación con las subpoblaciones endocrinas y residuales.
El efecto de FGF2 en los cultivos en fase 3 fue similar pero incluso más pronunciado que el de Hrg1p. Por ejemplo, la subpoblación no endocrina PEC (CHGA-) aumentó como lo hizo para Hrg1p. El efecto principal del FGF2 en estos cultivos fue la disminución sustancial en la subpoblación endocrina. En algunos casos, estas células fueron casi no detectables con 3 días de tratamiento (del 32,9 % al 0,33 %). Por consiguiente, el aumento en el tamaño de los agregados celulares para los cultivos tratados con FGF2 se atribuyó principalmente al aumento en las subpoblaciones no endocrinas, y en algunos casos, subpoblaciones de células residuales (del 13,1 % al 22,7 % durante 3 días en la fase 3).
Por lo tanto, la Heregulina y/o FGF2 parecen desempeñar un papel en la especificación de las células de las poblaciones de PEC. Esto es sorprendente, dado que Wang et al (2007) supra informaron que la Heregulina sola desempeñó un papel en la renovación celular cuando se usó en el contexto con células madre pluripotentes.
Ejemplo 7
MÉTODOS PARA MEJORAR LA FUNCIÓN DE INJERTO IN VIVO DE PEC MEDIANTE EL TRATAMIENTO DE CULTIVOS DE CÉLULAS DERIVADAS DE IPS CON HEREGULINA
Debido a que los métodos de acuerdo con la Tabla 8 cuando se aplicaron a iPSC para producir iPEC no proporcionaron una función in vivo potente en animales, los solicitantes exploraron otros métodos para la producción de iPEC. Los cambios en el método convencional como se establece en la Tabla 8 incluyen, pero sin limitación: la optimización del número de veces que se pasa cualquier iPSC; modulación de los niveles de la señalización de BMP; modulación de los parámetros de agregación de la suspensión de iPSC durante la expansión y la diferenciación (por ejemplo, fuerza de cizalla, velocidad de rotación y similares); la optimización de las concentraciones, el tiempo de uso y la duración del uso de factores de crecimiento, tal como inhibidores de Wnt, Activina y rho-quinasa; y el tratamiento con otros factores de crecimiento en varias fases 1 a 4 del protocolo de diferenciación como candidatos para mejorar la masa celular, la proliferación, la diferenciación, supervivencia de las células, y similares (por ejemplo, ligandos de ERBB). Estos numerosos experimentos iterativos fueron probados solos o en combinación, para determinar cómo se podrían optimizar los métodos de diferenciación para las iPSC durante las fases 1-4. Dichos métodos de diferenciación optimizados producen poblaciones de iPEC que, cuando se injertaron, dieron como resultado potentes células secretoras de insulina sensibles a la glucosa in vivo similares a las observadas e informadas para hESC. La siguiente Tabla 11 describe las condiciones de referencia, con y sin Heregulina, que se demostraron para diferenciar iPSC a iPEC, que maduraron más tarde a células de los islotes sensibles a la glucosa in vivo. Las condiciones iniciales fueron similares a las descritas en los Ejemplos 1, 2 y 5, así como en la Tabla 8 de el presente documento, excepto que la Heregulina se añadió en las fases 3 y 4. Aunque se usaron 30 ng/ml de Hrg1p, son adecuadas las concentraciones que varían de 10 ng/ml a 50 ng/ml, o incluso superiores a 50 ng/ml. Asimismo, la adición de un inhibidor de la rhoquinasa, Y-27632, se mantuvo en los cultivos de diferenciación como se describe en el Ejemplo 2.
Tabla 11: Comparación de las formulaciones de medios de diferenciación del momento basal y de Heregulina para la fabricación de células endodérmicas pancreáticas (PEC) derivadas de iPSC
Momento basal (Sin Heregulina) Fase (1-4) Momento basal con Heregulina 20 % de KSR-F10 A10 Y10 iPSC Ag. 20 % de KSR-F10 A10 Y10
r0.2FBS-ITS1:5000 A100 W100 Y10 1 r0.2FBS-ITS1:5000 A100 W100 Y10 r0.2FBS-ITS1:5000 A100 Y10 r0.2FBS-ITS1:5000 A100 Y10
r0.2FBS-ITS1:1000 IV K25 Y10 2 r0.2FBS-ITS1:1000 IV K25 Y10
r0.2FBS-ITS1:1000 K25 Y10 r0.2FBS-ITS1:1000 K25 Y10
r0.2FBS-ITS1:1000 K25 r0.2FBS-ITS1:1000 K25
db- CTT3 N50 3 db- CTT3 N50 H30
db- CTT3 N50 db- CTT3 N50 H30
db- CTT3 N50 db- CTT3 N50 H30
db- N50 K50 E50 Y10 4 db- N50 K50 E50 H30 Y10
db- N50 K50 E50 Y10 db- N50 K50 E50 H30 Y10
db- N50 K50 E50 (o sin alimentación) db- N50 K50 E50 (o sin alimentación) db- N50 K50 E50 Y10 db- N50 K50 E50 H30 Y10
db- N50 K50 E50 Y10 db- N50 K50 E50 H30 Y10
Agregados de iPSC: agregados de iPSC; KSR: suero desactivado (Life Technologies); F10: bFGF a 10 ng/ml (R&D Systems); A10: Activina A a 10 ng/ml (R&D Systems); A100: Activina A a 100 ng/ml; r0.2FBS: RPMI 1640 (Mediatech); FBS al 0,2 % (HyClone), 1x GlutaMAX-1 (Life Technologies), penicilina/estreptomicina al 1 % v/v; ITS: Insulina-transferrina-selenio (Life Technologies) diluida a 1:5.000 o 1:1.000; A100: Activina A humana recombinante a 100 ng/ml (R&D Systems); K25: KGF humano recombinante a 25 ng/ml (R&D Systems); CTT3: KAAD-ciclopamina 0,25 |jM (Toronto Research Chemicals) y TTNPB 3 nM (Sigma-Aldrich); N50: Nogina humana recombinante a 50 ng/ml (R&D Systems); K50: KGF humano recombinante a 50 ng/ml (R&D Systems); E50: EGF humano recombinante a 50 ng/ml (R&D Systems); Y10: Y-27632 10 j M; Solución madre 20 mM, x2000; H30: Heregulina a 30 ng/ml (solución madre a 100 g/ml); db, DMEM (alto contenido de glucosa).
Para determinar el efecto de la adición de Heregulina o de Heregulina y un inhibidor de la rho-quinasa en subpoblaciones de células en fase 3 y 4, las poblaciones de iPEC fueron analizadas por citometría de flujo. La Tabla 12 proporciona un resumen del análisis de citometría de flujo de varias poblaciones de iPEC usando las formulaciones expuestas en la Tabla 11, así como las formulaciones que se modificaron al aumentar la concentración de Activina hasta 200 ng/ml. Además, la Tabla 12 muestra las condiciones generales usadas para cada conjunto de experimentos (momento basal con o sin Heregulina) y los porcentajes relativos de los tipos de células de la población de iPEC (endocrina, no endocrina, subpoblaciones de células positivas en PDX1, residuales o triple negativas). La Tabla 12 también desvela datos sobre la función in vivo de las células producidas en cada experimento.
Tabla 12: Com osiciones de iPEC de cultivos de células derivadas de iPS tratadas con Here ulina
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(continuación)
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En determinadas condiciones, la relación de subpoblaciones de células en el PEC (hESC, E2354) y iPEC (E2314, E2344, E2347) se alteraron las poblaciones. Por ejemplo, a veces, el porcentaje de células endocrinas (CHGA+) disminuyó y el porcentaje de células no endocrinas (CHGA-/NKX6.1+/PDX1+) aumentó en comparación con las condiciones iniciales (sin Heregulina). Aunque parecía que la Heregulina era responsable de cambiar las proporciones de las células endocrinas en relación con las células no endocrinas en estas poblaciones de PEC y iPEC, en el experimento n° 2380 (E2380), el nivel de células endocrinas (CHGA+) aumentó en lugar de disminuir con la adición de Heregulina.
Para determinar si el cambio en la composición de las poblaciones de PEC y iPEC afectó a la función in vivo, se trasplantaron injertos de PEC e iPEC de la mayoría de los experimentos descritos en la Tabla 12 a ratones esencialmente como se ha descrito anteriormente en el presente documento y en otras publicaciones de patentes y no de patentes del solicitante, incluyendo Schulz et al. (20l2) y Kroon et al (2008), supra y las patentes de Ee .UU. n.° 7.534.608; 7.695.965; 7.993.920 y 8.278.106, supra. En resumen, las poblaciones de PEC e iPEC se encapsularon completamente con un dispositivo de encapsulación de células semipermeable biodegradable, algunos de los cuales incluían microperforaciones. Los dispositivos fueron fabricados por el solicitante, y se describen detalladamente en la patente de EE.UU. n.° 8.278.106, Titulada "ENCAPSULATION OF PANCREATIC CELLS FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS", presentada el viernes 13 de noviembre de 2009. Los ensayos de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) se realizaron a partir de aproximadamente 56 días después del implante. La sangre se recogió antes de (ayunas) y en combinaciones de 30 y/o 60 minutos después de la administración de la glucosa. La función del injerto se evaluó midiendo las concentraciones de péptido C humano en el suero en respuesta a la administración de la glucosa.
La cantidad de péptido C humano liberada en el suero es indicativa de la cantidad de insulina liberada. El péptido C es un péptido corto de 31 aminoácidos que conecta o une las cadenas A y B de la proinsulina y la preproinsulina, que se secreta por el funcionamiento de las células beta o secretoras de insulina. Como ha sido analizado anteriormente por Kroon et al. (2008) supra et al., son apropiadas las mediciones de péptido C humano para la evaluación de la liberación de insulina generada de novo por las células implantadas. Por consiguiente, los niveles de péptido C humano en el suero de estos animales son una medida de la función in vivo de los injertos de PEC e iPEC maduras. El péptido C humano se detectó en el suero al menos 8 semanas después del implante. Con semanas adicionales de implante y en ayunas, los niveles de péptido C estimulados por la glucosa aumentaron con los niveles máximos de desplazamiento del péptido C de 60 minutos a 30 minutos después de la administración de glucosa, lo que es indicativo de una respuesta más rápida a la exposición a la glucosa a medida que las células de insulina van madurando. Hubo algunos ratones que no pudieron presentar la función o fueron sacrificados debido a una mala salud; sin embargo, estos ratones estaban en cohortes que, en cambio, presentaban animales de alto nivel de funcionamiento, sugiriendo así un fallo del injerto en lugar de una incapacidad de las células implantadas para diferenciarse y funcionar.
Las FIG. 7A-C muestran los niveles de péptido C humano en el suero tras la administración de glucosa para todos los experimentos indicados en la Tabla 12, a excepción de E2344. Las FIG. 7A-C muestran que, en comparación con los controles de referencia, aquellos injertos resultantes del tratamiento con Heregulina, en general, resultaron tener niveles más altos de péptido C humano en suero. Por ejemplo, en la FIG. 7A, en el experimento 2380, hay un aumento de aproximadamente 5 veces (933 pM: 200 pM a los 60 minutos después de la administración de glucosa) en los injertos resultantes del tratamiento con Heregulina en comparación con los preparados sin Heregulina (momento basal). La Heregulina parece tener un menor efecto sobre las PEC producidas a partir de hESC, ya que el experimento 2354 (FIG. 7C) no muestra niveles más altos de péptido C en suero en aquellos injertos resultantes del tratamiento con Heregulina en comparación con los controles de referencia. Además, al comparar las PEC derivadas de hESC (CyT203) e iPEC derivadas de iPSC, los injertos de iPEC tienen una función comparable in vivo a los injertos de PEC (por ejemplo, compárense la FIG.7A y la FiG. 7B (injertos de iPSC) con la FIG.7c (CyT203 hESC). Como tales, los injertos de iPEC son tan robustos como los injertos de PEC. Asimismo, las proporciones relativas de células endocrinas con respecto a no endocrinas, que pareció afectar a algunas de las poblaciones de iPEC (por ejemplo, E2314, E2347 y E2354), no pareció afectar a la función in vivo debido a que iPEC de E2380, que no tuvo el mismo cambio en las subpoblaciones endocrinas y no endocrinas, también mostró buena función (véase FIG.7A-C).
Además ensayarse para la secreción de insulina estimulada por glucosa, los injertos de iPEC maduros se ensayaron para determinar si solo podían mantener la euglucemia, similar a la euglicemia mantenida por PEC derivadas de hESC, Si las células beta del animal hospedador fueron destruidas. esto implicó la destrucción de las células beta del ratón implantado usando la toxina de células beta, estreptozotocina (STZ), que muestra una mayor citotoxicidad contra las células beta murinas en comparación con las células beta humanas. Se tomaron mediciones de glucosa en sangre no en ayunas al azar para cada ratón antes y después del tratamiento con STZ. Tras la implantación del injerto de iPEC en el día 13 después del tratamiento con STZ, se reanudó la hiperglucemia (cabe señalar el aumento de la glucosa en sangre), lo que demuestra el control de la glucemia por el injerto de iPEC en lugar del páncreas de ratón endógeno (véanse la Figura 8A y Figura 8B.
Además, pareció haber un efecto sinérgico cuando se proporcionaron Heregulina y un inhibidor de la rho-quinasa durante las fases 1-4 de diferenciación (véase la Tabla 11). Por ejemplo, la iPSC tratada con Heregulina en las fases 3 y 4 sin un inhibidor de la rho-quinasa dio como resultado una masa celular visiblemente pobre, de manera que hizo imposible la implantación. El apoyo adicional para la sinergia de la Heregulina y un inhibidor de la rho-quinasa fue evidente en algunos de los experimentos, por ejemplo, E2356, E2380, por lo que las condiciones del momento basal con un inhibidor de la rho-quinasa solo no funcionaron tan sólidamente como un injerto con el inhibidor de la rhoquinasa y la Heregulina (véanse las Fig. 7A y B). Parece que el tratamiento con Heregulina y un inhibidor de la rhoquinasa no fue aditivo, porque la adición de la Heregulina sola proporcionó una masa celular insuficiente para el trasplante, y la adición de un inhibidor de la rho-quinasa solo (condiciones iniciales) tuvo una función in vivo deficiente. Como tal, el suministro de Heregulina sola o un inhibidor de la rho-quinasa solo no es esencialmente similar al efecto de suma de los dos combinados. Es decir, por sí solos, ninguno de los dos da como resultado una respuesta de glucosa robusta in vivo, pero combinados producen una respuesta de glucosa similar a la de las células derivadas de hES. Por consiguiente, parece que el suministro de Heregulina y un inhibidor de la rho-quinasa es sinérgico, ya que su efecto combinado es superior a la suma del efecto de cada uno por separado. Es decir, las iPEC tratadas con el inhibidor de la rho-quinasa y Heregulina maduraron in mostrando secreción de insulina estimulada por glucosa, y fueron capaces de mantener la euglucemia en un modelo de ratón con diabetes (véase FIG.7A-B y FIG.8A-B).
La funcionalidad de ERBB requiere unión al ligando, dimerización de receptores y tráfico de receptores. La variabilidad en cada proceso puede producir una regulación diferencial de los receptores y las señales de cadena abajo que controlan. Por ejemplo, ligandos de ERBB distintos se unen a los receptores de ERBB con diferentes afinidades, por tanto, alterando los patrones y la dinámica de la formación de dímeros ERBB. La Tabla 13 muestra las muchas posibles combinaciones diferentes de ligandos y complejos de unión al receptor. Las revisiones relacionadas con la complejidad de este sistema son proporcionadas por Oda, et al. (2005) "A comprehensive pathway map of epidermal growth factor receptor signaling", Mol. Syst. Biol., 1 (2005) y Lazzara et al. (2009) "Quantitative modeling perspectives on the ERBB system of cell regulatory processes", Experimental Cell Research 315(4):717-725.
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Huotari et al. sugirieron que la neuregulina-4 puede modular los niveles relativos de las subpoblaciones de células endocrinas aumentando el número de células de somatostatina (delta) a expensas de las células de glucagón (alfa), y que la neuregulina-4 no afectó a la proporción de células exocrinas (por ejemplo, amilasa) a células endocrina (por ejemplo, p-insulina, a-glucagón, 8-somatostatina, polipéptido pancreático PP). Estos estudios, sin embargo, se realizaron mediante la incubación de neuregulina-4 en cultivos de tejido de órganos de todo el montaje obtenidos de ratones del día E12.5. Estas poblaciones de células de explante de ratón se diferenciaron más allá de las poblaciones de células en fase 3 (por ejemplo, endodérmicas de tracto digestivo superior negativas en PDX1) y/o fase 4 ( endodérmicas de tracto digestivo superior positivas en PDX1) descritas en el presente documento. La neuregulina-4 solo se une a RTK de ERBB4, de modo que solo la subpoblación endocrina del cultivo de ratón de todo el montaje puede ser modulada por la neuregulina-4 en este contexto. Por lo tanto, el tratamiento de las células en fase 3 (endodérmicas de tracto digestivo superior negativas en PDX1) y/o fase 4 (endodérmicas de tracto digestivo superior positivas en PDX1) como se describe en el presente documento con un ligando de ERBB diferente, por ejemplo, Hrg1, no se esperaría que modularan la subpoblación endocrina relativa como en Huotari, porque ya se ha demostrado que Hrg1 se une a ERBB3 e induce la dimerización de ERBB2/3. Sin embargo, debido a la expresión de bajo nivel de ERBB2 y 3 en PEC como se muestra en la FIG. 6, no estaba claro si las células de los tipos 3 y 4 expresaban niveles bajos o altos de ERBB2 y 3 para unirse a Hrg1.
Además, en un contexto diferente, el solicitante describió que Hrg1 se unió a ERBB 2/3 y potenció la autorrenovación de células madre pluripotentes (véase Wang et al (2007)). Aunque es posible que Hrg1 pueda actuar en la misma capacidad en el contexto de las fases 3 y 4, el solicitante ha descrito previamente que la mayor parte de la expansión celular para la producción de PEC se produce en la fase de células madre pluripotentes (fase 0). Durante la fase 0, se cultivan las hESC, se pasan y se expanden durante aproximadamente dos (2) semanas. Por lo tanto, la mayor parte de la expansión celular o la autorrenovación para producir la expansión celular no se produce durante las fases 1-4. Véase Schulz et al. (2012) supra. Asimismo, suponiendo que ERBB2/3 está presente durante las fases 3 y 4, cabría esperar que la Heregulina tuviera el mismo efecto que con las células madre pluripotentes (autorrenovación) en lugar de tener un impacto en la diferenciación dirigida. La diferencia en la función parece depender del contexto, es decir, las células madre pluripotentes frente a un tipo de célula de linaje endodérmico o pancreático.
En resumen, el suministro de Heregulina o Heregulina y un inhibidor de la rho-quinasa in vitro a células endodérmicas de tracto digestivo superior (fase 3) y células endodérmicas pancreáticas que expresaban PDX1 (final de la fase 3 y fase 4) produjeron poblaciones de p Ec y iPEC, que cuando se trasplantaron, maduraron y se desarrollaron en células secretoras de insulina sensibles a la glucosa in vivo (véanse las FlG. 7 y 8). Este uso de Heregulina o Heregulina y un inhibidor de la rho-quinasa se ha informado en el presente documento por primera vez. Dicho uso y efecto no son discernibles de lo descrito previamente en la literatura de patente o no de patente.
Ejemplo 8
LA ACTIVINA SUPRIME LA EXPRESIÓN DE NGN3 Y LA PRODUCCIÓN DE CÉLULAS COMPROMETIDAS CON EL LINEAJE ENDOCRINO EN CULTIVOS DE CÉLULAS ENDODÉRMICAS (PEC) PANCREÁTICAS
Las células endodérmicas pancreáticas, o "PEC", son una población pancreática de células que se compone principalmente de dos subpoblaciones distintas: (i) una subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina (CHGA-) (de aquí en adelante, "no endocrina (CHGA-)"), que se desarrolla y madura dando lugar a células beta secretoras de insulina sensibles a la glucosa in vivo; y (ii) una subpoblación de células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) (de aquí en adelante, "endocrina (CHGA+)"), que puede dar lugar a otras células que no secretan insulina o que mantienen los islotes durante la maduración in vivo. La subpoblación no endocrina (CHGA-) es negativa en CHGA y predominantemente positiva en PDX1 y NKX6.1, mientras que la subpoblación de células comprometidas con el linaje endocrino es positiva en CHGA y, en su mayoría, negativa en PDX1 y NKX6.1. La subpoblación no endocrina (CHGA-) tarda aproximadamente de 8 a 12 semanas o más en desarrollarse y madurar a células beta que secretan insulina sensibles a la glucosa en cantidades que permitan la detección sistémica de las respuestas de la insulina (según lo analizado por ELISA para el péptido C) in vivo. Se necesitan, sin embargo, menos de 8 semanas para que las células sensibles a la glucosa se desarrollen y maduren in vivo durante el desarrollo embrionario normal. Por lo tanto, sigue siendo deseable obtener (1) una población de PEC con un aumento de la subpoblación no endocrina (CHGA-) y/o (2) una verdadera población de células endocrinas (CHGA+) que sea sensible a la glucosa in vitro y/o que sea una población evolutivamente avanzada (por ejemplo, adecuadamente especificada y con ciertos marcadores distintivos coherentes con los descritos para las poblaciones pancreáticas similares in vivo) y/o (3) una población de células progenitoras que sea capaz de acortar y/o reducir la duración del período de desarrollo y maduración in vivo.
Respecto al primer objetivo, es deseable obtener una población de PEC, mediante la que la subpoblación no endocrina (CHGA-) permanece intacta mientras que, al mismo tiempo, la diferenciación a las células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) se reprima de manera similar a la que ocurre de manera natural in vivo. Los siguientes ejemplos describen métodos para la producción de dicha población de PEC.
Durante el desarrollo normal in vivo, se cree que la Neurogenina-3 (NGN3), un factor de transcripción, es el principal regulador del desarrollo de células endocrinas, y que la expresión de NGN3 no surge hasta después de la regulación al alza de PDX1 y NKX6.1, por ejemplo, en células de linaje endodérmico pancreático in vivo. Véase Rukstalis y Habener (2009), "Neurogenin3: A master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration", Islets 1(3): 177­ 184. De acuerdo con la Tabla 8, en la fase 3, se usa ácido retinoico (RA) o el análogo de retinoide, ácido 4- [(E)-2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)-1-propenil]benzoico o "TTNPB" (o "TT3" en la Tabla 8) para inducir la expresión de PDX1. Sin embargo, al mismo tiempo, el ácido retinoico también induce prematuramente la expresión de NGN3 que inicia la especificación endocrina. Por consiguiente, la supresión, represión o inhibición de NGN3 durante la fase 3 y/o la fase 4 pueden proporcionar una clave para minimizar las células comprometidas con la subpoblación del linaje endocrino (CHGA+) en PEC y/u obtener células endocrinas en fases posteriores del desarrollo in vitro e/o in vivo. De manera importante, cualquier supresor, represor o inhibidor de NGN3 no debe al mismo tiempo suprimir, reprimir o inhibir la subpoblación no endocrina (CHGA-) y preferentemente aumenta esta subpoblación durante la producción in vitro de PEC.
Se exploraron diversos factores de crecimiento por su capacidad para suprimir genes tales como NGN3 durante las fases 3 y 4. Un factor de crecimiento candidato fue la Activina, que tiene diversas funciones en la expansión y diferenciación de las células madre. Por ejemplo, a niveles bajos (por ejemplo, 10 ng/ml), la Activina ayuda a mantener la pluripotencia de las células madre pluripotentes y la proliferación celular. A niveles más altos (por ejemplo, 100 ng/ml), la Activina actúa como un factor de crecimiento por diferenciación responsable de la producción de endodermo definitivo en la fase 1 (véase, por ejemplo, la Tabla 8). Para probar su efecto sobre la represión de células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) durante la formación de PEC, el solicitante probó por primera vez la Activina a una concentración de nivel medio de aproximadamente 50 ng/ml con diferenciación adherente convencional. A este nivel, la Activina fue capaz de suprimir la expresión de NGN3 sin suprimir la expresión de los genes PDX1 y NKX6.1 en PEC (compárese la FIG. 9D-E con la FIG. 9A-B). Sin embargo, cuando se usó el mismo nivel de Activina con un cultivo de suspensión de agregados celulares más escalable durante la fase 3, la masa celular global disminuyó drásticamente y, en algunos casos, se eliminaron los agregados celulares (compárese el control con los agregados celulares tratados con Activina en la Figura 10). Se observaron disminuciones similares en los agregados celulares para la Activina a 25 ng/ml como con 50 ng/ml (datos no mostrados).
A la vista de los resultados, las concentraciones más bajas de Activina (por ejemplo, 5 ng/ml y 10 ng/ml) se probaron en las fases 3 y 4. Como se muestra en la FIG. 11, a menores concentraciones de Activina, los agregados celulares fueron capaces de mantener la masa celular y el rendimiento en comparación con el control (compárese la FIG. 11B-C en el día 8 y la FIG. 11B-D en el día 12 con la FIG.11A, control, para d8 y d12). Por tanto, los niveles de Activina inferiores a aproximadamente 25 ng/ml son aceptables para mantener la masa celular y el rendimiento. El solicitante luego realizó un análisis de citometría de flujo en estos cultivos celulares para determinar si la Activina a niveles bajos durante las fases 3 y 4 tenía algún efecto sobre la composición del agregado celular; véase la Tabla 14. La Tabla 14 muestra que los niveles bajos de Activina no disminuyen la producción de la subpoblación no endocrina (CHGA-), y cuando el tratamiento se aplica en las fases 3 y 4, de hecho, puede aumentar esta subpoblación (véase la Tabla 14 A5 Fase 3 y 4 resultados). Sin embargo, parece que la diferenciación a las células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) todavía se está induciendo de manera significativa dados los porcentajes muy similares de células endocrinas (CHGA+) observados con y sin Activina (véase la columna de endocrinas de la Tabla 13). Por tanto, aunque la Activina puede suprimir o inhibir la expresión de NGN3 y NKX2.2 como se observa con QPCR, a niveles más bajos (lo que permite mantener la masa celular) no reduce la subpoblación comprometida con el linaje endocrino (CHGA+) cuando se analiza al final de la fase 4. De forma ventajosa, las subpoblaciones negativas solo en PDX1 y Triple Negativas se redujeron en comparación con el control, en particular, cuando la Activina se usa en las fases 3 y 4.
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Ejemplo 9
LA ACTIVINA, HEREGULINA Y WNT SUPRIMEN LA PRODUCCIÓN DE CÉLULAS COMPROMETIDAS CON LA LÍNEA ENDOCRINA EN CULTIVOS DE PEC
El Ejemplo 8 mostró que niveles moderados de Activina (por ejemplo, 50 ng/ml) durante las fases 3 y 4 fueron capaces de suprimir o reprimir la expresión de NGN3 (FIG. 9), pero que estos mismos niveles no mantuvieron la masa celular. Los niveles más bajos de Activina (por ejemplo, 5 y 10 ng/ml) fueron capaces de mantener la masa celular (Figura 11), pero no fueron suficientes para continuar reprimiendo la diferenciación endocrina durante la fase 4, ya que el porcentaje de células del linaje endocrino (CHGA+) se mantuvo esencialmente similar al control (Tabla 14, columna de CHGA+) y al descrito en los ejemplos anteriores. Por tanto, parece que la supresión de la diferenciación de las células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) principalmente durante la fase 3 a estos niveles bajos no es suficiente, porque aún se considera necesaria la supresión continuada de esta subpoblación a través de la fase 4. Véase Rukstalis et al. (2009) supra. Por tanto, se exploraron factores de crecimiento adicionales que eran capaces de prevenir la pérdida y el rendimiento celular (es decir, contrarrestar el efecto de los niveles de Activina de moderados a altos), mientras que, al mismo tiempo, no afectaban a la producción de subpoblaciones progenitoras pancreáticas multipotentes no endocrinas y suprimían la diferenciación de las células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+).
En vista de los ejemplos anteriores que describen que la Heregulina a 30 ng/ml durante las fases 3 y 4 suele cambiar los niveles relativos de subpoblaciones de PEC endocrinas (CHGA+) y no endocrinas (CHGA-), el solicitante probó qué efectos podría tener la reducción de las concentraciones de Heregulina cuando se combina con Activina en la producción de PEC.
Las células madre pluripotentes se diferenciaron usando el protocolo convencional según la Tabla 8, excepto que, durante la fase 3, la Activina se incluyó a 10 ng/ml o 20 ng/ml en combinación con Heregulina a 2 ng/ml o 10 ng/ml; y, durante la fase 4, la Activina se redujo a 5 ng/ml con Heregulina a 1 ng/ml durante dos días y luego a 10 ng/ml después. Como se muestra en la FIG. 12 (imágenes del día 10; panel superior), la Activina a 10 ng/ml y la Heregulina a 2 ng/ml mostraron cierta pérdida de células en comparación con el control (compárense las FIG. 12A y B, panel superior). El aumento de Activina a 20 ng/ml con Heregulina que permanece igual a 2 ng/ml agravó la pérdida de células (compárense FIG.12B y C, panel superior). Sin embargo, la prevención de una mayor pérdida de células a concentraciones más altas de Activina (20 ng/ml) fue posible al aumentar la Heregulina a 10 ng/ml en el contexto de Activina a 20 ng/ml (compárese con la Figura 12 D y C, panel superior). Por tanto, cuando los niveles de Heregulina son demasiado bajos, se observa una pérdida significativa de células, pero cuando se elevan los niveles de Heregulina, por ejemplo, al menos 20 ng/ml, hay un cambio en los porcentajes de las células no endocrinas (CHGA-) en comparación con las subpoblaciones del linaje endocrino (CHGA+).
Se realizó un análisis de PCR cuantitativo para determinar los niveles relativos de expresión génica en los días 8, 10 y 12 de diferenciación con las combinaciones anteriores de Activina y Heregulina (FIG. 13). De manera similar a lo que se muestra en el Ejemplo 8 (Fig. 9), la Activina a 10 y 20 ng/ml fue capaz de reprimir NGN3 y NKX2.2 (otro marcador de diferenciación endocrina) sin disminuir la expresión de NKX6.1 (compárese la FIG.13A y B con la de C). El hecho de que la expresión de NKX6.1 permanezca alta indica que la producción de subpoblaciones no endocrinas (CHGA-) permanece sin cambios o no se ve afectada. Específicamente, sin embargo, a 20 ng/ml de Activina y 10 ng/ml de Heregulina, o 10 ng/ml de Activina y 2 ng/ml de Heregulina, la pérdida de células dependiente de Activina que se observó previamente cuando se usó a 25 ng/ml y 50 ng/ml (FIG. 10) se redujo mucho (FIG. 12 D y E, panel superior). Por lo tanto, la Heregulina parece contrarrestar eficazmente la pérdida celular observada originalmente mediante el uso de Activina en la fase 3. Asimismo, aunque todavía se produce alguna inducción de NGN3 y NKX2.2 (es decir, no está tan reprimida como se observó cuando se usaron 50 ng/ml de Activina en las fases 3 y 4 en la diferenciación basada en la adherencia en el Ejemplo 8, FIG.9), se reduce significativamente en comparación con las condiciones convencionales (compárense las condiciones de control y las condiciones A20H10 de la FIG. 13A y B).
Aunque más de 20 ng/ml de Activina reprimirían aún más los marcadores NGN3 y NKX2.2, y por lo tanto, reprimirían aún más la diferenciación endocrina, luego se requerirían niveles más altos de Heregulina para mantener la masa celular a fin de compensar el efecto de la dosis de Activina a altas concentraciones. Sin embargo, los niveles más altos de Heregulina como los observados en los ejemplos anteriores pueden cambiar la producción relativa de subpoblaciones endocrinas (CHGA+) y no endocrinas (CHGA-) de PEC. Aun así, el efecto de niveles más altos de Activina en la represión de la expresión de NGN3 seguía siendo deseable. Por tanto, los solicitantes exploraron factores de crecimiento adicionales o morfógenos que pueden afectar a los destinos del endodermo anterior y posterior, y controlar otros aspectos del desarrollo, incluyendo, pero sin limitación, WNT, FGF, PDGF, ácido retinoico (RA o TTNPB), BMP, hedgehog, EGF, IGF y similares.
En particular, se exploró la afectación de las vías de señalización de Wnt canónicas mediante la adición de Wnt3A en los medios de diferenciación de Activina y Heregulina en las fases 3 y/o 4. De nuevo, cualquier combinación debe suprimir la diferenciación de las células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) observada mediante la represión de la expresión de NGN3 y NKX2.2, y mantener una buena masa celular (es decir, una pérdida de masa celular limitada), mientras que, al mismo tiempo, no se afecte a la subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina. Una de las mezclas analizadas fue de 50 ng/ml de Wnt junto con 10 ng/ml de Activina y 2 ng/ml de Heregulina en la fase 3; y como antes, durante la fase 4, la Activina a 5 ng/ml con Heregulina a 1 ng/ml durante dos (2) días, luego Activina a 5 ng/ml y Heregulina a 10 ng/ml después. Esto dio produjo una mayor masa celular (PEC) que la Activina y la Heregulina solas a las mismas concentraciones (compárense las FIG. 12D y E, panel superior), e incluso una mayor masa celular que el control (compárense las FIG. 12A y E, panel superior). El análisis de QPCR de agregados celulares en estas condiciones (por ejemplo, combinación de Activina, Heregulina y Wnt en el fase 3, y Activina y Heregulina en la fase 4) mostraron que hubo una supresión significativa de las células comprometidas con la diferenciación del linaje endocrino (CHGA+) observada por la disminución de la expresión de NGN3 y NKX2.2 en las fases 3 y 4, en particular, los días 8, 10 y 12 (FIG. 13 A y B). No obstante, aunque la expresión de NKX6.1 se reprimió inicialmente el día 8, se elevó significativamente en los días 10 y 12 (fase 4) (FIG.13C). Por lo tanto, el desarrollo de la subpoblación no endocrina (CHGA-) no se vio afectado con la adición de Wnt, y la diferenciación de las células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) pareció retrasarse o suprimirse, y no hubo una pérdida aparente de masa celular.
Para determinar la composición celular de la población de PEC con la combinación de Activina, Heregulina y Wnt durante la fase 3, se realizó una citometría de flujo después de la fase 4, y la composición celular de PEC se muestra en la Tabla 14. Como se muestra, los factores de crecimiento combinados (Activina, Heregulina y Wnt, o "AHW") redujeron de manera eficaz la diferenciación de las células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) según lo observado por el porcentaje disminuido de esta subpoblación (15,6 frente a 58,8) al tiempo que aumenta la subpoblación no endocrina (CHGA-)-(58,1 frente a 23,4) en comparación con los cultivos celulares de control bajo el protocolo convencional (Tabla 8). Los datos de la citometría de flujo apoyan y coinciden con los datos de QPCR en que la combinación de los tres factores (AHW) en general retrasó o suprimió la diferenciación de las células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) en PEC sin afectar a la producción de la subpoblación no endocrina ( CHGA-). La expresión retardada de estos genes in vitro coincide con su inicio (o retraso) en el desarrollo pancreático de mamíferos in vivo, por lo que la expresión de NGN3 en la diferenciación endocrina ocurre después del inicio de la expresión de PDX1 y NKX6.1 en la subpoblación no endocrina (CHGA-). Además, no hubo compromiso en la masa ni en el rendimiento de PEC.
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En vista de los resultados obtenidos usando la combinación de Activina, Heregulina y Wnt, los niveles de Activina se ajustaron nuevamente en la fase 3 para establecer un intervalo de concentraciones en el que se pudiera usar Activina. Las concentraciones de Activina probadas variaron de aproximadamente 0, 25, 50, 75 y 100 ng/ml con Wnt a 50 ng/ml y Heregulina a 5 ng/ml durante la fase 3. La Activina se redujo a 5 ng/ml, Heregulina a 5 ng/ml y Wnt no se incluyó durante la fase 4. Las células se fotografiaron al final de la fase 4 (día 13) y se muestran en la FIG. 12 (panel inferior). La pérdida de células fue nuevamente evidente a concentraciones más altas de Activina, por ejemplo, de entre 75 y 100 ng/ml (FIG. 12D y E, panel inferior). De manera importante, la inclusión de WNT en la fase 3 permitió el uso de una concentración mucho mayor de Activina en la fase 3 de lo que hubiera sido posible debido a la pérdida de células.
Para probar el efecto de la Activina y la Heregulina continuadas durante la fase 4, en el contexto de la Activina, Heregulina y Wnt en la fase 3, se diferenciaron ESC humanas usando tres condiciones: (i) protocolo convencional (véase la Tabla 8; o Protocolo n.° 1 de la Tabla 17); (ii) combinación de Activina (75 ng/ml), Heregulina (5 ng/ml) y Wnt (50 ng/ml) en la fase 3, seguida de los factores convencionales de la fase 4; y (iii) combinación de Activina (75 ng/ml), Heregulina (5 ng/ml) y Wnt (50 ng/ml) en la fase 3, seguida de más Activina (5 ng/ml) y Heregulina (5 ng/ml) durante la fase 4, véase la Tabla 17. Se realizó una citometría de flujo después de la fase 4 para las tres condiciones, y la composición celular de PEC se muestra en la Tabla 17. El AHW en la fase 3 disminuye las células comprometidas con el linaje endocrino y aumenta el contenido de subpoblaciones no endocrinas (CHGA-) en comparación con el control (21,8 frente a 42,2 para las células comprometidas con la subpoblación del linaje endocrino; y 40,1 frente a 27,6 para la subpoblación no endocrina (CHGA-), y el tratamiento adicional con AH en la fase 4 disminuye aún más las células comprometidas con el linaje endocrino y aumenta aún más el contenido de subpoblación no endocrina (CHGA-) ( 6,46 frente a 21.8 para células comprometidas con el linaje endocrino; y 72,7 frente a 40,1 para la subpoblación progenitora no endocrina (CHGA-).
Tabla 16: Activina, Heregulina y Wnt en las fases 3 y 4 disminuye las subpoblaciones endocrinas y aumenta las sub oblaciones no endocrinas CHGA-
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Ejemplo 10
LOS INJERTOS DE PEC PRODUCIDOS USANDO LA COMBINACIÓN DE ACTIVINA, HEREGULINA Y WNT HAN MEJORADO LA FUNCIÓN SENSIBLE A LA GLUCOSA IN VIVO
El ejemplo 9 demostró que basándose en los datos de morfología (por ejemplo, imágenes de microscopía de baja potencia de agregados de células diferenciadas), de QPCR y de citometría de flujo, parece que la combinación de Activina, Heregulina y Wnt ("AHW") pueden reprimir eficazmente las células comprometidas con la diferenciación del linaje endocrino (CHGA+) observada por la represión de la expresión de NGN3 y NKX2.2, mantener o aumentar las subpoblaciones no endocrinas (CHGA-) mientras que, al mismo tiempo, no tiene ningún efecto perjudicial ni mejora en la masa celular ni en el rendimiento. Para determinar si estos cambios tienen un efecto en el desarrollo final y en la maduración de células secretoras de insulina sensibles a la glucosa, se implantaron agregados de PEC derivados de AHW en animales, junto con las PEC creadas con el protocolo convencional de acuerdo con la Tabla 8 o el Protocolo n.° 1 de la Tabla 17.
Específicamente, las células madre pluripotentes humanas se diferenciaron usando la combinación de los tres factores (AHW) en la fase 3, y luego la Activina y la Heregulina solas en la fase 4. El control PEC se realizó esencialmente de acuerdo con la Tabla 8. Los agregados celulares se analizaron por QPCR en los días 8, 10, 12 y 14 como se muestra en la FIG. 14. Tanto el control como el protocolo de AHW modificado produjeron PEC según lo observado por la expresión de NKX6.1 (Figura 14A), aunque hay una expresión de NKX6.1 más potente usando AHW en el día 14 (después de la fase 4). Al mismo tiempo, la diferenciación de las células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) se suprimió en gran medida con el protocolo AHW como se observó mediante la represión de la expresión de NGN3, especialmente el día 8 en comparación con el protocolo de control (FIG. 14B).
Los agregados de PEC de ambos métodos se cargaron en los dispositivos de encapsulación semipermeables implantables patentados por el solicitante en el día 14 de la diferenciación y se implantaron en ratones SCID beis esencialmente como se ha descrito anteriormente (n = 5 animales para cada uno de los métodos de AHW y control, n = 10 en total). A las 11 semanas del implante, las PEC producidas usando el protocolo AHW resultaron ser una media de aproximadamente 900 pM de péptido C después de una hora (60') de la exposición a la glucosa, mientras que las PEC de control fueron de aproximadamente 400 pM de péptido C. Véase la FIG. 15, en la que se comparan los animales de AHW con los del control. Específicamente, A las 11 semanas del implante, 3 de los 5 ratones con los implantes de AHW promediaron más de 1.200 pM de péptido C humano (FIG. 15, animales n.° 3514, 3516 y 3518), mientras que los niveles de péptido C en los animales de control fueron significativamente más bajos. De hecho, solo 1 de los 5 animales de control resultaron tener niveles cercanos a 600 pM (FIG. 15, animal n.° 3524). Por lo tanto, basándose en los niveles de péptido C, a las 11 semanas del implante, el protocolo de AHW fue capaz de producir una población de PEC con al menos una mejora del doble en la función in vivo, medida según el nivel de péptido C humano tras la estimulación con glucosa. Esto potencialmente se correlaciona con un tiempo de maduración más rápido.
a las 14 semanas del implante, los implantes de AHW de PEC continuaron superando a los implantes de injerto de control, y con un tiempo de respuesta de secreción de insulina más rápido, porque los valores de péptido C 30 minutos después de la exposición a la glucosa para los implantes de AHW de PEC fueron superiores a los valores 60 minutos después de la exposición para los implantes de control FIG. 16). Específicamente, 3 de los 4 animales con implantes de AHW DE PEC promediaron más de 3.500 pM de péptido C 30 minutos después de la exposición a la glucosa, en comparación con los 3 primeros animales de control que promediaron aproximadamente 2.300 pM pero después de 60 minutos después de la exposición a la glucosa (FIG. 16). Este dato demuestra que la diferenciación usando la combinación de los tres factores de crecimiento (AHW) es capaz de producir una población de PEC que funcione mejor (es decir, niveles aumentados de péptido C en suero 30 minutos después de la exposición a la glucosa, lo que indica una respuesta de glucosa más rápida de los injertos de PEC derivados de AHW implantados) o es potencialmente más potente que el protocolo de PEC convencional en los puntos de tiempo estudiados. Sin limitar esta aplicación a ninguna teoría, se cree que el aumento de la potencia en los implantes de PEC de AHW se atribuye al hecho de que la combinación de AHW (1) retrasó o reprimió la diferenciación de las células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) en PEC; (2) aumentó la subpoblación de células progenitoras pancreáticas multipotentes no endocrinas en PEC; y (3) mantuvo una buena masa celular.
Ejemplo 11
CULTIVO DE CELULAS ENDOCRINAS PANCREÁTICAS IN VITRO
Los Ejemplos 9 y 10 describen el retraso, la represión, la supresión o la inhibición deliberadas de la diferenciación de células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+) en las fases 3 y 4. En un esfuerzo por producir una célula precursora de células endocrinas evolutivamente avanzadas o una célula endocrina in vitro, los solicitantes probaron diversos métodos durante las fases 5, 6 y/o 7. Por ejemplo, el solicitante probó qué factores de crecimiento, solos o en combinación, eran capaces de estimular o inducir la diferenciación endocrina, es decir, inducir la expresión de NGN3.
La siguiente Tabla 17 resume varios métodos para la producción endocrina junto con el protocolo convencional para producir PEC (Protocolo n.° 1) y el protocolo usado para producir PEC AHW (Protocolo n°. 2). La Tabla 17, el Protocolo n°. 3, indica una serie de factores de crecimiento en días y fases específicos, sin embargo, los solicitantes han probado, y un experto en la materia apreciará, que no todos los factores de crecimiento, solos o en combinación, se tienen que usar en el día/la fase exactos indicados. Por consiguiente, la Tabla 17 representa las numerosas iteraciones (por ejemplo, factores de crecimiento, duración y similares) probadas por los solicitantes.
T l 17: M r r ir l l PE n rin in vi r
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(continuación)
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hESC Ag.: agregados de hESC; XF HA: DMEM/F12 que contiene GlutaMAX, suplementado con 10% v/v de reemplazo de suero desactivado sin Xeno, aminoácidos no esenciales al 1 % v/v, 2-mercaptoetanol 0,1 mM, penicilina/estreptomicina al 1 % v/v (todas de Life Technologies), Heregulina-1b a 10 ng/ml (Peprotech) y Activina A a 10 ng/ml (R&D Systems); SP: hESC SFM StemPro® (Life Technologies); r0.2FBS: RPMI 1640 (Mediatech); FBS al 0,2 % (HyClone), 1x GlutaMAX-1 (Life Technologies), penicilina/estreptomicina al 1 % v/v; cb: c Mr L: CMRL 1066, Glutamax x1, penicilina/estreptomicina al 1 % v/v, B-27 al 2 %; db: DMEm Eli Glucosa (HyClone) suplementado con un suplemento B-27 x0,5 (Life Technologies), GlutaMAX x1 y penicilina/estreptomicina al 1 % v/v; A100, A50, A5: 100 ng/ml, 50 ng/ml, Activina A humana recombinante a 5 ng/ml (R&D Systems); BMP20, BMP10: 20 ng/ml, BMP4 a 10 ng/ml (Peprotech); CTT3: KAAD-ciclopamina 0,25 mM (Toronto Research Chemicals) y TTNPB 3 nM (Sigma-Aldrich); E50: EGF humano recombinante a 50 ng/ml (R&D Systems); H10, H5: 10 ng/ml, Heregulina 1b a 5 ng/ml; IGF25: IGF2 a 25 ng/ml (Peprotech); ITS: Insulina-transferrina-selenio (Life Technologies) diluida a 1:5.000 o 1:1.000; IV: Inhibidor de la RI quinasa IV de TGF-b 2,5 mM (EMD Bioscience); K50, K25: 50 ng/ml, KGF humano recombinante (continuación)
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a 25 ng/ml (R&D Systems o Peprotech); MG0.05: MATRIGEL al 0,05 % (BD Biosciences); N50: Nogina humana recombinante a 50 ng/ml (R&D Systems); NC10: nicotinamida 10 mM; PDGF10: Factor de crecimiento derivado de plaquetas a 10 ng/ml (Pd Gf , R&D Systems); RO1: inhibidores de la gamma-secretasa, RO4929097, 1 mM; SHH100: sonic hedgehog a 100 ng/ml; TTNPB1: TTNPB 1 nM (Sigma-Aldrich); W50: Wnt3A de ratón recombinante a 50 ng/ml (R&D Systems); Y10: Y-27632 10 mM (Tocris Bioscience).
Anteriormente, el uso descrito por el solicitante de un inhibidor de la gamma secretasa para la producción de células progenitoras/precursoras endocrinas en la patente de EE. UU. n.° 8.129.182, "ENDOCRINE PROGENITOR/PRECURSOR CELLS, PANCREATIC HORMONE EXPRESSING CELLS AND METHODS OF PRODUCTION", concedida el martes 6 de marzo de 2012. Como se describe y se reivindica en la patente 182, para inducir aún más la diferenciación de las células endodérmicas pancreáticas positivas en PDX1 hacia el linaje endocrino, se dilucidaron factores de crecimiento o agentes que inhibieron la señalización de Notch. Esto se logró mediante la aplicación de un inhibidor de gamma secretasa (por ejemplo, DAPT o éster t-butílico de N-[N-(3,5-difluorofenacetil)-L-alanil]-S-fenilglicina y análogos relacionados). Los inhibidores de la gamma-secretasa bloquean la escisión intramembrana de la molécula Notch, impidiendo así la liberación del dominio intracelular de Notch activado. Se usó una aplicación de 2 a 4 días del inhibidor de la gamma secretasa DAPT, por ejemplo, en los días finales de la adición de ácido retinoico o inmediatamente después de la extracción del ácido retinoico para inducir la expresión de NGN3. En este caso, se usó otro inhibidor de la gamma-secretasa, RO44929097 durante la fase 5. Véase la Tabla 17.
Como se ha indicado en la Tabla 17, para impulsar la diferenciación y/o maduración del linaje endocrino, durante las fases 6 y 7, se aplicó una combinación de factores de crecimiento que incluían, pero sin limitación, BMP4 ("BMP"), Sonic Hedgehog ("SHH"), factor de crecimiento derivado de plaquetas ("PDGF"), FGF2 ("FGF"), ácido retinoico y/o análogos del ácido retinoico, tales como TTNPB ("TTNPB"), factor de crecimiento de tipo insulina I (IGF-I o "IGF1") y II (IGF-II o "IGF2"), un derivado de la vitamina B3, Nicotinamida ("NC") o combinaciones de uno o más de estos factores de crecimiento. Una de dichas combinaciones se describe en la Tabla 17, protocolo n° 3.
Por ejemplo, el PEC elaborado a partir del protocolo de AHW esencialmente como se describe anteriormente en el Ejemplo 10 se trató adicionalmente en la fase 5 (días 13 y 14) con el inhibidor de la gamma secretasa, RO4929097 ("R01"), normalmente, durante 2 días a 1 pM, de acuerdo con la Tabla 17, Protocolo n.° 3. Este tratamiento en fase 5 produce la inducción de la expresión de NGN3 y, posteriormente, la diferenciación endocrina. Además, la nicotinamida se incluyó durante las fases 5 y 6 para inducir también la expresión de NGN3 o la diferenciación endocrina. La expresión del gen NGN3 se analizó mediante detección Nanostring de ARNm después de la fase 4 (cultivos del día 13), después de la fase 5 (cultivos del día 15) y después de 2 días de la fase 6. Como se muestra en la FIG. 17, el inhibidor de la gamma-secretasa indujo fuertemente la expresión de NGN3 después de la fase 5 en el día 15 en comparación con la expresión de bajo nivel de NGN3 al final de la fase 4 (día 13). Después de la eliminación del inhibidor de gamma-secretasa en el día 15 (primer día de la fase 6), la expresión de NGN3 disminuye como se observa en el día 17 (FIG. 17). Este aumento transitorio en la expresión de NGN3 durante la fase 5 coincide con su expresión transitoria observada durante el desarrollo de células beta in vivo. Véase Jorgensen et al. (2007) supra.
Se observa que el número total de días para cualquiera de las fases puede variar y varía, por ejemplo, las fases 5, 6 y/o 7 se pueden acortar o alargar en el número de días. Esto se aplica también a las fases anteriores 1, 2, 3 y 4.
Además, se puede añadir un inhibidor de la rho-quinasa a los medios de diferenciación de forma continua o intermitente durante cualquiera de las fases 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 para potenciar la supervivencia celular, la masa celular y el rendimiento. Un inhibidor de la rho-quinasa en las fases 1, 2 y 4, por ejemplo, parece potenciar la diferenciación de células madre pluripotentes inducida, por ejemplo, mediante el mantenimiento de la masa celular y el rendimiento.
Asimismo, en aproximadamente el día 20 (es decir, la unión entre las fases 6 y 7 del Protocolo n.° 3 de la Tabla 17), los agregados celulares pueden disociarse y volver a agregarse. Esta disociación y reagregación eliminaron ciertas subpoblaciones celulares, dejando así una población de células predominantemente endocrinas y/o progenitoras/precursoras endocrinas /progenitoras (CHGA+). Esta manipulación física también facilita el análisis de las poblaciones endocrinas y constituye una etapa de purificación, en caso de necesitarse. Para más información, véase el Ejemplo 14.
Además, partiendo dela fase 6 a la fase 7, si fuera necesario, se puede usar una concentración muy baja, por ejemplo, aproximadamente el 0,05 %, de Matrigel para ayudar a mantener los agregados celulares y/o evitar que las células endocrinas migren de los agregados celulares. El uso de Matrigel o cualquier otra matriz celular compleja puede depender de los propios agregados celulares específicos (por ejemplo, agregados de PEC, agregados de células progenitoras/precursoras endocrinas como se describe a continuación y similares) y, potencialmente, de la estirpe de PSC de la que se derivaron los agregados celulares. Es posible el uso de otras matrices complejas o matrices definidas, por ejemplo, suero, laminina, fibronectina, colágeno y otras proteínas de la matriz extracelular, para realizar funciones esencialmente similares. Para más información, véase el Ejemplo 14.
La adición del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) 1 y/o 2 (IGF1 o IGF2) se puede añadir en la fase 6 o 7 o durante la fase 6, por ejemplo, a partir del día 16, 17 o 18. Las células madre pluripotentes se diferenciaron esencialmente como se describe anteriormente de acuerdo con la Tabla 17, excepto por la adición de IGF1 a 50 o 200 ng/ml o IGF2 a 25 o 100 ng/ml a los cultivos celulares durante la fase 6, específicamente en el día 17 durante aproximadamente 3 días. Los agregados celulares se analizaron en busca de ARNm usando Nanostring después de la fase 6 (día 20). Estos estudios preliminares mostraron que IGF2 resultó ser más capaz de inducir la expresión de INS que IGF1 (datos no mostrados); sin embargo, un tratamiento más prolongado podría producir un efecto más potente de IGF2 solo o IGF1, o la combinación de los dos.
La Tabla 17 describe el uso de varios factores de crecimiento a ciertas concentraciones; sin embargo, la invención no se limita a las concentraciones específicas descritas en el presente documento, ya que un experto en la materia reconocerá que la modificación de la concentración del factor de crecimiento es convencional en la técnica y, de hecho, se describe en los ejemplos anteriores con al menos cambios en los niveles de Activina y Heregulina, y su efecto sobre la diferenciación celular y la composición. Las modificaciones en el presente documento incluyen, pero sin limitación, 5, 10, 20, 50 a 100 ng/ml de Activina; 5, 25, 50 a 75 ng/ml de Wnt; 2, 5, 10, 30 ng/ml de Heregulina; sonic hedge-hog a de 10 a 200 ng/ml (SHH); de 10 a 100 ng/ml de PDGF; de 10 a 20 ng/ml de BMP; de 2 a 20 ng/ml de FGF2; y de 25 a 200 ng/ml de IGF1 y/o IGF2. Además, se puede usar cualquiera de las combinaciones de estos factores, y se puede variar la fase o el período en que se usen, incluso significativamente, sin apartarse de la invención descrita.
Ejemplo 12
FUNCIÓN IN VIVO DE CÉLULAS ENDOCRINAS PANCREÁTICAS
Hasta ahora, las poblaciones enriquecidas de células endocrinas producidas in vitro a partir de PSC no han dado lugar a células beta secretoras de insulina sensibles a la glucosa in vivo. Por lo tanto, los solicitantes probaron si los métodos anteriores de acuerdo con la Tabla 17 y los descritos en el Ejemplo 11 anterior podrían producir la primera célula endocrina in vitro sensible a la glucosa in vivo.
Las células madre pluripotentes humanas se diferenciaron de acuerdo con el Protocolo n.° 3 de la Tabla 17 para las fases 1-5; sin embargo, en las fases 6 y 7, solo se usó FBS, Matrigel y un inhibidor de la rho-quinasa, además del medio de DMEM base con suplemento de B-27. La expresión de ARN fue analizada mediante Nanostring, con puntos de tiempo al comienzo de las fases 5 (d13) y 6 (d15), y al final de las fases 6 (d20) y 7 (d26). Las FIG. 18A-D y 19A-D muestran niveles relativos de expresión de ARNm para marcadores de subpoblaciones progenitoras pancreáticas no endocrinas multipotentes, incluyendo PDX1, NKX6.1, SOX9 y PTF1A, y marcadores de células endocrinas que incluyen insulina (INS), glucagón (GCG), somatostatina (SST) y grelina (GHRL). Al final de la fase 4 (día 13), PDX1, SOX9, NKX6.1 y PTF1A fueron altamente expresados. Todos estos marcadores se reducen durante la fase 5 a medida que se produce la diferenciación o la inducción endocrinas (día 15). Asimismo, al final de la fase 6 (día 20) o a comienzos de la fase 7, los niveles de ARNm de PDX1, NKX6.1 y PTF1A han disminuido, al mismo tiempo que los niveles de ARNm de INS, GCG, GHRL y SST aumentaron (compárense las FIG.18A-D y FIG.19A-D en el día 20). Específicamente, la disminución de la expresión de PDX1 y PFT1A, y el drástico aumento concomitante en la expresión relativa de ARNm de INS, GCG, GHRL y SST a través de las fases 5 y 6 se deben a la combinación de Activina, Heregulina y Wnt (AHW), y en particular, a la Activina, en las fases 3 y 4. Es decir, la inclusión de Activina en las fases 3 y 4 reprimió la diferenciación endocrina en las fases 3 y 4, mientras que la gamma-secretasa en la fase 5 indujo la diferenciación endocrina en las fases 5, 6 y 7. Los niveles similares de expresión de NKX6.1 en los días 20 y 26 (fases 6 y 7) en comparación con los puntos de tiempo anteriores mostrados coincidieron con la expresión de este marcador en células endocrinas pancreáticas, así como en subpoblaciones progenitoras pancreáticas multipotentes no endocrinas. Por lo tanto, en fases posteriores (por ejemplo, fases 5, 6 y 7), las células se dirigieron hacia la diferenciación endocrina, mientras que se suprimieron de hacer lo mismo en las fases anteriores, fases 3 y 4.
Después de la fase 6, los agregados celulares se disociaron y se volvieron a agregar (descrito con más detalle a continuación en el Ejemplo 14), lo que eliminó algunos tipos de células creados durante las fases 3 y 4, incluyendo ciertas subpoblaciones de PEC, por ejemplo, células no endocrinas (CHGA-). La eliminación de subpoblaciones no endocrinas (CHGA-) y/o células exocrinas y/o células progenitoras exocrinas y/o de conductos y/o células progenitoras de conductos se puede ver por la disminución drástica en SOX9 y PTF1A después de la agregación (FIG.18, compárese el día 20 con el día 26). Después de la fase 7, las células endocrinas se cargaron en dispositivos el día 26 y se trasplantaron a ratones RAG2 el día 27 esencialmente como se ha descrito previamente para el trasplante (o la implantación) en ratones SCID beige. La FIG. 20 muestra los niveles séricos de péptidos C humanos después del ayuno y una hora (60') después de la administración de o exposición a la glucosa. A las 10 semanas del implante, los cinco animales estaban produciendo insulina según lo observado por el P-péptido humano en suero. A las 15 semanas después del implante (FIG. 21), todos los animales mostraron niveles aumentados de producción de insulina en comparación con las 10 semanas posteriores al implante, y 2 de los 5 animales promediaron 1500 pM de péptido C, lo que es evidencia de una potente capacidad de respuesta a la glucosa in vivo.
Antes de cargar las células endocrinas en dispositivos el día 26, se tomaron muestras para verificar que las células beta funcionales se desarrollaron, maduraron y surgieron de células endocrinas trasplantadas de las fases 6 y 7 y no, por ejemplo, de cualquier subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina restante. Se realizó la Inmunocitoquímica usando marcadores endocrinos y no endocrinos en las muestras. Las secciones congeladas del día 26 se cosieron con anticuerpos usando DAPI (FIG. 22A), NKX6.1 y cromogranina A (FIG. 22B). Es evidente que la gran mayoría de las células positivas (rojas) en NKX6.1 también se tiñen de forma positiva para la cromogranina (CHGA+), un marcador endocrino. Por lo tanto, parece que las células progenitoras pancreáticas multipotentes no endocrinas, como se muestra por la falta de células CHGA-/NKX6.1+, no parecen estar presentes en ningún número significativo en estas preparaciones de células endocrinas.
Las muestras de estos mismos agregados de células endocrinas también se tiñeron conjuntamente para INS, NKX6.1 y PDX1 (FIG. 23A-B). Las FIG. 23A-B mostraron que la mayoría de las células que expresan insulina también expresan NKX6.1 y PDX1. Este es un resultado sorprendente dado que los informes publicados previamente de células que expresan insulina derivadas in vitro de PSC no expresan conjuntamente NKX6.1 y/o PDX1. Véase la patente de Ee . u U. n.° 7.033.831 y las solicitudes relacionadas de Geron Corporation y Jiang et al. (2007), "Generation of insulinproducing islet-like clusters from human embryonic stem cells", Stem Cells, agosto de 2007;25(8):1940-53. Epub 17 mayo de 2007.
En conjunto, estos datos proporcionan evidencias convincentes de que, por primera vez, un cultivo celular endocrino derivado de PSC in vitro puede (1) expresar conjuntamente INS, Pd x 1 y NKX6.1 in vitro, y es probable que sea sensible a la glucosa in vitro; y (2) puede dar lugar a células secretoras de insulina sensibles a la glucosa in vivo.
Ejemplo 13
EL ÁCIDO RETINOICO, LA NICOTINAMIDA Y LA BMP AUMENTAN LA EXPRESIÓN DE PDX1 Y NKX6.1 EN CÉLULAS ENDOCRINAS
Un sello distintivo de las células beta maduras es que regulan al alza NKX6.1 y PDX1, a nivel celular individual, en relación con los niveles observados en las subpoblaciones no endocrinas (CHGA-) de PEC. Los ejemplos 11 y 12 describieron la producción de células endocrinas, por lo que la mayoría de las células tienen niveles de expresión de NKX6.1 y PDX1 similares a los observados para la subpoblación no endocrina (CHGA-) de PEC. Por consiguiente, es deseable identificar factores de crecimiento que mejoren específicamente la expresión de al menos estos dos marcadores en células endocrinas positivas en insulina.
Dos factores candidatos incluyen TTNPB, un ácido retinoico o análogo de retinoide, y BMP4, un miembro de la familia de proteínas morfogenéticas óseas que forma parte de la superfamilia de factores de crecimiento transformantes beta. TTNPB y BMP4 se probaron en varias combinaciones en las fases 6 y 7, y en diversas concentraciones, pero normalmente a 0,5 nM y 10 ng/ml, respectivamente. Como se muestra mediante el análisis de ARNm de Nanostring en la FIG. 24, BMP en las fases 6 y 7, solo en la fase 7, o en combinación con TTNPB, puede aumentar simultáneamente la expresión de insulina y PDX1 (FIG.24A y C). Por el contrario, TTNPB solo en estas mismas fases (fases 6 y 7 y fase 7 solo) no parece aumentar la expresión de PDX1, e incluso parece disminuir ligeramente la expresión de PDX1 en comparación con BMP sola (compárense las columnas 4 y 5 de FIG.24C con las columnas 2 y 3). Los efectos de BMP en la expresión de NKX6.1 son menos evidentes, ya que, en todas las condiciones, (el tratamiento con BMP sola, TTNPB solo, BMP y TTNPB combinados, tratamiento de cada uno en las fases 6 y 7, o solo en la fase 7), La expresión de NKX6.1 es relativamente estable. Como un indicador adicional de la especificidad de BMP, también se observó que BMP regulaba al alza la expresión del gen del inhibidor de la diferenciación (ID) (por ejemplo, ID1), que se sabe que está regulada por miembros de la superfamilia de TGF-p, incluyendo BMP4 (FIG.24D). Por lo tanto, sin limitar dicha aplicación a ninguna teoría, parece que BMP es el factor que induce selectivamente la regulación al alza de PDX1 e iD1.
Para determinar si algunos de estos marcadores se expresaron conjuntamente en alguna célula, los agregados de células endocrinas se fijaron en el día 27 (después de la fase 7) de diferenciación, y se prepararon secciones congeladas y se tiñeron mediante inmunocitoquímica (ICC) para el péptido C, NKX6.1 y PDX1. Véanse las FIG. 25­ 28. En este caso, En lugar de teñir con INS, las células se tiñeron con un anticuerpo contra el péptido C, un fragmento central de proinsulina, y por lo tanto, esta tinción también es indicativa de células que expresan insulina (FIG. 25). Los resultados de ICC coincidieron con los datos de Nanostring anteriores, es decir, que BMP sola, o combinada con TTNPB, en las fases 6 y 7, o solo en la fase 7, fue capaz de inducir la expresión de PDX1 en células que expresaban insulina (péptido C) (Fig. 25 y 26).
A pesar del hecho de que los datos de ARNm sugirieron que BMP y TTNPB solos o en combinación tuvieron poco efecto sobre la expresión de NKX6.1, los estudios del ICC demostraron que, a nivel celular, la expresión conjunta de células que expresan NKX6.1 y péptido C (o insulina) es bastante potente (Fig. 27 y 28), es decir, la tinción de NKX6.1 es brillante, y también suele ser más brillante que la observada en la subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina. Por lo tanto, la expresión de NKX6.1 parece expresarse conjuntamente de manera predominante con células que expresan péptido C (o insulina). Los datos combinados de ARNm (Nanostring) y proteína (ICC) también demuestran que, en ciertos contextos, puede haber un límite para usar solo una metodología para caracterizar inicialmente un tipo de célula. Por lo tanto, los datos de ICC demostraron que la BMP sola o en combinación con TTNPB en las fases 6 y 7, o solo en 7, pudo aumentar los niveles de PDX1 y NKX6.1 en las células que expresaban péptido C (o insulina) (FIG. 27 y 28). El efecto más fuerte se observa cuando los dos factores se usan en combinación, pero BMP sola es capaz de conseguir lo mismo. TTNPB también puede regular independientemente de PDX1 y NKX6.1. Por ejemplo, el tratamiento con TTNPB durante menos días, por ejemplo, 2, 3 o 4 días durante la fase 7 fue capaz de inducir la expresión de NKX6.1 sin la presencia de BMP (datos no mostrados). Por consiguiente, el uso de estos factores de crecimiento, en particular, para TTNPB, puede ser dependiente del tiempo.
Refiriéndose específicamente a la nicotinamida, la FIG. 29 muestra que la nicotinamida en las condiciones de cultivo de la fase 6 aumenta la expresión de INS y disminuye la expresión de GCG, dando lugar a un aumento del triple en la relación de expresión de INS/GCG. La función de la nicotinamida no está clara, pero se ha informado que la nicotinamida previene la pérdida de células beta en roedores como resultado del tratamiento con estreptozotocina, mediante la inhibición de PARP-1, poli(adenosina trifosfato [ADP]-ribosa) polimerasa-1, y previniendo el agotamiento de NAD+. Véase Masiello, P. et al. (1998) "Experimental N iDd M Development of a New Model in Adult Rats Administered Streptozotocin and Nicotinamide", Diabetes, 47 (2):224-9. La nicotinamida también puede aumentar la diferenciación endocrina y el contenido de insulina en los islotes fetales humanos. Véase Otonkoski T. et al. (1993), "Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells". J Clin Invest 92:1459 -1466.
De nuevo, las células beta maduras in vivo expresan altos niveles de PDX1 y NKX6.1, y altos niveles de PDX1 y NKX6.1 son necesarios para la función adecuada. Por lo tanto, BMP, y BMP en combinación con TTNPB, al inducir una alta expresión de ambos marcadores en células positivas en insulina indica que, por primera vez, se pueden producir células endocrinas sensibles a la glucosa no solo in vivo sino también potencialmente in vitro.
Asimismo, como se ha mencionado anteriormente, los días para las fases 6 y 7 no son rígidos, y pueden acortarse, o incluso alargarse, y un experto en la materia reconocerá esto, pues los 5 y 10 días para las fases 6 y 7, respectivamente, se pueden manipular fácilmente; en particular, si se usan esencialmente los mismos factores de crecimiento que se describen en el presente documento y de acuerdo con la Tabla 17.
Ejemplo 14
MATRIGEL SOLO Y EN COMBINACIÓN CON UN INHIBIDOR DE RHO KINASE MEJORA LA ADHESIÓN CELULAR DE LOS AGREGADOS DE CÉLULAS ENDOCRINAS Y PEC
En el Ejemplo 11 anterior, los agregados celulares se disociaron y se volvieron a agregar o se volvieron a asociar entre las fases 6 y 7. La disociación se realizó con Accutase en o alrededor del día 20 y se volvió a agregar en un cultivo de rotación, esencialmente como se describe en Schulz et al. supra. La reagregación elimina ciertas subpoblaciones de PEC, incluyendo las subpoblaciones no endocrinas (CHGA-) restantes, así como otras células no endocrinas, como se describe con más detalle en Kelly et al. (2011), supra. Las células endocrinas tienen afinidad entre sí, sin embargo, esta interacción in vitro es relativamente débil, incluso las células reagregadas en las fases 6/7 solo se asociaron de manera floja. Por tanto, se realizaron estudios para probar diversos factores y agentes para determinar su capacidad para aumentar las interacciones de célula a célula dentro de los agregados de células endocrinas.
Se descubrió que la adición de un Y-27632, un inhibidor de la rho-quinasa y Matrigel diluido (0,05 % v/v) fue capaz de potenciar asociaciones de células más estrechas de los agregados de células endocrinas reagregadas. La combinación de Y-27632 y Matrigel aumentó al menos, por ejemplo, la interacción de célula a célula de los agregados celulares frente a cualquiera de los componentes solo.
Un cultivo diferenciado producido esencialmente como se describe en el Ejemplo 12, en el día 20, se disoció con Accutase y se volvió a agregar en db con FBS al 5 % (las concentraciones más bajas de FBS, es decir, 2 % o 1 % también son eficaces) y DNAsa. No se incluyó Y-27632 en el medio de reagregación, ya que hacerlo hubiera dado lugar a la incorporación de subpoblaciones no endocrinas (CHGA-), así como otras células no endocrinas en los agregados recién formados. Al día siguiente, y cada día posterior, los agregados celulares se trataron con Y-27632 o Matrigel, o con ambos componentes. Se tomaron imágenes con un estereomicroscopio 1, 2 y 3 días después de la agregación, como se muestra en la FIG. 30. La FIG. 30 demuestra que la combinación de Matrigel, Y-27632 y db-FBS fue la más eficaz. Esta combinación fue más eficaz que usar db-FBS solo o db-FBS y Matrigel o db-FBS e Y-27632 (compárese con la FIG. 30A-D). Los agregados celulares que usan los agentes combinados parecían morfológicamente más ajustados el resto de las otras muestras (FIG. 30D). Es probable que los agentes mejoren el contacto de célula a célula y las interacciones entre las células y la matriz; aunque experimentos posteriores en ausencia de FBS, y solo Matrigel y Y-27632 dieron los mismos resultados. Estos agregados celulares más apretados aparecen más morfológicamente como tejido orgánico. Esto es ventajoso para que los agregados celulares puedan soportar mejor las tensiones del cultivo de rotación, la carga en dispositivos, la manipulación para el trasplante, han mejorado el desarrollo y la maduración in vitro e in vivo, y similares.
Ejemplo 15
LA AUSENCIA DE NOGINA PROPORCIONA PEC ENRIQUECIDO EN LA SUBPOBLACIÓN PROGENITORA MULTIPOTENTE NO ENDOCRINA CON CONTENIDO DE CÉLULAS ENDOCRINAS LIMITADO Y SIN LA NECESIDAD DE FRACCIONAMIENTO O PURIFICACIÓN DE LA POBLACIÓN DE PEC
Como se ha analizado anteriormente, se desea la producción de una población PEC (fase 4) que esté altamente enriquecida en la subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina (CHGA-), pero relativamente repleta de células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+). Dichas poblaciones celulares podrían, por ejemplo, ser útiles para detectar moléculas o condiciones que induzcan específicamente su diferenciación a las células del linaje endocrino. Los compuestos con esta actividad pueden ser útiles para aplicaciones de medicina regenerativa para generar células endocrinas, incluyendo células beta pancreáticas ya sea in vivo o ex vivo. Dado que se sabe que el fraccionamiento y la purificación de poblaciones celulares específicas a partir de mezclas de células más complejas conllevan una pérdidas de eficacia, debido a la muerte celular y por otras razones, es beneficioso poder crear poblaciones de células altamente enriquecidas en un fenotipo deseado a través de una diferenciación dirigida eficaz solo, sin la necesidad, por tanto, de etapas de purificación.
Se expandieron ESC humanas indiferenciadas y se diferenciaron esencialmente como se ha descrito anteriormente en la Tabla 17, Protocolo n.° 1 para las fases 1-4 y en Schulz et al. (2012) supra, excepto que durante los tres (3) días de la fase 3, se compararon 4 condiciones diferentes: (i) 0 nogina ("sin nogina") durante los 3 días; (ii) 1 día de Nogina a 50 ng/ml y 2 días sin Nogina adicional; (iii) 2 días de Nogina a 50 ng/ml y 1 día sin nogina adicional; e (iv) 3 días de Nogina a 50 ng/ml. Después de la fase 3, cada una de estas condiciones (i) a (iv) recibió el cóctel de medios de diferenciación convencional de fase 4 según la Tabla 8 y la Tabla 17, pero sin Nogina adicional. El análisis de citometría de flujo después de la fase 4 demostró que la Nogina produjo una subpoblación progenitora pancreática no endocrina multipotente superior al 90 % con menos del 5 % de células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+). Véase la Tabla 17. Por otra parte, con cada día adicional de tratamiento con nogina, se produjeron menos subpoblaciones progenitores pancreáticas no endocrinas multipotentes (compárese un 90,6 % sin nogina con un 64,6 % con 3 días de tratamiento con nogina). Por el contrario, Cada día adicional de tratamiento con nogina aumentó los niveles de producción de células comprometidas con el linaje endocrino (CHGA+).
TABLA 18: Mayor duración de los efectos de la Nogina en subpoblaciones de células endocrinas a no endocrinas de PEC
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El análisis de QPCR de los cultivos celulares después de la fase 4 (día 12) mostró que, con cada día adicional de tratamiento con Nogina, hubo un aumento en los niveles de expresión del marcador de linaje endocrino, incluyendo NKX2.2 e INS (FIG.31B y D), lo que coincide con los datos de la citometría de flujo de la Tabla 18. Por el contrario, el nivel de expresión de los genes marcadores para la subpoblación progenitora pancreática multipotente no endocrina, incluyendo NKX6.1 (y PDX1), fue relativamente abundante durante cualquier período de tiempo del tratamiento con nogina.
Ejemplo 16
AGENTES QUE MODULAN LA EXPRESIÓN DE LOS GENES DE LINAJE PANCREÁTICO EN LA FASE 7
A continuación, se evaluó si había moduladores adicionales de la expresión génica del linaje pancreático. Se realizaron métodos de diferenciación esencialmente similares a los descritos en los Ejemplos 13 y 14 (es decir, AHW en la fase 3, AH en la fase 4, inhibidores de la gamma secretasa y de la rho-quinasa en la fase 5, Matrigel e inhibidor de la rhoquinasa en las fases 6 y 7). Además, se ensayaron otros agentes para determinar su capacidad para modular la expresión génica incluyendo BMP, Nogina, Fg F1, FGF2, FGF7, EGF, Hrg, HGF, SCF o TTNPB en los días 30-35, durante la fase 7. La expresión de ARN se analizó mediante Nanostring al final de una fase 7 (d35) ampliada. Las FIG.
32A-C muestran que la BMP aumenta la expresión de INS, PDX1 e ID1, Coincidiendo con los datos mostrados en la FIG. 24 y descritos en detalle en el Ejemplo 13. La BMP también disminuyó la expresión de GHRL. El FGF1 (FGF ácido) reguló al alza a GCG y SST. Sorprendentemente, el FGF2 en los días 30-35 de la fase 7 produjo un aumento significativo en la expresión de SST con la inhibición o supresión concomitante de los otros genes de hormonas (por ejemplo, INS, GCG, GHRL; FIG. 32B, panel SST).
Estos estudios demuestran que ciertos agentes todavía pueden modular y afectar a la expresión génica y, por lo tanto, la diferenciación del cultivo celular y el tipo de célula resultante de estas células más diferenciadas/comprometidas.
Ejemplo 17
LOS CULTIVOS CELULARES EN DISOCIACIÓN O REAGRAGACIÓN REDUCEN LAS SUBPOBLACIONES NO ENDOCRINAS (CHGA-) Y AUMENTA ADECUADAMENTE LAS SUBPOBLACIONES ENDOCRINAS (CHGA+)
Anteriormente, se ha observado que la disociación y la agregación de cultivos celulares pueden agotar o reducir eficazmente la presencia de ciertas subpoblaciones de células cuando se vuelven a agregar y, como consecuencia, la reagregación se puede usar para enriquecer ciertas subpoblaciones de células. Se diseñaron estudios para determinar los efectos, si lo hubiera, de cultivos celulares reagregados con sus subpoblaciones enriquecidas, en este caso, subpoblaciones endocrinas (CHGA+). (véase el Ejemplo 14).
Los métodos de diferenciación fueron esencialmente similares a los descritos en el Ejemplo 14, incluyendo la disociación y la reagregación de agregados celulares derivados de hES antes de la fase 7 (d20). La Figura 33A-C muestra el análisis de ARN después de la fase 7 (alrededor del d29) que demuestra que las subpoblaciones no endocrinas (CHGA-) disminuyeron significativamente en los cultivos celulares reagregados como lo demuestra el análisis de Nanostring usando una combinación de marcadores que incluyen PTF1A, SOX9, PDX1 y NKX6.1 (FIG.33A). La Figura 33B también muestra que la agregación dio como resultado un aumento en los marcadores de células de los islotes pancreáticos y endocrinas, incluyendo INS, GCG, polipéptido pancreático (PPY), GHRL, miembro 8 de la familia 30 de vehículos de solutos (SLC30A8), Glucosa-6-fosfatasa 2 (G6PC2), prohormona convertasa 1 (PCSK1) y glucoquinasa (GCK).
En solitario, estos marcadores se observan en otros tipos de células, por ejemplo, PTF1A también se expresa en células exocrinas, SOX9, en células ductales, PDX1 y NKX6.1, en células beta. Por tanto, los solicitantes obtuvieron datos de varios marcadores de PE, endocrinos y de islote como referencia para determinar la significancia de cualquier expresión de marcador. Asimismo, aunque se ensayaron cuatro marcadores de PE y no endocrinos (CHGA-) (PTF1A, s OX9, PDX1 y NKX6.1), solo las subpoblaciones de PTF1A y SOX9 se agotaron de los cultivos celulares reagregados al final de la fase 7 (alrededor del d25, d26, d27, d28, d29, d30 y más). Por el contrario, la expresión de PDX1 y NKX6.1, que también se observa en células beta y pancreáticas endocrinas, permaneció alta después de la fase 7. Véase el documento FIG. 33A.
De manera similar, otros marcadores endocrinos (por ejemplo, células beta y alfa) que incluyen SLC30A8, G6PC2, PCSK1 y GCK se observaron a niveles de expresión más altos en los cultivos celulares reagregados de d20 en comparación con aquellos cultivos que no fueron disociados y reagregados (o "no reag."). Véase el documento FIG.
33C. SLC30A8, por ejemplo, es un transportador de cinc relacionado con la secreción de la insulina, y ciertos alelos de SL30A8 pueden aumentar el riesgo de desarrollar diabetes de tipo 2; La glucosa-6-fosfatasa 2 (G6PC2) es una enzima que se encuentra en los islotes pancreáticos; la prohormona convertasa 1 (PCSK1), junto con PCSK2, procesa la proinsulina a la insulina en los islotes pancreáticos; y, finalmente, la glucoquinasa (GCK) facilita la fosforilación de la glucosa a glucosa-6-fosfato y se expresa en las células del hígado, páncreas, intestino y cerebro, donde regula el metabolismo de los carbohidratos al actuar como un sensor de glucosa, desencadenando cambios en el metabolismo o la función celular en respuesta a niveles crecientes o decrecientes de glucosa, tal como ocurre después de una comida o en ayunas. Las mutaciones de GCK pueden causar formas inusuales de diabetes o hipoglucemia. El aumento de la expresión de estos marcadores en la fase 7 indica que la disociación y la reagregación de los cultivos celulares agotan o reducen de manera eficaz las subpoblaciones no endocrinas (CHGA-) y aumentan las subpoblaciones endocrinas (CHGA+). Por lo tanto, Los solicitantes ahora han perfeccionado aún más un método que produce células endocrinas adecuadamente especificadas in vitro para la función in vivo.
El análisis de citometría de flujo de los cultivos celulares en las fases 1-7 también confirma que la disociación y la reagregación de los cultivos celulares como anteriormente aumenta las subpoblaciones endocrinas totales (enriquecimiento de células CHGA+) con la disminución concomitante de las subpoblaciones no endocrinas (CHGA)-o subpoblaciones de células de PE. Véase la siguiente Tabla 19.
Tabla 19: Los cultivos celulares reagregados aumentan las subpoblaciones endocrinas totales (CHGA+) y disminu en las sub oblaciones no endocrinas CHGA- des ués de la Fase 7
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Hasta ahora, las células beta funcionales solo pueden diferenciarse a través de una fase de trasplante in vivo, y aún no se ha descrito una célula beta funcional auténtica completamente in vitro. Véase Zhou, et al. (2008), Nature 455, 627-632. Por lo tanto, por primera vez, los solicitantes han demostrado una población de células endocrinas (CHGA+) in vitro superior al 50 % que tiene menos del 10 % de células no endocrinas (CHIGA-) y que están debidamente especificadas. Asimismo, dichas células son capaces de desarrollarse y madurar en células beta funcionales auténticas e islotes in vivo; véase el siguiente Ejemplo 18.
Ejemplo 18
PRODUCCIÓN DE INSULINA IN VIVO DESDE LAS SUBPOBLACIONES ENDOCRINAS (CHGA+)
Como estudio de seguimiento del Ejemplo 17, se diseñaron estudios para determinar los efectos in vivo, si los hubiera, de cultivos celulares reagregados con sus subpoblaciones endocrinas enriquecidas (CHGA+).
Se expandieron cultivos de células madre pluripotentes humanas y se diferenciaron de manera esencialmente similar a la descrita anteriormente en los Ejemplos 12-14 y 16 y en Schulz et al. (2012), supra, excepto que, aproximadamente al comienzo de la fase 7 (aproximadamente d20), los cultivos se agruparon y se separaron en 2 muestras: 1) los agregados celulares se disociaron y se volvieron a agregar ("cultivo celular reagregado"); y 2) los agregados celulares que no se disociaron y se volvieron a agregar (el control). Además, ambas muestras incluyeron además BMP, RA o un análogo de RA, TTNPB, y un inhibidor de la rho-quinasa y Matrigel al 0,05 % durante la fase 7 (cultivos de células de d20 a d28). Antes de que se trasplantaran las muestras, se tomaron muestras para el análisis de citometría de flujo y Nanostring (Tabla 19 anterior). La Tabla 19 muestra que el cultivo de células reagregadas a aproximadamente d29 contenía aproximadamente un 11 % más de subpoblaciones endocrinas (CHGA+) que el control. De manera importante, la muestra reagregada contenía un 9,25 % menos de células de tipo no endocrino (CHGA-) o PE (solo 1,45 %) que las muestras que no se volvieron a agregar.
Las dos muestras se cargaron por separado y se encapsularon en los dispositivos de administración de fármacos ENCAPTRA® EN20™ semipermeables, biocompatibles, del solicitante (un dispositivo de investigación del tamaño de un animal), y se trasplantaron por vía subcutánea esencialmente como se describe en el Ejemplo 10 anterior en un total de 10 ratones SCID Beige (5 animales recibieron un cultivo celular reagregado; 5 animales recibieron cultivos celulares de control).
La Figura 34 muestra tras 21 semanas del trasplante, o en la vida, los niveles séricos de péptidos C humanos en ayunas (la primera de las tres barras de la izquierda para cada animal), treinta minutos (30'; segunda barra) y una hora (60'; tercera barra) después de la administración de o la exposición a la glucosa. A las 21 semanas del implante, todos menos dos animales (Animal n.°. 4317 y 4323; uno de cada cohorte) produjeron niveles potentes de insulina según lo observado en su mayoría por encima de 932 a 2691 pM de péptido C en suero humano. Sin embargo, cuando se comparan los índices de estimulación entre los dos grupos (la diferencia entre el nivel sérico de péptido C a los 30' o a los 60' y el nivel de péptido C en suero en ayunas) no hubo diferencia significativa en la función in vivo entre los cultivos de células agregadas y las cohortes de control. Por tanto, si los cultivos o injertos trasplantados consistían en aproximadamente un 98 % de cultivos de células endocrinas/reagregadas CHGA+ o aproximadamente un 87 % de células endocrinas/CHGA+ (Control), ambos parecen tener una función in vivo. Por lo tanto, los solicitantes han demostrado por primera vez que una población de células endocrinas in vitro (CHGA+) (una célula endocrina adecuadamente especificada) puede dar lugar a células secretoras de insulina fisiológicamente funcionales cuando se implantan.
Por lo tanto, por primera vez, los solicitantes han demostrado una población in vitro de células endocrinas adecuadamente especificadas, las cuales, cuando se trasplantan, se desarrollan y maduran hasta células funcionales de los islotes pancreáticos que secretan insulina en respuesta a la glucosa en sangre. Además, la función in vivo es similar a la descrita anteriormente por el solicitante de p Ec y publicada en Schulz et al. (2012), supra. Además, parece que siempre que las células endocrinas debidamente especificadas se hayan fabricado mediante los métodos descritos en el presente documento a través de las fases 1-7, el enriquecimiento adicional de células endocrinas (o el agotamiento de células no endocrinas) a través de la disociación y la agregación no es necesario o requerido para la función in vivo. Estos aspectos de la invención nunca se han demostrado hasta ahora. Hasta la fecha, los solicitantes y otros solo demostraron la función in vivo usando una población de células progenitoras pancreáticas, y no una población de células endocrinas. De hecho, como se describe en Kelly et al. (2011) supra, se muestra que las subpoblaciones endocrinas (CHGA+) de PEC o las preparaciones de células progenitoras pancreáticas no dieron lugar a la función in vivo.
Ejemplo 19
MEDIOS DE BASES COMPLEJOS PARA EL CULTIVO DE CÉLULAS ENDOCRINAS
Los medios de bases complejos, tales como CMRL y RMPI, se usan ampliamente para cultivar células de los islotes y preservar la masa de las células de los islotes. Los medios de CMRL suelen ser más complejos (más componentes o ingredientes) que RPMI. Además, tanto CMRL como RMPI son más complejos que DMEM, un medio de uso común y menos complejo para el cultivo celular. Por lo tanto, los solicitantes exploraron si dichos medios de base complejos serían beneficiosos para mantener las células endocrinas durante las últimas fases de la diferenciación, por ejemplo, fases 6 y 7.
El trasplante de islotes requiere el cultivo y el injerto de islotes con una masa adecuada de células de los islotes y una toxicidad mínima. El cultivo de islotes a corto plazo se ha relacionado con la rápida degradación y la pérdida de viabilidad y el control de la glucosa. Véase, S. Matsumoto, et al. (2003), "A comparative evaluation of culture conditions for short-term maintenance (<24 hr.) of human islets isolated using the Edmonton protocol", Cell Tissue Banking, 4, pág. 85; y N.J.M. Londres, et al. (1998), "Isolation, Culture and Functional Evaluation of Islets of Langerhans", Diabetes & Metabolism, 23, 200-207. En 1978, un estudio de Andersson et al. (1978) comparó la eficacia de TCM, RPMI, CMRL, DMEM y Hams F10 para el cultivo de islotes de ratón. Véase Andersson A. (1978) "Isolated mouse pancreatic islets in culture: Effects of serum and different culture media on the insulin production of the islets", Diabetelogia, 14, 397­ 404. Los resultados de Andersson mostraron que F10 de Ham proporcionaba cultivos de islotes con el mayor contenido de insulina, pero que RMPI proporcionó cultivos con la mejor tasa de biosíntesis de la insulina; y que esto, posiblemente, se debía al alto nivel de glucosa y nicotinamida en los medios. Otros investigadores más, tales como Davalli et al. (1992) mostraron que TCM con adenosina fosfato y xantina eran mejores para el cultivo de islotes porcinos que CMRL y la RMPI. Véase Davalli, A.M. et al. (1992), "In vitro function of adult pig islets: Effect of culture in different media", Transplantation, 60, 854-860. Davalii et al. Sugirieron además que el alto nivel de glucosa encontrado en F10 y RMPI de Ham era posiblemente tóxico para los islotes porcinos. Por consiguiente, los islotes de diferentes especies pueden tener diferentes requisitos de cultivo, y no existe una fórmula adecuada para todas las células endocrinas y de islotes. Véase Andersson (1978), pág. 4 supra.
La siguiente Tabla 20 describe solo aquellos componentes que se encuentran en los medios CMRL, RPMI y DMEM que varían entre cada uno de los tipos de medios, es decir, la Tabla 20 no enumera los componentes compartidos en los 3 tipos de medios base, si no que solo aparecen aquellos componentes que están contenidos en CMRL pero no en RPMI ni/o en DMEM. La Tabla 20 muestra que CMRL es el más complejo (el mayor número de componentes) y DMEM es el menos complejo (el menor número de componentes). S, indica la presencia de ese componente en ese medio base; y N, indica que el componente no está presente en los medios. En resumen, DMEM carece de aproximadamente 7 componentes (N, cajas sombreadas) que están presentes en CMRL y RPMI.
Tabla 20: Com aración de medios de cultivo celular CMRL RPMI DMEM
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(continuación)
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Los métodos de preparación de cultivos de células endocrinas fueron esencialmente similares a los descritos anteriormente, excepto que, durante la fase 6 (d15), o la fase media 7 (d23), o la fase media 7 (d26), o las fases 6 y 7 (d15 a d25), se usaron medios base DMEM o CMRL. Además, algunos cultivos recibieron insulina como factor de crecimiento (IGF), nicotinamida (NC), glucosa (Glc) y/o un inhibidor de la rho-quinasa (Y-27632).
En un experimento, las células de la fase 7, comenzando alrededor del d23, se cultivaron en medios base CMRL o DMEM con suplemento B27, Matrigel, BMP, IGF e Y-27632. El análisis de Nanostring de muestras d26 (fase 7) mostró que, en general, las células en fase 7 cultivadas en CMRL habían aumentado la expresión génica no específica de marcadores endocrinos tanto hormonales como pancreáticos en comparación con las células en la mismo fase cuando se cultivaron en DMEM. Véanse las FIG. 35A-C. Así pues, CMRL puede ser importante para el mantenimiento de las células endocrinas.
Los estudios correspondientes también se realizaron usando RPMI en comparación con los medios basados en DMEM y en CMRL (datos no mostrados). Los medios CMRL y RMPI tuvieron efectos similares en los cultivos celulares, y ambos mejoraron con respecto al DMEM, por lo tanto, los componentes que no están presentes en DMEM y están presentes tanto en CMRL como en RPMI pueden ser importantes para el mantenimiento de las células endocrinas durante la fase 6 y/o 7, incluido el glutatión reducido, aminoácidos, hidroxil-L-prolina, L-prolina, ácido L-aspártico, ácido L-glutámico y vitaminas, biotina y ácido para-aminobenzoico.
Ejemplo 20
LA CRIOCONERVACIÓN NO REDUCE LOS NÚMEROS CELULARES ENDOCRINOS
Una terapia celular viable en el mercado requerirá una fabricación a mayor escala del producto celular y un medio para almacenar el producto a largo plazo según las necesidades demandadas por los pacientes. Por consiguiente, cualquier producto celular, ya sean las células solas o las encapsuladas, tal como el dispositivo de administración de fármacos ENCAPTRA®, puede necesitar ser crioconservado o tener otros medios para el almacenamiento a largo plazo sin efectos perjudiciales o tóxicos para las células; y sin afectar al efecto terapéutico de las células o, en este caso, a la producción in vivo de insulina en respuesta a la glucosa en sangre. Por lo tanto, los solicitantes investigaron si las células endocrinas crioconservadas en fase 7 mantienen su capacidad de desarrollarse y funcionar in vivo de manera similar a la observada para PEC recién preparadas (no crioconservadas) y crioconservadas como se describe en detalle en las patentes de EE. UU. n.° 8.278.106 y 8.425.928, ambas tituladas, "ENCAPSULATION OF PANCREATIC CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS", emitidas el 2 de octubre de 2012 y el 23 de abril de 2013, respectivamente; y Solicitud de EE.UU. n.° 61/775.480, Titulada "CRYOPRESERVATION, HIBERNATION AND ROOM TERMPERATURE STORAGE OF ENCAPSULATED PANCREATIC ENDODERM CELL AGGREGATES", presentada el 7 de marzo de 2013, y Kroon et al (2008) supra.
Los métodos de preparación de cultivos de células endocrinas fueron esencialmente similares a los descritos anteriormente, excepto que los cultivos de células estaban todos en medios basados en CMRL durante la fase 7 y se dividieron en las siguientes muestras: 1) No disociada o reagregada, pero crioconservada aproximadamente el día 23 durante varias horas y luego descongelada y cultivada durante varios días en medio base de CMRL con suplemento de B27, BMP, TTNPB, y un inhibidor de la rho-quinasa (No reag./crioconservada); 2) No disociada o reagregada y no crioconservada (No reag./No crioconservada); y 3) Disociada y reagregada y no crioconservada (Reag./No crioconservada). Las 3 muestras anteriores se cultivaron en las mismas condiciones de los medios de la fase 7. Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo el día 27. Véase la siguiente Tabla 21.
Tabla 21: Análisis de citometría de flujo de células endocrinas crioconservadas, recién preparadas y rea re adas de fase 7.
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Basándose en el análisis de citometría de flujo de la Tabla 21, para aquellos cultivos que no fueron disociados o reagregados (muestras 1 y 2), la crioconservación de las células (muestra 2) no reduce el número total de células endocrinas (CHGA+) en comparación con las células recién preparadas (muestra 1) (88,57 frente a 89,97). Como era de esperar, la población endocrina total (CHGA+) es mayor en los cultivos que se han disociado y reagregado, y no crioconservado (92,85). Por lo tanto, la disociación y la reagregación afectan a los números de células endocrinas (CHGA+), como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 17, pero la crioconservación de los cultivos de la fase 7 no parece alterar la composición celular.
Además, las muestras se analizaron usando inmunohistoquímica celular con tinción para NKX6.1, péptido C, INS y GCG. Véanse las FIG. 36A-B. Los agregados de células endocrinas (CHGA+) de la fase 7 (No reag./No crioconservada; muestra 2) mostraron expresión conjunta o tinción conjunta de NKX6.1 (nuclear) y péptido C (citoplasmática) (FIG. 36A-C). No se observó tinción conjunta en análisis similares de PEC de un protocolo de diferenciación de fase 4. Los cultivos celulares de la fase 7 también fueron principalmente hormonales, como puede observarse en la FIG. 36A-C, que muestra la tinción separada de células con INS (36A; citoplasmática) y GCG (36B; citoplásmica), es decir, la mayoría de las células individuales no expresaron conjuntamente INS y g Cg como se observa con las subpoblaciones endocrinas (CHGA+) de PEC de la fase 4. La FIG. 37 muestra fotomicrografías con patrones de tinción similares, pero de cultivos celulares que se habían disociado y reagregado al inicio de la fase 7.
La Figura 37 compara la función del injerto de los cultivos celulares 1 y 3 de la Tabla 20 anterior. El análisis de la función in vivo de los injertos de la fase 7 trasplantados de ambas cohortes de animales a las 12 semanas mostró que los cultivos que se habían crioconservado, pero que no se habían reagregado (muestra 1) tenían niveles de péptido C en suero similares 30 y 60 minutos después de la exposición a la glucosa en comparación con aquellos cultivos que no se habían crioconservado, pero que se habían reagregado (muestra 3). Estos niveles de péptido C son comparables a los observados para las semanas 10 y 15 en las Fig. 20 y 21 (por ejemplo, en la semana 15, el nivel medio de péptido C fue de 995 pM a los sesenta minutos después de la administración de glucosa). Por tanto, se espera y se anticipa que un análisis posterior mostrará que los niveles de péptido C aumentarán por encima de 1.000 pM a los 30 y/o 60 minutos, en la mayoría de los animales, de la estimulación con glucosa de manera similar a la descrita en el Ejemplo 18 y observada en la FIG. 34. De hecho, el animal n.° 4490, un injerto de la Muestra 1, tenían niveles de péptido C en suero a las 12 semanas que eran comparables a los del animal n.° 4320 del Ejemplo 18 (Figura 34) después de 21 semanas del implante.
Por lo tanto, las células endocrinas de la fase 7 en crioconservación no parecen afectar a su función in vivo.
Ejemplo 21
EL AUMENTO DE LAS CONCENTRACIONES DE GLUCOSA AFECTA A LA EXPRESIÓN DE HORMONAS
Los niveles de glucosa en las formulaciones de cultivos celulares varían de 1 g/l (5,5 mM) a 10 g/l (55 mM), y algunos medios tienen aproximadamente 5,5 mM de glucosa, lo que se aproxima a los niveles normales de azúcar en sangre in vivo. Los niveles de glucosa que se acercan a 10 mM son niveles prediabéticos, y aquellos por encima de 10 mM son análogos a una afección diabética. Dicho de otra manera, la glucosa por encima de 10 mM imita las condiciones hiperglucémicas in vivo. El alto nivel de glucosa puede causar, por ejemplo, modificaciones secundarias posteriores a la traducción, que incluyen la glicación, glioxidación y estrés carbonílico. Dado que los informes de los efectos del alto nivel de glucosa en diferentes tipos de células in vitro varían, los solicitantes buscaron estudiar los efectos del alto nivel de glucosa (es decir, 4,5 g/l o 24,98 mM de glucosa) en las células endocrinas en fase 6 y/o 7.
La glucosa es un azúcar hexosa soluble que se añade a todos los medios de cultivo celular, incluyendo el Medio de Ames; Medio basal de Eagle (BME); Modificación de Fitton-Jackson del medio de BGJb; Medio de Click; medio CMRL-1066; medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM); DMEM/Mezcla de nutrientes de Ham F-12 (50:50); Modificación de F-12 de Coon; Medio de Fischer; Medio H-Y (Hybri-Max®); Medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM); Medio Modificado 5A de McCoy; Medio MCDB; Medio 199; Medio Mínimo Esencial de Eagle (EMEM); Medio NCTC; Mezcla de nutrientes, F-10 de Ham; Mezcla de nutrientes, F-12 de Ham; Modificación de Kaighn de la Mezcla de nutrientes de Ham F-12 (F12K); RPMI-1640; Medio de hibridoma sin suero/sin proteínas; Medio MB de Waymouth; Medio E de Williams y varios medios patentados. El medio L-15 contiene galactosa en lugar de glucosa. Véase "Sigma-Aldrich Media Expert", disponible en Internet en sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/mediaexpert/ glucose.html.
Los medios que contienen niveles de suplementos de glucosa superiores a 10 mM incluyen al menos DMEM/mezcla de nutrientes de Ham F-12 (50:50) que contiene 17,5 mM de glucosa; DMEM (alto nivel de glucosa), GMEM y IMDM contienen niveles de glucosa de 25 mM; y el medio HY (Hybri-Max®) y el medio de hibridoma sin suero/sin proteínas contienen 22,6 y 28,9 mM de glucosa, respectivamente. Véase "Sigma-Aldrich Media Expert", disponible en Internet en sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/glucose.html. Debido a que los diferentes medios de cultivo celular contienen niveles muy diferentes de glucosa, y los efectos de la glucosa en general varían de un sistema de cultivo celular al siguiente, se estudiaron los efectos del alto nivel de glucosa en las células endocrinas.
De nuevo, los métodos de preparación de cultivos de células endocrinas fueron esencialmente similares a los descritos anteriormente, excepto durante las fases 6 y/o 7, los cultivos celulares se trataron con medio base de CMRL con y sin alto contenido de glucosa (concentración de glucosa total 4,5 g/l, o 25 mM). Por tanto, esto es 3,5 g/l además de los 1.000 mg/l o 1 g/l (5,5 mM) de glucosa ya encontrados en los medios CMRL. Ambas condiciones con y sin glucosa exógena se trataron con los mismos factores de crecimiento, incluyendo nicotinamida, BMP, RA (o TTNPB) y, como alternativa, un inhibidor de la rho-quinasa y Matrigel. El análisis Nanostring mostró que, cuando se añadió un alto contenido de glucosa al inicio de la fase 6, al final de la fase 6 hubo una mayor expresión de INS, GCG y SST, y una disminución de la expresión de GHRL (FIG. 39A y B). Por lo tanto, el aumento de la glucosa exógena durante las fases 6 y 7, a excepción de Grelina, aumenta la expresión hormonal.
Ejemplo 22
PRODUCCIÓN DE CÉLULAS BETA INMADURAS
Los Ejemplos 8-21 describen diversos métodos iterativos para la producción de células endocrinas in vitro, incluyendo el uso de alto nivel de Activina sola o combinada con Wnt y/o Heregulina en la fase 3; bajo nivel de Activina en la fase 4 sola o combinada con Heregulina; Nogina y un inhibidor de la gamma secretasa con o sin KGF, EGF y un inhibidor de la rho-quinasa en la fase 5; y una o más de los siguientes entre nicotinamida, ácido retinoico, BMP y Matrigel en las fases 6-7. Las poblaciones de células endocrinas producidas a partir de dichos métodos no son de una sola hormona (por ejemplo, Solo INS, solo GCG o solo SST); véase la FIG. 39), sino que también expresan conjuntamente otros marcadores de células endocrinas inmaduras, incluyendo NKX6.1 y PDX1.
Se realizó un análisis de citometría de flujo en dos cultivos de fase 7 diferentes usando tinción con hormona INS, SST y GCG (conjunto de datos A y conjunto de datos B). El conjunto de datos (A) se realizó después de examinar varias iteraciones de las fases 1-7, y el otro conjunto de datos (B) se realizó antes en el tiempo, por ejemplo, en ausencia de nicotinamida, BMP, CMRL y similares. Véase la siguiente Tabla 22. La Tabla 22 muestra los porcentajes totales de la tinción positiva en INS, SST y GCG (véanse 5 columnas de la izquierda), la tinción negativa total en iNs , SST y GCG (véanse 5 columnas a la derecha) y la tinción de una sola hormona (véase la columna central). La tinción hormonal de estos dos conjuntos de datos (A y B) se compara con la obtenida a partir de cultivos de PEC en fase 4 que se habían mantenido en cultivo hasta aproximadamente el día 26.
Tabla 22: Comparación de células que expresan hormonas de la Fase 7 y la Fase 4 (PEC)
Citometría de flujo de hormonas (A) de la Fase 7 (d27)
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Citometría de flujo de hormonas (B) de Fase 7 (d29)
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(continuación)
Citometría de flujo de hormonas (B) de Fase 7 (d29)
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Citometría de flujo de hormonas (PEC) en Fase 4 (d26)
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En general, la subpoblación positiva total en INS (la suma de células solo positivas para INS más positivas conjuntamente para INS/SST más positivas conjuntamente para INS/GCG más positivas conjuntamente para INS/SST/GCG) es tanto como el triple en los cultivos endocrinos en fase 7 en comparación con los cultivos de PEC en fase 4 (49,3 frente a 22,7 frente a 15,8). Por consiguiente, la subpoblación total de INS solo (sin expresión conjunta con SST o GCG) también es mayor para los cultivos endocrinos en fase 7 que para los cultivos de PEC en fase 4 (22,7 frente a 12,9 frente a 3,7). De manera importante, los cultivos en fase 7 tienen más células que solo expresan la hormona INS como porcentaje de la población total de INS (22,7/49,3 = 46 % en A y 12,7/22,7 = ~ 57 % en B) en comparación con los cultivos de PEC en fase 4 (3,7/15,8 = 23 %). Por consiguiente, parece que los cultivos de células endocrinas en fase 7 consisten en más células que expresan una sola hormona, particularmente, células que solo expresan INS, que los cultivos de PEC en fase 4. Y al menos los Ejemplos 18 y 20 demuestran que las células endocrinas en fase 7, aunque todavía son inmaduras, se desarrollan y maduran a islotes pancreáticos fisiológicamente funcionales capaces de secretar insulina en respuesta a la glucosa en sangre cuando se trasplantan; mientras que las subpoblaciones endocrinas (CHGA+) de los cultivos de PEC en fase 4 no son capaces de hacerlo in vivo. Para más información, véanse la FIG. 44 y 45 y los ejemplos anteriores.
Ejemplo 23
LAS CÉLULAS ENDOCRINAS (CHGA+) DE LA FASE 7 Y LA FASE 4 (PEC) SE DISTINGUEN ENTRE SÍ
Aunque el análisis de los cultivos en fase 7 (células endocrinas adecuadamente especificadas) y en fase 4 (PEC) usan los mismos anticuerpos (por ejemplo, CHGA, INS, NKX6.1) para la tinción celular y los análisis, las subpoblaciones de células endocrinas (CHGA+) debidamente especificadas en fases 7 y 4 (PEC) no son iguales.
Previamente, los solicitantes informaron que el origen de las células beta funcionales observadas después del trasplante de los cultivos de PEC en fase 4 se debía a células progenitoras pancreáticas o no endocrinas (CHGA-) y no a las células endocrinas primarias (CHGA+). Kelly et al. (2011), supra, demostraron que cuando los cultivos de PEC se enriquecieron (purificaron) en subpoblaciones endocrinas (CHGA+) y se trasplantaron, no dieron lugar a islotes pancreáticos funcionales ni a células beta en comparación con los cultivos de PEC no enriquecidos. Véase Kelly et al (2011), pág.3-4, La FIG. 4 y la Tabla 1 complementaria; Schulz et al. (2012) supra; y las patentes de EE.UU. n.° 7.534.608; 7.695.965; 7993920; y 8.278.106. Los ejemplos 17 y 18 y la Tabla 19 describieron un cultivo de células endocrinas (CHGA+) casi puras (98,2 %) en fase 7 que, cuando se trasplantó, dio como resultado un injerto funcional robusto in vivo (FIG. 34). En vista de los Ejemplos 17 y 18 y de otros resultados descritos en el presente documento, la población funcional de los cultivos en fase 7 son las células endocrinas (CHGA+) en fase 7 y no el porcentaje significativamente menor de células no endocrinas (CHGA-) (2,08 %). Esto está en contraste con los cultivos de PEC en fase 4, sobre el que el solicitante había informado en detalle en divulgaciones anteriores, en el que la función in vivo se atribuye a las subpoblaciones no endocrinas (CHGA-). Por lo tanto, en general, las subpoblaciones endocrinas en fases 7 y 4 no son comparables ni iguales.
La Tabla 23 muestra los datos de citometría de flujo que comparan la subpoblación endocrina total (CHGA+) y la no endocrina (CHGA-) en fase 7 (endocrina adecuadamente especificada) y fase 4 (PEC), y demuestra que las subpoblaciones no son equivalentes y que se distinguen entre sí. Por ejemplo, el porcentaje total de subpoblación CHGA+ fue significativamente mayor en los cultivos en fase 7 en comparación con los cultivos en fase 4 (85,2 frente a 39,4). Por consiguiente, el porcentaje total de la subpoblación CHGA- fue significativamente menor en los cultivos en fase 7 en comparación con los cultivos en fase 4 (14,8 frente a 60,1). Además, las verdaderas células endocrinas, por ejemplo, las células beta, no solo expresan CHGA+ sino que también expresan al menos INS y NKX6.1. Por lo tanto, una verdadera célula endocrina expresa CHGA+/INS+/NKX6.1+ (triple positiva) y es capaz de funcionar in vivo. La Tabla 23 muestra que los cultivos en fase 7 tenían casi 5 veces más células CHGA+/INS+/NKX6.1+ (triple positivas) que los cultivos en fase 4 (37,8 frente a 7,8); y aunque las subpoblaciones CHGA+/INS+/NKX6.1+ en fase 4 pueden aparecer correctamente especificadas, tal como se ha tratado anteriormente, estas subpoblaciones endocrinas en fase 4 no funcionan in vivo cuando se trasplantan, mientras que las subpoblaciones no endocrinas (CHGA-) en fase 4 maduran y funcionan in vivo. Por lo tanto, los solicitantes se refieren a las células endocrinas en fase 7 como "células endocrinas inmaduras" o "células beta inmaduras" y no como células progenitoras/precursoras endocrinas, ya que estas células están comprometidas evolutivamente para convertirse en células beta maduras in vivo.
Tabla 23: Comparación de células endocrinas (CHGA+) y no endocrinas (CHGA-) de las fases 7 y 4 (PEC)
Citometría de flujo de células endocrinas/no endocrinas en Fase 7
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Citometría de flujo de células endocrinas/no endocrinas en Fase 4
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Ejemplo 24
PURIFICACIÓN DE CÉLULAS ENDOCRINAS DE POBLACIONES DE CÉLULAS EN FASE 7 USANDO UN SENSOR DE CINC
Las vesículas secretoras de células beta contienen altas concentraciones de cinc. El cinc se acumula en las vesículas al menos por la acción del transportador de cinc SLC30A8 (o ZnT8). Las sondas fluorescentes de unión al cinc se han usado para visualizar el cinc en las células al absorber y emitir más luz a longitudes de onda específicas cuando se unen con el cinc que sin el cinc. No obstante, los informes muestran que la mayoría de las sondas pueden no localizarse correctamente para detectar cinc dentro de las vesículas de células beta. Curiosamente, PyDPy1 (o Py1; Chemical Communications, 2011, 47: 7107-9) puede entrar en las vesículas, pero no se ha usado con células beta hasta la fecha. Py1 aumenta la intensidad de la fluorescencia x50-80 cuando se une a Zn2+. Por primera vez, los solicitantes han demostrado la producción de una célula endocrina o célula beta inmadura, población capaz de funcionar in vivo. Por lo tanto, es ventajoso contar con un medio para enriquecer aún más esta población para fines de análisis in vitro adicionales, para usar como herramienta de detección, o para proporcionar una población de células beta inmaduras enriquecida para el trasplante.
Se trataron células endocrinas o células beta inmaduras en fase 7 con Py1, y las células se clasificaron mediante fluorescencia para determinar aquellas con alto contenido de cinc. Se volvió a suspender un sensor de cinc Py1 (personalizado sintetizado por ChemoGenics Biopharma, Research Triangle Park, NC) a 10 mM en DMSO y se diluyó en DPBS (-/-)/BSA al 0,25 % (tampón A) a concentración final 5 micromolar (solución de tinción). Se lavaron agregados de células en fase 7 diferenciados dos veces con DPBS (-/-) y se disociaron con Accumax. El Accumax se inactivó con la adición de medio base que contenía B-27. La suspensión celular resultante se filtró a través de una malla de 40 micrómetros, se centrifugó, se lavó en tampón A y se volvió a suspender en solución de tinción. La tinción se prosiguió durante 15 minutos, las células se centrifugaron, se lavaron en tampón A y se volvieron a suspender en tampón A para la clasificación. Las células se clasificaron mediante citometría de flujo en CMRL/FBS al 50 % a 4 °C. Tras la clasificación, las células se centrifugaron y se volvieron a suspender en tampón de aislamiento de ARN.
En los resultados mostrados en la FIG. 40, las células englobadas o seleccionadas por el polígono son células vivas que tienen una fluorescencia aumentada debido a la presencia de un sensor Py1 unido a cinc. Esta población de células se dividió en dos ventanas de análisis aproximadamente iguales y se clasificó en dos tubos, denominados brillante y oscura según su intensidad de fluorescencia. Se preparó ARN a partir de las células y se sometió a un análisis de Nanostring.
Como se ve en las FIG. 42A-C, la población oscura se enriquece en los marcadores del linaje de células beta tales como INS, IAPP, PDX1, NKX6.1, PAX4, PCSK1, G6PC2, GCK y SLC30A8. Esto indica que las células beta o las células beta inmaduras se pueden purificar a partir de una población de células en fase 7 usando un sensor de cinc. Un experimento previo determinó que 630.000 unidades de ARNm de INS por Nanostring corresponden al aproximadamente 49 % de células positivas en INS por citometría de flujo (datos no mostrados). Por lo tanto, una población oscura purificada que tiene un valor de Nanostring para INS de 1.200.000, correspondería al aproximadamente 93 % de células positivas en INS (1.200.000/630.000 x 49 %).
Por el contrario, la población clasificada como brillante se enriqueció con marcadores del linaje de células alfa tales como GCG, ARX y SLC30A8 (FIG. 41, 42, 43). Y de manera similar a las células beta, también se sabe que las células de glucagón absorben el cinc. Por tanto, se puede usar el sensor Py1 para unir el cinc en las células beta y de glucagón, pero separarse o clasificarse por sus diferentes niveles de fluorescencia.
Resumen de los métodos de preparación de cultivos de PEC (fases 1-4) y células endocrinas (fases 1-7)
En resumen, las invenciones descritas en el presente documento están dirigidas a al menos PEC y células endocrinas inmaduras y a métodos de fabricación de dichas células que comprenden al menos las fases 1-4 para la producción de PEC, y las fases 1-7 para la producción de células endocrinas. Las Figuras 43, 44 y 45 son diagramas que resumen ciertos aspectos de las composiciones celulares del solicitante y DE los métodos de producción descritos en el presente documento.
Los solicitantes han informado previamente que las subpoblaciones endocrinas (CHGA+) que siguen un protocolo de diferenciación en fase 4 no se convierten en células de islotes pancreáticos maduras y funcionales cuando se trasplantan in vivo. Véase el tipo de célula "EN" después de la fase 4 en la FIG.43 y 44. Estas subpoblaciones endocrinas (CHGA+) tuvieron una expresión temprana o prematura de NGN3 (expresión de NGN3 antes de la expresión conjunta de PDX1 y NKX6.1). Véase también Rukstalis et al. (2009), supra. Por el contrario, las subpoblaciones no endocrinas (CHGA-) de PEC que no expresaron NGN3 se desarrollan y maduran en células endocrinas in vivo. Este retraso en la expresión de NGN3 hasta después de la maduración in vivo de subpoblaciones no endocrinas (CHGA-) de PEC se mostró en el Ejemplo 10 (FIG. 15-16) donde la combinación de Activina, Wnt y Heregulina reprimieron eficazmente NGN3 en comparación con el control, y el trasplante de este PEC en comparación con el control mejoró la función in vivo. Véanse las FIG. 15-16.
Los solicitantes intentaron obtener un cultivo celular endocrino adecuadamente especificado que fuera capaz de desarrollarse y madurar a los islotes pancreáticos in vivo y producir insulina en respuesta a niveles de glucosa en sangre similares a los observados en todos los casos con p Ec , específicamente la subpoblación no endocrina (CHGA-) de PEC. Con este fin, los solicitantes realizaron muchos experimentos iterativos para suprimir o inhibir la expresión de NGN3 en las fases 3 y 4. Los Ejemplos 8 a 11 describen en detalle el uso de Activina por el solicitante sola o en combinación con otros agentes tales como Wnt y Heregulina, y a diversas concentraciones, para afectar a la expresión o supresión de NGN3. La FIG. 44 también resume el efecto de la Activina en las fases 3 y 4.
Una vez que se demostró que la expresión de NGN3 podría retrasarse y que no afectaba a la función in vivo, los solicitantes investigaron métodos para inducir la expresión de marcadores endocrinos en fases posteriores a la formación de PEC (fase 4). Los Ejemplos 11-14 y 16-22 describen las numerosas iteraciones y los métodos empleados para optimizar las condiciones de cultivo para producir poblaciones endocrinas adecuadamente especificadas que pudieran dar lugar a una función in vivo. Específicamente, el solicitante usó un inhibidor de la gamma secretasa en fase 5 para inducir la expresión de NGN3 y la diferenciación endocrina. El solicitante usó reactivos tales como CMRL en las fases 6 y 7 para aumentar la expresión del marcador endocrino; BMP para aumentar INS y PDX1. Las Figuras 44 y 45 resumen y describen estos esfuerzos.
Se apreciará que, inicialmente, se requiere el uso de múltiples metodologías para caracterizar e identificar células (por ejemplo, Q-PCR, ICC, análisis de citometría de flujo, Ensayos de péptido C y similares). Tras haberse caracterizado e identificado completamente dichas células en ciertas condiciones de cultivo de diferenciación de células, Normalmente se usaron la Q-PCR y el ARN multiplexado de Nanostring como métodos únicos para analizar si se había obtenido dicho tipo de célula.
Los métodos, las composiciones y los dispositivos descritos en el presente documento son actualmente representativos de realizaciones preferidas, y son ilustrativos y no pretenden ser limitaciones del alcance de la invención. A los expertos en la materia se les ocurrirán cambios y otros usos que están definidos por el alcance de la divulgación. Por consiguiente, será evidente para un experto en la materia que pueden realizarse sustituciones y modificaciones variables de la invención desvelada en el presente documento.
Como se usa en las siguientes reivindicaciones y en toda la presente divulgación, La expresión "que consiste esencialmente en" significa que incluye cualquier elemento enumerado después de la expresión y se limita a otros elementos que no interfieren ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la divulgación de los elementos enumerados. Por lo tanto, la expresión "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan o no a la actividad o acción de los elementos enumerados. Asimismo, se apreciará que, en realizaciones en las que se mencionan valores numéricos, tales como cantidades, concentraciones, porcentajes, proporciones o intervalos, el valor al que se hace referencia puede ser "al menos aproximadamente" el valor numérico, "aproximadamente" el valor numérico o "al menos" el valor numérico.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir una célula beta inmadura humana unipotente que comprende: poner en contacto células del linaje endodérmico definitivo humano in vitro con un miembro de la superfamilia de TGFp y un miembro de la familia de Wnt, produciendo así una célula beta inmadura humana unipotente.
2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha célula beta inmadura humana unipotente expresa INS, NKX6.1, y no expresa sustancialmente NGN3.
3. El método de la reivindicación 1, en el que dicha célula beta inmadura unipotente expresa INS, NKX6.1 y MAFB, y no expresa sustancialmente NGN3.
4. El método de la reivindicación 1, que comprende además poner en contacto las células del linaje endodérmico definitivo humano in vitro con una Heregulina.
5. El método de la reivindicación 1, en el que el miembro de la superfamilia de TGFp es Activina A.
6. El método de la reivindicación 1, en el que el miembro de la familia de Wnt es Wnt3a.
7. El método de la reivindicación 4, en el que la Heregulina es Heregulina-1, Heregulina-2, Heregulina-3 o Heregulina-4.
8. El método de la reivindicación 1, en el que las células del linaje endodérmico definitivo humano se ponen en contacto con al menos 50 ng/ml del miembro de la superfamilia de TGFp.
9. El método de la reivindicación 1, en el que las células del linaje endodérmico definitivo humano se ponen en contacto con al menos 25 ng/ml del miembro de la familia de Wnt.
10. El método de la reivindicación 4, en el que las células del linaje endodérmico definitivo humano se ponen en contacto con 5-15 veces menos de Heregulina que el miembro de la superfamilia de TGFp y el miembro de la familia de Wnt.
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