WO2015178431A1 - 膵芽細胞の製造方法および膵芽細胞を含む膵疾患治療剤 - Google Patents

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健二 長船
太郎 豊田
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing pancreatic blasts and a therapeutic agent for pancreatic diseases comprising pancreatic blasts produced by the method.
  • the present application further relates to a method for treating pancreatic disease using the pancreatic blast.
  • pancreas functions as an exocrine gland that secretes digestive enzymes such as pancreatic lipase, trypsin, elastase, pancreatic amylase, and an endocrine gland that secretes pancreatic hormones such as glucagon, insulin, somatostatin, and pancreatic polypeptide (PP).
  • pancreatic hormones such as glucagon, insulin, somatostatin, and pancreatic polypeptide (PP).
  • ghrelin a gastric secretion hormone
  • This pancreatic hormone is produced by a cell mass called a pancreatic islet composed of four types of cells, ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells and PP cells in the pancreas.
  • insulin plays an important role in promoting glucose utilization, protein synthesis, neutral fat formation and storage, lowering blood glucose level, and maintaining blood sugar at the correct concentration.
  • Glucagon plays an important role in the regulation mechanism of glucose metabolism along with insulin as a blood glucose-elevating hormone through liver glycolysis and gluconeogenesis.
  • Somatostatin exerts its action through binding to the somatostatin receptor and suppresses the secretion of various hormones such as glucagon and insulin in the pancreas.
  • PP is a hormone secreted from cells of the islets of Langerhans in response to food intake, known as a satiety factor, and functions to suppress food intake and reduce weight gain.
  • Ghrelin is known to increase body weight by stimulating food intake and reducing fat oxidation.
  • Diabetes mellitus is a disease that develops when insulin is deficient or loses its function, and once it develops, it is difficult to cure. Diabetes can be broadly classified into two types: type 1 diabetes (insulin-dependent diabetes) and type 2 diabetes (non-insulin-dependent diabetes).
  • Type 2 diabetes is a chronic disease that develops by acquiring resistance to insulin, and is a diabetes whose lifestyle is considered to be an onset mechanism such as obesity and stress caused by overeating and lack of exercise. Type 2 diabetes often develops in middle and old age, and many diabetic patients suffer from type 2 diabetes.
  • type 1 diabetes is a disease caused by destruction of ⁇ cells (insulin producing cells) due to autoimmune diseases, viral infections, etc., and insulin is not secreted into the body.
  • Symptomatic treatment by insulin administration is mainly performed, but pancreas transplantation or islet transplantation is also performed as a treatment method that can automatically control blood glucose level constantly changing in the body and reduce the burden on the patient .
  • pancreas transplantation or islet transplantation is also performed as a treatment method that can automatically control blood glucose level constantly changing in the body and reduce the burden on the patient .
  • pancreas transplantation or islet transplantation is also performed as a treatment method that can automatically control blood glucose level constantly changing in the body and reduce the burden on the patient .
  • the current situation is that there is a lack of transplantable pancreas or islets.
  • the patient needs to continue to take the immunosuppressant throughout the life, and problems such as the risk of infection and side effects due to the immunosuppressant remain.
  • Insulin-producing cells can be obtained, for example, by taking the patient's pancreatic duct epithelium-derived cells out of the body and differentiating them.
  • Non-Patent Documents 1 to 5 a method of inducing differentiation of pluripotent stem cells such as embryonic stem (ES) cells and induced pluripotent stem (iPS) cells using activin or retinoic acid (RA)
  • ES embryonic stem
  • iPS induced pluripotent stem
  • RA retinoic acid
  • Patent Document 2 and Patent Document 3 a method of introducing PDX1 into pluripotent stem cells and culturing
  • Patent Document 4 and Non-Patent Document 6 a method of producing insulin-producing cells by acting on pluripotent stem cells by appropriately combining low molecular compounds
  • insulin-producing cells obtained in vitro in this way were administered in vivo to acquire glucose responsiveness.
  • pancreatic progenitor cells were produced and administered in vivo, insulin was secreted from the administered cells according to the glucose concentration (Non-patent Documents 7 and 8).
  • JP 2009-225661 A US Pat. No. 7,534,608 JP 2006-075022 A WO2011 / 082122
  • the present application aims to provide a method for inducing differentiation of pancreatic blasts from PDX1-positive NKX6.1-negative cells. More specifically, an object of the present invention is to provide a method for inducing differentiation of pancreatic blasts, including a step of further differentiating PDX1-positive NKX6.1-negative cells derived from pluripotent stem cells. Another object of the present invention is to provide a therapeutic agent for pancreatic disease and a method for treating pancreatic disease.
  • PDX1-positive NKX6.1-negative cells are cultured in a medium containing KGF, EGF and BMP inhibitors under conditions where cell aggregates are generated. It was found for the first time that pancreatic blasts can be induced to differentiate by culturing. The present invention has been completed based on such knowledge.
  • the present invention has the following features: [1] A method for producing pancreatic blasts, comprising culturing PDX1-positive NKX6.1-negative cells in a medium containing KGF, EGF and a BMP inhibitor. [2] The method according to [1], wherein the medium further contains a ROCK inhibitor or a non-muscle myosin II inhibitor. [3] In the above [2], the ROCK inhibitor or non-muscle myosin II inhibitor is any one compound selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil, SR3677, GSK269962, H-1152 and Blebbistatin. The method described.
  • [4] The method according to any one of [2] or [3], wherein the culture is performed under adhesion culture conditions.
  • [5] The method according to [1], wherein the culturing is performed under conditions where a cell aggregate is generated.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the PDX1-positive NKX6.1-negative cell is a cell produced from a pluripotent stem cell by a method comprising the following two steps. : (1) a step of culturing pluripotent stem cells in a medium containing activin, and (2) a step of culturing the cells obtained in step (1) in a medium containing KGF.
  • the medium containing activin further contains a GSK3 inhibitor.
  • the medium containing KGF further contains a BMP inhibitor, a retinoic acid derivative, and a hedgehog pathway inhibitor.
  • the BMP inhibitor is Noggin.
  • the GSK3 inhibitor is CHIR99021.
  • the retinoic acid derivative is TTNPB.
  • a method for producing pancreatic blasts from pluripotent stem cells comprising the following steps (i) to (iii): (I) culturing pluripotent stem cells in a medium containing activin, (Ii) culturing the cells obtained in step (i) in a medium containing KGF; (Iii) A step of separating the cells obtained in step (ii) into single cells and culturing them in a medium containing KGF, EGF and BMP inhibitor.
  • the medium containing KGF, EGF and BMP inhibitor used in the step (iii) is a medium further containing a ROCK inhibitor or a non-muscle myosin II inhibitor.
  • the ROCK inhibitor or the non-muscle myosin II inhibitor is any one compound selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil, SR3677, GSK269962, H-1152 and Blebbistatin.
  • the cells are separated into single cells, cultured in a medium containing KGF, a BMP inhibitor, a retinoic acid derivative and a hedgehog pathway inhibitor, and then cultured in a medium containing KGF, EGF and BMP inhibitor.
  • a therapeutic agent for pancreatic disease comprising pancreatic blasts produced by the method according to any one of [1] to [28].
  • the therapeutic agent according to [29], wherein the pancreatic disease is diabetes.
  • the therapeutic agent according to [30], wherein the diabetes is type 1 diabetes.
  • a method for treating pancreatic disease comprising transplanting pancreatic blasts produced by the method according to any one of [1] to [28] to a subject in need of treatment for pancreatic disease.
  • pancreatoblasts produced by the method provided in the present application can be used for regenerative medicine for pancreatic diseases such as diabetes.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a protocol for producing pancreatic blasts from pluripotent stem cells.
  • FIG. 2 shows the content of PDX1-positive NKX6.1-negative cells and PDX1-positive NKX6.1-positive cells in the cells obtained by each induction method.
  • d0 indicates the cells after the completion of the second step
  • W / O indicates the cells on the 4th day in which the cells were not dissociated in the third step and only the medium was exchanged
  • Monolayer in the third step 4th day cell which performed adhesion culture is shown
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a protocol for producing pancreatic blasts from pluripotent stem cells.
  • FIG. 2 shows the content of PDX1-positive NKX6.1-negative cells and PDX1-positive NKX6.1-positive cells in the cells obtained by each induction method.
  • d0 indicates the cells after the
  • FIG. 3 shows the content of PDX1-positive NKX6.1-positive cells obtained from each pluripotent stem cell line (KhES3, 585A1, 604B1, 692D2, 648B1, and 409B2).
  • 2D shows the case where adhesion culture was performed in the third step
  • Agg shows the case where suspension culture was performed in the third step.
  • FIG. 4A shows the results of measuring the expression intensity of PDX1 and NKX6.1 in cells after each elapsed day in the third step using a flow cytometer.
  • FIG. 4B shows the content of PDX1-positive NKX6.1-positive cells after each elapsed day in the third step.
  • FIG. 5A shows an immunostaining image for pancreatic blast cell markers (PDX1, NKX6.1, SOX9 and GATA4) in the cell aggregate on the fourth day of the third step.
  • FIG. 5B shows an immunostaining image for endocrine cell markers (INS, GCG, Somatostatin, and Ghrelin) in the cell aggregate on day 4 of the third step.
  • FIG. 6A shows an immunostained image for pancreatic blast markers (PDX1, NKX6.1, SOX9 and GATA4) in the cell aggregate on day 12 of the third step.
  • FIG. 6B shows an immunostained image against endocrine cell markers (INS, GCG, Somatostatin and Ghrelin) in the cell aggregate on the 12th day of the third step.
  • FIG. 7A shows a schematic diagram of a protocol for examining the culture conditions in the third step.
  • the black arrow indicates the conditions for adding Noggin (NOG), KGF, and EGF to the culture solution
  • the white arrow indicates that Noggin (NOG) is not added, or Noggin (NOG), KGF, and EGF are added to the culture solution. The conditions not added are shown.
  • FIG. 7B shows the content of PDX1-positive NKX6.1-negative cells and PDX1-positive NKX6.1-positive cells in cells obtained under each condition.
  • FIG. 8A shows a schematic diagram of a protocol for examining the effect of ALK5 inhibitor II in the third step.
  • the arrow indicates the period during which ALK5 inhibitor II is added.
  • Fig. 8B shows the expression of PDX1 (vertical axis) and NKX6.1 (horizontal axis) in the condition where ALK5 inhibitor II was not added (left figure) and in the condition where ALK5 inhibitor II was added (right figure). The result measured with a meter is shown.
  • the numbers indicate the content of PDX1-positive and NKX6.1-positive cells.
  • FIG. 9 shows immunostained images of PDX1 and insulin at the site of transplantation 30 days after transplantation into the peri-testicular adipose tissue of an immunodeficient mouse (NOD. CB17-Prkdcscid / J).
  • FIG. 10A shows the amount of human C-peptide in the plasma of mice against the number of days after transplantation in which induced pancreatic cells were transplanted under the kidney capsule of immunodeficient mice.
  • FIG. 10B shows the amount of change in human C-peptide in the plasma of pancreatic blast-transplanted mice due to glucose load (+).
  • FIG. 11A shows a schematic diagram of an adhesion condition protocol for producing pancreatic blasts from pluripotent stem cells.
  • FIG. 11B shows an immunostaining image for pancreatic blast cell markers (PDX1 (lower figure) and NKX6.1 (upper figure)) when Y-27632 is used at 50 ⁇ M in the third step (right figure). Water (left figure) in the figure represents a negative control.
  • FIG. 11C shows the content of PDX1-positive NKX6.1-positive cells and PDX1-positive NKX6.1-negative cells when Y-27632 at each concentration was used in the third step.
  • FIG. 12A shows a schematic diagram of a modified protocol for adhesion conditions for producing pancreatic blasts from pluripotent stem cells.
  • FIG. 12A shows a schematic diagram of a modified protocol for adhesion conditions for producing pancreatic blasts from pluripotent stem cells.
  • FIG. 12B shows an immunostaining image for pancreatic blast cell markers (PDX1 (lower figure) and NKX6.1 (upper figure)) when 50 ⁇ M of Fasudil was used in the third step of the modified protocol (right figure).
  • Water (left figure) in the figure represents a negative control.
  • FIG. 12C shows the content of PDX1-positive NKX6.1-positive cells and PDX1-positive NKX6.1-negative cells when Fasudil at each concentration was used in the third step.
  • Y50 indicates the result when 50 ⁇ M Y-27632 was used as a positive control.
  • FIG. 13A shows an immunostaining image for NKX6.1 when 5 ⁇ M SR3677 was used in the third step of the modified protocol (right figure).
  • FIG. 13B shows the content of NKX6.1 positive cells when SR3677 at each concentration was used in the third step of the modified protocol.
  • Y50 indicates the result when 50 ⁇ M Y-27632 was used as a positive control.
  • FIG. 13C shows an immunostaining image for NKX6.1 when 0.1 ⁇ M GSK269962 was used in the third step of the modified protocol (right figure).
  • DMSO (left figure) shows a negative control.
  • FIG. 13D shows the content of NKX6.1 positive cells when GSK269962 at each concentration was used in the third step of the modified protocol.
  • FIG. 14A shows an immunostaining image for NKX6.1 when 50 ⁇ M H-1152 was used in the third step of the modified protocol (right figure).
  • DMSO left figure
  • FIG. 14B shows the content of NKX6.1-positive cells when each concentration of H-1152 was used in the third step of the modified protocol.
  • Y50 indicates the result when 50 ⁇ M Y-27632 was used as a positive control.
  • FIG. 14C shows immunostained images for pancreatic blast cell markers (PDX1 (bottom) and NKX6.1 (top)) when 5 ⁇ M Blebbistatin was used in the third step of the modified protocol (right).
  • DMSO left figure
  • FIG. 14D shows the content of PDX1-positive NKX6.1-positive cells when Blebbistatin at each concentration was used in the third step of the modified protocol.
  • Y50 indicates the result when 50 ⁇ M Y-27632 was used as a positive control.
  • a method for producing pancreatic blast cells comprising a step of culturing PDX1-positive NKX6.1-negative cells in a medium containing KGF, EGF and BMP inhibitor.
  • Pancreatoblasts are cells that can be induced to differentiate into cells that form the pancreas, such as endocrine cells, pancreatic duct cells, and exocrine cells, and examples include cells expressing at least PDX1 and NKX6.1.
  • a cell expressing a gene marker such as SOX9 or GATA4 may be used.
  • the pancreatic blast cells produced according to the present embodiment may be provided as a cell population containing other cell types or may be a purified population.
  • the cell population includes 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, or 80% or more pancreatic cells.
  • the PDX1-positive NKX6.1-negative cells are cultured in a medium containing KGF, EGF and BMP inhibitors under conditions that produce cell aggregates. Also good. “Conditions under which cell aggregates are generated” is not particularly limited as long as cell aggregates can be obtained in a medium.
  • the cells may be suspended by culturing in a single cell state by being substantially separated (or dissociated) by any method, or may be cultured in the state of a cell aggregate in which cells are adhered in advance.
  • the suspension culture is performed by separating the cells into a single cell state.
  • separation methods include mechanical separation and separation solutions having protease activity and collagenase activity (for example, trypsin, solutions containing trypsin and collagenase, Accutase (TM) and Accumax (TM) (Innovative Cell Technologies, Inc) Or separation using a separation solution having only collagenase activity.
  • protease activity and collagenase activity for example, trypsin, solutions containing trypsin and collagenase, Accutase (TM) and Accumax (TM) (Innovative Cell Technologies, Inc) Or separation using a separation solution having only collagenase activity.
  • Suspension culture means culturing cells in a non-adherent state on a culture dish.
  • it is not artificially treated (for example, coating treatment with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving adhesion with cells, or artificially suppresses adhesion (for example, poly
  • This can be carried out using hydroxyethyl methacrylic acid (poly-HEMA) or 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer (Lipidure).
  • the size of the cell aggregate is not particularly limited, but the cell aggregate may be formed by at least 3 ⁇ 10 3 or more cells.
  • the number of cells constituting the cell aggregate for example, 1 ⁇ 10 4 One or more, 2 ⁇ 10 4 or more, 3 ⁇ 10 4 or more, 4 ⁇ 10 4 or more, 5 ⁇ 10 4 or more may be mentioned.
  • PDX1-positive NKX6.1-negative cells are separated into single cells and cultured for adhesion.
  • adhesion culture is performed in a medium used in (Step 2) described later.
  • the period of adhesion culture in the medium used in (Step 2) is not particularly limited, and examples thereof include 1 day or more, 2 days or more, or 3 days or more, and more preferably 1 day.
  • it is desirable to use a ROCK inhibitor for the purpose of suppressing apoptosis when pluripotent stem cells are separated into a single cell state The following can be used, and Y-27632 is preferable.
  • the adhesion culture means culturing in a coated culture dish.
  • the coating agent include Matrigel (BD Biosciences), Synthemax (Corning), gelatin, extracellular protein (eg, collagen, laminin (eg, laminin 111, 411 or 511), heparan sulfate proteoglycan, and entactin), or Examples thereof include fragments of the extracellular protein, and combinations thereof.
  • a medium used for the culture process of pancreatic blasts from PDX1-positive NKX6.1-negative cells can be prepared by appropriately adding KGF, EGF and BMP inhibitors to a basal medium used for animal cell culture.
  • basal media include MEM Zinc Option, IMEM Zinc Option, IMDM, Medium 199, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), ⁇ MEM, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's F12, Examples include 1640 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof.
  • the basal medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum free.
  • FBS fetal bovine serum
  • albumin, transferrin, KnockOutKSerum Replacement (KSR) (serum substitute for ES cell culture) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen precursor
  • KSR KnockOutKSerum Replacement
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid insulin
  • collagen precursor May contain one or more serum substitutes such as trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Invitrogen), non-essential amino acids (NEAA), vitamins It may also contain one or more substances such as, growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, and the like.
  • the basal medium is IMEM Zinc Option medium with B27 supplement.
  • KGF is a protein called Keratinocyte® Growth Factor and is sometimes called FGF-7.
  • FGF-7 Commercially available products such as R & DRsystems can be used as KGF.
  • the concentration of KGF is 1 ng / ml to 1 ⁇ g / ml, preferably 5 ng / ml to 500 ng / ml, more preferably 10 ng / ml to 200 ng / ml.
  • EGF is a protein called epidermal growth factor or Epidermal® Growth Factor.
  • EGF commercially available products such as R & D systems can be used.
  • the concentration of EGF is 1 ng / ml to 1 ⁇ g / ml, preferably 5 ng / ml to 500 ng / ml, more preferably 10 ng / ml to 100 ng / ml.
  • BMP inhibitors include proteinaceous inhibitors such as Chordin, Noggin, Follistatin, Dorsomorphin (ie 6- [4- (2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl] -3-pyridin-4-yl-pyrazolo (1,5-a) pyrimidine), its derivatives (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116: II_60; PB Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33 -41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3 (8): e2904) and LDN-193189 (i.e.
  • the concentration is 1 ng / ml to 1 ⁇ g / ml, preferably 5 ng / ml to 500 ng / ml, more preferably 50 ng / ml to 200 ng / ml. is there.
  • the medium used for the culture process of PDX1-positive NKX6.1-negative cells to pancreatic blasts may further contain a ROCK inhibitor or a non-muscle myosin II inhibitor.
  • a ROCK inhibitor or a non-muscle myosin II inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho-kinase (ROCK).
  • ROCK Rho-kinase
  • Fasudil / HA1077 eg, Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)
  • SR3677 eg, Feng Y et al. , J Med Chem. 51: 6642-6645 (2008)
  • GSK269962 eg, see Stevenger RA et al., J Med Chem. 50: 2-5 (2007) or WO2005 / 037197
  • H-1152 eg, , Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)
  • Wf-536 eg, Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol.
  • ROCK inhibitors for example, US Patent Application Publication Nos. 2005/0209261, 2005/0192304, 2004/0014755, 2004/0002508,. 2004/0002507, 2003/0125344, 2003/0087919, and International Publications 2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976 No., 2004/039796).
  • one or more ROCK inhibitors may be used.
  • Preferred ROCK inhibitors used in this step include Y-27632, Fasudil / HA1077, SR3677, GSK269962 and H-1152.
  • the concentration in the medium is 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 500 ⁇ M, and more preferably 10 ⁇ M to 200 ⁇ M.
  • the concentration in the medium when Fasudil / HA1077 is used as a ROCK inhibitor is 1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 10 ⁇ M to 100 ⁇ M.
  • the concentration in the medium is 0.1 ⁇ M to 50 ⁇ M, preferably 0.5 ⁇ M to 50 ⁇ M.
  • the concentration in the medium is 0.001 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.005 ⁇ M to 50 ⁇ M, and more preferably 0.05 ⁇ M to 120 ⁇ M.
  • the concentration in the medium is 5 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 10 ⁇ M to 50 ⁇ M.
  • Non-muscle myosin II inhibitor is an inhibitor of ATPase activity of the heavy chain subunit of non-muscle myosin IIA or non-muscle myosin IIB, one of the heavy chain isoforms of non-muscle myosin II, an inhibitor of myosin light chain kinase Is exemplified.
  • Examples of such drugs include blebbistatin A3, CalphostinphosC, Goe6976, Goe7874, Fasudil / HA1077, Hypericin, K-252a, KT5823, ML-7, ML-9, Picatannol, Staurosporine, W-5, Examples thereof include, but are not limited to, W-7, W-12, W-13, Wortmannin and the like.
  • Preferred non-muscle myosin II inhibitors used in this step include blebbistatin and Fasudil / HA1077.
  • the concentration in the medium is 1 ⁇ M to 200 ⁇ M, preferably 10 ⁇ M to 100 ⁇ M.
  • the medium used in the step of culturing pancreatic cells from PDX1-positive NKX6.1-negative cells of the present invention may further contain a TGF ⁇ inhibitor.
  • a TGF ⁇ inhibitor is a substance that inhibits signal transduction from binding of TGF ⁇ to the receptor to SMAD, and that inhibits binding to the ALK family of receptors, or a substance that inhibits phosphorylation of SMAD by the ALK family
  • Lefty-1 NCBINCAccessionNo., Mouse: NM_010094, human: NM_020997 is exemplified
  • SB431542 SB202190 (above, RKLindemann et al., Mol.
  • ALK5 inhibitor II (2- [3- [ 6-methylpyridin-2-yl] -1H-pyrazol-4-yl] -1,5-naphthyridine), TGF ⁇ RI kinase inhibitor VIII (6- [2-tert-butyl-5- [6-methyl-pyridine- 2-yl] -1H-imidazol-4- Le] - quinoxaline) and their derivatives are exemplified.
  • it may be ALK5 inhibitor II.
  • the concentration in the medium when ALK5 inhibitor II is used as the TGF ⁇ inhibitor is 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 to 50 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M to 20 ⁇ M.
  • TGF ⁇ inhibitor When adding a TGF ⁇ inhibitor, it is desirable to add it two days after the start of culture of PDX1-positive NKX6.1-negative cells. Although an addition period is not specifically limited, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, or 4 days or more are illustrated.
  • the number of days for the culture process of PDX1-positive NKX6.1-negative cells from pancreatic blasts because there is no particular effect on the production efficiency of pancreatic blasts by culturing for a long period of time.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30-40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air. Performed, the CO 2 concentration is preferably about 2-5%.
  • PDX1-positive NKX6.1-negative cells are not particularly limited as long as they express PDX1, but do not express NKX6.1.
  • Expressing PDX1 means that the PDX1 gene or gene product can be detected by a known method, and not expressing NKX6.1 means that the NKX6.1 gene or gene product cannot be detected. Meaning and examples of the detection method include immunostaining.
  • PDX1-positive NKX6.1-negative cells may be isolated from the living body, and may be produced from other cell types such as pluripotent stem cells by a known method.
  • the PDX1-positive NKX6.1-negative cell may be a cell produced from a pluripotent stem cell by a method comprising the following steps: (Step 1) A step of culturing pluripotent stem cells in a medium containing activin, and (Step 2) a step of culturing the cells obtained in Step 1 in a medium containing KGF.
  • a method for producing pancreatic blasts from pluripotent stem cells which includes the following step as a certain aspect.
  • Step 1) culturing pluripotent stem cells in a medium containing activin
  • Step 2) culturing the cells obtained in Step 1 in a medium containing KGF
  • Step 3 A step of separating the cells obtained in Step 2 (PDX1-positive NKX6.1-negative cells) into single cells and then culturing them in a medium containing KGF, EGF and BMP inhibitor.
  • the medium used in the step of culturing the pluripotent stem cells of these aspects in a medium containing activin can be prepared by appropriately adding activin to the basal medium used for culturing animal cells.
  • basal media include MEM Zinc Option, IMEM Zinc Option, IMDM, Medium 199, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), ⁇ MEM, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's F12, Examples include 1640 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof.
  • the basal medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum free.
  • FBS fetal bovine serum
  • albumin, transferrin, KnockOutKSerum Replacement (KSR) (serum substitute for ES cell culture) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen precursor
  • KSR KnockOutKSerum Replacement
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid insulin
  • collagen precursor May contain one or more serum substitutes such as trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Invitrogen), non-essential amino acids (NEAA), vitamins It may also contain one or more substances such as, growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, and the like.
  • the basal medium is RPMI 1640 medium with B27 supplement.
  • the pluripotent stem cells may be cultured as a single cell by being substantially separated (or dissociated) by any method, or a cell aggregate in which cells adhere to each other You may culture in the state of this. More preferably, the cells are cultured in a single cell state.
  • the separation method include mechanical separation and separation solution having protease activity and collagenase activity (for example, trypsin and collagenase-containing solution Accutase (TM) and Accumax (TM) (Innovative Cell Technologies, Inc) ) Or separation using a separation solution having only collagenase activity.
  • Pluripotent stem cells can be adherently cultured using a coated culture dish.
  • the adhesion culture in step 1 of this embodiment can be performed by the same method as described above.
  • Activins may be any of activins A, B, C, D, and AB, but activin A is particularly preferably used.
  • activin activin derived from any mammal such as human and mouse can be used.
  • activin used in the present invention it is preferable to use activin derived from the same animal species as the pluripotent stem cell used for differentiation. For example, when human-derived pluripotent stem cell is used as a starting material, human-derived activin is used. It is preferable to use it.
  • These activins are commercially available.
  • the concentration in the medium is usually 0.1 to 200 ng / ml, preferably 5 to 150 ng / ml, particularly preferably 10 to 100 ng / ml.
  • the medium used in Step 1 may further contain a GSK3 inhibitor and / or a ROCK inhibitor.
  • a GSK3 inhibitor is defined as a substance that inhibits the kinase activity of GSK-3 ⁇ protein (for example, phosphorylation ability for ⁇ -catenin), and many are already known.
  • BIO indirubin derivative BIO (also known as GSK-3 ⁇ inhibitor IX; 6-bromoindirubin 3′-oxime), a maleimide derivative SB216763 (3- (2,4-dichlorophenyl) -4- (1-methyl-1H-indol-3-yl) ) -1H-pyrrole-2,5-dione), SB415286 (3-[(3-chloro-4-hydroxyphenyl) amino] -4- (2-nitrophenyl) -1H-pyrrole-2,5-dione) , GSK-3 ⁇ inhibitor VII (4-dibromoacetophenone), a phenyl ⁇ bromomethyl ketone compound, L803-mts (also known as GSK-3 ⁇ peptide inhibitor; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-) NH2) and CHI with high selectivity R99021 (6- [2- [4- (2,4-Dichlorophenyl) -5- (4-methyl-1H-imide
  • the concentration in the medium is usually 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M, particularly preferably 1 ⁇ M to 5 ⁇ M.
  • an addition period is not specifically limited, 1 day or more, 2 days or more, or 3 days or more are illustrated, Preferably it is 1 to 3 days.
  • the ROCK inhibitor used in Step 1 can be the same as described above, and is preferably Y-27632.
  • a ROCK inhibitor when added, it can be used for the purpose of suppressing apoptosis when pluripotent stem cells are separated into a single cell state, and the addition period is not particularly limited, but it is 1 day or more. Or 2 days or more, and preferably 1 day.
  • the number of days in step 1 is not particularly limited because there is no particular effect on the production efficiency of pancreatic blasts by culturing for a long period of time. The above is mentioned. More preferably, it is 4 days.
  • the medium used in the step of culturing the cells obtained in step 1 in a medium containing KGF can be prepared by appropriately adding KGF to a basal medium used for culturing animal cells.
  • basal media include MEM Zinc Option, IMEM Zinc Option, IMDM, Medium 199, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), ⁇ MEM, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's F12, Examples include 1640 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof.
  • the basal medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum free.
  • albumin, transferrin, KnockOutKSerum Replacement (KSR) (serum substitute for ES cell culture) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen precursor
  • KSR KnockOutKSerum Replacement
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid insulin
  • collagen precursor May contain one or more serum substitutes such as trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Invitrogen), non-essential amino acids (NEAA), vitamins It may also contain one or more substances such as, growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, and the like.
  • the basal medium is IMEM Zinc Option medium with B27 supplement.
  • the KGF used in step 2 can be the same as described above, and the KGF concentration is preferably lower than that described above, for example, 1 ng / ml to 500 ng / ml, preferably 10 ng. / ml to 100 ng / ml.
  • the medium used in Step 2 may further contain a BMP inhibitor, a retinoic acid derivative, and a hedgehog pathway inhibitor.
  • the BMP inhibitor used in Step 2 can be used under the same conditions as described above.
  • the retinoic acid derivative used in Step 2 means an artificially modified retinoic acid that retains the function of natural retinoic acid, such as 4-[[(5,6,7,8-tetrahydro-5, 5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) carbonyl] amino] -Benzoic acid (AM580) (Tamura K, et al., Cell Differ. Dev. 32: 17-26 (1990)), 4-[(1E ) -2- (5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) -1-propen-1-yl] -Benzoic acid (TTNPB) (Strickland S, et al Cancer Res.
  • TTNPB 4-[(1E ) -2- (5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) -1-propen-1-yl] -Benzoic acid
  • a preferred retinoic acid derivative used in this step is TTNPB.
  • the concentration of the retinoic acid derivative used in this step can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the retinoic acid derivative used.
  • TTNPB is used as the retinoic acid derivative
  • 1 nM to 100 nM preferably 5 nM to 50 nM. More preferably, it is 5 nM to 10 nM.
  • the hedgehog pathway inhibitor used in Step 2 inhibits the signal generated when any of Sonic hedgehog, Indian hedgehog, and Desert hedgehog binds to the membrane receptor Patched, for example, Smoothened activity.
  • hedgehog binds to the receptor and inhibits the signal generated by the receptor, for example, cyclopamine, jervin, 3-keto-N- (aminoethyl-aminocaproyl- dihydro-cinnamoyl) (KAAD ) -Cyclopamine, CUR-61414, SANT-1, SANT-2, SANT-3, SANT-4, IPI-926, IPI-269609, GDC-0449 and NVP-LDE-225.
  • it is KAAD-cyclopamine.
  • the concentration of the hedgehog pathway inhibitor used in Step 2 can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the hedgehog pathway inhibitor used.
  • concentration of the hedgehog pathway inhibitor used in Step 2 0.1 nM To 1 ⁇ M, preferably 1 nM to 500 nM.
  • a pluripotent stem cell is a stem cell that has pluripotency that can be differentiated into all cells existing in a living body and also has proliferative ability.
  • Embryonic stem (ES) cells JA Thomson et.al. (1998), Science 282: 1145-1147; JA Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7844-7848; JA Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55: 254-259; JA Thomson and VS Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38: 133-165), clone obtained by nuclear transfer Embryonic embryonic stem (ntES) cells (T.
  • ntES nuclear transfer Embryonic embryonic stem
  • the pluripotent stem cell is a human pluripotent stem cell.
  • IPS cells are particularly preferably used as a material for transplanted pancreatic cells.
  • iPS cells obtained from somatic cells that are the same as or substantially the same as the HLA genotype of the transplant recipient individual from the viewpoint that rejection does not occur .
  • substantially the same means that the HLA genotype matches the transplanted cells to such an extent that an immune response can be suppressed by an immunosuppressive agent.
  • HLA-A, HLA-B And somatic cells having an HLA type in which 3 loci of HLA-DR or 4 loci plus HLA-C are matched.
  • pancreatic blasts obtained using the above steps can be used as a medicine (especially a medicine for cell medicine).
  • the cells Prior to administration, the cells may be treated with an agent that irradiates radiation or inhibits cell growth such as mitomycin C.
  • pancreatic blasts are suspended in physiological saline or the like, and the cell suspension is used as a medicine, which is directly administered to the patient's pancreas, mesentery, spleen, liver and kidney (especially kidney capsule) or polyvinyl alcohol.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • the cells may be administered with a scaffold such as polyethylene glycol, gelatin, or collagen.
  • the number of cells to be administered may be appropriately increased or decreased according to the size of the body. For example, 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 10 cells / individual, preferably 5 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 10 cells. / Individual, more preferably 1 ⁇ 10 9 to 1 ⁇ 10 10 cells / individual.
  • the medicament containing the pancreatic blast may be used for the treatment of pancreatic diseases, and examples of the pancreatic diseases include acute pancreatitis, chronic pancreatitis, diabetes, pancreatic cancer, and Langerhans islet tumor.
  • the pancreatic blast cells of the present invention are effective against diabetes because they are induced in the body into insulin-producing cells that secrete insulin corresponding to the glucose concentration. In particular, it is effective for type 1 diabetes, in which insulin-producing cells die.
  • cells are human and non-human animals (eg, mice, rats, cows, horses, pigs, sheep, monkeys, dogs, cats, birds, etc.), with particular limitations although not, human-derived cells are particularly preferred.
  • Pancreatic cell differentiation-inducing human ES cell line KhES3 was received from Kyoto University and cultured by conventional methods (H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345: 926-932) . (Alternatively, culture was performed under feeder free conditions using Essential 8, Corning's Synthemax.) KhES3 was induced into pancreatic blasts according to the protocol described in FIG. Specifically, the human ES cell line KhES3 grown to approximately 70% confluence on the culture dish was detached using CTK solution (Reprocell) and then separated into individual cells using Accutase (Innovative Cell Technologies). and, after seeding in Matrigel (BD) coated with 24 well or 6 well plate (Greiner) at 2.0 ⁇ 10 5 /well ⁇ 3.0 ⁇ 10 5 / well , were induced to differentiate into pancreatic bud cells by the following steps .
  • CTK solution Reprocell
  • Accutase Innovative Cell Technologies
  • the cells obtained in the second step were separated into single cells using Trypsin and seeded in a low adhesion 96 well plate (Lipidure Coat, NOF) at 3.0 ⁇ 10 3 to 3.0 ⁇ 10 4 / well.
  • Added MEM Zinc Option medium (15 ⁇ 10 4 / ml) containing 100 ng / ml KGF, 100 ng / ml Noggin, 50 ng / ml EGF (R & D systems), 10 ⁇ M Y-27632 and 1% B-27
  • the cells were further cultured for 4 to 20 days. At this time, the medium was changed every 4 days with the same medium.
  • the cells obtained in the second step were separated into single cells using Trypsin, and then applied to a 24-well plate (Greiner) coated with Matrigel at 6.0 ⁇ 10 4 to 4.8 ⁇ 10 5 / cm 2 . Then, the cells were seeded and cultured for 4 days in the same medium. Similarly, as a control, the cells obtained in the second step were not separated and replaced with the same medium and cultured for 4 days.
  • iPS cell lines Four peripheral blood mononuclear cell derived iPS cell lines (585A1, 604B1, 692D2 and 648B1 (all Okita K, et al, Stem Cells. 2013 31: 458-466)) and One type of fibroblast-derived iPS cell line (409B2 (Okita K, et al, Nat Methods. 2011 8: 409-412) is available from the Institute for iPS Cell Research, Kyoto University. The iPS cell line was induced to differentiate into pancreatic blasts by the same process as described above.
  • PDX1 and NKX6.1 were both more positive in cell culture agglomerates (Agg) in (third step) than in adhesion culture (2D), even when starting from any of the five iPS cell lines. It was confirmed that the cell rate increased (FIG. 3).
  • the period of (third step) is 0 days (S3d0), 1 day (S3d1), 2 days (S3d2), 4 days (S3d4), 8 days (S3d8),
  • S3d0 1 day
  • S3d1 1 day
  • S3d2 2 days
  • S3d4 4 days
  • S3d8 8 days
  • both PDX1 and NKX6.1 positive cell rates increased when the test was performed for 8 days or more.
  • the maximum was reached around 12 days, and it was not confirmed that the efficiency was particularly reduced by continuing the culture thereafter (FIGS. 4A and B).
  • cell aggregates in (third step) were formed at 3.0 ⁇ 10 4 / well and cultured for 4 days (S3d4) or 12 days (S3d12).
  • pancreatic blast cell markers PDX1, NKX6.1, SOX9 and GATA4
  • INS endocrine cell markers
  • GCG GCG
  • Somatostatin and Ghrelin endocrine cell markers
  • the third step is to collect cell aggregates on the 12th day and transplant them into the peri-testicular adipose tissue of immunodeficient mice (NOD. CB17-Prkdcscid / J) (Charles river). As a result, a mass of insulin-positive cells adjacent to PDX1-positive cells having a tubular structure was formed. Thus, it was confirmed that the induced pancreatic blasts form a pancreatic epithelial-like structure in vivo (Fig. 9).
  • Step 3 Cell aggregates collected on the 4th, 5th, or 12th day were collected, the cultured cells were washed with physiological saline, and the media aggregates were removed. The concentrate or the concentrate of the cell aggregate from which the culture supernatant was removed was prepared.
  • the aggregated cells on the 4th day of the third step were collected, and Improved MEM Zinc Option medium (15 ⁇ 10 4) containing 1% B-27 supplemented with 5 ⁇ M ALK5 inhibitor II (Santa Cruz) was added. / ml) for 1 day, the cultured cells were washed with physiological saline, and the concentrate of the cell aggregate from which the medium was removed or the concentrate of the cell aggregate from which the culture supernatant was removed was prepared. .
  • the obtained cell aggregate concentrate was transplanted under the kidney capsule of immunodeficient mice (NOD. CB17-Prkdc scid / J).
  • the administered induced pancreatic blast cells have a function of producing insulin in response to the blood glucose level after engrafting in the living body. Therefore, it was suggested that the induced pancreatic cells can be used as a therapeutic agent for insulin secretion failure.
  • iPS cell line (585A1) was seeded on a 24-well plate coated with Matrigel at 2.0 ⁇ 10 5 / well, and 100 ng / ml activin A (R & D) in RPMI1640 medium (Nacalai Tesque) containing 2% B27 (Life Technologies). systems), 3 ⁇ M CHIR99021 (Axon Medchem) and 10 ⁇ M Y-27632 (WaKo) were added and cultured for 1 day.
  • the medium was replaced with RPMI1640 medium containing 100 ng / ml activin A, 1 ⁇ M CHIR99021 and 2% B27 (Life Technologies), and cultured for 2 days. Furthermore, the medium was replaced with RPMI1640 medium containing 100 ng / ml activin A and 2% B27 (Life Technologies), and cultured for 1 day.
  • the culture medium obtained in the first step was replaced with Improved MEM Zinc Option medium (Invitrogen) containing 50 ng / ml KGF (R & D systems) and 1% B-27 (Life Technologies) for 3 days. Cultured.
  • Improved MEM Zinc Option medium Invitrogen
  • 50 ng / ml KGF R & D systems
  • 1% B-27 B-27
  • the cells obtained in the second step were separated into single cells using Trypsin and seeded at 1.6 ⁇ 10 5 to 2.4 ⁇ 10 5 / cm 2 on a 24-well plate coated with Matrigel.
  • Improved MEM Zinc Option medium (15 x 10 4 / ml) containing 100 ng / ml KGF, 100 ng / ml Noggin, 50 ng / ml EGF (R & D systems), each concentration of Y-27632 and 1% B-27 They were added and cultured for 4 days.
  • the obtained cells were treated with BD Cytofix / Cytoperm TM Kit, stained with anti-PDX1 antibody (R & D systems) and anti-NKX6.1 antibody (University of Iowa), and PDX1 and NKX6. One positive cell rate was detected.
  • the third step when Y-27632 was used, the content of PDX1 and NKX6.1 positive cells increased in a concentration-dependent manner, and the effect was highest at 100 ⁇ M (FIGS. 11B and C).
  • iPS cell line (585A1) was seeded on a 24-well plate coated with Matrigel at 2.0 ⁇ 10 5 / well, and 100 ng / ml activin A (R & D) in RPMI1640 medium (Nacalai Tesque) containing 2% B27 (Life Technologies). systems), 3 ⁇ M CHIR99021 (Axon Medchem) and 10 ⁇ M Y-27632 (WaKo) were added and cultured for 1 day.
  • the medium was replaced with RPMI1640 medium containing 100 ng / ml activin A, 1 ⁇ M CHIR99021 and 2% B27 (Life Technologies), and cultured for 2 days. Furthermore, the medium was replaced with RPMI1640 medium containing 100 ng / ml activin A and 2% B27 (Life Technologies), and cultured for 1 day.
  • the medium was 100 ng / ml KGF, 100 ng / ml Noggin, 50 ng / ml EGF (R & D systems), each compound (Y-27632, Fasudil (HA-1077), SR3677, GSK269962, H-1152 and Blebbistatin) And Improved MEM Zinc Option medium (15 ⁇ 10 4 / ml) containing 1% B-27 was added, followed by further culturing for 4 days.
  • the obtained cells were treated with BD Cytofix / Cytoperm TM Kit, stained with anti-PDX1 antibody (R & D systems) and anti-NKX6.1 antibody (University of Iowa), and NKX6 with a flow cytometer or image analyzer. .1 positive cell rate or both PDX1 and NKX6.1 positive cell rates were detected.
  • the cells are dissociated, and in the third step, the cells are adherently cultured using the same medium as in the second step. Further, in the third step, a ROCK inhibitor or a non-muscle myosin II inhibitor is used. It was confirmed that the PDX1 and NKX6.1 positive cell rates increased by adding.

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Abstract

　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞を、KGF、EGFおよびBMP阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、膵芽細胞の製造方法を提供する。当該培養工程は、浮遊培養によって行われてもよく、接着培養によって行われても良い。接着培養で行う場合、さらにROCK阻害剤または非筋ミオシンII阻害剤を含む培地で培養してもよい。

Description

膵芽細胞の製造方法および膵芽細胞を含む膵疾患治療剤
　本発明は、膵芽細胞の製造方法および同方法によって製造された膵芽細胞を含む膵疾患治療剤に関する。本願はさらに、当該膵芽細胞を用いる膵疾患の治療法に関する。
　膵臓は、膵リパーゼ、トリプシン、エラスターゼ、膵アミラーゼなどの消化酵素を分泌する外分泌腺および、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド（PP）等の膵ホルモンを分泌する内分泌腺として機能している。近年、胃分泌ホルモンであるグレリンが膵臓の内分泌細胞からも分泌されることが報告されている。この膵ホルモンは、膵臓の中のα細胞、β細胞、δ細胞およびPP細胞の4種の細胞からなる膵島と呼ばれる細胞塊により産生されている。
　ここで、インスリンは、ブドウ糖の利用、蛋白の合成、中性脂肪の形成および貯蔵を促進し、血糖値を低下させ、血糖を正しい濃度に保つ重要な役割を果たす。グルカゴンは、肝糖原分解、糖新生作用などを介する血糖上昇ホルモンとしてインスリンと並び糖代謝調節機構において重要な役割を担っている。ソマトスタチンは、ソマトスタチンレセプターへの結合を介して作用を発現し、膵臓でのグルカゴン、インスリン等の種々のホルモン分泌を抑制する。ＰＰは、食物摂取に対応してランゲルハンス島の細胞から分泌されるホルモンであり、飽食因子として知られ、食物摂取を抑制し、体重増加を低減させる働きがある。グレリンは食物摂取を刺激し、脂肪酸化を低下させることによって体重を増加させることが知られている。
　糖尿病は、インスリンが不足したりその働きが失われたりすることによって発症する疾患であり、一度発症すると根治させることが難しい疾患である。糖尿病は、１型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）と２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）の大きく２つのタイプに分類することができる。
　２型糖尿病は、インスリンに対する抵抗性を獲得することで発症する慢性疾患であり、食べ過ぎや運動不足によっておこる肥満やストレス等、生活習慣が発症メカニズムと考えられている糖尿病である。２型糖尿病は中高年で発病することが多く、糖尿病患者の多くは２型糖尿病を罹患している。
　一方、１型糖尿病は、自己免疫疾患やウイルス感染等によってβ細胞（インスリン産生細胞）が破壊され、インスリンが体内に分泌されないことによっておこる疾患である。インスリンの投与による対症療法が主に行われているが、体内で常に変化する血糖値を自動的にコントロールして、患者の負担を軽くできる治療法として、膵臓移植又は膵島移植も行われている。この治療法によって正常な血糖値を達成することは可能であるが、移植可能な膵臓又は膵島が不足しているのが現状である。また、移植片に対する免疫拒絶反応を回避するために、患者は免疫抑制剤を一生服用し続ける必要があり、感染症の危険性や免疫抑制剤による副作用等の問題が残る。
　１型糖尿病の治療法として、体外で患者由来の細胞からインスリン産生細胞自体を誘導し、誘導したインスリン産生細胞を患者の生体内に移植することが検討されている。インスリン産生細胞は例えば、患者の膵管上皮由来細胞を体外に取り出して分化させる等により得ることができる法。
　インスリン産生細胞を得る方法としては、胚性幹（ES）細胞や人工多能性幹（iPS）細胞などの多能性幹細胞をアクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）やレチノイン酸（ＲＡ）を用いて分化誘導する方法が例示される（特許文献１、非特許文献１から５）。さらに、多能性幹細胞へＰＤＸ１を導入して培養する方法（特許文献２および特許文献３）、低分子化合物を適宜組み合わせて多能性幹細胞に作用させてインスリン産生細胞を製造する方法（特許文献４および非特許文献６）が知られている。しかしながらこのようにin vitroで得られたインスリン産生細胞を生体内に投与して、グルコース応答能を獲得したという報告は無い。一方、膵前駆細胞を製造し、生体内に投与した場合において、投与した細胞からグルコース濃度に応じてインスリンを分泌した報告（非特許文献７および非特許文献８）。
特開２００９－２２５６６１号公報 米国特許７５３４６０８号公報 特開２００６－０７５０２２号公報 ＷＯ２０１１／０８１２２２
Ｅ．Ｋｒｏｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００８）Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．４：４４３－４５２ Ｋ．Ａ．Ｄ’Ａｍｏｕｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１１：１３９２－１４０１ Ｗ．Ｊｉａｎｇ，Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）１７：３３３－３４４ Ｊ．Ｈ．Ｓｈｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（２００７）５０：１２２８－１２３８ Ｒ．Ｍａｅｈｒ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００９），ｖｏｌ．１０６，Ｎｏ．３７：１５７６８－１５７７３ Ｋｕｎｉｓａｄａ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．（２０１２）　ｖｏｌ．８，Ｎｏ．２：２７４－２８４． Ｋｒｏｏｎ　Ｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００８）　ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．４：４４３－４５２． Ｒｅｚａｎｉａ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｉａｂｅｔｅｓ．（２０１２）　ｖｏｌ．６１，Ｎｏ．８：２０１６－２０２９．
　一の態様において、本願はPDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞を分化誘導する方法を提供することを目的とする。より具体的には、多能性幹細胞から誘導したPDX1陽性NKX6.1陰性細胞をさらに分化する工程を含み、膵芽細胞を分化誘導する方法を提供することを目的とする。
　他の態様において、膵臓疾患治療剤、並びに膵臓疾患治療方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、PDX1陽性NKX6.1陰性細胞を、細胞凝集塊の生成される条件下でKGF、EGFおよびBMP阻害剤を含む培地中で培養することで膵芽細胞を分化誘導できることを初めて見出した。本発明はそのような知見を基にして完成されたものである。
　すなわち、本発明は以下の特徴を有する：
［１］　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞を、KGF、EGFおよびBMP阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、膵芽細胞の製造方法。
［２］　前記培地が、さらにROCK阻害剤または非筋ミオシンII阻害剤を含む培地である、［１］に記載の方法。
［３］　前記ROCK阻害剤または非筋ミオシンII阻害剤が、Y-27632、Fasudil、SR3677、GSK269962、H-1152およびBlebbistatinから成る群より選択されるいずれか一つの化合物である、［２］に記載の方法。
［４］　前記培養が、接着培養条件下で行われる、［２］または［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］　前記培養が、細胞凝集塊の生成される条件下で行われる、［１］に記載の方法。
［６］　前記PDX1陽性NKX6.1陰性細胞が、次の２つの工程を含む方法で多能性幹細胞より製造された細胞である、［１］から［５］のいずれか１項に記載の方法：
（１）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、および
（２）工程（１）で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程。
［７］　前記工程（１）において、アクチビンを含む培地がさらにＧＳＫ３阻害剤を含む、［６］に記載の方法。
［８］　前記工程（２）において、KGFを含む培地がさらにBMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む、［６］または［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］　前記BMP阻害剤が、Nogginである、［１］から［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］　前記ＧＳＫ３阻害剤が、CHIR99021である、［７］から［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］　前記レチノイン酸誘導体が、TTNPBである、［８］から［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］　前記ヘッジホッグ経路阻害剤が、KAAD‐シクロパミンである、［８］から［１１］のいずれか１項に記載の方法。
［１３］　前記膵芽細胞がPDX1陽性およびNKX6.1陽性である［１］から［１２］のいずれか１項に記載の方法。
［１４］　前記膵芽細胞が、ヒト細胞である、［１］から［１３］のいずれか１項に記載の方法。
［１５］　以下の工程（i）から（iii）を含む、多能性幹細胞から膵芽細胞を製造する方法：
（i）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、
（ii）工程（i）で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程、
（iii）工程（ii）で得られた細胞を、単一細胞へ分離し、KGF、EGFおよびBMP阻害剤を含む培地で培養する工程。
［１６］　前記工程（iii）で用いるKGF、EGFおよびBMP阻害剤を含む培地が、さらにROCK阻害剤または非筋ミオシンII阻害剤を含む培地である、［１５］に記載の方法。
［１７］　前記ROCK阻害剤または非筋ミオシンII阻害剤が、Y-27632、Fasudil、SR3677、GSK269962、H-1152およびBlebbistatinから成る群より選択されるいずれか一つの化合物である、［１６］に記載の方法。
［１８］　前記工程（iii）が、単一細胞へ分離し、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養後、KGF、EGFおよびBMP阻害剤を含む培地で培養する工程である、［１６］または［１７］のいずれか１項に記載の方法。
［１９］　前記工程（iii）での培養が、接着培養条件下で行われる、［１６］から［１８］のいずれか１項に記載の方法。
［２０］　前記工程（iii）での培養が、浮遊培養条件下で行われる、［１５］に記載の方法。
［２１］　前記工程（i）において、アクチビンを含む培地がさらにＧＳＫ３阻害剤を含む、［１５］から［２０］のいずれか１項に記載の方法。
［２２］　前記工程（ii）において、KGFを含む培地がさらにBMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む、［１５］から［２１］のいずれか１項に記載の方法。
［２３］　前記BMP阻害剤が、Nogginである、［１５］から［２２］のいずれか１項に記載の方法。
［２４］　前記ＧＳＫ３阻害剤が、CHIR99021である、［２１］から［２３］のいずれか１項に記載の方法。
［２５］　前記レチノイン酸誘導体が、TTNPBである、［１８］、または［２２］から［２４］のいずれか１項に記載の方法。
［２６］　前記ヘッジホッグ経路阻害剤が、KAAD‐シクロパミンである、［１８］、または［２２］から［２６］のいずれか１項に記載の方法。
［２７］　前記膵芽細胞が、PDX1陽性およびNKX6.1陽性である［１５］から［２６］のいずれか１項に記載の方法。
［２８］　前記膵芽細胞が、ヒト細胞である、［１５］から［２７］のいずれか１項に記載の方法。
［２９］　［１］から［２８］のいずれか１項に記載の方法で製造された膵芽細胞を含む、膵疾患の治療剤。
［３０］　前記膵疾患が糖尿病である、［２９］に記載の治療剤。
［３１］　前記糖尿病が、１型糖尿病である、［３０］に記載の治療剤。
［３２］　［１］から［２８］のいずれか１項に記載の方法で製造された膵芽細胞の、膵疾患の治療剤の製造のための使用。
［３３］　膵疾患治療のために用いられる、［１］から［２８］のいずれか１項に記載の方法で製造された膵芽細胞。
［３４］　［１］から［２８］のいずれか１項に記載の方法で製造された膵芽細胞を膵疾患の治療が必要な対象へ移植することを含む、膵疾患の治療方法。
　本発明者らによってPDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞へ誘導することが可能となり、当該膵芽細胞は、生体内でグルコース応答性のインスリン産生細胞へとなることが初めて見出された。本願で提供される方法で製造された膵芽細胞は、糖尿病等の膵臓疾患の再生医療に使用され得る。
図１は、多能性幹細胞から膵芽細胞を製造するプロトコールの概略図を示す。 図２は、各誘導方法で得られた細胞のPDX1陽性NKX6.1陰性細胞およびPDX1陽性NKX6.1陽性細胞の含有率を示す。図中d0は第２工程終了後の細胞を示し、W/Oは、第３工程において細胞を解離せず、培地交換のみを行った４日目の細胞を示し、Monolayerは、第３工程において接着培養を行った４日目の細胞を示し、Aggregateは、第３工程において浮遊培養を行った４日目の細胞を示す。（N=3-4） 図３は、各多能性幹細胞株（KhES3、585A1、604B1、692D2、648B1および409B2）から得られたPDX1陽性NKX6.1陽性細胞の含有率を示す。図中2Dは、第３工程において接着培養を行った場合を示し、Aggは、第３工程において浮遊培養を行った場合を示す。（Mean±S.D.,n=3） 図４Aは、第３工程の各経過日数後の細胞におけるPDX1およびNKX6.1の発現強度をフローサイトメーターを用いて測定した結果を示す。図４Bは、第３工程の各経過日数後のPDX1陽性NKX6.1陽性細胞の含有率を示す。(Mean±S.D.,n=3) 図５Aは、第３工程４日目の細胞凝集塊における膵芽細胞マーカー（PDX1、NKX6.1、SOX9およびGATA4）に対する免疫染色像を示す。 図５Bは、第３工程４日目の細胞凝集塊における内分泌細胞マーカー（INS、GCG、SomatostatinおよびGhrelin）に対する免疫染色像を示す。 図６Aは、第３工程１２日目の細胞凝集塊における膵芽細胞マーカー（PDX1、NKX6.1、SOX9およびGATA4）に対する免疫染色像を示す。 図６Bは、第３工程１２日目の細胞凝集塊における内分泌細胞マーカー（INS、GCG、SomatostatinおよびGhrelin）に対する免疫染色像を示す。 図７Aは、第３工程における培養条件を検討するための、プロトコールの概略図を示す。図中、黒矢印は、Noggin（NOG）、KGFおよびEGFを培養液に添加する条件を示し、白矢印は、Noggin（NOG）を添加しない、またはNoggin（NOG）、KGFおよびEGFを培養液に添加しない条件を示す。図７Bは、各条件で得られた細胞のPDX1陽性NKX6.1陰性細胞およびPDX1陽性NKX6.1陽性細胞の含有率を示す。 図８Aは、第３工程におけるALK5阻害剤IIの効果を検討するための、プロトコールの概略図を示す。図中、矢印は、ALK5阻害剤IIを添加する期間を示す。図８Bは、ALK5阻害剤IIを添加しなかった条件（左図）およびALK5阻害剤IIを添加した条件（右図）におけるPDX1（縦軸）およびNKX6.1（横軸）の発現をフローサイトメーターで測定した結果を示す。図中、数字は、PDX1陽性およびNKX6.1陽性の細胞の含有率を示す。 図９は、免疫不全マウス（NOD. CB17-Prkdcscid/J）の副精巣周囲脂肪組織へ移植した30日後の移植部位におけるPDX1およびインスリンに対する免疫染色像を示す。 図１０Aは、誘導した膵芽細胞を免疫不全マウスの腎被膜下へ移植した移植後の日数に対するマウスの血漿中のヒトC-Peptide量を示す。図１０Bは、グルコース負荷（+）による膵芽細胞移植マウスの血漿中のヒトC-Peptideの変化量を示す。 図１１Aは、多能性幹細胞から膵芽細胞を製造する接着条件プロトコールの概略図を示す。 図１１Bは、第３工程においてY-27632を50μM用いた場合（右図）での、膵芽細胞マーカー（PDX1（下図）およびNKX6.1（上図））に対する免疫染色像を示す。図中Water（左図）は陰性対照を示す。図１１Cは、第３工程において各濃度のY-27632を用いた場合のPDX1陽性NKX6.1陽性細胞およびPDX1陽性NKX6.1陰性細胞の含有率を示す。 図１２Aは、多能性幹細胞から膵芽細胞を製造する接着条件の改変プロトコールの概略図を示す。 図１２Bは、改変プロトコールの第３工程においてFasudilを50μM用いた場合（右図）での、膵芽細胞マーカー（PDX1（下図）およびNKX6.1（上図））に対する免疫染色像を示す。図中Water（左図）は陰性対照を示す。図１２Cは、第３工程において各濃度のFasudilを用いた場合のPDX1陽性NKX6.1陽性細胞およびPDX1陽性NKX6.1陰性細胞の含有率を示す。図中、Y50は、陽性対照として、Y-27632を50μM用いた場合の結果を示す。 図１３Aは、改変プロトコールの第３工程においてSR3677を5μM用いた場合（右図）での、NKX6.1に対する免疫染色像を示す。図中DMSO（左図）は陰性対照を示す。図１３Bは、改変プロトコールの第３工程において各濃度のSR3677を用いた場合のNKX6.1陽性細胞の含有率を示す。図中、Y50は、陽性対照として、Y-27632を50μM用いた場合の結果を示す。 図１３Cは、改変プロトコールの第３工程においてGSK269962を0.1μM用いた場合（右図）での、NKX6.1に対する免疫染色像を示す。図中DMSO（左図）は陰性対照を示す。図１３Dは、改変プロトコールの第３工程において各濃度のGSK269962を用いた場合のNKX6.1陽性細胞の含有率を示す。図中、Y50は、陽性対照として、Y-27632を50μM用いた場合の結果を示す。 図１４Aは、改変プロトコールの第３工程においてH-1152を50μM用いた場合（右図）での、NKX6.1に対する免疫染色像を示す。図中DMSO（左図）は陰性対照を示す。図１４Bは、改変プロトコールの第３工程において各濃度のH-1152を用いた場合のNKX6.1陽性細胞の含有率を示す。図中、Y50は、陽性対照として、Y-27632を50μM用いた場合の結果を示す。 図１４Cは、改変プロトコールの第３工程においてBlebbistatinを5μM用いた場合（右図）での、膵芽細胞マーカー（PDX1（下図）およびNKX6.1（上図））に対する免疫染色像を示す。図中DMSO（左図）は陰性対照を示す。図１４Dは、改変プロトコールの第３工程において各濃度のBlebbistatinを用いた場合のPDX1陽性NKX6.1陽性細胞の含有率を示す。図中、Y50は、陽性対照として、Y-27632を50μM用いた場合の結果を示す。
　本願の一つの態様として、PDX1陽性NKX6.1陰性細胞をKGF、EGFおよびBMP阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、膵芽細胞を製造する方法を提供する。
　膵芽細胞とは、内分泌細胞、膵管細胞および外分泌細胞などの膵臓を形成する細胞へと分化誘導できる細胞であり、少なくともPDX1およびNKX6.1が発現している細胞が例示される。このほかにも、SOX9、またはGATA4などの遺伝子マーカーが発現している細胞でも良い。
　本態様によって製造される膵芽細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、純化された集団であってもよい。好ましくは、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上または８０％以上の膵芽細胞が含まれる細胞集団である。
　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞を製造するにあたり、当該PDX1陽性NKX6.1陰性細胞は、KGF、EGFおよびBMP阻害剤を含む培地で細胞凝集塊の生成される条件下で培養しても良い。「細胞凝集塊の生成される条件下」とは、特に限定されず、培地中で細胞凝集塊が得られれば良い。例えば任意の方法で実質的に分離（または解離）することで単一細胞の状態とした後浮遊培養しても、または、予め細胞同士が接着した細胞凝集塊の状態で培養してもよい。好ましくは、単一細胞の状態に分離して浮遊培養する方法である。分離した単一細胞を浮遊培養することによって、細胞同士が接着して細胞凝集塊が生成する。あるいは、分離した細胞を遠心することで、細胞凝集塊を作製しても良い。分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシン、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Accutase(TM)およびAccumax(TM)（Innovative Cell Technologies, Inc）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。
　浮遊培養とは、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養することである。特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの、または、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）または２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体（Lipidure）によるコーティング処理）したものを使用して行うことができる。
　細胞凝集塊の大きさは、特に限定されないが、少なくとも３×１０３個以上の細胞によって細胞凝集塊が形成されていても良く、細胞凝集塊を構成する細胞数として、例えば、１×１０４個以上、２×１０４個以上、３×１０４個以上、４×１０４個以上、５×１０４個以上が挙げられる。
他の態様として、PDX1陽性NKX6.1陰性細胞は単一細胞の状態に分離して接着培養する。または、単一細胞の状態に分離した後、後述する（工程２）で使用される培地中で接着培養する。当該（工程２）で使用される培地中で接着培養する期間は、特に限定されないが、例えば、１日以上、２日以上または３日以上が挙げられ、より好ましくは、1日である。当該（工程２）で使用される培地には、多能性幹細胞を単一細胞の状態に分離した際のアポトーシスを抑制する目的でROCK阻害剤を使用することが望ましく、当該ROCK阻害剤は、後述するものと同様のものを用いることができ、好ましくは、Y-27632である。
本願明細書及び請求の範囲において接着培養とは、コーティング処理された培養皿にて培養することである。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD Biosciences）、Synthemax（Corning）、ゼラチン、細胞外タンパク質（例えば、コラーゲン、ラミニン（例えば、ラミニン１１１、４１１または５１１）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン等）、または当該細胞外タンパク質の断片、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程に使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へKGF、EGFおよびBMP阻害剤を適宜添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。１つの実施形態において、基礎培地は、B27サプリメントを含むIMEM Zinc Option培地である。
　KGFは、Keratinocyte Growth Factorと呼ばれるタンパク質であり、FGF-7と呼ばれることもある。KGFは、R&D systems社等の市販されているものを使用することができる。KGFの濃度は、１ ng/mlから1 μg/ml、好ましくは、5 ng/mlから500 ng/ml、より好ましくは、10 ng/mlから200 ng/mlである。
　EGFは、上皮成長因子またはEpidermal Growth Factorと呼ばれるタンパク質である。EGFは、R&D systems社等の市販されているものを使用することができる。EGFの濃度は、１ ng/mlから1 μg/ml、好ましくは、5 ng/mlから500 ng/ml、より好ましくは、10 ng/mlから100 ng/mlである。
　BMP阻害剤は、Chordin、Noggin、Follistatin、などのタンパク質性阻害剤、Dorsomorphin (すなわち、6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine)、その誘導体 (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3(8):e2904)およびLDN-193189（すなわち、4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline）が例示される。好ましくは、Nogginである。Nogginは、Peprotech社等の市販されているものを使用することができる。
　BMP阻害剤としてNogginを用いる場合、その濃度は、１ ng/mlから1 μg/ml、好ましくは、5 ng/mlから500 ng/ml、より好ましくは、50 ng/mlから200 ng/mlである。
　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程に使用される培地は、さらにROCK阻害剤または非筋ミオシンII阻害剤を含んでいてもよい。上述したPDX1陽性NKX6.1陰性細胞を接着培養を行う場合においては、ROCK阻害剤または非筋ミオシンII阻害剤を培地へさらに添加することが好ましい。
ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632（例、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（例、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、SR3677（例、Feng Y et al., J Med Chem. 51: 6642-6645(2008)参照）、GSK269962（例、Stavenger RA et al., J Med Chem. 50: 2-5 (2007)またはWO2005/037197参照）、H-1152（例、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（例、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）およびそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本発明では、１種または２種以上のROCK阻害剤が使用され得る。本工程で用いる好ましいROCK阻害剤としては、Y-27632、Fasudil/HA1077、SR3677、GSK269962およびH-1152が挙げられる。
　ROCK阻害剤としてY-27632を用いる場合の培地中の濃度は、0.1μMから100μM、好ましくは、1μMから500μM、さらに好ましくは、10μＭから200μMである。
　本発明において、ROCK阻害剤としてFasudil/HA1077を用いる場合の培地中の濃度は、1μMから100μM、好ましくは、10μMから100μMである。
　本発明において、ROCK阻害剤としてSR3677を用いる場合の培地中の濃度は、0.1μMから50μM、好ましくは、0.5μMから50μMである。
　本発明において、ROCK阻害剤としてGSK269962を用いる場合の培地中の濃度は、0.001μMから100μM、好ましくは、0.005μMから50μM、さらに好ましくは、0.05μMから120μMである。
　本発明において、ROCK阻害剤としてH-1152を用いる場合の培地中の濃度は、5μMから100μM、好ましくは、10μMから50μMである。
　非筋ミオシンII阻害剤は、非筋ミオシンIIの重鎖アイソフォームの一つである非筋ミオシンIIAまたは非筋ミオシンIIBの重鎖サブユニットのATPase活性の阻害剤、ミオシン軽鎖キナーゼの阻害剤が例示される。このような薬剤として、例えば、ブレビスタチン（Blebbistatin）A3、Calphostin C、Goe6976、Goe7874、Fasudil/HA1077、Hypericin、K-252a、KT5823、ML-7、ML-9、Piceatannol、Staurosporine、W-5、W-7、W-12、W-13、Wortmannin等が挙げられるがこれらに限定されない。本工程で用いる好ましい非筋ミオシンII阻害剤としては、ブレビスタチンおよびFasudil/HA1077が挙げられる。
　本発明において、非筋ミオシンII阻害剤としてブレビスタチンを用いる場合の培地中の濃度は、1μMから200μM、好ましくは、10μMから100μMである。
　本発明のPDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程に使用される培地は、さらにTGFβ阻害剤を含んでいてもよい。TGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、またはALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されず、例えば、Lefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345 、SD093、 SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A-83-01(WO 2009146408) ALK5阻害剤II（２－［３－［６－メチルピリジン－２－イル］－１Ｈ－ピラゾル－４－イル］－１，５－ナフチリジン）、TGFβRIキナーゼ阻害剤VIII（６－［２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－［６－メチル－ピリジン－２－イル］－１Ｈ－イミダゾル－４－イル］－キノキサリン）およびこれらの誘導体などが例示される。好ましくは、ALK5阻害剤IIであり得る。
　TGFβ阻害剤としてALK5阻害剤IIを用いる場合の培地中の濃度は、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１から５０μＭ、さらに好ましくは、１μＭから２０μＭである。
　TGFβ阻害剤を添加する場合、PDX1陽性NKX6.1陰性細胞の培養開始後、２日経過後に添加することが望ましい。添加期間は特に限定されないが、１日以上、２日以上、３日以上または４日以上が例示される。
　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程の日数は、長期間培養することで膵芽細胞の製造効率に特に影響がないため上限はないが、例えば、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上または１４日以上が挙げられる。より好ましくは、４日以上２０日以下である。
　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。
　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞とは、PDX1を発現しているが、NKX6.1を発現していない細胞であれば、特に限定されない。PDX1を発現しているとは、公知の方法にて、PDX1遺伝子または遺伝子産物を検出できることを意味し、NKX6.1を発現していないとは、NKX6.1遺伝子または遺伝子産物を検出できないことを意味し、当該検出方法として、例えば、免疫染色法などが例示される。
　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞は、生体内から単離されていてもよく、既知の方法にて、多能性幹細胞等の他の細胞種から製造されてもよい。ある態様においてPDX1陽性NKX6.1陰性細胞は、次の工程を含む方法で多能性幹細胞より製造された細胞であっても良い：
（工程１）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、および
（工程２）工程１で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程。
従って、上述のPDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞誘導する方法を工程３として適用することで、ある態様として次の工程を含む、多能性幹細胞から膵芽細胞を製造する方法も提供する：
（工程１）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、
（工程２）工程１で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程、
（工程３）工程２で得られた細胞（PDX1陽性NKX6.1陰性細胞）を単一細胞へ分離後、KGF、EGFおよびBMP阻害剤を含む培地で培養する工程。
　これらの態様の多能性幹細胞をアクチビンを含む培地で培養する工程（工程１）で使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へアクチビンを適宜添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。１つの実施形態において、基礎培地は、B27サプリメントを含むRPMI 1640培地である。
　本態様の工程１において、多能性幹細胞は、任意の方法で実質的に分離（または解離）することで単一細胞の状態として培養してもよく、または、細胞同士が接着した細胞凝集塊の状態で培養してもよい。より好ましくは、単一細胞の状態に分離して培養する。分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Accutase(TM)およびAccumax(TM)（Innovative Cell Technologies, Inc）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。多能性幹細胞は、コーティング処理された培養皿を用いて接着培養することができる。
　本態様の工程１における接着培養は、前述の条件と同じ方法によって行い得る。
　アクチビンは、アクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＡＢのいずれのアクチビンもよいが、特にアクチビンＡが好適に用いられる。また、アクチビンとしてはヒト、マウス等いずれの哺乳動物由来のアクチビンをも使用することができる。本発明に使用するアクチビンとしては、分化に用いる多能性幹細胞と同一の動物種由来のアクチビンを用いることが好ましく、例えばヒト由来の多能性幹細胞を出発原料とする場合、ヒト由来のアクチビンを用いることが好ましい。これらのアクチビンは商業的に入手可能である。
　アクチビンを用いる場合、培地中の濃度は、通常０．１から２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５から１５０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは１０から１００ｎｇ／ｍｌである。
　工程１に使用される培地は、さらにＧＳＫ３阻害剤および/またはROCK阻害剤を含んでいてもよい。ＧＳＫ３阻害剤とは、GSK－3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK－3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、SB415286（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK－3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK－3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）および高い選択性を有するCHIR99021(6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile)が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能である。他の入手先から入手しても、あるいは自ら作製してもよい。本発明で使用されるGSK-3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。
　CHIR99021を用いる場合、培地中の濃度は、通常０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１μＭから１０μＭ、特に好ましくは１μＭから５μＭである。
　ＧＳＫ３阻害剤を添加する場合、多能性幹細胞の培養開始時に添加することが望ましい。添加期間は特に限定されないが、１日以上、２日以上または３日以上が例示され、好ましくは１日から３日である。
工程１に使用されるROCK阻害剤は、上述したものと同様のものを用いることができ、好ましくは、Y-27632である。本発明において、ROCK阻害剤を添加する場合、多能性幹細胞を単一細胞の状態に分離した際のアポトーシスを抑制する目的で使用することができ、添加期間は特に限定されないが、１日以上、または２日以上が例示され、好ましくは１日である。
　工程１の日数は、長期間培養することで膵芽細胞の製造効率に特に影響がないため上限はないが、例えば、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、または７日以上が挙げられる。より好ましくは、４日である。
　工程１で得られた細胞をKGFを含む培地で培養する工程（工程２）で使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へKGFを適宜添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。１つの実施形態において、基礎培地は、B27サプリメントを含むIMEM Zinc Option培地である。
　工程２で用いるKGFは、上述と同様のものを用いることができ、KGFの濃度は、上述より低濃度を用いることが好ましく、例えば、１ ng/mlから500 ng/ml、好ましくは、10 ng/mlから100 ng/mlである。
　工程２に使用される培地は、さらにBMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含んでもよい。
　工程２で用いるBMP阻害剤は、上述と同様の条件で用いることができる。
　工程２に用いるレチノイン酸誘導体は、天然のレチノイン酸が有する機能を保持する人工的に修飾されたレチノイン酸を意味し、例えば、4-[[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)carbonyl]amino]-Benzoic acid（AM580）（Tamura K,et al., Cell Differ. Dev. 32: 17-26 (1990)）、4-[(1E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propen-1-yl]-Benzoic acid（TTNPB）（Strickland S, et al., Cancer Res. 43: 5268-5272 (1983))、パルミチン酸レチノール、レチノール、レチナール、３－デヒドロレチノイン酸、３－デヒドロレチノール、３－デヒドロレチナール、または、Abe, E., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 78: 4990-4994 (1981)、 Schwartz, E. L.et al., Proc.Am.Assoc.Cancer Res. 24: 18 (1983)、および Tanenaga, K. et al., Cancer Res. 40: 914-919 (1980) に記載されている化合物が挙げられる。本工程で用いる好ましいレチノイン酸誘導体としては、TTNPBが挙げられる。本工程で用いるレチノイン酸誘導体の濃度は、使用するレチノイン酸誘導体に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、レチノイン酸誘導体としてTTNPBを用いる場合、1ｎMから100ｎM、好ましくは、５ｎMから５0ｎM、さらに好ましくは、５ｎＭから１０ｎMである。
　工程２に用いるヘッジホッグ経路阻害剤は、ソニック・ヘッジホッグ、インディアン・ヘッジホッグ、およびデザート・ヘッジホッグのいずれかが膜受容体であるPatchedに結合して起こるシグナル、例えば、Smoothenedの活性を阻害する化合物を意味し、ヘッジホッグが受容体に結合して起こるシグナルを阻害すれば、特に限定されないが、例えば、シクロパミン、ジェルビン、3-Keto-N-(aminoethyl-aminocaproyl- dihydro-cinnamoyl)（KAAD）-シクロパミン、CUR-61414、SANT-1、SANT-2、SANT-3、SANT-4、IPI-926、IPI-269609、GDC-0449およびNVP-LDE-225が挙げられる。好ましくは、KAAD-シクロパミンである。工程２で用いるヘッジホッグ経路阻害剤の濃度は、使用するヘッジホッグ経路阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ヘッジホッグ経路阻害剤としてKAAD-シクロパミンを用いる場合、0.1 nMから1 μＭ、好ましくは、1 nMから500 nMである。
　本願明細書および請求の範囲において多能性幹細胞とは、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、例えば胚性幹(ES)細胞(J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）、精子幹細胞（「GS細胞」）(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)、胚性生殖細胞（「EG細胞」）(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)、人工多能性幹(iPS)細胞（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；WO2007/069666）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）（WO2011/007900）などが含まれる。より好ましくは、多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞である。
　iPS細胞は移植用膵芽細胞の材料として特に好適に用いられる。得られた膵芽細胞を医薬として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型と同一もしくは実質的に同一である体細胞から得たiPS細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。
　他の態様においては、上記の工程を用いて得られた膵芽細胞を医薬（特に細胞医療の為の医薬）として利用することができる。当該細胞は、投与前に、放射線を照射する、または、マイトマイシンＣなどの細胞増殖を抑止する薬剤によって処理されても良い。
　得られた膵芽細胞を生理食塩水等に懸濁させ細胞懸濁液を医薬として用い、患者の膵臓、腸間膜、脾臓、肝臓および腎臓（特に、腎被膜化）へ直接投与もしくはポリビニルアルコール（PVA）（Qi Z et al., Cell Transplant.21: 525-534 (2012)）またはアルギン酸（Dufrane D, et al., Transplantation 90: 1054-1062 (2010)）でカプセル化して投与することによって行い得る。投与の際、当該細胞は、ポリエチレングリコール、ゼラチン、またはコラーゲン等の足場材と共に投与しても良い。投与する細胞数は、体躯の大きさに合わせて適宜増減して用いても良く、例えば、１×１０８から１×１０１０細胞／個体、好ましくは、５×１０８から１×１０１０細胞／個体、さらに好ましくは、１×１０９から１×１０１０細胞／個体である。
　当該膵芽細胞を含む医薬は、膵疾患の治療に用いても良く、膵疾患には、急性膵炎、慢性膵炎、糖尿病、膵癌、ランゲルハンス島腫瘍などが例示される。本発明の膵芽細胞は、体内で、グルコース濃度に対応して、インスリンを分泌するインスリン産生細胞へと誘導されることから、糖尿病に対して有効である。特に、インスリン産生細胞が死滅する、１型糖尿病に有効である。
　本明細書中に記載される「細胞」の由来は、ヒト及び非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなど）であり、特に限定はされないが、ヒト由来の細胞が特に好ましい。
　以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
　膵芽細胞分化誘導
　ヒトES細胞株KhES3は、京都大学より受領し、従来の方法で培養した（H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932）。(あるいはEssential8, CorningのSynthemaxを用いたfeeder free条件にて培養した。)KhES3を図１に記載したプロトコールに従って膵芽細胞へと誘導した。詳細には、培養皿に対しておおよそ70％コンフルエントに増殖したヒトES細胞株KhES3をCTK溶液（リプロセル）を用いて剥離させ、続いてAccutase（Innovative Cell Technologies）を用いて個々の細胞へと分離し、Matrigel（BD）をコートした24 wellあるいは6 well　plate （Greiner）に2.0×105/well～3.0×105/wellにて播種した後、次の工程によって膵芽細胞へと分化誘導した。
　（第１工程）
　2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地（ナカライテスク）（0.4 ml/well）に100 ng/ml アクチビンＡ（R&D systems）、3 μM CHIR99021（Axon Medchem）および10 μM Y-27632（WaKo）を添加して1日間培養した。培地を100　ng/mlアクチビンＡおよび2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地（0.8ml/well）に交換し、2日間培養した。さらに、培地を100ng/ml アクチビンＡおよび2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地（0.4ｍｌ/well）に交換し、1日間培養した。
　（第２工程）
　50 ng/ml KGF(R&D systems)および1％のB-27（Life Technologies）を含むImproved MEM Zinc Option培地(Invitrogen社)（0.8ml/well）に交換して3日間培養した。続いて、0-50 ng/ml KGF、100 ng/ml Noggin（Peprotech）、5又は10nM TTNPB（Santa Cruz Biotechnology）、0.5 μM 3－Keto－N－aminoethyl－N'－aminocaproyldihydrocinnamoyl Cyclopamine（KAAD‐シクロパミンまたはK-CYC）(Toronto Research Chemicals)および1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地（0.8ml/well）に交換して3日間培養した。
　（第３工程）
　第２工程で得られた細胞をTrypsinを用いて単一細胞へと分離し、低接着96ウェルプレート（Lipidure Coat、NOF）に3.0×103～3.0×104/wellにて播種した。100 ng/ml KGF、100 ng/ml Noggin、50ng/ml EGF（R&D systems）、10 μM Y-27632および1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地（15×104/ml）を添加してさらに4日間から20日間培養した。この時、同じ培地で4日おきに培地交換した。また、対照として、第２工程で得られた細胞をTrypsinを用いて単一細胞へと分離し、Matrigelをコートした24 well　plate （Greiner）に6.0×104～4.8×105/cm2にて播種して、同様の培地により4日間接着培養を行った。同様に、対照として、第２工程で得られた細胞を分離せず、同様の培地へ交換して4日間培養を行った。
　第３工程４日後に得られた細胞（S3d4）をBD Cytofix/CytopermTM Kitを用いて処理した後、抗PDX1抗体（R&D systems）および抗NKX6.1抗体（University of Iowa）を用いて染色しフローサイトメーターにてPDX1陽性細胞率またはPDX1およびNKX6.1両陽性細胞率を検出したところ、第３工程において、細胞を分離し、細胞凝集塊を作製した場合、PDX1およびNKX6.1両陽性細胞率が増加することが確認された（図２）。また、細胞凝集塊が、3.0×103個以上で構成されることで十分であることが確認された。
　種々のiPS細胞株での検討
　4種の末梢血単核球由来のiPS細胞株（585A1、604B1、692D2および648B1（全て、Okita K, et al, Stem Cells. 2013 31:458-466））ならびに1種の線維芽細胞由来のiPS細胞株（409Ｂ2（Okita K, et al, Nat Methods. 2011 8:409-412）は、京都大学iPS細胞研究所より入手可能である。京都大学より入手したこれらのiPS細胞株を用いて、上記と同様の工程により、膵芽細胞へと分化誘導した。
　その結果、5種のiPS細胞株いずれから出発した場合においても、（第3工程）にて細胞凝集塊（Agg）を形成した方が、接着培養（2D）よりもPDX1およびNKX6.1両陽性細胞率が増加することが確認された（図３）。
　培養期間検討
　ヒトES細胞株KhES3を用いて、（第3工程）の期間を0日（S3d0）、1日（S3d1）、2日（S3d2）、4日（S3d4）、8日（S3d8）、12日（S3d12）、16日（S3d16）および20日（S3d20）間行ったところ、8日間以上行った場合にPDX1およびNKX6.1両陽性細胞率が高くなった。このとき12日間行ったあたりで、最大に達し、以後培養を継続することで特に効率が減弱することは確認されなかった（図4AおよびB）。
　さらに、ヒトES細胞株KhES3を用いて、（第3工程）での細胞凝集塊を3.0×104/wellにて形成させ、４日間（S3d4）または１２日間（S3d12）培養した後の細胞凝集を膵芽細胞マーカー（PDX1、NKX6.1、SOX9およびGATA4）および内分泌細胞マーカー（INS、GCG、SomatostatinおよびGhrelin）に対する抗体を用いて免疫染色を行った（図５および図６）。細胞凝集塊形成から１２日（S3d12）において、膵芽細胞マーカーの発現している細胞が増大し、内分泌細胞マーカーを発現する細胞が多く現れたことが確認された。
　第３工程を４日間行った後、1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地（15×104/ml）で培養、あるいは100 ng/ml KGF、50ng/ml EGF（R&D systems）、1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地（15×104/ml）で培養しても、PDX1およびNKX6.1両陽性細胞率が４日後に比べ１２日後で増加することから（図７B）、第３工程を４日以上行うことで細胞の運命が決定されると考える。このことから第３工程は少なくとも４日行うことが望ましい。
　ALK5阻害剤IIの添加検討
　ALK5阻害剤II（Santa Cruz）の処理は、第３工程２日目以降で１-2日間の処理（図８A）でPDX1およびNKX6.1両陽性細胞率を増加させた（図８B）。
　膵芽細胞の評価
　第３工程は１２日目の細胞凝集塊を回収し、免疫不全マウス（NOD. CB17-Prkdcscid/J）（Charles river）の副精巣周囲脂肪組織へ移植し、30日後移植部位を回収したところ管構造をとるPDX1陽性細胞に隣接するインスリン陽性細胞の塊が生じたことから、誘導した膵芽細胞は、in vivoで膵上皮様の構造を形成することが確認された（図９）。
　誘導膵芽細胞の治療効果
　第３工程４日目、5日目、または１２日目の細胞凝集塊を回収し、培養後の細胞を生理食塩水で洗浄し、培地を除去した細胞凝集塊の濃縮物、または、培養上清を除去した細胞凝集塊の濃縮物を調整した。
　この他にも、第３工程４日目の細胞凝集塊を回収し、5 μM ALK5阻害剤II（Santa Cruz）を添加した1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地（15×104/ml）中で１日間培養し、培養後の細胞を生理食塩水で洗浄し、培地を除去した細胞凝集塊の濃縮物、または、培養上清を除去した細胞凝集塊の濃縮物を調整した。
　得られた細胞凝集塊の濃縮物を、免疫不全マウス（NOD. CB17-Prkdcscid/J）の腎臓被膜下に移植した。
　膵芽細胞の腎被膜化移植後150日目において、同マウスから末梢血を採取し、ELISAキット（Mercodia）を用いて血漿中のヒトC-Peptideの量を測定したところ、14匹中13匹においてヒトC-Peptideが確認された。また、いずれの方法で調整された細胞凝集塊の濃縮物の移植においても、150日後に、血漿中ヒトC-Peptideを検出できた。さらに、移植後30日から150日間の時間経過と共にC-Peptideの量が増大することが確認された（図１０A）。
　続いて、移植後150日目のマウスに対して、絶食5時間以上後にグルコースを3 g/kg腹腔内投与した場合の、ヒトC-Peptideの増加量を測定したところ、グルコース投与群において、有意にC-Peptideの量が増加していることが確認された（図１０B）。このことは、9匹中5匹において確認された。
　以上より、投与された誘導膵芽細胞は生体内に生着した後、血中グルコース量に応答して、インスリンを産生する機能を有していることが確認された。従って、当該誘導膵芽細胞は、インスリン分泌不全に対する治療剤として利用できることが示唆された。
　接着培養でのプロトコール（図１１A）の検討
（第１工程）
　iPS細胞株（585A1）をMatrigelをコートした24 well plateに2.0×105/wellで播種し、2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地（ナカライテスク）に100 ng/ml アクチビンＡ（R&D systems）、3 μM CHIR99021（Axon Medchem）および10 μM Y-27632（WaKo）を添加して1日間培養した。培地を100 ng/mlアクチビンＡ、1 μM CHIR99021および2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地に交換し、2日間培養した。さらに、培地を100ng/ml アクチビンＡおよび2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地に交換し、1日間培養した。
　（第２工程）
　第１工程で得られた培養物の培地を、50 ng/ml KGF(R&D systems)および1％のB-27（Life Technologies）を含むImproved MEM Zinc Option培地(Invitrogen社)に交換して3日間培養した。続いて、50 ng/ml KGF、100 ng/ml Noggin（Peprotech）、10nM TTNPB（Santa Cruz Biotechnology）、0.5 μM 3－Keto－N－aminoethyl－N'－aminocaproyldihydrocinnamoyl Cyclopamine（KAAD‐シクロパミンまたはK-CYC）(Toronto Research Chemicals)および1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地に交換して3日間培養した。
　（第３工程）
　第２工程で得られた細胞を、Trypsinを用いて単一細胞へと分離し、Matrigelをコートした24 well　plateに1.6×105～2.4×105/ cm2にて播種した。100 ng/ml KGF、100 ng/ml Noggin、50ng/ml EGF（R&D systems）、各濃度のY-27632および1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地（15×104/ml）を添加して4日間培養した。
　得られた細胞をBD Cytofix/CytopermTM Kitを用いて処理した後、抗PDX1抗体（R&D systems）および抗NKX6.1抗体（University of Iowa）を用いて染色しフローサイトメーターにてPDX1およびNKX6.1両陽性細胞率を検出した。
　第３工程において、Y-27632を用いた場合、濃度依存的にPDX1およびNKX6.1両陽性細胞の含有率が上昇し、100μMで最もその効果が高かった（図１１BおよびC）。
　以上のように、第３工程にて、細胞を解離後、ROCK阻害剤を用いることによって接着培養によりPDX1およびNKX6.1両陽性細胞が産生することが確認された。
　接着培養でのプロトコール（図１２A）と第３工程での添加剤の検討
（第１工程）
　iPS細胞株（585A1）をMatrigelをコートした24 well plateに2.0×105/wellで播種し、2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地（ナカライテスク）に100 ng/ml アクチビンＡ（R&D systems）、3 μM CHIR99021（Axon Medchem）および10 μM Y-27632（WaKo）を添加して1日間培養した。培地を100 ng/mlアクチビンＡ、1 μM CHIR99021および2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地に交換し、2日間培養した。さらに、培地を100ng/ml アクチビンＡおよび2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地に交換し、1日間培養した。
　（第２工程）
　50 ng/ml KGF(R&D systems)および1％のB-27（Life Technologies）を含むImproved MEM Zinc Option培地(Invitrogen社)に交換して3または4日間培養した。続いて、50 ng/ml KGF、100 ng/ml Noggin（Peprotech）、10nM TTNPB（Santa Cruz Biotechnology）、0.5 μM 3－Keto－N－aminoethyl－N'－aminocaproyldihydrocinnamoyl Cyclopamine（KAAD‐シクロパミンまたはK-CYC）(Toronto Research Chemicals)および1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地に交換して2または3日間培養した。
　（第３工程）
　第２工程で得られた細胞をTrypsinを用いて単一細胞へと分離し、Matrigelをコートした24 well　plateに1.6×105～2.4×105/ cm2にて播種した。50 ng/ml KGF、100 ng/ml Noggin、10nM TTNPB、0.5 μM KAAD‐シクロパミン、10 μM Y-27632および1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地を加え、1日間培養した。続いて、培地を100 ng/ml KGF、100 ng/ml Noggin、50ng/ml EGF（R&D systems）、各化合物（Y-27632、Fasudil（HA-1077）、SR3677、GSK269962、H-1152およびBlebbistatin）および1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地（15×104/ml）を添加してさらに4日間培養した。
　得られた細胞をBD Cytofix/CytopermTM Kitを用いて処理した後、抗PDX1抗体（R&D systems）および抗NKX6.1抗体（University of Iowa）を用いて染色しフローサイトメーターまたはイメージアナライザーにてNKX6.1陽性細胞率またはPDX1およびNKX6.1両陽性細胞率を検出した。
　第３工程において、Fasudilを用いた場合、濃度依存的にPDX1およびNKX6.1両陽性細胞の含有率が上昇し、50μMで最もその効果が高かった（図１２BおよびC）。
　第３工程において、SR3677を用いた場合、濃度依存的にNKX6.1陽性細胞の含有率が上昇し、5μMで最もその効果が高かった（図１３AおよびB）。
　第３工程において、GSK269962を用いた場合、濃度依存的にNKX6.1陽性細胞の含有率が上昇し、1μMで最もその効果が高かった（図１３CおよびD）。
　第３工程において、H-1152を用いた場合、濃度依存的にNKX6.1陽性細胞の含有率が上昇し、50μMで最もその効果が高かった（図１４AおよびB）。
　第３工程において、Blebbistatinを用いた場合、5μMでPDX1およびNKX6.1両陽性細胞の含有率が上昇し、20μMまでその効果が高かった（図１４CおよびD）。
　以上のように、細胞を解離し、第３工程にて、第２工程と同様の培地を用いて細胞を接着培養し、さらに、第３工程にて、ROCK阻害剤または非筋ミオシンII阻害剤を添加することでPDX1およびNKX6.1両陽性細胞率が増加することが確認された。

Claims (29)

  1. 　PDX1陽性NKX6.1陰性細胞を、KGF、EGFおよびBMP阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、膵芽細胞の製造方法。
  2. 　前記培地が、さらにROCK阻害剤または非筋ミオシンII阻害剤を含む培地である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ROCK阻害剤または非筋ミオシンII阻害剤が、Y-27632、Fasudil、SR3677、GSK269962、H-1152およびBlebbistatinから成る群より選択されるいずれか一つの化合物である、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記培養が、接着培養条件下で行われる、請求項２または３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記培養が、細胞凝集塊の生成される条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記PDX1陽性NKX6.1陰性細胞が、次の２つの工程を含む方法で多能性幹細胞より製造された細胞である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法：
    （１）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、および
    （２）工程（１）で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程。
  7. 　前記工程（１）において、アクチビンを含む培地がさらにＧＳＫ３阻害剤を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記工程（２）において、KGFを含む培地がさらにBMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む、請求項６または７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記BMP阻害剤が、Nogginである、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記ＧＳＫ３阻害剤が、CHIR99021である、請求項７から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記レチノイン酸誘導体が、TTNPBである、請求項８から１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記ヘッジホッグ経路阻害剤が、KAAD‐シクロパミンである、請求項８から１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記膵芽細胞がPDX1陽性およびNKX6.1陽性である請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記膵芽細胞が、ヒト細胞である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　以下の工程（i）から（iii）を含む、多能性幹細胞から膵芽細胞を製造する方法：
    （i）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、
    （ii）工程（i）で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程、
    （iii）工程（ii）で得られた細胞を、単一細胞へ分離し、KGF、EGFおよびBMP阻害剤を含む培地で培養する工程。
  16. 　前記工程（iii）で用いるKGF、EGFおよびBMP阻害剤を含む培地が、さらにROCK阻害剤または非筋ミオシンII阻害剤を含む培地である、請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記ROCK阻害剤または非筋ミオシンII阻害剤が、Y-27632、Fasudil、SR3677、GSK269962、H-1152およびBlebbistatinから成る群より選択されるいずれか一つの化合物である、請求項１６に記載の方法。
  18. 　前記工程（iii）が、単一細胞へ分離し、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養後、KGF、EGFおよびBMP阻害剤を含む培地で培養する工程である、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 　前記工程（iii）での培養が、接着培養条件下で行われる、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 　前記工程（iii）での培養が、浮遊培養条件下で行われる、請求項１５に記載の方法。
  21. 　前記工程（i）において、アクチビンを含む培地がさらにＧＳＫ３阻害剤を含む、請求項１５から２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 　前記工程（ii）において、KGFを含む培地がさらにBMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む、請求項１５から２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 　前記BMP阻害剤が、Nogginである、請求項１５から２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 　前記ＧＳＫ３阻害剤が、CHIR99021である、請求項２１から２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 　前記レチノイン酸誘導体が、TTNPBである、請求項１８、または請求項２２から２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 　前記ヘッジホッグ経路阻害剤が、KAAD‐シクロパミンである、請求項１８、または請求項２２から２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 　前記膵芽細胞が、PDX1陽性およびNKX6.1陽性である請求項１５から２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 　前記膵芽細胞が、ヒト細胞である、請求項１５から２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 　請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法で製造された膵芽細胞を含む、糖尿病の治療剤。
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