JP7414530B2 - 細胞凝集体、細胞凝集体の混合物及びそれらの製造方法 - Google Patents
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Description
[1]
FOXA2陽性又はTUJ1陽性の神経系細胞を含み、
1000個以上の細胞を含む、細胞凝集体。
[2]
FOXA2陽性又はTUJ1陽性の神経系細胞を、全細胞数の約70%以上含む、[1]に記載の細胞凝集体。
[3]
培養時に細胞死が抑制され得る、[1]又は[2]に記載の細胞凝集体。
[4]
以下から選択される少なくとも一つの特徴を更に有する、[1]~[3]のいずれかに記載の細胞凝集体:
(a1)円相当径が100μm~2000μmであること、
(a2)包絡度が0.5以上であること、
(a3)フェレ径比が0.5以上であること、及び
(a4)円形度が0.3以上であること。
[5]
表面にデブリ層を有さず顕微鏡下で細胞凝集体の境界線が明瞭である、[1]~[4]のいずれかに記載の細胞凝集体。
[6]
複数の細胞凝集体の混合物であって、[1]~[5]のいずれかに記載の細胞凝集体を全細胞凝集体数の50%以上含む、細胞凝集体の混合物。
[7]
円形度、最小径、最大径、垂直フェレ径もしくは水平フェレ径、フェレ径比、円相当径、周囲長、面積、及び、周囲長の包絡度もしくは面積の包絡度からなる群より選択される指標のうち1以上の指標において、15%以下の変動係数を有する、[6]に記載の細胞凝集体の混合物。
[8]
接着性細胞集団の混合物の製造方法であって、
(1)複数の幹細胞を第一の分化誘導因子存在下で分化誘導し、第一分化段階にある神経前駆細胞を1以上含む複数の細胞を得る工程;
(2)工程(1)で得られた複数の細胞から第一分化段階にある神経前駆細胞を選択的に分離する工程であって、
液体媒体の連続的な流れの中に、工程(1)で得られた複数の細胞を浮遊させること、及び
第一分化段階にある神経前駆細胞を識別し、第一分化段階にある神経前駆細胞とそうでない細胞とを、別々の液体媒体の連続的な流れへ流れるように分離することを含む、工程;並びに
(3)工程(2)で分離された第一分化段階にある神経前駆細胞を第二の分化誘導因子存在下で培養して、接着性細胞集団の混合物を得る工程であって、
接着性細胞集団の混合物は、以下の(b1)及び(b2)の特徴を有する接着性細胞集団を、全接着性細胞集団数の50%以上含む工程を備える、製造方法:
(b1)第二分化段階にある神経系細胞を含むこと、及び
(b2)1000個以上の細胞を含むこと。
[9]
(b1)及び(b2)の特徴を有する接着性細胞集団が、培養時に細胞死が抑制され得る、[8]に記載の製造方法。
[10]
接着性細胞集団を14~20日間培養した場合に、培養終了時における細胞数が、培養開始時における細胞数の5%以上、好ましくは10%以上である、[9]に記載の製造方法。
[11]
接着性細胞集団の混合物が細胞凝集体の混合物である、[8]~[10]のいずれかに記載の製造方法。
[12]
接着性細胞集団が細胞凝集体であり、上記(b1)及び(b2)の特徴を有する細胞凝集体の円相当径が100μm~2000μmである、[11]に記載の製造方法。
[13]
(b1)及び(b2)の特徴を有する接着性細胞集団が細胞凝集体であって、以下の特徴を更に有する、[12]に記載の製造方法:
(b3)包絡度が0.5以上であること
(b4)フェレ径比が0.5以上であること、及び
(b5)円形度が0.3以上であること。
[14]
細胞凝集体の混合物が、円形度、最小径、最大径、垂直フェレ径もしくは水平フェレ径、フェレ径比、円相当径、周囲長、面積、及び、周囲長の包絡度もしくは面積の包絡度からなる群より選ばれる指標のうち1以上の指標において、15%以下の変動係数を有する、[11]~[13]のいずれかに記載の製造方法。
[15]
工程(2)において、第一分化段階にある神経前駆細胞が、マイクロ流路方式セルソーターを用いて分離される、[8]~[14]のいずれかに記載の製造方法。
[16]
工程(2)において、第一分化段階にある神経前駆細胞が閉鎖系で分離される、[8~[15]のいずれかに記載の製造方法。
[17]
幹細胞が多能性幹細胞である、[8]~[16]のいずれかに記載の製造方法。
[18]
第一分化段階にある神経前駆細胞が、中脳底板へ運命づけられた神経前駆細胞である、[8]~[17]のいずれかに記載の製造方法。
[19]
第一分化段階にある神経前駆細胞が、Corin及び/又はLrtm1陽性の細胞である、[18]に記載の製造方法。
[20]
第二分化段階にある神経系細胞が、TUJ1、OTX2、FOXA2、LMX1A、LMX1B、EN1、Nurr1、PITX3、DAT、GIRK2及びTHからなる群より選ばれるマーカーの少なくとも1つについて陽性の神経系細胞である、[8]~[19]のいずれかに記載の製造方法。
[21]
第二分化段階にある神経系細胞が、FOXA2陽性かつTUJ1陽性のドーパミン産生神経前駆細胞である、[20]に記載の製造方法。
[22]
[8]~[21]のいずれかに記載の製造方法により得られる接着性細胞集団の混合物。
[23]
接着性細胞集団の製造方法であって、
[8]~[21]のいずれかに記載の製造方法により得られる接着性細胞集団の混合物から、上記(b1)及び(b2)の特徴を有する接着性細胞集団を分離する工程を備える、製造方法。
[24]
[23]に記載の製造方法により得られる接着性細胞集団。
[25]
[1]~[5]のいずれかに記載の細胞凝集体、[6]もしくは[7]に記載の細胞凝集体の混合物、[22]に記載の接着性細胞集団の混合物、又は[24]に記載の接着性細胞集団のいずれかを含む、移植用医薬組成物。
[26]
[1]~[5]のいずれかに記載の細胞凝集体、[6]もしくは[7]に記載の細胞凝集体の混合物、[22]に記載の接着性細胞集団の混合物、又は[24]に記載の接着性細胞集団のいずれかを含む、神経系細胞の補充を必要とする疾患の治療剤。
[27]
[1]~[5]のいずれかに記載の細胞凝集体、[6]もしくは[7]に記載の細胞凝集体の混合物、[22]に記載の接着性細胞集団の混合物、又は[24]に記載の接着性細胞集団のいずれかを、患者の中枢神経に移植する工程を含む、神経系細胞の補充を必要とする疾患の治療方法。
〔細胞集団〕
本明細書において、接着性細胞集団とは、複数の細胞同士が接着して形成される細胞の塊をいい、細胞が三次元方向に生物学的に結合(すなわち接着)した三次元の接着性細胞集団、及び細胞が二次元方向に生物学的に結合した二次元の接着性細胞集団を含む概念である。
本明細書において、神経系細胞(Neural Cell)としては、例えば中枢神経系の神経系細胞、又は、自律神経の神経系細胞もしくは運動神経や感覚器系の神経系細胞などの末梢神経系細胞など、あらゆる神経系細胞が挙げられ、神経系細胞には、神経細胞、神経堤由来細胞、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、及びそれらの幹細胞もしくは前駆細胞等が含まれる。
FOXA2陰性でTUJ1陽性の神経系細胞としては、例えば、GABA神経前駆細胞、GABA神経細胞、コリン神経前駆細胞、コリン神経細胞、グルタミン酸神経前駆細胞、グルタミン酸神経細胞、網膜細胞(視細胞、視細胞前駆細胞、網膜色素上皮細胞等を含む)、及び角膜細胞が挙げられる。
FOXA2陽性及びTUJ1陽性の神経系細胞としては、ドーパミン産生神経前駆細胞及びドーパミン産生神経細胞等の神経細胞が挙げられる。
ヒトTUJ1(Neuron-specific class III beta-tubulin)としては、NCBIアクセッション番号NM_006086又はNM_001197118で示されるポリヌクレオチド及びこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトOTX2としては、NCBIアクセッション番号NM_021728、NM_172337、NM_001270523、NM_001270524又はNM_001270525で示されるポリヌクレオチド及びこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトLMX1Aとしては、NCBIアクセッション番号NM_001174069又はNM_177398で示されるポリヌクレオチド及びこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトLMX1Bとしては、NCBIアクセッション番号NM_002316、NM_001174146又はNM_001174147で示されるポリヌクレオチド及びこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトEN1としては、NCBIアクセッション番号NM_001426で示されるポリヌクレオチド及びこれがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトNurr1としては、NCBIアクセッション番号NM_006186で示されるポリヌクレオチド及びこれがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトPITX3としては、NCBIアクセッション番号NM_005029で示されるポリヌクレオチド及びこれがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトDAT(SLC6A3)としては、NCBIアクセッション番号NM_001044で示されるポリヌクレオチド及びこれがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトGIRK2(KCNJ6)としては、NCBIアクセッション番号NM_002240で示されるポリヌクレオチド及びこれがコードするタンパク質が挙げられる。
ヒトTHとしては、NCBIアクセッション番号NM_000360、NM_199292又はNM_199293で示されるポリヌクレオチド及びこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
神経前駆細胞とは、より分化が進んだ神経系細胞に分化誘導され得る前駆細胞を意味する。神経前駆細胞は、中枢神経系の神経系細胞、又は、自律神経の神経系細胞もしくは運動神経や感覚器系の神経系細胞などの末梢神経系の神経系細胞等、神経細胞を含むあらゆる神経系細胞へ分化され得る。
本明細書において、幹細胞とは、多分化能(複数種類の細胞へ分化し得る能力)と自己複製能の両方を有し、際限なく増殖可能な細胞である。幹細胞としては、例えば、胚性の幹細胞(ES細胞);骨髄、血液、皮膚(表皮、真皮、皮下組織)由来の細胞から遺伝子導入等により人工的に作製された人工多能性幹細胞(iPS細胞)等の多能性幹細胞、並びに、脂肪、毛包、脳、神経、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉及びその他の組織に存在し、特定された複数種類の細胞に分化する体性の幹細胞が挙げられる。
本明細書における多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であれば、特に限定されない。
多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞(ES細胞:Embryonic stem cell)、EG細胞(Embryonic germ cell)、人工多能性幹細胞(iPS細胞:induced pluripotent stem cell)等を挙げることができる。間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell;MSC)から得られるMuse細胞(Multi-lineage differentiating stress enduring cell)及び生殖細胞(例えば精巣)から作製される精子幹細胞(GS細胞)も多能性幹細胞に包含される。胚性幹細胞は、1981年に初めて樹立され、1989年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。胚性幹細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はLIF(白血病抑制因子)を含む培地中で培養することによって製造することができる。胚性幹細胞の製造方法は、例えば、WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関から入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所から入手可能である。ヒト胚性幹細胞であるRx::GFP株(KhES-1株由来)は、国立研究開発法人理化学研究所から入手可能である。マウス胚性幹細胞であるEB5細胞株及びD3細胞株は、それぞれ国立研究開発法人理化学研究所及びATCCから入手可能である。
EG細胞は、始原生殖細胞をmSCF、LIF及びbFGFを含む培地中で培養することによって製造することができる(Cell,70:841-847,1992)。
分化誘導因子としては、幹細胞から神経系細胞(第一分化段階にある神経前駆細胞及び第二分化段階にある神経系細胞を含む)へ分化誘導させるために細胞内シグナル伝達を調整する因子を意味する。神経系細胞の種類によって、当業者に周知の分化誘導因子を適宜選択することができる。
本明細書において、BMP阻害剤とは、BMPに起因するシグナル伝達を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、又は低分子有機化合物のいずれであってもよい。ここでBMPとしては、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7が挙げられる。BMP阻害剤として、BMPに直接作用する物質(例えば抗体、アプタマー等)、BMPをコードする遺伝子の発現を抑制する物質(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等)、BMP受容体(BMPR)とBMPの結合を阻害する物質、BMP受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。BMPRとして、ALK2又はALK3を挙げることができる。BMPシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができ、コルジン(Chordin)、ノギン(Noggin)、フォリスタチン(Follistatin)などのタンパク質性阻害剤、ドルソモルフィン(Dorsomorphin)(すなわち、6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine)及びその誘導体(P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3(8):e2904)、並びにLDN193189(すなわち、4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline;4-[6-(4-ピペラジン-1-イルフェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]キノリン)が例示される。ここでLDN193189は、BMPR(ALK2/3)阻害剤(以下、BMPR阻害剤)として周知であり、例えば塩酸塩の形態で市販されている。ドルソモルフィン及びLDN193189は、それぞれSigma-Aldrich社及びStemgent社から入手可能である。BMP阻害剤として、これら一種又は二種以上を適宜選択して使用してもよい。本発明で使用されるBMP阻害剤は、好ましくは、LDN193189であり得る。
本明細書において、TGFβ阻害剤とは、TGFβのTGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、又は低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、TGFβに直接作用する物質(例えば、タンパク質、抗体、アプタマー等)、TGFβをコードする遺伝子の発現を抑制する物質(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等)、TGFβ受容体とTGFβの結合を阻害する物質、及びTGFβ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質(例えば、TGFβ受容体の阻害剤、Smadの阻害剤等)を挙げることができる。受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、又はALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質が挙げられ、例えば、Lefty-1(NCBIアクセッション番号として、マウス:NM_010094、ヒト:NM_020997が例示される)、Lefty-2(NCBIアクセッション番号として、マウス:NM_177099、ヒト:NM_003240及びNM_001172425が例示される)、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)、A83-01(WO2009/146408)及びこれらの誘導体などが例示される。本発明で使用されるTGFβ阻害剤として、好ましくはSB431542(4-(5-ベンゾール[1,3]ジオキソール-5-イル-4-ピリジン-2-イル-1H-イミダゾール-2-イル)-ベンズアミド)又はA-83-01(3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド)が挙げられ、これらは、TGFβ受容体(ALK5)及びActivin受容体(ALK4/7)の阻害剤として公知である。TGFβ阻害剤として、これら一種又は二種以上を適宜選択して使用してもよい。本発明で使用されるTGFβ阻害剤は、更に好ましくは、A83-01であり得る。
本明細書において、SHH(Sonic hedgehog;ソニック・ヘッジホッグ)シグナル刺激剤としては、SHHが受容体であるPatched(Ptch1)に結合して引き起こされるSmoothened(Smo)の脱抑制及びさらに続くGli2の活性化を引き起こす物質として定義され、例えば、Hedgehogファミリーに属するタンパク質、具体的にはSHHもしくはIHH(Indian Hedgehog;インディアン・ヘッジホッグ)、SHH受容体、SHH受容体アゴニスト、Hh-Ag1.5(Li, X., et al., Nature Biotechnology, 23, 215~ 221 (2005).)、Smoothened Agonist、SAG(N-Methyl-N’-(3-pyridinylbenzyl)-N’-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane;N-メチル-N’-(3-ピリジニルベンジル)-N’-(3-クロロベンゾ[b]チオフェン-2-カルボニル)-1,4-ジアミノシクロヘキサン)、20-ヒドロキシコレステロール(20a-hydroxycholesterol)、パルモルファミン(Purmorphamine、PMA;9-シクロヘキシル-N-[4-(4-モルホリニル)フェニル]-2-(1-ナグタレニルオキシ)-9H-プリン-6-アミン)、及びこれらの誘導体などが例示される(Stanton BZ, Peng LF., Mol Biosyst. 6:44-54, 2010)。SHHシグナル刺激剤として、これら一種又は二種以上を適宜選択して使用してもよい。
本明細書において、FGF8とは、特に限定されないが、ヒトFGF8の場合、FGF8a、FGF8b、FGF8e又はFGF8fの4つのスプライシングフォームが例示され、より好ましくは、FGF8bである。FGF8は、例えばWako社やR&D systems社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現させることによって得てもよい。
本明細書において、GSK3β阻害剤とは、GSK3βタンパク質のキナーゼ活性(例えば、βカテニンに対するリン酸化能)を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるBIO(別名、GSK3β阻害剤IX;6-ブロモインジルビン3’-オキシム)、マレイミド誘導体であるSB216763(3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン)、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK3β阻害剤VII(4-ジブロモアセトフェノン)、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts(別名、GSK3βペプチド阻害剤;Myr-N-GKEAPPAPPQpSP-NH2(配列番号1))及び高い選択性を有するCHIR99021(6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile)が挙げられる。GSK3β阻害剤として、これら一種又は二種以上を適宜選択して使用してもよい。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。本発明で使用されるGSK3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。
本明細書において、細胞外マトリクス(細胞外基質ともいう)とは、細胞の外に存在する超分子構造体であり、天然由来であっても、人工物(組換え体)であってもよい。例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリン及びラミニンといった物質又はこれらの断片が挙げられる。これらの細胞外基質は、組み合わせて用いられてもよく、例えば、BD Matrigel(商標)などの細胞からの調製物であってもよい。好ましくは、ラミニン又はその断片である。本明細書においてラミニンとは、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ1本ずつ持つヘテロ三量体構造を有するタンパク質であり、サブユニット鎖の組成が異なるアイソフォームが存在する細胞外マトリックスタンパク質である。ラミニンは、5種のα鎖、4種のβ鎖及び3種のγ鎖のヘテロ三量体の組合せで約15種類のアイソフォームを有する。特に限定されないが、例えば、α鎖は、α1、α2、α3、α4又はα5であり、β鎖は、β1、β2、β3又はβ4であり、ならびにγ鎖は、γ1、γ2又はγ3が例示される。本発明において用いられるラミニンは、より好ましくは、α5、β1及びγ1からなるラミニン511である(Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010))。
本明細書において、神経栄養因子とは、運動ニューロンの生存と機能維持に重要な役割を果たしている膜受容体へのリガンドであり、例えば、神経成長因子(Nerve Growth Factor;NGF)、脳由来神経栄養因子(Brain-derived Neurotrophic Factor;BDNF)、神経栄養因子3(Neurotrophin 3、NT-3)、神経栄養因子4/5(Neurotrophin 4/5;NT-4/5)、神経栄養因子-6(Neurotrophin 6;NT-6)、塩基性線維芽細胞増殖因子(basic FGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic FGF)、線維芽細胞増殖因子-5(FGF-5)、上皮成長因子(Epidermal Growth Factor;EGF)、肝細胞成長因子(Hepatocyte Growth Factor;HGF)、インスリン様成長因子1(Insulin、Insulin Like Growth Factor 1;IGF 1)、インスリン様成長因子2(Insulin Like Growth Factor 2;IGF 2)、グリア細胞株由来神経栄養因子(Glia cell line-derived Neurotrophic Factor;GDNF)、TGF-β2、TGF-β3、インターロイキン-6(Interleukin 6;IL-6)、毛様体神経栄養因子(Ciliary Neurotrophic Factor;CNTF)及びLIFなどが挙げられる。また、これらの一種又は二種以上を適宜選択して用いてもよい。本発明において好ましい神経栄養因子は、GDNF及びBDNFから成るグループより選択される因子である。神経栄養因子は、例えばWako社やR&D systems社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現させることによって得てもよい。
本発明において、ROCK阻害剤とは、Rhoキナーゼ(ROCK)の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632(例えば、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000);Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照)、Fasudil/HA1077(例えば、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照)、H-1152(例えば、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照)、Wf-536(例えば、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照)及びそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸(例えば、siRNA)、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体も使用できる(例えば、米国特許出願公開第20050209261号、同第20050192304号、同第20040014755号、同第20040002508号、同第20040002507号、同第20030125344号、同第20030087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照)。本発明では、1種又は2種以上のROCK阻害剤が使用され得る。本発明で使用されるROCK阻害剤は、好ましくは、Y-27632であり得る。
本明細書おいて細胞の培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができ、基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow’s Minimal Essential Medium(GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、StemFit培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、Neurobasal培地又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。これらの基礎培地から、本発明の製造方法の各工程において使用される培地を調製することができる。
無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、Life Technologies社(現ThermoFisher)製の、KnockOut Serum Replacement(KSR)、Chemically-defined Lipid concentrated、Glutamax、B-27 Supplement、N2 Supplement、ITS Supplementが挙げられる。
未分化維持培地として使用可能なフィーダーフリー培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばEssential 8培地が挙げられる。Essential 8培地は、DMEM/F12培地に、添加剤として、L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium(64mg/l)、sodium selenium(14μg/l)、insulin(19.4mg/l)、NaHCO3(543mg/l)、transferrin(10.7mg/l)、bFGF(100ng/mL)、及び、TGFβ阻害剤(TGFβ1(2ng/mL)又はNodal(100ng/mL))を含む(Nature Methods, 8, 424-429 (2011))。市販のフィーダーフリー培地としては、例えば、Essential 8(Life Technologies社製;現ThermoFisher)、S-medium(DSファーマバイオメディカル社製)、StemPro(Life Technologies社製;現ThermoFisher)、hESF9(Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 9;105(36):13409-14)、mTeSR1(STEMCELL Technologies社製)、mTeSR2(STEMCELL Technologies社製)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies社製が挙げられる。またこの他に、フィーダーフリー培地としては、StemFit(味の素社製)が挙げられる。上記工程(1)ではこれらを用いることにより、簡便に本発明を実施することが出来る。
本発明の一態様として、FOXA2陽性又はTUJ1陽性の神経系細胞を含み、細胞凝集体1個あたりの細胞数が1000個以上である、細胞凝集体が挙げられる。細胞凝集体の混合物としては、複数の細胞凝集体の混合物であって、本発明の細胞凝集体を全細胞凝集体数の50%以上含む混合物である。
(a1)円相当径が100μm~2000μmであること、
(a2)包絡度が0.5以上であること、
(a3)フェレ径比が0.5以上であること、及び
(a4)円形度が0.3以上であること。
ここで用いられる顕微鏡は、倍率4~10倍程度の当業者に周知の顕微鏡であれば特に限定はないが、具体的には、ThermoFisher EVOS XLが挙げられる。
本発明の一態様として、以下の工程を含む、神経系細胞を含む接着性細胞集団の混合物の製造方法が挙げられる:
(1)複数の幹細胞を第一の分化誘導因子存在下で分化誘導し、第一分化段階にある神経前駆細胞を1以上含む複数の細胞を得る工程;
(2)工程(1)で得られた複数の細胞から第一分化段階にある神経前駆細胞を選択的に分離する工程であって、液体媒体の連続的な流れの中に、工程(1)で得られた複数の細胞を浮遊させること、及び、第一分化段階にある神経前駆細胞を識別し、第一分化段階にある神経前駆細胞とそうでない細胞とを、別々の液体媒体の連続的な流れへ流れるように分離することを含む、工程;並びに
(3)工程(2)で分離された第一分化段階にある神経前駆細胞を第二の分化誘導因子存在下で培養して、接着性細胞集団の混合物を得る工程であって、
接着性細胞集団の混合物は、以下の(b1)及び(b2)の特徴を有する接着性細胞集団を、全接着性細胞集団数の50%以上含む工程を備える、方法:
(b1)第二分化段階にある神経系細胞を含むこと、
(b2)1000個以上の細胞を含むこと。
工程(1)は複数の幹細胞を第一の分化誘導因子存在下で分化誘導し、第一分化段階にある神経前駆細胞を1以上含む複数の細胞を得る工程である。本明細書において、第一分化段階にある神経前駆細胞とは、幹細胞、好ましくは多能性幹細胞から第二分化段階にある神経系細胞へと分化誘導する際の、中間体に相当する神経前駆細胞であれば特に限定はないが、例えば、神経細胞へ分化可能である神経前駆細胞が挙げられる。
(1a)多能性幹細胞を細胞外基質(細胞外マトリクスともいう)上でBMP阻害剤及びTGFβ阻害剤を含む培地中で接着培養する工程、
(1b)上記工程(1a)で得られた細胞をBMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤及びFGF8を含む培地中で細胞外基質上にて接着培養する工程、
(1c)上記工程(1b)で得られた細胞をBMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤、FGF8及びGSK3β阻害剤を含む培地中で細胞外基質上にて接着培養する工程、
(1d)上記工程(1c)で得られた細胞をBMP阻害剤及びGSK3β阻害剤を含む培地中で細胞外基質上にて接着培養する工程。
尚、培地の組成は、培養の途中で、適宜調整又は変更してもよい。
工程(2)は、液体媒体の連続的な流れの中に、工程(1)で得られた複数の細胞を浮遊させること、及び第一分化段階にある神経前駆細胞を識別し、第一分化段階にある神経前駆細胞とそうでない細胞とを、別々の液体媒体の連続的な流れへ流れるように分離することを含む。
工程(3)は、工程(2)で分離された第一分化段階にある神経前駆細胞を第二の分化誘導因子存在下で培養して、接着性細胞集団の混合物を得る工程である。該接着性細胞集団の混合物は、以下の(b1)及び(b2)の特徴を有する接着性細胞集団を、全接着性細胞集団数の50%以上含む:
(b1)第二分化段階にある神経系細胞を含むこと、
(b2)1000個以上の細胞を含むこと。
ここで用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、GMEM培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM)培地、Ham’s F12培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、Neurobasal Medium(ライフテクノロジーズ;現ThermoFisher)及びこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、Neurobasal Mediumである。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2 Supplement、B-27 Supplement、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、核酸(例えば、Dibutyryl cyclic AMP(dbcAMP))などの1つ以上の物質も含有し得る。好ましい培地は、B-27 Supplement、アスコルビン酸及びdbcAMPを含有するNeurobasal Mediumである。この培地へ適宜神経栄養因子を加えて培養することができる。
接着性細胞集団の混合物の製造方法により、以下の(b1)及び(b2)の特徴を有する接着性細胞集団を、全接着性細胞集団数の50%以上含む接着性細胞集団の混合物を製造することができる:
(b1)第二分化段階にある神経系細胞を含み、
(b2)1000個以上の細胞を含む。
また、上記接着性細胞集団の混合物の製造方法により得られる接着性細胞集団の混合物から、上記(b1)及び(b2)の特徴を有する接着性細胞集団を分離する工程を備える接着性細胞集団の製造方法によって、上記(b1)及び(b2)の特徴を有する接着性細胞集団を得ることができる。
該接着性細胞集団又はその混合物は、培養時に細胞死が抑制され得る。当該接着性細胞集団を14-20日間培養した場合に、培養終了時における細胞数が、培養開始時における細胞数の5%以上、好ましくは8%以上、更に好ましくは10%以上、更に好ましくは15%以上、更に好ましくは60%以上、更に好ましくは約100%である。
(b3)包絡度が0.5以上、好ましくは0.7~1.0、更に好ましくは、0.8~1.0であること、
(b4)フェレ径比が0.5以上、好ましくは0.6~1.0、更に好ましくは、0.7~1.0であること、及び
(b5)円形度が0.3以上、好ましくは0.5~1.0、更に好ましくは0.7~1.0であること。
・円相当径が100μm~1000μmであり、
・包絡度が0.8~1.0であり、
・フェレ径比が0.7~1.0であり、
・円形度が0.7~1.0である。
得られる細胞凝集体の混合物において、円形度、最小径、最大径、垂直フェレ径もしくは水平フェレ径、フェレ径比、円相当径、周囲長、面積、及び、周囲長の包絡度もしくは面積の包絡度からなる群より選ばれる指標のうち、1以上の指標において変動係数が15%以下である。
本発明の細胞凝集体もしくはその混合物又は接着性細胞集団は、神経細胞もしくは神経細胞に分化し得る神経系細胞の移植を必要とする疾患に罹患した患者のための、移植用医薬組成物として有用であり、神経細胞の変性、損傷もしくは機能障害を伴う疾患の治療薬等の医薬として使用することができる。すなわち、本発明の細胞凝集体もしくは接着性細胞集団、及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物もまた、本発明の範疇である。
本発明の一態様として、本発明の細胞凝集体もしくはその混合物又は接着性細胞集団を、神経系細胞の移植を必要とする疾患に罹患した患者に移植する工程を含む、神経系細胞の補充を必要とする疾患の治療方法が挙げられる。
移植に際して、本発明の細胞凝集体を該細胞凝集体の生存能力を維持するために必要な媒体において保存してもよい。「生存能力を維持するために必要な媒体」としては、培地、生理学的緩衝溶液等が挙げられるが、ドーパミン産生神経前駆細胞を含む細胞集団が生存する限りにおいて特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができる。一例として、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製した培地が挙げられる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、GMEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、Neurobasal培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地又はこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。
本明細書における「機能的生着」とは、移植された細胞が生着し、生体内で本来の機能を果たしている状態を意味する。
<細胞及び培養>
ヒトiPS細胞をドーパミン産生神経前駆細胞へ分化誘導するためのプロトコールを図1に示す。分化誘導開始まで拡大培養(day -7~0)、分化誘導開始から12日目まで(day 0~12)の第一分化段階、及び、分化誘導開始後12日目~28日間(day 12~28)第二分化段階における培養条件は、それぞれ図1に示されている。なお、ソーティングは分化誘導開始後12日目(day12)に行われた。
このiPS細胞を、Miyazaki T et al.,Nat Commun.3:1236,2012の記載に準拠した方法で培養した。すなわち簡潔には、Laminin511E8でコーティングされた6ウェルプレート上にてFGF2(bFGF)を含む未分化維持培地(AK03N)により、iPS細胞を維持培養した。
0.1μM LDN193189及び3μM CHIR99021を含有する基本培地Aでの培養から5日後、すなわち分化誘導開始後12日目(day12)、TrypLE CTSを用いて細胞を解離し、2%FBS、30μM Y-27632(WAKO)、20mM Dグルコース及び50μg/ml ペニシリン/ストレプトマイシン)を含有するCa2+Mg2+-free HBSS(Invitrogen)へ懸濁させた。上記の抗Corin抗体を添加し、4℃で20分間インキュベートし、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を行い、Corin陽性細胞を回収し、種々の解析を実施した。
尚、抗Corin抗体は以下の方法で作製した。カニクイザルCorin遺伝子のうち、細胞外領域の一部(79-453アミノ酸)をコードする遺伝子配列を293E細胞に導入して、Corinタンパク質の細胞外領域断片を発現させて回収した。回収したタンパク質をマウスに免疫したのち、リンパ球細胞を取り出してミエローマ細胞とフュージョンさせた。フュージョンさせた細胞集団より、Corinに反応性を持つクローンを選択した。このクローンの培養上清を抗Corinモノクローナル抗体として蛍光ラベルを施した後に用いた。
<ソーティング>
FACSのためのセルソーターとして、Stream-In-Air方式の機種であるBD社のFACSJazz(商標)、又はマイクロ流路方式の機種であるCytonome社のGigasortを用いた。Corin陽性細胞を回収し、種々の解析を実施した。
FACSJazz(商標)の場合、ソーティング条件は、一般に神経細胞のセルソーティングに用いられるノズル径100μm、シース圧力は29 PSIである。また、Gigasortの場合、ソーティング条件はメーカー標準の流路内径約200μm、シース圧力は14-20PSIである。
回収したCorin陽性細胞をPrimeSurface 96Uプレート(住友ベークライト)に20000個/ウェルにて移し、基本培地B(B-27(商標)Supplement minus vitamin A(Invitrogen)、20ng/mL BDNF(WAKO)、10ng/mL GDNF(WAKO)、200mM Ascorbic acid(WAKO)及び0.4mM dbcAMP(Sigma)を添加したNeurobasal(登録商標)medium(Invitrogen))を用いて浮遊培養した。この時、最初の培地としては、30μMのY-27632を添加した培地を用いたが、3日に一度、半量ずつ培地を交換した際には、Y-27632を添加しない培地を用いた。ソーティングから16日後(分化誘導終了:day28)まで浮遊培養を実施してドーパミン産生神経前駆細胞を分化誘導した。この期間に、顕微鏡を用いて培養4日毎に浮遊培養細胞凝集体の撮影を行った観察像を図2に示す。
Day28にて表1に記載の数の細胞凝集体を、マイクロピペッターを用いて96ウェルU底プレートから培地ごと回収し、細胞凝集体が自重で沈殿するのを待った。上清培地を除去し、PBS 1mLを添加して、細胞凝集体が自重で沈殿するのを待った。上清を除去し、神経細胞分散キットの酵素液1mLを添加して37℃水浴でインキュベートした。10分おきにピペッティングし、インキュベート開始から30分経過した時点で細胞懸濁液を10μL採取し、トリパンブルー(Thermo Fisher Scientific)10μLと混合して血球計算盤に注入した。顕微鏡下で細胞数を計測した。その結果を表1の「酵素液中」の欄に示す。また、トリパンブルー非陽性細胞数/全細胞数を算出し、細胞の生存率とした。次に、神経細胞分散キットの分散液、除去液を加えて遠心した。上清除去した後、PBS 1mLで再懸濁し、10μLをトリパンブルー(Thermo Fisher Scientific)10μLと混合して血球計算盤に注入した。顕微鏡下で細胞数を計測した。その結果を表1の「洗浄後[血球計算盤]」の欄に示す。また再懸濁したサンプルを自動セルカウンター(chemometec,NC-200)により測定した。その結果を表1の「洗浄後[NC-200]」の欄に示す。
Day28にて48個の細胞凝集体を、マイクロピペッターを用いて96ウェルU底プレートから培地ごと回収し、6cm低接着ディッシュ(住友ベークライト)に移した。デジタルマイクロスコープ(キーエンス;VHX-5000)を用いて透過照明により細胞凝集体を撮影し、図3の画像を得た。視野内にGigasortにより選別された細胞の細胞凝集体は47個(B)、Jazzにより選別された細胞の細胞凝集体は48個(A)であった。
Day28にて細胞数計測用に酵素液添加後に分散した細胞に、分散液及び除去液を加えて遠心した。上清を除去し、PBSで再懸濁し、Live/Dead試薬(Thermo Fisher Scientific)、Foxa2(R&D)/Alexa647-anti-goat(Thermo Fisher Scientific)、Alexa488-Tuj1(BD)、Alexa647-Oct3/4(BD)、FITC-TRA2-49(Millipore)、PerCP-Cy5.5-Sox1(BD)、Alexa647-Pax6(BD)、Alexa488-Ki67(BD)で染色した。フローサイトメーターGallios(ベックマンコールター)を用いて、細胞懸濁液に含まれる全細胞に対する、FOXA2陽性かつTUJ1陽性の細胞、FOXA2陽性細胞、又はTUJ1陽性細胞の割合を算出した(表2)。Jazz及びGigasortのいずれを用いた場合でも、FOXA2及び/又はTUJ1マーカーの陽性率が高く、また、多能性マーカーであるOCT3/4及び/又はTRA-2-49の陽性率が低かった。
Day28にて10個の細胞凝集体を、マイクロピペッターを用いて96ウェルU底プレートから培地ごと回収し、細胞凝集体が自重で沈殿するのを待った。上清培地を除去し、PBS 1mLを添加して自重で沈殿するのを待った。上清を除去した後、PFAにて細胞凝集体を固定し、OCTコンパウンドで包埋及び凍結した。次いで、クライオスタット(Leica)を用いて細胞凝集体を10μmに薄切し、切片をスライドガラスに張り付けた。ブロッキングバッファー(2%正常ロバ血清、0.3%TritonX100/PBS)によりブロッキングを行い、抗Nurr1マウスIgG抗体(ペルセウスプロテオミクス)、抗Foxa2ヤギIgG抗体(R&D systems)、及び抗THウサギIgG抗体(Millipore)で一次染色、Alexa488標識抗マウス抗体、Alexa594標識抗ヤギ抗体、Alexa647標識抗ウサギ抗体、及びDAPI(全てThermo Fisher Scientific)で二次染色を行った。VECTASHIELD Hard setで染色後の切片を封入し、共焦点顕微鏡(Olympus FV1200)で観察した(図6)。
Claims (9)
- 細胞凝集体の混合物の培養時における細胞死を抑制する方法であって、
該細胞凝集体の混合物を、以下の工程(1)~(3)を備える方法により製造することを含み、
該細胞凝集体の混合物は、ドーパミン産生神経前駆細胞を含み、1000個以上の細胞からなる細胞凝集体の混合物である、方法:
(1)複数の人工多能性幹細胞を第一の分化誘導因子存在下で分化誘導し、第一分化段階にある神経前駆細胞を1以上含む複数の細胞を得る工程;
(2)工程(1)で得られた複数の細胞から第一分化段階にある神経前駆細胞を、マイクロ流路方式セルソーターを用いて選択的に分離する工程であって、
液体媒体の連続的な流れの中に、工程(1)で得られた複数の細胞を浮遊させること、及び
第一分化段階にある神経前駆細胞を識別し、第一分化段階にある神経前駆細胞とそうでない細胞とを、別々の液体媒体の連続的な流れへ流れるように分離することを含む、工程;並びに
(3)工程(2)で分離された第一分化段階にある神経前駆細胞を第二の分化誘導因子存在下で培養して、細胞凝集体の混合物を得る工程。 - 以下の工程:
(1)複数の人工多能性幹細胞を第一の分化誘導因子存在下で分化誘導し、第一分化段階にある中脳底板へ運命づけられた神経前駆細胞を1以上含む複数の細胞を得る工程;
(2)工程(1)で得られた複数の細胞から第一分化段階にある前記神経前駆細胞を、マイクロ流路方式セルソーターを用いて選択的に分離する工程であって、
液体媒体の連続的な流れの中に、工程(1)で得られた複数の細胞を浮遊させること、及び
第一分化段階にある前記神経前駆細胞に特異的な指標を識別し、第一分化段階にある前記神経前駆細胞とそうでない細胞とを、別々の液体媒体の連続的な流れへ流れるように分離することを含む、工程;並びに
(3)工程(2)で分離された第一分化段階にある前記神経前駆細胞を第二の分化誘導因子存在下で培養して、細胞凝集体の混合物を得る工程を備える、ドーパミン産生神経前駆細胞を含む細胞凝集体の混合物の製造方法。 - 細胞凝集体の混合物において、培養時に細胞死が抑制される、請求項2に記載の製造方法。
- 細胞凝集体の混合物において、細胞凝集体が、表面にデブリ層を有さず、顕微鏡下で細胞凝集体の境界線が明瞭な細胞凝集体である、請求項2又は3に記載の製造方法。
- 第一分化段階にある前記神経前駆細胞に特異的な前記指標が、第一分化段階にある前記神経前駆細胞に特異的に発現するマーカーである、請求項2~4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 細胞凝集体を14~20日間培養した場合に、培養終了時における細胞数が、培養開始時における細胞数の15%以上である、請求項2~5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 細胞凝集体を14~20日間培養した場合に、培養終了時における細胞数が、培養開始時における細胞数の50%以上である、請求項6に記載の製造方法。
- 工程(2)において、第一分化段階にある神経前駆細胞が閉鎖系で分離される、請求項2~7のいずれか一項に記載の製造方法。
- 第一分化段階にある神経前駆細胞が、Corin及び/又はLrtm1陽性の細胞である、請求項2~8のいずれか一項に記載の製造方法。
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