CN111788303A - 细胞聚集体、细胞聚集体的混合物和它们的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供适于移植的包含产多巴胺神经前体细胞的细胞聚集体、其混合物和它们的制造方法。本发明的细胞聚集体包含FOXA2阳性或TUJ1阳性的神经系统细胞，包含1000个以上的细胞。

Description

细胞聚集体、细胞聚集体的混合物和它们的制造方法

技术领域

本发明涉及细胞聚集体等黏附性细胞群体、该细胞群体的混合物和它们的制造方法。

背景技术

帕金森病是由中脑黑质的产多巴胺神经细胞的脱落所引起的神经退行性疾病，目前在全世界约有400万的患者。作为帕金森病的治疗，进行了基于L-DOPA或多巴胺激动剂的药物治疗、基于脑立体定向手术的凝固术、深部电刺激治疗和胎儿中脑移植等。胎儿中脑移植存在其供给源的组织伦理问题而且感染危险性也高。

近些年，提出了使用由胚胎干细胞(ES细胞)和诱导多能干细胞(iPS细胞)等多能干细胞分化诱导的产多巴胺神经细胞或作为其前体细胞的产多巴胺神经前体细胞的治疗法(非专利文献1)，也报道了其制造方法。具体而言，作为产多巴胺神经前体细胞的制造方法，提出了包括通过成为产多巴胺神经前体细胞或产多巴胺神经细胞的标记物的因子(具体而言Corin或Lrtm1)来筛选适于移植的细胞的工序的方法(专利文献1、非专利文献2和非专利文献3)，为了减小数量差的影响且确保品质均匀性、提高生产效率，需求进一步的改良。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2015/34012号

非专利文献

非专利文献1：Wernig M，et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2008，105:5856-5861

非专利文献2：Doi D，et al.，Stem Cell Reports.2014，2:337-350

非专利文献3：Samata B，et al.，Nature communication.2016，7:1-11

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供在大小和形状方面良好的神经细胞的细胞聚集体等黏附性细胞群体、包含该细胞群体的具有高均匀性的细胞聚集体或细胞群体的混合物、和它们的制造方法，具体而言包含产多巴胺神经前体细胞的细胞聚集体、具有高均匀性的该细胞聚集体的混合物、和它们的制造方法等。

用于解决问题的方案

本发明人等进行了深入研究，结果发现：经过使多个细胞悬浮于液体介质的连续流中并将该细胞分离成目标神经前体细胞和并非此细胞的细胞的工序，以使其分别流入各个液体介质的连续流，筛选目标神经前体细胞，对其进行培养来制造包含神经系统细胞的细胞聚集体，从而可以得到要求适当地管理细胞数、细胞的状态的、包含适于人移植用途的数量的神经系统细胞的细胞聚集体、和该细胞聚集体的均匀的混合物，以至完成了本发明。

即，本发明涉及以下方案。

[1]一种细胞聚集体，其包含FOXA2阳性或TUJ1阳性的神经系统细胞，且

包含1000个以上的细胞。

[2]根据[1]所述的细胞聚集体，其包含总细胞数的约70％以上的FOXA2阳性或TUJ1阳性的神经系统细胞。

[3]根据[1]或[2]所述的细胞聚集体，其在培养时能抑制细胞死亡。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞聚集体，其进一步具有选自以下的至少一个特征：

(a1)圆当量直径为100μm～2000μm，

(a2)包络度为0.5以上，

(a3)费雷特直径比为0.5以上，和

(a4)圆形度为0.3以上。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的细胞聚集体，其在表面不具有碎片层且在显微镜下细胞聚集体的交界线清晰。

[6]一种细胞聚集体的混合物，其为多个细胞聚集体的混合物，且包含总细胞聚集体数的50％以上的[1]～[5]中任一项所述的细胞聚集体。

[7]根据[6]所述的细胞聚集体的混合物，其在选自由圆形度、最小直径、最大直径、垂直费雷特直径或水平费雷特直径、费雷特直径比、圆当量直径、周长、面积、以及周长的包络度或面积的包络度组成的组中的指标中的1个以上的指标中，具有15％以下的变异系数。

[8]一种黏附性细胞群体的混合物的制造方法，其包括如下工序：

(1)在第一分化诱导因子的存在下对多个干细胞进行分化诱导，得到包含1个以上的处于第一分化阶段的神经前体细胞的多个细胞的工序；

(2)从工序(1)中得到的多个细胞中选择性分离处于第一分化阶段的神经前体细胞的工序，该工序包括：

在液体介质的连续流中，使工序(1)中得到的多个细胞悬浮，和

识别处于第一分化阶段的神经前体细胞，将处于第一分化阶段的神经前体细胞与并非处于第一分化阶段的神经前体细胞分离，以使其分别流入各个液体介质的连续流；及

(3)在第二分化诱导因子的存在下培养工序(2)中分离的处于第一分化阶段的神经前体细胞，从而得到黏附性细胞群体的混合物的工序，其中，

黏附性细胞群体的混合物包含总黏附性细胞群体数的50％以上的具有以下的(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体，

(b1)包含处于第二分化阶段的神经系统细胞；和

(b2)包含1000个以上的细胞。

[9]根据[8]所述的制造方法，其中，具有(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体在培养时能抑制细胞死亡。

[10]根据[9]所述的制造方法，其中，将黏附性细胞群体培养14～20天时，培养结束时的细胞数为培养开始时的细胞数的5％以上、优选为10％以上。

[11]根据[8]～[10]中任一项所述的制造方法，其中，黏附性细胞群体的混合物为细胞聚集体的混合物。

[12]根据[11]所述的制造方法，其中，黏附性细胞群体为细胞聚集体，上述具有(b1)和(b2)的特征的细胞聚集体的圆当量直径为100μm～2000μm。

[13]根据[12]所述的制造方法，其中，具有(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体为细胞聚集体，且还具有以下的特征：

(b3)包络度为0.5以上，

(b4)费雷特直径比为0.5以上，和

(b5)圆形度为0.3以上。

[14]根据[11]～[13]中任一项所述的制造方法，其中，细胞聚集体的混合物在选自由圆形度、最小直径、最大直径、垂直费雷特直径或水平费雷特直径、费雷特直径比、圆当量直径、周长、面积、以及周长的包络度或面积的包络度组成的组中的指标中的1个以上的指标中，具有15％以下的变异系数。

[15]根据[8]～[14]中任一项所述的制造方法，其中，在工序(2)中，使用微通道式细胞分选仪将处于第一分化阶段的神经前体细胞分离。

[16]根据[8～[15]中任一项所述的制造方法，其中，在工序(2)中，使处于第一分化阶段的神经前体细胞在封闭系统中分离。

[17]根据[8]～[16]中任一项所述的制造方法，其中，干细胞为多能干细胞。

[18]根据[8]～[17]中任一项所述的制造方法，其中，处于第一分化阶段的神经前体细胞是注定中脑底板命运的神经前体细胞。

[19]根据[18]所述的制造方法，其中，处于第一分化阶段的神经前体细胞为Corin和/或Lrtm1阳性的细胞。

[20]根据[8]～[19]中任一项所述的制造方法，其中，处于第二分化阶段的神经系统细胞为选自由TUJ1、OTX2、FOXA2、LMX1A、LMX1B、EN1、Nurr1、PITX3、DAT、GIRK2和TH组成的组中的标记物的至少1种呈阳性的神经系统细胞。

[21]根据[20]所述的制造方法，其中，处于第二分化阶段的神经系统细胞是FOXA2阳性且TUJ1阳性的产多巴胺神经前体细胞。

[22]一种黏附性细胞群体的混合物，其利用[8]～[21]中任一项所述的制造方法而得到。

[23]一种黏附性细胞群体的制造方法，其具备如下工序；从利用[8]～[21]中任一项所述的制造方法得到的黏附性细胞群体的混合物中分离所述具有(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体。

[24]一种黏附性细胞群体，其利用[23]所述的制造方法而得到。

[25]一种移植用药物组合物，其包含：[1]～[5]中任一项所述的细胞聚集体、[6]或[7]所述的细胞聚集体的混合物、[22]所述的黏附性细胞群体的混合物、或[24]所述的黏附性细胞群体中的任意者。

[26]一种需要补充神经系统细胞的疾病的治疗剂，其包含：[1]～[5]中任一项所述的细胞聚集体、[6]或[7]所述的细胞聚集体的混合物、[22]所述的黏附性细胞群体的混合物、或[24]所述的黏附性细胞群体中的任意者。

[27]一种需要补充神经系统细胞的疾病的治疗方法，其包括如下工序：

将[1]～[5]中任一项所述的细胞聚集体、[6]或[7]所述的细胞聚集体的混合物、[22]所述的黏附性细胞群体的混合物、或[24]所述的黏附性细胞群体中的任意者移植到患者的中枢神经中。

发明的效果

根据本发明，可以提供在大小和形状方面良好的神经细胞的细胞聚集体等黏附性细胞群体、包含该细胞群体的具有高均匀性的黏附性细胞群体的混合物和它们的制造方法。根据本发明，可以提供能够实现作为药物所要求的程度的细胞聚集体等黏附性细胞群体的均匀性，例如适于移植到人的神经系统细胞。

附图说明

图1示出用于将人iPS细胞分化诱导为产多巴胺神经前体细胞的方案。

图2示出：对于使用Jazz或Gigasort进行了分选的各细胞组，第二分化阶段的悬浮培养时的第16天、第20天、第24天、第28天(day 16、day 20、day 24、day 28)的细胞聚集体显微镜观察图像(n＝3)。

图3示出分化诱导开始后第28天(day 28)的细胞聚集体的利用数码显微镜的形态观察图像。(A)示出Jazz的结果，(B)示出Gigasort的结果。

图4示出：对于图3中的各细胞聚集体，测定各圆当量直径(A)、包络度(B)、面积(C)、费雷特直径比(D)和圆形度(E)，并用Jazz(浅灰色)和Gigasort(深灰色)进行比较的图表。

图5示出：对于图3中的各细胞聚集体，分别测定各最小直径、周长、费雷特直径(水平)、费雷特直径(垂直)、费雷特直径比、包络度(面积)、包络度(周长)面积、最大直径、圆形度、圆当量直径，计算出变异系数(CV值)，用Jazz(浅灰色)和Gigasort(深灰色)进行比较的图表。

图6示出使用分化诱导开始后第28天(day 28)的抗FOXA2抗体、抗Nurr1抗体、抗TH抗体和DAPI而得到的免疫染色图像。

具体实施方式

I.定义

〔细胞群体〕

本说明书中，黏附性细胞群体是指多个细胞彼此黏附而形成的细胞的块，是包括细胞在三维方向上生物学地结合(即黏附)而成的三维的黏附性细胞群体、及细胞在二维方向上生物学地结合而成的二维的黏附性细胞群体的概念。

三维的黏附性细胞群体也称为细胞聚集体(Cell Aggregate)，只要是形成了立体结构的细胞的块就没有特别限定，可以是球形或非球形。本说明书中的细胞聚集体优选为具有近似球形的立体形状的细胞聚集体。近似球形的立体形状可以是具有三维结构的形状，在投影至二维表面时，显示出例如圆形或椭圆形。

二维的黏附性细胞群体也称为细胞片层，只要是单层或多层的细胞平面地黏附而形成的单层或多层的结构体就没有特别限定。通过贴壁培养所制造的细胞及通过非贴壁培养所制造的细胞包括在本说明书中的细胞片层。

本说明书中，“黏附性细胞群体的混合物”或“细胞聚集体的混合物”是指存在2个以上黏附性细胞群体或细胞聚集体的方式(组合物)。黏附性细胞群体或细胞聚集体可以是如下任意的状态：在各自容器内悬浮于培养基等液态介质中、附着于容器中及沉淀于容器的底部。另外，经冷冻的黏附性细胞群体或细胞聚集体也包括在本说明书中的黏附性细胞群体或细胞聚集体的混合物中。

本说明书中的细胞(包括细胞聚集体、细胞片层、细胞群体等中的细胞)是哺乳动物的细胞，优选为啮齿类(例如，小鼠、大鼠)或灵长类(例如，人、猴)的细胞，更优选人的细胞。

〔神经系统细胞〕

本说明书中，作为神经系统细胞(Neural Cell)，例如可列举出中枢神经系统的神经系统细胞、或者自主神经的神经系统细胞或运动神经、感官系统的神经系统细胞等外周神经系统统细胞等所谓的神经系统细胞，神经系统细胞中包括神经细胞、神经嵴来源细胞、胶质细胞、少突胶质细胞、小神经胶质细胞和它们的干细胞或前体细胞等。

本说明书中，FOXA2阳性或TUJ1阳性的神经系统细胞只要是以可检测的水平表达FOXA2或TUJ1的神经系统细胞就没有特别限定。作为该神经系统细胞，可列举出神经干细胞、神经前体细胞、神经细胞、中脑腹侧来源神经前体细胞、产多巴胺神经前体细胞、产多巴胺神经细胞、GABA神经前体细胞、GABA神经细胞、胆碱能神经前体细胞、胆碱能神经细胞、谷氨酸神经前体细胞、谷氨酸神经细胞、视网膜细胞(包括视细胞、视细胞前体细胞、视网膜色素上皮细胞等)、角膜细胞等。

详细而言，作为FOXA2阳性且TUJ1阴性的神经系统细胞，例如可列举出神经干细胞、神经前体细胞和中脑腹侧来源神经前体细胞。

作为FOXA2阴性且TUJ1阳性的神经系统细胞，例如可列举出GABA神经前体细胞、GABA神经细胞、胆碱能神经前体细胞、胆碱能神经细胞、谷氨酸神经前体细胞、谷氨酸神经细胞、视网膜细胞(包括视细胞、视细胞前体细胞、视网膜色素上皮细胞等)和角膜细胞。

作为FOXA2阳性和TUJ1阳性的神经系统细胞，可列举出产多巴胺神经前体细胞和产多巴胺神经细胞等神经细胞。

本说明书中，产多巴胺神经前体细胞只要没有特别声明，则还可以包含产多巴胺神经细胞或多巴胺能神经元等。产多巴胺神经前体细胞为FOXA2阳性和TUJ1阳性，进一步优选含有OTX2、LMX1A、LMX1B、EN1、Nurr1、PITX3、DAT、GIRK2和TH中的1种以上为阳性的细胞。

作为神经系统细胞的其它方式，可列举出FOXA2、TUJ1、OTX2、LMX1A、LMX1B、EN1、Nurr1、PITX3、DAT、GIRK2和TH的至少1种为阳性的神经系统细胞。

作为人FOXA2，可列举出NCBI登录号NM_021784或NM_153675表示的多核苷酸和由这些编码的蛋白质。

作为人TUJ1(神经元特异性III类β-微管蛋白：Neuron-specific class IIIbeta-tubulin)，可列举出NCBI登录号NM_006086或NM_001197118表示的多核苷酸和由这些编码的蛋白质。

作为人OTX2，可列举出NCBI登录号NM_021728、NM_172337、NM_001270523、NM_001270524或NM_001270525表示的多核苷酸和由这些编码的蛋白质。

作为人LMX1A，可列举出NCBI登录号NM_001174069或NM_177398表示的多核苷酸和由这些编码的蛋白质。

作为人LMX1B，可列举出NCBI登录号NM_002316、NM_001174146或NM_001174147表示的多核苷酸和由这些编码的蛋白质。

作为人EN1，可列举出NCBI登录号NM_001426表示的多核苷酸和其所编码的蛋白质。

作为人Nurr1，可列举出NCBI登录号NM_006186表示的多核苷酸和其所编码的蛋白质。

作为人PITX3，可列举出NCBI登录号NM_005029表示的多核苷酸和其所编码的蛋白质。

作为人DAT(SLC6A3)，可列举出NCBI登录号NM_001044表示的多核苷酸和其所编码的蛋白质。

作为人GIRK2(KCNJ6)，可列举出NCBI登录号NM_002240表示的多核苷酸和其所编码的蛋白质。

作为人TH，可列举出NCBI登录号NM_000360、NM_199292或NM_199293表示的多核苷酸和由这些编码的蛋白质。

〔神经前体细胞〕

神经前体细胞是指能分化诱导为分化进一步发展的神经系统细胞的前体细胞。神经前体细胞可以分化为包括中枢神经系统的神经系统细胞、或自主神经的神经系统细胞或运动神经、感官系统的神经系统细胞等外周神经系统的神经系统细胞等神经细胞在内的所谓的神经系统细胞。

〔干细胞〕

本说明书中，干细胞是指具有多能性(能分化为多种细胞的能力)和自我复制能力这两种、能无限增殖的细胞。作为干细胞，例如可列举出胚胎干细胞(ES细胞)；由源自骨髓、血液、皮肤(表皮、真皮、皮下组织)的细胞通过基因转移等而人工制作的诱导多能干细胞(iPS细胞)等多能干细胞；以及存在于脂肪、毛囊、脑、神经、肝脏、胰腺、肾脏、肌肉和其它组织且分化为特定的多种细胞的成体干细胞。

〔多能干细胞〕

本说明书中的多能干细胞只要具有能分化为存在于生物体的所有细胞的多能性、且也同时具备增殖能力的干细胞，就没有特别限定。

多能干细胞可以衍生自受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织干细胞、体细胞等。作为多能干细胞，可以列举出胚胎干细胞(ES细胞：Embryonic stemcell)、胚胎生殖干细胞(EG细胞：Embryonic germ cell)、诱导多能干细胞(iPS细胞：induced pluripotent stemcell)等。由间充质干细胞(mesenchymal stem cell；MSC)得到的Muse细胞(多系分化持续应激细胞：Multi-lineage differentiating stress enduring cell)和由生殖细胞(例如精巢)制作的精子干细胞(GS细胞)也包括在多能干细胞中。胚胎干细胞于1981年被首次建立，在1989年之后也用于制作基因敲除小鼠。1998年建立了人胚胎干细胞，也被用于再生医学。胚胎干细胞可以通过在饲养层细胞上或在包含LIF(白血病抑制因子)的培养基中培养内部细胞块而制造。胚胎干细胞的制造方法例如记载于WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718等中。胚胎干细胞可以从规定的机构获得，另外，还可以购入市售品。例如，作为人胚胎干细胞的KhES-1、KhES-2和KhES-3可以从京都大学再生医科学研究所获得。作为人胚胎干细胞的Rx：GFP株(KhES-1株来源)可以从国立研究开发法人理化学研究所从获得。作为小鼠胚胎干细胞的EB5细胞株和D3细胞株可以分别从国立研究开发法人理化学研究所和ATCC获得。

作为胚胎干细胞之一的核移植胚胎干细胞(ntES细胞)可以由将体细胞的核移植到除去了核的卵子中而制作的克隆胚胎来建立。

EG细胞可以通过在包含mSCF、LIF和bFGF的培养基中培养原始生殖细胞而制造(Cell，70：841-847，1992)。

本说明书中的“诱导多能干细胞”是指：通过利用公知的方法等使体细胞重编程(reprogramming)而衍生出多能性的细胞。具体而言，可列举出通过选自包含Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、Lin28、Esrrb等的重编程基因组的多个基因的组合中的任意者的表达而使成纤维细胞或外周血单个核细胞等分化的体细胞重编程，衍生出多能性的细胞。作为优选的重编程因子的组合，可以列举出：(1)Oct3/4、Sox2、Klf4和Myc(c-Myc或L-Myc)、(2)Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28和L-Myc(Stem Cells，2013；31：458-466)。

2006年由山中等人在小鼠细胞中建立了诱导多能干细胞(Cell，2006，126(4)，pp.663-676)。2007年也在人成纤维细胞中建立了诱导多能干细胞，与胚胎干细胞同样具有多能性和自我复制能力(Cell，2007，131(5)，pp.861-872；Science，2007，318(5858)，pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.，2008，26(1)，pp.101-106)。

诱导多能干细胞除了利用基于基因表达的直接重编程来制造的方法以外，还可以利用通过化合物的添加等由体细胞衍生出诱导多能干细胞的方法来制造(Science，2013，341，pp.651-654)。

另外，还可以获得经诱导的诱导多能干细胞，例如，由京都大学建立的201B7细胞、201B7-Ff细胞、253G1细胞、253G4细胞、1201C1细胞、1205D1细胞、1210B2细胞、1231A3细胞等人诱导多能干细胞细胞株可以从京都大学获得。作为经诱导的诱导多能干细胞，例如，京都大学所建立的Ff-I01细胞、Ff-I01s04细胞、QHJ-I01和Ff-I14细胞可以从京都大学获得。

作为制造诱导多能干细胞时使用的体细胞，没有特别限定，可列举出源自组织的成纤维细胞、血细胞(例如，外周血单个核细胞(PBMC)、T细胞)、肝细胞、胰腺细胞、肠上皮细胞、平滑肌细胞等。

在制造诱导多能干细胞时，在通过几种基因的表达进行重编程的情况下，用于表达基因的手段没有特别限定。作为上述手段，可列举出使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体、腺病毒载体、或腺相关病毒载体)的感染法；使用质粒载体(例如，质粒载体、或附加型载体)的基因转移法(例如，磷酸钙法、脂质体转染法、RetroNectin法、或电穿孔法)；使用RNA载体的基因转移法(例如，磷酸钙法、脂质体转染法、或电穿孔法)；蛋白质的直接注入法(例如，使用针的方法、脂质体转染法、或电穿孔法)等。

诱导多能干细胞可以在饲养层细胞的存在下或在没有饲养层细胞的存在下(无饲养层)进行制造。在饲养层细胞的存在下制造诱导多能干细胞时，可以利用公知的方法在未分化维持因子的存在下来制造诱导多能干细胞。作为在没有饲养层细胞的存在下制造诱导多能干细胞时所使用的培养基，没有特别限定，可以使用公知的胚胎干细胞和/或诱导多能干细胞的维持培养基、或用于通过无饲养层建立诱导多能干细胞的培养基。作为用于通过无饲养层建立诱导多能干细胞的培养基，例如可以列举出Essential 8培养基(E8培养基)、Essential 6培养基、TeSR培养基、mTeSR培养基、mTeSR-E8培养基、Stabilized Essential8培养基、StemFit培养基等无饲养层培养基。在制造诱导多能干细胞时，例如可以通过使用仙台病毒载体以无饲养层方式将Oct3/4、Sox2、Klf4、和Myc的4因子基因转移到体细胞中，从而制作诱导多能干细胞。

本发明中使用的多能干细胞为哺乳动物的多能干细胞，优选为啮齿类(例如，小鼠或大鼠)或灵长类(例如，人或猴)的多能干细胞，更优选为人或小鼠多能干细胞，进一步优选为人诱导多能干细胞(iPS细胞)或人胚胎干细胞(ES细胞)。

〔分化诱导因子〕

作为分化诱导因子，是指为了由干细胞分化诱导为神经系统细胞(包括处于第一分化阶段的神经前体细胞和处于第二分化阶段的神经系统细胞)而调整细胞内信号传递的因子。可以根据神经系统细胞的种类适宜选择本领域技术人员公知的分化诱导因子。

例如，作为用于由多能干细胞分化诱导为Corin和/或Lrtm1阳性细胞的分化诱导因子，可以示例出BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂、FGF8和GSK3β抑制剂。

另外，作为用于由Corin和/或Lrtm1阳性细胞分化诱导为产多巴胺神经前体细胞的分化诱导因子，可以列举出神经营养因子等。

〔BMP抑制剂〕

本说明书中，BMP抑制剂只要是抑制起因于BMP的信号传递的物质就没有特别限定，可以是核酸、蛋白质或低分子有机化合物中的任意者。此处作为BMP，可列举出BMP2、BMP4、BMP7和GDF7。作为BMP抑制剂，可以列举出直接作用于BMP的物质(例如抗体、适体等)、抑制编码BMP的基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸、siRNA等)、抑制BMP受体(BMPR)与BMP的结合的物质、抑制起因于基于BMP受体的信号传递的生物活性的物质。作为BMPR，可以列举出ALK2或ALK3。作为BMP信号传递路径抑制物质，可以使用本领域技术人员公知的化合物，可示例出腱蛋白(Chordin)、头蛋白(Noggin)、卵泡抑素(Follistatin)等蛋白质抑制剂、多索吗啡(Dorsomorphin)(即，6-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)苯基]-3-吡啶基-4-基-吡唑并[1,5-a]嘧啶)及其衍生物(P.B.Yu et al.(2007)，Circulation，116：II_60；P.B.Yuet al.(2008)，Nat.Chem.Biol.，4：33-41；J.Hao et al.(2008)，PLoS ONE，3(8)：e2904)、及LDN193189(即，4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline；4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉)。此处LDN193189作为BMPR(ALK2/3)抑制剂(以下、BMPR抑制剂)是公知的，例如以盐酸盐的形态有所市售。多索吗啡和LDN193189可以分别从Sigma-Aldrich公司和Stemgent公司获得。作为BMP抑制剂，可以适宜选择这些中的一种或两种以上来使用。本发明中使用的BMP抑制剂可以优选为LDN193189。

〔TGFβ抑制剂〕

本说明书中，TGFβ抑制剂是抑制由TGFβ与TGFβ的受体的结合继而向SMAD结合的信号传递的物质，只要是抑制所引起的信号传递路径的物质就没有特别限定，可以是核酸、蛋白质或低分子有机化合物中的任意者。作为该物质，例如可以列举出直接作用于TGFβ的物质(例如，蛋白质、抗体、适体等)、抑制编码TGFβ的基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸、siRNA等)、抑制TGFβ受体与TGFβ的结合的物质、和抑制起因于基于TGFβ受体的信号传递的生理活性的物质(例如，TGFβ受体的抑制剂、Smad的抑制剂等)。抑制与作为受体的ALK家族的结合的物质、或抑制基于ALK家族的SMAD的磷酸化的物质，例如可示例出：Lefty-1(作为NCBI登录号，可示例出小鼠：NM_010094、人：NM_020997)、Lefty-2(作为NCBI登录号，可示例出小鼠：NM_177099、人：NM_003240和NM_001172425)、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al.，Mol.Cancer，2003，2：20)、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly ResearchLaboratories)、A83-01(WO2009/146408)和它们的衍生物等。作为本发明中使用的TGFβ抑制剂，可列举出优选为SB431542(4-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺)或A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺)，这些作为TGFβ受体(ALK5)和Activin受体(ALK4/7)的抑制剂是公知的。作为TGFβ抑制剂，可以适宜选择这些中的一种或两种以上来使用。本发明中使用的TGFβ抑制剂可进一步优选为A83-01。

需要说明的是，TGFβ抑制剂、BMP抑制剂等SMAD信号传递抑制活性可以通过利用本领域技术人员公知的方法、例如利用蛋白质印迹法检测Smad的磷酸化而确定(Mol CancerTher.(2004)3，737-45.)。

〔SHH信号刺激剂〕

本说明书中，作为音猬因子(SHH：Sonic hedgehog)信号刺激剂，被定义为SHH与作为受体的Patched(Ptch1)结合而引起的Smoothened(Smo)的脱抑制和进而引起随后的Gli2的活化的物质，例如，属于Hedgehog家族的蛋白质、具体而言SHH或印度刺猬因子(IHH：Indian Hedgehog)、SHH受体、SHH受体激动剂、Hh-Ag1.5(Li，X.，et al.，NatureBiotechnology，23，215～221(2005).)、平和受体激动剂、SAG(N-Methyl-N’-(3-pyridinylbenzyl)-N’-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane；N-甲基-N’-(3-吡啶基苄基)-N’-(3-氯代苯并[b]噻吩-2-羰基)-1,4-二氨基环己烷)、20-羟基胆固醇(20a-hydroxycholesterol)、2,6,9-三元取代嘌呤(Purmorphamine、PMA；9-环己基-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-(1-萘戊烯基氧基)-9H-嘌呤-6-胺)、和它们的衍生物等可示例出(Stanton BZ，Peng LF.，Mol Biosyst.6：44-54，2010)。作为SHH信号刺激剂，可以适宜选择这些中的一种或两种以上来使用。

作为本发明中使用的SHH信号刺激剂，可以优选列举出SHH蛋白质(Genbank登录号：NM_000193、NP_000184)、2,6,9-三元取代嘌呤和SAG。作为本发明中使用的SHH信号刺激剂，可进一步优选为2,6,9-三元取代嘌呤。

〔FGF8〕

本说明书中，FGF8没有特别限定，人FGF8的情况，可示例出FGF8a、FGF8b、FGF8e或FGF8f这4个剪接形式，更优选为FGF8b。FGF8由例如Wako公司、R&D systems公司等进行了市售而能够容易地利用，但也可以通过本领域技术人员公知的方法强制表达为细胞而得到。

〔GSK3β抑制剂〕

本说明书中，GSK3β抑制剂被定义为抑制GSK3β蛋白质的激酶活性(例如，针对β连环蛋白的磷酸化能力)的物质，已知存在多种，例如可列举出作为靛红衍生物的BIO(别名、GSK3β抑制剂IX；6-溴靛红3’-肟)、作为马来酰亚胺衍生物的SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、作为苯基α溴甲基酮化合物的GSK3β抑制剂VII(4-二溴苯乙酮)、作为细胞膜渗透型的磷酸化肽的L803-mts(别名、GSK3β肽抑制剂；Myr-N-GKEAPPAPPQpSP-NH₂(序列号1))和具有高选择性的CHIR99021(6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈)。作为GSK3β抑制剂，可以适宜选择这些中的一种或两种以上来使用。这些化合物由例如Calbiochem公司、Biomol公司等市售而能够容易地利用，还可以从其它获取源获得，或还可以自己制作。本发明中使用的GSK3β抑制剂可以优选为CHIR99021。

〔细胞外基质〕

本说明书中，细胞外基质(也称为extracellular matrix)是存在于细胞外的的超分子结构体，可以是源自天然的，还可以是人工物(重组体)。例如可列举出胶原、蛋白聚糖、纤连蛋白、透明质酸、生腱蛋白、巢蛋白、弹性蛋白、原纤蛋白和层粘连蛋白之类的物质或它们的片段。这些细胞外基质还可以组合使用，例如，还可以为由BD Matrigel(商标)等的细胞的制备物。优选为层粘连蛋白或其片段。本说明书中层粘连蛋白是具备具有α链、β链、γ链各1条的异源三聚体结构的蛋白质，是存在亚单位链的组成不同的同工型的细胞外基质蛋白质。层粘连蛋白具有5种α链、4种β链和3种γ链的异源三聚体的组合的约15种同工型。没有特别限定，例如，α链可示例出α1、α2、α3、α4或α5，β链可示例出β1、β2、β3或β4，以及γ链可示例出γ1、γ2或γ3。本发明中使用的层粘连蛋白更优选为由α5、β1和γ1组成的层粘连蛋白511(Nat Biotechnol 28，611-615(2010))。

本发明中，层粘连蛋白可以是片段，只要是具有整合素结合活性的片段就没有特别限定，例如，可以是作为通过弹性蛋白酶酶解而得到的片段的E8片段(EMBO J.，3：1463-1468，1984、J.Cell Biol.，105：589-598，1987)。因此，本发明中，可以优选示例出用弹性蛋白酶将层粘连蛋白511酶解而得到的、记载于WO2011/043405的层粘连蛋白511E8(优选为人层粘连蛋白511E8)。需要说明的是，本发明中使用的层粘连蛋白511E8等层粘连蛋白E8片段无需是层粘连蛋白的弹性蛋白酶酶解产物，可以是重组体。另外，层粘连蛋白511E8进行了市售，例如可以从NIPPI Corporation等购入。

从避免混入未鉴定成分的观点出发，本发明中使用的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段优选被分离。

〔神经营养因子〕

本说明书中，神经营养因子是在维持运动神经元的存活和功能方面发挥重要的作用的膜受体上的配体，例如可列举出神经生长因子(Nerve Growth Factor；NGF)、脑衍生神经营养因子(Brain-derived Neurotrophic Factor；BDNF)、神经营养因子3(Neurotrophin3、NT-3)、神经营养因子4/5(Neurotrophin 4/5；NT-4/5)、神经营养因子-6(Neurotrophin6；NT-6)、碱性成纤维细胞生长因子(basic FGF)、酸性成纤维细胞生长因子(acidic FGF)、成纤维细胞生长因子-5(FGF-5)、上皮生长因子(Epidermal Growth Factor；EGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor；HGF)、胰岛素样生长因子1(Insulin、Insulin LikeGrowth Factor 1；IGF 1)、胰岛素样生长因子2(Insulin Like Growth Factor 2；IGF 2)、胶质细胞株来源神经营养因子(Glia cell line-derived Neurotrophic Factor；GDNF)、TGF-β2、TGF-β3、白细胞介素-6(Interleukin 6；IL-6)、睫状神经营养因子(CiliaryNeurotrophic Factor；CNTF)和LIF等。另外，可以适宜选择这些中的一种或两种以上来使用。本发明中优选的神经营养因子是选自由GDNF和BDNF组成的组中的因子。神经营养因子从例如Wako公司、R&D systems公司等进行了市售而能够容易地利用，还可以通过利用本领域技术人员公知的方法使细胞强制表达而得到。

〔ROCK抑制剂〕

本发明中，ROCK抑制剂只要能够抑制Rho激酶(ROCK)的功能就没有特别限定，例如可列举出Y-27632(参照例如Ishizaki et al.，Mol.Pharmacol.57，976-983(2000)；Narumiya et al.，Methods Enzymol.325，273-284(2000))、Fasudil/HA1077(参照例如Uenata et al.，Nature 389：990-994(1997))、H-1152(参照例如Sasaki et al.，Pharmacol.Ther.93：225-232(2002))、Wf-536(参照例如Nakajima et al.，CancerChemother Pharmacol.52(4)：319-324(2003))和它们的衍生物、以及针对ROCK的反义核酸、RNA干扰诱导核酸(例如，siRNA)、显性失活突变体和它们的表达载体。另外，作为ROCK抑制剂，还已知其它低分子化合物，本发明还可以使用这样的化合物或它们的衍生物(参照例如美国专利申请公开第20050209261号、美国专利申请公开第20050192304号、美国专利申请公开第20040014755号、美国专利申请公开第20040002508号、美国专利申请公开第20040002507号、美国专利申请公开第20030125344号、美国专利申请公开第20030087919号和国际公开第2003/062227号、国际公开第2003/059913号、国际公开第2003/062225号、国际公开第2002/076976号、国际公开第2004/039796号)。本发明中，可以使用1种或2种以上的ROCK抑制剂。本发明中使用的ROCK抑制剂可以优选为Y-27632。

〔培养基〕

本说明书中用于培养细胞的培养基可以通过将动物细胞的培养中通常使用的培养基作为基础培养基来制备，作为基础培养基，例如可以列举出BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、格拉斯哥极限必需培养基(GMEM)、改良的MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、伊格尔MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F12培养基、StemFit培养基、IMDM/F12培养基、HAM培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、Neurobasal培养基或它们的混合培养基等能在动物细胞的培养中使用的培养基。可以由这些基础培养基制备在本发明的制造方法的各工序中使用的培养基。

本说明书中，为了抑制多能干细胞的细胞死亡，包含多能干细胞的细胞群体的培养中使用的培养基期望的是包含未分化维持因子的培养基(未分化维持培养基)。另外，包含多能干细胞的细胞群体的培养中使用的培养基期望的是无饲养层的无血清培养基。该培养基例如可以通过在基础培养基中添加未分化维持因子、血清替代物和适宜营养源等而制备。具体而言，通过在DMEM/F12培养基中添加bFGF、KSR、非必需氨基酸(non Essentialamino acids；NEAA)、L-谷氨酰胺和2-巯基乙醇而制备。

本说明书中的“无血清培养基”是指不含无调整或未纯化的血清的培养基。本发明中，在混入有经纯化的血液来源成分、动物组织来源成分(例如，生长因子)的培养基中，只要不包含无调整或未纯化的血清就包括在无血清培养基中。

无血清培养基还可以含有血清替代物。作为血清替代物，可以列举出适宜含有例如白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’硫代甘油、或它们的相等物等。上述血清替代物例如可以利用WO98/30679中记载的方法而制备。作为血清替代物，还可以利用市售品。作为上述市售的血清替代物，例如可列举出Life Technologies公司(现ThermoFisher)制的KnockOut血清替代物(KSR)、化学成分确定的脂质浓缩物、Glutamax、B-27补充剂、N2补充剂、IT S补充剂。

无血清培养基还可以适宜含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如，非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等。

为了避免制备的繁杂度，作为上述无血清培养基，可以使用如下培养基：添加了适量(例如为约0.5％至约30％、优选约1％至约20％)市售的KSR的无血清培养基(例如，在GMEM培养基中添加了约8％KSR、化学成分确定的脂质浓缩物的培养基)、或在Neurobasal培养基中添加了适量(例如，约0.1～5％)市售的B-27的无血清培养基。另外，作为KSR同等品，可列举出日本特表2001-508302公报中公开的培养基。

培养优选在无血清培养基中进行。作为无血清培养基，优选在包含KSR或B-27的无血清培养基、或者在无异源条件的培养基中进行。此处“无异源”是指与培养对象的细胞的生物物种不同的生物物种来源的成分除外的条件。

本说明书中，饲养层细胞是指在培养干细胞时所共存的除该干细胞以外的细胞。作为饲养层细胞，例如可列举出小鼠成纤维细胞(MEF等)、人成纤维细胞、SNL细胞、STO细胞等。饲养层细胞可以是经增殖抑制处理的饲养层细胞，此处，作为增殖抑制处理，可列举出增殖抑制剂(例如，丝裂霉素C)处理、或基于γ射线照射或UV照射等进行的处理。其中，本发明中优选在没有饲养层细胞的存在下(无饲养层)进行培养。

本说明书中，在没有饲养层细胞的存在下(无饲养层)是指在没有饲养层细胞的存在下进行培养。在没有饲养层细胞的存在下例如可列举出：上述那样的未添加饲养层细胞的条件、或者实质上不含饲养层细胞(例如，饲养层细胞数相对于总细胞数的比例为3％以下、优选为0.5％以下)的条件。

作为能用作未分化维持培养基的无饲养层培养基，开发/市售有多种合成培养基，例如可列举出Essential 8培养基。Essential 8培养基在DMEM/F12培养基中包含作为添加剂的L-抗坏血酸-2-磷酸镁(64mg/l)、亚硒酸钠(14μg/l)、胰岛素(insulin)(19.4mg/l)、NaHCO₃(543mg/l)、运铁蛋白(10.7mg/l)、bFGF(100ng/mL)、以及TGFβ抑制剂(TGFβ1(2ng/mL)或Nodal(100ng/mL))(Nature Methods，8，424-429(2011))。作为市售的无饲养层培养基，例如可列举出Essential 8(Life Technologies公司制；现ThermoFisher)、S培养基(DSPharma Biomedical Co.,Ltd.制)、StemPro(Life Technologies公司制；现ThermoFisher)、hESF9(Proc Natl Acad Sci U S A.2008Sep 9；105(36)：13409-14)、mTeSR1(STEMCELL Technologies公司制)、mTeSR2(STEMCELL Technologies公司制)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司制。此外，作为无饲养层培养基，可列举出StemFit(味之素公司制)。通过在上述工序(1)中使用它们，从而能够简便地实施本发明。

需要说明的是，本说明书中，“包含物质X的培养基”，“在物质X的存在下”是指：添加了外源(exogenous)物质X的培养基或包含外源物质X的培养基、或在外源物质X的存在下。即，理解为：在存在于该培养基中的细胞或组织内源性(endogenous)地表达、分泌或生产该物质X的情况下，内源性物质X与外源物质X有所区别，未包含外源物质X的培养基即使不包含内源性物质X，也不属于“包含物质X的培养基”的范畴。

II.细胞聚集体及其混合物

作为本发明的一个方式，可列举出包含FOXA2阳性或TUJ1阳性的神经系统细胞、每一个细胞聚集体的细胞数为1000个以上的细胞聚集体。作为细胞聚集体的混合物，是多个细胞聚集体的混合物，且是包含总细胞聚集体数的50％以上的本发明的细胞聚集体的混合物。

该细胞聚集体中，FOXA2阳性的神经系统细胞或TUJ1阳性的神经系统细胞的数只要在将该细胞聚集体或源自该细胞聚集体的产物移植到生物体时能够发挥该神经系统细胞的功能，就没有特别限定，依赖于该神经系统细胞的种类，优选为总细胞数的约70％以上、进一步优选约80％以上、更优选约90％以上。

作为本发明的一个方式，可列举出包含FOXA2阳性且TUJ1阳性的神经细胞、每一个细胞聚集体的细胞数为1000个以上的细胞聚集体。

神经系统细胞为产多巴胺神经前体细胞的情况，本发明中的细胞聚集体优选包含总细胞数的约50％以上、进一步优选包含约70％以上、更优选包含约80％以上的FOXA2阳性且TUJ1阳性的神经细胞。

在本发明的一个方式中，细胞聚集体的特征在于在培养时能抑制细胞死亡。此处“在培养时能抑制细胞死亡”是指在分化诱导因子等的存在下以37℃左右进行细胞培养时能够抑制通常发生的神经细胞的细胞死亡。

例如，将细胞聚集体在37℃下、分化诱导因子的存在下培养14～20天时，培养结束时的细胞数为培养开始时的细胞数的5％以上、优选为8％以上、进一步优选为10％以上、进一步优选为15％以上、进一步优选为30％以上时，可以判定该细胞聚集体“在培养时能抑制细胞死亡”。

在本发明的一个方式中，细胞聚集体具有选自以下的(a1)～(a4)中的至少1个特征。细胞聚集体还可以具有全部(a1)～(a4)的特征。

(a1)圆当量直径为100μm～2000μm，

(a2)包络度为0.5以上，

(a3)费雷特直径比为0.5以上，和

(a4)圆形度为0.3以上。

此处上述(a1)～(a4)可以通过如下方式进行测定：在显微镜或数码显微镜中，用相机对观察面拍摄通过在垂直方向上平行的透射照明而产生的图像，对得到的图形(即，将细胞聚集体投影至平面时所形成的图形)进行解析，从而测定。

此处圆当量直径是指具有与上述图形的面积相同的面积的圆的直径。圆当量直径优选为100μm～1000μm、进一步优选为200μm～600μm、优选为300μm～600μm、进而更优选为450μm～600μm。

包络度表示上述图形与包围该图形的凸多边形的周长或面积的比。具体而言，包络度包括周长的包络度和面积的包络度，周长的包络度是图形的周长相对于包络图形的周长的比，面积的包络度是图形的面积相对于包络图形的面积的比。包络度优选为0.7～1.0、进一步优选为0.8～1.0。

费雷特直径比是指外接上述图形的四边形的、水平方向的长度与垂直于此的垂直方向的长度的比，由垂直方向的长度相对于水平方向的长度的比表示。费雷特直径比优选为0.6～1.0、进一步优选为0.7～1.0。

在上述图形为正圆时，圆形度为1，随着变得越细长，圆形度越接近0，是由4π×(面积)÷(周长)²表示的值。圆形度优选为0.5～1.0、进一步优选为0.7～1.0。

作为本发明的细胞聚集体的一个方式，可列举出：在孤立的细胞聚集体的表面未形成碎片层且在显微镜下细胞聚集体的交界线清晰的细胞聚集体。

此处使用的显微镜只要是倍率4～10倍左右的本领域技术人员公知的显微镜就没有特别限定，具体而言，可列举出ThermoFisher EVOS XL。

“孤立的细胞聚集体”是指不与其它细胞聚集体接触而能观察到细胞聚集体的外缘的状态的细胞聚集体。

碎片层是指：存在于细胞聚集体的表面，能作为单个颗粒观察到的颗粒组(例如，死细胞的组)连续地集合呈层状的结构。在细胞聚集体的表面形成有碎片层的情况下，与不具有碎片层或具有少量的碎片层的细胞聚集体相比，该细胞聚集体的交界线不清晰。

包含多个上述的本发明的细胞聚集体的细胞聚集体的混合物也在本发明的范畴内。本说明书中，细胞聚集体的混合物包含至少2个以上、优选包含5个以上的细胞聚集体，包含总细胞聚集体数的约20％以上、优选约40％以上、进一步优选约50％以上、特别优选60％以上的本发明的细胞聚集体。细胞聚集体的混合物可以包含以卫星形状存在的能测定的大小的微小的细胞组。

此处“以卫星形状存在的微小的细胞组”是指不与细胞聚集体结合地独立存在，由多个细胞(例如，死细胞)形成的小的细胞组。

本发明的细胞聚集体的混合物具有至少在大小和形状方面良好的均匀性，在选自由圆形度、最小直径、周长、费雷特直径(垂直费雷特直径或水平费雷特直径)、费雷特直径比、最大直径、包络度(周长包络度或面积包络度)、面积和圆当量直径组成的组中的指标中的1个以上的指标中，变异系数(CV值)为15％以下、优选为12％以下或10％以下、更优选为8％以下或5％以下。此处各指标可以通过如下方式测定：在显微镜或数码显微镜中，用相机对观察面拍摄通过在垂直方向上平行的透射照明而产生的图像，对得到的图形进行解析而测定，但只要是能以与该方法相同程度的精度进行测定的方法，就对测定方法没有限定。

此处，最小直径是指用平行的2条直线夹持图形时的、2条直线之间的距离的最小值。本发明的细胞聚集体的最小直径例如为200μm～600μm、优选为300μm～600μm、进一步优选为400μm～600μm。

周长是指图形的周围长度，即，是指在将细胞聚集体投影到平面上时所形成的图形的周围长度。本发明的细胞聚集体的周长例如为800μm～2700μm、优选为1600μm～2700μm。

费雷特直径(垂直费雷特直径或水平费雷特直径)是指外接于图形的四边形的垂直方向或水平方向的长度。即，费雷特直径是指：在假设将细胞聚集体投影到平面上时所形成的图形所外接的四边形时的、该四边形的每个边的长度。本发明的细胞聚集体的垂直费雷特直径或水平费雷特直径例如为200μm～800μm、优选为300μm～600μm、进一步优选为400μm～800μm。

最大直径是指图形的内圆周上任意两点之间的距离最大的长度。即，最大直径是指将细胞聚集体投影到平面上时所形成的图形的内圆周上任意两点之间的距离中最大距离的长度。本发明的细胞聚集体的最大直径例如为200μm～900μm、优选为300μm～600μm、进一步优选为400μm～900μm。

面积是利用二维计算出的图形的面积，即，是指在将细胞聚集体投影到平面上时所形成的图形的面积。本发明的细胞聚集体的面积例如为46000μm²～278000μm²、优选为165000μm²～278000μm²。

上述的各指标根据将细胞聚集体投影到平面上时的方向而具有多个值，但为了方便起见，可以采用在任意方向上测得的值。各指标当中，细胞聚集体越接近正球体、即投影到平面上时的图形越接近正圆，则费雷特直径比、包络度和圆形度表示越均匀的值。

III.黏附性细胞群体的混合物的制造方法

作为本发明的一个方式，可列举出包含神经系统细胞的黏附性细胞群体的混合物的制造方法，所述方法包括以下的工序：

(1)在第一分化诱导因子的存在下对多个干细胞进行分化诱导，得到包含1个以上的处于第一分化阶段的神经前体细胞的多个细胞的工序；

(2)从工序(1)中得到的多个细胞中选择性分离处于第一分化阶段的神经前体细胞的工序，该工序包括：在液体介质的连续流中，使工序(1)中得到的多个细胞悬浮，以及识别处于第一分化阶段的神经前体细胞，将处于第一分化阶段的神经前体细胞与并非处于第一分化阶段的神经前体细胞分离，以使其分别流入各个液体介质的连续流；及

(3)在第二分化诱导因子的存在下培养工序(2)中分离的处于第一分化阶段的神经前体细胞，得到黏附性细胞群体的混合物的工序，其中，

黏附性细胞群体的混合物包含总黏附性细胞群体数的50％以上的具有以下的(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体：

(b1)包含处于第二分化阶段的神经系统细胞；

(b2)包含1000个以上的细胞。

〔工序(1)〕

工序(1)是在第一分化诱导因子的存在下对多个干细胞进行分化诱导而得到包含1个以上的处于第一分化阶段的神经前体细胞的多个细胞的工序。本说明书中，处于第一分化阶段的神经前体细胞只要是相当于由干细胞、优选为多能干细胞分化诱导为处于第二分化阶段的神经系统细胞时相当于中间体的神经前体细胞，就没有特别限定，例如可列举出能分化为神经细胞的神经前体细胞。

作为神经前体细胞，具体而言，可列举出注定中脑底板(floor plate)命运的神经前体细胞等。作为注定中脑底板命运的神经前体细胞，可列举出Corin和/或Lrtm1阳性的细胞。该细胞可以利用本领域技术人员公知的方法进行制造。

对于用于由干细胞得到处于第一分化阶段的神经前体细胞的分化诱导方法，可以适宜根据神经前体细胞的种类而使用本领域技术人员公知的方法。即，在本领域技术人员公知的第一分化诱导因子的存在下用适合的培养基进行培养即可。此处第一分化诱导因子是指对细胞的分化状态(与分化相关的转录因子、基因、蛋白质的表达)产生影响的因子，可列举出低分子化合物、蛋白质、蛋白质的肽片段、以及二氧化碳气体、氧分压或压力等物理因素。具体而言，已知使用SMAD抑制剂(BMP抑制剂、TGFβ抑制剂)、SHH信号刺激剂、GSK3β抑制剂、神经营养因子的方法等。

例如，注定中脑底板命运的神经前体细胞的情况，可列举出Stem cell reports，vol.2 337-350，2014中记载的公知的方法。

本说明书中，作为注定中脑底板命运的神经前体细胞，具体而言，可列举出Corin和/或Lrtm1阳性的细胞。Corin和/或Lrtm1阳性的细胞是指：表达了能通过抗Corin抗体或抗Lrtm1抗体识别Corin蛋白质和/或Lrtm1蛋白质的量的细胞。

以处于第一分化阶段的神经前体细胞是包含Corin和/或Lrtm1阳性的细胞的神经前体细胞的情况为例进行列举，对干细胞的分化诱导方法进行具体地说明。

由多能干细胞分化诱导为Corin和/或Lrtm1阳性的细胞时，可以使用包含第一分化诱导因子的培养基进行。作为第一分化诱导因子，可以示例出例如上述的、BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂、FGF8和GSK3β抑制剂。由多能干细胞分化诱导为Corin和/或Lrtm1阳性的细胞时，期望的是通过如下多个阶段的工序来进行：

(1a)将多能干细胞在细胞外基质(也称为extracellular matrix)上在包含BMP抑制剂和TGFβ抑制剂的培养基中进行贴壁培养的工序、

(1b)将上述工序(1a)中得到的细胞在包含BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂和FGF8的培养基中在细胞外基质上进行贴壁培养的工序、

(1c)将上述工序(1b)中得到的细胞在包含BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂、FGF8和GSK3β抑制剂的培养基中在细胞外基质上进行贴壁培养的工序、

(1d)将上述工序(1c)中得到的细胞在包含BMP抑制剂和GSK3β抑制剂的培养基中在细胞外基质上进行贴壁培养的工序。

此处使用的培养基可以将动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基进行制备。作为基础培养基，例如包括GMEM培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、伊格尔极限必需培养基(EMEM)培养基、αMEM培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养基、StemFit培养基、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、Neurobasal培养基(Life Technologies；现ThermoFisher)和它们的混合培养基等。优选为GMEM培养基。培养基中可以含有血清，或还可以无血清。根据需要培养基还可以包含例如白蛋白、转铁蛋白、KnockOut血清替代物(KSR)(血清替代物)、N2补充剂、B-27补充剂、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油等中的1种以上的血清替代物，还可以含有脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等中的1种以上的物质。优选的培养基是含有KSR、2-巯基乙醇、非必需氨基酸和丙酮酸的GMEM培养基。可以向该培养基中适宜加入选自由BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂、FGF8和GSK3β抑制剂组成的组中的试剂来进行培养。

需要说明的是，培养基的组成可以在培养过程中进行适宜调整或变更。

在细胞外基质上进行贴壁培养的情况，可以通过使用用细胞外基质进行了涂层处理的培养容器进行培养来进行。涂层处理可以通过将含有细胞外基质的溶液放入培养容器后适宜去除该溶液而进行。

上述工序(1a)通常在进一步包含ROCK抑制剂的培养基中进行。即，工序(1a)可以是“将多能干细胞在细胞外基质上在包含ROCK抑制剂、BMP抑制剂和TGFβ抑制剂的培养基中进行贴壁培养的工序”。

对于培养条件，培养温度没有特别限定，优选在约37℃、含CO₂的空气气氛下进行培养，CO₂浓度优选为约2～5％。

培养期间只要是出现Corin和/或Lrtm1阳性的细胞的期间就没有特别限定，优选在上述工序(1)结束后得到的细胞群体中包含的Corin和/或Lrtm1阳性的细胞的比例为10％以上的期间进行培养，期望的是至少进行10天、更优选进行12天至16天。

作为多个多能干细胞，可以使用细胞彼此被解离的多能干细胞。作为使细胞彼此解离的方法，例如可列举出如下方法：力学解离的方法；使用具有蛋白酶活性和胶原酶活性的解离溶液(例如，Accutase(商标)和Accumax(商标)等)或仅具有胶原酶活性的解离溶液的解离方法。优选利用使用胰蛋白或其替代物(可示例出TrypLE CTS(Life Technologies；现ThermoFisher))将人多能干细胞解离的方法。将细胞解离的情况下，期望的是在解离后适宜添加ROCK抑制剂并进行培养。添加ROCK抑制剂的情况下，添加并培养至少1天即可，更优选为1天。

需要说明的是，一个方式中，人多能干细胞(例如，人iPS细胞)还可以在上述工序(1)之前、在没有饲养层细胞的存在下、在含有bFGF和SHH信号刺激剂的无血清培养基中进行贴壁培养。该贴壁培养优选在用层粘连蛋白511、层粘连蛋白511的E8片段或玻连蛋白对表面进行了涂层的细胞容器中实施。该贴壁培养优选使用Essential 8、TeSR培养基、mTeSR培养基、mTeSR-E8培养基、或StemFit培养基、进一步优选使用Essential 8或StemFit培养基作为无饲养层培养基来加以实施(WO2017/183736)。

〔工序(2)〕

工序(2)包括：在液体介质的连续流中，使工序(1)中得到的多个细胞悬浮，和识别处于第一分化阶段的神经前体细胞，将处于第一分化阶段的神经前体细胞与并非处于第一分化阶段的神经前体细胞分离，以使其分别流入各个液体介质的连续流。

本发明中，为了从工序(1)中得到的多个细胞中选择性分离处于第一分化阶段的神经前体细胞，基于特定的指标识别该神经前体细胞。此处对使用的指标没有特别限定，可以适宜使用本领域技术人员公知的指标。即，可列举出处于第一分化阶段的神经前体细胞中特异性表达的标记物基因/蛋白、细胞大小、细胞的密度等。

将该神经前体细胞中特异性表达的标记物作为指标的情况下，使用与其特异性结合的物质和细胞分离装置(细胞分选仪)将标记物阳性细胞分离即可。

作为标记物，可以使用在目标的处于第一分化阶段的神经前体细胞的表面所表达的蛋白质。作为与该标记物特异性结合的物质，可以使用抗体、适体，可以优选使用抗体或其抗原结合片段。

上述抗体还可以是多克隆或单克隆抗体。这些抗体可以使用本领域技术人员公知的技术来制作(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley and Sons.Section 11.12-11.13)。具体而言，抗体为多克隆抗体的情况下，可以通过如下方式得到：依据常规方法在大肠杆菌或哺乳类细胞株等中表达、纯化的标记物的蛋白，将具有标记物的部分氨基酸序列的寡肽或糖脂质纯化，使家兔等非人动物免疫，依据常规方法由该免疫动物的血清得到。另一方面，在单克隆抗体的情况下，可以从如下杂交瘤细胞中得到：使由经上述免疫的非人动物得到的脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞融合而制备的杂交瘤细胞(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel etal.(1987)Publish.John Wiley and Sons.Section 11.4-11.11)。作为抗体的抗原结合片段，可示例出抗体的一部分(例如Fab片段)或合成抗体片段(例如，单链Fv片段“ScFv”)。Fab和F(ab)₂片段等抗体的片段还可以利用基因工序中公知的方法来制作。

出于识别或分离表达标记物的细胞的目的，该待结合的物质可以与例如荧光标记、放射性标记、化学发光标记、酶、生物素或链亲合素等能检测的物质、或蛋白A、蛋白G、微珠或磁珠等能分离提取的物质结合或接合。

该待结合的物质还可以间接地进行标记。可以使用本领域技术人员公知的各种方法来进行，例如可列举出使用与该抗体特异性结合的经预先标记的抗体(二次抗体)的方法。

本说明书中，与标记物特异性结合的适体可以使用本领域技术人员公知的技术来制作(SELEX(systematic evolution of ligand by exponential enrichment)法：Ellington，A.D.&Szostak，J.W.(1990)Nature，346，818-822.，Tuerk，C.&Gold，L.(1990)Science，249，505-510)。

处于第一分化阶段的神经前体细胞为注定中脑底板命运的神经前体细胞的情况，可以使用Corin和/或Lrtm1作为标记物。人Corin可以由NCBI的登录号NM_006587获得其序列。同样地，人Lrtm1可以由NM_020678获得其序列。例如，针对Corin的抗体可以利用WO2004/065599、WO2006/009241中记载的制作法得到，针对Lrtm1的抗体可以利用WO2013/015457中记载的制作法得到。

工序(2)中使用的细胞分离装置包括如下机构：使工序(1)中得到的多个细胞悬浮于液体介质的连续流中，识别处于第一分化阶段的神经前体细胞，将处于第一分化阶段的神经前体细胞与并非此的细胞分离，以使其分别流入各个液体介质的连续流。

本说明书中，前述细胞分离装置(也称为细胞分选仪)是用于检测标记物等处于第一分化阶段的神经前体细胞特征性指标的装置和具备不形成液滴而能进行连续送液的液体流路的装置。通过使用该细胞分离装置，从而能够在不形成液滴的连续的溶液体系内分离细胞。

本说明书中的细胞分离装置优选为完全封闭系统。作为该细胞分离装置，具体而言，可以列举出Hulspas R等人著的记载于Cytotherapy.2014Oct；16(10)：1384-9(Hulspas文献)的微通道式细胞分选仪。该文献的细胞分离装置为完全封闭系统的微通道式，能够不形成液滴地将细胞分离。另外，作为该细胞分离装置，优选能够以高速(例如，5000颗粒/秒左右以上、一次执行处理总量1000万个细胞以上)分离细胞的装置。

具体而言，可以利用Cytonome公司Gigasort细胞分选仪(参照https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25065635(Hulspas文献)和http://www.cytonome.com/)。该细胞分选仪为完全封闭系统的微通道式，通过用空气压力使标记物等检测装置通过后的分离对象细胞的流路弯曲，从而能够在未形成液滴的连续的溶液体系内将细胞分离。

〔工序(3)〕

工序(3)为在第二分化诱导因子的存在下培养工序(2)中分离的处于第一分化阶段的神经前体细胞，得到黏附性细胞群体的混合物的工序。该黏附性细胞群体的混合物包含总黏附性细胞群体数的50％以上的具有以下的(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体：

(b1)包含处于第二分化阶段的神经系统细胞；

(b2)包含1000个以上的细胞。

本说明书中，处于第二分化阶段的神经系统细胞是进行工序(2)的筛选后、进一步继续培养而分化阶段得到发展的细胞，包含注定分化为特定的神经系统细胞的前体细胞。此处处于第二分化阶段的神经系统细胞只要是与处于第一分化阶段的神经前体细胞相比、分化得到发展的状态就没有特别限定，分化的发展情况依赖于目标神经系统细胞。

作为处于第二分化阶段的神经系统细胞，可列举出TUJ1、OTX2、FOXA2、LMX1A、LMX1B、En1、Nurr1、PITX3、DAT、GIRK2和TH中的至少1个、优选至少2个、进一步优选至少3个为阳性的神经细胞。作为处于第二分化阶段的神经系统细胞的一个方式，可列举出FOXA2阳性和/或TUJ1阳性的细胞。

作为处于第二分化阶段的神经系统细胞，可优选列举出中脑腹侧来源神经细胞、具体而言产多巴胺神经前体细胞或产多巴胺神经细胞。作为处于第二分化阶段的神经系统细胞，可优选列举出FOXA2阳性且TUJ1阳性的产多巴胺神经前体细胞。

对于用于由工序(2)中得到的细胞获得处于第二分化阶段的神经系统细胞的分化诱导方法，根据目标神经系统细胞的种类适宜使用本领域技术人员公知的方法即可。即，在本领域技术人员公知的第二分化诱导因子的存在下用适合的培养基进行培养即可。此处，作为第二分化诱导因子，是指对细胞的分化状态(与分化相关的转录因子、基因、蛋白质的表达)产生影响的因子，可列举出低分子化合物、蛋白质、蛋白质的肽片段、以及二氧化碳气体、氧分压或压力等物理因素。例如，产多巴胺神经前体细胞的情况，可列举出Stem cellreports，vol.2 337-350，2014中记载的公知的方法。

以第二分化阶段的神经系统细胞为包含产多巴胺神经前体细胞的神经细胞的情况为例进行列举，对分化诱导方法进行具体地说明。

此处使用的培养基可以以动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基来制备。作为基础培养基，例如包括GMEM培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、伊格尔极限必需培养基(EMEM)培养基、αMEM培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养基、Ham’sF12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、Neurobasal培养基(Life Technologies；现ThermoFisher)和它们的混合培养基等。优选为Neurobasal培养基。培养基中可以含有血清，或还可以无血清。根据需要培养基还可以包含例如白蛋白、转铁蛋白、KnockOut血清替代物(KSR)(ES细胞培养时的FBS的血清替代物)、N2补充剂、B-27补充剂、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油等中的1种以上的血清替代物，还可以含有脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、核酸(例如，双丁酰cAMP(dbcAMP))等中的1种以上的物质。优选的培养基为含有B-27补充剂、抗坏血酸和dbcAMP的Neurobasal培养基。可以向该培养基中适宜加入神经营养因子进行培养。

分化诱导可以通过悬浮培养进行，此处悬浮培养是指使细胞以非黏附的状态在培养容器中进行培养，没有特别限定，可以使用如下培养容器来进行：出于改善与细胞的黏附性的目的而未经人工处理(例如，基于细胞外基质等的涂层处理)的培养容器；或进行了人工抑制黏附的处理(例如，聚羟乙基甲基丙烯酸(poly-HEMA)、非离子性的表面活性多元醇(Pluronic F-127等)或进行了基于磷脂类似结构物(例如，以2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱作为结构单元的水溶性聚合物(Lipidure))的涂层处理的培养容器。

对于培养条件，培养温度没有特别限定，为约30～40℃、优选约37℃，在含CO₂的空气气氛下进行培养，CO₂浓度优选约2～5％。

培养期间只要是出现Foxa2阳性细胞的期间就没有特别限定，培养期望的是进行至少7天。更优选为7天至30天，进一步优选为14天至21天、或14天至20天、或14天至18天、或14天至16天，最优选为16天。

培养期望的是适宜添加ROCK抑制剂来进行培养。添加ROCK抑制剂的情况，添加并培养至少1天即可，更优选为1天。

IV.黏附性细胞群体及其混合物

利用黏附性细胞群体的混合物的制造方法，可以制造包含总黏附性细胞群体数的50％以上的具有以下的(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体的黏附性细胞群体的混合物：

(b1)包含处于第二分化阶段的神经系统细胞，

(b2)包含1000个以上的细胞。

另外，通过黏附性细胞群体的制造方法，从而能够获得上述具有(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体，所述方法包括如下工序：从利用上述黏附性细胞群体的混合物的制造方法而得到的黏附性细胞群体的混合物中分离上述具有(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体。

黏附性细胞群体的混合物可以是三维的黏附性细胞群体的混合物(即细胞聚集体的混合物)，还可以是二维的单层或多层的黏附性细胞群体的混合物(即细胞片层)。三维的黏附性细胞群体中，圆当量直径为100μm～2000μm、优选为100μm～1000μm、进一步优选为200μm～600μm、进一步优选为300μm～600μm。

该黏附性细胞群体或其混合物在培养时能抑制细胞死亡。将该黏附性细胞群体培养14-20天时，培养结束时的细胞数为培养开始时的细胞数的5％以上、优选为8％以上、进一步优选为10％以上、进一步优选为15％以上、进一步优选为60％以上、进一步优选为约100％。

需要说明的是，通过培养所致的细胞数的变动依赖于细胞的种类，第二分化阶段中的神经系统细胞为产多巴胺神经前体细胞的情况，已知通常约80％以上的细胞灭亡。然而，通过使用本发明的制造方法，在第二分化阶段中培养14-20天时，培养结束时的细胞数为第二分化阶段的培养开始时的细胞数的5％以上、优选为8％以上、进一步优选为10％以上、进一步优选为15％以上、进一步优选为20％以上、具体而言例如15％～80％、或15％～50％。

另一方面，第二分化阶段中的神经系统细胞为神经干细胞的情况，通常已知即使细胞数暂时减少，之后细胞数也会恢复。在这样的神经系统细胞的情况下，在第二分化阶段中培养14-20天时，培养结束时的细胞数为第二分化阶段的培养开始时的细胞数的80％以上或约100％。

作为三维的黏附性细胞群体的一个方式，可以列举出细胞聚集体，该细胞聚集体优选进一步具有以下的特征：

(b3)包络度为0.5以上、优选为0.7～1.0、进一步优选为0.8～1.0，

(b4)费雷特直径比为0.5以上、优选为0.6～1.0、进一步优选为0.7～1.0，和

(b5)圆形度为0.3以上、优选为0.5～1.0、进一步优选为0.7～1.0。

作为优选的一个方式，可列举出具有以下的特征的细胞聚集体：

·圆当量直径为100μm～1000μm、

·包络度为0.8～1.0、

·费雷特直径比为0.7～1.0、

·圆形度为0.7～1.0。

该细胞聚集体进一步优选具有以下的特征：

得到的细胞聚集体的混合物中，在选自由圆形度、最小直径、最大直径、垂直费雷特直径或水平费雷特直径、费雷特直径比、圆当量直径、周长、面积、以及周长的包络度或面积的包络度组成的组中的指标当中，1个以上的指标中变异系数为15％以下。

在上述制造方法中，作为成为原料的干细胞，只要是能分化为神经系统细胞的干细胞就没有特别限定，优选列举出多能干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、Muse细胞等。

作为干细胞，进一步优选列举出多能干细胞，进而更优选列举出ES细胞或iPS细胞。

利用上述本发明的制造方法而得到的黏附性细胞群体也是本发明的概念。

进而，上述制造方法中的工序(2)中得到的神经前体细胞是通过在第二分化诱导因子的存在下进行培养而能分化诱导为本发明的细胞聚集体、黏附性细胞群体的非黏附性细胞群体、即孤立的细胞的混合物。该细胞的混合物也为本发明的范畴。

具体而言，可列举出：通过包含约70％以上的Corin或Lrtm1阳性的细胞、在第二分化诱导因子的存在下进行培养，从而能分化诱导为本发明的细胞聚集体、黏附性细胞群体的细胞的混合物。

通过将该细胞的混合物供于悬浮培养，从而能够获得上述本发明的第二分化阶段中的神经系统细胞的细胞聚集体。另外，通过将该细胞的混合物供于贴壁培养，从而能够制造单层的细胞片层，该细胞片层也为本发明的范畴。

V.药物组合物

对于本发明的细胞聚集体或其混合物或黏附性细胞群体，作为用于患有需要移植神经细胞或能分化为神经细胞的神经系统细胞的疾病的患者的移植用药物组合物是有用的，可以作为伴随神经细胞的改性、损伤或功能障碍的疾病的治疗药等药物而使用。即，包含本发明的细胞聚集体或黏附性细胞群体、及作为药物可接受的载体的药物组合物也为本发明的范畴。

作为需要移植神经细胞的疾病、或伴随神经细胞的损伤或功能障碍的疾病，例如可列举出脊髓损伤、运动神经病、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、亨廷顿舞蹈症、多系统萎缩、脊髓小脑变性症、阿尔茨海默氏病、色素性视网膜炎、老年性黄斑变性、帕金森氏综合征，优选列举出帕金森病。

作为本发明的一个方式，可列举出包含含有本发明的产多巴胺神经前体细胞的细胞聚集体或其混合物或黏附性细胞群体的帕金森病治疗药。该帕金森病治疗剂中包含的产多巴胺神经前体细胞的细胞数只要移植片在给药后能成活就没有特别限定，例如，每1次移植可以包含1.0×10⁴个以上。另外，还可以根据症状、躯体的大小进行适宜增减地加以制备。产多巴胺神经前体细胞向疾病部位的移植例如可以利用记载于Nature Neuroscience，2，1137(1999)或N Engl J Med.；344：710-9(2001)中那样的方法来进行。

对于作为药物可接受的载体而言，只要是为了维持细胞的存活而使用的物质就可以没有特别限定地使用本领域技术人员公知的物质。具体而言可以使用，生理性水性溶剂(生理盐水、缓冲液、无血清、培养基等)。根据需要还可以在移植医疗中，在包含要移植的组织或细胞的药物中配混通常使用的保存剂、稳定剂、还原剂、等渗剂等。

对于本发明的药物组合物，可以通过将本发明的细胞聚集体或其混合物、或黏附性细胞群体悬浮在适合的生理性水性溶剂中，而制成细胞悬浮液。如果需要，还可以添加冷冻保存剂进行冷冻保存，在使用时进行解冻、清洗并用于移植。

VI.治疗方法

作为本发明的一个方式，可列举出需要补充神经系统细胞的疾病的治疗方法，所述方法包括如下工序：将本发明的细胞聚集体或其混合物或黏附性细胞群体移植到患有需要移植神经系统细胞的疾病的患者中。

作为本发明的一个方式，本发明中得到的包含产多巴胺神经前体细胞的细胞聚集体或其混合物或黏附性细胞群体可以制成制剂、具体而言移植用制剂对帕金森病患者进行给药。通过将得到的产多巴胺神经前体细胞悬浮于生理盐水等中，移植到患者的多巴胺神经缺乏的区域、例如纹状体中，从而进行。

VII.移植

在进行移植时，为了维持该细胞聚集体的存活能力，还可以保存在所需的介质中。作为“为了维持存活能力所需的介质”，可列举出培养基、生理学缓冲溶液等，只要包含产多巴胺神经前体细胞的细胞群体存活就没有特别限定，若为本领域技术人员则可以适宜选择。作为一个例子，可列举出将在动物细胞的培养中通常使用的培养基作为基础培养基而制备的培养基。作为基础培养基，例如可以列举出BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、GMEM培养基、改良的MEM Zinc Option培养基、Neurobasal培养基、IMDM培养基、Medium199培养基、伊格尔MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F12培养基、IMDM/F12培养基、HAM培养、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基或它们的混合培养基等能在动物细胞的培养中使用的培养基。

此处，本说明书中的“成活”是指被移植的细胞在生物体内长期(例：30天以上、60天以上、90天以上)存活，黏附并滞留于脏器内。

本说明书中的“功能性成活”是指被移植的细胞成活，并在生物体内发挥原本的功能的状态。

本说明书中的“功能性成活率”是指移植的细胞中实现了功能性成活的细胞的比例。被移植的产多巴胺神经前体细胞的功能性成活率可以通过例如测量移植片中的TH阳性细胞数而求出。

通过移植上述细胞聚集体，从而被移植的细胞(包括产多巴胺神经前体细胞和在移植后所诱导的包含产多巴胺神经前体细胞)的功能性成活率为0.1％以上、优选为0.2％以上、进一步优选为0.4％以上、进一步优选为0.5％以上、进一步优选为0.6％以上。

作为本说明书中成为移植对象的哺乳动物，例如可列举出人、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔子、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴等，优选列举出啮齿类(例如，小鼠、大鼠)或灵长类(例如，人、猴)，更优选列举出人。

实施例

以下列举实施例对本发明进行详细地说明，但本发明不受这些任何限定。

(试验1)

＜细胞和培养＞

将用于将人iPS细胞分化诱导为产多巴胺神经前体细胞的方案示于图1。图1分别示出在直至分化诱导开始进行扩大培养(day-7～0)、从分化诱导开始至第12天为止(day 0～12)的第一分化阶段、以及分化诱导开始后第12天～28天(day 12～28)第二分化阶段的培养条件。需要说明的是，在分化诱导开始后第12天(day 12)进行分选。

作为人iPS细胞的QHJ-I01是将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-MYC、LIN28和p53的显性失活体(Okita，K.，et al.Stem Cells 31，458-66，2013)通过附加型载体导入人PBMC中而得到的细胞，是从京都大学的山中教授等人处领受。

利用依据Miyazaki T et al.，Nat Commun.3：1236，2012记载的方法培养该iPS细胞。即简而言之，在用Laminin511E8涂层的6孔孔板上通过包含FGF2(bFGF)的未分化维持培养基(AK03N)维持培养iPS细胞。

使用TrypLE CTS(Life Technologies)将维持培养iPS细胞而得到的细胞群体解离，在另行准备的用Laminin511E8(iMatrix-511、Nippi)涂层的6孔孔板中以每1孔播种5×10⁶个，将培养基更换为分化培养基(分化诱导开始：第0天)。作为分化培养基，在基础培养基A中添加10μM Y-27632(WAKO)、0.1μM LDN193189(STEMGENT)和0.5μM A83-01(WAKO)来使用。需要说明的是，基础培养基A是含有8％KSR(Invitrogen)、1mM丙酮酸钠(Invitrogen)、0.1mM MEM非必需氨基酸(Invitrogen)和0.1mM 2-巯基乙醇(WAKO)的GMEM(Invitrogen)。次日(day 1，第1天)将培养基更换为含有0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01、2μM 2,6,9-三元取代嘌呤(WAKO)和100ng/mL FGF8(WAKO)的基础培养基A。2天后(day 3，第3天)将培养基更换为含有0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01、2μM 2,6,9-三元取代嘌呤、100ng/mL FGF8和3μM CHIR99021(WAKO)的基础培养基A。4天后(day 7，第7天)将培养基更换为含有0.1μMLDN193189和3μM CHIR99021的基础培养基A。在此期间每天进行一次培养基更换。在分化诱导开始后第12天(day 12)实施了使用抗Corin抗体的细胞分选。

＜分选前处理＞

用含有0.1μM LDN193189和3μM CHIR99021的基础培养基A培养5天后，即在分化诱导开始后第12天(day 12)使用TrypLE CTS将细胞解离，悬浮于含有2％FBS、30μM Y-27632(WAKO)、20mM D葡萄糖和50μg/ml青霉素/链霉素)的Ca2+Mg2+-free HBSS(Invitrogen)中。添加上述的抗Corin抗体，在4℃下进行20分钟孵育，进行荧光活化细胞分选(FACS)，回收Corin阳性细胞，实施了各种解析。

需要说明的是，抗Corin抗体利用以下的方法进行制作。在食蟹猕猴Corin基因当中，将编码一部分细胞外区域(79-453氨基酸)的基因序列导入293E细胞中，表达并回收Corin蛋白质的细胞外区域片段。使小鼠免疫回收的蛋白质后，取出淋巴细胞并与骨髓瘤细胞融合。从融合的细胞群体中选择对Corin具有反应性的克隆。将该克隆的培养上清液液作为抗Corin单克隆抗体在实施了荧光标记后使用。

＜分选＞

作为用于FACS的细胞分选仪，使用作为Stream-In-Air方式的机型的BD公司的FACSJazz(商标)、或作为微通道式的机型的Cytonome公司的Gigasort。回收Corin阳性细胞，实施了各种解析。

FACSJazz(商标)的情况，分选条件如下：通常神经细胞的细胞分选中使用的喷嘴直径100μm、鞘压力为29PSI。另外，Gigasort的情况，分选条件如下：制造商标准的流路内径约200μm、鞘压力为14-20PSI。

＜分选后的悬浮培养＞

将回收的Corin阳性细胞以20000个/孔移至PrimeSurface 96U孔板(SumitomoBakelite Co.,Ltd.)中，使用添加了基础培养基B(B-27(商标)补充剂减去维生素A(Supplement Minus Vitamin A)(Invitrogen)、20ng/mL BDNF(WAKO)、10ng/mL GDNF(WAKO)、200mM抗坏血酸(WAKO)和0.4mM dbcAMP(Sigma)的Neurobasal(注册商标)培养基(Invitrogen))进行悬浮培养。此时，作为最初的培养基，使用添加了30μM的Y-27632的培养基，每3天进行一次更换一半量培养基时，使用未添加Y-27632的培养基。从分选起至16天后(分化诱导结束：day 28，第28天)为止实施悬浮培养而分化诱导了产多巴胺神经前体细胞。在此期间，使用显微镜每培养4天进行悬浮培养细胞聚集体的拍摄，将观察图像示于图2。

使用Jazz筛选的组的细胞聚集体中，从分化诱导开始后第16天起至第28天(day16～day 28天)为止未观察到悬浮培养细胞聚集体的大小发生变化。相比之下，使用Gigasort筛选的组的细胞聚集体中，从分化诱导开始后第20天(day 20)左右起可知细胞聚集体的直径变大。另外，在第16天、第20天、第24天和第28天中，与使用了Gigasort的细胞聚集体相比，均是使用了Jazz的细胞聚集体的死细胞、碎片、卫星形状的细胞群体多。例如，使用了Jazz的情况下，从“day 16，第16天”起第3位的聚集体中，除细胞聚集体以外可观察到小的黑色粒(即卫星形状的细胞群体)、包围细胞聚集体那样的碎片。与此相对，使用了Gigasort的情况下，碎片和卫星形状的细胞群体显著减少。若观察使用Gigasort筛选的组的细胞聚集体，则细胞聚集体的交界线清晰，未观察到在使用Jazz筛选的细胞聚集体的周围所观察到的碎片层、卫星形状所存在的微细的细胞群体的形成，可知存在于细胞聚集体的周围的死细胞、死细胞的细胞群体少。进而，源自Gigasort的第24天之后的细胞聚集体的直径为约450μm～约600μm，比源自Jazz的细胞聚集体(外缘不不清晰且残留有碎片部分的细胞聚集体的直径为约350μm～约400μm)大。

＜细胞数测量＞

在第28天使用微量移液管将表1中记载的数的细胞聚集体从96孔U底孔板中按培养基进行回收，等待细胞聚集体在自重下沉淀。去除上清培养基，添加PBS 1mL，等待细胞聚集体在自重下沉淀。去除上清液，添加神经细胞分散试剂盒的酶液1mL并在37℃水浴中孵育。每隔10分钟进行移液，在从孵育开始起经过30分钟的时刻采集细胞悬浮液10μL，与台盼蓝(Thermo Fisher Scientific)10μL混合并注入血细胞计数板中。在显微镜下计数细胞数。将其结果示于表1的“酶液中”一栏。另外，计算出台盼蓝非阳性细胞数/总细胞数，作为细胞的存活率。接着，加入神经细胞分散试剂盒的分散液、去除液并进行离心分离。去除上清液后用PBS 1mL使其再次悬浮，将10μL与台盼蓝(Thermo Fisher Scientific)10μL混合并注入血细胞计数板中。在显微镜计数细胞数。将其结果示于表1的“清洗后[血细胞计数板]”一栏。另外，通过自动细胞计数器(chemometec，NC-200)测定再次悬浮的样品。将其结果示于表1的“清洗后[NC-200]”一栏。

[表1]

如表1所示，可知：在任意的测定法中，使用Gigasort筛选的组的细胞聚集体中，每一细胞聚集体的细胞数为使用Jazz筛选的组的细胞聚集体的约3倍。需要说明的是，细胞数测量时的存活率全部为100％。

＜细胞形态测量＞

在第28天使用微量移液管将48个细胞聚集体从96孔U底孔板按培养基进行回收，移至6cm低黏附培养皿(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)中。使用数码显微镜(Keyence；VHX-5000)通过透射照明拍摄细胞聚集体，得到图3的图像。在视野内通过Gigasort筛选的细胞的细胞聚集体为47个(B)，通过Jazz筛选的细胞的细胞聚集体为48个(A)。

对通过数码显微镜中内置的VHX-5000(Ver1.3.2.4)软件获得的图像进行解析，测定了细胞聚集体的圆形度、最小直径、周长、费雷特直径(水平)、费雷特直径(垂直)、费雷特直径比、包络度(面积)、最大直径、包络度(周长)、面积和圆当量直径(图4)。其中，对于圆当量直径、包络度、面积、费雷特直径比、圆形度，将Jazz(浅灰色)与Gigasort(深灰色)进行比较的图表示于图4。另外，利用获得的数据计算出标准偏差和变异系数(CV值)。将CV值示于图5。

如图3所示，可知：与使用Jazz筛选的组的细胞聚集体相比，使用Gigasort筛选的组的细胞聚集体在视觉上也较大。另外，如图4所示，与使用Jazz筛选的组的细胞聚集体相比，使用Gigasort筛选的组的细胞聚集体的圆当量直径和面积大，且作为球形周围的光滑性的指标的、表示缺口、凸起的包络度的偏差显著地小。

由这些结果示出：通过使用Gigasort来筛选细胞，从而使更多的细胞损伤较少地存活下来，由这些细胞形成的细胞聚集体更大且接近正球，而且是光滑的球形。

另外，计算出所测定的各参数的变异系数(CV值)，结果如图5所示，与使用Jazz筛选的组的细胞聚集体相比，使用Gigasort筛选的组的细胞聚集体的大小(最小直径、周长、费雷特直径、费雷特直径比、最大直径、面积、和圆当量直径)、球形状(圆形度)、表面的状态(包络度)等全部参数中CV值小。即，可知使用Gigasort筛选的组的细胞聚集体的均匀性高。

＜流式细胞仪解析＞

在第28天为了计数细胞数而添加酶液后向分散的细胞中加入分散液和去除液并进行离心分离。去除上清液，用PBS进行再次悬浮，用Live/Dead试剂(Thermo FisherScientific)、Foxa2(R&D)/Alexa647-anti-goat(Thermo Fisher Scientific)、Alexa488-Tuj1(BD)、Alexa647-Oct3/4(BD)、FITC-TRA2-49(Millipore)、PerCP-Cy5.5-Sox1(BD)、Alexa647-Pax6(BD)、Alexa488-Ki67(BD)进行染色。使用流式细胞仪Gallios(BeckmanCoulter)，计算出FOXA2阳性且TUJ1阳性的细胞、FOXA2阳性细胞、或TUJ1阳性细胞相对于细胞悬浮液中包含的总细胞的比例(表2)。使用Jazz和Gigasort任意者的情况下，FOXA2和/或TUJ1标记物的阳性率均高，另外，作为多能性标记物的OCT3/4和/或TRA-2-49的阳性率低。

[表2]

由表2可知：使用Gigasort筛选后经成熟培养的细胞中，与使用Jazz的细胞组相比，表达基因的阳性率也为相同程度。

＜免疫染色＞

在第28天使用微量移液管将10个细胞聚集体从96孔U底孔板按培养基进行回收，等待细胞聚集体在自重下沉淀。去除上清培养基，添加PBS 1mL，等待细胞聚集体在自重下沉淀。去除上清液，用PFA固定细胞聚集体，用OCT包埋剂进行包埋和冷冻。接着，使用低温恒温器(Leica)将细胞聚集体切成10μm，将切片贴于载玻片上。通过封闭缓冲液(2％正常驴血清、0.3％TritonX100/PBS)进行封闭，用抗Nurr1小鼠IgG抗体(Perseus ProteomicsInc.)、抗Foxa2山羊IgG抗体(R&D systems)和抗TH兔子IgG抗体(Millipore)进行一次染色，用Alexa488标记抗小鼠抗体、Alexa594标记抗山羊抗体、Alexa647标记抗兔子抗体和DAPI(全部为Thermo Fisher Scientific)进行二次染色。封入用VECTASHIELD Hard set染色后的切片中，利用共聚焦显微镜(Olympus FV1200)进行观察(图6)。

可知：使用Gigasort筛选后经成熟培养的细胞中，与使用Jazz的细胞组相比，标记物的表达量上也没有大的差异。即，分化度为同等。

产业上的可利用性

本发明在再生医疗、特别是帕金森病的治疗方面是有用的。

Claims (27)

1.一种细胞聚集体，其包含FOXA2阳性或TUJ1阳性的神经系统细胞，且

包含1000个以上的细胞。

2.根据权利要求1所述的细胞聚集体，其包含总细胞数的约70％以上的FOXA2阳性或TUJ1阳性的神经系统细胞。

3.根据权利要求1或2所述的细胞聚集体，其在培养时能抑制细胞死亡。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞聚集体，其进一步具有选自以下的至少一个特征：

(a1)圆当量直径为100μm～2000μm，

(a2)包络度为0.5以上，

(a3)费雷特直径比为0.5以上，和

(a4)圆形度为0.3以上。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞聚集体，其在表面不具有碎片层且在显微镜下细胞聚集体的交界线清晰。

6.一种细胞聚集体的混合物，其为多个细胞聚集体的混合物，且包含总细胞聚集体数的50％以上的权利要求1～5中任一项所述的细胞聚集体。

7.根据权利要求6所述的细胞聚集体的混合物，其在选自由圆形度、最小直径、最大直径、垂直费雷特直径或水平费雷特直径、费雷特直径比、圆当量直径、周长、面积、以及周长的包络度或面积的包络度组成的组中的指标中的1个以上的指标中，具有15％以下的变异系数。

8.一种黏附性细胞群体的混合物的制造方法，其包括如下工序：

(1)在第一分化诱导因子的存在下对多个干细胞进行分化诱导，得到包含1个以上的处于第一分化阶段的神经前体细胞的多个细胞的工序；

(2)从工序(1)中得到的多个细胞中选择性分离处于第一分化阶段的神经前体细胞的工序，该工序包括：

在液体介质的连续流中，使工序(1)中得到的多个细胞悬浮，和

识别处于第一分化阶段的神经前体细胞，将处于第一分化阶段的神经前体细胞与并非处于第一分化阶段的神经前体细胞分离，以使其分别流入各个液体介质的连续流；及

(3)在第二分化诱导因子的存在下培养工序(2)中分离的处于第一分化阶段的神经前体细胞，从而得到黏附性细胞群体的混合物的工序，其中，

黏附性细胞群体的混合物包含总黏附性细胞群体数的50％以上的具有以下的(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体，

(b1)包含处于第二分化阶段的神经系统细胞；和

(b2)包含1000个以上的细胞。

9.根据权利要求8所述的制造方法，其中，具有(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体在培养时能抑制细胞死亡。

10.根据权利要求9所述的制造方法，其中，将黏附性细胞群体培养14～20天时，培养结束时的细胞数为培养开始时的细胞数的5％以上。

11.根据权利要求8～10中任一项所述的制造方法，其中，黏附性细胞群体的混合物为细胞聚集体的混合物。

12.根据权利要求11所述的制造方法，其中，黏附性细胞群体为细胞聚集体，所述具有(b1)和(b2)的特征的细胞聚集体的圆当量直径为100μm～2000μm。

13.根据权利要求12所述的制造方法，其中，具有(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体为细胞聚集体，且还具有以下的特征：

(b3)包络度为0.5以上，

(b4)费雷特直径比为0.5以上，和

(b5)圆形度为0.3以上。

14.根据权利要求11～13中任一项所述的制造方法，其中，细胞聚集体的混合物在选自由圆形度、最小直径、最大直径、垂直费雷特直径或水平费雷特直径、费雷特直径比、圆当量直径、周长、面积、以及周长的包络度或面积的包络度组成的组中的指标中的1个以上的指标中，具有15％以下的变异系数。

15.根据权利要求8～14中任一项所述的制造方法，其中，在工序(2)中，使用微通道式细胞分选仪将处于第一分化阶段的神经前体细胞分离。

16.根据权利要求8～15中任一项所述的制造方法，其中，在工序(2)中，使处于第一分化阶段的神经前体细胞在封闭系统中分离。

17.根据权利要求8～16中任一项所述的制造方法，其中，干细胞为多能干细胞。

18.根据权利要求8～17中任一项所述的制造方法，其中，处于第一分化阶段的神经前体细胞是注定中脑底板命运的神经前体细胞。

19.根据权利要求18所述的制造方法，其中，处于第一分化阶段的神经前体细胞为Corin和/或Lrtm1阳性的细胞。

20.根据权利要求8～19中任一项所述的制造方法，其中，处于第二分化阶段的神经系统细胞为选自由TUJ1、OTX2、FOXA2、LMX1A、LMX1B、EN1、Nurr1、PITX3、DAT、GIRK2和TH组成的组中的标记物的至少1种呈阳性的神经系统细胞。

21.根据权利要求20所述的制造方法，其中，处于第二分化阶段的神经系统细胞是FOXA2阳性且TUJ1阳性的产多巴胺神经前体细胞。

22.一种黏附性细胞群体的混合物，其利用权利要求8～21中任一项所述的制造方法而得到。

23.一种黏附性细胞群体的制造方法，其具备如下工序；从利用权利要求8～21中任一项所述的制造方法得到的黏附性细胞群体的混合物中分离所述具有(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体。

24.一种黏附性细胞群体，其利用权利要求23所述的制造方法而得到。

25.一种移植用药物组合物，其包含：权利要求1～5中任一项所述的细胞聚集体、权利要求6或7所述的细胞聚集体的混合物、权利要求22所述的黏附性细胞群体的混合物、或权利要求24所述的黏附性细胞群体中的任意者。

26.一种需要补充神经系统细胞的疾病的治疗剂，其包含：权利要求1～5中任一项所述的细胞聚集体、权利要求6或7所述的细胞聚集体的混合物、权利要求22所述的黏附性细胞群体的混合物、或权利要求24所述的黏附性细胞群体中的任意者。

27.一种需要补充神经系统细胞的疾病的治疗方法，其包括如下工序：

将权利要求1～5中任一项所述的细胞聚集体、权利要求6或7所述的细胞聚集体的混合物、权利要求22所述的黏附性细胞群体的混合物、或权利要求24所述的黏附性细胞群体中的任意者移植到患者的中枢神经中。

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