CN109072198A - 产多巴胺神经祖细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明通过下述步骤(1)及(2)制备包含Corin和/或Lrtm1阳性细胞的细胞群体，并使用与Corin结合的物质和/或与Lrtm1结合的物质从得到的细胞群体中收集Corin和/或Lrtm1阳性细胞，通过将该Corin和/或Lrtm1阳性细胞在包含1个或多个神经营养因子的培养液中悬浮培养，从而制备产多巴胺神经祖细胞。(1)将多能干细胞在无饲养层细胞存在下，在包含Sonic hedgehog(SHH)信号刺激剂及未分化维持因子的未分化维持培养基中，在细胞外基质的存在下进行贴壁培养的步骤，及(2)将步骤(1)中得到的细胞群体在包含1种以上的诱导分化因子的培养液中培养的步骤。

Description

产多巴胺神经祖细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及产多巴胺神经祖细胞的制备方法、以及包含可使其向产多巴胺神经祖细胞分化的Corin和/或Lrtm1阳性细胞的细胞群体的制备方法。
背景技术
帕金森氏病是由于中脑黑质的产生多巴胺的神经细胞的脱落而发生的神经变性疾病，目前全世界约有400万患者。作为帕金森氏病的治疗，已经进行了基于L-DOPA或多巴胺激动剂的药物治疗、基于定位脑手术的凝固术或深层电刺激治疗及胎儿中脑移植等。
胎儿中脑移植存在其供应源的组织的伦理问题，并且感染的危险性也高。因此，提出了使用从胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)等多能干细胞所诱导分化成的神经细胞的治疗法(非专利文献1)。但是已有人指出，经诱导分化的神经细胞在移植时有可能形成良性肿瘤，而且认为产多巴胺神经细胞以外的细胞可能导致运动障碍，因此，人们追求选择植活并且安全的细胞进行移植。
作为产多巴胺神经祖细胞的制备方法，提出了包括通过作为产生多巴胺的神经细胞或产多巴胺神经祖细胞的标记的基因而筛选适于移植的细胞的步骤的方法(专利文献1)，但为了减少由含有生物来源成分所导致的批次差异的影响、提高产生效率，进一步的改良是人们希望的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2015/34012号公报
非专利文献
Wernig M,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,2008,引物105:5856-5861
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于制备适于作为帕金森氏病治疗剂的产多巴胺神经祖细胞。因此，本发明的问题是提供产多巴胺神经祖细胞的制备方法等。
解决问题的方法
本发明人为了解决上述课题进问题研究，着眼于细胞表面膜蛋白Corin和/或Lrtm1，发现了可高效制备包含表达它们的细胞的细胞群体的方法。进而发现，以Corin和/或Lrtm1为指标从该细胞群体中提取细胞，进一步继续培养后，可得到产多巴胺神经祖细胞，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
[1]包含Corin和/或Lrtm1阳性细胞的细胞群体的制备方法，包括下述步骤(1)及(2)：
(1)将多能干细胞在无饲养层细胞存在下，在包含Sonic hedgehog(SHH)信号刺激剂及未分化维持因子的未分化维持培养基中，在细胞外基质的存在下进行贴壁培养的步骤，及
(2)将步骤(1)中得到的细胞在包含1种以上的诱导分化因子的培养基中培养的步骤。
[2]根据[1]所述的制备方法，其中，SHH信号刺激剂为SAG(N-甲基-N’-(3-pyridinylbenzyl)-N’-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane)、shh蛋白质或其片段、Purmorphamine或它们的组合。
[3]根据[1]或[2]所述的制备方法，其中，步骤(1)中的未分化维持培养基为还包含TGF(Transforming growth factor)β抑制剂或BMP(Bone Morphogenetic Protein)抑制剂的培养基。
[4]根据[3]所述的制备方法，其中，TGFβ抑制剂为A83-01，BMP抑制剂为LDN193189。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，未分化维持因子至少包含FGF(Fibroblast growth factor)信号传导通路作用物质。
[6]根据[5]所述的制备方法，其中，FGF信号传导通路作用物质为bFGF。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(1)中，对多能干细胞进行不超过48小时的培养。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的制备方法，其中，诱导分化因子为选自下组中的1个或多个因子：BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂、FGF8及GSK(Glycogen synthasekinase)3β抑制剂。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(2)为在细胞外基质上进行贴壁培养的步骤。
[10]根据[9]所述的制备方法，其中，细胞外基质为层粘连蛋白或其片段。
[11]根据[9]所述的制备方法，其中，细胞外基质为层粘连蛋白511E8。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的方法，其中，步骤(2)包括以下步骤：
(a)将步骤(1)中得到的细胞在细胞外基质的存在下，在包含BMP抑制剂及TGFβ抑制剂的培养基中进行贴壁培养的步骤，
(b)将上述步骤(a)中得到的细胞在包含BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂及FGF8的培养基中，在细胞外基质的存在下进行贴壁培养的步骤，
(c)将上述步骤(b)中得到的细胞在包含BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂、FGF8及GSK3β抑制剂的培养基中，在细胞外基质的存在下进行贴壁培养的步骤，及(d)将上述步骤(c)中得到的细胞在包含BMP抑制剂及GSK3β抑制剂的培养基中，在细胞外基质的存在下进行贴壁培养的步骤。
[13]根据[12]所述的制备方法，其中，步骤(a)中的培养基还包含ROCK抑制剂。
[14]根据[13]所述的制备方法，其中，ROCK抑制剂为Y-27632。
[15]根据[12]～[14]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(2)中的BMP抑制剂为LDN193189。
[16]根据[12]～[15]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(2)中的TGFβ抑制剂为A83-01。
[17]根据[12]～[16]中任一项所述的制备方法，步骤(2)中的SHH信号刺激剂为Purmorphamine。
[18]根据[12]～[17]中任一项所述的制备方法，其中，GSK3β抑制剂为CHIR99021。
[19]根据[1]～[18]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(2)至少进行10天。
[20]根据[19]所述的制备方法，其中，步骤(2)进行12天～21天。
[21]根据[19]所述的制备方法，其中，步骤(2)进行12天～14天。
[22]根据[1]～[21]中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(2)中得到的细胞群体中包含的Corin和/或Lrtm1阳性细胞的比例为10％以上。
[23]产多巴胺神经祖细胞的制备方法，包括以下步骤：
(3)从通过[1]～[22]中任一项所述的制备方法得到的细胞群体中，使用与Corin结合的物质和/或与Lrtm1结合的物质来收集Corin和/或Lrtm1阳性细胞的步骤，及
(4)将步骤(3)中得到的Corin和/或Lrtm1阳性细胞在包含1个或多个神经营养因子的培养基中进行悬浮培养的步骤。
[24]根据[23]所述的制备方法，其中，与Corin结合的物质或与Lrtm1结合的物质为Corin或与Lrtm1结合的抗体或适体。
[25]根据[23]或[24]所述的制备方法，其中，神经营养因子为BDNF及GDNF。
[26]根据[23]～[25]中任一项所述的制备方法，其中，包含神经营养因子的培养基还包含B27补充剂、抗坏血酸及cAMP类似物。
[27]根据[26]所述的制备方法，其中，cAMP类似物为二丁酰环腺苷酸(Dibutyrylcyclic AMP)。
[28]根据[23]～[27]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(4)中的培养基还包含ROCK抑制剂。
[29]根据[28]所述的制备方法，其中，ROCK抑制剂为Y-27632。
[30]根据[23]～[29]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(4)至少进行7天。
[31]根据[30]所述的制备方法，其中，步骤(4)进行14天～30天。
[32]根据[30]所述的制备方法，其中，步骤(4)进行14天～16天。
[33]通过[1]～[22]中任一项所述的制备方法得到细胞群体，其中，Corin和/或Lrtm1阳性细胞的含量为10％以上。
[34]通过[23]～[32]中任一项所述的制备方法得到的产多巴胺神经祖细胞。
[35]帕金森氏病治疗剂，其包含通过[23]～[32]中任一项所述的制备方法得到的产多巴胺神经祖细胞。
发明的效果
根据本发明，可以有效地得到对帕金森氏病治疗剂等有用的产多巴胺神经祖细胞。
附图简要说明
[图1]图1示出产生多巴胺的细胞的制备流程的一个示例。图中，“Y”表示Y-27632。
[图2]图2为示出在实施例1中，在有或无SAG(300nM)存在下培养的第12天的细胞中的流式细胞术的结果，即，显示Corin阳性细胞率(Corin阳性细胞占总细胞数的比例)的图。
[图3]图3为示出在实施例1中，对于第28天的细胞进行了FoxA2、Nurr1(均为中脑标记)染色，确认是否正在向多巴胺神经祖细胞分化的结果的图(照片)。以表明核存在的DAPI阳性细胞作为100％，Foxa2为99.0％、Nurr1为14.6％。
[图4]图4为在实施例3中，示出在有或无SAG(300nM)存在下培养的第12天的细胞中的流式细胞术的结果，即显示Corin阳性细胞率的图。
[图5]图5示出了在实施例1中，将第28天的细胞移植至大鼠(给药6-OHDA的大鼠)的脑内后于第4周的移植物的情形。图(照片)显示了对移植物进行TH(中脑标记)、HuNu(人细胞核)染色，确认其是否正在向多巴胺神经祖细胞分化的结果。A为SAG(300nM)存在下的细胞的移植物，以显示移植细胞(人细胞核)的存在的HuNu阳性细胞为100％，TH为平均9.24％(个体(1)6.1％、个体(2)12.37％)。B为无SAG存在下的细胞的移植物，以HuNu阳性细胞为100％，TH为平均9.7％(个体(3)6.27％、个体(4)13.13％)。
具体实施方式
I.定义
<多能干细胞>
本发明可使用的多能干细胞为具有能够分化成活体中存在的全部细胞的多功能性，且兼具增殖能力的干细胞，其中，没有特别限定，包括例如：胚性干(ES)细胞、通过核移植得到的克隆胚来源的胚性干(ntES)细胞、精子干细胞(“GS细胞”)、胚胎生殖细胞(“EG细胞”)、人工多能性干(iPS)细胞、来自培养的成纤维细胞或骨髓干细胞的多能性细胞(Muse细胞)等。优选的多能干细胞为ES细胞、ntES细胞及iPS细胞。
(A)胚胎干细胞
ES细胞，是从人、小鼠等哺乳动物的初期胚(例如囊胚)的内部细胞团块建立而成的、具有多能性与基于自我复制的增殖能力的干细胞。
ES细胞是源自囊胚(受精卵的8细胞期、桑椹胚之后的胚胎)的内部细胞团块的胚胎源干细胞，具有分化成所有构成成体的细胞的能力(即所谓的分化多能性)，以及基于自我复制的增殖能力。ES细胞于1981年在小鼠中发现(M.J.Evans and M.H.Kaufman(1981),Nature 292:154-156)，之后，人、猴等灵长类也建立了ES细胞株(J.A.Thomson et al.(1998),Science 282:1145-1147；J.A.Thomson et al.(1995),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:7844-7848；J.A.Thomson et al.(1996),Biol.Reprod.,55:254-259；J.A.Thomson andV.S.Marshall(1998),Curr.Top.Dev.Biol.,38:133-165)。
ES细胞可以通过从对象动物的受精卵的囊胚取出内部细胞团块，将内部细胞团块在成纤维细胞的饲养层上进行培养而建立。另外，可以使用添加有白血病抑制因子(LIF))、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等物质的培养基，通过传代培养维持细胞。针对人及猴的ES细胞的建立与保持的方法，例如记载在USP 5,843,780；Thomson JA,et al.(1995),ProcNatl.Acad.Sci.US A.92:7844-7848；Thomson JA,et al.(1998),Science.282:1145-1147；H.Suemori et al.(2006),Biochem.Biophys.Res.Commun.,345:926-932；M.Ueno etal.(2006),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:9554-9559；H.Suemori et al.(2001),Dev.Dyn.,222:273-279；H.Kawasaki et al.(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:1580-1585；Klimanskaya I,et al.(2006),Nature.444:481-485等中。
用于制作ES细胞的培养基可以使用例如补充了0.1mM 2-巯基乙醇、0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酸、20％KSR及4ng/ml bFGF的DMEM/F-12培养基，于37℃、2％CO2/98％空气的潮湿气氛中维持人ES细胞(O.Fumitaka et al.(2008),Nat.Biotechnol.,26:215-224)。另外，ES细胞需要隔3～4天进行传代，此时，传代可以使用例如含有1mM CaCl2及20％KSR的PBS中的0.25％胰蛋白酶及0.1mg/ml胶原酶IV进行。
ES细胞的选择一般可以将碱性磷酸酶、Oct-3/4、Nanog等基因标记的表达作为指标，使用Real-Time PCR法来进行。特别地，在人ES细胞的选择中，可以将OCT-3/4、NANOG、ECAD等基因标记的表达作为指标(E.Kroon et al.(2008),Nat.Biotechnol.,26:443-452)。
就人ES细胞株而言，例如WA01(H1)及WA09(H9)可以从WiCell Reserch Institute取得，KhES-1、KhES-2及KhES-3可以从京都大学再生医科学研究所(日本京都)取得。
(B)精子干细胞
精子干细胞为精巢来源的多能干细胞，是作为用于精子形成的起源的细胞。该细胞与ES细胞一样，能够诱导分化成各种谱系的细胞，例如具有移植至小鼠囊胚中则可以制成嵌合小鼠等的性质(M.Kanatsu-Shinohara et al.(2003)Biol.Reprod.,69:612-616；K.Shinohara et al.(2004),Cell,119:1001-1012)。精子干细胞能够在包含神经胶细胞类来源的神经营养因子(GDNF)的培养基中进行自我复制，还可以通过在与ES细胞相同的培养条件下反复传代而得到精子干细胞，(竹林正则等(2008)，实验医学，26卷，5号(增刊)，41～46页，羊土社(日本东京))。
(C)胚胎生殖细胞
胚胎生殖细胞，是从胚胎阶段的原始生殖细胞建立的、具有与ES细胞相同的多能性的细胞，可通过在LIF、bFGF、干细胞因子(stem cell factor)等物质的存在下培养原始生殖细胞而建立(Y.Matsui et al.(1992),Cell,70:841-847；J.L.Resnick et al.(1992),Nature,359:550-551)。
(D)人工多能干细胞
人工多能性干(iPS)细胞是源自体细胞的人工干细胞，其可以通过将特定的初始化因子以DNA或蛋白质的形式导入体细胞而制作，并具有与ES细胞基本同样的特性，例如分化多能性与基于自我复制的增殖能力(K.Takahashi and S.Yamanaka(2006)Cell,126:663-676；K.Takahashi et al.(2007),Cell,131:861-872；J.Yu et al.(2007),Science,318:1917-1920；Nakagawa,M.等,Nat.Biotechnol.26:101-106(2008)；国际公开WO 2007/069666；Okita,K.,et al.Stem Cells 31,458-66(2013))。初始化因子可以由在ES细胞中特异性表达的基因、其基因产物或非编码(non-coding)RNA，或对于ES细胞的维持未分化起重要作用的基因、其基因产物或非编码RNA，或低分子化合物所构成。初始化因子中包含的基因包括例如：Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、显性失活体p53、shRNA等p53基因的抑制因子、EBNA1或Glis1等，这些初始化因子可以单独使用，也可以组合使用。作为初始化因子的组合，可例示：WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、WO2011/16588、WO2013/176233、Huangfu D,et al.(2008),Nat.Biotechnol.,26:795-797，Shi Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,2:525-528，Eminli S,et al.(2008),Stem Cells.26:2467-2474，Huangfu D,et al.(2008),Nat Biotechnol.26:1269-1275，Shi Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,3,568-574，Zhao Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,3:475-479，Marson A,(2008),Cell Stem Cell,3,132-135，Feng B,et al.(2009),Nat CellBiol.11:197-203，R.L.Judson et al.,(2009),Nat.Biotech.,27:459-461，LyssiotisCA,et al.(2009),Proc Natl Acad Sci U S A.106:8912-8917，Kim JB,et al.(2009),Nature.461:649-643，Ichida JK,et al(2009),Cell Stem Cell.5:491-503，Heng JC,etal(2010),Cell Stem Cell.6:167-74，Han J,et al(2010),Nature.463:1096-100，MaliP,et al(2010),Stem Cells.28:713-720，Maekawa M,et al(2011),Nature.474:225-9.中记载的组合。
在上述初始化因子中也包括组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂[例如：丙戊酸(VPA)、曲古霉素A、丁酸钠、MC 1293、M344等低分子抑制剂、针对HDAC的siRNA及shRNA(例如，HDAC1siRNA Smartpool(Millipore)，针对HDAC1的HuSH 29mer shRNA构建体(OriGene)等)等核酸性表达抑制剂等]、MEK抑制剂(例如：PD184352、PD98059、U0126、SL327及PD0325901)、糖原合成酶激酶-3抑制剂(例如：Bio及CHIR99021)、DNA甲基转移酶抑制剂(例如：5-氮杂胞苷)、组蛋白甲基转移酶抑制剂(例如：BIX-01294等低分子抑制剂、Suv39hl、Suv39h2、SetDBl及针对G9a的siRNA及shRNA等核酸性表达抑制剂等)、L通道的钙激动剂(例如Bayk8644)、丁酸、TGFβ抑制剂或ALK5抑制剂(例如：LY364947、SB431542、616453及A83-01)、p53抑制剂(例如针对p53的显性失活体、siRNA及shRNA)、ARID3A抑制剂(例如：针对ARID3A的siRNA及shRNA)、miR-291-3p、miR-294、miR-295及mir-302等miRNA，WntSignaling(例如soluble Wnt3a)、神经肽Y、前列腺素类(例如：前列腺素E2及前列腺素J2)、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等为了提高建立效率的目的而使用的因子，在本说明书中，对这些为了改善建立效率而使用的因子与初始化因子不加以特别区分。另外，也可以适当选择它们中的一种或二种以上使用。
对初始化因子而言，在为蛋白质的形式的情况下，也可以通过例如脂质转化、与细胞膜穿透肽(例如：源自HIV的TAT及聚精氨酸)的融合、显微注射等手段而导入体细胞内。
另一方面，在初始化因子为DNA的形式的情况下，可以通过例如：病毒、质粒、人工染色体等载体，脂质转化、脂质体、显微注射等手段导入体细胞内。作为病毒载体，可例示逆转录病毒载体、慢病毒载体(以上见：Cell,126,pp.663-676,2006；Cell,131,pp.861-872,2007；Science,318,pp.1917-1920,2007)、腺病毒载体(Science,322,945-949,2008)、腺相关病毒载体、仙台病毒载体(WO 2010/008054)等。另外，作为人工染色体载体，例如包括人的人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC，PAC)等。作为质粒，可使用哺乳动物细胞用质粒(Science,322:949-953,2008)。在载体中，可以以能够表达核初始化物质的方式而包含启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子、聚腺苷酸化位点等控制序列，可以进一步，根据需要而包含药物抗性基因(例如卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等)、胸苷激酶基因、白喉毒素基因等选择标记序列、緑色荧光蛋白质(GFP)、β葡萄糖醛酸酶(GUS)、FLAG等报告基因序列等。另外，在上述载体中可以为了在进行体细胞的导入后将编码初始化因子的基因、或编码启动子和与其结合的初始化因子的基因一起切除，而在它们的前后具有LoxP序列。
另外，在初始化因子为RNA的形态的情况下，可以通过例如脂质转化、显微注射等手段而导入体细胞内，也可以为了抑制分解而使用掺入有5-甲基胞苷及假尿苷(pseudouridine)(TriLink Biotechnologies)的RNA(Warren L,(2010)Cell StemCell.7:618-630)。
作为用于iPS细胞诱导的培养基，包括例如：含有10～15％FBS的DMEM、DMEM/F12或DME培养基(这些培养基中可以进一步适当包含LIF、青霉素/链霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸类、2-巯基乙醇等。)或市售的培养基[例如：小鼠ES细胞培养用培养基(TX-WES培养基，Thromb-X公司)、灵长类ES细胞培养用培养基(灵长类ES/iPS细胞用培养基，Reprocell公司)、无血清培养基(mTeSR，Stemcell Technology公司)]等。
作为培养方法的示例，例如，可以于37℃、5％CO2存在下，在含有10％FBS的DMEM或DMEM/F12培养基上使体细胞与初始化因子接触并培养约4～7天，之后，将细胞重新接种在饲养层细胞(例如，丝裂霉素C处理的STO细胞、SNL细胞等)上，从体细胞与初始化因子的接触起约10日后，使用含有bFGF的灵长类ES细胞培养用培养基进行培养，从所述接触起约30～约45日或更长时间后，可以产生iPS样集落。
或者，可以于37℃、5％CO2存在下，在饲养层细胞(例如，丝裂霉素C处理的STO细胞、SNL细胞等)上利用含有10％FBS的DMEM培养基(可以在其基础上进一步适当包含LIF、青霉素/链霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸类、2-巯基乙醇等)进行培养，在约25～约30天或更长时间后，可产生ES样集落。优选地，例如，可使用以要初始化的体细胞本身替代饲养层细胞的方法(Takahashi K,et al(2009),PLoS One.4:e8067或WO2010/137746)、或者使用细胞外基质(例如：Laminin-5(WO2009/123349)及Matrigel(BD公司))的方法。
除此以外，例如，也可使用不含有血清的培养基进行培养的方法(Sun N,et al(2009),Proc Natl Acad Sci U S A.106:15720-15725)。进一步，为了提高建立效率，也可以通过低氧条件(0.1％以上且15％以下的氧浓度)来建立iPS细胞(Yoshida Y,et al(2009),Cell Stem Cell.5:237-241或WO2010/013845)。
在上述培养期间，从培养开始第2天以后，每天1次用新鲜的培养基进行培养基更换。另外，在核初始化中使用的体细胞的细胞数没有特别限制，可以为培养平皿中每100cm2约5×103～约5×106细胞的范围。
iPS细胞可以根据形成的集落的形状来选择。另一方面，如果导入作为标记基因的是与体细胞初始化时表达的基因(例如：Oct3/4、Nanog)关联表达的药物抗性基因，则可以通过利用包含相应药物的培养基(选择培养基)进行培养来选择建立的iPS细胞。另外，在标记基因为荧光蛋白质基因的情况下，可以通过利用荧光显微镜进行观察；在标记基因为发光酶基因的情况下，可以通过加入发光基质；在标记基因为生色酶基因的情况下，可以通过加入生色底物，来选择iPS细胞。
在本说明书中所使用的术语“体细胞”，是指除了卵子、卵母细胞、ES细胞等生殖系统细胞或分化全能性细胞以外的所有动物细胞(优选为包括人在内的哺乳动物细胞)。在体细胞中，非限定地将胎儿(仔)的体细胞、新生儿(仔)的体细胞及成熟的健康或疾病性的体细胞均包括在内，另外，原代培养细胞、传代细胞及细胞系化的细胞也均包括在内。具体而言，体细胞可例示为例如：(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(体细胞干细胞)、(2)组织祖细胞、(3)淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰细胞(胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞及脂肪细胞等已分化的细胞等。
另外，在将iPS细胞作为移植用细胞的材料的情况下，从不产生排斥反应方面看，优选使用与接受移植方的个体的HLA基因型相同或实质上相同的体细胞。其中，“实质上相同”是指HLA基因型的一致性达到可以利用免疫抑制剂抑制针对移植的细胞的免疫反应的程度，例如：具有HLA-A、HLA-B及HLA-DR的3个基因座、或加上HLA-C的4个基因座一致的HLA型的体细胞。
(E)通过核移植得到的克隆胚胎来源的ES细胞
nt ES细胞，是通过核移植技术制作的、克隆胚胎来源的ES细胞，与受精卵来源的ES细胞具有基本相同的特性(T.Wakayama et al.(2001),Science,292:740-743；S.Wakayama et al.(2005),Biol.Reprod.,72:932-936；J.Byrne et al.(2007),Nature,450:497-502)。即，通过将未受精卵的核与体细胞的核进行置换而得到克隆胚胎来源的囊胚，从此囊胚的内部细胞团块所建立的ES细胞为nt ES(nuclear transfer ES)细胞。为了进行nt ES细胞的制作，可使用核移植技术(J.B.Cibelli et al.(1998),NatureBiotechnol.,16:642-646)以及ES细胞制作技术(上述)的组合(若山清香等(2008),实验医学,26卷,5号(增刊),47～52页)。在核移植中，可以通过向哺乳动物的去掉核的未受精卵中注入体细胞的核，数小时培养而初始化。
(F)多谱系分化应激持久细胞(Multilineage-differentiating StressEnduring cells)(Muse细胞)
Muse细胞为通过WO2011/007900中记载的方法制备的多能干细胞，具体而言，是在将成纤维细胞或骨髓间质细胞进行长时间的胰蛋白酶处理(优选为8小时或16小时的胰蛋白酶处理)后，进行悬浮培养，由此得到的具有多能性的细胞，其SSEA-3及CD105为阳性。
<产多巴胺神经祖细胞>
在本发明中，作为产多巴胺神经祖细胞，如果没有特殊说明，可以包括产生多巴胺的神经细胞或多巴胺工作性神经元等。另外，产多巴胺神经祖细胞也可以为包含其它细胞种类的细胞群体、优选为不含有血清素神经细胞的细胞群体。产多巴胺神经祖细胞优选为包含Foxa2、Nurr1、Lmx1a、Pitx3和/或TH阳性细胞的细胞群体。在本发明中，作为人Foxa2，可列举NCBI登记号NM_021784或NM_153675所示的聚核苷酸及由这些基团所编码的蛋白质。在本发明中，作为人Nurr1，可列举NCBI登记号NM_006186所示的聚核苷酸及由这些基团所编码的蛋白质。在本发明中，作为人TH，可列举NCBI登记号NM_000360、NM_199292或NM_199293所示的聚核苷酸及由这些基团所编码的蛋白质。作为人Lmx1a，可列举NCBI登记号NM_001174069或NM_177398所示的聚核苷酸及由这些基团所编码的蛋白质。作为人Pitx3，可列举NCBI登记号NM_005029所示的聚核苷酸及由这些基团所编码的蛋白质。
<SHH信号刺激剂>
在本发明中，SHH(Sonic hedgehog)信号刺激剂被定义为SHH与作为受体的Patched(Ptch1)结合而引起的Smoothened(Smo)的脱抑制、及进一步继续引起Gli2的活化的物质，可例示例如：属于Hedgehog家族的蛋白质，具体而言SHH或IHH(Indian Hedgehog)、SHH受体、SHH受体激动剂、Hh-Ag1.5(Li,X.,et al,Nature Biotechnology,23,215～221(2005).)、Smoothened Agonist、SAG(N-甲基-N’-(3-吡啶基苄基)-N’-(3-氯代苯并[b]噻吩-2-羰基)-1,4-二氨基环己烷；N-甲基-N'-(3-吡啶苄基)-N'-(3-氯苯[b]噻吩-2-羰基)-1,4-二氨基环己烷)、20a-羟基胆固醇、Purmorphamine(PMA；9-环己基-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-(萘-1-氧基)-9H-嘌呤-6-胺)及它们的衍生物等(Stanton BZ,Peng LF.,MolBiosyst.6:44-54,2010)。作为SHH信号刺激剂，也可以适当选择它们中的一种或二种以上使用。
作为本发明中使用的SHH信号刺激剂，优选可列举：SHH蛋白质(Genbank登记号：NM_000193、NP_000184)、Purmorphamine、SAG。
<未分化维持因子>
未分化维持因子只要是具有抑制多能干细胞的分化的作用的物质即可，没有特别的限定。作为本领域技术人员所通常使用的未分化维持因子，在为始发态多能干细胞(Primed pluripotent stem cells)(例如：人ES细胞、人iPS细胞)的情况下，可列举FGF信号传导通路作用物质、TGFβ抑制剂、胰岛素等。作为FGF信号传导通路作用物质，具体而言可列举成纤维细胞生长因子(例如：bFGF、FGF4、FGF8)。另外，作为TGFβ抑制剂，可列举TGFβ信号传导通路作用物质、Nodal/Activin信号传导通路作用物质。作为TGFβ信号传导通路作用物质，可列举例如TGFβ1、TGFβ2。作为Nodal/Activin信号传导通路作用物质，可列举例如Nodal、ActivinA、ActivinB。作为未分化维持因子，也可以适当选择它们中的一种或二种以上使用。在培养人多能干细胞(人ES细胞、人iPS细胞)的情况下，对上述步骤(1)中的培养基而言，优选作为未分化维持因子至少包含bFGF。
本发明中使用的未分化维持因子通常为哺乳动物的未分化维持因子。
在本说明书中，作为哺乳动物，包括啮齿类、有蹄类、食肉目、灵长类等。在啮齿类中，包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等。在有蹄类中，包括猪、牛、山羊、马、绵羊等。在食肉目中，包括犬、猫等。本发明中的“灵长类”，只要是属于灵长目的哺乳类动物即可，作为灵长类，可列举狐猴、懒猴、攀鼩目(SCANDETIA)等原猴亚目，与猴、类人猿、人等猿猴亚目。
未分化维持因子由于在哺乳动物的种间可能具有交叉反应性，所以虽然只要可保持作为培养对象的多能干细胞的未分化状态即可，可以使用任一种哺乳动物的未分化维持因子，但优选为使用与培养的细胞为相同种类的哺乳动物的未分化维持因子。例如，在人多能干细胞的培养中，可以使用人未分化维持因子(例如：bFGF、FGF4、FGF8、EGF、Nodal、ActivinA、ActivinB、TGFβ1、TGFβ2等)。其中，在称为“人蛋白质X”的情况下，指蛋白质X具有在人活体内天然表达的蛋白质X的氨基酸序列。
在本发明中使用的未分化维持因子优选是经分离的。“分离”是指接受了除去目标成分或细胞以外的因子的操作，而脱离了天然存在的状态。因此，由培养对象的细胞、组织产生的，包含于细胞、组织及培养基中的内源性的蛋白质X，不包括在“经分离的蛋白质X”中。“经分离的蛋白质X”的纯度(蛋白质X占总蛋白质重量的重量百分率)通常为70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为99％以上、进一步优选为100％。因此，在一种实施方式中，本发明包括提供经分离的未分化维持因子的步骤。另外，在一种实施方式中，包括向步骤(1)中使用的培养基中外来性(或外源性)添加经分离的未分化维持因子的步骤。或者，也可以预先向上述步骤(1)中使用的培养基添加未分化维持因子。
在步骤(1)中，使用的培养基中的未分化维持因子的浓度，是可以维持所培养的多能干细胞的未分化状态的浓度，本领域技术人员可以适当设定。例如，具体而言，在无饲养层细胞存在下使用bFGF作为未分化维持因子的情况下，其浓度通常为4ng～500ng/mL左右、优选为10ng～200ng/mL左右、更优选为30ng～150ng/mL左右。
<培养基>
在本发明中，在细胞的培养中使用的培养基可以以在动物细胞的培养中通常使用的培养基作为基础培养基而制备、或作为市售品购入；作为基础培养基，可列举例如：BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM(GMEM)培养基、Improved MEM ZincOption培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F12培养基、IMDM/F12培养基、Ham's培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、Neurobasal培养基或它们的混合培养基等、可在动物细胞的培养中使用的培养基。可以从这些基础培养基制备在本发明的制备方法的各步骤中使用的培养基。
在本发明中，作为“包含未分化维持因子的培养基”(未分化维持培养基)使用的培养基为无饲养层的无血清，例如可以通过向基础培养基添加未分化维持因子及后述的血清替代物及适当的营养源等来制备。具体而言，例如可以通过向DMEM/F12培养基添加bFGF、KSR、非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺及2-巯基乙醇来制备。
另外，也可以将作为适于未分化维持培养基市售的、后述的包含未分化维持因子的无饲养层培养基作为未分化维持培养基使用。
本发明中的“无血清培养基”是指不含有无调整或未纯化的血清的培养基。在本发明中，混入有经过纯化的血液来源的成分、动物组织来源的成分(例如：生长因子)的培养基，只要不含有无调整或未纯化的血清，也包括在无血清培养基中。
无血清培养基任选含有血清替代物。作为血清替代物，可列举适当含有例如：白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’硫醇丙三醇，或它们的等同物等的物资。该血清替代物可以通过例如WO98/30679中记载的方法来制备。作为血清替代物，也可以利用市售品。作为该市售的血清替代物，可列举例如：Knockout SerumReplacement(Life Technologies，现为ThermoFisher Scientific)公司制；以下也记作KSR)、Chemically-defined Lipid concentrated(Life Technologies公司制)、GlutaMax(Life Technologies公司制)、B27(Life Technologies公司制)、N2补充剂(LifeTechnologies公司制)、ITS补充剂(Life Technologies公司制)。
无血清培养基也可以适当含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如：非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等。
为了避免制备的复杂，作为该无血清培养基可以使用适量(例如：约0.5％～约30％、优选为约1％～约20％)添加了市售的KSR(Life Technologies公司制)的无血清培养基(例如，向GMEM培养基添加了约8％KSR，Chemically-defined Lipid concentrated的培养基)、或向Neurobasal培养基适量(例如：约0.1～5％)添加了市售的B27(LifeTechnologies公司制)的无血清培养基。另外，作为KSR等同品，可列举在日本特表2001-508302中公开的培养基。
培养优选在无血清培养基中进行。作为无血清培养基，优选在包含KSR或B27的无血清培养基、或在不含异源物种成分(Xeno-free)条件的培养基中进行。在此“不含异源物种成分”是指已将来源于与培养对象的细胞的生物物种不同的生物物种的成分排除的条件。
在本发明中，饲养层细胞，是指在培养干细胞时使干细胞与之共存的、除了该干细胞以外的细胞。作为饲养层细胞，可列举例如：小鼠成纤维细胞(MEF等)、人成纤维细胞、SNL细胞、STO细胞等。饲养层细胞可以为经过增殖抑制处理的饲养层细胞中，这里作为增殖抑制处理，可列举基于增殖抑制剂(例如丝裂霉素C)处理或伽马射线照射或UV照射等的处理。其中，在本发明中，优选在无饲养层细胞存在下(无饲养层，feeder-free)中进行培养。
在本发明中，在无饲养层细胞存在下(无饲养层)是指在无饲养层细胞存在下进行培养。在无饲养层细胞存在下，是指可列举例如：如上所述的不添加饲养层细胞的条件，或在实质上不含(例如，饲养层细胞数相对于总细胞数的比例为3％以下、优选为0.5％以下)饲养层细胞的条件。
作为能够作为未分化维持培养基使用的无饲养层培养基，已经开发、市售了众多合成培养基，例如可列举Essential 8(Life Technologies公司制)。Essential 8培养基为在DMEM/F12培养基中，作为添加剂包含L-抗坏血酸-2-phosphate magnesium(64mg/l)、亚硒酸钠(14μg/1)、胰岛素(19.4mg/l),NaHCO3(543mg/l)、转铁蛋白(10.7mg/l)、bFGF(100ng/mL)、及TGFβ抑制剂(TGFβ1(2ng/mL)或Nodal(100ng/mL))(Nature Methods,8,424-429(2011))。包含市售的未分化维持因子的无饲养层培养基，即作为能够作为未分化维持培养基使用的无饲养层培养基，可列举S-medium(DS Pharma Biomedical公司制)、StemPro(Life Technologies公司制)、hESF9(Proc Natl Acad Sci U S A.2008Sep 9；105(36):13409-14)、mTeSR1(STEMCELL Technologies公司制)、mTeSR2(STEMCELL Technologies公司制)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司制)或StemFit(味之素公司制)。可以在上述步骤(1)中通过使用它们而简便地实施本发明。
<细胞外基质>
在本发明中，细胞外基质是指在细胞外存在的超分子结构体，可以为天然来源也可以为人工物质(重组体)。可列举例如：胶原蛋白、蛋白聚糖、纤维粘连蛋白、透明质酸、肌腱蛋白、巢蛋白、弹性蛋白、微纤维蛋白及层粘连蛋白这样的物质或它们的片段。这些细胞外基质也可以组合使用，例如可以为BD Matrigel(商标)等来自细胞的制备物。优选为层粘连蛋白或其片段。在本发明中，层粘连蛋白是指分别具有α链、β链、γ链各1条的杂三聚物结构的蛋白质，为存在亚单元链的组成不同的亚型的细胞外基质蛋白质。层粘连蛋白以5种α链、4种β链及3种γ链的异三聚体的组合计，有约15种亚型。没有特别限定，可例示例如：α链为α1、α2、α3、α4或α5，β链为β1、β2、β3或β4，以及γ链为γ1、γ2或γ3。在本发明中使用的层粘连蛋白更优选为包含α5、β1及γ1的层粘连蛋白511(Nat Biotechnol 28,611-615(2010))。
在本发明中，层粘连蛋白可以为片段，只要是具有整联蛋白结合活性的片段即可，没有特别限定，可以为例如：作为用胰蛋白酶进行消化而得到的片段的E8片段(EMBO J.,3:1463-1468,1984，J.Cell Biol.,105:589-598,1987)。因此，在本发明中、优选为可例示将层粘连蛋白511用胰蛋白酶进行消化而得到的在WO2011/043405中记载的层粘连蛋白511E8(优选为人层粘连蛋白511E8)。另外，在本发明中使用的层粘连蛋白511E8等层粘连蛋白E8片段，不需要为层粘连蛋白的胰蛋白酶消化产物，也可以为重组体。另外，层粘连蛋白511E8已经市售，能够从例如Nippi株式会社等购入。
从避免未鉴定成分的混入的观点出发，在本发明中使用的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段优选是经分离的。
<诱导分化因子>
作为诱导分化因子，只要是从多能干细胞向Corin和/或Lrtm1阳性细胞、或向产多巴胺神经祖细胞进行诱导分化的物质即可，没有特别的限定，具体而言可以示例BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂、FGF8及GSK3β抑制剂。
<BMP抑制剂>
在本发明中，BMP抑制剂只要是阻碍BMP引起的信号转导的物质即可，没有特别的限定，可以为核酸、蛋白质、低分子有机化合物中的任何一种。其中，作为BMP，可列举BMP2、BMP4、BMP7及GDF7。作为BMP抑制剂，可列举直接作用于BMP的物质(例如抗体、适体等)，抑制编码BMP的基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸、siRNA等)、阻碍BMP受体(BMPR)与BMP的结合的物质、阻碍由基于BMP受体的信号转导而引起的生理活性的物质。作为BMPR，可列举ALK2或ALK3。作为BMP信号传导通路阻碍物质，可以使用对本领域技术人员众所周知的化合物，可例示腱蛋白(Chordin)、头蛋白(Noggin)、卵泡抑素(Follistatin)等蛋白质性抑制剂，Dorsomorphin(即，6-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基-吡唑并[1,5-a]嘧啶)、其的衍生物(P.B.Yu et al.(2007),Circulation,116:II_60；P.B.Yu et al.(2008),Nat.Chem.Biol.,4:33-41；J.Hao et al.(2008),PLoS ONE,3(8):e2904)及LDN193189(即，4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉；4-[6-(4-哌嗪-1-基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉)。其中，LDN193189作为BMPR(ALK2/3)抑制剂(以下称为BMPR抑制剂)众所周知，例如以盐酸盐的形态市售。Dorsomorphin及LDN193189分别可以从Sigma-Aldrich公司及Stemgent公司获得。作为BMP抑制剂，也可以适当选择它们中的一种或二种以上使用。本发明中使用的BMP抑制剂可优选为LDN193189。
培养基中的LDN193189的浓度，只要是阻碍BMP的浓度即可，没有特别限定，例如为：1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、40μm、50μm，但不限于这些。优选为100nM。
<TGFβ抑制剂>
在本发明中，TGFβ抑制剂是指阻碍自TGFβ与TGFβ受体的结合到SMAD的信号转导的物质，只要是阻碍作为原因的信号传导通路的物质即可，没有特别的限定，可以为核酸、蛋白质、低分子有机化合物中的任一种。作为该物质，可列举例如：与TGFβ直接作用的物质(例如：蛋白质、抗体、适体等)、抑制编码TGFβ的基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸、siRNA等)、阻碍TGFβ受体与TGFβ的结合的物质、阻碍基于TGFβ受体的信号转导引起的生理活性的物质(例如：TGFβ受体的抑制剂、Smad的抑制剂等)。可列举阻碍与作为受体的ALK家族的结合的物质，或阻碍基于ALK家族的SMAD的磷酸化的物质，可例示例如：Lefty-1(作为NCBI保藏号，可例示小鼠：NM_010094、人：NM_020997)、Lefty-2(作为NCBI保藏号，可例示小鼠：NM_177099、人：NM_003240及NM_001172425)、SB431542、SB202190(以上为R.K.Lindemann etal.,Mol.Cancer,2003,2:20)，SB505124(GlaxoSmithKline)，NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)，LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)，A83-01(WO2009/146408)及它们的衍生物等。作为本发明中使用的TGFβ抑制剂，优选可列举SB431542(4-(5-苯[1,3]间二氧杂环戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺)或A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-羧硫基酰胺)，它们作为TGFβ受体(ALK5)及Activin受体(ALK4/7)的抑制剂而公知。作为TGFβ抑制剂，也可以适当选择它们中的一种或二种以上使用。本发明中使用的TGFβ抑制剂进一步可优选为A83-01。
培养基中的A83-01的浓度，只要是阻碍ALK5的浓度即可，没有特别限定，例如为：1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、40μm、50μm，但不限于这些。优选为500nM～5μm、更优选为500nM。
另外，SB431542、LDN193189等的TGFβ抑制活性，可通过对本领域技术人员众所周知的方法，例如通过Western印迹法来检测Smad的磷酸化而确定(Mol Cancer Ther.(2004)3,737-45.)。
Purmorphamine、SAG等SHH刺激剂的活性可通过对本领域技术人员众所周知的方法，例如可以通过着眼于Gli1基因的表达的报告基因检测而确定(Oncogene(2007)26,5163-5168)。
<GSK3β抑制剂>
在本发明中，GSK3β抑制剂是指被定义作为阻碍GSK3β蛋白质的激酶活性(例如：相对于βCatenin的磷酸化能力)的物质，有许多是已知的，可列举例如：作为靛玉红衍生物的BIO(别名，GSK3β抑制剂IX；6-溴靛玉红3'-肟)、作为马来酰亚胺衍生物的SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、作为苯基α溴甲基酮化合物的GSK3β抑制剂VII(4-二溴乙酰苯)、作为细胞膜穿透型的磷酸化肽的L803-mts(别名GSK3β肽抑制剂；Myr-N-GKEAPPAPPQpSP-NH2(序列号1))及具有高选择性的CHIR99021(6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-腈)。作为GSK3β抑制剂，也可以适当选择它们中的一种或二种以上使用。这些化合物已经由例如Calbiochem公司、Biomol公司等市售而可以容易地利用，可以从其它获得途径获得，或也可以另外自行制作。本发明中使用的GSK3β抑制剂可优选为CHIR99021。
培养基中的CHIR99021的浓度例如为：1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、40μm、50μm，但不限于这些。优选为1μm。
<FGF8>
在本发明中，对FGF8没有特别限定，在人FGF8的情况下，可示例FGF8a、FGF8b、FGF8e或FGF8f这4者的剪接形式，更优选为FGF8b。FGF8为，例如已经由Wako公司、R&Dsystems公司等市售而可以容易地利用，可以通过利用对本领域技术人员公知的方法而使细胞强制表达来得到。
培养基中的FGF8的浓度，例如为：1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL，但不限于这些。优选为100ng/mL。
<Corin阳性细胞和/或Lrtm1阳性细胞>
Corin阳性细胞和/或Lrtm1阳性细胞，是指表达Corin蛋白质和/或Lrtm1蛋白质，表达的量可被抗Corin抗体或抗Lrtm1抗体所识别的细胞。即，可列举通过下述“细胞选择方法”而使细胞在细胞表面上表达可识别的量的Corin蛋白质、或Ltrm1蛋白质的细胞。
<细胞选择方法>
在本发明中，为了从细胞群体中选择Corin阳性细胞和/或Lrtm1阳性细胞，可以使用与Corin或Lrtm1特异性结合的物质进行选择。与Corin或Lrtm1结合的物质可以使用抗体、适体、优选为抗体或其抗原结合片段。
在本发明中，抗体可以为多克隆或单克隆抗体。这些抗体可以使用对本领域技术人员众所周知的技术来制作(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubelet al.(1987)Publish.John Wiley and Sons.Section 11.12-11.13)。具体而言，在抗体为多克隆抗体的情况下，可以如下获得：对依照常规方法利用大肠杆菌或哺乳类细胞株等表达并纯化的Corin或Lrtm1所编码的蛋白质、具有部分氨基酸序列的寡肽或糖脂质进行纯化，对家兔等非人动物进行免疫，从该免疫动物的血清依照常规方法获得。另一方面，在抗体为单克隆抗体的情况下，可以从杂交瘤细胞中获得，所述杂交瘤细胞为使从上述经过免疫的非人动物得到的脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合而制备(Current protocols inMolecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley andSons.Section 11.4-11.11)。作为抗体的抗原结合片段，可例示抗体的一部分(例如Fab片段)或合成抗体片段(例如单链Fv片段“ScFv”)。Fab及F(ab)2片段等抗体的片段还可以通过在基因工程学上众所周知的方法来制作。例如：针对Corin的抗体可以通过WO2004/065599，WO2006/009241中记载的制作法，针对Lrtm1的抗体可以通过WO2013/015457中记载的制作法获得。
人Corin的序列可以根据NCBI的登记号NM_006587得到。同样，人Lrtm1的序列可以根据NM_020678得到。
为了识别或分离表达Corin或Lrtm1的细胞，可以将该结合物质与例如荧光标记、辐射性标记、化学发光标记、酶、生物素或链霉菌抗生物素蛋白等可检测的物质，或蛋白A、蛋白G、珠或磁珠等提供分离提取可能性的物质结合或缀合。
该进行结合的物质还可以被间接地标记。可使用对本领域技术人员公知的各种方法，可列举例如：使用与该抗体进行特异性结合的预先被标记的抗体(第二抗体)的方法。
作为检测产多巴胺神经祖细胞的方法，包括使用流式细胞仪或蛋白芯片等。
提取产多巴胺神经祖细胞的方法包括，例如：使粒子与该进行结合的物质接合并使其沉降的方法、使用磁珠磁性筛选细胞的方法(例如：MACS)、利用荧光标记使用细胞分选仪的方法、或使用固定化抗体等的载体(例如：细胞富集柱)的方法等。
在本发明中，与Corin或Lrtm1特异性结合的适体可以使用对本领域技术人员众所周知的技术来制作(SELEX(systematic evolution of ligand by exponentialenrichment)法：Ellington,A.D.&Szostak,J.W.(1990)Nature,346,818-822.,Tuerk,C.&Gold,L.(1990)Science,249,505-510)。
<神经营养因子>
在本发明中，神经营养因子，是指对运动神经元的生存与功能保持起重要作用的膜受体的配体，可列举例如：神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3(NT-3)、神经营养因子4/5(NT-4/5)、神经营养因子6(NT-6)、basic FGF、acidic FGF、FGF-5、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF 1)、胰岛素样生长因子2(IGF 2)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、TGF-β2、TGF-β3、白细胞介素6(IL-6)、睫状神经营养因子(CNTF)及LIF等。另外，可以适当选择它们中的一种或二种以上使用。在本发明中，优选的神经营养因子为选自包括GDNF及BDNF的组中的因子。神经营养因子例如已经由Wako公司、R&D systems公司等市售而可以容易地利用，可以通过利用对本领域技术人员公知的方法向细胞强制表达来得到。
培养基中的GDNF1的浓度，例如为：0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL，但不限于这些。优选为10ng/mL。培养基中BDNF1的浓度，例如为：0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL，但不限于这些。优选为20ng/mL。
<ROCK抑制剂>
在本发明中，ROCK抑制剂只要可抑制Rho激酶(ROCK)的功能即可，没有特别限定，可列举例如：Y-27632(例如参考Ishizaki et al.,Mol.Pharmacol.57,976-983(2000)；Narumiya et al.,Methods Enzymol.325,273-284(2000))、Fasudil/HA1077(例如参考Uenata et al.,Nature 389:990-994(1997))、H-1152(例如参考Sasaki et al.,Pharmacol.Ther.93:225-232(2002))、Wf-536(例如参考Nakajima et al.,CancerChemother Pharmacol.52(4):319-324(2003))及它们的衍生物，以及针对ROCK的反义核酸、RNA干扰诱导性核酸(例如：siRNA)、显性失活突变体及它们的表达载体。另外，由于作为ROCK抑制剂还已知其它低分子化合物，所以在本发明中也可以使用这样的化合物或它们的衍生物(参考例如：美国专利申请公开第20050209261号、第20050192304号、第20040014755号、第20040002508号、第20040002507号、第20030125344号、第20030087919号，及国际公开第2003/062227号、第2003/059913号、第2003/062225号、第2002/076976号、第2004/039796号)。在本发明中可使用一种或两种以上的ROCK抑制剂。本发明中使用的ROCK抑制剂可优选为Y-27632。
Y-27632的浓度，例如为：100nM、500nM、750nM、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、40μm、50μm，但不限于这些。优选为10μm。
另外，在本说明书中，“包含物质X的培养基”、“在物质X的存在下”是指添加了外源性(exogenous)的物质X的培养基或包含外源性的物质X的培养基、或在外源性的物质X的存在下。换言之，当该培养基中存在的细胞或组织内源表达、分泌或产生该物质X时，应理解为内源性物质X与外源性的物质X相区别，不包含外源性的物质X的培养基即使包含内源性的物质X，也不属于“包含物质X的培养基”的范畴。
II.包含Corin和/或Lrtm1阳性细胞的细胞群体的制备方法
本发明提供包含Corin和/或Lrtm1阳性细胞的细胞群体的制备方法，其包括下述步骤(1)及(2)：
(1)将多能干细胞在无饲养层细胞存在下，在包含SHH信号刺激剂、及未分化维持因子的未分化维持培养基中进行贴壁培养的步骤，及
(2)将步骤(1)中得到的细胞群体，在包含1种以上的诱导分化因子的培养基中培养的步骤。
<步骤(1)>
作为上述步骤(1)中的优选的多能干细胞，可列举人工多能干细胞或胚胎干细胞(ES细胞、iPS细胞)、更优选为人的人工多能干细胞或人胚胎干细胞(ES细胞、iPS细胞)。其中，对人工多能干细胞的制备方法没有特别的限定，可以如上所述通过对本领域技术人员众所周知的方法来制备，但优选的是人工多能干细胞的制作步骤(即，将体细胞初始化而建立多能干细胞的步骤)也在无饲养层的条件下进行。其中，对获得胚胎干细胞(ES细胞、iPS细胞)的方法没有特别的限定，如上所述可以通过对本领域技术人员众所周知的方法来制备，优选胚胎干细胞(ES细胞、iPS细胞)的制作步骤也在无饲养层条件下进行。
多能干细胞的维持培养、扩大培养可以利用贴壁培养也可以利用悬浮培养来实施，优选利用贴壁培养来实施。多能干细胞的维持培养、扩大培养可以在饲养层存在下实施也可以在无饲养层条件下实施，优选在无饲养层条件下来实施。多能干细胞的维持培养及扩大培养中的无饲养层细胞存在下(无饲养层条件下)，是指实质上不包含饲养层细胞(例如：饲养层细胞数相对于总细胞数的比例为3％以下)的条件。优选为在不包含饲养层细胞的条件下，实施多能干细胞的维持培养及扩大培养。进行多能干细胞的维持培养、扩大培养时，可以在ROCK抑制剂的存在下实施。
在步骤(1)中使用的多能干细胞的维持培养、扩大培养可以在未分化维持培养基中，通过对本领域技术人员众所周知的方法来实施。
在步骤(1)中使用的未分化维持培养基，只要是向基础培养基添加了未分化维持因子，多能干细胞可以在维持多能性的状态下生存的培养基即可，没有特别的限定，关于这样的未分化维持因子及基础培养基，如上所述。作为在步骤(1)中使用的未分化维持培养基，具体而言可以使用已经添加了未分化维持因子的市售的多能干细胞用培养基，作为未分化维持因子优选可列举bFGF或TGFβ等。作为未分化维持培养基，可列举例如：Essential8(Life Technologies公司制)、S-medium(DS Pharma Biomedical公司制)，StemPro(LifeTechnologies公司制)、hESF9(Proc Natl Acad Sci U S A.2008Sep 9；105(36):13409-14)、mTeSR1(STEMCELL Technologies公司制)、mTeSR2(STEMCELL Technologies公司制)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司制)、StemFit(味之素公司制)，优选可列举Essential 8或StemFit。另外，可以向未分化维持培养基适当添加上述ROCK抑制剂而使用。
步骤(1)中的无饲养层细胞存在下(无饲养层条件)是指，实质上不含饲养层细胞(例如：饲养层细胞数相对于总细胞数的比例为3％以下)的条件。优选为在不包含饲养层细胞的条件下实施步骤(1)。
步骤(1)中的多能干细胞的培养可以在悬浮培养或贴壁培养的任一种条件下进行，优选为利用贴壁培养进行。
进行贴壁培养时使用的培养器，只要能够进行“贴壁培养”即可，没有特别限定，优选为细胞黏附性的培养器。作为细胞黏附性的培养器，可列举培养器的表面出于提高与细胞的黏附性的目的而经过人工处理的培养器，具体而言可列举上述的内部被涂层剂所包覆的培养器。作为包衣剂，可列举例如：层粘连蛋白[包括层粘连蛋白α5β1γ1(以下称为层粘连蛋白511)、层粘连蛋白α1β1γ1(以下称为层粘连蛋白111)等及层粘连蛋白片段(层粘连蛋白511E8等)]、巢蛋白、胶原蛋白、明胶、玻连蛋白(Vitronectin)、Synthemax(Corning公司)、Matrigel等细胞外基质等，或聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等高分子等。另外，也可以使用经过正电荷处理等表面加工的培养容器。优选可列举层粘连蛋白，更优选可列举层粘连蛋白511E-8。对层粘连蛋白511E-8而言，可以购入市售品(例：iMatrix-511，Nippi)。
步骤(1)中使用的培养基包含SHH刺激剂。在步骤(1)中，通过将多能干细胞用SHH刺激剂进行处理后，在步骤(2)中进行在诱导分化因子存在下的贴壁培养，由此可以高效率地制备Corin表达细胞。
SHH刺激剂的浓度可以在能够完成上述效果的范围中适当设定。例如，Shh蛋白质通常以20～1000ng/ml、优选为50～300ng/ml的浓度使用。SAG通常以1～2000nM、优选为10～700nM、更优选为30～600nM、进一步优选为30～300nM的浓度使用。PMA通常以0.002～20μm、优选为0.02～2μm的浓度使用。另外，在一种实施方式中，SHH刺激剂可以以与上述浓度的SAG具有同样的SHH刺激作用的量进行适当使用。
在步骤(1)中使用的培养基可以为血清培养基也可以为无血清培养基，从避免化学未确定的成分的混入来看，优选为无血清培养基。
在步骤(1)中使用的培养基，从避免化学未限定的成分的混入来看，也可以是所含成分为化学限定的培养基。
在步骤(1)中的无饲养层条件下的多能干细胞的培养中，为了代替饲养层细胞而为多能干细胞提供立足点，可以将适当的基质用作立足点。利用作为立足点的基质，在已包覆表面的细胞容器中，贴壁培养多能干细胞。
作为可以用作立足点的基质，可列举层粘连蛋白(Nat Biotechnol 28,611-615(2010))、层粘连蛋白片段(Nat Commun 3,1236(2012))、基底膜标准品(Nat Biotechnol19,971-974(2001))、明胶，胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白多糖、巢蛋白、玻连蛋白(Vitronectin)等。
优选地，在步骤(1)中的无饲养层条件下的多能干细胞的培养中，在用经分离的层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的E8片段(进一步优选为层粘连蛋白511的E8片段)包覆表面的细胞容器中贴壁培养多能干细胞。
对于步骤(1)中的多能干细胞的培养时间，只要在可达到提高步骤(2)中形成的细胞群体的质的效果的范围，没有特别限定，通常为0.5～48小时。步骤(1)中的多能干细胞的培养时间优选为1小时以上、2小时以上、6小时以上、12小时以上、18小时以上或24小时以上。步骤(1)中的多能干细胞的培养时间优选为36小时以内或28小时以内。在一种实施方式中，步骤(1)中的多能干细胞的培养时间的范围优选为2～48小时、更优选为6～48小时、进一步优选为12～36小时、更进一步优选为18～28小时(例如24小时)。即，在步骤(2)开始的0.5～48小时(优选为18～28小时)前开始第一步骤，在步骤(1)完毕后接着进行步骤(2)。在进一步的实施方式中，步骤(1)中的多能干细胞的培养时间的范围优选为18～48小时、18～36小时、18～28小时或24～28小时。如果用SHH信号刺激剂处理细胞后，用其它方式处理贴壁细胞，则处理时间可以分别设为在上述培养时间的范围内。通常，进行步骤(1)时不添加ROCK抑制剂。
步骤(1)中的培养温度、CO2浓度等培养条件可适当设定。培养温度例如为约30℃～约40℃、优选为约37℃。另外，CO2浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。
在优选的一种实施方式中，将人多能干细胞(例如，人iPS细胞)在无饲养层细胞存在下，在含有bFGF及SHH信号刺激剂的无血清培养基中贴壁培养。该贴壁培养优选在用层粘连蛋白511、层粘连蛋白511的E8片段或玻连蛋白包覆了表面的细胞容器中实施。该贴壁培养优选使用Essential 8、TeSR培养基、mTeSR培养基、mTeSR-E8培养基或StemFit培养基、进一步优选使用Essential 8或StemFit培养基作为无饲养层培养基来实施。
在优选的一种实施方式中，将人多能干细胞(例如，人iPS细胞)在无饲养层细胞存在下，在含有bFGF及SHH信号刺激剂的无血清培养基中悬浮培养。在该悬浮培养中，人多能干细胞也可以形成人多能干细胞的凝聚体。
在优选的实施方式中，通过步骤(1)得到的细胞为维持了多能性样性质(pluripotent-like state)的细胞，通过步骤(1)而维持了多能性样性质。多能性样性质是指维持包括多能性的、在多能干细胞中共同的由多能干细胞所特有的特质中的至少一部分的状态。多能性样性质不要求严格的多能性。具体而言，表达作为多能性性质(pluripotentstate)的指标的标记的全部或一部分的状态包括于“多能性样性质”中。作为多能性样性质的标记，可列举Oct3/4阳性、碱性磷酸酶阳性等。在一种实施方式中，维持多能性样性质的细胞为Oct3/4阳性。即使在Nanog的表达量低于ES细胞或iPS细胞的情况下，也相当于“表示多能性样性质的细胞”。
在一种实施方式中，通过步骤(1)得到的细胞为Corin和/或Lrtm1阳性细胞、产多巴胺神经祖细胞、或具有向多巴胺神经细胞分化的能力的干细胞。在一种实施方式中，通过步骤(1)得到的细胞至少为Corin和/或Lrtm1阳性细胞、产多巴胺神经祖细胞、或具有向多巴胺神经细胞分化的能力的Oct3/4阳性的干细胞。
在优选的实施方式中，将人多能干细胞(例如iPS细胞)在无饲养层细胞存在下，在含有SHH信号刺激剂及bFGF的无血清培养基中贴壁培养。
上述该贴壁培养优选为在利用层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的E8片段包覆了表面的细胞容器中实施。SHH信号刺激剂优选为Shh蛋白质、SAG或Purmorphamine(PMA)、更优选为SAG。可以将TGFβ抑制剂(例如，Lefty、SB431542、A-83-01)或BMP抑制剂(例如，LDN193189)与SHH信号刺激剂(例如，Shh蛋白质、SAG、PMA)组合使用。具体而言可列举SAG及A-83-01、SAG及LDN193189的组合。培养时间为0.5～48小时(优选为18～48小时、18～36小时、18～28小时或24～28小时)。
对步骤(1)而言，例如：将多能干细胞在无饲养层细胞存在下，在包含未分化维持因子的培养基(未分化维持培养基)中维持培养，通过向该培养基中添加SHH信号刺激剂、或与包含SHH信号刺激剂的未分化维持培养基进行培养基交换，继续进行培养而实施。
例如，将人多能干细胞(例如，人iPS细胞)，在无饲养层细胞存在下，在包含bFGF的无血清培养基中进行维持培养。该维持培养优选通过贴壁培养进行。该贴壁培养优选在用玻连蛋白、层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的E8片段包覆了表面的细胞容器中实施。并且，在步骤(1)中，向该培养基中添加SHH信号刺激剂，继续进行培养。SHH信号刺激剂优选为Shh蛋白质、SAG或PMA。其中，可以将TGFβ抑制剂(例如，Lefty、SB431542，A-83-01)或BMP抑制剂(例如，LDN193189)与SHH信号刺激剂(例如，Shh蛋白质、SAG、PMA)组合使用。添加后，继续进行培养0.5～48小时(优选为18～48小时、18～28小时或约24小时)。
<步骤(2)>
在本发明中，上述步骤(2)可以使用包含可以将多能干细胞向Corin和/或Lrtm1阳性细胞诱导分化的诱导分化因子的培养基进行，优选通过以下多阶段的步骤进行；
(a)将多能干细胞在细胞外基质基础上，在包含BMP抑制剂及TGFβ抑制剂的培养基中进行贴壁培养的步骤，
(b)将上述步骤(a)中得到的细胞在包含BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂及FGF8的培养基中，在细胞外基质上进行贴壁培养的步骤，
(c)将上述步骤(b)中得到的细胞在包含BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂、FGF8及GSK3β抑制剂的培养基中，在细胞外基质上进行贴壁培养的步骤，
(d)将上述步骤(c)中得到的细胞在包含BMP抑制剂及GSK3β抑制剂的培养基中，在细胞外基质上进行贴壁培养的步骤。
在本发明中，步骤(2)中使用的培养基可以用在动物细胞培养中使用的培养基作为基础培养基来制备，这样的培养基具体而言是在从多能干细胞等未分化细胞使细胞进行分化的情况下使用的、本领域技术人员众所周知的培养基。作为基础培养基，包括例如：Glasgow's Minimal Essential Medium(GMEM)培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)培养基、αMEM培养基、Dulbecco's modifiedEagle's Medium(DMEM)培养基、Ham's F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、Neurobasal Medium(Life Technologies公司制)及它们的混合培养基等。优选为GMEM培养基。在培养基中可以含有血清，或也可以为无血清。根据需要，培养基可以包含例如：白蛋白、转铁蛋白、Knockout Serum Replacement(KSR)(血清替代物)、N2补充剂(Invitrogen)、B27补充剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫醇丙三醇等中的1个以上的血清替代物，也可含有脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、GlutaMax(Invitrogen)、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等中的1种以上的物质。优选的培养基为含有KSR、2-巯基乙醇、非必需氨基酸及丙酮酸的GMEM培养基。
为了使得向包含Corin和/或Lrtm1阳性细胞的细胞群体分化，可以向这些培养基中适当加入上述选自BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂、FGF8及GSK3β抑制剂中的试剂进行培养。
对步骤(2)而言，例如在步骤(2)通过上述(a)、(b)、(c)及(d)的步骤进行的情况下，作为在步骤(2)中在步骤(b)及步骤(c)中使用的SHH信号刺激剂，可以适当选用上述任意SHH信号刺激剂中的一种或二种以上，优选使用Purmorphamine。
培养基中的Purmorphamine的浓度只要是可活化Gli2的浓度，没有特别限定，例如为：1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μM，但不限于这些。优选为2μM。
在步骤(2)中，所谓在细胞外基质的存在下，优选在细胞外基质上贴壁培养，是指可以通过使用已利用细胞外基质包覆处理的培养容器进行培养。包覆处理可通过将含有细胞外基质的溶液放入培养容器后，适当除去该溶液而进行。
通常，步骤(2)中的步骤(a)为在还包含ROCK抑制剂的培养基中进行。即，步骤(a)可以为“将多能干细胞在细胞外基质上，在包含ROCK抑制剂、BMP抑制剂及TGFβ抑制剂的培养基中进行贴壁培养的步骤”。
对于培养条件，对培养温度没有特别限定，为约30～40℃、优选为约37℃，在含有CO2的空气的气体氛围中进行培养，CO2浓度优选为约2～5％。
培养时长只要是Corin和/或Lrtm1阳性细胞可出现的时长即可，没有特别限定，优选培养到步骤(2)的结束后得到的细胞群体中包含的Corin和/或Lrtm1阳性细胞的比例为10％以上，步骤(2)优选至少进行10天。更优选为12天～21天，进一步优选为12天～14天。
另外，在步骤(2)内的步骤(a)中，可列举1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上或其以上的天数。优选为1天。同理，在步骤(b)中，可列举1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上或其以上的天数。优选为2天。同理，在步骤(c)中，1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上或其以上的天数可列举。优选为4天。同理，在步骤(d)中，可列举1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上或其以上的天数。优选为5天。
多能干细胞可以使细胞解离后使用，使细胞解离的方法包括例如：力学解离的方法、使用具有蛋白酶活性与胶原酶活性的解离溶液(例如：Accutase(商标)及Accumax(商标)等)或仅具有胶原酶活性的解离溶液进行解离的方法。优选可以使用胰蛋白酶或其替代物(可例示TrypLE CTS(Life Technologies))而解离人多能干细胞的方法。在使细胞解离的情况下，优选在解离后适当添加ROCK抑制剂来培养。添加ROCK抑制剂的情况下，添加至少1天培养即可，更优选为1天。
III.产多巴胺神经祖细胞的制备方法
<步骤(3)>
步骤(3)的收集Corin和/或Lrtm1阳性细胞的步骤，可以基于上述<细胞选择方法>进行。
<步骤(4)>
步骤(4)中使用的培养基可以将在动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基来制备。作为基础培养基，包括例如：Glasgow's Minimal Essential Medium(GMEM)培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)培养基、αMEM培养基、Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)培养基、Ham's F12培养基、RPMI1640培养基、Fischer's培养基、Neurobasal Medium(Life Technologies公司制)及它们的混合培养基等。优选为Neurobasal Medium。在培养基中可以含有血清，或也可以为无血清。根据需要，培养基可以包含例如：白蛋白、转铁蛋白、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES细胞培养时的FBS的血清替代物)、N2补充剂(Invitrogen)、B27补充剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫醇丙三醇等中的1个以上的血清替代物，也可含有脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、GlutaMax(Invitrogen)、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、核酸(例如：Dibutyryl cyclic AMP(dbcAMP))等中的1个以上的物质。优选的培养基为含有B27补充剂、抗坏血酸及dbcAMP的Neurobasal Medium。可以向该培养基适当加入神经营养因子进行培养。
在步骤(4)中的悬浮培养，是指以与培养容器不黏附的状态培养细胞，没有特别限制，可以使用为了提高与细胞的黏附性而不经过基于人工处理(例如：基于细胞外基质等的包覆处理)的培养容器，或使用经过基于人工地抑制黏附的处理(例如：聚羟乙基甲基丙烯酸(poly-HEMA)、非离子性的表面活性多元醇(Pluronic F-127等)或类似磷脂结构物质(例如：作为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的构成单位的水溶性聚合物(Lipidure))的包覆处理的培养容器而进行。
对于培养条件，对培养温度没有特别限定，为约30～40℃、优选为约37℃，在含有CO2的空气的气体氛围中进行培养，CO2浓度优选为约2～5％。
培养时长只要是Nurr1或Foxa2阳性细胞出现的时长即可，没有特别限定，步骤(iii)优选至少进行7天。更优选为7天～30天、进一步优选为14天～21天或14天～16天，最优选为16天。
在贴壁步骤(3)后接着进行连接步骤(4)的情况下，优选适当添加ROCK抑制剂进行培养。添加ROCK抑制剂的情况下，添加至少1天培养即可，更优选为1天。
IV.医药
<帕金森氏病治疗剂>
本发明中得到的产多巴胺神经祖细胞可以作为制剂对帕金森氏病患者给药。通过使得到的产多巴胺神经祖细胞悬浮于生理盐水等中，并移植至患者的纹状体区域而进行。因此，在本发明中，提供包含通过上述方法从多能干细胞得到的产多巴胺神经祖细胞的帕金森氏病治疗剂。
在本发明中，帕金森氏病治疗剂中包含的产多巴胺神经祖细胞的细胞数只要在给药移植物后可以植活即可，没有特别限定，例如可包含15×104个以上。另外，也可以配合症状、身材的大小而进行适当增减而制备。
产多巴胺神经祖细胞的向疾病部位的移植，例如可以通过在NatureNeuroscience,2,1137(1999)或N Engl J Med.；344:710-9(2001)中记载的方法进行。
<试剂盒>
在本发明中的其它实施方式中，包括从多能干细胞制作产多巴胺神经祖细胞的试剂盒。该试剂盒中，包含制作上述产多巴胺神经祖细胞的各步骤中使用的培养基、添加剂或培养容器等。可列举包含例如：抗Corin抗体和/或抗Lrtm1抗体、步骤(1)中使用的SHH信号刺激剂(例如：SAG)，在步骤(2)中使用的BMP抑制剂(例如：LDN193189)、TGFβ抑制剂(例如：A83-01)、SHH信号刺激剂(例如：Purmorphamine)、FGF8、GSK3β抑制剂(例如：CHIR99021)、细胞外基质(例如层粘连蛋白511E8)及神经营养因子(例如：BDNF及GDNF)的试剂盒。在本试剂盒中可以还包含记载了制备步骤的顺序的文件、说明书。
以下结合实施例对本发明进行详细说明，但应该知晓本发明不受限于这些。
实施例
实施例1
细胞及培养
将制备产生多巴胺的细胞的规程示于图1。
人iPS细胞QHJ-I01从京都大学的山中教授等处获得，其是利用游离型载体将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-MYC、LIN28及p53的显性失活体(Okita,K.,et al Stem Cells 31,458-66(2013)；WO2013/176233)导入人PBMC而得到的细胞。
iPS细胞通过Miyazaki T et al.,Nat Commun.3:1236,2012中记载的方法进行培养。简而言之，在用Laminin511E8包覆的6孔板上，利用包含FGF2(bFGF)的未分化维持培养基进行维持培养。
在诱导分化开始(即更换为分化培养基)的24小时前，更换为包含SHH信号刺激剂SAG(Enzo Life Sciences,Inc,300nM)的未分化维持培养基——StemFit：AK-03N(Ajinomoto)，得到了包含iPS细胞的细胞群体。
将在SAG存在下培养24小时后的包含上述iPS细胞的细胞群体使用TrypLE CTS(Life Technologies)进行解离，以每一孔5×106个接种于另行准备的用Laminin511E8(iMatrix-511，Nippi)包覆的6孔板中，将培养基更换为分化培养基[含有10μm Y-27632(WAKO)、0.1μm LDN193189(STEMGENT)及0.5μm A83-01(WAKO)的基本培养基A[含有8％KSR(Invitrogen)、1mM丙酮酸钠(Invitrogen)、0.1mM MEM非必需氨基酸(Invitrogen)及0.1mM2-巯基乙醇(WAKO)的GMEM(Invitrogen)]。次日(第1天)，将培养基更换为含有0.1μmLDN193189、0.5μm A83-01、2μm Purmorphamine(WAKO)及100ng/mL FGF8(WAKO)的基本培养基A。2天之后(第3天)，将培养基更换为含有0.1μm LDN193189、0.5μm A83-01、2μmPurmorphamine、100ng/mL FGF8及3μm CHIR99021(WAKO)的基本培养基A。4天之后(第7天)，将培养基更换为含有0.1μm LDN193189及3μm CHIR99021的基本培养基A。将培养基更换为含有0.1μm LDN193189及3μm CHIR99021的基本培养基A。在此期间，培养基更换以1天一次进行。在诱导分化开始后第12天(第12天)，使用抗Corin抗体实施了流式细胞术分析(图1)。
另外，抗Corin抗体利用以下方法制作。将食蟹猴Corin基因中的编码细胞外区域的一部分(氨基酸79-453)的基因序列导入293E细胞，使其表达Corin蛋白质的细胞外区域片段并回收。用回收的蛋白质免疫小鼠后，分离出淋巴细胞并使其与骨髓瘤细胞融合。从融合而成的细胞群体中选择对Corin具有反应性的克隆。将该克隆的培养上清液作为抗Corin单克隆抗体，进行荧光标记后使用。
从含有0.1μm LDN193189及3μm CHIR99021的基本培养基A的培养起5天之后，即诱导分化开始后第12天(第12天)时，使用TrypLE CTS对细胞进行解离，使其悬浮于含有2％FBS、10μm Y-27632(WAKO)、20mM D-葡萄糖及50μg/ml青霉素/链霉素的无Ca2+Mg2+HBSS(Invitrogen)中。添加上述抗Corin抗体，于4℃培养20分钟，使用FACS(BD)进行分选而回收Corin阳性细胞，测量了细胞数。将测定的Corin阳性率的结果示于图2。左侧的柱状图示出在无SAG存在下维持未分化培养(预处理)的情况下的对象细胞，右侧的柱状图示出在300nM的SAG存在下维持未分化的培养(预处理)的情况下的Corin阳性率。
结果发现，通过在诱导分化前在未分化维持培养基中进行SAG处理，Corin阳性细胞的比例提高。
将回收的Corin阳性细胞以20000个/孔转移至PrimeSurface 96U板(住友BakeLite)，使用添加了基本培养基B(B27补充剂无维生素A(Invitrogen)、20ng/mL BDNF、10ng/mL GDNF、200mM抗坏血酸及0.4mM dbcAMP(Sigma)的Neurobasal培养基(Invitrogen))进行悬浮培养。此时，最初的培养基使用的是添加了30μm的Y-27632的培养基，但在3天一次每次更换一半量时，使用的是没有添加Y-27632的培养基。从分选到16天之后(第28天)为止实施悬浮培养，并进行FoxA2、Nurr1(均为中脑标记)染色，确认是否在进行向多巴胺神经祖细胞的分化。其结果可知，如图3所示，得到的细胞表达了FoxA2及Nurr1。此时，以表示核的存在的DAPI阳性细胞作为100％，Foxa2为99.0％、Nurr1为14.6％。
实施例2
与实施例1同样，进行了改变添加的SAG的浓度的实验，及与SAG同时添加A83-01或LDN193189的实验，测定了Corin阳性率。将在研究条件及各自条件下的Corin阳性率示于表1。
[表1]
条件 添加剂 Corin阳性率(％)
条件2 None(对照) 11.7
条件3 SAG(10nM) 22.7
条件4 SAG(300nM) 32.1
条件5 SAG(10nM)、A83-01(500nM) 17.8
条件6 SAG(300nM)、A83-01(500nM) 40.5
条件7 SAG(10nM)、LDN193189(100nM) 26.9
条件8 SAG(300nM)、LDN193189(100nM) 38.7
条件9 A83-01(500nM) 12.4
条件10 LDN193189(100nM) 12.6
条件11 A83-01(500nM)、LDN193189(100nM) 7.9
从以上的结果可知，在添加了SAG、或在SAG基础上添加了A83-1或LDN193189的情况下，与对照相比，Corin阳性率以依赖于SAG的添加浓度的方式提高。另一方面，在仅添加了A83-1和/或LDN193189的情况下，没有显示出效果。
实施例3
基于利用不同方法制备的iPS细胞的制备
人iPS细胞LPF11是将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-MYC利用仙台病毒载体(Cytotune2.0L，ID Pharma公司制)导入人PBMC，依照京都大学的公开规程(人iPS细胞的建立、维持培养，CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310，http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html)记载的方法，使用StemFit培养基(味之素公司制)、Laminin511-E8(Nippi公司制)而建立的。
使用该iPS细胞，通过与实施例1相同的方法进行了培养及诱导分化，于第12天(12日)使用抗Corin抗体测定了Corin阳性细胞相对于总细胞数的比例。将测定的Corin阳性率的结果示于图4。左侧的柱状图示出在无SAG存在下维持未分化的培养(预处理)的情况下的Corin阳性率，右侧的柱状图示出在300nM的SAG存在下维持未分化的培养(预处理)的情况下的Corin阳性率。
结果发现，与实施例1的情况相同，不依赖于iPS细胞的种类，通过在诱导分化前在未分化维持培养基中进行SAG处理，Corin阳性细胞的比例提高。
实施例4
对动物的细胞移植
对实施例1中制备的细胞(相当于第28天)是否适于移植进行了研究。此时，3天一次每次更换一半量培养基。
将第28天的细胞针对TH(产生多巴胺的神经细胞标记)、Foxa2及Nurr1(均为中脑标记)进行了免疫染色发现，如图3所示，得到的细胞表达了FoxA2及Nurr1。此时，以显示核的存在的DAPI阳性细胞作为100％，Foxa2为99.0％、Nurr1为14.6％。
将得到的细胞的包含4×105个细胞的多个细胞团块悬浮于2μl(生理盐水)中，向帕金森氏病模型大鼠(单侧给药6-OHDA的大鼠)的纹状体使用22号注射针给药，观察了4周后的移植物的情形(图5)。在对移植物的分析中，确认了TH阳性的纤维、及细胞体(图5A及B)。此时，在SAG处理、无处理的细胞移植物中，TH阳性细胞数相对于HuNu阳性细胞数(表示人细胞核、移植细胞的植活数)的比例未观察到差异，示出了同样的染色图像(图5A及B)。
从以上的结果可知，在实施例1中制备的细胞(第28天)中，SAG处理、无处理均可以确认移植物的植活及向产多巴胺细胞的成熟，提示了其适合于作为用于帕金森氏病的治疗的细胞。
工业实用性
本发明对再生医疗、尤其是帕金森氏病的治疗是有用的。
序列表
<110> 国立大学法人京都大学(Kyoto University)
大日本住友制药株式会社(Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.)
<120> 产多巴胺神经祖细胞的制备方法
<130> OP-17069
<150> JP2016-086499
<151> 2016-04-22
<160> 1
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L803-mts
<220>
<221> 脂质(LIPID)
<222> (1)..(1)
<223> 肉豆蔻酸酯(MYRISTATE)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 磷酸化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 1
Gly Lys Glu Ala Pro Pro Ala Pro Pro Gln Ser Pro
1 5 10

Claims (23)

1.包含Corin和/或Lrtm1阳性细胞的细胞群体的制备方法，包括下述步骤(1)及(2)：
(1)在无饲养层细胞存在下、在包含Sonic hedgehog(SHH)信号刺激剂及未分化维持因子的未分化维持培养基中，在细胞外基质的存在下对多能干细胞进行贴壁培养的步骤，及
(2)将步骤(1)中得到的细胞在包含1种以上的诱导分化因子的培养基中进行培养的步骤。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，SHH信号刺激剂为：SAG(N-甲基-N’-(3-吡啶基苄基)-N’-(3-氯代苯并[b]噻吩-2-羰基)-1,4-二氨基环己烷)、shh蛋白质或其片段、Purmorphamine或它们的组合。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，步骤(1)中的未分化维持培养基是还包含TGFβ抑制剂或BMP抑制剂的培养基。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，TGFβ抑制剂为A83-01，BMP抑制剂为LDN193189。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，未分化维持因子至少包含FGF信号传导通路作用物质。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，FGF信号传导通路作用物质为bFGF。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(1)中，对多能干细胞进行不超过48小时的培养。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的制备方法，其中，诱导分化因子为选自下组中的1种或多种因子：BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂、FGF8及GSK3β抑制剂。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中，步骤(2)为在细胞外基质上进行贴壁培养的步骤。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，细胞外基质为层粘连蛋白或其片段。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其中，细胞外基质为层粘连蛋白511E8。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，步骤(2)包括以下步骤：
(a)在细胞外基质的存在下，在包含BMP抑制剂及TGFβ抑制剂的培养基中将步骤(1)中得到的细胞进行贴壁培养的步骤；
(b)在包含BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂及FGF8的培养基中，在细胞外基质的存在下将上述步骤(a)中得到的细胞进行贴壁培养的步骤；
(c)在包含BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、SHH信号刺激剂、FGF8及GSK3β抑制剂的培养基中，在细胞外基质的存在下将上述步骤(b)中得到的细胞进行贴壁培养的步骤，及
(d)在包含BMP抑制剂及GSK3β抑制剂的培养基中，在细胞外基质的存在下将上述步骤(c)中得到的细胞进行贴壁培养的步骤。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其中，步骤(a)中的培养基还包含ROCK抑制剂。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的制备方法，其中，步骤(2)中得到的细胞群体中包含的Corin和/或Lrtm1阳性细胞的比例为10％以上。
15.产多巴胺神经祖细胞的制备方法，包括以下步骤：
(3)使用与Corin结合的物质和/或与Lrtm1结合的物质从通过权利要求1～14中任一项所述的制备方法得到的细胞群体中收集Corin和/或Lrtm1阳性细胞的步骤，及
(4)将步骤(3)中得到的Corin和/或Lrtm1阳性细胞在包含1种或多种神经营养因子的培养基中进行悬浮培养的步骤。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其中，与Corin结合的物质或与Lrtm1结合的物质为与Corin或Lrtm1结合的抗体或适体。
17.根据权利要求15或16所述的制备方法，其中，神经营养因子为BDNF及GDNF。
18.根据权利要求15～17中任一项所述的制备方法，其中，包含神经营养因子的培养基还包含B27补充剂、抗坏血酸及cAMP类似物。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其中，cAMP类似物为二丁酰环腺苷酸(Dibutyrylcyclic AMP)。
20.根据权利要求15～19中任一项所述的制备方法，其中，在包含神经营养因子的培养基中的悬浮培养至少进行7天。
21.通过权利要求1～14中任一项所述的制备方法而得到的细胞群体，其中，Corin和/或Lrtm1阳性细胞的含量为10％以上。
22.通过权利要求15～20中任一项所述的制备方法得到的产多巴胺神经祖细胞。
23.帕金森氏病治疗剂，其包含通过权利要求15～20中任一项所述的制备方法得到的产多巴胺神经祖细胞。
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