CN112011510A - 一种由人多能干细胞制备多巴胺神经元的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种由多能干细胞分化制备多巴胺神经元的方法。具体地，包括以下步骤(a)提供多能干细胞和添加物，所述添加物包括小分子化合物和蛋白因子；(b)使所述多能干细胞与所述添加物在适合的培养条件下接触，以使所述多能干细胞分化成多巴胺神经元。本发明能够获得高纯度人iPSC(induced pluripotent stem cell)来源的多巴胺神经元，操作方法简单且不需要其它纯化步骤，且分化所得多巴胺神经元所需成熟时间较短，在分化起始第35天左右就能具备成熟的电生理功能。

Description

一种由人多能干细胞制备多巴胺神经元的方法
技术领域
本发明涉及神经生物学领域，具体涉及一种制备人源多巴胺神经元(dopamineneuron，DA)的方法。
背景技术
帕金森氏病(Parkinson’s Disease,PD)是一类常见的神经退行性疾病，多发于60岁以上老年人群，其一般的病理特征是中脑黑质多巴胺神经元(DA)选择性的渐进死亡，出现临床症状时神经元的死亡量至少在50％以上。帕金森氏病(PD)是一类异质性较高的疾病，其发病机理较为复杂，除了遗传因素的作用之外，环境因素及生活习惯对疾病的发生也有很大影响。因此，一方面，对于疾病研究来说，动物来源原代细胞及通用的细胞研究模型无法很好体现病理表型；另一方面，帕金森氏病(PD)目前也没有非常有效的治疗方法，现有药物如L-Dopa(左旋多巴)等常常只能减缓疾病的进程。所以，从疾病病理的研究及治疗的需求，以及药物精确筛选的角度，高纯度的、能够尽可能反映神经元在体性质及功能的分化方法不可或缺。
然而，目前的现有多巴胺神经元(DA)分化方法效率较低。
因此，本领域迫切需要开发一种将人多能干细胞(PSC)高效分化为多巴胺神经元的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种将人多能干细胞(PSC)高效分化为多巴胺神经元的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种由多能干细胞分化制备多巴胺神经元的方
法，包括步骤：
(a)提供：
i)多能干细胞；和
ii)添加物，其中所述添加物包括小分子化合物和蛋白因子，所述小分子化合物包括LDN-193189、SB-431542、CHIR99021、Y27632，AA、cAMP、DAPT，所述因子包括SHH、SAG、BDNF、GDNF、TGF-β3；
(b)使所述多能干细胞与所述添加物在适合的培养条件下接触，以使所述多能干细胞分化成多巴胺神经元。
在另一优选例中，所述多能干细胞包括：非胚胎来源人诱导多能干细胞、人胚胎干细胞。
在另一优选例中，所述培养条件包括第一培养条件、第二培养条件、第三培养条件、第四培养条件、第五培养条件、第六培养条件、第七培养条件、第八培养条件、第九培养条件、第十培养条件。
在另一优选例中，所述第一培养条件具有以下特征：
a)培养时间为18～36个小时；和
b)在含有LDN-193189和SB-431542的培养基中培养，所述培养基为培养基A，所述培养基A包含成分：Knock-out DMEM基础培养基，敲除血清替代物，谷氨酰胺，非必需氨基酸，巯基乙醇，青-链霉素。
在另一优选例中，所述第二培养条件具有以下特征：
a)培养时间为48～72个小时；和
b)在含有LDN-193189，SB-431542，SHH，SAG的培养基中培养，所述培养基为培养基A。
在另一优选例中，所述第三培养条件具有以下特征：
a)培养时间为18～36个小时；和
b)在含有LDN-193189，SB-431542，SHH，SAG，CHIR-99021，Y27632的培养基中培养，所述培养基为培养基A。
在另一优选例中，所述第四培养条件具有以下特征：
a)培养时间为24～48个小时；和
b)在含有LDN-193189，SB-431542，SHH，SAG，CHIR-99021的培养基中培养，所述培养基为培养基A。
在另一优选例中，所述第五培养条件具有以下特征：
a)培养时间为48～72个小时；和
b)在含有LDN-193189，SB-431542，SHH，SAG，CHIR-99021的培养基中培养，所述培养基为培养基B1，所述培养基B1包含成分：Knock-out DMEM基础培养基，敲除血清替代物，谷氨酰胺，非必需氨基酸，巯基乙醇，青-链霉素，Knock-out DMEM/F12基础培养基，N2添加物，葡萄糖。
在另一优选例中，所述第六培养条件具有以下特征：
a)培养时间为48～72个小时；和
b)在含有LDN-193189和CHIR-99021的培养基中培养，所述培养基为培养基B2，所述培养基B2包含成分：Knock-out DMEM基础培养基，敲除血清替代物，谷氨酰胺，非必需氨基酸，巯基乙醇，青-链霉素，Knock-out DMEM/F12基础培养基，N2添加物，葡萄糖。
在另一优选例中，所述第七培养条件具有以下特征：
a)培养时间为48～72个小时；和
b)在含有LDN-193189和CHIR-99021的培养基中培养，所述培养基为培养基B3，所述培养基B3包含成分：Knock-out DMEM基础培养基，敲除血清替代物，谷氨酰胺，非必需氨基酸，巯基乙醇，青-链霉素，Knock-out DMEM/F12基础培养基，N2添加物，葡萄糖。。
在另一优选例中，所述第八培养条件具有以下特征：
a)培养时间为48～72个小时；和
b)在含有BDNF，GDNF，AA，cAMP，TGF-β3，DAPT，CHIR-99021的培养基中培养，所述培养基为培养基C，所述培养基C包含成分：Neurobasal基础培养基,B-27添加物，谷氨酰胺，青-链霉素。
在另一优选例中，所述第九培养条件具有以下特征：
a)培养时间为18～36个小时；和
b)在含有BDNF，GDNF，AA，cAMP，TGF-β3，DAPT，Y27632的培养基中培养，所述培养基为培养基C。
在另一优选例中，所述第十培养条件具有以下特征：
a)培养时间≥20天，较佳地，≥35天；和
b)在含有BDNF，GDNF，AA，cAMP，TGF-β3，DAPT的培养基中培养，所述培养基为培养基C。
在另一优选例中，所述方法具有以下特征：
(i)细胞分化率为≥85％，较佳地，≥90％；
(ii)细胞能够表达多种多巴胺神经元标志物，如TH、DAT、GirK2及神经元标志物Tuj1，且其他类型神经细胞标志物如GAD-67、GFAP表达极少；
(iii)健康人来源的分化细胞多巴胺的释放量S1与帕金森氏病病人来源细胞的多巴胺的释放量S2的比值为S1/S2＝2.7～3.8倍；
(iv)细胞具备成熟电生理功能。
在本发明的第二方面，提供了一种多巴胺神经元，所述多巴胺神经元用本发明第一方面所述的方法制备。
在另一优选例中，所述方法具有以下特征：
(i)细胞分化率为≥85％，较佳地，≥90％；
(ii)细胞能够表达多种多巴胺神经元标志物，如TH、DAT、GirK2及神经元标志物Tuj1，且其他类型神经细胞标志物如GAD-67、GFAP表达极少；
(iii)健康人来源的分化细胞多巴胺的释放量S1与帕金森氏病病人来源细胞的多巴胺的释放量S2的比值为S1/S2＝2.7～3.8倍；
(iv)细胞具备成熟电生理功能。
在本发明的第三方面，提供了本发明第二方面所述的多巴胺神经元的用途，用于细胞治疗、药物筛选和建立疾病模型。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了人诱导多能干细胞(iPSC)分化所得多巴胺神经元(DA)的形态变化。
图2显示了多巴胺神经元(DA)的性质鉴定。
图3显示了多巴胺神经元(DA)的基因表达检测。
图4显示了多巴胺神经元(DA)的多巴胺释放情况检测。
图5显示了多巴胺神经元(DA)的电生理功能鉴定。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种高效的以人多能干细胞(PSC)为起始材料制备多巴胺神经元(DA)的技术方法，具体的，通过特定与神经元发育相关的蛋白/小分子的作用，将人多能干细胞(PSC)分化为定向多巴胺神经元(DA)方向的神经前体细胞(NPC)，再改变培养条件，促进神经前体细胞向多巴胺神经元(DA)方向分化，之后让这些新生神经元在添加有神经营养物质的培养环境中进一步成熟，产生神经元的形态，以及相应的电生理及递质释放功能。通过多个细胞系的验证，本发明的方法在多巴胺神经元神经前体细胞(NPC)阶段，前体特异性标志物FoxA2的表达效率可达到接近100％，在多巴胺神经元(DA)阶段，神经元种类特异性标志物Tuj1的表达效率可达到94％左右，多巴胺神经元(DA)的特异性标志物TH的表达效率可达到接近90％。所得神经元细胞可用于制备帕金森氏病(PD)的疾病细胞模型，药物研发，以及细胞治疗的研究等多种用途。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用的术语“多能干细胞(PSC)”指代同时具备自我更新和多向分化潜能的一类细胞，包括但不限于：(1)胚胎来源多能干细胞，(2)体细胞重编程所得多能干细胞。
如本文所用的术语“诱导多能干细胞(iPSC)”指代体细胞经由重编程过程逆向发育成为具有多分化潜能状态的一类干细胞。其多能性体现的方式为：具备分化为三个胚层以及多种细胞类型的能力。
如本文所用的术语“分化”指代干细胞在特定背景下向目标细胞类型转化的过程。
如本文所用的术语“分化效率”指代多能干细胞在特定背景下向目标细胞类型转化的频率。如：90％的分化效率指分化后的细胞群体中至少有90％为目标细胞类型。
本发明的主要优点包括：
1)本发明所述的方法取材简单，具有无限的扩增能力，为多巴胺神经元(DA)的分化提供良好起始材料；
2)本发明能够获得高纯度人iPSC(induced pluripotent stem cell)来源的多巴胺神经元
3)本发明操作方法简单且不需要其它纯化步骤，
4)本发明分化所得多巴胺神经元所需成熟时间较短，在分化起始第35天左右就能具备成熟的电生理功能。
5)本发明分化所得多巴胺神经元，在分化起始第35天左右，就能体现出帕金森氏病人来源神经元在多巴胺释放上的缺陷。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1.
人诱导多能干细胞(iPSC)的培养
本发明共使用了三株人诱导多能干细胞(iPSC)进行多巴胺神经元(DA)的分化，其中，H3为健康人来源，购自ATCC(ASC-1011)，P1、P2为帕金森氏病患者来源，是原代皮肤来源成纤维细胞作为起始细胞，经由仙台病毒(购自Thermofisher公司)重编程后所得。所有细胞来源及背景清晰，并通过多能性检测、核型检测及支原体检测后使用。所有人多能干细胞系为无饲养层培养，细胞被种板在包被有基质胶(Matrigel)的培养器皿中，于mTeSR1完全培养基(购自Stemcell Technologies公司)中进行培养，每天进行培养基的更换，在细胞长至合适传代的情况时，使用温和解离剂(购自Stemcell Technologies公司)进行消化处理，传代比例一般为1:3～1:10。
实施例2.
从人多能干细胞(PSC)诱导分化产生多巴胺神经元(DA)
本方法中所有试剂，除非特别说明，其来源及使用浓度均以表1为准。本方法中所使用的基础培养基A、B、B1、B2、B3、C，其配制方法以表2为准。
将人多能干细胞用Accutase于37度孵育8分钟，消化成为单细胞，之后使用含有10μM Y27632的mTeSR1培养基将细胞悬浮；将细胞悬液以2×105/cm2的密度种板，培养器皿需预先使用0.5mg/ml左右浓度Matrigel 37度包被1小时以上；次日细胞应达到约100％汇合，换新鲜不含Y27632的mTeSR1继续培养细胞；第三日起始诱导分化，记为D0(诱导第0天)，将培养基换为基础培养基A，并添加0.5uM LDN-193189和10μM SB-431542；D1在D0基础上额外添加100ng/ml SHH和1uM SAG；D2与D1培养条件相同；D3按照1:1比例将细胞进行传代，首先用Accutase将细胞于37度孵育30～40分钟消化为单细胞，后使用在D2基础上额外添加3μMCHIR-99021和Y-27632的培养液将细胞接种于预先包被Matrigel的新的培养器皿中；D4将培养基更换为不含Y-27632度培养基；D5将基础培养基改为B1，添加物与D4相同；D6不换液；D7将基础培养基改为B2，添加LDN-431542和CHIR-99021；D8不换液；D9将基础培养基改为B3，添加物与D7相同；D10不换液；D11将基础培养基更换为C，添加CHIR-99021，20ng/mlBDNF，20ng/ml GDNF，0.2mM AA，0.5mM cAMP，1ng/ml TGF-β3，10μM DAPT；D12不换液；D13对细胞进行1:1传代，后用不含CHIR-99021培养基(其余成分与D11相同)进行培养，传代方法与D3相同，与之不同的是，包被培养器皿的基质不同，具体来说，需要将培养器皿先用15ug/ml多聚鸟氨酸(PLO)于37度包被过夜，之后用PBS洗涤3次，再加入1ug/ml Laminin和2ug/mlFibronectin共同37度包被过夜；D14细胞需达到100％汇合，将培养基换为不含Y27632的培养基，之后隔天换液；至分化D20～D25，可以观察到表层细胞大部分呈现神经元形态，有神经纤维长出，并且在部分区域有因为细胞脱落而产生的空孔出现，此时应对细胞再进行传代，先将培养器皿用PLO/Laminin/Fibronectin包被(方法与D13相同)，后吸去包被液开盖在干净的安全柜中干燥1个小时左右，用Accutase将细胞于37度孵育30～40分钟消化为单细胞，之后以24孔板为例，用30ul培养基(与D14相同)将约4×105细胞悬浮起来，滴在孔板正中央，置于安全柜中静置10分钟，之后轻柔加入0.5ml培养基，置于培养箱中继续培养，隔天换液；至D35后，隔两天换液直至使用。此方法，较为适用于多巴胺神经元(DA)的电生理功能检测及各类操作中需要使用细胞爬片的情况。多巴胺神经元(DA)分化过程添加物添加情况简述见表3。
分化过程中关键时间点细胞形态变化见图1，其中D1仍保持多能干细胞高核质比的形态；D18高密度生长的细胞呈现卷曲形态；D30细胞已经具备神经元的形态；至D50，分化细胞已经表现为典型的成熟神经元形态。
一个优选的处理办法，D20～D25，Accutase消化后，按照1.0×105/cm2的密度将细胞在低吸附6孔板中悬浮培养5天，之后用Accutase将细胞于37度孵育30～40分钟消化为单细胞，之后按照2.0×105/cm2的密度将细胞种在PLO/Laminin/Fibronectin包被的培养器皿中，隔天换液；至D35后，隔两天换液直至使用。
实施例3.
细胞的免疫荧光检测
细胞的免疫荧光检测中，细胞的处理大体包括如下步骤：固定，通透，封闭，一抗孵育，洗涤，二抗孵育，细胞核染色，洗涤，封片。在细胞处理方式上，多巴胺神经元与其它细胞具有不同的样本处理方式。
a)多巴胺神经元的处理。固定：用含有4％蔗糖的4％PFA于37度条件下孵育15分钟。通透：用含有0.5％Triton-X100的PBS室温孵育10分钟。封闭：用含有0.3％Triton-X100，10％常规山羊血清的PBS室温孵育1个小时。一抗孵育：用0.3％Triton-X100，1％常规山羊血清的PBS稀释一抗(一抗及具体稀释比例见表2)，4度过夜孵育。洗涤：PBS洗涤3～5次，每次5分钟。二抗孵育：用一抗相同的稀释液稀释二抗，室温避光孵育1个小时。细胞核染色：用DAPI染液(购于thermofisher公司)避光孵育5分钟。洗涤：PBS洗涤3～5次，每次5分钟。封片：用封片剂(购于thermofisher公司)将种有细胞的爬片固定在载玻片上，于室温避光封片并干燥，后用透明指甲油围绕爬片封边。用于细胞免疫荧光检测的抗体及使用情况如表5所示。
b)其它细胞的处理。其它细胞在处理上与多巴胺神经元的重要差异在于固定步骤，其它细胞的处理方式是，用4％PFA于室温进行孵育，如细胞为多层生长可适当延长孵育时间，一般为5～30分钟。
封片后的细胞用激光共聚焦显微镜(Leica公司，型号SP8)进行多通道荧光检查，之后用LasX软件(Leica公司)获取图像并分析。
对分化所得多巴胺神经元(DA)的免疫荧光检测及效率统计结果见图2，图示分化过程中细胞的阶段性标志物的免疫荧光检测结果。分化D7细胞已强烈表达神经前体细胞(NPC)标志物Sox2及Nestin，且多巴胺神经元(DA)前体典型标志物之一FoxA2，神经元骨架蛋白Tuj1也开始表达。D14，分化细胞表现出Sox2-/Nestin+的多巴胺神经元(DA)前体典型特征，FoxA2表达量及表达效率明显增加。至D50，分化细胞中绝大多数标记为神经元(Tuj1，94.6％)，且已呈现成熟多巴胺神经元(DA)性质，高表达其标志物TH(89.2％)，DAT及A9标志物Girk2，且分化细胞中仅含有极少其它细胞类型如GABA能神经元(GAD-67)，5羟色胺神经元(Serotoin)和星形胶质细胞(GFAP)。
实施例4.
多巴胺神经元的基因表达检测
将培养的多巴胺神经元用Trizol裂解并提取总RNA，之后用第一链合成试剂盒(购自Vazyme公司)将RNA反转为cDNA。之后以cDNA作为扩增模版，通过各自对应引物(表4)及DNA聚合酶(Q5，NEB公司)扩增目的基因片段，之后进行凝胶电泳检测，得到目的基因对应条带并进行分析。
对H3、P1、P2三株细胞分化所得多巴胺神经元(DA)的基因表达情况的结果见图3，在D35，对H3，P1，P2三株细胞分化所得多巴胺神经元(DA)均进行了标志物基因表达的检测。三株细胞均能检测到FoxA2，Nurr1，Tuj1，TH，DAT，Pitx3，Girk2及VMAT2的表达。
实施例5.
多巴胺释放检测
在多巴胺神经元分化至D35～40，将培养基换为含有/不含有56mM KCl(购于Sigma)的HBSS缓冲液(购于Thermofisher)，每24孔每孔加入150μl，37度孵育20分钟。之后收集处理过的上清液，并按照说明书中描述的方法进行多巴胺的Elisa检测(Elisa试剂盒购于abnova)。
对H3、P1、P2三株细胞分化所得多巴胺神经元(DA)的多巴胺释放检测结果见图4。在D40，对H3，P1，P2三株细胞分化所得多巴胺神经元(DA)均进行了多巴胺释放Elisa检测，在给予KCl刺激后，健康细胞能够明显表现出增强的多巴胺释放，而帕金森氏疾病组相对来说增强较少(P1)或没有差异(P2)，与疾病特征相符。
实施例6.
多巴胺神经元(DA)的电生理功能检测
在分化D25左右将多巴胺神经元(DA)种在玻璃细胞爬片上，继续培养10天左右之后进行电生理功能检测。使用电流钳记录诱发的动作电位，给予从-40→+100pA的注入电流，选取sweep 6(注入10pA电流时)作为典型图；使用电压钳记录全细胞电流，细胞钳制在-70mV，给予从-70mV至+30mV的去极化刺激。使用全细胞膜片钳记录自发兴奋性突触后电流(sEPSC)。
对H3，P1，P2三株细胞分化所得多巴胺神经元(DA)的电生理功能检测结果见图5。在D35，对H3，P1，P2三株细胞分化所得多巴胺神经元(DA)均进行了诱发性动作电位(AP)，钠离子电流，自发兴奋性突触后电流(sEPSC)的检测，三株细胞均能检测到典型的电生理功能。
表1.多巴胺神经元(DA)分化所需试剂及其浓度
Figure BDA0002079272160000101
Figure BDA0002079272160000111
表2.多巴胺神经元(DA)分化过程中使用基础培养基的配制方法
Figure BDA0002079272160000112
表3.多巴胺神经元(DA)分化过程添加物添加情况简述
Figure BDA0002079272160000121
表4.用于基因表达检测的引物
Figure BDA0002079272160000122
Figure BDA0002079272160000131
表5.用于细胞免疫荧光检测的抗体及使用情况
抗体名称 厂商 货号 种属 稀释比例
Nanog CST #4903 兔 1:200
SSEA4 abcam ab16287 鼠 1:400
Tra-1-81 CST #4745 鼠 1:400
Nestin abcam ab18102 鼠 1:500
FOXA2 abcam ab108422 兔 1:300
Tuj1 abcam ab14545 2G10 鼠 1:1000
TH abcam ab76442 鸡 1:800
DAT abcam ab5990 大鼠 1:500
GIRK2 abcam ab66502 兔 1:500
GFAP DAKO Z0334 兔 1:20000
Serotonin abcam ab6336 大鼠 1:500
GAD-67 abcam ab97739 兔 1:200
Actin Beyotime AA128 鼠 1:400
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海有机化学研究所
<120> 一种由人多能干细胞制备多巴胺神经元的方法
<130> P2019-0579
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgccaggagc acaagcgagg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgttcgtagg ccttgaggtc c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgacatttct gccttctcc 19
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtaaagtgt ccaggaaaag 20
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcctcttctc acaagtacgt gcctcg 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggggcgaagc cgggcatgaa caagtgcag 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctttggagtt ggttttgc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcagttgtga tccatgag 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccttccagag gaaccgctac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgaccgagt tgaaggcgaa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acatggcaca gaagcacagt 20
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatggtccag gagcgtgaag 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctaccgggt catcacagat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actgcatggg tggaaaagac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgagctgtg aaggtgtttg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggtccaagt ccaggtcagg 20

Claims (10)

1.一种由多能干细胞分化制备多巴胺神经元的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供：
i)多能干细胞；和
ii)添加物，其中所述添加物包括小分子化合物和蛋白因子，所述小分子化合物包括LDN-193189、SB-431542、CHIR99021、Y27632，AA、cAMP、DAPT，所述因子包括SHH、SAG、BDNF、GDNF、TGF-β3；
(b)使所述多能干细胞与所述添加物在适合的培养条件下接触，以使所述多能干细胞分化成多巴胺神经元。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养条件包括第一培养条件、第二培养条件、第三培养条件、第四培养条件、第五培养条件、第六培养条件、第七培养条件、第八培养条件、第九培养条件、第十培养条件。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一培养条件具有以下特征：
a)培养时间为18～36个小时；和
b)在含有LDN-193189和SB-431542的培养基中培养，所述培养基为培养基A，所述培养基A包含成分：Knock-out DMEM基础培养基，敲除血清替代物，谷氨酰胺，非必需氨基酸，巯基乙醇，青-链霉素。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第五培养条件具有以下特征：
a)培养时间为48～72个小时；和
b)在含有LDN-193189，SB-431542，SHH，SAG，CHIR-99021的培养基中培养，所述培养基为培养基B1，所述培养基B1包含成分：Knock-out DMEM基础培养基，敲除血清替代物，谷氨酰胺，非必需氨基酸，巯基乙醇，青-链霉素，Knock-out DMEM/F12基础培养基，N2添加物，葡萄糖。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第六培养条件具有以下特征：
a)培养时间为48～72个小时；和
b)在含有LDN-193189和CHIR-99021的培养基中培养，所述培养基为培养基B2，所述培养基B2包含成分：Knock-out DMEM基础培养基，敲除血清替代物，谷氨酰胺，非必需氨基酸，巯基乙醇，青-链霉素，Knock-out DMEM/F12基础培养基，N2添加物，葡萄糖。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第七培养条件具有以下特征：
a)培养时间为48～72个小时；和
b)在含有LDN-193189和CHIR-99021的培养基中培养，所述培养基为培养基B3，所述培养基B3包含成分：Knock-out DMEM基础培养基，敲除血清替代物，谷氨酰胺，非必需氨基酸，巯基乙醇，青-链霉素，Knock-out DMEM/F12基础培养基，N2添加物，葡萄糖。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第八培养条件具有以下特征：
a)培养时间为48～72个小时；和
b)在含有BDNF，GDNF，AA，cAMP，TGF-β3，DAPT，CHIR-99021的培养基中培养，所述培养基为培养基C，所述培养基C包含成分：Neurobasal基础培养基,B-27添加物，谷氨酰胺，青-链霉素。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具有以下特征：
(i)细胞分化率为≥85％，较佳地，≥90％；
(ii)细胞能够表达多种多巴胺神经元标志物，如TH、DAT、GirK2及神经元标志物Tu j1，且其他类型神经细胞标志物如GAD-67、GFAP表达极少；
(iii)健康人来源的分化细胞多巴胺的释放量S1与帕金森氏病病人来源细胞的多巴胺的释放量S2的比值为S1/S2＝2.7～3.8倍；
(iv)细胞具备成熟电生理功能。
9.一种多巴胺神经元，其特征在于，所述多巴胺神经元用权利要求1所述的方法制备。
10.如权利要求9所述的多巴胺神经元的用途，其特征在于，用于细胞治疗、药物筛选和建立疾病模型。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115896024A (zh) * 2022-11-30 2023-04-04 苏州大学附属第二医院 一种多巴胺能神经元的诱导分化方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104379731A (zh) * 2011-11-04 2015-02-25 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于植入的中脑多巴胺(da)神经元
US20160250260A1 (en) * 2013-08-26 2016-09-01 The J. David Gladstone Ins., a testamentary trust established under the Will of J. David Gladstone Small molecule cellular reprogramming to generate neuronal cells
WO2018193949A1 (ja) * 2017-04-19 2018-10-25 国立大学法人名古屋大学 ドパミン神経細胞の調製方法
CN109072198A (zh) * 2016-04-22 2018-12-21 国立大学法人京都大学 产多巴胺神经祖细胞的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104379731A (zh) * 2011-11-04 2015-02-25 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于植入的中脑多巴胺(da)神经元
US20160250260A1 (en) * 2013-08-26 2016-09-01 The J. David Gladstone Ins., a testamentary trust established under the Will of J. David Gladstone Small molecule cellular reprogramming to generate neuronal cells
CN109072198A (zh) * 2016-04-22 2018-12-21 国立大学法人京都大学 产多巴胺神经祖细胞的制备方法
WO2018193949A1 (ja) * 2017-04-19 2018-10-25 国立大学法人名古屋大学 ドパミン神経細胞の調製方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
彭雅南等: "人诱导性多能干细胞源神经元移植治疗帕金森病的现状与未来", 《中国组织工程研究》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115896024A (zh) * 2022-11-30 2023-04-04 苏州大学附属第二医院 一种多巴胺能神经元的诱导分化方法及其应用

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