CN107438669B - 用于治疗神经退行性疾病的干细胞衍生多巴胺能细胞的生产方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产多巴胺能细胞和评价其功能的方法。在包被有层粘连蛋白‑111、层粘连蛋白‑121、层粘连蛋白‑521、层粘连蛋白‑421或层粘连蛋白‑511的培养板上，使用含有GSK3抑制剂和TGF‑β抑制剂并适时施加成纤维细胞生长因子的培养基来培养多能人胚胎干细胞，此时所需神经细胞以更高的速率产生。本发明还描述了用于生产这种多巴胺能细胞的有用的细胞培养试剂盒，以及使用这种细胞进行干细胞治疗的方法。

Description

用于治疗神经退行性疾病的干细胞衍生多巴胺能细胞的生产 方法和组合物
相关的申请的交叉引用
本申请要求于2015年2月25日递交的美国临时专利申请号 62/300,000、2015年6月19日递交的美国临时专利申请号62/182,051 以及2015年4月9日递交的美国临时专利申请号62/145,467的优先 权，通过引用将前述申请的全部公开内容并入本文。
背景技术
通过引用将文件名为“Seq_List_LCTI_200040USP3_ST25.txt” 的ASCII文本文件中的材料并入本申请，该文件创建于2006年2月 10日，文件大小为8,781字节。
本发明涉及由人类多能干细胞(hESCs)生产某些所需的多巴胺 能细胞的方法，以及基于分子标志物预测其移植至脑部后的表型成熟 的方法。这些多巴胺能细胞可用于基于干细胞的治疗，例如治疗包括 帕金森病在内的神经退行性疾病。本发明还公开了用于实施该方法的 试剂盒。通常，在层粘连蛋白-111(或其他重组生产的层粘连蛋白) 的基底上培养干细胞，并将这些干细胞暴露于多种细胞培养基中，以 便比此前方法更高效地获得多巴胺能细胞。
层粘连蛋白是主要存在于基膜的异三聚体糖蛋白家族。它们通 过与一侧相邻细胞受体结合相互作用，以及与其他层粘连蛋白分子或 其他基质蛋白(例如胶原、巢蛋白或蛋白聚糖)结合来起作用。层粘 连蛋白分子也是重要的信号转导分子，可以强烈影响细胞的行为和功 能。层粘连蛋白在维持细胞/组织表型方面，以及在组织修复和发育 中促进细胞生长和分化方面都很重要。
层粘连蛋白是一类多结构域的大蛋白，具有共同的结构组织。 层粘连蛋白分子包括一个α链亚基、一个β链亚基和一个γ链亚基， 它们通过一个卷曲螺旋结构域连接形成三聚体。在天然组织中，十二 种已知的层粘连蛋白亚基链可以形成至少15种类型的三聚体层粘连 蛋白。在三聚体层粘连蛋白结构内具有与其他层粘连蛋白和基膜分子 结合活性的可识别结构域以及膜结合受体。图1分别示出了三种层粘 连蛋白链亚基。例如，结构域VI、IVb和IVa形成球状结构，而结 构域V、IIIb和IlIa(其含有富含半胱氨酸的EGF样元件)形成棒状 结构。三条链中的I和II结构域参与形成三股铰链卷曲螺旋结构(长 臂)。
在人组织中存在五种不同α链、三种β链和三种γ链，已经发 现了至少十五种它们的不同组合。基于它们的历史发现顺序，这些分 子被命名为层粘连蛋白-1至层粘连蛋白-15，而另一种命名法依据其 链的组成描述了其异构体，例如包含α-1、β-1和γ-1链的层粘连蛋白 -111(层粘连蛋白-1)。已经确定出四个由结构定义的层粘连蛋白家 族组。五个已确定的层粘连蛋白分子构成第一组，它们的β1和γ1 链相同，而α链组成不同(α1至α5链)。包括层粘连蛋白-521在内 的五个已确定的层粘连蛋白分子构成第二组，它们的β1和γ1链相同， 而α链组成不同。已确定的层粘连蛋白分子的第三组只有一个已确定 的成员，层粘连蛋白-332，其链组成为α3β3γ2。已确定的层粘连蛋 白分子的第四组只有一个已确定的成员，层粘连蛋白-213，其具有新 识别出的γ3链(α2β1γ3)。
人类胚胎干细胞(hES)为多种疾病的再生医学发展提供了希望， 所述疾病如脊髓和心脏损伤、I型糖尿病和诸如帕金森病之类的神经 退行性疾病等。干细胞是一种未分化的细胞，其可分化成为特化的细 胞。胚胎干细胞具有广泛的自我更新能力和多能性，具有分化成所有 三种胚层的细胞的潜力，其可用于治疗目的，并且可以为组织替代疗 法、药物筛选、功能基因组学和蛋白质组学提供无限的细胞来源。
干细胞疗法和对神经退行性疾病的治疗有望很快进入临床试 验。然而，在制定标准化优良制造标准(good manufacturing practices, GMP)级的人多能干细胞(hPS)的祖细胞时，仍然存在一个主要障 碍——这些祖细胞移植后会在成年人大脑中成熟并发挥功能。由于细 胞移植时是未成熟的祖细胞，并且其在体内完全成熟成为功能集成的 神经元需要6个月或更长时间，因而在移植前无法对所移植细胞的功 能性进行评估，并且也缺乏对未成熟祖细胞的产量和成熟度进行预测 的可靠标志物。
作为预测功能性标志物的替代物，本领域依赖于对移植的祖细 胞进行评估，所述评估是通过与产生某些神经元亚型相关的基因和蛋 白质的表达来进行的。由于不确定这些标志物能否预测终末分化和功 能成熟，因此祖细胞必须通过长时间的体内功能评估，以便控制批次 间的变异和治疗效果。这对为更大群体的患者生产细胞以及推出标准 化的临床用干细胞产品造成了重要的阻碍。
为了减少必须在细胞发育过程中进行的体内研究，有必要确定 一组有效的标志物，这些标志物可以在移植前预测干细胞产物的体内 表现。在祖细胞阶段就能够预测体内移植的结果，也使得能够生产不 同来源的标准化细胞产物，例如源自患者衍生细胞或患有HLA-单倍 型供体的hPS细胞库。
由于特定类型的中脑多巴胺能(mesencephalic dopamine, mesDA)神经元的相对局灶性退变，帕金森病是干细胞疗法特别感兴 趣的靶标。在许多使用胎儿细胞的临床试验中，已经从概念上证实了 帕金森病细胞替代疗法是可以成功的。
近来的研究发展使我们能更好地理解来自中脑腹侧神经底板的 mesDA神经元的发育和细胞个体发生学，并且这些知识已经使由hPS 细胞形成腹侧中脑祖细胞的研究级实验方案得以具体化。与旧有方案 相比，已证实这些腹侧中脑衍生的多巴胺能神经元能够在帕金森病的 动物模型中存活、成熟并获得适当的功能特性。此外，由这些实验方 案产生的移植物不会导致细胞过度生长或肿瘤形成，因而其可作为合 适的干细胞替代疗法的候选细胞。
在目前的腹侧中脑分化实验方案中，移植前通常在体外用中脑 神经底板标志物LMX1A、FOXA2、OTX2和CORIN来确认祖细胞 的mesDA同一性，但是一项新的研究显示：这些标志物和其他几种 常用的腹侧中脑标标志物也在下丘脑核的间质祖细胞中共表达。因 此，在生产富集的mesDA神经元的实验方案中它们似乎并非最优的 标志物，因为显然它们对mesDA结构域并无特异性。
为再生医学和人类神经细胞建模的目的，需要在化学限定的、 无异种的、无病原体的条件下发展多能干细胞衍生和培养方法，以将 这些细胞重新分化为具有再生能力的神经细胞。期望的是这样的方法 应该能提供大量的这种分化的细胞。此外，发展预测移植的祖细胞在 动物模型中的成功移植结果的方法也是期望的。
发明内容
本发明提供了生产某些特定干细胞衍生所需的多巴胺能细胞的 方法，以及在移植后评价其功能的方法。这些多巴胺能细胞可用于基 于干细胞的治疗，例如治疗包括帕金森病在内的神经退行性疾病。在 其他方面中，本发明提供了用于由胚胎干细胞生产多巴胺能细胞的试 剂盒。
本发明还提供了某些所需干细胞的单层培养方法，这种方法增 加了细胞的同种性，从细胞培养板或单细胞悬浮液中的其他细胞支持 物中去除干细胞，在用于传代的单细胞悬浮液中将干细胞重新铺板接 种并且在使得干细胞培养物能够扩增并大量生产这种细胞的大量稀 释液中进行扩增。
在一些方面中，本发明描述了多潜能干细胞在层粘连蛋白-111 或层粘连蛋白-121基底上的铺板接种，并使用几种不同的细胞培养 基来培养细胞，以获得多巴胺能细胞，特别是尾部化的多巴胺能祖细 胞。铺板接种前可以用EDTA对细胞进行传代。
在各种实施方案中，可以使用多达六种不同的细胞培养基。在 其他实施方案中，只需要使用三种或四种不同的细胞培养基。
干细胞可以在含有N2培养基(N2M)、TGF-β抑制剂、头蛋白、 声猬蛋白(sonichedgehog protein)和GSK3抑制剂的初级培养基中 进行培养。在初始的24-72小时内可在培养基中加入ROCK抑制剂。
然后可以除去初级培养基并加入二级培养基，二级培养基含有 N2培养基和成纤维细胞生长因子(FGF)。FGF可以是FGF8b。二 级培养基可以在铺板接种后约156小时至约228小时内加入。
然后可以除去二级培养基，并重新铺板接种干细胞。重新铺板 接种可以在铺板接种后约252小时至约276小时内进行。
重新铺板接种可以使用含有B27培养基、ROCK抑制剂、FGF、 脑源性神经营养因子(BDNF)和抗坏血酸的三级培养基进行。
之后可以使用四级培养基来培养这些干细胞，所述四级培养基 含有B27培养基、FGF、脑源性神经营养因子(BDNF)和抗坏血酸。 干细胞可以在最初铺板接种(不包括重新铺板接种)后使用四级培养 基培养至约372小时至约396小时。换言之，将重新铺板接种的干细 胞在四级培养基中培养约108小时至约132小时的时间。
在一些其他实施方案中，第一培养基包含神经诱导培养基 (NIM)或N2培养基、ROCK抑制剂、TGFβ抑制剂、GSK3抑制剂， 并且任选地包括声猬蛋白和头蛋白。
根据一些实施方案，第二培养基包括(i)NIM或N2培养基； TGF-β抑制剂和GSK3抑制剂，并且任选地包含GSK3抑制剂和声猬 蛋白。第二培养基不含第一培养基中的ROCK抑制剂。第二培养基 可以在铺板接种后约36小时至约60小时内加入。
根据一些其他实施方案，第三培养基含有神经增殖培养基 (NPM)和TGF-β抑制剂；并且任选地包含GSK3抑制剂和声猬蛋 白。可以在第一次铺板接种后约84小时至约108小时后加入第三培 养基，并且可以在第一次铺板接种后约156小时至约180小时内换液。 第三培养基可以在第一次铺板接种后约156小时至约228小时内去 除。
在一些进一步的实施方案中，第四培养基含有(i)神经增殖培 养基(NPM)或N2培养基；和(ii)成纤维细胞生长因子(FGF)。 第四培养基可以在第一次铺板接种后约156小时至约228小时内加 入。第四培养基可以在暴露后约36至约108小时内去除，即第一次 初始铺板接种后约252小时至约276小时内。然后将细胞在包被有层 粘连蛋白-111、层粘连蛋白-121、层粘连蛋白-521、层粘连蛋白-421 或层粘连蛋白-511的第二个培养板上重新铺板接种。
可以使用第五培养基，其中含有B27培养基、脑源性神经营养 因子(BDNF)、抗坏血酸(AA)、神经胶质细胞系衍生的神经营养 因子(GDNF)、和成纤维细胞生长因子(FGF)。第五培养基可以 在初始铺板接种后约324小时至约348小时内更换。在约14天至16 天之后，即约336小时至约384小时后，获得祖细胞。如果需要更多 次换液，可以使用第六细胞培养基，其中含有B27培养基、脑源性 神经营养因子(BDNF)、抗坏血酸(AA)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、cAMP激动剂(例如二丁酰-cAMP)和γ- 分泌酶抑制剂(DAPT)，并且不含成纤维细胞生长因子(FGF)。
本申请还公开了提供高移植物结果成功率的尾部化的多巴胺能 祖细胞的方法，其包括：在包被有层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-121、 层粘连蛋白-521、层粘连蛋白-421或层粘连蛋白-511的第一基底上铺 板接种胚胎干细胞以产生多巴胺能祖细胞；对表达尾腹侧中脑标志物 的多巴胺能祖细胞进行鉴定；并在基底上将经过鉴定的多巴胺能祖细 胞从其他多巴胺能祖细胞中分离出来，以获得具有高移植物结果成功 率的尾部多巴胺能祖细胞。
所述方法还可以进一步包括将尾部化的多巴胺能祖细胞移植到 哺乳动物的脑中。所述哺乳动物可以是人类。这种移植可用于治疗神 经退行性疾病，例如帕金森氏病。
鉴定腹侧中脑祖细胞的步骤可以通过OTX2、FOXA2和 LMX1A/B的共表达来定义。腹侧中脑结构域内多巴胺能祖细胞的鉴 定步骤可以通过鉴定高水平表达EN1、SPRY1、WNT1、CNPY1、 PAX8、ETV5、PAX5、FGF8、SP5或TLE4的细胞来进行。更具体 地说，鉴定多巴胺能细胞的步骤可以通过鉴定高水平表达EN1、 SPRY1、PAX8、CNPY1和ETV5的细胞来进行。
在腹侧中脑培养物中鉴定多巴胺能祖细胞的步骤可以进一步包 括排除高水平表达EPHA3、FEZF1、WNT7B、BARHL1、BARHL2、 FOXG1、SIX3、HOXA2、GBX2或PAX6的细胞，以及通过鉴定仅 低至中等水平表达的CORIN和FOXP2的细胞。
本发明也描述了用于体外生产多巴胺能细胞的试剂盒。所述试 剂盒包括：包被有层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-121、层粘连蛋白-521、 层粘连蛋白-421或层粘连蛋白-511的细胞培养板；细胞培养基；GSK3 抑制剂；声猬蛋白；ROCK抑制剂；TGF-β抑制剂；成纤维细胞生长 因子(FGF)；脑源性神经营养因子(BDNF)；和抗坏血酸(AA)。
以下对本发明公开文件中上述和其他的非限制性特征进行详细 描述。
附图说明
本专利或申请文件至少包含一幅彩色附图。本专利或专利申请 公开文件带有彩色附图的复印件将依据需求通过Office提供并支付 必要的费用。
以下是附图的简要说明，用以解释本文公开的实施例，而目的 不是在于限制本发明。
图1示出了层粘连蛋白alpha(α)、beta(β)和gamma(γ) 链的结构基序。N末端、内部和C末端球状结构域以白色椭圆形表 示。卷曲螺旋形成结构域(I和II)以白色矩形表示。棒状结构(V、 IIIb和IlIa结构域)以灰色矩形表示。
图2是本发明中一些方法的图示，鉴定特定成分以及确定何时 施用于干细胞以实现期望的效果。这是一种适用于GMP的分化方案。
图3是本发明中其他方法的另一幅图示，其中使用了其他替代 的细胞培养基(NIM和NPM)。本图中的NDM培养基等同于B27M 培养基。
图4A至4G是一组图像和图示，用以说明不同批次的腹侧中脑 形成的hESCs给出的结果不同，这与常见的mesDA标志物无关。使 用6-OHDA制造大鼠单侧多巴胺能损伤，对三十三(33)组损伤大 鼠使用28个不同批次的VM模式的hESCs进行移植。所有移植物均 来源于H9细胞。
图4A示出了一组选定动物在体内成熟后拍摄的图像。对大脑进 行染色以显示出TH(酪氨酸羟化酶)的含量，图中示出了不同移植 物的不同结果。图4B是在33批次的每个动物多巴胺能(DA)细胞 产量的定量结果。y轴是每100,000个移植细胞中TH+细胞的数量， 坐标从0到20,000，间隔为4,000，顶部30,000到50,000，间隔为 20,000。图4C是33组动物中每个个体通过HuNu+免疫染色来反应 移植物体积的定量结果。y轴是每100,000个移植细胞中每立方厘米 移植物的体积，坐标从0至7，间隔为1。图4D是来自33组动物的 每个个体的移植物中DA细胞的密度(即每mm3移植物体积中总TH+ 细胞数)的定量结果。y轴坐标从0至15,000，间隔为3,000。在图 4B至4D中，细胞量归一化为100,000个移植物细胞，并且图中水平线示出了每批次的平均值。图4E是实施例6的总结示意图。
图4F是在每个移植实验的第16天(移植当天)移植细胞群中 FOXA2、LMX1A和CORIN的基因表达量相对于平均TH+细胞量(即 DA产量)的图示。在LMX1A图中，y轴坐标从0至6,000，间隔为 2000，x轴坐标从0至10,000，间隔为2,500。斯皮尔曼(Spearman) 相关：R＝0.15，p＝0.50。在FOXA2图中，y轴坐标从0至1,500，间 隔为500，x轴坐标从0至10,000，间隔为2,500。斯皮尔曼相关： R＝-0.38，p＝0.08。在CORIN图中，y轴坐标从0至15,000，间隔为5,000，x轴坐标从0至10,000，间隔为2,500。斯皮尔曼相关：R＝-0.17， p＝0.37。
图4G是在每个移植实验的第16天(移植当天)移植细胞群中 TH、NURR1和AADC的基因表达量相对于平均TH+细胞量(即DA 产量)的图示。每个图中给出了斯皮尔曼相关分析(仅腹侧中脑细胞) 的结果R和p值，相关性趋势由线性回归线表示。在TH图中，y轴 坐标从0至8,000，间隔为2,000，x轴坐标从0至8,000，间隔为2,000。 斯皮尔曼相关：R＝-0.18，p＝0.53。在NURR1图中，y轴坐标从0至 4,000，间隔为1,000，x轴坐标从0至8,000，间隔为2,000。斯皮尔 曼相关：R＝0.11，p＝0.70。在AADC图中，y轴坐标从0至600，间 隔为200，x轴坐标从0至8,000，间隔为2,000。斯皮尔曼相关：R＝0.31， p＝0.28。
图5A至5I是一组说明移植细胞RNA测序分析的图示，如图所 示移植物TH+含量与中脑-后脑边缘(MHB)的标志物之间呈正相关 关系。所有移植物均来源于H9细胞。图5A是在6周和＞16周时， DA-高组和DA-低组的DA产量的图示。只有各组实验第16天的RNA 样品的才分为高或低组。通过苯丙胺诱导旋转行为来评估长期成熟 (＞16周)的移植物的多巴胺能功能(“-”表示功能未恢复，“+”表示 功能恢复，ND表示未确定)。y轴是每100,000个移植细胞中TH+ 细胞的数量，坐标从0至10,000，间隔为5,000。图5B是第16天细 胞样品的RNA测序分析结果的PCA图，该图显示出DA-低组和DA- 高组样品在PC4轴上的聚集。图5C是DA-高组与DA-低组细胞样品 的RNA测序数据之比经过Deseq2分析后的结果列表(参见下图5I 中的矩阵图数据(boxed data)点)。该列表显示了具有最高log2倍 数变化(log2FC)且p值<0.001的12个基因。
图5D是EN1的mRNA水平图，图5E是PAX8的mRNA水平 图，二者都是在第16天移植的细胞批次中通过qRT-PCR测量的。在 EN1图中，y轴坐标从0至15,000，间隔为5,000，x轴坐标从0至 8,000，间隔为2,000。在PAX8图中，y轴坐标从0至150，间隔为 50，x轴坐标从0至8,000，间隔为2,000。对于图5D和5E，每个图 中斯皮尔曼相关分析都给出R和p值，相关性用线性回归线显示。
图5F是RNA测序相关分析的汇总图，显示了TH+含量、移植 物体积和TH+密度之间的正相关性，以及MHB基因的RNA水平和 普通腹侧中脑标志物之间的正相关性。通过斯皮尔曼相关分析确定正 相关性，p＜0.05。通过qRT-PCR验证的基因以粗体显示。图5G是 不同细胞批次RNA水平的斯皮尔曼距离分析的图示，该图显示了 MHB基因的共调节，而FOXP2、FOXA2、LMX1B、CORIN、LMX1A 和OTX2与MHB基因簇分离或负结合。图5H是来自预测标记高表达的不同细胞批次的TH+神经元的五个代表性图像，其示出了移植 细胞成熟的形态。标尺：50μm。
图5I是对DA-高组和DA-低组细胞样品的RNA测序数据进行 Deseq2分析之后进行预测标记的图形分析。根据log2倍数变化与归 一化后计数的平均值的比值绘制标志物图。本图中的方格显示了上图 5C中所列的基因。
图6A至6F是一组图像和图示，说明腹侧中脑形成(patterned) 的hESC培养物含有间脑STN命运的细胞。图6A是一组三幅图的图 示，显示了移植细胞(第16天)中的间质标记物FEZF1、WNT7B 和EPHA3的RNA水平与移植物中TH+含量之间的负相关性。在 FEZF1图中，y轴坐标从0至8，间隔为2，x轴坐标从0至10,000， 间隔为2,500。R＝-0.63，p＝0.015。在WNT7B图中，y轴坐标从0至 0.6，间隔为0.2，x轴坐标从0至10,000，间隔为2,500。斯皮尔曼相关：R＝-0.54，p＝0.024。在EPHA3图中，y轴坐标从0至20，间 隔为5，x轴坐标从0至10,000，间隔为2,500。斯皮尔曼相关：R＝-0.63， p＝0.015。
图6B是一组腹侧中脑形成的hESC培养物(第16天)的免疫 染色图像，显示出STN结构域命运(BARHL1+/FOXA2+和 PITX2+/LMX1A/B+细胞)的存在。图6C是间脑STN区域和侧中脑 区域中的表达域的示意图。图6D是一组18周龄移植物的共聚焦图 像，其显示出存在BARHL1+/PITX2+和BARHL1+/PITX2-细胞。图 6E是在移植当天BARHL1的RNA低(左)或高(右)水平批次的 细胞的移植物中BARHL1+细胞含量的一组示例图像。
图6F是一组表明在移植时BARHL1和BARHL2的RNA水平 (qRT-PCR)与成熟移植物中BARHL1+细胞数量呈正相关性的图示。 在BARHL1图中，y轴坐标从0至1500，间隔为500，x轴坐标从0 至15,000，间隔为5,000。斯皮尔曼相关：R＝0.89，p＝0.03。在BARHL2 图中，y轴坐标从0至5000，间隔为1000，x轴坐标从0至15,000， 间隔为5,000。斯皮尔曼相关：R＝0.89，p＝0.03。在图6A和6F中， 每个图中给出了斯皮尔曼相关分析的结果R和p值，相关性趋势由线性回归线表示。
图6G是一组八幅腹侧中脑形成的hESC培养物的免疫染色图像 (第42天，类似于图6B)，显示出STN命运培养物的最终体外分 化结果。
图7A至7I是一组图像和图示，说明从FGF8到hESC的定时递 送导致了细胞命运从间脑转向尾部腹侧中脑祖细胞。体外研究使用来 自H9和RC17细胞系的数据。
图7A是用FGF8b处理hESC细胞的第0-9天进行分化之后，进 行qRT-PCR分析(第10天)后得到的FOXG1、SIX3、GBX2和HOXA2 的mRNA水平的图示。在FOXG1图中，y轴坐标从0至800，间隔 为200。在SIX3图中，y轴坐标从0至1000，间隔为200。在GBX2 图中，y轴坐标从0至150，间隔为50。在HOXA2图中，y轴坐标 从0至300，间隔为100。在所有四幅图中，x轴示出了FGF8b的量， 坐标为0、300或100ng/mL三者之一。
图7B是一组四幅免疫染色图像(第16天)，其显示了从第0-9 天用FGF8b处理的培养物中PITX2+和NKX2.1细胞的斑块，以及 LMX1-细胞的斑块。图7C是一组九幅免疫染色图像，说明在从第7-16 天或第9-16天用FGF8b处理的培养物中，LMX1+/FOXA2+腹侧中脑 表型得以维持。图7D是一组六幅免疫染色图像，说明从第9-16天 用FGF8b处理的培养物中，第16天BARHL1+和FOXA2细胞的水 平降低。图7E是一组六幅免疫染色图像，说明从第9-16天用FGF8b 处理的培养物中，第16天PITX2的水平降低，而EN1细胞的水平升 高了。图7F是图7D-7E的定量化图形。y轴坐标从0至100％，间隔 为20。图7G是在第16天经PCR分析后得出的FOXA2、LMX1A、 OTX2和EN1的mRNA水平的图示。y轴上的标签从底部到顶部分 别为1、4、16、64、256和1024。
图7H是对照和FGF8b处理的腹侧中脑形成的培养物(第16天) 的FACS图，该图表明FOXA2+祖细胞的百分比不变。VM的值为 94.6±2.7％(均值±标准误)。VM+FGF8的值为95.4±1.3％。对照的 值为0.3±0.2％，n＝3。图7I是对照和FGF8b处理的腹侧中脑形成的 培养物(第16天)的FACS图，该图表明CORIN+祖细胞的百分比 下降。VM的值为52.9±4.5％。VM+FGF8的值为28.1±1.8％。对照的 值为0％，n＝3。
图8A至8K是一组图像和图示，说明hESCs在符合GMP要求 的层粘连蛋白基底上分化产生高产量和高纯度的腹侧中脑祖细胞。使 用RC17细胞。图8A是一组七幅图像，用于说明hESCs在不同的层 粘连蛋白亚型上的神经分化。图8B的两张图像显示了在多能培养基中LN-111上培养hESC如何导致细胞分离和形成球形，而多能细胞 能有效地贴附于LN-521基质上。图8C是使用LN-111包被的基底与 使用LN-121包被的基底的比较图，该图显示出在两种基底上多巴胺 能细胞的产量大致相等。图8D是一组四幅图像，用于说明在补充的 N2培养基中以低密度在LN-111基底上接种hESCs会使得在分化7 天后产生汇合的神经培养物。图8E是示出了在LN-111上分化三天 时间OCT4和NANOG的mRNA水平下调的图示。y轴坐标从0.0至 1.0，间隔为0.2，x轴坐标从0至3，间隔为1。
图8F是这样的图示，其示出了不同基础培养基组合 (DMEM/F12+加入N2补充剂、N2补充剂、B27补充剂的Neurobasal 和DMEM/F12+)之间的细胞产量图。y轴是第11天的细胞计数(以 百万计)，坐标从0至200，间隔为50。
图8G是来自基于EB的研究级实验方案的细胞产量与来自图2 所示的为适应GMP改进的LN-111实验方案的细胞产量的比较图。y 轴是细胞计数(以百万计)，坐标从0至500，间隔为100。图8H 至8K显示了由图2的GMP方案产生的腹侧中脑祖细胞的最终成熟 (第45天)。图8H是由注入去极化电流诱导的动作电位的典型痕 迹图。图8I是一些腹侧中脑细胞显示出自发性突触后电流，表明突 触在皿中融合的示意图。图8J是多巴胺能表型在短暂的膜去极化特 征后去极化反弹的图形示例。图8K是示出图8J中各条迹线的放大 插图。
图9A至9E是一组图像和图示，用于说明由符合GMP要求的 实验方案进行的hESCs分化会产生可高表达尾部腹侧中脑预测标志 物的腹侧中脑细胞批次。图9A是根据GMP实验方案分化的培养物 的一组三幅免疫染色图像，显示出LMX1A/FOXA2非常高度的重叠。 图9B是一组两张通过流式细胞技术双染色的OTX2/FOXA2的FACS 图，以重复实验的平均值(％)±标准误表示，(n＝3)。这两幅图中， y轴(OTX2-APC)都取对数，底值都为100，并都经过101、102、 103、104、105、106和107处理。x轴(FOXA2-PE)也取对数，最左 边的值为100，并经过104、104和106处理。
图9C是根据研究级拟胚体实验方案或GMP级LN-111实验方 案进行分化的人ESCs中基因表达水平的图示。以朝向腹侧前脑 (vFB)和腹侧后脑(vHB)的分化作为对照。数值经过颜色编码， 并用每个基因最高表达的样本归一化(＝1000)。图9D至9E是含有 高水平尾部VM标志物的细胞批次中附加移植物的10个典型图像。 图9D的图像为移植的H9细胞，图9E显示的为RC17细胞，二者均 通过GMP级实验方案产生。
图10是帕金森病动物模型中行为恢复的图示。在根据GMP实 验方案LN-111分化的RC17细胞移植前后，对单侧6-OHDA损伤大 鼠进行苯丙胺诱导旋转行为的评估。将第9至16天在FGF8b存在下 分化的细胞移植入一组动物(mesDA RC17，绿点)体内，以量产中 脑多巴胺能(mesDA)结构域的尾部VM细胞。该组表现出功能恢 复，可由对苯丙胺诱导的旋转行为的逆转和过度补偿(第22周)来 证实。将不存在FGF8b的情况下分化的细胞移植入另一组(STN RC17，红点)体内，以产生STN结构域的头侧VM细胞。与mesDA 组相比，STN组没有显示出对苯丙胺诱导的旋转行为的功能恢复。
具体实施方式
参考附图可全面理解本发明公开的组合物和方法。出于方便理 解本发明公开的内容的目的，这些附图仅为示意图，其目的不在于定 义或限制示例性实施方案的范围。
虽然以下说明书中为了清楚起见而使用了具体术语，但是这些 术语仅旨在体现实施方案中有所选附图解释的特定结构，而意不在于 限定或限制本公开范围。在以下附图和说明书中，可以理解的是，相 同的数字标记涉及相同功能的元件。
除非上下文另有明确规定，否则本文中的单数形式“一个”、 “一种”和“所述”也包括复数形式。
如在说明书和权利要求中所使用的，术语“包含”可以包括 “由......组成”和“基本上由......组成”的实施方案。本申请中使用 术语“包含”、“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“含有” 及其变体是开放式的过渡短语、术语或表达，其目的在于说明所述成 分/步骤的存在，并允许存在其他成分/步骤。然而，这样的描述应解 释为：也可将成分或方法描述为“由所列举的成分/步骤组成”和 “基本上由所列举的成分/步骤组成组成”，其允许仅存在所述成分/ 步骤，以及可能由此产生的任何杂质，并排除其他成分/步骤。
本申请的说明书和权利要求书中的数值应理解为包括与所限定 的数值的差距小于本申请中所描述的常规测量技术会产生的实验误 差的值。
本发明公开的所有范围都包括引入的端点值，并可以单独组合 (例如，“从2至10”的范围包括端点2和10以及所有的中间值)。
术语“约”可用于包括在不改变该值基本功能的情况下而变化 的任何数值。当与范围联用时，“约”也公开了两个端点的绝对值所 限定的范围，例如，“从约2至约4”也公开了“从2至到4”的范 围。所述术语“约”可以指给定值加或减10％。
与本发明内容可能有关的一些公知的参考文献包括：Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Sambrook等人，1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press),GeneExpression Technology(Methods in Enzymology,Vol.185,D.Goeddel编著，1991.Academic Press,San Diego,Calif.),"Guide to Protein Purification"inMethods in Enzymology(M.P.Deutshcer编著，(1990)Academic Press,Inc.)；PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(Innis等人，1990. Academic Press,San Diego,Calif.),Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,SecondEd.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,N.Y.),Gene Transfer and ExpressionProtocols，pp.109-128,E.J. Murray编著，The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.)，或者the Ambion 1998Catalog(Ambion,Austin,Tex.)。
本文中所使用的术语“层粘连蛋白-521”是指通过将α5、β2和 γ1链连接在一起形成的蛋白质。该术语应解释为包括重组层粘连蛋 白-521和来自天然来源的异源三聚体层粘连蛋白-521。
本文中所使用的术语“层粘连蛋白-111”是指通过将α1、β1和 γ1链连接在一起形成的蛋白质。该术语应解释为包括重组层粘连蛋 白-111和来自天然来源的异源三聚体层粘连蛋白-111。
本文中所使用的术语“层粘连蛋白-121”是指通过将α1、β2和 γ1链连接在一起形成的蛋白质。该术语应解释为包括重组层粘连蛋 白-121和来自天然来源的异源三聚体层粘连蛋白-121。
本文中所使用的术语“层粘连蛋白-421”是指通过将α4、β2和 γ1链连接在一起形成的蛋白质。该术语应解释为包括重组层粘连蛋 白-421和来自天然来源的异源三聚体层粘连蛋白-421。
本文中所使用的术语“层粘连蛋白-511”是指通过将α5、β1和 γ1链连接在一起形成的蛋白质。该术语应解释为包括重组层粘连蛋 白-511和异源三聚体层粘连蛋白-511。
术语“完整”是指蛋白质由α链、β链和γ链的所有结构域构成， 由三条链连接在一起形成异三聚体结构。所述蛋白质不会分解为单独 的链、片段或功能域。术语“链”是指层粘连蛋白的整条α、β或γ 链。术语“片段”是指具有与另一分子或受体结合活性的任意一个、 两个或三个功能结构域的蛋白质片段。然而，链不应该被认为是片段， 因为每个链具有超过三个这样的结构域。类似地，完整的层粘连蛋白 不应被视为片段。功能性结构域的例子包括域I、II、III、IV、V、 VI和G结构域。
如本说明书所用，术语“自我更新”是指干细胞经过多个细胞 分裂周期仍保持未分化(即多能)的能力。多能性本身是指干细胞分 化成任何细胞类型的能力。术语“增殖”是指干细胞分裂的能力。存 活是指干细胞生存的能力，无论其是分化的还是未分化的，并且不需 要干细胞保持分裂或分化的能力。
缩写“DA”是指多巴胺，其在本说明书中的使用一般是指能够 产生多巴胺的细胞，或能产生多巴胺生成细胞的细胞。
将本发明公开的层粘连蛋白基底与细胞培养基组合，能够提供 临床级多巴胺能细胞的细胞培养系统。具体来说，本方法公开了更多 的多巴胺能细胞。
本发明涉及通过培养干细胞来获得用于再生疗法的分化的神经 细胞的更有效的方法。具体说来，使用层粘连蛋白作为多能干细胞的 基质/基底，比含有其他基质的培养物得到更多的分化细胞。只有一 种层粘连蛋白可用作基质/基底，或者基质/基底可以包括层粘连蛋白 -111(LN-111)、LN-121、LN-521、LN-421或LN-511的等特定层 粘连蛋白。通常可在乳头上皮和真皮、内皮细胞、胰腺、周围神经和 胎盘中发现层粘连蛋白-111。
本发明还涉及为细胞(特别是干细胞)提供营养的不同细胞培 养基。在这方面，干细胞培养通常需要两样物质：(1)为干细胞提 供结构支持的基底或包被层；和(2)为干细胞提供营养的细胞培养 基。基底或包被层(1)通常置于例如培养皿或其他容器之上。使用 适当的时间间隔与层粘连蛋白-111基底组合，应用于不同的细胞培 养基，能得到大量产生多巴胺的分化的神经细胞(即多巴胺能细胞)。
使用本发明的方法和材料得到的干细胞可以用于诱导多能干细 胞、胚胎干细胞、成体干细胞、胎儿干细胞、羊水干细胞和任何一般 的多能干细胞。
可以对本方法进行改进以获得许多不同表型的神经细胞。这些 神经细胞可用于基于干细胞的疗法，包括将这些细胞移植或者移接到 哺乳动物患者的脑中以治疗各种神经退行性疾病。在没有形成因子的 情况下，得到了端脑命运(telencephalic fate)的神经细胞。神经祖 细胞的头-尾和背部-中心的形成可以通过加入依赖性的形成因子来 控制。参照图2对上述方法进行说明，该方法提供了本发明的细胞培 养基中的各种成分的添加时间线和列表。如此处所示，将多能干细胞 接种在包被有层粘连蛋白-111的培养板上，并培养超过16天的时间。 培养基可以包含培养基、分化因子和形成因子的各种组合，在16-25天期间以特定间隔施用。
在最开始，先图示说明四种不同的细胞培养基，通过添加分化 因子和/或形成因子来改进，以形成多种不同的细胞培养基。这四种 培养基在本文中是指神经诱导培养基(NIM)、N2培养基(N2M)、 神经增殖培养基(NPM)和B27培养基(B27M)。
所述NIM、N2M、NPM和B27M培养基由常用成分制成。这些 常用成分包括DMEM/F12培养基，其可从供应商Invitrogen购买获 得(货号10565和21331)。DMEM/F12通常含有以下表1中所列出 的成分:
表1.
Figure BDA0001428400130000171
Figure BDA0001428400130000181
另一种常用成分是Neurobasal培养基，其为MACS神经培养基， 可从供应商Miltenyi(货号130-093-570)或Life Technologies(货号 13712-01)购买获得。N2补充剂可从供应商Life Technologies(目录 号A13707-01)购买获得100倍浓度液。可以从供应商Life Technologies(货号12587-010)购买不含维生素A的B27补充剂， 或从供应商Miltenyi(货号130-097-263)购买MACS NeuroBrew-21。
所述NIM、N2M、NPM和B27M培养基可通过将这些常用成分 按体积比与其他添加剂混合来制备。
所述神经诱导培养基(NIM)由1体积份(pbv)的DMEM/F12 与Neurobasal按50:50比例混合的混合物；1份1×N2补充剂(1:100 稀释)；和1份1×B27补充剂(1:50稀释)；添加2mML-谷氨酰胺， 并且根据需要任选地添加0.2％的青霉素/链霉素而制成。
所述N2培养基(N2M)由1体积份(pbv)的DMEM/F12与 Neurobasal按50:50比例混合的混合物；1份1×N2补充剂；添加2mM L-谷氨酰胺，并且根据需要任选地添加0.2％的青霉素/链霉素而制成。 与NIM相比，N2M完全不含B27补充剂。
所述神经增殖培养基(NPM)由1体积份(pbv)的DMEM/F12 与Neurobasal按50:50比例混合的混合物；1份0.5×N2补充剂(1:200 稀释)；和任选的1份0.5×B27补充剂(1:100稀释)；添加2mM L- 谷氨酰胺，并且根据需要任选地添加0.2％的青霉素/链霉素而制成。 与NIM和B27M相比，N2和B27补充剂在NPM中更加稀释。当存 在B27时，可以称为NPM-B。
所述B27培养基(B27M)由1体积份(pbv)的Neurobasal培 养基；1份1×B27补充剂(1:50稀释)；添加2mM L-谷氨酰胺，并 且根据需要任选地添加0.2％的青霉素/链霉素而制成。B27M完全不 含N2补充剂。
本公开使用的分化因子包括：TGFβ抑制剂；重组人头蛋白；脑 源性神经营养因子(BDNF)；抗坏血酸(AA)；神经胶质细胞系衍 生的神经营养因子(GDNF)；环磷酸腺苷(cAMP)，如二丁酰-环 腺苷一磷酸(db-cAMP)；和γ-分泌酶抑制剂如DAPT。在一些特定 的实施方案中，TGFβ抑制剂为SB431542(CAS#301836-41-9)。 头蛋白可以从供应商R&D Systems(货号6057-GMP)或Miltenyi(货 号130-103-456)购买获得。BDNF(货号130-096-286)和GDNF(货号130-098-449)可从供应商Miltenyi获得。
本发明使用的形成因子(patterning factor)包括GSK3抑制剂、 成纤维细胞生长因子(FGF)和声猬蛋白。在一些特定的实施方案中， GSK3抑制剂为CHIR99021(CAS#252917-06-9)。在其他一些实施 方案中，成纤维细胞生长因子为FGF8b。在其他一些实施方案中，具体的声猬蛋白为SHH-C24II。
在一些特定的实施方案中，ROCK抑制剂可用于本方法的某些 部分。ROCK抑制剂可以为Y27632(CAS#129830-38-2)。也可以 使用头蛋白和γ-分泌酶，例如DAPT。
接下来，在分化之前，可以在StemPro或iPSBrew(货号 130-104-368)培养基中的Cellstart或层粘连蛋白-521上培养细胞。 在分化开始前4至6天，细胞也可以用EDTA传代。应使用状态良 好的多能干细胞。
以下参见图2和图3，分化实验方案从第0天开始，并持续16 天。16天后，可以准备移植用细胞。在第0天，将多能干细胞铺板 接种在层粘连蛋白-111、LN-121、LN-521、LN-421和/或LN-511的 基底上。基底可完全由层粘连蛋白111组成，完全由LN-121组成， 或由LN-111与LN-121组合而成，或者也可以与其他特定的层粘连 蛋白组合而成。基底也可以包括其他基础因子。在一些特定的实施方 案中，层粘连蛋白由完整的层粘连蛋白组成，即包含全部所有三条链。 还可以设想，在其他一些特定的实施方案中，基底可以由特定层粘连 蛋白的片段组成。干细胞铺板接种密度可以为每平方厘米约10,000 个细胞。
在此考虑了至少两种不同的实验方案/方法在层粘连蛋白包被的 基底上来分化16-25天的干细胞。图2中示出了一种实验方案，图3 中示出了另一种实验方案。
在图2的实验方案中，对干细胞使用了四种不同的细胞培养基。 现在将对这四种细胞培养基的组成进行说明。这些细胞培养基在本文 中称为初级细胞培养基、二级细胞培养基、三级细胞培养基和四级细 胞培养基。
初级细胞培养基包含N2M、TGF-β抑制剂和GSK3抑制剂。不 含B27补充剂。在一些特定的实施方案中，初级细胞培养基由上述 列出的成分组成。所述TGF-β抑制剂的浓度为约5μM至约15μM， 特别为约10μM。在一些具体的实施方案中，所述TGF-β抑制剂为 SB431542。所述GSK3抑制剂的浓度为约0.2μM以上。在一些具体 的实施方案中，所述GSK3抑制剂为CHIR99021。在一些实施方案 中，初级细胞培养基进一步包含声猬蛋白(SHH)，如SHH-C24II。 当含有SHH蛋白时，其含量至少为50ng/ml，包括约100ng/ml至约 400ng/ml，特别是约200ng/ml。还包含的头蛋白的含量为约50ng/ml 至约150ng/ml，特别是约100ng/ml。头蛋白也可以作为TGF-β抑制 剂。在其他一些特定的实施方案中，初级细胞培养基由上述列出的成 分组成(包括SHH和和头蛋白)。在铺板接种后的最初24至72小 时内，培养基中可含有ROCK抑制剂。在一些具体的实施方案中， 所述ROCK抑制剂为Y-27632。所述ROCK抑制剂的浓度为约5μM 至约15μM，特别是约10μM。如果需要，可以认为含有ROCK抑制 剂的初级细胞培养基(“初级-A”)与不含ROCK抑制剂的初级细 胞培养基(“初级-B”)是不同的培养基。
二级细胞培养基包含N2M和成纤维细胞生长因子(FGF)。在 一些特定的实施方案中，二级细胞培养基由上述列出的成分组成。不 含B27补充剂。FGF的含量为约50ng/ml至约150ng/ml，特别是约 100ng/ml。在一些特定的实施方案中，所述成纤维细胞生长因子为FGF8b。
三级细胞培养基含有B27M、ROCK抑制剂、成纤维细胞生长因 子(FGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和抗坏血酸(AA)，并 且任选地含有胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)。请注意该 培养基中含有B27，但不含N2。在一些特定的实施方案中，三级细 胞培养基由上述列出的成分组成。FGF的含量为约50ng/ml至约 150ng/ml，特别是约100ng/ml。在一些特定的实施方案中，所述成纤 维细胞生长因子为FGF8b。BNDF的含量为约5ng/ml至约30ng/ml， 特别是约20ng/ml。AA的浓度为约0.1mM至约0.5mM，特别是约 0.2mM。ROCK抑制剂的浓度为约5μM至约15μM，特别是约10μM。 可含有约2ng/ml至约20ng/ml，特别是约10ng/ml的GDNF，但通常 不包含GDNF。
四级细胞培养基含有B27M、成纤维细胞生长因子(FGF)、脑 源性神经营养因子(BDNF)和抗坏血酸(AA)，并且任选地含有胶 质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)。请注意该培养基中含有 B27，但不含N2。在一些特定的实施方案中，四级细胞培养基由上述 列出的成分组成。FGF的含量为约50ng/ml至约150ng/ml，特别是约 100ng/ml。在一些特定的实施方案中，成纤维细胞生长因子为FGF8b。 BNDF的含量为约5ng/ml至约30ng/ml，特别是约20ng/ml。AA的 浓度为约0.1mM至约0.5mM，特别是约0.2mM。可含有约2ng/ml 至约20ng/ml，特别是约10ng/ml的GDNF，但通常不包含GDNF。 四级细胞培养基通常与三级细胞培养基相同，但不含ROCK抑制剂。
接下来，将描述图2中分化实验方案。可以以每平方厘米约 10,000个细胞的密度铺板接种干细胞。在层粘连蛋白包被的基底上铺 板接种干细胞(如上所述)之后，在约156小时至约228小时(即约 7天至约9天)的时间段内使用初级细胞培养基。可以定期给初始细胞培养物换液。然后除去初级细胞培养基，并将二级细胞培养基加入 到基底中。
关于这一点，二级细胞培养基含有FGF，并且通过改变加入FGF 的量和时间点(即7-9天)可以控制所得细胞的头-尾的形成。可以 在初始铺板接种后约252小时至约276小时内(即约11天)去除二 级细胞培养基。换言之，细胞在二级细胞培养基中暴露约36小时至约60小时的时间(即约2至4天)。
然后将细胞分离为单细胞重新铺板接种，并暴露于含有ROCK 抑制剂的三级细胞培养基中。重新铺板接种时的细胞密度可以为每平 方厘米约50万个细至每平方厘米约100万个细胞。在重新铺板接种 过程中应考虑仅短时间使用三级细胞培养基，即约48小时或更短。 然后将细胞暴露于四级细胞培养基中，直至初始铺板接种后约324小 时至约396小时(即约14-16天)。换言之，细胞在四级细胞培养基 中暴露约108小时至约132小时的时间(即约5)。约14-16天后， 细胞密度可高达每平方厘米约178万个细胞。约16天至约25天后， 神经细胞已准备好可以用于进行低温保存或移植。对所需细胞的鉴定 可以通过目标标志物的表达来验证，下文将进一步说明。
以下参考图3，在这25天期间，将在干细胞和层粘连蛋白包被 的基底上使用6种不同的细胞培养基。以下说明这六种细胞培养基的 组成。
第一细胞培养基含有NIM或N2M、ROCK抑制剂、TGF-β抑制 剂和GSK3抑制剂。在一些特定的实施方案中，第一细胞培养基由上 述列出的成分组成。多种添加剂可以是上述特定添加剂的任意组合。 所述ROCK抑制剂的浓度为约5μM至约15μM，特别是约10μM。所 述TGFβ抑制剂的浓度为约5μM至约15μM，特别是约10μM。所述 GSK3抑制剂的浓度为约0.2M以上。如下文将进一步说明的，GSK3 抑制剂的量/浓度会影响所获得的神经细胞的类型。在一些实施方案 中，第一细胞培养基进一步包含声猬蛋白(SHH)。当含有SHH蛋 白时，其含量至少为50ng/ml，包括约100ng/ml至约300ng/ml，特别 是约200ng/ml。也可含有约50ng/ml至约150ng/ml，特别是约100ng/ml 的头蛋白。头蛋白也可以作为TGFβ抑制剂。在其他一些特别的实施 方案中，第一细胞培养基由上述列出的成分组成(包括SHH和和头 蛋白)。
第二细胞培养基含有NIM或N2M、TGF-β抑制剂和GSK3抑制 剂；但不含有第一细胞培养基中的ROCK抑制剂。在一些特定的实 施方案中，第二细胞培养基由上述列出的成分组成。这些添加剂的用 量如上所述。在一些实施方案中，第二细胞培养基进一步包含声猬蛋白(SHH)。当含有SHH蛋白时，其含量至少为50ng/ml，包括约 100ng/ml至约300ng/ml，特别是约200ng/ml。在该第二细胞培养基 中也可含有约100ng/ml至约300ng/ml，特别是约200ng/ml的头蛋白。 在一些特定的实施方案中，第二细胞培养基由上述列出的成分组成(包括SHH和和头蛋白)。
第三细胞培养基含有(i)NIM或N2M；(ii)TGF-β抑制剂。 所述TGFβ抑制剂的浓度为约5μM至约15μM，特别是约10μM。也 可含有约50ng/ml至约150ng/ml，特别是约100ng/ml的头蛋白。在 一些实施方案中，第三细胞培养基进一步包含GSK3抑制剂和SHH 蛋白。如果含有GSK3抑制剂，其浓度为约0.2M以上。当含有SHH 蛋白时，其含量至少为50ng/ml，包括约100ng/ml至约300ng/ml，特 别是约200ng/ml。在一些特定的实施方案中，第三细胞培养基由NPM 或N2M、TGFβ抑制剂、GSK3抑制剂和SHH蛋白组成。
第四细胞培养基含有(i)NIM或N2M；和(ii)FGF。FGF的 含量为约50ng/ml至约150ng/ml，特别是约100ng/ml。
第五细胞培养基含有B27培养基、脑源性神经营养因子 (BDNF)、抗坏血酸(AA)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子 (GDNF)和成纤维细胞生长因子(FGF)。在一些特定的实施方案 中，第五细胞培养基由上述列出的成分组成。BNDF的含量为约 5ng/ml至约30ng/ml，特别是约20ng/ml。AA的浓度为约0.1mM至 约0.5mM，特别是约0.2mM。GDNF的含量为约2ng/ml至约20ng/ml， 特别是约10ng/ml。FGF的含量为约50ng/ml至约150ng/ml，特别是 约100ng/ml。
第六细胞培养基可用于神经元成熟；并且其含有B27M、BDNF、 抗坏血酸(AA)、GDNF、db-cAMP和γ-分泌酶。在一些特定的实 施方案中，第六细胞培养基由上述列出的成分组成。BNDF的含量为 约5ng/ml至约30ng/ml，特别是约20ng/ml。AA的浓度为约0.1mM 至约0.5mM，特别是约0.2mM。GDNF的含量为约5ng/ml至约 30ng/ml，特别是约10ng/ml。db-cAMP的浓度为约200μM至约800μM， 特别是约500μM。γ-分泌酶的浓度为约0.1μM至约5μM，特别是约 1μM。
在包被有层粘连蛋白的基底上铺板接种干细胞之后，在约36小 时至约60小时的时间段内，具体为约48小时(即约2天)使用第一 细胞培养基。然后除去第一细胞培养基，并将第二细胞培养基加入到 基底中。在初始铺板接种后约84小时至约108小时内(即约4天)去除第二细胞培养基，并更换为第三细胞培养基。第三细胞培养基可 以在初始铺板接种后约156小时至约180小时内更换。第三细胞培养 基可以在初始铺板接种后约156小时至约228小时内(即初始铺板接 种后约7-9天)去除。
关于这点，可以通过使用第一至第三细胞培养基在这一初始阶 段通过剂量依赖性方式添加GSK3抑制剂来控制所得细胞的头-尾的 形成。在一些实施方案中，在这些间脑命运(diencephalic fate)细胞 的培养基中使用0.2μM至0.4μM的GSK3抑制剂。在其他一些实施 方案中，在这些中脑命运细胞的培养基中使用0.6μM至0.8μM的 GSK3抑制剂。在其他一些实施方案中，在这些前菱脑命运细胞的培 养基中使用1μM至2μM的GSK3抑制剂。在其他一些更进一步的实 施方案中，在这些后菱脑命运细胞的培养基中使用超过4μM的GSK3 抑制剂。
类似地，可以通过剂量依赖性地添加SHH蛋白来控制神经祖细 胞的背-腹的形成。在其他一些实施方案中，如果没有向培养物中加 入SHH蛋白，则细胞将被富集以用于翼板的命运。在其他一些实施 方案中，可以加入约50ng/ml至约150ng/mL的SHH蛋白以富集细胞用于基板的命运。在其他一些实施方案中，可以加入约200ng/ml以 上的SHH蛋白以富集细胞用于底板的命运。为了富集细胞用于顶板 的命运，在第三细胞培养基(约第4天使用)中不应含有TGFβ抑制 剂或头蛋白。这使得骨形态发生蛋白(BMP)得以激活。
在一些实施方案中，可以在第二和第三细胞培养基中加入 purmorphamine和SHH蛋白质以获得更有效的腹侧形成。所述 purmorphamine的含量应为约0.1μM至约1μM，特别是约0.5mM。
之后继续，在初始铺板接种后约156小时至约228小时，用第 四细胞培养基代替第三细胞培养基。如上所述，第四细胞培养基中 FGF的用量和加入时间可以控制祖细胞的头-尾的形成。可以在初始 铺板接种后约252小时至约276小时内(即初始铺板接种后约11天)去除第四细胞培养基。此时，细胞可以在包被有第二层粘连蛋白的基 底上重新铺板接种，并使用第五细胞培养基。在初始铺板接种后约 324小时至约396小时内(即约14-16天)，可用第五细胞培养基来 培养细胞。也可以在初始铺板接种后约324小时至约348小时内更换第五细胞培养基。
约14-16天后，对通过这些方法使用第一至第五细胞培养基培 养的细胞进行鉴定，可以通过包括FOXG1、OTX2、LMX1A、FOXA2 和HOXA2在内的区域标志物的表达来验证。约16天至约25天后， 神经细胞已准备好可以用于进行低温保存或移植。如果需要在成熟神经元表型的长期研究中使用细胞，则可以在第六细胞培养基中培养细 胞。可以获得大量神经细胞。
图2和图3的细胞培养基相互可比。图2的初级细胞培养基与 图3的第二细胞培养基相似。图2的二级细胞培养基与图3的第四细 胞培养基相似。图2的四级细胞培养基(B27M)与图3的第五细胞 培养基(NDM)相似。
通过以下实施例进一步说明本发明。这些实施例仅为说明本发 明，其目的不在于限制根据本发明生产制造设备所设定的材料、条件 或方法参数。
实施例
用层粘连蛋白-111包被培养板
在起始分化之前，利用1μg/cm2的层粘连蛋白-111的PBS溶液 和Ca2+/Mg2+(总体积300μL)包被24孔板。对于一些孔，将层粘连 蛋白-111和PBS直接混合加入孔中。振荡培养板以确保均匀包被。 然后用石蜡膜覆盖培养板，并在4℃下放置约1至约7天，然后使用。
稀释CHIR99021
将CHIR99021溶于DMSO制备10mM储备液。将储备液分装 (5-10μL/小瓶)并在-20℃储存。每份试样冻融三次后不能使用。
为了在细胞培养中使用，在N2M中将CHIR99021以1:100稀释， 得到100μM溶液，然后加入到细胞培养基中。
实施例1
材料和方法
将神经诱导培养基(NIM)、Y-27632(10μM)、SB431542(10μM) 和头蛋白(100ng/mL)混合，以制备分化培养基。每平方厘米的分 化需要约250μL的培养基。为了建立腹侧中脑命运的模式，将0.6至 1.0μM的CHIR99021和200ng/mL Shh-C24II加入到培养基中。
细胞团表现出多能性，并且在起始分化之前已经从培养物中去 除了任意已分化的细胞团。将StemMACS iPSBrew培养基吸除，细 胞在PBS中洗涤一次。在细胞中加入EDTA(0.5mM)，并将细胞在 室温下孵育约7分钟。不时振荡培养板，以确保细胞浸没在EDTA 中。
在15mL离心管中制备10mL洗涤培养基(含有0.1％白蛋白的 DMEM/F12培养基或与生长培养基相似的其他培养基)。去除EDTA， 并将1mL洗涤培养基转移到培养板中。
立即用移液器将细胞团从培养皿中吸出并吹打分散为均匀的大 小，同时避免分离成单个细胞。然后用洗涤培养基将细胞团转移到 15mL离心管中。将细胞悬浮液混合，将1mL悬浮液转移到1.5mL 离心管中进行计数。将离心管以400×g离心5分钟。
从1.5mL离心管中吸除培养基，并将细胞重新悬浮于100μL的 Accutase细胞消化液中。将细胞置于培养箱中7分钟以产生单细胞悬 浮液。在1.5mL离心管中加入900μL洗涤培养基，并用移液器吹打 分离细胞。然后进行细胞计数，以估计悬浮液中细胞的总数。起始分 化需要约10,000个细胞/平方厘米，将细胞从悬浮液中转移到一个新 的离心管中，然后以400×g离心5分钟。
吸除洗涤培养基，并将细胞重悬于NIM、Y-27632(10μM)、 SB431542(10μM)、头蛋白、CHIR99021(0.7μM)和SHH-C24II (200ng/ml)混合的分化培养基中，以形成50,000个细胞/mL的细胞 悬浮液。从包被的培养板中吸除层粘连蛋白-111，并将细胞悬浮液以 10,000个细胞/平方厘米(每平方厘米约250μL培养基)接种在包被 的培养板上。充分振荡和摇动培养板以确保接种均匀。
约48小时(第2天)后，将培养基更换为含有SB431542(10μM) 和头蛋白(100ng/mL)的新神经诱导培养基(NIM)。为了建立腹 侧中脑命运的模式，将0.6至1.0μM的CHIR99021和200ng/mL SHH-C24II加入到培养基中。分化培养基的体积与用于起始分化的培 养基的体积相同。
约48小时(即铺板接种后约96小时，第4天)后，将培养基 更换为含有SB431542(10μM)和头蛋白(100ng/mL)的神经增殖培 养基(NPM)。为了建立腹侧中脑命运的模式，将0.6至1.0μM的 CHIR99021和200ng/mL Shh-C24II加入到培养基中。每平方厘米需 要加入约350μL的培养基。
约72小时(即铺板接种后约168小时，第7天)后，用含有 SB431542(10μM)和头蛋白(100ng/mL)的NPM培养基换液。为 了建立腹侧中脑命运的模式，将0.6至1.0μM的CHIR99021和 200ng/mL Shh-C24II加入到培养基中。每平方厘米需要加入约350μL 的培养基。
约48小时(即铺板接种后约216小时，第9天)后，用含有成 纤维细胞生长因子(FGF8b)(100ng/mL)的NPM培养基换液。每 平方厘米需要加入约500μL的培养基。
约48小时(即铺板接种后约264小时，第11天)后，将细胞 重新铺板接种于新的层粘连蛋白-111包被的12孔板中。用PBS洗涤 细胞两次，并摇动培养板以除去所有死亡和漂浮的细胞。每孔中加入 约300μL的Accutase细胞消化液。将细胞在培养箱中放置10分钟，偶尔摇动以确保细胞浸没在Accutase细胞消化液中。
用15mL离心管制备10mL的NPM。10分钟后，用1mL移液器 将细胞吹打分散，得到单细胞悬浮液，并将其转移到含有NPM的 15mL离心管中。将细胞以400×g离心5分钟。然后吸除培养基，将 细胞沉淀转移至新的1.5mL离心管中，并重悬于1mL的NPM中。 取出10μL细胞悬浮液进行计数。将悬浮液以1:10至1:50的比例进 行稀释。细胞计数的同时，将细胞以400×g离心5分钟。
吸除培养基，将细胞以170万个细胞/mL的密度重悬于加入了 脑源性神经营养因子(BDNF)(20ng/mL)、抗坏血酸(AA) (0.2mM)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)(10ng/mL)和FGF8b(100ng/mL)的B27培养基(B27M)中。从 包被的培养板中吸除层粘连蛋白-111，并将细胞以800,000个细胞/ 平方厘米的密度接种于培养板中。充分振荡和摇动培养板，以在孵育 前对细胞进行均匀地铺板接种。
约72小时(即铺板接种后约336小时，第14天)后，用含有 BDNF(20ng/mL)、AA(0.2mM)、GDNF(10ng/mL)和FGF8b (100ng/mL)的B27M培养基给细胞换液。每平方厘米需要加入约 500μL的培养基。
约48小时(即铺板接种后约384小时，第16天)后，细胞已 准备好可以用于进行低温冻存和/或移植。
祖细胞表型的验证
用含有BDNF、抗坏血酸和FGF8b的B27M培养基将平行的细 胞培养板中的细胞培养至第14天(即铺板接种后336小时)，然后 收集细胞进行RNA分析或固定细胞用于免疫细胞化学实验。在第14 天，通过FOXG1、OTX2、LMX1A、FOXA2和HOXA2等区域标志 物的表达明确鉴定出细胞的区域身份。
实施例2
材料和方法
在24孔板中使用与实施例1中公开的相同的材料和实验方案， 仅做以下改变：
将层粘连蛋白-111溶于含有Ca2+/Mg2+(700μL/cm2)的PBS中， 并用其包被培养板。为了在层粘连蛋白-111包被的平板上接种细胞 悬浮液，每平方厘米需要约250μL细胞悬浮液(500μL/孔)。为了 起始分化，24孔板中的6孔总共需要120,000个细胞。
在铺板接种后96小时和168小时进行标记，向每个孔中加入约 600μL培养基。在铺板接种后216小时进行标记，向每个孔中加入约 700μL培养基。
一些细胞系重新铺板接种时需要向培养基中加入10μM的 Y-27632才能够存活。在重新铺板接种过程中，每孔中加入约150μL 的Accutase细胞消化液。在336小时进行标记时，向每个孔中加入 约700μL培养基。
实施例3
制备移植用细胞(第16-25天)
使用与实施例1和实施例2中公开的相同的材料和实验方案。
在含有B27M、BAG(BDNF+AA+GDNF)和FGF8b的培养基 中培养细胞直到移植当天，期间不需要任何进一步的操作。每隔2 至3天更换培养基。细胞在第16天最适合移植，但直到第26天都可 以移植。用于移植的细胞不能从培养基中吸收DAPT或db-cAMP， 因为这将导致神经元过早成熟以及分离细胞时死亡细胞的增加。
实施例4
长程终末神经元成熟
使用与实施例1和实施例2中公开的相同的材料和实验方案。
成熟神经元表型的长期研究中的所用细胞在第16和25天之间 重新铺板接种，以避免培养物密度过高以及细胞从贴壁状态脱落。在 含有B27M和BAG(不含db-cAMP和DAPT)的培养基中培养细胞 直到重新铺板接种。使用与第11天(即第一次铺板后264小时)相 同的方法进行重新铺板接种，细胞在含有B27M、BDNF(20ng/mL)、 GDNF(10ng/mL)、抗坏血酸(0.2mM)、db-cAMP(500μM)和 DAPT(1μM)的培养基中培养。
应避免重新铺板接种时间过晚，因为这会对成熟神经元细胞造 成应激。在分化的晚期阶段，神经元可能开始脱离培养板。可以通过 向细胞培养基中加入层粘连蛋白和纤连蛋白(FN)来缓解这种现象。 成熟的多巴胺能表型只会从第45天开始出现。
实施例5
在过去6年中，在多个不同的研究场所中有超过500只大鼠脑 内移植了31种不同批次的hES衍生mesDA祖细胞。移植实验计划 的概况如下表2至表3所示：移植部位：Str.＝纹状体，SN＝黑质。大 鼠宿主品系：SD＝Sprague-Dawley大鼠、LH＝Lister-hooded大鼠、At＝ 无胸腺Crl:NIH-Foxn1rnu大鼠。为了进行免疫抑制，Ciclo＝每天腹膜 内注射环孢素(10mg/kg)，从移植前一天开始。
表2.
Figure BDA0001428400130000301
Figure BDA0001428400130000311
表3.
Figure BDA0001428400130000321
所有实验的方案如图4E所示，hESCs在体外分化16天，将各 种不同批次的腹侧中脑形成的hESCs移植到具有6-OHDA单侧多巴 胺能损伤的大鼠中。图4A是一组细胞在体内成熟后移植物的，用 TH对大脑染色。尽管在评级之前会常规地评估所有腹侧中脑形成的 细胞批次中高表达的中脑腹侧标志物LMX1A、FOXA2和OTX2，在 不同实验之间移植物大小与多巴胺神经元数量的体内结果仍会有所 不同。
为了从这些实验中确定不同批次间的变异水平，对每只动物的 每100,000个移植细胞(DA产量)中TH+神经元的总数进行了定量， 如图4B所示，移植物大小基于免疫染色后HuNu+细胞体积(mm3) 确定。移植物的体积的如图4C所示。所有定量结果都以每100,000 个移植细胞中的量报告数值。这能保证对所有移植物DA密度 (TH+/mm3)的估计，结果如图4D所示。这些定量评估表明不同实 验间变异性相当大。
为了确定通常使用的mesDA祖细胞标志物在体外能够多大程度 上预测体内成熟后移植物中TH+的含量，在移植当天从上面列举的 每个细胞批次(均含有高水平的FOXA2/LMX1A共表达细胞)分别 收集RNA样品并进行分析。在进一步体外成熟之后，对来自相同细胞重新铺板接种后的RNA样品也进行分析。
图4F是一组图示，依据第16天(即移植当天)每个移植实验 中平均TH+细胞的含量相对于移植细胞群体中FOXA2、LMX1A和 CORIN的基因表达水平绘制。类似地，图4G也是一组图示，其显示 了第16天移植细胞群体，但该图显示的是TH、NURR1和AADC的 基因表达情况。每幅图中给出了斯皮尔曼相关(仅腹侧中脑细胞)的 结果R和p值，相关性趋势由线性回归线表示。
据发现，常用的mesDA标志物FOXA2、LMX1A和CORIN的 表达是移植物多巴胺能分化所必需的。然而，在移植时间点FOXA2 和LMX1A的表达水平与移植物中DA的产量并无显著相关，这表明 在FOXA2/LMX1A共表达细胞内，需要其他的标志物来预测体内结 果。
图4F和4G显示出：对是否延长祖细胞在体外成熟形成神经元 进行的评估，反映了它们在移植物中相应的体内成熟。在进一步的实 验中，用于移植的细胞也在体外平行地进行末端分化39-45天(而不 是仅仅16天)，据发现，DA标志物TH、NURR1和AADC的表达 水平与移植后DA产量并无任何统计学上的显著相关。
实施例6
为了能够无偏差的搜寻与移植后的DA产量(即，移植成功的 结果)正相关的潜在标志物，使用RNA测序对移植当天收集的细胞 样品进行全基因表达谱分析。
为进行无偏差的基因表达分析，根据移植物中TH+细胞的总数 将移植实验分为DA-高组和DA-低组。不同批次之间TH+含量比较 图如图5A所示。通过苯丙胺诱导的旋转行为或PET成像，在具有长 期成熟(即长于16周)的移植物中评估移植物的多巴胺能功能。“-”符号表示功能未能恢复，“+”符号表示功能恢复，“ND”表示“未确定”。
重要的是，所有功能未能恢复的长期移植物都属于DA-低组， 而DA-高组含有具有治疗潜力的能够诱导功能恢复的细胞。
为了确定DA-高和DA-低细胞批次间是否可以通过不同的基因 表达谱来鉴定，在所有选定的第16天的RNA测序样品上进行无偏 倚的主成分分析(PCA)。如图5B所示，观察到DA-高样品在PC1 正向轴聚类，其含有如FGF8、PAX5、EN2和CNPY1等基因，这些 基因都已被证明对于中脑-后脑边缘(MHB)的形成很重要。
由于两组之间有明显的表达谱差异，因而进行了Deseq2分析， 以鉴定DA-高组和DA-低组的样品之间的所有差异表达的基因。图 5I是对DA-高组和DA-低组细胞样品的RNA测序数据进行Deseq2 分析之后进行预测标记的图形分析。根据log2倍数变化与归一化后计数的平均值的比值绘制标志物图。从上述分析中出现的排名前12 位的基因中，再次发现在尾部腹侧中脑和MHB区域高表达的基因与 体内DA产量正相关，这些基因为PAX5、FGF8、SPRY1、EN1、EN2、 SP5、ETV4、CNPY1、TLE4和ETV5。图5C示出了这些基因表达谱。 这12个基因是具有最高倍数变化且p值＜0.001的基因。
为了评估所选的这些标志物的预测价值，在移植物结果(即TH+ 含量)与经PCA和Deseq2分析选定的基因的RNA表达水平之间进 行了直接斯皮尔曼相关分析。图5D至5E具体示出了了EN1和PAX8 的斯皮尔曼相关分析结果。将斯皮尔曼相关分析结果给出R和p值， 并用线性回归线显示相关性。为了验证RNA测序数据集的有效性， 使用qRT-PCR评估基因相关性的一个子集，包括4个附加的移植实 验，具体如图5E所示。
TH+含量、移植物体积和DA密度，以及MHB基因的RNA水 平和普通腹侧中脑标志物的之间的RNA测序相关性分析，总结图如 图5F所示。示意图仅显示了通过斯皮尔曼相关分析确定的正相关， p＜0.05。通过qRT-PCR验证的基因以粗体显示。
将上述相关性与通常使用的腹侧中脑标志物(即LMX1A、 LMX1B、FOXA2、FOXP2、CORIN和OTX2)的相关性进行比较。
分析表明，通过DeSeq2鉴定的大多数尾部侧腹中脑标志物与移 植物的移植物大小及TH总含量呈正相关，如图5G所示。图5G具 体是不同细胞批次间RNA水平的斯皮尔曼距离分析的图示，显示了 MHB基因的共调节。标志物EN1、SPRY1、WNT1、ETV5和CNPY1 与DA密度(TH+/mm3)呈正相关。这些标志物与更明显和更广泛表 达的腹侧中脑标志物FOXA2、LMX1A、CORIN、FOXP1及FOXP2 不同，通过几项分析显示其与移植物大小和DA总产量呈负相关，表明它们可能与MHB基因簇分离或负结合。LMX1A和OTX2仅显示 出与DA密度呈正相关，但与移植物的DA产量无显著相关性。
为了研究RNA测序分析中鉴定出的基因是否能构成共调控基因 网络的一部分，在29批次的腹侧中脑形成化细胞中，对每个候选基 因的表达值进行了斯皮尔曼相关分析。如图5G所示，与DA高产量 相关的所有MHB基因都显示出共调节模式。特别地，MHB标志物SPRY1和ETV4/5以及尾部腹侧中脑标记物EN1和CNPY1在分析中 聚簇，表明这些基因之间有很强的共调节作用。然而，LMX1A和 OTX2与这些基因之间仅有很少或几乎没有完全没有正向共调节。 CORIN、LMX1B、FOXA2和FOXP2与几个尾部基因呈负相关，表 明这些常用的标记物与尾部腹侧中脑表型没有特异性的相关性，并且 它们可能在腹侧中脑更靠近尾部的区域以更高水平表达。据报道参与 mesDA神经发生的其他腹侧中脑标志物(即MSX1、SOX6和PBX1) 在第16天的腹侧中脑形成祖细胞中进行分析时，没有表现出与移植 物的DA密度的任何相关性。图5H是来自预测标记高表达的不同细 胞批次的TH+神经元的一组五幅代表性图像，其示出了移植细胞成 熟形态。
实施例7
通过RNA测序表达值发现，第16天间脑标志物FEZF1、WNT7B 和EPHA3与移植物中的DA产量之间显示出强负相关性，如图6A 所示。这种相关性引发人们去研究某些批次含有BARHL1+和 PITX2+STN祖细胞的腹侧中脑形成hESCs是否衍生自前部 LMX1A+/FOXA2+结构域。
在第16天的分化细胞批次中都能检测到BARHL1+和PITX2+。 图6B是一组腹侧中脑形成的hESC细胞培养物在第16天进行免疫染 色后的图像，其揭示出STN结构域命运(BARHL1+/FOXA2+和 PITX2+/LMX1+细胞)的存在。图6C是间脑STN区域和侧中脑区域 中的PITX2和BARHL1表达域的示意图。图6G显示了在第42天分 化时图6B的细胞培养物。
如图6B至6C所示，BARHL1+细胞既可以是FOXA2+也可以是 FOXA2-，说明间脑底板细胞和侧向细胞群在不同批次的分化的祖细 胞中都存在。进一步发现终末分化的hES细胞培养物中存在 FOXA2+/BARHL1+/MAP2+神经元和PITX2+/LMX1A/B+细胞，说明这 些祖细胞向STN命运分化。
图6D是18周龄移植物共聚焦成像后的一组图像。在移植了腹 侧中脑形成细胞的动物中，检测到BARHL1+细胞的存在有差异，并 且这些细胞可能是PITX2+(表明腹侧间脑STN命运)或PITX2-(表 明其他侧向命运)。图6E是在移植当天BARHL1的RNA低或高水 平批次的细胞的移植物中BARHL1+细胞含量的一组示例图像。
为了研究这些标志物是否可用于预测移植物中非多巴胺能侧向 细胞和头部-腹侧污染细胞的数量，在几个移植实验中对BARHL1+细胞的数量进行了定量。相关分析表明，移植物中BARHL1+细胞的 密度与移植当天分化的细胞批次中BARHL1和BARHL2的体外表达水平呈正相关，如图6D和6F所示。每张图的斯皮尔曼相关分析结 果给出R和p值，并用线性回归线显示相关性。
这些结果表明，祖细胞培养物中的BARHL1和BARHL2可用作 鉴定和定量腹侧中脑形成hESCs中几种常见的污染群体的体外和体 内标志物。
实施例8
鉴于腹侧中脑形成的hES细胞祖细胞的不同结果，接下来研究 分化方案中的形成是否可以针对腹侧中脑的尾部多巴胺能结构域进 行优化(因为该结构域的标志物与体内高DA产量相关)。位于尾部 腹侧中脑的细胞临近MHB，小鼠和鸡雏模型中的研究表明，该区域 内mesDA祖细胞的发育取决于由MHB分泌的生长因子FGF8的活 性。此外，发现FGF8的高表达与基因表达分析中的DA-高组相关， 如上图5C所示。
图7A是一组图示，其是在第0-9天建立腹侧中脑形成过程中用 外源性FGF8b处理hESC后，在第10天对分化中的hESCs进行 qRT-PCR分析之后建立的一组图示。分析显示在腹侧间脑 (CHIR＝0.4μM)或腹侧中脑(CHIR＝0.8μM)培养物中诱导出了前 脑和后脑标志物。
据发现：在神经诱导和形成(patterning)的早期阶段(第0-9 天)，将FGF8b与SHH和GSK3i一起加入到分化培养基中以激活典 型的WNT信号传导，引起前脑标志物FOXG1和SIX3在间脑形成培 养物中的显著上调，以及后脑标志物HOXA2和GBX2在中脑形成培 养物中的上调。这表明早期形成中使用FGF8b引起了几种非腹侧中 脑祖细胞命运的培养物污染。图7B是一组在第16天的免疫染色图 像，其显示了从第0-9天用FGF8b处理的培养物中PITX2+和NKX2.1+细胞的斑块，以及LMX1A-细胞的斑块。
与之相比，如果朝向腹侧中脑的起始形成完成之后，将FGF8b 加入到细胞中(从第7-16天或9-16天)，则能维持细胞的 FOXA2+/LMX1A+表型，如图7C所示。
图7D至7F对应于用FGF8b处理的第16天的培养物。从第9-16 天用FGF8b处理培养物，此时加入100ng/mL的FGF8b引起了腹侧 中脑祖细胞的尾化。如图7D-7E中的免疫染色图像所示，BARHL1+和PITX2+水平都有所下降，图7F为图7D-7E的定量结果。然而， 对照组腹侧中脑培养物中完全没有EN1表达，用FGF8b处理的培养 物中，EN1+祖细胞和EN1的mRNA在第9-16天含量高。图7E是一 组EN1免疫染色的图像，图7G是FOXA2、LMX1A、OTX2和EN1 的mRNA水平的qRT-PCR分析结果图。
总结来说，从第9至16天用FGF8b处理进一步导致 BARHL1+/FOXA2+和PITX2+STN祖细胞百分比显著降低，如图7D 至7F所示。这种降低表明在晚期将FGF8b加入到培养物中会将祖细 胞命运由前腹侧中脑和STN命运转为尾部腹侧中脑mesDA祖细胞命 运。
图7H至7I为流式细胞术分析的FACS图，如图所示，尽管从 第9-16天加入FGF8b不影响FOXA2+祖细胞的百分比，但是CORIN+祖细胞数量降低了47％。这与图5F至5G中的RNA测序分析中发现 的CORIN的负相关性是一致的，表明在蛋白质和mRNA水平上， CORIN的表达与尾部腹侧中脑/间脑命运比与尾部mesDA祖细胞命 运的相关性更强。
实施例9
为了开发兼容GMP的分化实验方案，以获得移植结果良好的尾 化mesDA腹侧中脑祖细胞的高产量和可再现产量，使用源自Roslin 细胞(hPS Creg#RCe021-A)的完全GMP衍生hES细胞系RC17。 此前的研究级腹侧中脑分化实验方案已经实现了在Matrigel上进行胚体(embryoid body，EB)形成或培养的步骤，两者在GMP适应性 方面所具有的问题分别在于难以再现和未定义动物衍生成分的含量。
测试了7种不同的全长层粘连蛋白亚型，发现其中的4种 (LN-111、LN-421、LN-511和LN-521)有效地支持腹侧中脑祖细 胞从实验方案的第0-11天进行贴壁分化。这在图8A中示出，该图 是表明七种所测试的层粘连蛋白亚型中神经细胞最佳附着和产量的 一组图像。相对于100％的标准产量，LN-111的产量为170％，LN-421 的产量为294％，LN-511的产量为223％，LN-521的产量为208％。 根据本发明所述方法对RC17细胞进行分化，但是在培养板上用层粘 连蛋白-121进行包被，而不是用层粘连蛋白-111进行包被。图8C中 对产量进行了比较，并且产量彼此大致相等，即LN-121与LN-111 作为基底的作用一样好。
与有效支持hPSC生长的LN-511和LN-521相反，据发现，当 未分化的hESC在多能培养基(iPS brew)中的LN-111上铺板培养 时，培养4天后细胞形成球状，容易从培养皿分离，如图8B中的图 像所示。当在B27培养基中将相同数量的细胞铺板接种到LN-111上 时，培养物保持附着，并在分化7天后生长至融合，同时多能性标志 物表现出迅速的下调。图8D是在第0、2、4和7天拍摄的一组图像， 显示出在B27培养基中的LN-111基质上以低密度接种hESC能产生 融合的神经培养物，而图8E是在三天分化中多能性标志物mRNA水 平降低的图示。这表明LN-111选择性地支持神经细胞的生长而不支 持多能干细胞的生长，这与其在发育中的大脑中的广泛表达是一致 的。
接下来，测试了适用于GMP的多种基础培养基的不同组合，目 的是优化腹侧中脑祖细胞的总产量和纯度。已经发现，在第0-11天， 在含有N2补充剂而不含B27补充剂的NeuroBasal+DMEM/F12基础 培养基中的分化在第11天细胞产量最高。图8F是不同培养基培养 下细胞产量的图示。
为了确保腹侧中脑祖细胞的准确尾化，从分化的第9-16天向细 胞中加入100ng/mL的FGF8b。对于实现GMP的兼容性，实验方案 中所有生长因子和化学物质都更换为下表4中所列举物质。
表4.
Figure BDA0001428400130000401
如图2所示，GMP兼容的实验方案包括在含有LN-111的基底 上铺板接种约1×106个hESCs，然后在第0-9天用N2培养基、 SB431542、头蛋白、Shh-C24II和CHIR99021进行培养。然后去除 第一培养物，并第9-11天将铺板接种的细胞暴露于N2培养基和 FGF8b，生成祖细胞。然后使用ROCK抑制剂(Y-27632)将祖细胞 以0.8×106/cm2的密度重新铺板接种到三个独立的培养板上。在第 11-16天，去除Y-27632，每个培养板在含有B27、FGF8b、BDNF 和抗坏血酸的培养基中培养，使细胞覆盖约1.78±0.13×106/cm3的面 积。与原始的基于EB研究级分化方案获得的产量相比，此时最终产 量要高出40倍以上。
基于这些数字，推断从100万个未分化的hESC开始，16天内 可以产生超过3.8亿个可移植的祖细胞。图8G是基于EB实验方案 的细胞计数与基于GMP/LN-111实验方案的细胞计数的对比图示。
在这些祖细胞体外终末分化后，在分化后第45天对分化为腹侧 中脑的hESC进行膜片钳电生理学研究。将在盖玻片上生长的细胞浸 没在连续流动的Krebs溶液(119mMNaCl、2.5mM KCl、1.3mM MgSO4、2.5mM CaCl2、25mM葡萄糖和26mM NaHCO3)中，在28 ℃下供应95％O2-5％CO2的气体。使用Multiclamp 700B放大器 (Molecular Devices)进行记录，使用填充有122.5mM葡萄糖酸钾、 12.5mM KCl、0.2mM EGTA、10mM Hepes、2mM MgATP、0.3mMNa3GTP和8mM NaCl的硼硅酸盐玻璃移液管(3-7MOhm)，利用 KOH调节pH至7.3。使用pClamp10.2(Molecular Devices)采集数 据；电流以0.1kHz进行滤波并以2kHz进行数字化。选择具有圆形 细胞体形态的神经元用于全细胞膜片钳。在电流钳模式下破膜后立即 监测静息膜电位。此后，将细胞保持在-60mV至-80mV的膜电位， 并且以10pA的增量注入500ms电流，从而使电流从-20pA增加至 +90pA，以诱导动作电位。对于去极化的反弹，向细胞注入20pA的 小电流以诱导动作电位。使用相同的内部溶液在静息膜电位下记录自 发性突触后电流。
当使用膜片钳进行电生理学(11/11)评估时，已经证实细胞变 为诱发动作电位的神经元。在神经元的成熟部分(静息膜电位＜ -40mV)中，7个细胞中的4个进一步显示出在短暂去极化后的反弹 动作电位，这是体外中脑多巴胺神经元的特征。图8H是由注入去极化电流诱导的动作电位的典型痕迹示意图。图8I是一些腹侧中脑细 胞显示出自发性突触后电流，表明突触在皿中融合的示意图。图8J 是多巴胺能表型在短暂的膜去极化特征后去极化反弹的示例。图8K 是示出图8J中各条迹线的放大插图。
例10
为了验证图3中的新实验方案能够产生纯腹侧中脑神经祖细胞 的群体，对培养物进行FOXA2和LMX1A/B染色，发现两种蛋白质 的共定位程度很高。图9A是祖细胞免疫染色后的一组照片，图上显 示出在分化的培养物中，LMX1A/FOXA2的重叠程度非常高。图9B 是流式细胞术分析后的一组图，表明在分化第16天，培养物平均含 有95％的OTX2+/FOXA2+祖细胞。
为了监测体内预测结果批次间的变异，设计了使用新的关键预测标 志物(EN1、SPRY1、PAX8、CNPY1和ETV5)的qRT-PCR组。根据实施例 10的GMP实验方案分化人胚胎干细胞，然后在分化的第16天评估正确的 头-尾腹侧中脑形成，并监测所有前脑(FOXG1)、后脑(HOXA2)或侧向(PAX6) 污染细胞群体。qRT-PCR组中所使用的所有引物列于下表5中。
表5.
Figure BDA0001428400130000421
Figure BDA0001428400130000431
Figure BDA0001428400130000441
为了评估与研究级实验方案相比，新GMP方案的再现性和准确 性，使用设计的qRT-PCR组分析了34个研究级和43个GMP腹侧 中脑批次。
图9C是根据两种实验方案分化的hESCs的比较图像。在分化 的第16天评估hESC的RNA表达。以向腹侧前脑(vFB)和腹侧后 脑(vHB)的分化作为对照。数值经过颜色编码，并用每个基因最高 表达的样本归一化。
虽然在所有批次的细胞中OTX1、OTX2、LMX1A、LMX1B和 FOXA2的表达都很强，但是在研究级实验方案产生的批次之间，尾 部腹侧中脑标志物PAX8、EN1、SPRY1和ETV5的表达有相当大的 差异。研究级细胞批次通常分为两类：(i)具有高水平EN1、PAX8、 ETV5、SPRY1和HOXA2的细胞批次；或(ii)具有低水平EN1、 PAX8、ETV5、SPRY1和HOXA2的细胞批次，而在HOXA2不表达 的情况下，只有非常少的批次含有高水平的尾部腹侧中脑标志物 (EN1、PAX8、ETV5、SPRY1)。
这些表达模式表明后脑细胞(HOXA2+)的存在对于在研究级实 验方案产生的培养物中诱导完整的尾部腹侧中脑特征是必需的，因为 缺少后脑细胞会导致产生主要具有头部腹侧中脑特征的培养物。与此 相反，实施新的GMP实验方案能够得到更同质化且不含高水平 HOXA2污染的细胞批次。
GMP实验方案中加入FGF8b(第9-16天)很强烈地引起了高水 平表达诱导的尾部腹侧中脑标志物(EN1、PAX8、ETV5和SPRY1)， 通过与DA高产量(CORIN和FOXP2)呈负相关的标志物的减少， 已能够预测DA产量随之减少。在没有HOXA2污染的情况下，发生 这种尾化。对根据实施例10的GMP实验方案分化的两个临床相关 细胞系(H9和RC17)的移植物进行评估时，发现两个细胞系产生的 神经元，都富含具有大量TH表达细胞的移植物。图9D(H9)和图9E(RC17)是含有高水平尾部腹侧中脑标志物的细胞批次的代表性 图像。这些细胞密集地促使宿主纹状体(参见标记为D”和E”的细胞) 活动，并表达成熟mesDA标志物。本实验方案减少了后脑污染，并 提高了尾部侧腹中脑标志物的表达，这预示了良好的移植物结果。
例11
为了确定GMP实验方案是否在体内产生了具有功能性多巴胺 能活性的细胞，以及头部相对尾部VM表型是否真正能够预测体内 功效，通过将细胞移植到帕金森氏病的动物模型中来进行评估。在根 据LN-111GMP实验方案(图2的实验方案)分化的VM模式的RC17 在细胞纹状体内移植前后，对两组单侧6-OHDA损伤大鼠进行苯丙 胺诱导旋转行为的评估。一组动物(mesDA RC17)从第9-16天接受 存在FGF8b的情况下分化的细胞，以产生高水平表达预测标志物 EN1、CNPY1、SPRY1、ETV5和PAX8的尾部VM mesDA祖细胞， 如图9C所示。如图10所示，该组动物表现出功能恢复，这一点可 由对苯丙胺诱导的旋转行为的逆转和过度补偿(第22周)来证实。 由于损伤引起大鼠旋转行为，所以旋转行为减少就等于行为恢复。如 果移植物能起作用，则能消除旋转行为。相反，动物接受不含FGF8b 的情况下分化的细胞以产生STN结构域(STN RC17组)的头部VM 细胞，这些动物在苯丙胺诱导的旋转行为中未显示出功能恢复。这些 STN形成细胞中VM一般标志物的表达水平高，但预测性尾部VM 标志物表达水平低，从而验证了尾部VM标志物用于帕金森病动物 模型的体内预测结果的有效性。
讨论
细胞的临床前评估与其体内表现是相关的，因为对于中枢神经 系统的紊乱而言，是使用未成熟祖细胞进行移植的，这些祖细胞是在 体内移植后进行终末分化和成熟的。移植的祖细胞只有在体内几个月 后才能起作用。这使得在移植之前评估细胞的治疗潜力变得很复杂。 因此，希望的是能够基于移植前的祖细胞的体外特征来预测移植细胞 的体内成熟。
据发现，TH+神经元的体外分化与体内TH+神经元的形成无关。 还已经发现：尽管通常用于鉴定发育过程中和干细胞培养中的 mesDA祖细胞的FOXA2、LMX1A和CORIN对于移植后的多巴胺分 化是必需的，但它们还不足以用于体内预测细胞的产量或功能。这就 凸显了验证可以预测体内细胞功能成熟的标志物，而不是仅依赖于在 特定细胞系中分化的祖细胞中表达的标志物的需要。
当采用无偏见的方法鉴定成功移植物结果的预测标志物时，发 现由接近MHB的中脑细胞表达的标志物(即EN1、ETV5、CNPY1、 PAX8和SPRY1)与成功移植结果相关，而间脑结构域表达的标志物， 如EPHA3，与移植结果呈负相关。这些发现与最近在小鼠模型中的 研究一致，表明mesDA和STN神经元谱系之间非常密切的关系。而 许多关键的转录因子，包括LMX1A、LMX1B、CORIN、FOXA1、 FOXA2、FOXP1、FOXP2、MSX1、NURR1和PBX1都是在两个谱 系中共有的，只有mesDA谱系可以通过EN1和CNPY1的表达来鉴 定，其仅局限于腹侧中脑的尾部。
基于对这些标志物的分析，证实了腹侧中脑形成培养物含有 STN和mesDA祖细胞，并且当祖细胞仅通过移植的LMX1A、FOXA2 和OTX2的高共表达来限定时，它们在每个批次中的相对比例可能有 助于已经观察到的但此前不明原因的体内结果的差异。
通过在分化祖细胞阶段定时递送外源FGF8b来微调形成模式以 富集多巴胺能祖细胞。依据这一点，以及一些其他调整，保证了制定 一个完整的GMP分化实验方案，用于生产mesDA祖细胞。该GMP 实验方案的关键是使用LN-111，一种生理相关的细胞外基质成分，其通常在发育中的脑中表达，并已发现其支持分化的神经祖细胞而不 支持多能干细胞的附着。
通过对移植了人胎腹侧中脑组织的帕金森病患者死后进行的脑 分析，可以确定：移植物中含有约100,000个移植的TH+神经元这一 点与患者的临床益处有显著关联。与研究级实验方案相比，使用基于 层粘连蛋白的GMP实验方案，在分化开始时每个hESC中获得的 mesDA祖细胞数大大增加，使得移植结果与研究级方案的最佳分化 相匹配。由于从预测标志物高的细胞批次中移植的每100,000个祖细 胞平均有约5000至6000个成熟的DA神经元，因而即使在不需要自 动培养系统的小型GMP实验室中，为几百名患者手工生产细胞也可 以实现。这里提出的实验方案省略了其他干细胞临床治疗相关的许多 大规模生产问题。
此外，在实施例11和图10中已经验证了GMP实验方案的体内 功效以及上述新鉴定的标志物的预测能力。由于多巴胺能6-OHDA 损伤引起动物旋转，所以旋转行为的下降可认为等同于行为恢复。如 果移植物导致旋转行为下降到或低于基线0，就可以认为是具有功能。
通过已经移植到大鼠模型中的大量细胞批次的全基因分析，建 立了一组在祖细胞阶段更准确地体外预测成功移植结果的标志物。更 好地预测移植物结果的能力将加速干细胞向临床应用的进展，并且可 以用于批次间的可比性以及比较不同临床试验中移植的细胞。长期来 看，能更好地预测在祖细胞水平的细胞体内成熟和功能特性，将有助 于使用自体或单独匹配的细胞进行移植。
应充分意识到，上述公开方案的变体和其他特征、功能或替代 方案可以组合出成许多其他的不同系统或用途。各种可能由本领域技 术人员做出的、目前尚未预见到或未预料到的替代方案、修饰、变体 或改进，也应涵盖在以下权利要求书中。
序列表
<110> BioLamina AB
<120> 预测成功移植的尾部腹侧中脑标志物
<130> LCTI 200040USP3
<160> 58
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 1
ggggaccaca acatgctgct cc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 2
aatgcactgc ctgcgtaggc tg 22
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 3
ccttgcacat gccggag 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 4
gcacagagcc tcgcctt 17
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 5
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<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 6
agaaataagg cgacgggaac at 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 7
ggagattacg agtagccgtg ag 22
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<211> 22
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<213> 人（Homo sapiens）
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<213> 人（Homo sapiens）
<400> 9
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<213> 人（Homo sapiens）
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<213> 人（Homo sapiens）
<400> 20
gccgacgtgg tgccgttgta 20
<210> 21
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<213> 人（Homo sapiens）
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<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
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<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
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<213> 人（Homo sapiens）
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<213> 人（Homo sapiens）
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<213> 人（Homo sapiens）
<400> 58
tgcagggaga aaggagagaa 20

Claims (3)

1.一种诱导产生尾部腹侧中脑祖细胞的方法，其包括：
将胚胎干细胞铺板接种于含有层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-421、层粘连蛋白-511或层粘连蛋白-521的基底上，以产生尾部腹侧中脑祖细胞，
其中所述干细胞在含有N2培养基、TGF-β抑制剂、头蛋白、声猬蛋白和GSK3抑制剂并且不含B27补充剂的初级培养基中进行培养，其中所述TGF-β抑制剂以5μM至15μM的浓度存在，所述头蛋白以50 ng/ml至150 ng/ml的量存在，所述GSK3抑制剂以0.2μM或更高的浓度存在，所述声猬蛋白以至少50 ng/ml的量存在，
其中去除所述初级培养基并加入二级培养基，所述二级培养基含有N2培养基和以50ng/ml至150 ng/ml的量的成纤维细胞生长因子8b（FGF8b），且不含B27补充剂，
其中所述二级培养基在铺板接种后156小时至228小时内加入，
其中除去所述二级培养基，并重新铺板接种干细胞，
其中所述重新铺板接种在铺板接种后252小时至276小时内进行，
其中所述重新铺板接种使用含有B27培养基、ROCK抑制剂、FGF8b、脑源性神经营养因子（BDNF）和抗坏血酸的三级培养基进行，其中所述ROCK抑制剂以5μM至15μM的浓度存在，所述FGF8b以50 ng/ml至150 ng/ml的量存在，所述BDNF以5 ng/ml至30 ng/ml的量存在，和所述抗坏血酸以0.1 mM至0.5 mM的浓度存在，和
其中所述干细胞随后在四级培养基中培养，所述四级培养基含有B27培养基、FGF8b、脑源性神经营养因子（BDNF）和抗坏血酸，其中所述FGF8b以50 ng/ml至150 ng/ml的量存在，所述BDNF以5 ng/ml至30 ng/ml的量存在，和所述抗坏血酸以0.1 mM至0.5 mM的浓度存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞在四级培养基中培养直至铺板接种后324小时至396小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞在四级培养基中培养持续108小时至132小时的时间段。
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