CN111213057A - 用于底板中脑多巴胺能祖细胞的单细胞蛋白质表达谱分析的方法 - Google Patents

用于底板中脑多巴胺能祖细胞的单细胞蛋白质表达谱分析的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于分析包含人底板mesDA祖细胞的细胞组合物的体外方法，所述方法包括：a)使所述细胞组合物的细胞或其样品的细胞接触对抗原FOXA2，OTX2，PAX6，和NKX6.1具有特异性的抗原结合分子，由此标记所述细胞组合物或所述样品的细胞；b)测定被所述抗原各自的所述抗原结合分子标记的所述细胞的百分比，并且其中如果所述细胞组合物的细胞的蛋白质表达谱是如下，则所述细胞有资格作为人底板mesDA祖细胞：80‑100％的所述细胞呈FOXA2阳性，80‑100％的所述细胞呈OTX2阳性，小于10％的所述细胞呈PAX6阳性，并且小于10％的所述细胞呈NKX6.1阳性。还提供了用于所述方法的包括所述抗原结合分子的试剂盒。

Description

用于底板中脑多巴胺能祖细胞的单细胞蛋白质表达谱分析的 方法
产生本发明的工作已从European Union Seventh Framework Programme FP7/2007-2013在拨款方案No.602278下获得资金。
技术领域
本发明涉及用于在单细胞水平上分析人底板(floorplate)中脑多巴胺能祖细胞的蛋白质表达谱(expression profile)的方法。
背景技术
中脑多巴胺能(DA)神经元分泌神经递质多巴胺，在不同的大脑功能(例如认知，记忆处理，运动控制和运动)中发挥中枢作用。它们是在三种不同的细胞核中发现：黑质致密部(substantia nigra pars compacta)(A9组)，腹侧被盖区(ventral tegmental area)(A10组)和脑红核后区域(retrorubral field)(A8组)。中脑的黑质致密部(SNpc)中的A9组的细胞体使尾壳核(caudate putamen)、背侧纹状体(dorsalateral striatum)受神经支配，并形成黑质纹状体通路，其通过从突出多巴胺能神经元控制释放多巴胺而调节运动功能。A9多巴胺能神经元在黑质中的变性是多巴胺系统的功能障碍和描述为紊乱帕金森氏病(PD)的多种运动特征的主要原因。虽然PD还涉及其他神经元亚型的变形，但是黑质致密部多巴胺能神经元的丧失是PD症状的主要原因，并已成为细胞替代治疗的主要目标。
在胎儿发育过程中，这些DA神经元的祖细胞在发育中的中脑的腹侧神经管中形成。来自所谓的底板区域的祖细胞的特征在于转录因子FOXA2，LMX1A和OTX2的表达。这些细胞产生DA SNpc神经元(A9组)和DA腹侧被盖区神经元(A10组)。已表明，从胎儿中脑中解剖出并被移植到帕金森病患者的纹状体中的胎儿细胞，可以在功能上使纹状体重新受神经支配并恢复多巴胺能神经元的功能(Barker，2013；Kefalopoulou，2014)。但是，胎儿DA祖细胞有限的可得性和使用这种组织的伦理以及后勤顾虑强调了替代细胞来源的必要性。
在过去的几年中，确定了对多能干细胞(PSC)或诱导性多能干细胞(iPSC)成功分化为腹侧中脑(mes)多巴胺能(DA)祖细胞至关重要的因素，并导致了用于产生治疗相关的mesDA神经元的体外分化方案的各种方案(Kriks，2011；Kirkeby，2012；Kirkeby，2013；Grealish，2014；Kirkeby，2017)，这是PD背景下用于临床应用的最有希望的细胞群，因为它类似于交配后(post coitum)第6-7.5周人胚胎的腹侧中脑的更复杂组成(EP3061809)。
不同的研究表明，从胚胎干细胞分化的mesDA祖细胞在以下方面具有与衍生自人胎儿腹侧中脑的细胞相同的特征：i)亚型特异性成熟；ii)大鼠帕金森模型中的整合和投射能力；iii)经调节的DA释放；和iv)帕金森症状的功能恢复(Grealish，2014；Kirkeby，2012)。
方案是基于通过化学抑制糖原合酶激酶3(GSK3)以诱导WNT信号传导用于尾状模式化(caudalised patterning)为中脑命运和激活声波刺猬(SHH)信号传导用于模式化为腹侧命运而对神经转化和区域化的双重SMAD抑制(Kirkeby，2013)。
尽管为产生多巴胺能神经元祖细胞优化了方案，但制造的细胞批次中的差异仍不可避免。已知体外分化的细胞培养物可含有具有不想要的细胞命运或分化阶段的细胞，因为分化过程是高度复杂且敏感的程序，其中实验结果可受到轻微变化的影响(例如，取决于用户的操作变化，细胞密度，分化开始之前的起始细胞组合物中的变化，例如细胞系、传代数和培养条件，和生长因子效价)。
因此，在GMP级PSC/iPSC衍生mesDA神经元的产生内的一种需要是用于全面细胞产物表征的可靠体外测定方法的建立，其允许确定细胞批次的身份和纯度。而且，该测定方法必须与细胞植入并成熟为中脑多巴胺能神经元的潜力相关联，以及揭示潜在的致瘤性。
通常将中脑底板标记物(如LMX1A，FOXA2和OTX2)用于在植入之前确认细胞的身份。最近，Kirkeby等确定了一组体外标记物，其允许通过qRT-PCR预测成功的细胞植入(Kirkeby等，2017)。除了LMX1A，FOXA2和OTX2以外，成功植入结果的预测标志物为EN1，ETV5，CNPY1，PAX8和SPRY1。而且，间脑区域标志物，如EPHA3，FEZF1和WNT7B与负相关的植入结果相关。然而，在mRNA水平上对大量细胞分析了表达。这具有几个缺点。首先，公知基因的mRNA表达水平仅反映其表达为蛋白质或作为蛋白质存在的潜力。基于众多转录后调控机制、翻译后修饰以及蛋白质和mRNA的不同稳定性和流动率，mRNA到实际蛋白质的转换可或不可发生，且如果其发生，其可导致众多不同的、略有变化的形式的给定蛋白质。而且，尽管在给定时刻可能无法检测到基因的mRNA，但相应的蛋白质仍可以存在数周或甚至数月。因此，不可能通过阳性或阴性地检测相应的mRNA来不可改变地预测某种形式的蛋白质的存在。重要的是，在免除调节性RNA和核酶的情况下，只有蛋白质而不是其相应的mRNA发挥影响细胞状态及其环境的功能。其次，对大量细胞的测量不反映单个细胞的真实状态，而是生成水平化的结果，其甚至可能不在单个细胞中存在。但是，由于给定混合物中只有一部分细胞可能是感兴趣的或有危险的细胞，因此主体分析不具有允许真实且定量地描述细胞混合物中不同表型的细胞的灵敏度和区分能力。另外，使用基于PCR的技术的方法是费时且易受污染的。
总之，需要允许在单个细胞的蛋白水平上的定量读出，并且预测底板mesDA祖细胞在移植到受试者之后的成功细胞处理和植入的方法。
发明内容
本发明描述了一种新用户友好的标准化方法，用于底板mesDA祖细胞在单细胞水平上的蛋白质谱分析，其也可以在GMP条件下使用。预料不到地，我们发现了在蛋白质水平上允许清楚地描述细胞表型的标记物组合。对阳性和阴性底板mesDA祖细胞标记物具有特异性的抗原结合分子如抗体-荧光染料缀合物用于例如流式细胞术，其第一次允许分化的底板mesDA祖细胞在大约2.5小时内的单细胞、定量、标准化蛋白质谱分析，用于识别细胞产物的身份。
该组由抗原结合分子组成，例如对本文公开的mesDA神经元的一些或全部阳性和阴性标记物具有特异性的单克隆抗体克隆(阳性标记物：FOXA2，OTX2，CD47，NKX2.1；阴性标记物：OCT3/4，PAX6，SOX1，NKX6.1，KI-67)。对一些或所有这些细胞标记物为阳性或阴性的细胞的百分比描绘了细胞表型和纯度的清晰图画。
我们进一步发现，在中脑的基板中以及在发育中的胚胎的后脑中表达的标记物NKX6.1是令人惊讶地有效的标记物，用于检测分化的干细胞群体中的后脑祖细胞的存在。因此，NKX6.1用作阴性标记物以将侧中脑和后脑细胞与中脑底板模式化细胞区分开。此外，令人惊讶地，我们发现，与PCR相比，通过流式细胞术在蛋白质水平评估时，标记物NKX2.1不同地表达。虽然底板中脑多巴胺能神经元中不存在NKX2.1 mRNA，但我们已经看到，转化为人mesDA祖细胞后，仍有相当大百分比的NKX2.1阳性细胞。因而NKX2.1在蛋白质水平上的定量可以监测底板中脑祖细胞在培养物中的潜在的批与批之间的变化。
总之，我们首次证明，标记物的定量和组合以及如本文公开的相应的百分比允许在细胞在细胞替代疗法中施用于患有PD的患者之前，确定体外产生的底板mesDA祖细胞有资格：
·FOXA2(80-100％，优选90-100％)，
·OTX2(80-100％，优选90-100％)，
·PAX6(低于10％，优选低于5％)，
·NKX6.1(低于10％，优选低于5％)，
·任选地，NKX2.1(5-90％，优选5-70％)，
·如果细胞是从OCT3/4阳性细胞产生，则任选地，OCT3/4(低于0.1％)。
该组合可以扩展到以下三个标记物中的至少一个(或全部)：
·KI-67(10-90％)，
·IAP(80-100％，优选90-100％)，
·SOX1(低于10％，优选低于5％)。
附图说明
图1
人胎儿大脑的示意图和标记物表达：
可以将神经管沿嘴端-尾端(rostro-caudal)轴和背侧-腹侧(dorso-ventral)轴细分为不同区域。神经管的最嘴端部分称为前脑，之后是中脑，而最尾端部分形成后脑。神经管的最腹侧部分称为底板。不同大脑区域的细胞的特征在于特异性标记物表达(前脑：PAX6，OTX2，NKX2.1，腹侧中脑：FOXA2，OTX2，NKX2.1，后脑：NKX6.1)。
图2
示意性分化方案：
人ES细胞和iPS细胞通过明确的方案分化为底板mesDA祖细胞。方案是基于通过CHIR99021抑制糖原合酶激酶3(GSK3)以诱导WNT信号传导用于嘴端-尾端模式化和激活声波刺猬(SHH-C24II)用于腹侧模式化而对神经转化和区域化的双重SMAD抑制(Kirkeby，2012，2013)。针对神经诱导(培养基1)、神经增殖(培养基2)和神经分化(培养基3)优化不同的培养基。所描述的方案遵循贴壁分化过程。取决于所用细胞系，可以修改方案，例如添加Y-27632代替thiazovivin和在第1天以及第11天添加Y-27632。
图3
分化为底板mesDA祖细胞的人胚胎干细胞的FOXA2，OTX2，NKX6.1和PAX6表达的流式细胞术分析。
图4
分化为底板mesDA祖细胞的诱导多能干细胞的FOXA2，OTX2，NKX6.1，和PAX6表达的流式细胞术分析。
图5
在分化16天后，朝向腹侧前脑、背侧前脑或腹侧后脑细胞模式化的多能干细胞衍生神经祖细胞培养物的FOXA2，OTX2，NKX6.1，PAX6，OCT3/4，NKX2.1，IAP，KI-67和SOX1表达的流式细胞术分析。
朝向底板mesDA细胞分化的多能干细胞培养物在分化4，8，11和16天后的FOXA2，OTX2，NKX6.1，PAX6，OCT3/4和NKX2.1表达的流式细胞术分析。
图7
在分化11天后，底板mesDA祖细胞的FOXA2，OTX2，NKX6.1和PAX6表达的免疫细胞化学分析。
具体实施方式
本发明公开了可用于通过测定细胞的关于如本文所公开的所述细胞标记物的表达谱，识别细胞组合物中的人底板mesDA祖细胞或其包含所述细胞和可能的其他细胞的样品中的人底板mesDA祖细胞的细胞标记物。
在第一个方面，本发明提供了一种用于分析包含人底板mesDA祖细胞的细胞组合物的体外方法，所述方法包括：
a)使所述细胞组合物的细胞或其样品的细胞与对抗原FOXA2，OTX2，PAX6和NKX6.1具有特异性的抗原结合分子接触，从而标记所述细胞组合物或所述样品的细胞；
b)测定被所述抗原各自的所述抗原结合分子标记的所述细胞的百分比，其中如果所述细胞组合物的细胞的蛋白质表达谱是如下，则所述细胞有资格作为人底板mesDA祖细胞：
80-100％，优选90-100％的所述细胞呈FOXA2阳性，
80-100％，优选90-100％的所述细胞呈OTX2阳性，
小于10％，优选小于5％的所述细胞呈PAX6阳性，并且
小于10％，优选小于5％的所述细胞呈NKX6.1阳性。
所述抗原结合分子可以与荧光团缀合。
所述细胞组合物或所述样品的细胞可以在抗原是转录因子时在与所述抗原结合分子接触之前用固定剂和去污剂处理，因此所述细胞组合物或所述样品的细胞(步骤a)可以是固定的和透化的细胞。
所述细胞组合物或所述样品的细胞与对抗原FOXA2，OTX2，PAX6和NKX6.1具有特异性的荧光团缀合抗原结合分子的接触可以连续地进行，例如首先使对FOXA2具有特异性的荧光团缀合抗原结合分子与所述细胞组合物或其样品的细胞接触，随后可以测定被对FOXA2具有特异性的所述抗原结合分子标记的所述细胞的百分比，随后是对如本文所公开的下一个标记物具有特异性的下一个荧光团缀合抗原结合分子，以此类推。可以在使对第二抗原具有特异性的第二抗原结合分子与所述细胞组合物或其样品的细胞接触之前，将对第一抗原具有特异性的抗原结合分子从所述细胞组合物或其样品的细胞去除，以此类推。或者，将方法的步骤a)中提供的细胞组合物或其样品细分为多个子样品，并且使对如本文公开的标记物之一具有特异性的每种抗原结合分子与单个子样品的细胞接触。或者，当所使用的抗原结合分子缀合至允许并行检测标记细胞的不同检测部分，例如荧光团时，步骤a)中提供的相同细胞组合物或其样品或该方法的子样品被同时用于对如本文公开的标记物具有特异性的一些或全部抗原结合分子。
所述方法，其中在步骤a)中，如果所述细胞组合物或其所述样品的所述细胞衍生自OCT3/4阳性细胞，则所述细胞组合物或其所述样品的细胞另外与对抗原OCT3/4具有特异性的抗原结合分子接触，并且其中在步骤)中，所述细胞组合物或其所述样品的细胞的蛋白质表达谱另外包括：
小于0.1％的所述细胞组合物或其所述样品的细胞呈OCT3/4阳性。
对抗原OCT3/4具有特异性的所述抗原结合分子可以与荧光团缀合。
所述方法，其中在步骤a)中使所述细胞组合物或其所述样品的细胞另外与对抗原NKX2.1具有特异性的抗原结合分子接触，并且其中在步骤b)中，所述细胞组合物或其所述样品的细胞的蛋白质表达谱另外包括：
5-90％，优选5-70％的所述细胞组合物或其所述样品的细胞呈NKX2.1阳性。
对抗原NKX2.1具有特异性的所述抗原结合分子可以与荧光团缀合。
所述方法，其中在步骤a)中使所述细胞组合物或其所述样品的细胞另外与对抗原KI-67具有特异性的抗原结合分子接触，并且其中在步骤b)中，所述细胞组合物或其所述样品的细胞的蛋白质表达谱另外包括：
10-90％的所述细胞组合物或其所述样品的细胞呈KI-67阳性。
对抗原KI-67具有特异性的所述抗原结合分子可以与荧光团缀合。
所述方法，其中在步骤a)中使所述细胞组合物或其所述样品的细胞另外与对抗原IAP具有特异性的抗原结合分子接触，并且其中在步骤b)中，所述细胞组合物或其所述样品的细胞的所述蛋白质表达谱另外包括：
80-100％，优选90-100％的所述细胞组合物或其所述样品的细胞呈IAP阳性。
对抗原IAP具有特异性的所述抗原结合分子可以与荧光团缀合。
所述方法，其中在步骤a)中使所述细胞组合物或其所述样品的细胞另外与对抗原SOX1具有特异性的抗原结合分子接触，并且其中在步骤b)中，所述细胞组合物或其所述样品的细胞的所述蛋白质表达谱另外包括：
小于10％，优选小于1％的所述细胞组合物或其所述样品的细胞呈SOX1阳性。
对抗原SOX1具有特异性的所述抗原结合分子可以与荧光团缀合。
所述方法，其中在步骤a)中，使所述细胞组合物或其所述样品的细胞另外与对选自抗原KI-67，IAP和SOX1的抗原具有特异性的至少一种抗原结合分子接触，并且其中在步骤b)中，所述细胞组合物或其所述样品的细胞的蛋白质表达谱另外包括：
如果在步骤a)中使用了对KI-67具有特异性的抗原结合分子，则10-90％的所述细胞组合物或其所述样品的细胞呈KI-67阳性，
如果在步骤a)中使用了对IAP具有特异性的抗原结合分子，则80-100％，优选90-100％的所述细胞组合物或其所述样品的细胞呈IAP阳性，
如果在步骤a)中使用了对SOX1具有特异性的抗原结合分子，则小于5％，优选小于1％的所述细胞组合物或其所述样品的细胞的呈SOX1阳性。
所述抗原结合分子可以与荧光团缀合。
所述方法，其中测定被所述抗原各自的所述抗原结合分子标记的所述细胞组合物或其所述样品的细胞的百分比是通过流式细胞术或免疫细胞化学进行。
所述方法，其中所述包含人底板mesDA祖细胞的细胞组合物是通过从人细胞体外分化的方法产生的或在由此产生的过程中，所述细胞可以转换为人底板mesDA祖细胞。可以转换为底板mesDA祖细胞的所述人细胞可以选自人iPS细胞，人胚胎干细胞或直接重编程人体细胞。
所述抗原结合分子可以是抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本发明提供了用于分析人底板mesDA祖细胞的蛋白质谱的试剂盒，其包括对抗原FOXA2，OTX2，PAX6和NKX6.1具有特异性的抗原结合分子。
所述试剂盒，其中所述试剂盒另外包括对抗原Oct3/4具有特异性的抗原结合分子。
所述试剂盒，其中所述试剂盒另外包括对抗原NKX2.1具有特异性的抗原结合分子。
所述试剂盒，其中所述试剂盒另外包括对抗原KI-67具有特异性的抗原结合分子。
所述试剂盒，其中所述试剂盒另外包括对抗原IAP具有特异性的抗原结合分子。
所述试剂盒，其中所述试剂盒另外包括对抗原SOX1具有特异性的抗原结合分子。
所述试剂盒，其中所述试剂盒另外包括对选自用于抗原KI-67，IAP和SOX1的抗原的抗原具有特异性的至少一种抗原结合分子。
所述抗原结合分子可以与荧光团缀合。
从包含可转化为人底板mesDA祖细胞的细胞例如多能干细胞的起始细胞组合物产生人底板mesDA祖细胞在本领域中是公知的并且公开于例如Kriks，2011；Kirkeby，2012；Kirkeby，2013；Grealish，2015年；Kirkeby，2017。
定义
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。术语“包含人底板mesDA祖细胞的细胞组合物”是指(完整)细胞组合物或其样品，其包含人底板mesDA祖细胞和其它细胞，例如，以任何比率与其他神经身份一起。
所述包含人底板mesDA祖细胞的细胞组合物可以是通过从人细胞体外分化的方法产生的或在由此产生的过程中，所述细胞可以转换为人底板mesDA祖细胞。
使用本领域公知的分化或直接重编程的方案，例如Kriks，2011；Kirkeby，2012；Ladewig，2012；Kirkeby，2013；Grealish，2015；Kirkeby，2017中的，所述细胞组合物的人底板mesDA祖细胞可以衍生自人细胞，例如人iPS细胞，人胚胎干细胞或直接重编程人体细胞，其可以转换为人底板mesDA祖细胞。如本文公开的本发明方法可以用于监测和/或识别在干细胞分化为有资格作为人底板mesDA祖细胞的细胞的该过程中的细胞的状态。
在分析包含人底板mesDA祖细胞的细胞组合物的上下文中，术语“分析”意指，例如，通过测定所述细胞组合物或所述样品的细胞的如本文所公开的表达谱，识别细胞组合物或样品中的人底板mesDA祖细胞。
可以从包含人底板mesDA祖细胞的(完整)细胞组合物取样品，例如一个或多个等分试样。然后，如本文公开的方法可包括步骤a)之前的“提供来自所述细胞组合物的样品”的步骤。
如本文所用，术语“测定被所述抗原各自的所述抗原结合分子标记的所述细胞的百分比，即所述细胞组合物或其所述样品的细胞的百分比”是指测定细胞组合物中或取自细胞组合物的样品中的细胞的数量，所述细胞例如是针对相应抗原用荧光标记的，例如，如果在所述细胞组合物或所述样品中，10个细胞中的9个对抗原FOXA2作标记，则细胞组合物或样品中90％的细胞呈FOXA2阳性，如果在相同细胞组合物或样品中，10个细胞中的8个对抗原OTX2作标记，则相同细胞组合物或样品中80％的细胞还呈OTX2阳性。这与确定是否一些或所有细胞对标记物为双重阳性无关。
如本文所用，术语“有资格作为(qualify as)人底板mesDA祖细胞”是指能够在移植到患有PD的受试者之后，在功能上使纹状体重新受神经支配并恢复多巴胺能神经元的功能，以至少部分地使帕金森症状恢复的离体细胞。
术语“包含人底板mesDA祖细胞的细胞组合物是通过从人细胞体外分化的方法产生的或在由此产生的过程中，所述人细胞可以转换为人底板mesDA祖细胞”是指曾对其或对其应用包括对于成功分化为底板mesDA祖细胞关键的因素的分化方案的细胞群的细胞。因此，该方法允许使多能性细胞分化为人底板mesDA祖细胞，但也可含有具有不想要的细胞命运或分化阶段的细胞。
可转化为人底板mesDA祖细胞的人细胞可以是OCT3/4阳性人iPS细胞，OCT3/4阳性人胚胎干细胞或OCT3/4阴性直接重编程人体细胞。如例如WO03/046141中公开的，可以从胚胎分离人胚胎干细胞而没有破坏。
如本文所用，术语“多能干细胞”是指能够自我更新并具有分化为任何胚胎胚层：内胚层、中胚层和外胚层，以及从其衍生的细胞的潜能的细胞。这些标准对胚胎干细胞(ESC)和诱导性多能干细胞(iPSC)适用。优选地，这些细胞是人的。不同程度的多能性在本领域中是已知的，称为“始发状态(primed state)”多能干细胞，“原始状态(naive state)”多能干细胞或“复位阶段(reset stage)”多能干细胞。
如本文所用，术语胚胎干细胞(ESC)是指衍生自植入前的早期囊胚的内部细胞团的多能干细胞。ESC能够自我更新，并具有分化为任何胚胎胚层：内胚层、中胚层和外胚层以及从其衍生的细胞的潜能。ESC显示多能性标记物OCT3/4的表达。
如本文所用，术语“诱导多能干细胞(iPSC)”是指通过将具有较低潜能的细胞(即，更加分化的细胞，通常是体细胞)转化为多能状态而产生的多能细胞，所得细胞能够自我更新，并具有分化成任何胚胎胚层：内胚层、中胚层和外胚层以及从其衍生的细胞的潜能。iPSC显示多能性标记物OCT3/4的表达。重编程可通过本领域已知的方法(例如核转移，细胞融合，或因子诱导重编程，即一种或多种重编程因子的诱导表达，例如但不限于OCT3/4，SOX2，KLF4，C-MYC，NANOG，LIN28等)实现。重编程因子可以是作为核酸引入，或者通过病毒转导或通过转染作为蛋白质引入。不同的培养条件和重编程因子的组合可导致不同程度的多能性，称为“始发状态”多能干细胞，“原始状态”多能干细胞或“复位阶段”多能干细胞。
如本文所用，术语“人底板中脑多巴胺能祖细胞(mesDA)”是指特征在于FOXA2(80-100％)，OTX2(80-100％)，PAX6(低于10％)，NKX6.1(低于10％)的表达的体外分化细胞。这种组成反映了高纯度的mesDA祖细胞，其谱类似于交配后第6-7.5周人胚胎的腹侧中脑中存在的mesDA祖细胞，并且它是PD治疗背景下用于临床应用的最有希望的细胞群。
细胞可以体外衍生自不同的起始细胞组合物，例如但不限于胚胎干细胞，诱导多能干细胞，可重编程体细胞。
如本文所用，术语“分化”是指细胞分化，其是发育生物学中使用的术语，描述了将较低专门化的细胞变为更加专门化的细胞类型的过程。在体外，干细胞的分化可以自发发生，或者通过向培养基中添加分化诱导物质(例如专门的培养基，细胞因子，受体拮抗剂或小分子)而有意地诱导。
同样，培养基质，即细胞培养制品的涂层，可以通过提供与细胞接触的不同蛋白质或化合物而用于使分化过程偏向。
如本文所用，术语“标记物”是指由某种细胞类型特异性表达的细胞抗原。标记物可以是如本文公开的阳性选择标记物，例如FOXA2，IAP，NKX2.1和OTX2，或者可以是如本文使用的阴性选择标记物，例如OCT3/4，PAX6，SOX1，NKX6.1，KI-67。
如本文所用，术语“表达”定义为在细胞中由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
细胞群或细胞组合物或其样品的细胞的“蛋白质表达谱”或“蛋白质特征”指示这些细胞表达哪些基因。
如本文所用，术语“缀合至荧光团的抗原结合分子”是指抗原结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，与荧光团的偶联或缀合。在某些情况下，缀合是抗原结合分子与荧光团的直接偶联或结合。在其他情况下，缀合是抗原结合分子与荧光团的间接偶联或结合，例如通过生物素和链霉抗生物素蛋白。抗原可以与抗原结合分子(例如，第一抗体)结合，具有缀合的荧光团的第二分子(例如，第二抗体)然后可以与该抗原结合分子结合。
用于分析的方法包括例如基于流式细胞术的方法或荧光显微镜法。
流式细胞术是基于激光或阻抗的生物物理技术，通过将例如细胞悬浮在流体流中并使其通过电子检测设备，在例如细胞分选和生物标记物检测中使用。它允许对高达每秒数千个粒子的物理和化学特性同时进行多参数分析。荧光激活细胞分选(FACSTM)是流式细胞术的一种特殊类型。它提供了基于每个细胞的特定光散射和荧光特性，将生物细胞的异质混合物一次一个细胞分选到两个或更多个容器中的方法。免疫细胞化学(ICC)是一种常见的实验室技术，其用于通过使用例如与其结合的特异性第一抗体来解剖学地可视化特定蛋白质或抗原在细胞中的定位。当第一抗体直接缀合至荧光团或通过例如具有缀合的荧光团的第二抗体结合时，第一抗体允许在荧光显微镜下可视化该蛋白质。ICC允许评估特定样品中的细胞是否表达所讨论的抗原。
如本文所用，术语“抗原结合分子”是指优先结合细胞的期望靶分子即抗原或对其具有特异性的任何分子。术语“抗原结合分子”包括例如抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“抗体”是指多克隆或单克隆抗体，其可以通过本领域技术人员公知的方法产生。抗体可以是任何物种的，例如鼠，大鼠，羊，人。
术语“抗体”包括完整分子和抗体片段(抗原结合片段)两者，例如Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv和单链抗体。另外，术语“抗原结合分子”包括除抗体或其抗原结合片段以外的、优先结合细胞的期望靶分子的任何分子。合适的分子包括但不限于与期望靶分子结合的称为适体的寡核苷酸，碳水化合物，凝集素或任何其他抗原结合蛋白(例如受体-配体相互作用)。抗体与荧光团之间的连接(偶联)可以是共价的或非共价的。非共价连接是例如通过生物素-抗生物素蛋白。使抗体与荧光团偶联的方法是本领域技术人员公知的。
关于抗原结合分子，例如抗体或其抗原结合片段，术语“特异性结合”或“对……具有特异性(specific for)”是指抗原结合分子(在针对抗原结合结构域的抗体或其片段的情况下)，其识别并结合本文公开的细胞组合物或样品中的特定抗原，但基本上不识别或结合所述细胞组合物或所述样品中的其他抗原。与来自一种物种的抗原特异性结合的抗体或其片段的抗原结合结构域也可以与来自另一物种的该抗原结合。这种跨物种反应性与在本文使用的“对……具有特异性”的定义并不矛盾。特异性结合抗原的抗体或其片段的抗原结合结构域也可以基本上结合所述抗原的不同变体(等位基因变体，剪接变体，异形体(isoform)等)。这种交叉反应性与该抗原结合结构域对该抗原具有特异性的定义并不矛盾。
叉头盒(Forkhead)蛋白A2(FOXA2)是在人中由FOXA2基因编码的蛋白。
同源盒(Homeobox)蛋白OTX2是在人中由OTX2基因编码的蛋白质。
配对盒(Paired box)蛋白PAX6是在人中由PAX6基因编码的蛋白质。
同源盒蛋白NKX6.1(也称为NKX6-1)是在人中由NKX6-1基因编码的蛋白质。
Oct-3/4(八聚物结合转录因子3/4，也称为Oct-3或Oct-4)是在人中由POU5F1基因编码的蛋白质。
NK2同源盒1(NKX2-1，NKX2.1或TTF-1)是在人中由NKX2-1基因编码的蛋白质。
抗原KI-67也称为Ki-67或MKI67，是在人中由MKI67基因编码的蛋白质(由单克隆抗体抗Ki-67识别的抗原)。
IAP(整合素相关蛋白)也称为CD47(分化簇47)，是在人中由CD47基因编码的跨膜蛋白。
SOX1是基因，其在HMG(高迁移率基团)DNA结合结构域中编码转录因子，并且主要在神经发生中起作用。
实施方式
在本发明的第一实施方式中，一个或多个样品取自预期包含人底板mesDA祖细胞的细胞组合物。使用例如实施例1中描述的基于胚状体(EB)的方案，所述细胞组合物的细胞从人iPS细胞体外分化为人底板mesDA祖细胞。
为了监测分化状态，在开始分化程序后的几个时间点，例如第4、6、8、11、14、16和/或18天，从所述细胞组合物取所述样品。在固定和透化后，使样品的细胞与对抗原FOXA2，OTX2，PAX6和NKX6.1具有特异性的缀合至荧光团的抗原结合分子接触，从而标记所述样品的细胞。任选地，所述一个或多个样品还与对抗原OCT3/4，NKX2.1，KI-67，IAP，SOX1具有特异性的缀合至荧光团的一种、多种或全部抗原结合分子接触。样品的细胞的蛋白质表达谱是例如通过流式细胞术测定。
显示出以下蛋白质表达谱的一个或多个样品的细胞使所述样品的细胞有资格作为人底板mesDA祖细胞：
80-100％，优选90-100％的所述样品的细胞呈FOXA2阳性，
80-100％，优选90-100％的所述样品的细胞中呈OTX2阳性，
小于10％，优选小于5％的所述样品的细胞呈PAX6阳性，
小于10％，优选小于5％的所述样品的细胞呈NKX6.1阳性，并且任选地
小于0.1％的所述样品的细胞呈OCT3/4阳性，和/或
5-90％，优选5-70％的所述样品的细胞呈NKX2.1阳性，和/或
10-90％的所述样品的细胞呈KI-67阳性，和/或
80-100％，优选90-100％的所述样品的细胞呈IAP阳性，和/或
小于10％，优选小于5％的所述样品的细胞呈SOX1阳性。
所述样品的细胞反映出已经从其取样的所述细胞组合物中的细胞的组成。因此，如果例如在分化过程后第16天取的样品显示出如上所述的蛋白质表达谱，则该细胞组合物的细胞有资格作为人底板mesDA祖细胞，可能移植到例如需要治疗帕金森病的患者中。这些细胞有资格作为具有在移植后整合到纹状体中并恢复多巴胺能神经元的功能的潜力的底板mesDA祖细胞。
在本发明的另一个实施方式中，一个或多个样品取自预期包含人底板mesDA祖细胞的细胞组合物。使用例如实施例1中所述的基于EB的方案，所述细胞组合物的细胞从人iPS细胞体外分化为人底板mesDA祖细胞。
为了监测分化状态，在开始分化程序后的几个时间点，例如第4、6、8、11、14、16和/或18天，从所述细胞组合物取所述样品。将样品的细胞细分，并与描述用于底板mesDA分化祖细胞的蛋白质表达谱分析的标记物的组合接触。
例如，将偶联至APC的对抗原FOXA2具有特异性的抗体的染色与偶联至PE的对IAP具有特异性的抗体和偶联至FITC的对OTX具有特异性的抗体组合。此外，将PAX6，OCT3/4，KI-67和NKX2.1，NKX6.1，SOX1组合，而将组合的抗体缀合至不同的荧光团。
在本发明的一个实施方式中，使用例如实施例2中所述的贴壁分化方案，细胞组合物的细胞从人多能干细胞例如iPS细胞或人胚胎干细胞体外分化为人底板mesDA祖细胞。
在几个时间点之后，如上所述测定细胞的蛋白质表达谱。所述样品的细胞反映出已经从其取样的所述细胞组合物中的细胞的组成。因此，如果例如在分化过程后第16天取的样品显示出如本发明所述的蛋白质表达谱，则所述细胞组合物的细胞有资格作为具有在移植后整合到纹状体中并恢复多巴胺能神经元的功能的潜力的底板mesDA祖细胞。
在本发明的另一个实施方式中，使用例如实施例2所述的贴壁分化方案，细胞组合物的细胞从人ES细胞体外分化为人底板mesDA祖细胞。
使完整细胞组合物与本文公开的标记物的组合接触，以进行底板mesDA分化祖细胞的蛋白质表达谱分析。
例如，将偶联至APC的对抗原FOXA2具有特异性的抗体的染色与偶联至PE的对IAP具有特异性的抗体和偶联至FITC的对OTX具有特异性的抗体组合。此外，将PAX6，KI-67和NKX2.1，NKX6.1，SOX1组合，而将组合的抗体缀合至不同的荧光团。
如果细胞组合物的细胞的染色导致如本文所公开的蛋白质表达谱，则表明分化方案允许产生治疗相关的mesDA神经元。
在本发明的一个实施方式中，通过本领域已知的方法(方案)，细胞组合物的细胞从OCT3/4阴性人体细胞直接重编程为人底板mesDA祖细胞。
为了监测分化状态，在开始分化程序后的几个时间点，例如第4、6、8、11、14、16和/或18天，从所述细胞组合物取所述样品。将样品的细胞细分，并与描述用于底板mesDA分化祖细胞的蛋白质表达谱分析的标记物的组合接触。
例如，将偶联至APC的对抗原FOXA2具有特异性的抗体的染色与偶联至PE的对IAP具有特异性的抗体和偶联至FITC的对OTX具有特异性的抗体组合。此外，将PAX6，KI-67和NKX2.1，NKX6.1，SOX1组合，而将组合的抗体缀合至不同的荧光团。
在本发明的另一个实施方式中，使用例如实施例2中描述的贴壁分化方案产生底板mesDA祖细胞，并且在分化的16天后，使用对抗原FOXA2，OTX2，PAX6和NKX6.1具有特异性的缀合至荧光团的抗原结合分子，通过免疫细胞化学进行分析。
实施例
实施例1：基于胚状体(EB)形成，人胚胎干细胞向底板mesDA祖细胞的分化，以及在 体外16天后使用流式细胞术的单细胞蛋白质谱分析
人胚胎干细胞向底板mesDA祖细胞分化。该方案改编自Kirkeby等，2012，2013。为了分化，使用TrypLE(Life Technologies，12563-029)收获人胚胎干细胞。单细胞在低附着板中接种(2×106/2ml/6孔)以在DMEM-F12:MACS Neuro(1:1)，N2补充剂(1:100；Gibco17502-48)，无维生素A的NeuroBrew-21(1:50；Miltenyi Biotec 130-097-263)，2mM L-谷氨酰胺中形成EB。ROCK抑制剂(Thiazovivin 2μΜ，Miltenyi Biotec 130-104-461)在最初两天加入。在第4天，将细胞铺板在聚鸟氨酸(PO：15μg/ml；Sigma P3655)，纤连蛋白(FN：5μg/ml；BIOPUR AG 11-50-1104)和层粘连蛋白(LN：5μg/ml；Sigma L20-20)涂覆的塑料制品上。从第0天到第9天，存在以下神经化和模式化因子：SB431542(10μM，Miltenyi Biotec130-105-336)，LDN193189(100nM，Miltenyi Biotec 130-103-925)，CHIR99021(0.8μM，Miltenyi Biotec 130-103-926)，hSHH-C24-II(200ng/ml，Miltenyi Biotec 130-095-727)。从第2天到第9天，嘌吗啡胺(purmorphamide)(0.5μΜ，Miltenyi Biotec 130-104-465)加入到培养基中。在分化的第11天，将细胞用TrypLE解离为单细胞，并以在MACS Neuro培养基，无维生素A的NeuroBrew-21(1:50)，BDNF(20ng/ml；Miltenyi Biotec 130-096-285)，GDNF(10ng/ml；Miltenyi Biotec 130-096-290)和抗坏血酸(200μM；Sigma A5960)中的10,000个细胞/μl的液滴再铺板在干燥PO/LN/FN涂覆板上。
在分化过程的第11天进行单细胞蛋白质表达谱分析。因此，用TrypLE将细胞解离为单个细胞，并与对抗原FOXA2，OTX2，PAX6和NKX6.1具有特异性的缀合至荧光团的抗体接触，从而标记所述样品的细胞。
简而言之，固定细胞并使用FoxP3缓冲液组(Miltenyi Biotec 130-093-142)透化。然后，将0.5×10E6个细胞用于采用偶联至不同荧光团的FOXA2，OTX2，PAX6和NKX6.1特异性抗体的染色，并通过流式细胞术确定阳性细胞的百分比，以分析细胞是否显示出确定它们有资格作为根据本发明的人底板mesDA祖细胞的蛋白质表达谱。
实施例2：人胚胎干细胞向底板中脑多巴胺能祖细胞的贴壁分化，以及体外16天后 使用流式细胞术的单细胞蛋白质谱分析
人胚胎干细胞(hES细胞)向底板mesDA祖细胞分化。该方案改编自Kirkeby等，2012，2013，而基于EB的方案适用于完全贴壁培养(图2)。为了分化，使用TrypLE(LifeTechnologies，12563-029)收获hES细胞。将单细胞以每12孔90,000个细胞的密度(23684细胞/cm2)在含有DMEM-F12:MACS Neuro(1:1)，N2补充剂(1:100；Gibco 17502-48)，无维生素A的NeuroBrew-21(1:50；Miltenyi Biotec 130-097-263)，2mM L-谷氨酰胺的神经诱导培养基(培养基1)中接种到层粘连蛋白-111(Biolamina，LN111)上。ROCK抑制剂(Thiazovivin2μΜ，Miltenyi Biotec 130-104-461)在最初两天加入。在第4天，将培养基更换为神经增殖培养基(培养基2)，其含有DMEM-F12：MACS Neuro(1:1)，N2补充剂(1:200)，无维生素A的NeuroBrew-21(1:100)和2mM L-谷氨酰胺。从第0天到第9天，存在以下神经化和模式化因子：SB431542(10μM，Miltenyi Biotec 130-105-336)，头蛋白(100ng/ml，Miltenyi Biotec130-103-456)，CHIR99021(0.7μM，Miltenyi Biotec 130-103-926)，hSHH-C24-II(600ng/ml，Miltenyi Biotec 130-095-727)。在第9天，添加FGF8b(100ng/ml，Miltenyi Biotec130-095-740)。在分化的第11天，将细胞用TrypLE解离为单细胞，并以800,000细胞/cm2的密度在MACS Neuro培养基，无维生素A的NeuroBrew-21(1:50)，2mM L-谷氨酰胺(培养基3)中再铺板在层粘连蛋白-111涂覆的板上。另外，添加了BDNF(20ng/ml；Miltenyi Biotec130-096-286)和抗坏血酸(200μM；Sigma A5960)(图2)。
在分化过程的第16天进行单细胞蛋白质表达谱分析。因此，用TrypLE将细胞解离为单个细胞，并与对抗原FOXA2，OTX2，PAX6和NKX6.1具有特异性的缀合至荧光团的抗体接触，从而标记所述样品的细胞。
简而言之，固定细胞并使用FoxP3缓冲液组(Miltenyi Biotec 130-093-142)透化。然后，将细胞用以下抗体缀合物染色，而每次染色均使用0.5×10E6个细胞：
-抗FoxA2-APC，
-抗Otx2-FITC，
-抗Pax6-PE，
-抗Nkx6.1-AlexaFluor647。
流式分析显示92.6％FOXA2、93.1％OTX2、0.83％PAX6和2.6％NKX6.1，阳性细胞。
总之，细胞显示出确定它们有资格作为根据本发明的人底板mesDA祖细胞的蛋白质表达谱(图3)。
实施例3：诱导多能干细胞向底板中脑多巴胺能祖细胞的贴壁分化，以及在体外16 天后使用流式细胞术的单细胞蛋白质谱分析
根据实施例2中所述的分化方案，诱导多能人干细胞(iPS细胞)向底板mesDA祖细胞分化。从第0天到第9天，存在以下神经化和模式化因子：SB431542(10μM，MiltenyiBiotec 130-105-336)，头蛋白(100ng/ml，Miltenyi Biotec 130-103-456)，CHIR99021(1μM，Miltenyi Biotec 130-103-926)，hSHH-C24-II(400ng/ml，Miltenyi Biotec 130-095-727)。在分化的第11天，用TrypLE将细胞解离为单细胞，并以800,000个细胞/cm2的密度在MACS Neuro培养基，无维生素A的NeuroBrew-21(1:50)，2mM L-谷氨酰胺(培养基3)中再铺板在层粘连蛋白-111涂覆的板上。另外，添加了FGF8b(100ng/ml，Miltenyi Biotec 130-095-740)，BDNF(20ng/ml；Miltenyi Biotec 130-096-286)和抗坏血酸(200μM；SigmaA5960)。
在分化过程的第16天进行单细胞蛋白质表达谱分析。因此，用TrypLE将细胞解离为单个细胞，并与对抗原FOXA2，OTX2，PAX6和NKX6.1具有特异性的缀合至荧光团的抗体接触，从而标记所述样品的细胞。
流式分析显示93.8％FOXA2、94.4％OTX2、1.3％PAX6和1.2％NKX6.1，阳性细胞。
总之，细胞显示出确定它们有资格作为根据本发明的人底板mesDA祖细胞的蛋白质表达谱(图4)。
实施例4：采用不同浓度的CHIR的人胚胎干细胞的贴壁分化，以及在体外16天后使 用流式细胞术的单细胞蛋白质谱分析
根据实施例2中描述的贴壁分化方案分化人胚胎干细胞。以不同浓度施加模式化因子CHIR99021(Miltenyi Biotec 130-103-926)和hSHH-C24-II(Miltenyi Biotec 130-095-727)，以使细胞向腹侧前脑、背侧前脑和腹侧后脑身份模式化。
A腹侧前脑：CHIR99021：0μM，hSHH-C24-II：800ng/ml
B背侧前脑：CHIR99021：0μM，hSHH-C24-II：0ng/ml
C腹侧后脑：CHIR99021：4μM，hSHH-C24-II：800ng/ml
在分化过程的第16天进行单细胞蛋白质表达谱分析。因此，使用TrypLE将细胞解离为单个细胞，固定并使用FoxP3缓冲液组(Miltenyi Biotec 130-093-142)透化。然后将细胞细分为三个子样品，并与对抗原FOXA2，OTX2，PAX6，NKX6.1，OCT3/4，NKX2.1，IAP，KI-67，SOX1具有特异性的缀合至荧光团的抗体接触，而0.5×10E6个细胞用于每次染色。
组合以下抗体荧光染料用于三种抗原结合分子的同时染色：
-抗FoxA2-APC，抗Otx2-FITC，抗IAP-PE
-抗Pax6-PE，抗Oct3/4-APC，抗Ki-67-FITC
-抗Nkx6.1-AlexaFluor 647，抗Nkx2.1-AlexaFluor 488，抗Soxl-PE
在不同样品中低于80％的FOXA2表达，在背侧前脑和后脑样品中>10％的PAX6表达，在腹侧前脑样品中>90％的NKX2.1表达，和在腹侧后脑样品中<80％的OTX2以及>10％的NKX6.1表达清楚地表明细胞没有显示出底板mesDA祖细胞表型，且无资格用于移植(图1，图5)。
实施例5：人胚胎干细胞向底板中脑多巴胺能祖细胞的贴壁分化，以及在体外4、8、 11和16天后使用流式细胞术的单细胞蛋白质谱分析
根据实施例2中所述的贴壁分化方案分化人胚胎干细胞。分别以0.7μM和600ng/ml的浓度施加模式化因子CHIR99021(Miltenyi Biotec 130-103-926)和hSHH-C24-II(Miltenyi Biotec 130-095-727)。
在分化过程的第4、8、11和16天进行单细胞蛋白质表达谱分析。因此，使用TrypLE将细胞解离为单个细胞，固定并使用FoxP3缓冲液组(Miltenyi Biotec 130-093-142)透化。然后将细胞细分为三个子样品，并与对抗原FOXA2，OTX2，PAX6，NKX6.1，OCT3/4，NKX2.1具有特异性的缀合至荧光团的抗体接触，而0.5×10E6个细胞用于每次染色。
组合以下抗体荧光染料用于三种抗原结合分子的同时染色：
-抗FoxA2-APC，抗Otx2-FITC
-抗Pax6-PE，抗Oct3/4-APC
-抗Nkx6.1-AlexaFluor 647，抗Nkx2.1-AlexaFluor 488
流式细胞术分析显示出细胞在分化的第4天、第8天和第16天不类似于确定它们有资格作为根据本发明的底板多巴胺能神经元的表达谱。仅有分化过程的第11天的细胞显示出确定它们有资格作为根据本发明的人底板mesDA祖细胞的蛋白质表达谱(图6)。
实施例6：用于大鼠中的移植研究的人胚胎干细胞的贴壁分化
根据实施例2中所述的贴壁分化方案分化人胚胎干细胞。分别以0.7μM和600ng/ml的浓度施加模式化因子CHIR99021(Miltenyi Biotec 130-103-926)和hSHH-C24-II(Miltenyi Biotec 130-095-727)。
在分化过程的第16天，用TrypLE将细胞解离成单个细胞。取样品、固定细胞并使用FoxP3缓冲液组(Miltenyi Biotec 130-093-142)透化。然后将细胞细分为子样品，并与对抗原FOXA2，OTX2，PAX6，NKX6.1，OCT3/4，NKX2.1，IAP，KI-67，SOX1具有特异性的缀合至荧光团的抗体接触，而0.5×10E6个细胞用于每次染色。
组合以下抗体荧光染料用于三种抗原结合分子的同时染色：
-抗FoxA2-APC，抗Otx2-FITC，抗IAP-PE
-抗Pax6-PE，抗Oct3/4-APC，抗Ki-67-FITC
-抗Nkx6.1-AlexaFluor 647，抗Nkx2.1-AlexaFluor 488，抗Soxl-PE
显示确定其有资格作为底板多巴胺能神经元的表达谱的分化活细胞的样品和不类似于确定其有资格作为底板多巴胺能神经元的表达谱的分化活细胞的样品用于移植到大鼠中的研究。第一个样品与体内移植后的良好植入和多巴胺能神经元的高产量相关，而第二个样品导致体内多巴胺能神经元的显著更低的产量。
实施例7：在分化的16天后FOXA2，OTX2，NKX6.1和PAX6表达的免疫细胞化学分析
根据实施例2中所述的贴壁分化方案分化人胚胎干细胞。分别以0.7μM和600ng/ml的浓度施加模式化因子CHIR99021(Miltenyi Biotec 130-103-926)和hSHH-C24-II(Miltenyi Biotec 130-095-727)。
然后在分化过程的第16天进行免疫细胞化学染色。因此，将细胞用4％多聚甲醛固定并使用0.2％Triton-X-100透化。因此，4个子样品与对抗原FOXA2，OTX2，PAX6和NKX6.1具有特异性的缀合至荧光团的抗体接触。
免疫细胞化学分析显示高百分比的FOXA2和OTX2阳性细胞，而细胞为PAX6和NKX6.1阴性(图7)。
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Claims (14)

1.一种用于分析包含人底板mesDA祖细胞的细胞组合物的体外方法，所述方法包括：
a)使所述细胞组合物的细胞或其样品的细胞接触对抗原FOXA2，OTX2，PAX6，和NKX6.1具有特异性的抗原结合分子，由此标记所述细胞组合物或所述样品的细胞；
b)测定被所述抗原各自的所述抗原结合分子标记的所述细胞的百分比，其中如果所述细胞组合物的细胞的蛋白质表达谱是如下，则所述细胞有资格作为人底板mesDA祖细胞：
80-100％的所述细胞呈FOXA2阳性，
80-100％的所述细胞呈OTX2阳性，
小于10％的所述细胞呈PAX6阳性，并且
小于10％的所述细胞呈NKX6.1阳性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中，如果所述细胞衍生自OCT3/4阳性细胞，则使所述细胞另外与对抗原OCT3/4具有特异性的抗原结合分子接触，并且其中在步骤b)中，所述细胞的所述蛋白质表达谱另外包括：
小于0.1％的所述细胞呈OCT3/4阳性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤a)中，所述细胞另外与对抗原NKX2.1具有特异性的抗原结合分子接触，并且其中在步骤b)中，所述细胞的所述蛋白质表达谱另外包括：
5-90％的所述细胞呈NKX2.1阳性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，使所述细胞另外与对选自抗原KI-67，IAP和SOX1的抗原具有特异性的至少一种抗原结合分子接触，并且其中在步骤b)中，所述细胞的所述蛋白质表达谱另外包括：
如果在步骤a)中使用了对KI-67具有特异性的抗原结合分子，则10-90％的所述细胞呈KI-67阳性，
如果在步骤a)中使用了对IAP具有特异性的抗原结合分子，则80-100％的所述细胞呈IAP阳性，
如果在步骤a)中使用了对SOX1具有特异性的抗原结合分子，则小于10％的所述细胞呈SOX1阳性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述抗原结合分子与荧光团缀合，并且其中测定被所述抗原各自的所述抗原结合分子标记的所述细胞的百分比是通过流式细胞术或免疫细胞化学进行。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述包含底板mesDA祖细胞的细胞组合物是通过从细胞体外分化的方法产生的或在由此产生的过程中，所述细胞可以转换为底板mesDA祖细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中可以转换为底板mesDA祖细胞的所述细胞选自人iPS细胞，人胚胎干细胞或直接重编程人体细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述抗原结合分子是抗体或其抗原结合片段。
9.一种用于分析人底板mesDA祖细胞的蛋白质谱的试剂盒，其包括对抗原FOXA2，OTX2，PAX6和NKX6.1具有特异性的抗原结合分子。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述试剂盒另外包括对抗原Oct3/4具有特异性的抗原结合分子。
11.根据权利要求9或10所述的试剂盒，其中所述试剂盒另外包括对抗原NKX2.1具有特异性的抗原结合分子。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒另外包括对抗原KI-67，IAP和SOX1具有特异性的抗原结合分子。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的试剂盒，其中所述抗原结合分子是抗体或其抗原结合片段。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的试剂盒，其中所述抗原结合分子与荧光团缀合。
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