CN111386338A

CN111386338A - 包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的制备方法及该细胞团块

Info

Publication number: CN111386338A
Application number: CN201880075772.8A
Authority: CN
Inventors: 中野德重
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2017-11-24
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2020-07-07
Also published as: AU2018371437A1; EP3715452A1; KR20200088880A; JPWO2019103125A1; SG11202004831QA; WO2019103125A1; CA3083344A1; US20210071137A1; EP3715452A4; JP7384671B2; IL274872A

Abstract

本发明的课题在于提供由多潜能干细胞有效地制备包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的手段。细胞团块的制备方法，所述细胞团块包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织，所述方法包括下述步骤(1)及(2)：(1)第一步骤，将多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块。

Description

包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的制备方法及该细胞团块

技术领域

本发明涉及由多潜能干细胞制备包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的方法及该细胞团块。

背景技术

在非专利文献1中，报告了通过将由人iPS细胞制作的聚集体在Wnt信号转导途径抑制物质及源自小鼠肉瘤的基膜制剂(基质胶)的存在下悬浮培养，制作了人角膜类器官。然而，从避免异种成分及未确定因素的混入的观点出发，迫切期望也可以不使用源自小鼠肉瘤的基膜制剂的包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的制备方法。

在非专利文献2中，报告了将人iPS细胞在平面上贴壁培养，制作了立体的晶状体。在非专利文献3中，报告了将人iPS细胞在平面上贴壁培养，二维地形成了包含中枢神经，视网膜，角膜，晶状体，表皮的集群。然而，迫切期望通过不需要实施有特定处理的容器，并能够容易地扩大规模的悬浮培养，有效地制备包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的方法。

在专利文献1中，报告了通过在不存在Wnt信号转导途径抑制物质的条件下使细胞的聚集体形成，使得到的聚集体与5nM的BMP4进行长时间作用，在无血清培养基中悬浮培养，由此立体地形成了角膜、晶状体等前眼部组织。

然而，由于重组蛋白质(BMP4)的价格昂贵，因此迫切期望也可以不将重组蛋白质以高浓度长时间使用的制备包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2015/020091

非专利文献

非专利文献1：Foster et al.Scientific Reports，7，2017.

非专利文献2：Fu et al.Investigative Ophthalmology&Visual Science，58.1，2017∶517-527.

非专利文献3：Hayashi et al.Nature，531.7594，2016∶376-380.

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的在于提供由多潜能干细胞有效地制备包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的手段。特别是提供通过可以将经无饲养细胞条件下培养的多潜能干细胞作为起始材料，降低昂贵的重组蛋白质的使用量由此进行便宜的制备，由此有效地制备细胞团块的手段。

解决问题的手段

本发明人在为解决上述问题进行反复研究时，发现通过在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，添加BMP信号转导途径作用物质，由此可有效地制备一并包含神经组织、神经系统细胞和非神经上皮组织的细胞团块。进一步发现，通过将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，用1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径作用物质处理，可改善细胞团块的制备效率。此外，通过将BMP信号转导途径作用物质的添加条件最优化，鉴定从悬浮培养开始72小时以内的所谓最适添加时期，成功进行了通过比以往更低浓度的BMP4导致的包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的诱导分化。

即，本发明涉及以下内容。

[1]细胞团块的制备方法，所述细胞团块包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织，所述方法包括下述步骤(1)及(2)；

(1)第一步骤，将多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；

(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块。

[2]细胞团块的制备方法，所述细胞团块包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织，所述方法包括下述步骤(a)、(1)及(2)；

(a)a步骤，将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中维持培养，

(1)第一步骤，将在a步骤中维持培养的多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成，

[3]根据上述[1]或[2]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述步骤(2)中的BMP信号转导途径作用物质在从上述步骤(1)中多潜能干细胞的悬浮培养开始时的0.5小时以后72小时以内进行添加。

[4]根据上述[1]或[2]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述步骤(2)中的BMP信号转导途径作用物质在由上述步骤(1)形成的聚集体的表层的细胞的1成以上形成紧密连接的时期内进行添加。

[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，上述BMP信号转导途径作用物质为选自：BMP2，BMP4，BMP7，BMP13及GDF7中的至少一种蛋白质。

[6]根据上述[1]～[4]中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，上述BMP信号转导途径作用物质为BMP4。

[7]根据上述[6]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述步骤(2)中的悬浮培养在上述BMP4的浓度为10pM～5nM的培养基中进行。

[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，上述Wnt信号转导途径抑制物质具有对于非经典Wnt途径的抑制活性。

[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，上述Wnt信号转导途径抑制物质为PORCN抑制剂。

[10]根据上述[9]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述PORCN抑制剂为选自：IWP-2，IWP-3，IWP-4，IWP-L6，IWP-12，LGK-974，Wnt-C59，ETC-159及GNF-6231中的至少一种化合物。

[11]根据上述[1]～[7]中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，上述Wnt信号转导途径抑制物质为TANK抑制剂。

[12]根据上述[11]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述TANK抑制剂为选自IWR1-endo，XAV939及MN-64中的至少一种化合物。

[13]根据上述[1]～[12]中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，上述步骤(1)和/或上述步骤(2)中的培养还在TGFβ信号转导途径抑制物质的存在下进行。

[14]根据上述[13]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述TGFβ信号转导途径抑制物质为Alk5/TGFβRl抑制剂。

[15]根据上述[14]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述Alk5/TGFβR1抑制剂为选自：SB431542，SB505124，SB525334，LY2157299，GW788388，LY364947，SD-208，EW-7197，A83-01及RepSox中的至少一种化合物。

[16]根据上述[2]～[15]中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，上述步骤(a)中的Sonic hedgehog信号转导途径作用物质为选自：SAG，嘌吗啡胺(Purmorphamine)及GSA-10中的至少一种化合物。

[17]根据上述[16]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述步骤(a)中的培养基中包含的Sonic hedgehog信号转导途径作用物质的浓度具有相当于10nM～700nM的SAG的Sonic hedgehog信号转导促进活性。

[18]根据上述[1]～[17]中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，上述步骤(1)和/或步骤(2)中的悬浮培养为使用无血清培养基的悬浮培养。

[19]根据上述[18]所述的细胞团块的制备方法，其中，上述无血清培养基为包含血清代替物的无血清培养基。

[20]细胞团块，其为根据上述[1]～[19]中任一项所述的制备方法得到的包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块。

[21]非神经上皮组织片的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)～(4)；

(2)第二步骤，将第一步骤得到的聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块；

(3)第三步骤，从第二步骤得到的细胞团块回收2)非神经上皮组织；

(4)第四步骤，使第三步骤得到的2)非神经上皮组织分散，在平面上培养，由此得到非神经上皮组织片。

[22]非神经上皮组织片的制备方法，所述方法包括下述步骤(a)及下述步骤(1)～(4)；

[23]根据上述[21]或[22]所述的非神经上皮组织片的制备方法，其中，上述步骤(3)中的非神经上皮组织的回收方法，通过细胞团块的冻融进行。

[24]根据上述[23]所述的非神经上皮组织片的制备方法，其中，通过细胞团块的冻融进行的非神经上皮组织的回收，采用慢速冷冻法进行。

[25]根据上述[21]～[24]中任一项所述的非神经上皮组织片的制备方法，其中，上述2)非神经上皮组织为角膜或其前体组织。

[26]非神经上皮组织片，其为根据上述[21]～[25]中任一项所述的制备方法得到的非神经上皮组织片。

[27]细胞团块，其为1)神经系统细胞或神经组织的表面的3成以上被2)非神经上皮组织包覆的，包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块，

在被2)非神经上皮组织包覆的1)神经系统细胞或神经组织的表面区域的至少一部分中，形成1)神经系统细胞或神经组织与外侧的2)非神经上皮组织的距离为30μm以上的间隙。

[28]根据上述[27]所述的细胞团块，其中，上述2)非神经上皮组织在培养液中也能够维持由上皮细胞自主地形成的球体样的结构。

[29]根据上述[27]或[28]所述的细胞团块，其中，上述2)非神经上皮组织具有上皮细胞极性。

[30]根据上述[27]～[29]中任一项所述的细胞团块，其中，上述2)非神经上皮组织具有基膜样结构。

[31]根据上述[30]所述的细胞团块，其中，上述基膜样结构形成于1)神经系统细胞或神经组织与2)非神经上皮组织之间。

[32]根据上述[27]～[31]中任一项所述的细胞团块，其中，上述2)非神经上皮组织为假复层上皮。

[33]根据上述[27]～[31]中任一项所述的细胞团块，其中，上述2)非神经上皮组织为复层上皮。

[34]根据上述[27]～[33]中任一项所述的细胞团块，其中，上述2)非神经上皮组织为角膜或其前体组织。

[35]根据上述[27]～[34]中任一项所述的细胞团块，其中，上述1)神经系统细胞或神经组织为中枢神经系统的细胞或组织或其前体组织。

[36]根据上述[35]所述的细胞团块，其中，上述中枢神经系统的细胞或组织为视网膜。

[37]根据上述[27]～[36]中任一项所述的细胞团块，其中，上述2)非神经上皮组织的一部分为基板(placode)或源自基板的组织。

[38]根据上述[37]所述的细胞团块，其中，上述基板为颅基板。

[39]根据上述[37]所述的细胞团块，其中，上述源自基板的组织为晶状体。

[40]被测物质的毒性、药效评价方法，包括使上述[27]～[39]中任一项所述的包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块与被测物质接触的步骤，和

检验该被测物质对该细胞或该组织造成的影响的步骤。

[41]被测物质的毒性、药效评价方法，其中，包括使根据上述[1]～[19]中任一项所述的制备方法得到的包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块与被测物质接触的步骤，和，

检验该被测物质对该细胞或该组织造成的影响的步骤。

[42]被测物质的毒性、药效评价方法，包括使根据上述[21]～[25]中任一项所述的方法得到的非神经上皮组织片与被测物质接触的步骤，和，

检验该被测物质对该非神经上皮组织片造成的影响的步骤。

[43]根据上述[40]～[42]中任一项所述的被测物质的毒性、药效评价方法，其中，上述检验的步骤为：

将与被测物质接触的细胞团块或非神经上皮组织片利用染料进行染色的步骤，

从经染色的细胞团块或非神经上皮组织片中提取染料的步骤，及

对提取的染料的量进行定量而评价被测物质的刺激性的步骤。

[44]由于感觉器官的障碍导致的疾病的治疗药物，其包含由上述[1]～[19]中任一项所述的方法得到的细胞团块。

[45]由于角膜的障碍导致的疾病的治疗药物，其包含由上述[25]所述的方法得到的非神经上皮组织片。

[46]由于感觉器官的障碍导致的非人动物的疾病的治疗方法，包括将从上述[1]～[19]中任一项所述的方法得到的细胞团块中的有效量的2)非神经上皮组织移植至需要进行移植的对象的步骤。

[47]被测物质的毒性、药效评价用试剂，其包含由上述[1]～[19]中任一项所述的方法得到的细胞团块。

发明效果

根据本发明，实现由多潜能干细胞以低成本有效地制备包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块。

另外，实现提供一种细胞团块，所述细胞团块在神经系统细胞或神经组织与非神经上皮组织之间具有间隙，能够从神经系统细胞或神经组织容易地分离采集非神经上皮组织。

附图说明

[图1]图1上部为示意性示出在比较例1中，从人ES细胞制作细胞团块时的顺序的图。下部A及B为示出比较例1中在悬浮培养开始28天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。下部C～M为示出利用进行荧光免疫染色而检查在悬浮培养开始28天后的细胞团块中的各细胞标记的表达情况的结果的图。C～F分别示出RLDH3，Chx10，泛细胞角蛋白(Pan CK)和其核染色图像。G～J分别示出Rx，Pax6，βIII微管蛋白(Tuj1)和其核染色图像。K～M分别示出Bf1，N-钙黏着蛋白和其核染色图像。

[图2-1]图2-1的上部为示意性示出在实施例1中，由人ES细胞制作包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块时的顺序的图。下部A及B为示出在实施例2中在悬浮培养开始28天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。下部C～R为示出利用进行荧光免疫染色而检查在悬浮培养开始28天后的细胞团块中的各细胞标记的表达情况的结果的图。C及D分别示出Chx10的染色图像和其核染色图像。E及F分别示出RLDH3的染色图像和其核染色图像。G及H分别示出NCAM的染色图像和其核染色图像。I及J分别示出N-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。K～N分别示出EpCAM，Six1，p63的染色图像和其核染色图像。O及P分别示出PDGFRβ的染色图像和其核染色图像。Q及R分别示出细胞角蛋白18(CK18)的染色图像和其核染色图像。

[图2-2]图2-2的S～AN为示出利用进行荧光免疫染色而检查在悬浮培养开始28天后的细胞团块中的各细胞标记的表达情况的结果的图。S及T分别示出细胞角蛋白19(CK19)的染色图像和其核染色图像。U及V分别示出泛细胞角蛋白的染色图像和其核染色图像。W～Y分别示出C-Maf，Sox1的染色图像和其核染色图像。Z～AB分别示出Prox1，乙酰化微管蛋白(AcTub)的染色图像和其核染色图像。AC～AE分别示出L-Maf，晶状体蛋白αA(CryαA)的染色图像和其核染色图像。AF～AH分别示出Emx2，N-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。AI～AK分别示出Pax6，βIII微管蛋白的染色图像和其核染色图像。AL～AN分别示出Six1，泛细胞角蛋白的染色图像和其核染色图像。

[图2-3]图2-3的AO～AV为示出利用进行荧光免疫染色而检查在悬浮培养开始28天后的细胞团块中的各细胞标记的表达情况的结果的图。AO～AP分别示出EpCAM的染色图像和其核染色图像。AQ～AR分别示出层粘连蛋白的染色图像和其核染色图像。AS～AV分别示出RLDH3，Chx10，泛细胞角蛋白的染色图像和其核染色图像。下部AW为示意性示出培养第28天的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的结构的图。

[图3]图3A～C为示出利用进行荧光免疫染色而检查实施例2中在悬浮培养开始28天后的细胞团块中的各细胞标记的表达情况的结果的图。A～C分别示出N-钙黏着蛋白，EpCAM的染色图像和其核染色图像。下部图3D为将采用荧光免疫染色得到的图像利用分析软件进行测量的结果。

[图4]图4上部为示意性示出在实施例3中，由人ES细胞制作包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块时的顺序的图。下部A～C为示出在实施例3中在悬浮培养开始90天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。下部D～N为示出在悬浮培养开始90天后的细胞团块中的各细胞标记的表达情况利用进行荧光免疫染色而检查的结果的图。D～K分别示出细胞角蛋白5(CK5)，细胞角蛋白12(CK12)，层粘连蛋白的染色图像和其核染色图像。L～N分别示出粘蛋白4(Mucin4，MUC4)，Pax6的染色图像和其核染色图像。

[图5]图5上部为示意性示出在实施例4中，改变BMP4的添加时期而由人ES细胞制作包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块时的顺序的图。下部A～F为示出在实施例2中在悬浮培养开始10天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。分别为示出由以下细胞形成的悬浮培养开始10天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图，A：由没有添加BMP4的对照的细胞，B：由与悬浮培养开始同时添加了BMP4的细胞，C～F：由分别在悬浮培养开始第1，2，3及6天添加了BMP4的细胞。

[图6]图6上部为示意性示出在实施例5中，在由人ES细胞进行的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的制备过程中，制作细胞聚集体时的顺序的图。下部A及B分别为示出在实施例5中在悬浮培养开始2及3天后的细胞聚集体的倒置显微镜的明场观察图像的图。下部C～J为示出利用进行荧光免疫染色而检查在悬浮培养开始2天后或者3天后的细胞聚集体中各细胞标记的表达情况的结果的图。C及D分别示出在悬浮培养开始2天后的细胞聚集体的ZO-1的染色图像和其核染色图像。G及H分别示出在悬浮培养开始2天后的细胞聚集体的N-钙黏着蛋白(NCad)的染色图像和其核染色图像。E及F分别示出在悬浮培养开始3天后的细胞聚集体的ZO-1的染色图像和其核染色图像。I及J分别示出在悬浮培养开始3天后的细胞聚集体的N-钙黏着蛋白(NCad)的染色图像和其核染色图像。

[图7]图7上部为示意性示出在实施例6中，改变BMP4的添加浓度而由人ES细胞制作包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块时的顺序的图。下部A～H为示出在实施例6中在悬浮培养开始10天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。分别为示出悬浮培养开始后第10天的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图：A为没有添加BMP4的对照的，B～H为分别在悬浮培养开始后第2天改变浓度(0.1nM、0.25nM、0.5nM、0.75nM、1nM、1.5nM、5nM)添加BMP4并进一步进行悬浮培养的。

[图8]图8上部为示意性示出在实施例7中，由人ES细胞进行包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的制备中，检查各Wnt信号转导途径抑制物质的效果的顺序的图。下部A～K为示出在实施例7中在悬浮培养开始28天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。分别为示出悬浮培养开始后第10天的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图：A为没有添加Wnt信号转导途径抑制物质的对照，B～K为分别在悬浮培养开始时改变Wnt信号转导途径抑制物质的种类、浓度进行添加，并进一步进行悬浮培养。

[图9]图9上部为示意性示出在实施例8中，由人ES细胞进行的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的制备中，检查利用在悬浮培养开始前的化合物进行的前处理的效果的顺序的图。下部A～C为示出实施例8中在悬浮培养开始15天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。A为周围整体的80％以上被非神经上皮包覆，为接近球状的形态的第1级的细胞团块，B为周围整体的80％～40％被非神经上皮包覆，或者形状发生变形的第2级的细胞团块，C为细胞团块表面的非神经上皮的比例为40％以下的第3级的细胞团块的例子。D为将实施各条件的化合物前处理后形成的细胞团块的品质评价结果进行图表化。

[图10]图10上部为示意性示出在实施例9中，由人iPS细胞制作包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块时的顺序的图。下部A为示出在实施例9中在悬浮培养开始10天后的细胞团块，B及C为悬浮培养开始28天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。下部D～S为示出利用进行荧光免疫染色而检查在悬浮培养开始28天后的细胞团块中的各细胞标记的表达情况的结果的图。D～G分别示出Six1，NCAM，E-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。H～K分别示出RLDH3，Chx10，泛细胞角蛋白的染色图像和其核染色图像。L～O分别示出Pax6，Rx，βIII微管蛋白的染色图像和其核染色图像。P～S分别示出p63，N-钙黏着蛋白，EpCAM的染色图像和其核染色图像。

[图11]图11上部为示意性示出实施例10中，由人ES细胞制作包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块时的顺序的图。下部A为示出实施例10中在悬浮培养开始34天后的细胞团块，B为A的仅经分离非神经上皮组织的状态，C为将分离的非神经上皮组织进行酶处理而单细胞化后，接种在细胞培养皿中之后第3天的倒置显微镜的明场观察图像的图。

[图12]图12上部为示意性示出实施例11中，由人ES细胞制作包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块时的顺序的图。下部A为在实施例11中，将细胞团块利用GHS分类1及2的化合物进行处理后实施了利用荧光素染色法的评价结果进行图表化。

具体实施方式

1.定义

在本发明中，“干细胞”意指具有分化潜能和维持分化潜能的增殖能力(特别是自我更新的能力)的未分化的细胞。在干细胞中，根据分化潜能而包括多潜能干细胞(pluripotent stem cell)，多能干细胞(multipotent stem cell)，单能干细胞(unipotent stem cell)等亚群。多潜能干细胞意指能够在体外培养，并且具有可能分化为构成生物体的全部的细胞(源自三胚层(外胚层，中胚层，内胚层)的组织的潜能(分化多潜能性(pluripotency))的干细胞。多能干细胞意指具有分化成多种类型的组织或细胞、但不是所有种类的组织或细胞的潜能的干细胞。单能性干细胞意指具有分化成特定的组织、细胞的潜能的干细胞。

多潜能干细胞可以由受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织中的干细胞、体细胞等诱导。作为多潜能干细胞，可列举：胚胎干细胞(ES细胞：Embryonic stem cell)，EG细胞(Embryonic germ cell)，人工多潜能干细胞(iPS细胞：induced pluripotent stem cell)等。由间充质干细胞(mesenchymal stem cell；MSC)得到的Muse细胞(Multi-lineagedifferentiating Stress Enduring cell)、由生殖细胞(例如睾丸)制作的GS细胞也包括在多潜能干细胞中。胚胎干细胞最先在1981年建立，并且自1989年起还已经用于产生敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干细胞，其也正用于再生医学。可通过在饲养细胞上或在含有LIF的培养基中培养内细胞团而产生ES细胞。ES细胞的制备方法记载在例如，WO 96/22362，WO 02/101057，US 5,843,780，US 6,200,806，US 6,280,718等中。胚胎干细胞可从给定的机构得到，或可以购买市售品。例如，作为人胚胎干细胞的KhES-1，KhES-2和KhES-3，可从京都大学再生医科学研究所得到。作为任意小鼠胚胎干细胞的EB5可从国立研究开发法人理化学研究所得到，并且D3细胞系可从ATCC得到。作为ES细胞之一的核移植ES细胞(ntES细胞)可从将体细胞的细胞核移植到去除了细胞核的卵细胞制备的克隆胚胎建立。

EG细胞可通过在含有mSCF、LIF和bFGF的培养基中培养原始生殖细胞而产生(Cell，70：841-847，1992)。

本发明中的“人工多潜能干细胞”意指通过公知的方法等将体细胞重编程(reprogramming)而被诱导具有多潜能性的细胞。具体而言，可列举将成纤维细胞、外周血单核细胞等分化成的体细胞通过表达选自由Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等组成的组中的重编程基因组中的多个基因的组合中的任一种而进行重编程，从而被诱导具有多潜能性的细胞。2006年，由山中等以小鼠细胞建立了人工多潜能干细胞(Cell，2006，126(4)，663-676)。在2007年还从人成纤维细胞中建立了人工多潜能干细胞，与胚胎干细胞同样具有多潜能性和自我更新能力(Cell，2007，131(5)pp.861-872；Science，2007，318(5858)pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.，2008，26(1)pp.101-106)。作为人工多潜能干细胞，除了利用基因表达的直接重编程而制备的方法以外，也可以通过化合物的添加等由体细胞诱导人工多潜能干细胞(Science，2013，341pp.651654)。

用于获得人工多潜能干细胞的体细胞没有特别限制，可列举组织来源的成纤维细胞、血液谱系细胞(例如，外周血单核细胞、T细胞)、肝细胞、胰腺细胞、肠上皮细胞、平滑肌细胞等。

当通过表达一些种类的基因(例如，Oct3/4，Sox2，Klf4，及Myc这4种因子))进行重编程而产生人工多潜能干细胞时，对用于基因表达的方式没有特别限制。作为前述方式，可列举使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒(Sendai virus)载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)的感染法，使用质粒载体(例如，质粒载体、附加体载体)的基因导入法(例如，磷酸钙法、脂质转染法、RetroNectin法、电穿孔法)，使用RNA载体的基因导入法(例如，磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法)，直接注射蛋白的方式，等等。

用于本发明的多潜能干细胞优选为ES细胞或人工多潜能干细胞。

作为多能干细胞，可列举诸如造血干细胞、神经干细胞、视网膜干细胞、间充质干细胞等的组织干细胞(也称为组织性干细胞、组织特异性干细胞或体干细胞)。

可以例如，通过使用同源重组技术产生遗传上修饰的多潜能干细胞。作为被修饰的染色体上的基因，可列举例如：细胞标记基因、组织相容性抗原的基因、与由神经系统细胞的障碍导致的疾病相关的基因等。染色体上的靶基因的修饰可以使用以下各项所述的方法进行：Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual(操作小鼠胚胎，实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Gene Targeting，APractical Approach(基因靶向，实践方法)，IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual Series 8，Gene Targeting，Making of Mutant Mouse using ES cell(基因靶向，使用ES细胞产生突变体小鼠)，YODOSHACO.，LTD.(1995)；等等。

具体而言，例如，分离要修饰的靶基因(例如，细胞标记基因、组织相容性抗原基因、疾病相关的基因等)的基因组遗传子，并使用该分离的基因组遗传子制备用于将该靶基因进行同源重组的靶向载体。将所产生的靶向载体引入到干细胞中，并选择在所述靶基因与所述靶向载体之间发生了同源重组的细胞，由此，能够制备染色体上的基因得到了所述修饰的干细胞。

作为用于分离靶基因的基因组基因的方法，可列举以下各项中记载的已知的方法：Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手册)，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学流程)，John Wiley&Sons(1987-1997)等。对靶基因的基因组基因而言，也可以使用基因组DNA文库筛选系统(由Genome Systems制造)、通用基因组步量试剂盒(Universal Genome Walker试剂盒)(由CLONTECH制造)等分离。

用于靶基因同源重组的靶向载体的制备和同源重组子的有效筛选可以按照以下各项中记载的方法进行：Gene Targeting，A Practical Approach(基因靶向，实践方法)，IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual Series 8，Gene Targeting，Making of Mutant Mouse using ES cell(基因靶向，使用了ES细胞产生突变体小鼠)，YODOSHA CO.，LTD.(1995)；等等。作为所述靶向载体，可以使用替换类型或插入类型中的任一种。作为所述筛选方法，可以使用诸如阳性选择、启动子选择、阴性选择、聚腺苷酸(polyA)选择等方法。

作为用于从所选的细胞系中选择需要的同源重组子的方法，可列举用于基因组DNA的DNA杂交法(Southern hybridization method)、PCR法等。

本发明中的“哺乳动物”包括啮齿类、有蹄类、食肉目、灵长类动物等。啮齿类包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等。有蹄类包括猪、牛、山羊、马、绵羊等。在食肉目中，包括犬、猫等。本发明中的“灵长类”是指属于灵长目的哺乳动物，并且灵长类包括诸如狐猴，懒猴，树鼩等的原猴亚目，和诸如猴，类人猿，人等的类人猿亚目。

本发明使用的多潜能干细胞为哺乳动物的多潜能干细胞，优选为啮齿类(例如，小鼠，大鼠)或灵长类(例如，人，猴)的多潜能干细胞，最优选为人多潜能干细胞。

在本发明中，“信号转导”是指在细胞膜等存在的受体蛋白质与化学物质等结合而发生结构变化，将其作为刺激依次传递到细胞内，最终带来基因表达、通道的打开等反应的过程、机制等，表示细胞具有的对于生物化学刺激进行的信息的传递，扩大，处理，应答机制。

在本发明中，“细胞黏附(Cell adhesion)”是指细胞和细胞之间的黏附，及细胞与细胞外基质的黏附。在体外的人工培养环境中产生的细胞与培养器材等的黏附也包含在细胞黏附中。作为细胞黏附的种类，可列举锚定连接(anchoring junction)，通讯连接(communicating junction)，封闭连接(occluding junction)。

在本发明中，“紧密连接(Tight junction)”是指在细胞间的黏附中，在脊椎动物和脊索动物中可见的封闭连接。紧密连接在上皮细胞之间形成。在源自生物体的组织中以及用本发明的制备方法等制作的细胞团块中是否存在紧密连接，可以通过利用使用例如针对紧密连接的构成成分的抗体(抗紧密连接蛋白抗体，抗ZO-1抗体等)的免疫组织化学等手段来检测。

本发明中的“悬浮培养”或者“悬浮培养法”是指将细胞，细胞聚集体或细胞团块维持在培养液中悬浮存在的状态下培养，及进行该培养的方法。即，悬浮培养为细胞、细胞聚集体或细胞团块在与培养器材等不黏附的条件下进行，而在与培养器材等黏附的条件下进行的培养(贴壁培养，或贴壁培养法)不包括在悬浮培养的范畴中。在该情况下，细胞发生黏附是指细胞，细胞聚集体或细胞团块与培养器材之间，形成了作为细胞黏附的一种的牢固的细胞-基质间连接(cell-substratum junction)。更具体而言，悬浮培养意指在细胞，细胞聚集体或细胞团块与培养器材等之间未形成强的细胞-基质间连接的条件下的培养，贴壁培养意指在细胞，细胞聚集体或细胞团块与培养器材等之间形成强的细胞-基质间连接的条件下的培养。

在悬浮培养中的细胞聚集体或细胞团块中，细胞和细胞为面黏附。在悬浮培养中的细胞聚集体或细胞团块中，与培养器材等之间几乎不形成细胞-基质间连接、或即使形成，其贡献也是小的。在一些实施方式中，在悬浮培养中的细胞聚集体或细胞团块中，在聚集体或细胞团块的内部存在内源的细胞-基质间连接，但是与培养器材等之间几乎不形成细胞-基质间连接、或即使形成，其贡献也是小的。

细胞-细胞发生面黏附(面连接)，意指一个细胞以面与另一个细胞连接。更具体地，细胞-细胞面黏附意指例如，在一个细胞的表面积中，与另一个细胞的表面发生黏附的比例为例如1％以上，优选3％以上，更优选5％以上。细胞的表面可通过根据将膜染色的试剂(例如DiI)的染色、细胞粘附因子(例如，E-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白)的免疫染色进行观察。

进行悬浮培养时使用的培养容器没有特别限制，只要其能够实现“悬浮培养”即可，并且本领域普通技术人员能够适当确定此类培养容器。作为这样的培养容器，可列举例如：烧瓶、组织培养瓶、平皿、皮氏培养皿、组织培养皿、多联培养皿、微量平板、微孔平板、微孔、多联平板、多孔平板、室载玻片、碗、管、托盘、培养袋、旋转烧瓶或转瓶。为了能够实现悬浮培养，这些培养容器优选为非细胞黏附性的。作为非细胞黏附性的培养容器，可以使用培养容器的表面没有处于提高与细胞的黏附性的目的而进行了人工处理(例如：用基膜制剂，层粘连蛋白，entactin，胶原蛋白，明胶等细胞外基质等，或聚赖氨酸，多聚鸟氨酸等高分子等进行的包被处理，或正电荷处理等表面加工)的那些等。作为非细胞黏附性的培养容器，可以使用培养容器的表面处于降低与细胞的黏附性的目的而进行了人工处理(例如：MPC聚合物等超亲水性处理，蛋白低吸附处理等)的那些等。可以使用旋转烧瓶、摇瓶等进行转管培养。培养容器的培养表面可以是平底的或可以具有凹陷和凸出。

在本发明中用于培养细胞的培养基可以由通常用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基而制作。作为基础培养基，可列举例如：BME培养基，BGJb培养基，CMRL 1066培养基，Glasgow MEM培养基，改良的MEM Zinc Option培养基，IMDM培养基，Medium 199培养基，Eagle MEM培养基，αMEM培养基，DMEM培养基，F-12培养基，DMEM/F12培养基，IMDM/F12培养基，Ham′s培养基，RPMI 1640培养基，Fischer’s培养基，或它们的混合培养基等可以用于动物细胞的培养的培养基。

多潜能干细胞的培养中，可以使用以上述基础培养基作为基础的多潜能干细胞培养用的培养基，优选为公知的胚胎干细胞及或人工多潜能干细胞用的培养基、用于在无饲养细胞下培养多潜能干细胞的培养基。可列举例如：Essential 8培养基，TeSR培养基，mTeSR培养基，mTeSR-E8培养基，StemFit培养基等无饲养细胞培养基。

本发明中的“无血清培养基”意指不包含未调节或未纯化的血清的培养基。在本发明中，将混入经纯化的血液来源的组分和动物组织来源的组分(例如，生长因子)的培养基也包括在无血清培养基中，除非其中含有未调节的或未纯化的血清。

无血清培养基中可以含有血清代替物。作为血清代替物，可列举适当含有例如：白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’硫醇甘油，或它们的等效物等的那些。此种血清代替物可以通过例如：WO98/30679中记载的方法制备。作为血清代替物，也可以利用市售品。作为此种市售的血清代替物，可列举例如：Knockout^TM血清替代品(Life Technologies公司，下文中有时也被称为KSR)，化学成分确定的脂质浓缩物(Chemically Defined Lipid Concentrate，由Life Technologies公司制)，Glutamax^TM(由Life Technologies公司制)，B27(由Life Technologies公司制)，N2(由LifeTechnologies公司制)。

用于悬浮培养的无血清培养基可以适当地含有脂肪酸或脂质，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，维生素，生长因子，细胞因子，抗氧化剂，2-巯基乙醇，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。

为避免复杂的制备，作为此种无血清培养基，可以使用添加有适量的市售的KSR(由Life Technology公司制)(例如：约0.5％～约30％、优选为约1％～约20％)的无血清培养基(例如：在F-12培养基和IMDM培养基的1：1混合液中添加了1×化学成分确定的脂质浓缩物、5％KSR及450μM 1-一硫代甘油的培养基)。另外，作为与KSR相当的产品，可列举在日本特表2001-508302中公开的培养基。

本发明中的“血清培养基”是指含有无调整或未纯化的血清的培养基。所述培养基可以含有脂肪酸、脂质、氨基酸(例如、非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、1-一硫代甘油、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等。例如在使用基质胶等基膜制剂而将多潜能干细胞诱导分化为视网膜组织等的情况下，可使用血清培养基(Cell StemCell，10(6)，771-775(2012))。

在本发明中，培养优选在无外源物质(xeno-free)的条件下进行。“无外源物质”是指已将与培养对象的细胞的生物种类不同的生物种类来源的成分排除的条件。

从避免化学上不确定的成分的混入的观点出发，本发明使用的培养基优选为所含成分经化学上确定的培养基(限定化学成分培养基，Chemically defined medium；CDM)。

本发明中的“基膜(Basement membrane)样结构”是指由细胞外基质构成的薄的膜状结构。在生物体中，基膜在上皮细胞的基底侧(basal)形成。作为基膜的成分，可列举：IV型胶原蛋白，层粘连蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白多糖(串珠素，perlecan)，entactin/nidogen，细胞因子，生长因子等。在源自生物体的组织中以及用本发明的制备方法等制作的细胞团块中是否存在基膜，可以通过利用使用例如PAM染色等组织染色，以及针对基膜的构成成分的抗体(抗层粘连蛋白抗体，抗IV型胶原蛋白抗体等)的免疫组织化学等手段来检测。

本发明中的“基膜制剂”指包含具有以下功能的基膜构成成分的制剂：当在其上接种并培养具有基膜形成能力的期望的细胞的情况下，控制上皮细胞样的细胞形态，分化，增殖，运动，功能表达等。例如，当将通过本发明制备的细胞和组织分散并进一步的贴壁培养时，可以在存在基膜制剂的条件下培养。此处，“基膜组成成分”是指在动物组织中的上皮细胞层与间质细胞层等之间存在的薄膜形式的细胞外基质分子。基膜制剂可以通过例如以下操作而制作：将经由基膜而黏附于支撑体上的具有基膜形成能力的细胞，使用具有该细胞的脂质溶解能力的溶液、碱溶液等从支撑体除去。作为基膜制剂，可列举包括作为基膜制作物而市售的商品(例如：Matrigel^TM(Corning Incorporated制造，下文中有时称为基质胶))、Geltrex^TM(Life Technologies公司制)，作为基膜成分公知的细胞外基质分子(例如：层粘连蛋白，IV型胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白多糖，entactin等)的那些。

在本发明中，可以将从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤等组织乃至细胞提取、并使其可溶的基质胶(Corning公司制)等基膜制剂用于细胞以及组织的培养。同样地，作为细胞培养中使用的基膜成分，也可使用人可溶化羊膜(生物资源应用研究所制)，在HEK293细胞中产生的人重组层粘连蛋白(BioLamina公司制)，人重组层粘连蛋白片段(Nippi公司制)，人重组玻连蛋白(Thermo Fisher公司制)等，但从避免源自不同的生物种类的成分的混入的观点，及避免传染病的风险的观点出发，优选成分明确的重组蛋白质。

在本发明中，“包含物质X的培养基”及“在物质X的存在下”分别是指添加了外源性(exogenous)的物质X的培养基或包含外源性的物质X的培养基及在外源性的物质X的存在下。对外源性的物质X而言，与例如在培养基中存在的细胞或组织内源性(endogenous)表达，分泌或者产生该物质X的内源性的物质X相区别。

例如：“包含Sonic hedgehog信号转导途径作用物质的培养基”是指添加了外源性的Sonic hedgehog信号转导途径作用物质的培养基，或包含外源性的Sonic hedgehog信号转导途径作用物质的培养基。

在本发明中，“饲养细胞”是指在培养干细胞时共存的除干细胞之外的细胞。作为用于培养多潜能干细胞同时维持未分化状态的饲养细胞，包括例如：小鼠成纤维细胞(MEF)、人成纤维细胞、或SNL细胞等。对于饲养细胞，优选经历增殖抑制处理的饲养细胞。作为增殖抑制处理，可列举增殖抑制剂(例如：丝裂霉素C)处理或UV照射等。对用于培养多潜能干细胞同时维持未分化状态的饲养细胞而言，通过分泌体液因子(优选为未分化维持因子)，或产生用于细胞黏附的构架(细胞外基质)而有助于维持多潜能干细胞的未分化。

在本发明中，细胞的“聚集体(Aggregate)”是指由分散在培养基中的细胞集合形成的团块，所述团块中细胞之间彼此粘附。在细胞的聚集体中也包括：细胞团块，胚样体(Embryoid body)，球体(Sphere)，球状体(Spheroid)，类器官(Organoid)。优选在细胞的聚集体中细胞彼此为面黏附。在一些实施方式中，在聚集体的一部分或全部中，有时细胞彼此形成了细胞-细胞间连接(cell-cell junction)和或细胞黏附(cell adhesion)例如黏附连接(adherence junction)。作为本发明中的“聚集体”，具体而言，可列举在下述“2.包含神经系统细胞或神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的制备方法”中的第一步骤中生成的在悬浮培养开始时处于分散的细胞形成的聚集体。

在本发明中，“均一聚集体”意指在培养多个聚集体时，各聚集体的尺寸一致，并且在通过最大直径的长度评价所述聚集体的尺寸时，作为均一聚集体，最大直径的长度变化小。更具体而言，是指全部聚集体的群体中的75％以上的聚集体在该凝集团块的群体中最大直径的平均值±100％、优选为平均值±50％的范围内，更优选为平均值±20％的范围内。

在本发明中，“形成均一聚集体”意指当细胞汇聚而形成细胞的聚集体进行悬浮培养时，通过使给定数量的经分散的细胞迅速聚集由此形成大小均一的细胞的聚集体。

“分散”意指将细胞、组织通过酶处理、物理处理等分散处理而分离成小的细胞块(2个细胞以上且100个细胞以下，优选为50个细胞以下)或单个细胞。给定数量的经分散的细胞是指细胞块或特定数量的单个细胞的汇聚。

作为使多潜能干细胞的分散方法，可列举：机械分散处理、细胞分散液处理和添加细胞保护剂的处理。这些处理可以联合进行。优选地进行细胞分散液处理，然后进行机械分散处理。

作为机械分散处理的方法，可列举吹打处理或利用刮刀的刮片操作。

关于用于细胞分散液处理的细胞分散液，可列举包含例如：胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、DNA酶、木瓜蛋白酶等和诸如乙二胺四乙酸等螯合剂中的任一种的溶液。也可以使用市售的细胞分散液，例如：Accumax(Innovative celltechnologies公司制)、TrypLE Select(Life Technologies公司制)。

作为用于添加细胞保护剂的处理的细胞保护剂，可列举：FGF信号转导途径作用物质，肝素，ROCK抑制物质，血清，或血清代替物。关于优选的细胞保护剂，可列举ROCK抑制物质。

例如：作为使多潜能干细胞分散的方法，可列举将多潜能干细胞的集群在作为细胞保护剂的ROCK抑制物质的存在下用细胞分散液(Accumax)处理，进一步通过吹打使其分散的方法。

在本发明的制备方法中，优选通过迅速汇集多潜能干细胞而形成多潜能干细胞的聚集体。当以这样的方式形成多潜能干细胞的聚集体时，可以以良好的重现性在由所形成的聚集体诱导和分化的细胞中形成上皮样结构。作为形成聚集体的实验操作，可列举例如：使用小孔的板(例如：孔的底面积用平底换算时为0.1～2.0cm²左右的板)、微孔等将细胞控制在小空间中的方法，通过使用小的离心管进行短时间离心而使细胞聚集的方法。作为小孔的板，可列举例如：24孔板(面积用平底换算时为1.88cm²左右)、48孔板(面积用平底换算时为1.0cm²左右)、96孔板(面积用平底换算时为0.35cm²左右，内径6～8mm左右)、384孔板。优选地，可列举96孔板。关于小孔的板的形状，从上方看孔时底表面的形状可列举为多边形、长方形、椭圆形、正圆形，优选为正圆形。作为小孔的板的形状，从侧面看孔时的底表面的形状优选为外周部高而内凹部低的下凹结构，可列举为例如：U型底，V型底，M型底、优选为U型底或V型底，最优选可列举为V型底。作为小孔的板，也可以使用细胞培养皿(例如：60mm～150mm平皿，培养瓶)的底表面具有凹凸或齿状的那些。小孔的板的底表面优选使用非细胞黏附性底表面，优选经前述非细胞黏附性包被的底表面。

对多潜能干细胞的聚集体的形成，和在形成凝集体的各细胞中形成了上皮样结构而言，可以基于聚集体的尺寸及细胞数目，宏观形态，采用组织染色分析的微观形态及其均一性、分化及未分化标记的表达及其均一性、分化标记的表达控制及其同步性、聚集体间的分化效率的再现性等而判断。

本发明中的“组织”意指具有以下结构的细胞群体的结构体，在所述结构中，形态、性质不同的多种类型细胞以给定模式在空间上配置。

在本发明中，“神经组织”是指由神经系统细胞构成的组织，包括发育阶段或成人阶段的大脑，中脑，小脑，脊髓，视网膜，外周神经等。神经组织有时形成具有层结构的上皮结构(神经上皮)，并且神经组织中的神经上皮可以通过使用光学显微镜的明场观察而评价存在的量。

在本发明中，“神经系统细胞(Neural cell)”是指来源于外胚层的组织中除表皮谱系细胞之外的细胞。即，其包括：神经系统前体细胞，神经元(神经细胞)，胶质细胞，神经干细胞，神经元前体细胞及神经胶质前体细胞等细胞。神经系统细胞还包括构成下文提及的视网膜组织的细胞(视网膜细胞)、视网膜祖细胞、视网膜层专有的神经细胞、神经视网膜细胞和视网膜色素上皮细胞。神经系统细胞可以用巢蛋白、TuJ1、PSA-NCAM、N-钙黏着蛋白等作为标记进行鉴定。

神经元是形成神经回路并且对信号转导有贡献的功能细胞，可以通过将TuJl，Dcx，HuC/D等不成熟神经细胞标记，和/或Map2，NeuN等成熟神经细胞标记的表达作为指标进行鉴定。

作为胶质细胞(glial cell)，可列举：星形胶质细胞，少突胶质细胞，米勒胶质细胞等。作为星形胶质细胞的标记，可列举GFAP，作为少突胶质细胞的标记可列举o4，作为米勒胶质细胞的标记可列举CRALBP等。

神经干细胞是具有向神经细胞和胶质细胞的分化潜能(多分化潜能性)和维持多分化潜能性的增殖能力(有时称为自我更新能力)的细胞。关于神经干细胞标记，可列举：巢蛋白、Sox2、Musashi、Hes家族、CDl33等；然而，这些标记是关于祖细胞/前体细胞全体的标记，而不被认为是神经干细胞特异性的标记。神经干细胞的数量可以通过神经球测定、克隆测定等评估。

神经元前体细胞是具有增殖能力的细胞，其产生神经细胞，并且不产生胶质细胞。作为神经元前体细胞的标记，可列举Tbr2，Tα1等。或者，不成熟神经细胞标记(TuJ1，Dcx，HuC/D)阳性且增殖标记(Ki67，pH3，MCM)阳性的细胞也可以作为神经元前体细胞鉴定。

胶质前体细胞是指具有增殖能力，产生胶质细胞，且不产生神经细胞的细胞。

神经系统前体细胞(Neural Precursor cell)为包括神经干细胞，神经元前体细胞及胶质前体细胞的前体细胞的聚集体，具有增殖能力和神经元及胶质细胞产生能力。神经系统前体细胞可以用巢蛋白，GLAST，Sox2，Sox1，Musashi，Pax6等作为标记鉴定。备选地，神经系统细胞标记为阳性且生长标记(Ki67，pH3，MCM)为阳性的细胞也可以被鉴定为神经系统前体细胞。

本发明中的“视网膜组织”意指在生物体视网膜中构成各视网膜层的视细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞、它们的前体细胞、或视网膜祖细胞等细胞中的至少多种类型以层状形式在空间上排列的视网膜组织。对各种细胞是否为构成任一种视网膜层的细胞而言，可采用公知的方法，通过例如有无细胞标记的表达或其水平等确认。

本发明中的“视网膜层”表示构成视网膜的各个层。具体可列举：视网膜色素上皮层，视细胞层，外界膜，外核层，外网织层，内核层，内网织层，神经节细胞层，神经纤维层和内界膜。

本发明中的“视网膜祖细胞”是指能够分化成：视细胞，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞，视网膜色素上皮细胞中的任意成熟的视网膜细胞的前体细胞。

对视细胞前体细胞、水平细胞前体细胞、双极细胞前体细胞、无长突细胞前体细胞、视网膜节细胞前体细胞、视网膜色素上皮前体细胞而言，分别意指确定分化成视细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞的前体细胞。

本发明中的“视网膜层专有的神经细胞”是指构成视网膜层的细胞，且为视网膜层特异性的神经细胞。作为视网膜层专有的神经细胞，可列举：双极细胞，视网膜神经节细胞，无长突细胞，水平细胞，视细胞，视网膜色素上皮细胞，视杆细胞及视锥细胞。

本发明中的“视网膜细胞”包括前述视网膜祖细胞和视网膜层专有的神经细胞。

作为视网膜细胞标记，可列举在视网膜祖细胞中表达的Rx(也称为Rax)，Aldhla3，及PAX6，在下丘脑神经元的前体细胞中表达而在视网膜祖细胞中不表达的Nkx 2.1，在下丘脑神经上皮中表达而在视网膜中不表达的Sox1，在视细胞的前体细胞中表达的Crx，Blimp1等。作为视网膜层专有的神经细胞的标记，可列举在双极细胞中表达的Chx10，PKCα及L7，在视网膜神经节细胞中表达的TuJl及Brn3，在无长突细胞中表达的钙视网膜蛋白(Calretinin)，在水平细胞中表达的钙结合蛋白(Calbindin)，在成熟视细胞中表达的视紫质(Rhodopsin)及恢复蛋白(Recoverin)，在视杆细胞中表达的Nrl，在视锥细胞中表达的Rxr-gamma，在视网膜色素上皮细胞中表达的RPE65及Mitf等。

在本发明中，“非神经上皮组织”是指在具有上皮结构的组织中除了神经上皮组织以外的组织。上皮组织可由外胚层，中胚层，内胚层，营养外胚层中的任意胚层形成。在上皮组织中包括上皮，中皮，内皮。作为非神经上皮组织中包含的组织的例，可列举：表皮，角膜上皮，鼻腔上皮，口腔上皮，气管上皮，支气管上皮，气管上皮，肾上皮，肾皮质上皮，胎盘上皮等。

对上皮组织而言，通常利用各种细胞间结合而连接，形成具有单层或复层化的层结构的组织。这些上皮组织的有无的确认，存在量的定量能够通过利用光学显微镜的观察、或使用针对上皮细胞标记的抗体(抗E-钙黏着蛋白抗体，抗N-钙黏着蛋白抗体，抗EpCAM抗体等)的免疫组织化学等手段进行。

在本发明中，“上皮细胞极性(Epithelial polarity)”表示在上皮细胞内，在空间上形成的构成成分及细胞功能的分布的偏置。例如：角膜上皮细胞局部存在于眼球的最外层，在顶端侧(apical)表达用于泪液维持的膜结合型粘蛋白(MUC-1，4，16)等顶端侧特异性蛋白质，在基底侧(basal)表达用于与基膜黏附的α6整联蛋白，β1整联蛋白等基底侧特异性蛋白质。

源自生物体的组织中以及用本发明的制备方法等制作的细胞团块中的上皮细胞以及上皮组织中是否存在上皮细胞极性，可以通过使用鬼笔环肽(Phalloidin)，顶端侧标记(抗MUC-1抗体，抗PKC-zeta抗体等)以及基底侧标记(抗α6整联蛋白抗体，抗β1整联蛋白抗体等)的免疫组织化学等手段检测。

角膜为非神经上皮组织的一种，为眼球壁的外层的前方约占1/6的透明的表面皿状的组织。作为角膜的部分结构，可列举角膜上皮，鲍曼氏膜，角膜基质层，后弹力层(Descemet膜)，角膜内皮等，但不限于这些。角膜通常从体表侧起依次由角膜上皮，鲍曼氏膜，角膜基质层，后弹力层，及角膜内皮组成的5个层构成。对诱导为角膜、其部分结构、或其前体组织而言，可以根据标记的表达而确认。作为角膜、其部分结构、或其前体组织的标记，可列举：泛细胞角蛋白(角膜上皮前体组织)，细胞角蛋白18(角膜上皮前体组织)，细胞角蛋白19(角膜上皮前体组织)，EpCAM(角膜上皮前体组织)，PDGFR-β(表层外胚层)，Six1(表层外胚层及基板)，E-钙黏着蛋白(角膜上皮前体组织)，N-钙黏着蛋白(角膜上皮干细胞，前体组织)，细胞角蛋白3(角膜上皮)，细胞角蛋白12(角膜上皮)，细胞角蛋白14(角膜上皮)，p63(角膜上皮)，ZO-1(角膜上皮)，PDGFR-α(角膜基质层，角膜内皮，或其前体组织)，Pitx2(角膜基质层及角膜内皮的前体组织)，ABCG2(角膜基质层及角膜内皮的前体组织)等。在一种实施方式中，根据本发明的方法制备的细胞团块中包含的角膜上皮的前体组织为泛细胞角蛋白阳性及E-钙黏着蛋白阳性的上皮细胞层。在一种实施方式中，根据本发明的方法制备的细胞团块中包含的角膜上皮为细胞角蛋白3阳性、细胞角蛋白12阳性、细胞角蛋白14阳性、p63阳性及ZO-1阳性的上皮结构。在一种实施方式中，根据本发明的方法制备的细胞团块中包含的角膜基质层及角膜内皮的前体组织为间充质细胞的凝聚层。在一种实施方式中，该间充质细胞的凝聚层为泛细胞角蛋白阳性、PDGFR-(α阳性、或Pitx2阳性并且ABCG2阳性。角膜基质层和角膜内皮都源自于间充质细胞，但由于角膜内皮呈现上皮化的内皮细胞层样的形态，因此在上述的标记表达的分析以外，通过进行形态学的观察，能够实现将角膜基质层(或其前体组织)与角膜内皮(或其前体组织)进行区别，或确认诱导为角膜内皮或其前体组织。

在本发明中，“基板(placode)”主要表示在脊椎动物的发育过程中，表皮外胚层的一部分肥大而形成的器官的原基(primordial organ)。作为源自于基板的组织，可列举：晶状体，鼻，内耳，三叉神经等。作为基板，或为其前体组织的前基板区域(preplacoderegion)的标记，可列举Six1，Six4，Dlx5，Eya2等。

晶状体基板是指包括肥大的表皮外胚层细胞层的晶状体前体组织。其通过在胚胎发育中，通过与视胞的表皮外胚层的接触，该接触区域发生肥大而形成。

晶状体为源自于基板的组织之一，为使从外进入眼球的光折射，聚焦于视网膜的实现透镜的功能的组织。作为晶状体的部分结构，可列举：晶状体上皮，晶状体核，晶状体囊等，但不限于这些。作为晶状体的前体组织，可列举：晶状体基板，晶状体泡等。

晶状体泡是指由于晶状体基板的陷入而形成的小泡。

对诱导为晶状体、其部分结构、或其前体组织而言，可以根据标记的表达确认。作为晶状体、其部分结构、或其前体组织的标记，可列举：Six1(表层外胚层及基板)，FoxC1(基板)，Emx2(基板)，Sox1(中枢神经系统及晶状体前体组织)，FoxE3(晶状体前体组织)，Prox1(晶状体前体组织)，L-Maf(晶状体前体组织)，α，β及γ晶体蛋白(晶状体)等，但不限于这些。在一种实施方式中，晶状体基板为L-Maf阳性的肥大的表皮外胚层细胞层。在一种实施方式中，晶状体泡为L-Maf阳性的小泡。

作为后述的根据本发明的制备方法制备的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的一种实施方式，可列举前眼部组织。由多潜能干细胞制作的凝聚体内中，可以通过从多潜能性细胞诱导向前眼部组织或其部分结构，或其前体组织的分化，由此得到包含前眼部组织或其部分结构，或其前体组织的细胞团块。在上述前眼部组织中，包括为非神经上皮组织的一种的角膜组织，包括为源自基板的组织的一种的晶状体，包括为神经组织的一种的视网膜组织。

2.包含神经系统细胞或神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的制备方法

本发明提供细胞团块的制备方法，所述细胞团块包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织。以下，也称为本发明的制备方法。

本发明的制备方法的一种实施方式为包含神经系统细胞或神经组织，及非神经上皮组织的细胞团块的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)及(2)：

本发明的制备方法的更优选一种实施方式为，

细胞团块的制备方法，所述细胞团块包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织，所述方法包括下述步骤(a)、(1)及(2)：

<(al步骤>

对于将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中维持培养的a步骤进行说明。

在a步骤中，将多潜能干细胞用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径作用物质进行处理后，在第一步骤中进行悬浮培养，由此多潜能干细胞的状态发生变化，非神经上皮组织的形成效率改善，聚集体的素质提高，容易分化，不易产生细胞死亡，可以高效率地制备聚集体的内部密集的维持未分化性的细胞聚集体。

步骤(a)优选在不存在饲养细胞的条件下实施。

本发明中的不存在饲养细胞的条件(无饲养细胞)是指实质上不含饲养细胞(例如：相对于总细胞数，饲养细胞数的比例为3％以下)的条件。

对步骤(a)中使用的培养基而言，只要是在无饲养细胞条件下能够实现多潜能干细胞的未分化维持培养的培养基(无饲养细胞培养基)即可，没有特别限定。可列举例如：包含未分化维持因子，并包含TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径作用物质的培养基。

步骤(a)中使用的培养基为了能够实现未分化维持培养而包含未分化维持因子。用于维持未分化的因子没有特别限制，只要是具有抑制多潜能干细胞的分化的作用的物质即可。作为本领域普通技术人员广泛应用的未分化维持因子，在致敏的(primed)多潜能干细胞(例如，人ES细胞，人iPS细胞)的情况下，可列举：FGF信号转导途径作用物质、TGFβ家族信号转导途径作用物质、胰岛素等。作为FGF信号转导通路作用物质，具体而言可列举：成纤维细胞生长因子(例如，bFGF、FGF4、FGF8)。另外，作为TGFβ家族信号转导通路作用物质，可列举：TGFβ信号转导通路作用物质、Nodal/激活蛋白信号转导通路作用物质。作为TGFβ信号转导通路作用物质，可列举例如TGFβl、TGFβ2。作为Nodal/激活蛋白信号转导通路作用物质，可列举例如：Nodal、激活蛋白A、激活蛋白B。培养人多潜能干细胞(人ES细胞，人iPS细胞)时，步骤(a)中的培养基优选为作为未分化维持因子而包含bFGF。

用于本发明的未分化维持因子通常是维持哺乳动物未分化状态的因子。关于哺乳动物，可列举上文提及的那些。由于未分化维持因子可以在哺乳动物物种之间具有交叉反应性，因此也可以使用用于维持任何哺乳动物未分化状态的因子，只要能够维持要培养的多潜能干细胞的未分化状态即可。优选地，使用与要培养的细胞是同一物种的哺乳动物的未分化维持因子。例如，对于人多潜能干细胞的培养，使用人的未分化维持因子(例如，bFGF，FGF4，FGF8，EGF，Nodal，激活蛋白A，激活蛋白B，TGFβ1，TGFβ2等)。在此“人蛋白质X”是指蛋白质X(未分化维持因子等)具有在人生物体内天然表达的蛋白质X的氨基酸序列。

在本发明中使用的保持未分化因子优选经过分离。

“分离”是指进行除去作为目标的成分、细胞以外的因子的操作而脱离了天然存在的状态。因此，在“经过分离的蛋白质X”中，不包括由培养对象的细胞、组织产生的细胞、在组织及培养基中包含的内源性的蛋白质X。“经过分离的蛋白质X”的纯度(蛋白质X的重量占总蛋白质重量的百分率)通常为70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上，进一步优选为99％以上，最优选为100％。

在一种实施方式中，本发明包括提供经过分离的未分化维持因子的步骤。另外，在一种实施方式中，包括向步骤(a)中使用的培养基中外来地(或外因地)添加经过分离的未分化维持因子的步骤。或者，也可以在步骤(a)中使用的培养基中预先添加未分化维持因子。

步骤(a)中使用的培养基中的未分化维持因子浓度为能够维持所培养的多潜能干细胞的未分化状态的浓度，对于本领域技术人员而言可以适当设定。例如，在不存在饲养细胞的条件下作为未分化维持因子使用bFGF的情况下，其浓度通常为约4ng/mL～500ng/mL、优选为约10ng/mL～约200ng/mL，更优选为约30ng/mL～150ng/mL。

关于无饲养细胞的培养基，已经开发了多种合成的培养基并且已市售，例如，可列举Essential 8培养基。Essential 8培养基是在DMEM/F12培养基中作为添加剂包含以下各项：L-抗坏血酸-2-磷酸镁(64mg/L)，硒酸钠(14μg/L)，胰岛素(19.4mg/L)，NaHCO₃(543mg/L)，转铁蛋白(10.7mg/L)，bFGF(100ng/mL)，及TGFβ家族信号转导途径作用物质(TGFβl(2ng/mL)或Nodal(100ng/mL))(Nature Methods，8，424-429(2011))。作为市售的无饲养细胞培养基，可列举例如：Essential 8(Life Technologies公司制)，S-medium(DS PharmaBiomedical公司制)，StemPro(Life Technologies公司制)，hESF9，mTeSR1(STEMCELLTechnologies公司制)，mTeSR2(STEMCELL Technologies公司制)，TeSR-E8(STEMCELLTechnologies公司制)。除了这些之外，可列举StemFit(由Ajinomoto Co.，Inc.制)作为无饲养细胞培养基。可在上述步骤(a)中通过使用它们而简便地实施本发明。StemFit培养基如Nakagawa et al.Scientific Reports，4，3594，2014.中记载的那样，作为未分化维持成分含有bFGF。

在步骤(a)中使用的培养基可以为血清培养基也可以为无血清培养基，从避免化学未确定的成分的混入的观点出发，优选为无血清培养基。

从避免化学未确定的成分的混入的观点出发，在步骤(a)中使用的培养基优选为含有成分经过化学确定的培养基。

步骤(a)中多潜能干细胞的培养可以在悬浮培养及贴壁培养中的任一个条件下进行，优选为利用贴壁培养进行。

在步骤(a)中无饲养细胞条件下的多潜能干细胞的培养中，作为培养基可以使用上述无饲养细胞培养基。

在步骤(a)中无饲养细胞条件下的多潜能干细胞的培养中，可以使用适当的基质作为构架，用于给多潜能干细胞提供替代饲养细胞的构架。通过作为构架的基质而在表面进行了涂覆的细胞容器中贴壁培养多潜能干细胞。

关于可以用作构架的基质，可列举：层粘连蛋白(Nat Biotechnol 28，611-615(2010))，层粘连蛋白片段(Nat Commun 3，1236(2012))，基膜制剂(Nat Biotechnol 19，971-974(2001))，明胶，胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，entactin，玻连蛋白(Vitronectin)等。

“层粘连蛋白”是指包含α，β，γ链的异三聚物分子，为存在亚单元链的组成不同的亚型的细胞外基质蛋白质。具体而言，层粘连蛋白以5种α链、4种β链及3种γ链的杂三聚物的组合计，有约15种亚型。层粘连蛋白的名称通过将α链(α1-α5)、β链(β1-β4)和γ链(γ1-γ4)各自的数目进行组合而确定。例如，具有α5链、β1链、γ1链的组合的层粘连蛋白称为层粘连蛋白511。在本发明中，优选使用层粘连蛋白511(Nat Biotechnol 28，611-615(2010))。

本发明中使用的层粘连蛋白片段没有特别限制，只要其具有与多潜能干细胞的黏附性并且允许在无饲养细胞的条件下维持培养多潜能干细胞即可，并且其优选是E8片段。在通过用弹性蛋白酶消化层粘连蛋白511得到的多个片段中，层粘连蛋白E8片段被鉴定为具有强细胞黏附活性的片段(EMBO J.，3：1463-1468，1984，J.Cell Biol.，105：589-598，1987)。在本发明中，优选使用层粘连蛋白511的E8片段(Nat Commun 3，1236(2012)，Scientific Reports 4，3549(2014))。用于本发明的层粘连蛋白E8片段不需要是层粘连蛋白的弹性蛋白酶消化产物，并且可以是重组体。或可以为在基因重组动物(蚕等)中产生的那些。为了避免未确定成分的混入，在本发明中优选使用重组体的层粘连蛋白片段。层粘连蛋白511的E8片段已经市售，并可以从例如Nippi，Inc.等购买。

从避免未确定成分的混入的观点出发，在本发明中使用的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段优选经过分离。

优选地，在步骤(a)中无饲养细胞条件下的多潜能干细胞的培养中，将人多潜能干细胞在用经过分离的层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的E8片段(最优选地，层粘连蛋白511的E8片段)涂覆表面的细胞容器中贴壁培养。

步骤(a)中多潜能干细胞的培养时间没有特别限定，在可实现继续提高步骤(1)中形成的聚集体的素质的效果的范围内即可，通常为0.5～144小时、优选为2～96小时，更优选为6～48小时，进一步优选为12～48小时，更进一步优选为18～28小时(例如，24小时)。

即，步骤(a)在步骤(1)开始的0.5～144小时(优选地，18～28小时)前开始，在步骤(a)结束之后步骤(1)继续进行。

步骤(a)中的培养温度，CO₂浓度等培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30℃～约40℃，优选为约37℃。另外，CO₂浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。

优选在一种实施方式中，将人多潜能干细胞(例如：人ES细胞，人iPS细胞)在不存在饲养细胞的条件下，在含有bFGF的无血清培养基中贴壁培养。该贴壁培养优选为在用层粘连蛋白511、层粘连蛋白511的E8片段或玻连蛋白对表面进行涂覆的细胞容器中实施。对该贴壁培养而言，优选地，作为无饲养细胞培养基使用StemFit实施。

优选在一种实施方式中，将人多潜能干细胞(例如：人ES细胞，人iPS细胞)在不存在饲养细胞的条件下，在含有bFGF的无血清培养基中悬浮培养。在悬浮培养中，人多潜能干细胞可以形成人多潜能干细胞聚集体。

Sonic hedgehog(以下，有时记作Shh)信号转导途径作用物质是指可增强由Shh介导的信号转导的物质。作为Shh信号转导途径作用物质，可列举例如：属于Hedgehog家族的蛋白质(例如：Shh、Ihh)，Shh受体，Shh受体激动剂，Smo激动剂，嘌吗啡胺，GSA-10，Hh-Ag1.5，20(S)-羟基胆固醇或SAG(Smoothened Agonist；N-甲基-N′-(3-吡啶基苄基)-N′-(3-氯苯并[b]噻吩-2-羰基)-1，4-二氨基环己烷)等。Shh信号转导途径作用物质优选为SAG。

培养基中的Shh信号转导途径作用物质的浓度可在能够实现上述效果的范围内适当设定。SAG在步骤(a)中通常以约1nM～约2000nM、优选为约10nM～约1000nM，更优选为约10nM～约700nM，进一步优选为约50nM～约700nM，特别优选为约100nM～约600nM，最优选为约100nM～约500nM的浓度使用。当使用除了SAG以外的Shh信号转导途径作用物质时，优选地以赋予与上文提及的浓度的SAG的活性等同的Shh信号转导促进活性的浓度使用。Sonichedgehog信号转导促进活性可以以本领域技术人员众所周知的方法，例如通过关注Glil基因的表达的报告基因检测来确定(Oncogene(2007)26，5163-5168)。例如，作为具有相当于10nM～700nM的SAG的Sonic hedgehog信号转导促进活性的Shh转导途径作用物质，可列举：20nM～2μM的嘌吗啡胺，20nM～3μM的GSA-10，10nM～1μM的Hh-Ag1.5等。

TGFβ家族信号转导途径(即TGFβ超家族信号转导途径)是指以TGFβ，Nodal/激活蛋白，或BMP为配体，在细胞内由Smad家族转导的信号转导途径。

TGFβ家族信号转导通路抑制物质表示抑制GFβ家族信号转导通路，即由Smad家族转导的信号转导通路的物质，具体而言可列举：TGFβ信号转导通路抑制物质、Nodal/激活蛋白信号转导通路抑制物质和BMP信号转导通路抑制物质。作为TGFβ家族信号转导途径抑制物质，优选TGFβ信号转导途径抑制物质。

作为TGFβ信号转导通路抑制物质没有特别限定，只要为抑制TGFβ引起的信号转导通路的物质即可，可为核酸、蛋白质、低分子有机化合物中的任一种。作为该物质，可列举例如：直接作用于TGFβ的物质(例如，蛋白质、抗体、适体等)、抑制编码TGFβ的基因的表达的物质(例如，反义寡核苷酸、siRNA等)、抑制TGFβ受体与TGFβ的结合的物质、抑制由TGFβ受体的信号转导而引起的生理活性的物质(例如，TGFβ受体的抑制剂、Smad的抑制剂等)。作为TGFβ信号转导通路抑制物质而为人所知的蛋白质，可列举Lefty等。

作为TGFβ信号转导途径抑制物质，可以使用本领域技术人员众所周知的化合物。具体而言，可列举：SB431542(本说明书中，有时简写为SB431)，SB505124，SB525334，LY2157299，LY2109761，GW788388，LY364947，SD-208，EW-7197，A 83-01，RepSox等Alk5/TGFβR1抑制剂，SIS3等SMAD3抑制剂。在此，SB431542(4-(5-苯[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺)及A 83-01(3-(6-甲基-2-吡啶)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-羧硫基酰胺)为作为TGFβ受体(ALK5)及激活蛋白受体(ALK4/7)的抑制剂(即TGFβR抑制剂)而公知的化合物。SIS3为阻碍作为处于TGFβ受体的控制下的细胞内信号转导因子的SMAD3的磷酸化的TGFβ信号转导途径抑制物质。本发明中使用的TGFβ信号转导途径抑制物质优选为SB431542或A-83-01。

培养基中的TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度可以在能实现上述效果的范围内适当设定。在作为步骤(a)中的TGFβ转导途径抑制物质使用SB431542的情况下，通常以约1nM～约100μM、优选为约10nM～约50μM，更优选为约100nM～约50μM，进一步优选为约1μM～约10μM的浓度使用。另外，在使用除了SB431542以外的TGFβ信号转导途径抑制物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的SB431542等同的TGFβ信号转导途径抑制活性的浓度使用。

<步骤(1)>

对将在未分化条件下维持的多潜能干细胞、优选为步骤(a)得到的多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成的第一步骤进行说明。

Wnt信号转导途径是指以Wnt家族·蛋白质为配体，主要以Frizzled作为受体的信号转导途径。作为该信号途径，除了由β-连环蛋白转导的经典Wnt途径(Canonical Wntpathway)之外，可列举β-连环蛋白(β-Catenin)非依赖性的非经典Wnt途径(Non-CanonicalWnt pathway)等。作为非经典Wnt途径，可列举：平面细胞极性(Planar Cell Polarity，PCP)途径，Wnt/Calcium途径，Wnt-RAP1途径，Wnt-Ror2途径，Wnt-PKA途径，Wnt-GSK3MT途径，Wnt-aPKC途径，Wnt-RYK途径，Wnt-mTOR途径等。在非经典Wnt途径中，存在着在除了Wnt以外的其它信号转导途径中也被活化的共用的信号转导因子，但在本发明中将这些因子也作为Wnt信号转导途径的构成因子，将针对这些因子的抑制物质也包括在Wnt信号转导途径抑制物质中。

在本发明中，Wnt信号转导途径抑制物质没有限制，只要能抑制由Wnt家族·蛋白质诱发的信号转导即可。可以为核酸，蛋白质，低分子有机化合物中的任一种。作为该物质，可列举例如：抑制Wnt的加工和向胞外的分泌的物质，直接作用于Wnt的物质(例如：蛋白质，抗体，适体等)，抑制编码Wnt的基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸，siRNA等)，抑制Wnt受体和Wnt的结合的物质，抑制经由Wnt受体的信号转导引起的生理活性的物质。对于作为Wnt信号转导途径抑制物质为人所知的蛋白质，可列举属于分泌型卷曲相关蛋白(secretedFrizzled Related Protein，sFRP)类的蛋白质(sFRP1～5，Wnt Inhibitory Factor-1(WIF-1)，Cerberus)，属于Dickkopf(Dkk)类的蛋白质(Dkk1～4，Kremen)等。

作为Wnt信号转导途径抑制物质，可以使用本领域技术人员众所周知的化合物。作为Wnt信号转导途径抑制物质，可列举例如：Porcupine抑制剂(也称为PORCN抑制剂)，Frizzled抑制剂，Dv1抑制剂，Tankyrase抑制剂(也称为TANK抑制剂)，酪蛋白激酶1抑制剂，连环蛋白反应性转录抑制剂，p300抑制剂，CBP抑制剂，BCL-9抑制剂(Am J CancerRes.2015；5(8)：2344-2360)等。另外，虽然没有报告作用机制，作为Wnt信号转导途径抑制物质仍可列举KY 02111，KY03-I。

作为PORCN抑制剂，可列举例如：IWP-2，IWP-3，IWP-4，IWP-L6，IWP-12，LGK-974，ETC-159，GNF-6231，Wnt-C59等。

作为TANK抑制剂，可列举例如：IWR1-endo，XAV939，MN-64，WIKI4，TC-E 5001，JW55，AZ6102等。

本发明中使用的Wnt信号转导途径抑制物质优选为PORCN抑制剂，TANK抑制剂或KY02111，更优选为PORCN抑制剂。

本发明中使用的PORCN抑制剂优选为IWP-2或Wnt-C59。本发明中使用的TANK抑制剂优选为XAV939。

本发明中使用的Wnt信号转导途径抑制物质，也优选具有相对于非经典Wnt途径(Non-Canonical Wnt pathway)的抑制活性。作为具有相对于非经典Wnt途径的抑制活性的Wnt信号转导途径抑制物质，可列举例如：PORCN抑制剂，抗Frizzled抗体，Box5肽等。Porcupine已知除了作为经典Wnt途径的配体的Wnt1、Wnt3a等以外，也参与作为非经典Wnt途径的配体的Wnt5a、Wnt5b、Wnt11的脂质修饰(Dev Biol.2012Jan15；361(2)：392-402.，Biochem J.2007Mar 15；402(Pt 3)：515-523.)，PORCN抑制剂抑制经典Wnt途径和非经典Wnt途径这两者。

培养基中的Wnt信号转导通路抑制物质的浓度在能实现上述效果的范围内可适宜设定。例如，作为Wnt信号转导途径抑制物质使用为PORCN抑制剂的一种的IWP-2时，其浓度为通常约0.01μM～约30μM、优选为约0.1μM～约30μM，更优选为约2μM。使用为PORCN抑制剂的一种的Wnt-C59时，其浓度为通常约1pM～约30μM、优选为约100pM～约30μM，更优选为约1nM～约1μM。使用为TANK抑制剂的一种的XAV939时，其浓度为通常约0.01μM～约30μM、优选为约0.1μM～约30μM，更优选为约1μM。使用KY 02111时，其浓度为通常约0.01μM～约30μM、优选为约0.1μM～约30μM，更优选为约5μM。

步骤(1)中，优选在Wnt信号转导途径抑制物质及TGFβ信号转导途径抑制物质存在下悬浮培养。

作为步骤(1)中使用的TGFβ信号转导途径抑制物质，可以使用与步骤(a)中例示的相同的那些。步骤(a)及步骤(1)的TGFβ信号转导途径抑制物质可以相同也可以不同、优选为相同。

培养基中的TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度可以在能实现上述效果的范围内适当设定。在作为TGFβ信号转导途径抑制物质使用SB431542的情况下，通常以约1nM～约100μM、优选为约10nM～约50μM，更优选为约100nM～约50μM，进一步优选为约500nM～约10μM的浓度使用。另外，在使用除了SB431542以外的TGFβ信号转导途径抑制物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的SB431542等同的TGFβ信号转导途径抑制活性的浓度使用。

用于步骤(1)的培养基没有特别限制，只要是上文提及的定义部分记载的那些即可。用于步骤(1)的培养基可以是含血清培养基或无血清培养基。从避免化学上未确定的成分的混入的观点出发，本发明中优选使用无血清培养基。为了避免复杂的制备，例如优选使用：适量添加了市售的KSR等血清代替物的无血清培养基(例如：在IMDM和F-12的1∶1的混合液中添加了5％KSR，450μM 1-一硫代甘油及1x化学成分确定的脂质浓缩物的培养基，或在GMEM中添加了5％～20％KSR，NEAA，丙酮酸，2-巯基乙醇的培养基)。关于向无血清培养基中的KSR的添加量，例如在人ES细胞的情况下通常为约1％～约30％、优选为约2％～约20％。

在步骤(1)中聚集体的形成之时，优选首先进行步骤(a)得到的多潜能干细胞的分散操作。关于通过分散操作得到的“经分散的细胞”，可列举例如以70％以上为单个细胞，30％以下为2～50个细胞的细胞团块存在的状态。作为经分散的细胞，优选可列举以80％以上为单个细胞、20％以下为2～50个细胞的细胞团块存在的状态。关于经分散的细胞，可列举细胞之间的黏附(例如面黏附)几乎消失的状态。在一部分实施方式中，经分散的细胞是指细胞-细胞间连接(例如，粘附连接)几乎消失的状态。

步骤(a)得到的多潜能干细胞的分散操作可包括上文所述的机械分散处理，细胞分散液处理，添加细胞保护剂的处理。这些处理可以联合进行。优选地，可在添加细胞保护剂的处理的同时进行细胞分散液处理，然后进行机械分散处理。

作为用于添加细胞保护剂的处理的细胞保护剂，可列举：FGF信号转导途径作用物质，肝素，ROCK抑制物质，肌球蛋白抑制物质，血清，或血清代替物。关于优选的细胞保护剂，可列举ROCK抑制物质。为了抑制由分散诱导的多潜能干细胞(特别是人多潜能干细胞)的细胞死亡，也可以从第一步骤培养开始时添加Rho相关卷曲螺旋(Rho-associated coiled-coil)激酶(ROCK)的抑制物质。作为ROCK抑制物质，可列举：Y-27632，Fasudil(HAl077)，H-1152，HA-100等。或者，也可以使用制作好的细胞保护剂。作为制作好的细胞保护剂，可列举例如：RevitaCell Supplement(Thermo Fisher Scientific公司制)，CloneR(StemcellTechnologies公司制)。

关于用于细胞分散处理的细胞分散液，可列举包含胰蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、DNA酶、木瓜蛋白酶等酶类，和乙二胺四乙酸等螯合剂中的任一种的溶液。也可以使用市售的细胞分散液，例如：TrypLE Select(Thermo FisherScientific公司制)、TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific公司制)，Accumax(Innovative Cell Technologies公司制)。

将经分散的细胞悬浮在上述培养基中。

然后，将经分散的多潜能干细胞的混悬液接种在上文提及的培养容器中，将经分散的多潜能干细胞在相对于培养容器为非黏附性的条件下培养，由此由此使多个细胞汇聚而形成聚集体。

此时，可以通过将经分散的多潜能干细胞接种在诸如10cm平皿的比较大的培养器中，从而在1个培养器中同时形成多个细胞的聚集体，但从不易产生每个聚集体的大小的偏差的观点出发，优选在例如96孔微量滴定板的这样的多孔板(U底，V底)的各孔中加入一定数量的经分散的多潜能干细胞，并静置培养时，细胞迅速凝聚，从而在各孔中形成1个聚集体。通过从多个孔回收在各孔中形成的聚集体，可以得到均一聚集体的群体。

步骤(1)中，从为了避免聚集体的复杂的制备的观点出发，可以使用能在各孔内放有聚集体的状态下将板全部的培养基一次性更换的三维细胞培养容器。作为三维细胞培养容器，可列举例如PrimeSurface96有缝孔板(住友BakeLite公司制)等。

步骤(1)中的多潜能干细胞的浓度可以适当设定使得更均一，有效地形成细胞的聚集体。例如，当使用96孔微孔板悬浮培养人多潜能干细胞(例如，由步骤(a)得到的人ES细胞、人iPS細胞)时，将配置使得每孔通常约1×103～约1×10⁵细胞、优选为约3×10³～约5×10⁴细胞，更优选为约4×10³～约2×10⁴细胞，进一步优选为约4×10³～约1.6×10⁴细胞，特别优选为约8×10³～约12×10⁴细胞的液体添加于孔中，将板静置而形成聚集体。

步骤(1)中的培养温度、CO₂浓度等培养条件可适当设定。培养温度例如为约30℃～约40℃，优选为约37℃。CO₂浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。

在步骤(1)中，当进行培养基更换操作时，可列举例如：不丢弃原有培养基且加入新培养基的操作(添加培养基操作)，弃掉半量左右(原有培养基的体积量的30～90％左右，例如40～60％左右)的原有培养基且加入半量左右(原有培养基的体积量的30～90％，例如40～60％左右)的新培养基的操作(半量培养基更换操作)，弃掉全量左右(原有培养基的体积量的90％以上)的原有培养基并加入全量左右(原有培养基的体积量的90％以上)的新培养基的操作(全量培养基更换操作)。

当在特定时间点添加特定成分(例如：诱导分化因子)时，可以进行例如在计算终浓度的基础上，丢弃半量左右的原有培养基，并加入半量左右的含有比最终浓度还高的特定的成分的新培养基的操作(半量培养基更换操作)。

当通过在特定时间点稀释而降低原有培养基中包含的成分的浓度时，例如，可以每天多次进行培养基更换操作，优选在1小时内进行多次(例如，2-3次)。此外，当通过在特定时间点进行稀释而降低原有培养基中包含的成分的浓度时，可以将细胞或聚集体转移到另一个培养容器中。

培养基更换操作中使用的工具没有特别限制，可列举例如：移液管、微量移液管(PIPETMAN)、多通道微量移液管(MULTICHANNEL PIPETMAN)、连续的分配器等。例如，使用96孔板作为培养容器的情况下，可以使用多通道微量移液管。

对用于形成细胞的聚集体所必需的悬浮培养的时间而言，能够以使得细胞均一地聚集的方式根据使用的多潜能干细胞而适当确定，但为了形成均一的细胞的聚集体，优选为尽可能短的时间。从经分散的细胞到形成细胞聚集体的步骤可分为：细胞发生汇聚的步骤；及汇聚的细胞形成细胞聚集体的步骤。对从接种经分散的细胞的时刻(即悬浮培养开始时)到细胞发生汇聚而言，例如：在为人多潜能干细胞(例如，人ES细胞，人iPS细胞)的情况下，优选为约24小时以内，更优选为约12小时以内形成汇聚的细胞。在从接种经分散的细胞的时刻(即悬浮培养开始时)到形成细胞聚集体的步骤中，例如：在为人多潜能干细胞(例如，人ES细胞，人iPS细胞)的情况下，优选在约72小时以内，更优选为约48小时以内形成聚集体。所述到形成凝集体的时间可通过调整进行细胞凝集的器具、离心条件等而适宜调节。

对细胞的聚集体的形成而言，可以基于聚集体的尺寸及细胞数目，宏观形态，采用组织染色分析的微观形态及其均一性、分化及未分化标记的表达及其均一性、分化标记的表达控制及其同步性、聚集体间的分化效率的再现性等而判断。

在聚集体形成后，也可以直接继续进行聚集体的培养。步骤(1)中的悬浮培养的时间通常为约8小时-6天，优选约12小时-48小时。

<步骤(2)>

对将步骤(1)得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，得到包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块的第二步骤进行说明。

BMP信号转导途径作用物质是指能够增强由BMP介导的信号转导的物质。作为BMP信号转导途径作用物质，可列举例如：BMP2，BMP4或者BMP7等BMP蛋白质，GDF7等GDF蛋白质，抗BMP受体抗体或BMP部分肽等。

BMP2蛋白质及BMP4蛋白质可获自例如R&D Systems公司，BMP7蛋白质可获自Biolegend公司，GDF7蛋白质可获自例如和光纯药公司。BMP信号转导途径作用物质优选为BMP4。

培养基中BMP信号转导途径作用物质的浓度可以在能实现上述效果的范围内适当设定。在作为BMP信号转导途径作用物质使用BMP4的情况下，通常以约1pM～约100nM、优选为约10pM～约50nM，更优选为约100pM～约25nM，进一步优选为约250pM～约10nM的浓度使用。另外，在使用除了BMP4以外的BMP信号转导途径作用物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的BMP4等同的BMP信号转导途径增强活性的浓度使用。

步骤(2)中使用的培养基没有特别限定，只要包含BMP信号转导途径作用物质即可。用于步骤(2)的培养基可以是含血清培养基或无血清培养基。从避免化学上未确定的成分的混入的观点出发，本发明中优选使用无血清培养基。为了避免复杂的制备，例如优选使用：适量添加了市售的KSR等血清代替物的无血清培养基(例如：在IMDM和F-12的1∶1的混合液中添加了5％KSR，450μM 1-一硫代甘油及1x化学成分确定的脂质浓缩物的培养基，或在GMEM中添加了5％～20％KSR，NEAA，丙酮酸，2-巯基乙醇的培养基)。关于向无血清培养基中的KSR的添加量，例如在人ES细胞的情况下通常为约1％～约30％、优选为约2％～约20％。第二步骤中，通过将第一步骤得到的多潜能干细胞的聚集体在包含BMP信号转导途径作用物质的培养基(优选地，无血清培养基)中进行悬浮培养而使细胞团块形成，由此提高细胞团块的素质。具体而言，可以高效率地形成以下细胞团块：在包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块中，1)神经系统细胞或神经组织(优选为其表面的3成以上)被2)非神经上皮组织包覆，更优选为1)神经系统细胞或神经组织与2)非神经上皮组织之间形成有30μm以上的间隙。

步骤(2)优选不添加Sonic hedgehog信号转导途径作用物质而进行，优选在实质上不存在Sonic hedgehog信号转导途径作用物质的条件下进行。步骤(2)也可以在TGFβ信号转导途径抑制物质的存在下进行。

3.包含神经系统细胞或神经组织，及非神经上皮组织的细胞团块

本发明提供以下细胞团块：所述细胞团块包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织，其中，优选为1)神经系统细胞或神经组织被2)非神经上皮组织包覆(优选为1)的表面的3成以上被2)包覆)。以下，也称为本发明的细胞团块。本发明的细胞团块可以优选通过上述本发明的制备方法制备。

本发明的细胞团块中的1)神经系统细胞或神经组织优选为中枢神经系统的细胞或组织，或其前体组织，作为中枢神经系统的细胞或组织，可列举：视网膜，大脑皮质，间脑(例如，下丘脑)及源自这些组织的细胞。

本发明的细胞团块中的2)非神经上皮组织优选具有上皮细胞极性，更优选在与1)神经系统细胞或神经组织之间具有基膜样结构。

非神经上皮组织优选为假复层上皮、复层上皮。作为非神经上皮组织，具体而言可列举：表皮或其前体组织，角膜或其前体组织，及口腔上皮或其前体组织，更优选为角膜或其前体组织。

在本发明的细胞团块中，也优选2)非神经上皮组织的一部分为基板或源自基板的组织的实施方式。作为基板可列举颅基板，作为源自基板的组织，可列举：晶状体，内耳组织，三叉神经等。

在本发明的细胞团块中，1)神经系统细胞或神经组织与2)非神经上皮组织之间可形成30μm以上、优选为40μm以上、更优选为50μm以上，通常30～1000μm的间隙。1)及2)的之间形成这样的间隙，能够实现从在内侧存在的神经系统细胞或神经组织中分离采集在外侧存在的非神经上皮组织(例如，角膜)，因而能够实现作为精度更高的移植材料提供。

1)神经系统细胞或神经组织与2)非神经上皮组织之间可以进一步形成组织(例如，包含源自神经嵴细胞的组织，包含间充质细胞的组织)。

4.非神经上皮组织片的制备方法

本发明提供非神经上皮组织片的制备方法。

本发明的非神经上皮组织片的制备方法的一种实施方式为非神经上皮组织片的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)～(4)。

本发明的非神经上皮组织片的制备方法的另外的一种实施方式为非神经上皮组织片的制备方法，其中，在上述步骤(1)～(4)之前包括下述步骤(a)。

(a)a步骤，将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中培养。

本方法中的步骤(a)，步骤(1)及步骤(2)可与上述本发明的细胞团块的制备方法中的步骤(a)，步骤(1)及步骤(2)同样进行实施。

<步骤(3)>

在步骤(3)中，从第二步骤得到的细胞团块回收非神经上皮组织的步骤通常在显微镜观察下使用镊子等，通过剥离、回收位于细胞团块的外侧的非神经上皮组织而进行。作为第三步骤中的非神经上皮组织的回收方法，可列举并优选采用冻融、优选为使用慢速冷冻法的冻融法。在该方法中，通过将在外侧具有非神经上皮组织及内侧具有神经细胞或神经组织的细胞团块冻融，由此，不施加物理处理而将外侧的非神经上皮组织从细胞团块剥离。

<步骤(4)>

在步骤(4)中，通过对第三步骤得到的非神经上皮组织进行分散处理，将经分散的细胞和/或细胞聚集体在平面上培养，由此形成源自非神经上皮组织的细胞片。分散处理可以包括上文提及的机械分散处理，细胞分散液处理，添加细胞保护剂的处理。这些处理可以联合进行。对经分散的细胞和/或细胞聚集体的平面培养而言，可适当选择采用本领域中通常实施的方法。

本发明的非神经上皮组织片的制备方法的另外的一种实施方式为非神经上皮组织片的制备方法，包括在上述步骤(1)～(4)之前进行上述步骤(a)。

5.化合物刺激性测试的实施方法

本发明可以提供使用上述“包含神经系统细胞或神经组织及非神经上皮组织的细胞团块”或“非神经上皮组织片”的化合物刺激性测试的实施方法。

作为化合物刺激性测试的实施方法，可列举被测物质的毒性、药效评价方法，其包括例如：使“包含神经系统细胞或神经组织及非神经上皮组织的细胞团块”或“非神经上皮组织片”与被测物质接触的步骤，和检验该被测物质对该细胞或该组织造成的影响的步骤。

本发明的化合物刺激性测试的实施方法的一种实施方式为化合物刺激性测试的实施方法，其中，化合物的毒性、药效评价通过利用染料的染色和提取而进行。

本发明的化合物刺激性試的实施方法的一种实施方式为化合物刺激性测试的实施方法，所述方法包括下述步骤(A)～(D)。

(A)使“包含神经系统细胞或神经组织及非神经上皮组织的细胞团块”或“非神经上皮组织片”与被测物质接触的步骤；

(B)利用染料将经与被测物质接触的“包含神经系统细胞或神经组织及非神经上皮组织的细胞团块”或“非神经上皮组织片”进行染色的步骤；

(C)从染色的“包含神经系统细胞或神经组织及非神经上皮组织的细胞团块”或“非神经上皮组织片”中提取染料的步骤；

(D)将提取到的染料的量定量，评价评价对象化合物的刺激性的步骤。

<步骤(A)>

对使“包含神经系统细胞或神经组织及非神经上皮组织的细胞团块”或“非神经上皮组织片”与被测物质接触的步骤进行说明。

被测物质和接触使对象可以为细胞团块，也可以为非神经上皮组织片。关于构成这些细胞团块或非神经上皮组织片的非神经上皮组织，优选为形成了紧密连接，更优选为假复层上皮或者复层上皮，进一步优选非神经上皮组织为角膜。也优选这些非神经上皮组织中形成了基膜样的结构。非神经上皮组织片也可以以平面的细胞培养皿，或者Transwell等薄膜状的细胞培养器材中的任意形态使用。这些细胞培养皿或者细胞培养器材可以为了促进细胞的黏附而用层粘连蛋白等细胞外基质，聚-D-赖氨酸等合成基质等涂覆。

步骤(A)中使用的被测物质可以以自身原样，或也可以用溶剂稀释而使用。作为在此时使用的稀释中使用的溶剂，优选对测试结果没有影响的那些，可以使用例如：生理盐水，PBS，HBSS，或者DMEM等细胞培养用的培养基。在被测物质在培养液中不溶，且得不到良好的悬浊性的情况下，可以根据需要将DMSO，乙醇，矿物质油等作为增溶溶剂使用。

在步骤(A)中被测物质的暴露条件中的培养温度，CO₂浓度等培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30℃～约40℃，优选为约37℃。另外，CO₂浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。关于步骤(A)中被测物质的暴露时期也可适当设定。暴露时期为例如30秒～2天、优选为1分钟～1天。

另外，为了保证实验体系的可靠性，优选与被测物质的评价同时进行而实施已知的阳性对照及阴性对照的化合物的评价。作为阳性对照化合物，可以使用相对于眼睛的损伤性、刺激性的GHS分类为1或者2的化合物，例如：十二烷基硫酸钠，乙酸，苯扎氯铵等。

<步骤(B)>

对利用染料将步骤(A)得到的经与被测物质接触的“包含神经系统细胞或神经组织及非神经上皮组织的细胞团块”或“非神经上皮组织片”进行染色的步骤进行说明。

步骤(B)中使用的染料没有限定，只要能够评价由被测物质引起的对紧密连接发生的损伤即可。这些染料中，优选相对于细胞的毒性低，对测试结果的影响较低的那些。作为一例，可列举荧光素。

步骤(B)中染料的浓度，溶解染料的溶剂，染色时间等染色条件可以适当设定。对染料的浓度而言，在使用荧光素的情况下，例如为0.0001％～1％、优选为0.02％。作为溶解染料的溶剂，例如为生理盐水，PBS，HBSS，或者DMEM等细胞培养用的培养基、优选为PBS。关于染色时间，在为荧光素的情况下，例如为10秒～10分钟、优选为30秒。作为步骤(B)中的染色条件，也可以适当实施染色前及染色后的样品的洗涤意在降低背景。

<步骤(C)>

对从步骤(B)得到的染色的“包含神经系统细胞或神经组织及非神经上皮组织的细胞团块”或“非神经上皮组织片”中提取染料的步骤进行说明。

步骤(C)中的溶解染料的溶剂，提取时间等染料的提取条件可以适当设定。作为溶解染料的溶剂，例如，生理盐水，PBS，HBSS，或者DMEM等细胞培养用的培养基、优选为与步骤(B)中使用的溶解染料的溶剂相同。关于提取时间，在使用荧光素的情况下，例如为10秒～24小时、优选为10分钟。作为步骤(C)中的提取条件，也可以将放入染色的样品的管乃至平皿进行震荡。

<步骤(D)>

对将步骤(C)得到的提取到的染料的量定量，评价评价对象化合物的刺激性的步骤进行说明。

步骤(D)中提取到的染料量的定量法没有限定，只要能够评价溶剂中的染料量即可。作为这样的定量法，可列举例如：吸光光度法，荧光分光分析法、优选为荧光分光分析法。

可以通过将步骤(D)中测定的从被测物质处理样品中提取到的染料的浓度的测定值，与阳性对照处理组及阴性对照处理组的测定值进行比较，由此对于被测物质的刺激性进行评价。

6.毒性、药效性评价用试剂等

本发明的细胞团块，根据本发明的制备方法制备的细胞团块，或通过本发明制备的非神经上皮组织片可以为感官组织。因此，可提供被测物质的毒性、药效性评价用试剂，其含有本发明的细胞团块，根据本发明的制备方法制备的细胞团块，或通过本发明制备的非神经上皮组织片。

7.治疗药物及疾病的治疗方法

本发明可提供由于感觉器官的障碍导致的疾病的治疗药物，其含有本发明的细胞团块，根据本发明的制备方法制备的细胞团块，或通过本发明制备的非神经上皮组织片。

作为由于感觉器官的障碍导致的疾病的治疗药物，可列举例如：包含本发明的细胞团块或者根据本发明的制备方法制备的细胞团块的悬浊液，或包含通过本发明制备的非神经上皮组织片的移植物。

作为悬浊液，可列举例如将细胞团块悬浊于人工泪液或生理盐水中的液。悬浊液也可以包含从细胞团块分离的非神经上皮细胞，可以包含促进细胞的黏附的因子，例如细胞外基质、透明质酸等。

包含非神经上皮组织片的移植物可以为在羊膜或胶原蛋白凝胶膜等膜状的载体上形成有非神经上皮组织片的移植物。

进一步，可提供由于感觉器官的障碍导致的疾病的治疗方法，包括从本发明的细胞团块，根据本发明的制备方法制备的细胞团块，或通过本发明制备的非神经上皮组织片，将非神经上皮组织的有效量移植至有需要进行移植的对象的步骤。

上述治疗药物或治疗方法当细胞团块中包含的非神经上皮组织为角膜上皮组织的情况下，可以用于屏障功能等角膜上皮的功能受损的疾病的治疗。作为所述疾病，可列举例如：复发性的角膜营养不良，斯蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)，化学外伤及角膜上皮干细胞缺乏症等。

上述由于感觉器官的障碍导致的疾病也可以是由于感觉器官的障碍导致的动物的疾病，也可以是由于视觉器官，听觉器官，嗅觉器官，味觉器官，皮肤等感觉器官的障碍导致的非人动物的疾病。

实施例

以下结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的范围不受其限定。另外，使用的试剂及材料没有特别限定，只要能够商业获取即可。

比较例1：由人ES细胞制作的神经组织

人ES细胞(KhES-1株，从京都大学获得)基于Scientific Reports，4，3594(2014)中记载的方法在无饲养细胞条件下培养。作为无饲养细胞培养基使用了StemFit培养基(AK02N，Ajinomoto Co.，Inc.制)，无饲养细胞构架使用了层粘连蛋白511-E8(Nippi公司制)。

作为具体维持培养操作，首先亚汇合的人ES细胞(KhES-1株)利用PBS洗涤之后，使用Accumax(Innovative Cell Technologies公司制)进行酶处理后，添加StemFit培养基并使用细胞刮刀从培养皿表面剥下细胞，通过吹打分散成单一细胞。之后，将上述分散为单一细胞的人ES细胞接种在利用层粘连蛋白511-E8包被的塑料培养皿中，在Y27632(ROCK抑制物质，和光纯药公司制，10μM)的存在下，利用StemFit培养基进行了无饲养细胞培养。作为上述塑料培养皿而使用了6孔板(Corning公司制，细胞培养用，培养面积9.5cm²)的情况下，使上述分散为单一细胞的人ES细胞的接种细胞数为1.2×10⁴。接种1天后，总量培养基更换为不包含Y27632的StemFit培养基。然后，1-2天一次将全部量的培养基更换为不含Y27632的StemFit培养基。之后，培养至接种的7天后达到亚汇合(培养面积的6成覆盖细胞的程度)。将培养的细胞用于诱导分化中时，接种的6天后与Stemfit培养基的培养基更换同时添加了SB-431542(TGF-β信号转导途径抑制物质，和光纯药公司制，5μM)和SAG(Shh信号途径作用物质，Enzo Life Sciences公司制，300nM)。

将如上所述地制作的亚汇合的人ES细胞利用PBS洗涤之后，使用Accumax进行了酶处理后，添加诱导分化用的无血清培养基并使用细胞刮刀从培养皿表面剥下细胞，通过吹打分散成单一细胞。

之后，将上述分散成单个细胞的人ES细胞以在非细胞黏附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V底板，住友BakeLite公司制)的每1孔为1×10⁴细胞的方式而漂浮在100μl的无血清培养基中，在37℃，5％CO₂的条件下悬浮培养。关于此时的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用了在F-12+Glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)和IMDM+Glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)的1∶1混合液中添加了5％Knockout血清替代物(Thermo Fisher Scientific公司制)，450μM 1-一硫代甘油(和光纯药公司制)，1x化学成分确定的脂质浓缩物(Thermo Fisher Scientific公司制)，50单位/ml青霉素-50μg/ml链霉素(Nacalai Tesque公司制)的无血清培养基。悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天，步骤1开始)，在上述无血清培养基中添加了Y27632(终浓度20μM)，IWP-2(Wnt信号转导途径抑制物质，Tocris Bioscience公司制，2μM)，SB-431542(TGF-β信号转导途径抑制物质，和光纯药公司制，1μM)。之后，在悬浮培养开始后第3天，以每1孔100μl加入了不含有Y27632，包含IWP-2及SB-431542的无血清培养基。之后，在悬浮培养开始后第6，10，13，17，21，24天使用不含有Y27632，包含IWP-2和SB-431542(图1中，也简称SB431)的无血清培养基进行半量培养基更换。在悬浮培养开始后第28天将细胞团块回收至平皿中，使用倒置显微镜(Keyence公司制，BIOREVO)进行明场观察(图1A-B)。图1A右下的比例尺表示1000μm，图1B右下的比例尺表示200μm。其结果，通过上述诱导分化法由人多潜能干细胞形成了细胞团块。

将上述悬浮培养开始后第28天的细胞团块，分别用4％多聚甲醛室温固定15分钟之后，在20％蔗糖/PBS用4℃浸泡过夜，在冷冻保护处理之后，制作成冷冻切片。对于这些冷冻切片，使用针对神经及视网膜组织中表达的RLDH3的抗体(Sigma Aldrich公司制，兔)，抗Chx10抗体(Santa Cruz Biotechnology公司制，山羊)，抗Rx抗体(TAKARABio公司制，豚鼠)，为大脑皮质标记的抗Bf1抗体(TAKARABio公司制，兔)，为角膜及中枢神经系统标记的抗Pax6抗体(Covance公司制，兔)，为角膜、非神经组织标记的抗泛细胞角蛋白(Pan CK)抗体(Sigma Aldrich公司制，小鼠)，为神经细胞标记的抗βIII微管蛋白(Tuj1)抗体(SigmaAldrich公司制，小鼠)，为神经上皮标记的抗N-钙黏着蛋白抗体(BD Bioscience公司制，小鼠)实施了荧光免疫染色。作为荧光标记二次抗体，使用了Alexa488标记驴抗兔抗体(Thermo Fisher Scientific公司制、)，CF555标记驴抗小鼠抗体(Biotium公司制)，CF555标记驴抗山羊抗体，CF543标记驴抗豚鼠抗体，Alexa647标记驴抗小鼠抗体进行多重染色，在核的对比染色中使用了Hoechst33342(Sigma Aldrich公司制)。

在染色的切片的观察及图像的获得中使用了正置荧光显微镜Axio Imager M2及附属软件Axio Vision(Carl Zeiss公司制)。图1C右下的比例尺表示200μm。图1F为与图1C，D，E，图1J为与图1G，H，I，图1M为图1K和L相对应的核的对比染色图像。

其结果，用上述诱导分化法诱导的悬浮培养开始后第28天的细胞团块为视网膜中表达的RLDH3，Chx10，Rx阴性(图1C，D，G)，大脑、中枢神经系统中表达的Bf1，Pax6阳性(图1K，H)，为神经细胞标记的Tuj1，N-钙黏着蛋白阳性(图1I，L)，因此可知为由中枢神经系统的细胞形成的细胞团块。另外，由于不能确认泛细胞角蛋白阳性的组织，可知不包含非神经系统的上皮组织(图1E)。

实施例1：由人ES细胞制作的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块

人ES细胞(KhES-1株，从京都大学获得)基于Scientific Reports，4，3594(2014)中记载的方法在无饲养细胞条件下培养。作为无饲养细胞培养基使用了StemFit培养基，无饲养细胞构架使用了层粘连蛋白511-E8。作为具体维持培养操作，与比较例1同样地实施。之后，在与比较例1相同的条件下，开始了用96孔板的悬浮培养。之后，在悬浮培养开始后第2天以每1孔100μl加入了不含有Y27632，包含IWP-2，SB-431542，BMP4的无血清培养基。关于BMP4，在添加的培养基中添加3nM，使得孔中终浓度为1.5nM。之后，在悬浮培养开始后第6，10，13，17，21，24天使用不含有Y27632和BMP，包含IWP-2和SB-431542的无血清培养基进行半量培养基更换。在悬浮培养开始后第28天将细胞团块回收至平皿中，使用倒置显微镜(Keyence公司制，BIOREVO)进行明场观察(图2A-B)。图2A右下的比例尺表示1000μm，图2B右下的比例尺表示200μm。其结果，可知通过上述诱导分化法由人ES细胞形成了包含神经组织及非神经上皮组织的直径约1mm左右的细胞团块，进一步经过悬浮培养第21天～第28天，外侧的非神经上皮组织急速膨胀，与内侧的神经组织之间形成空间。

将上述悬浮培养开始后第28天的细胞团块分别用4％多聚甲醛室温固定15分钟之后，在20％蔗糖/PBS用4℃浸泡过夜，冷冻保护处理之后，制作成冷冻切片。对于这些冷冻切片，使用为神经、视网膜组织标记的抗Chx10抗体，抗RLDH3抗体，抗CD56/NCAM抗体(BioLegend公司制，小鼠)，抗N-钙黏着蛋白抗体，为非神经上皮组织、角膜标记的抗CD326/EpCAM抗体(R&D Systems公司制，山羊)，抗Six1抗体(Sigma Aldrich公司制，兔)，抗p63抗体(Santa Cruz Biotechnology公司制，小鼠)，抗PDGFRβ抗体(R&D Systems公司制，山羊)，抗细胞角蛋白18抗体(Sigma Aldrich公司制，小鼠)，抗细胞角蛋白19抗体(Thermo FisherScientific公司制，小鼠)，抗泛细胞角蛋白抗体，为基膜标记的抗层粘连蛋白抗体(KYOWAPHARMA CHEMICAL CO.，LTD.制，小鼠)，为神经细胞标记的抗βIII微管蛋白(Tuj1)抗体，为晶状体标记的抗C-Maf抗体(R&D Systems公司制，小鼠)，抗Proxl抗体(R&D Systems公司制，山羊)，抗L-Maf抗体(abcam公司制，兔)，抗晶体蛋白αA抗体(R&D Systems公司制，山羊)，晶状体及中枢神经系统标记的抗Soxl抗体(R&D Systems公司制，山羊)，基板标记的抗Emx2抗体(R&D Systems公司制，绵羊)，为稳定的微管的标记的抗乙酰化微管蛋白抗体(Santa Cruz Biotechnology公司制，小鼠)进行荧光免疫染色。作为荧光标记二次抗体，使用Alexa488标记驴抗兔抗体，CF555标记驴抗小鼠抗体，CF555标记驴抗山羊抗体，CF543标记驴抗绵羊抗体，Alexa647标记驴抗小鼠抗体，Alexa647标记驴抗山羊抗体进行多重染色，在核的对比染色中使用了Hoechst33342(Sigma Aldrich公司制)。图2D为与C，图2F为与E，图2H为与G，图2J为与I，图2N为与K，L及M，图2P为与O，图2R为与Q，图2T为与S，图2V为与U，图2Y为与W及X，图2AB为与Z及AA，图2AE为与AC及AD，图2AH为与AF及AG，图2AK为与AI及AJ，图2AN为与AL及AM，图2AP为与AO，图2AR为与AQ，图2AV为与AS，AT及AU相对应的核的对比染色图像。在染色的切片的观察及图像的获得中使用了正置荧光显微镜Axio Imager M2及附属软件Axio Vision。图2C，图2S右下的比例尺表示200μm，图2W，AO右下的比例尺表示100μm。

其结果可知，用上述诱导分化法诱导的悬浮培养开始后第28天的细胞团块的内侧为Chx10，RLDH3，NCAM，N-钙黏着蛋白阳性的神经视网膜的上皮组织(图2C-J)，外侧为EpCAM，Six1，p63，PDGFRβ，细胞角蛋白18，19，泛细胞角蛋白阳性的角膜、眼睛表面外胚层的非神经上皮组织(图2K-V)。此外，非神经上皮组织的一部分发生肥大至厚度约100μm左右，肥大部分为C-Maf，L-Maf，Sox1，Prox1，Emx2，Pax6，N-钙黏着蛋白，晶体蛋白αA阳性、Tuj1阴性，由此可知，通过上述制备法在细胞团块中形成晶状体基板，产生了晶状体泡的陷入，以覆盖陷入的晶状体的表面的方式形成了泛细胞角蛋白，EpCAM，Six1阳性的角膜组织，在接近形成有晶状体的中心，与视网膜组织相接侧形成了层粘连蛋白阳性的基膜组织。此外，根据仅在上皮组织的一个面形成了层粘连蛋白阳性的基膜组织，由此可知形成的角膜组织具有上皮细胞极性。进一步，形成有角膜组织的细胞核是复层化的，由此可知形成的角膜组织为假复层上皮或者复层上皮(图2W-AR)。另外，可知在RLDH3，Chx10阳性的内侧的视网膜组织与泛细胞角蛋白阳性的外侧的非神经上皮组织之间，存在为泛细胞角蛋白阳性且没有上皮形成的间充质细胞(图2AS-AV)。将通过上述制备法形成的细胞团块的模式图示于图2AW。

实施例2：由人ES细胞制作的细胞团块中的神经组织与非神经上皮组织间的间隙的测定

对于上述实施例1得到的悬浮培养开始后第28天的细胞团块，用实施例1中记载的方法实施使用为神经、视网膜上皮组织标记的抗N-钙黏着蛋白抗体和为非神经上皮组织、角膜标记的抗CD326/EpCAM抗体的荧光双重染色，实施了利用荧光显微镜附属软件的AxioVision的分析(图3A-D)。图3A，图3D右下的比例尺表示200μm。其结果可知，培养第28天的细胞团块的内侧的N-钙黏着蛋白阳性的神经组织与外侧的EpCAM阳性的非神经上皮组织之间形成的间隙最小为33.37μm，最大为118.34μm，在跨细胞团块的基本周围整体在神经上皮和非神经上皮之间形成了30μm以上的间隙(图3A-D)。虽然在上述的间隙中不存在细胞核而为无细胞性，但在一部分的位置中确认到了非上皮性的细胞的分布。

实施例3：由人ES细胞制作的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的长期培养和成熟

人ES细胞(KhES-1株，从京都大学获得)基于Scientific Reports，4，3594(2014)中记载的方法在无饲养细胞条件下培养。作为无饲养细胞培养基使用了StemFit培养基，无饲养细胞构架使用了层粘连蛋白511-E8。作为具体维持培养操作，与比较例1同样地实施。之后，在与实施例1相同的条件下实施用96孔板的悬浮培养。在悬浮培养开始后第28天，将细胞团块以1只平皿48个细胞团块转移到10cm悬浮培养用平皿(住友BakeLite公司制)，使用无血清培养基培养而实施悬浮培养到第90天。在此时的无血清培养基(gfCDM+KSR)中，以每1枚平皿15ml使用在F-12+Glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)和IMDM+Glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)的1∶1混合液中添加10％Knockout血清替代物(Thermo Fisher Scientific公司制)，450μM 1-一硫代甘油(和光纯药公司制)，1x化学成分确定的脂质浓缩物(Thermo Fisher Scientific公司制)，50单位/ml青霉素-50μg/ml链霉素(Nacalai Tesque公司制)的无血清培养基，3天乃至4天交换一次半量的培养基。

将上述悬浮培养开始后第90天的细胞团块使用倒置显微镜(Keyence公司制，BIOREVO)进行明场观察(图4A-C)。图4A右下的比例尺表示1000μm，图4B，4C右下的比例尺表示200μm。观察的结果，培养第90天的细胞团块的外侧的组织在培养液中也自主地维持了球形的结构(图4A)。另外，由细胞彼此密合的上皮组织形成了外侧的中空状的组织(图4C)。观察后，将细胞团块在4％多聚甲醛中室温固定15分钟，在20％蔗糖/PBS用4℃浸泡过夜，冷冻保护处理之后，制作成冷冻切片。对于这些冷冻切片，使用为成熟角膜上皮标记的抗细胞角蛋白12抗体(Santa Cruz Biotechnology公司制，山羊)，为角膜上皮细胞标记的抗细胞角蛋白5抗体(Spring Biosciences公司制，兔)，抗粘蛋白4抗体(R&D Systems公司制，山羊)，为角膜，中枢神经系统细胞标记的抗Pax6抗体，为基膜标记的抗层粘连蛋白抗体，在与实施例1相同的条件下实施荧光免疫染色。图4D，4H，4L的右下的比例尺表示200μm。

其结果，在培养第90天的细胞团块中，外侧的非神经上皮组织延长，形成了200μm以上的间隙。上述非神经上皮组织为细胞角蛋白12，细胞角蛋白5，Mucci4阳性的角膜上皮组织，可知具有由层粘连蛋白等构成的基膜组织。此外，在角膜上皮细胞膜表面的顶端面侧表达的粘蛋白4在非神经上皮组织的外侧的面局部存在，可知形成的非神经上皮组织具有上皮细胞极性。另外，内侧的组织为Pax6阳性的视网膜、中枢神经系统的组织。根据上述的结果，可知通过悬浮培养从细胞团块可得到成熟的角膜上皮组织(图4D-N)。

实施例4：来自人ES细胞的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的制备中BMP4添加时期的研究(1)

人ES细胞(KhES-1株，从京都大学获得)基于Scientific Reports，4，3594(2014)中记载的方法在无饲养细胞条件下培养。作为无饲养细胞培养基使用了StemFit培养基，无饲养细胞构架使用了层粘连蛋白511-E8。

具体维持培养操作与比较例1同样地实施。之后，在与比较例1相同的条件下，开始了用96孔板的悬浮培养。将在悬浮培养时期中没有添加BMP信号转导途径作用物质的条件作为对照(-BMP4条件，图5A)。此外，在与悬浮培养开始同时添加BMP信号转导途径作用物质的条件(0天+BMP4条件，图5B)中，添加了人重组BMP4(R&D Systems公司制，1.5nM，步骤2开始)。之后，在悬浮培养开始后第1，2，3天添加BMP信号转导途径作用物质的条件(1～3天+BMP4条件，图5C～E)中，以每1孔100μl加入了不含有Y27632，包含IWP-2，SB-431542，BMP4的无血清培养基。关于BMP4，在添加的培养基中添加3nM，使得孔中终浓度为1.5nM。在仅0天+BMP4条件，在悬浮培养开始后第3天以每1孔100μl加入了不含有Y27632，包含IWP-2，SB-431542，BMP4的无血清培养基。在诱导分化开始后第6天添加BMP信号转导途径作用物质的条件(6天+BMP4条件，图5F)中，在诱导分化开始后第3天以每1孔100μl加入不含有Y27632和BMP4，包含IWP-2和SB-431542的无血清培养基，第6天以不含有Y27632，包含IWP-2，SB-431542，BMP4的无血清培养基进行半量培养基更换。在其它条件下，在悬浮培养开始后第6天使用不含有Y27632和BMP，包含IWP-2和SB-431542的无血清培养基进行半量培养基更换。在悬浮培养开始后第10天，使用倒置显微镜(Keyence公司制，BIOREVO)进行明场观察(图5A-F)。

其结果，在没有添加BMP4的条件下，形成表面的光滑胚样体，在胚样体表面没有确认到非神经上皮样的结构(图5A)。在与诱导分化开始同时添加了BMP4的条件(0天+BMP4)下，胚样体的形成显著受到抑制(图5B)。在诱导分化开始第1天及第2天添加了BMP4的条件(1，2天+BMP4)下，形成了包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块，其有具有神经上皮样的结构的中央部被非神经上皮样的层覆盖的二层结构(图5C，D)。将两种条件进行比较时，通过第2天添加了BMP4，形成了相比第1天添加了BMP4的条件的胚样体(图5C)而言，胚样体的直径计约1.3倍，换算为体积时约2.2倍大的胚样体(图5D)。在诱导分化开始第3天及第6天添加了BMP4的条件下，外侧的非神经上皮样的组织的形成效率低于第2天添加了BMP4的条件。根据上述的结果可知，在来自人多潜能干细胞的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的形成中，将BMP信号转导途径作用物质在悬浮培养开始后72小时以内添加有效果。

实施例5：来自人ES细胞的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的制备中BMP4添加时期的研究(2)

具体维持培养操作与比较例1同样地实施。之后，在与比较例1相同的条件下，实施了用96孔板的悬浮培养。在悬浮培养开始后第2天及第3天使用倒置显微镜进行聚集体的明场观察。图6A右下的比例尺表示200μm。观察的结果，在对BMP4的添加而言优选的时期的悬浮培养开始后第2天的聚集体在表面可见凹凸，形成了变形的形状(图6A)。另一方面，在悬浮培养开始后第3天的聚集体中，在第2天观察到的凹凸减少，呈现接近球体的形状(图6B)。

将上述悬浮培养开始后第2天及第3天的聚集体用实施例1中记载的方法固定，制作成冷冻切片。对于这些冷冻切片，使用为神经上皮标记的抗N-钙黏着蛋白(NCad)抗体及为紧密连接标记的抗ZO-1抗体(Thermo Fisher Scientific公司制，兔)进行荧光免疫染色。荧光标记二次抗体及核的对比染色使用了实施例1中记载的那些。图6C右下的比例尺表示100μm。其结果，在悬浮培养开始后第2天的聚集体中，聚集体的最表层的细胞的一部分为ZO-1阳性，形成了紧密连接(图6C)。另一方面，在悬浮培养开始后第3天的聚集体中，ZO-1阳性的细胞被摄入聚集体的内部，在最表层中没有观察到局部存在(图6E)。此外，在悬浮培养开始后第3天的聚集体中，强力表达N-钙黏着蛋白，可更明确地确认构成了外层的细胞彼此更密合的区域和聚集体内部的细胞松散的区域的二层结构(图6I，J)。根据上述的结果可知，作为用于确定包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的制备过程中的BMP4添加时期的手段，能够利用检测聚集体的最表层的细胞中紧密连接。

实施例6：来自人ES细胞的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的制备中BMP4添加浓度的研究

人ES细胞(KhES-1株，从京都大学获得)基于Scientific Reports，4，3594(2014)中记载的方法在无饲养细胞条件下培养。作为无饲养细胞培养基使用了StemFit培养基，无饲养细胞构架使用了层粘连蛋白511-E8。作为具体维持培养操作，与比较例1同样地进行。

将如上所述地制作的亚汇合的人ES细胞利用PBS洗涤之后，使用Accumax进行了酶处理后，添加诱导分化用的无血清培养基并使用细胞刮刀从培养皿表面剥下细胞，通过吹打分散成单一细胞。之后，将上述分散成单个细胞的人ES细胞以在非细胞黏附性的96孔培养板(PrimeSurface96V底板，住友BakeLite公司制)的每1孔为1×10⁴细胞的方式而漂浮在100μl的无血清培养基中，在37℃，5％CO₂的条件下悬浮培养。关于此时的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用了在F-12+Glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)和IMDM+Glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)的1：1混合液中添加了5％Knockout血清替代物(Thermo Fisher Scientific公司制)，450μM 1-一硫代甘油(和光纯药公司制)，1x化学成分确定的脂质浓缩物(Thermo Fisher Scientific公司制)，50u/ml青霉素-50μg/ml链霉素(Nacalai Tesque公司制)的无血清培养基。悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天，步骤1开始)向上述无血清培养基中添加了Y27632(终浓度20μM)，IWP-2(2μM)，SB-431542(1μM)。在悬浮培养开始后第2天，以每1孔100μl加入了不含有Y27632，包含IWP-2，SB-431542，BMP4的无血清培养基。其时，使BMP4的添加量为0.1nM、0.25nM、0.5nM、0.75nM、1nM、1.5nM、5nM及无添加对照这8个条件。BMP4以在添加的培养基中为设定的条件的2倍的浓度进行添加，使得孔中终浓度达到设定的条件。悬浮培养开始后第6天，使用不含有Y27632和BMP，包含IWP-2和SB-431542的无血清培养基进行半量培养基更换。在悬浮培养开始后第10天，使用倒置显微镜(Keyence公司制，BIOREVO)进行明场观察(图7A～H)。图7A右下的比例尺表示200μm。

其结果，在没有添加BMP4的条件下，形成表面的光滑胚样体，在胚样体表面没有确认到非神经上皮样的结构(图7A)。另一方面，在添加了BMP4的条件下，在0.1nM～5nM中的任一浓度都在内侧存在神经上皮样的细胞团块，形成了在表面具有非神经上皮组织的细胞团块(图7B-H)。根据上述的结果可知，在悬浮培养开始后第2天添加BMP4时，0.1nM以上的浓度能够在细胞团块表面形成非神经上皮组织。

实施例7：来自人ES细胞的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的制备中各Wnt信号转导途径抑制物质的效果

人ES细胞(KhES-1株)基于Scientific Reports，4，3594(2014)中记载的方法在无饲养细胞条件下培养。作为无饲养细胞培养基使用了StemFit培养基，无饲养细胞构架使用了层粘连蛋白511-E8。作为具体维持培养操作，与实施例1同样地进行。

将如上所述地制作的亚汇合的人ES细胞利用PBS洗涤之后，使用Accumax进行了酶处理后，添加诱导分化用的无结成培养基培养基，使用细胞刮刀从培养皿表面剥下细胞，通过吹打分散成单一细胞。之后，将上述分散成单个细胞的人ES细胞以在非细胞黏附性的96孔培养板(PrimeSurface 96V底板，住友BakeLite公司制)的每1孔为1.2×10⁴细胞的方式而漂浮在100μl的无血清培养基中，在37℃，5％CO₂的条件下悬浮培养。关于此时的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用了在F-12+Glutamax培养基)和IMDM+Glutamax培养基的1∶1混合液中添加了5％Knockout血清替代物，450μM 1-一硫代甘油，1x化学成分确定的脂质浓缩物，50u/ml青霉素-50μg/ml链霉素的无血清培养基。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天，步骤1开始)，在上述无血清培养基中添加了Y27632(终浓度20μM)，SB-431542(1μM)。实施了在悬浮培养开始时作为Wnt信号转导途径抑制物质，添加IWP-2(Tocris Bioscience公司制，2或5μM)，C-59(Cayman Chemicals公司制，2μM)，IWP-L6(AdooQ bioscience公司制，1或10μM)，LGK974(Cayman Chemicals公司制，1或5μM)，KY 02111(Cayman Chemicals公司制，1或5μM)，XAV939(Cayman Chemicals公司制，1μM)，作为Wnt信号转导途径抑制物质无添加的对照而仅添加DMSO了的条件。之后，在悬浮培养开始后第2天以每1孔100μl加入了不含有Y27632，包含各Wnt信号转导途径抑制物质，SB-431542，BMP4的无血清培养基。关于BMP4，在添加的培养基中添加3nM，使得孔中终浓度为1.5nM。悬浮培养开始后第6天，使用不含有Y27632和BMP，包含各Wnt信号转导途径抑制物质和SB-431542的无血清培养基进行半量培养基更换。在悬浮培养开始后第10天，使用倒置显微镜(Keyence公司制，BIOREVO)进行明场观察(图8A～K)。图8A右下的比例尺表示200μm。

其结果，在没有添加Wnt信号转导途径抑制物质的条件下，即使从悬浮培养开始第2天添加BMP4，在胚样体的表面也未形成非神经上皮组织(图8A)。另一方面，在从悬浮培养开始时刻添加IWP-2，C-59，IWP-L6，LGK974，KY02111，XAV939的各条件下，形成了在内侧存在神经上皮样的细胞团块，在表面具有非神经上皮组织的细胞团块(图8B～K)。根据上述的结果可知，Wnt信号转导途径抑制物质的添加对由BMP4添加引起的具有非神经上皮组织的细胞团块的形成有用。

实施例8：来自人ES细胞的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的制备中诱导分化前的化合物处理的效果

人ES细胞(KhES-1株)基于Scientific Reports，4，3594(2014)中记载的方法在无饲养细胞条件下培养。作为无饲养细胞培养基使用了StemFit培养基，无饲养细胞构架使用了层粘连蛋白511-E8。作为具体维持培养操作，与实施例1同样地进行。在将培养的细胞用于诱导分化中时，制作了在接种的6天后与Stemfit培养基的培养基更换同时进行了以下条件的4种条件的细胞：不添加任何的条件(对照)，仅添加300nM SAG的条件(+300nM SAG)，仅添加5μM SB-431542的条件(+5μM SB-431542)，同时添加SAG和SB431542的条件(+SAG/SB)。

在上述处理的次日，将形成了亚汇合的4种条件的人ES细胞分别用实施例1中记载的方法实施了采用悬浮培养的向包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的诱导分化。之后，在诱导分化第15天使用倒置显微镜(Keyence公司制，BIOREVO)进行明场观察。对于实施了各前处理后形成的细胞团块，评价为周围整体的80％以上被非神经上皮包覆的接近球状的形态的细胞团块(第1级，例＝图9A)，周围整体80％～40％被非神经上皮包覆，或者形状发生变形的细胞团块，(第2级，例＝图9B)，细胞团块表面的非神经上皮的比例为40％以下细胞团块(第3级，例＝图9C)的三个阶段。

其结果为，将培养的细胞用于诱导分化时，在接种的6天后与Stemfit培养基的培养基更换同时不添加任何的条件(对照)中，在32个细胞团块中，第1级的细胞团块为6个，第2级的细胞团块为18个，第3级的细胞团块为8个。仅添加300nM SAG的条件(+300nM SAG)下，在32个细胞团块中，第1级的细胞团块为10个，第2级的细胞团块为18个，第3级的细胞团块为4个。仅添加5μM SB-431542的条件(+5μM SB-431542)下，在32个细胞团块中，第1级的细胞团块为28个，第2级的细胞团块为4个，第3级的细胞团块为0个。同时添加SAG和SB431542的条件(+SAG/SB)下，在32个细胞团块中，第1级的细胞团块为30个，第2级的细胞团块为2个，第3级的细胞团块为0个。评价结果作图示于图9D。根据上述的结果可知，将培养的细胞用于诱导分化时，通过实施采用5μM SB-431542的前处理，或者同时添加SAG和SB431542的前处理，与无处理的对照相比，形成周围整体的80％以上被非神经上皮包覆的接近球状的形态的第1级的细胞团块的比例大幅提高(图9D)。

实施例9：由人iPS细胞制作的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块

人iPS细胞(201B7株，从iPS Academia Japan，Inc.获取)基于ScientificReports，4，3594(2014)中记载的方法在无饲养细胞条件下培养。作为无饲养细胞培养基使用了StemFit培养基，无饲养细胞构架使用了层粘连蛋白511-E8。作为具体维持培养操作，与比较例1同样地实施。之后，在与实施例1相同的条件下实施用96孔板的悬浮培养。在悬浮培养开始后第2天，以每1孔100μl加入了不含有Y27632，包含IWP-2，SB-431542，BMP4的无血清培养基。关于BMP4，在添加的培养基中添加3nM，使得孔中终浓度为1.5nM。悬浮培养开始后第6天，使用不含有Y27632和BMP，包含IWP-2和SB-431542的无血清培养基进行半量培养基更换。在悬浮培养开始后第10天及第28天使用倒置显微镜(Keyence公司制，BIOREVO)进行明场观察(图10A-C)。图10A及C右下的比例尺表示200μm，图10B右下的比例尺表示1000μm。其结果可知，与利用实施例1由人ES细胞系KhES-1进行制作时同样，由人iPS细胞系201B7形成了非神经上皮组织围拢了中央部的神经组织的细胞团块。

利用上述由人iPS细胞系201B7制作了悬浮培养开始后第28天的细胞团块，用实施例1中记载的方法制作冷冻切片，使用为神经、视网膜组织标记的抗Chx10抗体，抗RLDH3抗体，抗CD56/NCAM抗体，抗N-钙黏着蛋白抗体，抗Pax6抗体，抗Rx抗体，非神经上皮组织、角膜标记的抗CD326/EpCAM抗体，抗E-钙黏着蛋白抗体(R&D Systems公司制，山羊)，抗Six1抗体，抗p63抗体(Santa Cruz Biotechnology公司制，兔)，抗泛细胞角蛋白抗体，为神经细胞标记的抗βIII微管蛋白(Tujl)抗体进行荧光免疫染色。荧光标记二次抗体及显微镜观察的条件采用实施例1中记载的方法实施。图10G为图10D-F的，图10K为图10H-J的，图10O为图10L-N的，图10S为图10P-R的核的对比染色图像。

其结果可知，与实施例1中实施的由人ES细胞系KhES-1制备的情况下同样，通过上述制作法从iPS细胞系201B7形成了包含内侧为Chx10，RLDH3，NCAM，N-钙黏着蛋白，Pax6，Rx，Tuj1阳性的神经视网膜组织，外侧为EpCAM，E-钙黏着蛋白，Six1，p63，泛细胞角蛋白阳性的非神经上皮组织的细胞团块(图10D-S)。

实施例10：来自人ES细胞角膜上皮片的制备例

通过实施例3中记载的方法由人ES细胞系KhES-1制作了细胞团块。在悬浮培养开始后第28天用微移液器回收细胞团块，移至悬浮培养用平皿(住友BakeLite公司制)，进一步在37℃，5％CO₂的条件下悬浮培养6天。关于此时的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用了在F-12+Glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)和IMDM+Glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)的1：1混合液中添加了10％Knockout血清替代物(Thermo Fisher Scientific公司制)，450μM 1-一硫代甘油(和光纯药公司制)，1x化学成分确定的脂质浓缩物(Thermo Fisher Scientific公司制)，50单位/ml青霉素-50μg/ml链霉素(Nacalai Tesque公司制)的无血清培养基。为了分离角膜上皮细胞，在双目实体显微镜下使用5号精密镊子从从悬浮培养开始第34天的胚样体去掉内侧的神经组织，仅回收了外侧的角膜上皮组织。在角膜上皮组织的回收前(图11A)及回收后(图11B)实施了利用倒置显微镜的明场观察。图11A右下的比例尺表示200μm。观察的结果可知，能够将在细胞团块的外侧存在的仅角膜上皮组织有效地分离(图11B)。之后，将回收的组织用PBS洗涤，添加Accumax+10μM Y-27632，在37℃温水浴下使其反应15分钟。在第一次的反应后通过吹打将组织解离，进一步在37℃温水浴下使其反应5分钟。在第二次的反应结束后，再次吹打后添加10％KSR gfcdm培养基，利用孔径大小为40μm的细胞滤网(Corning公司制)除去夹杂物。将得到的细胞悬浊液于220G离心5分钟，除去上清，将细胞再悬浮于10％KSR gfcdm+10μMY-27632中，测量细胞数。以0.5μg/cm²的条件对4孔板(Thermo Fisher公司制)涂覆层粘连蛋白511E8，以5x10⁴个细胞/cm²的密度接种细胞。关于此时的无血清培养基，使用在10％KSRgfcdm中添加了10μM Y-27632和10ng/ml bFGF，在37℃，5％CO₂的条件下培养。3天的培养之后，实施利用倒置显微镜的明场观察(图11C)。图11C右下的比例尺表示100μm。观察的结果为观察到分离的角膜上皮细胞与器材的黏附和细胞之间的密合，显示可能形成角膜上皮片。

实施例11：使用了由人ES细胞制作的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块的化合物刺激性测试

通过实施例3中记载的方法由人ES细胞系KhES-1制作了细胞团块。在悬浮培养开始后第28天用微移液器回收细胞团块，移至悬浮培养用平皿(住友BakeLite公司制)，进一步在37℃，5％CO₂的条件下悬浮培养9天。关于此时的无血清培养基(gfCDM+KSR)，使用了在F-12+Glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)和IMDM+Glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)的1∶1混合液中添加了10％Knockout血清替代物(Thermo Fisher Scientific公司制)，450μM 1-一硫代甘油(和光纯药公司制)，1x化学成分确定的脂质浓缩物(Thermo Fisher Scientific公司制)，50单位/ml青霉素-50μg/ml链霉素(Nacalai Tesque公司制)的无血清培养基。

将以上述的方法制作的悬浮培养第37天的细胞团块以每1管3个而加入1.5ml微管中，进行利用PBS的洗涤二次。之后，用PBS稀释测试化合物，将使浓度为2.5％的化合物溶液添加至微管中，在37℃，5％CO₂的条件下对细胞团块进行了24小时化合物处理。作为此时的测试化合物，使用GHS的眼睛刺激性的判定为分类1：严重的眼睛损伤性(不可逆地作用)盐酸异丙嗪(Sigma Aldrich公司制)，及为分类2：刺激性(可逆地作用)的4-甲酰苯甲酸(东京化成工业公司制)，将仅用PBS处理的细胞团块作为无添加的对照。化合物处理后的细胞团块用PBS洗涤3次，进一步用0.02％荧光素/PBS溶液(Sigma Aldrich公司制)染色30秒之后，用PBS洗涤4次。洗涤之后的细胞团块用200μl的PBS处理10分钟，提取在细胞团块中摄入的荧光素。在激发485nm，发射535nm的条件下使用荧光读板器(2104EnVision多标记计数器，Perkin Elmer公司制)测量以上述方法制作的提取液中的荧光素浓度。

其结果，在来自用GHS的眼睛刺激性的判定为分类1的盐酸异丙嗪处理的细胞团块、和用分类2的4-甲酰苯甲酸处理的细胞团块的荧光素摄取后的洗脱量中，观察到显著差别(图12A)。此时，来自为对照的仅用PBS处理的细胞团块的洗脱量为检测限以下。根据上述结果显示，使用通过本说明书中记载的制备法制作的包含神经组织及非神经上皮组织的细胞团块能够进行体外的化合物刺激性测试。

工业实用性

根据本发明，可实现以低成本有效地由多潜能干细胞制备包含视网膜等神经组织，神经系统细胞和角膜等非神经上皮组织的细胞团块。

本申请以在日本申请的日本特愿2017-226308(申请日：2017年11月24日)为基础，其内容全部包含于本说明书中。

Claims

1.细胞团块的制备方法，所述细胞团块包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织，所述方法包括下述步骤(1)及(2)：

2.细胞团块的制备方法，所述细胞团块包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织，所述方法包括下述步骤(a)、(1)及(2)：

3.根据权利要求1或2所述的细胞团块的制备方法，其中，所述Wnt信号转导途径抑制物质为PORCN抑制剂。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞团块的制备方法，其中，所述步骤(1)和/或步骤(2)中的培养还在TGFβ信号转导途径抑制物质的存在下进行。

5.细胞团块，其为根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法得到的包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块。

6.非神经上皮组织片的制备方法，包括下述步骤(1)～(4)：

7.非神经上皮组织片的制备方法，包括下述步骤(a)及下述步骤(1)～(4)：

(a)a步骤，将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在包含1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径作用物质，以及2)未分化维持因子的培养基中维持培养；

(1)第一步骤，将在a步骤中维持培养的多潜能干细胞在Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，使细胞的聚集体形成；

8.根据权利要求6或7所述的非神经上皮组织片的制备方法，其中，所述2)非神经上皮组织为角膜或其前体组织。

9.非神经上皮组织片，其通过权利要求6～8中任一项所述的制备方法得到。

10.细胞团块，其包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织，其中，1)神经系统细胞或神经组织的表面的3成以上被2)非神经上皮组织包覆，

11.根据权利要求10所述的细胞团块，其中，所述2)非神经上皮组织为角膜或其前体组织。

12.根据权利要求10或11所述的细胞团块，其中，所述1)神经系统细胞或神经组织为中枢神经系统的细胞或组织或其前体组织。

13.根据权利要求12所述的细胞团块，其中，所述中枢神经系统的细胞或组织为视网膜。

14.被测物质的毒性、药效评价方法，包括使权利要求10～13中任一项所述的包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块，或

使通过权利要求1～4中任一项所述的制备方法得到的包含1)神经系统细胞或神经组织及2)非神经上皮组织的细胞团块与被测物质接触的步骤，和，

检验该被测物质对该细胞或该组织造成的影响的步骤。

15.被测物质的毒性、药效评价方法，包括使通过权利要求6～8中任一项所述的方法得到的非神经上皮组织片与被测物质接触的步骤，和，

检验该被测物质对该非神经上皮组织片造成的影响的步骤。

16.由于感觉器官的障碍导致的疾病的治疗药物，其包含通过权利要求1～4中任一项所述的方法得到的细胞团块，或通过权利要求6～8中任一项所述的方法得到的非神经上皮组织片。