KR102297584B1 - 망막 색소 표피 세포의 제조 방법 - Google Patents

망막 색소 표피 세포의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기를 포함하는 망막 색소 표피 세포의 제조 방법에 관련된다:
(1) 다능성 간세포를 무혈청 배지 내에서 부유 배양함으로써 다능성 간세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 공정 (1)로 형성된 응집체를, 각각 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 2 공정, 및
(3) 공정 (2)로 얻어진 응집체를, 각각 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 색소 표피 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 3 공정.

Description

망막 색소 표피 세포의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING RETINAL PIGMENT EPITHELIAL CELLS}
본 발명은, 망막 색소 표피 세포의 제조 방법등에 관한 것이다.
다능성 간세포 (pluripotent stem cell)를 사용하여 망막 색소 표피 세포를 제조하는 보고가 알려져 있다(비특허문헌 1). 균일한 다능성 간세포의 응집체를 Wnt 시그널 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 내에서 형성시켜, 이것을 기저막 표품의 존재 하에서 부유 배양하여, 이어서 혈청 배지 내에서 부유 배양한 후, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 포함하고 소닉 헤지혹 (Sonic hedgehog) 시그널 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양함으로써, 망막 색소 표피 세포를 얻는 방법(비특허문헌 2 및 특허문헌 1)이 나타나 있다.
특허 문헌
특허 문헌 1: 국제 공개 제 2013/077425호
비특허 문헌
비특허 문헌 1: Cell Stem Cell, 5, 396-408 (2009)
비특허 문헌 2: Cell Stem Cell, 10(6), 771-785 (2012)
다능성 간세포로부터 망막 색소 표피 세포를 제조하는 방법의 개발이 요망되고 있다.
본 발명은, 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트를 다능성 간세포로부터 제조하는 방법 등을 제공한다.
즉, 본 발명은：
[1］(1) 다능성 간세포를 무혈청 배지 내에서 부유 배양함으로써 다능성 간세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 공정 (1)로 형성된 응집체를, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 2 공정, 및
(3) 공정 (2)로 얻어진 응집체를, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 색소 표피 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 3 공정을 포함하는 망막 색소 표피 세포의 제조 방법(이하, 본 발명 제조 방법 1으로 언급하는 일도 있다.) ;
[2］(1) 다능성 간세포를 무혈청 배지 내에서 부유 배양함으로써 다능성 간세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 공정 (1)로 형성된 응집체를, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 2 공정,
(3) 공정 (2)로 얻어진 응집체를, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 색소 표피 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 3 공정, 및
(4) 공정 (3)으로 얻어진 응집체를 분산해, 얻어진 세포를 접착 배양하는 제 4 공정 을 포함하는 망막 색소 표피 세포 시트의 제조 방법(이하, 본 발명 제조 방법 2로 언급하는 일도 있다.) ；
[3］상기 공정 (4)에 있어서, 혈청 대체물 존재하에서 접착 배양을 실시하는 상기 [2］에 기재된 제조 방법；
[4］상기 공정 (4)에 있어서, ROCK 저해 물질 존재하에서 접착 배양을 실시하는 상기 [2］또는 [3］에 기재된 제조 방법；
[5］상기 공정 (4)에 있어서, Wnt 시그널 경로 작용 물질, FGF 시그널 경로 저해 물질, Activin 시그널 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 물질을 추가로 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지를 사용하여 접착 배양을 실시하는 상기 [2］내지 [4］중 어느 하나에 기재된 제조 방법；
[6］상기 공정 (4)에 있어서, 배양기질로 표면 처리된 배양기재 (vessel material) 상에서 접착 배양을 실시하는 상기 [2］내지 [5］중 어느 하나에 기재된 제조 방법；
[7］상기 배양기질이, 합성 배양기질인 상기 [6］에 기재된 제조 방법；
[8］상기 배양기질이, 라미닌인 상기 [6］에 기재된 제조 방법；
[9］상기 다능성 간세포가 영장류 다능성 간세포인 상기 [1］내지 [8］중 어느 하나에 기재된 제조 방법；
[10］상기 다능성 간세포가 인간 다능성 간세포인 상기 [1］내지 [9］중 어느 하나에 기재된 제조 방법；
[11］상기 공정 (1) 및 공정 (2)이, 혈청 대체물 존재하에서 행해지는 상기 [1］내지 [10］중 어느 하나에 기재된 방법；
[12］부유 배양이, 기저막 표품 비존재하에서 행해지는 상기 [1］내지 [11］중 어느 하나에 기재된 방법；
[13］상기 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이, BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF7로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 단백질인 상기 [1］내지 [12］중 어느 하나에 기재된 방법；
[14］공정 (2)에 있어서의 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지가, FGF 시그널 경로 저해 물질을 추가로 포함하는, 상기 [1］내지 [13］중 어느 하나에 기재된 방법；
[15］상기 [1］내지 [14］중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조되는 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트를 함유하여 이루어지는, 독성 또는 약효 평가용 시약；
[16］상기 [1］내지 [14］중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조되는 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트에 피검 물질을 접촉시켜, 그 물질이 그 세포 또는 그 세포 시트에 미치는 영향을 검정하는 것을 포함하는, 피검 물질의 독성 또는 약효 평가 방법；
[17］상기 [1］내지 [14］중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조되는 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트를 함유하여 이루어지는, 망막 조직의 장해에 기인하는 질환의 치료제；
[18］상기 [1］내지 [14］중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조되는, 유효량의 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트를, 이식을 필요로 하는 대상으로 이식하는 것을 포함하는, 망막 조직의 장해에 기인하는 질환의 치료 방법；및
[19］망막 조직의 장해에 기인하는 질환의 치료에 있어서의 사용을 위한 상기 [1］내지 [14］중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조되는 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트；
등을 제공한다.
본 발명의 제조 방법에 의하면, 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트를 고효율로 제조하는 것이 가능해진다. 본 발명의 제조 방법에 있어서는, 기저막 표품을 배지 내에 첨가하는 일 없이, 즉 기저막 표품 비존재하에 응집체를 부유 배양하여, 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트를 얻는 것이 가능하여, 얻어진 세포 또는 세포 시트에 대한 이종 유래 성분의 혼입의 리스크가 저감 된다. 본 발명의 제조 방법에 의하면, 화학 물질등의 독성 또는 약효 평가나 이식 치료등을 목적으로하여, 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트를 효율적으로 제공하는 것이 가능해진다.
도 1은, 부유 배양 3일째에 BMP4를 배지에 첨가해 부유 배양한 인간 배성 간세포 유래 응집체의 부유 배양 18일째의 명시야상 (A), 및 부유 배양 3일째에 BMP4를 배지에 첨가해 부유 배양하여, 부유 배양 18일째부터 BMP4를 포함하지 않고 CHIR99021를 포함하는 배지로 부유 배양한 인간 배성 간세포 유래 응집체의 부유 배양 20일째의 명시야상 (B)을 나타내는 도면이다.
도 2는, 부유 배양 개시 3일째부터 18일째까지 BMP4를 포함하는 배지로 부유 배양한 인간 배성 간세포 유래 응집체를, (A) 부유 배양 18일째부터 21일째까지 BMP4를 포함하지 않고 CHIR99021를 포함하는 배지로 부유 배양하여, 그 후 BMP4 및 CHIR99021를 모두 포함하지 않는 배지로 부유 배양했을 때의 부유 배양 27일째의 명시야상, (B) 부유 배양 18일째부터 27일째까지 BMP4를 포함하지 않고 CHIR99021를 포함하는 배지로 부유 배양했을 때의 부유 배양 27일째의 명시야상, 및 (C) 부유 배양 18일째부터 21일째까지 BMP4를 포함하지 않고 CHIR99021를 포함하는 배지로 부유 배양하여, 부유 배양 21일째부터 27일째까지 BMP4를 포함하지 않고 CHIR99021 및 SU-5402를 포함하는 배지로 부유 배양을했을 때의 부유 배양 27일째의 명시야상을 나타내는 도면이다.
도 3은, 인간 배성 간세포 유래 응집체를 부유 배양 3일째부터 18일째까지 BMP4를 포함하는 배지로 부유 배양하여, 부유 배양 18일째부터 21일째까지 BMP4를 포함하지 않고 CHIR99021를 포함하는 배지로 부유 배양하여, 배양 21일째에 응집체를 파쇄하여 얻어진 세포를 CHIR99021를 포함하는 배지로 접착 배양했을 때의 부유 배양 개시부터 27일째의 (A) 명시야상, (B) 망막 색소 표피 마커 Mitf의 형광 면역 염색상, 및 (C) 밀착 결합 (tight junction) 마커 ZO-1의 형광 면역 염색상이다.
도 4는, 인간 배성 간세포 유래 응집체를 부유 배양 3일째부터 18일째까지 BMP4를 포함하는 배지로 부유 배양하여, 부유 배양 18일째부터 21일째까지 BMP4를 포함하지 않고 CHIR99021를 포함하는 배지로 부유 배양하여, 부유 배양 21일째에 분산해, 얻어진 세포를 SynthemaxTM로 표면 처리한 Boyden 챔버에 파종하여 Y27632를 포함하는 배지로 접착 배양했을 때의 부유 배양 개시부터 40일째의 (A) 망막 색소 표피 세포 시트의 상, 및 (B) 명시야 확대상이다.
도 5는, 부유 배양 개시부터 40일째의 망막 색소 표피 세포 시트의 명시야 확대상이다. 인간 배성 간세포 유래 응집체를, 부유 배양 3일째부터 18일째까지 BMP4를 포함하는 배지로 부유 배양하여, 부유 배양 18일째부터 21일째까지 BMP4를 포함하지 않고 CHIR99021를 포함하는 배지로 부유 배양하여, 배양 21일째에 분산해, 얻어진 세포를 SynthemaxTM로 표면 처리한 Boyden 챔버에 파종하여 접착 배양했다. 부유 배양 개시부터 24일째, 또는 접착 배양 개시부터 3일째에, (A) 성분 첨가하지 않고, 또는 (B) 3μM CHIR99021, (C) 10μM SU-5402, (D) 3μM CHIR99021와 10μM SU-5402, (E) 1 nM 인간 BMP4 단백질, 혹은 (F) 50 ng/ml 인간 액티빈을 첨가해 부유 배양 개시부터 40일째까지 접착 배양을 계속했다.
도 6은, 인간 배성 간세포 유래 응집체를 부유 배양 3일째부터 18일째까지 BMP4를 포함하는 배지로 부유 배양하여, 부유 배양 18일째부터 21일째까지 BMP4를 포함하지 않고 CHIR99021를 포함하는 배지로 부유 배양하여, 부유 배양 21일째에 분산해, 얻어진 세포를 (A) MatrigelTM 또는, (B) SynthemaxTM로 표면 처리한 Boyden 챔버에 파종하여 접착 배양했을 때의, 부유 배양 개시부터 26일째의 망막 색소 표피 시트의 상이다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명에 있어서의 「부유 배양」이란, 세포 또는 세포덩어리를 배양기재 등에 접착시키지 않는 조건으로 배양하는 것을 말한다.
부유 배양을 실시할 때에 사용되는 배양기는, 「부유 배양」 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고, 당업자이면 적절히 결정하는 것이 가능하다. 이와 같은 배양기로서는, 예를 들어, 플라스크, 조직배양용 플라스크, 디쉬, 페트리디쉬, 조직배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 마이크로포아, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 또는 롤러 보틀을 들 수 있다. 이들의 배양기는, 부유 배양에 사용되므로, 세포 비접착성인 것이 바람직하다. 세포 비접착성의 배양기로서는, 배양기의 표면이, 세포와의 접착성을 향상시키는 목적으로 인공적으로 처리(예를 들어, 세포외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리)되어 있지 않은 것 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 세포의 배양에 통상 사용되는 배지는, 동물세포의 배양에 통상 사용되는 배지를 기초 배지로서 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들어, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, F-12 배지, 햄 배지, RPMI 1640배지, Fischer's 배지, 또는 이들의 혼합 배지 등, 동물세포의 배양에 사용 가능한 배지를 들 수가 있다.
본 발명에 있어서의 「무혈청 배지」란, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 배지를 의미한다. 본 발명에서는, 정제 된 혈액 유래 성분이나 동물 조직 유래 성분(예를 들어, 증식 인자)이 혼입하고 있는 배지도, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 한 무혈청 배지에 포함된다.
무혈청 배지는, 혈청 대체물을 함유하고 있어도 된다. 혈청 대체물로서는, 예를 들어, 알부민, 트란스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3' 티올 글리세롤, 혹은 이들의 균등물등을 적절히함유하는 것을 들 수가 있다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어, WO98/30679에 기재된 방법에 의해 조제할 수 있다. 혈청 대체물로서는 시판품을 이용해도 된다. 이러한 시판되는 혈청 대체물로서는, 예를 들어, KnockoutTM Serum Replacement(Invitrogen 사제：이하, KSR라고 언급하는 일도 있다.), Chemically-defined Lipid concentrate (Gibco 사제), GlutamaxTM(Gibco 사제)를 들 수 있다.
부유 배양에 사용하는 무혈청 배지는, 지방산 또는 지방질, 아미노산(예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 증식 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 함유해도 된다.
조제의 번잡함을 회피하기 위해서, 이러한 무혈청 배지로서 시판되는 KSR를 적당량(예를 들어, 약 1% 내지 약 20%) 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR 및 450μM 1-모노티오 글리세롤을 첨가한 배지)를 사용해도 된다.
본 발명에 있어서의 「혈청 배지」란, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하는 배지를 의미한다. 당해 배지는, 지방산 또는 지방질, 아미노산(예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 증식 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 1-모노티오글리세롤, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 함유해도 된다.
본 발명에 있어서의 「기저막 표품」이란, 그 위에 기저막 형성능을 갖는 원하는 세포를 파종하여 배양했을 경우에, 표피 세포 모양의 세포 형태, 분화, 증식, 운동, 기능 발현 등을 제어하는 기능을 갖는 기저막 구성 성분을 포함하는 것을 말한다. 여기서, 「기저막 구성 성분」이란, 동물의 조직에 있어서, 표피 세포층과 간질세포층 등과의 사이에 존재하는 얇은 막상을 한 세포외 매트릭스 분자를 말한다. 기저막 표품은, 예를 들어 기저막을 개재하여 지지체상에 접착하고 있는 기저막 형성능을 갖는 세포를, 그 세포의 지방질 용해능을 갖는 용액이나 알칼리 용액등을 사용하여 지지체로부터 제거하는 것으로 제작할 수 있다. 기저막 표품으로서는, 기저막 조제물로서 시판되고 있는 상품(예를 들어, MatrigelTM(Beckton Dickinson 사제：이하, 마트리겔이라고 언급하는 일도 있다))나, 기저막 성분으로서 공지된 세포외 매트릭스 분자(예를 들어, 라미닌, IV형 콜라겐, 헤파란 황산 프로테오글리칸, 엔타크틴등)를 포함하는 것을 들 수 있다.
MatrigelTM는, Engelbreth Holm Swarm(EHS) 마우스 육종으로부터 추출된 기저막 조제물이다. MatrigelTM의 주성분은 IV형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸 및 엔타크틴이며, 이들에 추가해 TGF-β, 섬유아세포 증식 인자(FGF), 조직 플라스미노겐 활성화 인자 및 EHS 종양에 의해 자연적으로 생성되는 증식 인자가 포함된다. MatrigelTM 의 "증식 인자가 감소된 제품"은 통상적인 MatrigelTM 보다 증식 인자의 농도가 낮고, 그 표준 농도는 EGF가＜0.5 ng/ml, NGF가＜0.2 ng/ml, PDGF가 ＜5 pg/ml, IGF-1이 5 ng/ml, TGF-β 1.7 ng/ml이다.
본 발명에 있어서, 「물질 X를 포함하는 배지」란, 외인성(exogeneous)의 물질 X가 첨가된 배지 또는 외인성의 물질 X를 포함하는 배지를 의미하고, 「물질 X를 포함하지 않는 배지」란, 외인성의 물질 X가 첨가되어 있지 않은 배지 또는 외인성의 물질 X를 포함하지 않는 배지를 의미한다. 여기서, 「외인성의 물질 X」란, 그 배지로 배양되는 세포 또는 조직에 있어 외래의 물질 X를 의미하며, 그 세포 또는 조직이 산생하는 내재성(endogenous)의 물질 X는 이에 포함되지 않는다.
예를 들어, 「BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지」란, 외인성의 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가된 배지 또는 외인성의 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지이다. 「소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 배지」란, 외인성의 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가되어 있지 않은 배지 또는 외인성의 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 배지이다.
본 발명에 있어서의 「영장류」란, 영장목에 속하는 포유류 동물을 말하며, 영장류로서는, 레무르나 로리스, 츠바이등의 원원아목 (Strepsirrhin)과, 원숭이, 유인원, 인간등의 진원아목 (Haplorhini)을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「간세포」란, 세포 분열 이후에도 같은 분화능을 유지하는 세포여, 조직이 상해를 받았을 때에 그 조직의 재생에 기여하는 세포를 말한다. 간세포로서는, 배성 간세포 (이하, ES 세포라고 언급하는 일도 있다.) 혹은 조직간세포 (조직성간세포, 조직 특이적 간세포 또는 체질간세포라고도 불린다), 또는 인공 다능성 간세포 (iPS 세포：induced pluripotent stem cell)를 들 수 있다. 상기의 간세포 유래의 조직 세포는, 이에 의해 조직 재생이 가능한 사실로부터 알 수 있듯이, 생체에 가까운 정상적인 세포로 간세포가 분화할 수 있는 것이 알려져 있다.
간세포는, 소정의 기관으로부터 입수할 수 있고 또, 시판품을 구입할 수도 있다. 예를 들어, 인간 배성 간세포인 KhES-1, KhES-2및 KhES-3은, 쿄토 대학 Institute for Frontier Medical Sciences부터 입수 가능하다. 모두 마우스 배성 간세포인, EB5 세포는 RIKEN으로부터, D3주는 ATCC로부터 입수 가능하다.
간세포는, 자체 공지된 방법에 의해 유지하여 배양할 수 있다. 예를 들어, 인간 간세포는, KnockoutTM Serum Replacement(Invitrogen 사)를 첨가한 배지로 배양함으로써 유지할 수 있다. 마우스 간세포는, 소 태아 혈청(FCS) 및 Leukemia Inhibitory Factor(LIF)를 첨가해 피더 세포 없이 배양함으로써 유지할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「다능성 간세포」란, 인비트로에 있어서 배양하는 것이 가능하고 또한, 태반을 제외한 생체를 구성하는 모든 세포 (3 배엽(외배엽, 중배엽, 내배엽) 유래의 조직)로 분화할 수 있는 능력(다능성(pluripotency))을 갖는 간세포를 말한다. 배성 간세포 (ES 세포)도 「다능성 간세포」에 포함된다. 「다능성 간세포」는, 수정란, 클론배, 생식 간세포 또는 조직내 간세포로부터 얻어진다. 체세포에 여러종류의 유전자를 도입함으로써, 배성 간세포를 닮은 다능성을 인공적으로 갖게한 세포 (인공 다능성 간세포라고도 불린다)도 다능성 간세포에 포함된다. 다능성 간세포는, 자체 공지된 방법으로 제작하는 것이 가능하다. 제작 방법으로서는, 예를 들어 Cell, 2007, 131(5) pp.861-872나, Cell, 2006, 126(4) pp.663-676에 기재된 방법을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「배성 간세포 (ES 세포)」란, 자기 복제능을 가지고 멀티능 (특히, 다능성 「pluripotency」)을 갖는 간세포이며, 초기배에 유래하는 다능성 간세포를 말한다. 배성 간세포는, 1981년에 처음으로 수립되어 1989년 이후 녹아웃 마우스 제작에도 응용되고 있다. 1998년에는 인간 배성 간세포가 수립되어 있고, 재생 의학에도 이용되고 있다.
본 발명에 있어서의 「인공 다능성 간세포」란, 섬유아세포 등과 같이 분화한 세포를 Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc등의 여러 종류의 유전자의 발현에 의해 직접 재프로그래밍화하는 등하여 멀티능을 가지도록 유도한 세포이다. 2006년, 야마나카등에 의해 마우스 세포로 인공 다능성 간세포가 수립되었다 (Cell, 2006, 126(4) pp. 663-676). 인공 다능성 간세포는, 2007년에 인간 섬유아세포에서도 수립되어 배성 간세포와 마찬가지로 멀티능을 갖는다 (Cell, 2007, 131(5) pp. 861-872；Science, 2007, 318(5858) pp. 1917-1920；Nat. Biotechnol., 2008, 26(1) pp. 101-106).
유전자 개변된 다능성 간세포는, 예를 들어, 상동 재조합 기술을 사용하는 것에 따라 제작할 수 있다. 개변되는 염색체상의 유전자로서는, 예를 들어, 세포 마커 유전자, 조직 적합성 항원의 유전자, 신경계 세포의 장해에 기인하는 질환 관련 유전자등을 들 수 있다. 염색체상의 표적 유전자의 개변은, Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)；Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)；바이오 매뉴얼 시리즈 8, Gene Targeting, ES 세포를 사용한 변이 마우스의 제작, YODOSHA CO., LTD. (1995)；등에 기재된 방법을 사용하여 실시할 수가 있다.
구체적으로는, 예를 들어, 개변하는 표적 유전자(예를 들어, 세포 마커 유전자, 조직 적합성 항원의 유전자나 질환 관련 유전자등)의 게놈 유전자를 단리해, 단리된 게놈 유전자를 사용하여 표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터를 제작한다. 제작된 타겟 벡터를 간세포에 도입해, 표적 유전자와 타겟 벡터의 사이에 상동 재조합을 일으킨 세포를 선택함으로써, 염색체상의 유전자가 개변된 간세포를 제작할 수 있다.
표적 유전자의 게놈 유전자를 단리하는 방법으로서는, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)나 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons(1987-1997) 등에 기재된 공지된 방법을 들 수 있다. 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템(Genome Systems 제)이나 Universal Genome Walker Kits(CLONTECH제)등을 사용하는 것에 따라, 표적 유전자의 게놈 유전자를 단리할 수도 있다.
표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터의 제작, 및 상동 재조합체의 효율적인 선별은, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993)；바이오 매뉴얼 시리즈 8, Gene Targetinh, ES 세포를 사용한 변이 마우스의 제작, YODOSHA CO., LTD. (1995)；등에 기재된 방법에 따라 실시할 수가 있다. 타겟 벡터는, 대체형 및 삽입형의 임의의 것일 수 있고, 선별 방법으로서는, 포지티브 선택, 프로모터 선택, 네거티브 선택, 또는 폴리 A 선택등의 방법을 사용할 수 있다.
선별한 세포주 중에서 목적으로 하는 상동 재조합체를 선택하는 방법으로서는, 게놈 DNA에 대한 서던 하이브리다이제이션법이나 PCR법 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「응집체」란, 배지 내에 분산하고 있던 세포가 집합해 형성한 덩어리를 말한다. 본 발명에 있어서의 「응집체」에는, 부유 배양 개시시에 분산하고 있던 세포가 형성한 응집체와 부유 배양 개시시에 이미 형성되고 있던 응집체가 포함된다.
「응집체를 형성시킨다」란, 세포를 집합시켜 세포의 응집체를 형성시키고 부유 배양시, 「일정수의 분산한 세포를 신속히 응집」시킴으로써 질적으로 균일한 세포의 응집체를 형성시키는 것을 말한다.
본 발명에 있어서는, 다능성 간세포를 신속히 집합시켜 다능성 간세포의 응집체를 형성시키는 것이 바람직하다. 이와 같이 다능성 간세포의 응집체를 형성시키면, 형성된 응집체로부터 분화 유도되는 세포에 있어서 표피 모양 구조를 양호한 재현성으로 형성시킬 수 있다.
응집체를 형성시키는 실험적인 조작으로서는, 예를 들어, 작은 웰 플레이트 (96 웰 플레이트)나 마이크로포아등을 사용하여 작은 스페이스에 세포를 가두는 방법, 작은 원심 튜브를 사용하여 단시간 원심하는 것으로 세포를 응집시키는 방법을 들 수 있다.
다능성 간세포의 응집체가 형성된 것이나, 응집체를 형성하는 세포에 있어서 표피 모양 구조가 형성된 것은, 응집체의 사이즈 및 세포수, 거시적 형태, 조직 염색 해석에 의한 미시적 형태 및 그 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그 동기성 (synchronism), 분화 효율의 응집체간의 재현성 등에 기초하여 판단하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서의 「조직」이란, 형태나 성질이 상이한 복수 종류의 세포가 일정한 패턴으로 입체적으로 배치한 구조를 갖는 세포 집단의 구조체를 이른다.
본 발명에 있어서의 「망막 조직」이란, 생체 망막에 있어서 각 망막층을 구성하는 광수용체, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막절 세포, 이들의 선구 세포, 또는 망막 선구 세포등의 세포가, 적어도 복수 종류, 층상에서 입체적으로 배열한 망막 조직을 의미한다. 각각의 세포가 어느 망막층을 구성하는 세포인지는, 공지된 방법, 예를 들어 세포 마커의 발현 유무 혹은 그 정도 등에 의해 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「망막층」이란, 망막을 구성하는 각층을 의미하고, 구체적으로는, 망막 색소 표피층, 광수용체층, 외경계막, 외과립층, 외망상층, 내과립 층, 내망상층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 네경계막을 들 수가 있다.
본 발명에 있어서의 「망막층 특이적 신경세포」란, 망막층을 구성하는 세포로서 망막층에 특이적 신경세포를 의미한다. 망막층 특이적 신경세포로서는, 쌍극세포, 마디 세포, 아마크린 세포, 수평 세포, 광수용체, 색소 표피 세포, 간체세포 및 뿔꼴 세포를 들 수가 있다.
본 발명에 있어서의 「망막 색소 표피 세포」란 생체 망막에 있어서 신경 망막 조직의 외측에 존재하는 표피 세포를 의미한다. 망막 색소 표피 세포 여부는, 당업자이면, 예를 들어 세포 마커 (RPE65(색소 표피 세포), Mitf(색소 표피 세포)등)의 발현이나, 멜라닌 과립의 존재, 다각형의 특징적인 세포 형태등에 의해 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「망막 선구 세포」란, 광수용체, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막절 세포, 망막 색소 표피 세포 중 임의의 성숙 망막 세포로 분화할 수 있는 선구 세포를 말한다.
광수용체 선구 세포, 수평 세포 선구 세포, 쌍극세포선구 세포, 아마크린 세포 선구 세포, 망막절 세포 선구 세포, 망막 색소 표피 선구 세포란, 각각, 광수용체, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막절 세포, 망막 색소 표피 세포로 분화되도록 되어있는 선구 세포를 말한다.
망막세포 마커로서는, 망막 선구 세포로 발현하는 Rax 및 PAX6, 시상하부 뉴런의 선구 세포에서는 발현하지만 망막 선구 세포에서는 발현하지 않는 Nkx2.1, 시상하부 신경 표피로 발현해 망막에서는 발현하지 않는 Sox1, 광수용체의 선구 세포로 발현하는 Crx 등을 들 수 있다. 망막층 특이적 신경세포의 마커로서는, 쌍극세포로 발현하는 Chx10 및 L7, 마디 세포로 발현하는 Tuj1 및 Brn3, 아마크린 세포로 발현하는 Calretinin, 수평 세포로 발현하는 Calbindin, 광수용체로 발현하는 Rhodopsin 및 Recoverin, 색소 표피 세포로 발현하는 RPE65 및 Mitf, 간체세포로 발현하는 Nrl, 뿔꼴 세포로 발현하는 Rxr-gamma 등을 들 수 있더.
본 발명 제조 방법 1은, 하기 공정 (1), (2) 및 (3)을 포함하는 망막 색소 표피 세포의 제조 방법이다:
(1) 다능성 간세포를 무혈청 배지 내에서 부유 배양함으로써 다능성 간세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 공정 (1)로 형성된 응집체를, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 2 공정, 및,
(3) 공정 (2)로 얻어진 응집체를, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 색소 표피 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 3 공정.
다능성 간세포를 무혈청 배지 내에서 부유 배양함으로써 다능성 간세포의 응집체를 형성시키는 공정 (1)에 대해 설명한다.
공정 (1)에 있어서 사용되는 무혈청 배지는, 상기 서술한 같은 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 및 Wnt 시그널 경로 저해 물질이 모두 첨가되어 있지 않은 무혈청 배지를 사용할 수 있다. 조제의 번잡함을 회피하려면 , 예를 들어, 시판되는 KSR등의 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, IMDM와 F-12의 1：1의 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1xChemically Defined Lipid Concentrate가 첨가된 배지)를 사용하는 것이 바람직하다. 무혈청 배지에 대한 KSR의 첨가량으로서는, 예를 들어 인간 ES 세포의 경우에는, 통상 약 1% 내지 약 20%이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20%이다.
공정 (1)에 있어서의 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5%이다.
공정 (1)에 있어서의 다능성 간세포의 농도는, 다능성 간세포의 응집체를 보다 균일하게, 효율적으로 형성시키도록 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어 96 웰 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 인간 ES 세포를 부유 배양하는 경우, 1 웰 당 약 1x103 내지 약 1x105 세포, 바람직하게는 약 3x103 내지 약 5x104 세포, 보다 바람직하게는 약 5x103 내지 약 3x104 세포, 가장 바람직하게는 약 1.2x104 세포가 되도록 조제한 액을 웰에 첨가해, 플레이트를 정치하여 응집체를 형성시킨다.
응집체를 형성시키기 위해서 필요한 부유 배양의 시간은, 세포를 균일하게 응집시키도록, 사용하는 다능성 간세포에 의해 적절히 결정 가능하지만, 균일한 응집체를 형성하기 위해서는 가능한 한 단시간인 것이 바람직하다. 예를 들어, 인간 ES 세포의 경우에는, 바람직하게는 약 24시간 이내, 보다 바람직하게는 약 12시간 이내에 응집체를 형성시킨다. 이 응집 체형성까지의 시간은, 세포를 응집시키는 기구나, 원심 조건 등을 조정함으로써 적절히 조절하는 것이 가능하다.
다능성 간세포의 응집체가 형성된 것은, 응집체의 사이즈 및 세포수, 거시적 형태, 조직 염색 해석에 의한 미시적 형태 및 그 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그 동기성, 분화 효율의 응집체간의 재현성 등에 기초하여 판단하는 것이 가능하다.
공정 (1)로 형성된 응집체를, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 얻는 공정 (2)에 대해 설명한다.
공정 (2)에 있어서 사용되는 배지는, 예를 들어, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가되지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가된 무혈청 배지 또는 혈청 배지이며, 기저막 표품을 첨가할 필요는 없다.
이러한 배지에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청 배지는, 상기 서술한 같은 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 조제의 번잡함을 회피하려면 , 예를 들어, 시판되는 KSR등의 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, IMDM와 F-12의 1：1의 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤 및 1xChemically Defined Lipid Concentrate가 첨가된 배지)를 사용하는 것이 바람직하다. 무혈청 배지에 대한 KSR의 첨가량으로서는, 예를 들어 인간 ES 세포의 경우에는, 통상 약 1% 내지 약 20%이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20%이다.
공정 (2)에 사용되는 무혈청 배지는, 공정 (1)에 사용한 무혈청 배지가 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 한 당해 배지를 그대에 사용할 수도 있고, 새로운 무혈청 배지로 대체할 수도 있다. 공정 (1)에 사용한 무혈청 배지를 그대로 공정 (2)에 사용하는 경우, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질만을 배지 내에 첨가하면 된다.
소닉 헤지혹(이하, Shh라고 언급하는 일이 있다) 시그널 전달 경로 작용 물질이란, Shh에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질이다. Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어, Hedgehog 패밀리에 속하는 단백질(예를 들어, Shh), Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, Purmorphamine, 또는 SAG 등을 들 수 있다.
「소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는」 배지에는, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 실질적으로 포함하지 않는 배지, 예를 들어, 망막 선구 세포 및 망막 조직에 대한 선택적 분화에 불리한 영향을 주는 정도의 농도의 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 함유하지 않는 배지도 포함된다.
「소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가되어 있지 않는」배지에는, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질이 실질적으로 첨가되어 있지 않은 배지, 예를 들어, 망막 선구 세포 및 망막 조직에 대한 선택적 분화에 불리한 영향을 주는 정도의 농도의 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가되어 있지 않은 배지도 포함된다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이란, BMP에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강할 수 있는 물질이다. BMP 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 BMP2, BMP4 혹은 BMP7등의 BMP 단백질, GDF7등의 GDF 단백질, 항BMP 수용체 항체, 또는, BMP 부분 펩티드 등을 들 수 있다. BMP2 단백질, BMP4 단백질 및 BMP7 단백질은 예를 들어 R＆D Systems로부터, GDF7 단백질은 예를 들어 Wako Pure Chemical Industries, Ltd로부터 입수 가능하다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 다능성 간세포의 응집체를 형성하는 세포의 망막세포에 대한 분화를 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 BMP4의 경우에는, 약 0.01 nM 내지 약 1 μM, 바람직하게는 약 0.1 nM 내지 약 100 nM, 보다 바람직하게는 약 1.5 nM의 농도가 되도록 배지에 첨가한다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 공정 (1)의 부유 배양 개시부터 약 24시간 이후에 첨가되며, 부유 배양 개시 후 몇일 이내 (예를 들어, 15일 이내)에 배지에 첨가해도 된다. 바람직하게는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 부유 배양 개시 후 1일째부터 15일째까지의 사이, 보다 바람직하게는 1일째부터 9일째까지의 사이, 가장 바람직하게는 3일째에 배지에 첨가한다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 배지에 첨가되어 다능성 간세포의 응집체를 형성하는 세포의 망막세포에 대한 분화 유도가 개시된 이후는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 배지에 첨가할 필요는 없고, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 배지를 사용하여 배지 교환을 실시해 된다. 이로써, 배지에 소요되는 비용을 억제할 수가 있다. 망막세포에 대한 분화 유도가 개시된 세포는, 예를 들어, 당해 세포에 있어서의 Rax 유전자의 발현을 검출함으로써 확인할 수 있다. GFP등의 형광 리포터 단백질 유전자가 Rax 유전자자리에 노크 인된 다능성 간세포를 공정 (1)에 사용하여 형성된 응집체를, 망막세포에 대한 분화 유도에 필요한 농도의 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 존재하에 부유 배양하여, 발현한 형광 리포터 단백질로부터 발광하는 형광을 검출함으로써, 망막세포에 대한 분화 유도가 개시된 시기를 확인할 수도 있다. 공정 (2)의 실시양태의 하나로서 공정 (1)로 형성된 응집체를, Rax 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 시작할 때까지, 망막세포에 대한 분화 유도에 필요한 농도의 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하고, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 얻는 공정을 들 수가 있다.
공정 (2)에 있어서의 배양 온도, CO2 농도등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 또 CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5%이다.
망막 선구 세포를 포함하는 응집체가 수득된 것은, 예를 들어, 망막 선구 세포의 마커인 Rax 또는 PAX6를 발현하는 세포가 응집체에 포함되어 있는 것을 검출함으로써 확인할 수 있다.
공정 (2)로 얻어진 응집체를, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 색소 표피 세포를 포함하는 응집체를 얻는 공정 (3)에 대해 설명한다.
공정 (3)에 있어서 사용되는 배지는, 예를 들어, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 모두 첨가되지 않고 Wnt 시그널 경로 작용 물질이 첨가된 무혈청 배지 또는 혈청 배지이다.
「소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는」 배지에는, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 실질적으로 포함하지 않는 배지, 예를 들어, 망막 조직에 대한 선택적 분화에 불리한 영향을 주는 정도의 농도의 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 함유하지 않는 배지도 포함된다.
「소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 모두 첨가되어 있지 않는」 배지에는, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 모두가 실질적으로 첨가되어 있지 않은 배지, 예를 들어, 망막 조직에 대한 선택적 분화에 불리한 영향을 주는 정도의 농도의 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가되어 있지 않은 배지도 포함된다.
이러한 배지에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청 배지로서는, 상기 서술한 같은 배지를 들 수가 있다. 바람직하게는, DMEM-F12 배지 등의 기초 배지에, N2 서플리먼트 (Invitrogen 사) 또는 B27 서플리먼트 (Invitrogen 사) 등의 신경 영양 인자 혼합물이 첨가되고 KSR이 첨가되어 있지 않은 무혈청 배지를 들 수가 있다.
Wnt 시그널 경로 작용 물질이란, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질이다. Wnt 시그널 경로 작용 물질로서는, 예를 들어, Wnt 패밀리에 속하는 단백질(예를 들어, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a), Wnt 수용체 아고니스트, GSK3β 억제제 (예를 들어, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO), CHIR99021, Kenpaullone)를 들 수 있다.
Wnt 시그널 경로 작용 물질의 농도는, 다능성 간세포의 응집체를 형성하는 세포의 망막세포에 대한 분화를 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 CHIR99021의 경우에는, 약 0.1 μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1 μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 3μM 의 농도로 첨가한다.
Wnt 시그널 경로 작용 물질은, 예를 들어 인간 ES 세포를 사용하는 경우, 공정 (1)의 부유 배양 개시부터 12일째 이후, 바람직하게는 18일째에 첨가한다.
공정 (3)에 있어서, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 Wnt 시그널 경로 작용 물질과 FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 응집체를 배양하는 것이 보다 바람직하다.
FGF 시그널 경로 저해 물질이란, FGF에 의해 매개되는 시그널을 저해할 수 있는 물질이다. FGF 시그널 경로 저해 물질로서는, 예를 들어, FGF 수용체, FGF 수용체 저해제(예를 들어, SU-5402, AZD4547, BGJ398), MAP 키나아제 케스케이드 저해 물질 (예를 들어, MEK 저해제, MAPK 저해제, ERK 저해제), PI3 키나아제 저해제, Akt 저해제 등을 들 수 있다.
공정 (3)에 사용되는 FGF 시그널 경로 저해 물질의 농도는, 다능성 간세포의 응집체를 형성하는 세포의 망막세포에 대한 분화를 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 SU-5402의 경우, 약 0.1 μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1 μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 10μM 의 농도로 첨가한다.
이와 같이 하여 제조된 망막 색소 표피 세포는 응집체의 표면에 존재하기 때문에, 현미경 관찰등으로 확인이 가능하다. 망막 색소 표피 세포가 존재하는 응집체를, 예를 들어 분산 처리(예를 들어, 트립신/EDTA 처리)해, 얻어진 세포를 FACS를 사용하여 선별함으로써, 고순도의 망막 색소 표피 세포를 수득하는 일도 가능하다. 핀셋 등을 사용하여, 응집체로부터 물리적으로 망막 색소 표피 세포를 잘라, 배양할 수도 있다. 분산 또는 잘라낸 망막 색소 표피 세포는 접착 조건 하에서 배양할 수 있다. 망막 색소 표피 세포를 포함하는 응집체를 마이크로피펫에 의한 피펫팅 조작등에 의해 파쇄해, 얻어진 세포를 접착 조건 하에서 배양할 수도 있다. 접착 배양하는 경우, 세포 접착성의 배양기, 예를 들어 세포외 매트릭스 등 (예를 들어, 폴리-D-리신, 라미닌, 피브로넥틴)에 의해 코팅 처리된 배양기를 사용하는 것이 바람직하다. 접착 배양에 있어서의 배양 온도, CO2 농도, O2 농도등의 배양 조건은, 적절히 결정할 수 있다. 이 때, 혈청, 이미 알려진 증식 인자나 증식을 촉진하는 첨가제나 화학 물질의 존재하에서 배양해도 된다. 이미 알려진 증식 인자로서는, 예를 들어 EGF, FGF등을 들 수가 있다. 증식을 촉진하는 첨가제로서 N2 서플리먼트 (Invitrogen 사)나 B27 서플리먼트 (Invitrogen 사)등을 들 수가 있다.
본 발명 제조 방법 2는, 하기 공정 (1), (2), (3) 및 (4)를 포함하는 망막 색소 표피 세포 시트의 제조 방법이다：
(1) 다능성 간세포를 무혈청 배지 내에서 부유 배양함으로써 다능성 간세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
(2) 공정 (1)로 형성된 응집체를, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 2 공정,
(3) 공정 (2)로 얻어진 응집체를, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 Wnt 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 색소 표피 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 3 공정, 및
(4) 공정 (3)으로 얻어진 응집체를 분산해, 얻어진 세포를 접착 배양하는 제 4 공정.
본 발명 제조 방법 2의 공정 (1), 공정 (2) 및 공정 (3)은, 본 발명 제조 방법 1의 공정 (1), 공정 (2) 및 공정 (3)와 마찬가지로 실시할 수 있다.
공정 (3)으로 얻어진 응집체를 분산해, 얻어진 세포를 접착 배양하는 공정 (4)에 대해 설명한다.
공정 (4)는, 공정 (3)의 실시 개시부터 60일 이내, 바람직하게는 30일 이내, 보다 바람직하게는 3일 후에 실시한다.
공정 (4)에 있어서 분산한 응집체 유래 세포는, 망막 색소 표피 세포의 균일한 시트를 효율적으로 형성시킬 수 있는 농도가 되도록 접착 배양 용기에 파종한다. 예를 들어 65 mm Boyden 챔버를 사용하여 응집체 유래 세포를 접착 배양하는 경우, 1 웰 당 약 1x103 내지 약 1x107 세포, 바람직하게는 약 3x103 내지 약 5x106 세포, 보다 바람직하게는 약 5x103 내지 약 1x106 세포, 더욱 바람직하게는 약 2x105 세포가 되도록 조제한 액을 웰에 첨가해, 플레이트를 정치하여 응집체 유래 세포를 접착시키고 배양한다.
공정 (4)에 있어서의 접착 배양에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청 배지로서는, 상기 서술한 같은 배지를 들 수가 있다. 조제의 번잡함 회피하려면 , 시판되는 KSR등의 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, DMEM/F-12 및 Neurobasal의 1：1 혼합액에 1/2 x N2 서플리먼트, 1/2 x B27 서플리먼트 및 100μM 2-메르캅토에탄올이 첨가된 배지)를 사용하는 것이 바람직하다. 무혈청 배지에 첨가되는 KSR의 농도로서는, 예를 들어 인간 ES 세포 유래 세포의 경우에는, 통상 약 1% 내지 약 20%이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20%이다.
공정 (4)에 있어서, ROCK 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다.
ROCK 저해 물질이란, Rho 키나아제에 의해 매개되는 시그널을 저해할 수 있는 물질이다. ROCK 저해 물질로서는, 예를 들어, Y-27632, Fasudil를 들 수 있다.
공정 (4)에 사용되는 ROCK 저해 물질의 농도는, 망막 색소 표피 세포의 균일한 시트를 효율적으로 형성시킬 수 있는 농도이면 된다. 예를 들어 Y-27632의 경우, 약 0.01 μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1 μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 20μM 의 농도가 되도록 첨가한다.
공정 (4)에 있어서, Wnt 시그널 경로 작용 물질, FGF 시그널 경로 저해 물질, Activin 시그널 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 물질을 추가로 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 세포를 배양하는 것이 보다 바람직하다.
Wnt 시그널 경로 작용 물질로서는, 예를 들어, Wnt 패밀리에 속하는 단백질(예를 들어, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a), Wnt 수용체 아고니스트, GSK3β 억제제 (예를 들어, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO), CHIR99021, Kenpaullone)를 들 수 있다.
공정 (4)에 사용되는 Wnt 시그널 경로 작용 물질의 농도는, 망막 색소 표피 세포의 균일한 시트를 효율적으로 형성시킬 수 있는 농도이면 된다. 예를 들어 CHIR99021의 경우에는, 약 0.1 μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1 μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 3μM 의 농도가 되도록 첨가한다.
Wnt 시그널 경로 작용 물질은, 공정 (4)의 개시부터 예를 들어 18일 이내, 바람직하게는 6일째에 첨가한다.
FGF 시그널 경로 저해 물질로서는, 예를 들어, FGF 수용체, FGF 수용체 저해제(예를 들어, SU-5402, AZD4547, BGJ398), MAP 키나아제 케스케이드 저해 물질(예를 들어, MEK 저해제, MAPK 저해제, ERK 저해제), PI3 키나아제 저해제, Akt 저해제를 들 수 있다.
공정 (4)에 사용되는 FGF 시그널 경로 저해 물질의 농도는, 망막 색소 표피 세포의 균일한 시트를 효율적으로 형성시킬 수 있는 농도이면 된다. 예를 들어 SU-5402의 경우, 약 0.1 μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1 μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 10μM 의 농도가 되도록 첨가한다.
FGF 시그널 경로 저해 물질은, 공정 (4)의 개시부터 예를 들어 18일 이내, 바람직하게는 6일째에 첨가한다.
Activin 시그널 경로 작용 물질이란, Activin에 의해 매개되는 시그널을 증강할 수 있는 물질이다. Activin 시그널 경로 작용 물질로서는, 예를 들어, Activin 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Activin A, Activin B, Activin C, Activin AB 등), Activin 수용체, Activin 수용체 아고니스트를 들 수 있다.
공정 (4)에 사용되는 Activin 시그널 경로 작용 물질의 농도는, 망막 색소 표피 세포의 균일한 시트를 효율적으로 형성시킬 수 있는 농도이면 된다. 예를 들어 Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A (R＆D systems사 ＃338-AC)의 경우, 약 1 ng/ml 내지 약 10μg/ml, 바람직하게는 약 10 ng/ml 내지 약 1 μg/ml, 보다 바람직하게는 약 100 ng/ml의 농도가 되도록 첨가한다.
Activin 시그널 경로 작용 물질은, 공정 (4)의 개시부터 예를 들어 18일 이내, 바람직하게는 6일째에 첨가한다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 BMP2, BMP4 혹은 BMP7등의 BMP 단백질, GDF7 등의 GDF 단백질, 항BMP 수용체 항체, 또는, BMP 부분 펩티드 등을 들 수 있다.
공정 (4)에 사용되는 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 망막 색소 표피 세포의 균일한 시트를 효율적으로 형성시킬 수 있는 농도이면 된다. 예를 들어 BMP4의 경우에는, 약 0.01 nM 내지 약 1 μM, 바람직하게는 약 0.1 nM 내지 약 100 nM, 보다 바람직하게는 약 1.5 nM의 농도가 되도록 배지에 첨가한다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 공정 (4)의 개시부터 예를 들어 18일 이내, 바람직하게는 6일째에 첨가한다.
공정 (4)에 있어서, 예를 들어, Wnt 시그널 경로 작용 물질, FGF 시그널 경로 저해 물질, Activin 시그널 경로 작용 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류의 물질을 추가로 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지, 또는, Wnt 시그널 경로 작용 물질과 FGF 시그널 경로 저해 물질을 추가로 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 세포를 배양한다.
공정 (4)에 있어서, 배양기질로 표면 처리된 배양기재 상에서 접착 배양을 실시하는 것이 바람직하다.
공정 (4)에 있어서의 배양기재의 처리에 사용되는 배양기질로서는, 응집체 유래 세포의 접착 배양과 망막 색소 표피 시트의 형성을 가능하게 하는 세포 배양 기질을 들 수 있다. 조제의 번잡함을 피하고 이종 유래 성분의 혼입을 방지하기 위해서는, 합성 배양 기질, 인간 유래 기저막 성분, 또는 재조합 인간형 기저막 단백질 등을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 배양기질로서 구체적으로는, SynthemaxTM (Corning 사) 등의 합성 배양기질, CellstartTM (Invitrogen 사) 혹은 인간 세포외 기질 (BD 사) 등의 인간 유래 기저막 성분, 또는, 인간 재조합 라미닌 111 (BioLamina 사), 인간 재조합 라미닌 511 (BioLamina 사), 인간 재조합 라미닌 521 (BioLamina 사), 인간 재조합 라미닌 411 (BioLamina 사), 인간 재조합 라미닌 421 (BioLamina 사), 인간 재조합 라미닌 332 (BioLamina 사) 혹은 인간 재조합 라미닌 211 (BioLamina 사) 등의 재조합 인간 라미닌을 들 수 있다. 여기서, 라미닌 111이란, α1 사슬, β1 사슬 및 γ1 사슬로 이루어진 라미닌이며, 라미닌 511이란, α5 사슬, β1 사슬 및 γ1 사슬로 이루어진 라미닌이며, 라미닌 521이란, α5 사슬, β2 사슬 및 γ1 사슬로 이루어진 라미닌이며, 라미닌 411이란, α4 사슬, β1 사슬 및 γ1 사슬로 이루어진 라미닌이며, 라미닌 421이란, α4 사슬, β2 사슬 및 γ1 사슬로 이루어진 라미닌이며, 라미닌 332란, α3 사슬, β3 사슬 및 γ2 사슬로 이루어진 라미닌이며, 라미닌 211이란, α2 사슬, β1 사슬 및 γ1 사슬로 이루어진 라미닌이다. 나아가 라미닌의 α 사슬, β 사슬 및 γ 사슬 각각의 C말단 영역으로 구성되는 E8 프래그먼트로 칭하는 부분도 세포가 발현하는 인테그린에 대해 결합 활성을 나타낸다는 것이 알려져 있으므로 (J.Biol.Chem., 284, 7820-7831(2009)), 상기의 라미닌과 마찬가지로 사용할 수 있는 것이 기대된다.
본 발명 제조 방법 1 또는 2에 의해 제조된 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트는, 생체의 망막 색소 표피 세포에 매우 유사한 특징을 가지고 있으므로, 망막세포의 장해에 기인하는 질환의 치료약의 스크리닝, 그 밖의 원인에 의한 세포 손상에 대한 치료약을 위한 세포 치료용 이식용 재료나 질환 연구 재료, 창약 재료로서 이용 가능하다. 또 화학 물질등의 독성 또는 약효 평가에 있어서도, 광 독성등의 독성 연구, 독성 시험등에 활용 가능하다.
망막세포의 장해에 기인하는 질환으로서는, 예를 들어, 유기 수은 중독, 클로로킨 망막증, 망막 색소 변성증, 연령 관련 황반변성증, 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생아 망막증 등을 들 수 있다.
본 발명 제조 방법 1 또는 2에 의해 제조된 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트는, 세포 손상 상태에 있어서, 손상 세포나, 장해를 받은 조직 자체를 보충하는 (예를 들어, 이식 수술에 사용하는) 등에 사용하는 이식용 망막 색소 표피 세포로서 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1：인간 ES 세포를 사용한 망막 색소 표피 세포의 제조
인간 ES 세포 (KhES-1 유래)를 「Ueno, M. 등. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」, 「Watanabe, K. 등. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」에 기재된 방법으로 준해 배양했다. 배지로는 DMEM/F12 배지 (Sigma)에 20% KSR (KnockoutTM Serum Replacement；Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산, 5 ng/ml bFGF를 첨가한 배지를 사용했다. 배양된 상기 ES 세포를, TrypLE Express (Invitrogen)를 사용하여 단일 세포로 분산한 후, 단일 분산된 ES 세포를 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (스미론 스페로이드 플레이트, 스미토모 베이크라이트사)의 1 웰 당 1.2x104 세포가 되도록 100μl의 무혈청 배지에 부유시켜, 응집체를 신속하게 형성시킨 후, 37℃, 5% CO2로 배양했다. 그 때의 무혈청 배지에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x 화학정의 지질 농축물 (Chemically defined lipid concentrate), 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시 3일째에 종농도 1.5 nM의 BMP4를 첨가해 부유 배양을 계속했다. 웰 내의 배양액의 반량을 3일 간격으로, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고 있지 않는 상기 배지로 교환했다. 부유 배양 개시 18일째에 3μM CHIR99021를 포함하는 DMEM/F-12 배지에 1 x N2 서플리먼트를 첨가한 무혈청 배지에 응집체를 옮겨, 부유 배양 개시 21일째까지 배양하여, 현미경 관찰을 실시했다.
부유 배양 개시 18일째에, 신경 표피의 형성이 확인되었다(도 1 A). 부유 배양 개시 21일째에, 표피의 두께가 얇은 망막 색소 표피 세포로 분화한 세포가 확인되었다(도 1 B).
실시예 2：인간 ES 세포를 사용한 망막 색소 표피 세포의 제조
인간 ES 세포 (KhES-1 유래)를 「Ueno, M. 등. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」, 「Watanabe, K. 등. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」에 기재된 방법으로 준해 배양했다. 배지에는 DMEM/F12 배지 (Sigma)에 20% KSR (KnockoutTM Serum Replacement；Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산, 5 ng/ml bFGF를 첨가한 배지를 사용했다. 배양된 상기 ES 세포를, TrypLE Express (Invitrogen)를 사용하여 단일 세포로 분산해, 단일 분산된 ES 세포를 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (스미론 스페로이드 플레이트, 스미토모 베이크라이트사)의 1 웰 당 1.2x104 세포가 되도록 100μl의 무혈청 배지에 부유시켜, 응집체를 신속하게 형성시킨 후, 37℃, 5% CO2로 배양했다. 그 때의 무혈청 배지에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x Chemically defined lipid concentrate, 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시 3일째에 종농도 1.5 nM의 BMP4를 첨가해 부유 배양을 계속했다. 웰 내의 배양액의 반량을 3일 간격으로, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고 있지 않는 상기 배지에 교환했다. 부유 배양 개시 18일째에 3μM CHIR99021를 포함하는 DMEM/F-12 배지에 1 x N2 서플리먼트를 첨가한 무혈청 배지에 응집체를 옮겨, 부유 배양 개시 21일째까지 부유 배양했다. 대조로서 CHIR99021 비존재하에서도 동일하게 응집체를 배양했다. CHIR99021를 포함하는 상기 배지로 부유 배양한 응집체의 일부는 부유 배양 개시 27일째까지 같은 배지 조건으로 부유 배양하고, 다른 일부에 대해서는, 부유 배양 개시 21일째부터, 3μM CHIR99021 (Wnt 시그널 경로 작용 물질)와 10μM SU-5402(FGF 시그널 경로 저해 물질)를 포함하는 DMEM/F-12 배지에 1 x N2 서플리먼트를 첨가한 무혈청 배지에서 37℃, 5% CO2로 부유 배양 개시 27일째까지 부유 배양했다.
배양 21일째부터 Wnt 시그널 경로 작용 물질 비존재하에서 배양한 응집체에서는, 표피의 두께가 얇은 망막 색소 표피로부터 두께가 있는 신경 표피로 복귀했으며 (도 2 A), Wnt 시그널 경로 작용 물질 존재하에서의 배양을 계속한 응집체에서는, 거의 모든 응집체의 표면에 있어서 흑색을 나타내는 망막 색소 표피 세포가 출현했다(도 2 B). Wnt 시그널 경로 작용 물질과 FGF 시그널 경로 저해 물질의 존재하에서 배양한 응집체에서는, 분화 유도의 효율이 증대해, 응집체 표면의 거의 전면이 망막 색소 표피 세포인 응집체가 형성되었다 (도 2 C).
실시예 3：인간 ES 세포를 사용한 망막 색소 표피 세포의 제조
인간 ES 세포 (KhES-1 유래)를 「Ueno, M. 등. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」, 「Watanabe, K. 등. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」에 기재된 방법에 따라 배양했다. 배지에는 DMEM/F12 배지 (Sigma)에 20% KSR (KnockoutTM Serum Replacement；Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산, 5 ng/ml bFGF를 첨가한 배지를 사용했다. 배양된 상기 ES 세포를, TrypLE Express (Invitrogen)를 사용하여 단일 세포로 분산해, 단일 분산된 ES 세포를 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (스미론 스페로이드 플레이트, 스미토모 베이크라이트사)의 1 웰 당 1.2x104 세포가 되도록 100μl의 무혈청 배지에 부유시켜, 응집체를 신속하게 형성시킨 후, 37℃, 5% CO2로 배양했다. 그 때의 무혈청 배지에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x Chemically defined lipid concentrate, 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시 3일째에 종농도 1.5 nM의 BMP4를 첨가해 부유 배양을 계속했다. 웰 내의 배양액의 반량을 3일 간격으로, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고 있지 않는 상기 배지에 교환했다. 부유 배양 개시 18일째에 3μM CHIR99021를 포함하는 DMEM/F-12 배지에 1 x N2 서플리먼트를 첨가한 무혈청 배지에 응집체를 옮겨, 부유 배양 개시 21일째까지 부유 배양했다. 부유 배양 개시 21일째에 응집체를 마이크로피펫을 이용한 용액의 주입 및 제거에 의해 파쇄해, 얻어진 세포를, 3μM CHIR99021 (Wnt 시그널 경로 작용 물질)를 포함하는 DMEM/F-12 배지에 1 x N2 서플리먼트를 첨가한 무혈청 배지에 의해 37℃, 5% CO2로 접착 배양했다.
부유 배양 개시부터 27일째에는 특징적인 다각형의 세포 형태를 갖는 망막 색소 표피 세포가 관찰되었다 (도 3 A). 세포 염색법에 의해 단백질의 발현을 확인했는데, 망막 색소 표피 세포 마커인 전사 인자 Mitf 양성(도 3 B) 및 밀착 결합 마커인 ZO-1 양성(도 3 C)이며, 얻어진 세포가 망막 색소 표피 세포인 것이 확인되었다.
실시예 4：인간 ES 세포를 사용한 망막 색소 표피 세포 시트의 제조
인간 ES 세포 (KhES-1 유래)를 「Ueno, M. 등. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」, 「Watanabe, K. 등. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」에 기재된 방법으로 준해 배양했다. 배지에는 DMEM/F12 배지 (Sigma)에 20% KSR (KnockoutTM Serum Replacement；Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산, 5 ng/ml bFGF를 첨가한 배지를 사용했다. 배양된 상기 ES 세포를, TrypLE Express (Invitrogen)를 사용하여 단일 세포로 분산해, 단일 분산된 ES 세포를 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (스미론 스페로이드 플레이트, 스미토모 베이크라이트사)의 1 웰 당 1.2x104 세포가 되도록 100μl의 무혈청 배지에 부유시켜, 응집체를 신속하게 형성시킨 후, 37℃, 5% CO2로 배양했다. 그 때의 무혈청 배지에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x Chemically defined lipid concentrate, 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시 3일째에 종농도 1.5 nM의 BMP4를 첨가해 부유 배양을 계속했다. 웰 내의 배양액의 반량을 3일 간격으로, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고 있지 않는 상기 배지에 교환했다. 부유 배양 개시 18일째에 3μM CHIR99021를 포함하는 DMEM/F-12 배지에 1 x N2 서플리먼트를 첨가한 무혈청 배지에 응집체를 옮겨, 부유 배양 개시 21일째까지 배양했다. 부유 배양 개시 21일째에, 세포 분산액 Accutase (ICT 사)를 사용하여 응집체를 분산해, 40μM 세포 스트레이너로 찌꺼기를 제거했다. 얻어진 세포를 1 웰 당 2 x105 세포가 되도록, DMEM/F-12 배지와 Neurobasal 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 1/2 N2 서플리먼트, 1/2 B27 서플리먼트, 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지 200μl에 현탁하여, SynthemaxTM로 코팅 처리를 실시한 65 mm Boyden 챔버 (Transwell, 코닝)에 파종하고, 같은 조성의 배지 1 ml를 하부의 웰에도 첨가해, 37℃, 5% CO2로 접착 배양을 실시했다. 배지 교환을 3일에 한 번 실시해, 부유 배양 개시부터 40일째에 표피의 형성의 정도를 현미경에 의해 관찰했다.
부유 배양 개시부터 40일째에는, 특징적인 다각형의 세포 형태를 가져(도 4 B), 색소가 축적한 균일한 망막 색소 표피 세포의 시트가 형성되었다 (도 4 A).
실시예 5：인간 ES 세포를 사용한 망막 색소 표피 세포 시트의 제조
인간 ES 세포 (KhES-1 유래)를 「Ueno, M. 등. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」, 「Watanabe, K. 등. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」에 기재된 방법으로 준해 배양했다. 배지에는 DMEM/F12 배지 (Sigma)에 20% KSR (KnockoutTM Serum Replacement；Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산, 5 ng/ml bFGF를 첨가한 배지를 사용했다. 배양된 상기 ES 세포를, TrypLE Express (Invitrogen)를 사용하여 단일 세포로 분산해, 배양된 상기 ES 세포를, 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (스미론 스페로이드 플레이트, 스미토모 베이크라이트사)의 1 웰 당 1.2x104 세포가 되도록 100μl의 무혈청 배지에 부유시켜, 응집체를 신속하게 형성시킨 후, 37℃, 5% CO2로 배양했다. 그 때의 무혈청 배지에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x Chemically defined lipid concentrate, 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시 3일째에 종농도 1.5 nM의 BMP4를 첨가해 부유 배양을 계속했다. 웰 내의 배양액의 반량을 3일 간격으로, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고 있지 않는 상기 배지에 교환했다. 부유 배양 개시 18일째에 3μM CHIR99021를 포함하는 DMEM/F-12 배지에 1 x N2 서플리먼트를 첨가한 무혈청 배지에 응집체를 옮겨, 부유 배양 개시 21일째까지 배양했다. 부유 배양 개시 21일째에, 세포 분산액 Accutase (ICT 사)를 사용하여 응집체를 분산해, 40μM 세포 스트레이너로 찌꺼기를 제거했다. 얻어진 세포를 1 웰 당 2 x105 세포가 되도록, DMEM/F-12 배지와 Neurobasal 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 1/2 N2 서플리먼트, 1/2 B27 서플리먼트, 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지 200μl에 현탁해, SynthemaxTM로 코팅 처리를 실시한 65 mm Boyden 챔버 (Transwell, 코닝)에 파종하고, 같은 조성의 배지 1 ml를 하부의 웰에도 첨가해 37℃, 5% CO2로 접착 배양을 실시했다. 부유 배양 개시부터 24일째, 즉 접착 배양 개시부터 3일째에, 3μM CHIR99021를 첨가, 10μM SU-5402를 첨가, 3μM CHIR99021와 10μM SU-5402를 동시 첨가, 1 nM 재조합 인간 BMP4 단백질을 첨가, 또는, 50 ng/ml 재조합 인간 액티빈을 첨가해, 접착 배양을 계속했다. 상기 물질을 첨가하지 않는 조건에서도 동일하게 배양했다. 배지 교환을 3일에 한 번 실시해, 부유 배양 개시부터 40일째에 표피의 형성의 정도를 현미경에 의해 관찰했다.
부유 배양 개시부터 24일째에 3μM CHIR99021를 첨가 (도 5 B)했을 경우, 무첨가의 컨트롤(도 5 A)과 비교해 보다 어두운 망막 색소 표피 세포로 분화했다. 3μM CHIR99021와 10μM SU-5402와의 동시 첨가 (도 5 D)에서는, 3μM CHIR99021 단독의 첨가 (도 5 B)보다 한층 더 어둡게 착색한 색소 표피를 얻을 수 있었다. 1 nM 재조합 인간 BMP4 단백질을 첨가 (도 5 E), 또는 50 ng/ml 재조합 인간 액티빈을 첨가 (도 5 F)한 경우에는 각각, 무첨가의 컨트롤 (도 5 A)과 비교해 보다 균일한 표피를 얻을 수 있었다.
실시예 6：인간 ES 세포를 사용한 망막 색소 표피 세포 시트의 제조
65 mm Boyden 챔버 (Transwell, 코닝)의 웰에, 30배에 희석한 Growth Factor Reduced MatrigelTM, 또는 40배로 희석한 SynthemaxTM (코닝)를 각각 100μl첨가해, 상기 마트리겔을 첨가한 챔버에 대해서는 4℃로 24시간, 상기 SynthemaxTM를 첨가한 챔버에 대해서는 실온으로 2시간, 각각 보온함으로써, 배양기재의 코팅 처리를 실시했다. 실시예 4에 기재된 방법으로 부유 배양 개시 21일째의 응집체로부터 단일 세포의 현탁액을 조제해, 상기 각 조건으로 코팅한 웰에 1 웰 당 2 x105 세포가 되도록, DMEM/F-12 배지와 Neurobasal 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 1/2 N2 서플리먼트, 1/2 B27 서플리먼트, 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지 200μl에 현탁한 세포를 파종하고, 같은 조성의 배지 1 ml를 하부의 웰에도 첨가해 37℃, 5% CO2로 접착 배양을 실시했다. Boyden 챔버에 대한 파종으로부터 5일째에 세포의 접착과 표피 형성을 관찰했다.
SynthemaxTM (도 6 B)로 코팅한 배양기재에서는, 기저막 표품인 마트리겔을 코팅한 배양기재(도 6 A)에 있어서와 마찬가지로, 배양한 응집체 유래 세포가 접착해, 세포끼리 밀접한 망막 색소 표피 모양의 형태가 관찰되었다.
실시예 7：인공 다능성 간세포 (iPS 세포)를 사용한 망막 색소 표피 세포의 제조예
인간 iPS 세포주 201 B7 (RIKEN BioResource 센터 또는 iPS 아카데미 재팬 주식회사로부터 입수 가능)를 「Ueno, M. 등. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」, 「Watanabe, K. 등. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」에 기재된 방법으로 준해 배양한다. 배지에는 DMEM/F12 배지 (Sigma)에 20% KSR (KnockoutTM Serum Replacement；Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산, 5 ng/ml bFGF를 첨가한 배지를 사용했다. 배양된 상기 iPS 세포를, TrypLE Express (Invitrogen)를 사용하여 단일 세포로 분산한 후, 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (스미론 스페로이드 플레이트, 스미토모 베이크라이트사)의 1 웰 당 1.2x104 세포가 되도록 100μl의 무혈청 배지에 부유시켜, 응집체를 신속하게 형성시킨 후, 37℃, 5% CO2로 부유 배양했다. 그 때의 무혈청 배지에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x Chemically defined lipid concentrate, 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시 3일째에 종농도 1.5 nM의 BMP4를 첨가해 부유 배양을 계속한다. 웰 내의 배양액의 반량을, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고 있지 않는 상기 배지에 3일 간격으로 교환했다. 부유 배양 개시 18일째에 3μM CHIR99021를 포함하는 DMEM/F-12 배지에 1 x N2 서플리먼트를 첨가한 무혈청 배지에 응집체를 옮겨, 부유 배양 개시 21일째까지 배양한다. 부유 배양 개시 21일째에 응집체를 마이크로피펫을 이용한 용액의 주입 및 제거에 의해 파쇄하여 얻어진 세포를, 3μM CHIR99021 (Wnt 시그널 경로 작용 물질)를 포함하는 DMEM/F-12 배지에 1xN2 서플리먼트를 첨가한 무혈청 배지에 의해 37℃, 5%CO2로 접착 배양했다. 부유 배양 개시부터 27일째에, 현미경에 의한 세포 형태의 관찰 및 세포 염색법에 의한 망막 색소 표피 마커 유전자(Mitf, ZO-1)의 발현의 확인을 실시했다.
이와 같이 하여, 인간 iPS 세포로부터 망막 색소 표피 세포를 제조한다.
실시예 8：인공 다능성 간세포 (iPS 세포)를 사용한 망막 색소 표피 세포 시트의 제조예
인간 iPS 세포주 201 B7 (RIKEN BioResource 센터 또는 iPS Academy 재팬 주식회사로부터 입수 가능)를 「Ueno, M. 등. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」, 「Watanabe, K. 등. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」에 기재된 방법으로 준해 배양한다. 배지에는 DMEM/F12 배지 (Sigma)에 20% KSR (KnockoutTM Serum Replacement；Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산, 5 ng/ml bFGF를 첨가한 배지를 사용했다. 배양된 상기 iPS 세포를, TrypLE Express (Invitrogen)를 사용하여 단일 세포로 분산한 후, 비세포 접착성의 96 웰 배양 플레이트 (스미론 스페로이드 플레이트, 스미토모 베이크라이트사)의 1 웰 당 1.2x104 세포가 되도록 100μl의 무혈청 배지에 부유시켜, 응집체를 신속하게 형성시킨 후, 37℃, 5% CO2로 부유 배양했다. 그 때의 무혈청 배지에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1 x Chemically defined lipid concentrate, 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다. 부유 배양 개시 3일째에 종농도 1.5 nM의 BMP4를 첨가해 부유 배양을 계속한다. 웰 내의 배양액의 반량을, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 첨가하고 있지 않는 상기 배지에 3일 간격으로 교환했다. 부유 배양 개시 18일째에 3μM CHIR99021를 포함하는 DMEM/F-12 배지에 1 x N2 서플리먼트를 첨가한 무혈청 배지에 응집체를 옮겨, 부유 배양 개시 21일째까지 배양한다. 부유 배양 개시 21일째에, 세포 분산액 Accutase (ICT 사)를 사용하여 응집체를 분산해, 40μM 세포 스트레이너로 찌꺼기를 제거한다. 얻어진 세포를 1 웰 당 2 x105 세포가 되도록, DMEM/F-12 배지와 Neurobasal 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 1/2 N2 서플리먼트, 1/2 B27 서플리먼트, 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지 200μl에 현탁해, SynthemaxTM로 코팅 처리를 실시한 65 mm Boyden 챔버 (Transwell, 코닝)에 파종하고, 같은 조성의 배지 1 ml를 하부의 웰에도 첨가해 37℃, 5% CO2로 접착 배양을 실시한다. 부유 배양 개시부터 24일째, 즉 접착 배양 개시부터 3일째에, 3μM CHIR99021, 10μM SU-5402, 1 nM 재조합 인간 BMP4 단백질, 50 ng/ml 재조합 인간 액티빈의 어느 하나, 혹은 이들을 조합하여 첨가해도 된다. 배지 교환을 3일에 한 번 실시해, 부유 배양 개시부터 40일째에 표피의 형성의 정도를 현미경에 의해 관찰했다.
이와 같이 하여, 인간 iPS 세포로부터 망막 색소 표피 세포 시트를 제조한다.
본 출원은, 2013년 11월 11 일자로 일본 나라에 출원된 일본 특허출원 2013-232795호를 기초로하고 있고, 여기서 언급함으로써 그 내용은 모두 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 제조 방법에 의하면, 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트를 고효율로 제조하는 것이 가능하다.

Claims (19)

  1. 하기를 포함하는 망막 색소 표피 세포의 제조 방법:
    (1) 다능성 간세포를 무혈청 배지 내에서 부유 배양함으로써 다능성 간세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
    (2) 공정 (1)로 형성된 응집체를, 각각 헤지혹 패밀리에 속하는 단백질, Shh, Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, 푸르모파민 (Purmorphamine) 및 SAG로 이루어진 군으로부터 선택되는 소닉 헤지혹에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질을 포함하지 않고, BMP 단백질, BMP2, BMP4, BMP7, GDF 단백질, GDF7, 항BMP 수용체 항체 및 BMP 부분 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 BMP에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강할 수 있는 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 2 공정, 및
    (3) 공정 (2)로 얻어진 응집체를, 각각 헤지혹 패밀리에 속하는 단백질, Shh, Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, 푸르모파민 (Purmorphamine) 및 SAG로 이루어진 군으로부터 선택되는 소닉 헤지혹에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질 및 BMP 단백질, BMP2, BMP4, BMP7, GDF 단백질, GDF7, 항BMP 수용체 항체 및 BMP 부분 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 BMP에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강할 수 있는 물질을 포함하지 않고, Wnt 패밀리에 속하는 단백질, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a, Wnt 수용체, Wnt 수용체 아고니스트, GSK3β 억제제, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO), CHIR99021 및 켄파울론 (Kenpaullone) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 색소 표피 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 3 공정.
  2. 하기를 포함하는 망막 색소 표피 세포 시트의 제조 방법:
    (1) 다능성 간세포를 무혈청 배지 내에서 부유 배양함으로써 다능성 간세포의 응집체를 형성시키는 제 1 공정,
    (2) 공정 (1)로 형성된 응집체를, 각각 헤지혹 패밀리에 속하는 단백질, Shh, Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, 푸르모파민 (Purmorphamine) 및 SAG로 이루어진 군으로부터 선택되는 소닉 헤지혹에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질을 포함하지 않고, BMP 단백질, BMP2, BMP4, BMP7, GDF 단백질, GDF7, 항BMP 수용체 항체 및 BMP 부분 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 BMP에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강할 수 있는 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 선구 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 2 공정,
    (3) 공정 (2)로 얻어진 응집체를, 각각 헤지혹 패밀리에 속하는 단백질, Shh, Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, 푸르모파민 (Purmorphamine) 및 SAG로 이루어진 군으로부터 선택되는 소닉 헤지혹에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질 및 BMP 단백질, BMP2, BMP4, BMP7, GDF 단백질, GDF7, 항BMP 수용체 항체 및 BMP 부분 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 BMP에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강할 수 있는 물질을 포함하지 않고, Wnt 패밀리에 속하는 단백질, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a, Wnt 수용체, Wnt 수용체 아고니스트, GSK3β 억제제, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO), CHIR99021 및 켄파울론 (Kenpaullone) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 내에서 부유 배양하여, 망막 색소 표피 세포를 포함하는 응집체를 얻는 제 3 공정, 및
    (4) 공정 (3)으로 얻어진 응집체를 분산해, 얻어진 세포를 접착 배양하는 제 4 공정.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 공정 (4) 중, 혈청 대체물, ROCK 저해 물질, 또는 혈청 대체물 및 ROCK 저해 물질 존재하에서 접착 배양을 실시하는 제조 방법.
  4. 제 2 항 또는 3 항에 있어서, 하기를 포함하는 제조 방법:
    상기 공정 (4) 중,
    Wnt 패밀리에 속하는 단백질, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a, Wnt 수용체, Wnt 수용체 아고니스트, GSK3β 억제제, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO), CHIR99021 및 켄파울론 (Kenpaullone) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질,
    FGF 수용체, FGF 수용체 저해제, SU-5402, AZD4547, BGJ398, MAP 키나아제 케스케이드 저해 물질, MEK 저해제, MAPK 저해제, ERK 저해제, PI3 키나아제 저해제 및 Akt 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 FGF 시그널 경로 저해 물질,
    액티빈 (Activin) 패밀리에 속하는 단백질, Activin A, Activin B, Activin C, Activin AB, Activin 수용체 및 Activin 수용체 아고니스트로 이루어진 군으로부터 선택되는 Activin에 의해 매개되는 시그널을 증강할 수 있는 물질, 및
    BMP 단백질, BMP2, BMP4, BMP7, GDF 단백질, GDF7, 항BMP 수용체 항체 및 BMP 부분 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 BMP에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강할 수 있는 물질
    로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 물질을 추가로 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 중에서 접착 배양을 실시하는 제조 방법.
  5. 제 2 항 또는 3 항에 있어서, 상기 공정 (4) 중, 배양기질로 표면 처리된 배양기재 (vessel material) 상에서 접착 배양을 실시하는 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 배양기질이 합성 배양기질인 제조 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 배양기질이 라미닌인 제조 방법.
  8. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 다능성 간세포가 영장류 다능성 간세포인 제조 방법.
  9. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 다능성 간세포가 인간 다능성 간세포인 제조 방법.
  10. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 공정 (1) 및 공정 (2)가 혈청 대체물 존재하에서 행해지는 제조 방법.
  11. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 기저막 표품 비존재하에서 부유 배양을 실시하는 제조 방법.
  12. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, BMP에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강할 수 있는 물질이, BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF7로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질인 제조 방법.
  13. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 공정 (3)에 있어서의 헤지혹 패밀리에 속하는 단백질, Shh, Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, 푸르모파민 (Purmorphamine) 및 SAG로 이루어진 군으로부터 선택되는 소닉 헤지혹에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질 및 BMP 단백질, BMP2, BMP4, BMP7, GDF 단백질, GDF7, 항BMP 수용체 항체 및 BMP 부분 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 BMP에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강할 수 있는 물질을 포함하지 않고, Wnt 패밀리에 속하는 단백질, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a, Wnt 수용체, Wnt 수용체 아고니스트, GSK3β 억제제, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO), CHIR99021 및 켄파울론 (Kenpaullone) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지가, FGF 수용체, FGF 수용체 저해제, SU-5402, AZD4547, BGJ398, MAP 키나아제 케스케이드 저해 물질, MEK 저해제, MAPK 저해제, ERK 저해제, PI3 키나아제 저해제 및 Akt 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 FGF 시그널 경로 저해 물질을 추가로 포함하는, 제조 방법.
  14. 하기를 포함하는, 피검 물질의 독성 또는 약효 평가방법:
    제 1 항 또는 2 항에 기재된 방법에 의해 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트를 제조하는 단계,
    망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트에 피검 물질을 접촉시키는 단계 및
    그 물질의 세포 또는 세포 시트에 대한 영향을 검정하는 단계.
  15. 하기를 포함하는, 망막 조직의 장해에 기인하는 질환의 치료제의 제조 방법:
    제 1 항 또는 2 항에 기재된 방법에 의해 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트를 제조하는 단계 및
    유효량의 망막 색소 표피 세포 또는 망막 색소 표피 세포 시트를 포함하는, 망막 조직의 장해에 기인하는 질환의 치료를 위한 이식용 재료를 조제하는 단계.
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