CN105518123A - 制备眼前段组织的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的细胞聚集体的制备方法，所述方法包括：在骨形态发生因子信号转导途径激活物质存在下，悬浮培养多能干细胞聚集体，以诱导眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的自组织。在一个实施方案中，所述骨形态发生因子信号转导途径激活物质是BMP4。在一个实施方案中，所述悬浮培养完全或部分地在成纤维细胞生长因子存在下进行。所产生的细胞聚集体可以进一步包含神经视网膜组织。

Description

制备眼前段组织的方法
技术领域
本发明涉及用于在体外诱导多能干细胞分化成眼前段组织的技术。
背景技术
迄今为止，本发明人使用SFEBq方法(专利文件1)通过在不含血清的培养基中悬浮培养多能干细胞聚集体，并且通过体外自组织形成视杯(其是眼原基)(专利文件2，非专利文件1和2)已经成功地开发了包含来自多能干细胞的神经视网膜组织和视网膜色素上皮组织的视网膜前体组织。然而，通过体外悬浮培养由多能干细胞诱导与视网膜一起组成眼球的眼前段组织(如角膜、晶状体等)还未见报道。
非专利文件3报道了通过在PA6饲养层上贴壁培养人iPS细胞而诱导角膜上皮细胞。然而，在饲养细胞存在下的培养不是优选的，因为应当避免不确定因素的污染。另外，角膜等的立体结构还未被构建。该文件中所述的方法需要12周的长时期来诱导角膜上皮细胞。该文件还描述了BMP4处理抑制iPS细胞分化为角膜上皮细胞。
非专利文件4描述了通过在BMP4、BMP7和FGF2存在下贴壁培养人ES细胞来诱导晶状体前体细胞。非专利文件5描述了通过在PA6饲养层上贴壁培养小鼠iPS细胞而诱导角膜上皮。非专利文件6描述了通过在饲养细胞存在下贴壁培养人ES细胞而诱导角膜基质细胞。非专利文件7描述了通过贴壁培养将人ES细胞诱导为角膜样细胞。然而，这些文件无一公开悬浮培养多能干细胞来在空间上形成眼前段组织，如角膜、晶状体等。
[文件列表]
专利文件
专利文件1:WO2009/148170
专利文件2:WO2011/055855
[非专利文件]
非专利文件1:Nakano等人，CellStemCell，10(6):771-785，2012
非专利文件2:Eiraku等人，Nature，472(7341):51-56，2011
非专利文件3:Hayashi等人，PLOSONE，7(9):e45435，2012
非专利文件4:Yang等人，FASEBJ.，24:3274-3283，2010
非专利文件5:Yoshida等人，PLOSONE，6(12):e28856，2011
非专利文件6:Chan等人，PLOSONE，8(2):e56831，2013
非专利文件7:Ahmad等人，StemCells，25:1145-1155，2007
发明概述
发明要解决的问题
本发明的一个目的是开发用于诱导多能干细胞选择性分化为眼前段组织或其前体组织的高度实用的方法。
解决问题的方式
本发明人已经进行了大量研究，并且发现通过在悬浮培养下用BMP4处理人多能干细胞的聚集体可以诱导眼前段组织(晶状体和角膜)的自组织，并且有效地进行角膜和晶状体的立体形成。通过在由本发明人开发的诱导立体视网膜自组织的方法(SFEBq法)的初始过程中实施BMP4处理，其已经成功地在聚集体中形成的视网膜上皮组织聚集体的表面上以自组织的方式形成表面外胚层，并且自发地引起可见于活体胚胎的“通过视网膜的表面外胚层向眼前段前体组织(晶状体基板和角膜基板)的分化诱导”。结果，可以立体地形成自组织的视网膜在内部，并且增厚的晶状体和角膜上皮前体组织在表面中的悬浮的聚集体。
他们还通过连续培养所述悬浮的聚集体而成功地使所述聚集体内的晶状体基板自发内陷，并且形成晶状体泡。
成年人的角膜从表面到内部由三层组成：上皮、间质和内皮。通过长期培养上述聚集体，他们还成功地允许聚集体表达多种在成人角膜上皮中观察到的标记蛋白。尽管已知间质和内皮由来源于神经嵴细胞的间充质细胞发育而来，而不是由表面外胚层而来，当长期培养上述聚集体时，除了视网膜组织和角膜上皮组织之外，间充质细胞也可以在所述聚集体中发育，其结果是，他们发现，可以形成具有联合的角膜上皮层和间充质细胞层(对应于间质和内皮)的立体角膜。
本发明人基于上述发现进行了进一步的研究并且完成了本发明。
因此，本发明如下：
[1]包含眼前段组织或其部分结构或其前体组织的制备方法，所述方法包括在骨形态发生因子信号转导途径激活物质存在下，悬浮培养多能干细胞的聚集体。
[2][1]的方法，其中在所述在骨形态发生因子信号转导途径激活物质存在下的悬浮培养之前，在不存在骨形态发生因子信号转导途径激活物质的情况下悬浮培养所述多能干细胞的聚集体。
[3][1]或[2]的方法，其中所述骨形态发生因子信号转导途径激活物质是BMP4。
[4][3]的方法，其中BMP4具有1-5nM的浓度。
[5][1]-[4]中任一项的制备方法，其中所述悬浮培养完全或部分地在成纤维细胞生长因子存在下进行。
[6][1]-[5]中任一项的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。
[7][1]-[6]中任一项的方法，其中所述多能干细胞来源于人。
[8][1]-[7]中任一项的方法，其中所述悬浮培养在不存在饲养细胞的情况下进行。
[9][1]-[8]中任一项的方法，其中所述细胞聚集体还包含神经视网膜组织。
[10][1]-[9]中任一项的方法，其中所述眼前段组织是角膜和/或晶状体。
[11][1]-[10]中任一项的方法，其中所述细胞聚集体包含作为所述眼前段组织的部分结构的角膜上皮，并且还包含间充质组织或来源于其的胶膜间质和/或角膜内皮。
[12][11]的方法，其中所述角膜上皮是分层的。
[13][1]-[12]中任一项的方法，所述方法还包括从所述细胞聚集体分离所述眼前段组织或其部分结构或其前体组织。
[14][13]的方法，其中所述眼前段组织或其部分结构或其前体组织与神经视网膜组织一起分离。
[15]通过[1]-[12]中任一项的方法获得的细胞聚集体。
[16]眼前段组织或其部分结构或其前体组织，其是由[13]或[14]的方法获得的。
发明效果
按照本发明，可以在能够提供高通量的悬浮培养下立体形成眼前段组织(如晶状体、角膜等)或其部分结构、或其前体组织。
按照本发明，能够以常规方法难以达到的高的效率由多能干细胞诱导眼前段组织(如晶状体、角膜等)或其部分结构、或其前体组织。在一个在具有相当小的体积的培养隔室(如96孔板)中形成聚集体的实施方案中，可以以不低于80％的效率形成包含角膜前体组织的聚集体，并且可以以不低于20％的效率获得包含晶状体前体组织的细胞聚集体。
按照本发明，可以在“短时间”内由多能干细胞诱导眼前段组织(如晶状体、角膜等)或其部分结构、或其前体组织，而这是常规方法难以达到的。在根据本发明的一个实施方案中，能够在自分化培养开始起约3周内由多能干细胞诱导晶状体和角膜上皮，而这在常规上至少需要两倍长的时间。
按照本发明，能够由多能干细胞邻接地立体形成在活体的眼中共存的视网膜、晶状体和角膜。因此，可以复制与体内相似的非人工组织发育培养环境。
按照本发明，角膜上皮和与其邻接的神经嵴来源的间充质组织(其形成角膜内皮和角膜间质)可以在聚集体中同时形成，从而产生层状的具有上皮、间质和内皮的前体组织的角膜前体组织。
按照本发明，可以形成角膜上皮，所述角膜上皮具有成熟角膜所特有的层状上皮结构，包括作为表层的鳞状上皮和作为深层的立方上皮。
按照本发明，可以在聚集体的表层上选择性地形成角膜前体组织，并且，甚至在不使用FACS等的情况下，就能够以高纯度分离角膜祖细胞。
附图简述
[图1A]图1A显示在添加BMP4的条件下，在由SFEBq方法获得的人ES细胞聚集体(第14天)的表层中形成不同于神经视网膜的Rx::venus阴性的、E-钙黏着蛋白阳性的上皮细胞层。
[图1B]图1B显示在添加BMP4的条件下在由SFEBq方法获得的人ES细胞聚集体(第24天)的表层中形成的上皮细胞层是广谱细胞角蛋白(pancytokeratin)阳性的。
[图1C]图1C显示在添加BMP4的条件下在由SFEBq方法获得的人ES细胞聚集体(第24天)的表层中形成L-Maf阳性的晶状体基板样组织，其中上皮细胞层增厚。
[图2]图2显示在添加BMP4的条件下由SFEBq方法获得的人ES细胞聚集体(第55天)的表层中形成的上皮组织表达角膜上皮特有的细胞角蛋白3(CK3)、细胞角蛋白12(CK12)和细胞角蛋白14(CK14)。
[图3A]图3A显示在添加BMP4的条件下由SFEBq方法获得的人ES细胞聚集体(第33天)的表层中的增厚的角膜上皮与神经视网膜组织之间的间充质细胞聚集体层中的PDGFR-α的表达。
[图3B]图3B显示在添加BMP4的条件下由SFEBq方法获得的人ES细胞聚集体(第53天)的表层中的增厚的角膜上皮与神经视网膜组织之间的间充质细胞聚集体层中的Pitx2和ABCG2的表达。
[图3C]图3C显示间充质细胞聚集体层的最内部中形成的上皮化的内皮细胞层(epithelizedendothelialcelllayer)的形态学。
[图4A]图4A显示在添加bFGF的组中观察到的晶状体泡样囊泡，其中观察到具有沿前-后轴的形态极性(在前部薄，在后部厚)的晶状体组织的形成，这是体内晶状体发育中可见的。
[图4B]图4B显示在不添加bFGF的组中观察到的晶状体泡样囊泡。在添加bFGF的组中观察到的组织极性是不清楚的。
[图5A]图5A显示CK3在分层的角膜上皮中的表达。
[图5B]图5B显示CK12在分层的角膜上皮中的表达。
[图5C]图5C显示CK15在分层的角膜上皮中的表达。
[图5D]图5D显示Na-KATP酶在分层的角膜上皮中的表达。
实施方案描述
本发明提供包含眼前段组织或其部分结构、或其前体组织和神经视网膜组织的细胞聚集体的制备方法，所述方法包括在骨形态发生因子信号转导途径激活物质存在下悬浮培养多能干细胞的聚集体。
在下文中详细地阐释本发明。
(1)多能干细胞
“多能干细胞”是指具有分化成组成身体的所有细胞的潜能(分化多能性)和经由细胞分裂产生具有相同的分化能力的子细胞的潜能(自我复制能力)的细胞。
分化多能性可以通过将评价靶标的细胞移植到裸鼠中并且检测是否存在包含三个胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的每种细胞的畸胎瘤的形成来评价。
多能干细胞的实例包括胚胎干细胞(ES细胞)，胚胎生殖细胞(EG细胞)，诱导的多能干细胞(iPS细胞)等，并且多能干细胞没有限制，只要其具有分化多能性和自我复制能力二者即可。在本发明中，优选使用胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。
例如，胚胎干细胞(ES细胞)可以通过培养预植入的早期胚胎、构成早期胚胎的内细胞团、单个卵裂球等而建立(ManipulatingtheMouseEmbryoALaboratoryManual(操作小鼠胚胎实验室手册)，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1994)；Thomson，J.A.等人，Science，282，1145-1147(1998))。作为早期胚胎，可以使用通过核移植体细胞的细胞核制备的早期胚胎(Wilmut等人(Nature，385，810(1997))，Cibelli等人(Science，280，1256(1998))，AkiraIRITANI等人(TanpakushitsuKakusanKoso，44，892(1999))，Baguisi等人(NatureBiotechnology，17，456(1999))，Wakayama等人(Nature，394，369(1998)；NatureGenetics，22，127(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，14984(1999))，RideoutIII等人(NatureGenetics，24，109(2000)，Tachibana等人(HumanEmbryonicStemCellsDerivedbySomaticCellNuclearTransfer(通过体细胞核转移获得的人胚胎干细胞)，Cell(2013)，出版中))。作为早期胚胎，还可以使用单性胚(Kim等人(Science，315，482-486(2007))，Nakajima等人(StemCells，25，983-985(2007))，Kim等人(CellStemCell，1，346-352(2007))，Revazova等人(CloningStemCells，9，432-449(2007))，Revazova等人(CloningStemCells，10，11-24(2008))。
用于本发明方法的胚胎干细胞中还包括通过将ES细胞与体细胞进行细胞融合获得的融合ES细胞。
胚胎干细胞可从适当的组织获得，并且可以购买商业产品。例如，人胚胎干细胞KhES-1、KhES-2和KhES-3可从京都大学(KyotoUniversity)的前沿医学科学研究所(InstituteforFrontierMedicalSciences)获得。
胚胎生殖细胞(EG细胞)可以通过在LIF、bFGF、SCF等存在下培养原生殖细胞而建立(Matsui等人，Cell，70，841-847(1992)，Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(23)，13726-13731(1998)，Turnpenny等人，StemCells，21(5)，598-609，(2003))。
诱导的多能干细胞(iPS细胞)是指通过使体细胞(例如，成纤维细胞、皮肤细胞、淋巴细胞等)与核重编程因子(nuclearreprogrammingfactor)接触而人工获得分化多能性和自我复制能力的细胞。通过包括向体细胞(例如，成纤维细胞、皮肤细胞等)中引入由Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc构成的核重编程因子的方法首次发现iPS细胞(Cell，126:p.663-676，2006)。此后，多名研究者已经在重编程因子的组合和所述因子的引入方法方面进行了多种改进，并且已经报道了多种诱导的多能干细胞的制备方法。
所述核重编程因子可以用任意物质配置，诸如蛋白质因子或其编码核酸(包括结合在载体中的形式)或低分子化合物，只要其是能够由诸如成纤维细胞等的体细胞诱导具有分化多能性和自我复制能力的细胞的物质即可。当所述核重编程因子是蛋白质因子或其编码核酸时，优选的核重编程因子由以下组合例示(以下，仅显示蛋白质因子的名称)。
(1)Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc(其中Sox2可被Sox1、Sox3、Sox15、Sox17或Sox18替换。Klf4可被Klf1、Klf2或Klf5替换。此外，c-Myc可被T58A(活性形式突变体)、N-Myc或L-Myc替换。)
(2)Oct3/4、Klf4、Sox2
(3)Oct3/4、Klf4、c-Myc
(4)Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28
(5)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28
(6)Oct3/4、Klf4、Sox2、bFGF
(7)Oct3/4、Klf4、Sox2、SCF
(8)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、bFGF
(9)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、SCF
在这些组合中，当考虑将获得的iPS细胞用于治疗应用时，优选的是Oct3/4、Sox2和Klf4三种因子的组合。另一方面，当不考虑将iPS细胞用于治疗应用时(例如，用作药物发现筛选等的研究工具)，优选的是由Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc组成的四种因子，或向其加入Lin28或Nanog的5种因子。
iPS细胞优选地用于自体移植。
通过由已知的遗传工程方法修饰染色体中的基因而获得的多能干细胞也可以用于本发明。所述多能干细胞可以是这样的细胞，其中已经通过已知方法以符合读码框的(in-frame)方式在编码分化标记物的基因中敲入标记基因(例如，荧光蛋白，如GFP等)，所述细胞可以通过使用所述标记基因的表达作为指标而被鉴定为已经达到相应的分化阶段。
可以使用温血动物多能干细胞，优选哺乳动物多能干细胞作为多能干细胞。例如，哺乳动物包括实验室动物，包括啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠，和兔；家畜动物如猪、牛、山羊、马和绵羊；陪伴动物如狗和猫；灵长类动物如人、猴、猩猩和黑猩猩。多能干细胞优选是啮齿动物(小鼠、大鼠等)或灵长类动物(人等)的多能干细胞，并且最优选是人多能干细胞。
多能干细胞可以通过本身已知的方法培养来维持。例如，从临床应用方面来看，优选地通过使用血清替代品(如KnockoutTM血清替代物(KnockoutTMSerumReplacement，KSR)等)的无血清培养或不含饲养细胞的培养维持多能干细胞。
要用于本发明的多能干细胞优选是分离的。成为“分离的”意指进行去除靶细胞或成分之外的因子的操作，并且所述细胞或成分不再以天然状态存在。“分离的人多能干细胞”的纯度(人多能干细胞的数目占总细胞数目的百分比)通常不小于70％，优选地不小于80％，更优选地不小于90％，进一步优选地不小于99％，最优选100％。
(2)可以通过本发明的方法诱导分化的组织
按照本发明的制备方法，可以通过在多能干细胞聚集体中诱导多能细胞分化成眼前段组织或其部分结构、或其前体组织而获得包含眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的细胞聚集体。
眼前段(anterioreyesegment)是指在眼球锯齿缘之前的部分。眼前段组织是指构成眼前段的组织，并且包括组织如角膜、晶状体、虹膜、睫状体、前房和后房、小带、前部玻璃体和前部巩膜以及眼外段中的结膜和眼睑等或其部分结构。由本发明的方法制备的细胞聚集体中包含的眼前段组织或其部分结构或其前体组织优选地包括：i)角膜，其部分结构，或其前体组织，和/或ii)晶状体，其部分结构，或其前体组织。
角膜是透明的表面玻璃样组织，其占据眼球外层之前的部分的约1/6。角膜的部分结构的实例包括，但不限于，角膜上皮，前界层(Bowman’smembrane)，角膜基质，后界层(Descemet’smembrane)，角膜内皮等。角膜通常由5层构成，其自体表侧起以角膜上皮、前界层、角膜基质、后界层和角膜内皮的次序组成。角膜、其部分结构或其前体组织的诱导可以通过标记物的表达来确认。角膜、其部分结构或其前体组织的标记物的实例包括广谱细胞角蛋白(角膜上皮前体组织)，E-钙黏着蛋白(角膜上皮前体组织)，细胞角蛋白3(角膜上皮)，细胞角蛋白12(角膜上皮)，细胞角蛋白14(角膜上皮)，p63(角膜上皮)，ZO-1(角膜上皮)，PDGFR-α(角膜基质，角膜内皮，或其前体组织)，Pitx2(角膜基质和角膜内皮的前体组织)，ABCG2(角膜基质和角膜内皮的前体组织)等。在一个实施方案中，由本发明的方法制备的细胞聚集体中包含的角膜上皮的前体组织是广谱细胞角蛋白阳性的和E-钙黏着蛋白阳性的上皮细胞层。在一个实施方案中，由本发明的方法制备的细胞聚集体中包含的角膜上皮是细胞角蛋白3阳性的，细胞角蛋白12阳性的，细胞角蛋白14阳性的，p63阳性的和ZO-1阳性的上皮结构。在一个实施方案中，由本发明的方法制备的细胞聚集体中包含的角膜基质和角膜内皮的前体组织是间充质细胞的聚集体层。在一个实施方案中，间充质细胞的聚集体层是PDGFR-α阳性的，或Pitx2阳性的和ABCG2阳性的。尽管角膜基质和角膜内皮都来源于间充质细胞，但是角膜内皮表现出上皮化的内皮细胞层样形式。上述标记物表达分析之外的形态学观察允许区分角膜基质(或其前体组织)与角膜内皮(或其前体组织)，并且证实角膜内皮或其前体组织的诱导。
晶状体是起将从外部进入眼球的光折射并且集中在视网膜上的透镜的作用的组织。晶状体的部分结构的实例包括，但不限于，晶状体上皮，晶状体核，晶状体囊等。晶状体的前体组织的实例包括晶状体基板、晶状体泡等。晶状体基板是由增厚的表面外胚层细胞层构成的晶状体前体组织。在胚胎发育中，其通过使视杯与表面外胚层接触而形成，这使接触区域增厚。晶状体泡是由晶状体基板的内陷形成的泡。晶状体、其部分结构或其前体组织的诱导可以通过标记物的表达来证实。晶状体、其部分结构或其前体组织的标记物的实例包括，但不限于，L-Maf(晶状体前体组织)，α、β和γ晶体(晶状体)等。在一个实施方案中，晶状体基板是L-Maf阳性的增厚的表面外胚层细胞层。在一个实施方案中，晶状体泡是L-Maf阳性的囊泡。
神经视网膜是指视网膜中感应光的部分，并且包含至少一种类型的视网膜细胞。作为视网膜细胞，可以提及构成视网膜的任何细胞，并且没有特别限制。其实例包括光感受器，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞等。视网膜细胞的诱导可以通过细胞标记物的表达来证实。视网膜细胞标记物的实例包括，但不限于，Rx(视网膜祖细胞)，PAX6(祖细胞)，Crx(光感受器的祖细胞)，Chx10(双极细胞)，L7(双极细胞)，Tuj1(神经节细胞)，Brn3(神经节细胞)，钙视网膜蛋白(Calretinin)(无长突细胞)，钙结合蛋白(Calbindin)(水平细胞)，视紫红质(Rhodopsin)(光感受器)，视觉恢复蛋白(recoverin)(光感受器)，RPE65(色素上皮细胞)，Mitf(色素上皮细胞)等。在一个实施方案中，由本发明的方法制备的细胞聚集体中包含的神经视网膜组织是Rx阳性的、Chx10阳性的上皮组织。
(3)多能干细胞聚集体的形成
可以通过在不粘附于培养容器的条件下培养(即，悬浮培养)分散的多能干细胞并且组装多个多能干细胞以允许聚集体形成，而获得多能干细胞聚集体。
用于聚集体形成的培养容器没有特别限制，并且其实例包括烧瓶、组织培养瓶、平皿、培养皿、组织培养皿、多重平皿(multi-dishes)、微量板、微孔板、微孔、多重板(multi-plates)、多孔板、室载玻片(chamberslide)、培养皿、管、托盘、培养袋和旋转瓶。为了允许在非贴壁条件下的培养，培养容器优选是非细胞粘附的。可用的非细胞粘附培养容器包括其表面被人工处理成非细胞粘附的培养容器、其表面没有进行用于改善细胞粘附性的人工处理(例如，利用胞外基质的包被处理等)的培养容器等。
用于聚集体形成的培养基可以使用用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基来制备。所述基础培养基没有特别限制，只要其可以用于培养动物细胞即可，并且可以是BME培养基，BGJb培养基，CMRL1066培养基，GlasgowMEM培养基，改良的MEM锌选项培养基，IMDM培养基，Medium199培养基，EagleMEM培养基，αMEM培养基，DMEM培养基，ham培养基，Ham’sF-12培养基，RPMI1640培养基，Fischer’s培养基，其混合的培养基等。
为了避免对多能干细胞向眼前段组织或其部分结构或其前体组织的分化诱导的不利影响，用于聚集体形成的培养基优选是无血清培养基。所述无血清培养基意指不含未调节的或未纯化的血清的培养基。含有纯化的来源于血液的成分和来源于动物组织的成分(例如，细胞因子)的培养基对应于无血清培养基。
用于聚集体形成的培养基可以包含血清替代品。例如，所述血清替代品可以是适当地包含清蛋白、运铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、痕量元素、2-巯基乙醇或3’-硫代甘油或其等价物等的替代品。例如，这样的血清替代品可以通过WO98/30679所述的方法制备。为了促使本发明的方法更容易实施，可以使用商购的血清替代品。所述商购血清替代品的实例包括敲除血清替代物(KnockoutSerumReplacement，KSR，由Invitrogen制备)，化学成分确定的浓缩脂质(Chemically-definedLipidConcentrated，由GibcoCompany制备)和Glutamax(由GibcoCompany制备)。
用于聚集体形成的培养基可以包含其他添加剂，只要对多能干细胞向眼前段组织或其部分结构或其前体组织的分化诱导没有不利影响即可。添加剂的实例包括，但不限于，胰岛素、铁源(例如，运铁蛋白等)、矿物质(例如，硒酸钠等)、糖(例如，葡萄糖等)、有机酸(例如，丙酮酸、乳酸等)、血清蛋白(例如，清蛋白等)、氨基酸(例如，L-谷氨酰胺等)、还原剂(例如，2-巯基乙醇等)、维生素(例如，抗坏血酸、d-生物素等)、抗生素(例如，链霉素、青霉素、庆大霉素等)、缓冲剂(例如，HEPES等)等。
用于聚集体形成的培养基可以是下文提到的用于诱导多能干细胞向眼前段组织或其部分结构或其前体组织分化的培养基。
为了形成多能干细胞聚集体，自传代培养物收集多能干细胞，并且分散成单个细胞状态或接近单个细胞状态。将多能干细胞用适当的细胞离散溶液分散。所述细胞离散溶液的实例包括EDTA；蛋白酶如胰蛋白酶、胶原酶IV、金属蛋白酶等，等等，它们被单独使用或者以适当的组合使用。这些中，优选的是显示低细胞毒性的那种，并且此种细胞离散溶液的实例包括商购的产品如DISPASE(EIDIA)，TrypLE(Invitrogen)，Accutase(MILLIPORE)等。其中，优选使用Accutase，因为其甚至在细胞被解离成接近单个细胞状态时也不容易引起多能干细胞(特别是人多能干细胞)的细胞死亡。分散的多能干细胞被悬浮在上述培养基中。
为了抑制由分散引起的多能干细胞(特别是人多能干细胞)的细胞死亡，优选的是自培育开始起就加入Rho相关卷曲螺旋激酶(Rho-associatedcoiled-coilkinase，ROCK)的抑制剂(JP-A-2008-99662)。ROCK抑制剂的实例包括Y-27632((+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐)等。用于悬浮培养的ROCK抑制剂的浓度是能够抑制由分散引起的多能干细胞的细胞死亡的浓度。例如，对于Y-27632，该浓度通常约为0.1-200μM，优选地约2-50μM。
将分散的多能干细胞的悬浮液接种到上述培养容器中，并且将分散的多能干细胞在不粘附细胞培养容器的条件下培养，由此多个多能干细胞组装形成聚集体。在该情形中，分散的多能干细胞可以被接种到比较大的培养容器(如10-cm平皿)中，以在一个培养隔室中同时形成多个多能干细胞聚集体。然而，聚集体的尺寸，以及其中包含的多能干细胞的数量可以宽泛地变化，并且所述变化可能引起聚集体之间多能干细胞向眼前段组织或其部分结构或其前体组织的分化水平的差异，这又可能降低分化诱导的效率。因此，优选的是快速地使分散的多能干细胞成一体以在一个培养隔室中形成一个聚集体。用于快速地使分散的多能干细胞成一体的方法的实例包括下述方法：
(1)包括将分散的多能干细胞装入具有比较小的体积(例如，不大于1ml，不大于500μl，不大于200μl，不大于100μl)的培养隔室中以在所述隔室中形成一个聚集体的方法。优选地，在装入所述分散的多能干细胞后，将所述培养隔室静置。所述培养隔室的实例包括，但不限于，多孔板(384-孔，192-孔，96-孔，48-孔，24-孔等)中的孔，微孔，室载玻片等，管，悬滴法中的培养基的液滴等。由于重力，装在所述隔室中的分散的多能干细胞沉淀于一点上，或者细胞彼此粘附从而在一个培养隔室中形成一个聚集体。多壁板、微孔、室载玻片、管等的底部的形状优选是U型底或V型底，以促使分散的多能干细胞沉淀于一点。
(2)包括将分散的多能干细胞放置在离心管中，将其离心以允许多能干细胞沉淀于一点上，由此在管中形成一个聚集体的方法。
要接种在一个培养隔室中的多能干细胞的数量没有特别的限制，只要每个培养隔室形成一个聚集体，并且可以通过本发明的方法在所述聚集体中诱导多能干细胞向眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的分化。通常，在一个培养隔室中接种约1×103-约5×104个，优选约1×103-约2×104个，更优选约2×103-约1.2×104个多能干细胞。然后，通过快速地使多能干细胞成一体，每个培养隔室形成通常由约1×103-约5×104个、优选约1×103-约2×104个、更优选约2×103-约1.2×104个多能干细胞构成的一个细胞聚集体。
可以适当地确定聚集体形成所需的时间，只要每个隔室形成一个聚集体，并且可以通过本发明的方法在所述聚集体中诱导多能干细胞向眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的分化。通过缩短所述时间，预期向目标眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的分化的有效诱导，并且，因此，所述时间优选更短。优选地，在24小时内形成多能干细胞聚集体，更优选地，在12小时内形成，更优选地在6小时内形成，最优选地在2–3小时内形成。可以通过由本领域技术人员选择用于细胞聚集的工具、离心条件等来适当地调节聚集体形成所需的时间。
可以适当地设定其他培养条件，如聚集体形成时的培养温度和CO2浓度。培养温度没有特别限制，并且，例如，是约30-40℃，优选地约37℃。例如，CO2浓度是约1-10％，优选约5％。
此外，准备多个在相同培养条件下的培养隔室，并且在每个培养隔室中形成一个多能干细胞聚集体，由此可以获得多能干细胞聚集体的质量均一的群体。多能干细胞聚集体是否是质量均一的可以基于下述进行评价：聚集体团块的尺寸和其中的细胞数量，通过组织染色分析的其宏观形态学、微观形态学和同质性，分化和不分化标记物的表达及其同质性，分化标记物表达的调节及其同步性，聚集体间分化效率的重现性等。在一个实施方案中，用于本发明方法的多能干细胞聚集体的群体在所述聚集体中包含均一数量的多能干细胞。特定参数“均一”的多能干细胞聚集体的群体意指在其群体中的总聚集体的不低于90％落在所述聚集体群体中该参数的平均数±10％、优选±5％的范围内。
(4)眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的诱导
本发明的制备方法包括在骨形态发生因子信号转导途径激活物质如BMP4存在下悬浮培养多能干细胞聚集体。通过在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质的培养基中悬浮培养多能干细胞聚集体，诱导自所述多能干细胞向眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的分化，并且产生包含眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的细胞聚集体。
按照本发明，通过在悬浮培养条件下用骨形态发生因子信号转导途径激活物质如BMP4处理多能干细胞聚集体而诱导眼前段组织的自组织，由此可以立体形成眼前段组织(如角膜、晶状体等)、其部分结构或其前体组织。按照本发明的一个实施方案，通过悬浮培养多能干细胞聚集体而诱导神经视网膜的自组织。在该过程中，通过用骨形态发生因子信号转导途径激活物质处理，表面外胚层以自组织的方式形成在所述聚集体中形成的视网膜上皮组织聚集体的表面中，并且，可以在体外自发引起“视网膜诱导眼前段组织的前体组织(晶状体基板、角膜基板等)自表面外胚层分化”，这是在体内胚胎发育过程中可见的。结果，神经视网膜在细胞聚集体内自组织，并且眼前段组织、其部分结构或其前体组织(例如，晶状体基板、角膜上皮前体组织)在其表面上自组织。即，在一个实施方案中，通过本发明获得的细胞聚集体还包含神经视网膜组织。以这种方式获得细胞聚集体，所述细胞聚集体包含构成所述细胞聚集体的表层的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织和在所述细胞聚集体内部的神经视网膜组织，其中所述眼前段组织或其部分结构、或其前体组织与所述神经视网膜组织相邻。
“悬浮培养”多能干细胞聚集体是指在不粘附培养容器的条件下在培养基中培养多能干细胞的聚集体。这使得在常规贴壁培养中难以实现的立体形成成为可能。
用于悬浮培养的培养基包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质。所述骨形态发生因子信号转导途径激活物质是激活该途径的任意物质，在骨形态发生因子与受体结合后，信号通过该途径传递。所述骨形态发生因子信号转导途径激活物质的实例包括BMP2，BMP4，BMP7，GDF5等。优选地，所述骨形态发生因子信号转导途径激活物质是BMP4。尽管以下主要描述BMP4，但是，用于本发明的骨形态发生因子信号转导途径激活物质不限于BMP4。BMP4是已知的细胞因子，其氨基酸序列也是已知的。用于本发明的BMP4是哺乳动物BMP4。哺乳动物的实例包括实验动物如啮齿动物，诸如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等，兔等；家养动物如猪、牛、山羊、马、绵羊等；陪伴动物，如狗、猫等；和灵长类动物如人、猴、猩猩、黑猩猩等。BMP4优选是啮齿动物(小鼠，大鼠等)或灵长类动物(人等)的BMP4，最优选是人BMP4。人BMP4意指BMP4具有在人体中天然表达的BMP4的氨基酸序列。代表性的人BMP4的氨基酸序列的实例包括NCBI登记号NP_001193.2(2013年6月15日更新)，NP_570911.2(2013年6月15日更新)，NP_570912.2(2013年6月15日更新)，通过从这些氨基酸序列中的每个去除N端信号序列(1-24)获得的氨基酸序列(成熟形式的人BMP4氨基酸序列)等。
骨形态发生因子信号转导途径激活物质在培养基中的浓度可以适当地确定在这样的范围内，在所述范围内，可以在聚集体中诱导多能干细胞向眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的分化。当使用BMP4作为骨形态发生因子信号转导途径激活物质时，其浓度通常为0.1-50nM，优选1-5nM。在培养期间BMP4浓度可以保持恒定或者变化。例如，可以先将BMP4浓度设定为3–7nM，优选4–6nM，更优选约5nM，然后设定为0-3nM，优选0.5-2nM，更优选约1nM。
不需要在自多能干细胞诱导眼前段组织或其部分结构或其前体所需的整个时间期间一直进行在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中的培养，仅需要在部分时间期间进行。例如，先将多能干细胞聚集体在不存在骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的条件下进行悬浮培养，之后在骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)存在下对其进行悬浮培养。在一个实施方案中，在形成多能干细胞聚集体之后，将所述多能干细胞聚集体在不存在骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的条件下悬浮培养1-5天，优选1-3天，然后，可以在将培养基更换为包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基后继续悬浮培养。
用于聚集体的悬浮培养的培养基可以使用用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基来制备。所述基础培养基没有特别限制，只要其可以用于培养动物细胞即可，并且可以是BME培养基，BGJb培养基，CMRL1066培养基，GlasgowMEM培养基，改良的MEM锌选项培养基(ImprovedMEMZincOptionmedium)，IMDM培养基，Medium199培养基，EagleMEM培养基，αMEM培养基，DMEM培养基，ham培养基，Ham’sF-12培养基，RPMI1640培养基，Fischer’s培养基，其混合的培养基等。
为了避免对诱导多能干细胞向眼前段组织或其部分结构或其前体组织分化的不利影响，用于悬浮培养聚集体的培养基优选是无血清培养基。
用于悬浮培养聚集体的培养基可以包含血清替代品。例如，所述血清替代品可以是适当地包含清蛋白、运铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、痕量元素、2-巯基乙醇或3’-硫代甘油或它们的等价物等的替代品。这样的血清替代品可以例如通过WO98/30679中所述的方法制备。为了促使本发明的方法更容易实施，可以使用商购的血清替代品。所述商购血清替代品的实例包括敲除血清替代物(KSR)(由Invitrogen制备)，化学成分确定的浓缩脂质(由GibcoCompany制备)和Glutamax(由GibcoCompany制备)。
用于悬浮培养聚集体的培养基可以包含其他添加剂，只要没有对多能干细胞向眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的分化的诱导施加不利的影响即可。所述添加剂的实例包括，但不限于，胰岛素、铁源(例如，运铁蛋白等)、矿物质(例如，硒酸钠等)、糖(例如，葡萄糖等)、有机酸(例如，丙酮酸，乳酸等)、血清蛋白(例如，清蛋白等)、氨基酸(例如，L-谷氨酰胺等)、还原剂(例如，2-巯基乙醇等)、维生素(例如，抗坏血酸，d-生物素等)、抗生素(例如，链霉素，青霉素，庆大霉素等)、缓冲剂(例如，HEPES等)等。
在一个实施方案中，为了避免对诱导多能干细胞向眼前段组织或其部分结构、或其前体组织分化的不利影响，用于悬浮培养聚集体的培养基优选是添加有血清替代品(KSR等)的不含生长因子的化学成分确定的培养基(gfCDM)。此处，“生长因子”包括模式形成因子(patternformationfactor)(不包括骨形态发生因子信号转导途径激活物质)如Fgf，Wnt，Nodal，Notch，Shh等；胰岛素和富脂质清蛋白。不含生长因子的化学成分确定的培养基的实例包括Wataya等人，ProcNatlAcadSciUSA，105(33):11796-11801，2008中公开的gfCDM。gfCDM是IMDM与Ham’sF-12的1:1混合培养基，其包含1x化学成分确定的脂质浓缩物，单硫代甘油(450μM)，纯化的BSA和人脱铁运铁蛋白(终浓度150μg/ml)。
用于悬浮培养聚集体的培养容器没有特别限制。所述培养容器包括，例如，烧瓶、组织培养瓶、平皿、培养皿、组织培养皿、多重平皿、微量板、微孔板、微孔、多重板、多孔板、室载玻片、培养皿、管、托盘、培养袋和旋转瓶。为了允许在非粘附条件下培养，培养容器优选是非细胞粘附的。可用的非细胞粘附的培养容器包括表面被人工处理成为细胞不粘附的培养容器、表面没有进行用于改善细胞粘附性的人工处理(例如，利用胞外基质的包被处理等)的培养容器等。
聚集体的悬浮培养可以在存在或不存在饲养细胞的条件下进行，只要自多能干细胞向眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的分化诱导是可能的即可。为了避免不确定因素的污染，聚集体的悬浮培养优选在不存在饲养细胞的条件下进行。
可以适当地设定用于悬浮培养聚集体的其他培养条件，如培养温度，CO2浓度和O2浓度。培养温度没有特别的限制，并且例如，是约30-40℃，优选约37℃。CO2浓度例如是约1-10％，优选约5％。O2浓度例如是约20-40％。
在优选的实施方案中，将多能干细胞聚集体的质量均一的群体在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中悬浮培养。使用多能干细胞聚集体的质量均一的群体，可以将聚集体之间向眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的分化水平的差异抑制至最小程度，并且可以提高目标分化诱导的效率。多能干细胞聚集体的质量均一的群体的悬浮培养包括以下实施方案：
(1)准备多个培养隔室，并且接种多能干细胞聚集体的质量均一的群体，以使在一个培养隔室中包含一个多能干细胞聚集体(例如，在96孔板的每个孔中放置一个多能干细胞聚集体)。在每个培养隔室中，将一个多能干细胞聚集体在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中悬浮培养。
(2)接种多能干细胞聚集体的质量均一的群体，以使在一个培养隔室中包含多个多能干细胞聚集体(例如，在10cm的平皿中放置多个多能干细胞聚集体)。在所述培养隔室中，将多个多能干细胞聚集体在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中悬浮培养。
可以将实施方案(1)和(2)中任一个用于本发明的方法，并且在培养过程中可以改变实施方案(从实施方案(1)到实施方案(2)，或从实施方案(2)到实施方案(1))。为了避免聚集体之间的相互作用并且实现稳定的分化诱导，实施方案(1)是优选的。
如以上提及的，因为在本发明的方法中在细胞聚集体中诱导眼前段组织的自组织，所述细胞聚集体中包含的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织的分化阶段随着时间进程而进展。因此，优选地按照目标眼前段组织或其部分结构、或其前体组织适当地调节培养时间和培养条件。在以下(5)-(11)中，按时间顺序来说明本发明的一个实施方案，其是本发明的示例，而不限制本发明。
(5)神经视网膜组织的诱导
当在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中悬浮培养多能干细胞聚集体时，神经视网膜组织在所述聚集体内部被诱导。神经视网膜组织的诱导可以使用神经视网膜组织标记物(例如，Rx，Chx10)的表达或神经上皮样结构(假复层柱状上皮)的形成作为指标进行验证。诱导神经视网膜组织所需要的时间取决于培养条件和所述多能干细胞所来源于的哺乳动物的种类而变化，并且作一般性限定。然而，当使用人多能干细胞时，神经视网膜组织在例如自开始悬浮培养所述多能干细胞聚集体起的8，9，10，11，12，13，14或15天内在所述聚集体内部被诱导。
(6)角膜上皮前体组织和/或晶状体基板的诱导
当在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中连续地悬浮培养在上述(5)中获得的在内部包含神经视网膜组织的聚集体时，在所述神经视网膜组织的外部形成外胚层上皮细胞层，并且所述神经视网膜组织诱导外胚层上皮细胞层向角膜上皮前体组织和/或晶状体基板分化，从而在所述细胞聚集体的表层形成角膜上皮前体组织和/或晶状体基板。在所述聚集体中，角膜上皮前体组织和/或晶状体基板构成所述细胞聚集体的表层，神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且角膜上皮前体组织和/或晶状体基板与神经视网膜组织邻接。角膜上皮前体组织和/或晶状体基板的诱导可以使用角膜上皮前体组织标记物(例如，广谱细胞角蛋白、E-钙黏着蛋白)和晶状体基板标记物(例如，L-Maf)的表达或增厚的上皮细胞层的形成作为指标进行验证。诱导角膜上皮前体组织和/或晶状体基板所需要的时间取决于培养条件和所述多能干细胞所来源的哺乳动物的种类而变化，并且不能被一般性指定。然而，当使用人多能干细胞时，角膜上皮前体组织和/或晶状体基板在例如自开始悬浮培养所述多能干细胞聚集体起的10，12，14，16，18，20，22，24，26或28天内在所述细胞聚集体的表层中形成。通过选择证实已经由培养的多个细胞聚集体形成角膜上皮前体组织和/或晶状体基板的细胞聚集体，可以获得包含角膜上皮前体组织和/或晶状体基板、以及神经视网膜组织的细胞聚集体，其中，角膜上皮前体组织和/或晶状体基板构成所述细胞聚集体的表层，神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且角膜上皮前体组织和/或晶状体基板与神经视网膜组织邻接。如以上提及的，可以以例如不小于60％、优选不小于70％、更优选不小于80％的效率形成包含角膜前体组织的细胞聚集体群体，并且可以以例如不小于10％、优选不小于15％、更优选不小于20％的效率获得包含晶状体前体组织的细胞聚集体群体。
(7)角膜上皮的诱导
在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中进一步悬浮培养在上述(6)中获得的包含角膜上皮前体组织和神经视网膜组织的细胞聚集体(其中所述角膜上皮前体组织构成所述细胞聚集体的表层，所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且所述角膜上皮前体组织与所述神经视网膜组织邻接)，由此诱导所述角膜上皮前体组织向角膜上皮的进一步分化。结果，可以形成包含角膜上皮和神经视网膜组织的细胞聚集体，其中所述角膜上皮构成所述细胞聚集体的表层，所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且所述角膜上皮与所述神经视网膜组织邻接。角膜上皮的诱导可以使用角膜上皮标记物(例如，细胞角蛋白3，细胞角蛋白12，细胞角蛋白14，p63，ZO-1)和角膜上皮干细胞标记物(例如，细胞角蛋白15)的表达作为指标进行验证。诱导角膜上皮所需要的时间取决于培养条件和所述多能干细胞所来源的哺乳动物的种类而变化，并且不能一般性指定。然而，当使用人多能干细胞时，角膜上皮在例如自开始悬浮培养多能干细胞聚集体起的20，25，30，35，40，45，50，55，60，65或70天内在所述细胞聚集体的表层中形成。通过选择证实已经由培养的多个细胞聚集体形成角膜上皮的细胞聚集体，可以获得包含角膜上皮和神经视网膜组织的细胞聚集体，其中所述角膜上皮构成所述细胞聚集体的表层，所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体内部，并且所述角膜上皮与所述神经视网膜组织邻接。
作为用于进一步悬浮培养以诱导角膜上皮前体组织向角膜上皮进一步分化的培养基，可以继续使用上述(4)中所述的用于悬浮培养多能干细胞聚集体的培养基。作为基础培养基，可以采用被改良以适于培养角膜上皮和表皮上皮的细胞的培养基。所述培养基的实例包括，但不限于，CnT-30培养基(由CELLnTEC制备)，成分确定的K-SFM培养基(由Gibco/Invitrogen制备)等。
(8)角膜上皮的分层
在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中进一步悬浮培养在上述(7)中获得的包含角膜上皮和神经视网膜组织的细胞聚集体(其中所述角膜上皮构成所述细胞聚集体的表层，所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且所述角膜上皮与所述神经视网膜组织邻接)，由此诱导角膜上皮分层。结果，可以形成包含分层的角膜上皮和神经视网膜组织的细胞聚集体，其中所述角膜上皮构成所述细胞聚集体的表层，并且所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部。角膜上皮的分层可以通过显微镜观察成熟的角膜特有的上皮分层结构而证实，其中表层是鳞状上皮，并且深层是立方上皮。角膜上皮分层所需要的时间取决于培养条件和所述多能干细胞所来源的哺乳动物的种类而变化，并且不能一般性指定。然而，当使用人多能干细胞时，分层的角膜上皮在例如自开始悬浮培养所述多能干细胞聚集体起的75，80，84，90或95天内在所述细胞聚集体的表层中形成。通过选择证实已经由培养的多个细胞聚集体形成分层的角膜上皮的细胞聚集体，可以获得包含分层的角膜上皮和神经视网膜组织的细胞聚集体，其中所述角膜上皮构成所述细胞聚集体的表层，并且所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部。
作为用于进一步悬浮培养以诱导角膜上皮分层的培养基，可以继续使用上述(4)中所述的用于悬浮培养多能干细胞聚集体的培养基。作为基础培养基，可以采用被改良以适于培养角膜上皮和表皮上皮的细胞的培养基。所述培养基的实例包括，但不限于，CnT-30培养基(由CELLnTEC制备)，成分确定的K-SFM培养基(由Gibco/Invitrogen制备)等。
用于进一步悬浮培养的培养基可以包含成纤维细胞生长因子。即，在本发明方法的一个实施方案中，细胞聚集体的悬浮培养完全或部分地在存在成纤维细胞生长因子的条件下进行。作为成纤维细胞生长因子，可以使用具有使成纤维细胞生长的活性的任意物质。成纤维细胞生长因子的实例包括bFGF。尽管在下文中主要描述了bFGF，但是本发明中所用的成纤维细胞生长因子不限于bFGF。加入成纤维细胞生长因子(bFGF等)促进角膜上皮的分层。
bFGF是已知的细胞因子，并且其氨基酸序列也是已知的。用于本发明的bFGF是哺乳动物bFGF。哺乳动物的实例包括实验动物，如啮齿动物，包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等，兔等；家养动物，如猪、牛、山羊、马、绵羊等；陪伴动物，如狗、猫等；和灵长类动物，如人、猴、猩猩、黑猩猩等。bFGF优选是啮齿动物(小鼠，大鼠等)或灵长类动物(人等)的bFGF，最优选是人bFGF。人bFGF的代表性氨基酸序列的实例包括NCBI登记号NP_001997.5(2013年7月7日更新)等。
当使用bFGF作为成纤维细胞生长因子时，bFGF在用于角膜上皮分层的培养基中的浓度没有特别限制，只要其促进角膜上皮的分层即可。然而，其通常为约0.1–1000ng/ml，优选约0.5–500ng/ml，更优选约2–200ng/ml。
(9)间充质组织的诱导
在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中进一步悬浮培养在上述(6)或(7)中获得的包含角膜上皮或其前体组织以及神经视网膜组织的细胞聚集体(其中所述角膜上皮或其前体组织构成所述细胞聚集体的表层，所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且所述角膜上皮或其前体组织与所述神经视网膜组织邻接)，由此在所述角膜上皮或其前体组织与所述神经视网膜组织之间形成间充质组织。所述间充质组织表现出层形态，其中间充质细胞密实地聚集。已知成人角膜从表面到内部包含三层：上皮、基质和内皮，并且基质和内皮是由间充质细胞而不是表面外胚层发育而来。即，本发明可以在细胞聚集体中重现体内胚胎内的角膜基质和角膜内皮的发育。按照进一步培养的结果，所得到的细胞聚集体包含角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)或其前体组织，间充质组织，和神经视网膜组织，其中所述角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)或其前体组织、间充质组织和神经视网膜组织从所述细胞聚集体表层到内部以角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)或其前体组织、间充质组织和神经视网膜组织的次序按层排列。
在一个实施方案中，在角膜上皮或其前体组织与神经视网膜组织之间形成的间充质组织可以是角膜基质或其前体组织和角膜内皮或其前体组织。在该实施方案中，由进一步培养获得的细胞聚集体包含角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)或其前体组织、角膜基质或其前体组织、角膜内皮或其前体组织和神经视网膜组织，其中这些从所述细胞聚集体表层到内部以角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)或其前体组织、角膜基质或其前体组织、角膜内皮或其前体组织和神经视网膜组织的次序按层排列。即，在所述细胞聚集体中，邻近神经视网膜组织并且在其外部形成包含角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)或其前体组织、角膜基质或其前体组织和角膜内皮或其前体组织的角膜或其前体组织(角膜样组织)。
间充质组织或角膜基质或其前体组织以及角膜内皮或其前体组织的诱导可以使用角膜基质、角膜内皮或其前体组织的标记物(包括PDGFR-α，Pitx2，ABCG2等)的表达或形态特征(形成间充质细胞在其中密实地聚集的层)作为指标进行验证。此外，由于角膜内皮具有如上皮化内皮细胞层的形态，所以可能通过使用此种形态特征作为指标来区分角膜基质(或其前体组织)与角膜内皮(或其前体组织)或者证实角膜内皮或其前体组织的诱导。
诱导间充质组织(角膜基质或其前体组织，以及角膜内皮或其前体组织)所需要的时间取决于培养条件和所述多能干细胞所来源的哺乳动物种类而变化，并且不能一般性指定。然而，当使用人多能干细胞时，间充质组织(角膜基质或其前体组织，以及角膜内皮或其前体组织)在例如自开始悬浮培养所述多能干细胞聚集体起的20，25，30，35，40，45，50，55，60，65或70天内在角膜上皮或其前体组织与神经视网膜组织之间形成。通过选择证实已经形成间充质组织(角膜基质或其前体组织，以及角膜内皮或其前体组织)的细胞聚集体，在上述实施方案中，可以获得包含角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)或其前体组织、间充质组织(角膜基质或其前体组织，以及角膜内皮或其前体组织)和神经视网膜组织的细胞聚集体。
作为用于进一步悬浮培养以诱导间充质组织的培养基，可以继续使用上述(4)中所述的用于悬浮培养多能干细胞聚集体的培养基。作为基础培养基，可以采用被改良以适于培养角膜上皮和表皮上皮的细胞的培养基。所述培养基的实例包括，但不限于，CnT-30培养基(由CELLnTEC制备)，成分确定的K-SFM培养基(由Gibco/Invitrogen制备)等。
当需要形成上述实施方案中的包含分层的角膜上皮、间充质组织(角膜基质或其前体组织，以及角膜内皮或其前体组织)和神经视网膜组织的细胞聚集体时，用于进一步悬浮培养的培养基可以包含成纤维细胞生长因子(bFGF等)。
当使用bFGF作为成纤维细胞生长因子时，bFGF在用于进一步悬浮培养的培养基中的浓度没有特别限制，只要其促进角膜上皮的分层即可。然而，其通常为约0.1–1000ng/ml，优选约0.5–500ng/ml，更优选约2–200ng/ml。
(10)晶状体泡的诱导
在包含骨形态发生因子信号转导途径激活物质(BMP4等)的培养基中进一步悬浮培养在上述(6)中获得的包含晶状体基板和神经视网膜组织的细胞聚集体(其中所述晶状体基板构成所述细胞聚集体的表层，所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且所述晶状体基板邻接所述神经视网膜组织)，由此诱导晶状体基板的内陷，并且形成晶状体泡。结果，可以形成包含晶状体泡和神经视网膜组织的细胞聚集体。晶状体泡的形成可以使用作为晶状体前体组织标记物(例如，L-Maf)阳性的囊泡的形态特征作为指标进行验证。形成晶状体泡所需要的时间取决于培养条件和所述多能干细胞所来源的哺乳动物种类而变化，并且不能一般性指定。然而，当使用人多能干细胞时，晶状体泡在例如自开始悬浮培养所述多能干细胞聚集体起的20，25，30，35，40，45，50，55，60，65或70天内形成。通过选择证实已经由培养的多个细胞聚集体形成晶状体泡的细胞聚集体，可以获得包含晶状体泡和细胞聚集体神经视网膜组织的细胞聚集体。
作为用于进一步悬浮培养的培养基，可以使用添加有成纤维细胞生长因子的上述(4)中所述的用于悬浮培养多能干细胞聚集体的培养基。即，在本发明方法的一个实施方案中，细胞聚集体的悬浮培养完全或部分地在存在成纤维细胞生长因子的条件下进行。作为成纤维细胞生长因子，可以使用具有使成纤维细胞生长的活性的任意物质。成纤维细胞生长因子的实例包括bFGF。尽管在下文中主要描述了bFGF，但是本发明中所用的成纤维细胞生长因子不限于bFGF。通过加入成纤维细胞生长因子(bFGF等)，形成的晶状体泡开始表现出与在体内晶状体发育中观察到的形态极性一致的形态极性，即，其在前-后轴之前的部分是薄的，并且在前-后轴之后的部分是厚的。尽管通过继续使用未添加成纤维细胞生长因子(bFGF等)的上述(4)中所述的用于浮游培养多能干细胞聚集体的培养基也可以诱导晶状体基板的内陷和晶状体泡的形成，但是没有清楚地出现上述组织极性。
当使用bFGF作为成纤维细胞生长因子时，bFGF在用于诱导晶状体泡形成的培养基中的浓度没有特别限制，只要其能够给予晶状体泡前述形态极性即可。然而，其通常为约0.1–1000ng/ml，优选约0.5–500ng/ml，更优选约2–200ng/ml。
(11)制备眼前段组织或其部分结构、或其前体组织
在另一方面，可以从如上文提及获得的细胞聚集体分离眼前段组织或其部分结构、或其前体组织。在一个实施方案中，眼前段组织或其部分结构、或其前体组织可以与神经视网膜组织一起分离。此外，本发明提供通过上述方法获得的细胞聚集体、眼前段组织或其部分结构、或其前体组织。例如，可以从包含角膜或其前体组织和神经视网膜组织的细胞聚集体(其中所述角膜或其前体组织构成所述细胞聚集体的表层，所述神经视网膜组织被包含在所述细胞聚集体的内部，并且所述角膜或其前体组织邻接所述神经视网膜组织)分离包含角膜或其前体组织的表层。在上述(8)中获得的细胞聚集体中，由于所述角膜或其前体组织在所述聚集体的表层形成可手工分离的层，所以所述角膜或其前体组织能够被容易地分离，而无需酶处理等。此外，通过用酶等分散所获得的角膜或其前体组织，甚至在不使用FACS等的情况下也可以以高纯度分离角膜细胞和角膜祖细胞。这样获得的角膜或其前体组织可以用于按其原样或以培养物薄片的形式移植。
以这种方式，通过本发明获得的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织可以用于移植。例如，通过本发明获得的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织可以用作治疗药物用于由眼前段组织的病症导致的疾病，或用于损伤的眼前段组织的补充组织。通过向具有由眼前段组织的病症导致的疾病或受损的眼前段组织的患者移植通过本发明获得的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织，所述由眼前段组织的病症导致的疾病或对眼前段组织的损伤可以得到治疗。由眼前段组织的病症导致的疾病的实例包括由角膜病症导致的疾病(圆锥角膜，大泡性角膜病变(bullouskeratopathy)，角膜白斑(cornealleukoma)，疱疹角膜(herpescornea)，角膜营养不良(cornealdystrophy)，由近视激光手术(如LASEK、PRK等)失败导致的角膜损伤)，由晶状体病症导致的疾病(例如，先天性白内障(congenitalcataract)，后天性白内障(acquiredcataract))等。
在移植治疗中，由于组织相容性抗原的差异导致的移植排斥通常是成问题的，然而，该问题可以通过使用从移植接受者的体细胞建立的多能干细胞(例如，诱导的多能干细胞)得到解决。即，在优选的实施方案中，使用从接受者的体细胞建立的多能干细胞(例如，诱导的多能干细胞)作为本发明的方法中的多能干细胞，并且，制备对于所述接受者来说在免疫学上是自体的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织并将其移植到所述接受者。
此外，通过本发明获得的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织可以用于筛选和评估药物。具体地，由于通过本发明获得的眼前段组织或其部分结构、或其前体组织具有与活生物体中的眼前段组织或其前体组织的结构极其相似的高等结构(如由视网膜、晶状体和角膜以及具有层形式的角膜上皮(优选是分层的角膜上皮)、角膜基质和角膜内皮的各前体组织的角膜前体组织的邻接的立体形成所证实的)，其可以用于筛选用于以下的治疗药物：由眼前段组织的病症导致的疾病，和受损的眼前段组织，药物产品和化妆品的副作用和毒性测试(例如，角膜刺激测试的替代测试)，以及开发用于眼前段组织的疾病的新的治疗方法等。
在下文中通过参考以下实施例更详细地解释本发明，所述实施例仅是示例性的，并不限制本发明的范围。
实施例
实施例1：通过人ES细胞的悬浮聚集物培养的晶状体和角膜前体组织的 自组织
(方法)
通过胰蛋白酶处理，将人ES细胞(KhES-1；视网膜特异性基因Rx中敲入荧光蛋白基因Venus)分散为单个细胞，并且按照SFEBq方法(Nakano等人，CellStemCell，10(6):771-785，2012)，形成聚集体，并且在存在5％CO2的条件下在37℃进行悬浮聚集体培养，用于分化诱导。将分散的5000个人ES细胞接种在涂敷有低细胞吸附性表面涂层的V底96孔板的每个孔中，并且使用添加有5％KSR(KnockoutSerumReplacement)的不含生长因子的化学合成的培养基(不含生长因子的化学成分确定的培养基；gfCDM；Wataya等人，ProcNatlAcadSciUSA，105(33):11796-11801，2008)作为用于分化诱导的培养基。为了抑制分散引起的细胞死亡，在分化诱导的头3天添加20μM的ROCK抑制剂Y-27632，并且在接下来的3天将其浓度减半。在开始分化诱导后的第3天至第18天，加入5nM的BMP4，并且在第18天至第21天，将其浓度减半。通过免疫组织染色分析这些聚集体。
(结果)
从开始分化诱导起的第9天，在聚集体内部观察到Rx::venus的强荧光。在开始分化诱导起的第12天，不管存在还是不存在BMP4添加，都观察到荧光，并且BMP4处理使得荧光变得约2倍以上更强。Rx::venus阳性组织表现出神经上皮样结构(假复层柱状上皮)，表达神经视网膜标记物Chx10，并且发现具有形成的神经视网膜。在从开始分化诱导起的第14天，在聚集体表层中观察到与神经视网膜不同的Rx::venus阴性上皮细胞层的形成(图1A)。在从开始分化诱导起的第24天，在表面中的上皮细胞层被检测为对光谱细胞角蛋白是阳性的并且对E-钙黏着蛋白是阳性的，所述二者是非神经外胚层上皮标记(图1B)。在不少于90％的聚集体中观察到具有良好的重现性的在神经视网膜外部上的非神经外胚层上皮组织的此种自组织。这提示表面中的上皮细胞层高度或中度增厚(基板形成)，并且各自形成晶状体基板或角膜上皮前体组织。晶状体基板样组织是L-Maf阳性的，L-Maf是晶状体前体组织标记物(图1C)。在不少于90％的聚集体中形成角膜上皮前体组织，并且在50％的聚集体中形成晶状体基板。
实施例2：通过由人ES细胞自组织的角膜前体组织的长期培养的角膜标 记物的表达
(方法)
在实施例1的培养条件下在V底96孔板中培养至分化诱导的第18天后，将悬浮的聚集体转移到不吸附细胞的培养皿(直径6cm)，并且在5％CO2，40％O2存在下在37℃进行悬浮培养。用于培养的培养基是gfCDM+5％KSR，在第18至30天添加1nMBMP4，并且从第30天至以后添加以下两种培养基(基于已知支持角膜上皮和表皮上皮的培养的商购培养基)中的任一种，然后在第55天通过免疫组织染色进行分析。
1)添加有1nMBMP4的CnT-30培养基(CELLnTEC)的培养基
2)添加有10％FBS和1nMBMP4的成分确定的K-SFM培养基(Gibco/Invitrogen)的培养基
(结果)
在使用上述1)和2)中任一项的培养基进行的培养中，在人ES细胞聚集体的表层自组织的上皮前体组织允许扩大培养，并且在开始分化培养后第55天，除了是广谱细胞角蛋白阳性的之外，在不少于80％的聚集体中观察到表达细胞角蛋白3(CK3)、细胞角蛋白12(CK12)、细胞角蛋白14(CK14)、p63和ZO-1(其是角膜上皮特有的)的上皮结构的形成(图2)。该结果清楚地证明，通过本发明的方法自组织立体形成的表层中的上皮组织是角膜的前体组织。
实施例3：具有来自人ES细胞的上皮组织和间充质组织二者的角膜前体 组织的自组织
(方法)
以与实施例2中相似的方式，进行培养至第30天。即，将人ES细胞聚集体在实施例1的培养条件下在V底96孔平板中培养至分化诱导的第18天，然后将悬浮的聚集体转移到不吸附细胞的培养皿(直径为6cm)，并且在存在5％CO2，40％O2的条件下在37℃进行悬浮培养。用于培养的培养基是gfCDM+5％KSR，在第18至30天添加1nMBMP4，然后通过免疫组织染色进行分析。在第30天后至第55天，对一部分培养的聚集体继续进行悬浮培养。对于后一种培养，使用添加有10％FBS和1nMBMP4的成分确定的K-SFM培养基(Gibco/Invitrogen)的培养基。
(结果)
如在实施例1和2中所述，人ES细胞聚集体具有在表层中的来源于表面外胚层的角膜上皮和晶状体组织，和在内部的神经视网膜组织。在第30天的样品中，间充质细胞在适度增厚的角膜上皮之下紧接着(即，在角膜上皮与神经视网膜组织之间)出现，形成密实聚集的层，这在70％的聚集体中被证实。间充质细胞对间充质标记物PDGFR-α是阳性的(第30天；图3A)，并且对在最初的角膜的间充质细胞(来源于神经嵴细胞)中表达的Pitx2和ABCG2也是阳性的(第53天；图3B)。在活体的角膜中，在表面中角膜基质存在于的角膜上皮层之下，并且角膜内皮存在于角膜基质之下，并且角膜基质和角膜内皮来源于间充质细胞，所述间充质细胞源自在角膜上皮下聚集的神经嵴细胞。与活体中的状态相似的这种状态可以在人ES细胞聚集体的表层和其下的层中产生。此外，间充质细胞的聚集体层的最内部被部分上皮化，这表明内皮样细胞层的形态形成(图3C，箭头)。因此，表明在通过本发明的方法的眼前段的自组织中，由人多能干细胞不仅形成角膜上皮组织，还可以立体形成包含角膜基质和角膜内皮的整个角膜层的前体组织。
实施例4：自来源于人ES细胞的晶状体基板的晶状体泡的自组织
(方法)
在实施例3的条件下，继续对人ES细胞聚集体的悬浮培养至自开始分化诱导起的第30天。在该情形中，从第15天起向培养基中加入20ng/mlbFGF。作为其他的培养条件，在实施例3的条件下培养30天后，从第30天至第55天在gfCDM+10％KSR或GMEM+10％KSR中进行培养。
(结果)
在第30天的样品中，不管存在还是不存在bFGF添加，在40％的聚集体中，在表层中由晶状体基板的内陷形成晶状体泡样囊泡。该囊泡对晶状体初始标记物L-Maf是阳性的，并且添加bFGF使其表达水平增加两倍以上。在添加bFGF的实例中，在晶状体泡样囊泡中观察到形态极性(形成在前部较薄而在后部较厚的晶状体组织)，这是在体内晶状体发育中沿前-后轴可见的，并且证实接近于体内晶状体形成的晶状体形成(图4A)。尽管在不存在bFGF的条件下甚至在gfCDM+10％KSR或GMEM+10％KSR中培养至第55天时也可以良好的再现性观察到晶状体泡样囊泡的内陷和形成，但是没有清楚地出现上述组织极性(图4B)。因此，表明极性形成不仅是由通过bFGF的加速发育导致的，也是由向晶状体成熟的发育程序的质量提升(qualitativepromotion)引起的。
实施例5：分层的角膜上皮的自组织
(方法)
将人ES细胞聚集体在与上述实施例相同的条件下在V底96孔平板中培养至分化诱导的第30天。然后，将悬浮的聚集体转移至不吸附细胞的培养皿(直径为6cm)，并且在37℃，5％CO2，40％O2的条件下进行悬浮培养。作为培养基，使用gfCDM+5％KSR直至第30天，并且从第30天起使用gfCDM+20％KSR。从第3天至第18天，添加5nMBMP4。在第24天，将BMP4浓度减半(2.5nM)，并且从第30天起至以后继续以1nM进行添加。另外，在培养过程中，从第15天起以20ng/ml的浓度向培养基中添加碱性FGF。在第84天通过免疫组织染色分析悬浮的聚集体。
(结果)
发现在人ES细胞聚集体的表层中自组织的上皮前体组织，并且在开始分化培养后的第84天，发现对角膜上皮特有的细胞角蛋白3(CK3)阳性的、对细胞角蛋白12(CK12)阳性的、对细胞角蛋白15(CK15)(其是角膜上皮干细胞的标记物)阳性的角膜上皮(图5A、5B和5C)。另外，在角膜上皮上表达的Na-KATP酶也被染色(图5D)。上皮具有分层的上皮结构，其是成熟的角膜特有的，其中表层是鳞状上皮，并且深层是立方上皮(图5B)。结果表明，通过本发明方法经由自组织形成的立体角膜上皮前体组织在其进一步成熟时自发地进行分层，并且显示出角膜上皮固有的组织构造，以及蛋白表达，其与活体中的那些接近。此外，在角膜上皮之下发现间充质聚集体层，这清楚地证明其是上皮、间质和内皮的完整角膜层的前体组织。
工业适用性
按照本发明，在能够提供高通量的悬浮培养下可以由多能干细胞立体形成眼前段组织(如晶状体、角膜等)或其部分结构、或其前体组织。因此，本发明可用于实施眼科领域中的再生医学。
尽管已经在强调优选的实施方案的前提下描述了本发明，但是，本领域技术人员清楚优选的实施方案可以进行改进。本发明旨在本发明可以由除本说明书中详述的方法之外的方法实施。因此，本发明涵盖包括在后附“权利要求书”的精神和范围内的所有改进。
在本文引用的任何公布(包括专利和专利申请)中公开的内容通过引用完全结合在本文中，结合的程度如同它们在此公开一样。
本申请是基于在日本提交的专利申请号2013-163586(申请日：2013年8月6日)，其内容完整地结合于此。

Claims (16)

1.包含眼前段组织或其部分结构或其前体组织的细胞聚集体的制备方法，所述方法包括在骨形态发生因子信号转导途径激活物质存在下悬浮培养多能干细胞的聚集体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述在骨形态发生因子信号转导途径激活物质存在下的悬浮培养之前，在不存在骨形态发生因子信号转导途径激活物质的情况下悬浮培养所述多能干细胞的聚集体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述骨形态发生因子信号转导途径激活物质是BMP4。
4.根据权利要求3所述的方法，其中BMP4具有1-5nM的浓度。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其中所述悬浮培养完全或部分地在成纤维细胞生长因子存在下进行。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞来源于人。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述悬浮培养在不存在饲养细胞的条件下进行。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述细胞聚集体还包含神经视网膜组织。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述眼前段组织是角膜和/或晶状体。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述细胞聚集体包含作为所述眼前段组织的部分结构的角膜上皮，并且还包含间充质组织或来源于其的角膜基质和/或角膜内皮。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述角膜上皮是分层的。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述细胞聚集体分离所述眼前段组织或其部分结构或其前体组织。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述眼前段组织或其部分结构或其前体组织与神经视网膜组织一起分离。
15.通过根据权利要求1-12中任一项所述的方法获得的细胞聚集体。
16.眼前段组织或其部分结构或其前体组织，其通过根据权利要求13或14所述的方法获得。
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