CN109312306A - 产生视网膜组织的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于产生视网膜细胞或视网膜组织的方法,其包括以下步骤(1)‑(3):(1)第一步骤:在不存在饲养细胞的情况下在含有以下的培养基中培养多能干细胞:1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,以及2)用于维持未分化状态的因子,(2)第二步骤:将在第一步骤中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质的培养基中悬浮培养,形成细胞聚集体,和(3)第三步骤:在含有BMP信号转导途径活化物质的培养基中在存在或不存在Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,将第二步骤中获得的聚集体悬浮培养,以获得含有视网膜细胞或视网膜组织的聚集体。

Description

产生视网膜组织的方法
[技术领域]
本发明涉及由多能干细胞产生视网膜细胞或视网膜组织的方法。
[背景技术]
作为从多能干细胞产生神经组织例如视网膜组织的方法,已经报道了一种产生神经组织的方法,所述方法包括在无血清培养基中形成多能干细胞的均匀聚集体;在悬浮液中培养它们;在适当的分化诱导因子等的存在下,在分离诱导培养基中的悬浮液中培养它们,以诱导多能干细胞分化成预期的神经细胞。(专利文献1和非专利文献1)。例如,以下是已知的:用于从多能干细胞获得多层视网膜组织的方法(非专利文献2和专利文献2);以及用于获得多层视网膜组织的方法(非专利文献3和专利文献3),其包括在含有Wnt信号转导途径抑制物质的无血清培养基中形成多能干细胞的均匀聚集体,然后在基膜制剂存在下将它们悬浮培养,然后在含血清培养基中将它们悬浮培养;以及用于获得视网膜组织的方法(专利文献5和非专利文献10),其是通过在含有BMP信号转导途径活化物质的培养基中悬浮培养多能干细胞聚集体。另外,诱导多能干细胞分化为下丘脑组织的方法(专利文献4和非专利文献4),以及诱导多能干细胞分化为神经祖细胞的方法(非专利文献5和6)也有报道。
可以培养作为这些生产方法的起始材料的多能干细胞(特别是在灵长类动物多能干细胞的情况下),同时在饲养细胞存在下并添加维持未分化状态的因子保持未分化状态。近年来,已经在培养中进行了改进以维持未分化状态,并且已经报道了在没有饲养细胞(无饲养细胞)的情况下添加维持未分化状态的因子来培养灵长类动物多能干细胞的方法(非专利文献7,8和9)。人们期望一种稳定地产生神经细胞或神经组织例如视网膜等的方法,所述方法使用通过所述方法进行无饲养细胞培养的多能干细胞作为起始材料。
[文件清单]
[专利文献]
专利文献1:WO 2009/148170
专利文献2:WO 2011/055855
专利文献3:WO 2013/077425
专利文献4:WO 2013/065763
专利文献5:WO 2015/025967
[非专利文件]
非专利文件1:Cell Stem Cell,3,519-32(2008)
非专利文件2:Nature,472,51-56(2011)
非专利文件3:Cell Stem Cell,10(6),771-775(2012)
非专利文件4:Nature,480,57-62(2011)
非专利文件5:Nature Biotechnology,27(3),275-80(2009)
非专利文件6:Proc Natl Acad Sci USA,110(50),20284-9(2013)
非专利文件7:Nature Methods,8,424-429(2011)
非专利文件8:Scientific Reports,4,3594(2014)
非专利文件9:In Vitro Cell Dev Biol Anim.,46,247-58(2010)
非专利文件10:Nature Communications,6,6286(2015)
[发明概述]
[技术问题]
本发明要解决的问题是提供一种从多能干细胞产生视网膜细胞或视网膜组织的方法,所述多能干细胞在不存在饲养细胞的情况下保持未分化状态。
[解决问题的方法]
发明人进行了深入研究以试图解决上述问题,并发现通过以下可以高效地形成维持未分化状态的细胞聚集体:在含有TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径活化物质的培养基中在不存在饲养细胞的情况下(在无饲养细胞条件下)培养多能干细胞,然后将它们悬浮培养在含有Wnt信号转导途径抑制物质的培养基中。另外,发明人已经发现,通过使用这种高质量的细胞聚集体,可以高效诱导神经组织例如视网膜组织等和神经细胞,从而完成了本发明。
即,本发明涉及以下内容。
[1]一种用于产生视网膜细胞或视网膜组织的方法,其包括以下步骤(1)-(3):
(1)第一步骤:在不存在饲养细胞的情况下在含有以下的培养基中培养多能干细胞:1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,以及2)用于维持未分化状态的因子,
(2)第二步骤:将在第一步骤中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质的培养基中悬浮培养,形成细胞聚集体,和
(3)第三步骤:在含有BMP信号转导途径活化物质的培养基中在存在或不存在Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,将第二步骤中获得的聚集体悬浮培养,以获得含有视网膜细胞或视网膜组织的聚集体。
[2][1]的产生方法,其中在第一步骤中将多能干细胞培养0.5小时-144小时。
[3][1]或[2]的产生方法,其中第一步骤中的培养通过黏附培养进行。
[4][1]-[3]中任一项的产生方法,其中在第二步骤中,分散在第一步骤中获得的细胞,并将分散的细胞在悬浮液中培养。
[5][1]-[4]中任一项的产生方法,其中维持未分化状态的因子至少包括FGF信号转导途径活化物质。
[6][5]的产生方法,其中FGF信号转导途径活化物质是bFGF。
[7][1]-[6]中任一项的产生方法,其中在第二步骤中用于悬浮培养的培养基还包含Sonic hedgehog信号转导途径活化物质。
[8][7]的产生方法,其中多能干细胞是人多能干细胞,并且在第二步骤中,培养基中Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的浓度是对应于在10nM至700nM的SAG的Sonichedgehog信号转导活性的浓度。
[9][1]-[8]中任一项的产生方法,其中TGFβ家族信号转导途径抑制物质是TGFβ信号转导途径抑制物质或BMP信号转导途径抑制物质。
[10][1]-[9]中任一项的产生方法,其中TGFβ家族信号转导途径抑制物质是选自由Lefty,SB431542,A-83-01和LDN193189组成的组中的一种或多种物质。
[11][1]-[10]中任一项的产生方法,其中所述Sonic hedgehog信号转导途径活化物质是选自由Shh,SAG和嘌吗啡胺(Purmorphamine)组成的组中的一种或多种物质。
[12][1]-[11]中任一项的产生方法,其中在第三步骤中,在第二步骤开始的第1天和第9天之间将BMP信号转导途径活化物质添加到培养基中。
[13][12]的产生方法,其中在第三步骤中,在第二步骤开始的第1天和第6天之间将BMP信号转导途径活化物质加入到培养基中。
[14][13]的产生方法,其中在第三步骤中,在第二步骤开始的第1天和第3天之间将BMP信号转导途径活化物质加入到培养基中。
[15][1]-[14]中任一项的产生方法,其中BMP信号转导途径活化物质是选自由BMP2,BMP4,BMP7和GDF7组成的组中的一种或多种蛋白质。
[16][1]至[15]中任一项的产生方法,其中BMP信号转导途径活化物质是BMP4。
[17][1]-[16]中任一项的产生方法,其中在第三步中,在含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的培养基中培养所述聚集体,所述Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的浓度不超过对应于在700nM的SAG的Sonic hedgehog信号转导活性的浓度。
[18][1]-[16]中任一项的产生方法,其中在第三步骤中,培养基中Sonichedgehog信号转导途径活化物质的浓度不超过对应于在700nM的SAG的Sonic hedgehog信号转导活性的浓度。
[19][1]-[18]中任一项的产生方法,其中所述培养在含有Wnt信号转导途径抑制物质的培养基中从第二步骤开始进行3天至18天。
[20][1]-[19]中任一项的产生方法,其中所述培养在含有Wnt信号转导途径抑制物质的培养基中从第二步骤开始进行10天。
[21][1]-[20]中任一项的产生方法,其中Wnt信号转导途径抑制物质是IWR-1-endo。
[22][1]-[21]中任一项的产生方法,其中第三步包括以下步骤:
(i)步骤:在含有BMP信号转导途径活化物质的培养基中在存在或不存在Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,将第二步骤中获得的聚集体悬浮培养,以获得细胞聚集体,所述细胞聚集体含有视网膜细胞或视网膜组织并且其中Chx10阳性细胞的存在率不低于20%且不高于100%;
(ii)步骤:将步骤(i)中获得的细胞聚集体在含有Wnt信号转导途径活化物质和/或FGF信号转导途径抑制物质的无血清培养基或含血清培养基中培养仅一段时间到表达RPE65基因的细胞的出现前;
(iii)步骤:在不含Wnt信号转导途径活化物质的无血清培养基或含血清培养基中培养步骤(ii)中获得的细胞聚集体,在所述细胞聚集体中不出现表达RPE65基因的细胞。
[23][1]-[22]中任一项的产生方法,其中在第三步骤中获得的聚集体包含一种或多种选自由以下组成的组的细胞:视网膜祖细胞,神经视网膜祖细胞,感光细胞前体细胞,感光细胞,杆感光细胞,锥感光细胞,水平细胞,无长突细胞,中间神经元,神经节细胞,双极细胞,视网膜色素上皮细胞和睫状边缘带细胞。
[24][1]-[23]中任一项的产生方法,其中多能干细胞是人多能干细胞。
[25][1]-[24]中任一项的产生方法,其中多能干细胞是诱导的多能干细胞。
[26][1]-[25]中任一项的产生方法,其中在第二步骤中形成均匀的聚集体。
[27][1]-[26]中任一项的产生方法,其中所述悬浮培养在不存在基膜制备的情况下进行。
[28]用于评价测试物质的毒性或功效的试剂,其包含通过[1]-[27]中任一项的方法产生的视网膜细胞或视网膜组织。
[29]用于评估测试物质的毒性或功效的方法,其包括使所述物质与通过[1]-[27]中任一项的方法产生的视网膜细胞或视网膜组织接触,并检测所述物质对所述细胞或组织的影响。
[30]用于治疗由视网膜细胞或视网膜组织失调引起的疾病的药物,其包含通过[1]-[27]中任一项的方法产生的视网膜细胞或视网膜组织。
[31][30]的药物,其中所述视网膜细胞或视网膜组织是视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞或视网膜组织。
[32]治疗由视网膜细胞或视网膜组织失调引起的疾病的方法,其包括移植通过[1]-[27]中任一项的方法产生的有效量的视网膜细胞或视网膜组织给需要移植的受试者。
[33]通过[1]-[27]中任一项的方法产生的视网膜细胞或视网膜组织,其用于治疗由于视网膜细胞或视网膜组织失调引起的疾病。
[34]药物组合物,其包含通过[1]-[27]中任一项的方法产生的视网膜细胞或视网膜组织作为活性成分。
[发明的有益效果]
根据本发明,可以在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞高效地产生高质量细胞聚集体以及视网膜细胞或视网膜组织。
[附图的简要说明]
图1显示了在具有(C,D)或没有(A,B)前提条件的条件下通过明视野观察的细胞聚集体形态的比较结果。
图2显示了在具有(C,D,G,H)或没有(A,B,E,F)前提条件的条件下通过免疫组织染色在细胞聚集体中Rx(A-D)的表达和Chx10(E-H)的表达的比较结果。
图3显示了通过明视野观察在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体的形态的比较结果。
图4显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Rx表达(A-D)和Chx10(E-H)表达的比较结果。
图5显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达的比较结果。
图6显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达的比较结果。
图7显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达的比较结果。
图8显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达的比较结果。用DAPI复染。
图9显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达的比较结果。用DAPI复染。
图10显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞(A,B:TFH-R1-10-2株,C,D:TFH-R2-10-F8株)形成的细胞聚集体中Chx10表达(A,C)和Rx表达(B,D)的比较结果。
图11显示了从人iPS细胞诱导的含有感光细胞的视网膜组织的明视野观察结果(A)。显示了通过免疫组织染色在含有感光细胞的视网膜组织中的Rx,Chx10和Crx的表达的观察结果(B-E)。用DAPI(E)复染。
图12显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达(A,D,G),Rx表达(B,E,H)和Pax6表达(C,F,I)的比较结果。
图13显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达(A,D,G),Rx表达(B,E,H)和Pax6表达(C,F,I)的比较结果。
图14显示了从人iPS细胞诱导的含有感光细胞的视网膜组织的明视野观察结果(A)。显示了通过免疫组织染色在含有感光细胞的视网膜组织中的Crx,Chx10,Rx,恢复蛋白,NRL,RXRG,N-钙粘蛋白和Aqp1的表达的观察结果(B-E)。用DAPI(B-E)复染。
图15显示了从人iPS细胞诱导的含有感光细胞的视网膜组织的明视野观察结果(A)。显示了通过免疫组织染色在含有感光细胞的视网膜组织中的Crx,Chx10,Rx,恢复蛋白,NRL,RXRG,N-钙粘蛋白和Aqp1的表达的观察结果(B-E)。用DAPI(B-E)复染。
图16显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达的比较结果。
图17显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达的比较结果。
图18显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达的比较结果。
图19显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达的比较结果。
图20显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达的比较结果。
图21显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达的比较结果。
图22显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达和Rx表达的比较结果。
图23显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10,Rx,Crx,和Brn3b的表达的比较结果。
图24显示了通过免疫组织染色在各种培养条件下由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达和Rx表达的比较结果。
图25显示了通过免疫组织染色由人iPS细胞形成的细胞聚集体中Chx10表达和Rx表达的比较结果。
[实施方案的描述]
1.定义
在本发明中,“干细胞”是指具有分化潜能和维持分化潜能的增殖能力(特别是自我更新能力)的未分化细胞。根据分化潜能,干细胞包括诸如多能干细胞(pluripotent),专能干细胞(multipotent),单能干细胞等亚群。多能干细胞是指能够在体外培养并具有分化成属于三个胚层(外胚层,中胚层,内胚层)和/或胚外组织的任何细胞谱系的潜能(多能性)的干细胞。专能干细胞是指具有分化成多种但不是所有种类的组织或细胞的潜能的干细胞。单能干细胞是指具有分化成特定组织或细胞的潜能的干细胞。
多能干细胞可以从受精卵,克隆胚,生殖干细胞,组织中的干细胞,体细胞等中诱导。多能干细胞的实例包括胚胎干细胞(ES细胞),EG细胞(胚胎生殖细胞),诱导多能干细胞(iPS细胞)等。从间充质干细胞(MSC)获得的Muse细胞(多谱系分化应激持续细胞)和由生殖细胞(例如睾丸)产生的GS细胞也包括在多能干细胞中。胚胎干细胞最初建立于1981年,自1989年以来也被应用于敲除小鼠的产生。1998年,人类胚胎干细胞建立,也被用于再生医学。ES细胞可以通过在饲养细胞或含有LIF的培养基中培养内细胞团来生产。ES细胞的产生方法描述于例如WO 96/22362,WO 02/101057,US 5,843,780,US 6,200,806,US 6,280,718等中。胚胎干细胞可以从给定的组织获得,或者可以购买市售产品。例如,人胚胎干细胞KhES-1,KhES-2和KhES-3可从京都大学前沿医学科学研究所(KyotoUniversity’sInstitute for Frontier Medical Sciences)获得。Rx::GFP菌株(衍生自KhES-1)是人胚胎干细胞,可从Incorporated Administrative Agency RIKEN获得。EB5细胞是小鼠胚胎干细胞,可从Incorporated Administrative Agency RIKEN获得,D3细胞系是小鼠胚胎干细胞,可从ATCC获得。
核移植ES细胞(ntES细胞)是ES细胞之一,可以通过将体细胞的细胞核移植到去核卵中而产生的克隆胚胎建立。
EG细胞可以通过在含有mSCF,LIF和bFGF的培养基中培养原生殖细胞来生产(Cell,70:841-847,1992)。
本发明中的“诱导多能干细胞”是通过已知方法等对体细胞进行重编程而诱导具有多能性的细胞。具体地,可以提及通过表达选自由重编程基因(包括Oct3/4,Sox2,Klf4,Myc(c-Myc,N-Myc,L-Myc),Glis1,Nanog,Sall4,lin28,Esrrb等)组成的组中的多个基因的组合,通过重编程分化的体细胞(例如成纤维细胞,外周血单核细胞等)诱导的具有多能性的细胞。重编程因子的优选组合的实例包括(1)Oct3/4,Sox2,Klf4和Myc(c-Myc或L-Myc),和(2)Oct3/4,Sox2,Klf4,Lin28和L-Myc(Stem Cells,2013;31:458-466)。
诱导的多能干细胞由Yamanaka等在2006年在小鼠细胞中建立(Cell,2006,126(4),pp.663-676)。2007年,也由人成纤维细胞建立诱导多能干细胞,其具有与胚胎干细胞类似的多能性和自我更新能力(Cell,2007,131(5),pp.861-872;Science,2007,318(5858),pp.1917-1920;Nat.Biotechnol.,2008,26(1),pp.101-106)。
除了基于通过基因表达直接重编程的产生方法之外,还可以通过添加化合物等从体细胞获得诱导的多能干细胞(Science,2013,341,pp.651-654)。
还可以获得已建立的诱导多能干细胞,例如由京都大学(Kyoto University)建立的人诱导多能细胞系,例如201B7细胞,201B7-Ff细胞,253G1细胞,253G4细胞,1201C1细胞,1205D1细胞,1210B2细胞或1231A3细胞等,它们可以从京都大学和iPS Academia Japan,Inc.获得。作为已建立的诱导多能干细胞,例如,京都大学建立的Ff-I01细胞,Ff-I14细胞和QHJI01s04细胞可从京都大学获得。
用于产生诱导多能干细胞的体细胞不受特别限制,可以提及组织来源的成纤维细胞,血液细胞系(例如外周血单核细胞(PBMC),T细胞),肝细胞,胰腺细胞,肠上皮细胞,光滑肌细胞等。
当通过几种基因的表达重编程产生诱导的多能干细胞时,基因表达的手段不受特别限制。上述手段的实例包括使用病毒载体(例如,逆转录病毒载体,慢病毒载体,腺病毒载体,腺相关病毒载体,作为细胞溶质RNA载体的Sendivirus载体)的感染方法,使用非病毒载体的质粒载体(例如,质粒载体,附加型载体)的基因转移方法(例如,磷酸钙法,脂质转染法,RetroNectin法,电穿孔法),使用RNA载体的基因转移方法(例如,磷酸钙法,脂质转染法,电穿孔法),直接注射蛋白质的方法(例如,使用针的方法,脂质转染法,电穿孔法)等。
诱导多能干细胞可以在饲养细胞存在下或在不存在饲养细胞的情况下(无饲养细胞)产生。当在饲养细胞存在下产生诱导多能干细胞时,诱导多能干细胞可以在存在维持未分化状态的因子的情况下通过已知方法产生。虽然用于在不存在饲养细胞的情况下产生诱导多能干细胞的培养基(即含有维持未分化状态因子的培养基(未分化维持培养基))没有特别限制,但是可以使用已知的胚胎干细胞维持培养基和/或诱导多能干细胞维持培养基,以及本领域普通技术人员熟知的作为在无饲养细胞条件下建立诱导多能干细胞的培养基的培养基。作为用于在无饲养细胞条件下建立诱导多能干细胞的未分化维持培养基,已经开发了许多合成培养基并且可商购获得,例如,可提及Essential 8培养基(LifeTechnologies制造)。Essential 8培养基是DMEM/F12培养基,其含有L-抗坏血酸-2-磷酸镁(64mg/l),亚硒酸钠(14μg/l),胰岛素(19.4mg/l),NaHCO3(543mg/l),转铁蛋白(10.7mg/l),bFGF(100ng/mL)和TGFβ家族信号转导途径活化物质(TGFβ1(2ng/mL)或Nodal(100ng/mL))作为添加剂(Nature Methods,8,424-429(2011))。其他可商购的无饲养细胞培养基(未分化维持培养基)的实例包括Essential 6培养基(Life Technologies制造),稳定化Essential 8培养基(Life Technologies制造),S-培养基(DS Pharma Biomedical制造),StemPro(Life Technologies制造),hESF9(Proc Natl Acad Sci U S A.2008 Sep 9;105(36):13409-14),TeSR培养基(STEMCELL Technologies制造),mTeSR1(STEMCELLTechnologies制造),mTeSR2(STEMCELL Technologies制造),以及TeSR-E8(STEMCELLTechnologies制造)。除此之外,其他无饲养细胞培养基(未分化维持培养基)的实例包括StemFit(注册商标)(由Ajinomoto Co.,Inc.制造)。例如,当要产生诱导多能干细胞时,通过在没有饲养细胞的情况下使用Sendivirus载体将4种因子Oct3/4,Sox2,Klf4和Myc基因转移到体细胞中,可以产生诱导多能干细胞。
用于本发明的多能干细胞优选是ES细胞或诱导多能干细胞,更优选是诱导多能干细胞。
作为专能干细胞,可以提及组织干细胞(也称为组织中的干细胞,组织特异性干细胞或体干细胞),例如造血干细胞,神经干细胞,视网膜干细胞,间充质干细胞等。
遗传修饰的多能干细胞可以通过使用例如同源重组技术产生。待修饰的染色体上的基因的实例包括细胞标志基因,组织相容性抗原基因,与神经细胞失调引起的疾病相关的基因等。可以使用以下中描述的方法修饰染色体上的靶基因:Manipulating the MouseEmbryo,A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994);Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993);Biomanual Series 8,Gene Targeting,Making of Mutant Mouse using EScell,YODOSHA CO.,LTD.(1995);等等。
具体而言,例如,分离包含待修饰的靶基因(例如,细胞标志基因,组织相容性抗原基因,疾病相关基因等)的基因组DNA,以及使用分离的基因组DNA产生用于靶基因的同源重组的靶向载体。将产生的靶向载体引入干细胞中,并且选择在靶基因和靶向载体之间显示同源重组的细胞,从而可以产生在染色体上具有修饰基因的干细胞。
用于分离包含靶基因的基因组DNA的方法的实例包括Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987-1997)等中描述的已知方法。还可以使用基因组DNA文库筛选系统(由Genome Systems制造),Universal GenomeWalkerKits(由CLONTECH制造)等分离包含靶基因的基因组基因。也可以使用编码靶蛋白的多核苷酸代替基因组DNA。可以通过PCR方法扩增相应的多核苷酸来获得多核苷酸。
YODOSHA用于靶基因同源重组的靶向载体的产生和同源重组体的有效选择可以根据Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993);Biomanual Series 8,Gene Targeting,Making of Mutant Mouse using EScell,YODOSHA CO.,LTD.(1995)等中描述的方法进行。作为靶向载体,可以使用任何替换类型或插入类型。作为选择方法,可以使用诸如阳性选择,启动子选择,阴性选择,polyA选择等方法。
从所选细胞系中选择所需同源重组体的方法的实例包括基因组DNA的Southern杂交方法,PCR方法等。
此外,还可以通过基因组编辑产生遗传修饰的多能干细胞。基因组编辑是通过诸如锌指系统,CRISPR/Cas9系统,转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)等技术进行基因特异性破坏,报告基因敲入等的遗传修饰技术。
在CRISPR/Cas9基因组编辑系统中,通常,将Cas9(DNA切割酶)的表达载体或mRNA以及在聚合酶III启动子等的控制下表达指导RNA的表达载体或指导RNA本身引入细胞中。指导RNA可以是与靶基因组序列和tracrRNA互补的RNA(crRNA)的融合RNA。当原始间隔区相邻基序(PAM序列NGG)存在于靶基因组序列的3’端时,Cas9解离DNA双链,通过指导RNA识别靶序列,并切割两条链,并在修复切割位点的过程引入突变。
转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)是使用由植物病原菌黄杆菌属物种(Xanthomonas spp)产生的TAL效应子的系统。TALEN通常是人工核酸酶,其中TAL效应子的DNA结合结构域和FokI核酸酶的DNA切割结构域融合。DNA结合结构域由34个氨基酸的重复序列组成,并且一个重复序列识别靶DNA的一个碱基。重复序列中的第12和第13个氨基酸称为重复可变二残基(RVD),靶碱基由该序列确定。FokI结构域在靶序列上二聚化并通过设计两对TALEN分子在基因组上的特定序列上彼此面对而显示核酸酶活性。切割的DNA双链通过细胞中的该机制修复,并在该过程中引入突变。当通过TALEN进行基因组编辑时,将TALEN的表达载体或mRNA引入细胞。
本发明中的“哺乳动物”包括啮齿动物,有蹄类(ungulata),食肉目(carnivora),灵长类动物等。啮齿动物包括小鼠,大鼠,仓鼠,豚鼠等。有蹄类包括猪,牛,山羊,马,绵羊等。食肉目包括狗,猫等。本发明中的“灵长类动物”是指属于灵长类动物的哺乳动物,并且灵长类动物包括原猴亚目(prosimian)例如狐猴,懒猴,tupai等,以及类人猿亚目(anthropoidea)例如猴,猿,人等。
用于本发明的多能干细胞是哺乳动物多能干细胞,优选啮齿动物(例如小鼠,大鼠)或灵长类动物(例如人,猴)的多能干细胞,更优选人多能干细胞,更优选人诱导多能干细胞(iPS细胞)或人胚胎干细胞(ES细胞)。
本发明中的“悬浮培养”或“悬浮培养方法”是指培养同时保持细胞或细胞聚集体悬浮在培养基中的状态以及进行培养的方法。即,悬浮培养在细胞或细胞聚集体未黏附于培养容器等的条件下进行,在允许与培养容器等黏附的条件下进行的培养(黏附培养或黏附培养方法)不包括在悬浮培养类别中。在这种情况下,细胞的黏附意味着在细胞或细胞聚集体与培养容器之间形成强的细胞-基质连接。更具体地,悬浮培养是指在细胞或细胞聚集体与培养容器之间未形成强细胞-基质连接的条件下的培养,并且黏附培养是指在细胞或细胞聚集体与培养容器等之间形成强细胞-基质连接的条件下的培养。
在悬浮培养中的细胞聚集体中,形成平面细胞-细胞黏附。在悬浮培养中的细胞聚集体中,与培养容器等难以形成细胞-基质连接,即使形成细胞-基质连接,其贡献也很小。在一些实施方案中,内源性细胞-基质连接存在于聚集体内,但是与培养容器等很难形成细胞-基质连接,并且即使形成,其贡献也很小。
平面细胞-细胞黏附(平面附着)意味着细胞通过平面附着到另一个细胞。更具体地,平面细胞-细胞黏附意指,例如,细胞表面积的不小于1%,优选不小于3%,更优选不小于5%黏附于另一细胞的表面。通过用染色膜的试剂(例如DiI)染色,细胞黏附因子(例如E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白)的免疫染色,可以观察细胞表面。
进行悬浮培养时使用的培养容器没有特别限制,只要其能够“悬浮培养”并且本领域普通技术人员可以适当地确定。这种培养容器的实例包括烧瓶,组织培养瓶,培养皿(平皿),皮氏培养皿(petri dish),组织培养皿,多层平皿(multidish),微量板,微孔板,微孔板,多层板(multiplate),多孔板,细胞培养载玻片(chamber slide),盘(schale),管,托盘,培养袋,旋转瓶,锥形瓶和滚瓶。为了能够进行悬浮培养,这些培养容器优选是非细胞黏附的。有用的非细胞黏附培养容器包括其表面未经过人工处理(例如,用细胞外基质例如基膜制剂,层粘连蛋白,巢蛋白,胶原,明胶等进行表面处理,或用聚合物例如聚赖氨酸,聚鸟氨酸等进行涂层处理或正电荷处理等)以改善对细胞的黏附性的培养容器等。作为非细胞黏附性培养容器,可以使用表面经过人工处理(例如,用MPC聚合物等的超亲水处理等,蛋白质低吸附处理等)以降低对细胞的黏附性的培养容器等。可以使用旋转瓶,滚瓶等进行旋转培养。培养容器的培养表面可以是平底或可以具有凹凸。
用于黏附培养的培养容器没有特别限制,只要可以进行“黏附培养”,并且本领域普通技术人员可以根据培养规模,培养条件和培养时间适当选择适合的培养容器。这种培养容器的实例包括烧瓶,组织培养瓶,培养皿(平皿),组织培养皿,多层平皿(multi-dish),微量板,微孔板,微孔板,多层板(multi-plate),多孔板,细胞培养载玻片(chamberslide),盘(schale),管,托盘,培养袋,微载体、珠、叠板、旋转瓶,锥形瓶和滚瓶。为了能够进行黏附培养,这些培养容器优选是细胞黏附的。细胞黏附培养容器包括其表面已被人工处理以改善对细胞的黏附性的培养容器,具体地,可以提及表面经处理的培养容器,或其内部包被有涂层剂的培养容器。涂层剂的实例包括细胞外基质例如层粘连蛋白[包括层粘连蛋白α5β1γ1(下文称层粘连蛋白511),层粘连蛋白α1β1γ1(下文称层粘连蛋白111)等和层粘连蛋白片段(层粘连蛋白511E8等)],巢蛋白,胶原,明胶,玻璃体结合蛋白,Synthemax(Corning Incorporated),基质胶(Matrigel)等,或聚合物例如聚赖氨酸,聚鸟氨酸等。表面经处理培养容器的实例包括通过正电荷处理等表面处理的培养容器。
用于培养本发明细胞的培养基可以从通常用于作为基础培养基培养动物细胞的培养基制备。基础培养基的实例包括可用于培养动物细胞的培养基,例如BME培养基,BGJb培养基,CMRL1066培养基,Glasgow MEM(GMEM)培养基,改进型MEM Zinc Option培养基,IMDM培养基,Medium199培养基,Eagle MEM培养基,αMEM培养基,DMEM培养基,F-12培养基,DMEM/F-12培养基,IMDM/F12培养基,汉姆培养基(Ham’s medium),RPMI1640培养基,费舍尔培养基(Fischer’s medium)及其混合培养基等。
本发明中的“无血清培养基”是指不含未调节或未纯化的血清的培养基。在本发明中,含有纯化血液衍生组分和动物组织衍生组分(例如生长因子)的培养基也包括在无血清培养基中,除非其中含有未调节或未纯化的血清。
无血清培养基可含有血清替代品。血清替代品的实例包括适当含有白蛋白,转铁蛋白,脂肪酸,胶原前体,微量元素,2-巯基乙醇或3′硫醇甘油,或这些等同物等的血清替代品。这种血清替代品可以通过例如WO98/30679中描述的方法制备。血清替代品可以是市售产品。这种市售血清替代品的实例包括KnockoutTM Serum Replacement(LifeTechnologies,现在是ThermoFisher:以下有时表示为KSR),化学定义的脂质浓缩物(Chemically Defined Lipid Concentrated)(Life Technologies制造)和GlutamaxTM(Life Technologies制造),B27(Life Technologies制造),N2补充剂(Life Technologies制造)和ITS补充剂(Life Technologies制造)。
用于悬浮培养的无血清培养基可适当地含有脂肪酸或脂质,氨基酸(例如,非必需氨基酸),维生素,生长因子,细胞因子,抗氧化剂,2-巯基乙醇,丙酮酸,缓冲剂,无机盐等。
为了避免复杂的制备,补充有适当量(例如,约0.5%至约30%,优选约1%至约20%)的市售KSR(由Life Technologies制造)的无血清培养基(例如,F-12培养基和补充有10%KSR、化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)和450μM 1-硫代甘油的IMDM培养基的1∶1混合物的培养基,)用作这种无血清培养基。另外,作为与KSR等同的产物,可以提及JP-A-2001-508302中公开的培养基。
本发明中的“含血清培养基”是指含有未调节或未纯化的血清的培养基。培养基可含有脂肪酸或脂质,氨基酸(如非必需氨基酸),维生素,生长因子,细胞因子,抗氧化剂,2-巯基乙醇,1-硫代甘油,丙酮酸,缓冲剂,无机盐等。
在一个实施方案中,本发明中的培养可优选在无异源体系条件下进行。“无异源体系”是指消除来自与待培养细胞不同的物种的组分的条件。
在本发明中,“含有物质X的培养基”和“在物质X存在下”是指补充有外源物质X的培养基或含有外源物质X的培养基,或存在外源物质X的培养基。也就是说,当培养基中存在的细胞或组织内源性地表达,分泌或产生物质X时,内源性物质X与外源物质X不同,并且不含外源物质X的培养基被理解为落在“含有物质X的培养基”的类别外,即使它含有内源性物质X。
例如,“含有TGFβ家族信号转导途径抑制物质的培养基”是补充有外源TGFβ家族信号转导途径抑制物质的培养基或含有外源TGFβ家族信号转导途径抑制物质的培养基。
在本发明中,“饲养细胞”是指在培养干细胞时共存的干细胞以外的细胞。用于培养多能干细胞同时保持未分化状态的饲养细胞的实例包括小鼠成纤维细胞(MEF等),人成纤维细胞,SNL细胞等。作为饲养细胞,优选进行生长抑制处理的饲养细胞。生长抑制处理的实例包括用生长抑制剂(例如丝裂霉素C)处理,γ照射,UV照射等处理。用于培养多能干细胞同时保持未分化状态的饲养细胞通过分泌体液因子(优选维持未分化状态的因子)或产生用于细胞黏附的支架(细胞外基质)而有助于维持多能干细胞的未分化状态。
在本发明中,“不存在饲养细胞(无饲养细胞)”是指在不存在饲养细胞的情况下培养。不存在饲养细胞意味着,例如,不添加饲养细胞的条件,或基本上不存在饲养细胞的条件(例如,饲养细胞数相对于细胞总数的比例不超过3%,优选不超过0.5%)。
在本发明中,细胞的“聚集体”是指通过组装分散在培养基中的细胞形成的凝块,其中细胞彼此黏附。细胞团块,胚状体,球体,球状体也涵盖在细胞聚集体中。优选地,在细胞聚集体中形成平面细胞-细胞黏附。在一些实施方案中,细胞有时在一些或所有聚集体中形成细胞-细胞连接和/或细胞黏附,例如黏附连接。本发明中的“聚集体”具体包括在上述本发明[1]的第二步骤中产生的聚集体(其由在悬浮培养开始时分散的细胞形成)以及在上述本发明[1]的第三步骤产生的聚集体(其包含从多能干细胞分化的诱导视网膜细胞),并且“聚集体”还包括在上述本发明[1]的第二步骤的悬浮培养开始时已形成的聚集体。在第二步骤中形成的细胞聚集体涵盖“胚状体(EB)”。
在本发明中,“均匀的聚集体”是指当培养多个聚集体时每个聚集体的尺寸是恒定的,并且当通过最大直径的长度评估聚集体的尺寸时,最大直径的长度的变化是小的。更具体地,这意味着整个聚集体群中不少于75%的聚集体在聚集体群体中的最大直径的平均值±100%,优选平均值±50%,更优选平均值±20%内。
在本发明中,“形成均匀的细胞聚集体”是指当聚集细胞以形成细胞聚集体并在悬浮液中培养聚集体时“快速聚集给定数量的分散细胞”以形成尺寸均匀的细胞聚集体。
“分散”是指通过分散处理例如酶处理,物理处理等将细胞或组织分成小细胞簇(不少于2个细胞且不超过100个细胞,优选不超过50个细胞)或单细胞。给定数量的分散细胞是一定数量的细胞簇或单细胞的集合。
分散多能干细胞的方法的实例包括机械分散处理,细胞分散溶液处理和细胞保护剂添加处理。这些处理可以组合进行。优选地,进行细胞分散溶液处理,然后进行机械分散处理。
作为机械分散处理的方法,可以提及移液处理或通过刮刀的刮擦操作。
作为用于细胞分散溶液处理的细胞分散液,可以提及含有任何酶(例如胰蛋白酶,胶原酶,透明质酸酶,弹性蛋白酶,链霉蛋白酶,DNA酶,木瓜蛋白酶等)以及螯合剂(例如乙二胺四乙酸等)的溶液。还可以使用市售的细胞分散溶液,例如TrypLE Select(LifeTechnologies制造)和TrypLE Express(Life Technologies制造)。
当多能干细胞分散时,可以通过用细胞保护剂处理来抑制多能干细胞的细胞死亡。作为用于细胞保护剂处理的细胞保护剂,可以提及FGF信号转导途径活化物质,肝素,IGF信号转导途径活化物质,血清和血清替代物。为了抑制由分散诱导的细胞死亡(特别是人多能干细胞的细胞死亡),可以在分散时加入Rho相关的卷曲螺旋激酶(ROCK)抑制物质或肌球蛋白抑制物质。作为ROCK抑制物质,可以提及Y-27632,法舒地尔(HA1077),H-1152等。作为肌球蛋白抑制物质,可以提及布雷他汀(Blebbistatin)。作为优选的细胞保护剂,可以提及ROCK抑制物质。
例如,用于分散多能干细胞的方法包括一种方法,该方法包括在作为细胞保护剂的ROCK抑制物质存在下用细胞分散溶液(TrypLE Select)处理多能干细胞集落,并通过移液进一步分散它们。
在本发明的产生方法中,优选通过快速聚集多能干细胞形成多能干细胞的聚集体。当以这种方式形成多能干细胞的聚集体时,可以在从形成的聚集体诱导和分化的细胞中形成具有良好再现性的上皮样结构。形成聚集体的实验操作的实例包括通过将细胞保持在小空间中的方法,其使用具有小孔的板(例如,具有基底面积为约0.1-2.0cm2(当以平底计算时)的孔的板),微孔等,通过使用小型离心管通过离心短时间聚集细胞的方法。作为具有小孔的板,可以提及例如,24孔板(当以平底计算时面积为约1.88cm2,),48孔板(以平底计算时面积约1.0cm2)底部),96孔板(以平底计算时面积约0.35cm2,内径约6-8mm),和384孔板。优选96孔板。作为具有小孔的板的形状,当从上方观察井时底表面的形状是例如多边形,矩形,椭圆形,真圆形,优选为真圆形。当从侧孔观察孔时,作为具有小孔的板的形状,底表面的形状可以是平底结构或具有高外周和低内凹的结构。底表面的形状包括例如U形底部,V形底部,M形底部,优选M形底部或V形底部。作为具有小孔的平板,也可以使用在底表面上具有凹凸或凹陷的细胞培养皿(例如,60mm-150mm培养皿,培养瓶)。具有小孔的板的底表面优选是非细胞黏附的底表面,优选上述非细胞黏合剂涂覆的底表面。
多能干细胞或含有多能干细胞的细胞群的聚集体的形成及其均匀性可以基于聚集体的大小和其中的细胞数,肉眼可见的形态,通过组织染色分析的显微形态和其均一性等等来确定。此外,可以通过以下确定聚集体中上皮样结构的形成及其均匀性:聚集体的宏观形态,组织染色分析的显微形态及其均匀性,分化和未分化标志物的表达及其均匀性,分化标志物的表达的对照及其同步性,聚集体之间分化效率的再现性,等等。
本发明中的“组织”是指具有以下结构的细胞群的结构,其中一种具有均匀形态或性质的细胞,或具有不同形态和性质的多种细胞以给定的模式空间排列。
在本发明中,“神经组织”是指在发育阶段或成人阶段由神经细胞(包括大脑,中脑,小脑,脊髓,视网膜,周围神经,前脑,后脑,端脑,间脑等)构成的组织。细胞聚集体中的神经组织可以通过光学显微镜(例如,明视野显微镜,相差显微镜,微分干涉对比显微镜,立体显微镜等)或使用作为指标的神经组织标志物(例如PSA-NCAM,N-钙粘蛋白等)的表达来进行显微镜观察来确认。
神经组织可以形成“神经上皮组织”(具有层结构的上皮结构)。神经上皮组织的特征可以通过指标(例如组织中包含的细胞的形态,组织中细胞体的取向,整个组织的透明度,宏观形式等)来鉴定。细胞聚集体中神经上皮组织的量可以通过使用光学显微镜的明视野观察来评估。
在本发明中,“神经细胞”是指来自外胚层的组织中的表皮谱系细胞以外的细胞。即,它包括例如神经前体细胞,神经元(神经元细胞),神经胶质细胞,神经干细胞,神经元前体细胞,神经胶质前体细胞等。可以通过使用作为标志物的Nestin,TuJ1,PSA-NCAM,N-钙粘蛋白等来鉴定神经细胞。神经元(或神经元细胞)是形成神经回路并有助于信号传递的功能细胞,并且可以通过使用作为指标的未成熟神经元标志物(例如TuJ1,Dcx,HuC/D等)和/或成熟神经元标志物(例如Map2,NeuN等)的表达来鉴定。
神经细胞包括下文描述的视网膜细胞。
在本发明中,“视网膜细胞”是指在体内视网膜中构成每个视网膜层的细胞或其祖细胞/前体细胞,并且非限制性地包括视网膜祖细胞,神经视网膜祖细胞,感光细胞前体细胞,感光细胞,杆感光细胞,锥感光细胞,水平细胞,无长突细胞,中间神经元,视网膜神经节细胞(神经节细胞),双极细胞,视网膜色素上皮细胞(RPE),睫状边缘带细胞,这些细胞的祖细胞/前体细胞等。在本发明中,“视网膜组织”是指其中在体内视网膜中构成各个视网膜层的一种或至少两种或更多种上述细胞在层中空间排列的组织。由每个细胞构成的视网膜层可以通过已知方法确认,例如,细胞标记物的表达是否存在或其水平等。
本发明中的“视网膜层”是指构成视网膜的各层。其具体实例包括视网膜色素上皮层,感光细胞层,外界膜,外核层,外网状层,内核层,内网状层,神经节细胞层,神经纤维层和内界膜。
本发明中的“视网膜祖细胞”是指能够分化成任何成熟视网膜层特异性神经细胞(包括感光细胞,杆感光细胞,锥感光细胞,水平细胞,双极细胞,无长突细胞,视网膜神经节细胞,视网膜色素上皮细胞等)的祖细胞。
在本发明中,“神经视网膜祖细胞”是指能够分化成任何一种或多种成熟视网膜层特异性神经细胞(包括感光细胞,水平细胞,双极细胞,无长突细胞,视网膜神经节细胞,等等)的祖细胞。通常,神经视网膜祖细胞不分化成视网膜色素上皮细胞。
感光细胞的前体细胞,水平细胞的前体细胞,双极细胞的前体细胞,无长突细胞的前体细胞,视网膜神经节细胞的前体细胞和视网膜色素上皮祖细胞的前体细胞分别是指致分化为感光细胞,水平细胞,双极细胞,无长突细胞,视网膜神经节细胞和视网膜色素上皮细胞的前体细胞。
在本发明中,“视网膜层特异性神经细胞”是构成视网膜层的细胞,并且是视网膜层特异的神经元细胞。视网膜层特异性神经细胞的实例包括双极细胞,视网膜神经节细胞,无长突细胞,水平细胞,感光细胞,视网膜色素上皮细胞,杆感光细胞和锥感光细胞。
视网膜细胞标记物的实例包括在视网膜祖细胞中表达的Rx(也称为Rax),PAX6和Chx10,在下丘脑神经元的祖细胞中表达但在视网膜祖细胞中不表达的Nkx2.1,在下丘脑神经上皮细胞中表达但在视网膜中不表达的Sox1,在感光细胞的祖细胞中表达的Crx和Blimp1,等等。视网膜层特异性神经细胞标志物的实例包括:在双极细胞中表达的Chx10,PKCα和L7,在视网膜神经节细胞中表达的TUJI和Brn3,在无长突细胞中表达的钙结合蛋白,在水平细胞中表达的钙结合蛋白,在成熟感光细胞中表达的视紫红质和恢复蛋白,在杆感光细胞中表达的Nrl和视紫红质,在锥细胞感光细胞中表达的Rxr-γ,S-Opsin和M/L-Opsin,在视网膜色素上皮细胞中表达的RPE65和Mitf,在睫状边缘带细胞中表达的Rdh10和SSEA1等等。
2.产生视网膜细胞或视网膜组织的方法
本发明的一个实施方案是一种产生视网膜细胞或视网膜组织的方法,其包括以下步骤(1)-(3):
(1)第一步骤:在不存在饲养细胞的情况下在含有以下的培养基中培养多能干细胞:1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,以及2)用于维持未分化状态的因子,
(2)第二步骤:将在第一步骤中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质的培养基中悬浮培养,形成细胞聚集体,和
(3)第三步骤:在含有BMP信号转导途径活化物质的培养基中在存在或不存在Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,将第二步骤中获得的聚集体悬浮培养,以获得含有视网膜细胞或视网膜组织的聚集体。
2-1.步骤(1)
在步骤(1)中,在不存在饲养细胞的情况下在含有以下的培养基中培养多能干细胞:1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,以及2)用于维持未分化状态的因子。
步骤(1)中优选的多能干细胞是诱导多能干细胞或胚胎干细胞(ES细胞),更优选人诱导多能干细胞或人胚胎干细胞(ES细胞)。
诱导性多能干细胞的产生方法没有特别限制,可以通过上述本领域普通技术人员熟知的方法制备。还希望在无饲养细胞条件下进行制备诱导多能干细胞的步骤(即,重编程体细胞以建立多能干细胞的步骤)。
尽管胚胎干细胞(ES细胞)的产生方法没有特别限制,并且可以通过如上所述的本领域普通技术人员熟知的方法产生,但是还希望的是在无饲养细胞条件下进行制备胚胎干细胞(ES细胞)的步骤。
步骤(1)中使用的多能干细胞的维持培养或扩增培养可以通过本领域普通技术人员熟知的方法进行。虽然多能干细胞的维持培养和扩增培养可以通过黏附培养或悬浮培养进行,但优选通过黏附培养进行。尽管多能干细胞的维持培养和扩增培养可以在饲养细胞的存在下或在无饲养细胞条件下进行,但优选在无饲养细胞条件下进行。在多能干细胞的维持培养和扩增培养中不存在饲养细胞(无饲养细胞)意味着基本上不存在饲养细胞的条件(例如,饲养细胞数相对于细胞总数的比例不超过3%)。优选地,多能干细胞的维持培养和扩增培养在无饲养细胞的条件下进行。
步骤(1)中不存在饲养细胞(无饲养细胞)意指基本上无饲养细胞的条件(例如,饲养细胞数相对于细胞总数的比例不超过3%)。优选地,步骤(1)在无饲养细胞的条件下进行。步骤(1)中使用的培养基没有特别限制,只要其是能够培养多能干细胞以在无饲养细胞条件(无饲养细胞培养基)下维持未分化状态的培养基即可。为了使培养保持无差别的状态,它包含维持未分化状态的因子。
维持未分化状态的因子不受特别限制,只要其是具有抑制多能干细胞分化的作用的物质即可。在引发的多能干细胞(例如,人ES细胞,人iPS细胞)的情况下本领域普通技术人员广泛使用的维持未分化状态的因子的实例包括FGF信号转导途径活化物质,TGFβ家族信号转导途径活化物质,胰岛素等。作为FGF信号转导途径活化物质,可以具体提及成纤维细胞生长因子(例如,bFGF,FGF4,FGF8)。作为TGFβ家族信号转导途径活化物质,可以提及TGFβ信号转导途径活化物质,Nodal/激活蛋白信号转导途径活化物质。作为TGFβ信号转导途径活化物质,可以提及例如TGFβ1,TGFβ2。作为Nodal/激活蛋白信号转导途径活化物质,可以提及例如Nodal,激活蛋白A,激活蛋白B。维持未分化状态的因子可以包含这些中的一种或多种。当培养人多能干细胞(人ES细胞,人iPS细胞等)时,步骤(1)中的培养基优选含有bFGF作为维持未分化状态的因子。
维持用于本发明的未分化状态的因素通常是维持哺乳动物未分化状态的因子。哺乳动物是例如上面提到的那些。由于维持未分化状态的因子可能在哺乳动物物种之间具有交叉反应性,因此也可以使用任何哺乳动物的维持未分化状态的因子,只要可以维持待培养的多能干细胞的未分化状态即可。优选地,使用与待培养细胞相同物种的哺乳动物的维持未分化状态的因子。例如,对于人多能干细胞的培养,使用维持未分化状态的人因子(例如,bFGF,FGF4,FGF8,EGF,Nodal,激活蛋白A,激活蛋白B,TGFβ1,TGFβ2等)。这里,“人蛋白质X”是指蛋白质X具有在体内在人中天然表达的蛋白质X的氨基酸序列。
优选分离用于维持本发明中使用的未分化状态的因子。“分离”意味着已经进行了除去预期组分或细胞以外的因子的操作,并且该组分或细胞不再处于天然存在状态。因此,“分离的蛋白质X”不包括由待培养的细胞或组织产生的内源性蛋白质X,并且包含在细胞或组织中或培养基中。“分离的蛋白质X”的纯度(蛋白质X的重量相对于总蛋白质重量的百分比)通常不小于70%,优选不小于80%,更优选不小于90%,进一步优选不小于99%,进一步优选100%。因此,在一个实施方案中,本发明包括提供用于维持未分化状态的分离因子的步骤。在一个实施方案中,它包括外源添加用于维持未分化状态的分离因子至步骤(1)中使用的培养基的步骤。或者,可以预先将用于维持未分化状态的因子添加到步骤(1)中使用的培养基中。
在步骤(1)中使用的培养基中维持未分化状态的因子浓度是能够维持待培养的多能干细胞的未分化状态的浓度,并且可以由本领域普通技术人员适当确定。例如,具体地,当bFGF用作在没有饲养细胞的情况下维持未分化状态的因子时,其浓度通常为约4ng-500ng/mL,优选约10ng-200ng/mL,更优选约30ng-150ng/mL。
作为在步骤(1)中使用的无饲养细胞培养基(即,未分化维持培养基),已经开发了许多合成培养基并且可商购获得。例如,可以提及Essential 8(由Life Technologies制造)培养基。Essential 8培养基是DMEM/F12培养基,其含有L-抗坏血酸-2-磷酸镁(64mg/l),亚硒酸钠(14μg/l),胰岛素(19.4mg/l),NaHCO3(543mg/l),转铁蛋白(10.7mg/l),bFGF(100ng/mL)和TGFβ家族信号转导途径活化物质(TGFβ1(2ng/mL)或Nodal(100ng/mL))作为添加剂(Nature Methods,8,424-429(2011))。其他可商购的无饲养细胞培养基(未分化维持培养基)的实例包括Essential6培养基(Life Technologies制造),稳定化Essential 8培养基(Life Technologies制造),S-培养基(DS Pharma Biomedical Co.,Ltd.制造),StemPro(Life Technologies制造),hESF9(Proc Natl Acad Sci U S A.2008 Sep 9;105(36):13409-14),TeSR培养基(STEMCELL Technologies制造),mTeSR1(STEMCELLTechnologies制造),mTeSR2(STEMCELL Technologies制造),TeSR-E8(STEMCELLTechnologies制造)。除此之外,作为无饲养细胞培养基可以提及StemFit(注册商标)(由Ajinomoto Co.,Inc.制造)。通过在上述步骤(1)中使用它们可以方便地进行本发明。
在步骤(1)中,多能干细胞可以在悬浮培养和黏附培养的任何条件下培养,优选黏附培养。
虽然用于黏附培养的培养容器没有特别限制,只要可以进行“黏附培养”,但是细胞黏附培养容器是优选的。细胞黏附培养容器包括其表面已被人工处理以改善对细胞的黏附性的培养容器,并且具体地可以提及以上提到的其内部包被有涂层剂的培养容器。涂层剂的实例包括细胞外基质例如层粘连蛋白[包括层粘连蛋白α5β1γ1(下文称层粘连蛋白511),层粘连蛋白α1β1γ1(下文称层粘连蛋白111)等和层粘连蛋白片段(层粘连蛋白511E8等)],巢蛋白,胶原,明胶,玻璃体结合蛋白,Synthemax(Corning Incorporated),基质胶(Matrigel)等,或聚合物例如聚赖氨酸,聚鸟氨酸等。还可以使用其表面通过正电荷处理等处理的培养容器。优选层粘连蛋白,更优选层粘连蛋白511E-8。层粘连蛋白511E-8可以是市售产品(例如,iMatrix-511,Nippi)。
步骤(1)中使用的培养基含有TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径活化物质。具体地,例如,可以将TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质添加到上述未分化维持培养基中。在第一步骤中,用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质处理多能干细胞,并在第二步骤中进行悬浮培养,从而改变细胞状态,改善聚集体质量,并且可以高效地产生维持未分化状态的细胞聚集体。由此获得的细胞聚集体预期显示出例如具有光滑表面和致密内部的球形细胞聚集体的特征。
TGFβ家族信号转导途径(即TGFβ超家族信号转导途径)是由Smad家族(其中以TGFβ,Nodal/激活蛋白或BMP作为配体)在细胞内转导的信号转导途径。
TGFβ家族信号转导途径抑制物质是抑制TGFβ家族信号转导途径(即由Smad家族转导的信号转导途径)的物质。具体地,可提及TGFβ信号转导途径抑制物质,Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质和BMP信号转导途径抑制物质。
TGFβ信号转导途径抑制物质没有特别限制,只要它是抑制由TGFβ引起的信号转导途径的物质即可,并且可以是核酸,蛋白质和低分子有机化合物中的任何一种。作为所述物质,可以提及例如,直接作用于TGFβ的物质(例如,蛋白质,抗体,适体等),抑制编码TGFβ的基因表达的物质(例如,反义寡核苷酸,siRNA等),抑制TGFβ受体和TGFβ结合的物质,以及抑制由TGFβ受体转导的信号引起的生理活性的物质(例如,TGFβ受体抑制剂,Smad抑制剂等)。作为被称为TGFβ信号转导途径抑制物质的蛋白质,可以提及Lefty等。作为TGFβ信号转导途径抑制物质,可以使用本领域普通技术人员公知的化合物,具体地,可以提及SB431542,LY-364947,SB-505124,A-83-01等。SB431542(4-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺)和A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺)是已知作为TGFβ受体(ALK5)和激活蛋白受体(ALK4/7)的抑制剂的化合物(即,TGFβR抑制剂)。可以含有这些中的一种或多种作为TGFβ信号转导途径抑制物质。TGFβ信号转导途径抑制物质优选是SB431542或A-83-01。
Nodal/激活蛋白(Activin)信号转导途径抑制物质没有特别限制,只要它是抑制由Nodal或激活蛋白引起的信号转导途径的物质即可,并且可以是核酸,蛋白质和低分子有机化合物中的任何一种。所述物质的实例包括直接作用于Nodal或激活蛋白的物质(例如,抗体,适体等),抑制编码Nodal或激活蛋白的基因表达的物质(例如,反义寡核苷酸,siRNA等),抑制Nodal或激活蛋白受体和Nodal或激活蛋白结合的物质,以及抑制由Nodal或激活蛋白受体转导的信号引起的生理活性的物质。作为Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质,可以使用本领域普通技术人员公知的化合物,具体地,可以提及SB431542,A-83-01等。另外,可以使用已知为Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质的蛋白质(Lefty,Cerberus等)。可以含有这些中的一种或多种作为Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质。Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质优选是SB431542,A-83-01或Lefty。
BMP信号转导途径抑制物质没有特别限制,只要它是抑制由BMP引起的信号转导途径的物质即可,并且可以是核酸,蛋白质和低分子有机化合物中的任何一种。作为BMP,可以提及BMP2,BMP4,BMP7和GDF7。所述物质的实例包括直接作用于BMP的物质(例如,抗体,适体等),抑制编码BMP的基因表达的物质(例如,反义寡核苷酸,siRNA等),抑制BMP受体(BMPR)和BMP结合的物质,以及抑制由BMP受体转导的信号引起的生理活性的物质。作为BMPR,可以提及ALK2或ALK3。作为BMP信号转导途径抑制物质,可以使用本领域普通技术人员公知的化合物,具体地,可以提及LDN193189,Dorsomorphin等。这里,LDN193189(4-[6-(4-哌嗪-1-基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉)是已知的BMPR(ALK2/3)抑制剂(下文称为BMPR抑制剂)并且通常以盐酸盐的形式商购。另外,也可以使用称为BMP信号转导途径抑制物质的蛋白质(脊索蛋白(Chordin),头蛋白(Noggin)等)。可以含有这些中的一种或多种作为BMP信号转导途径抑制物质。BMP信号转导途径抑制物质优选是LDN193189。
TGFβ家族信号转导途径抑制物质优选是Lefty,SB431542,A-83-01或LDN193189。
可以组合使用具有不同作用点的多种类型的TGFβ家族信号转导途径抑制物质。通过组合它们,预计将提高对聚集体质量的改善效果。例如,可以提及TGFβ信号转导途径抑制物质和BMP信号转导途径抑制物质的组合,TGFβ信号转导途径抑制物质和Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质的组合,以及BMP信号转导途径抑制物质和Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质的组合。优选地,组合使用TGFβ信号转导途径抑制物质和BMP信号转导途径抑制物质。特别优选的组合是SB431542和LDN193189的组合。
Sonic hedgehog(下文有时称为Shh)信号转导途径活化物质是能够增强Shh介导的信号转导的物质。Shh信号转导途径活化物质的实例包括属于Hedgehog家族的蛋白质(例如,Shh和Ihh),Shh受体,Shh受体激动剂,PMA(嘌吗啡胺(Purmorphamine);9-环己基-N-[4-(4-吗啉基)苯基]]-2-(1-萘基氧基)-9H-嘌呤-6-胺),SAG(平和化激动剂(SmoothenedAgonist);N-甲基-N′-(3-吡啶基苄基)-N′-(3-氯苯并[b]噻吩-2)-羰基)-1,4-二氨基环己烷)等。Shh信号转导途径活化物质可以含有这些中的一种或多种。优选的Shh信号转导途径活化物质是Shh蛋白(Genbank登录号:NM_000193,NP_000184),SAG和PMA。
TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径活化物质可以组合使用。通过组合它们,预计将提高对聚集体质量的改善效果。特定组合的实例包括选自Lefty,SB431542,A-83-01和LDN193189组成的组中的任何TGFβ家族信号转导途径抑制物质以及选自Shh蛋白,SAG和PMA组成的组中的任何Shh信号转导途径活化物质的组合。当TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径活化物质组合使用时,可以在含有TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径活化物质的培养基中培养细胞,或者可以用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径活化物质中的任何一种处理细胞,然后可以用它们中的任一种或两种连续处理细胞。或者,可以用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径活化物质处理细胞,然后用它们中的任一种连续处理。
可以适当地确定TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的浓度,使其落入能够实现上述效果的范围内。例如,SB431542通常以0.1-200μM,优选2-50μM的浓度使用。A-83-01通常以0.05-50μM,优选0.5-5μM的浓度使用。LDN193189通常以1-2000nM,优选10-300nM的浓度使用。Lefty通常以5-200ng/ml,优选10-50ng/ml的浓度使用。Shh蛋白通常以20-1000ng/ml,优选50-300ng/ml的浓度使用。SAG通常以1-2000nM,优选10-700nM,更优选30-600nM的浓度使用。PMA通常以0.002-20μM,优选0.02-2μM的浓度使用。在一个实施方案中,TGFβ家族信号转导途径抑制物质可以适当地使用,其量显示TGFβ家族信号转导途径抑制活性等同于上述浓度的SB43154的活性。在一个实施方案中,Sonic hedgehog信号转导途径活化物质可以适当地使用,其量显示Shh信号转导促进活性等同于上述浓度的SAG的活性。
TGFβ家族信号转导途径抑制SB431542,LDN193189等的活性可通过通过本领域普通技术人员熟知的方法如Western印迹法(Mol Cancer Ther.(2004)3,737-45.)检测例如Smad的磷酸化来确定。SAG等的Sonic hedgehog信号转导促进活性可通过本领域普通技术人员熟知的方法(例如,注意Gli1基因表达的报告基因测定(Oncogene(2007)26,5163-5168))确定。
虽然用于步骤(1)的培养基可以是含血清的培养基或无血清培养基,但它优选是无血清培养基,以避免被化学不确定的组分污染。
为了避免被化学不确定的组分污染,用于步骤(1)的培养基可以是其组分是化学上确定的培养基。
为了在步骤(1)中在无饲养细胞条件下培养多能干细胞,可以使用上述无饲养细胞培养基(即,未分化维持培养基)作为培养基。作为无饲养细胞培养基(未分化维持培养基),可以提及Essential 8培养基,Essential 6培养基,稳定化的Essential 8培养基,S-培养基,StemPro培养基,hESF9培养基,TeSR培养基,mTeSR培养基(mTeSR1,mTeSR2等),TeSR-E8,StemFit(注册商标)培养基等,并且优选使用Essential 8培养基或StemFit(注册商标)培养基。
为了在步骤(1)中在无饲养细胞条件下培养多能干细胞,可以使用合适的基质作为支架,以代替饲养细胞为多能干细胞提供支架。将多能干细胞在细胞容器中进行黏附培养,所述细胞容器的表面包被有基质作为支架。
作为可用作支架的基质,可以提及层粘连蛋白(Nat Biotechnol 28,611-615(2010)),层粘连蛋白片段(Nat Commun 3,1236(2012)),基膜制剂(Nat Biotechnol 19,971-974(2001)),明胶,胶原,硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,巢蛋白,玻连蛋白等。
“层粘连蛋白”是由α,β,γ链组成的异源三聚体分子和含有具有不同亚基链组成的同种型的细胞外基质蛋白。具体地,基于异源三聚体的组合(5种α链,4种β链和3种γ链),层粘连蛋白具有约15种同种型。层粘连蛋白的名称通过组合α链(α1-α5),β链(β1-β4)和γ链(γ1-γ3)各自的编号来确定。例如,具有α5链,β1链,γ1链组合的层粘连蛋白被称为层粘连蛋白511。在本发明中,优选使用层粘连蛋白511(Nat Biotechnol 28,611-615(2010))。
用于本发明的层粘连蛋白通常是哺乳动物层粘连蛋白。作为哺乳动物,可以列举上述那些。为了实现无异源体系条件,优选使用与待培养细胞相同物种的哺乳动物的层粘连蛋白。例如,人层粘连蛋白(优选人层粘连蛋白511)用于培养人多能干细胞。
用于本发明的层粘连蛋白片段没有特别限制,只要其对多能干细胞具有黏附性并且能够在无饲养细胞条件下维持多能干细胞的培养,并且优选E8片段。层粘连蛋白E8片段被鉴定为通过用弹性蛋白酶消化层粘连蛋白511获得的片段中具有强细胞黏附活性的片段(EMBO J.,3:1463-1468,1984,J.Cell Biol.,105:589-598,1987)。在本发明中,优选使用层粘连蛋白511的E8片段(Nat Commun 3,1236(2012),Scientific Reports 4,3549(2014))。用于本发明的层粘连蛋白E8片段不需要是层粘连蛋白的弹性蛋白酶消化产物,并且可以是重组体。为避免未鉴定组分的污染,重组层粘连蛋白片段优选用于本发明。层粘连蛋白511的E8片段可商购获得,并且可以从例如Nippi,Inc.等购买。
优选分离用于本发明的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段。
本发明中的“基膜制剂”是指含有基膜构成组分的基膜制剂,当将能够形成基膜的细胞铺在其上并培养时其具有控制细胞形态,分化,生长,运动,功能表达等功能,与上皮细胞相似。例如,当进行进一步的黏附培养时,可以分散本发明产生的视网膜细胞和视网膜组织,并在基膜制剂的存在下进行培养。这里,“基膜构成组分”是指在动物组织中存在于上皮细胞层和间质细胞层之间的薄膜形式的细胞外基质分子。基膜制剂可以例如通过用能够溶解细胞脂质的溶液,碱溶液等从载体上除去能够形成基膜的细胞(其经由基膜黏附至载体)来产生。基膜制剂的实例包括作为基膜制剂可商购的产品(例如,MatrigelTM(由CorningIncorporated制造:下文有时称为Matrigel)),GeltrexTM(由Life Technologies制造),以及称为基膜组分细胞外基质分子(例如层粘连蛋白,IV型胶原,硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,巢蛋白等)。
MatrigelTM是从Engelbreth Holm Swarn(EHS)小鼠肉瘤中提取的基膜制剂。MatrigelTM的主要组分是IV型胶原蛋白,层粘连蛋白,硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。除此之外,还含有TGF-β,FGF,组织纤溶酶原激活物和EHS肿瘤天然产生的生长因子。MatrigelTM的“生长因子减少的产物”具有比普通MatrigelTM更低的生长因子浓度,其标准浓度对于EGF是<0.5ng/ml,对于NGF是<0.2ng/ml,对于PDGF是<5pg/ml,对于IGF1是5ng/ml和对于TGFβ是1.7ng/ml。
为避免未鉴定组分的污染,优选在本发明中使用分离的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段。
优选地,在步骤(1)中在无饲养细胞条件下的多能干细胞培养中,将人多能干细胞以黏附状态培养在细胞容器中,所述细胞容器表面包被分离的层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的E8片段(更优选地,层粘连蛋白511的E8片段)。
虽然步骤(1)中多能干细胞培养的时间没有特别限制,只要可以实现提高步骤(2)中形成的聚集体质量的效果,但通常为0.5-144小时。步骤(1)中多能干细胞的培养时间优选不小于1小时,不小于2小时,不小于6小时,不小于12小时,不小于18小时,不小于20小时或不少于24小时。步骤(1)中多能干细胞的培养时间优选在96小时内,72小时内,60小时内,48小时内或28小时内。在一个实施方案中,步骤(1)中多能干细胞的培养时间的范围优选是2-96小时,6-72小时,6-60小时,12-60小时,18-60小时,18-48小时或18-28小时(例如24小时)。即,在步骤(2)中的悬浮培养开始之前0.5-144小时(优选12-60小时,18-48小时或18-28小时),第一步开始,并且步骤(2)在完成步骤(1)之后连续进行。当用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径活化物质之一处理细胞,然后用另一种物质连续处理时,每种处理时间可以设定为独立地落在上述培养时间的范围内。
当用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径活化物质两者处理细胞,然后用其中一种连续处理细胞时,以及当用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径活化物质任一者处理细胞然后用两者连续处理时,每者处理时间也可以设定为独立地落在上述培养期的范围内。
在一个实施方案中,细胞可以用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,SB431542或LDN193189)和Shh信号转导途径活化物质(例如,SAG)任一者一起培养18-28小时(例如,24小时),然后用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如SB431542或LDN193189)和Shh信号转导途径活化物质(例如SAG)任一者进一步培养18-28小时(例如24小时)。在这种情况下,TGFβ家族信号转导途径抑制物质的浓度是,例如,显示相当于3μM-10μM的SB431542的TGFβ信号转导途径抑制活性的浓度,或显示相当于50nM-200nM的LDN193189的BMP信号转导途径抑制活性的浓度,Shh信号转导途径活化物质的浓度是,例如,显示相当于100nM-500nM的SAG的信号转导促进活性的浓度。
在另一个实施方案中,细胞可以用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,SB431542或LDN193189)和Shh信号转导途径活化物质(例如,SAG)两者一起培养18-28小时(例如,24小时),然后用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如SB431542或LDN193189)和Shh信号转导途径活化物质(例如SAG)任一者进一步培养18-28小时(例如24小时)。在这种情况下,TGFβ家族信号转导途径抑制物质的浓度是,例如,显示相当于3μM-10μM的SB431542的TGFβ信号转导途径抑制活性的浓度,或显示相当于50nM-200nM的LDN193189的BMP信号转导途径抑制活性的浓度,Shh信号转导途径活化物质的浓度是,例如,显示相当于100nM-500nM的SAG的信号转导促进活性的浓度。
在另一个实施方案中,细胞可以用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,SB431542或LDN193189)和Shh信号转导途径活化物质(例如,SAG)任一者一起培养18-28小时(例如,24小时),然后用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如SB431542或LDN193189)和Shh信号转导途径活化物质(例如SAG)两者进一步培养18-28小时(例如24小时)。在这种情况下,TGFβ家族信号转导途径抑制物质的浓度是,例如,显示相当于3μM-10μM的SB431542的TGFβ信号转导途径抑制活性的浓度,或显示相当于50nM-200nM的LDN193189的BMP信号转导途径抑制活性的浓度,Shh信号转导途径活化物质的浓度是,例如,显示相当于100nM-500nM的SAG的信号转导促进活性的浓度。
可以适当地确定步骤(1)中的培养温度和CO2浓度等培养条件。培养温度为例如约30℃至约40℃,优选约37℃。CO2浓度为例如约1%至约10%,优选约5%。
在一个优选的实施方案中,人多能干细胞(例如人iPS细胞)在不存在饲养细胞的情况下和在含有bFGF的无血清培养基(未分化维持培养基)中以黏附状态培养。黏附培养优选在表面包被层粘连蛋白511,层粘连蛋白511的E8片段或玻连蛋白的细胞容器中进行。作为无饲养细胞培养基(未分化维持培养基),黏附培养优选使用Essential 8,TeSR培养基,mTeSR培养基,mTeSR-E8培养基或StemFit(注册商标)培养基,更优选Essential 8或StemFit(注册商标)培养基。
在一个实施方案中,在不存在饲养细胞的情况下和在含有bFGF的无血清培养基中,将人多能干细胞(例如人iPS细胞)悬浮培养。在悬浮培养中,人多能干细胞可以形成人多能干细胞的聚集体。
在优选的实施方案中,步骤(1)中获得的细胞是维持多能样特性(多能样状态)的细胞,并且在整个步骤(1)中维持多能样特性。多能样特性意味着维持多能干细胞独特和共有的至少一部分特征,包括多能性。多能样特性不需要严格的多能性。具体地,表达作为多能性(多能状态)指标的全部或一些标志物的状态包括在“多能样特性”中。作为多能样特性的标志物,可以提及Oct3/4阳性,碱性磷酸酶阳性等。在一个实施方案中,维持多能样特性的细胞是Oct3/4阳性细胞。即使Nanog的表达水平低于ES细胞或iPS细胞的表达水平,它也包括在“显示多能性特性的细胞”中。
在一个实施方案中,步骤(1)中获得的细胞是具有分化成至少视网膜细胞或视网膜组织(优选视网膜组织,视网膜祖细胞或视网膜层特异性神经细胞)的能力的干细胞。在一个实施方案中,步骤(1)中获得的细胞是Oct3/4阳性干细胞,其具有分化成至少视网膜细胞或视网膜组织(优选视网膜组织,视网膜祖细胞或视网膜层特异性神经细胞)的能力。在一个实施方案中,步骤(1)中获得的细胞含有不少于60%,例如不少于90%的Oct3/4阳性干细胞。
在优选的实施方案中,在步骤(1)中,在含有TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质和bFGF的无血清培养基中在不存在饲养细胞的情况下黏附培养人多能干细胞(例如iPS细胞,ES细胞)。
上述提到的步骤(1)中的黏附培养优选在表面包被层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的E8片段的细胞容器中进行。TGFβ家族信号转导途径抑制物质优选是TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,A-83-01,Lefiy),Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01),BMP信号转导途径抑制物质(例如,LDN193189,脊索蛋白(Chordin),头蛋白(Noggin)),或这些的组合(例如,SB431542和LDN193189)。TGFβ家族信号转导途径抑制物质进一步优选为Lefty,SB431542,A-83-01或LDN193189,或这些的组合(例如SB431542和LDN193189)。Sonic hedgehog信号转导途径活化物质优选为Shh蛋白,SAG或嘌吗啡胺(Purmorphamine,PMA),更优选为SAG。TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01,LDN193189)和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,Shh蛋白,SAG,PMA)可以组合使用。培养时间为0.5-144小时(优选2-96小时,6-72小时,6-60小时,12-60小时,18-60小时,18-48小时或18-28小时(例如24小时)。在培养过程中,TGFβ家族信号转导途径抑制物质(如Lefty,SB431542,A-83-01,LDN193189),Shh信号转导途径活化物质(如Shh蛋白,SAG,PMA)或它们的组合可以改变。在一个实施方案中,细胞可以用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,LDN193189)和Shh信号转导途径活化物质(例如,SAG)两者一起培养18-28小时(例如,24小时),然后用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如SB431542,LDN193189)和Shh信号转导途径活化物质(例如SAG)任一者进一步培养18-28小时(例如24小时)。在另一个实施方案中,细胞可以用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,LDN193189)和Shh信号转导途径活化物质(例如,SAG)任一者培养18-28小时(例如,24小时),然后用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如SB431542,LDN193189)和Shh信号转导途径活化物质(例如SAG)两者或任一者进一步培养18-28小时(例如24小时)。
例如,在步骤(1)开始之前,在含有维持未分化状态的因子的培养基中,在不存在饲养细胞的情况下对多能干细胞进行维持培养,将TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质加入培养物中,并且继续培养以进行步骤(1)。具体地,例如,当在维持培养完成后开始步骤(1)时,可以将添加加入有TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的未分化维持培养基或更换未分化维持培养基的部分或全部,并继续培养。
例如,在不存在饲养细胞情况下和在含有bFGF的无血清培养基中对人多能干细胞(例如人iPS细胞)进行维持培养。维持培养优选在黏附培养中进行。黏附培养优选在表面包被玻连蛋白、层粘连蛋白511,或层粘连蛋白511的E8片段的细胞容器中进行。维持培养的时间没有特别限制。多能干细胞是能够增殖(优选自主复制)维持分化潜能的细胞,维持培养是能够维持多能性的培养方法。因此,如果操作得当,可以进行无限的维持培养。在一些实施方案中,在维持培养期间,将多能干细胞冷冻以产生冷冻细胞原种,并培养冷冻细胞原种并继续维持培养。虽然培养后的培养时间没有特别限制,但例如是约1天-1000天,优选约7天-150天,更优选约10天-90天。在一些实施方案中,可以在维持培养期间进行细胞的传代操作。
在步骤(1)中,将TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质加入到含有经受如上所述的维持培养的人多能干细胞的培养基中,并继续培养。TGFβ家族信号转导途径抑制物质优选是TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,A-83-01,SB431542),Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,A-83-01,Lefty),BMP信号转导途径抑制物质(例如,LDN193189),或其组合(例如,SB431542和LDN193189)。TGFβ家族信号转导途径抑制物质进一步优选为Lefty,SB431542,A-83-01,LDN193189,或其组合(例如SB431542和LDN193189)。Sonic hedgehog信号转导途径活化物质优选为Shh蛋白,SAG或PMA。TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01,LDN193189)和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,Shh蛋白,SAG,PMA)可以组合使用。加入后,继续培养0.5-144小时(优选2-96小时,6-72小时,6-60小时,12-60小时,18-60小时,18-48小时或18-28小时(例如,24小时))。在培养过程中,TGFβ家族信号转导途径抑制物质(如Lefiy,SB431542,A-83-01,LDN193189),Shh信号转导途径活化物质(如Shh蛋白,SAG,PMA)或它们的组合可以改变。在一个实施方案中,细胞可以用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,LDN193189)和Shh信号转导途径活化物质(例如,SAG)两者一起培养18-28小时(例如,24小时),并且用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如SB431542,LDN193189)和Shh信号转导途径活化物质(例如SAG)任一者进一步培养18-28小时(例如24小时)。在另一个实施方案中,细胞可以用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,LDN193189)和Shh信号转导途径活化物质(例如,SAG)任一者培养18-28小时(例如,24小时),并且用TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如SB431542,LDN193189)和Shh信号转导途径活化物质(例如SAG)任一者或两者进一步培养18-28小时(例如24小时)。
2-2.步骤(2)
步骤(2)用于说明将步骤(1)中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质的培养基中悬浮培养以形成细胞聚集体。
在本发明的步骤(2)中开始悬浮培养的时间点是进行以下操作的时间点。
·操作:包括更换步骤(1)中使用的未分化维持培养基,即含有以下的培养基:1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,和2)用于维持未分化状态的因子,并进行悬浮培养。
上述操作中的培养基更换是与未分化维持培养基以外的培养基交换,并且没有特别限制,只要所述培养基能够诱导分化成本发明的视网膜细胞和/或视网膜组织,或其中间体。例如,可以提及不含“未分化维持因子”的培养基,例如后面将描述的基础培养基等。在步骤(2)开始的时间点,即在培养基更换的时间点,它可以含有或不含有Wnt信号转导途径抑制物质,并且可以如下所述在培养基更换之后添加Wnt信号转导途径抑制物质。
步骤(2)中使用的培养基(基础培养基)没有特别限制,可以适当选择上述定义部分中描述的基础培养基。步骤(2)中使用的培养基可以是含血清培养基或无血清培养基。为了避免化学不确定组分的污染,优选在本发明中使用无血清培养基。为了避免复杂的制备,例如,优选使用补充有适当量的市售血清替代品例如KSR等的无血清培养基(例如,IMDM和F-12的1∶1混合物的培养基,其中添加10%KSR,450μM 1-硫代甘油和1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated),或GMEM培养基,其补充有5%-20%KSR,NEAA,丙酮酸,2-巯基乙醇)。在人多能干细胞的情况下加入无血清培养基中的KSR的量通常为约1%至约30%,优选约2%至约20%(例如,约5%,约10%)。
步骤(2)中使用的培养基含有Wnt信号转导途径抑制物质。在步骤(1)中,用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质处理多能干细胞,并且在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质的培养基(优选无血清培养基)中悬浮培养以形成细胞聚集体,由此进一步提高聚集体的质量,并且可以高效地形成维持未分化状态的细胞聚集体和适于分化成视网膜细胞的聚集体。由此获得的细胞聚集体预期显示出例如球形并具有光滑表面,未塌陷形状和致密内部的特征。
步骤(2)中使用的Wnt信号转导途径抑制物质没有特别限制,只要其可以抑制由Wnt介导的信号转导,并且可以是蛋白质,核酸,低分子量化合物等中的任何一种。由Wnt介导的信号通过Wnt受体转导,所述Wnt受体以卷曲蛋白(Fz)和LRP5/6(低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6)的异二聚体存在。Wnt信号转导途径抑制物质的实例包括但不限于直接作用于Wnt或Wnt受体的物质(抗Wnt中和抗体,抗Wnt受体中和抗体等),抑制编码Wnt或Wnt受体的基因的表达的物质(例如,反义寡核苷酸,siRNA等),抑制Wnt受体和Wnt结合的物质(可溶性Wnt受体,显性阴性Wnt受体等,Wnt拮抗剂,Dkk1,Cerberus蛋白等),和抑制由Wnt受体信号转导引起的生理活动的物质[低分子量化合物例如CKI-7(N-(2-氨基乙基)-5-氯异喹啉-8-磺酰胺),D4476(4-[4-(2,3-二氢-1,4-苯丙二噁英-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺),IWR-1-endo(IWRle)(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-六氢-1,3-二氧代-4,7-甲桥-2H-异吲哚-2-基]-N-8-喹啉基-苯甲酰胺),及IWP-2(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫代]乙酰胺)等等]等。可以含有这些中的一种或多种作为Wnt信号转导途径抑制物质。CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2等是已知的Wnt信号转导途径抑制物质,可以适当地获得市售产品等。IWR1e优选用作Wnt信号转导途径抑制物质。
Wnt信号转导途径抑制物质的浓度仅需要是能够诱导形成良好细胞聚集体的浓度。例如,将IWR-1-endo添加至培养基中,使得浓度为约0.1μM至约100μM,优选约0.3μM至约30μM,更优选约1μM至约10μM,进一步优选约3μM。当使用除IWR-1-endo之外的Wnt信号转导途径抑制物质时,理想的是以表现出与上述浓度的IWR-1-endo相当的Wnt信号转导途径抑制活性的浓度使用。
向培养基中添加Wnt信号转导途径抑制物质的时间没有特别限制,只要可以提供上述效果,但是当较早添加时可以获得更高的效果。从步骤(2)中的悬浮培养开始,通常在6天内,优选在3天内,更优选在1天内,更优选在12小时内,并且进一步优选在步骤(2)中开始悬浮培养时,向培养基中加入Wnt信号转导途径抑制物质。具体地,例如,可以添加加入有Wnt信号转导途径抑制物质的基础培养基,或者将部分或全部培养基更换为基础培养基。虽然步骤(2)中用Wnt信号转导途径抑制物质处理步骤(1)中获得的细胞的时间没有特别限制,只要可以实现上述效果,优选地,当步骤(2)中开始悬浮培养时添加该物质至培养基中,作用直至步骤(2)结束(在加入BMP信号转导途径活化物质之前)。进一步优选地,如后所述,即使在步骤(2)完成之后(即,在步骤(3)的时间段期间),细胞也连续暴露于Wnt信号转导途径抑制物质。在一个实施方案中,如稍后所述,甚至在完成步骤(2)之后(即,在步骤(3)的时期期间),Wnt信号转导途径抑制物质可以被允许连续起作用,直到形成神经上皮组织和/或神经组织。可以通过上述方法确认神经上皮组织和/或神经组织的形成。
为了形成聚集体,首先进行步骤(1)中获得的细胞的分散操作以得到分散的细胞。通过分散操作获得的“分散细胞”是指例如不少于70%的细胞是单细胞而不超过30%的细胞是2-50个细胞的团块的状态。优选地,作为分散细胞,可以提及不少于80%的细胞是单细胞,不超过20%的细胞是2-50个细胞的团块的状态。分散的细胞是指几乎没有细胞相互黏附的状态(例如,平面附着)。在一些实施方案中,分散的细胞是指几乎没有细胞-细胞连接(例如,黏合结合)的状态。
步骤(1)中获得的细胞的分散操作可包含上述机械分散处理,细胞分散溶液处理和细胞保护剂处理。这些处理可以组合进行。优选地,细胞分散溶液处理与细胞保护剂处理同时进行,然后进行机械分散处理。
作为用于细胞保护剂处理的细胞保护剂,可以提及FGF信号转导途径活化物质,血清和血清替代物。此外,作为抑制由分散诱导的多能干细胞的细胞死亡(特别是人多能干细胞的细胞死亡)的细胞保护剂,可以添加Rho相关的卷曲螺旋激酶(ROCK)抑制剂或肌球蛋白抑制剂。为了抑制由分散诱导的多能干细胞(特别是人多能干细胞)的细胞死亡并保护细胞,可以从第二步骤培养开始添加Rho相关的卷曲螺旋激酶(ROCK)抑制剂或肌球蛋白抑制剂。作为ROCK抑制剂,可以提及Y-27632,法舒地尔(HA1077),H-1152等。作为肌球蛋白抑制剂,可以提及布雷他汀(Blebbistatin)。
作为用于细胞分散溶液处理的细胞分散液,可以提及含有任何酶(例如胰蛋白酶,胶原酶,透明质酸酶,弹性蛋白酶,链霉蛋白酶,DNA酶,木瓜蛋白酶等)以及螯合剂(例如乙二胺四乙酸等)的溶液。还可以使用市售的细胞分散溶液,例如TrypLE Select(LifeTechnologies制造)和TrypLE Express(Life Technologies制造)。
作为机械分散处理的方法,可以提及移液处理或通过刮刀的刮擦。
将分散的细胞悬浮在上述培养基中。例如,将分散的细胞悬浮在含有Wnt信号转导途径抑制物质(和必要时的细胞保护剂例如ROCK抑制剂等)的无血清培养基中,由此用Wnt信号转导途径抑制物质的处理从步骤(2)中的悬浮培养开始是可能的。
然后,将分散细胞的悬浮液接种在上述培养容器中,并将分散的细胞在不黏附于培养容器的条件下培养,从而聚集多个细胞以形成聚集体。
在这种情况下,通过将分散的细胞接种在比较大的培养容器如10cm培养皿中,可以在一个培养容器中同时形成多个细胞聚集体。但是,在这种情况下,聚合体的大小会有所不同。因此,例如,将给定数量的分散细胞置于多孔板(U形底部,V形底部,M形底部)(例如96孔微孔板)的每个孔中,并进行静态培养,由此细胞在每个孔中快速聚集形成一个聚集体。从多个孔中回收聚集体,由此可以获得均匀的聚集体的群体。
可以适当地设定步骤(2)中的细胞浓度,从而可以更均匀和有效地形成细胞聚集体。例如,当使用96孔微孔板将人细胞(例如,步骤(1)中从人iPS获得的细胞)悬浮培养时,将制备的液体(达到约1x 103细胞至约1x 105细胞,优选约3x 103细胞至约5x 104细胞,更优选约4x 103细胞至约2x 104细胞,进一步优选约4x 103细胞至约1.6x 104细胞,进一步更优选约8x 103细胞至约1.2x 104细胞/孔)添加到这些孔中,并将该板静置以形成聚集体。
可以适当地确定步骤(2)中的培养温度和CO2浓度等培养条件。培养温度为例如约30℃至约40℃,优选约37℃。CO2浓度为例如约1%至约10%,优选约5%。
在步骤(2)中,当执行培养基更换操作时,可以提及例如,添加新培养基而不丢弃现有培养基的操作(培养基添加操作),丢弃大约一半量的现有培养基(现有培养基体积的约30-90%,例如,40-60%)并添加约一半量的新鲜培养基(现有培养基体积的约30-90%,例如,40-60%)的操作(半培养基更换操作),放弃约全部量的现有培养基(不少于现有培养基的量的90%)并添加全部量的新鲜培养基(不少于现有培养基的量的90%)的操作(全培养基更换操作)。
当在特定时间点添加特定组分(例如,诱导分化因子)时,可以进行例如,计算最终浓度的操作,丢弃大约一半量的现有培养基并添加约一半量的含有浓度高于最终浓度(特别是最终浓度的1.5倍-3.0倍,例如,最终浓度的约2倍)的特定组分的新鲜培养基的操作(半培养基更换操作,半培养基更换)。
当在某个时间点维持现有培养基中的特定组分的浓度时,则例如,可以进行操作以丢弃约一半量的现有培养基并添加约一半量的含有与现有培养基相同的浓度该特定组分的新鲜培养基。
当在某个时间点通过稀释来降低现有培养基中包含的组分的浓度时,例如,可以每天多次进行培养基更换操作,优选1小时内多次(例如,2-3次)。此外,当在某个时间点通过稀释来降低现有培养基中包含的组分的浓度时,可以将细胞或聚集体转移到另一个培养容器中。
虽然用于培养基更换操作的工具没有特别限制,但是例如,可以提及移液管,微量移液管,多通道微量移液管,连续分配器等。例如,当96孔板用作培养容器时,可以使用多通道微量移液管。
形成细胞聚集体所需的悬浮培养时间可根据使用的细胞适当确定,以使细胞均匀聚集。为了形成均匀的细胞聚集体,期望尽可能短。分散的细胞形成细胞聚集体的步骤可分为聚集细胞的步骤和从聚集的细胞形成细胞聚集体的步骤。在人多能干细胞(例如,步骤(1)中从人iPS获得的干细胞)的情况下在接种分散的细胞(即,在悬浮培养开始时)以聚集细胞的步骤中,例如聚集的细胞优选在约24小时内形成,更优选在约12小时内形成。在人多能干细胞(例如人iPS细胞)的情况下从分离的细胞接种的时间点(即,悬浮培养开始的时间)到形成聚集体的时间段,例如优选在约72小时内,更优选在约48小时内形成聚集体。通过控制用于聚集细胞的工具,离心条件等,可以适当地调节细胞聚集体形成的时间。
细胞聚集体的形成及其均匀性可以基于以下来确定:聚集体的大小和细胞数,宏观形态,显微镜形态和通过组织染色分析的均匀性,用于分化和未分化状态的标志物的表达及其均一性,分化标记物的表达的对照及其同步性,聚集体之间分化效率的再现性等。
在聚集体形成后,可以将聚集体原样连续培养。步骤(2)中悬浮培养的时间通常为24小时-6天,优选24小时-3天,进一步优选约24小时-48小时。
在一个实施方案中,步骤(2)中使用的培养基可以进一步含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质。在步骤(1)中,用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径活化物质处理多能干细胞,并且在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的培养基(优选无血清培养基)中悬浮培养以形成细胞聚集体,由此期待进一步提高聚集体的质量,并且可以高效地形成维持未分化状态(例如球形的,光滑表面的,未塌陷的和致密内部的细胞聚集体,其维持未分化特性)的细胞聚集体。
作为Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,可以使用上述那些。优选地,Sonichedgehog信号转导途径活化物质是SAG,嘌吗啡胺(Purmorphamine,PMA)或Shh蛋白。在一个实施方案中,可以在步骤(2)中使用与步骤(1)中使用的相同种类的Sonic hedgehog信号转导途径活化物质。培养基中的Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的浓度可以适当地确定为落入能够实现上述效果的范围内。在步骤(2)中SAG的使用浓度通常为1-2000nM,优选10nM-1000nM,更优选10nM-700nM,进一步优选50nM-700nM,进一步优选100nM-600nM,进一步优选100nM-500nM。在另一个实施方案中,在步骤(2)中,SAG的使用浓度通常为1-2000nM,优选3nM-100nM,更优选5nM-50nM,进一步优选10nM-30nM。在步骤(2)中,PMA的使用浓度通常为0.002-20μM,优选0.02-2μM。在步骤(2)中,Shh蛋白质的使用浓度通常为20-1000ng/ml,优选50-300ng/ml。当使用除SAG,PMA,Shh蛋白之外的Sonic hedgehog信号转导途径活化物质时,理想的是使用显示与上述浓度(例如,5nM-50nM)的SAG相当的Sonic hedgehog信号转导促进活性的浓度。
向培养基中添加Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的时间没有特别限制,只要可以提供上述效果,但是当较早添加时可以获得更高的效果。从步骤(2)中的悬浮培养开始,通常在6天内,优选在3天内,更优选在1天内,更优选在12小时内,并且进一步优选在步骤(2)中开始悬浮培养时,向培养基中加入Sonic hedgehog信号转导途径活化物质。Sonichedgehog信号转导途径活化物质可以在培养基中包含持续任何时间(例如,约24小时,约48小时,直至步骤(2)结束)直至步骤(2)完成(在BMP信号转导途径活化物质加入之前)。在一个实施方案中,在步骤(2)中Sonic hedgehog信号转导途径活化物质与Wnt信号转导途径抑制物质同时加入并含在培养基中持续相同的时间(例如,直到步骤(2)结束)。
在一个实施方案中,步骤(2)中使用的培养基可以进一步含有TGFβ信号转导途径抑制物质。在步骤(1)中,用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质处理多能干细胞,并且在第二步骤中,将第一步骤中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质和TGFβ家族信号转导途径抑制物质的培养基(优选无血清培养基)中或在含有Wnt信号转导途径抑制物质,Sonic hedgehog信号转导途径活化物质和TGFβ家族信号转导途径抑制物质的培养基(优选无血清培养基)中悬浮培养以形成细胞聚集体,由此期待进一步提高聚集体的质量,并且可以高效地形成维持未分化状态(例如球形的,光滑表面的,未塌陷的和致密内部的细胞聚集体,其维持未分化特性)的细胞聚集体。
作为TGFβ信号转导途径抑制物质,可以使用上述那些。优选地,TGFβ信号转导途径抑制物质是SB431542或A83-01。在一个实施方案中,可以在步骤(2)中使用与步骤(1)中使用的相同种类的TGFβ信号转导途径抑制物质。培养基中的TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度可以适当地确定为落入能够实现上述效果的范围内。SB431542的使用浓度通常为0.1-200μM,优选2-50μM,更优选3-10μM。A-83-01的使用浓度通常为0.05-50μM,优选0.5-5μM。当使用除SB431542或A-83-01之外的TGFβ信号转导途径抑制物质时,理想的是以表现出与上述浓度的SB431542相当的TGFβ信号转导途径抑制活性的浓度使用。
向培养基中添加TGFβ信号转导途径抑制物质的时间没有特别限制,只要可以提供上述效果,但是当较早添加时可以获得更高的效果。从步骤(2)中的悬浮培养开始,通常在6天内,优选在3天内,更优选在1天内,更优选在12小时内,并且进一步优选在步骤(2)中开始悬浮培养时,向培养基中加入TGFβ信号转导途径抑制物质。在步骤(2)中,TGFβ信号转导途径抑制物质在培养基中包含持续任何时间(例如,约24小时,约48小时,直至步骤(2)结束)直至步骤(2)完成(在BMP信号转导途径活化物质加入之前)。在一个实施方案中,TGFβ信号转导途径抑制物质与Wnt信号转导途径抑制物质同时加入并含在培养基中持续相同的时间(例如,直到步骤(2)结束)。
步骤(2)中使用的培养基可以基本上不含TGFβ信号转导途径抑制物质。在本说明书中,当步骤(1)中使用的培养基含有TGFβ信号转导途径抑制物质时,以及当在培养基更换(例如,约全部量的培养基更换)期间从步骤(1)至步骤(2)转移的TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度时被抑制到其生物活性(即,TGFβ信号转导途径抑制活性)不表达的水平(例如,对于SB431542不超过5nM)时,它可以被认为是基本上不含TGFβ信号转导途径抑制物质的培养基。在本说明书中,除了TGFβ信号转导途径抑制物质之外的物质也被类似地解释。例如,通过不含TGFβ信号转导途径抑制物质的培养基的培养基更换操作,将来自步骤(1)的TGFβ信号转导途径抑制物质(例如SB431542)的携带抑制到步骤(1)中使用的培养基中的TGFβ信号转导途径抑制物质(例如SB431542)的浓度的不超过3%,优选不超过1%,不超过0.3%,不超过0.1%,不超过0.03%,或不超过0.01%,并且TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度时被抑制到其生物活性(即,TGFβ信号转导途径抑制活性)不表达的水平(例如,对于SB431542不超过5nM)时,由此可以获得基本上不含TGFβ信号转导途径抑制物质的培养基。在培养基更换(例如,大约总量的培养基更换)期间,培养基中的组分携带至新鲜介质可以通过除去旧培养基并用新鲜培养基预先洗涤细胞和培养容器一次或多次而被抑制到最小。
步骤(2)中使用的培养基可以基本上不含Sonic hedgehog信号转导途径活化物质。在本说明书中,当步骤(1)中使用的培养基含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质时,以及当在培养基更换(例如,约全部量的培养基更换)期间从步骤(1)至步骤(2)转移的Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的浓度时被抑制到其生物活性(即,Sonichedgehog信号转导途径活化)不表达的水平(例如,对于SAG不超过0.03nM)时,它可以被认为是基本上不含Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的培养基。例如,通过不含Sonichedgehog信号转导途径活化物质的培养基的培养基更换操作,将来自步骤(1)的Sonichedgehog信号转导途径活化物质(例如SAG)的携带抑制到步骤(1)中使用的培养基中的Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如SAG)的浓度的不超过3%,优选不超过1%,不超过0.3%,不超过0.1%,不超过0.03%,或不超过0.01%,并且Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的浓度时被抑制到其生物活性(即,Sonic hedgehog信号转导途径活化)不表达的水平(例如,对于SAG不超过0.03nM)时,由此可以获得基本上不含Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的培养基。在培养基更换(例如,大约总量的培养基更换)期间,培养基中的组分携带至新鲜介质可以通过除去旧培养基并用新鲜培养基预先洗涤细胞和培养容器一次或多次而被抑制到最小。
在优选的实施方案中,在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的人细胞(例如,步骤(1)中从人iPS细胞获得的细胞)在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)的无血清培养基中进行悬浮培养以形成聚集体。培养基可以进一步含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,SAG,PMA,Shh蛋白)和/或TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,Lefiy,SB431542,A-83-01)。添加Wnt信号转导途径抑制物质的时间和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质和/或TGFβ信号转导途径抑制物质的添加时间可以相同或不同。优选地,从悬浮培养开始时起,Wnt信号转导途径抑制物质,Sonic hedgehog信号转导途径活化物质和/或TGFβ信号转导途径抑制物质优选都包含在培养基中。还可以将ROCK抑制剂(例如,Y-27632)添加到培养基中。步骤(2)中培养的时间为24小时-6天,优选24小时-48小时。形成的聚集体优选是均匀的聚集体。
例如,回收步骤(1)中获得的人细胞(例如,从步骤(1)中的人iPS细胞获得的细胞),在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,SAG,PMA,Shh蛋白)和/或TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01)的无血清培养基中分散成单细胞或其接近状态并进行悬浮培养。无血清培养基可含有ROCK抑制剂(例如,Y-27632)。将人多能干细胞(例如,人iPS细胞)的悬浮液接种在上述培养容器中,并且在它们对培养容器不黏附的条件下培养分散的多能干细胞,由此多个多能干细胞是组装形成聚集体。步骤(2)中培养的时间为24小时-6天,优选24小时-48小时。形成的聚集体优选是均匀的聚集体。
在一个优选的实施方案中,在步骤(1)中,在含有TGFβ信号转导途径抑制物质并含有或不含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如SAG,PMA,Shh蛋白)的培养基中培养多能干细胞(优选黏附培养),并且在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)并且含有或不含有Sonic hedgehog信号转导途径的活化物质(例如,SAG,PMA,Shh蛋白)和/或TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01)的培养基中进行悬浮培养。优选地,SB431542可用作步骤(1)中的TGFβ信号转导途径抑制物质。步骤(2)中培养的时间为24小时-6天,优选24小时-48小时。形成的聚集体优选是均匀的聚集体。
在一个优选的实施方案中,在步骤(1)中,在含有BMP信号转导途径抑制物质并含有或不含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如SAG,PMA,Shh蛋白)的培养基中培养多能干细胞(优选黏附培养),并且在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)并且含有或不含有Sonic hedgehog信号转导途径的活化物质(例如,SAG,PMA,Shh蛋白)和/或TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01)的培养基中进行悬浮培养。优选地,LDN193189或Dorsomorphin,更优选LDN193189,可用作步骤(1)中的BMP信号转导途径抑制物质。步骤(2)中培养的时间为24小时-6天,优选24小时-48小时。形成的聚集体优选是均匀的聚集体。
在一个优选的实施方案中,在步骤(1)中,在含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质并含有或不含有TGFβ信号转导途径抑制物质和/或BMP信号转导途径抑制物质的培养基中培养多能干细胞(优选黏附培养),并且在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)并且含有或不含有Sonic hedgehog信号转导途径的活化物质(例如,SAG,PMA,Shh蛋白)和/或TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01)的培养基中进行悬浮培养。优选地,SAG可以用作步骤(1)中的Sonic hedgehog信号转导途径活化物质。步骤(2)中培养的时间为24小时-6天,优选24小时-48小时。形成的聚集体优选是均匀的聚集体。
在一个优选的实施方案中,在步骤(1)中,在含有以下的培养基中培养(优选地,黏附培养)多能干细胞(例如,人多能干细胞):TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01),Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01),BMP信号转导途径抑制物质(例如,LDN193189),或其组合(例如,SB431542和LDN193189)等);Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,Shh蛋白,SAG,PMA);或TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如Lefty,SB431542,A-83-01,LDN193189)和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如Shh蛋白,SAG,PMA)的组合,并且在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在含有以下的培养基中进行悬浮培养:Wnt信号转导途径抑制物质(如CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(如SAG,PMA,Shh蛋白)(在一个实施方案,不含TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,A-83-01,Lefty))或Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2),Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,SAG,PMA,Shh蛋白)和TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,A-83-01,Lefty)。步骤(2)中培养的时间为24小时-6天,优选24小时-48小时。形成的聚集体优选是均匀的聚集体。
在另一个优选的实施方案中,在步骤(1)中,在含有以下的培养基中培养(优选地,黏附培养)多能干细胞(例如,人多能干细胞):TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01),Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01),BMP信号转导途径抑制物质(例如,LDN193189),或其组合(例如,SB431542和LDN193189)等);Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,Shh蛋白,SAG,PMA);或TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如Lefty,SB431542,A-83-01,LDN193189)和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如Shh蛋白,SAG,PMA)的组合,并且在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在以下培养基中进行悬浮培养:在不含Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(如SAG,PMA,Shh蛋白)但含有Wnt信号转导途径抑制物质(如CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)的培养基中;在不含Sonichedgehog信号转导途径活化物质(如SAG,PMA,Shh蛋白)或TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,A-83-01,Lefty)但含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)的培养基中;或在不含Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,SAG,PMA,Shh蛋白)但含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e)和TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,A-83-01,Lefty)的培养基中。步骤(2)中培养的时间为24小时-6天,优选24小时-48小时。形成的聚集体优选是均匀的聚集体。
在另一个实施方案中,在步骤(1)中,在含有TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如Lefty,SB431542,A-83-01,LDN193189)和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如Shh蛋白,SAG,PMA)的组合的培养基中培养(优选,黏附培养)多能干细胞(例如,人多能干细胞)18小时-30小时(例如,约24小时),之后进一步在含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(如Shh蛋白,SAG,PMA)的培养基中培养(优选,黏附培养)18小时-30小时(例如,约24小时),并且在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在以下培养基中进行悬浮培养:在不含Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(如SAG,PMA,Shh蛋白)但含有Wnt信号转导途径抑制物质(如CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)的培养基中;在不含Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(如SAG,PMA,Shh蛋白)或TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,A-83-01,Leftv)但含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)的培养基中;或在不含Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,SAG,PMA,Shh蛋白)但含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e)和TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,A-83-01,Lefty)的培养基中。步骤(2)中培养的时间为24小时-6天,优选24小时-48小时。形成的聚集体优选是均匀的聚集体。
在另一个实施方案中,在步骤(1)中,在含有TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如Lefty,SB431542,A-83-01,LDN193189)和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如Shh蛋白,SAG,PMA)的组合的培养基中培养(优选,黏附培养)多能干细胞(例如,人多能干细胞)18小时-30小时(例如,约24小时),之后进一步在含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(如Shh蛋白,SAG,PMA)的培养基中培养(优选,黏附培养)18小时-30小时(例如,约24小时),并且在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)并且含有或不含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如SAG,PMA,Shh蛋白)和/或TGFβ信号转导途径抑制物质(如Lefty,SB431542,A-83-01)的培养基中进行悬浮培养。步骤(2)中培养的时间为24小时-6天,优选24小时-48小时。形成的聚集体优选是均匀的聚集体。
在任何实施方案中,步骤(2)中的培养基优选含有ROCK抑制物质(例如,Y-27632)。
通过以这种方式进行步骤(2),形成步骤(1)中获得的细胞的聚集体或由其衍生的细胞。本发明还提供了产生这种聚集体的方法。步骤(2)中获得的聚集体具有比在步骤(1)中不进行用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质处理时形成的聚集体更高的质量。具体而言,例如,可以获得具有高比率的具有光滑表面、致密内部和未塌陷形状的球形细胞聚集体的聚集体群。在一个实施方案中,当从第二步骤开始的第6天随机选择聚集体(例如,不少于100个聚集体)时,未塌陷的聚集体和/或非囊性聚集体的比率的总和例如不小于70%,优选不小于80%。
步骤(2)中获得的聚集体具有分化成视网膜细胞或视网膜组织(例如视网膜组织,视网膜祖细胞或视网膜层特异性神经细胞)的效力。
在一个实施方案中,通过使用步骤(1)中获得的并在步骤(2)中具有分化成至少视网膜细胞或视网膜组织(例如,视网膜组织,视网膜祖细胞或视网膜层特异性神经细胞)的潜力的干细胞(例如,具有分化成至少视网膜细胞或视网膜组织(例如视网膜组织,视网膜祖细胞或视网膜层特异性神经细胞)的潜力的Oct3/4阳性干细胞),可以获得含有干细胞(优选Oct3/4阳性干细胞)的聚集体,所述干细胞具有分化成至少视网膜细胞或视网膜组织(例如,视网膜组织,视网膜祖细胞或视网膜层特异性神经细胞)的潜力。通过在适当的分化条件下培养步骤(2)中获得的聚集体,可以高效诱导视网膜细胞和视网膜组织。
在一个实施方案中,步骤(2)中获得的聚集体含有对应于在步骤(1)完成时获得的维持多能样特性的细胞(具体地,表达Oct3/4)与视网膜细胞或视网膜组织之间的中间阶段细胞的细胞。这些细胞表达以下中的任何:(i)多能特性标志物Oct3/4,和(ii)前述视网膜细胞标志物(Rx,PAX6,Chx10,Crx,Blimp1)和/或前述视网膜层特异性神经细胞标志物。即,在一个实施方案中,步骤(2)中获得的聚集体含有表达以下任一项的细胞的混合物:(i)多能特性标志物Oct3/4,和(ii)前述视网膜细胞标志物(Rx,PAX6,Chx10,Crx,Blimp1)和/或前述视网膜层特异性神经细胞标志物。也就是说,步骤(2)中获得的聚集体含有具有至少分化成视网膜细胞或视网膜组织和/或视网膜细胞或视网膜组织的祖细胞的能力的于细胞。祖细胞的特征在于,当它们在已知的适当培养条件下培养时,它们显示出表达上述视网膜细胞或视网膜层特异性神经细胞标志物的能力(本领)。因此,在一个实施方案中,步骤(2)中获得的聚集体含有Oct3/4阳性干细胞,其具有分化成至少视网膜细胞或视网膜组织和/或视网膜细胞或视网膜组织的祖细胞的能力。步骤(2)中获得的聚集体中包含的细胞的一部分可以表达上述视网膜层特异性细胞标志物。在一个实施方案中,步骤(2)中获得的聚集体可含有Oct3/4阳性细胞,其比例不小于总细胞的50%,例如不小于70%。
2-3.步骤(3)
说明步骤(3),其中从步骤(2)中获得的聚集体诱导含有视网膜细胞或视网膜组织的聚集体。
步骤(3)中使用的培养基(基础培养基)没有特别限制,可以适当选择上述定义中描述的基础培养基。步骤(3)中使用的培养基是例如补充有BMP信号转导途径活化物质的无血清培养基或含血清培养基(优选无血清培养基)。
用于这种培养基的无血清培养基或含血清培养基不受特别限制,只要其如上所述即可。为了避免复杂的制备,例如,优选使用补充有适当量的市售血清替代品例如KSR等的无血清培养基(例如,IMDM和F-12的1∶1混合物的培养基,其补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油和1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated))。在人多能干细胞(例如iPS细胞)的情况下,加入无血清培养基中的KSR的量通常为约1%至约20%,优选约2%至约20%。
作为步骤(3)中使用的培养基(优选无血清培养基),可以直接使用步骤(2)中使用的培养基(优选无血清培养基),或者可以用新鲜培养基(优选无血清培养基)替换。当将步骤(2)中使用的不含BMP信号转导途径物质的无血清培养基直接用于步骤(3)时,可以向培养基中加入BMP信号转导途径活化物质。
步骤(3)中使用的BMP信号转导途径活化物质的实例包括BMP蛋白例如BMP2,BMP4,BMP7等,GDF蛋白例如GDF7等,抗BMP受体抗体,BMP部分肽等。BMP2蛋白,BMP4蛋白和BMP7蛋白可以从例如R&D Systems获得,GDF7蛋白可以从例如Wako Pure Chemical Industries,Ltd.获得。BMP信号转导途径活化物质优选是BMP4。
BMP信号转导途径活化物质的浓度可以是可以诱导形成多能干细胞聚集体的细胞分化成视网膜细胞的浓度。例如,在人BMP4的情况下,将其加入培养基中至约0.01nM至约1μM,优选约0.1nM至约100nM,更优选约1nM至约10nM,进一步优选约1.5nM(55ng/mL)的浓度。当使用除BMP4之外的BMP信号转导途径活化物质时,理想的是使用与上述浓度的BMP4相当的BMP信号转导促进活性的浓度。
在步骤(3)期间,培养基中BMP信号转导途径活化物质的浓度可以变化。例如,在步骤(3)开始时,提供BMP信号转导途径活化物质在上述范围内,并且浓度可以以每2-4天40-60%的比例逐渐或逐步降低。在一个实施方案中,从步骤(3)开始,用给定浓度(例如,约1.5nM)的BMP信号转导途径活化物质培养细胞给定时间(例如,4-10天),并且浓度可以以每2-4天40-60%的比例逐渐或逐步降低。
BMP信号转导途径活化物质仅需要在步骤(2)中的悬浮培养开始后约24小时或更晚之后添加,并且还可以从悬浮培养开始的若干天(例如,15天内)之后添加到培养基中。优选地,将BMP信号转导途径活化物质在从步骤(2)中的悬浮培养开始的第1天和第15天之间,更优选第1天和第9天之间,第1天和第8天之间,第1天和第7天之间,第1天和第6天之间,第1天和第5天之间或第1天和第4天之间,更优选第1天和第3天之间的任何时间点添加到培养基中。在本说明书中,“从步骤(2)中的悬浮培养开始起N天”是指从步骤(2)中的悬浮培养开始后N天(N×24小时后)到N+1天的进展前((N+1)x 24小时)的时间。例如,从步骤(2)中的悬浮培养开始起2天是指从作为标准的步骤(2)中的悬浮培养开始起48小时,直到72小时的进展前。
在一个具体实施方案中,在步骤(2)中的悬浮培养开始后例如在第1-9天,优选第1-3天,可以用含有BMP4的培养基部分或全部更换培养基以将BMP4的终浓度调节至约1-10nM,并且细胞可以在BMP4存在下培养例如约1-12天,优选2-9天,更优选2-5天。为了将BMP4的浓度保持在相同水平,可以用含有BMP4的培养基将培养基部分或全部更换一次或两次。或者,如上所述,BMP4的浓度也可逐步降低。
在向培养基中添加BMP信号转导途径活化物质并开始将形成聚集体的细胞分化诱导为视网膜细胞后,不需要向培养基中添加BMP信号转导途径活化物质,并且培养基可以用不含BMP信号转导途径活化物质的无血清培养基或含血清培养基更换。在一个实施方案中,在分化诱导为视网膜细胞开始后,通过用各自不含BMP信号转导途径活化物质的无血清培养基或含血清培养基更换培养基,培养基中BMP信号转导途径活化物质的浓度以每2-4天40-60%的比例逐渐或逐步降低。已经开始诱导分化为视网膜细胞的细胞可以通过例如检测细胞中视网膜祖细胞标志基因(例如,Rx基因(别名Rax),Pax6基因,Chx10基因)的表达来确认。将通过使用多能干细胞(其中荧光报告蛋白基因例如GFP等被敲入Rx基因座中)在步骤(2)中形成的聚集体在分化诱导为视网膜细胞所需浓度的BMP信号转导途径活化物质的存在下在悬浮液中培养,并且检测从表达的荧光报告蛋白发出的荧光,从而也可以确认开始向视网膜细胞分化诱导的时间点。作为步骤(3)的一个实施方案,可以提及以下步骤:将步骤(2)中形成的聚集体在含有分化诱导为视网膜细胞所必需的浓度的BMP信号转导途径活化物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养,直到表达视网膜祖细胞标志基因(例如,Rx基因,Pax6基因,Chx10基因)的细胞开始出现,从而获得包含视网膜祖细胞的聚集体。
在步骤(3)中,当执行培养基更换操作时,可以提及例如,添加新培养基而不丢弃现有培养基的操作(培养基添加操作),丢弃大约一半量的现有培养基(现有培养基体积的约40-80%)并添加约一半量的新鲜培养基(现有培养基体积的40-80%)的操作(半培养基更换操作),放弃约全部量的现有培养基(不少于现有培养基的量的90%)并添加全部量的新鲜培养基(不少于现有培养基的量的90%)的操作(全培养基更换操作)。
当在特定时间点添加特定组分(例如,BMP4)时,可以进行例如,计算最终浓度的操作,丢弃大约一半量的现有培养基并添加约一半量的含有浓度高于最终浓度(特别是最终浓度的1.5倍-3.0倍,例如,最终浓度的约2倍)的特定组分的新鲜培养基的操作(半培养基更换操作,半培养基更换)。
当有待在某个时间点维持现有培养基中的特定组分的浓度时,则例如,可以进行操作以丢弃约一半量的现有培养基并添加约一半量的含有与现有培养基相同的浓度该特定组分的新鲜培养基。
当在某个时间点通过稀释来降低现有培养基中包含的组分的浓度时,例如,可以每天多次进行培养基更换操作,优选1小时内多次(例如,2-3次)。此外,当在某个时间点通过稀释来降低现有培养基中包含的组分的浓度时,可以将细胞或聚集体转移到另一个培养容器中。
虽然用于培养基更换操作的工具没有特别限制,但是例如,可以提及移液管,微量移液管,多通道微量移液管,连续分配器等。例如,当96孔板用作培养容器时,可以使用多通道微量移液管。
在一个实施方案中,当步骤(2)中加入到培养基中的Shh信号转导途径活化物质的浓度相对较低时(例如,对于SAG,不超过300nM,优选不超过30nM,进一步优选不超过3nM,并且对于其他Shh信号转导途径活化物质,是赋予等于或低于上述浓度的SAG的Shh信号转导促进活性的浓度),不需要培养基更换,并且可以将BMP信号转导作用物质(例如BMP4)加入到步骤(2)中使用的培养基中。另一方面,当Shh信号转导途径活化物质的浓度相对较高时(例如,对于SAG,超过700nM或不小于1000nM,并且对于其他Shh信号转导途径活化物质,是赋予等于上述浓度的SAG的Shh信号转导促进活性的浓度),理想的是当加入BMP信号转导作用物质时将培养基更换为含有BMP信号转导作用物质(例如BMP4)且不含Shh信号转导途径活化物质的新鲜培养基以抑制Shh信号转导途径活化物质的影响。
在一个优选的实施方案中,有待在步骤(3)中使用的培养基中Shh信号转导途径活化物质的浓度是不对选择性分化成视网膜祖细胞或视网膜组织产生不利影响的浓度。具体地,当根据SAG的Shh信号转导促进活性计算时,所述浓度不超过700nM,优选不超过300nM,更优选不超过10nM,进一步优选不超过0.1nM,进一步优选基本上没有Shh信号转导途径活化物质。“基本上没有Shh信号转导途径活化物质”的培养基是指培养基,在所述培养基中Shh信号转导途径活化物质的浓度被抑制到其生物活性(即Sonic hedgehog信号转导途径活化)不表达的水平(例如,对于SAG不超过0.03nM)。“不含Shh信号转导途径活化物质”的培养基还包括基本上不补充Shh信号转导途径活化物质的培养基,例如,不补充浓度为表达其生物活性(即,Sonic hedgehog信号转导途径活化)(即对选择性分化成视网膜祖细胞或视网膜组织具有不利影响的浓度)的Shh信号转导途径活化物质的培养基。
在步骤(3)中,步骤(2)中获得的聚集体在存在或不存在Wnt信号转导途径抑制物质的情况下在含有BMP信号转导途径活化物质(例如,BMP4)的培养基(优选无血清培养基)中培养。也就是说,除了BMP信号转导途径活化物质(例如BMP4)之外,步骤(3)中使用的培养基可以含有或不含有Wnt信号转导途径抑制物质。在优选的实施方案中,步骤(2)中获得的聚集体在存在Wnt信号转导途径抑制物质的情况下在含有BMP信号转导途径活化物质(例如,BMP4)的培养基(优选无血清培养基)中培养。即,在该实施方案中,步骤(3)中使用的培养基(优选无血清培养基)含有BMP信号转导途径活化物质(例如BMP4)和Wnt信号转导途径抑制物质。
作为Wnt信号转导途径抑制物质,可以使用任何上述Wnt信号转导途径抑制物质。优选地,在步骤(3)中使用与步骤(2)中相同种类的Wnt信号转导途径抑制物质。
Wnt信号转导途径抑制物质的浓度仅需要是能够诱导视网膜祖细胞和视网膜组织的浓度。例如,将IWR-1-endo添加至培养基中,使得浓度为约0.1μM至约100μM,优选约0.3μM至约30μM,更优选约1μM至约10μM,进一步优选约3μM。当使用除IWR-1-endo之外的Wnt信号转导途径抑制物质时,理想的是以表现出与上述浓度的IWR-1-endo相当的Wnt信号转导途径抑制活性的浓度使用。当步骤(2)的培养基中Wnt信号转导途径抑制物质的浓度为100时,步骤(3)的培养基中Wnt信号转导途径抑制物质的浓度优选为50-150,更优选为80-120,进一步优选为90-110,并且更优选等于步骤(2)的培养基中Wnt信号转导途径抑制物质的浓度。
向培养基中添加Wnt信号转导途径抑制物质的时间没有特别限制,只要可以形成含有视网膜细胞或视网膜组织的聚集体即可,但更优选早期添加。优选地,在步骤(3)开始时将Wnt信号转导途径抑制物质添加到培养基中。更优选地,在步骤(2)中加入Wnt信号转导途径抑制物质,并且在步骤(3)中(即,从步骤(3)开始时起)也连续地包含在培养基中。进一步优选地,在步骤(2)中的悬浮培养开始时添加Wnt信号转导途径抑制物质,并且在步骤(3)中也连续地包含在培养基中。例如,将BMP信号转导作用物质(例如BMP4)加入到步骤(2)中获得的培养物(在含有Wnt信号转导途径抑制物质的培养基中的聚集体悬浮液)中。
Wnt信号转导途径抑制物质的作用时间没有特别限制,只要可以提供上述效果即可。优选地,当在步骤(2)中开始悬浮培养时添加Wnt信号转导途径抑制物质时,该时间段为2天至30天,更优选6天至20天,8天至18天,10天至18天,或10天至17天(例如,10天),其中以步骤(2)中的悬浮培养开始的时间为起点。在另一个实施方案中,当在步骤(2)中开始悬浮培养时添加Wnt信号转导途径抑制物质时,Wnt信号转导途径抑制物质的作用时间优选为3天至15天(例如,5天,6天,7天),更优选6天至10天(例如,6天),其中以步骤(2)中的悬浮培养开始的时间为起点。
在一个实施方案中,步骤(3)中使用的培养基可以进一步含有TGFβ信号转导途径抑制物质。特别是,当在步骤(2)的悬浮培养中使用含有TGFβ信号转导途径抑制物质的培养基时,也优选在步骤(3)中连续使用含有TGFβ信号转导途径抑制物质的培养基。
作为TGFβ信号转导途径抑制物质,可以使用任何上述TGFβ信号转导途径抑制物质。优选地,在步骤(3)中使用与步骤(2)中使用的TGFβ信号转导途径抑制物质相同种类的那些。
TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度仅需要是能够诱导视网膜祖细胞和视网膜组织的浓度。例如,SB431542通常以0.1-200μM,优选2-50μM,更优选3-10μM的浓度使用。A-83-01通常以0.05-50μM,优选0.5-5μM的浓度使用。当使用除SB431542或A-83-01之外的TGFβ信号转导途径抑制物质时,理想的是以表现出与上述浓度的SB431542相当的TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度使用。当步骤(2)的培养基中TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度为100时,步骤(3)的培养基中TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度优选为50-150,更优选为80-120,进一步优选为90-110。更优选相当于步骤(2)的培养基中TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度。
TGFβ信号转导途径抑制物质在培养基中的添加时间和作用时间没有特别限制,只要可以实现形成含有视网膜细胞或视网膜组织的聚集体即可。当在步骤(2)中开始悬浮培养时添加TGFβ信号转导途径抑制物质时,优选为2天至30天,更优选6天至20天,8天至18天,10天至18天,或10天至17天(例如,10天),其中以步骤(2)中的悬浮培养开始的时间为起点。在一个优选的实施方案中,培养基中TGFβ信号转导途径抑制物质的添加时间和暴露时间与上述Wnt信号转导途径抑制物质的添加时间和作用期相同。即,在该实施方案中,TGFβ信号转导途径抑制物质与Wnt信号转导途径抑制物质同时加入到培养基中并含在培养基中持续与Wnt信号转导途径抑制物质相同的时间。
例如,在步骤(1)中,用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质处理多能干细胞;在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质和TGFβ家族信号转导途径抑制物质的培养基(优选无血清培养基)中或在含有Wnt信号转导途径抑制物质,Sonic hedgehog信号转导途径活化物质和TGFβ家族信号转导途径抑制物质的培养基(优选无血清培养基)中悬浮培养以形成细胞聚集体;并且在步骤(3)中,在含有BMP信号转导途径活化物质(例如,BMP4)的培养基(优选无血清培养基)中,在Wnt信号转导途径抑制物质和TGFβ信号转导途径抑制物质的存在下培养步骤(2)中获得的聚集体。即,在该实施方案中,步骤(3)中使用的培养基(优选无血清培养基)含有BMP信号转导途径活化物质(例如BMP4),TGFβ信号转导途径抑制物质和Wnt信号转导途径抑制物质。
在一个实施方案中,在步骤(3)的悬浮培养后,将步骤(3)的培养基更换为基本上不含外源BMP信号转导作用物质并含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质和血清的培养基并且继续悬浮培养。在步骤(1)中,用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonichedgehog信号转导途径活化物质处理多能干细胞,并且在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在含有或不含有Wnt信号转导途径抑制物质的培养基(优选无血清培养基并任选地还含有TGFβ信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质)中进行悬浮培养以形成聚集体,将步骤(2)中获得的聚集体在含有BMP信号转导途径活化物质(例如BMP4)的培养基(优选无血清培养基和任选地还含有Wnt信号转导途径抑制物质和/或TGFβ信号转导途径抑制物质)中培养给定时间,将培养基更换为基本上不含有外源BMP信号转导作用物质(例如BMP4)包含Sonic hedgehog信号转导途径活化物质和血清的培养基,并且继续培养。即,在该实施方案中,在步骤(3)中培养后,将培养基从含有BMP信号转导途径活化物质(例如BMP4)的培养基(优选无血清培养基和任选地还含有Wnt信号转导途径抑制物质和/或TGFβ信号转导途径抑制物质)更换为基本上不含外源BMP信号转导作用物质并含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质和血清的培养基。
作为血清,可以使用例如,牛血清,牛犊血清,胎牛血清,马血清,马驹血清,马驹胎血清,兔血清,幼兔血清,兔胎血清,人血清等哺乳动物的血清可。血清的加入浓度为约1-30%,优选约3-20%,更优选约10%。在该实施方案中,可以使用适当量的血清替代品例如市售的KSR等代替血清。
作为Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,可以使用任何上述Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,优选SAG。例如,在SAG的情况下,通常以约0.1nM-10μM,优选约10nM-1μM,更优选约100nM的浓度添加。
当将从步骤(3)转移的BMP信号转导作用物质(例如,BMP4)的浓度抑制到其生物活性(即,BMP信号转导作用)不表达的水平(例如,对于BMP4小于0.01nM的浓度)时,可以认为它是基本上不含BMP信号转导作用物质的培养基。例如,通过不含BMP信号转导作用物质的培养基的培养基更换操作,将来自步骤(3)的BMP信号转导作用物质(例如BMP4)的携带抑制到步骤(3)中使用的培养基中的BMP信号转导作用物质(例如BMP4)的浓度的不超过3%,优选不超过1%,不超过0.3%,不超过0.1%,不超过0.03%,或不超过0.01%,并且BMP信号转导作用物质的浓度时被抑制到其生物活性(即,BMP信号转导作用)不表达的水平(例如,BMP4的浓度小于0.01nM),由此可以获得基本上不含BMP信号转导作用物质的培养基。
在一个实施方案中,从悬浮培养开始(步骤(2)),在7天后,更优选在9天(例如10天)后,更换为基本上不含外源BMP信号转导作用物质并含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质和血清的培养基。这里,当开始形成神经上皮时,也可以更换为含有Sonichedgehog信号转导途径活化物质和血清的培养基。通过使用显微镜观察明场图像观察细胞的形态,可以确认神经上皮的形成。在一个实施方案中,在更换为含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质和血清的培养基后,将细胞培养3天至20天,优选5天至15天,7天至10天。
在本发明的方法中,悬浮培养优选在不存在基膜制剂的情况下通过步骤(2)和步骤(3)进行。
可以适当地确定步骤(3)中的培养温度和CO2浓度等培养条件。培养温度为例如约30℃至约40℃,优选约37℃。CO2浓度为例如约1%至约10%,优选约5%。
通过这种培养,将形成步骤(2)中获得的聚集体的细胞诱导分化成视网膜祖细胞,从而可以获得含有视网膜祖细胞的聚集体。本发明还提供了制备这种含有视网膜祖细胞的聚集体的方法。获得包含视网膜祖细胞的聚集体可以通过例如检测聚集体中表达Rax,PAX6或Chx10(其是视网膜祖细胞标志物)的细胞的存在来确认。步骤(3)的一个实施方案时以下步骤:将步骤(2)中形成的聚集体在含有分化诱导为视网膜细胞所必需的浓度的BMP信号转导途径活化物质的无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养,直到表达Rx基因的细胞开始出现,从而获得包含视网膜祖细胞的聚集体。在一个实施方案中,进行步骤(3)的培养直至聚集体中含有的细胞的不少于20%(优选不少于30%,不少于40%,不少于50%,不少于60%,不少于70%,不少于80%,不少于90%)表达Rx。在该实施方案中,表达Rx的细胞优选共表达Chx10。
在一个实施方案中,步骤(3)中获得的聚集体含有视网膜组织并且基本上不含非神经头部外胚层。在上述聚集冷冻切片的免疫染色图像中,在含有视网膜组织且基本上没有非神经头外胚层的聚集体中,例如观察到Rx阳性组织,并且未观察到其外部的Rx阴性组织。
在产生视网膜细胞和/或视网膜组织的优选实施方案中,在步骤(1)中,在含有TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,A-83-01)和bFGF的无血清培养基中,在不存在饲养细胞的情况下黏附培养人多能干细胞(例如人iPS细胞)优选2-96小时,6-72小时,6-60小时,12-60小时,18-60小时,18-48小时或18-28小时(例如24小时),并且在步骤(2),将步骤(1)中获得的细胞在不含或含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如SAG,PMA,Shh蛋白)的无血清培养基中在存在Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWRle),IWP-2)的情况下进行悬浮培养,并在步骤(3)中,将聚集体在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)和BMP信号转导途径活化物质(例如BMP4)的无血清培养基中进行悬浮培养。
在产生视网膜细胞和/或视网膜组织的优选实施方案中,在步骤(1)中,在含有BMP信号转导途径抑制物质(例如,LDN193189)和bFGF的无血清培养基中,在不存在饲养细胞的情况下黏附培养人多能干细胞(例如人iPS细胞)优选2-96小时,6-72小时,6-60小时,12-60小时,18-60小时,18-48小时或18-28小时(例如24小时),并且在步骤(2),将步骤(1)中获得的细胞在不含或含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如SAG,PMA)的无血清培养基中在存在Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)的情况下进行悬浮培养,并在步骤(3)中,将聚集体在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)和BMP信号转导途径活化物质(例如BMP4)的无血清培养基中进行悬浮培养。
在视网膜祖细胞和/或视网膜组织的产生的优选实施方案中,在步骤(1)中,在含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,SAG,PMA)和bFGF的无血清培养基中,在不存在饲养细胞的情况下黏附培养人多能干细胞(例如人iPS细胞)优选2-96小时,6-72小时,6-60小时,12-60小时,18-60小时,18-48小时或18-28小时(例如24小时),并且在步骤(2),将步骤(1)中获得的细胞在不含或含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如SAG,PMA)的无血清培养基中在存在Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)的情况下进行悬浮培养,并在步骤(3)中,将聚集体在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)和BMP信号转导途径活化物质(例如BMP4)的无血清培养基中进行悬浮培养。
在视网膜细胞和/或视网膜组织的产生的优选实施方案中,在步骤(1)中,在不存在饲养细胞的情况下在含有以下的无血清培养基中黏附培养人多能干细胞(例如,人ips细胞):TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01),Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01),BMP信号转导途径抑制物质(例如,LDN193189),或其组合(例如,SB431542和LDN193189)等);Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,Shh蛋白,SAG,PMA);或TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如Lefty,SB431542,A-83-01,LDN193189)和Sonichedgehog信号转导途径活化物质(例如Shh蛋白,SAG,PMA)的组合和bFGF,在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)的无血清培养基(含有或不含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,SAG,PMA,Shh蛋白)和/或TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01))中进行悬浮培养以形成细胞聚集体,并且在步骤(3)中,将聚集体在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)和BMP信号转导途径活化物质(例如BMP4)的无血清培养基(含有或含有TGFβ信号转导途径抑制物质(例如Lefty,SB431542,A-83-01))中进行悬浮培养以给出含有视网膜细胞(例如视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)或视网膜组织的聚集体。
步骤(2)中的培养基优选含有ROCK抑制物质(例如,Y-27632)。
在视网膜细胞和/或视网膜组织的产生的优选实施方案中,在TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01,LDN193189)和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,Shh蛋白,SAG,PMA)的组合和bFGF的无血清培养基中,在不存在饲养细胞的情况下对人多能干细胞(例如人iPS细胞)进行黏附培养18小时-30小时(例如,约24小时),并且之后在含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如Shh蛋白,SAG,PMA)和bFGF的无血清培养基中黏附培养18小时-30小时(例如,约24小时)。在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)的无血清培养基(含有或不含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,SAG,PMA,Shh蛋白)和/或TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01))中进行悬浮培养以形成细胞聚集体,并且在步骤(3)中,将聚集体在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)和BMP信号转导途径活化物质(例如BMP4)的无血清培养基(含有或含有TGFβ信号转导途径抑制物质(例如Lefty,SB431542,A-83-01))中进行悬浮培养以给出含有视网膜细胞(例如视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)或视网膜组织的聚集体。
步骤(2)中的培养基优选含有ROCK抑制物质(例如,Y-27632)。
在视网膜细胞和/或视网膜组织的产生的优选实施方案中,在步骤(1)中,在不存在饲养细胞的情况下在含有以下的无血清培养基中黏附培养人多能干细胞(例如,人ips细胞):TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01),Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01),BMP信号转导途径抑制物质(例如,LDN193189),或其组合(例如,SB431542和LDN193189)等);Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,Shh蛋白,SAG,PMA);或TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如Lefty,SB431542,A-83-01,LDN193189)和Sonichedgehog信号转导途径活化物质(例如Shh蛋白,SAG,PMA)的组合和bFGF,在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在无血清培养基中或在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)的无血清培养基(含有或不含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,SAG,PMA,Shh蛋白)和/或TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01))中进行悬浮培养以形成细胞聚集体,并且在步骤(3)中,将聚集体在含有Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)和BMP信号转导途径活化物质(例如BMP4)的无血清培养基中进行悬浮培养10天,并将培养基更换为不含有外源BMP信号转导作用物质(例如BMP4)并含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如SAG)和血清的培养基,并继续悬浮培养,得到含有视网膜细胞(例如视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)或视网膜组织的聚集体。
步骤(2)中的培养基优选含有ROCK抑制物质(例如,Y-27632)。
在视网膜细胞和/或视网膜组织的产生的优选实施方案中,在步骤(1)中,在不存在饲养细胞的情况下在含有以下的无血清培养基中黏附培养人多能干细胞(例如,人iPS细胞):TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如,TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01),Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质(例如,Lefty,SB431542,A-83-01),BMP信号转导途径抑制物质(例如,LDN193189),或其组合(例如,SB431542和LDN193189)等);Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,Shh蛋白,SAG,PMA);或TGFβ家族信号转导途径抑制物质(例如Lefty,SB431542,A-83-01,LDN193189)和Sonichedgehog信号转导途径活化物质(例如Shh蛋白,SAG,PMA)的组合和bFGF,在步骤(2)中,将步骤(1)中获得的细胞在Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)的存在下,在含有Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(例如,SAG,PMA,Shh蛋白)和/或TGFβ信号转导途径抑制物质(例如,SB431542,A-83-01,Lefty)的无血清培养基中进行悬浮培养以形成细胞聚集体,并且在步骤(3)中,将聚集体在Wnt信号转导途径抑制物质(例如,CKI-7,D4476,IWR-1-endo(IWR1e),IWP-2)和BMP信号转导途径活化物质(例如BMP4)的存在下在含有TGFβ信号转导途径抑制物质(例如Lefty,SB431542,A-83-01)的无血清培养基中进行悬浮培养以给出含有视网膜细胞(例如视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)或视网膜组织的聚集体。
步骤(2)中的培养基优选含有ROCK抑制物质(例如,Y-27632)。
获得的含有视网膜祖细胞的聚集体可以原样用作评价毒性或功效的试剂。对含有视网膜祖细胞的聚集体进行分散处理(例如,胰蛋白酶/EDTA处理或木瓜蛋白酶处理),并使用FACS或MACS对所得细胞进行选择,由此也可以获得高纯度的视网膜祖细胞。
此外,含有通过上述步骤(1)-步骤(3)获得的视网膜祖细胞的聚集体可以在无血清培养基或含血清培养基中连续培养,以使视网膜祖细胞进一步分化,从而产生神经上皮结构样视网膜组织。
这种培养基(基础培养基)没有特别限制,可以适当选择上述定义中描述的基础培养基。用于这种培养基的无血清培养基或含血清培养基不受特别限制,只要其如上所述即可。例如,可以提及含血清培养基(其是补充有10%胎牛血清,N2补充剂,100μM牛磺酸和500nM视黄酸的DMEM-F12培养基),或补充有适量的市售的血清替代品例如KSR等的无血清培养基(例如,补充有10%KSR的2,450μM 1-硫代甘油和1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的IMDM和F-1的1∶1混合物)等。
虽然用于从视网膜祖细胞诱导视网膜组织的培养时间根据预期的视网膜层特异性神经细胞而变化,但是例如约7天至约200天。
视网膜组织存在覆盖聚集体的表面。在完成悬浮培养之后,可以用例如对甲醛溶液等固定剂固定聚集体,并且制备冷冻切片,然后可以通过免疫染色等确认具有层结构的视网膜组织的形成。由于视网膜组织的各层由不同的视网膜祖细胞(感光细胞,水平细胞,双极细胞,无长突细胞,视网膜神经节细胞)构成,因此可以使用针对在这些细胞中表达的上述标志物的抗体通过免疫染色确认层结构的形成。在一个实施方案中,视网膜组织是Rx-或Chx10-阳性神经上皮结构。
存在于聚集体表面上的视网膜组织可以通过使用镊子等从聚集体物理切除。在这种情况下,由于可以在每个聚集体的表面上形成除视网膜组织之外的神经组织,因此可以切出从聚集体切除的神经组织的一部分并通过下述免疫染色等进行确认,由此能偶确认所述组织是视网膜组织。
在一个实施方案中,步骤(3)中获得的聚集体含有视网膜组织并且基本上不含非神经头部外胚层。在上述聚集冷冻切片的免疫染色图像中,在含有视网膜组织且基本上没有非神经头外胚层的聚集体中,例如观察到Rx阳性组织,并且未观察到其外部的Rx阴性组织。
步骤(3)的一个实施方案是以下步骤:将步骤(2)中形成的聚集体在含有分化诱导为视网膜细胞所必需的浓度的BMP信号转导途径活化物质(例如BMP4)的无血清培养基或含血清培养基(如上所述,任选地含有Wnt信号转导途径抑制物质和/或TGFβ信号转导途径抑制物质)中悬浮培养,直到表达Rx基因和/或Chx10基因的细胞开始出现,以给出包含视网膜祖细胞的聚集体,并且随后将含有视网膜祖细胞的聚集体在无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养,直至形成视网膜组织,由此获得包含视网膜组织的聚集体。当含有视网膜祖细胞的聚集体随后在无血清培养基或含血清培养基中悬浮培养直至形成视网膜组织时,将培养基中诱导视网膜祖细胞的BMP信号转导途径活化物质的浓度通过将培养基用无血清培养基或含血清培养基(每个培养基不含BMP信号转导途径活化物质(例如,BMP4))更换,以40-60%/2-4天的比率逐渐或逐步降低。在这种情况下,Wnt信号转导途径抑制物质和/或TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度可以与BMP信号转导途径活化物质相同的比例降低,并且优选保持在恒定水平。在一个实施方案中,进行含有视网膜祖细胞的聚集体的悬浮培养直至聚集体中含有的细胞的不少于20%(优选不少于30%,不少于40%,不少于50%,不少于60%,不少于70%,不少于80%,不少于90%)表达Chx10。
在步骤(3)的一个实施方案中,步骤(2)中获得的聚集体,或通过上述方法在悬浮液中培养步骤(2)中获得的聚集体获得的聚集体可以进行黏附培养以形成黏附的聚集体。将黏附聚集体在含有分化诱导为视网膜细胞所必需的浓度的BMP信号转导途径活化物质的无血清培养基或含血清培养基(所述培养基任选地含有Wnt信号转导途径抑制物质和/或TGFβ信号转导途径抑制物质)中以黏附状态培养,直到表达Rx基因和/或Chx10基因的细胞开始出现,以给出包含视网膜祖细胞的黏附聚集体。含有视网膜祖细胞的聚集体在无血清培养基或含血清培养基中以黏附状态连续培养,直至形成视网膜组织,从而获得含有视网膜组织的聚集体。在一个实施方案中,进行含有视网膜祖细胞的聚集体的黏附培养直至不少于10%(优选不少于20%,不少于30%,不少于40%,不少于50%,不少于60%,不少于70%,不少于80%,不少于90%)的细胞表达Chx10。
通过本发明的产生方法,可以高效地从多能干细胞获得视网膜组织。由于通过本发明的产生方法获得的视网膜组织含有对每个视网膜层特异的神经元(神经元细胞),因此还可以获得构成视网膜组织的细胞,例如感光细胞,水平细胞,双极细胞,无长突细胞,视网膜神经节细胞或其祖细胞/前体细胞等。从获得的视网膜组织获得哪种细胞可以通过本身已知的方法(例如,细胞标志物的表达)确认。
获得的含有视网膜组织的聚集体也可以直接用作评价毒性或功效的试剂。对含有视网膜组织的聚集体进行分散处理(例如,胰蛋白酶/EDTA处理),并使用FACS或MACS对所得细胞进行选择,由此还可以获得高纯度的视网膜组织构成细胞,例如高纯度感光细胞。
通过已知方法(例如,WO 15/087614),具体地,通过以下步骤(A)和步骤(B),可以从含有通过本发明的产生方法(上述步骤(1)-步骤(3))获得的视网膜组织的细胞聚集体产生含有睫状边缘带样结构的视网膜组织。
在一个实施方案中,睫状边缘带样结构可以通过以下步骤(A)和步骤(B)从含有视网膜组织的细胞聚集体在从步骤(2)的悬浮培养开始第6-30天,第10-20天(第10天,第11天,第12天,13个天,第14天,第15天,第16天,第17天,第18天,第19天或20天)产生,所述聚集体是含有通过步骤(1)-(3)获得的视网膜组织的细胞聚集体。
本说明书中的睫状边缘带样结构是指类似于睫状边缘带的结构。“睫状边缘带(CMZ)”的实例包括存在于体内视网膜中的视网膜组织(特别是神经视网膜)和视网膜色素上皮的边界区域中的组织,其是包含视网膜组织干细胞的区域(视网膜干细胞)。睫状边缘带也称为睫毛边缘或视网膜边缘,而睫状边缘带,睫毛边缘和视网膜边缘是等同组织。已知睫状边缘带在向视网膜组织的供应视网膜祖细胞或分化细胞,维持视网膜组织结构等方面起重要作用。睫状边缘带的标志基因的实例包括Rdh10基因(阳性),Otx1基因(阳性),Zic1(阳性)等。
步骤(A)包括将包含通过本发明的产生方法(即步骤(1)-步骤(3))获得的视网膜组织的细胞聚集体(其中Chx10阳性细胞以视网膜组织的20%或更多和100%或更少的比例存在)在无血清培养基或含血清的培养基(每个培养基含有Wnt信号通路活化物质和/或FGF信号通路抑制物质)中仅在出现表达RPE65基因的细胞前的一段时间培养。
作为步骤(A)的优选培养,可提及悬浮培养。
作为有待在步骤(A)中使用的无血清培养基,可以提及作为补充有N2或KSR的基础培养基的无血清培养基。更具体地,可提及无血清培养基,其是补充有N2补充物(LifeTechnologies)的DMEM/F-12培养基。作为含有血清的培养基,可以提及含血清培养基,其是补充有胎牛血清的基础培养基。
可以适当地确定步骤(A)中的培养条件,例如培养温度和CO2浓度等。培养温度例如在约30℃至约40℃的范围内,优选例如约37℃。CO2浓度例如在约1%至约10%的范围内,优选地,例如,约5%左右。
在步骤(A)中,当在培养基中培养上述“包含视网膜组织的细胞聚集体”时,有待包含在无血清培养基或含血清培养基中的Wnt信号转导途径活化物质没有特别限制,只要它能增强Wnt介导的信号转导。Wnt信号转导途径活化物质的具体实例包括属于Wnt家族的蛋白质(例如,Wnt1,Wnt3a,Wnt7a),Wnt受体,Wnt受体激动剂,GSK3β抑制剂(例如,6-溴靛玉红-3′-肟(BIO),CHIR99021,Kenpaullone)等。
在共同的Wnt信号转导途径活化物质例如CHIR99021的情况下,有待在步骤(A)中含于无血清培养基或含血清培养基中的Wnt信号转导途径活化物质的浓度是,例如,在约0.1μM至约100μM的范围内,优选地,例如,在约1μM至约30μM的范围内,更优选地,例如,约3μM。
当在培养基中培养上述“包含视网膜组织的细胞聚集体”时,步骤(A)中有待在无血清培养基或含血清培养基中含有的FGF信号转导途径抑制物质没有特别限制,只要它可以抑制由FGF介导的信号转导。FGF信号转导途径抑制物质的实例包括FGF受体,FGF受体抑制剂(例如,SU-5402,AZD4547,BGJ398),MAP激酶级联抑制物质(例如,MEK抑制剂,MAPK抑制剂,ERK抑制剂),PI3激酶抑制剂,Akt抑制剂等。
步骤(A)中的无血清培养基或含血清培养基中含有的FGF信号转导途径抑制物质的浓度仅需要是可以诱导聚集体分化成睫状边缘带样结构的浓度。例如,在SU-5402的情况下,将其加入到培养基中至浓度为约0.1μM至约100μM,优选约1μM至约30μM,更优选约5μM。
步骤(A)中“仅在表达RPE65基因的细胞出现之前培养一段时间“是指仅在表达RPE65基因的细胞出现之前的全部或部分期间进行培养。也就是说,仅在全部或部分时期(任何时期)培养就足够了,在此期间,存在于培养系统中的上述“包含视网膜组织的细胞聚集体”由基本上不表达RPE65基因的细胞构成。通过采用这种培养,可以获得其中不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体。
为了确定这样的特定时期,使用上述“包含视网膜组织的细胞聚集体”作为样品,并且样品中包含的RPE65基因的表达的存在或不存在或其水平可以通过一般基因工程方法或生化方法测量。具体地,例如,RPE65基因的表达的存在或不存在或其水平可以通过使用针对RPE65蛋白的抗体对上述“包含视网膜组织的细胞聚集体”的冷冻切片进行免疫染色方法来检查。
作为步骤(A)中“表达RPE65基因的细胞出现前的时间”,可以提及例如以下时间,在该时间过程中,存在于上述视网膜组织中的Chx10阳性细胞的比例比上述细胞聚集体在无血清培养基或含血清培养基(每个含有Wnt信号转导途径活化物质和/或FGF信号转导途径抑制物质)中培养开始时的比例降低,并且落入30%至0%的范围之内。作为“不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”,可以提及Chx10阳性细胞以上述视网膜组织的30%~0%的比例存在于所述组织中的细胞聚集体。
虽然步骤(A)中“表达RPE65基因的细胞出现之前的时间”的天数根据Wnt信号转导途径活化物质和/或FGF信号转导途径抑制物质的种类,无血清培养基或含血清培养基的种类,其他培养条件等而变化,但是它例如时在14天内。更具体地,当使用无血清培养基(例如,作为补充有N2的基础培养基的无血清培养基)时,上述时间优选地,例如,在10天内(例如,从第20天的约10天内,其中以步骤(2)的开始为起点),更优选地,例如,3天至6天。更具体地,当使用含血清培养基(例如,作为补充有胎牛血清的基础培养基的含血清培养基)时,上述时间优选地,例如,在12天内(例如,从第20天的约12天内,其中以步骤(2)的开始为起点),更优选地,例如,6天至9天。
然后作为步骤(B),通过如上所述培养获得的“不出现表达RPE65基因的细胞的细胞聚集体”在无血清培养基或含血清培养基(每个培养基不含Wnt信号转导途径活化物质)中培养。
作为步骤(B)中的优选培养,可提及悬浮培养。
步骤(B)的无血清培养基优选不含FGF信号转导途径抑制物质。
作为步骤(B)中的无血清培养基,可以提及作为补充有N2或KSR的基础培养基的培养基。作为含有血清的培养基,可以提及培养基,其是补充有胎牛血清的基础培养基。更具体地,可提及含血清培养基,其是补充有胎牛血清的DMEM/F-12培养基。
步骤(B)中的上述无血清培养基或含血清培养基可含有已知的生长因子,促进生长的添加剂和化学物质等。已知生长因子的实例包括EGF,FGF,IGF,胰岛素等。促进生长的添加剂的实例包括N2补充剂(Life Technologies),B27补充剂(Life Technologies),KSR(Life Technologies)等。促进生长的化学物质的实例包括类视黄醇(例如视黄酸)和牛磺酸。
步骤(B)中培养的优选时间是,例如,以下培养时间,在该时间过程中存在于上述视网膜组织中的Chx10阳性细胞的比例比上述细胞聚集体在无血清培养基或含血清培养基(每个含有Wnt信号转导途径活化物质)中培养开始时的比例增加,并达到30%或更多。具体地,例如,从步骤(A)的开始作为起始点,从约第3天开始是3天-60天,优选约35天。
可以适当地设定步骤(B)中的培养条件例如培养温度,CO2浓度等。培养温度例如在约30℃至约40℃的范围内,优选例如约37℃。CO2浓度例如在约1%至约10%的范围内,优选地,例如,约5%左右。
在步骤(B)中直至获得“包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体”的上述培养天数根据无血清培养基或含血清培养基的种类,其他培养物条件等而变化,其例如时在100天内。上述培养天数优选为例如20天至70天,更优选为例如30天至60天。
在通过上述步骤(A),(B)制备的“包含睫状边缘带样结构的细胞聚集体”中,视网膜色素上皮和视网膜组织(特别是神经视网膜)存在于同一细胞聚集体中的睫状边缘带结构附近。该结构可通过显微镜观察等确认。具体地,例如,作为具有厚视网膜侧和薄视网膜色素上皮侧的上皮结构的睫状边缘带状结构(其在具有高透明度的视网膜组织和显示色素沉着的视网膜色素上皮之间形成)的存在可以通过显微镜观察证实。此外,能够通过具有聚集体冷冻切片的免疫染色鉴定Rdh10阳性,Otx1阳性或Zic1阳性细胞来证实睫状边缘带样结构的存在。
在另一个实施方案中,通过上述步骤(A),(B)进行聚集体中包含的视网膜组织(神经上皮)的分化,并且能够产生成熟的视网膜组织和选自由以下组成的组的细胞中至少一个,优选多个,更优选全部:感光细胞前体细胞,感光细胞,锥感光细胞,杆感光细胞,水平细胞,中间神经元(无长突细胞,神经节细胞等)。
含有视网膜色素上皮细胞的视网膜组织能够通过以下步骤(C)由含有通过本发明的产生方法(即上述步骤(1)-步骤(3))获得的视网膜组织的细胞聚集体产生。视网膜色素上皮片可以通过以下步骤(D)由通过以下步骤(C)获得的视网膜色素上皮细胞产生。
本发明中的“视网膜色素上皮细胞”是指体内视网膜中存在于神经视网膜组织外侧的上皮细胞。基于例如细胞标志物(RPE65(成熟的视网膜色素上皮细胞),Mitf(幼年或成熟的视网膜色素上皮细胞)的表达,黑色素颗粒的存在,多边形的特征细胞形态等本领域普通技术人员能够证实它是否是视网膜色素上皮细胞。
首先,在步骤(C)中,将含有通过本发明的产生方法获得的视网膜组织的细胞聚集体悬浮培养在不含BMP信号转导途径活化物质但含有Wnt信号转导途径活化物质的无血清培养基或含血清培养基中以得到含有视网膜色素上皮细胞的聚集体。
作为有待在步骤(C)中使用的无血清培养基,可以提及作为补充有N2或KSR的基础培养基的无血清培养基。更具体地,可提及无血清培养基,其是补充有N2补充物(LifeTechnologies)的DMEM/F-12培养基。作为含有血清的培养基,可以提及含血清培养基,其是补充有胎牛血清的基础培养基。
除了上述Wnt信号转导途径活化物质之外,步骤(C)中使用的无血清培养基还可以含有上述Nodal/激活蛋白信号转导途径活化物质和/或上述FGF信号转导途径抑制物质。
步骤(C)中的优选培养是例如悬浮培养。
说明步骤(D),其中将本发明的步骤(C)中获得的聚集体分散并且以黏附状态培养所获得的细胞。
步骤(D)在步骤(C)开始后60天内,优选在30天内,更优选3天内进行。
步骤(D)中使用的培养基(基础培养基)没有特别限制,可以适当选择上述定义中描述的基础培养基。作为步骤(D)中用于黏附培养的无血清培养基或含血清培养基,可提及上述培养基。为了避免复杂的制备,优选使用补充有适当量的市售血清替代品例如KSR等的无血清培养基(DMEM/F-12和神经基础培养基(Neurobasal)的1∶1混合物的培养基,其补充有1/2x N2补充剂,1/2x B27补充剂和100μM 2-巯基乙醇)。在衍生自人iPS细胞的细胞的情况下,加入无血清培养基中的KSR的量通常为例如约1%至约20%,优选约2%至约20%。
在步骤(D)中,优选在含有ROCK抑制物质的上述无血清培养基或含血清培养基中培养细胞。
在步骤(D)中,更优选在含有一种或多种选自由以下组成的组中的物质的无血清培养基或含血清培养基中培养细胞:Wnt信号转导途径活化物质,FGF信号转导途径抑制物质,激活蛋白信号转导途径活化物质和BMP信号转导途径活化物质。
激活蛋白信号转导途径活化物质是能够增强由激活蛋白介导的信号的物质。激活蛋白信号转导途径活化物质的实例包括属于激活蛋白家族的蛋白质(例如,激活蛋白A,激活蛋白B,激活蛋白C,激活蛋白AB等),激活蛋白受体和激活蛋白受体激动剂。
步骤(D)中有待使用的激活蛋白信号转导途径活化物质的浓度可以是任何浓度,只要可以有效地形成均匀的视网膜色素上皮细胞片。例如,加入重组人/小鼠/大鼠激活蛋白A(R&D systems,#338-AC)至约1ng/ml至约10μg/ml的浓度,优选约10ng/ml至约1μg/ml,更优选约100ng/ml。激活蛋白信号转导途径活化物质例如在从步骤(D)开始18天内加入,优选在第6天加入。
在步骤(D)中,黏附培养优选在其表面用培养基质处理的培养容器上进行。作为在步骤(D)中用于处理培养容器的培养基质,可以提及能够使聚集体衍生细胞黏附培养和视网膜色素上皮片形成的细胞培养基质。
如上所述,除了上述步骤(1)-步骤(3)之外,还包含步骤(A)和步骤(B)或步骤(C)和步骤(D)的视网膜细胞或视网膜组织的产生方法也在本发明的范围内。步骤(3)可包括上述步骤(A)和步骤(B)或步骤(C)和步骤(D)等。
4.评估毒性或功效的方法
由于通过本发明的产生方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(例如,视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)可在筛选药物(其用于治疗由于视网膜组织或视网膜细胞失调引起的疾病)或毒性评估中用作疾病研究或药物发现的材料,它可以用作评估测试物质的毒性或功效的试剂。例如,iPS细胞由患有由视网膜组织失调引起的疾病(特别是遗传性疾病)的人类患者产生,并且使用iPS细胞,通过本发明的方法产生视网膜组织或视网膜细胞(例如,视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)。视网膜组织或视网膜细胞可以在体外再现引起患者的疾病的视网膜组织失调。因此,本发明提供评估测试物质的毒性或功效的方法,其包括使测试物质与通过本发明的产生方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(例如,视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)接触,并检测所述物质对所述细胞或组织的影响。
例如,通过本发明的产生方法产生的具有特定失调(例如,遗传性失调)的视网膜组织或视网膜细胞(例如,视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)在存在或不存在(阴性对照)测试物质的情况下培养。然后,将用测试物质处理的视网膜组织或视网膜细胞的失调严重程度与阴性对照的程度进行比较。结果,可以选择降低失调严重性的测试物质作为用于治疗由所述失调引起的疾病的药物的候选物质。例如,可以探索改善由本发明的产生方法产生的视网膜细胞的生理活性(例如,促进或成熟)的测试物质作为药物产品的候选物质。或者,根据本发明的产生方法,通过诱导诱导多能干细胞的分化来制备视网膜细胞,所述诱导多能干细胞由具有引起特定失调例如视网膜疾病等的基因突变的体细胞制备。可以基于添加有测试物质的视网膜细胞是否显示上述失调作为指标来探索有效作为针对所述失调的药物或预防药物的测试物质的候选物。
对于毒性评估,通过本发明的产生方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(例如,视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)在存在或不存在(阴性对照)测试物质的情况下培养。然后,将用测试物质处理的视网膜组织或视网膜细胞的毒性严重程度与阴性对照的程度进行比较。结果,与阴性对照相比发挥毒性的测试物质可以被判断为对视网膜组织或视网膜细胞(例如视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)具有毒性的物质。
即,本发明包括评估毒性的方法,其包括以下步骤:
(步骤1)在存活的培养条件下,在测试物质存在下培养由本发明的产生方法产生的视网膜组织或视网膜细胞一段给定时间,并测量细胞损伤的严重程度,
(步骤2)在存活的培养条件下,在没有测试物质的情况下或在阳性对照的存在下培养由本发明的产生方法产生的视网膜组织或视网膜细胞,并测量细胞损伤的严重程度,
(步骤3)基于(步骤1)和(步骤2)中测量的结果的差异,评估步骤1中测试物质的毒性。
如本文所用,“在不存在测试物质的情况下”包括仅添加培养基或用于溶解测试物质的溶剂而不添加测试物质。另外,“阳性对照”是指具有毒性的已知化合物。用于测量细胞损伤严重程度的方法的实例包括测量活细胞数的方法,例如,测量细胞内ATP量的方法,通过细胞染色(例如,细胞核染色)测量活细胞数的方法和形态观察等。
在步骤3中,作为评价测试物质的毒性的方法,比较步骤1中的测量值和步骤2中的阴性对照的测量值,并且当步骤1中的细胞损伤的严重程度高时,测试物质可判断为有毒性。另外,比较步骤1中的测量值和步骤2中阳性对照的测量值,并且当步骤1中的细胞损伤的严重程度相同或更高时,可以判断测试物质有毒性。
5.药物组合物
本发明提供含有有效量的通过本发明的产生方法制备的视网膜组织或视网膜细胞(例如视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)的药物组合物。
药物组合物含有有效量的通过本发明的产生方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(例如视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)和药学上可接受的载体。
作为药学上可接受的载体,可以使用生理水性溶剂(盐水,缓冲液,无血清培养基等)。必要时,在移植疗法中,含有待移植的组织或细胞的药物可含有常规使用的防腐剂,稳定剂,还原剂,等渗剂等。
本发明的药物组合物可以通过将利用本产生方法产生的视网膜组织或视网膜细胞悬浮于适当的生理水性溶剂中而制成悬浮液。必要时,可以向组合物中加入冷冻保存剂,冷冻保存,使用时解冻,用缓冲液洗涤,并用于移植治疗。
通过本发明的产生方法获得的视网膜组织也可以用镊子等切割成适当的尺寸,以得到片制品。
通过本发明的产生方法获得的细胞也可以在步骤(3)中进行黏附培养以进行分化诱导,以形成片状细胞,从而得到片制品。
本发明的药物组合物可用作由于视网膜组织或视网膜细胞(例如视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)的失调引起的疾病的药物。
6.治疗药物(药物)
通过本发明的产生方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(例如,视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)可用于由于视网膜组织或视网膜细胞的失调引起的疾病的移植疗法。因此,本发明提供了用于治疗由视网膜组织或视网膜细胞的失调引起的疾病的药物,所述药物包含由本发明的产生方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(例如,视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)。通过本发明的产生方法产生的视网膜组织或视网膜细胞(例如视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞)可用作治疗由于视网膜组织或视网膜细胞的失调引起的疾病的药物,或者补充受损状态的视网膜组织中相应的受损部位。由视网膜组织或视网膜细胞的失调引起的疾病和受损状态的视网膜组织可以通过以下来治疗:将由本发明的产生方法产生的视网膜组织或视网膜细胞移植到具有由于视网膜组织或视网膜细胞的失调引起的疾病或受损状态的视网膜组织的需要移植的患者,以补充视网膜细胞或失调的视网膜组织本身。由视网膜组织或视网膜细胞的失调引起的疾病的实例包括黄斑变性,年龄相关性黄斑变性,视网膜色素变性,白内障,青光眼,角膜疾病,视网膜病等,这些是眼科疾病。
在移植治疗中,由于组织相容性抗原的差异导致的排斥通常会引起问题。然而,该问题可以通过使用从移植受体的体细胞建立的多能干细胞(例如,诱导多能干细胞)来解决。即,在优选的实施方案中,从受体的体细胞建立的多能干细胞(例如,诱导多能干细胞)用作本发明方法中的多能干细胞,并且产生视网膜组织或视网膜细胞(其对于受体是免疫学上的自我)并移植到受体。
此外,同种异体视网膜组织或视网膜细胞可由从与受体免疫相容(例如,在HLA型和MHC型方面相容)的其他体细胞建立的多能干细胞(例如,诱导多能干细胞)产生,并移植到受体。
[实施例]
下面通过参考实施例和药理实施例,实施例详细解释本发明,但不应将其解释为限制性的。
实施例1:在步骤1后(也称为预调节)在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑 制物质从人iPS细胞产生视网膜组织的实施例
根据“Scientific Reports,4,3594(2014)”中描述的方法,在无饲养细胞下培养人iPS细胞(1231A3株,得自Kyoto University)。作为无饲养细胞培养基,使用StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造),并且作为无饲养细胞支架,使用层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造)。
作为特定的维持培养操作,首先用PBS洗涤亚汇合的人iPS细胞(1231A3株),并使用TrypLE Select(Life Technologies制造)将其分散成单细胞。此后,将分散成单细胞中的上述人iPS细胞接种在涂有层粘连蛋白511-E8的塑料培养皿中,并在Y27632(ROCK抑制物质,10μM)存在下在StemFit(注册商标)培养基中在无饲养细胞条件下培养。当使用6孔板(由Iwaki制造,用于细胞培养,培养面积9.4cm2)作为上述塑料培养皿时,将分散成单细胞的上述人iPS细胞的铺板细胞数调节至1.0x 104。接种后一天,用不含Y27632的StemFit(注册商标)培养基更换全部培养基。此后,在1-2天中一次,用不含Y27632的StemFit(注册商标)培养基更换全部培养基。此后,将细胞培养至接种后6天,此时它们变成亚汇合(60%的培养面积被细胞覆盖)。
作为本产生方法的步骤1(预调节)的具体实例,进行以下操作。首先用PBS洗涤亚汇合的人iPS细胞(1231A3株),并使用TrypLE Select(Life Technologies制造)将其分散成单细胞。此后,将分散成单细胞中的上述人iPS细胞接种在涂有层粘连蛋白511-E8的塑料培养皿(由Iwaki制造)中,并在Y27632(ROCK抑制物质,10μM)存在下在StemFit(注册商标)培养基中在无饲养细胞条件下培养。当使用6孔板(由Iwaki制造,培养面积9.4cm2)作为上述塑料培养皿时,将分散成单细胞的上述人iPS细胞的铺板细胞数调节至1.0x 104。当使用60mm皿(由Iwaki制造,用于细胞培养,培养面积21cm2)作为上述塑料培养皿时,将分散成单细胞的上述人iPS细胞的铺板细胞数调节至2.0x 104。接种后一天,用不含Y27632的StemFit(注册商标)培养基更换全部培养基。此后,在1-2天中一次,用不含Y27632的StemFit(注册商标)培养基更换全部培养基。此后,将细胞培养至接种后5天,即在亚汇合前一天(50%的培养面积被细胞覆盖)。即使在接种后培养6天,也获得了类似的结果。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质(TGFβR-i),5μM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节处理,图1“预调节:TGFβR-i+Shh”)存在下或在其不存在下(步骤1:没有预调节处理,图1“未处理的对照”)将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的上述人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天。使用倒置显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)对培养的细胞进行明视野观察。结果发现,在无饲养细胞培养期间用TGFβ信号转导途径抑制物质(SB431542)和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的处理对人iPS细胞的形态没有产生很大影响。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies制造),用细胞分散溶液处理不经预调节处理的如此制备的人iPS细胞和经预调节处理的人iPS细胞,并通过移液操作进一步分散成单细胞。此后,将分散成单细胞中的上述人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,SUMITOMO BAKELITE)中的100μl无血清培养基中,1.0×104个细胞/孔,并在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为无血清培养基(gfCDM+KSR),使用补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipidconcentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。
在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入上述无血清培养基中,并在含有或不含有Wnt信号转导途径抑制物质(IWR-1e,3μM)的培养基中进一步培养细胞。到悬浮培养开始后第2天,在有或没有预调节的条件下形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有或不含有IWR-1e的培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度不会改变。此后,使用上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4且进一步含有或不含有IWR-1e的无血清培养基进行半培养基更换操作,每2-4天进行一次,以避免外源IWR-1e浓度的变化。
在悬浮培养开始后第17天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察(图1)。结果,在没有预调节且没有添加Wnt信号转导途径抑制物质的条件下,聚集体生长差并且其形状崩塌(图1A)。相反,在添加Wnt信号转导途径抑制物质的条件下获得未变形且具有致密内部的细胞聚集体,并且发现神经组织形成(图1B)。此外,在具有预调节并且不添加Wnt信号转导途径抑制物质(图1C)或添加Wnt信号转导途径抑制物质(图1D)的条件下,获得具有聚集体光滑表面和致密内部的未变形的圆形细胞聚集体,并且发现神经组织形成。
在悬浮培养开始后第17天,将上述细胞聚集体各自用4%多聚甲醛固定,制备冷冻切片。这些冷冻切片针对Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠),或Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,由Exalpha制造,绵羊)进行免疫染色。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些免疫染色切片(图2)。
结果,在步骤1中没有用SB431542和SAG预调节并且在步骤2和步骤3中没有添加IWR-1e的条件下产生细胞聚集体,发现Rx阳性细胞相比于总细胞的比例是不超过约3%(图2A)。
不包括在步骤1中用SB431542和SAG预调节并且包括在步骤2和步骤3中添加IWR-1e的条件下产生的细胞聚集体中,总细胞中Rx阳性细胞的比例为约40%(图2B)从连续切片的分析中,在这些条件下产生的细胞聚集体中观察到弱的Chx10阳性(图2F)。
包括在步骤1中用SB431542和SAG预调节并且在步骤2和步骤3中未添加IWR-1e的条件下产生的细胞聚集体中,发现总细胞中Rx阳性细胞的比例为约40%(图2C)。从连续切片的分析,在这些条件下产生的细胞聚集体,观察到约40%的Chx10阳性(强阳性)细胞(图2G)。
此外,发现包括在步骤1中用SB431542和SAG预调节并且包括在步骤2和步骤3中添加IWR-1e的条件下产生的细胞聚集体中,总细胞中Rx阳性细胞的比例为约60%(图2D)。从连续切片的分析,在这些条件下产生的细胞聚集体中,观察到约60%的Chx10阳性(强阳性)细胞(图2H)。
根据这些结果,发现在不包括预调节且不包括在步骤2和步骤3中添加Wnt抑制剂的条件下几乎不形成神经组织,而神经组织可以在任何其他条件下形成。
与没有预调节且在步骤2和步骤3中不添加Wnt抑制剂的条件相比,发现在没有预调节且在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的条件下,视网膜组织形成有所促进(图1A,1B,图2A,2B,2E,2F)。另一方面,发现在步骤1中用TGFβ家族信号转导途径抑制物质和Shh信号转导途径活化物质预调节并且在步骤2和步骤3中并进一步添加Wnt信号转导途径抑制物质可以高效地形成视网膜组织(图2B,2D,2F,2H)。
实施例2:包括在步骤1中用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节且在 步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,从人iPS细胞产生视网膜组织的 实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(1231A3株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在SAG(Sonichedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节处理,图3“预调节:Shh”)存在下或在其不存在下(步骤1:无预调节条件,图3“未处理的对照”)将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节处理的人iPS细胞和无预调节条件情况下的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMOBAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipidconcentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下五个条件1-5下培养细胞。
·条件1.不包括步骤1中的预调节处理,并且不包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加外源Wnt信号转导途径抑制物质或外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图3A)。
·条件2.包括步骤1中的预调节处理,并且不包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加外源Wnt信号转导途径抑制物质或外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图3B)。
·条件3.包括步骤1中的预调节处理,在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图3C)。
·条件4.包括步骤1中的预调节处理,在步骤2开始时向上述无血清培养基中不添加外源Wnt信号转导途径抑制物质并且添加SAG(30nM)作为Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图3D)。
·条件5.包括步骤1中的预调节处理,在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(30nM)作为Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图3E)。
在悬浮培养开始后第2天,在条件1-5的任一条件下形成细胞聚集体(步骤2完成,并且步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有或不含有IWR-1e的培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度不会改变。此后,使用上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4且进一步含有或不含有IWR-1e的无血清培养基进行半培养基更换操作,每2-4天进行一次,以避免外源IWR-1e浓度的变化。
在悬浮培养开始后第17天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察(图3)。结果发现,在步骤1中没有预调节的条件1下没有聚集体生长并且没有神经组织形成(图3A),而在步骤1中用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质进行预调节处理的条件2-5下聚集体生长并且可以形成神经组织(图3B-E)。特别地,条件2和4相比(其中不允许Wnt信号转导途径抑制物质起作用(图3B,D)),发现在条件3和5下神经组织的形成效率良好(其中允许Wnt信号转导途径抑制物质在步骤2和步骤3中起作用(图3C,E))。
悬浮培养开始后第17天的上述细胞聚集体各自用4%多聚甲醛固定,得到冷冻切片。这些冷冻切片针对Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠),或Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,由Exalpha制造,绵羊)进行免疫染色。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些免疫染色切片(图4)。
结果发现,在没有预调节的条件1下没有形成神经组织,而在用SAG进行预调节处理的条件2-5中的任何一个下形成神经组织。
其中,在步骤1中用SAG预调节且在步骤2和步骤3中未添加外源Wnt信号转导途径抑制物质的条件2下,总细胞中Rx阳性细胞的比例为约40%(图4A)。从连续切片的分析中发现,在上述条件下产生的细胞聚集体的视网膜组织中,Rx阳性细胞是Chx10共阳性(图4E)。
另一方面,发现条件3(在步骤1中用SAG预调节,并且在步骤2和步骤3中添加IWR-1e(图4B))下产生的细胞聚集体中,总细胞中Rx阳性细胞的比例为约90%。从连续切片的分析中发现,在上述条件下产生的细胞聚集体的视网膜组织中,Rx阳性细胞是Chx10共阳性(图4F)。
也就是说,从条件2和条件3的比较,发现通过步骤1中的预调节和在步骤2和步骤3中用Wnt信号转导途径抑制物质的进一步处理,可以以约90%的效率形成视网膜组织。
在包括步骤1中用SAG预调节的条件4下和包括在步骤2中添加SAG的条件4下产生的细胞聚集体中,总细胞中Rx阳性细胞的比例为约60%(图4C)。从连续切片的分析中发现,在上述条件下产生的细胞聚集体的视网膜组织中,Rx阳性细胞是Chx10共阳性(图4G)。
另一方面,发现包括在步骤1中用SAG预调节的条件下和在步骤2中加入SAG并在步骤2和步骤3中加入IWR-1e的条件5下产生的细胞聚集体中,总细胞中的Rx阳性细胞比例为约为90%(图4D)。从连续切片的分析中发现,在上述条件下产生的细胞聚集体的视网膜组织中,Rx阳性细胞是Chx10共阳性(图4H)。
也就是说,从条件4和条件5的比较,发现通过步骤1中的预调节,在步骤2中添加Sonic hedgehog信号转导途径活化物质和在步骤2和步骤3中用Wnt信号转导途径抑制物质的进一步处理,可以以约90%的效率形成视网膜组织。
实施例3:包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质的预调节且在步骤2和步 骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,从人iPS细胞产生视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(1231A3株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)中在加入SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质(TGFβR-i),5μM)并且不添加外源Sonic hedgehog转导途径活化物质的条件(步骤1:预调节(TGFβR-i)处理,图5“预调节:TGFβR-i”)下,或在SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质(TGFβR-i),5μM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(TGFβR-i+Shh)处理,图5“预调节:TGFβR-i+Shh”)存在下将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(TGFβR-i)处理的人iPS细胞和预调节(TGFβR-i+Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下三个条件1-3下培养细胞。
·条件1.包括步骤1中的预调节(TGFβR-i)处理,以及在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(30nM)作为Sonichedgehog信号转导途径活化物质(图5A)。
·条件2.包括步骤1中的预调节(TGFβR-i+Shh)处理,以及在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonichedgehog信号转导途径活化物质(图5B)。
·条件3.包括步骤1中的预调节(TGFβR-i+Shh)处理,以及在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(30nM)作为Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图5C)。
在悬浮培养开始后第2天,在上述条件1-5的任一条件下形成细胞聚集体(步骤2完成,并且步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的上述无血清培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度不会改变。此后,使用上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4且进一步含有IWR-1e的无血清培养基进行半培养基更换操作,每2-4天进行一次,以避免外源IWR-1e浓度的变化。
在悬浮培养开始后第17天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现可以在条件1-3中的任何条件下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第17天的细胞聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊),或Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠)进行免疫染色。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些免疫染色切片。结果,发现在条件1-3中的任何条件下形成神经组织并且神经组织中Chx10阳性的比例为约90%(图5A-C)。从连续切片的分析,在视网膜组织中,可以证实这些Chx10阳性细胞是Rx共阳性的。
即,发现在包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质的预调节且在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,可以从人iPS细胞有效地形成视网膜组织。
实施例4:包括在步骤1中用BMP信号转导途径抑制物质的预调节且在步骤2和步骤 3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,从人iPS细胞产生视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(1231A3株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)中在加入LDN193189(BMP信号转导途径抑制物质(BMPR-i),100nM)并且不添加外源Sonic hedgehog转导途径活化物质的条件(步骤1:预调节(BMPR-i)处理,图5“预调节:BMPR-i”)下,或在LDN193189(BMP信号转导途径抑制物质,100nM,BMPR-i)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(BMPR-i+Shh)处理,图6“预调节:BMPR-i+Shh”)存在下将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(BMPR-i)处理的人iPS细胞和预调节(BMPR-i+Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下三个条件1-3下培养细胞。
·条件1.包括步骤1中的预调节(BMPR-i)处理,以及在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(30nM)作为Sonichedgehog信号转导途径活化物质(图6A)。
·条件2.包括步骤1中的预调节(BMPR-i+Shh)处理,以及在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonichedgehog信号转导途径活化物质(图6B)。
·条件3.包括步骤1中的预调节(BMPR-i+Shh)处理,以及在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(30nM)作为Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图6C)。
在悬浮培养开始后第2天,在上述条件1-3的任一条件下形成细胞聚集体(步骤2完成,并且步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的上述无血清培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度不会改变。此后,使用上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4且进一步含有IWR-1e的无血清培养基进行半培养基更换操作,每2-4天进行一次,以避免外源IWR-1e浓度的变化。
在悬浮培养开始后第17天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现可以在条件1-3中的任何条件下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第17天的细胞聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊),或Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠)进行免疫染色。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些免疫染色切片。结果,发现在条件1-3中的任何条件下形成神经组织并且神经组织中Chx10阳性的比例为约90%(图6A-C)。从连续切片的分析,在视网膜组织中,可以证实这些Chx10阳性细胞是Rx共阳性的。
即,发现在包括在步骤1中用BMP信号转导途径抑制物质的预调节且在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,可以从人iPS细胞有效地形成视网膜组织。
实施例5:在包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog 信号转导途径活化物质预调节,步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质,步骤3中 添加BMP信号转导途径活化物质,以及使用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质和血清 噁情况下,从人iPS细胞产生视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(1231A3株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)中在包括没有添加外源TGFβ信号转导途径抑制物质和添加SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(Shh)处理,图7“预调节:Shh”)的条件下,和在包括添加SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质(TGFβR-i),5μM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(TGFβR-i+Shh)处理,图7“预调节:TGFβR-i+Shh”)的条件下将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(Shh)处理的人iPS细胞或预调节(TGFβR-i+Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下四个条件1-4下培养细胞。
·条件1.包括步骤1中的预调节(Shh)处理,以及在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图7A)。
·条件2.包括步骤1中的预调节(Shh)处理,以及在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(30nM)作为Sonichedgehog信号转导途径活化物质(图7B)。
·条件3.包括步骤1中的预调节(TGFβR-i+Shh)处理,以及在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonichedgehog信号转导途径活化物质(图7C)。
·条件4.包括步骤1中的预调节(TGFβR-i+Shh)处理,以及在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(30nM)作为Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图7D)。
在悬浮培养开始后第2天,在上述条件1-4的任一条件下形成细胞聚集体(步骤2完成,并且步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的上述无血清培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度不会改变。此后,使用上述不含Y27632、SAG和人重组BMP4且进一步含有IWR-1e的无血清培养基进行半培养基更换操作,每2-4天进行一次,以避免外源IWR-1e浓度的变化。
接下来,在悬浮培养开始后第10天,使用通过将SAG(100nM)作为Sonic hedgehog信号转导途径活化物质和胎牛血清(10%)作为血清添加到上述无血清培养基中而获得的含有Shh血清培养基(图7“Shh+血清”),更换约80%培养基(80%更换操作)的操作重复3次,从而将培养基更换为上述不含Y27632,人重组BMP4或IWR1-e并且含有SAG和血清的含Shh血清培养基。此后,每2-4天一次,用上述含有Shh血清的培养基进行半培养基更换操作。
在悬浮培养开始后第17天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现可以在条件1-4中的任何条件下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第17天的细胞聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊),或Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠)进行免疫染色。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些免疫染色切片。结果,发现在条件1-4中的任何条件下形成神经组织并且神经组织中Chx10阳性的比例为约80%(图7A-D)。从连续切片的分析,在视网膜组织中,可以证实这些Chx10阳性细胞是Rx共阳性的。
即,发现在步骤1中包括预调节,在步骤2中添加Wnt信号转导途径抑制物质以及在步骤3中添加BMP信号转导途径抑制物质,随后在含Shh血清的培养基中培养的情况下,可以从人iPS细胞有效地形成视网膜组织。
实施例6:包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转 导途径活化物质的预调节以及在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质和TGFβ信 号转导途径抑制物质的情况下,从人iPS细胞产生视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(1231A3株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质(TGFβR-i),5μM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(TGFβR-i+Shh)处理,图8“预调节:TGFβR-i+Shh”)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(TGFβR-i+Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下四个条件1-4下培养细胞。
·条件1.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图8A)。
·条件2.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(30nM)作为Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图8B)。
·条件3.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SB431542(5μM)作为TGFβ信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图8C)。
·条件4.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SB431542(5μM)作为TGFβ信号转导途径抑制物质并添加SAG(30nM)作为Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图8D)。
在悬浮培养开始后第2天,在条件1-4的任一条件下形成细胞聚集体(步骤2完成,并且步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有或不含有IWR-1e和SB431542的培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e和SB431542的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有或不含有IWR-1e和SB431542,以避免外源性IWR-1e和SB431542的浓度变化。
在悬浮培养开始后第10天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e和/或SB431542的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次,使用上述不含Y27632,SAG,人重组BMP4,IWR-1e和SB431542的无血清培养基进行半培养基更换操作。
在悬浮培养开始后第19天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现可以在条件1-4中的任何条件下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第19天的细胞聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊),或Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠)进行免疫染色。作为复染,用DAPI染色核酸。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图8)。
结果,发现在条件1-4中的任何条件下形成神经组织。在条件1中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约70%,在条件2中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约70%,在条件3中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约70%。在条件4中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约80%。从连续切片的分析,可以证实这些Chx10阳性细胞是Rx共阳性细胞。
也就是说,发现在包括在步骤2和步骤3中添加(如条件1和条件2中)Wnt信号转导途径抑制物质并且在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质浓度至3%或更低的条件下,也实现了向视网膜组织的有效分化。此外,发现在包括在步骤2和步骤3中添加(如条件3和条件4中)Wnt信号转导途径抑制物质和TGFβ信号转导途径抑制物质的条件下,也实现了向视网膜组织的有效分化。
实施例7:包括在步骤1中用BMP信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转 导途径活化物质的预调节以及在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质和TGFβ信 号转导途径抑制物质的情况下,从人iPS细胞产生视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(1231A3株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加LDN193189(BMP信号转导途径抑制物质(BMPR-i),100nM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(BMPR-i+Shh)处理,图9“预调节:BMPR-i+Shh”)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(BMPR-i+Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下两个条件1-2下培养细胞。
·条件1.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图9A)。
·条件2.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SB431542(5μM)作为TGFβ信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图9B)。
在悬浮培养开始后第2天,在条件1和条件2下形成细胞聚集体(步骤2完成,并且步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有或不含有IWR-1e和SB431542的培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有或不含有IWR-1e和SB431542,以避免外源性IWR-1e和SB431542的浓度变化。
在悬浮培养开始后第10天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e和/或SB431542的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次,使用上述不含Y27632,SAG,人重组BMP4,IWR-1e和SB431542的无血清培养基进行半培养基更换操作。
在悬浮培养开始后第19天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现可以在条件1和条件2下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第19天的细胞聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊),或Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠)进行免疫染色。作为复染,用DAPI染色核酸。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图9)。
结果,发现可以在条件1和条件2下形成神经组织。在条件1中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约80%,并且在条件2中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约90%。从连续切片的分析,可以确认这些Chx10阳性细胞是Rx共阳性细胞。
也就是说,在条件1中,发现在包括在步骤1中用BMP信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质并且在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质浓度至3%或更低的条件下,也实现了向视网膜组织的有效分化。此外,在条件2中,发现在包括步骤1中用BMPR抑制剂和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预处理并且在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质和TGFβ信号转导途径抑制物质的条件下,也实现了向视网膜细胞的有效分化。
此外,从实施例6和实施例7发现,当步骤1包括用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节或用BMPR抑制剂和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节时,通过在步骤2和步骤3添加Wnt信号转导途径抑制物质也实现了向视网膜细胞的有效分化。
实施例8:使用利用Sendivirus载体建立的人iPS细胞作为起始材料和包括步骤1 中的预调节和在步骤2中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,产生网膜组织的实施例
如下建立人iPS细胞(TFH-R1-10-2株和TFH-R2-10-F8株,由Sumitomo DainipponPharma Co.,Ltd.建立)。它们是如下建立的:根据Life Technologies公布的方案(iPS 2.0Sendai重编程试剂盒,出版号MAN0009378,修订版1.0)和京都大学公布的方案(建立人iPS细胞的维持培养,CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310,http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html)中描述的方法,并使用通过众所周知的方法制备的外周血单核细胞(PBMC)作为起始材料,可商购获得Sendivirus载体(Oct3/4,Sox2,KLF4,L-Myc 4因子CytoTune试剂盒,由DNAVEC Corporation制造(目前为ID Pharma Co.,Ltd.))和StemFit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造),层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造)。
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(TFH-R1-10-2株和TFH-R2-10-F8株)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质(TGFβR-i),5μM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(TGFβR-i+Shh)处理,图8“预调节:TGFβR-i+Shh”)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(TGFβR-i+Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入上述无血清培养基中,加入IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质(图10“Wnt-i(第0-17天)”),以及加入SAG(30nM)作为Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图10“Shh第0天”)并培养细胞。通过使用任何TFH-R1-10-2株和TFH-R2-10-F8株中任者的人iPS细胞作为起始材料,在悬浮培养开始后第2天形成细胞聚集体(步骤2完成,并且步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免IWR-1e的浓度变化。
在悬浮培养开始后第17天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现可以通过使用TFH-R1-10-2株和TFH-R2-10-F8株中任者的人iPS细胞作为起始材料形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第17天的细胞聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊),或Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠)进行免疫染色。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图10)。
结果,发现可以通过使用TFH-R1-10-2株和TFH-R2-10-F8株中任者的人iPS细胞作为起始材料形成神经组织。还发现当TFH-R1-10-2株是起始材料时(图10A),Chx10阳性视网膜组织的比例约为70%。从连续切片的分析,可以确认这些Chx10阳性细胞是Rx共阳性细胞(图10B)。发现当TFH-R2-10-F8株是起始材料时(图10C),Chx10阳性视网膜组织的比例约为90%。从连续切片的分析,可以确认这些Chx10阳性细胞是Rx共阳性细胞(图10D)。
根据这些结果,发现使用Sendivirus载体建立的作为起始材料的人iPS细胞在包括步骤1中的预调节处理和步骤2与步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的条件下也有效地分化成视网膜组织。
因此,发现视网膜细胞和/或视网膜组织可以通过本申请的产生方法由使用游离型载体建立的iPS细胞(例如,1231A3株)和使用Sendivirus载体建立的人iPS细胞(例如,TFH-R1-10-2株和TFH-R2-10-F8株)产生,不管iPS细胞的建立方法如何。
实施例9:包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转 导途径活化物质的预调节以及在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质和TGFβ信 号转导途径抑制物质的情况下,从人iPS细胞产生含有感光细胞的视网膜细胞的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(1231A3株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质(TGFβR-i),5μM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(TGFβR-i+Shh)处理)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(TGFβR-i+Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入上述无血清培养基中,加入IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质,以及加入SAG(30nM)作为Sonichedgehog信号转导途径活化物质并培养细胞。在悬浮培养开始后第2天形成细胞聚集体。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免IWR-1e的浓度变化。
在悬浮培养开始后第20天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现形成神经组织。
提取上述悬浮培养开始后第20天的一部分细胞,用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊),或Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠)进行免疫染色。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片。结果发现,在上述悬浮培养开始后第20天的细胞含有神经组织,并且所述神经组织是Chx10和Rx共阳性视网膜组织。
提取上述悬浮培养开始后第20天的一部分细胞,按照“Nature Communications6,6286(2015)”中记载的方法进行分化培养。
将悬浮培养开始后第20天的细胞聚集体转移到90mm低黏附性培养皿(由SUMITOMOBAKELITE CO.,LTD.制造)中,并在含有Wnt信号转导途径活化物质(CHIR99021,3μM)和FGF信号转导途径抑制物质(SU5402,5μM)的无血清培养基(加有1%N2补充剂的DMEM/F12培养基)中在37℃,5%CO2培养3天(即,悬浮培养开始后第23天)。在此期间,将约50个聚集体悬浮培养在每个90mm黏附性培养皿的含有上述CHIR99021和SU5402的10ml无血清培养基中。在悬浮培养开始后第23天,形成薄的神经上皮,并且形成视网膜色素上皮(RPE)样组织。
将悬浮培养开始后第23天的细胞聚集体在90mm低黏附性培养皿(由SUMITOMOBAKELITE CO.,LTD.制造)中在不含Wnt信号转导途径活化物质或FGF信号转导途径抑制物质的含血清培养基(DMEM/F12培养基,其添加有10%胎牛血清,1%N2补充剂,0.5μM视黄酸和100μM牛磺酸)在37℃,5%CO2,大气氧浓度(约20%)悬浮培养直至悬浮培养开始后第58天(35天)。从悬浮培养开始后第20天到悬浮培养完成,用上述含血清培养基每2-4天进行一次半培养基更换操作。在此期间,将每个90-mm低黏附性培养皿中约30个聚集体悬浮培养于15ml上述含血清培养基中。在悬浮培养开始后第35天存在神经视网膜样组织。
在悬浮培养开始后第58天的细胞聚集体用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果发现,除了神经组织外,还可以形成染料沉积的视网膜色素上皮细胞(图11,A,用箭头所示)。
在悬浮培养开始后第58天,将由此制备的细胞聚集体各自用4%多聚甲醛固定,制备冷冻切片。这些冷冻切片针对Rx(抗Rax/Rx抗体,由Takara制造,豚鼠)(Rx是视网膜组织标志物之一),Chx10(抗Chx10抗体,由Exalpha制造,绵羊)(Chx10是神经视网膜祖细胞标志物之一),Crx(抗Crx抗体,由Takara制造,兔)(Crx是光感受器前体细胞标记物之一),并且使用倒置荧光显微镜(由KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察。
结果发现,在上述悬浮培养开始后第58天,在细胞聚集体中形成约90%的Rx阳性视网膜组织(图11,B)。进一步发现Rx阳性视网膜组织含有Chx10阳性神经视网膜祖细胞(图11,C)。此外,发现Rx阳性视网膜组织含有Crx阳性感光细胞前体细胞(图11,D)。从形态学观察,发现Rx阳性视网膜组织含有睫状边缘带样结构(图11,E,用箭头显示)。从形态学观察,可以证实Rx阳性和Chx10阴性和Crx阴性内层视网膜神经细胞(例如,神经节细胞和无长突细胞)包含在视网膜组织的内部(图11)。
根据这些结果,发现作为起始材料的无饲养细胞培养的人iPS细胞在包括步骤1中的预调节处理和步骤2与步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的条件下有效地分化成视网膜组织。进一步发现视网膜细胞(或视网膜层特异性神经细胞),例如神经视网膜祖细胞,感光细胞前体细胞,视网膜色素上皮细胞,内层视网膜神经细胞,睫状边缘带样结构可以通过制备的视网膜组织的继续分化培养来产生。此外,发现神经视网膜祖细胞,感光细胞前体细胞,内层视网膜神经细胞在上述视网膜组织中形成具有层结构的连续上皮结构。
也就是说,发现可通过本申请的产生方法从无饲养细胞培养的人多能干细胞产生可用于再生医学,细胞移植治疗和有效性,安全性的评估研究的视网膜组织和视网膜细胞。
实施例10:包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号 转导途径活化物质的预调节以及在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况 下,从人iPS细胞产生视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(QHJI01s04株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质(TGFβR-i),5μM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(TGFβR-i+Shh)处理,图12“预调节:TGFβR-i+Shh”)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(TGFβR-i+Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件1-3的三个条件下培养细胞。
·条件1.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图12A-C,“条件1”)。
·条件2.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(10nM)作为外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图12D-F,“条件2”)。
·条件3.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(30nM)作为外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图12G-I“条件3”)。
在条件1,条件2和条件3的悬浮培养开始后第2天形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。此后,每2-4天一次用上述培养基无血清培养基进行半培养基更换操作,上述培养基无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
在悬浮培养开始后第12天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4和IWR-1e。
在悬浮培养开始后第20天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现在条件1,条件2和条件3下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第20天的聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊),或Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠),或Pax6(其是包括视网膜组织的神经组织的标志物)进行免疫染色。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图12)。
结果,发现可以在条件1,条件2和条件3中形成神经组织。在条件1中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约95%(图12A),在条件2中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约95%(图12D),在条件3中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约85%(图12G)。从连续切片的分析,可以确认这些Chx10阳性细胞是Rx和Pax6共阳性细胞。
也就是说,在条件1中,发现在包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质并且在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质浓度至3%或更低(在悬浮培养开始后第12天)的条件下,也实现了向视网膜组织的有效分化。此外,在条件2和条件3中,发现在包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2中添加Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,以及在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的条件下,也实现了向视网膜细胞的有效分化。
实施例11:包括在步骤1中用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节且 在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,从人iPS细胞产生视网膜组织 的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(QHJI01s04株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)中在包括添加SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(Shh)处理,图13“预调节:Shh”)的条件下,将在亚汇合前两天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养培养两天(也就是说,允许Sonic hedgehog信号转导途径活化物质在分化开始前作用两天)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMOBAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipidconcentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件1-3的三个条件下培养细胞。
·条件1.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图13A-C,“条件1”)。
·条件2.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(10nM)作为外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图13D-F,“条件2”)。
·条件3.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(30nM)作为外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图13G-I“条件3”)。
在条件1,条件2和条件3的悬浮培养开始后第2天形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
在悬浮培养开始后第10天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4和IWR-1e。
在悬浮培养开始后第20天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现在条件1,条件2和条件3下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第20天的细胞聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊),或Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠),或Pax6(其是包括视网膜组织的神经组织的标志物)进行免疫染色。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图13)。
结果,发现在条件1,条件2和条件3下形成神经组织。在条件1中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约95%,在条件2中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约90%,在条件3中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约70%。从连续切片的分析,可以确认这些Chx10阳性细胞是Rx和Pax6共阳性细胞。
即,在条件1中,发现在包括在步骤1中用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质并且在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质浓度至3%或更低(在悬浮培养开始后第10天)的条件下,也实现了向视网膜组织的有效分化。此外,在条件2和条件3中,发现在包括在步骤1中用Sonichedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2中添加Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,以及在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的条件下,也实现了向视网膜细胞的有效分化。
实施例12:包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号 转导途径活化物质的预调节以及在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况 下,从人iPS细胞产生包含感光细胞的视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(QHJI01s04株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质(TGFβR-i),5μM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(TGFβR-i+Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件1下培养细胞。
·条件1.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质。
在条件1,条件2和条件3的悬浮培养开始后第2天形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。此后,每2-4天一次用上述培养基无血清培养基进行半培养基更换操作,上述培养基无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
在悬浮培养开始后第10天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4和IWR-1e。
在悬浮培养开始后第20天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现形成神经组织。
提取上述悬浮培养开始后第20天的一部分细胞,按照“Nature Communications6,6286(2015)”中记载的方法进行分化培养。
将悬浮培养开始后第20天的细胞聚集体转移到90mm低黏附性培养皿(由SUMITOMOBAKELITE CO.,LTD.制造)中,并在含有Wnt信号转导途径活化物质(CHIR99021,3μM)和FGF信号转导途径抑制物质(SU5402,5μM)的无血清培养基(加有1%N2补充剂的DMEM/F12培养基)中在37℃,5%CO2培养3天(即,悬浮培养开始后第23天)。在此期间,将约50个聚集体悬浮培养在每个90mm黏附性培养皿的含有上述CHIR99021和SU5402的10ml无血清培养基中。在悬浮培养开始后第23天,形成薄的神经上皮,并且形成视网膜色素上皮(RPE)样组织。
将悬浮培养开始后第23天的细胞聚集体在90mm低黏附性培养皿(由SUMITOMOBAKELITE CO.,LTD.制造)中在不含Wnt信号转导途径活化物质或FGF信号转导途径抑制物质的含血清培养基(DMEM/F12培养基,其添加有10%胎牛血清,1%N2补充剂,0.5μM视黄酸和100μM牛磺酸)在37℃,5%CO2,大气氧浓度(约20%)悬浮培养直至悬浮培养开始后第85天(62天)。从悬浮培养开始后第23天到悬浮培养完成,用上述含血清培养基每2-4天进行一次半培养基更换操作。在此期间,将每个90-mm低黏附性培养皿中约30个聚集体悬浮培养于15ml上述含血清培养基中。在悬浮培养开始后第35天存在神经视网膜样组织。
在悬浮培养开始后第85天的细胞聚集体用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现形成了具有连续上皮结构的神经组织(图14A)。
在悬浮培养开始后第85天,将由此制备的细胞聚集体各自用4%多聚甲醛固定,制备冷冻切片。这些冷冻切片针对以下进行染色:Crx(抗Crx抗体,由Takara制造,兔),其是感光细胞前体细胞标志物之一;Chx10(抗Chx10抗体,由Exalpha制造,绵羊),其是神经视网膜祖细胞标志物之一;Rx(抗Rax/Rx抗体,由Takara制造,豚鼠),其是视网膜组织标志物之一;恢复蛋白(抗恢复蛋白抗体,由Proteintech制造,兔),其是感光细胞标志物之一;NRL(抗NRL抗体,由R和D制造,山羊),其是杆感光细胞前体细胞标志物之一;RXR-γ(抗RXRG抗体,由R和D制造,山羊),其是锥感光细胞前体细胞标志物之一;N-钙粘蛋白(抗N-钙粘蛋白抗体,由BD制造,小鼠),其是神经组织标志物之一;Aqp1(抗Aqp1抗体,由Millipore制造,兔),其是RPE和睫状边缘标志物之一;并且使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察。作为复染,用DAPI染色核酸。
结果发现,在悬浮培养开始后第85天,在上述细胞聚集体中形成约含有Chx10阳性神经视网膜祖细胞和Crx阳性感光细胞前体细胞的90%视网膜组织(图14,B)。从连续切片的分析中,发现视网膜组织是Rx阳性视网膜组织并含有恢复蛋白阳性感光细胞(图14,C)。从连续切片的分析中,发现视网膜组织含有NRL阳性杆感光细胞前体细胞和RXR-γ阳性锥感光细胞前体细胞(图14,D)。此外,发现视网膜组织是N-钙粘蛋白阳性神经组织(图14E)。
根据这些结果,发现作为起始材料的无饲养细胞培养的人iPS细胞在包括步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节处理和步骤2与步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的条件下有效地分化成视网膜组织。进一步发现视网膜细胞(或视网膜特异性神经细胞),例如神经视网膜祖细胞,感光细胞前体细胞,感光细胞,锥感光细胞前体细胞,杆感光细胞前体细胞可以通过制备的视网膜组织的继续分化培养来产生。此外,发现神经视网膜祖细胞,感光细胞前体细胞,感光细胞在上述视网膜组织中形成具有层结构的连续上皮结构。
实施例13:包括在步骤1中用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节且 在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,从人iPS细胞产生包含感光细 胞的视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(QHJI01s04株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)中在包括添加SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(Shh)处理,图15)的条件下,将在亚汇合前两天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养培养两天(也就是说,允许Sonic hedgehog信号转导途径活化物质在分化开始前作用两天)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMOBAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipidconcentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件的三个条件下培养细胞。
·条件1.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(30nM)作为外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质。
在条件1,条件2和条件3的悬浮培养开始后第2天形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
在悬浮培养开始后第9天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4和IWR-1e。
在悬浮培养开始后第19天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现形成神经组织。
提取上述悬浮培养开始后第19天的一部分细胞,按照“Nature Communications6,6286(2015)”中记载的方法进行分化培养。
将悬浮培养开始后第19天的细胞聚集体转移到90mm低黏附性培养皿(由SUMITOMOBAKELITE CO.,LTD.制造)中,并在含有Wnt信号转导途径活化物质(CHIR99021,3μM)和FGF信号转导途径抑制物质(SU5402,5μM)的无血清培养基(加有1%N2补充剂的DMEM/F12培养基)中在37℃,5%CO2培养3天(即,悬浮培养开始后第22天)。在此期间,将约50个聚集体悬浮培养在每个90mm黏附性培养皿的含有上述CHIR99021和SU5402的10ml无血清培养基中。在悬浮培养开始后第22天,形成薄的神经上皮,并且形成视网膜色素上皮(RPE)样组织。
将悬浮培养开始后第22天的细胞聚集体在90mm低黏附性培养皿(由SUMITOMOBAKELITE CO.,LTD.制造)中在不含Wnt信号转导途径活化物质或FGF信号转导途径抑制物质的含血清培养基(DMEM/F12培养基,其添加有10%胎牛血清,1%N2补充剂,0.5μM视黄酸和100μM牛磺酸)在37℃,5%CO2,大气氧浓度(约20%)悬浮培养直至悬浮培养开始后第92天(70天)。从悬浮培养开始后第20天到悬浮培养完成,用上述含血清培养基每2-4天进行一次半培养基更换操作。在此期间,将每个90-mm低黏附性培养皿中约30个聚集体悬浮培养于15ml上述含血清培养基中。在悬浮培养开始后第35天存在神经视网膜样组织。
在悬浮培养开始后第92天的细胞聚集体用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现形成了具有连续上皮结构的神经组织(图15A)。
在悬浮培养开始后第92天,将由此制备的细胞聚集体各自用4%多聚甲醛固定,制备冷冻切片。这些冷冻切片针对以下进行染色:Crx(抗Crx抗体,由Takara制造,兔),其是感光细胞前体细胞标志物之一;Chx10(抗Chx10抗体,由Exalpha制造,绵羊),其是神经视网膜祖细胞标志物之一;Rx(抗Rax/Rx抗体,由Takara制造,豚鼠),其是视网膜组织标志物之一;恢复蛋白(抗恢复蛋白抗体,由Proteintech制造,兔),其是感光细胞标志物之一;NRL(抗NRL抗体,由R和D制造,山羊),其是杆感光细胞前体细胞标志物之一;RXR-γ(抗RXRG抗体,由R和D制造,山羊),其是锥感光细胞前体细胞标志物之一;N-钙粘蛋白(抗N-钙粘蛋白抗体,由BD制造,小鼠),其是神经组织标志物之一;Aqp1(抗Aqp1抗体,由Millipore制造,兔),其是RPE和睫状边缘标志物之一;并且使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察。作为复染,用DAPI染色核酸。
结果发现,在悬浮培养开始后第92天,在上述细胞聚集体中形成约含有Chx10阳性神经视网膜祖细胞和Crx阳性感光细胞前体细胞的80%视网膜组织(图15,B)。从连续切片的分析中,发现视网膜组织是Rx阳性视网膜组织并含有恢复蛋白阳性感光细胞(图15,C)。从连续切片的分析中,发现视网膜组织含有NRL阳性杆感光细胞前体细胞和RXR-γ阳性锥感光细胞前体细胞(图15,D)。此外,从连续切片的分析中,发现视网膜组织是N-钙粘蛋白阳性神经组织(图15,E)。从连续切片的分析中,发现视网膜组织含有Aqp1阳性睫状边缘样结构(图15,E)。
根据这些结果,发现作为起始材料的无饲养细胞培养的人iPS细胞在包括步骤1中使用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节处理,步骤2中添加Sonic hedgehog信号转导途径活化物质和步骤2与步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的条件下有效地分化成视网膜组织。进一步发现视网膜细胞(或视网膜特异性神经细胞),例如神经视网膜祖细胞,感光细胞前体细胞,感光细胞,锥感光细胞前体细胞,杆感光细胞前体细胞,睫毛边缘样结构可以通过制备的视网膜组织的继续分化培养来产生。此外,发现神经视网膜祖细胞,感光细胞前体细胞,感光细胞在上述视网膜组织中形成具有层结构的连续上皮结构。
实施例14:包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号 转导途径活化物质的预调节以及在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况 下,从人iPS细胞产生视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(QHJI01s04株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质(TGFβR-i),5μM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(TGFβR-i+Shh)处理,图16“预调节:TGFβR-i+Shh”)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(TGFβR-i+Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有6%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件下培养细胞。
·条件.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(30nM)作为外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图16,A,B)。
到悬浮培养开始后第2天,形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
此外,细胞在以下条件A,B的两种条件下在无血清培养基中培养。
·条件A.在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,所述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
·条件B.在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度不会改变。此外,在悬浮培养开始后第6天,使用不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)和IWR-1e的上述无血清培养基进行半培养基更换操作,使得外源人重组BMP4和外源IWR-1e的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,所述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
在上述条件A,B的两个条件下培养后,如下进一步培养细胞。
在悬浮培养开始后第12天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4和IWR-1e。
在悬浮培养开始后第18天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现在条件A和条件B下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第18天的聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊)进行免疫染色,Chx10是视网膜组织标志物之一。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图16A,B)。
结果,发现在条件A和条件B下形成神经组织。在条件A中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约80%,并且在条件B中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约80%。
也就是说,发现当外源性BMP的添加条件是条件A和条件B的任何条件时,在包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonichedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2中添加Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质并且在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质浓度至3%或更低(在悬浮培养开始后第12天)以及上述无血清培养基中含有的KSR浓度为6%的条件下,也实现了向视网膜组织的有效分化。
实施例15:包括在步骤1中用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节且 在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,从人iPS细胞产生视网膜组织 的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(QHJI01s04株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前两天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养两天:上述条件包括添加SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(Shh)处理,图16“预调节:Shh”)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMOBAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有6%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipidconcentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件下培养细胞。
·条件.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图16,C,D)。
到悬浮培养开始后第2天,形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
此外,细胞在以下条件C和D的两种条件下在无血清培养基中培养。
·条件C.在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,所述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
·条件D.在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度不会改变。此外,在悬浮培养开始后第6天,使用不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)和IWR-1e的上述无血清培养基进行半培养基更换操作,使得外源人重组BMP4和外源IWR-1e的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,所述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
在上述条件C和D的两个条件下培养后,如下培养细胞。
在悬浮培养开始后第12天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4和IWR-1e。
在悬浮培养开始后第18天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现在条件C和条件D下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第18天的聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊)进行免疫染色,Chx10是视网膜组织标志物之一。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图16C,D)。
结果,发现在条件C和条件D下形成神经组织。在条件C中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约80%,并且在条件D中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约80%。
也就是说,发现当外源性BMP的添加条件是条件C和条件D的任何条件时,在包括在步骤1中用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质并且在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质浓度至3%或更低(在悬浮培养开始后第12天)以及上述无血清培养基中含有的KSR浓度为6%的条件下,也实现了向视网膜组织的有效分化。
实施例16:包括在步骤1中用BMP信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转 导途径活化物质的预调节以及在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况 下,从人iPS细胞产生视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(QHJI01s04株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加LDN193189(BMP信号转导途径抑制物质(BMPR-i),100nM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(BMPR-i+Shh)处理,图17“预调节:BMPR-i+Shh”)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(BMPR-i+Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件下培养细胞。
·条件1.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图17,A,B)。
到悬浮培养开始后第2天,形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
此外,细胞在以下条件A,B的两种条件下在无血清培养基中培养。
·条件A.在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,所述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
·条件B.在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。此外,在悬浮培养开始后第6天,使用不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)和IWR-1e的上述无血清培养基进行半培养基更换操作,使得外源人重组BMP4和外源IWR-1e的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,所述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
在上述条件A,B的两个条件下培养后,如下培养细胞。
在悬浮培养开始后第10天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4和IWR-1e。
在悬浮培养开始后第20天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现在条件A和条件B下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第20天的聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊)进行免疫染色,Chx10是视网膜组织标志物之一。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图17A,B)。
结果,发现在条件A和条件B下形成神经组织。在条件A中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约90%,并且在条件B中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约90%。
也就是说,发现当外源性BMP的添加条件是条件A和条件B的任何条件时,在包括在步骤1中用BMP信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质并且在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质浓度至3%或更低(在悬浮培养开始后第10天)的条件下,也实现了向视网膜组织的有效分化。
实施例17:包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号 转导途径活化物质的预调节以及在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况 下,从人iPS细胞产生视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(QHJI01s04株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前两天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM),由此制备亚汇合前一天的人iPS细胞。此外在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前一天的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质(TGFβR-i),5μM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预处理(TGFβR-i24h+Shh 48h)处理,图18)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(TGFβR-i 24h+Shh 48h)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件下培养细胞。
·条件.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图18,A,B)。
到悬浮培养开始后第2天,形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
此外,细胞在以下条件A,B的两种条件下在无血清培养基中培养。
·条件A.在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,所述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
·条件B.在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。此外,在悬浮培养开始后第6天,使用不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)和IWR-1e的上述无血清培养基进行半培养基更换操作,使得外源人重组BMP4和外源IWR-1e的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,所述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
在上述条件A,B的两个条件下培养后,如下进一步培养细胞。
在悬浮培养开始后第10天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4和IWR-1e。
在悬浮培养开始后第20天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现在条件A和条件B下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第20天的聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊)进行免疫染色,Chx10是视网膜组织标志物之一。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图18A,B)。
结果,发现在条件A和条件B下形成神经组织。在条件A中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约80%,并且在条件B中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约80%。
也就是说,发现当外源性BMP的添加条件是条件A和条件B的任何条件时,在包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质并且在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质浓度至3%或更低(在悬浮培养开始后第10天)的条件下,也实现了向视网膜组织的有效分化。
实施例18:包括在步骤1中用BMP信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转 导途径活化物质的预调节以及在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况 下,从人iPS细胞产生视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(QHJI01s04株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前两天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM),由此制备亚汇合前一天的人iPS细胞。此外在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前一天的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加LDN193189(BMP信号转导途径抑制物质(BMPR-i),100nM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预处理(BMPR-i 24h+Shh 48h)处理,图19)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(BMPR-i 24h+Shh 48h)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件下培养细胞。
·条件.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图19,A,B)。
到悬浮培养开始后第2天,形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
此外,细胞在以下条件A,B的两种条件下在无血清培养基中培养。
·条件A.在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,所述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
·条件B.在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。此外,在悬浮培养开始后第6天,使用不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)和IWR-1e的上述无血清培养基进行半培养基更换操作,使得外源人重组BMP4和外源IWR-1e的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,所述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
在上述条件A,B的两个条件下如下培养细胞。
在悬浮培养开始后第10天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4和IWR-1e。
在悬浮培养开始后第20天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现在条件A和条件B下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第20天的聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊)进行免疫染色,Chx10是视网膜组织标志物之一。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图19A,B)。
结果,发现在条件A和条件B下形成神经组织。在条件A中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约50%,并且在条件B中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约70%。
也就是说,发现当外源性BMP的添加条件是条件A和条件B的任何条件时,在包括在步骤1中用BMP信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质并且在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质浓度至3%或更低(在悬浮培养开始后第10天)的条件下,也实现了向视网膜组织的分化。
实施例19:包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号 转导途径活化物质的预调节以及在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质和TGFβ 信号转导途径抑制物质的情况下,从人iPS细胞产生视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(QHJI01s04株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质(TGFβR-i),5μM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(TGFβR-i+Shh)处理,图20“预调节:TGFβR-i+Shh”)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(TGFβR-i+Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件下培养细胞。
·条件.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SB431542(5μM)作为TGFβ信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图20,A,B)。
到悬浮培养开始后第2天,形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
此外,细胞在以下条件A,B的两种条件下在无血清培养基中培养。
·条件A.在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e和SB431542的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e(3μM)和SB431542(5μM)的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用上述培养基无血清培养基进行半培养基更换操作,上述培养基无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e和SB431542,以避免外源IWR-1e和SB431542的浓度变化。
·条件B.在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e和SB431542的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e(3μM)和SB431542(5μM)的浓度不会改变。此外,在悬浮培养开始后第6天,使用不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)和IWR-1e和SB431542的上述无血清培养基进行半培养基更换操作,使得外源人重组BMP4和外源IWR-1e和SB431542的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,所述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e和SB431542的浓度变化。
在上述条件A,B的两个条件下培养后,如下进一步培养细胞。
在悬浮培养开始后第10天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e和SB431542的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4,IWR-1e和SB431542。
在悬浮培养开始后第20天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现在条件A和条件B下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第20天的聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊)进行免疫染色,Chx10是视网膜组织标志物之一。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图20A,B)。
结果,发现在条件A和条件B下形成神经组织。在条件A中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约95%,并且在条件B中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约95%。
也就是说,发现当外源性BMP的添加条件是条件A和条件B的任何条件时,在包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质和TGFβ信号转导途径抑制物质并且在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质和TGFβ信号转导途径抑制物质浓度至3%或更低(在悬浮培养开始后第10天)的条件下,也实现了向视网膜组织的有效分化。
实施例20:包括在步骤1中用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节以 及在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质和TGFβ信号转导途径抑制物质的情况 下,从人iPS细胞产生视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(QHJI01s04株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前两天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养两天:上述条件包括添加SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(Shh)处理,图21“预调节:Shh 48h”)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMOBAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.0×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipidconcentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中培养细胞。在悬浮培养开始后第2天形成细胞聚集体。
·条件.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SB431542(5μM)作为TGFβ信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图21,A,B)。
到悬浮培养开始后第2天,形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
此外,细胞在以下条件A,B的两种条件下在无血清培养基中培养。
·条件A.在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e和SB431542的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e(3μM)和SB431542(5μM)的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用上述培养基无血清培养基进行半培养基更换操作,上述培养基无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e和SB431542,以避免外源IWR-1e和SB431542的浓度变化。
·条件B.在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e和SB431542的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e(3μM)和SB431542(5μM)的浓度不会改变。此外,在悬浮培养开始后第6天,使用不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)和IWR-1e和SB431542的上述无血清培养基进行半培养基更换操作,使得外源人重组BMP4和外源IWR-1e的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,所述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e和SB431542的浓度变化。
将在上述条件A,B的两个条件下培养的细胞如下培养。
在悬浮培养开始后第10天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e和SB431542的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4,IWR-1e和SB431542。
在悬浮培养开始后第20天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现在条件A和条件B下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第20天的聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊)进行免疫染色,Chx10是视网膜组织标志物之一。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图21A,B)。
结果,发现在条件A和条件B下形成神经组织。在条件A中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约80%,并且在条件B中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约80%。
也就是说,发现当外源性BMP的添加条件是条件A和条件B的任何条件时,在包括在步骤1中用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质和TGFβ信号转导途径抑制物质并且在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质和TGFβ信号转导途径抑制物质浓度至3%或更低(在悬浮培养开始后第10天)的条件下,也实现了向视网膜组织的有效分化。
实施例21:包括在步骤1中用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节且 在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,从人iPS细胞产生视网膜组织 的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(QHJI01s04株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前两天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养两天:上述条件包括添加SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(Shh)处理,图22)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMOBAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.3×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipidconcentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件1和条件2下培养细胞。
·条件1.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图22A,B)。
·条件2.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(10nM)作为外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图22C,D)。
在条件1和条件2的悬浮培养开始后第2天形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,在条件1和条件2下,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。
在悬浮培养开始后第6天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4和IWR-1e。
在悬浮培养开始后第18天如此制备的细胞用倒置显微镜(由NikonCorporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现在条件1和条件2下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第18天的聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊),或Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠)进行免疫染色。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片。
结果,发现在条件1和条件2下形成神经组织。在条件1中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约90%(图22A),并且在条件2中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约80%(图22C)。从连续切片的分析中,发现条件1和条件2中的Chx10阳性细胞是Rx共阳性细胞(图22B,D)。
悬浮培养开始后的%或更少,即,在步骤2中添加或不添加Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的条件下,在包括在步骤1中使用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质,在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质至3%或更低(在悬浮培养开始后第6天)的条件下,也实现了向视网膜组织的有效分化。
实施例22:包括在步骤1中用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节且 在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,从人iPS细胞产生包含感光细 胞前体细胞和神经节细胞的视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(QHJI01s04株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前两天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养两天:上述条件包括添加SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(Shh)处理,图23)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMOBAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.3×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipidconcentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件1和条件2下培养细胞。
·条件1.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图23A-D)。
·条件2.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(10nM)作为外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图23E-H)。
在条件1和条件2的悬浮培养开始后第2天形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,在条件1和条件2下,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。
在悬浮培养开始后第6天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4和IWR-1e。
在悬浮培养开始后第11天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现在条件1和条件2下形成神经组织。
提取上述悬浮培养开始后第11天的一部分聚集体,用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊),或Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠)进行免疫染色。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片。
结果,发现在条件1和条件2下形成神经组织。在条件1中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约90%(图23A),并且在条件B中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约90%(图23E)。从连续切片的分析中,发现条件1和条件2中的Chx10阳性细胞是Rx共阳性细胞(图23B,F)。
在条件1和条件2下,提取上述悬浮培养开始后第11天的一部分细胞,按照“NatureCommunications 6,6286(2015)”中记载的方法进行分化培养。
将悬浮培养开始后第11天的细胞聚集体转移到90mm低黏附性培养皿(由SUMITOMOBAKELITE CO.,LTD.制造)中,并在含有Wnt信号转导途径活化物质(CHIR99021,3μM)和FGF信号转导途径抑制物质(SU5402,5μM)的无血清培养基(加有1%N2补充剂的DMEM/F12培养基)中在37℃,5%CO2培养3天(即,悬浮培养开始后第14天)。在此期间,将约50个聚集体悬浮培养在每个90mm黏附性培养皿的含有上述CHIR99021和SU5402的10ml无血清培养基中。在悬浮培养开始后第14天,形成薄的神经上皮,并且形成视网膜色素上皮(RPE)样组织。
将悬浮培养开始后第14天的细胞聚集体在90mm低黏附性培养皿(由SUMITOMOBAKELITE CO.,LTD.制造)中在不含Wnt信号转导途径活化物质或FGF信号转导途径抑制物质的含血清培养基(DMEM/F12培养基,其添加有10%胎牛血清,1%N2补充剂,和100μM牛磺酸)在37℃,5%CO2,大气氧浓度(约20%)悬浮培养直至悬浮培养开始后第35天(21天)。从悬浮培养开始后第20天到悬浮培养完成,用上述含血清培养基每2-4天进行一次半培养基更换操作。在此期间,将每个90-mm低黏附性培养皿中约30个聚集体悬浮培养于15ml上述含血清培养基中。
在悬浮培养开始后第35天的细胞聚集体用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现存在神经视网膜样组织,并且可以形成具有连续上皮结构的神经组织。
在悬浮培养开始后第35天,将由此制备的细胞聚集体各自用4%多聚甲醛固定,制备冷冻切片。将这些冷冻切片针对Crx(其是感光细胞前体细胞标记物之一)(抗Crx抗体,由Takara制造,兔),或Brn3b(其是神经节细胞标记物之一)(抗Brn3b抗体,由Santa Cruz制造,山羊)免疫染色,并且使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察。
结果发现,在条件1和条件2下悬浮培养开始后第35天,在上述细胞聚集体中形成约90%含有Crx阳性感光细胞前体细胞的视网膜组织(图23C,G)。从连续切片的分析中,发现视网膜组织含有Brn3b阳性神经节细胞(图23D,H)。
根据这些结果,发现作为起始材料的无饲养细胞培养的人iPS细胞在步骤2中添加或不添加Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的条件下在包括步骤1中用Sonichedgehog信号转导途径活化物质的预调节处理和步骤2与步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的条件下也有效地分化成视网膜组织。进一步发现视网膜细胞(或视网膜特异性神经细胞),例如感光细胞前体细胞和神经节细胞可以通过制备的视网膜组织的继续分化培养来产生。此外,发现感光细胞前体细胞和神经节细胞在上述视网膜组织中形成具有层结构的连续上皮结构。
实施例23:使用利用Sendivirus载体建立的人iPS细胞作为起始材料和包括步骤1 中的预调节和在步骤2中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,产生网膜组织的实施例
如下建立人iPS细胞(TFH-HA株,由Sumitomo Dainippon Pharma Co.,Ltd.建立)。使用通过众所周知的方法制备的外周血单核细胞(PBMC)作为起始材料,商业上可获得的Sendivirus载体(4因子(Oct3/4,Sox2,KLF4,L-Myc)CytoTune试剂盒,由ID Pharma Co.,Ltd.制造),和StemFit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造),层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造)来建立iPS细胞。
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(TFH-HA株)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质(TGFβR-i),5μM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(TGFβR-i+Shh)处理,图24“预调节:TGFβR-i+Shh”)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(TGFβR-i+Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.3×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件1和2的两个条件下培养细胞。
·条件1.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图24A,B,“条件1”)。
·条件2.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(10nM)作为外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图24E,F“条件2”)。
在悬浮培养开始后第2天,在条件1和条件2下形成细胞聚集体(步骤2完成,并且步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e(3μM)的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
在悬浮培养开始后第12天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4和IWR-1e。
在悬浮培养开始后第9天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现在条件1和条件2下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第19天的细胞聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊),或Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠)进行免疫染色。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图24)。
结果,发现可以在条件1和条件2中形成神经组织。在条件1中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约90%(图24A),并且在条件2中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约90%(图24E)。从连续切片的分析,可以确认这些Chx10阳性细胞是Rx共阳性细胞(图24B,F)。
也就是说,使用利用Sendivirus载体建立的人iPS细胞作为条件1中的起始材料,发现在包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2中不添加Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质并且在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质浓度至3%或更低(在悬浮培养开始后第12天)的条件下,也实现了向视网膜组织的有效分化。此外,使用利用Sendaivirus载体建立的人iPS细胞作为条件2中的起始材料,发现在包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2中添加Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,以及在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的条件下,也实现了向视网膜细胞的有效分化。
实施例24:使用利用Sendivirus载体建立的人iPS细胞作为起始材料和包括步骤1 中的预调节和在步骤2中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,产生网膜组织的实施例
如实施例23中所述建立人iPS细胞(TFH-HA株,由Sumitomo Dainippon PharmaCo.,Ltd.建立)。根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前两天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养两天:上述条件包括添加SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(300nM)(图24“预调节:Shh”)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96V底板,由SUMITOMOBAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.3×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipidconcentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件3和4的两个条件下培养细胞。
·条件3.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并且不添加外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图24C,D,“条件3”)。
·条件4.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(10nM)作为外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(图24G,H“条件4”)。
在悬浮培养开始后第2天,在条件3和条件4下形成细胞聚集体(步骤2完成,并且步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第3天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e(3μM)的浓度不会改变。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
在悬浮培养开始后第12天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4和IWR-1e。
在悬浮培养开始后第9天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现在条件3和条件4下形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第19天的细胞聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊),或Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠)进行免疫染色。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图24)。
结果,发现可以在条件3和条件4下形成神经组织。在条件3中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约60%(图24C),并且在条件4中,Chx10阳性视网膜组织的比例为约50%(图24G)。从连续切片的分析,可以确认这些Chx10阳性细胞是Rx共阳性细胞(图24D,H)。
也就是说,使用利用Sendivirus载体建立的人iPS细胞作为条件3中的起始材料,发现在包括在步骤1中用Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2中不添加Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质并且在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质浓度至3%或更低(在悬浮培养开始后第12天)的条件下,也实现了向视网膜组织的有效分化。此外,使用利用Sendivirus载体建立的人iPS细胞作为条件4中的起始材料,发现在包括在步骤1中用Sonichedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2中添加Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质并且在步骤3的过程中降低外源性Wnt信号转导途径抑制物质浓度至3%或更低的条件下,也实现了向视网膜细胞的有效分化。
实施例25:包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonic hedgehog信号 转导途径活化物质的预调节以及在步骤2和步骤3中使用Wnt信号转导途径抑制物质的情况 下,从人iPS细胞产生视网膜组织的实施例
根据实施例1中描述的方法并且使用作为无饲养细胞培养基的StemFit(注册商标)培养基(AK03N,由Ajinomoto Co.,Inc.制造)和作为无饲养细胞的支架的层粘连蛋白511-E8(由Nippi,Inc.制造),将人iPS细胞(1231A3株,来自Kyoto University)在无饲养细胞情况下培养。
在Stem Fit(注册商标)培养基(AK03N;由Ajinomoto Co.,Inc.制造)在以下条件下将在亚汇合前一天的无饲养细胞培养的人iPS细胞进行无饲养细胞培养一天:上述条件包括添加SB431542(TGFβ信号转导途径抑制物质(TGFβR-i),5μM)和SAG(Sonic hedgehog信号转导途径活化物质(Shh),300nM)(步骤1:预调节(TGFβR-i+Shh)处理,图25“预调节:TGFβR-i+Shh”)。
通过使用TrypLE Select(Life Technologies)用细胞分散溶液处理由此制备的预调节(TGFβR-i+Shh)处理的人iPS细胞,进一步通过移液操作分散为单细胞,将上述分散为单细胞中的人iPS细胞悬浮于非细胞黏附性96孔培养板(PrimeSurface 96狭缝孔板,由SUMITOMO BAKELITE制造)100μl无血清培养基中,每孔1.3×104个细胞。此后,将细胞在37℃,5%CO2下进行悬浮培养。作为针对性的无血清培养基(gfCDM+KSR),使用以下无血清培养基:其是补充有10%KSR,450μM 1-硫代甘油,1x化学定义的脂质浓缩物(Chemically-defined Lipid concentrated)的F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合物。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始(步骤2开始)后第0天),将Y27632(终浓度20μM)加入到上述无血清培养基中,并在无血清培养基中在以下条件2下培养细胞。
·条件2.包括在步骤2开始时向上述无血清培养基中添加IWR-1e(3μM)作为Wnt信号转导途径抑制物质并添加SAG(10nM)作为外源Sonic hedgehog信号转导途径活化物质
到悬浮培养开始后第2天,形成细胞聚集体(步骤2完成,步骤3开始)。
在悬浮培养开始后第4天,加入不含有Y27632或SAG、含有人重组BMP4(由R&D制造)并且进一步含有IWR-1e的培养基培养基50μl,使得外源人重组BMP4的最终浓度为1.5nM(55ng/ml),并且外源IWR-1e的浓度(3μM)不会改变。此后,每2-4天一次用无血清培养基进行半培养基更换操作,所述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4并进一步含有IWR-1e,以避免外源IWR-1e的浓度变化。
在悬浮培养开始后第10天,使用上述无血清培养基进行3次80%培养基更换操作,使得外源IWR-1e的浓度与培养基更换之前相比为3%或更低。此后,每2-4天一次用上述无血清培养基进行半培养基更换操作,上述无血清培养基不含Y27632,SAG,人重组BMP4和IWR-1e。
在悬浮培养开始后第17天如此制备的细胞用倒置显微镜(由Nikon Corporation制造,ECLIPSE Ti)进行明视野观察。结果,发现形成神经组织。
在上述悬浮培养开始后第17天的聚集体用4%多聚甲醛固定以产生冷冻切片。这些冷冻切片针对Chx10(其是视网膜组织标志物之一)(抗Chx10抗体,Exalpha,绵羊),或Rx(其是视网膜组织标志物之一)(抗Rx抗体,Takara,豚鼠)进行免疫染色。使用倒置荧光显微镜(KEYENCE CORPORATION制造,BIOREVO)观察这些染色切片(图25)。
结果,发现可以形成神经组织。在这种情况下,Chx10阳性视网膜组织的比例约为90%(图25A)。从连续切片的分析,可以确认这些Chx10阳性细胞是Rx共阳性细胞(图25,B)。
也就是说,发现在包括在步骤1中用TGFβ信号转导途径抑制物质和Sonichedgehog信号转导途径活化物质的预调节,在步骤2中添加Sonic hedgehog信号转导途径活化物质并且接种到狭缝孔板中,以及在步骤2和步骤3中添加Wnt信号转导途径抑制物质的条件下,也实现了向视网膜细胞的有效分化。
[工业适用性]
根据本发明,视网膜细胞或视网膜组织以及用于产生这些细胞的细胞聚集体可以从在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞高效产生。
在本说明书中陈述的任何出版物(包括专利,专利申请和科学文献)中公开的内容,在此以引用的方式整体并入本文中公开的内容,至它们已经在本文中公开的程度。
本申请基于在日本提交的专利申请号2016-086602(申请日:2016年4月22日),其全部内容并入本文。

Claims (32)

1.用于产生视网膜细胞或视网膜组织的方法,其包括以下步骤(1)-(3):
(1)第一步骤:在不存在饲养细胞的情况下在含有以下的培养基中培养多能干细胞:1)TGFβ家族信号转导途径抑制物质和/或Sonic hedgehog信号转导途径活化物质,以及2)用于维持未分化状态的因子,
(2)第二步骤:将在第一步骤中获得的细胞在含有Wnt信号转导途径抑制物质的培养基中悬浮培养,形成细胞聚集体,和
(3)第三步骤:在含有BMP信号转导途径活化物质的培养基中在存在或不存在Wnt信号转导途径抑制物质的情况下,将第二步骤中获得的聚集体悬浮培养,以获得含有视网膜细胞或视网膜组织的聚集体。
2.权利要求1的产生方法,其中所述多能干细胞在第一步骤中培养0.5小时至144小时。
3.权利要求1或2的产生方法,其中,所述第一步骤中的培养通过黏附培养进行。
4.权利要求1-3中任一项的产生方法,其中在第二步骤中,使第一步骤中获得的细胞分散,并将分散的细胞悬浮培养。
5.权利要求1-4中任一项的产生方法,其中所述维持未分化状态的因子至少包括FGF信号转导途径活化物质。
6.权利要求5的产生方法,其中所述FGF信号转导途径活化物质是bFGF。
7.权利要求1-6中任一项的产生方法,其中在第二步骤中用于悬浮培养的培养基还包含Sonic hedgehog信号转导途径活化物质。
8.权利要求7的产生方法,其中所述多能干细胞是人多能干细胞,并且在第二步骤中,培养基中Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的浓度是对应于在10nM至700nM的SAG的Sonic hedgehog信号转导活性的浓度。
9.权利要求1-8中任一项的产生方法,其中所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质是TGFβ信号转导途径抑制物质或BMP信号转导途径抑制物质。
10.权利要求1-9中的产生方法,其中所述TGFβ家族信号转导途径抑制物质是选自由Lefty,SB431542,A-83-01和LDN193189组成的组中的一种或多种物质。
11.权利要求1-10中任一项的产生方法,其中所述Sonic hedgehog信号转导途径活化物质是选自由Shh,SAG和嘌吗啡胺组成的组中的一种或多种物质。
12.权利要求1-11中任一项的产生方法,其中在第三步骤中,在第二步骤开始的第1天和第9天之间将BMP信号转导途径活化物质添加到培养基中。
13.权利要求12的产生方法,其中在第三步骤中,在第二步骤开始的第1天和第6天之间将BMP信号转导途径活化物质加入到培养基中。
14.权利要求13的产生方法,其中在第三步骤中,在第二步骤开始的第1天和第3天之间将BMP信号转导途径活化物质加入到培养基中。
15.权利要求1-14中任一项的产生方法,其中所述BMP信号转导途径活化物质是选自由BMP2,BMP4,BMP7和GDF7组成的组中的一种或多种蛋白质。
16.权利要求1-15中任一项的产生方法,其中所述BMP信号转导途径活化物质是BMP4。
17.权利要求1-16中任一项的产生方法,其中在第三步骤中,培养基中Sonic hedgehog信号转导途径活化物质的浓度不超过对应于在700nM的SAG的Sonic hedgehog信号转导活性的浓度。
18.权利要求1-17中任一项的产生方法,其中所述培养在含有Wnt信号转导途径抑制物质的培养基中从第二步骤开始进行3天至18天。
19.权利要求1-18中任一项的产生方法,其中所述培养在含有Wnt信号转导途径抑制物质的培养基中从第二步骤开始进行10天。
20.权利要求1-19中任一项的产生方法,其中所述Wnt信号转导途径抑制物质是IWR-1-endo。
21.权利要求1-20中任一项的产生方法,其中在第三步骤中获得的聚集体包含一种或多种选自由以下组成的组的细胞:视网膜祖细胞,神经视网膜祖细胞,感光细胞前体细胞,感光细胞,杆感光细胞,锥感光细胞,水平细胞,无长突细胞,中间神经元,神经节细胞,双极细胞,视网膜色素上皮细胞和睫状边缘带细胞。
22.权利要求1至21中任一项的产生方法,其中所述多能干细胞是人多能干细胞。
23.权利要求1-22中任一项的产生方法,其中所述多能干细胞是诱导的多能干细胞。
24.权利要求1-23中任一项的产生方法,其中在第二步骤中形成均匀的聚集体。
25.权利要求1-24中任一项的产生方法,其中悬浮培养是在不存在基膜制剂的情况下进行。
26.用于评价测试物质的毒性或功效的试剂,其包含通过权利要求1-25中任一项的方法产生的视网膜细胞或视网膜组织。
27.用于评估测试物质的毒性或功效的方法,其包括使所述物质与通过权利要求1-25中任一项的方法产生的视网膜细胞或视网膜组织接触,并检测所述物质对所述细胞或组织的影响。
28.用于治疗由视网膜细胞或视网膜组织失调引起的疾病的药物,其包含通过权利要求1-25中任一项的方法产生的视网膜细胞或视网膜组织。
29.权利要求28的药物,其中所述视网膜细胞或视网膜组织是视网膜祖细胞,视网膜层特异性神经细胞或视网膜组织。
30.治疗由视网膜细胞或视网膜组织失调引起的疾病的方法,其包括移植通过权利要求1-25中任一项的方法产生的有效量的视网膜细胞或视网膜组织给需要移植的受试者。
31.通过权利要求1-25中任一项的方法产生的视网膜细胞或视网膜组织,其用于治疗由于视网膜细胞或视网膜组织失调引起的疾病。
32.药物组合物,其包含通过权利要求1-25中任一项的方法产生的视网膜细胞或视网膜组织作为活性成分。
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