KR102604999B1 - 소뇌 선구체 조직의 제조 방법 - Google Patents

소뇌 선구체 조직의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 인간 다능성 줄기 세포의 응집체를 인슐린 함유 무혈청 배지 중에서 부유 배양하고, 부유 배양에서 인간 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 ROCK 저해제, TGFβ 신호 저해제 및 제 1 섬유아세포 증식 인자에 의해 처리함으로써, 중뇌-후뇌 경계 부위의 신경 선구체 조직을 포함하는 인간 세포 응집체를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 중뇌-후뇌 경계 부위의 신경 선구체 조직을 포함하는 인간 세포 응집체를 무혈청 배지 중에서 부유 배양하여 신경 선구체 조직에서의 신경 선구체 세포에 의한 신경표피 구조 형성을 유도하고, 소뇌판 조직을 포함하는 인간 세포 응집체를 수득할 수 있다.

Description

소뇌 선구체 조직의 제조 방법 {METHOD FOR PRODUCING CEREBELLAR PROGENITOR TISSUE}
본 발명은 시험관내에 있어서 인간 다능성 줄기 세포의 소뇌 선구체 조직으로의 분화를 유도하는 기술에 관한 것이다.
운동계의 주요 구성 인자인 소뇌는, 여러 상세하게 밝혀진 유형의 세포를 갖는 고차 뇌 구조이다. 소뇌의 초기 발생은 인간을 포함하는 양막류 중에서 보존되고 있다. 소뇌 발생의 초기 상은 협부 조직체의 형성이며, 이는 중뇌-후뇌경계 (MHB) 에 위치한다. 그 유도적 영향 하에, 소뇌 원기는 능뇌절 1 (r1) 의 배측 부위 (dorsal region) (익판) 에 발생한다 (비특허문헌 1~3). 소뇌 세포는 r1 에서 2 개의 상이한 배대에서 생성된다. 하나는 소뇌판의 뇌실대 (vz) 이며, 이는 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 (bHLH) 전사 인자 Ptf1a 를 발현한다. Ptf1a+ 선구체는 소뇌 피질의 GABA 작동성 뉴런 (푸르키네 (Purkinje) 세포 및 개재뉴런) 및 심부 소뇌핵 (DCN) 의 GABA 작동성 뉴런을 생성한다. 다른 대는 능뇌순 (RL) 이며, 이는 다른 bHLH 인자인 Atoh1 (Math1 로서도 알려짐) 을 발현한다. Atoh1+ 선구체는 과립 세포 (GC), 홑극붓털세포, 및 큰 DCN 투사 뉴런을 포함하는 소뇌 글루타민산 작동성 뉴런을 생성한다 (비특허문헌 4~9). 지난 10 년에 걸쳐 소뇌의 세포 분화의 제어에 관한 이해가 매우 진보하였다. 이러한 지식은, 다능성 줄기 세포로부터 소뇌 뉴런성 성분을 시험관내 생성하기 위한 기술적 진보를 촉진하였다 (비특허문헌 10~13). 그러나, 생성된 세포 성분이 어떻게 집합하여 소뇌의 복잡한 구조를 형성하는지는 거의 모르는 채로 남아 있다.
본 발명자들은, 3 차원 (3D) 배양에 있어서 자가유도성 신호전달 미소환경을 반복함으로써, 마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 로부터 소뇌 뉴런을 효율적으로 생성시킬 수 있다는 것을 보고하였다 (비특허문헌 11). mESC 는, Fgf2 및 인슐린에 반응하여 응집체 내에서 일부 협부 조직체 조직을 형성하는 가능성을 갖는다. 이러한 조건 하에서는, 내재성 Shh 신호전달을 저해제로 저해하는 경우, mESC-유래 신경계 선구체는 푸르키네 세포-전구체 마커 Kirrel2 (Neph3 로서도 알려짐) 를 발현하는 소뇌판 NE 으로 분화한다. 한편, 배양물에 대한 BMP 신호의 첨가는 Atoh1+ GC 및 Tbr1+ DCN 뉴런으로의 분화를 촉진했으나, mESC 응집체 중의 푸르키네 세포 생성을 억제하였다. 소뇌 뉴런 분화는 mESC 에서 성공적으로 유도될 수 있지만, 소뇌 원기 구조의 3D 형성은 지금까지 재정리되어있지 않다.
Fgf19, 마우스 Fgf15 (MHB 에서 발현됨) 의 인간 오르토로그는, 후뇌에서의 배측 (dorsal) 선구체 발생에 관여한다고 보고되고 있다 (비특허문헌 14 및 15).
SDF1 (CXCL12 로서도 알려짐), 케모카인 수용체 4 (CXCR4) 에 대한 분비 리간드는 수막 세포에서 발현되고, CXCR4 를 발현하는 외부 과립 (EGL) 세포 침윤에 결정적인 역할을 한다 (비특허문헌 16~19). SDF1- 또는 CXCR4-결손 마우스는 불규칙한 외부 과립 층 (EGL) 및 이소성으로 위치한 푸르키네 세포와 함께, 비정상적으로 발생하였다.
본 발명자들은, Rho-관련 이중 코일 키나아제 (ROCK) 의 저해제가 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포 (특히, 인간 다능성 줄기 세포) 의 세포사를 억제한다는 것을 발견하였다 (특허문헌 1 및 2).
JP-A-2008-99662 WO 2008/035110
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상기 언급한 바와 같이, 마우스 다능성 줄기 세포가, FGF2 와 인슐린을 함유하는 배지 중 응집체 부유 배양되는 경우, 소뇌 선구체로 분화될 수 있는 것이 보고되어 있었다 (비특허문헌 11). 그러나, 마우스 다능성 줄기 세포의 배양 조건을 인간 다능성 줄기 세포에 직접 적용하는 경우, 인간 다능성 줄기 세포의 소뇌 분화가 지지되지 않고, 소뇌 분화가 관찰되지 않으며 응집체 붕괴 등으로 인해 신경 배양 그 자체가 지속될 수 없다는 것이 발견되었다. 또한, 마우스 다능성 줄기 세포의 소뇌 선구체 조직으로의 분화 유도를 크게 촉진한 헤지호그 (Hedgehog) 저해제 (시클로파민) 는 인간 다능성 줄기 세포로부터의 소뇌판 형성을 유의하게 촉진하지 않았다. 예를 들어 소닉 (Sonic) 헤지호그의 인간 다능성 줄기 세포 배양계에 대한 첨가가 극성화된 소뇌판 형성을 촉진하므로, 인간 다능성 줄기 세포로부터의 소뇌 선구체 조직 분화의 조건은 마우스의 경우와 크게 상이하다는 것이 제시되었다.
따라서 본 발명은, 인간 다능성 줄기 세포로부터 소뇌 조직 또는 그 선구체 조직을 시험관내로 효율적으로 유도하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 시험관내에 있어서 인간 소뇌 조직을 발생시키기 위해 자가 형성 원리를 인간 ESC 배양에 적용하였다. ROCK 저해제 (Y-27632) 나 TGF-베타 저해제 (SB431542) 의 첨가를 포함하고 헤지호그 저해제의 첨가를 생략하는 등의 변형된 배양 조건을 사용하여, 이들은 시험관내에 있어서의 인간 다능성 줄기 세포로부터의 소뇌 선구체 조직 분화를 처음으로 가능하게 하였다. 더욱이, 3D 배양 조건을 최적화하는 과정에서, 본 발명자들은 상이한 방식으로 정돈된 소뇌판형 조직의 자가 형성을 촉진하는 2 개 인자인 Fgf19 및 SDF1 을 알아내었다. 응집체 배양에 Fgf19 를 첨가하면 인간 다능성 줄기 세포로부터의 소뇌판 형성이 촉진되며 응집체 내의 중뇌-후뇌 경계 신경 조직에서의 배복 (dorsal-ventral) (DV) 극성이 강화되었다. 소뇌 조직을 위한 자가 형성 hESC 배양에서의 추가적인 SDF1 처리는, 초기 소뇌판에서 관찰할 수 있는 바와 같이 계층화된 연속적인 소뇌판 NE 의 형성을 유도한다. 또한, 신경외배엽 (NE) 주연부는 Atoh1+/Barh1+ 세포로 이루어지는 상이한 RL 형 배대를 형성한다. 추가로, 소뇌 선구체 조직 (소뇌판 조직) 을 자가 조직화시키는 과정에서 Gdf7 을 첨가하면 소뇌판 조직 내에서의 능뇌순 형성이 촉진되었다.
본 발명자들은, 상기 언급한 발견에 근거하여 더욱 연구를 수행하였고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 하기와 같다:
[1] 인간 다능성 줄기 세포의 응집체를 인슐린을 함유하는 무혈청 배지 중에서 부유 배양하고, 부유 배양에서 인간 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 ROCK 저해제, TGFβ 신호 저해제 및 제 1 섬유아세포 증식 인자로 처리하는 것을 포함하는, 소뇌 선구체 조직을 포함하는 인간 세포 응집체의 제조 방법.
[2] [1] 에 있어서, 소뇌 선구체 조직이 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직인 제조 방법.
[3] [1] 또는 [2] 에 있어서, 부유 배양에서 인간 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 BMP4 로 처리하지 않는 제조 방법.
[4] [1] ~ [3] 중 어느 하나에 있어서, 부유 배양에서 인간 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 소닉 헤지호그 저해제로 처리하지 않는 제조 방법.
[5] [1] ~ [4] 중 어느 하나에 있어서, 제 1 섬유아세포 증식 인자가 FGF2 또는 FGF8 인 제조 방법.
[6] [1] 에 있어서, 하기 단계를 포함하는 제조 방법:
(I) 인간 다능성 줄기 세포의 응집체를 인슐린을 함유하는 무혈청 배지 중에서 부유 배양하고, 부유 배양에서 인간 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 ROCK 저해제, TGFβ 신호 저해제 및 제 1 섬유아세포 증식 인자로 처리하여 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직을 함유하는 인간 세포 응집체를 수득하는 단계, 및
(II) 수득한 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직을 함유하는 인간 세포 응집체를 무혈청 배지 중에서 추가 부유 배양하여 신경 선구체 조직 내의 신경 선구체에 의한 신경표피 구조의 형성을 유도하고, 이로써 소뇌판 조직을 함유하는 인간 세포 응집체를 수득하는 단계.
[7] [6] 에 있어서, 단계 (I) 의 부유 배양에서 인간 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 제 2 섬유아세포 증식 인자로 추가 처리하는 것을 포함하는 제조 방법.
[8] [7] 에 있어서, 제 2 섬유아세포 증식 인자가 FGF19, FGF17 또는 FGF8 인 제조 방법.
[9] [6] ~ [8] 중 어느 하나에 있어서, 단계 (II) 의 부유 배양에서 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체를 함유하는 인간 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 SDF1 로 처리하는 것을 포함하는 제조 방법.
[10] [6] 에 있어서, 단계 (II) 의 부유 배양에서 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체를 함유하는 인간 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 GDF7 로 처리하는 것을 포함하는 제조 방법.
[11] [7] 또는 [8] 에 있어서, 소뇌판 조직이 GABA 작동성 신경 선구체 및 소뇌 과립 세포 선구체를 포함하는 신경표피 구조인 제조 방법.
[12] [11] 에 있어서, 신경표피 구조가 배복 극성을 갖는 제조 방법.
[13] [9] 에 있어서, 소뇌판 조직이 세포 응집체의 표층 부위에 연속적인 소뇌 신경표피 구조 및 능뇌순형 조직을 포함하는 제조 방법.
[14] [13] 에 있어서, 소뇌판 조직이 선단 표면으로부터의 순서로 계층화된, 뇌실대, 푸르키네 세포대 및 능뇌순-유래 세포대를 포함하는 3-층 구조를 갖는 제조 방법.
[15] [1] ~ [14] 중 어느 하나의 제조 방법에 의해 수득되는 인간 세포 응집체.
[16] 하기 단계를 포함하는, 인간 푸르키네 세포, 인간 골지 세포 또는 인간 개재뉴런의 제조 방법:
(I) [6] ~ [14] 중 어느 하나의 제조 방법에 의해 인간 다능성 줄기 세포로부터 소뇌판 조직을 함유하는 인간 세포 응집체를 수득하는 단계,
(II) 수득한 인간 세포 응집체로부터 GABA 작동성 신경 선구체를 수득하는 단계, 및
(III) GABA 작동성 신경 선구체를 포유 동물 소뇌 과립 세포 선구체와 함께 공배양하여 GABA 작동성 신경 선구체의 푸르키네 세포, 골지 세포 또는 개재뉴런으로의 분화를 유도하는 단계.
[17] 하기 단계를 포함하는, 인간 소뇌 과립 세포의 제조 방법.
(I) [6] ~ [14] 중 어느 하나의 제조 방법에 의해 인간 다능성 줄기 세포로부터 소뇌판 조직을 함유하는 인간 세포 응집체를 수득하는 단계,
(II) 수득한 인간 세포 응집체로부터 소뇌 과립 세포 선구체를 수득하는 단계, 및
(III) 소뇌 과립 세포 선구체를 포유 동물 소뇌 세포와 함께 공배양하여 소뇌 과립 세포로의 분화를 유도하는 단계.
본 발명에 따르면, 인간 다능성 줄기 세포로부터 소뇌 선구체 조직을 시험관내로 효율적으로 유도할 수 있다. 중뇌-후뇌 경계 선구체 조직은 인간 다능성 줄기 세포로부터 처음으로 시험관내 형성될 수 있다. 생체내 관찰된 배복 극성은 이러한 중뇌-후뇌 경계 선구체 조직에서 재현될 수 있다. 본 발명에 따르면, 연속적인 표피 구조를 갖는 소뇌 선구체 조직 (소뇌판 조직) 을 인간 다능성 줄기 세포-유래 세포의 응집체에서 자가 조직화시킬 수 있다. 이러한 인간 소뇌판 조직에서, 생체내 관찰된 2 개의 주요 부위인 소뇌 신경표피 (소뇌 푸르키네 세포 및 개재뉴런의 선구체 조직) 와 능뇌순 (소뇌 과립 세포 및 소뇌 핵 신경 세포의 선구체 조직) 이 인접하여 자가 형성될 수 있다. 또한, 시험관내 유도된 인간 소뇌판 조직의 푸르키네 세포, 소뇌 개재뉴런, 소뇌 과립 세포, 소뇌 핵 세포 등으로의 분화를 더욱 유도할 수 있다.
도 1 은 Gbx2 (녹색), Otx2 (적색) 및 N-카드헤린 (청색) 에 대한 항체를 사용하는 세포 응집체의 형광 면역조직화학 염색 영상을 나타낸다.
도 2 는 정량 PCF 방법에 의한 부위 특이적 유전자 발현의 분석을 나타낸다. Six3 및 Otx2 (전뇌); En2 (중뇌); Gbx2 (후뇌문측); Pax2 및 Hoxa2 (후뇌미측). 좌측 컬럼 (CDMI) 은 Fgf2 비첨가 조건을 나타내고, 우측 컬럼 (+Fgf2) 은 Fgf2 첨가 조건을 각각 나타낸다.
도 3 은 분화 유도 제 35 일에서의 세포 응집체의 형광 면역조직화학 염색 영상을 나타낸다. a: N-카드헤린 (녹색), Kirrel2 (적색). b: Kirrel2 (녹색). c: Kirrel2 (녹색), Ptf1a (적색). 모든 영상에서, DAPI (청색) 으로 핵을 대비염색하였다.
도 4 는 항-Kirrel2 항체에 의한 FACS 분석을 나타낸다. 좌측: 대조군, 우측: FGF2 첨가군.
도 5 는 분류한 Kirrel2 세포를 마우스 상부 능뇌순-유래 세포와 함께 공배양하여 수득되는 푸르키네 세포 (a-e) 또는 골지 세포 (f) 의 형광 항체 염색 영상을 나타낸다. a: L7 (녹색), 칼빈딘 (적색). b: L7(녹색). c: L7 (녹색), GluR델타2 (적색). d: L7 (녹색), GluR델타2 (적색). e: 칼빈딘 (녹색), GluR델타2 (백색), Cbln1 (적색). f: 뉴로그라닌 (적색).
도 6 은 분화 유도 제 35 일에서의 세포 응집체의 형광 면역조직화학 염색 영상을 나타낸다. a: Kirrel2 (녹색), Atoh1 (적색). b: Sox2 (녹색), Atoh1 (적색). c: Barhl1 (녹색), Atoh1 (적색). d: Zic1 (녹색), Atoh1 (적색).
도 7 은 분화 유도제 35 일 (a 및 b) 및 제 53 일 (c) 의 세포 응집체의 형광 면역조직화학 염색 영상을 나타낸다. a: Barhl1 (녹색), Atoh1 (적색), DAPI (청색). b: Barhl1 (녹색), Atoh1 (적색), Lhx2 (청색). c: Tbr1 (녹색), SMI32 (적색).
도 8 은 재응집 배양 후 제 5 일 (상단) 및 제 8 일 (하단) 의 형광 면역조직화학 염색 영상을 나타낸다. a: GFP (녹색), Barhl1 (백색), Map2 (적색). b: GFP (녹색), Barhl1 (백색), Map2 (적색). c: GFP (녹색), Pax6 (백색), Map2 (적색). d: GFP (녹색). e: Pax6 (백색), Map2 (적색). f: GFP (녹색).
도 9 는 FGF2 에 의해 유도된 2 개의 구조적으로 상이한 Kirrel2+/N-카드헤린+ 신경표피 (NE) 의 면역조직화학 분석을 나타낸다. A: 작은 로제트형 NE. N-카드헤린 (녹색), Kirrel2 (적색). B: 편평-난형 연속적 NE. N-카드헤린 (녹색), Kirrel2 (적색). C: FGF19 를 첨가했을 때 작은 로제트 NE 를 갖는 세포 응집체와 편평-난형 연속적 NE 를 갖는 세포 응집체의 비율을 나타내는 그래프.
도 10 은 분화 유도 제 35 일에서의 세포 응집체의 형광 항체 염색 영상을 나타낸다. a: Kirrel2 (녹색), Ptf1a (적색). b: Kirrel2 (녹색), SKOR2 (백색), DAPI (청색). c: Kirrel2 (적색), Nkx6.1 (백색), DAPI (청색). d: Kirrel2 (녹색), 네스틴 (백색), Nkx6.1 (적색). e: Kirrel2 (녹색), Foxa2 (백색), Nkx6.1 (적색), DAPI (청색).
도 11 은 인간 ES 세포-유래 신경표피 및 배아 마우스 능뇌절 1 의 배복 축을 나타내는 모식도이다.
도 12 는 배양 제 35 일에서의 세포 응집체의 형광 면역조직화학 염색 영상 (좌측 및 중앙) 및 정량 PCR 방법에 의한 Atoh1 유전자 발현 분석 (우측) 을 나타낸다. Atoh1 (적색), DAPI (청색).
도 13 은 인간 ES 세포 응집체에서의 신경표피 구조의 자가 형성을 나타낸다. PKCζ (녹색), N-카드헤린 (적색).
도 14 는 SDF1 처리에 의한 소뇌 조직 형성 시험에 있어서 배양 제 35 일에서의 세포 응집체의 형광 항체 염색 영상을 나타낸다. a: Kirrel2 (녹색). b: PKC (녹색), Sox2 (적색). c: Kirrel2 (녹색), Skor2 (적색). d: Sox2 (적색), PH3 (백색). e: Kirrel2 (녹색), Atoh1 (적색). f: Barhl1 (녹색), Atoh1 (적색). g: Kirrel2 (녹색), Ptf1a (적색). h: Sox2 (녹색), Oligo2 (적색), Lhx5 (백색). i: Oligo2 (적색), Sox2 (백색). j: Barhl1 (녹색), Sox2 (백색). k: Kirrel2 (녹색), Atoh1 (적색). l: Kirrel2 (녹색), Atoh1 (적색), Barhl1 (백색).
도 15 는 FGF19 및 추가적인 SDF1 에 의해 각각 유도되는 극성화된 소뇌 NE 및 RL-형 구조를 갖는 연속적인 NE 의 2 개 보고에 있어의 자가 형성을 나타내는 모식도이다. SVZ: 뇌실하 영역, VZ: 뇌실대.
도 16 은 인간 다능성 줄기 세포 응집체로부터 유도한 푸르키네 세포에 있어서 관찰된, 푸르키네 세포에 특징적인 전기생리학적 소견을 나타낸다.
(1) 다능성 줄기 세포
"다능성 줄기 세포" 는 생체를 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 잠재력 (다능성), 및 세포 분열을 통해 동일한 분화 효능을 갖는 딸 세포를 생성하는 잠재력 (자가 복제력) 을 모두 갖는 세포를 지칭한다.
다능성은, 평가 표적 세포를 누드 마우스에 이식하고, 3 배엽 (외배엽, 중배엽, 내배엽) 의 각 세포를 함유하는 테라토마 형성의 유무를 시험함으로써 평가할 수 있다.
다능성 줄기 세포의 예는 배아 줄기 세포 (ES 세포), 배아 생식 세포 (EG 세포), 유도 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 등을 포함하며, 다능성 및 자가 복제력을 모두 갖는 것인 한, 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서, 배아 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포가 바람직하게 사용된다.
배아 줄기 세포 (ES 세포) 는 예를 들어, 착상전 초기 배아, 초기 배아를 구성하는 내부 세포 덩어리, 단일 할구 등을 배양함으로써 수립할 수 있다 (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Thomson, J. A. et al., Science, 282, 1145-1147 (1998)). 초기 배아로서, 체세포의 핵을 핵 이식함으로써 제작된 초기 배아를 사용할 수 있다 (Wilmut et al. (Nature, 385, 810 (1997)), Cibelli et al. (Science, 280, 1256 (1998)), Akira IRITANI et al. (Tanpakushitsu Kakusan Koso, 44, 892 (1999)), Baguisi et al. (Nature Biotechnology, 17, 456 (1999)), Wakayama et al. (Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999)), Rideout III et al. (Nature Genetics, 24, 109 (2000), Tachibana et al. (Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell (2013) in press)). 초기 배아로서, 단위생식 배아를 또한 사용할 수 있다 (Kim et al. (Science, 315, 482-486 (2007)), Nakajima et al. (Stem Cells, 25, 983-985 (2007)), Kim et al. (Cell Stem Cell, 1, 346-352 (2007)), Revazova et al. (Cloning Stem Cells, 9, 432-449 (2007)), Revazova et al.(Cloning Stem Cells, 10, 11-24 (2008)).
ES 세포와 체세포의 세포 융합에 의해 수득되는 융합 ES 세포도 본 발명의 방법에 사용되는 배아 줄기 세포에 포함된다.
배아 줄기 세포는 적절한 기관으로부터 입수할 수 있으며, 시판품을 구입할 수 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3 은 쿄토 대학 재생 의과 학연 연구소 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University) 로부터 입수가능하다.
배아 생식 세포 (EG 세포) 는, 시원 생식 세포를 LIF, bFGF 및 SCF 의 존재하에서 배양함으로써 수립할 수 있다 (Matsui et al., Cell, 70, 841-847 (1992), Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(23), 13726-13731 (1998), Turnpenny et al., Stem Cells, 21(5), 598-609, (2003)).
유도 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 는, 체세포 (예를 들어 섬유아세포, 피부 세포, 림프구 등) 를 핵 초기화 인자와 접촉시킴으로써 인위적으로 다능성 및 자가 복제력을 획득한 세포를 의미한다. iPS 세포는, 체세포 (예를 들어 섬유아세포, 피부 세포 등) 에 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 로 구성되는 핵 초기화 인자를 도입하는 것을 포함하는 방법에 의해 처음으로 발견되었다 (Cell, 126: p. 663-676, 2006). 그 후, 많은 연구자에 의해 초기화 인자의 조합 및 인자의 도입법 에 대해 많은 각종 개선이 이루어지고 있으며 다양한 유도 다능성 줄기 세포의 제조 방법이 보고되고 있다.
핵 초기화 인자는, 섬유아세포와 같은 체세포로부터 다능성 및 자가 복제력을 갖는 세포를 유도할 수 있는 것인 한, 단백질성 인자 또는 이를 인코딩하는 핵산 (벡터 내에 혼입된 형태 포함), 또는 저분자 화합물과 같은 임의의 물질로 구성될 수 있다. 핵 초기화 인자가 단백질성 인자 또는 이를 인코딩하는 핵산인 경우, 바람직한 핵 초기화 인자는 하기의 조합으로 예시된다 (이하, 단백질성 인자의 명칭만을 나타낸다).
(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (여기서, Sox2 는 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 또는 Sox18 로 대체가능하다. Klf4 는 Klf1, Klf2 또는 Klf5 로 대체가능하다. 또한, c-Myc 는 T58A (활성 형태 변이체), N-Myc 또는 L-Myc 로 대체가능하다.)
(2) Oct3/4, Klf4, Sox2
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(4) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28
(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, bFGF
(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, SCF
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF
(9) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF
이들의 조합 중에서, 수득되는 iPS 세포를 치료 용도로 사용하는 것을 고려하는 경우, Oct3/4, Sox2 및 Klf4 의 3 개 인자의 조합이 바람직하다. 한편, iPS 세포를 치료 용도로 사용하는 것을 고려하지 않는 경우 (예를 들어, 약물 발견 스크리닝 등의 연구 도구로서 사용하는 경우), Oct3/4, Klf4, Sox2 및 c-Myc 로 이루어지는 4 개 인자, 또는 이에 Lin28 또는 Nanog 를 부가한 5 개 인자가 바람직하다.
자가 이식에는 iPS 세포가 바람직하게 사용된다.
염색체에서의 유전자를 공지된 유전 공학 방법에 의해 변형시켜 수득한 다능성 줄기 세포도 본 발명에서 사용할 수 있다. 다능성 줄기 세포는, 공지된 방법에 의해 분화 마커를 인코딩하는 유전자에 표지 유전자 (예를 들어 GFP 등과 같은 형광 단백질) 를 인-프레임 방식으로 녹인 (knocked in) 한 세포일 수 있으며, 세포는 표지 유전자의 발현을 지표로서 사용하여 상응하는 분화 단계에 도달한 것으로 식별가능하다.
다능성 줄기 세포로서, 온혈 동물 다능성 줄기 세포, 바람직하게는 포유 동물 다능성 줄기 세포를 사용할 수 있다. 포유 동물은 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터 및 기니피그와 같은 설치류, 및 토끼를 포함하는 실험 동물; 돼지, 소, 염소, 말 및 양과 같은 가축; 개 및 고양이와 같은 애완동물; 인간, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지와 같은 영장류를 포함한다. 다능성 줄기 세포는 바람직하게는 설치류 (마우스, 래트 등) 또는 영장류 (인간 등) 의 다능성 줄기 세포이며, 가장 바람직하게는 인간 다능성 줄기 세포이다.
다능성 줄기 세포는, 자체 공지된 방법에 의해 유지 배양될 수 있다. 예를 들어 임상 응용의 양태에서는, 다능성 줄기 세포는 바람직하게는 KnockoutTM 혈청 대체물 (Serum Replacement) (KSR) 와 같은 혈청 대체물을 사용하는 무혈청 배양, 또는 무피더 세포 배양에 의해 유지된다.
본 발명에서 사용되는 다능성 줄기 세포는 바람직하게는 단리된다. "단리" 는, 표적 세포 또는 성분 외의 인자를 제거하는 조작이 수행되고 세포 또는 성분이 더 이상 자연 상태가 아니라는 것을 의미한다. "단리된 인간 다능성 줄기 세포" 의 순도 (총 세포수에 대한 인간 다능성 줄기 세포수의 백분율) 는 일반적으로 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이다.
(2) 다능성 줄기 세포 응집체의 형성
다능성 줄기 세포 응집체는, 분산된 다능성 줄기 세포를 배양 용기에 비접착성인 조건 하에 배양하고 (즉, 부유 배양), 복수의 다능성 줄기 세포를 집합시켜 응집체를 형성시킴으로써 수득될 수 있다.
응집체 형성에 사용하는 배양 용기는 특별히 한정되지 않으며, 이의 예는 플라스크, 조직 배양 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양 디쉬, 멀티-디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로-웰 플레이트, 마이크로포어, 멀티-웰 플레이트 (384-웰, 192-웰, 96-웰, 48-웰, 24-웰 등), 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백 및 롤러 보틀을 포함한다. 비접착성 조건 하에서의 배양이 가능하도록, 배양 용기는 세포 비접착성인 것이 바람직하다. 유용한 세포 비접착성 배양 용기는, 그의 표면이 세포 비접착성이 되도록 인공적으로 처리된 배양 용기, 및 그의 표면이 세포 접착성을 향상시키기 위한 인공적 처리 (예를 들어, 세포외 매트릭스 등으로의 코팅 처리) 를 거치지 않은 배양 용기를 포함한다.
멀티웰 플레이트, 마이크로포어, 챔버 슬라이드, 튜브 등의 바닥 형상은 분산된 다능성 줄기 세포가 1 개 스팟에 침전되는 것이 촉진되도록 바람직하게는 U-바닥 또는 V-바닥, 가장 바람직하게는 V-바닥이다. V-바닥 용기는, 용기의 저면이 경사면을 가져, 그 경사면이 저면 전체에 걸쳐서 균일한 경사 각도 (예를 들어, 수평면으로부터 30~60°) 를 형성하는 용기를 나타낸다.
응집체 형성에 사용되는 배지는, 포유 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 사용하여 제조될 수 있다. 기초 배지는 포유 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으며, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, 글라스고 (Glasgow) MEM 배지, 개선된 MEM 아연 옵션 (Improved MEM Zinc Option) 배지, IMDM 배지, 미듐 (Medium) 199 배지, 이글 (Eagle) MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, 햄 F-12 배지, RPMI 1640 배지, 피셔 (Fischer) 배지, Neurobasal 배지 및 이들의 혼합 배지 등일 수 있다. 한 구현예에서, IMDM 배지 및 햄 F-12 배지의 혼합 배지가 사용된다. 혼합비는, 용량비로, 예를 들어 IMDM : 햄 F-12 = 0.8~1.2 : 1.2~0.8 이다.
배양에 사용하는 배지는 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있다. 무혈청 배지는, 무조정 또는 미정제 혈청을 포함하지 않는 배지를 의미한다. 정제된 혈액 유래 성분 및 동물 조직 유래 성분 (예를 들어, 증식 인자) 으로 오염된 배지는 무혈청 배지에 상응한다. 화학적으로 미규정된 성분으로의 오염을 방지하기 위해, 무혈청 배지가 본 발명에서 바람직하게 사용된다.
응집체 형성에 사용되는 배지는 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 혈청 대체물은 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'-티올글리세롤, 또는 이들의 균등물 등을 적절히 포함하는 것일 수 있다. 이러한 혈청 대체물은 예를 들어, WO98/30679 에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 방법의 보다 용이한 실행을 촉진하기 위해서, 시판 혈청 대체물을 이용할 수 있다. 이러한 시판 혈청 대체물의 예는 녹아웃 혈청 대체물 (Knockout Serum Replacement) (KSR, Life Technologies사제), 및 화학적으로 규정된 지질 농축물 (Chemically-defined Lipid Concentrated) (Life Technologies사제) 을 포함한다.
응집체 형성에 사용되는 배지는 다능성 줄기 세포의 소뇌 또는 그의 선구체 조직으로의 분화 유도에 악영향을 주지 않는 한, 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 첨가제의 예는 인슐린, 철 공급원 (예를 들어 트랜스페린 등), 미네랄 (예를 들어 나트륨 셀레네이트 등), 당류 (예를 들어 글루코오스 등), 지질 (예를 들어 콜레스테롤 등), 유기산 (예를 들어 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질 (예를 들어 알부민 등), 아미노산 (예를 들어 L-글루타민 등), 환원제 (예를 들어 2-메르캅토에탄올, 모노티오글리세롤 등), 비타민 (예를 들어 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생 물질 (예를 들어 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제 (예를 들어 HEPES 등) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
응집체 형성에 사용되는 배지는 바람직하게는 후술한 단계 (I) 에서 사용한 배지일 수 있다.
다능성 줄기 세포 응집체 형성을 위해서는, 다능성 줄기 세포를 계대 배양으로부터 회수하고 단일 세포 상태로 또는 단일 세포 상태에 가깝게 분산시킨다. 다능성 줄기 세포는 적절한 세포 해리액을 사용하여 분산된다. 세포 해리액의 예는, EDTA; 트립신, 콜라게나아제 IV 및 메탈로프로테이나아제와 같은 프로테아제 등을 포함하며, 이는 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용된다. 그 중에서도 낮은 세포 독성을 나타내는 것이 바람직하고, 이러한 세포 해리액의 예는 디스파아제 (DISPASE) (EIDIA), TrypLE (Life Technologies) 및 아큐타아제 (Accutase) (MILLIPORE) 와 같은 시판 제품을 포함한다. 분산된 다능성 줄기 세포는 상술한 배지 중 현탁된다.
분산에 의해 유도된 다능성 줄기 세포 (특히, 인간 다능성 줄기 세포) 의 세포사를 억제하기 위해, Rho-관련 이중 코일 키나아제 (ROCK) 의 저해제를 배양 시작부터 첨가하는 것이 바람직하다 (JP-A-2008-99662). ROCK 저해제를 첨가하는 기간은 다능성 줄기 세포의 세포사를 억제할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 배양 시작부터 15 일 기간 이내에 첨가된다. ROCK 저해제의 예는, Y-27632 ((+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드 디히드로클로라이드) 등을 포함한다. 부유 배양에 사용되는 ROCK 저해제의 농도는, 분산에 의해 유도된 다능성 줄기 세포의 세포사를 억제할 수 있는 농도이다. 예를 들어, Y-27632 에 대해, 이러한 농도는 통상 약 0.1~200 μM, 바람직하게는 약 2~50 μM 이다. ROCK 저해제의 농도는 이의 첨가 기간 내에 변동될 수 있고, 예를 들어 후반기에 농도를 반감시킬 수 있다.
분산에 의해 유도된 다능성 줄기 세포 (특히, 인간 다능성 줄기 세포) 의 세포사를 억제하기 위해, 상술한 세포 해리액에 ROCK 저해제를 첨가하고 ROCK 저해제의 존재 하에 다능성 줄기 세포를 분산시킬 수 있다.
분산된 다능성 줄기 세포의 현탁액을 상술한 배양 용기에 시딩하고, 분산시킨 다능성 줄기 세포를 세포 배양 용기에 비접착성의 조건 하에 배양함으로써, 복수의 다능성 줄기 세포를 집합시켜 응집체를 형성시킨다. 이러한 경우, 분산된 다능성 줄기 세포를 10 cm 디쉬와 같은 비교적 큰 배양 용기에 시딩하여 1 개의 배양 구획 중에 복수의 다능성 줄기 세포 응집체를 동시에 형성시킬 수 있다. 그러나, 응집체의 크기, 및 응집체 중에 함유된 다능성 줄기 세포의 수가 크게 광범위할 수 있고, 이러한 편차는 응집체 사이에 다능성 줄기 세포의 소뇌 또는 그의 선구체 조직으로의 분화 수준에 있어서의 차이를 초래할 수 있어, 결과적으로 분화 유도의 효율이 저하될 수 있다. 따라서, 분산된 다능성 줄기 세포를 신속히 응집시켜 1 개의 배양 구획 중에 1 개의 응집체를 형성시키는 것이 바람직하다. 분산된 다능성 줄기 세포를 신속히 응집시키는 방법의 예는 하기 방법을 포함한다:
(1) 비교적 작은 부피 (예를 들어, 1 ml 이하, 500 ㎕ 이하, 200 ㎕ 이하, 100 ㎕ 이하) 의 배양 구획 중에 분산된 다능성 줄기 세포를 동봉하여 상기 구획 중에 1 개의 응집체를 형성하는 것을 포함하는 방법. 바람직하게는 분산된 다능성 줄기 세포를 동봉한 후, 배양 구획을 정치시킨다. 배양 구획의 예는, 멀티-웰 플레이트 (384-웰, 192-웰, 96-웰, 48-웰, 24-웰 등), 마이크로포어, 챔버 슬라이드 등에 있어서의 웰; 튜브; 및 현적법에 있어서의 배지의 액적을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 구획에 동봉된 분산시킨 다능성 줄기 세포는, 중력으로 인해 1 개 스팟에 침전되거나, 세포가 서로 부착되어 1 개의 배양 구획에서 1 개의 응집체가 형성된다. 멀티웰 플레이트, 마이크로포어, 챔버 슬라이드, 튜브 등의 바닥 형상은, 분산된 다능성 줄기 세포가 1 개 스팟에 침전되는 것이 촉진되도록, 바람직하게는 U-바닥 또는 V-바닥, 가장 바람직하게는 V-바닥이다.
(2) 원심분리 튜브에 분산된 다능성 줄기 세포를 넣고 이를 원심분리하여 1 개 스팟에 다능성 줄기 세포를 침전시킴으로써, 상기 튜브 중에 1 개의 응집체를 형성시키는 것을 포함하는 방법.
1 개의 배양 구획 중에 시딩하는 다능성 줄기 세포의 수는, 1 개의 배양 구획 당 1 개의 응집체가 형성되고 본 발명의 방법에 의해 상기 응집체에서 다능성 줄기 세포의 소뇌 또는 그의 선구체 조직으로의 분화가 유도될 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 일반적으로, 1 개의 배양 구획에 약 1 x 103 ~ 약 5 x 104 개, 바람직하게는 약 1 x 103 ~ 약 2 x 104 개, 보다 바람직하게는 약 2 x 103 ~ 약 1.2 x 104 개, 더욱 바람직하게는 약 5 x 103 ~ 약 7 x 103 개 (예를 들어, 6000 개) 의 다능성 줄기 세포를 시딩한다. 그런 다음, 다능성 줄기 세포를 신속히 응집시켜, 1 개의 배양 구획 당 일반적으로 약 1 x 103 ~ 약 5 x 104 개, 바람직하게는 약 1 x 103 ~ 약 2 x 104 개, 보다 바람직하게는 약 2 x 103 ~ 약 1.2 x 104 개, 더욱 바람직하게는 약 5 x 103 ~ 약 7 x 103 개 (예를 들어, 6000 개) 의 다능성 줄기 세포로 구성된 1 개의 세포 응집체가 형성된다.
응집체 형성까지의 시간은, 1 개의 구획 당 1 개의 응집체가 형성되고 본 발명의 방법에 의해 상기 응집체에서 다능성 줄기 세포의 소뇌 또는 그의 선구체 조직으로의 분화가 유도될 수 있는 한, 적절히 결정될 수 있다. 시간을 단축시킴으로써, 목적으로 하는 소뇌 또는 그의 선구체 조직으로의 효율적 분화 유도가 예상되고, 따라서 상기 시간이 짧은 것이 바람직하다. 바람직하게는, 다능성 줄기 세포 응집체는 24 시간 이내, 보다 바람직하게는 12 시간 이내, 더욱 바람직하게는 6 시간 이내, 가장 바람직하게는 2~3 시간 내에 형성된다. 상기 응집체 형성까지의 시간은 당업자에 의해 세포 응집용 도구, 원심분리 조건 등을 선택함으로써 적절히 조정될 수 있다.
응집체 형성시의 배양 온도 및 CO2 농도와 같은 기타 배양 조건은 적절히 설정될 수 있다. 배양 온도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 약 30~40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1~10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
더욱이, 동일 배양 조건 하의 다수 배양 구획을 준비하고, 각 배양 구획에서 1 개의 다능성 줄기 세포 응집체를 형성시킴으로써, 질적으로 균일한 다능성 줄기 세포 응집체 집단을 수득할 수 있다. 다능성 줄기 세포 응집체가 질적으로 균일한지 여부는 응집체 덩어리의 크기 및 그 안의 세포수, 거시적 형태, 조직학적 염색에 의해 분석된 바와 같은 미시적 형태 및 그의 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그의 동질성, 분화 마커의 발현 제어 및 그의 동시성, 응집체 중에서의 분화 효율의 재현성 등을 기초로 하여 평가될 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용하는 다능성 줄기 세포 응집체의 집단은, 응집체에 균일한 수의 다능성 줄기 세포를 함유한다. 특정의 매개변수에 있어서 다능성 줄기 세포 응집체의 집단이 "균일하다" 는 것은, 그 집단에서의 총 응집체의 90% 이상이 응집체 집단에서 매개변수의 평균치의 ±10%, 바람직하게는 ±5% 의 범위 내에 해당되는 것을 의미한다.
(3) 소뇌 선구체 조직의 유도
본 발명은, 다능성 줄기 세포 응집체를 인슐린 함유 무혈청 배지 중에서 배양하고, 부유 배양에서 인간 다능성 줄기 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 ROCK 저해제, TGFβ 신호 저해제 및 제 1 섬유아세포 증식 인자로 처리하는 것을 포함하는, 소뇌 선구체 조직을 포함하는 인간 세포 응집체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
소뇌 선구체 조직의 예는, 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직; 소뇌판 조직; 그의 부분 조직 (예를 들어, 뇌실대, 능뇌순) 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 중뇌-후뇌 경계는 배 발생의 과정 동안 중뇌와 앞쪽 후뇌의 발생을 제어하는 형성체이다. 중뇌-후뇌 경계는 중뇌-후뇌 경계 마커의 발현에 의해 확인될 수 있다. 중뇌-후뇌 경계 마커로서, En2 (중뇌 마커), Gbx2 (후뇌문측 마커) 등을 언급할 수 있다. 중뇌-후뇌 경계는 En2 양성 신경 선구체 및 Gbx2 양성 신경 선구체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 두 세포 모두를 포함한다. 신경 선구체는 N-카드헤린 양성 세포로서 확인될 수 있다. 한 구현예에서, 중뇌-후뇌 경계는 En2 양성 및/또는 Gbx2 양성 신경 선구체 조직이다. 소뇌판 조직의 정의는 하기에 언급한다.
본 발명에 있어서, 조직은 상이한 형태 및 특성을 갖는 복수 종류의 세포가 특정 패턴으로 입체적으로 배치되는 구조를 갖는 세포 집단의 구조를 지칭한다.
본 발명의 제조 방법은 구체적으로, 다능성 줄기 세포 응집체를 인슐린 함유 무혈청 배지 중에서 부유 배양하고, 부유 배양에서 인간 다능성 줄기 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 ROCK 저해제, TGFβ 신호 저해제 및 제 1 섬유아세포 증식 인자로 처리하여, 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직을 함유하는 세포 응집체를 수득하는 것을 포함한다 (단계 (I)). 소뇌 분화의 추가 진행이 요구되는 경우, 단계 (I) 에서 수득한 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직을 함유하는 세포 응집체를 무혈청 배지 중에서 추가로 부유 배양하여, 신경 선구체 조직에서의 신경 선구체에 의한 신경표피 구조 형성을 유도함으로써, 소뇌판 조직을 함유하는 인간 세포 응집체를 수득한다 (단계 (II)). 단계 (I) 에서 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화가 유도되고, 단계 (II) 에서 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직의 소뇌판 조직으로의 추가 분화가 유도된다.
본 발명의 방법에서, 소뇌 선구체 조직의 자가 조직화가 세포 응집체에서 유도되므로, 시간의 경과와 더불어 세포 응집체에 함유되는 소뇌 선구체 조직의 분화 단계가 진행된다. 따라서, 의도된 소뇌 선구체 조직의 분화 단계에 따라 배양 기간 및 배양 조건을 적절히 조정하는 것이 바람직하다.
(3.1) 단계 (I)
단계 (I) 에서, 다능성 줄기 세포 응집체를 인슐린 함유 무혈청 배지 중에서 부유 배양하고, 부유 배양에서 다능성 줄기 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 ROCK 저해제, TGFβ 신호 저해제 및 제 1 섬유아세포 증식 인자로 처리한다.
다능성 줄기 세포 응집체의 "부유 배양" 은, 다능성 줄기 세포 응집체를 배양 용기에 대해 비접착성인 조건 하에 배지 중에서 배양하는 것을 지칭한다.
부유 배양에 사용되는 배지는 인슐린을 함유한다. 배지 중 인슐린 농도는 세포 응집체에서 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화가 유도될 수 있는 범위 내에서 적절히 결정될 수 있다. 이의 농도는 일반적으로 0.1 ㎍/ml 이상, 바람직하게는 1 ㎍/ml 이상이다. 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화에 악영향이 없는 한, 상한치는 특별히 설정되지 않지만, 배양 비용의 측면에서 일반적으로 100 ㎍/ml 이하, 바람직하게는 20 ㎍/ml 이하이다. 한 구현예에서, 배지 중 인슐린 농도는 일반적으로 0.1~100 ㎍/ml, 바람직하게는 1~20 ㎍/ml (예를 들어, 7 ㎍/ml) 이다. 인슐린이 특히 다능성 줄기 세포 또는 그로부터 유래하는 세포의 증식 촉진에 기여하므로, 이러한 효과를 달성할 수 있는 농도로 배지에 함유된다.
부유 배양에 사용되는 배지는, 포유 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 사용하여 제조될 수 있다. 기초 배지는 포유 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으며, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066배지, 글라스고 MEM 배지, 개선된 MEM 아연 옵션 배지, IMDM 배지, 미듐 199 배지, 이글 MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, 햄 F-12배지, RPMI 1640 배지, 피셔 배지, Neurobasal 배지 및 이들의 혼합 배지 등일 수 있다. 한 구현예에서, IMDM 배지 및 햄 F-12 배지의 혼합 배지가 사용된다. 혼합비는 용량비로, 예를 들어 IMDM : 햄 F-12 = 0.8~1.2 : 1.2~0.8 이다.
화학적으로 미규정된 성분으로의 오염을 방지하기 위해, 부유 배양에서는 무혈청 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 혈청 대체물은 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'-티올글리세롤, 또는 이들의 균등물 등을 적절히 포함하는 것일 수 있다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어 WO98/30679 에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 방법의 보다 용이한 실행을 촉진하기 위해, 시판 혈청 대체물을 이용할 수 있다. 이러한 시판 혈청 대체물의 예는 화학적으로 규정된 지질 농축물 (Life Technologies사제) 을 포함한다. 화학적으로 규정된 성분을 함유하는 혈청 대체물이 바람직하다. 또한, 배양하는 세포의 동물 종과 상이한 동물로부터 단리된 성분 (이종 동물-유래 성분) (예를 들어, 인간 세포를 배양하는 경우, 비인간 동물로부터 단리된 성분) 를 함유하지 않는 혈청 대체물이 바람직하다. 화학적으로 미규정된 혈청 대체물 및 이종 동물-유래 성분을 함유하는 혈청 대체물 (예를 들어, KSR (녹아웃 혈청 대체물)) 은 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화 유도를 저해할 수 있으므로, 이의 사용은 바람직하지 않다.
세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화 유도에 악영향을 주지 않는 한, 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 첨가제의 예는, 철 공급원 (예를 들어 트랜스페린 등), 미네랄 (예를 들어 나트륨 셀레네이트 등), 당류 (예를 들어 글루코오스 등), 지질 (예를 들어 콜레스테롤 등), 유기산 (예를 들어 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질 (예를 들어 알부민 등), 아미노산 (예를 들어 L-글루타민 등), 환원제 (예를 들어 2-메르캅토에탄올, 모노티오글리세롤 등), 비타민 (예를 들어 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생 물질 (예를 들어 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제 (예를 들어 HEPES 등) 등을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다.
한 구현예에서, 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화 유도에 대한 악영향을 방지하기 위해, 세포 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는 본 명세서에서 특별히 기재된 것들 외의 성장 인자를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 여기서 "성장 인자" 는, Fgf; BMP; Wnt, Nodal, Notch 및 Shh 와 같은 패턴 형성 인자; 지질-풍부 알부민; 세포외 매트릭스를 포함한다. 성장 인자를 포함하지 않는 배지의 예는 [Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008] 에 개시된 gfCDM 을 포함한다.
화학적으로 미규정된 성분으로의 오염을 방지하기 위해, 부유 배양에 사용하는 배지는 바람직하게는 그의 성분이 화학적으로 규정된 배지이다.
바람직하게는, 부유 배양에 사용하는 배지는 이종 동물-유래 성분을 함유하지 않는다.
배양 온도, CO2 농도 및 O2 농도와 같은 세포 응집체의 부유 배양에 대한 다른 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30~40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1~10%, 바람직하게는 약 5% 이다. O2 농도는 예를 들어 약 20% 이다.
단계 (I) 의 부유 배양에서, 다능성 줄기 세포의 소뇌 선구체 조직으로의 분화 유도가 본 발명의 방법에 의해 가능한 한, 피더 세포의 존재 또는 부재 하에 세포 응집체의 부유 배양이 수행될 수 있다. 미규정 인자로의 오염을 방지하기 위해, 피더 세포의 부재 하에 세포 응집체의 부유 배양을 수행하는 것이 바람직하다.
세포 응집체의 부유 배양에 사용할 수 있는 용기로서, 상기 (2) 의 다능성 줄기 세포 응집체의 형성에 사용할 수 있는 용기로서 열거한 것을 언급할 수 있다. 세포 응집체를 한 장소에 안정적으로 위치시키고 응집체의 붕괴를 방지하기 위해, 용기 바닥의 형상은 바람직하게는 U-바닥 또는 V-바닥, 가장 바람직하게는 V-바닥이다.
바람직한 구현예에서, 질적으로 균일한 다능성 줄기 세포 응집체의 집단을 인슐린 함유 무혈청 배지 중에서 부유 배양한다. 질적으로 균일한 다능성 줄기 세포 응집체의 집단을 사용하여, 응집체 사이의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화 수준 차이를 최소한으로 억제할 수 있으며, 의도된 분화 유도 효율을 향상시킬 수 있다. 질적으로 균일한 다능성 줄기 세포 응집체 집단의 부유 배양은 하기 구현예를 포함한다.
(1) 복수의 배양 구획을 준비하고, 1 개의 배양 구획에 1 개의 다능성 줄기 세포 응집체가 함유되도록 질적으로 균일한 다능성 줄기 세포 응집체의 집단을 시딩한다 (예를 들어, 96-웰 플레이트의 각 웰에 1 개의 다능성 줄기 세포 응집체를 넣음). 각 배양 구획에 있어서, 1 개의 다능성 줄기 세포 응집체를 인슐린 함유 배지 중에서 부유 배양한다.
(2) 1 개의 배양 구획에 복수의 다능성 줄기 세포 응집체가 함유되도록 질적으로 균일한 다능성 줄기 세포 응집체의 집단을 시딩한다 (예를 들어, 10 cm 디쉬에 복수의 다능성 줄기 세포 응집체를 넣음). 배양 구획에 있어서, 복수의 다능성 줄기 세포 응집체를 인슐린 함유 배지 중에서 부유 배양한다.
본 발명의 방법에 대해 구현예 (1) 및 (2) 중 임의의 것을 이용할 수 있으며, 구현예는 배양 동안 변경될 수 있다 (구현예 (1) 에서 구현예 (2) 로, 또는 구현예 (2) 에서 구현예 (1) 로). 한 구현예에서, 단계 (I) 에서 구현예 (1) 이 이용되고 단계 (II) 에서 구현예 (2) 가 이용된다.
단계 (I) 에서, 상술한 부유 배양에서 다능성 줄기 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 세포 응집체를 ROCK 저해제, TGFβ 신호 저해제 및 제 1 섬유아세포 증식 인자로 처리한다. 이들 인자로 세포 응집체를 처리하는 것은, 부유 배양에 ROCK 저해제, TGFβ 신호 저해제 및 제 1 섬유아세포 증식 인자를 첨가하고, 배지 중 다능성 줄기 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 세포 응집체를 ROCK 저해제, TGFβ 신호 저해제 및 제 1 섬유아세포 증식 인자와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다.
Rho-관련 이중 코일 키나아제 (ROCK) 저해제는, 분산에 의해 유도된 다능성 줄기 세포 (특히, 인간 다능성 줄기 세포) 의 세포사를 억제하고 성장을 지지하는 효과를 갖는다. ROCK 저해제로서, 몇몇의 화합물이 알려져 있다 (예를 들어, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000) 및 Narumiya et al., Methods Enzymol. 325, 273-284 (2000)). 구체적으로는, ROCK 저해제로서 Y-27632 ((+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜) 시클로헥산카르복사미드) (바람직하게는, 디히드로클로라이드); 파수딜 (Fasudil) (5-(1-호모피페라지닐) 술포닐이소퀴놀린) (바람직하게는, 히드로클로라이드); H-1152 ((S)-(+)-2-메틸-1- [(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)술포닐]-헥사히드로-1H-1,4-디아제핀) (바람직하게는, 디히드로클로라이드) 등을 언급할 수 있다. ROCK 저해제는 바람직하게는 Y-27632 이다.
세포 응집체를 ROCK 저해제로 처리하는 시기 및 기간은, 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포의 세포사를 억제할 수 있고 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화가 가능한 것인 한, 특별히 한정되지 않는다. 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포의 세포사를 효과적으로 억제하기 위해, 다능성 줄기 세포 응집체의 부유 배양 시작부터 바람직하게는 2 시간 이내에, 보다 바람직하게는 부유 배양 시작부터 0.5 시간 이내에, 더욱 바람직하게는 부유 배양 시작부터 ROCK 저해제를 배지에 첨가하여, 세포 응집체를 ROCK 저해제로 처리한다. ROCK 저해제로의 처리 기간은 일반적으로 12 시간 이상, 바람직하게는 2, 4 또는 7 일 이상이다. ROCK 저해제로의 처리 기간의 상한치는 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화가 가능한 것인 한, 특별히 설정되지 않는다. 분화에 대한 예측불가능한 악영향을 방지하기 위해, 이는 일반적으로 21 일 이내, 바람직하게는 14 일 이내이다. ROCK 저해제로의 처리 기간 경과 후, ROCK 저해제는 배지로부터 제거된다. ROCK 저해제 처리 동안 배지 중의 ROCK 저해제 농도는, 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포의 세포사를 억제할 수 있는 농도이다. 예를 들어, Y-27632 에 대해, 이러한 농도는 일반적으로 약 0.1~200 μM, 바람직하게는 약 2~50 μM 이다. ROCK 저해제의 농도는 처리 기간 내에 변동될 수 있다. 예를 들어, 농도는 후반기에 반감될 수 있다.
TGFβ 신호 저해제는 다능성 줄기 세포의 중배엽으로의 분화를 억제하고 신경외배엽으로의 분화를 촉진하는 효과를 갖는다. TGFβ 신호 저해제는 TGFβ 에 의해 매개되는 신호 전달을 억제할 수 있는 것인 한, 특별히 한정되지 않는다. TGFβ 신호 저해제의 예는 SB431542 (4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드), LY-364947, SB-505, A-83-01 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 특히, SB431542 가 바람직하다.
세포 응집체를 TGFβ 신호 저해제로 처리하는 시기 및 기간은, 다능성 줄기 세포의 중배엽으로의 분화를 억제할 수 있고 신경외배엽으로의 분화를 촉진할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 중배엽 분화를 효과적으로 억제하고 신경외배엽으로의 분화를 효과적으로 촉진하기 위해, 다능성 줄기 세포 응집체의 부유 배양 시작부터 바람직하게는 2 시간 이내에, 보다 바람직하게는 부유 배양 시작부터 0.5 시간 이내에, 더욱 바람직하게는 부유 배양 시작부터 TGFβ 신호 저해제를 배지에 첨가하여, 세포 응집체를 TGFβ 신호 저해제로 처리한다. TGFβ 신호 저해제로의 처리 기간은 일반적으로 2 일 이상, 바람직하게는 7 일 이상이다. TGFβ 신호 저해제로의 처리 기간의 상한치는 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화가 가능한 것인 한, 특별히 설정되지 않는다. 분화에 대한 예측불가능한 악영향을 방지하기 위해, 이는 일반적으로 21 일 이내, 바람직하게는 14 일 이내이다. TGFβ 신호 저해제로의 처리 기간 경과 후, TGFβ 신호 저해제는 배지로부터 제거된다. TGFβ 신호 저해제로의 처리 동안 배지 중 TGFβ 신호 저해제 농도는, 다능성 줄기 세포의 중배엽으로의 분화를 억제할 수 있고 신경외배엽으로의 분화를 촉진할 수 있는 농도이다. 예를 들어, SB431542 에 대해, 이러한 농도는 일반적으로 약 0.1~200 μM, 바람직하게는 약 2~50 μM, 보다 바람직하게는 약 10~30 μM 이다. TGFβ 신호 저해제의 농도는 처리 기간 내에 변동될 수 있다. 예를 들어, 농도는 후반기에 반감될 수 있다.
제 1 섬유아세포 증식 인자는 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계로의 분화를 촉진하고 전뇌로의 분화를 억제하는 효과를 갖는 FGF 이다. 섬유아세포 증식 인자는 중뇌-후뇌 경계로의 분화를 촉진하는 것인 한, 특별히 한정되지 않는다. 섬유아세포 증식 인자 (FGF) 로서, 인간 및 마우스에서 FGF1~FGF23 이 확인되고 있다. 인간 FGF19 는 마우스 FGF15 의 오르토로그이므로, 인간 및 마우스의 FGF 패밀리는 22 개 멤버로 구성된다. 본 명세서에서, FGF 의 명칭은 인간 FGF 명명법을 따른다. 제 1 섬유아세포 증식 인자는 바람직하게는 FGF2 또는 FGF8 이며, 보다 바람직하게는 FGF2 이다. FGF2 는 염기성 섬유아세포 증식 인자 (bFGF) 로도 불리는 공지된 사이토카인이며, 그의 아미노산 서열도 공지되어 있다. 본 발명에서 사용하는 FGF2 는 일반적으로 포유 동물 FGF2 이다. 포유 동물의 예는 상기 언급된 것들을 포함한다. FGF2 가 많은 포유 동물 종 중에서 교차 반응성을 가지므로, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 것이면 임의의 포유 동물의 FGF2 를 또한 사용할 수 있다. 바람직하게는, 배양하는 세포와 동일한 종의 포유 동물의 FGF2 가 사용된다. 예를 들어, 설치류 (마우스, 래트 등) 또는 영장류 (인간 등) 의 FGF2 가 사용된다. 여기서 마우스 FGF2 는, FGF2 가 마우스 생체 내에서 자연적으로 발현되는 FGF2 의 아미노산 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 본 명세서에서, 다른 단백질 등에 대해도 유사한 해석이 적용된다. 마우스 FGF2 의 대표적인 아미노산 서열의 예는 NCBI 등록 번호 NP_032032.1 (2014 년 2 월 18 일 갱신), 상기 아미노산 서열로부터 N-말단 신호 서열 (1-9) 을 제거하여 수득한 아미노산 서열 (성숙 마우스 FGF2 아미노산 서열) 등을 포함한다. 인간 FGF2 의 대표적인 아미노산 서열의 예는 NCBI 등록 번호 NP_001997.5 (2014 년 2 월 18 일 갱신) 등을 포함한다.
세포 응집체를 제 1 섬유아세포 증식 인자로 처리하는 시기 및 기간은 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계으로의 분화를 촉진할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 다능성 줄기 세포 응집체의 부유 배양 시작을 제 0 일 (d0) 로 했을 때, 제 1 섬유아세포 증식 인자를 바람직하게는 d2~d4 에서의 임의 시점, 보다 바람직하게는 d2 에 배지에 첨가하여, 제 1 섬유아세포 증식 인자로의 세포 응집체 처리를 시작한다. 제 1 섬유아세포 증식 인자로의 처리 기간은 일반적으로 2 일 이상, 바람직하게는 5 일 이상이다. 제 1 섬유아세포 증식 인자로의 처리 기간의 상한치는 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화가 가능한 한, 특별히 설정되지 않는다. 분화에 대한 예측불가능한 악영향을 방지하기 위해, 이는 일반적으로 19 일 이내, 바람직하게는, 12 일 이내이다. 제 1 섬유아세포 증식 인자로의 처리 기간 경과 후, 제 1 섬유아세포 증식 인자는 배지로부터 제거된다. 제 1 섬유아세포 증식 인자로의 처리 동안 배지 중 제 1 섬유아세포 증식 인자 농도는, 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계로의 분화를 촉진할 수 있는 농도이다. 제 1 섬유아세포 증식 인자가 또한 다능성 줄기 세포의 유지 배양에도 사용되지만, 중뇌-후뇌 경계로의 분화 촉진 농도는 일반적으로 유지 배양에 대한 농도보다 더 높다. 제 1 섬유아세포 증식 인자로서 FGF2 를 사용하는 경우, 배지 중 이의 농도는 바람직하게는 20 ng/ml 이상, 보다 바람직하게는 40 ng/ml 이상, 더욱 바람직하게는 50 ng/ml 이상이다. 중뇌-후뇌 경계로의 분화에 대해 악영향이 없는 한, FGF2 농도의 상한치는 특별히 설정되지 않지만, 이는 배양 비용의 측면에서 바람직하게는 1000 ng/ml 이하, 보다 바람직하게는 300 ng/ml 이하, 더욱 바람직하게는 100 ng/ml 이하이다. 한 구현예에서, 배지 중 FGF2 농도는 바람직하게는 20~1000 ng/ml, 바람직하게는 40~300 ng/ml, 더욱 바람직하게는 50~100 ng/ml 이다. 제 1 섬유아세포 증식 인자의 농도는 처리 기간 내에 변동될 수 있다. 예를 들어, 농도는 후반기에 반감될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 부유 배양 시작부터 제 1 섬유아세포 증식 인자으로의 처리 시작까지는, 세포 응집체를 제 1 섬유아세포 증식 인자로 자극하지 않는다. 즉, 부유 배양 시작부터 제 1 섬유아세포 증식 인자으로의 처리 시작까지는, 부유 배양용 배지는 바람직하게는 제 1 섬유아세포 증식 인자를 실질적으로 포함하지 않는다. "제 1 섬유아세포 증식 인자를 실질적으로 포함하지 않는다" 는 것은, 배지 중 제 1 섬유아세포 증식 인자 농도가 중뇌-후뇌 경계로의 분화를 촉진하는 농도보다 낮은 것을 의미한다. 한 구현예에서, 부유 배양 시작부터 제 1 섬유아세포 증식 인자로의 처리 시작까지의 기간 동안 배지 중 제 1 섬유아세포 증식 인자의 농도는 일반적으로 1 ng/ml 미만, 바람직하게는 0.1 ng/ml 미만, 보다 바람직하게는 0.01 ng/ml 미만이다.
한 구현예에서, 단계 (I) 은 부유 배양에서 인간 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 제 2 섬유아세포 증식 인자로 추가 처리하는 것을 포함한다.
제 2 섬유아세포 증식 인자는 단계 (I) 에서 수득된 세포 응집체를 사용하여 수행되는, 단계 (II) 에서 형성되는 신경표피 구조에 신경관의 배복축을 따라 극성을 부여하는 효과를 갖는 FGF 이다. 섬유아세포 증식 인자 (FGF) 로서, FGF1~FGF23 이 인간 및 마우스에서 확인되고 있다. 제 2 섬유아세포 증식 인자는 바람직하게는 FGF19, FGF17 또는 FGF8 이며, 보다 바람직하게는 FGF19 이다. FGF19 는 공지된 사이토카인이며, 그의 아미노산 서열도 공지되어 있다. 본 발명에서 사용하는 FGF19 는 일반적으로 포유 동물 FGF19 이다. 포유 동물의 예는 상기 언급한 것들을 포함한다. 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의 포유 동물의 FGF19 를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 배양하는 세포와 동일한 종의 포유 동물의 FGF19 가 사용된다. 예를 들어, 설치류 (마우스, 래트 등) 또는 영장류 (인간 등) 의 FGF19 가 사용된다. 인간 FGF19 의 대표적인 아미노산 서열의 예는 NCBI 등록 번호 NP_005108.1 (2014 년 4 월 27 일 갱신), 상기 아미노산 서열로부터 N-말단 신호 서열 (1-22) 을 제거하여 수득한 아미노산 서열 (성숙 인간 FGF19) 등을 포함한다.
세포 응집체를 제 2 섬유아세포 증식 인자로 처리하는 시기 및 기간은 신경표피 구조에 신경관의 배복축을 따라 극성이 부여되는 한, 특별히 한정되지 않는다. 다능성 줄기 세포 응집체의 부유 배양 시작을 제 0 일 (d0) 로 했을 때, 제 2 섬유아세포 증식 인자는 바람직하게는 d10~d14 에서의 임의 시점에, 보다 바람직하게는 d14 에 배지에 첨가되어, 제 2 섬유아세포 증식 인자로의 세포 응집체의 처리가 시작된다. 제 2 섬유아세포 증식 인자로의 처리 기간은 일반적으로 2 일 이상, 바람직하게는 4 일 이상이다. 제 2 섬유아세포 증식 인자로의 처리 기간의 상한치는 신경표피 구조에 신경관의 배복축을 따라 극성이 부여되는 한, 특별히 한정되지 않는다. 중뇌-후뇌 경계 외의 모이어티로의 분화 가능성을 억제하기 위해, 이는 일반적으로 14 일 이내, 바람직하게는 11 일 이내, 보다 바람직하게는 7 일 이내이다. 제 2 섬유아세포 증식 인자로의 처리 기간 경과 후, 제 2 섬유아세포 증식 인자는 배지로부터 제거된다. 제 2 섬유아세포 증식 인자 처리 기간에서의 배지 중 제 2 섬유아세포 증식 인자 농도는, 신경표피 구조에 신경관의 배복축을 따라 극성을 부여하는 농도이다. 제 2 섬유아세포 증식 인자로서 FGF19 를 사용하는 경우, 배지 중 이의 농도는 바람직하게는 30 ng/ml 이상, 보다 바람직하게는 40 ng/ml 이상, 더욱 바람직하게는 50 ng/ml 이상이다. 중뇌-후뇌 경계로의 분화에 대한 악영향이 없는 한, FGF19 농도의 상한치는 특별히 설정되지 않지만, 이는 바람직하게는 1000 ng/ml 이하, 보다 바람직하게는 500 ng/ml 이하, 더욱 바람직하게는 300 ng/ml 이하이다. 한 구현예에서, 배지 중 FGF2 의 농도는 바람직하게는 30~1000 ng/ml, 바람직하게는 40~500 ng/ml, 더욱 바람직하게는 50~300 ng/ml 이다. 제 2 섬유아세포 증식 인자의 농도는 처리 기간 내에 변동될 수 있다. 예를 들어, 농도는 후반기에 반감될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 부유 배양 시작부터 제 2 섬유아세포 증식 인자로의 처리 시작까지는, 세포 응집체를 제 2 섬유아세포 증식 인자로 자극하지 않는다. 즉, 부유 배양 시작부터 제 2 섬유아세포 증식 인자로의 처리 시작까지는, 부유 배양용 배지는 바람직하게는 제 2 섬유아세포 증식 인자를 실질적으로 포함하지 않는다. "제 2 섬유아세포 증식 인자를 실질적으로 포함하지 않는다" 는 것은, 배지 중 제 2 섬유아세포 증식 인자 농도가 신경표피 구조에 신경관의 배복축을 따라 극성을 부여하는 농도보다 낮은 것을 의미한다. 한 구현예에서, 부유 배양 시작부터 제 2 섬유아세포 증식 인자로의 처리 시작까지의 기간 동안 배지 중 제 2 섬유아세포 증식 인자의 농도는 일반적으로 1 ng/ml 미만, 바람직하게는 0.1 ng/ml 미만, 보다 바람직하게는 0.01 ng/ml 미만, 가장 바람직하게는 0 ng/ml 이다.
본 발명에서 사용되는 인슐린, 제 1 섬유아세포 증식 인자 및 제 2 섬유아세포 증식 인자는 바람직하게 단리된다. "단리" 되는 것은, 의도된 성분 또는 세포 외의 인자를 제거하는 조작이 수행되고 성분 또는 세포가 더 이상 자연 상태가 아닌 것을 의미한다. 따라서, "단리된 단백질 X" 는 배양되는 세포 또는 조직으로부터 생성된 내인성 단백질 X 는 포함하지 않는다. "단리된 단백질 X" 의 순도 (총 단백질 중량에 대한 단백질 X 의 중량의 백분율) 는 일반적으로 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이다. 부유 배양에 사용되는 배지에 함유되는 단리된 인슐린, 제 1 섬유아세포 증식 인자 및 제 2 섬유아세포 증식 인자는, 배지에 외인적으로 첨가된 것이다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 단리된 인슐린/단리된 제 1 섬유아세포 증식 인자/단리된 제 2 섬유아세포 증식 인자를 각각 제공하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 단계 (I) 에서의 부유 배양에 사용하는 배지에 단리된 인슐린/단리된 제 1 섬유아세포 증식 인자/단리된 제 2 섬유아세포 증식 인자를 각각 외인적으로 첨가하는 단계가 포함된다.
바람직한 ROCK 저해제, TGFβ 신호 저해제 및 제 1 섬유아세포 증식 인자의 조합은 Y27632, SB431542 및 FGF2 이다.
바람직한 ROCK 저해제, TGFβ 신호 저해제, 제 1 섬유아세포 증식 인자 및 제 2 섬유아세포 증식 인자의 조합은 Y27632, SB431542, FGF2 및 FGF19 이다.
한 구현예에서는 단계 (I) 의 부유 배양에서, 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를, 부유 배양 시작부터 ROCK 저해제로 처리하고, 부유 배양 시작부터 TGFβ 신호 저해제로 처리하고, 부유 배양 시작 후 제 2 일~제 4 일부터 제 1 섬유아세포 증식 인자로 처리한다. ROCK 저해제로의 처리 기간은 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포의 세포사를 억제하는데 충분한 기간 (예를 들어, 12 시간 (2 일, 4 일 또는 7 일)~21 일 (또는 14 일)) 이다. TGFβ 신호 저해제로의 처리 기간은 중배엽 분화를 억제하고 신경외배엽으로의 분화를 촉진하는데 충분한 기간 (예를 들어, 2 일 (또는 7 일)~21 일 (또는 14 일)) 이다. 제 1 섬유아세포 증식 인자로의 처리 기간은 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화를 촉진하는데 충분한 기간 (예를 들어, 2 일 (또는 5 일)~19 일 (또는 12 일)) 이다.
한 구현예에서는 단계 (I) 의 부유 배양에서, 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를, 부유 배양 시작부터 ROCK 저해제로 처리하고, 부유 배양 시작부터 TGFβ 신호 저해제로 처리하고, 부유 배양 시작 후 제 2 일~제 4 일부터 제 1 섬유아세포 증식 인자로 처리하고, 부유 배양 시작 후 제 10 일~제 14 일부터 제 2 섬유아세포 증식 인자로 처리한다. ROCK 저해제로의 처리 기간은 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포의 세포사를 억제하는데 충분한 기간 (예를 들어, 12 시간 (2 일, 4 일 또는 7 일)~21 일 (또는 14 일)) 이다. TGFβ 신호 저해제로의 처리 기간은 중배엽 분화를 억제하고 신경외배엽으로의 분화를 촉진하는데 충분한 기간 (예를 들어, 2 일 (또는 7 일)~21 일 (또는 14 일)) 이다. 제 1 섬유아세포 증식 인자로의 처리 기간은 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화를 촉진하는데 충분한 기간 (예를 들어, 2 일 (또는 5 일)~19 일 (또는 12 일)) 이다. 제 2 섬유아세포 증식 인자로의 처리 기간은 신경표피 구조에 신경관의 배복축을 따라 극성을 부여하는데 충분한 기간 (예를 들어, 2 일 (또는 4 일)~14 일 (11 일 또는 7 일)) 이다.
바람직한 구현예에서, 상기 (2) 에서의 다능성 줄기 세포 응집체의 형성에 대하여, 단계 (I) 에서 사용하는 배지를 사용하여 다능성 줄기 세포 응집체를 형성시키고, 응집체의 부유 배양을 지속하여 단계 (I) 을 수행한다. 즉, 분산된 다능성 줄기 세포를 단계 (I) 에서 사용하는 배지 (인슐린 함유 무혈청 배지) 에 현탁하고, 다능성 줄기 세포의 현탁액을 상술한 배양 용기에 시딩하고, 분산된 다능성 줄기 세포를 세포 배양 용기에 대해 비접착성인 조건 하에 배양함으로써, 복수의 다능성 줄기 세포를 집합시켜 응집체를 형성시키고, 형성된 다능성 줄기 세포 응집체를 동일 배지 중 계속해서 부유 배양한다. 분산된 다능성 줄기 세포가 부유 배양 시작시 단시간에 응집체를 형성하므로, 이러한 구현예에서는 분산된 다능성 줄기 세포의 배양 시작을 단계 (I) 의 부유 배양 시작으로서 간주할 수 있다.
한 구현예에서, 인슐린, ROCK 저해제 및 TGFβ 신호 저해제를 함유하는 무혈청 배지에 분산된 다능성 줄기 세포를 배양 용기에서 부유 배양하여, 다능성 줄기 세포 응집체를 형성시키고, 수득한 다능성 줄기 세포 응집체를 동일 무혈청 배지 중 계속해서 부유 배양한다. 부유 배양에서, 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 제 1 섬유아세포 증식 인자 (및 임의로는 제 2 섬유아세포 증식 인자) 로 추가 처리한다.
한 구현예에서, 인슐린, ROCK 저해제 및 TGFβ 신호 저해제를 함유하는 무혈청 배지에 분산된 다능성 줄기 세포를 부유 배양하여 다능성 줄기 세포 응집체를 형성시키고, 수득한 다능성 줄기 세포 응집체를 동일한 무혈청 배지 중 계속하여 부유 배양한다. 이러한 부유 배양에서, 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 세포 응집체를 부유 배양 시작 후 제 2 일~제 4 일부터 제 1 섬유아세포 증식 인자로 추가 처리한다. ROCK 저해제로의 처리 기간은 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포의 세포사를 억제하는데 충분한 기간 (예를 들어, 12 시간 (2 일, 4 일, 또는 7 일)~21 일 (또는 14 일)) 이다. TGFβ 신호 저해제로의 처리 기간은 중배엽으로의 분화를 억제하고 신경외배엽으로의 분화를 촉진하는데 충분한 기간 (예를 들어, 2 일 (또는 7 일)~21 일 (또는 14 일)) 이다. 제 1 섬유아세포 증식 인자로의 처리 기간은 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화를 촉진하는데 충분한 기간 (예를 들어, 2 일 (또는 5 일)~19 일 (또는 12 일)) 이다.
한 구현예에서, 인슐린, ROCK 저해제 및 TGFβ 신호 저해제를 함유하는 무혈청 배지에 분산된 다능성 줄기 세포를 부유 배양하여 다능성 줄기 세포 응집체를 형성시키고, 수득한 다능성 줄기 세포 응집체를 동일한 무혈청 배지 중 계속하여 부유 배양한다. 이러한 부유 배양에서, 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 세포 응집체를 부유 배양 시작 후 제 2 일~제 4 일부터 제 1 섬유아세포 증식 인자로 처리하고, 부유 배양 시작 후 제 10 일~제 14 일부터 제 2 섬유아세포 증식 인자로 처리한다. ROCK 저해제로의 처리 기간은 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포의 세포사를 억제하는데 충분한 기간 (예를 들어, 12 시간 (2 일, 4 일, 또는 7 일)~21 일 (또는 14 일)) 이다. TGFβ 신호 저해제로의 처리 기간은 중배엽 분화를 억제하고 신경외배엽으로의 분화를 촉진하는데 충분한 기간 (예를 들어, 2 일 (또는 7 일)~21 일 (또는 14 일)) 이다. 제 1 섬유아세포 증식 인자로의 처리 기간은 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직 에 대한 분화를 촉진하는데 충분한 기간 (예를 들어, 2 일 (또는 5 일)~19 일 (또는 12 일)) 이다. 제 2 섬유아세포 증식 인자로의 처리 기간은 신경표피 구조에 신경관의 배복축을 따라 극성을 부여하는데 충분한 기간 (예를 들어, 2 일 (또는 4 일)~14 일 (11 일 또는 7 일)) 이다.
단계 (I) 의 부유 배양은 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화가 유도되는데 충분한 기간 동안 수행된다. 그 결과, 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직을 함유하는 세포 응집체를 수득한다. 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화는 예를 들어, 중뇌-후뇌 경계 마커 특이적 프로브를 사용하는 RT-PCR, 및 중뇌-후뇌 경계 마커 특이적 항체 및 신경 선구체 조직 특이적 항체를 사용하는 면역조직화학에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 단계 (I) 의 부유 배양은 세포 응집체에 함유된 세포 중 20% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상이 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체가 될 때까지 수행된다. 배양 기간은 다능성 줄기 세포의 동물 종; 및 ROCK 저해제, TGFβ 신호 저해제 및 제 1 섬유아세포 증식 인자의 종류와 농도에 따라 변동될 수 있으므로, 일반적으로 명시할 수 없다. 그러나 인간 다능성 줄기 세포를 사용하는 경우, 예를 들어 제 1 배양 단계는 일반적으로 14~30 일 (예를 들어, 21 일) 이다.
중뇌-후뇌 경계 마커로서, En2 (중뇌 마커), Gbx2 (후뇌문측 마커) 등을 언급할 수 있다. 신경 선구체 마커로서, N-카드헤린을 언급할 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체는 En2 또는 Gbx2 양성, 및 N-카드헤린 양성 세포로서 확인된다.
단계 (I) 은 세포 응집체에서 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화 유도를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 확인 단계는, 일부 세포 응집체를 분리하고, 이를 중뇌-후뇌 경계 마커 특이적 프로브를 사용하는 RT-PCR 또는 중뇌-후뇌 경계 마커 특이적 항체 및 신경 선구체 조직 특이적 항체를 사용하는 면역조직화학 분석에 의해 수행할 수 있다.
한 구현예에서, 단계 (I) 의 부유 배양에는 소닉 헤지호그 저해제가 첨가되지 않으며, 단계 (I) 의 부유 배양은 그 전체 기간에 걸쳐 소닉 헤지호그 저해제를 포함하지 않는다. 즉, 다능성 줄기 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 응집체는 소닉 헤지호그 저해제로 처리되지 않는다. [Muguruma, K. et al., Nature Neurosci. 13, 1171-1180, 2010] 의 방법에서는 마우스 ES 세포로부터의 소뇌 분화에 소닉 헤지호그 저해제를 필요로 하는 반편, 본 발명의 방법에 의해서는 소닉 헤지호그 저해제를 첨가하지 않아도 다능성 줄기 세포 (특히 인간 다능성 줄기 세포) 의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 효과적인 분화가 가능하다. 오히려, 소닉 헤지호그 저해제의 첨가는 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화를 억제한다. 소닉 헤지호그 저해제의 예는 시클로파민, 제르빈, GANT61, SANT-2, 토마티딘, 제룸본, GDC-0449, XL139, IPI926, IPI609, LDE225, 트리파라놀, AY9944 등과 같은 저분자량 화합물을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다.
한 구현예에서, 단계 (I) 의 부유 배양에는 BMP4 가 첨가되지 않고, 단계 (I) 의 부유 배양은 그 전체 기간에 걸쳐 BMP4 를 실질적으로 포함하지 않는다. 즉, 다능성 줄기 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 응집체는 BMP4 에 의해 처리되지 않는다. [Muguruma, K. et al., Nature Neurosci. 13, 1171-1180, 2010] 의 방법에서는 마우스 ES 세포로부터의 소뇌 분화에 BMP4 를 필요로 하는 한편, 본 발명의 방법에 의해서는 BMP4 를 첨가하지 않아도 다능성 줄기 세포 (특히 인간 다능성 줄기 세포) 의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화가 가능하다. "BMP4 를 실질적으로 포함하지 않는다" 는 것은, 배지 중 BMP4 농도가 생리 활성 발현 수준보다 낮은 것을 의미한다. 구체적으로는, 배지 중 BMP4 농도는 일반적으로 0.1 ng/ml 미만, 바람직하게는 0.01 ng/ml 미만, 보다 바람직하게는 0.001 ng/ml 미만, 가장 바람직하게는 0 ng/ml 이다.
바람직한 구현예에서, 단계 (I) 의 부유 배양에는 소닉 헤지호그 저해제 및 BMP4 가 첨가되지 않으며, 단계 (I) 의 부유 배양은 그 전체 기간에 걸쳐 소닉 헤지호그 저해제를 포함하지 않고, BMP4 를 실질적으로 포함하지 않는다. 즉, 다능성 줄기 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 응집체가 소닉 헤지호그 저해제 및 BMP4 에 의해 처리되지 않는다.
(3.2) 단계 (II)
단계 (II) 에서, 단계 (I) 에서 수득한 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직을 함유하는 인간 세포 응집체를 무혈청 배지 중 추가 부유 배양하여, 신경 선구체 조직에서의 신경 선구체에 의한 신경표피 구조 형성을 유도함으로써, 소뇌판 조직을 함유하는 인간 세포 응집체를 수득한다.
단계 (II) 에 사용되는 배지는, 단계 (I) 에서와 동일한 방식으로, 포유 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 사용하여 제조할 수 있다. 기초 배지로서, 단계 (I) 에 대해 기재된 기초 배지를 언급할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 단계 (II) 에 사용되는 배지는 기초 배지로서 인간 뉴런의 배양에 사용하는 배지로부터 제조된다. 이러한 기초 배지로서, Neurobasal 배지를 언급할 수 있다.
단계 (II) 에 사용되는 배지는 화학적으로 미규정된 성분으로의 오염을 방지하기 위해 바람직하게는 무혈청 배지이다.
단계 (II) 에 사용되는 배지는 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 혈청 대체물은 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'-티올글리세롤, 또는 이들의 균등물 등을 적절히 포함하는 것일 수 있다. 이러한 혈청 대체물로서, N2, B27, KSR 등을 언급할 수 있다. N2 는 인슐린, 트랜스페린, 프로게스테론, 푸트레신 및 나트륨 셀레나이트를 함유하는 공지된 혈청 대체 조성물이다. B27 의 조성은 [J. Neurosci. Res., vol. 35, p. 567-576, 1993, Brain Res., vol. 494, p. 65-74, 1989] 등에 기재되어 있다. N2, B27 은 Life Technologies 등으로부터 구입 가능하다. 배지에 첨가된 혈청 대체물의 양은 소뇌판 조직으로의 분화 유도를 달성할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 이것이 Life Technologies사제 N2 보충물인 경우, 배지 전체 부피에 대해 1/500~1/10 부피가 첨가된다. 바람직한 구현예에서, 단계 (II) 에 사용되는 배지는 N2 를 함유한다. 화학적으로 규정된 성분을 함유하는 혈청 대체물이 바람직하다. 또한, 배양하는 세포의 동물 종과 상이한 동물로부터 단리된 성분 (이종 동물-유래 성분) (예를 들어, 인간 세포를 배양하는 경우 비인간 동물로부터 단리된 성분) 을 함유하지 않는 혈청 대체물이 바람직하다. 화학적으로 미규정된 혈청 대체물 및 이종 동물-유래 성분 함유 혈청 대체물 (예를 들어, KSR (녹아웃 혈청 대체물)) 은 바람직하게는 사용되지 않는다.
단계 (II) 에 사용되는 배지는 소뇌판 조직의 분화 유도에 악영향을 주지 않는 한, 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 첨가제의 예는, 인슐린, 철 공급원 (예를 들어 트랜스페린 등), 미네랄 (예를 들어 나트륨 셀레네이트 등), 당류 (예를 들어 글루코오스 등), 유기산 (예를 들어 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질 (예를 들어 알부민 등), 아미노산 (예를 들어 L-글루타민 등), 환원제 (예를 들어 2-메르캅토에탄올 등), 비타민 (예를 들어 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생 물질 (예를 들어 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제 (예를 들어 HEPES 등) 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. L-글루타민을 함유하는 배지 중 장기 배양이 암모니아 독성을 일으킬 수 있으므로, L-글루타민 대신에 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드를 또한 사용할 수 있다. 바람직한 구현예서, 단계 (II) 에 사용되는 배지는 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드를 함유한다. L-알라닐-L-글루타민 디펩티드는 예를 들어 Glutamax (Life Technologies사제) 등으로서 시판되고 있다.
화학적으로 미규정된 성분으로의 오염을 방지하기 위해, 단계 (II) 에 사용되는 배지는 바람직하게는 그 성분이 화학적으로 규정된 배지이다.
바람직하게는, 단계 (II) 에 사용되는 배지는 이종 동물-유래 성분을 함유하지 않는다.
단계 (II) 에서의 배양 온도 및 CO2 농도와 같은 기타 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는 예를 들어 약 30~40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는 예를 들어 약 1~10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
단계 (II) 의 부유 배양에서, 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직의 소뇌판 조직으로의 분화 유도가 본 발명의 방법에 의해 가능한 한, 피더 세포의 존재 또는 부재 하에 세포 응집체의 부유 배양을 실행할 수 있다. 미규정 인자로의 오염을 방지하기 위해, 피더 세포의 부재 하에 세포 응집체의 부유 배양을 수행하는 것이 바람직하다.
세포 응집체의 부유 배양에 사용할 수 있는 용기로서, 상기 (2) 의 다능성 줄기 세포 응집체의 형성에 사용할 수 있는 용기로서 열거한 것들을 언급할 수 있다. 한 구현예에서, 페트리 디쉬와 같은 평평한 바닥을 갖는 용기를 사용한다.
단계 (II) 에서의 부유 배양은 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체에 의한 신경표피 구조 형성을 유도하는데 충분한 기간 동안 수행된다. 단계 (II) 를 수행함으로써, 세포 응집체 내에 GABA 작동성 신경 선구체 및 소뇌 과립 세포 선구체를 함유하는 신경표피 구조, 즉 소뇌판 조직이 형성될 수 있다. 신경표피 구조는 표피 관상 조직일 수 있다. GABA 작동성 신경 선구체 및 소뇌 과립 세포 선구체를 함유하는 신경표피 구조의 형성은, 예를 들어 GABA 작동성 신경 선구체 마커 (예를 들어, Kirrel2, Ptf1a, Sox2) 에 대한 특이적 항체, 및 소뇌 과립 세포 선구체 마커 (예를 들어, Atoh1, Barhl1) 에 대한 특이적 항체를 사용하는 면역조직화학에 의해, GABA 작동성 신경 선구체 마커 양성 세포 및 소뇌 과립 세포 선구체 마커 양성 세포를 함유하는 신경표피 구조 (즉, GABA 작동성 신경 선구체 마커 양성 및 소뇌 과립 세포 선구체 마커 양성 신경표피 구조) 의 형성을 검출함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 배양 중의 세포 응집체에 함유된 신경표피 구조 (예를 들어, N-카드헤린 양성 신경표피 구조) 중 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상이 GABA 작동성 신경 선구체 마커 양성 및 소뇌 과립 세포 선구체 마커 양성이 될 때까지, 단계 (II) 의 부유 배양이 수행된다. 배양 기간이 다능성 줄기 세포의 동물 종; 배지 조성과 같은 배양 조건에 따라 변동할 수 있으므로, 이는 일반적으로 명시될 수 없다. 그러나 인간 다능성 줄기 세포를 사용한 경우, 단계 (II) 의 부유 배양 시작부터 약 3 일 내에 신경표피 구조의 형성이 시작되므로, 부유 배양의 배양 기간은 3 일 이상이다. GABA 작동성 신경 선구체 및 소뇌 과립 세포 선구체를 함유하는 신경표피 구조가 유지되는 한, 단계 (II) 의 배양 기간에 상한치는 없다. 배양 기간이 지나치게 긴 경우, 세포 응집체의 취약성이 증가하고 세포 응집체가 붕괴될 수 있다. 따라서, 배양 기간은 일반적으로 40 일 이내, 바람직하게는 32 일 이내이다.
한 구현예에서, 신경표피 구조는 정단-기저 극성을 갖는다. 정단-기저 극성은, 정단 마커 (예를 들어, PKCζ), 및 기저 마커에 대한 항체를 사용하는 면역조직화학 분석에 의해 확인할 수 있다. 신경표피 구조가 표피 관상 조직인 경우, 정단측이 루멘과 접한다 (apical side in).
여기서, 상술한 단계 (I) 이 인간 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 제 2 섬유아세포 증식 인자로 처리하는 것을 추가로 포함하는 경우, 단계 (II) 에서 수득하는 세포 응집체에서의 소뇌판 조직 (신경표피 구조) 은 배복 극성을 획득한다. 보다 구체적으로는, 각 신경표피 구조에서, 소뇌 신경 선구체 마커 (예를 들어, Kirrel2, Ptf1a, Atoh1, SKOR2) (이는, 배 발생에 있어서 신경관의 배측 (dorsal) 에 발현됨) 에 대해 양성인 세포가 세포 응집체의 외부측에 국부화되고, 신경표피 구조에서의 루멘을 가로질러 반대 부위에 복측 (ventral) 마커 (예를 들어, Nkx6.1, Foxa2) 에 대해 양성인 세포가 국부화된다. 즉, 배 발생에서 신경관의 배복축을 따라 극성을 갖는 구조를 시험관내에서 세포 응집체 내에 재현할 수 있다.
단계 (I) 에서 제 2 섬유아세포 증식 인자로의 처리를 수행하지 않은 경우, 대다수의 세포 응집체는 작은 로제트 신경표피 구조를 갖는다. 제 2 섬유아세포 증식 인자로의 처리를 수행하는 경우, 신경표피 구조의 형성이 촉진되고, 대다수 (예를 들어 70% 이상) 의 세포 응집체가 더 큰 편평-난형 신경표피 구조를 함유한다.
한 구현예에서, 단계 (II) 는 부유 배양에서 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직을 함유하는 인간 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 GDF7 로 처리하는 것을 포함한다. GDF7 로 처리하는 것은 소뇌 과립 세포 선구체 (예를 들어, Atoh 양성 세포) 로의 분화 및 능뇌순의 형성을 촉진한다.
GDF7 은 공지된 사이토카인이고, 그의 아미노산 서열도 공지되어 있다. 본 발명에 사용하는 GDF7 은 일반적으로 포유 동물 GDF7 이다. 포유 동물로서, 상기 언급된 것들을 열거할 수 있다. 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 포유 동물의 GDF7 이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 배양하는 세포와 동일 종의 포유 동물의 GDF7 이 사용된다. 예를 들어, 설치류 (마우스, 래트 등) 또는 영장류 (인간 등) 의 GDF7 이 사용된다. 인간 GDF7 의 대표적인 아미노산 서열의 예는 NCBI 등록 번호 NP_878248.2 (2014 년 1 월 26 일 갱신), 상기 아미노산 서열의 제 322 번부터 제 450 번 아미노산까지의 부분 서열 (성숙 인간 GDF7) 등을 포함한다.
세포 응집체를 GDF7 로 처리하는 시기 및 기간은 소뇌 과립 세포 선구체로의 분화를 촉진하는 한, 특별히 한정되지 않는다. 소뇌 과립 세포 선구체로의 분화를 효과적으로 촉진하기 위해, 단계 (II) 에서 세포 응집체의 부유 배양 시작부터 바람직하게는 2 일 이내에, 보다 바람직하게는 부유 배양 시작부터 1 일 이내에, 더욱 바람직하게는 부유 배양 시작부터 GDF7 을 배지에 첨가하여, 세포 응집체를 GDF7 로 처리한다. GDF7 로의 처리 기간은 일반적으로 2 일 이상, 바람직하게는 7 일 이상이다. GDF7 로의 처리 기간의 상한치는 세포 응집체에서 소뇌판 조직으로의 분화가 가능한 한, 특별히 한정되지 않는다. 분화에 대한 예측불가능한 악영향을 방지하기 위해, 이는 일반적으로 21 일 이내, 바람직하게는 14 일 이내이다. GDF7 로의 처리 기간 경과 후, GDF7 은 배지로부터 제거된다. GDF7 처리 동안 배지 중 GDF7 농도는 소뇌 과립 세포 선구체로의 분화를 촉진할 수 있는 농도이다. 예를 들어, 이러한 농도는 일반적으로 약 10 ng/ml 이상, 바람직하게는 50 ng/ml 이상, 보다 바람직하게는 100 ng/ml 이상이다. GDF7 농도의 상한치는 소뇌 과립 세포 선구체로의 분화에 악영향을 미치지 않는 한 특별히 한정되지 않는다. 배양 비용의 측면에서, 이는 일반적으로 1000 ng/ml 이하, 바람직하게는 500 ng/ml 이하, 보다 바람직하게는 300 ng/ml 이하이다. GDF7 농도는 처리 기간 내에 변동될 수 있다. 예를 들어, 농도는 후반기에 반감될 수 있다.
한 구현예에서, 단계 (II) 는 부유 배양에서 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직을 함유하는 인간 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 SDF1 로 처리하는 것을 포함한다. SDF1 로 처리하는 것은 소뇌판 조직에서의 신경표피 구조 형성을 촉진한다. 특히, 이는 연속적인 소뇌판 신경표피의 형성에 효과적이다. 또한, 신경표피 구조와 연속하여 능뇌순이 형성될 수 있다.
SDF1 은 CXCL12 로도 지칭되는 공지된 케모카인이며, 그의 아미노산 서열도 공지되어 있다. 본 발명에서 사용하는 SDF1 은 일반적으로 포유 동물 SDF1 이다. 포유 동물의 예는 상기 언급된 것들을 포함한다. 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 포유 동물의 SDF1 을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 배양하는 세포와 동일 종의 포유 동물의 SDF1 이 사용된다. 예를 들어, 설치류 (마우스, 래트 등) 또는 영장류 (인간 등) 의 SDF1 이 사용된다. 인간 SDF1 의 대표적인 아미노산 서열의 예는 NCBI 등록 번호 NP_001171605.1 (2014 년 5 월 25 일 갱신), 상기 아미노산 서열로부터 N-말단 신호 서열 (1-22) 을 제거하여 수득한 아미노산 서열 (성숙 인간 SDF1) 등을 포함한다.
세포 응집체를 SDF1 로 처리하는 시기 및 기간은 소뇌판 조직에서의 신경표피 구조 형성을 촉진하는 한, 특별히 한정되지 않는다. SDF1 은 소뇌내 세포의 위치 결정에 관여하는 인자이므로, 세포 응집체 내에 GABA 작동성 신경 선구체 및 소뇌 과립 세포 선구체를 함유하는 신경표피 구조 (소뇌판 조직) 가 어느 정도 형성되었을 때의 단계에서 세포 응집체를 SDF1 로 처리하는 것이 바람직하다. 이러한 측면에서, 단계 (II) 에 있어서의 세포 응집체의 부유 배양 시작부터 바람직하게는 제 4 일~제 10 일에서의 임의 시점, 보다 바람직하게는 제 6 일~제 8 일에서의 임의 시점에서 SDF1 을 배지에 첨가하여, 세포 응집체를 SDF1 로 처리한다. SDF1 로의 처리 기간은 일반적으로 2 일 이상, 바람직하게는 7 일 이상이다. SDF1 로의 처리 기간의 상한치는 세포 응집체에서 소뇌판 조직으로의 분화가 가능한 한, 특별히 한정되지 않는다. 분화에 대한 예측불가능한 악영향을 방지하기 위해, 이는 일반적으로 21 일 이내, 바람직하게는 14 일 이내이다. SDF1 로의 처리 기간 경과 후, SDF1 은 배지로부터 제거된다. SDF1 로의 처리 동안 배지 중 SDF1 농도는, 신경표피 구조의 형성을 촉진할 수 있는 농도이다. 예를 들어, 이러한 농도는 일반적으로 약 50 ng/ml 이상, 바람직하게는 100 ng/ml 이상이다. SDF1 농도의 상한치는 신경표피 구조의 형성을 촉진하는 한, 특별히 한정되지 않는다. 배양 비용의 측면에서, 이는 일반적으로 1000 ng/ml 이하, 바람직하게는 500 ng/ml 이하이다. SDF1 농도는 처리 기간 내에서 변동될 수 있다. 예를 들어 농도는 후반기에 반감될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 단계 (II) 에서의 부유 배양 시작부터 SDF1 처리 시작 까지는, 세포 응집체를 SDF1 로 자극하지 않는다. 즉, 단계 (II) 에서의 부유 배양 시작부터 SDF1 처리 시작까지는, 부유 배양용 배지는 바람직하게는 SDF1 을 실질적으로 포함하지 않는다. "SDF1 을 실질적으로 포함하지 않는다" 는 것은, 배지 중 SDF1 농도가 신경표피 구조의 형성을 촉진하는 농도보다 낮은 것을 의미한다. 한 구현예에서, 단계 (II) 에서의 부유 배양 시작부터 SDF1 처리 시작까지의 기간 동안 배지 중 SDF1 농도는 일반적으로 1 ng/ml 미만, 바람직하게는 0.1 ng/ml 미만, 보다 바람직하게는 0.01 ng/ml 미만이다.
한 구현예에서, 단계 (I) 의 부유 배양에서 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 세포 응집체를 제 2 섬유아세포 증식 인자 (예를 들어, FGF19) 로 처리하고, 단계 (II) 의 부유 배양에서 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직을 함유하는 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 세포 응집체를 SDF1 로 추가 처리한다. 상기 언급한 바와 같이, 단계 (I) 에서의 제 2 섬유아세포 증식 인자 (예를 들어, FGF19) 로의 처리에 의해, 단계 (II) 에서 수득한 세포 응집체에서의 소뇌판 조직 (신경표피 구조) 은 배복 극성을 획득한다. 구체적으로는, 각 신경표피 구조에서, 소뇌 신경 선구체 마커 양성 세포가 세포 응집체의 외부 측에 국부화되고, 신경표피 구조에서의 루멘을 가로질러 반대 부위에 복측 마커 양성 세포가 국부화된다. 이러한 배복 극성을 갖는 소뇌판 조직 (신경표피 구조) 을 함유하는 세포 응집체를 SDF1 로 추가 처리함으로써, 연속적인 소뇌판 신경표피의 형성이 촉진되고, 세포 응집체의 표면 구역에 연속적인 소뇌 신경표피 구조 (예를 들어, Kirrel2 양성 신경표피 구조) 가 형성될 수 있다. 신경표피 구조는 정단측 (예를 들어, Sox2+ VZ 세포, PKCζ 양성 세포) 이 표면측 (세포 응집체의 표면) 에 위치하고 기저측 (예를 들어, Skor2+ 푸르키네 선구체) 이 심부에 위치하는 극성을 갖는다. SDF1 처리는, 배아에서의 초기 소뇌 발생에서 관찰할 수 있는 바와 같이 소뇌 신경표피 구조의 정단-기저축을 따른 3 개 층으로의 적층화 (lamination) 를 촉진하고, 정단측으로부터 기저측으로, 뇌실대 (예를 들어, aPKC+, Sox2+, Ptf1a+, Kirrel2+), 푸르키네 세포 전구체 구역 (예를 들어, Skor2+, Olig2+, GAD+, Lhx5+) 및 능뇌순-유래 신경세포 구역 (예를 들어, Atoh1+, Barhl1+) 의 3 개 층 구조를 발생시킨다. 더욱이, 이는 연속적인 소뇌 신경표피 구조의 가장자리에 능뇌순-형 조직의 형성을 초래한다. 능뇌순형 조직은 감긴 구조를 나타내고, Atoh1+ 세포 및 Barhl1+ 세포를 함유한다. 상기 나타낸 바와 같이, 단계 (I) 에서의 제 2 섬유아세포 증식 인자 (예를 들어, FGF19) 로의 처리와 단계 (II) 에서의 SDF1 로의 처리를 조합하여, 보다 고차 구조를 갖는 소뇌 선구체 조직이 형성될 수 있다.
한 구현예에서, 단계 (I) 의 부유 배양에서 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를, 부유 배양 시작부터 ROCK 저해제로 처리하고, 부유 배양 시작부터 TGFβ 신호 저해제로 처리하고, 부유 배양 시작 후 제 2 일~제 4 일부터 제 1 섬유아세포 증식 인자로 처리하고, 부유 배양 시작 후 제 10 일~제 14 일부터 제 2 섬유아세포 증식 인자로 처리하고, 단계 (II) 의 부유 배양에서 추가로, 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체를 함유하는 인간 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 부유 배양 시작 후 제 4 일~제 10 일부터 SDF1 로 처리한다. ROCK 저해제로의 처리 기간은 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포의 세포사를 억제하는데 충분한 기간 (예를 들어, 12 시간 (2 일, 4 일, 또는 7 일)~21 일 (또는 14 일)) 이다. TGFβ 신호 저해제로의 처리 기간은 중배엽 분화를 억제하고 신경외배엽으로의 분화를 촉진하는데 충분한 기간 (예를 들어, 2 일 (또는 7 일)~21 일 (또는 14 일)) 이다. 제 1 섬유아세포 증식 인자로의 처리 기간은 다능성 줄기 세포의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직으로의 분화를 촉진하는데 충분한 기간 (예를 들어, 2 일 (또는 5 일)~19 일 (또는 12 일)) 이다. 제 2 섬유아세포 증식 인자로의 처리 기간은 신경표피 구조에 신경관의 배복축을 따라 극성을 부여하는데 충분한 기간 (예를 들어, 2 일 (또는 4 일)~14 일 (또는 11 일 또는 7 일)) 이다. SDF1 로의 처리 기간은 소뇌판 조직에서의 신경표피 구조 형성을 촉진하는데 충분한 기간 (예를 들어, 2 일 (또는 7 일)~21 일 (또는 14 일)) 이다.
본 발명에서 사용되는 GDF7 및 SDF1 은 바람직하게는 단리된다. 부유 배양에 사용되는 배지에 함유되는 단리된 GDF7 및 SDF1 은 배지에 외인적으로 첨가된다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 단리된 GDF7/단리된 SDF1 을 각각 제공하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명은 단계 (II) 의 부유 배양에 사용하는 배지에 단리된 GDF7/단리된 SDF1 을 각각 외인적으로 첨가하는 단계를 포함한다.
(4) 푸르키네 세포, 골지 세포 또는 개재뉴런의 유도
상술한 본 발명의 제조 방법에 의해 수득되는 소뇌판 조직을 함유하는 세포 응집체가 GABA 작동성 신경 선구체를 함유하므로, 세포 응집체를 분화 조건 하에 추가 배양함으로써 푸르키네 세포, 골지 세포 또는 개재뉴런을 제조할 수 있다. 구체적으로는, 상술한 본 발명의 제조 방법에 의해 수득한 소뇌판 조직을 함유하는 세포 응집체로부터 GABA 작동성 신경 선구체를 수득하고, GABA 작동성 신경 선구체를 포유 동물 소뇌 과립 세포 선구체와 함께 공배양하여, GABA 작동성 신경 선구체의 푸르키네 세포, 골지 세포 또는 개재뉴런으로의 분화를 유도한다.
GABA 작동성 신경 선구체는, GABA 작동성 신경 선구체를 함유하는 다능성 줄기 세포-유래 세포 집단으로서, 바람직하게는 단리된 GABA 작동성 신경 선구체로서 제공될 수 있다. GABA 작동성 신경 선구체의 단리는 GABA 작동성 신경 선구체에 대해 특이적인 마커에 대한 항체를 사용하여, FACS 에 의해 수행할 수 있다. GABA 작동성 신경 선구체 특이적 마커로서, Kirrel2 등을 언급할 수 있다.
소뇌 과립 세포 선구체가 능뇌순에 풍부하게 함유되어 있으므로, 비인간 포유 동물 (예를 들어, 마우스) 배아의 능뇌순을 단리하고 이를 적절한 세포 분산액 (예를 들어, 트립신-EDTA, TrypLE 등) 에 분산시켜 수득한 능뇌순유래 세포를, 소뇌 과립 세포 선구체로서 사용할 수 있다.
GABA 작동성 신경 선구체와 소뇌 과립 세포 선구체를 공배양하는 것은, GABA 작동성 신경 선구체와 소뇌 과립 세포 선구체를 적절한 비율 (예를 들어, GABA 작동성 신경 선구체 : 소뇌 과립 세포 선구체 = 1 : 5 ~ 1 : 20) 로 혼합하고, 이를 라미닌과 같은 세포외 매트릭스로 코팅한 배양 용기 상에서 배양함으로써 수행할 수 있다. 배양에 사용하는 배지로서, 소뇌 신경세포의 배양에 사용하는 각종 배지를 사용할 수 있다. N2 및 트리요오도티로닌을 배지에 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 시토신 베타-D-아라비노푸라노시드 (Ara-C) 를 배지에 첨가할 수 있다 (Tabata, T. et al., J. Neurosci. Method. 104, 45-53). 예를 들어, N2 및 트리요오도티로닌을 보충한 DMEM/햄 F-12 등을 사용할 수 있다.
배양 기간은 GABA 작동성 신경 선구체의 푸르키네 세포, 골지 세포 또는 개재뉴런으로의 분화에 충분한 기간이면 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로 15 일 이상이다.
푸르키네 세포 또는 개재뉴런로의 분화는, 푸르키네 세포, 골지 세포 또는 개재뉴런에 대해 특이적인 마커의 발현, 세포의 형상, 전기생리학적 성질 등을 평가함으로써 확인할 수 있다. 본 발명의 방법은, 이러한 확인 단계를 포함할 수 있다. 푸르키네 세포-특이적 마커로서, L7/pcp2, 칼빈딘 등을 언급할 수 있다. 골지 세포의 마커로서, 뉴로그라닌 등을 언급할 수 있다. 개재뉴런의 마커로서, 파르브알부민 등을 언급할 수 있다.
푸르키네 세포로의 분화 과정에서, 축색 및 수상돌기를 갖는 푸르키네 세포 특이적 마커 (L7/pcp2, 칼빈딘)-양성 세포가 먼저 생성된다. 세포를 더 배양함으로써, 성숙화가 진행되고, 수상돌기 가시가 형성되고, GluR델타2 가 발현되고, 그에 따라 성숙 푸르키네 세포가 생긴다. 성숙 푸르키네 세포는, (1) 자발적인 활동 전위의 반복 발화, (2) 과분극화-활성화된 양이온 채널 전류 (Ih 전류), 및 (3) NMDA 수용체-비의존적 AMPA 수용체-의존적 글루타메이트 수용을 포함하는 특징적인 전기생리적 특징을 갖는다.
공배양물로부터 푸르키네 세포, 골지 세포 또는 개재뉴런을 단리함으로써, 푸르키네 세포 또는 개재뉴런을 수득할 수 있다. 단리는 각각의 세포에 대해 특이적인 마커에 대한 항체를 사용하여 FACS, 패닝 (panning) 등에 의해 수행할 수 있다.
GABA 작동성 신경 선구체와 소뇌 과립 세포 선구체와의 공배양에 대해서는, [Muguruma, K. et al., Nature Neurosci. 13, 1171-1180, 2010] 을 참조할 수 있다.
(5) 소뇌 과립 세포의 유도
상술한 본 발명의 제조 방법에 의해 수득한 소뇌판 조직을 함유하는 세포 응집체가 소뇌 과립 세포 선구체를 포함하므로, 상기 선구체를 분화 조건 하에 추가 배양함으로써 소뇌 과립 세포를 제조할 수 있다. 구체적으로는, 상술한 본 발명의 제조 방법에 의해 수득한 소뇌판 조직을 함유하는 세포 응집체로부터 소뇌 과립 세포 선구체를 수득하고, 소뇌 과립 세포 선구체를 포유 동물 소뇌 세포와 함께 공배양하여, 소뇌 과립 세포 선구체의 소뇌 과립 세포로의 분화를 유도한다.
소뇌 과립 세포 선구체는 소뇌 과립 세포 선구체를 함유하는 다능성 줄기 세포-유래 세포 집단으로서, 또는 단리된 소뇌 과립 세포 선구체로서 제공될 수 있다. 소뇌 과립 세포 선구체의 단리는, 소뇌 과립 세포 선구체에 대해 특이적인 마커에 대한 항체를 사용하여 FACS, 패닝, 자성 비즈 등에 의해 수행할 수 있다. 소뇌 과립 세포 선구체 특이적 마커로서, Atoh1, Barhl1, Pax6 등을 언급할 수 있다.
소뇌 세포는 비인간 포유 동물 (예를 들어, 마우스) 소뇌를 단리하고 이를 적절한 세포 분산액 (예를 들어, 트립신-EDTA, TrypLE 등) 에 분산시킴으로써 수득할 수 있다. 바람직하게는, 신생아 (예를 들어, 생후 2 일 이내) 비인간 포유 동물 소뇌가 사용된다.
소뇌 과립 세포 선구체와 소뇌 세포의 공배양은, 소뇌 과립 세포 선구체와 소뇌 세포를 적절한 비율 (예를 들어, 소뇌 과립 세포 선구체 : 소뇌 세포 = 1 : 5 ~ 1 : 40) 로 혼합하고, 혼합물을 라미닌과 같은 세포외 매트릭스로 코팅한 배양 용기 상에서 배양함으로써 수행할 수 있다. 배양에 사용하는 배지로서, 소뇌 신경세포의 배양에 사용되는 각종 배지를 사용할 수 있다. 배지에 N2 를 첨가하는 것이 바람직하다. 예를 들어, N2 및 혈청을 보충한 DMEM/햄 F-12 등을 사용할 수 있다.
배양 기간은 소뇌 과립 세포 선구체의 소뇌 과립 세포로의 분화에 충분한 기간인 한, 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로 약 3~10 일 (바람직하게는, 5~8 일) 이다.
소뇌 과립 세포로의 분화는, 소뇌 과립 세포에 대해 특이적인 마커의 발현, 세포의 형상 등을 평가함으로써 확인할 수 있다. 본 발명의 방법은 이러한 확인 단계를 포함할 수 있다. 소뇌 과립 세포 특이적 마커로서, Barhl1, Pax6, MAP2 등을 언급할 수 있다.
분화한 소뇌 과립 세포가 신경돌기를 따라 이동한 후 세포의 이동 방향이 지금까지의 접선 방향에 대해 수직 방향으로 변화하는 특징적인 이동 패턴을 나타내므로, 이러한 이동 패턴의 축색을 갖는 세포를 소뇌 과립 세포로서 확인할 수 있다.
공배양물로부터 소뇌 과립 세포를 단리함으로써, 소뇌 과립 세포를 수득할 수 있다. 단리는 소뇌 과립 세포에 대해 특이적인 마커에 대한 항체를 사용하여 FACS, 패닝 등에 의해 수행할 수 있다.
(6) 세포 응집체, 단리된 소뇌 선구체 조직, 소뇌 선구체 조직 구성 세포, 소뇌 구성 세포, 및 그의 용도
추가적인 측면에서, 상술한 본 발명의 제조 방법에 의해 수득한 세포 응집체로부터 소뇌 선구체 조직 (소뇌판 조직 등) 을 단리할 수 있다. 또한, 소뇌 선구체 조직을 적절한 세포 분산액으로 분산시킴으로써, 소뇌 선구체 조직을 구성하는 각종 세포를 단리할 수 있다. 본 발명은 상술한 본 발명의 제조 방법에 의해 수득한 세포 응집체, 소뇌 선구체 조직, 및 소뇌 선구체 조직 구성 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 (4) 및 (5) 에 기재된 방법에 의해 수득되는 소뇌 구성 세포 (푸르키네 세포, 골지 세포, 개재뉴런, 과립 세포, 심부 소뇌핵) 를 제공한다.
본 발명에 의해 수득한 세포 응집체, 소뇌 선구체 조직, 소뇌 선구체 조직 구성 세포, 및 소뇌 구성 세포는 이식 치료요법에 사용할 수 있다. 예를 들어, 소뇌의 장애로 인해 발생하는 질환의 치료 약물로서 또는 소뇌의 손상 상태에 있어서 해당하는 손상 부분을 보충하기 위해, 본 발명의 방법에 의해 수득하는 세포 응집체, 소뇌 선구체 조직, 소뇌 선구체 조직 구성 세포, 또는 소뇌 구성 세포를 사용할 수 있다. 소뇌의 장애로 인해 발생하는 질환을 갖는 환자, 또는 소뇌의 손상 상태를 갖는 환자에게 본 발명에 의해 수득하는 세포 응집체, 소뇌 선구체 조직, 소뇌 선구체 조직 구성 세포, 또는 소뇌 구성 세포를 이식함으로써, 소뇌의 장애로 인해 발생하는 질환, 또는 소뇌의 손상 상태를 치료할 수 있다. 소뇌의 장애로 인해 발생하는 질환의 예는, 증후성 피질 소뇌 변성증, 올리브교 소뇌 위축증, 샤이-드래거 (Shy-Drager) 증후군, 척수소뇌 변성증 (SCA) (예를 들어, 유전성 척수소뇌 변성증, 산발성 척수소뇌 변성증 (예를 들어, 다계통 위축증 (MSA), 피질성 소뇌 위축증 (CCA))), 댄디-워커 (Dandy-Walker) 증후군 등을 포함한다. 어린이에게서 종종 관찰되는 골수아종은 소뇌 충부에서 빈번하게 발생하며, 이러한 소뇌에서의 골수아종도 소뇌 장애로 인해 발생하는 질환에 포함된다. 또한, 이러한 소뇌의 손상 상태의 예는 소뇌절제 환자, 소뇌 내 종양에 대한 방사선 조사 후의 환자, 외상을 포함한다.
이식 치료요법에서, 조직적합성 항원의 차이로 인한 이식편 거부가 자주 문제가 되지만, 이식 수취인의 체세포로부터 수립한 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포) 를 사용하여 이러한 문제를 해결할 수 있다. 즉, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 다능성 줄기 세포로서 수취인의 체세포로부터 수립된 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포) 를 사용하고, 수취인에 대해 면역학적 자기인 (immunologically self) 세포 응집체, 소뇌 선구체 조직, 소뇌 선구체 조직 구성 세포, 또는 소뇌 구성 세포를 제조하고, 수취인에게 이식한다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 수득하는 세포 응집체, 소뇌 선구체 조직, 소뇌 선구체 조직 구성 세포, 또는 소뇌 구성 세포를 소뇌의 장애로 인해 발생하는 질환, 또는 소뇌의 손상 상태를 치료하기 위한 약물의 스크리닝 및 평가에 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에 의해 수득한 소뇌 선구체 조직이 생체에서의 소뇌 선구체 조직과 매우 유사한 고차 구조를 가지므로, 이를 소뇌의 장애로 인해 발생하는 질환, 소뇌의 손상 상태에 대한 치료 약물의 스크리닝, 의약품의 부작용 및 독성 시험, 및 소뇌의 질환에 대한 새로운 치료 방법의 개발 등에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상술한 소뇌의 장애로 인해 발생하는 질환, 특히 소뇌의 장애로 인해 발생하는 유전성 질환을 갖는 인간 환자로부터 iPS 세포를 제조하고, iPS 세포를 사용하여, 본 발명의 방법에 의해 소뇌 선구체 조직을 함유하는 세포 응집체를 제조한다. 수득한 세포 응집체에 함유된 소뇌 선구체 조직은, 환자의 질환을 초래하는 소뇌의 장애를 시험관내 재현할 수 있다. 장애를 갖는 소뇌 선구체 조직을 함유하는 세포 응집체, 또는 그로부터 단리된 장애를 갖는 소뇌 선구체 조직을, 시험 물질의 존재 또는 부재 하에 (음성 대조군) 배양한다. 그런 다음, 시험 물질로 처리한 세포 응집체 또는 소뇌 선구체 조직에 있어서의 장애 수준을 음성 대조군의 경우와 비교한다. 그 결과, 장애 수준을 감소시킨 시험 물질을, 장애로 인해 발생하는 질환에 대한 치료 약물용 후보 물질로서 선택할 수 있다. 또한, 의약으로서의 안전성이 확인되어 있는 물질을 시험 물질로서 사용하는 경우, 선택된 물질의 치료적 유효량을, 스크리닝에 사용한 세포 응집체, 또는 소뇌 선구체 조직이 유래하는 환자에게 투여함으로써, 상기 환자에서의 소뇌의 장애로 인해 발생하는 질환을 치료할 수 있다. 또한, 장애를 갖는 소뇌 선구체 조직을 함유하는 세포 응집체, 또는 그로부터 단리된 장애를 갖는 소뇌 선구체 조직을 사용하여, 장애로 인해 발생하는 질환에 대한 의약품의 부작용, 독성 시험 및 새로운 치료 방법의 개발을 수행할 수 있다.
본 발명을 하기 실시예를 참조로 하여 보다 상세히 설명하지만, 이는 단지 예시일 뿐이며 본 발명의 범주를 한정하지 않는다.
[실시예]
[실시예 1] 인간 다능성 줄기 세포로부터의 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직의 형성
(방법)
인간 ES 세포 (KhES-1) 를 통상적인 방법에 의해 MEF 상에서 유지 배양한 것을 사용하였다. 배양체형 응집체의 무혈청 부유 배양 (SFEBq 법) 에 의해 인간 ES 세포를 분화시키기 위해, Nakano et al. (Cell Stem Cell, 10(6), 771-785, 2012) 방법에 따라 인간 ES 세포를 효소적으로 단일 세포에 분산시키고, 저세포 접착성 V-바닥 96 웰 플레이트 (SUMITOMO BAKELITE) 를 사용하여 재응집시켰다. 웰 당 6,000 개 세포를 시딩하고, 분화 배지로서 CDM 배지 [성장 인자를 포함하지 않는 화학 합성 배지 (인슐린 (7 ㎍/ml) 및 아포트랜스페린 (15 ㎍/ml) 이 보충된 성장 인자 불포함 화학적 규정 배지 (growth-factor-free Chemically Defined Medium); gfCDM; Wataya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 11796-11801, 2008)] 중에서 5% CO2 하에 37℃ 에서 배양하였다.
시딩일을 분화 배양의 제 0 일로서 선택한다. 제 0 일부터 제 7 일까지 10 μM Y-27632 (ROCK 저해제; 분산 동안 세포사 억제제: Watanabe et al., Nature Neuroscience, 8, 288-296, 2007) 및 10 μM SB431542 (TGF-베타 저해제) 를 첨가하였다. 배양 제 2 일부터 제 7 일까지, 최종 농도 50 ng/ml 로 FGF2 를 배지에 첨가하였다. 제 7 일에, Y-27632, SB431542 및 Fgf2 를 포함하지 않는 분화 배지로 1/3 의 배지를 교환하였다. 배양 제 14 일에, Y-27632, SB431542 및 FGF2 를 포함하지 않는 분화 배지에 의해 배지를 완전히 대체하였다. 세포 응집체를 고정하고 슬라이싱하였고, 면역형광법 및 정량 PCR 법에 의해 조직 분화를 분석하였다.
(결과)
분화 배양 시작으로부터 제 14 일에는 세포 응집체 중 90% 이상의 세포가 N-카드헤린 양성 신경 선구체로 분화하였다. 후뇌문측 부위 마커 Gbx2 의 발현이 제 14 일에 관찰되었고, 80% 이상의 N-카드헤린 양성 세포가 제 21 일에 Gbx2 양성이었다. 이때, 중뇌로부터의 문측 부위에 대한 마커인 Otx2 의 발현은 거의 관찰되지 않았다 (도 1). 또한, 신경관 전후방 축에 따른 부위에 대해 특이적인 유전자 중에서, 중뇌-후뇌 경계 마커 En2, Gbx2 의 발현이 FGF2 의 첨가에 의해 현저히 증가하였다 (도 2). FGF2 로 인한 En2 및 Gbx2 의 발현 상승은, 배양 시작으로부터 제 14 일 및 제 21 일에도 발견되었다. FGF2 가 전뇌 마커 Six3 및 Otx2 의 발현을 억제했으나 (도 2), 이는 배아 중뇌-후뇌 경계에서의 협부 조직체 형성의 기능에 연관되는 것으로 여겨지는 Fgf8 및 Wnt1 의 발현을 증강시켰다 (제 10 일 및 제 14 일). 이러한 결과는, 본 방법에 있어서 FGF2 가 중뇌-후뇌 경계에서의 신경 선구체의 자가 조직화를 촉진시켰음을 제시한다.
상술한 방법에서, Y-27632 를 첨가하지 않는 경우
인간 ES 세포가 응집체를 형성하지 않았으므로, ROCK 저해제가 분산으로 인한 세포사 억제 뿐 아니라 다능성 줄기 세포의 세포 응집체 형성 및 성장을 지지하는 효과를 제공한다는 것이 제시되었다.
SB431542 는 10-30 μM 의 농도 범위에서 중뇌-후뇌 경계에서의 신경 선구체로의 분화를 유도하였다. 3 μM 의 농도에서도 신경 선구체로의 분화 유도가 관찰되었다.
FGF2 는 20 ng/ml 및 100 ng/ml 의 농도에서도 중뇌-후뇌 경계에서의 신경 선구체로의 분화를 촉진하였다. ES 세포의 유지 배양에 사용하는 농도 (5~10 ng/ml) 의 FGF2 는, 중뇌-후뇌 경계에서의 신경 선구체로의 분화 촉진을 나타내지 않았다. FGF2 를 제 0 일 또는 제 1 일부터 배지에 첨가해도, 중뇌-후뇌 경계에서의 신경 선구체로의 현저한 분화 촉진은 관찰되지 않았다. 제 2 일-제 14 일,제 3 일-제 7 일, 제 4 일-제 7 일의 각 기간 동안 FGF2 를 첨가하는 것은 중뇌-후뇌 경계에서의 신경 선구체로의 분화 촉진 효과를 나타내었으며, 제 2 일-제 7 일의 기간 동안 FGF2 를 첨가하는 것이 최고 효과를 나타내었다. FGF2 대신 FGF8b 를 사용한 경우, 중뇌-후뇌 경계에서의 신경 선구체로의 분화가 촉진되었으나; FGF2 보다 효과가 약했다.
제 7 일에 배지 교환을 수행하지 않은 경우, 제 14 일까지 세포 응집체의 배양을 유지할 수 있고, 중뇌-후뇌 경계에서의 신경 선구체로의 분화가 가능하였으나; 세포 응집체의 취약성이 증가하였고 세포 응집체가 손상되게 되었다.
[실시예 2] 인간 다능성 줄기 세포로부터의 연속 표피 구조를 갖는 소뇌판 조직의 자가 형성
(방법)
실시예 1 의 방법에 따라 인간 다능성 줄기 세포 응집체를 배양하였다. 제 21 일에 및 제 21 일 이후, 저세포 접착성 10 cm 디쉬에 응집체를 옮기고, 신경 배양 배지 (Neurobasal/GlutaMaxI/N2, 모두 Life Technologies사제) 중 배양하였다. 배양 제 28 일에 동일 신경 배양 배지로 배지 전체량을 교환하고, 배양 제 35 일에 조직의 분화를 면역형광법에 의해 분석하였다.
(결과)
하나의 응집체 내에 N-카드헤린 양성 신경표피 구조가 복수 형성되었고, 70% 이상의 신경표피 세포는 소뇌 GABA 작동성 신경 선구체-특이적 kirrel2 에 양성이었다 (도 3 좌측, 중앙). Kirrel2 를 발현하는 신경표피 구조의 80% 이상 또한 GABA 작동성 신경 선구체-특이적 Ptf1a 를 발현하였다 (도 3, 우측). Kirrel2 양성 신경표피 구조는 또한 En2 양성이었다. 이러한 결과는, 실시예 1 의 방법에 의해 분화 유도된 중뇌-후뇌 경계 부위 선구체가 신경표피 구조의 형성과 함께 소뇌 신경판으로 자가 조직화되는 것이 촉진되었다는 것을 명확하게 제시한다.
신경 배양 배지로의 교환 시기를 제 14 일, 제 18 일 및 제 28 일로 설정한 경우에도, 제 21 일에 교환한 경우에 수득한 것과 유사한 N-카드헤린 양성 신경표피 구조가 형성되었다. 제 21 일에 교환한 경우, 가장 조직화된 신경표피 구조가 형성되었다.
헤지호그 저해제 시클로파민 (1 μM) 을 제 7 일-제 14 일, 제 14 일-제 21 일, 또는 제 21 일-제 35 일에 첨가한 경우, Kirrel2 양성 세포로의 분화가 더 증강되지는 않았다.
[실시예 3] 인간 다능성 줄기 세포-유래 소뇌판 조직의 분산 배양에 의한 푸르키네 세포 및 소뇌 개재뉴런의 분화
(방법)
실시예 1 및 2 의 방법에 따라 인간 다능성 줄기 세포 응집체를 배양하고, 배양 제 35 일에 소뇌 GABA 작동성 신경 선구체 마커 Kirrel2 에 대한 항체를 사용하여, FACS 에 의해 Kirrel2 양성 세포를 분리하였다. 분리된 Kirrel2 양성 세포와 배아 14 일령 마우스 상능뇌순으로부터 제조한 소뇌 과립 세포 선구체를, 세포 분산 효소 (TrypLE, Life Technologies) 에 의해 단일 세포에 분산시키고, DMEM/F12/10% FBS 배지 중 폴리 D-리신/라미닌으로 코팅한 커버 글래스 위에서 공배양하였다 (5% CO2, 37℃). 공배양에서, 마우스-유래 소뇌 과립 세포 선구체 (10 vol) 에 대해, 인간 다능성 줄기 세포-유래 Kirrel 양성 세포 (1 vol) 를 혼합하였다. 6~12 시간 후, DMEM/F12/N2/BSA/트리요오도티로닌 (T3) 을 첨가하여 FBS 농도를 약 0.8% 로 감소시켰다. 이후, 주 1 회의 빈도로 배지의 절반을 DMEM/F12/N2/BSA/트리요오도티로닌 (T3)/시토신 β-D-아라비노푸라노시드 (Ara-C) 로 교환하여 배양을 유지하였다 (Muguruma et al., Nature Neurosci., 13, 1171-1180, 2010). 공배양 시작부터 제 15 일 내지 제 115 일에, 세포 성숙을 면역형광법에 의해 분석하였다.
(결과)
실시예 1 및 2 의 방법에 따라 인간 다능성 줄기 세포 응집체를 배양하고, 제 35 일에 항-kirrel2 항체를 사용하여 FACS 에 의해 세포를 분리하였다. Fgf2 에 노출된 세포의 거의 30% 가 kirrel2 양성인 것이 관찰되었다 (도 4, 우측).
분리된 세포를 마우스 상능뇌순-유래 세포와 함께 공배양하였다. 제 15 일 (분화 유도 후, 연일수 제 50 일) 에, 푸르키네 세포 특이적 마커 L7/pcp2 및 칼빈딘의 발현이 관찰되었고, 이러한 마커 양성 세포에서 축색의 신장과 미성숙 수상돌기의 형성이 관찰되었다 (도 5a). 공배양 제 58 일 (연일수 제 93 일) 에, L7 양성 세포의 수상돌기의 분지화 및 신장이 관찰되었다 (도 5b). 이러한 L7 양성 세포의 출현은, 인간 ES 세포의 경우 뿐만 아니라 유사하게 배양한 인간 iPS 세포 (4 개 주) 의 경우에서도 발견되었다. 또한, 공배양 제 110 일 (연일수 제 145 일) 에, 푸르키네 세포 수상돌기 가시 특이적 GluR델타2 의 발현과 형태학 적으로 명료한 수상돌기 가시의 형성을 관찰할 수 있었다 (도 5c, d). 수상돌기 가시에서 발현된 GluR델타2 가 그의 리간드, CBLN1 에 결합한 것을 또한 확인할 수 있었다 (도 5e). 이러한 공배양계에서, 분리한 kirrel2 양성 세포는 대부분 푸르키네 세포로 분화되었으나, 이들 중 일부가 장기간 공배양 (58~113 일) 후에 유사하게 kirrel2 양성 GABA 작동성 개재뉴런 골지 세포 (도 5f, 뉴로그라닌 양성 세포), 파르브알부민 양성 개재뉴런으로 분화되었다.
[실시예 4] 인간 다능성 줄기 세포-유래 소뇌판 조직에서의 신경표피 및 능뇌순 조직의 형성
(방법)
실시예 1 및 2 의 방법에 따라 인간 다능성 줄기 세포 응집체를 배양하고, 배양 제 35 일에 조직 분화를 면역형광법에 의해 분석하였다.
(결과)
배양 제 35 일에, kirrel2 양성 신경상피 조직에서 소뇌 과립 세포 선구체 특이적 Atoh1 양성 세포가 관찰되었다 (도 6a, c). Atoh1 양성 세포는 또한 Barhl1, Sox2 및 Zic1 과 같은 기타 소뇌 과립 세포 마커도 발현하였다 (도 6b, d, e). 소뇌 신경세포는 kirrel2 양성 뇌실대 및 Atoh1 양성 능뇌순으로부터 생성된다. 그 결과는, 실시예 1 및 2 의 방법에 따라, 인간 다능성 줄기 세포의 kirrel2 양성 뇌실대 및 Atoh1 양성 능뇌순으로의 분화가 유도되었으며, 소뇌판 조직이 형성되었다는 것을 나타내고 있다.
FGF2 처리한 마우스 ES 세포-유래 신경표피 구조로부터의 Atoh1 양성 세포의 유도에 BMP4 의 첨가가 필요했으나 (Muguruma et al., Nature Neurosci., 13, 1171-1180, 2010), 인간 다능성 줄기 세포로부터는 BMP4 를 첨가하지 않아도 Atoh1 양성 세포가 유도되었다.
[실시예 5] 인간 다능성 줄기 세포 유래의 소뇌판 조직으로부터의 소뇌 과립 세포 및 소뇌 핵 세포의 분화
(방법)
실시예 1 및 2 의 방법에 따라 인간 다능성 줄기 세포 응집체를 배양하고, 제 21 일에 및 제 21 일 이후 신경 배양 배지 (Neurobasal/GlutaMaxI/N2) 중에서 배양하였다. 배양 제 28 일에 및 제 28 일 이후 주 1 회의 빈도로 배지 전체량을 교환함으로써 응집체를 연속하여 배양하고, 배양 제 35 일 및 제 53 일에 면역형광법에 의해 분석하였다.
또한, 인간 다능성 줄기 세포-유래 Atoh1 양성 세포의 소뇌 과립 세포로의 분화를 재응집 배양계에 의해 분석하였다. 즉, 인간 다능성 줄기 세포를 상술한 방법에 따라 배양하고, 제 42 일~제 49 일에 세포 분산 시약 (TrypLE, Life Technologies) 을 사용하여 단일 세포로 분산시켰다. pCAG-GFP 를 세포 내에 전기천공하여 세포를 표지하였다. 한편, 2 일령 ICR 계 마우스로부터 단리한 소뇌를 단일 세포에 분산시키고, 이의 20 vol 을 GFP 로 표지한 인간 다능성 줄기 세포-유래 신경 선구체 1 vol 과 혼합하였다. 세포 혼합물을 원심분리하여 세포 응집체를 형성시켜, 이를 폴리 D-리신/라미닌으로 코팅한 커버 글래스 위에서 DMEM/F12/N2/10% FBS 중 배양하였다 (5% CO2, 37℃) (Muguruma et al., Nature Neurosci., 13, 1171-1180, 2010). 재응집 배양 후, 세포를 제 5 일 및 제 8 일에 면역형광법에 의해 분석하였다.
(결과)
배양 제 35 일에 신경 상피 조직에서의 Barhl1 및 Atoh1 공발현 세포의 측면에 Barhl1 단일 세포가 존재하였으며, Lhx2 양성 세포는 그의 외부측에 보다 국부화되어 있었다 (도 7a, b). 이는 Atoh1 양성 능뇌순-유래 소뇌 신경 선구체가 인간 다능성 줄기 세포-유래 소뇌판 조직 내에서 이동하고, 과립 세포 선구체 (Barhl1) 및 소뇌 핵 선구체 (Lhx2) 로의 분화가 진행되고 있다는 것을 나타낸다. 추가로, 배양 제 53 일에는 능뇌순-유래 소뇌 핵 세포 선구체 마커인 Tbr1 및 SMI32 를 동시발현하는 대형 세포가 응집체 내에 국부화되었다 (도 7c).
재응집 배양 후 제 5 일에, GFP-표지된 인간 다능성 줄기 세포-유래 세포는 긴 신경돌기를 세포 응집체의 외부로 신장시켰다 (도 8a). GFP 양성 세포는 신경세포 특이적 마커 MAP2 양성이며, 그의 세포체가 소뇌 과립 세포 선구체 특이적 마커 Barhl1, Pax6 을 발현하고 신경돌기를 따라 이동한다는 것이 발견되었다 (도 8b, c). 제 8 일에, 세포체의 이동 방향이 접선 방향으로부터 수직 방향으로 변화하였다 (도 8d). 이동 방향이 변경된 세포도 MAP2 및 Pax6 을 발현하였다는 것이 확인되었다. 이러한 결과는, 재응집 배양계에 있어서 소뇌 과립 세포가 능뇌순으로부터 소뇌판 표층에 접선 방향으로 이동하고, 발생에 따라 접선 방향으로부터 소뇌판 심부를 향해 수직 방향으로 이동 방향을 변경하는 것을 재현 하고 있으므로, 인간 다능성 줄기 세포의 소뇌 과립 세포로의 분화가 유도될 수 있었다는 것을 나타내고 있다.
[실시예 6] FGF19 의 첨가에 의한 배복축 패턴을 갖는 소뇌판 조직 및 그의 주변 조직의 형성 촉진
(방법)
실시예 1 및 2 의 방법에 따라 인간 다능성 줄기 세포 응집체를 배양하였다. 배양 제 14 일에 FGF19 를 최종 농도 100 ng/ml 로 첨가하였다. 제 21 일에 및 제 21 일 이후, 세포를 신경 배양 배지 (Neurobasal/GlutaMaxI/N2) 중에서 배양하였다. 제 28 일에, 동일 배지로 배지 전체량을 교환하고, 제 35 일에 조직 분화를 면역형광법에 의해 분석하였다.
(결과)
FGF19 를 첨가하지 않는 경우, 제 35 일에 2 가지 상이한 유형의 Kirrel2 양성 신경표피 구조가 세포 응집체에서 관찰되었다. 대다수의 세포 응집체는 작은 로제트형 신경표피 구조를 가졌다 (도 9A). 나머지 세포 응집체 (~30%) 는 약간 큰 편평-난형의 신경표피 구조를 함유하였다 (도 9B). 후자 유형의 신경표피는 연속적이며 보다 두꺼웠다. 흥미롭게도, 소뇌판 신경표피 마커로서 Kirrel2 는 편평-난형의 신경표피 구조의 각 세포 응집체를 기준으로 하여 외부측에 발현되었다 (도 9B). 반대로, 세포 응집체 중의 작은 로제트는 명확한 극성을 갖는 Kirrel2 의 국부화를 나타내지 않았다 (도 9A).
FGF19 의 첨가는 세포 응집체에서의 연속적인 편평-난형 신경표피 구조 형성을 촉진하였다 (도 9C). FGF19 의 첨가는 인간 다능성 줄기 세포-유래 신경표피 구조에서 신경관의 배복축을 따라 극성을 갖는 구조 형성을 초래하였다. 즉, 소뇌 신경 선구체 마커이며 신경관의 배측에 발현되는 Kirrel2-, Ptf1a-, SKOR2- 양성 세포는 세포 응집체를 기준으로 하여 외부측에 국부화되고, 각 신경표피 구조 부위의 1/3~1/2 를 차지하였다. Atoh1 도 외부측에 발현되었다. 이와 반대로, 반대 부위 (세포 응집체를 기준으로 하여 내부측) 에는 복측 마커인 Nkx6.1, Foxa2 가 발현되었다 (도 10). 이러한 결과는, FGF19 가 인간 다능성 줄기 세포의 3 차 배양에서, 배측을 표면으로 하는 (dorsal side superficial) 명확한 배복 극성을 갖는 문측 후뇌 신경관형 구조의 자가 형성을 촉진한다는 것을 나타낸다 (도 11).
FGF19 가 50 ng/ml 의 농도에서도 신경표피 구조에서 신경관의 배복축을 따라 극성을 갖는 구조 형성을 촉진하였으나, 그의 효과 (빈도) 는 100 ng/ml 의 경우의 약 1/3 이었다. 300 ng/ml 의 FGF19 는 배복축 패턴 형성을 유사하게 촉진하였다. 그의 효과 (빈도) 는 100 ng/ml 의 경우와 동일한 수준의 것이었다. FGF19 를 배양 제 10 일에 첨가한 경우에도, 효율은 낮아지지만 배복축 패턴 형성이 촉진되었다. FGF19 대신 FGF8 또는 FGF17 을 사용한 경우, FGF19 와 같은 배복축 패턴 형성이 촉진되었으나, 그 효과는 FGF19 보다 약했다.
[실시예 7] GDF7의 첨가에 의한 소뇌판 조직에서의 능뇌순 형성의 촉진
(방법)
실시예 6 의 방법에 따라 인간 다능성 줄기 세포 응집체를 배양하였다. 제 21 일에 GDF7 을 최종 농도 100 ng/ml 로 첨가하였다. 신경 배양 배지 (Neurobasal/GlutaMaxI/N2) 중에서 세포를 연속하여 배양하였다. 제 28 일에, GDF7 을 포함하지 않는 동일 배지로 배지 전체량을 교환하고, 제 35 일에 면역형광법 및 정량 PCR 법에 의해 세포를 분석하였다.
(결과)
GDF7 의 첨가는 인간 다능성 줄기 세포-유래 신경 선구체 조직에서의 Atoh1 양성 세포 발현을 촉진하였다 (도 12 좌측, 중앙). 유전자 수준에 있어서, 이는 FGF2 를 첨가한 것에 대해 약 220 배, FGF2 를 첨가한 것에 대해 1.5 배로 증가하였다 (도 12, 우측). 이들 결과는, 배양 제 21 일에서의 GDF7 첨가가 능뇌순의 형성을 촉진하였다는 것을 나타내는 것이다.
GDF7 을 배양 제 14 일부터 첨가한 경우에도, Atoh1 양성 세포가 유도되었으나; 세포 응집체의 성장이 저해되었고, 세포 응집체의 크기가 작아졌으며, 신경표피 구조가 붕괴되는 경향이 있었다. 제 28 일에 및 제 28 일 이후에, GDF7 을 배지로부터 제거하지 않아도 능뇌순의 형성에 대한 악영향은 발견되지 않았다.
마우스에서, BMP4 가 능뇌순의 형성을 촉진하는 것이 알려져 있다. 그러나, 상술한 시험계에서 GDF7 대신 BMP4 를 사용해도 인간 다능성 줄기 세포로부터의 능뇌순의 형성은 유도할 수 없었다. 이는, 시험관내에서 다능성 줄기 세포로부터 능뇌순을 유도하기 위해 필요한 인자가 마우스와 인간 사이에 상이하고, GDF7 이 인간에서 능뇌순의 형성에 중요하며 GDF7 이 BMP4 에 의해 대체될 수 없는 것을 제시한다.
[실시예 8] SDF1 의 첨가에 의한 소뇌판 조직에서의 능뇌순 형성과 소뇌판의 3 층 구조 형성의 촉진
(방법)
실시예 6 의 방법에 따라 인간 다능성 줄기 세포 응집체를 배양하였다. 제 21 일에 및 제 21 일 이후에, 신경 배양 배지 (Neurobasal/GlutaMaxI/N2) 중에서 세포를 배양하였다. 제 28 일에 동일 배지로 배지 전체량을 교환하고, SDF1 을 최종 농도 300 ng/ml 로 첨가하였다. 제 35 일에, 조직의 분화를 면역형광법에 의해 분석하였다.
(결과)
SDF1 비첨가 조건 하에, 큰 편평-난형 신경표피의 자가 형성의 시간 경과적 변화 (시간적 측면) 를 검사하였다. 제 21 일에, 세포 응집체 중 형성된 신경 조직은 표피 형성 또는 정단-기저 극성을 거의 나타내지 않았다 (도 13A). 제 24 일~제 28 일까지, 정단-기저 극성을 갖는 신경표피 구조가 형성되었으나; 대부분은 작은 로제트였다 (도 13B, C). 제 35 일까지, 신경표피 로제트는 정단측이 내부측에 위치한 (apical side in) 크고 편평-난형인 구조로 변환되었다 (도 13D).
SDF1 의 첨가는 연속적인 kirrel2 양성 신경표피 구조 형성을 촉진하였다 (도 14a-c). SDF1 비처리 신경표피와 상이하게, SDF1 처리된 소뇌 신경표피 (Kirrel2+) 는 세포 응집체의 표면 부위 상에, 정단측이 외부측에 위치하도록 (apical side out) 연속적으로 형성되었다 (도 14a 및 b; 이러한 발상과 일치하여, Sox2+ 뇌실대 세포는 신경표피의 표층 측에 위치하였고, Shor2+ 푸르키네 선구체는 심부에 위치하였음; 도 14c). kirrel2 양성 신경표피의 가장자리에서, Sox2 양성 신경 선구체를 함유하는 굽혀진 조직이 형성되고, Atoh1, barhl1 양성의 세포가 국부화되었다 (도 14d-f). 이러한 결과는, SDF1 의 첨가가 인간 다능성 줄기 세포로부터의 kirrel2 양성 신경표피 구조 형성을 촉진하고, 능뇌순을 연속적으로 배치시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 연속적인 신경표피에서, 정단면으로부터 뇌실대 (Kirrel2, Sox2, Ptf1a 양성), 푸르키네 세포층 (Lhx5, Oligo2 양성) 및 능뇌순-유래 신경세포층 (Atoh1, Barh1 양성) 을 포함하는 3 개 층 구조가 연속적으로 자가 형성되고 있다는 것이 추가로 밝혀졌다 (도 14 g-l).
100 ng/ml 및 500 ng/ml 의 농도에서의 SDF1 도 또한, 소뇌판 조직에서의 능뇌순 형성과 소뇌판의 3 개 층 구조 형성을 촉진하였다. 제 21 일부터 SDF1 을 첨가한 경우에도, 제 28 일부터 첨가한 경우와 유사한 효과가 관찰되었다. 마트리겔 또는 라미닌은 SDF1 을 대체할 수 없었다.
상기로부터, FGF2 및 FGF19 로 처리한 인간 다능성 줄기 세포-유래 응집체가 배복 극성을 갖는 연속적인 신경표피를 자가 형성할 수 있고, 추가적인 SDF1 처리가 초기 소뇌 발생에서 관찰된 것들과 같은 Atoh+/Barhl1+능뇌순형 구조 및 적층화된 소뇌 신경표피 구조의 자발적 형성을 촉진한다는 것이 제시되었다 (도 15).
[실시예 9] 인간 다능성 줄기 세포로부터 유도된 푸르키네 세포의 기능 분석
(방법)
실시예 3 의 방법에 따라 인간 다능성 줄기 세포 응집체로부터 성숙 푸르키네 세포를 분화시켰다. 패치 클램프법을 사용하여, 그의 전기생리학적 반응을 분석하였다.
(결과)
푸르키네 세포의 4 가지 특징적인 전기생리학적 반응을 관찰할 수 있었다 (도 16). 첫 번째 것은 자발적인 활동 전위의 반복 발화이다. 두 번째 것은 과분극화-활성화된 양이온 채널 전류 (Ih 전류) 이다. 세 번째 것은 AMPA 수용체 저해제 (NBQX) 에 의한 미소 흥분성 시냅스-후 전류의 억제이다. 네 번째 것은 미소 흥분성 시냅스-후 전류가 NMDA 수용체 저해제에 의해 억제되지 않는 것이다. 이들 특징은, 푸르키네 세포에 특징적인 "글루타메이트 수용이 NMDA 수용체에 의해 매개되는 것이 아니라 AMPA 수용체에 의존적이다" 라는 것을 제시한다.
본 발명에 따르면, 인간 다능성 줄기 세포로부터 소뇌 선구체 조직을 시험관내로 효율적으로 유도할 수 있다. 본 발명은 소뇌의 장애로 인해 발생하는 질환에 대한 치료 약물의 개발, 부작용 및 독성에 대한 시험, 및 질환의 새로운 치료 방법의 개발 등에 유용하다.
본 발명을 바람직한 구현예에서 강조하여 설명하지만, 바람직한 구현예가 변경될 수 있다는 것이 당업자에게 있어 자명하다. 본 발명은, 본 명세서에 상세하게 기재된 것들 외의 방법에 의해 본 발명이 실시될 수 있다는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 첨부된 "특허청구범위" 의 취지 및 범주에 포함되는 모든 변경을 포함한다.
여기서 언급된 특허, 특허 출원 명세서 및 과학 문헌을 포함하는 임의 간행물에 개시된 내용은, 이들이 여기에 개시되어 있는 정도로, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 출원은, 일본에서 출원한 특허 출원 제 2014-182758 호 (출원일: 2014 년 9 월 8 일) 을 기초로 하며, 이의 내용은 본 명세서에 모두 포함된다.

Claims (17)

  1. 인간 다능성 줄기 세포의 응집체를 인슐린을 함유하는 무혈청 배지 중에서 부유 배양하고, 상기 부유 배양에 있어서, 인간 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를, Y-27632 ((+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드), 파수딜 (Fasudil) (5-(1-호모피페라지닐) 술포닐이소퀴놀린), 및 H-1152 ((S)-(+)-2-메틸-1- [(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)술포닐]-헥사히드로-1H-1,4-디아제핀)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ROCK 저해제; SB431542 (4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드), LY-364947, SB-505 및 A-83-01 로 이루어진 군으로부터 선택되는 TGFβ 신호 저해제; 및 FGF2 및 FGF8 로 이루어진 군으로부터 선택되는 제 1 섬유아세포 증식 인자를 포함하는 배지 안에서 배양하는 것을 포함하는, 소뇌 선구체 조직을 포함하는 인간 세포 응집체의 제조 방법으로서,
    상기 ROCK 저해제 및 TGFβ 신호 저해제는 부유 배양 시작부터 배지에 첨가되고, 상기 제 1 섬유아세포 증식 인자는 부유 배양 시작 후 제 2 일~제 4 일째 중 하나의 시점에서 배지에 첨가되는, 소뇌 선구체 조직을 포함하는 인간 세포 응집체의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 소뇌 선구체 조직이 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직인 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 부유 배양 전체 기간에서 인간 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 BMP4 로 처리하지 않는 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 부유 배양 전체 기간에서 인간 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 소닉 헤지호그 저해제로 처리하지 않는 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 제조 방법으로서:
    (I) 인간 다능성 줄기 세포의 응집체를 인슐린을 함유하는 무혈청 배지 중에서 부유 배양하고, 상기 부유 배양에 있어서, 인간 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를, Y-27632 ((+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드), 파수딜 (Fasudil) (5-(1-호모피페라지닐) 술포닐이소퀴놀린), 및 H-1152 ((S)-(+)-2-메틸-1- [(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)술포닐]-헥사히드로-1H-1,4-디아제핀)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ROCK 저해제; SB431542 (4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드), LY-364947, SB-505 및 A-83-01 로 이루어진 군으로부터 선택되는 TGFβ 신호 저해제; 및 FGF2 및 FGF8 로 이루어진 군으로부터 선택되는 제 1 섬유아세포 증식 인자를 포함하는 배지 안에서 배양하여 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직을 함유하는 인간 세포 응집체를 수득하는 단계, 및
    (II) 수득한 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체 조직을 함유하는 인간 세포 응집체를 무혈청 배지 중에서 추가 부유 배양하여 신경 선구체 조직 내의 신경 선구체로부터 신경표피 구조의 형성을 유도하고, 이로써 소뇌판 조직을 함유하는 인간 세포 응집체를 수득하는 단계,
    상기 ROCK 저해제 및 TGFβ 신호 저해제는 부유 배양 시작부터 배지에 첨가되고, 상기 제 1 섬유아세포 증식 인자는 부유 배양 시작 후 제 2 일~제 4 일째 중 하나의 시점에서 배지에 첨가되는, 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 단계 (I) 의 부유 배양에서 인간 다능성 줄기 세포의 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를, FGF19, FGF17 및 FGF8 로 이루어진 군으로부터 선택되는 제 2 섬유아세포 증식 인자를 포함하는 배지 안에서 배양하는 것을 포함하는 제조 방법으로서,
    상기 제 2 섬유아세포 증식 인자는 부유 배양 시작 후 제 10 일~제 14 일째 중 하나의 시점에서 배지에 첨가되는, 제조 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 단계 (II) 의 부유 배양에서 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체를 함유하는 인간 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 SDF1 로 처리하는 것을 포함하는 제조 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 단계 (II) 의 부유 배양에서 중뇌-후뇌 경계 신경 선구체를 함유하는 인간 세포 응집체 또는 그로부터 유래하는 인간 세포 응집체를 GDF7 로 처리하는 것을 포함하는 제조 방법.
  9. 제 6 항에 있어서, 소뇌판 조직이 GABA 작동성 신경 선구체 및 소뇌 과립 세포 선구체를 포함하는 신경표피 구조인 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 신경표피 구조가 배복 (dorsal-ventral) 극성을 갖는 제조 방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 소뇌판 조직이 세포 응집체의 표층 부위에 연속적인 소뇌 신경표피 구조 및 능뇌순형 조직을 포함하는 제조 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 소뇌판 조직이 선단 표면으로부터의 순서로 계층화된, 뇌실대, 푸르키네 (Purkinje) 세포대 및 능뇌순-유래 세포대를 포함하는 3-층 구조를 갖는 제조 방법.
  13. 하기 단계를 포함하는, 인간 푸르키네 세포, 인간 골지 세포 또는 인간 개재뉴런의 제조 방법:
    (I) 제 5 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 인간 다능성 줄기 세포로부터 소뇌판 조직을 함유하는 인간 세포 응집체를 수득하는 단계,
    (II) 수득한 인간 세포 응집체로부터 GABA 작동성 신경 선구체를 수득하는 단계, 및
    (III) GABA 작동성 신경 선구체를 포유 동물 소뇌 과립 세포 선구체와 함께 공배양하여 GABA 작동성 신경 선구체의 푸르키네 세포, 골지 세포 또는 개재뉴런으로의 분화를 유도하는 단계.
  14. 하기 단계를 포함하는, 인간 소뇌 과립 세포의 제조 방법.
    (I) 제 5 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 인간 다능성 줄기 세포로부터 소뇌판 조직을 함유하는 인간 세포 응집체를 수득하는 단계,
    (II) 수득한 인간 세포 응집체로부터 소뇌 과립 세포 선구체를 수득하는 단계, 및
    (III) 소뇌 과립 세포 선구체를 포유 동물 소뇌 세포와 함께 공배양하여 소뇌 과립 세포로의 분화를 유도하는 단계.
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