KR20240021432A - 소뇌 오가노이드의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (A) 내재성 WNT 분비 억제제 및 WNT 신호전달 작용제를 포함하는 후뇌 조직 유도 배지의 존재 하에서, 전분화능 줄기세포로부터 형성된 배아체를 배양하는, 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계;
(B) SHh(sonic hedgehog) 신호전달계 억제제를 포함하는 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 존재 하에서, 상기 배아체를 배양하는, 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계; 및
(C) 세포외기질 기반의 하이드로젤을 포함하는 기저면-첨면 유도 배지의 존재 하에서, 상기 배아체의 분극을 유도하는, 기저면-첨면 분극화 단계;를 포함하는, 소뇌 오가노이드의 제조방법에 관한 것이다.
(B) SHh(sonic hedgehog) 신호전달계 억제제를 포함하는 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 존재 하에서, 상기 배아체를 배양하는, 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계; 및
(C) 세포외기질 기반의 하이드로젤을 포함하는 기저면-첨면 유도 배지의 존재 하에서, 상기 배아체의 분극을 유도하는, 기저면-첨면 분극화 단계;를 포함하는, 소뇌 오가노이드의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 소뇌 오가노이드의 제조방법에 관한 것이다.
오가노이드(organoid)는 '장기유사체' 또는 '유사장기'라고도 불리우며, 줄기세포나 장기 기원 세포로부터 분리한 세포를 3차원 배양법으로 다시 응집, 재조합하여 제조된 장기 특이적 세포 집합체이다. 오가노이드는 모델로 하는 장기의 특이적 세포를 포함하고, 장기가 지닌 특정 기능을 재현하며, 실제 장기와 유사한 형태로 공간적 조직화가 가능하다.
특히, 인체의 모든 세포로 분화할 수 있는 전능성 줄기세포(pluripotent stem cells)을 이용하여 대부분의 인체 장기를 모사하는 오가노이드를 제작할 수 있으며 그 중 뇌 오가노이드는 다양한 난치성 중추신경계 질환을 모사하여 발병기전을 규명하고 치료법 개발을 하기 위한 체외배양 모델로 많은 각광을 받고 있다.
예를 들어, Lancaster 등은 인간 유도만능줄기세포로 뇌 오가노이드를 만든 바 있다(비특허문헌 1). 그러나 이렇게 만들어진 뇌 오가노이드는 하나의 오가노이드에서 대뇌, 중뇌 및 망막 등의 여러 기관들이 섞이게 되고, 크기도 제각각인 문제점이 있다.
대부분의 난치성 뇌질환은 특정 뇌 부위에 특이적으로 발생하는 질환으로서, 대상 질환의 발병부위가 아닌 다른 뇌 부위의 특성을 가지고 있거나 여러 부위의 특성이 혼재된 오가노이드는 정확한 뇌질환 모사가 불가능하다. 그러므로, 난치성 뇌질환 모델링을 통한 발병기전 연구, 치료법 개발 연구 등에 뇌 오가노이드를 활용하기 위해서는 특정 뇌 부위를 고순도로 모사할 수 있는 부위특이적 뇌 오가노이드 제작기술의 개발이 반드시 필요한 실정이다.
Madeline A. Lancaster, Juergen A. Knoblich, Generation of Cerebral Organoids from Human Plurpotent Stem Cells, Nat Protoc. 2014 October; 9(10): 2329-2340.
본 발명은 전분화능 줄기세포로부터 유래된 배아체로부터 소뇌 오가노이드를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시상태는, (A) 내재성 WNT 분비 억제제 및 WNT 신호전달 작용제를 포함하는 후뇌 조직 유도 배지의 존재 하에서, 전분화능 줄기세포로부터 형성된 배아체를 배양하는, 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계;
(B) SHh(sonic hedgehog) 신호전달계 억제제를 포함하는 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 존재 하에서, 상기 배아체를 배양하는, 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계; 및
(C) 세포외기질 기반의 하이드로젤을 포함하는 기저면-첨면 유도 배지의 존재 하에서, 상기 배아체의 분극을 유도하는, 기저면-첨면 분극화 단계;를 포함하는, 소뇌 오가노이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따른 소뇌 오가노이드의 제조방법을 이용하는 경우, 소뇌 부위를 고순도로 모사하는 소뇌 오가노이드를 제조할 수 있으며, 이를 이용하여 소뇌 관련 질환의 발병기전 연구 및 치료법 개발 연구 등의 발전에 기여할 수 있다.
도 1은 실시예의 후뇌 조직 유도 배지의 WNT 신호전달 작용제 농도에 따른 전뇌 부위 특이적 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예의 후뇌 조직 유도 배지의 WNT 신호전달 작용제 농도에 따른 후뇌 부위 특이적 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예의 후뇌 조직 유도 배지의 WNT 신호전달 작용제 농도에 따른 척수 부위 특이적 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예의 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 SHh 신호전달계 억제제 농도에 따른 등쪽 후뇌 부위 특이적 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예의 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 SHh 신호전달계 억제제 농도에 따른, 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화를 거친 7일차의 배아체 발달 상태를 관찰한 것이다.
도 6은 실시예에 따른 소뇌 오가노이드의 제조 과정을 배아체 형성(Day 0)으로부터 시계열적으로 도시한 것이다.
도 7은 실시예에 따른 소뇌 오가노이드의 제조 과정에서의 배아체의 발달 과정을 위상차 현미경을 통하여 관찰한 것이다.
도 8은 실시예에 따른 소뇌 오가노이드 제조방법에 따른 배아체 형성된 날로부터 35일째 되는 날(Day 35)의 소뇌 오가노이드를 면역형광염색법으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예의 후뇌 조직 유도 배지의 WNT 신호전달 작용제 농도에 따른 후뇌 부위 특이적 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예의 후뇌 조직 유도 배지의 WNT 신호전달 작용제 농도에 따른 척수 부위 특이적 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예의 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 SHh 신호전달계 억제제 농도에 따른 등쪽 후뇌 부위 특이적 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예의 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 SHh 신호전달계 억제제 농도에 따른, 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화를 거친 7일차의 배아체 발달 상태를 관찰한 것이다.
도 6은 실시예에 따른 소뇌 오가노이드의 제조 과정을 배아체 형성(Day 0)으로부터 시계열적으로 도시한 것이다.
도 7은 실시예에 따른 소뇌 오가노이드의 제조 과정에서의 배아체의 발달 과정을 위상차 현미경을 통하여 관찰한 것이다.
도 8은 실시예에 따른 소뇌 오가노이드 제조방법에 따른 배아체 형성된 날로부터 35일째 되는 날(Day 35)의 소뇌 오가노이드를 면역형광염색법으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 발명에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 일 실시상태는, (A) 내재성 WNT 분비 억제제 및 WNT 신호전달 작용제를 포함하는 후뇌 조직 유도 배지의 존재 하에서, 전분화능 줄기세포로부터 형성된 배아체를 배양하는, 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계;
(B) SHh(sonic hedgehog) 신호전달계 억제제를 포함하는 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 존재 하에서, 상기 배아체를 배양하는, 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계; 및
(C) 세포외기질 기반의 하이드로젤을 포함하는 기저면-첨면 유도 배지의 존재 하에서, 상기 배아체의 분극을 유도하는, 기저면-첨면 분극화 단계;를 포함하는, 소뇌 오가노이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A)를 통하여, 전분화능 줄기세포로부터 형성된 배아체는 고순도로 후뇌 특성을 모사하는 세포 집합체로 분화될 수 있다. 구체적으로, 상기 후뇌 특성이 모사된 세포 집합체는 고순도로 후뇌 특성을 모사하는 오가노이드일 수 있다. 상기 고순도로 후뇌 특성을 모사하는 세포 집합체 또는 오가노이드는 대뇌, 선조체, 중뇌 등의 다른 뇌 부위의 특성을 나타내는 조직의 혼재가 최소화된 상태를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A)는 상기 배아체의 신경외배엽(neuroectoderm)으로의 분화를 유도함과 동시에, 상기 배아체 전반에서 균일하게 후뇌 조직으로의 패턴화를 유도하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 내재성 WNT 분비 억제제는 상기 배아체 내에서 자연적으로 발현하는 WNT 신호전달 물질의 분비를 억제하는 물질일 수 있다. 상기 내재성 WNT 분비 억제제는 상기 배아체 내에서 자발적으로 발현하는 WNT 단백질로 인한 WNT 신호전달계의 활성화를 억제함으로써, 통제 불가능한 WNT 신호전달계의 불균질한 발현을 제어할 수 있다. 그러므로, 상기 내재성 WNT 분비 억제제 및 후술하는 WNT 신호전달 작용제를 조합하여 적용함에 따라, 상기 배아체는 후뇌로 선택적으로 균질하게 분화될 수 있다. 상기 내재성 WNT 분비 억제제는 PORCN(Porcupine O-Acyltransferase) 억제제로서의 기전을 수행할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 내재성 WNT 분비 억제제는 IWP-2, LGK-974, ETC-159, GNF6231, WNT-C59 및 WNT974로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 내재성 WNT 분비 억제제는 IWP-2를 포함할 수 있다. 보다 자세하게는, 상기 내재성 WNT 분비 억제제는 자연적으로 발현하는 WNT 신호전달 물질의 분비를 억제하여 WNT 신호전달계의 활성도를 효과적으로 중화시킬 수 있으며, 동시에 WNT 신호전달 작용제를 처리하더라도 이의 활성에 영향을 미치지 않을 수 있다. 즉, 상기 내재성 WNT 분비 억제제는 배아체에서 자발적으로 발현하는 내재성 WNT 단백질이 소포체에서 세포 밖으로 분비되는 형태로 변형되는 과정을 억제하여, 불균질하게 WNT 신호전달계가 형성되는 것을 효과적으로 제어할 수 있다. 이에 반하여, IWR-1-endo와 같은 물질의 경우, WNT 신호 전달계의 하위 단계의 cascade에서의 신호전달을 억제하는 역할을 수행하여, 후술하는 WNT 신호전달 작용제의 효과를 반감시키는 문제가 발생할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직 유도 배지는 0.1 μM 이상 2 μM 이하의 농도 범위의 IWP-2가 나타내는 효과와 동등한 효과를 나타내는 농도 범위의 내재성 WNT 분비 억제제를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 후뇌 조직 유도 배지는 0.5 μM 이상 2 μM 이하, 0.5 μM 이상 1.5 μM 이하, 또는 0.8 μM 이상 1.2 μM 이하의 농도 범위의 IWP-2가 나타내는 효과와 동등한 효과를 나타내는 농도 범위의 내재성 WNT 분비 억제제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직 유도 배지는 상기 내재성 WNT 분비 억제제의 농도 범위의 IWP-2를 포함할 수 있다. 상기 내재성 WNT 분비 억제제의 농도가 상기 범위 내인 경우, 상기 배아체 내에서 자발적으로 발현하는 WNT 신호전달계의 형성을 효과적으로 억제할 수 있다. 구체적으로, 상기 내재성 WNT 분비 억제제의 농도가 상기 범위 미만인 경우 통제 불가능한 WNT 신호전달계의 불균질한 발현 제어의 효과가 미미하여 불균질한 WNT 신호전달계의 형성을 초래할 수 있다. 또한, 상기 내재성 WNT 분비 억제제의 농도가 상기 범위 초과인 경우 과도한 WNT 신호전달계 억제에 의한 세포 분열 저하 및/또는 세포 생존율 저하를 초래할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 WNT 신호전달 작용제는 상기 배아체 전체를 균일하게 후뇌 부위 특이성을 부여할 수 있다. 즉, 전술한 바와 같이, 상기 내재성 WNT 분비 억제제를 통하여 배아체에서의 통제 불가능한 WNT 신호 전달 물질의 발생을 억제하는 반면, 상기 WNT 신호전달 작용제를 통하여 배아체 전체에 균일하게 WNT 신호 강도를 조절하여 배아체 전반에 걸쳐 균일한 후뇌 특이성 갖도록 할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 WNT 신호전달 작용제는 단백질계 WNT 신호전달 작용제 및 화합물계 WNT 신호전달 작용제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질계 WNT 신호전달 작용제는 WNT-1(Wnt Family Member 1), WNT-3a(Wnt Family Member 3A), 및 R-spondin-1 (RSPO1)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다. 또한, 상기 화합물계 WNT 신호전달 작용제는 GSK-3 beta 억제제의 기작을 수행하는 물질을 포함할 수 있으며, 구체적으로 CHIR99021, CP21R7, CHIR98014, LY2090314, 켄파울론, AR-AO144-18, TDZD-8, SB216763, BIO, TWS-119 및 SB415286으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 WNT 신호전달 작용제는 CHIR99021일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직 유도 배지 내에서의 상기 WNT 신호전달 작용제의 농도를 최적화하여, 후뇌 부위로의 선택적 분화를 유도할 수 있다. 구체적으로, 상기 배아체의 후뇌 부위로의 선택적 분화를 유도하기 위한 상기 WNT 신호전달 작용제의 농도는 하기와 같을 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직 유도 배지는 1 μM 초과 5 μM 미만의 농도 범위의 CHIR99021가 나타내는 효과와 동등한 효과를 나타내는 농도 범위의 WNT 신호전달 작용제를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 후뇌 조직 유도 배지는 1.5 μM 이상 4.5 μM 이하, 1.5 μM 이상 4 μM 이하, 1.5 μM 이상 3 μM 이하, 또는 1.5 μM 이상 2.5 μM 이하의 농도 범위의 CHIR99021가 나타내는 효과와 동등한 효과를 나타내는 농도 범위의 WNT 신호전달 작용제를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 후뇌 조직 유도 배지는 LMX1A 및 LMX1B 중 적어도 하나의 유전자가 특이적으로 발현하는 농도로 상기 WNT 신호전달 작용제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직 유도 배지는 상기 WNT 신호전달 작용제의 농도 범위의 CHIR99021를 포함할 수 있다. 상기 WNT 신호전달 작용제의 농도가 상기 범위 내인 경우, 효과적으로 후뇌 부위 특이적 유전자(예를 들어, LMX1A 및/또는 LMX1B 유전자)의 발현이 크게 증가되어, 상기 배아체가 균일하게 후뇌 특이성을 가지는 세포 집단으로 분화될 수 있다. 상기 WNT 신호전달 작용제의 농도가 상기 범위 미만인 경우, 후뇌가 아닌 전뇌 부위 특이적 유전자(예를 들어, FOXG1, LHX2, 및/또는 DLX2 유전자)의 발현이 높아질 수 있다. 또한, 상기 WNT 신호전달 작용제의 농도가 상기 범위 초과인 경우, 후뇌가 아닌 척수 부위 특이적 유전자(예를 들어, HOXB4, HOXC9 및/또는 HOXA1 유전자)의 발현이 높아질 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A)는 LMX1A 및 LMX1B 중 적어도 하나의 유전자가 발현하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 전분화능 줄기세포는 인간 유래 배아줄기세포 또는 인간 유래 iPS(induced pluripotent stem) 세포일 수 있다. 상기 전분화능 줄기세포는 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 3배엽으로 분화가능한 (pluripotency) 줄기세포를 의미하며, 배아줄기세포는 물론 유도다능성줄기세포(iPS, induced pluripotent stem cell), 성체줄기세포 중 상기와 같은 능력을 가진 세포들까지 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A)는, a1) 배아체 형성 배지에서 전분화능 줄기세포로부터 배아체를 형성하는 단계; 및 a2) 내재성 WNT 분비 억제제 및 WNT 신호전달 작용제를 포함하는 후뇌 조직 유도 배지를 상기 배아체 형성 배지에 추가하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 배아체 형성 배지는 액상의 배지일 수 있으며, 상기 전분화능 줄기세포의 3차원적 배양이 가능한 것이라면 적용할 수 있다. 나아가, 상기 배아체 형성 배지는 전분화능 줄기세포의 배양을 위한 공지의 다양한 첨가제를 목적하는 바에 따라 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직 유도 배지는 배아체의 배양이 가능한 공지의 배양액 및 첨가제를 포함할 수 있으며, 나아가 상기 내재성 WNT 분비 억제제 및 상기 WNT 신호전달 작용제를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직 유도 배지의 첨가량은 상기 배아체 형성 배지의 0.1 배 내지 2배의 부피일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 후뇌 조직 유도 배지의 첨가량은 상기 배아체 형성 배지와 동등한 부피일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A)는, a3) 1 내지 3일 중 한 시점 마다, 전체 배지 중 일부를 제거하고 상기 후뇌 조직 유도 배지를 추가하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 a3) 단계는 약 2일 마다 a2) 단계에서 추가된 후뇌 조직 유도 배지의 양만큼 배지를 제거하고, 동등한 양의 후뇌 조직 유도 배지를 추가하는 것일 수 있다. 이를 통하여, 상기 배아체에 영양분을 공급하고, 상기 내재성 WNT 분비 억제제 및 상기 WNT 신호전달 작용제가 효과적으로 작용할 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A)는 4일 내지 10일의 기간 동안 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A)는 5일 내지 8일의 기간, 5일 내지 7일의 기간, 또는 약 6일의 기간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)를 통하여, 전분화능 줄기세포로부터 유래된 배아체는 고순도로 등쪽 후뇌 특성이 모사된 세포 집합체로 분회될 수 있다. 구체적으로, 상기 등쪽 후뇌 특성이 모사된 세포 집합체는 고순도로 등쪽 후뇌 특성을 모사하는 오가노이드일 수 있다. 상기 고순도로 등쪽 후뇌 특성을 모사하는 세포 집합체 또는 오가노이드는 대뇌, 선조체, 중뇌 등의 다른 뇌 부위의 특성을 나타내는 조직의 혼재가 최소화된 상태를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는 상기 배아체의 신경외배엽(neuroectoderm)으로의 분화를 유도함과 동시에, 상기 배아체 전반에서 균일하게 등쪽 후뇌 조직으로의 패턴화를 유도하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 전분화능 줄기세포로부터 유래된 배아체는 후뇌 조직으로 분화 중인 배아체일 수 있다. 구체적으로, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는 교뇌 및 소뇌와 같은 후뇌 조직으로 분화 중인 배아체의 분화 과정에서 등쪽 후뇌 조직으로 특정되도록 유도하여, 보다 높은 소뇌 특이성을 가지도록 유도할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는, 상기 등쪽 후뇌 조직 유도 배지를 상기 전분화능 줄기세포로부터 유래된 배아체가 배양 중인 배지에 추가하는 단계;를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 전분화능 줄기세포로부터 유래된 배아체가 배양 중인 배지는 후뇌 조직 유도 배지를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는 특정 조직으로 분화 중인 배아체의 처리와 중첩적으로 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는 후뇌 조직 유도 배지를 이용한 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계와 중첩적으로 수행될 수 있다. 이 때, 상기 후뇌 조직 유도 배지는 내재성 WNT 분비 억제제 및 WNT 신호전달 작용제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 SHh 신호전달계 억제제는 상기 배아체 내의 일부 세포에서 자연적으로 활성화되는 SHh 신호전달계를 억제하는 역할을 수행하는 물질일 수 있다. 상기 SHh 신호전달계 억제제는 상기 배아체 내에서 자발적으로 발현하는 SHh 신호를 발생시키는 단백질로 인한 SHh 신호전달계의 활성화를 억제함으로써, 불균질하고 통제 불가능한 SHh 신호전달계의 활성화를 억제할 수 있다. 즉, 상기 SHh 신호전달계 억제제에 의한 내재성 SHh 신호의 억제를 통하여 상기 배아체는 등쪽 후뇌 조직으로 선택적으로 균질하게 분화될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 SHh 신호전달계 억제제는 사이클로파민(cyclopamine), 이트라코나졸(itraconazole), 로보트니키닌(robotnikinin), 세룰레닌(cerulenin), 및 GANT61로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 SHh 신호전달계 억제제는 사이클로파민(cyclopamine)일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 등쪽 후뇌 조직 유도 배지는 10 μM 초과 30 μM 이하의 농도 범위의 사이클로파민(cyclopamine)이 나타내는 효과와 동등한 효과를 나타내는 농도 범위의 SHh 신호전달계 억제제를 포함할 수 있다. 구체적으로, 등쪽 후뇌 조직 유도 배지는 10 μM 초과 30 μM 미만, 12 μM 이상 30 μM 미만, 12 μM 이상 30 μM 이하, 15 μM 이상 25 μM 이하, 또는 20 μM 이상 25 μM 이하의 농도 범위의 사이클로파민(cyclopamine)이 나타내는 효과와 동등한 효과를 나타내는 농도 범위의 SHh 신호전달계 억제제를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 등쪽 후뇌 조직 유도 배지는 PAX7, OLIG3, ATOH1, BARHL1, PTF1A 및 SKOR2 중 적어도 하나의 유전자가 특이적으로 발현하는 농도로 상기 SHh 신호전달계 억제제를 포함할 수 있다. 또한, 상기 등쪽 후뇌 조직 유도 배지는 상기 SHh 신호전달계 억제제의 농도 범위의 사이클로파민(cyclopamine)을 포함할 수 있다. 상기 SHh 신호전달계 억제제의 농도가 상기 범위 내인 경우, 효과적으로 등쪽 후뇌 부의 특이적 유전자(예를 들어, PAX7, OLIG3, ATOH1, BARHL1, PTF1A 및/또는 SKOR2)의 발현이 크게 증가되어, 상기 배아체가 균일하게 등쪽 후뇌 특이성을 가지는 세포 집단으로 분화될 수 있다. 상기 SHh 신호전달계 억제제의 농도가 상기 범위 미만인 경우, 전술한 바와 같은 등쪽 후뇌 특이적 유전자의 발현이 미미할 수 있다, 또한, 상기 SHh 신호전달계 억제제의 농도가 상기 범위 초과인 경우, 과다한 SHh 신호전달계 억제제의 농도로 인하여 배아체 내의 세포분열이 억제되어 배아체가 필요한 만큼 발달하지 못하고 사멸하는 문제가 발생할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는 PAX7, OLIG3, ATOH1, BARHL1, PTF1A 및 SKOR2 중 적어도 하나의 유전자가 발현하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계는, b1) 상기 등쪽 후뇌 조직 유도 배지를 상기 배아체를 배양 중인 배지에 추가하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계는, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계와 중첩적으로 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계가 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계와 중첩적으로 수행되는 기간 동안의 상기 등쪽 후뇌 조직 유도 배지는 상기 후뇌 조직 유도 배지에 전술한 SHh 신호전달계 억제제를 더 포함한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 첨가량은 배양 중인 배지의 0.1 배 내지 2배의 부피일 수 있다. 보다 구체적으로, 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 첨가량은 배양 중인 배지와 동등한 부피일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계는, b2) 1 내지 3일 중 한 시점 마다, 전체 배지 중 일부를 제거하고 상기 등쪽 후뇌 조직 유도 배지를 추가하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 b2) 단계는 약 2일 마다 b1) 단계에서 추가된 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 양만큼 배지를 제거하고, 동등한 양의 등쪽 후뇌 조직 유도 배지를 추가하는 것일 수 있다. 이를 통하여, 상기 배아체에 영양분을 공급하고, SHh 신호전달계 억제제가 효과적으로 작용할 수 있도록 할 수 있다. 또한, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계와 중첩되는 경우, 상기 내재성 WNT 분비 억제제 및 상기 WNT 신호전달 작용제와 함께 SHh 신호전달계 억제제가 효과적으로 작용할 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는 4일 내지 10일의 기간 동안 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는 5일 내지 8일의 기간, 5일 내지 7일의 기간, 또는 약 6일의 기간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A)를 수행한지 3일 내지 5일이 되는 시점으로부터 4일 내지 10일의 기간 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 전분화능 줄기세포를 추출하여 배양하는 시점을 0일차로 기산하는 경우, 이를 약 1일 동안 배양하여 배아체(1일차)를 형성하고 나서, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계는 1일차로부터 약 7일차 내지 약 9일차까지 수행될 수 있고, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계는 약 3일차 내지 약 12일차까지 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 기저면-첨면 분극화 단계(C)는 배양 중인 배아체 표면의 극성을 기저면화 되도록 유도하며, 상기 배아체의 외표면 부위 및 내표면 부위를 각각 기저면과 첨면으로 분극화되도록 할 수 있다. 이를 통하여, 배양 중인 배아체는 신경상피조직이 보다 발달하게 되어, 소뇌 특이적 조직으로 특정화될 수 있다. 이와 같은 역할을 수행하기 위하여, 상기 기저면-첨면 유도 배지는 배양 중인 배아체에 신경상피조직의 극성을 부여할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 기저면-첨면 유도 배지는 1 부피% 이상 10 부피% 이하의 농도 범위의 세포외기질 기반의 하이드로젤을 포함하여, 상기 역할을 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 세포외기질 기반의 하이드로젤은 라미닌 및 콜라겐 등의 세포외기질 기반 물질을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 세포외기질 기반의 하이드로젤은 매드리젤일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 기저면-첨면 분극화 단계(C)는 1일 내지 5일의 기간 동안 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 기저면-첨면 분극화 단계(C)는 1일 내지 4일, 2일 내지 4일, 또는 약 3일의 기간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A)는 4일 내지 10일의 기간 동안 수행되고, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는 4일 내지 10일의 기간 동안 수행되며, 상기 기저면-첨면 분극화 단계(C)는 1일 내지 5일의 기간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화단계(A), 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화단계(B), 및 기저면-첨면 분극화 단계(C)는 각각 독립적인 요소제어를 통해 수행되는 과정으로 각각의 단계에서의 소뇌로의 패턴화를 효과적으로 완료하기 위하여, 각 과정이 중첩되어 수행될 수 있다. 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A) 및 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는 1일 내지 5일의 기간 동안 중첩되어 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A) 및 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는 1일 내지 4일, 2일 내지 4일, 또는 약 3일의 기간 동안 중첩되어 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B) 및 상기 기저면-첨면 분극화 단계(C)는 1일 내지 5일의 기간 동안 중첩되어 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B) 및 상기 기저면-첨면 분극화 단계(C)는 1일 내지 4일, 2일 내지 4일, 또는 약 3일의 기간 동안 중첩되어 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 소뇌 오가노이드의 제조방법은, (D) BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), GDNF(Glial cell line-derived neurotrophic factor), cAMP, 및 아스코르브산(Ascorbic Acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 첨가물을 포함하는 소뇌 성숙화 배지의 존재 하에서, 상기 배아체를 소뇌 오가노이드로 성숙화시키는, 소뇌 오가노이드 성숙화 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 소뇌 오가노이드 성숙화 단계(D)는 단계적인 신호전달물질 처리를 통하여 소뇌 오가노이드의 특성을 완성하는 단계를 수행하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 소뇌 오가노이드 성숙화 단계(D)는 상기 (A) 내지 (C) 단계를 거친 배아체 내의 세포들이 소뇌 적합성 조직으로 배양될 수 있도록 소뇌 조직에 적합한 신경상피조직으로 분화될 수 있도록 처리하는 것일 수 있다. 성숙한 소뇌 오가노이드를 수득하기 위하여, 상기 소뇌 오가노이드 성숙화 단계(D)는 10일, 20일, 또는 30일 이상의 기간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 제조된 소뇌 오가노이드 조직 전체에서 소뇌 적합성 조직의 비율은 적어도 90 %일 수 있다. 구체적으로, 상기 제조된 소뇌 오가노이드 조직 전체에서 소뇌 적합성 조직의 비율은 적어도 92 %, 94 %, 또는 95 %일 수 있다. 본 발명의 일 실시상태에 따른 상기 소뇌 오가노이드는 고순도로 소뇌 조직의 특성이 구현된 오가노이드로서, 대뇌, 선조체, 중뇌 등의 다른 뇌 부위의 조직의 혼재가 최소화된 것일 수 있다. 이를 통하여, 본 발명의 일 실시상태에 따른 소뇌 오가노이드의 제조방법을 통하여 수득된 소뇌 오가노이드를 통하여, 소뇌 특이적 신경세포 및 신경세포 외 교세포의 발달을 관찰할 수 있다. 또한, 상기 고순도로 소뇌 조직의 특성이 구현된 본 발명에 따른 소뇌 오가노이드는, 소뇌 발달과정에 대한 연구 및 소뇌 특이적 질환모사에 대한 연구 등으로의 다양한 활용이 가능하다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
[배아체의 형성] (0일차 배아체(Day 0))
전능성 줄기세포를 하기 표 1과 같은 배아체 형성 배지에서 배양하였다.
| 성분 | 제품명 | 농도 | 분량 | |
| DMEM/F12 | Corning, 10-090-CV | 1X | 37 ml | |
| KSR | ThermoFisher, 10828-028 | 1X | 10 ml | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher, 15140-122 | 100X | 0.5 ml | |
| Glutamax | ThermoFisher, 35050-061 | 100X | 0.5 ml | |
| NEAA | ThermoFisher, 11140-050 | 100X | 0.5 ml | |
| FBS | TermoFisher, 16000-044 | 1X | 1.5 ml | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, H3149 | 1 mg/ml | 50 ul | |
| Beta-mercaptoethanol | ThermoFisher, 21985-023 | 1,000X | 50 ul | |
| bFGF | Peprotech, 100-18B | 4 ㎍/ml | 50 ul | |
| Y 27632 | Peprotech,1293823 | 50 mM | 50 ul | |
| 합계 | 50 ml | |||
전능성 줄기세포의 밀집도가 약 80 %로 되었을 때 D-PBS를 이용하여 세포 표면에 묻어 있는 잔여물을 세척하고 각각의 세포로 분리하였다. 나아가, 10 ml의 배아체 형성 배지 당 약 100,000개의 세포가 포함되도록 희석시키고, 이를 Ultra-Low-attachment U bottom 96 well plate(Corning, 7007)의 각 웰에 세포가 들어있는 배지를 약 100 ㎕씩 주입해주었다. 그리고 나서, 37 ℃의 CO2 분위기 하의 인큐베이터에 넣고 약 24시간 동안 배양하여 배아체를 형성하였다.
[후뇌 조직으로의 선택적 분화] (1 내지 4일차 배아체 (Day 1-4))
상기와 같이 배아체가 형성된 후, 약 하루 뒤에 각 웰마다 표면이 깨끗한 구형의 배양체가 한 개씩 잘 형성되었는지 확인하였다. 내재성 WNT 분비 억제제로서의 IWP-2를 1 μM의 농도로 포함하고, WNT 신호전달 작용제로서의 CHIR99021를 1 μM, 2 μM, 3 μM 및 5 μM의 농도로 각각 포함하는 후뇌 조직 유도 배지를 준비하고 나서, 배아체가 존재하는 각각의 웰에 상기 후뇌 조직 유도 배지를 약 100 ㎕씩 첨가하였다.
약 2일에 한번씩 기존의 배지를 약 100 ㎕ 제거하고, 상기 후뇌 조직 유도 배지를 약 100 ㎕씩 추가하며, 7일 동안 배아체를 배양하여, 배아체의 후뇌 조직으로의 선택적 분화가 잘 되었는지를 확인하였다.
도 1은 실시예의 후뇌 조직 유도 배지의 WNT 신호전달 작용제 농도에 따른 전뇌 부위 특이적 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 또한, 도 2는 실시예의 후뇌 조직 유도 배지의 WNT 신호전달 작용제 농도에 따른 후뇌 부위 특이적 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 나아가, 도 3은 실시예의 후뇌 조직 유도 배지의 WNT 신호전달 작용제 농도에 따른 척수 부위 특이적 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 1 내지 도 3의 결과에 따르면, 1 μM 초과 5 μM 미만의 농도 범위의 CHIR99021를 포함하는 후뇌 조직 유도 배지에서 후뇌 부위 특이적 유전자의 발현이 강하게 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 나아가, 2 μM 내지 3 μM 농도 범위의 CHIR99021를 포함하는 후뇌 조직 유도 배지에서 다른 뇌 부위의 특이적 유전자에 비하여 후뇌 부위 특이적 유전자의 발현 강도가 매우 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이에 반하여, 약 1 μM 수준의 CHIR99021를 포함하는 후뇌 조직 유도 배지의 경우에는 다른 뇌 부위에 비하여 전뇌 부위 특이적 유전자의 발현이 강하게 나타났으며, 약 5 μM 수준의 CHIR99021를 포함하는 후뇌 조직 유도 배지의 경우에는 다른 뇌 부위에 비하여 척수 부위 특이적 유전자의 발현이 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
이에, 내재성 WNT 분비 억제제로서의 IWP-2를 1 μM의 농도로 포함하고, WNT 신호전달 작용제로서의 CHIR99021를 2 μM 내지 3 μM의 농도로 각각 포함하는 후뇌 조직 유도 배지를 이용하여 전술한 바와 같이 배아체를 후뇌 조직으로의 선택적 분화시키며, 다음 단계를 준비하였다.
[등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화] (4 내지 7일차 배아체 (Day 4-7))
상기 후뇌 조직 유도 배지에 SHh 신호전달계 억제제로서의 사이클로파민(cyclopamine)을 0 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 35 μM, 40 μM, 45 μM 및 50 μM의 농도 범위로 추가한 등쪽 후뇌 조직 유도 배지를 준비하였다. 그리고 나서, 상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 처리를 수행하고 나서 4일째가 되는 날부터 약 3일 동안, 약 2일에 한번씩 기존의 배지를 약 100 ㎕ 제거하고, 상기와 같이 준비한 등쪽 후뇌 조직 유도 배지를 약 100 ㎕씩 추가하며, 배아체의 후뇌 조직으로의 선택적 분화 및 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화를 동시에 유도하였다.
도 4는 실시예의 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 SHh 신호전달계 억제제 농도에 따른 등쪽 후뇌 부위 특이적 유전자의 발현 결과를 나타낸 것이다. 또한, 도 5는 실시예의 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 SHh 신호전달계 억제제 농도에 따른, 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화를 거친 7일차의 배아체 발달 상태를 관찰한 것이다.
도 4의 결과에 따르면, SHh 신호전달계 억제제인 사이클로파민(cyclopamine)의 농도가 20 μM 이상인 경우, 등쪽 후뇌 조직으로의 분화를 확인할 수 있는 PAX7, OLIG3, ATOH1, BARHL1, PTF1A 및 SKOR2의 유전자의 발현량이 급격하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 5의 결과에 따르면, SHh 신호전달계 억제제인 사이클로파민(cyclopamine)의 농도가 30 μM을 초과하는 경우, 배아체가 더 이상 자라지 못하고 사멸하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 SHh 신호전달계 억제제 농도가 10 μM 초과 30 μM 이하인 경우, 배아체를 효과적으로 등쪽 후뇌 조직으로 배양할 수 있음을 알 수 있었다.
이에, SHh 신호전달계 억제제인 사이클로파민(cyclopamine)를 약 20 μM의 농도로 포함하는 등쪽 후뇌 조직 유도 배지를 이용하여 전술한 바와 같이 배아체를 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화시키며, 다음 단계를 준비하였다.
[기저면-첨면 분극화] (7 내지 10일차 배아체 (Day 7-10))
상기 등쪽 후뇌 조직 유도 배지에 약 2 부피%의 매트리젤을 추가한 기저면-첨면 유도 배지를 준비하였다. 그리고 나서, 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 처리를 수행하고 나서 4일째가 되는 날부터 약 3일 동안, 약 1일에 한번씩 기존의 배지를 약 100 ㎕ 제거하고, 상기와 같이 준비한 기저면-첨면 유도 배지를 약 100 ㎕씩 추가하며, 배아체의 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 및 기저면-첨면 분극화를 동시에 유도하였다.
[소뇌 오가노이드 성숙화] (10 내지 34일차 배아체 (Day 10-34))
웰 플레이트(well plate)의 각각의 웰에 BDNF(Brain derived neurotrophic factor) 및 GDNF(Glial cell derived neurotrophic factor)를 포함하는 소뇌 성숙화 배지 5 ㎖를 넣고, 상기 기저면-첨면 분극화된 배아체를 각각의 웰에 옮겼다. 그리고, 약 2일 간격으로 기존의 배지를 약 4 ㎖ 제거하고 새로운 소뇌 성숙화 배지 약 4 ㎖를 추가하며, 소뇌 오가노이드로의 성숙화 과정을 수행하였다(Day 10-34).
도 6은 실시예에 따른 소뇌 오가노이드의 제조 과정을 배아체 형성(Day 0)으로부터 시계열적으로 도시한 것이다. 나아가, 도 7은 실시예에 따른 소뇌 오가노이드의 제조 과정에서의 배아체의 발달 과정을 위상차 현미경을 통하여 관찰한 것이다.
또한, 도 8은 실시예에 따른 소뇌 오가노이드 제조방법에 따른 배아체 형성된 날로부터 35일째 되는 날(Day 35)의 소뇌 오가노이드를 면역형광염색법으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 8의 결과에 따르면, 제조된 소뇌 오가노이드에서 소뇌 특이적 푸르키녜 신경세포의 전구세포를 표지하는 SKOR2와 소뇌 특이적 과립세포의 전구세포를 표지하는 ATOH1을 발현하는 세포들이 다수 관찰되는 것을 확인할 수 있었다.
Claims (14)
- (A) 내재성 WNT 분비 억제제 및 WNT 신호전달 작용제를 포함하는 후뇌 조직 유도 배지의 존재 하에서, 전분화능 줄기세포로부터 형성된 배아체를 배양하는, 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계;
(B) SHh(sonic hedgehog) 신호전달계 억제제를 포함하는 등쪽 후뇌 조직 유도 배지의 존재 하에서, 상기 배아체를 배양하는, 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계; 및
(C) 세포외기질 기반의 하이드로젤을 포함하는 기저면-첨면 유도 배지의 존재 하에서, 상기 배아체의 분극을 유도하는, 기저면-첨면 분극화 단계;를 포함하는, 소뇌 오가노이드의 제조방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A)는,
a1) 배아체 형성 배지에서 전분화능 줄기세포로부터 배아체를 형성하는 단계; 및
a2) 내재성 WNT 분비 억제제 및 WNT 신호전달 작용제를 포함하는 후뇌 조직 유도 배지를 상기 배아체 형성 배지에 추가하는 단계;를 포함하는 것인, 소뇌 오가노이드의 제조방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 내재성 WNT 분비 억제제는 IWP-2, LGK-974, ETC-159, GNF6231, WNT-C59 및 WNT974로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인, 소뇌 오가노이드의 제조방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 후뇌 조직 유도 배지는 0.1 μM 이상 2 μM 이하의 농도 범위의 IWP-2가 나타내는 효과와 동등한 효과를 나타내는 농도 범위의 내재성 WNT 분비 억제제를 포함하는 것인, 소뇌 오가노이드의 제조방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 후뇌 조직 유도 배지는 1 μM 초과 5 μM 미만의 농도 범위의 CHIR99021가 나타내는 효과와 동등한 효과를 나타내는 농도 범위의 WNT 신호전달 작용제를 포함하는 것인, 소뇌 오가노이드의 제조방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A)는 LMX1A 및 LMX1B 중 적어도 하나의 유전자가 발현하는 것인, 소뇌 오가노이드의 제조방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 등쪽 후뇌 조직 유도 배지는 10 μM 초과 30 μM 이하의 농도 범위의 사이클로파민(cyclopamine)이 나타내는 효과와 동등한 효과를 나타내는 농도 범위의 SHh 신호전달계 억제제를 포함하는 것인, 소뇌 오가노이드의 제조방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는 PAX7, OLIG3, ATOH1, BARHL1, PTF1A 및 SKOR2 중 적어도 하나의 유전자가 발현하는 것인, 소뇌 오가노이드의 제조방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 기저면-첨면 유도 배지는 1 부피% 이상 10 부피% 이하의 농도 범위의 세포외기질 기반의 하이드로젤을 포함하는 것인, 소뇌 오가노이드의 제조방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A)는 4일 내지 10일의 기간 동안 수행되고,
상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는 4일 내지 10일의 기간 동안 수행되며,
상기 기저면-첨면 분극화 단계(C)는 1일 내지 5일의 기간 동안 수행되는 것인, 소뇌 오가노이드의 제조방법. - 청구항 10에 있어서,
상기 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(A) 및 상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B)는 1일 내지 5일의 기간 동안 중첩되어 수행되는 것인, 소뇌 오가노이드의 제조방법. - 청구항 10에 있어서,
상기 등쪽 후뇌 조직으로의 선택적 분화 단계(B) 및 상기 기저면-첨면 분극화 단계(C)는 1일 내지 5일의 기간 동안 중첩되어 수행되는 것인, 소뇌 오가노이드의 제조방법. - 청구항 1에 있어서,
(D) BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), GDNF(Glial cell line-derived neurotrophic factor), cAMP(Cyclic adenosine monophosphate), 및 아스코르브산(Ascorbic Acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 첨가물을 포함하는 소뇌 성숙화 배지의 존재 하에서, 상기 배아체를 소뇌 오가노이드로 성숙화시키는, 소뇌 오가노이드 성숙화 단계;를 더 포함하는, 소뇌 오가노이드의 제조방법. - 청구항 1에 있어서,
제조된 소뇌 오가노이드 조직 전체에서 소뇌 적합성 조직의 비율은 적어도 90 %인 것인, 소뇌 오가노이드의 제조방법.
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| Madeline A. Lancaster, Juergen A. Knoblich, Generation of Cerebral Organoids from Human Plurpotent Stem Cells, Nat Protoc. 2014 October; 9(10): 2329-2340. |
Also Published As
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