KR20140008369A - 환자-특이적 다능 신경 줄기 세포의 생성 방법 및 조성물 - Google Patents

환자-특이적 다능 신경 줄기 세포의 생성 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 처녀생식적으로 활성화된 인간 난모세포(phNSC)로부터 유래된 줄기 세포로부터 얻은 NSC의 생성을 위한 조성물 및 방법의 중대한 발견에 관한 것이다. 본 발명의 phNSC는 배양 및 확장 동안 증식 및 분화 퍼텐셜을 유지한다. 본 발명은 단위생식적으로 활성화된 난모세포로부터 분화된 단리된 신경 줄기 세포를 제공한다.

Description

환자-특이적 다능 신경 줄기 세포의 생성 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS OF PRODUCING PATIENT-SPECIFIC MULTIPOTENT NEURONAL STEM CELLS}
본 발명은 일반적으로 줄기 세포, 및 더 구체적으로는 인간 줄기 세포를 사용하여 신경 줄기 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
인간 배아 줄기 세포(Human embryonic stem cell: hESC) 세포는 세포 유형의 배열로 분화될 수 있는 만능(pluripotent) 세포이다. 면역-결핍 마우스에 주사될 때, 배아 줄기 세포는 분화된 종양(기형종)을 형성한다. 그러나, 배상체(embryoid body: EB)를 형성하도록 시험관내에서 유도된 배아 줄기 세포는 특정 성장 조건 하에서 몇몇 조직의 특징적인 다수 세포 유형으로 분화될 수 있는 배아 줄기 세포주의 공급원을 제공한다. 예를 들어, hESC는 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유도체로 분화될 수 있었다.
인간 ES 세포 및 그것의 분화된 자손은 치료적 이식용으로 그리고 약물 시험 및 개발용으로 인간 세포의 중요한 공급원이다. 이들 목표 둘 다에 의해 환자의 필요 또는 적절한 약리학적 시험을 위해 적합한 조직 유형으로 분화되는 충분한 세포의 제공이 필요로 된다. 이는 배아 줄기 세포로부터 분화된 세포를 생성하는 효율적이고 신뢰가능한 방법에 대한 필요와 관련된다.
포유류 난모세포의 처녀생식적 활성화는 배아 줄기 세포 발생을 위해 난모세포를 제공하는데 사용될 수 있다. 처녀생식적 활성화는 수컷 배우자로부터의 어떤 기여가 없을 때 암컷 배우자로부터의 배아 세포의 생성이다.
현재, 줄기 세포 연구의 초점은 인공 기관, 재활 장치 또는 천연 신체 조직을 대신하기 위한 인공 삽입물(prosthesis)의 개발이다. 이 개발은 일반적으로 확대/분화를 제어하기 위한 줄기 세포를 유전자 조작하기 위해 생체적합한 물질의 사용; 즉, 증식에 대해 기계적 지지물을 제공함으로써 조직-유사 기능을 모방하는 장치를 만들기 위한 3-D 스캐폴드(예를 들어, PLG 스캐폴드, 키토산 스캐폴드, PCL/PEG 스캐폴드)의 사용을 예상한다.
대안적으로, 배양 줄기 세포 또는 분화 줄기 세포의 이식은 치료적 양상으로서 예상된다. 이들 방법은 일반적으로 생체내 조직 유전자조작 또는 인시츄(in situ) 발생으로서 알려져 있다. 이 영역에서 다수의 작업이 실행적 사실로서 배양 세포의 직접적 이식을 주장하지만, 이러한 양상은 종종 다공성 스캐폴드 생체물질(줄기 세포 및 겔 또는 다공성 알기네이트로부터 유래된 심장 근육 세포) 내에서 분화 줄기 세포의 씨딩을 필요로 한다.
미수정 인간 난모세포는 단위생식의 배반포(blastocyst)로 발생을 위한 적절한 화학적 자극에 의해 인공적으로 활성화될 수 있다. 이러한 배반포의 내세포집단은 줄기 세포주로서 단리되고, 확장될 수 있다. Revazova 등에 의해 처음으로 의도적으로 획득된 인간 단위생식 줄기 세포(hpSC)는 시험관내 분화에서 그들의 증식 능력 및 다계통(multilineage)에서 인간 배아 줄기 세포(hESC)와 유사하다[1, 2]. hpSC는 단지 모계 염색체 세트로부터 게놈이 형성되는 방법에 따라서 이형접합 또는 동형접합 중 하나일 수 있다. 동형접합 hpSC는 이식을 위한 세포의 공급원으로서 유용할 수 있는데, hpSC 내 HLA 유전자의 세트가 면역 거부에 덜 영향받기 쉬운 분화 유도체를 생성할 수 있기 때문이다. 더 나아가, HLA 유형이 흔하다면, 분화 유도체는 수백만의 개체와 매칭될 것이다[2, 3]. 이들 면역유전학적 이점에 추가로, 단위 생식은 살아있는 인간 배아의 파괴를 수반하지 않기 때문에, hpSC의 사용은 통상적인 hESC와 동일한 윤리적 문제를 일으키지 않는다. 따라서, hpSC는 다능 신경 줄기 세포(neural stem cell: NSC)를 포함하는 체세포주의 공급원으로서 다른 만능 줄기 세포에 대한 매력적인 대안이다.
NSC는 신경계의 자가-재생 다능 줄기 세포인데, 이는 뉴런, 희돌기교세포 및 성상세포로 분화되는 능력을 가진다[4]. NSC는 태아 및 성인 중추 신경계로부터 직접적으로 또는 만능 줄기 세포로부터 유도된 신경 분화에 의해 얻어질 수 있다. 상대적으로 긴 시간 동안 분화를 위한 그것의 능력을 손실하지 않고 시험관내에서 증식될 수 있는 세포 배양물 NSC로서 얻어지며, 따라서, 추가 적용을 위한 세포 물질의 저장을 제공한다. NSC는 퇴행성 신경질병, 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등뿐만 아니라 부동을 야기하는 척수 손상의 회복 치료를 위한 관점적 치료로서 고려된다. 동물 모델에 의한 성공적인 실험은 NSC의 용법에 의한 세포 치료의 효율을 확인한다[5].
뉴런 및 신경교세포로 분화되는 능력은 마우스[6], 영장류[7] 및 인간 단위생식 줄기 세포에 대해 실험적으로 증명되었다[1, 2, 8]. 단위생식의 줄기 세포는 모계로 각인된 유전자의 2가지 세트를 함유하는데, 이는 모두 3개의 배엽층의 유도체로 분화를 위한 장애물이 되는 것으로 추정되었다. 그러나, 키메라 동물에 의한 실험은 신경계를 포함하는 외배엽 기원의 조직 및 기관에서 더 적은 정도의 단위생식 세포 제거를 나타내었다[9]. 문헌[Cibelli et al.]은 비-인간 영장류 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) 단위생식 줄기 세포의 확립을 기재하였으며, 이 세포주는 사이노(Cyno)-1로 불렸다[7]. 만능 상태의 증거로서, 사이노-1 시험관내 분화를 수행하였고, 특히 신경 유도체가 얻어졌다. 후에, 문헌[Sanchez-Pernaute et al.]은 관련된 분화에 의해 시험관내 사이노-1로부터 도파민 뉴런을 얻었고, 래트 및 원숭이 파킨슨병 모델에 대해 그것의 효과적인 치료를 나타내었다[10]. 시험관내 phSC의 신경 분화는 문헌[Revazova et al.][1, 2] 및 문헌[Harness et al.][8]에 의해 나타났다. 이들 연구에도 불구하고, 긴 증식성 인간 단위생식 NSC는 여전히 관찰되지 않았다.
본 발명은 처녀생식적으로 활성화된 인간 난모세포(phNSC)로부터 유래된 줄기 세포로부터 얻은 NSC의 생성을 위한 조성물 및 방법의 중대한 발견에 관한 것이다. 본 발명의 phNSC는 배양 및 확장 동안 증식적 및 분화적 퍼텐셜을 유지한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 단리된 신경 줄기 세포를 제공하는데, 이는 단위생식적으로 활성화된 난모세포로부터 분화된다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포는 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능하다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 ESC로부터 상이한 패턴의 접합성을 가진다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포는 모계 게놈만을 함유한다. 일 양태에서, 신경 줄기 세포는 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능하며, ESC로부터 상이한 패턴의 접합성을 가지고, 모계 게놈만을 함유한다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 단상형과 매칭을 기반으로 한 집단 그룹과 조직적으로 양립가능하다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 인간에게 이식가능하다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 미분화되거나, 부분적으로 분화되거나 또는 완전히 분화된다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 신경 세포로 분화될 수 있다. 신경 줄기 세포는 뉴런, 신경교세포, 희돌기교세포 및 성상세포로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 세포로 분화될 수 있다. 일 양태에서, 분화된 신경 세포는 뉴런이다. 추가 양태에서, 뉴런은 콜린 작용성 뉴런, GABA 작용성 뉴런, 글루타메이트 작용성 뉴런, 도파민 작용성 뉴런 및 세로토닌 작용성 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 분화된 신경 세포는 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능하며, ESC로부터 상이한 패턴의 접합성을 가지고, 모계 게놈만을 함유한다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 SOX2, 네스틴(Nestin), 무사시(Mushashi)-1, TUBB3, MAP2, FOXO4, GFAP, CD113 및 CD15로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 마커를 발현시킨다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 a) 적어도 2일 동안 섬유아세포의 피더(feeder)층 상에서 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 성장시키는 단계; b) 적어도 1일 동안 섬유아세포 피더층 없이 페트리 접시 상에서 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 성장시키는 단계; c) 신경 유도 배지에서 세포를 배양시키는 단계; d) (c)로부터의 세포의 단일 세포 현탁액을 얻는 단계; 및 e) 신경 증식 배지에서 섬유아세포 피더층이 없는 페트리 접시 상에서 단계 (d)로부터의 단일 세포를 배양시키는 단계에 의해 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 분화시킴으로써, 신경 줄기 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 신경 유도 배지는 페니실린-스트렙토마이신 암포테리신 용액(펜실베니아주 래드너에 소재한 VWR), DMEM/F12(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), L-글루타민(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), MEM 비-필수 아미노산 용액(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), N2 보충물(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)); 및 bFGF(뉴저지주 로키힐에 소재한 페프로테크(Peprotech))로 만들어진다. 추가 양태에서 L-글루타민은 2 mM로 존재하며, MEM 비-필수 아미노산 용액은 0.1 mM로 존재하고, bFGF는 신경 유도 배지에서 4 내지 20 ng/㎖로 존재한다. 다른 양태에서, 신경 증식 배지는 페니실린-스트렙토마이신 암포테리신 용액(펜실베니아주 래드너에 소재한 VWR), DMEM/F12(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), 스템프로(StemPro)(등록상표) 신경 보충물(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), 20 ng/㎖ bFGF(뉴저지주 로키힐에 소재한 페프로테크(Peprotech)) 및 20 ng/㎖ EGF(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))로 만들어진다. 추가적인 양태에서, FGF 및 EGF는 신경 증식 배지에서 20 ng/㎖로 존재한다. 추가 양태에서, 페트리 접시는 셀스타트(CELLstart)(상표명)(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))로 코팅된다. 본 발명은 또한 이 방법에 의해 생성된 신경 줄기 세포를 제공한다. 추가적인 양태에서, 신경상피 로제트(rosette)는 신경 유도 배지에서 약 1 내지 2주 후에 형성된다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 a) 적어도 2일 동안 섬유아세포의 피더층 상에서 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 성장시키는 단계; b) 적어도 1일 동안 섬유아세포 피더층 없이 페트리 접시 상에서 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 성장시키는 단계; c) 신경 유도 배지에서 세포를 배양시키는 단계; d) (c)로부터의 세포의 단일 세포 현탁액을 얻는 단계; 및 e) 신경 증식 배지에서 섬유아세포 피더층이 없는 페트리 접시 상에서 단계 (d)로부터의 단일 세포를 배양시키는 단계에 의해 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포로부터 유래된 단리된 신경 줄기 세포를 제공하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 신경 줄기 세포는 SOX2, 네스틴, 무사시-1, TUBB3, MAP2, FOXO4, GFAP, CD113 및 CD15로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 마커를 발현시킨다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포는 적어도 27회의 계대(passage)에 대해 신경 표현형을 유지한다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포는 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능하다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 ESC로부터 상이한 패턴의 접합성을 가진다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포는 모계 게놈만을 함유한다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 인간에게 이식가능하다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 미분화되거나, 부분적으로 분화되거나 또는 완전히 분화된다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 신경 세포로 분화될 수 있다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포로부터 분화된 신경 세포는 뉴런, 신경교세포, 희돌기교세포 및 성상세포일 수 있다. 일 양태에서, 분화된 신경 세포는 뉴런이다. 추가 양태에서, 뉴런은 콜린 작용성 뉴런, GABA 작용성 뉴런, 글루타메이트 작용성 뉴런, 도파민 작용성 뉴런 및 세로토닌 작용성 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 난모세포로부터 단위생식적으로 유래되어 생성된 신경 줄기 세포를 사용하여 신경성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 신경성 장애는 뇌전증, 경련, 신경독성 손상, 저산소증, 무산소증, 허혈, 뇌졸중, 뇌혈관 발작, 뇌 또는 척수 외상, 심근경색, 신체의 외상, 익수, 질식, 주산기 가사, 저혈당증 사건, 신경퇴화, 알츠하이머병, 노인성 치매, 근위축성 측색 경화증, 다발성 경화증, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다운 증후군, 코르사코프병, 정신 분열증, AIDS 치매, 다발-뇌경색성 치매, 빈스방거 치매, 신경 손상, 발작, 화학 독성, 중독, 몰핀 내성, 아편 내성, 오피오이드 내성, 바비 튜레이트 내성, 급성 및 만성 통증, 편두통, 불안, 주우울증, 조울증, 강박장애, 정신 분열증 및 기분 장애, 양극성 장애, 단극성 우울증, 기분부전장애, 계절성 정서 장애, 근육긴장이상 또는 다른 운동 장애, 수면 장애, 근육이완 및 요실금으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 이러한 치료가 필요한 환자에게 이식된다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 신경 분화 배지에서 신경 줄기 세포를 배양함으로써 신경 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 신경 분화 배지는 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신(펜실베니아주 래드너에 소재한 VWR); DMEM/F12(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)); 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)); 및 스템프로(StemPro)(등록상표) 신경 보충물(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))을 함유한다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 뉴런, 신경교세포, 희돌기교세포 및 성상세포로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 세포로 분화된다. 본 발명은 또한 신경 줄기 세포로부터 분화된 신경 세포를 제공한다. 일 양태에서, 신경 줄기 세포는 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포로부터 생성된다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포는 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능하다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 ESC로부터 상이한 패턴의 접합성을 가진다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포는 모계 게놈만을 함유한다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 인간에게 이식가능하다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 미분화되거나, 부분적으로 분화되거나 또는 완전히 분화된다. 일 양태에서 분화된 신경 세포는 뉴런이다. 추가 양태에서, 뉴런은 콜린 작용성 뉴런, GABA 작용성 뉴런, 글루타메이트 작용성 뉴런, 도파민 작용성 뉴런 및 세로토닌 작용성 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 양태에서 분화된 신경 세포는 뉴런이다. 추가 양태에서, 뉴런은 콜린 작용성 뉴런, GABA 작용성 뉴런, 글루타메이트 작용성 뉴런, 도파민 작용성 뉴런 및 세로토닌 작용성 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 a) 피더가 없는 조건에서 인간 만능 줄기 세포의 배양 단계; b) 신경 유도 배지에 대한 상기 세포의 노출 단계; c) 부분적으로 분화된 세포의 기계적 단리 단계; 및 d) 성숙까지 상기 세포의 추가적인 확장 및 유지 단계에 의해 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 분화시킴으로써 신경 줄기 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일 양태에서 신경 유도 배지는: a) 페니실린-스트렙토마이신 암포테리신 용액; b) DMEM/F12; c) MEM 비-필수 아미노산 용액; d) L-글루타민; e) N2 보충물; 및 f) bFGF를 포함한다. 추가 양태에서 L-글루타민은 2 mM로 존재하고, MEM 비-필수 아미노산 용액은 0.1 mM로 존재하며, bFGF는 신경 유도 배지에서 4 내지 20 ng/㎖로 존재한다. 다른 양태에서, 신경 증식 배지는 a) 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신; b) DMEM/F12; c) 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I; d) 스템프로(StemPro)(등록상표) 신경 보충물; e) bFGF; 및 f) EGF을 포함한다. 추가적인 양태에서, FGF 및 EGF는 신경 증식 배지에서 20 ng/㎖로 존재한다. 추가적인 양태에서, 피더가 없는 조건은, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 셀스타트(CELLstart), 매트리젤(Matrigel), 라미닌, 젤라틴, 피브로넥틴을 포함하는 ECM을 이용한다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 생성된 신경 줄기 세포를 제공한다. 추가 양태에서, 신경상피 로제트는 1 내지 2주 후에 형성된다.
추가적인 실시형태에서, 본 발명은 a) 피더가 없는 조건에서 인간 만능 줄기 세포의 배양 단계; b) 신경 유도 배지에 대한 상기 세포의 노출 단계; c) 부분적으로 분화된 세포의 기계적 단리 단계; 및 d) 성숙까지 상기 세포의 추가적인 확장 및 유지 단계를 포함하는 방법을 사용하여 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포로부터 유래된 단리된 신경 줄기 세포를 제공한다. 일 양태에서, 세포는 SOXBl-패밀리 NES, MSH-1, CXCR4, CCND1, LHX2, PAX6, GAP43으로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 줄기 세포는 마커를 발현시킨다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 적어도 30회의 계대에 대해 신경 표현형을 유지한다. 일 양태에서, 신경 줄기 세포는 신경 세포로 분화될 수 있다. 추가적인 양태에서, 신경 세포는 뉴런, 성상세포 및 희돌기교세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 양태에서 분화된 신경 세포는 뉴런이다. 추가 양태에서, 뉴런은 콜린 작용성 뉴런, GABA 작용성 뉴런, 글루타메이트 작용성 뉴런, 도파민 작용성 뉴런 및 세로토닌 작용성 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 난모세포로부터 단위생식적으로 유래된 신경 줄기 세포를 사용하여 신경성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 신경성 장애는 뇌전증, 경련, 신경독성 손상, 허혈, 뇌졸중, 뇌혈관 발작, 뇌 또는 척수 외상, 신체의 외상, 알츠하이머병, 노인성 치매, 근위축성 측색 경화증, 다발성 경화증, 파킨슨병, 헌팅턴병, 정신 분열증, 신경 손상, 편두통, 불안, 주우울증, 조울증, 강박장애, 정신 분열증 및 기분 장애, 양극성 장애, 단극성 우울증, 근육긴장이상 또는 다른 운동 장애, 수면 장애, 근육이완으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 이러한 치료가 필요한 환자에게 이식된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 신경 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공하며, 해당 방법은 신경 분화 배지에서 신경 줄기 세포를 배양시키는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 신경 분화 배지는: a) 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신; b) DMEM/F12; c) 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I; 및 d) 스템프로(StemPro)(등록상표) 신경 보충물을 포함한다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 뉴런, 희돌기교세포 및 성상세포로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 세포로 분화된다. 일 양태에서 분화된 신경 세포는 뉴런이다. 추가 양태에서, 뉴런은 콜린 작용성 뉴런, GABA 작용성 뉴런, 글루타메이트 작용성 뉴런, 도파민 작용성 뉴런 및 세로토닌 작용성 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명은 또한 본 방법에 의해 생성된 분화된 세포를 제공한다. 일 양태에서, 세포는 단위생식적으로 활성화된 난모세포로부터 분화된다.
도 1은 신경 유도의 제7일에 hpSC(짙은색 막대)에서 및 NEP 로제트(회색 막대)에서 상대적 유전자 발현을 나타내는 그래프를 도시한 도면;
도 2는 phNSC(짙은색 막대)에서 및 hNSC H9(회색 막대)에서 중요한 유전자의 상대적 전사 활성 수준을 나타내는 그래프를 도시한 도면;
도 3은 자발적으로 분화된 phNSC(짙은색 막대) 및 hNSC(회색 막대)에서 신경 마커 TUBB3 및 MAP2 및 신경교 마커 GFAP 및 FOXO4 발현을 나타내는 그래프를 도시한 도면;
도 4는 단위생식적으로 유래된 도파민 작용성 뉴런이 작용 퍼텐셜을 촉발시킬 수 있다는 것을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
본 발명은 처녀생식적으로 활성화된 인간 난모세포(phNSC)로부터 유래된 줄기 세포로부터 얻어진 NSC를 생성하는 방법 및 조성물의 중대한 발견에 관한 것이다. 본 발명의 phNSC는 배양 및 확장 동안 증식 및 분화 퍼텐셜을 유지한다.
본 조성물 및 방법이 기재되기 전, 본 발명은 기재된 특정 조성물, 방법 및 실험적 조건으로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 하는데, 이러한 조성물, 방법 및 조건이 다를 수 있기 때문이다. 또한 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 기재하는 목적을 위한 것이며, 제한되는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 하는데, 본 발명의 범주는 단지 첨부되는 특허청구범위에 의해 제한될 것이기 때문이다.
본 명세서 및 첨부되는 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 용어는 내용에서 달리 명확하게 표시되지 않는다면 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "방법"에 대한 기준은 하나 이상의 방법 및/또는 본 명세서에 기재된 유형의 단계를 포함하는데, 이는 본 명세서 등을 읽을 때 당업자에게 명백할 것이다.
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동일한 임의의 방법 및 물질은 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다.
"분화"는 해당 세포가 특정의 다른 구체화된 작용을 추정하게 하고, 특정의 다른 구체화된 기능적 단위로 변하는 능력을 상실하게 하는 세포에서 생기는 변화를 지칭한다. 분화될 수 있는 세포는 전능(totipotent), 만능 또는 다능 세포 중 어떤 것 일 수 있다. 분화는 성숙 성인 세포에 대해 부분적이거나 또는 완전할 수 있다.
"단위 생식"("처녀생식적으로 활성화된" 및 "단위생식적으로 활성화된"은 상호호환적으로 사용됨)은 정자 침투가 없을 때 난모세포의 활성화가 일어나는 과정이며, 모든 암컷 유래의 DNA를 포함하는 난모세포 또는 배아 세포, 예를 들어 난할구의 활성화에 의해 얻어지는 영양외배엽 및 내세포집단을 포함하는 조기 단계 배아의 발생을 지칭한다. 관련된 양태에서, "반수성개체(parthenote)"는 이러한 활성화에 의해 얻어진 결과 세포를 지칭한다. 다른 관련된 양태에서, "배반포:는 외부 영양막 세포 및 내세포집단(inner cell mass: ICM)으로 만들어진 세포의 중공 볼(hollow ball)을 포함하는 수정된 활성화된 난모세포의 절단 단계를 지칭한다. 추가 관련 양태에서, "배반포 형성"은 난모세포 수정 또는 활성화 후, 난모 세포가 후속하여 외부 영양막 세포 및 ICM으로 만들어진 세포의 중공 볼로 발생될 수 있는 시간(예를 들어, 5 내지 6일) 동안 배지에서 배양되는 과정을 지칭한다.
반수성개체 게놈은 후생유전적으로 각인된 모계 염색체의 단일 또는 이중 세트를 함유할 수 있다. 비경구 게놈은 없으며, 결과적으로, "단위생식의 배반포-유사 구조는 인간 배아에 특징적인 것으로 고려될 수 있는 기능적 게놈을 소유하지 못한다"[17]. 배외(extraembryonic) 조직의 발생에 대한 부계 DNA 영향의 결과로서, 부계 DNA가 없을 때 포유류 난은 자연적 배발생 단계를 통해 진행될 수 없다...." [18]. 추가로, 반수성개체는 전능성이 아니다[17]. 추가로, 인간이 되는 과정은 모계와 부계 DNA 둘 다의 각인을 필요로 한다. 반수성개체는 모계 게놈만을 함유하기 때문에, 처녀생식적 활성화는 분명히 부계 DNA 각인을 수반하지 않으며, 따라서 상이한 과정이 되고, 상이한 유기체를 야기한다. 적절한 DNA 각인의 결여는 분자적 수준(배반포기에서) 및 적절한 외부-배아 조직의 결여를 관찰하는 것에 의한 거시적 수준(즉, 태반) 둘 다에서 측정될 수 있다.
추가적으로, 처녀생식의 줄기 세포는 핵 전달을 포함하는 다른 방법을 사용하여 유래된 줄기 세포로부터의 몇몇 중요한 양태에서 상이하다. 첫째로, 단위생식적으로 유래된 줄기 세포는 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능하다. 단위생식적으로 유래된 줄기 세포는 난모세포의 게놈, 핵과 미토콘드리아 둘 다와 정확한 매치를 제공한다. 핵 전달에 의해 유래된 줄기 세포는 핵 공여자의 면역 동일성에 대해 거의 정확한 매치를 제공할 수 있는데, 핵과 매칭되지만, 미토콘드리아 유전자에는 매칭되지 않는다. 둘째로, 단위생식적으로 유래된 줄기 세포는 감수분열 및 유사분열 분할 동안 분명한 응집된 염색체 내 게놈 DNA의 단일 뉴클레오타이드 다형성에서 이형접합성의 분포에 의해 반영된 접합성의 독특한 패턴을 가진다. 반수성개체는 성체 줄기 세포 또는 핵 전달 세포로부터 수정된 배아로부터 유래된 줄기 세포(및 그것의 유도체)와 비교하여 DNA의 원위 말단 및 동원체 주변의 영역에서 발견되는 게놈 접합성의 독특한 패턴을 나타낸다. 문헌[Kim et al][19]에 나타낸 바와 같이, 단위생식의 세포는 동원체주변에서 동형접합성을 보유하지만, 이형접합성의 원위 영역을 나타내거나(난모세포에서 감수분열 II 동안 자매염색분체의 독립적 분리의 실패를 반영) 또는 동원체주변에서 유전자 마커의 이형접합성을 보유하며, 동형접합성의 특징적 원위 영역을 가진다(부계 염색체의 난모세포에서 감수분열 I동안 염색체의 세트와 상동성인 분리의 실패를 반영). 동원체 및 염색체의 원위 말단 주변에서 동형접합성 및 이형접합성의 이들 패턴은 단위생식의 줄기 세포 및 그것의 유도체를 수정된 배아로부터 유래된 세포 또는 수정된 배아로부터 유래된 줄기 세포로부터 유래된 세포와 구별하는데, 이는 염색체의 전체 길이를 통해 이형접합성을 증명한다. 셋째로, 단위생식적으로 유래된 줄기 세포는 모계 DNA만을 함유한다. 정상 포유류 발생은 모계와 부계 염색체 둘 다로부터의 기여를 필요로 한다. 반수성개체는 활성화된 난모세포로부터 배타적으로 유래된다. 반수성개체 게놈(단위 생식을 통해 생성된 것)은, 활성화가 허용되거나 또는 억제된 후 각각 난모세포를 방출시키려는 시도를 하는 극체에서 염색체의 방출 여부에 따라서, 후생유전적으로 각인된 모계 염색체의 단일 또는 이중 세트 중 하나를 본질적으로 함유한다. 반수성개체는 모계 염색체만을 함유하며, 따라서 부계 게놈 또는 다른 첨가된 유전적 물질이 없다. 넷째로, 단위생식적으로 유래된 줄기 세포는 항상 모계 핵형, XX를 가질 것이다.
더 나아가, 반수성개체는 단일 전핵만을 함유한다. 단일 전핵은 수정에 필요한 유전적 물질의 절반, 즉, 모계 게놈만을 함유한다. 추가로, 인간이 되는 것에서 시작되고, 진행된 과정으로부터 유래된 생물학적 물질을 사용하는 체세포 핵 전달과 달리, 반수성개체는 인간이 되는 과정에서 영구한 생물학적 물질을 결코 사용하지 않는다.
"만능 세포"는 미분화 상태에서 연장되고, 이론적으로 무한정인 시간 기간 동안 시험관내에서 유지될 수 있고, 상이한 분화된 조직 유형, 즉, 외배엽, 중배엽 및 내배엽이 생기게 할 수 있는 암컷 또는 수컷 모두 유래의 DNA를 함유하는 세포의 활성화에 의해 생성된 배아로부터 유래된 세포를 지칭한다. 세포의 만능 상태는 바람직하게는 적절한 조건 하에서 동정생식적 또는 자성생식적 방법에 의해 생성된 배아의 내세포집단으로부터 유래된 세포 또는 내세포집단을 배양시킴으로써, 예를 들어 섬유아세포 피더층 또는 다른 피더층 또는 백혈구 억제 인자(leukemia inhibitory factor: LIF)를 포함하는 배양물에 대해 배양시킴으로써 바람직하게 유지된다. 이러한 배양 세포의 만능 상태는 다양한 방법에 의해 확인될 수 있다, 예를 들어, (i) 만능 세포의 특징적인 마커의 발현을 확인하는 단계; (ii) 만능 세포의 게놈형을 발현시키는 세포를 함유하는 키메라 동물의 생성 단계; (iii) 생체내에서 상이한 분화 세포 유형의 생성과 함께, 동물, 예를 들어 SCID 마우스 내로 세포를 주입하는 단계; 및 (iv) 배상체 및 다른 분화된 세포 유형으로 세포의 분화를 관찰하는 단계(예를 들어 피더층 또는 LIF 없이 배양될 때).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "다능" 또는 "다능 세포"는 제한된 수의 다른 특정 세포 유형이 생길 수 있는 세포 유형을 지칭한다. 상기 기재한 바와 같이, 최종적인 내배엽 세포는 외배엽 또는 중배엽으로부터 생성된 조직으로 분화되지 않지만, 오히려, 창자 관뿐만 아니라 창자 관으로부터 유래된 외배엽 또는 중배엽으로 분화된다. 일 실시형태에서, 최종적인 내배엽 세포는 hESC로부터 유래된다. 이러한 과정은 췌장, 간, 폐, 위, 장 및 갑상선과 같은 인간 내배엽 유래 조직의 효율적인 생성을 위한 기반을 제공할 수 있다. 예를 들어, 최종적인 내배엽의 생성은 줄기 세포의 기능적 인슐린-생성 β-세포로 분화에서 제1 단계일 수 있다. 유용한 양의 인슐린-생성 β-세포를 얻기 위해서, 췌장섬/β-세포 운명(cell fate)에 도달되기 전 생기는 분화 단계 각각에 대해 고효율의 분화가 바람직하다. 줄기 세포의 최종적인 내배엽 세포로 분화는 기능적 췌장섬/β-세포에 대해 아마도 가장 빠른 단계를 나타내기 때문에, 이 단계에서 고효율의 분화가 특히 바람직하다.
"2배체 세포"는 수컷 또는 암컷 유래 모두의 2배체 DNA 내용물을 갖는 세포, 예를 들어 난모세포 또는 난할구를 지칭한다.
반수 세포"는 반수체 DNA가 수컷 또는 암컷 유래를 모두 가지는 경우, 반수체 DNA 함량을 가지는 세포, 예를 들어 난모세포 또는 난할구를 지칭한다.
"활성화"는 수정 또는 미수정 난모세포가, 예를 들어, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 감수분열의 중기 II에서, 염색분체 쌍의 분리, 제2 극체의 분출을 전형적으로 포함하는 과정을 겪으며, 난모세포가 염색체의 반수체 수를 가지고, 각각은 하나의 염색분체를 지니도록 야기하는 과정을 지칭한다. 활성화는 수컷 또는 암컷 유래 모두의 DNA를 함유하는 세포가 식별가능한 내세포집단 및 영양외배엽을 갖는 배아로 발생되도록 유도되는 방법을 포함하는데, 이는 만능 세포를 생성하는데 유용하지만, 그 자체는 생존할 수 있는 자손으로 발생되지 않을 수 있는 가능성이 있다. 활성화는, 예를 들어 다음의 조건 중 하나 하에서 수행될 수 있다: (1) 제2의 극체 분출을 야기하지 않는 조건; (ii) 극체 분출을 야기하지만, 극체 분출이 억제되는 조건; 또는 (iii) 반수체 난모세포의 제1 세포 분할을 억제하는 조건.
"중기 II"는 세포의 DNA 함량이 염색체의 반수체 수로 이루어지고, 각 염색체는 2개의 염색분체에 의해 나타나는 세포 발생 단계를 지칭한다.
일 실시형태에서, 중기 II 난모세포는 다양한 O2 인장(tension) 가스 환경하에 난모세포를 인큐베이션함으로써 활성화되고/배양된다. 관련된 양태에서, 저 O2 인장 가스 환경은 약 2%, 3%, 4% 또는 5%의 O2 농도를 포함하는 가스 혼합물에 의해 만들어진다. 추가 관련 양태에서, 가스 혼합물은 약 5% CO2를 포함한다. 추가로, 가스 혼합물은 약 90% N2, 91% N2 또는 93% N2를 포함한다. 이 가스 혼합물은 5% CO2 공기와 구별되는데, 이는 대략 5% CO2, 20% O2 및 75% N2이다.
"O2 인장"은 유체(즉, 액체 또는 기체)에서 산소의 부분압(가스 혼합물의 단일 성분에 의해 가해지는 압력)을 지칭한다. 낮은 인장은 산소의 부분압(pO2)이 낮을 때 저인장이고, pO2가 높을 때 고 인장이다.
"정해진-배지 조건"은 최적의 성장을 위해 필요한 성분의 농도가 상술된 경우 세포를 배양시키기 위한 환경을 지칭한다. 예를 들어, 세포의 사용(예를 들어, 치료적 용도)에 따라서, 이종 단백질을 함유하는 조건으로부터 세포를 제거하는 것은 중요하며; 즉, 배양 조건은 동물이 없는 조건이거나 또는 비인간 동물 단백질이 없다. 관련된 양태에서, "시험관내 수정(IVF) 배지"는 수정된 난모세포 상에서 또는 내에서 성장될 수 있는 화학적으로 정해진 물질을 함유하는 영양분 시스템을 지칭한다.
"세포밖 매트릭스(extracellular matrix: ECM) 기질"은 최적의 성장을 지지하는 표면 아래의 세포를 지칭한다. 예를 들어, 이러한 ECM 기질은, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 매트리젤, 라미닌, 젤라틴, 피브로넥틴 기질을 포함한다. 관련된 양태에서, 이러한 기질은 다양한 성장 인자(예를 들어, bFGF, 표피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자-1, 혈소판 유래 성장 인자, 신경 성장 인자 및 TGF-β-1)를 포함하는 콜라겐 IV, 엔탁틴, 헤파린 설페이트 프로테오글라이칸을 포함할 수 있다.
"배아"는 세포, 예를 들어 수컷 또는 암컷 유래 모두의 DNA를 함유하는 난모세포 또는 다른 배아 세포의 활성화를 초래하며, 선택적으로 변형될 수 있고, 식별가능한 영양외배엽 및 내세포집단을 포함하며, DNA가 수컷 또는 암컷 모두에서 유래되는 경우 살아있는 자손이 생길 수 없는 배아를 지칭한다. 그것에 함유된 내세포집단 또는 세포는 앞서 정의한 바와 같은 만능 세포의 생성에 유용하다.
"내세포집단(ICM)"은 태아 조직이 생기게 하는 배아의 내부 부분을 지칭한다. 본 명세서에서, 이들 세포는 시험관내에서 만능 세포의 연속적 공급을 제공하기 위해 사용된다. 추가로, ICM은 동정생식 또는 자성생식으로부터 생기는 배아, 즉, 수컷 또는 암컷 유래 모두의 DNA를 함유하는 세포의 활성화 시 생기는 배아의 내부 부분을 포함한다. 이러한 DNA는, 예를 들어 인간 DNA, 예를 들어 인간 난모세포 또는 정자의 DNA일 것이며, 유전적으로 변형될 수도 있거나, 변형되지 않을 수도 있다.
"영양외배엽"은 동정생식 또는 자성생식으로부터 생기는 배아, 즉, 수컷 또는 암컷 유래 모두, 예를 들어 인간 난소 또는 정자의 DNA를 함유하는 세포의 활성화로부터 초래된 배아의 해당 조직을 포함하는, 태반 조직에 생기는 초기 단계 배아의 다른 부분을 지칭한다.
"분화된 세포"는 특정의 분화된, 즉, 비-배아 상태를 소유하는 비-배아 세포를 지칭한다. 3가지의 가장 초기의 분화 세포 유형은 내배엽, 중배엽 및 외배엽이다.
"실질적으로 동일한"은 차이점을 측정하는 능력(예를 들어, HLA 타이핑, SNP 분석 등에 의함) 내에서 본질적으로 동일한 것에 가깝도록 특정 특징에 대해 동일한 품질을 지칭한다.
"조직적으로 양립가능한"은 유기체가 외래 조직의 이식을 견디는 정도를 지칭한다.
다른 실시형태에서, 줄기 세포는 병리 유전적으로 활성화된 인간 난모세포로부터 만들어진다. 일 양태에서, 신경 줄기 세포는 단위생식적으로 활성화된 인간 난모세포로부터 유래된 줄기 세포로부터 분화된 신경 줄기 세포로부터 얻어진다.
천연 환경에서, 난소로부터의 미성숙 난모세포(난)는 감수분열의 중기 II로 감수분열을 통한 진행을 초래하는 성숙 과정을 겪는다. 그 다음에 난모세포는 중기 II에서 저지된다. 중기 II에서, 세포의 DNA 함량은 염색체의 반수체 수로 이루어지며, 각각은 두 개의 염색분체에 의해 나타난다.
단위생식적으로 활성화된 난모세포, 배반포, ICM 및 자가 줄기 세포는 세포가 장래에 필요한 것으로 회복되도록 하는 방식으로 저장되거나 또는 "뱅킹(banked)"될 수 있다. 단위생식적으로 활성화된 난모세포 및 자가 줄기 세포의 알리쿼트는 언제든지 제거되어, 다수의 미분화 세포의 배양물로 성장될 수 있고, 그 다음에 특정 세포 유형 또는 조직 유형으로 분화된 다음, 피험체에서 질병을 치료하거나 또는 제기능을 하지 못하는 조직을 대체하기 위해 사용될 수 있다. 세포가 공여자로부터 단위생식적으로 유래되기 때문에, 세포는 저장될 수 있고, 따라서 개체 또는 밀접한 관계가 연장된 시간 기간 동안 세포에 접근될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포 뱅크는 단위생식적으로 활성화된 난모세포, 배반포, ICM 및/또는 자가 줄기 세포 샘플을 저장하기 위해 제공된다. 다른 실시형태에서, 이러한 세포 뱅크의 투여 방법이 제공된다. 미국 공개 특허 출원 제2003O215942호는 본 명세서에 전문이 참조로서 포함되는데, 이는 줄기 세포 뱅크 시스템의 예를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 단리된 신경 줄기 세포를 제공하는데, 이는 단위생식적으로 활성화된 난모세포로부터 분화된다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포는 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능하다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 ESC로부터 상이한 패턴의 접합성을 가진다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포는 모계 게놈만을 함유한다. 일 양태에서, 신경 줄기 세포는 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능하며, ESC로부터 상이한 패턴의 접합성을 가지고, 모계 게놈만을 함유한다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 매칭 단상형을 기반으로 한 집단 그룹과 조직적으로 양립가능하다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 인간에게 이식가능하다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 미분화되거나, 부분적으로 분화되거나 또는 완전히 분화된다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 신경 세포로 분화될 수 있다. 신경 줄기 세포는 뉴런, 신경교세포, 희돌기교세포 및 성상세포로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 세포로 분화될 수 있다. 일 양태에서, 분화된 신경 세포는 뉴런이다. 추가 양태에서, 뉴런은 콜린 작용성 뉴런, GABA 작용성 뉴런, 글루타메이트 작용성 뉴런, 도파민 작용성 뉴런 및 세로토닌 작용성 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 분화된 신경 세포는 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능하며, ESC로부터 상이한 패턴의 접합성을 가지고, 모계 게놈만을 함유한다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 SOX2, 네스틴, 무사시-1, TUBB3, MAP2, FOXO4, GFAP, CD113 및 CD15로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 마커를 발현시킨다.
"신경 세포"는 뇌, 척수 또는 중추신경계의 어떤 다른 부분과 관련된 임의의 세포를 지칭한다. 신경 세포는, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 뉴런, 성상세포, 신경교세포 및 희돌기교세포를 포함한다.
뉴런은 전기적 및 화학적 신호처리에 의한 정보를 처리하고, 전송하는 전기적으로 자극에 반응하는 세포이다. 화학적 신호처리는 다른 세포와 구체화된 연접인 시냅스를 통해 일어난다. 뉴런은 서로 연결되어 신경 네트워크를 형성한다. 뉴런은 신경계의 핵심 성분인데, 이는 뇌, 척수 및 말초 신경절을 포함한다. 다수의 구체화된 유형의 뉴런이 존재한다: 감각 뉴런은 접촉, 소리, 빛 및 감각 기관의 세포에 영향을 미치는 수많은 다른 자극에 반응한 다음, 척수 및 뇌에 신호를 보낸다. 운동 뉴런은 뇌 및 척수로부터 신호를 수용하는데, 이는 근수축을 야기하며, 분비선에 영향을 미친다. 연합뉴런은 뇌 또는 척수의 동일 영역 내에서 뉴런을 다른 뉴런에 연결시킨다.
뉴런은 이것이 제조하는 신경전달물질의 유형이 다르다. 일부 예는 하기와 같다:
콜린성 뉴런은 아세틸콜린을 제조한다. 아세틸콜린은 시냅스전 뉴런으로부터 시냅스 간극으로 방출된다. 이는 리간드-개폐형 이온 채널 및 대사자극성(GPCR) 무스카린 수용체 둘 다에 대한 리간드로서 작용한다. 니코틴 수용체는 니코틴에 결합되는 알파 및 베타 서브유닛으로 구성된 펜타머 리간드-개폐형 이온 채널이다. 리간드 결합은 Na+ 탈분극의 유입을 야기하는 채널을 개방하며, 시냅스전 신경전달물질의 방출 확률을 증가시킨다.
GABA 작용성 뉴런은 감마 아미노뷰티르산(gamma aminobutyric acid: GABA)을 제조한다. GABA는 CNS 내 2개의 신경억제제 중 하나이고, 다른 것은 글라이신이다. GABA는 ACh에 대해 상동성인 기능을 가지며, Cl-이온이 시냅스 후 뉴런으로 유입되도록 하는 음이온 채널을 개폐한다. Cl-는 뉴런 내에서 과분극을 야기하는데, 전압이 더 음으로 됨에 따라 촉발되는 작용 퍼텐셜의 확률을 감소시킨다.
글루타메이트 작용성 뉴런은 글루타메이트를 제조한다. 글루타메이트는 2개의 주요 흥분성 아미노산 중 하나이며, 다른 것은 아스팔테이트이다. 글루타메이트 수용체는 4가지 범주 중 하나이며, 이 중 3가지는 리간드-개폐형 이온 채널이고, 이중 하나는 G-단백질 결합 수용체이다(종종 GPCR로서 지칭됨). AMPA 및 카이네이트(Kainate) 수용체는 둘 다 빠른 흥분성 시냅스 전달을 매개하는 Na+ 양이온 채널에 침투가능한 양이온 채널로서 작용한다. NMDA 수용체는 Ca2 +에 더 침투가능한 다른 양이온 채널이다. NMDA 수용체의 기능은 채널 기공 내에서 공동-작용물질(agonist)로서 결합되는 글라이신 수용체에 의존한다. NMDA 수용체는 두 리간드가 모두 존재하지 않으면 작용하지 않는다. 대사성 수용체인 GPCR은 시냅스 전달 및 시냅스 후 흥분성(excitability)을 조절한다. 글루타메이트는 뇌에 대한 혈액의 흐름이 방해될 때 흥분세포독성을 야기할 수 있는데, 이는 뇌 손상을 야기한다. 혈액의 흐름이 억제될 때, 글루타메이트는 시냅스 전 뉴런으로부터 방출되는데, 이는 보통 스트레스 조건 이외의 경우보다 훨씬 NMDA 및 AMPA 수용체 활성화를 야기하고, 시냅스 후 뉴런으로 유입되는 상승된 Ca2 + 및 Na+ 및 세포 손상을 야기한다.
도파민 작용성 뉴런은 도파민을 제조한다. 도파민은 cAMP 및 PKA를 증가시키는 D1 유형(D1 및 D5) Gs 결합 수용체 및 cAMP 및 PKA를 감소시키는 Gi-결합 수용체를 활성화시키는 D2 유형(D2, D3 및 D4) 상에서 작용하는 신경전달물질이다. 도파민은 기분 및 거동과 관련되며, 시냅스 전 및 시냅스 후 둘 다의 신경 전달을 조절한다. 흑질 내 도파민 뉴런의 손실은 파킨슨병과 관련되었다.
세로토닌 작용성 뉴런은 세로토닌을 제조한다. 세로토닌, 즉, (5-하이드록시트립타민, 5-Hydroxytryptamine: 5-HT)은 흥분제 또는 억제제로서 작용할 수 있다. 4가지의 5-HT 수용체 분류 중에서, 3가지는 GPCR이고, 1가지는 리간드 개폐형 양이온 채널이다. 세로토닌은 트립토판 하이드록실라제에 의해 트립토판으로부터 합성된 다음, 방향족 산 데카복실라제에 의해 추가로 합성된다. 시냅스 후 뉴런에서 5-HT의 결여는 우울증과 관련되었다. 시냅스 전 세로토닌 전달자를 차단하는 약물, 예컨대 프로작(Prozac) 및 졸로프트(Zoloft)가 치료를 위해 사용된다.
성상교세포로서 총괄적으로 알려진 성상세포는 뇌 및 척수에서 특징적 별 모양의 신경교세포이다. 이들은 혈액-뇌 장벽을 형성하는 내피 세포의 생화학적 지지체, 신경 조직에 영양분의 공급, 세포밖 이온 밸런스의 유지 및 외상적 손상 후 뇌 및 척수의 회복 및 흉터 처리에서 역할을 포함하는 다수의 기능을 수행한다.
때때로 신경아교세포 또는 단순히 신경교로 불리는 신경교세포는 항상성을 유지하고, 마이엘린을 형성하며, 뇌의 뉴런에 대해, 및 자율 신경계에서와 같은 신경계의 다른 부분에서 뉴런에 대해 지지체 및 보호를 제공하는 비-신경 세포이다.
희돌기교세포는 뇌세포의 유형이다. 이것은 다양한 신경아교세포이다. 그것의 주요 기능은 일부 척추동물의 중추신경계(뇌 및 척수)에서 축색돌기(신경 세포의 긴 돌출부)의 절연이다.
"신경 줄기 세포" 또는 "NSC" 또는 "신경 전구체 세포" 또는 "NPC"는 신경 세포에서 분화될 수 있는 임의의 세포를 지칭한다.
"병리 유전학적으로 유래된 신경 줄기 세포" 또는 "phNSC"는 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포로부터 생성된 신경 줄기 세포인 신경 세포에서 분화될 수 있는 임의의 세포를 지칭한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 a) 적어도 2일 동안 섬유아세포의 피더층 상에서 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 성장시키는 단계; b) 적어도 1일 동안 섬유아세포 피더층 없이 페트리 접시 상에서 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 성장시키는 단계; c) 신경 유도 배지에서 세포를 배양시키는 단계; d) (c)로부터의 세포의 단일 세포 현탁액을 얻는 단계; 및 e) 신경 증식 배지에서 섬유아세포 피더층이 없는 페트리 접시 상에서 단계 (d)로부터의 단일 세포를 배양시키는 단계에 의해 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 분화시킴으로써, 신경 줄기 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 신경 유도 배지는 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 용액(펜실베니아주 래드너에 소재한 VWR), DMEM/F12(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), L-글루타민(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), MEM 비-필수 아미노산 용액(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), N2 보충물(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)); 및 bFGF(뉴저지주 로키힐에 소재한 페프로테크(Peprotech))로 만들어진다. 추가 양태에서 L-글루타민은 2 mM로 존재하며, MEM 비-필수 아미노산 용액은 0.1 mM로 존재하고, bFGF는 신경 유도 배지에서 4 내지 20 ng/㎖로 존재한다. 다른 양태에서, 신경 증식 배지는 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 용액(펜실베니아주 래드너에 소재한 VWR), DMEM/F12(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), 스템프로(StemPro)(등록상표) 신경 보충물 (뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), 20 ng/㎖ bFGF(뉴저지주 로키힐에 소재한 페프로테크(Peprotech)) 및 20 ng/㎖ EGF(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))으로 만들어진다. 추가적인 양태에서, FGF 및 EGF는 신경 증식 배지에서 20 ng/㎖로 존재한다. 추가 양태에서, 페트리 접시는 셀스타트(CELLstart)(상표명)(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))로 코팅된다. 본 발명은 또한 이 방법에 의해 생성된 신경 줄기 세포를 제공한다. 추가적인 양태에서, 신경상피 로제트는 신경 유도 배지에서 배양의 약 1 내지 2주 후에 형성된다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 a) 적어도 2일 동안 섬유아세포의 피더층 상에서 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 성장시키는 단계; b) 적어도 1일 동안 섬유아세포 피더층 없이 페트리 접시 상에서 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 성장시키는 단계; c) 신경 유도 배지에서 세포를 배양시키는 단계; d) (c)로부터의 세포의 단일 세포 현탁액을 얻는 단계; 및 e) 신경 증식 배지에서 섬유아세포 피더층이 없는 페트리 접시 상에서 단계 (d)로부터의 단일 세포를 배양시키는 단계에 의해 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포로부터 유래된 단리된 신경 줄기 세포를 제공한다. 일 양태에서, 신경 줄기 세포는 SOX2, 네스틴, 무사시-1, TUBB3, MAP2, FOXO4, GFAP, CD113 및 CD15로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 마커를 발현시킨다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포는 적어도 27회의 계대에 대해 신경 표현형을 유지한다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포는 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능하다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 ESC로부터 상이한 패턴의 접합성을 가진다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포는 모계 게놈만을 함유한다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 인간에게 이식가능하다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 미분화되거나, 부분적으로 분화되거나 또는 완전히 분화된다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 신경 세포로 분화될 수 있다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포로부터 분화된 신경 세포는 뉴런, 신경교세포, 희돌기교세포 및 성상세포일 수 있다. 일 양태에서 분화된 신경 세포는 뉴런이다. 추가 양태에서, 뉴런은 콜린 작용성 뉴런, GABA 작용성 뉴런, 글루타메이트 작용성 뉴런, 도파민 작용성 뉴런 및 세로토닌 작용성 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보통, 난모세포는 이 단계에서 배란되고, 정자에 의해 수정된다. 정자는 활성화로 불리는 과정에서 감수분열의 완료를 개시한다. 활성화 동안 염색분체의 쌍은 분리되며, 제2 극체는 밀려 나가고, 난모세포는 염색체의 반수체 수를 유지하는데, 각각은 하나의 염색분체를 지닌다. 정자는 단일 염색분체를 지니는 완전한 2배체 세포를 만들기 위해 염색체의 다른 반수체 보체에 기여한다. 그 다음에 염색체는 제1 세포 주기 동안 DNA 합성을 통해 진행된다. 그 다음에 이들 세포는 배아로 발생된다.
그와 대조적으로, 본 명세서에 기재된 배아는 세포의 인공적 활성화, 전형적으로 수컷 또는 암컷 유래 모두의 DNA를 함유하는 포유류 난모세포 또는 난할구에 의해 발생된다. 본 발명의 배경기술에서 논의한 바와 같이, 미수정 난모세포의 인공적 활성화에 대해 다수의 방법이 문헌에서 보고되었다. 이러한 방법은 물리적 방법, 예를 들어 배양물 내 난모세포의 프리킹(pricking), 조작과 같은 기계적 방법, 냉각 및 가열과 같은 열적 방법, 반복적인 전기 펄스, 트립신, 프로나제, 히알루로니다제와 같은 효소 처리, 삼투 처리, 다가 양이온 및 칼슘운반체, 예컨대 이오노마이신 및 A23187에 의하는 것과 같은 이온 처리, 에터, 에탄올, 테트라카인, 리그노카인, 프로카인, 페노티아진와 같은 마취제, 티오리다진, 트라이플루오페라진, 플루페나진, 클로르프로마진과 같은 진정제의 사용, 사이클로헥시마이드, 퓨로마이신과 같은 단백질 합성 억제제의 사용, 인산화 억제제, 예를 들어, 스타우로스포린, 2-아미노퓨린, 싱고신 및 DMAP, 이들의 조합물과 같은 단백질 키나제 억제제의 사용뿐만 아니라 다른 방법을 포함한다.
이러한 활성화 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 본 명세서에 참조로서 포함되는 미국특허 제5,945,577호에서 논의된다.
일 실시형태에서, 중기 II의 인간 세포, 전형적으로 남성 또는 여성 유래 모두의 DNA를 포함하는 난모세포 또는 난할구는 난모세포의 인공적 활성화를 초래하기 위해 인공적으로 활성화된다.
관련된 양태에서, 활성화된 세포, 예를 들어, 2배체인 난모세포는 영양외배엽 및 내세포집단을 포함하는 배아로 발생되도록 한다. 이는 배반포 발생을 가능하게 하는 공지된 방법 및 배양 배지를 사용하여 달성될 수 있다.
자성생식적 배아가 식별가능한 영양외배엽 및 내세포집단을 생성하도록 배양된 후, 이어서 내세포집단의 세포는 요망되는 만능 세포주를 생성하기 위해 사용된다. 이는 내세포집단 또는 전체 내세포집단으로부터 유래된 세포를 분화를 억제하는 배양물에 전달함으로써 수행될 수 있다. 이는 분화를 억제하는 피더층, 예를 들어 섬유아세포 또는 출생후 인간 조직으로부터 유래된 섬유아세포와 같은 상피 세포 등 또는 LIF를 생성하는 다른 세포에 내세포집단 세포를 전달함으로써 달성될 수 있다. 다른 인자/성분은, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 조건화된 배지의 첨가[20], bFGF 및 TGF-β1(LIF가 있거나 또는 없음)[21], gp130/STAT3 경로를 활성화하는 인자[22], PI3K/Akt, PKB 경로를 활성화하는 인자[23], 뼈형성 단백질(bone morphogenetic protein: BMP) 슈퍼-패밀리의 구성원인 인자[22], 및 정규/β-카테닌 Wnt 신호처리 경로를 활성화하는 인자(예를 들어, GSK-3-특이적 억제제; [24])를 포함하는, 미분화 상태에서 세포를 유지하기 위한 적절한 배양 조건을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 관련된 양태에서, 이러한 인자는 피더 세포 및/또는 ECM 기질을 포함하는 배양 조건을 포함할 수 있다[22].
일 양태에서, 내세포집단 세포는 인간 출생 후 포피 또는 진피 섬유아세포 또는 백혈병 억제 인자를 생성하는 다른 세포 상에서, 또는 백혈병 억제 인자의 존재에서 배양된다. 관련된 양태에서, 피더 세포는 ICM으로 시딩하기 전 불활성화된다. 예를 들어, 피더 세포는 항생제를 사용하여 유사분열로 불활성화될 수 있다. 관련된 양태에서, 항생제는, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 마이토마이신 C일 수 있다.
배양은 미분화, 만능 상태에서, 장기간 동안 이론적으로 무기한으로 세포를 유지하는 조건하에 달성될 것이다. 일 실시형태에서, 난모세포는 고 O2 인장 하에 칼슘 이오노포어(ionophore)에 의해 처녀생식적으로 활성화된 다음, 난모세포를 세린-트레오닌 키나제 억제제와 저 O2 인장 하에 접촉된다. 처녀생식적으로 활성화된 난모세포로부터 얻어진 ICM은, 세포가, 예를 들어 20% O2를 포함하는 가스 혼합물을 사용하여 유지되는 경우, 고 O2 인장 하에 배양된다. 일 양태에서, 배양가능한은 배양될 수 있거나 또는 배양되기에 적합한 것을 지칭한다. 관련된 양태에서, ICM 단리는 배양이 피더 세포 상에서 수행되는 경우 배반포 배양의 4일 후 기계적으로 수행된다. 이러한 배양은 면역수술을 위한 경우와 같이, 예를 들어 동물 공급원으로부터 유래된 물질을 사용할 필요를 제거한다.
관련된 양태에서, ICM에 대한 배양 배지는 혈청이 정해진 배지에 존재하는 경우, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 인간 제대 혈청을 포함하는 비-동물 혈청으로 보충된다(예를 들어, 덴마크에 소재한 메디컬트 에이/에스(MediCult A/S)로부터 입수가능한 IVF; 스웨덴에 소재한 비트로라이프(Vitrolife); 또는 플로리다주 베로 비치에 소재한 잔더 IVF 인코포레이티드(Zander IVF, Inc.)). 다른 양태에서, 제공된 바와 같은 배지 및 과정은 동물 생성물이 없다. 관련된 양태에서, 동물 생성물은 혈청, 인터페론, 케모카인, 사이토카인, 호르몬 및 성장인자를 포함하는 해당 생성물인데, 이들은 비-인간 공급원으로부터 유래된다.
본 발명에 의해 생성되는 세포의 만능 상태는 다양한 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 세포는 특징적 ES 세포 마커의 존재 또는 부재에 대해 시험될 수 있다. 인간 ES 세포의 경우에, 이러한 마커의 예는 상기 확인하였고, SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-60 및 TRA-1-81를 포함하며, 당업계에 공지되어 있다.
또한, 만능성은 세포를 적합한 동물, 예를 들어 SCID 마우스에 주입하고, 분화된 세포 및 조직의 생성을 관찰함으로써 확인될 수 있다. 만능성을 확인하는 또 다른 방법은 키메라 동물을 만들기 위해 대상 만능 세포를 사용하는 것과 상이한 세포 유형에 도입된 세포의 분포를 관찰하는 것이다. 키메라 동물의 생성을 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 본 명세서에 참조로서 포함된 미국특허 제6,642,433호에 기재된다.
만능성을 확인하기 위한 또 다른 방법은 분화가 바람직한 조건(예를 들어, 섬유아세포 피더층의 제거) 하에서 배양될 때 배상체 및 다른 분화된 세포 유형으로 ES 세포 분화를 관찰하는 것이다. 이 방법이 이용되었고, 이는 대상 만능 세포가 조직 배양물 내에서 배상체 및 상이한 분화 세포 유형을 생기게 하는 것을 확인하였다.
얻어진 만능 세포 및 세포주, 바람직하게는 완전하게 암컷 유래의 DNA로부터 유래된 인간 만능 세포 및 세포주는 수많은 치료적 및 진단적 용도를 가진다. 이러한 만능 세포는 수많은 질병 상태의 치료에서 세포 이식 치료 또는 (유전적으로 변형된다면)유전자 치료를 위해 사용될 수 있다.
이에 대해서, 마우스 배아 줄기(ES) 세포는 거의 임의의 세포 유형, 예를 들어 신경 줄기 세포로 분화될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 생성된 인간 만능(ES) 세포는 유사한 분화 능력을 소유하여야 한다. 본 발명에 따른 만능 세포는 공지된 방법에 따라 요망되는 세포 유형을 얻기 위해 분화되도록 유도될 것이다. 예를 들어, 본 발명에 따라 생성된 인간 ES 세포는 분화 배지에서 및 세포 분화를 제공하는 조건 하에서 이러한 세포를 배양시킴으로써 신경 줄기 세포, 조혈모세포, 근육 세포, 심근 세포, 간 세포, 도세포, 망막 세포, 연골세포, 상피 세포, 요로 세포 등으로 분화되도록 유도될 수 있다. ES 세포의 분화를 야기하는 배지 및 방법은 적합한 배양 조건과 같이 당업계에 공지되어 있다.
예를 들어, 문헌[Palacios et al.][25]은 레티노산이 없는 현탁 배양물 배지에서 초기에 이러한 세포의 응집물을 배양시키는 단계, 다음에 레티노산을 함유하는 동일 배지에서 배양시키는 단계 후 세포 부착을 제공하는 기질에 세포 응집물의 이동 단계를 포함하는 유도 과정을 줄기 세포에 실시하는 것에 의한 배양 세포로부터 조혈모세포의 생성을 교시한다.
게다가, 문헌[Pedersen et al.][26]은 특히 조혈 세포, 근육, 심근, 신경 세포를 포함하는 다양한 분화된 세포 유형을 생성하도록 배아 줄기 세포의 시험관내 분화를 위한 방법을 개시하는 수많은 논문을 언급하는 종설논문이다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 신경 분화 배지에서 신경 줄기 세포를 배양시킴으로써 신경 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 신경 분화 배지는 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신(펜실베니아주 래드너에 소재한 VWR); DMEM/F12 (뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)); 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)); 및 스템프로(StemPro)(등록상표) 신경 보충물(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))을 함유한다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 뉴런, 신경교세포, 희돌기교세포 및 성상세포로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 세포로 분화된다. 본 발명은 또한 신경 줄기 세포로부터 분화된 신경 세포를 제공한다. 일 양태에서, 신경 줄기 세포는 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포로부터 생성된다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포는 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능하다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 ESC로부터 상이한 패턴의 접합성을 가진다. 다른 양태에서, 신경 줄기 세포는 모계 게놈만을 함유한다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 인간에게 이식가능하다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 미분화되거나, 부분적으로 분화되거나 또는 완전히 분화된다. 일 양태에서 분화된 신경 세포는 뉴런이다. 추가 양태에서, 뉴런은 콜린 작용성 뉴런, GABA 작용성 뉴런, 글루타메이트 작용성 뉴런, 도파민 작용성 뉴런 및 세로토닌 작용성 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가로, 문헌[Bain et al.][27]은 신경 특성을 소유하는 신경 세포를 생성하기 위한 배아 줄기 세포의 시험관내 분화를 교시한다. 이들 참고문헌은 배아 또는 줄기 세포로부터 분화된 세포를 얻는 것에 대한 대표적인 보고된 방법이다. 이들 참고문헌 및 특히 배아 줄기 세포를 분화하기 위한 방법에 관한 그것의 개시내용은 본 명세서에 그것의 전문이 참조로서 포함된다. 따라서, 공지된 방법 및 배양 배지를 사용하여, 당업자라면 유전적으로 유전자 조작되거나 또는 유전자 이식 ES 세포를 포함하는 대상 ES 세포를 배양시켜, 요망되는 분화 세포 유형, 예를 들어 신경 세포, 근육 세포, 조혈 세포 등을 얻을 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 만능 세포는 임의의 요망되는 분화 세포 유형을 얻기 위해 사용될 수 있다. 분화된 인간 세포의 치료적 용법은 비견할 곳이 없다. 예를 들어, 인간 조혈 줄기 세포는 골수 이식이 필요한 의학적 치료에 사용될 수 있다. 이러한 과정은 다수의 질병, 예를 들어 난소암 및 백혈병과 같은 말기암뿐만 아니라 AIDS와 같이 면역계를 손상시키는 질병을 치료하기 위해 사용된다. 조혈 줄기 세포는, 남성 또는 여성 암으로부터 유래된 남성 또는 여성 DNA, 또는 제핵 난모세포를 지니는 AIDS 환자를 포함시키는 단계, 상기 기재한 바와 같은 만능 세포를 얻는 단계, 및 조혈 줄기 세포가 얻어질 때까지 분화가 바람직한 조건 하에 이러한 세포를 배양시키는 단계에 의해 얻어질 수 있다. 이러한 조혈 세포는 암 및 AIDS를 포함하는 질병의 치료에서 사용될 수 있다.
대안적으로, 대상 만능 세포는 신경 세포주를 생성하는 분화 조건 하에 이러한 세포를 배양함으로써 신경 장애를 지니는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 인간 신경 세포의 이식에 의해 치료될 수 있는 구체적 질병은, 예로서, 특히 파킨슨병, 알츠하이머병, ALS 및 뇌성마비를 포함한다. 파킨슨병의 구체적 경우에, 이식된 태아 뇌 신경 세포는 주변 세포와 적절한 연접을 만들고, 도파민을 생성한다는 것이 입증되었다. 이는 파킨슨병 증상의 장기간 역전을 초래할 수 있다.
줄기 세포 치료는 질병 또는 손상을 치료하기 위해서 손상 조직 내로 새로운 세포를 도입하는 개입 전략의 유형이다. 변화가능한 정도로 분화 능력을 지니는 후속의 발생을 만들며, 자기-재생하는 줄기 세포의 능력은 최소한 거부 및 부작용의 위험으로 신체 내에서 질병 영역 및 손상된 영역을 잠재적으로 대신할 수 있는 조직의 발생에 대해 상당한 퍼텐셜을 제공한다. 전형적으로, 줄기 세포는 치료를 위해 요망되는 곳에 이식된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 난모세포로부터 단위생식적으로 유래된 신경 줄기 세포를 사용하여 신경성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 신경 장애는 신체 신경계의 장애이다. 뇌, 척수 또는 다른 신경에서 구조적, 생화학적 또는 전기적 비정상은 증상의 범위를 만들 수 있다. 증상의 예는, 마비, 근력 저하, 불량한 협응능력, 감각 상실, 발작, 혼동, 통증 및 의식의 변경된 수준을 포함한다. 다수의 인식된 신경장애가 있으며, 일부는 상대적으로 흔하지만, 다수는 드물다. 이들은 신경학적 시험에 의해 평가될 수 있으며, 신경적 및 임상적 신경 심리학의 전문 분야 내에서 연구되고 처리될 수 있다.
일 양태에서, 신경성 장애는 뇌전증, 경련, 신경독성 손상, 저산소증, 무산소증, 허혈, 뇌졸중, 뇌혈관 발작, 뇌 또는 척수 외상, 심근경색, 신체의 외상, 익수, 질식, 주산기 가사, 저혈당증 사건, 신경퇴화, 알츠하이머병, 노인성 치매, 근위축성 측색 경화증, 다발성 경화증, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다운 증후군, 코르사코프병, 정신 분열증, AIDS 치매, 다발-뇌경색성 치매, 빈스방거 치매, 신경 손상, 발작, 화학 독성, 중독, 몰핀 내성, 아편 내성, 오피오이드 내성, 바비 튜레이트 내성, 급성 및 만성 통증, 편두통, 불안, 주우울증, 조울증, 강박장애, 정신 분열증 및 기분 장애, 양극성 장애, 단극성 우울증, 기분부전장애, 계절성 정서 장애, 근육긴장이상 또는 다른 운동 장애, 수면 장애, 근육이완 및 요실금으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 이러한 치료가 필요한 환자에게 이식된다.
대상 방법의 한 목적은 본질적으로 만능의 무제한적 공급, 분화된 신경 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있는 인간 세포를 제공하는 것이다. 인간 배아 줄기 세포 및 불임 치료 후 남아있는 배반포로부터 유래되거나 또는 NT를 사용하여 만들어진 그것의 분화된 자손은 태생의 세포 이식 치료에서 사용될 때 수용인의 면역계에 의해 거부될 가능성이 있을 것이다. 처녀생식적으로 유래된 줄기 세포는 현존하는 이식 방법과 관련된 상당한 문제, 즉, 난모세포 공여자에 대한 숙주대이식편 또는 이식대숙주 거부 때문에 생길 수 있는 이식 조직의 거부반응을 완화시킬 수 있는 분화된 세포를 초래하여야 한다. 통상적으로, 거부반응은 사이클로스포린과 같은 거부방지 약물의 투여에 의해 예방되거나 또는 감소된다. 그러나, 이러한 약물은 상당한 부작용, 예를 들어 면역억제, 발암성 특성을 가질 뿐만 아니라 매우 비싸지게 된다. 개시된 방법에 의해 생성된 세포는 난모 세포 공여자에 대해 거부방지 약물에 대한 필요를 제거하거나 또는 적어도 크게 감소시켜야 한다.
대상 발명의 다른 목적은 난모세포 공여자 패밀리의 구성원에 대한 이질유전자 이식에 적합한 분화된 신경 세포를 만들기 위해 사용될 수 있는 만능의 인간 세포의 본질적으로 무제한적인 공급을 제공하는 것이다. 세포는 난모세포 공여자의 직접적 가족 구성원의 세포와 면역학적으로 및 유전적으로 유사할 것이며, 따라서 공여자 가족 구성원에 의해 거부될 가능성이 더 적다.
예를 들어, 뇌 유래 성장 인자를 암호화하는 유전자는 본 발명에 따라 생성된 인간 만능 세포에 도입될 수 있으며, 세포는 신경 세포로 분화되고, 신경 세포의 손실을 지연시키기 위해 파킨슨 환자에게 이러한 질병 동안 세포가 이식된다.
일 실시형태에서, 신경 줄기 세포는 분화 및/또는 증식의 제어를 위해 기계적 지지체가 없을 때(즉, 3-D 스캐폴딩이 없을 때) 시험관 내에서 생성된다는 것이 개시된다. 일 양태에서, 신경 줄기 세포는, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 시험관내에서 마지막에 분화된 신경세포를 포함하는 것으로 개시된다.
다른 실시형태에서, 신경 줄기 세포는, 병리 유전적으로 활성화된 난모세포로부터 유도된 줄기 세포가 인공적으로 조작되어 신경 줄기 세포를 생성하는 경우, 단위생식적으로 활성화된 인간 난모세포로부터 생성된다.
일 양태에서, 신경 줄기 세포는 혈청 대체물(M/SR), 플라스모네이트, 및 DNA 억제제로 처리된 섬유아세포 피더층 상에서 gp130/STAT 경로 및/또는 MAP 키나제 경로를 활성화하는 적어도 하나의 마이토겐을 포함하는 배지에서 단위생식적으로 활성화된 난모세포로부터 단리된 줄기 세포를 배양하는 단계, M/SRP의 1/2 용적이 근처의 컨플류언스(confluence) 세포가 색소침착 및 반구형의 외관을 진행할 때까지 주기적으로 M/SR로 대체되는 경우 근처의 컨플류언스에 대해 첨가된 마이토겐 없이 플라스모네이트를 포함하는 M/SR에서(M/SRP) 마이토겐 처리된 세포를 배양하는 단계, 및 M/SR의 1/2 용적이 부유 세포 덩어리가 발생될 때까지 주기적으로 M/SR로 대체되는 경우 젤라틴 코팅된 기질에 M/SR 내 색소침착된/반구형의 세포를 전달하는 단계를 포함하여 생성된다. 관련된 양태에서, M/SR은 KO Hi 글루코스 DMEM, 스트렙토마이신, 비-필수 아미노산, 글루타맥스(Glutamax)-I, β-머캅토에탄올 및 혈청 대체물을 포함한다. 다른 관련된 양태에서, M/SRP는 M/SR 및 플라스모네이트의 성분을 포함한다.
본 발명은 NSC가 hpSC로부터 효율적으로 유래될 수 있다는 것을 입증하는 한 양태에 관한 것이다. 이 목적을 위해, 본 발명자들은 부착 모델[11]을 선택하였는데, 배상체를 사용하는 프로토콜과 비교하여 신경외배열의 더 균일하고 동시 발생적인 형성을 제공하기 때문이다[12]. 본래의 프로토콜[11]과 달리, 피더 세포는 신경 유도를 위해 줄기 세포 콜로니를 성장시키는 것에 사용되지 않았다. 본 발명자들의 연구에서, 셀스타트(CELLstart) 상에서 성장시킨 hpSC 콜로니에서 NEP 로제트의 발생은 ES-배지를 신경 유도를 위한 배지로 교체 후 1주일 내에 일어났다. hpSC로부터 얻은 NEP 로제트는 잘 형성된 내강을 가졌고, 적절한 신경 마커 세트를 발현시켰는데, 이는 신경상피의 충분한 형성을 위한 증거를 제공한다. SOX1 및 SOX3의 증가된 발현을 hpSC-유래 NEP 로제트에서 관찰한 반면, OCT4 하향-조절과 관련될 수 있는 SOX2 발현의 약간의 감소를 발현하였다(도 1)는 것이 주목할 만하다[13].
phNSC의 특성을 hESC H9로부터 유래된 hNSC와 비교하였다. NSC에 특이적인 주요 유전자의 전사 활성은 세포주 둘 다에 대해 비슷하였다. 이것에도 불구하고, SOXB1 유전자의 발현은 phNSC 및 hNSC와 상이하였다(도 2). 신경 전구체의 유지에서 그리고 그것의 분화 능력의 제한에서 SOXB1 유전자의 정확한 역할은 여전히 불명확하게 남아있다. 이들 유전자의 기능은 불필요한 것으로 나타났으며[13, 14], 따라서 NSC의 특성을 유지하는 것에서, SOXB1 유전자는 서로 상호 간에 보상되는 것이 가능하다.
대부분의 phNSC는 신경외배엽 CD113 및 CD15의 표면 마커를 발현시켰지만, 이 발현은 균일하지 않았다. 문헌[Sun et al.][15]은 미분화 인간 및 뮤린 NSC가 이종성 CD113 및 CD15 집단을 나타낼 수 있었고, 마커의 발현은 세포 주기의 단계에 의존한다. 이것에도 불구하고, CD113 음성 세포는 그것의 증식 및 신경성 퍼텐셜을 유지할 수 있다[15].
증식 성장 인자를 지지하기 위해, bFGF가 필요하지만, 이는 내인성 SHH를 억제하는데, 이는 뉴런으로 분화되고, NSC의 신경능(neural crest) 외배엽성중배엽(ectomesenchymal) 세포로 변형을 촉진하는 능력의 빠른 상실을 야기한다[16]. 신경관 마커 유전자 FOXD3 및 SNAI2, 및 중배엽 마커 ACTA1의 발현 수준은 phNSC 에서 27회까지의 계대로 높지 않았고, hNSC와 비교하여 훨씬 더 낮았다(도 2). 이들 데이터는 hNSC의 외배엽성중배엽 세포로 대규모 변형이 없음을 나타낸다.
성장 인자 없이 배지에서 자발적 분화로부터 초래되어, 세포 집단의 상당 부분이 phNSC의 경우에서뿐만 아니라 hNSC의 경우에서 뉴런에 의해 나타났다. 신경 분화는 Tuj1(튜뷸린 βIII)에 대해 양성 면역 세포 화학적 염색에 의해 및 TUBB3 및 MAP2 유전자의 높은 전사 활성에 의해 확인되었는데, 이는 qRT-PCR 분석에 의해 나타났다(도 3). 특이적 희돌기교세포 마커 FOXO4 및 성상세포 마커 GFAP의 전사 활성은 분화 세포 중에서 신경교 유도체의 존재를 나타내었다. 따라서 본 발명자들은 얻은 phNSC가 신경 유도체의 모두 3가지 주요 유형의 전구체로서 고려될 수 있다는 결론을 내렸다.
따라서, 본 발명은 만능 hpSC가 NSC의 양호한 공급원으로 작용할 수 있다는 것을 입증하였다. 얻은 phNSC는 상대적으로 장기간의 증식이 가능할 수 있는 반면, 그것의 신경발생 퍼텐셜 및 동결보존 및 추가 실행에 대해 충분한 양의 세포를 공급하는 능력은 유지되었다.
다능 신경 전구체 세포(NPC)는 동형접합 또는 이형접합 중 하나의 단위생식의 줄기 세포로부터 유래된 신경외배엽으로부터 유래되었다. 단위생식적으로 유래된 NPC는 중뇌 도파민 작용성 뉴런(DA)과 같은 뉴런으로 분화된다. 이들 DA 뉴런은 중뇌 표현형을 나타내며, 면역 세포 화학 및 RT-PCR에 의해 측정되는 바와 같이 TH, GIRK2, PITX3, NURRl, LMXA1 및 EN1을 발현시킨다. 선행기술로부터 알 수 있는 바와 같이, 도파민 작용성 뉴런의 주요 기능은 도파민을 방출시키는 것이다. 신체 내 도파민의 주요 작용은 보상-구동 학습이다. hpNPC로부터 유래된 DA 뉴런은 또한 LC/MS/MS에 의해 결정되는 바와 같이 도파민을 방출시킨다. 전체 세포 전기생리학은 단위생식적으로 유래된 도파민 작용성 뉴런이 작동 퍼텐셜을 촉발시킬 수 있다는 것을 증명하였다.
일 실시형태에서, 본 발명은: a) 피더가 없는 조건에서 인간 만능 줄기 세포의 배양 단계; b) 신경 유도 배지에 대한 상기 세포의 노출 단계; c) 부분적으로 분화된 세포의 기계적 단리 단계; 및 d) 성숙까지 상기 세포의 추가적인 확장 및 유지 단계에 의해 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 분화시킴으로써 신경 줄기 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 신경 유도 배지는: a) 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 용액; b) DMEM/F12; c) MEM 비-필수 아미노산 용액; d) L-글루타민; e) N2 보충물; 및 f) bFGF를 포함한다. 추가 양태에서, L-글루타민은 2 mM로 존재하며, MEM 비-필수 아미노산 용액은 0.1 mM로 존재하고, bFGF는 신경 유도 배지에서 4 내지 20 ng/㎖로 존재한다. 다른 양태에서, 신경 증식 배지는: a) 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신; b) DMEM/F12; e) 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I; d) 스템프로(StemPro)(등록상표) 신경 보충물; e) bFGF; 및 f) EGF를 포함한다. 추가적인 양태에서, FGF 및 EGF는 신경 증식 배지에서 20 ng/㎖로 존재한다. 추가적인 양태에서, 피더가 없는 조건은, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 셀스타트, 매트리젤, 라미닌, 젤라틴, 피브로넥틴을 포함하는 ECM 기질을 이용한다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 생성된 신경 줄기 세포를 제공한다. 추가 양태에서, 신경상피 로제트는 1 내지 2주 후에 형성된다.
추가적인 실시형태에서, 본 발명은 a) 피더가 없는 조건에서 인간 만능 줄기 세포의 배양 단계; b) 신경 유도 배지에 대한 상기 세포의 노출 단계; c) 부분적으로 분화된 세포의 기계적 단리 단계; 및 d) 성숙까지 상기 세포의 추가적인 확장 및 유지 단계를 포함하는 방법을 사용하여 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포로부터 유래된 단리된 신경 줄기 세포를 제공한다. 일 양태에서, 세포는 SOXB1-패밀리 NES, MSH-1, CXCR4, CCND1, LHX2, PAX6, GAP43으로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 줄기 세포는 마커를 발현시킨다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 적어도 30회의 계대에 대해 신경 표현형을 유지한다. 일 양태에서, 신경 줄기 세포는 신경 세포로 분화될 수 있다. 추가적인 양태에서, 신경 세포는 뉴런, 성상세포 및 희돌기교세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 양태에서 분화된 신경 세포는 뉴런이다. 추가 양태에서, 뉴런은 콜린 작용성 뉴런, GABA 작용성 뉴런, 글루타메이트 작용성 뉴런, 도파민 작용성 뉴런 및 세로토닌 작용성 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 난모세포로부터 단위생식적으로 유래된 신경 줄기 세포를 사용하여 신경성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 신경성 장애는 뇌전증, 경련, 신경독성 손상, 허혈, 뇌졸중, 뇌혈관 발작, 뇌 또는 척수 외상, 신체의 외상, 알츠하이머병, 노인성 치매, 근위축성 측색 경화증, 다발성 경화증, 파킨슨병, 헌팅턴병, 정신 분열증, 신경 손상, 편두통, 불안, 주우울증, 조울증, 강박장애, 정신 분열증 및 기분 장애, 양극성 장애, 단극성 우울증, 근육긴장이상 또는 다른 운동 장애, 수면 장애, 근육이완으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 양태에서, 신경 줄기 세포는 이러한 치료가 필요한 환자에게 이식된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 신경 줄기 세포의 분화 방법을 제공하며, 해당 방법은 신경 분화 배지에서 신경 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 신경 분화 배지는: a) 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신; b) DMEM/F12; c) 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I; 및 d) 스템프로(StemPro)(등록상표) 신경 보충물을 포함한다. 추가적인 양태에서, 신경 줄기 세포는 뉴런, 희돌기교세포 및 성상세포로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 세포로 분화된다. 일 양태에서 분화된 신경 세포는 뉴런이다. 추가 양태에서, 뉴런은 콜린 작용성 뉴런, GABA 작용성 뉴런, 글루타메이트 작용성 뉴런, 도파민 작용성 뉴런 및 세로토닌 작용성 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명은 또한 이 방법에 의해 생성된 분화 세포를 제공한다. 일 양태에서, 세포는 단위생식적으로 활성화된 난모세포로부터 분화된다.
다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도이며 제한하는 것이 아니다.
실시예 1
인간 처녀생식의 배아 줄기 세포의 생성
재료 및 방법
공여자는 비용 지불 없이 자발적으로 난소 및 혈액(DNA 분석을 위함)을 기증하였다. 공여자는 포괄적인 사전동의서에 서명하였고, 모든 공여 물질이 연구를 위해 사용되며, 생식 목적을 위한 것이 아니라는 것을 고지받았다. 배란 자극 전, 난모세포 공여자는 인간 세포, 조직 및 세포 생성물 및 조직계 생성물의 공여자에 대한 FDA 적격 결정 가이드라인(Food and Drug Administration. (Draft) Guidance for Industry: Eligibility Determination for Donors of Human Cells, Tissues, and Cellular and Tissue Based Products (HCT/Ps) 2004년 5월 발행) 및 러시아 보건부(Russian Public Health Ministry)의 규정 N 67(O2.26.03)에 따라 적합성에 대한 의학적 시험을 받았다. 이는 X-레이, 혈액 및 소변 분석 및 간 기능 검사를 포함하였다. 또한 매독, HIV, HBV 및 HCV에 대해 공여자를 스크리닝하였다.
대상 공여자에서 과배란 처리를 만들기 위한 표준 호르몬 자극을 사용하여 난모세포를 얻었다. 각각의 공여자 난소는 그들의 생리 주기의 제3일 내지 제13일에 FSH에 의해 배란 자극을 받았다. 전체 FSh의 1500IU가 주어졌다. 공여자 생리 주기의 제10일 내지 제14일에, 고나도리베린(gonadoliberin) 길항물질 오가루트란(Orgalutran)(네덜란드에 소재한 오가논(Organon))을 0.25 ㎎/일로 주사하였다. 공여자 생리 주기의 제12일 내지 제14일에, 매일 75IU FSH + 75IU LH(메노푸어(Menopur), 독일에 소재한 페링 게엠바하(Ferring GmbH))의 주사를 제공하였다. 초음파 검사가 직경 18 내지 20㎜에 난포를 나타낸다면, hGC(코라곤(Choragon), 독일에 소재한 페링 게엠바하(Ferring GmbH))의 1회 8000IU 용량을 공여자 생리 주기의 제14일에 투여하였다. 대략 제16일에 hCG 주사 후 35시간에 경질(Trans-vaginal) 천공을 수행하였다. 난포액을 초음파-감시하 세침흡입(needle aspiration)에 의해 마취시킨 공여자의 동난포로부터 멸균 튜브 내로 수집하였다.
난구 난모세포 복합체(Cumulus oocyte complexe: COC)를 난포액으로부터 뽑았고, 관류액(Flushing Medium)(메디컬트(MediCult))에서 세척한 다음, 37℃ 습한 분위기에서 20% O2, 5% CO2 중에서 2시간 동안 액체 파라핀(메디컬트(MediCult))을 씌운 일반 IVF 배지(Universal IVF medium)(메디컬트(MediCult), 표 1 참조)에서 인큐베이션시켰다.
IVF 배지
조성
염화칼슘
EDTA
글루코스
인간 혈청 알부민
황산마그네슘
페니실린 G
염화칼륨
인산이수소칼륨
중탄산나트륨
염화나트륨
락트산나트륨
피루브산나트륨
물
활성화 전, 난구-난모세포 복합체(COC)를 신비트로 하이아다제(Syn Vitro Hyadase)(메디컬트(MediCult))로 처리하여, 난구 세포를 제거한 후 30분 동안 파라핀을 씌운 일반 IVF 배지에서 인큐베이션시켰다.
이 시점으로부터 나아가서, 난모세포 및 배아의 배양을 이노마이신 처리를 제외하고, O2-감소 기체 혼합물(90% N2 + 5% O2 + 5% CO2)을 사용하여, 37℃에서 습한 분위기에서 수행하였다. 난모세포를 20% O2, 5% CO2의 기체 환경의 37℃에서 CO2 인큐베이터에서 5분 동안 5μM 이노마이신 중에서 인큐베이션에 의해 활성화한 다음, IVF 배지에서 4시간 동안 1mM 6-다이메틸아미노퓨린(DMAP), 37℃에서 90% N2, 5% O2 및 5% CO2의 기체 환경에서 파라핀을 씌워서 배양시켰다. 액체 파라핀 오일(덴마크에 소재한 메디컬트(MediCult), A/S)로 덮은 500㎕의 배지 중에서 4-웰 플레이트(덴마크에 소재한 눈클론(Nunclon), A/S)에서 활성화 및 배양을 수행하였다.
활성화된 난모세포를 5% O2, 5% CO2 및 90% N2를 포함하는 기체 환경 중의 IVF 배지에서 배양시켰고, 활성화된 난모세포로부터 만든 배아를 동일 기체 혼합물 중에서 배양시켰다.
1AA 또는 2AA(메릴랜드주 락빌에 소재한 셰이디 그로브 퍼틸리티(Shady Grove Fertility Center) 및 조지아주 아틀랜타에 소재한 조지아 생식전문가 협회(Georgia Reproductive Specialists))의 배반포 스코어링 변형에서 내세포집단(ICM)을 함유하는 완전히 확장된 배반포가 관찰될 때까지 활성화된 난모세포를 상기 조건 하에 IVF에서 인큐베이션시켰다.
0.5% 프로나제(세인트 루이스에 소재한 시그마(Sigma)) 처리에 의해 투명대를 제거하였다. 배반포를 인간 비장 세포에 말 항혈청과 함께 인큐베이션시킨 경우, 배반포로부터의 ICM을 면역-수술에 의해 단리시킨 후 기니아피그 보체에 노출시켰다. 영양외배엽 세포를 처리한 배반포를 조심해서 피펫팅함으로써 ICM으로부터 제거하였다.
전체 배반포로부터 phESC의 유도체화 후, 배반포를 phESC 의 배양을 위해 설계한 배지 내 피더층에 두었다(즉, 4ng/㎖ hrbFGF, 5ng/㎖ hrLIF 및 10% 인간 제대혈청으로 보충한 비트로HES(VitroHES)(비트로라이프(Vitrolife)). 배반포가 부착되고, 영양세포층 세포가 확산되었을 때, ICM은 눈에 보이게 되었다. 3 내지 4일의 추가 배양을 통해, ICM을 미세하게 뽑은 유리 피펫을 사용하여 영양외배엽 결과물로부터 ICM의 기계적 슬라이싱을 통해 단리시켰다. 추가로, IMC 세포를 37℃에서 5% CO2 및 20% O2 내 96-웰 플레이트에서 10% 인간 제대혈청, 5 ng/㎖ 인간 재조합 LIF(캘리포니아주 테메큘라에 소재한 케미콘 인터내셔널 인코포레이티드(Chemicon Int'l, Inc.)), 4 ng/㎖ 재조합 인간 FGF(캘리포니아주 테메큘라에 소재한 케미콘 인터내셔널 인코포레이티드(Chemicon Int'l, Inc.)) 및 페니실린-스트렙토마이신(100U/100㎍)로 보충한 비트로HES(VITROHES)(상표명) 배지(예를 들어, DMEM/고 글루코스 배지, 스웨덴에 소재한 비트로라이프(VitroLife))에서 유사분열로 불활성화된 출생 후 인간 진피 섬유아세포의 피더 세포층 상에서 배양시켰다. 이 기체 혼합물을 줄기 세포를 배양하기 위해 사용하였다. 비-동물 물질을 사용하여 인간 섬유아세포 배양물을 만들었다. 섬유아세포의 활성화에서, 10 ㎍/㎖ 미토마이신 C(미주리주 세인트 루이스에 소재한 시그마(Sigma))를 사용하여 3시간 동안 수행하였다.
별개의 방법에서, 인간 비장 세포에 말 항혈청과 함께 배반포를 인큐베이션시킴으로써 면역-수술을 수행한 다음 토끼 보체에 노출시켰다. 영양외배엽 세포를 처리한 배반포의 조심스러운 피펫팅을 통해 ICM으로부터 제거하였다. 단리시킨 ICM의 추가 배양을 인간 제대혈청을 함유하는 배지를 사용하여 유래된 유전적으로 관련없는 개체(부모 동의에 의함)로부터 얻은 신생아 인간 피부 섬유아세포(HSF)의 피더층 상에서 수행하였다. HSF 피더층은 미토마이신 C를 사용하여 유사 분열로 불활성화되었다.
HSF의 배양을 위한 배지는 90% DMEM(L-글루타민(인비트로전(Invitrogen)을 지니는 고 글루코스), 10% 인간 제대혈청 및 페니실린-스트렙토마이신(100U/100㎎) 인비트로전(Invitrogen))으로 이루어진다.
ICM 및 phESC의 배양을 위해, 4ng/㎖ hrbFGF, 5ng/㎖ hrLIF 및 10% 인간 제대혈청으로 보충한 비트로HES(VitroHES)(비트로라이프(Vitrolife))를 사용하였다. ICM을 신선한 피더층 상에서 기계적으로 플레이팅시켰고, 3 내지 4일 동안 배양시켰다. 제1 콜로니를 기계적으로 절단하였고, 5일의 배양 후 재플레이팅하였다. 모든 후속적인 계대를 배양의 5일 내지 6일 후 만들었다. 초기 계대에 대해, 콜로니를 클럼프(clump)로 기계적으로 분할하였고, 재플레이팅시켰다. phESC의 추가적인 계대를 콜라게나제 IV 처리 및 기계적 해리에 의해 수행하였다. phESC의 전파를 습한 분위기에서 37℃, 5% CO2로 수행하였다.
난모세포 활성화
초기 4개의 공여자로부터, 활성화된 난모세포를 5% O2, 5% CO2 및 90% N2를 포함하는 기체 환경 중의 IVF 배지에서 오(5) 일에 걸쳐 배양시켰다. 표 2는 활성화된 난모세포의 성숙 진행을 나타낸다. 각각의 난모세포를 4-웰 플레이트에서 분리시켰다.
배양시킨 활성화된 난모세포*
제1일 제2일 제3일 제5일
N1 1 전핵
(pronucleus: pn)
1 극체(pb)		 2 할구(blastomer: bl) 동일,
단편(fragmentation:fr)-0%		 4 bl 동일,

fr-2%		 1 상실배,

fr-15%
N2 0 pn,
1 pb		 4 bl 동일하지 않음,
fr-4%		 5 bl 동일하지 않음,
fr-20%		 4 bl 동일하지 않음,
fr-40%
N3 1 pn,
1 pb		 2 bl 동일하지 않음,
fr-0%		 6 bl 동일,
fr-0%		 초기 배반포
N4 1 pn,
1 pb		 4 bl 동일,
fr-0%		 4 bl 동일,
fr-20%		 양호한 ICM 1AA로 완전히 확정된 배반포
*세포를 제1일에 M1 배지(메디컬트(MediCult)에서 그리고 제2일 내지 제5일에 M2 배지에서 인큐베이션시켰다. 배지는 매일 변하였다. M1 및 M2는 인간 혈청 알부민, 글루코스 및 유래된 대사산물, 생리적 염, 필수 아미노산, 비-필수 아미노산, 비타민, 뉴클레오타이드, 중탄산나트륨, 스트렙토마이신(40㎎/ℓ), 페니실린(40,000IU/ℓ) 및 페놀 레드를 함유한다.
내세포집단을 N4로부터 분리시켰고, 상기 약술한 바와 같이 인간 섬유아세포 피더 세포에 옮겼다. N1 및 N2는 제6일에 축퇴되었다. 추가로, 제6일에, N3은 ICM 2AB에 의해 완전히 확장된 배반포를 생성하였다. 그 다음에 N3을 제6일에 인간 섬유아세포 피더 세포에 옮겼다. N4로부터의 ICM은 변하지 않았다. N3을 사용하여 줄기 세포를 단리시켰다.
ICM 세포는 5% CO2 및 95% N2를 포함하는 기체 환경의 나이트로HES(NitroHES) 배지에서 사십오(45)일에 걸쳐 배양시켰다. 표 2a는 N3 ICM 세포 배양의 진행을 나타낸다.
(표 2a)
Figure pct00001
줄기 세포 단리
5명의 공여자로부터의 난모세포로부터, 메디컬트(MediCult) 배지의 사용 후 감소된 산소 하에 배양으로 배양의 제5일 또는 제6일에 23개의 배반포를 생성시켰다. 배반포 중 11개는 시각적인 ICM을 가졌다(표 3).
반수성개체 및 단위생식의 배아 줄기 세포주의 발생
공여자
번호		 채취한
난모세포		 기증된
난모세포		 정상적으로 활성화된 난모세포 만들어진 반수성개체 유도된 배반포 발생된
계통
ICM과 함께 눈에 보이는 ICM 없음
1 8 4 4 4 2 - phESC-1
면역수술
2 15 8 8 8 3 3 전체 배반포로부터
phESC-3
phESC-4
phESC-5 모두
3 27 14 121 112 3 2 전체 배반포로부터 phESC-6
4 22 11 103 10 2 3 전체 배반포로부터 phESC-7
5 20 94 7 7 1 4 발생된 세포주 없음
1-2개의 난모세포는 활성화되지 않았다; 2-1개의 난모세포는 활성화 후 축퇴되었다; 3-1개의 난모세포는 활성화되지 않았다; 4-2개의 난모세포는 중기 I에 있었고, 폐기시켰다.
이들 결과는 단위생식적으로 활성화된 난모세포로부터 배반포의 형성에서 대략 57.5%의 성공률을 나타낸다.
실시예 2
인간 단위생식 줄기 세포의 유지
상기 기재한 것과 유사한 방법으로 생성한 인간 단위생식 줄기 세포주, 즉, phESC-1, phESC-3[1] 및 hpSC-Hhom-4[2]를 KDMEM/F12 인비트로젠(Invitrogen), 15% KSR(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), 2mM L-글루타민(GlutaMAX-I, Invitrogen Grand Island, NY), 0.1mM MEM 비필수 아미노산(Invitrogen), 0.1mM β-머캅토에탄올(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), 페니실린/스트렙토마이신/암포테리신 B(100 U/100 ㎍/25 ng)(MP 바이오케미컬스(Biomedicals)) 및 5 ng/㎖ bFGF(페프로테크(Peprotech))로 보충한 ES-배지 내 미토마이신-C 불활성화 마우스 배아 섬유아세포(밀리포어(Millipore)) 피더 상에서 유지하였다. 세포를 1:4 또는 1:6의 분할비로 5 내지 7일마다 디스파제 또는 콜라게나제 IV(둘 다 뉴욕주 글랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))로 계대시켰다. 본 발명자의 연구에 사용한 hpSC 계통으로부터의 실험 결과에 분명한 차이가 없었고, 따라서 데이터를 풀링시켰다.
신경상피 로제트의 얻는 단계에서 양호한 결과를 피더층에서 hESC의 유지에 의해 달성할 수 있다. 신경 유도 전 1회의 계대로, hESC를 셀스타트(CELLstart)(상표명) 코팅 용기에 통과시킨다. 60㎜ 페트리 접시를 사용하여 최상의 결과를 달성하였다. 계대일을 "제0일"로 고려한다. hESC를 15% KSR 및 5 ng/㎖의 bFGF를 지니는 ES 세포에 대한 배지에서 4 내지 7일 동안 유지시킨다. 콜로니는 제대로 형성되어야 한다.
실시예 3
배양 배지 제조 및 페트리 접시 코팅을 위한 재료 및 방법
재료
녹아웃 DMEM/F12, 인비트로젠(Invitrogen), 12660-012
DMEM/F12, 인비트로젠(Invitrogen), 10565-018,(L-글루타민의 공급물로서 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I 보충물로 보충함).
글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I 보충물, 인비트로젠(Invitrogen), 35050-061
MEM 비-필수 아미노산 용액 10 nM(100X), 인비트로젠(Invitrogen), 11140-050
셀스타트(CELLstart)(상표명), 인비트로젠(Invitrogen), A10142-01
스템프로(StemPro)(등록상표) 아쿠타제(Accutase)(등록상표) 세포 해리 시약, 인비트로젠(Invitrogen), A11105-01
스템프로(StemPro) 신경 보충물, 인비트로젠(Invitrogen), A10508-01
N2 보충물(100X), 인비트로젠(Invitrogen), 175O2-048
둘베코 인산염-완충 식염수(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline: D-PBS)(IX), 인비트로젠(Invitrogen), 14040-133, (Ca2+ 및 Mg2+에 의함)
EGF 재조합 인간, 인비트로젠(Invitrogen), PHG0314
재조합 인간 FGF-염기성, 페프로테크(Peprotech), 100-18B
페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 용액(100X), VWR, 1674049
둘베코 인산염-완충 식염수(D-PBS)(1X), w/o Ca2+, Mg2+, VWR, 16777-150
신경 유도를 위한 배지
배지의 표제 및 조성은 문헌[Shin et al.][11]에 기재된다. DMEM/F12에 기반한 신경 유도 DN2에 대한 배지를 N2로 보충하였다.
5㎖의 100x 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 용액을 500㎖ 용적의 배지 DMEM/F12의 새로운 보틀에 첨가한다. +4로 저장한다. DN2 배지를 준비하기 위해서:
- 멸균 배지 보틀에 PSA 용액을 함유하는 98㎖ DMEM F12를 무균성으로 옮긴다;
- 1㎖의 100x MEM 비-필수 아미노산 용액을 첨가한다;
- 1㎖의 100x N2 보충물을 첨가한다;
- 배지 DMEM/F12는 이미 L-글루타민을 함유하였으며, 따라서 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I 보충물은 첨가되지 않아야한다
- +4에서 저장한다. bFGF 용액을 첨가한 후 최종 4 내지 20 ng/㎖의 용액으로 사용한다.
신경 증식을 위한 배지
스템프로(StemPro)(등록상표) NSC SFM 키트에 대한 매뉴얼에 표시된 바와 같이 신경 증식을 위한 배지를 준비한다. 또한 스템프로(StemPro)(등록상표) NSC SFM 배지를 별개의 구성성분으로부터 제조할 수 있다.
500㎖의 용적을 지니는 배지 DMEM/F12의 새로운 보틀에 5㎖의 100x 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 용액을 첨가한다. +4에서 저장한다. 스템프로(StemPro)(등록상표) NSC SFM 배지를 제조하기 위해서:
- 멸균 배지 보틀에 PSA 용액을 함유하는 97㎖ DMEM/F12를 무균성으로 옮긴다;
- 1㎖의 100x 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I 보충물(1.1.3.)을 첨가한다;
- 2㎖의 스템프로(StemPro)(등록상표) 신경 보충물(1.1.7.)을 첨가한다;
- +4에서 저장한다. 성장 인자 bFGF 및 EGF를 첨가한 후, 20 ng/㎖의 최종 농도로 사용한다.
주의: MEM 비-필수 아미노산 용액은 인비트로젠(Invitrogen) 설명서에 따라 첨가되어서는 안 된다.
셀스타트 ( CELLstart )(상표명) 매트릭스에 의한 배양 용기의 코팅
50의 희석 인자로 PBS 중의 셀스타트(CELLstart)(상표명) 용액, 즉, 각각 1㎖의 PBS 당 20㎕의 셀스타트(CELLstart)(상표명) 용액을 희석시킨다. Ca2+ 및 Mg2+의 존재는 필수적이다. 용액을 저장하지 않으며, 사용 바로 전 제조한다.
하나의 35㎜ 페트리 접시 당 0.7 내지 1.0㎖의 용액 또는 하나의 60㎜ 페트리 접시 당 2.0㎖의 용액을 첨가하였다. +37℃에서 2시간 동안 인큐베이터 내에 둔다. 100과 동일한 희석 인자를 사용하여 2시간 미만 또는 4시간 이상 인큐베이션, 또는 +4℃에서 저장으로 계대 후 또는 장기간 배양 동안 세포 부착의 감소를 초래한다.
사용 전 셀스타트(CELLstart)(상표명) 용액을 흡입한다. 세정하지 않는다. 배양 배지에 즉시 첨가한다.
성장 인자 용액 10 ㎍/㎖의 농도로 PBS 중에서 0.1% HSA 용액 중의 성장 인자 EGF 및 bFGF을 희석시킨다. 예를 들어, PBS 중에서 5㎖의 0.1% HSA 용액 중의 동결건조 성장 인자의 50㎍을 멸균 희석시킨다. 500㎕ 마이크로원심분리 튜브에서 알리쿼팅하고, -20℃에서 저장한다. 반복적인 냉동-해동 주기를 피하고, 해동 후 14일 이내에 사용한다. 사용 바로 전 배지에 성장 인자를 첨가한다. 예를 들어, 20 ng/㎖의 최종 농도를 수용하기 위해 각 1㎖의 배지 당 2㎕의 성장 인자 용액을 첨가한다.
실시예 4
hpESC phNSC 및 hNSC 의 분석
전체 RNA를 제조업자의 설명서(퀴아젠(Qiagen))에 따라 퀴아심포니(QIAsymphony) 자동 정화 시스템을 사용하여 단리시켰다. 100 내지 500ng의 전체 RNA를 이스크립트(iScript) cDNA 합성 키트(바이오래드(Biorad))에 의한 역전사를 위해 사용하였다. 유전자의 전사 활성화를 분석하기 위해 PCR 반응을 반응 당 cDNA의 1/25 및 퀀티테크(QuantiTect) 프라이머 분석(사용한 프라이머는 표 4에서 보고함)을 퀀티테스트(Quantitest) SYBR 그린 마스터 믹스(Green master mix)(퀴아젠(Qiagen))와 함께 사용하여 2회 수행하였다. 역 전사효소 실시간 정량적 PCR(qRT-PCR)을 로터-진 Q(Rotor-Gene Q)(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 수행하였다. 표준 곡선에 대해 상대적 정량화를 수행하였고, 정량화된 값을 PPIG에 의해 결정된 입력값(사이클로필린(Cyclophilin) G)에 대해 정규화하였다. 정규화 후, 2 내지 7개의 유전자 발현 측정 수단의 표준오차를 계산하였다.
표면 마커의 FACS 분석을 APC-염색한 마우스 항-인간 CD133 항체(이바이오사이언스(eBioscience)) 및 마우스 항-인간 CD15 항체(비디 파민겐(BD Pharmingen))(표 5를 참조)로 수행하였다.
면역염색을 위해, NSC를 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰고, 0.1% 트윈(Tween) 20을 함유하는 용액에 의해, 그리고 0.3% 트리톤(Triton) X-100에 의해, 고정 후 1시간 동안 침투시켰다. 침투 후, 세포를 3% 정상 염소 혈청으로 +4℃에서 밤새 차단시켰다. SOX2, 네스틴 및 무사시-1에 대한 1차 항체를 각각 1:100, 1:200 및 1:300의 희석물 중에서 +4℃에서 밤새 적용하였다. 2차 항체(1:500)를 실온에서 2시간 동안 적용하였다. 분화된 뉴런의 1-단계 염색을 위해, 항체 결합시킨 항-튜뷸린 βIII 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488을 제조업자의 설명서(코반스(Covance))에 따라 적용하였다. 핵을 DAPI로 염색하였다. 1차 및 2차 항체의 목록을 표 5에서 제공한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 5
신경 유도 및 신경 줄기 세포
부착 모델을 문헌[Shin et al.][11]에 의해 제안하였다. 인간 배아 줄기 세포를 그들이 계대될 준비가 되기 전 피더층 또는 매트릭스 상에서 유지한다. 이 때, 배지를 신경 유도를 위한 것으로 교체한다. 1 내지 2주의 유지 후 이러한 조건에서, 신경상피 세포의 로제트가 형성되며, 이것은 신경관이 발생 반복되는 것으로 고려한다. 셀스타트(CELLstart)(상표명) 상의 피더가 없는 조건에서 신경상피 로제트를 획득하는 프로토콜을 이하에 기재한다.
hESC 배양물이 계대될 준비가 될 때, 배양물 배지를 20 ng/㎖의 bFGF로 보충한 DN2 배지로 교체한다. 배지의 교체일을 "제NI일"로 고려한다. 배지를 적어도 2일마다 1회 또는 더 빈번하게 신선한 것으로 교체하여야 한다.
3 내지 4일 후, 세포사멸 속도가 상당히 증가되었으며, 배지의 색은 붉은 오렌지색에서 황색으로 빠르게 변화될 것이다. 이 기간 동안, 배지는 적어도 1일 1회 교체되어야 한다.
세포 사멸의 안정 후, 대략 7 내지 10일에, 세포가 단일층보다는 밀집한 ≪언덕≫ 또는 ≪능선≫을 형성하는 필드를 발견할 수 있다. 이들 ≪언덕≫에서, 초기 신경상피 로제트가 형성된다.
로제트가 형성되기 시작된 후, 중심에서 작은 내강을 지니는 다중 NEP 로제트가 있는 잘 보이는 영역이 형성될 때까지, 배양물을 추가 3 내지 7일 동안 배양시켜야 한다. 이들은 후기 로제트 또는 최종적인 신경외배엽이다. 로제트 구조를 함유하는 영역은 원주형의 신경상피 세포로 둘러싸인 긴 내강을 지니는 분지된 능(crest)을 형성할 수 있다.
신경 분화를 위해, 독특하고, 중요한 변형으로 부착 모델[11]을 사용하였다. 5일 동안 마우스 배아 섬유아세포 피더층 상에서 유지한 hpSC를 셀스타트(CELLstart)(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)) 코팅한 60㎜ 페트리 접시 상에서 디스파제(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))와 함께 계대하였다. 다음 4일 동안, hpSC의 콜로니를 ES-배지에서 배양시킨 후 신경 유도를 위한 배지로 교체하였다. 신경 유도를 위한 배지는 N2 보충물(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), 0.1mM MEM 비필수 아미노산, 2mM L-글루타민(글루타맥스(GlutaMAX)-I, 뉴욕주 글랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)), 항생제 용액 및 20 ng/㎖의 bFGF를 함유하는 DMEM/F12를 기반으로 한다. 배지 교체일을 신경 유도의 제0일로서 고려하였다. 신경상피 세포의 잘-형성된 로제트를 지니는 영역을 기계적으로 단리시켰고, 트리플(TrypLE)(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))을 사용하여 단일 세포 현탁액에 해리시켰으며, 20 ng/㎖의 bFGF 및 20 ng/㎖의 EGF(둘 다 페프로테크(Peprotech))로 보충한 스템프로(StemPro) NSC SFM 배지(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))에서 24 웰 플레이트의 셀스타트(CELLstart)(상표명)(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen)) 코팅된 웰에 옮겼다. 충분한 양의 세포를 얻은 후, 상기 기재한 바와 같이 보충한 스템프로(StemPro) NSC SFM에서 NSC의 추가적인 유지 및 계대를 셀스타트(CELLstart) 코팅된 60㎜ 페트리 접시 상에서 수행하였다. 계대 동안 세포를 아쿠타제(Accutase)(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))에 의해 해리시켰다. H9 hESC-유래 GIBCO(등록상표) 인간 신경 줄기 세포(추가로 hNSC로서 불림; 뉴욕주 글랜드 아일랜드에 소재한 인비트로젠(Invitrogen))를 동일 조건 하에 유지시켰다.
셀스타트(CELLstart) 상에서 성장시키고 5일 후, hpSC의 콜로니는 완전히 형성된 것으로 보였고, 피더에서 성장시킨 콜로니와 비교하여 어떤 시각적 차이를 갖지 않았다. 배지를 교체한 후, 신경상피(NEP) 로제트의 제1 징후는 신경 유도의 제2일에 나타난다. 신경 유도를 위한 배지에서 배양의 제7일에, 세포 콜로니는 NEP 로제트의 클러스터를 함유하는 거대 영역으로서 나타났다. 이들 클러스터에서, 대부분의 로제트는 잘-형성된 내강을 가졌다. qRT-PCR 분석은 중요한 신경외배엽 유전자 PAX6 및 SOX1의 전사 활성이 미분화 hpSC와 비교할 때 이 단계에서 증가된 반면, 만능 마커 OCT4는 극적으로 하향조절된 것을 나타내었다(도 1). 구체적 신경 마커 NES(네스틴) 및 MS1(무사시-1)의 발현은 또한 높았다. 내배엽 마커 AFP 및 중배엽의 마커 ACTA1은 세포 클러스터를 함유하는 NEP 로제트에서 qRT-PCR에 의해 검출되지 않았다(데이터 미제시).
35㎜ 페트리 접시를 준비하기 위해, 우선 상기 기재한 바와 같이 셀스타트(CELLstart)(상표명)로 그들을 처리한 다음, 2㎖의 스템프로(StemPro)(등록상표) NSC를 20 ng/㎖의 bFGF와 EGF로 보충한 신경 증식을 위한 SFM 배지에 첨가하였다. +37℃, 5% CO2, 습한 분위기에서 인큐베이터 내에 접시를 둔다.
신경 유도 동안(셀스타트(CELLstart)(상표명) 처리한 용기 상에 접종 후 대략 제21일) 얻은 내강을 지니는 후기 로제트 NEP를 실체 현미경 하에 기계적으로 단리시킨다. 주사기 바늘을 사용할 수 있다. 로제트를 지니는 영역은 기계적으로 단일 세포를 단리시키는 것이 불가능하기 때문에 절단되어야 한다. 로제트가 없는 영역뿐만 아니라 단일층 필드는 폐기되어야 한다. 최소 용적의 배지에서 얻은 세포 클럼프를 수집한다. 하나의 35㎜ 페트리 접시마다 100 내지 300 um 크기의 15 내지 20 클럼프를 접종시킨다.
그 다음에 세포의 클럼프를 단일 세포 현탁액으로 분쇄하여야 한다. 이 목적을 위해, 원뿔형 바닥을 지니는 15㎖ 원심분리 튜브 내에 300㎕의 스템프로(StemPro)(등록상표) 아쿠타제(Accutase)(등록상표)를 넣고, 37℃로 가온시킨다. 얻은 세포의 클럼프를 스템프로(StemPro)(등록상표) 아쿠타제(Accutase)(등록상표)를 지니는 튜브 내 최소 용적의 배지에 옮기고, 3 내지 4분 동안 실온에서 인큐베이션시켰으며, 200㎕ 팁으로 대략 100회 위아래로 조심해서 피펫팅한다. 세포에 대해 스템프로(StemPro)(등록상표) 아쿠타제(Accutase)(등록상표)의 전체 시간은 10분을 초과하지 않아야 한다.
그 다음에 성장 인자 없이 신경 증식을 위해 6㎖의 따뜻한 스템프로(StemPro)(등록상표) NSC SFM 배지를 첨가한다. 뚜껑을 닫고, 튜브를 조심해서 6 내지 8회 진탕시켰고, 세포를 세정하였다.
120-130 g에서 4분 동안 원심분리시킨 다음, 가능한 많은 상청액을 조심해서 흡입한다. 원심분리 튜브에서 준비된 접시로부터 2㎖의 배지를 옮겼고, 펠렛을 재현탁하였으며, 배양 배지에서 튜브의 내용물을 옮겼다. 세포를 진탕하면서 접시에서 동일하게 분포시켰고, +37℃, 5% CO2, 습한 분위기에서 인큐베이터 내 접시에 둔다.
단리 후 다음날 세포 부착 및 생존도를 추정하고, 배지를 신선한 것으로 교체한다. 수용된 세포를 0 계대의 NSC로서 고려할 수 있다.
실시예 6
phNSC 의 클론 단리
NEP 로제트로부터 단리한 증식 세포의 집단은 일반적으로 동종이 아니다. 그들은 간엽성 유형의 세포로 오염될 수 있는데, 이는 높은 증식율 때문에 NSC의 분화를 유도하고, 그들을 대체한다. 개개 세포 클론의 단리는 NSC의 동종 집단을 얻게 한다. 배양 접시 35㎜를 준비하기 위해, 셀스타트(CELLstart)(상표명)로 처리하고, 그 다음에 각 접시 상에서 20 ng/㎖의 bFGF로 보충한 신경 유도 DN2에 대해 2㎖의 배지를 첨가하며, 37℃, 5% CO2, 습한 분위기에서 인큐베이터 내 접시를 둔다. 내강을 지니는 후기 NEP 로제트(셀스타트(CELLstart)(상표명)에 걸쳐 hESC의 인큐베이션 후 대략 21일)를 상기 기재한 바와 같이 실체 현미경 하에 기계적으로 단리시킨다. NEP 로제트를 지니는 단편의 크기는 100 내지 300㎛로 달라야 한다. 각 배양 접시 35㎜에서 NEP 로제트를 지니는 15 내지 20개 단편을 접종하고, 접시에 걸쳐 단편을 균일하게 분포시켰으며, 배지 교체 없이 2일 동안 배양시킨다. 단편은 이들 2일 동안 셀스타트(CELLstart)(상표명)로 처리한 접시의 표면상에서 부착되고, 가로 놓이기 쉽지만, 다수의 세포는 세포 클러스터의 주변으로 이동할 것이고, 간엽성 세포("편평 세포")의 형태와 유사한 형태를 얻었다. 동시에, 세포의 일부분을 부착 세포 클러스터 형태 2차 로제트의 중심 부분으로부터 쫓아냈다. 24웰 플레이트를 준비하기 위해 셀스타트(CELLstart)(상표명)로 웰을 처리한 다음, 신경 증식을 위해 성장 인자(각각 bFGF 및 EGF의 20 ng/㎖)로 보충한 0.5㎖의 스템프로(StemPro)(등록상표) NSC SFM 배지를 첨가하였으며(1.3.을 참조), 인큐베이터에 둔다. 2차 로제트를 지니는 35㎜ 접시로부터 편평 세포를 제거한다. 모든 바람직하지 않은 세포를 긁어내기 위해 200㎕ 플라스틱 팁을 사용한다. Ca2 + 및 Mg2 + 없이 1 내지 2㎖의 가온한 D-PBS로 접시를 세정하고, 신선한 따뜻한 배지 DN2를 첨가한다. 주사 바늘을 사용하여 2차 로제트를 지니는 필드를 절단하고, 그것을 0.1㎖의 가온한 스템프로(StemPro)(등록상표) 아쿠타제(Accutase)(등록상표)를 함유하는 0.5㎖ 원심분리 튜브 내로 최소 용적의 배지에서 옮긴다. 하나의 튜브마다 2차 로제트를 지니는 10개 이하의 단편을 둔다. 실온에서 3 내지 4분 동안 인큐베이션시킨 다음, 200㎕ 팁으로 약 100회 조심해서 피펫팅한다. 스템프로(StemPro)(등록상표) 아쿠타제(Accutase)(등록상표)에서 세포에 대한 전체 시간은 10분을 초과하지 않아야 한다. 각 바이알마다 0.4㎖의 가온한 스템프로(StemPro)(등록상표) NSC SFM 배지를 첨가한다. 120 내지 130g에서 4분 동안 튜브를 원심분리시킨 다음, 세포 펠렛의 방해 없이 가능한 많은 상청액을 주의해서 흡입한다. 준비한 24웰 플레이트의 웰로부터 250㎕의 배지를 세포 펠렛을 지니는 튜브에 옮기고, 200㎕ 팁을 사용하여 세포 펠렛을 재현탁시키며, 웰에 세포 현탁액을 다시 옮긴다. 하나의 튜브로부터 단일 웰에 세포를 옮긴다. 이 방법에 의해 얻은 세포 클론을 계대 0으로 고려한다. 다음 4 내지 6일 동안, 세포 증식을 관찰하고, 작은 로제트-유사 구조(별표)를 형성할 수 있고, 저밀도의 세포를 지니는 필드에서 뉴런-유사 세포로 자발적으로 분화될 수 있는, NSC와 형태적으로 유사한, 즉, 구체적 각이 있는 형태의 많은 세포를 함유하는 웰을 표시한다. 처음 2 내지 5회 계대 동안, 24웰 플레이트의 웰에서 세포를 유지하며, 1:2 또는 1:1의 비로 분할된다. 세포가 구체적 형태를 상실하기 시작하는 해당 웰을 폐기한다. 충분한 양의 세포를 얻은 후, 이들을 35㎜ 페트리 접시 상에서 배양시킨 다음, 60㎜ 페트리 접시 상에서 배양시킨다.
실시예 7
phNSC 의 분화
레티놀(인비트로젠(Invitrogen)), 0.1mM MEM 비필수 아미노산, 2mM L-글루타민(글루타맥스(GlutaMAX)-I 인비트로젠(Invitrogen)) 및 항생제 용액 없이 B27로 보충한 신경기본 배지(인비트로젠(Invitrogen))에서 NSC의 자발적 분화를 수행하였다.
B27 보충한 성장 인자 bFGF 및 EGF가 없는 배지에서, phNSC 및 hNSC의 자발적 분화가 4주 이내에 발생되었는데, 이는 주로 뉴런-유사 세포의 발생을 초래한다. 면역화학적 분석은 phNSC 유도체에서 뉴런-특이적 튜불린 βIII의 존재를 나타내었다. 전사 활성 분석은 phNSC 및 hNSC 유도체 둘 다에서 뉴런 특이적 마커 TUBB3(튜불린 βIII) 및 MAP2뿐만 아니라 성상세포 마커 GFAP를 나타내었다(도 3).동시에, 희돌기교세포 마커 FOXO4의 발현은 phNSC 세포 집단으로부터의 분화보다 더 높았다.
실시예 8
phNSC 유지 및 표현형
단일 세포 현탁액에 대한 단리 및 NEP 로제트 해리의 결과는 증식 세포 집단이었고; 일반적으로 이들 세포는 4.5 개월에 걸쳐 분할비 1:2로 4 내지 5일마다 계대되었다. 적어도 27회 계대 동안, phNSC는 hNSC와 유사한 특이적 형태를 유지하였다.
구체적으로, NSC의 유지 및 계대를 일부 변형과 함께 깁코-인비트로젠(GIBCO-Invitrogen) 사용자 매뉴얼(MAN0001758)에서 기재한 바와 같이 수행한다.
NSC를 증식 속도에 따라서 1:2의 분할비로 3 내지 5일마다 1회 계대시킨다. 씨딩 밀도는 ㎠ 당 적어도 5×104이어야 하는데, 세포가 저밀도로 분화되는 경향이 있기 때문이다.
세포는 헐렁한 단일층을 형성할 때 계대될 준비가 된다. 세포 및 밀집한 단일층의 과성장은 하위구분의 상실 및 분화를 야기할 수 있다. 세포를 계대하기 위해서:
- 계대 2 내지 3시간 전에 셀스타트(CELLstart)(상표명)로 처리한 필요량의 60㎜ 페트리 접시를 준비한다;
- +37℃, 5% CO2, 습한 분위기에서 인큐베이터 내 하나의 60㎜ 페트리 접시마다 필요량의 스템프로(StemPro)(등록상표) NSC SFM 배지, 6㎖의 배지를 가온시킨다;
- 10㎖의 스템프로(StemPro)(등록상표) NSC SFM 배지를 지니는 15㎖ 원심분리 튜브, 1 내지 2개의 60㎜ 페트리 접시마다 각 튜브를 준비한다. +37℃, 5% CO2, 습한 분위기에서 인큐베이터에 튜브를 둔다;
- 원심 분리 튜브에서 필요량의 스템프로(StemPro)(등록상표) 아쿠타제(Accutase)(등록상표), 계대되는 각 접시마다 1㎖를 첨가한다. 계대 전 수욕에서 20 내지 30분 동안 그것을 가온시킨다;
- 셀스타트(CELLstart)(상표명)의 첨가 후 2 내지 3시간에 성장 인자 EGF 및 bFGF를 둘 다 20 ng/㎖의 최종 농도로 첨가한다;
- 성장 인자로 보충한 6㎖의 스템프로(StemPro)(등록상표) NSC SFM 배지로 셀스타트(CELLstart)(상표명) 용액을 교체하고, 접시를 인큐베이터에 다시 둔다;
- 계대되는 접시, 성장 인자 없이 스템프로(StemPro)(등록상표) 아쿠타제(Accutase)(등록상표) 및 스템프로(StemPro)(등록상표) NSC SFM 배지를 지니는 튜브를 취한다;
- 접시로부터 배지를 흡입하고, 1㎖의 가온 스템프로(StemPro)(등록상표) 아쿠타제(Accutase)(등록상표)를 첨가하며, 4분 동안 실온에서 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 동안 조심해서 접시를 진탕시킨다;
- 세포가 표면으로부터 벗어나기 시작하면, 4분 후 도립현미경 하에 확인한다. 그렇지 않으면, 추가적인 인큐베이션이 필요하며, 접시를 1분 동안 인큐베이터에 둔다;
- 성장 인자가 없는 1㎖의 스템프로(StemPro)(등록상표) NSC SFM 배지를 접시에 첨가하고, 1000㎕ 팁으로 조심해서 세포 현탁액을 피펫팅하여 세포를 분리시킨다;
- 성장 인자가 없는 스템프로(StemPro)(등록상표) NSC SFM 배지를 함유하는 튜브에 세포 현탁액을 옮긴다. 하나의 튜브는 2개까지의 60㎜ 페트리 접시에 끼워진다;
- 조심해서 튜브를 진탕하여 내용물을 혼합한다;
- 4분 동안 120 내지 130 g에서 세포를 원심분리시키고, 모든 상청액을 조심해서 흡입한다;
- 필요량의 새로운 셀스타트(CELLstart)(상표명)를 처리한 접시를 취한다. 보통 세포는 1:2로 계대되며, 따라서 하나의 60㎜ 페트리 접시가 있다면, 2개의 새로운 접시를 사용한다;
- 각 접시로부터 원심분리 튜브에 1㎖의 배지를 옮겨서 펠렛을 재현탁시킨다. 1㎖의 세포 현탁액을 각각의 접시에 다시 옮긴다.
- 세포를 접시에서 진탕에 의해 동일하게 분포시킨다. +37℃, 5% CO2, 습한 분위기에서 인큐베이터에 접시를 둔다.
계대 다음 날 배양 배지를 신선한 것으로 교체한다. 다음에, 배지는 2일마다 적어도 1회 교체되어야 한다.
전사 활성 qRT-PCR 분석은 phNSC에서 SOX2, NES, MS1 및 PAX6의 발현 수준이 hNSC에서의 발현 수준에 가깝다는 것을 나타내었다. OCT4의 발현은 검출가능하지만, phNSC에서 또는 hNSC에서 매우 낮은 수준이었고; 내배엽 마커 AFP는 모든 NSC 계통에서 검출되지 않았다(데이터 미제시). 신경능 외배엽성중간엽뿐만 아니라 중배엽 마커 ACTA1에 특이적인 유전자 FOXD3 및 SNAI2의 전사 활성 수준은 hNSC와 비교하여 phNSC에서 더 낮은 반면, 높은 수준의 신경관 신경성 도메인 마커 OLIG2 발현이 phNSC에서 나타났다. SOX2, NES 및 MS1 발현은 또한 면역세포화학에 의해 단백질 수준을 확인하였다. 표면 마커 CD133 및 CD15 분석은 양성 및 음성 CD133 및 CD15 세포의 혼합된 집단을 나타낸다는 것을 나타내었다(데이터 미제시).
실시예 9
단위생식적으로 유래된 도파민 작용성 뉴런의 생성
다능 신경 전구체 세포(NPC)는 동형접합 또는 이형접합 중 하나의 단위생식의 줄기 세포로부터 유래된 신경외배엽으로부터 유래되었다. 단위생식적으로 유래된 NPC는 중뇌 도파민 작용성 뉴런(DA)과 같은 뉴런으로 분화된다. 이들 DA 뉴런은 중뇌 표현형을 나타내며, 면역세포화학 및 RT-PCR에 의해 측정한 바와 같이 TH, GIRK2, PITX3, NURRl, LMXA1 및 EN1를 발현시킨다. 선행기술로부터 알 수 있는 바와 같이, 도파민 작용성 뉴런의 주요 기능은 도파민을 방출시키는 것이다. 신체에서 도파민의 주요 기능은 보상-구동 학습이다. hpNPC로부터 유래된 DA 뉴런은 또한 LC/MS/MS에 의해 결정된 바와 같이 도파민을 방출시킨다. 전체 세포 전기생리학은 단위생식적으로 유래된 도파민 작용성 뉴런이 작동 퍼텐셜을 촉발시킬 수 있다는 것을 증명하였다.
LC / MS / MS 에 의한 도파민 방출의 결정
2.1×100㎜ 아틀란티스(Atlantis)-dC18 2.1×100㎜ 컬럼(워터스(Waters))를 사용하는 LC-MS/MS에 의해 배양물 내 도파민 수준을 분석하였다. 줄기 세포-유래 도파민 작용성 뉴런의 배양물로부터 조건화된 배지를 수집하였고, 1㎜ EDTA로 보충하였으며, -80℃에서 냉동시켰다. 샘플을 실온에서 해동시켰고, 200㎕의 샘플 및 표준을 2M NH4Cl-NH40H, pH8.5에서 500㎕의 복합화제 0.2% DPBA-에탄올아민 에스터 + 5 g/ℓ EDTA와 혼합하였다. 오아시스(Oasis) HLB 마이크로-용리 플레이트 30㎛(워터스(Waters))를 0.5㎖ 메탄올 다음에 0.5㎖ 0.2M NH4Cl-NH40H pH 8.5로 조건화하였다. 복합화된 샘플 및 표준을 조건화된 오아시스(Oasis) HLB 마이크로-용리 플레이트에서 0.5㎖/분 미만의 속도로 서서히 추출하였다. 추출 플레이트를 0.5㎖의 0.2M NH4Cl-NH4OH pH 8.5 다음에 0.5㎖의 20:80 메탄올: 0.2M NH4Cl-NH4OH, pH 8.5로 세척하였다. 그 다음에 도파민을 수중에서 100㎕의 4% 포름산으로 용리시켰고, 96-웰 플레이트에 수집하였다. 20㎕를 아틀란티스(Atlantis) DC-18 2.1×100㎜ 내경 컬럼에 로딩시켰고, 주사 샘플의 분리를 0.1% 포름산 - 아세토나이트릴 이동상에서 300㎕/분의 유속으로 8분 동안 구배 용리에 의해 달성하였다. PE SCIEX API 4000 LC/MS/MS 질량 분석기(스펙트라랩 사이언티픽 인코포레이티드(SpectraLab Scientific Inc.))로 피크를 분석하였고, 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monittoring: MRM)에 의해 정량화하였다. hpNPC로부터 유래된 DA 뉴런은 또한 LC MS/MS에 의해 결정되는 바와 같이 도파민을 방출시킨다.
샘플 # 5는 phNSC로부터 유래된 DA 뉴런에 의해 방출된 도파민 수준이다.
샘플 ID 농도(ng/㎖)
샘플 1 BLQ
샘플 2 12.2
샘플 3 BLQ
샘플 4 0.864
샘플 5 2.15
샘플 6 BLQ
BLQ는 정량의 제한 미만(Below Limit of Quantitation)
전기 생리학
뉴런이 성장하는 덮개 유리를 가장 넓은 지점에서 5㎜ 크기 및 1㎝ 길이의 방추 모양 챔버에 들어맞는 더 작은 분절로 절단하였다. 시험 챔버에 1.8mM CaCl2; 1mM MgCl2; 4mM KCl; 140mM NaCl; 10mM 글루코스; 10mM HEPES; 305-315 mOsm; pH 7.4(5 M NaOH로 조절)를 함유하는 타이로즈(Tyrodes) 용액을 뿌렸다. 140mM KCl; 10mM MgCl2; 6mM EGTA; 5mM HEPES-Na; 5mM ATP-Mg; 295 내지 305 mOsm; pH 7.25(1M KOH로 조절)로 채웠을 때 3 내지 5 MOhm의 저항을 지니도록 전극을 제조하였다. 5 KHz 베셀(Bessel) 필터로 데이터를 처리하였고, 멀티클램프(Multiclamp) 700 A 증폭기(액손 인트루먼츠(Axon Intrument)) 및 피클램프(Pclamp) 소프트웨어를 사용하여 10 내지 20 KHz에서 획득하였다. 모든 실험을 연속적 유동 챔버에서 현미경 하에 실온에서 수행하였다. 데이터를 도 4에 나타낸다. 전체 세포 전기생리학은 단위생식적으로 유래된 도파민 작용성 뉴런이 작동 퍼텐셜을 촉발할 수 있다는 것을 증명하였다.
참고문헌
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
본 발명은 상기 실시예에 대해 기재되었지만, 변형 및 변화가 본 발명의 정신과 범주 내에 포함된다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 다음의 특허청구범위에 의해서만 제한된다.

Claims (63)

  1. 단리된 신경 줄기 세포로서, 상기 세포는 단위생식적으로 활성화된 난모세포로부터 분화된 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포는 상기 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능한 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세포는 매칭 단상형을 기반으로 한 집단 그룹과 조직적으로 양립가능한 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포는 ESC로부터 상이한 패턴의 접합성을 가지는 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포는 모계 게놈만을 함유하는 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포는 상기 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능하며, ESC로부터 상이한 패턴의 접합성을 가지고, 상기 모계 게놈만을 함유하는 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포는 인간에게 이식가능한 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  8. 제1항에 있어서, 상기 세포는 미분화되거나, 부분적으로 분화되거나 또는 완전히 분화된 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  9. 제1항에 있어서, 상기 세포는 신경 세포로 분화될 수 있는 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포는 뉴런, 신경교세포, 희돌기교세포 및 성상세포로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 세포로 분화될 수 있는 것인 신경 줄기 세포.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포는 뉴런인 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  12. 뉴런이 콜린 작용성 뉴런, GABA 작용성 뉴런, 글루타메이트 작용성 뉴런, 도파민 작용성 뉴런 및 세로토닌 작용성 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제11항의 뉴런.
  13. 제12항에 있어서, 상기 뉴런은 도파민 작용성 뉴런인 것인 뉴런.
  14. 제1항에 있어서, 상기 세포는 SOX2, 네스틴(Nestin), 무사시(Mushashi)-1, TUBB3, MAP2, FOXO4, GFAP, CD113 및 CD15로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 마커를 발현시키는 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  15. 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 분화시킴으로써 신경 줄기 세포를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 적어도 2일 동안 섬유아세포의 피더(feeder)층 상에서 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 성장시키는 단계;
    b) 적어도 1일 동안 섬유아세포 피더층 없이 페트리 접시 상에서 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 성장시키는 단계;
    c) 신경 유도 배지에서 상기 세포를 배양시키는 단계;
    d) 상기 (c)로부터의 세포의 단일 세포 현탁액을 얻는 단계; 및
    e) 신경 증식 배지에서 섬유아세포 피더층이 없는 페트리 접시 상에서 상기 단계 (d)로부터의 단일 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 신경 줄기 세포의 생성 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 신경 유도 배지는
    a) 페니실린-스트렙토마이신 암포테리신 용액
    b) DMEM/F12;
    c) MEM 비-필수 아미노산 용액;
    d) L-글루타민;
    e) N2 보충물; 및
    f) bFGF를 포함하는 것인 신경 줄기 세포의 생성 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 신경 증식 배지는
    a) 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신;
    b) DMEM/F12;
    c) 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I;
    d) 스템프로(StemPro)(등록상표) 신경 보충물;
    e) bFGF; 및
    f) EGF를 포함하는 것인 신경 줄기 세포의 생성 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 페트리 접시는 셀스타트(CELLstart)로 코팅된 것인 신경 줄기 세포의 생성 방법.
  19. 제15항의 방법에 의해 생성된 신경 줄기 세포.
  20. 제15항에 있어서, 신경상피 로제트(rosette)는 약 1주 내지 2주 후에 형성되는 것인 신경 줄기 세포의 생성 방법.
  21. 하기 단계들을 포함하는 방법을 사용하여 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포로부터 유래된, 단리된 신경 줄기 세포:
    a) 적어도 2일 동안 섬유아세포의 피더층 상에서 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 성장시키는 단계;
    b) 적어도 1일 동안 섬유아세포 피더층 없이 페트리 접시 상에서 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 성장시키는 단계;
    c) 신경 유도 배지에서 상기 세포를 배양시키는 단계;
    d) 상기 (c)로부터의 세포의 단일 세포 현탁액을 얻는 단계; 및
    e) 신경 증식 배지에서 섬유아세포 피더층이 없는 페트리 접시 상에서 상기 단계 (d)로부터의 단일 세포를 배양시키는 단계.
  22. 제21항에 있어서, 상기 세포는 SOX2, 네스틴, 무사시-1, TUBB3, MAP2, FOXO4, GFAP, CD113 및 CD15로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 마커를 발현시키는 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  23. 제21항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포는 적어도 27회의 계대(passage)에 대해 상기 신경 표현형을 유지하는 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  24. 제21항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포는 신경 세포로 분화될 수 있는 것인 세포.
  25. 제24항에 있어서, 상기 신경 세포는 뉴런, 신경교세포, 성상세포 및 희돌기교세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  26. 세포가 뉴런인 것인 제25항의 분화된 신경 세포.
  27. 제26항에 있어서, 상기 뉴런은 콜린 작용성 뉴런, GABA 작용성 뉴런, 글루타메이트 작용성 뉴런, 도파민 작용성 뉴런 및 세로토닌 작용성 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 뉴런.
  28. 제27항에 있어서, 상기 뉴런은 도파민 작용성 뉴런인 것인 뉴런.
  29. 제21항에 있어서, 상기 세포는 상기 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능한 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  30. 제21항에 있어서, 상기 세포는 ESC로부터 상이한 패턴의 접합성을 가지는 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  31. 제21항에 있어서, 상기 세포는 상기 모계 게놈만을 함유하는 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  32. 제21항에 있어서, 상기 세포는 상기 난모세포 공여자와 조직적으로 양립가능하며, ESC로부터 상이한 패턴의 접합성을 가지고, 상기 모계 게놈만을 함유하는 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  33. 제21항에 있어서, 상기 세포는 인간에게 이식가능한 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  34. 난모세포로부터 단위생식적으로 유래된 것으로부터 생성된 신경 줄기 세포를 사용하는 신경성 장애의 치료방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 신경성 장애는 뇌전증, 경련, 신경독성 손상, 저산소증, 무산소증, 허혈, 뇌졸중, 뇌혈관 발작, 뇌 또는 척수 외상, 심근경색, 신체의 외상, 익수, 질식, 주산기 가사, 저혈당증 사건, 신경퇴화, 알츠하이머병, 노인성 치매, 근위축성 측색 경화증, 다발성 경화증, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다운 증후군, 코르사코프병, 정신 분열증, AIDS 치매, 다발-뇌경색성 치매, 빈스방거 치매, 신경 손상, 발작, 화학 독성, 중독, 몰핀 내성, 아편 내성, 오피오이드 내성, 바비 튜레이트 내성, 급성 및 만성 통증, 편두통, 불안, 주우울증, 조울증, 강박장애, 정신 분열증 및 기분 장애, 양극성 장애, 단극성 우울증, 기분부전장애, 계절성 정서 장애, 근육긴장이상 또는 다른 운동 장애, 수면 장애, 근육이완 및 요실금으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 신경성 장애의 치료방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포는 이러한 치료가 필요한 환자에게 이식되는 것인 신경성 장애의 치료방법.
  37. 신경 줄기 세포를 분화시키는 방법으로서, 상기 방법은 신경 분화 배지에서 신경 줄기 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 신경 줄기 세포의 분화 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 신경 분화 배지는
    a) 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신;
    b) DMEM/F12;
    c) 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I; 및
    d) 스템프로(StemPro)(등록상표) 신경 보충물을 포함하는 것인 신경 줄기 세포의 분화 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포는 뉴런, 신경교세포, 희돌기교세포 및 성상세포로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 세포로 분화된 것인 신경 줄기 세포의 분화 방법.
  40. 상기 세포가 뉴런인 것인 제39항의 분화된 신경 세포.
  41. 뉴런이 콜린 작용성 뉴런, GABA 작용성 뉴런, 글루타메이트 작용성 뉴런, 도파민 작용성 뉴런 및 세로토닌 작용성 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제40항의 뉴런.
  42. 제41항에 있어서, 상기 뉴런은 도파민 작용성 뉴런인 것인 뉴런.
  43. 제37항의 방법에 의해 생성된 분화된 세포.
  44. 세포가 단위생식적으로 활성화된 난모세포로부터 분화된 것인 제37항의 세포.
  45. 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포를 분화시킴으로써 신경 줄기 세포를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 피더가 없는 조건에서 인간 만능 줄기 세포의 배양 단계;
    b) 신경 유도 배지에 대한 상기 세포의 노출 단계;
    c) 부분적으로 분화된 세포의 기계적 단리 단계; 및
    d) 성숙까지 상기 세포의 추가적인 확장 및 유지 단계를 포함하는, 신경 줄기 세포의 생성방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 신경 유도 배지는:
    a) 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 용액;
    b) DMEM/F12;
    c) MEM 비-필수 아미노산 용액;
    d) L-글루타민;
    e) N2 보충물; 및
    f) bFGF를 포함하는 것인 신경 줄기 세포의 생성방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 신경 증식 배지는
    a) 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신;
    b) DMEM/F12;
    c) 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I;
    d) 스템프로(StemPro)(등록상표) 신경 보충물;
    e) bFGF; 및
    f) EGF를 포함하는 것인 신경 줄기 세포의 생성방법.
  48. 제45항에 있어서, 피더가 없는 조건은, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 셀스타트(CELLstart), 매트리젤(Matrigel), 라미닌, 젤라틴, 피브로넥틴을 포함하는 ECM 기질을 이용하는 것인 신경 줄기 세포의 생성방법.
  49. 제45항의 신경 줄기 세포.
  50. 제45항에 있어서, 신경상피 로제트는 1 내지 2주 후에 형성되는 것인 방법.
  51. 하기 단계들을 포함하는 방법을 사용하여 단위생식적으로 유래된 인간 줄기 세포로부터 유래된, 단리된 신경 줄기 세포:
    a) 피더가 없는 조건에서 인간 만능 줄기 세포의 배양 단계;
    b) 신경 유도 배지에 대한 상기 세포의 노출 단계;
    c) 부분적으로 분화된 세포의 기계적 단리 단계; 및
    d) 성숙까지 상기 세포의 추가적인 확장 및 유지 단계.
  52. 제51항에 있어서, 상기 세포는 SOXB1-패밀리 NES, MSH-1, CXCR4, CCND1, LHX2, PAX6 및 GAP43으로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 줄기 세포는 마커를 발현시키는 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  53. 제51항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포는 적어도 30회의 계대에 대해 신경 표현형을 유지하는 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  54. 제51항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포는 신경 세포로 분화될 수 있는 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  55. 제54항에 있어서, 상기 신경 세포는 뉴런, 성상세포 및 희돌기교세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단리된 신경 줄기 세포.
  56. 난모세포로부터 단위생식적으로 유래된 신경 줄기 세포를 사용하는 신경성 장애의 치료방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 신경성 장애는 뇌전증, 경련, 신경독성 손상, 허혈, 뇌졸중, 뇌혈관 발작, 뇌 또는 척수 외상, 신체의 외상, 알츠하이머병, 노인성 치매, 근위축성 측색 경화증, 다발성 경화증, 파킨슨병, 헌팅턴병, 정신 분열증, 신경 손상, 편두통, 불안, 주우울증, 조울증, 강박장애, 정신 분열증 및 기분 장애, 양극성 장애, 단극성 우울증, 근육긴장이상 또는 다른 운동 장애, 수면 장애, 근육이완으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 신경성 장애의 치료방법.
  58. 제56항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포는 이러한 치료가 필요한 환자에게 이식되는 것인 신경성 장애의 치료방법.
  59. 신경 줄기 세포의 분화 방법으로서, 상기 방법은 신경 분화 배지에서 신경 줄기 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 것인 신경 줄기 세포의 분화 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 신경 분화 배지는
    a) 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신;
    b) DMEM/F12;
    c) 글루타맥스(GlutaMAX)(상표명)-I; 및
    d) 스템프로(StemPro)(등록상표) 신경 보충물을 포함하는 것인 신경 줄기 세포의 분화 방법.
  61. 제59항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포는 뉴런, 희돌기교세포 및 성상세포로 이루어진 군으로부터 선택된 신경 세포로 분화된 것인 신경 줄기 세포의 분화 방법.
  62. 제59항의 분화된 세포.
  63. 제59항에 있어서, 상기 세포는 단위생식적으로 활성화된 난모세포로부터 분화된 것인 세포.
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