JP6680479B2 - 細胞処理方法、レーザ加工機 - Google Patents

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Description

本発明は、増殖した細胞集合体から複数個のクランプを切り出す方法、並びにその方法の実施に使用されるレーザ加工機に関する。
近時、体性幹細胞や胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ））を用いた再生医療技術及び創薬の研究開発が勃興している。この種の研究開発においては、必要となる目的細胞や組織を効率よく量産できることが極めて重要となる。
細胞培養の過程では、培地で増殖した細胞集合体（コロニー）の一部をクランプとして切り出し、そのクランプを新しい培地に移して再び培養する継代培養を行うことが通例である（例えば、下記特許文献を参照）。
特表２０１４−５０９１９２号公報
継代後の細胞の生育状態にばらつきを生じさせないようにするためには、細胞集合体を切断して複数個のクランプを得るに際し、各クランプの寸法を互いに略均一に整えることが望ましい。だが、細胞集合体を単純に格子切りする（格子状の切断線を描くように切る）と、細胞集合体の外周縁近傍に所在する部分が、方形状に切断される他の部分と比較して寸法の小さいいびつな形状となる。当該部分が継代用の細胞として混入した場合、継代後の細胞の生育状態が不均等になる懸念を招来する。
本発明は、以上の問題に初めて着目してなされたものであり、増殖した細胞集合体から略均等な寸法を有する複数個のクランプを切り出すとともに、形状または寸法の異なる切片の混入を適切に排除することを所期の目的としている。
本発明に係る細胞処理方法は、細胞培養容器に接着している状態で増殖した細胞集合体から略均等な寸法を有する複数個のクランプを切り出す方法であって、所定形状の複数個のクランプを切り出すための格子状の切断線の端が前記細胞集合体の外周縁までは到達せず、当該切断線によって切断されずに繋がった細胞集合体の周縁部を形成し、その周縁部の面積が一個のクランプの面積を上回っているように切断線を設定し、前記細胞集合体が、前記細胞培養容器に接着している状態で前記切断線に沿って切断されて前記クランプが形成されるとともに切断されずに繋がり細胞培養容器に接着した周縁部が形成されることを特徴とする。
本発明に係るレーザ加工機は、細胞培養容器に接着している状態で増殖した細胞集合体から略均等な寸法を有する複数個のクランプを切り出すものであって、所定形状の複数個のクランプを切り出すための格子状の切断線の端が前記細胞集合体の外周縁までは到達せず、当該切断線によって切断されずに繋がった細胞集合体の周縁部を形成し、その周縁部の面積が一個のクランプの面積を上回っているように切断線を設定し、その切断線を走査するように前記細胞培養容器に接着している状態の前記細胞集合体にレーザ光を照射することで前記クランプが形成されるとともに切断されずに繋がり細胞培養容器に接着した周縁部が形成されるように細胞集合体を切断する。
本発明によれば、増殖した細胞集合体から略均等な形状及び寸法を有する複数個のクランプを切り出すとともに、形状または寸法の異なる切片の混入を適切に排除することが可能となる。
本発明の一実施形態におけるレーザ加工機の概要を示す斜視図。 同レーザ加工機のハードウェア資源構成を示す図。 同レーザ加工機の機能ブロック構成図。 同実施形態の細胞処理方法を説明する側断面図。 同実施形態の細胞処理方法によるクランプの切り出しの模様を示す平面図。 同実施形態の細胞処理方法によるクランプの切り出しの模様を示す平面図。 同実施形態の細胞処理方法によるクランプの切り出しの模様を示す平面図。 同実施形態の細胞処理方法によるクランプの切り出しの模様を示す平面図。
本発明の一実施形態を、図面を参照して説明する。本実施形態のレーザ加工機は、細胞培養容器１上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させるレーザ照射処理を実行するものである。このレーザ照射処理の詳細は、特願２０１５−１１１７５９号明細書に開示されている。図１に示すように、本レーザ加工機は、一または複数の細胞培養容器１を支持する支持体２と、支持体２に支持させた細胞培養容器１にレーザビームＬを照射するレーザ照射装置３と、細胞培養容器１に対するレーザビームＬの照射位置を操作する変位機構４と、レーザ照射装置３及び変位機構４を制御する制御部５とを主要な構成要素とする。
細胞培養容器１及び支持体２は、ＣＯ2インキュベータ（図示せず）内に配置されることが好ましい。ＣＯ2インキュベータは、その内部の雰囲気のＣＯ2濃度及び温度を調節することのできる周知のものであり、レーザ照射処理中における細胞の培養環境、例えば細胞培養容器１に充填されている培地のｐＨ等を好適な状態に維持する役割を担う。
レーザ照射装置３は、レーザ光源３１と、レーザ光源３１から供給されたレーザ光Ｌを細胞培養容器１に向けて出射させる加工ノズル３３と、レーザ光源３１と加工ノズル３３との間に介在しレーザ光源３１が出力するレーザ光Ｌを加工ノズル３３へと導く光学系３２とを備える。
レーザ光源３１は、連続波レーザまたはパルスレーザ（連続波に近い、パルス幅の長い高周波レーザでもよい）Ｌを発振する装置である。使用するレーザＬの波長は一意に限定されず、例えば４０５ｎｍ、４５０ｎｍ、５２０ｎｍ、５３２ｎｍ、８０８ｎｍ等の可視光レーザや赤外線レーザを採用することができる。尤も、後述する細胞培養容器１の被照射層１２がそのレーザＬのエネルギを吸収できるような波長を選択する必要がある。また、波長が３８０ｎｍ以下の紫外線レーザは、ＤＮＡやタンパク質に吸収される可能性があり細胞への影響が懸念される。故に、レーザＬの波長は３８０ｎｍよりも長いことが好ましい。本実施形態では、レーザ光源３１として、波長が４０５ｎｍ近傍にある最大出力５Ｗの連続波ダイオードレーザを想定している。
加工ノズル３３は、細胞培養容器１の被照射層１２に照射するべきレーザ光Ｌを集光するためのレンズや、レーザ光Ｌの出射のＯＮ／ＯＦＦを切り替えるためのシャッタまたはミラー等を内蔵する。加工ノズル３３は、支持体２に支持される細胞培養容器１の下方に位置し、上方に向かってレーザＬを出射させる。加工ノズル３３から出射するレーザビームＬの光軸は、細胞培養容器１の被照射層１２に対して略直交する。
レーザ光源３１から加工ノズル３３に向けてレーザＬを伝搬させる光学系３２は、光ファイバ、ミラー、レンズ等の任意の光学要素を用いて構成できる。
変位機構４は、支持体２に支持させた細胞培養容器１に対してレーザ照射装置３の加工ノズル３３を相対的に変位させるＸＹステージを主体とする。ＸＹステージ４は、リニアモータ台車等を介して対象物をＸ軸方向（左右方向）及びＹ軸方向（前後方向）に沿って高速かつ精密に移動させ得る既知のものである。本実施形態では、加工ノズル３３をＸＹステージ４に支持させ、加工ノズル３３を支持体２及び細胞培養容器１に対して移動させることとしている。だが、支持体２をＸＹステージ４に支持させ、支持体２及び細胞培養容器１を加工ノズル３３に対して移動させるようにしても構わない。何れにせよ、変位機構４により、細胞培養容器１の被照射層１２とレーザビームＬの光軸とが交わる角度を略一定に保ちながら、細胞培養容器１の被照射層１２に対するレーザＬの照射位置を変位させることができる。
図２に示すように、制御部５は、プロセッサ５ａ、メインメモリ５ｂ、補助記憶デバイス５ｃ、操作入力デバイス５ｄ、Ｉ／Ｏインタフェース５ｅ等を有し、これらがコントローラ（システムコントローラやＩ／Ｏコントローラ等）によって制御されて連携動作するものである。補助記憶デバイス５ｃは、フラッシュメモリ、ハードディスクドライブ、その他である。操作入力デバイス５ｄは、手指で操作可能なタッチパネル、トラックパッド、マウス等のポインティングデバイスや、キーボード、押下ボタン等である。Ｉ／Ｏインタフェース５ｅは、サーボドライバ（サーボコントローラ）を含むことがある。また、制御部５は、汎用的なパーソナルコンピュータ、サーバコンピュータ、ワークステーション等により構成されることがある。
制御部５が実行するべきプログラムは、補助記憶デバイス５ｃに記憶されており、プログラム実行の際に、メインメモリ５ｂに読み込まれ、プロセッサ５ａによって解読される。そして、制御部５は、プログラムに従い、図３に示す照射位置座標取得部５１、出力制御部５２及び機構操作部５３としての機能を発揮する。
照射位置座標取得部５１は、細胞培養容器１に対するレーザ光Ｌの照射位置を指し示す一または複数のＸＹ座標を取得する。ここに言うＸＹ座標とは即ち、細胞培養容器１内に存在している培養細胞のうちの致死させるべき細胞の位置を指し示す座標である。致死させるべき細胞とは、例えば、培養したい細胞または組織に混入した不要細胞や、継代培養の目的で細胞培養容器１内の細胞集合体６を複数の細胞クランプ６１に分割する際の切断線６２即ち複数のクランプ６１の境界線上にある細胞等である。レーザ光Ｌの照射位置の座標は、予めメインメモリ５ｂまたは補助記憶デバイス５ｃに格納されていることもあれば、ユーザの手によって指定されることもある。照射位置座標取得部５１は、メインメモリ５ｂまたは補助記憶デバイス５ｃに格納されている照射位置の座標を読み出すか、ユーザによる照射位置の座標の指定を操作入力デバイス５ｄを介して受け付ける。
細胞培養容器１内の細胞集合体６をＣＣＤやＣＭＯＳ等のカメラセンサを用いて撮影し、得られた画像を解析して不要細胞その他の致死させるべき細胞の位置を特定するという形で、レーザ光Ｌの照射位置の座標を得ることもできる。細胞集合体６から複数のクランプ６１を切り出すための切断線６２（上にある複数のＸＹ座標の集合）を設定する際には、細胞培養容器１内の細胞集合体６の撮影画像から細胞集合体６の外周縁６４を検出した上で、図５ないし図８に示すように、各切断線６２の少なくとも一方の端が細胞集合体６の外周縁６４まで到達しないよう、切断線６２の長さを演算することが好ましい。画像解析を通じた致死させるべき細胞の位置の検出、即ちレーザ光Ｌの照射位置（特に、切断線６２）の座標の決定は、制御部５自身が実行してもよく、制御部５と通信可能に接続している外部の装置またはコンピュータ（図示せず）により実行してもよい。前者の場合、照射位置座標取得部５１は、カメラセンサが撮影した画像をＩ／Ｏインタフェース５ｅを介して取得し、その画像を解析して照射位置の座標を取得する。後者の場合、照射位置座標取得部５１は、外部の装置またはコンピュータからもたらされる照射位置の座標をＩ／Ｏインタフェース５ｅを介して受信することにより、照射位置の座標を取得する。
出力制御部５２は、加工ノズル３３から細胞培養容器１の被照射層１２に向けたレーザＬの出射のＯＮ／ＯＦＦ、及び被照射層１２に照射するレーザＬの出力強度つまりはレーザＬの持つエネルギ量を制御する。具体的には、加工ノズル３３からのレーザＬの出射のＯＮ／ＯＦＦを指令する信号をＩ／Ｏインタフェース５ｅを介して加工ノズル３３に与えるとともに、レーザＬの出力を制御する信号をＩ／Ｏインタフェース５ｅを介して加工ノズル３３またはレーザ光源３１に与える。
機構操作部５３は、加工ノズル３３を支持しているＸＹステージ４を操作することで、加工ノズル３３を照射位置座標取得部５１において取得した照射位置の座標に向けて移動させ、加工ノズル３３から出射するレーザビームＬの光軸を当該照射位置の座標に位置づける。具体的には、照射位置座標取得部５１において取得した照射位置の座標に対応する指令の信号を、Ｉ／Ｏインタフェース５ｅを介してＸＹステージ４に与える。加工ノズル３３から連続波レーザＬまたは連続波に近い高周波数パルスレーザＬを出射させつつ、照射位置の座標の時系列に従って加工ノズル３３ひいてはレーザビームＬを移動させれば、レーザＬを細胞培養容器１の被照射層１２に照射しながらその照射位置を連続的に移動させる走査を実行することができる。
なお、細胞培養容器１（の被照射層１２）における一定の領域を加工ノズル３３の光軸によってラスタスキャンするように、加工ノズル３３を細胞培養容器１に対して相対的に移動させながら、加工ノズル３３の光軸が死滅させるべき細胞の直下に到達するタイミングで、加工ノズル３３からレーザＬを出射させるようにしてもよい。
図４に示すように、本実施形態の細胞培養容器１は、加工ノズル３３から出射するレーザ光Ｌを透過させ得る容器本体１１に、レーザ光Ｌの照射を受けて熱及び／または酸を発生させる光応答性材料を含む層である被照射層１２を設けたものである。
容器本体１１は、加工ノズル３３から出射するレーザＬが属する波長帯の光を透過させる透明性または透光性を有する、プラスチックやガラス等の材料により構成する。プラスチックの例としては、ポリスチレン系ポリマー、アクリル系ポリマー（ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等）、ポリビニルピリジン系ポリマー（ポリ（４−ビニルピリジン）、４−ビニルピリジン−スチレン共重合体等）、シリコーン系ポリマー（ポリジメチルシロキサン等）、ポリオレフィン系ポリマー（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等）、ポリエステルポリマー（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等）、ポリカーボネート系ポリマー、エポキシ系ポリマー等を挙げることができる。既製の培養容器を、そのまま容器本体１１として用いてもよい。容器本体１１の形状は、既製の培養容器と同様、ディッシュ（シャーレ）形、マルチディッシュ形、フラスコ形等とすることができる。
ポリスチレン系樹脂を用いて作製した容器本体１１の光透過率は非常に高く、光波長約３８０ｎｍ以上では８５％以上となる。但し、光波長約３８０ｎｍ以下では、光波長が短くなるほど光透過率が低下、即ち容器本体１１による光の吸収が増大してゆく。これは、ポリスチレン材料に含まれる不純物に起因するものと思われる。
被照射層１２は、加工ノズル３３から出射するレーザＬが属する波長帯の光を吸収する色素構造（発色団）を含んだポリマー（高分子）により構成することが好ましい。このような材料は、容器本体１１へのコーティングが容易であり、必要な細胞の接着性を確保でき、かつ細胞への移行も起こりにくいものとなるからである。レーザ光Ｌを吸収する色素構造の例としては、アゾベンゼン、ジアリールエテン、スピロピラン、スピロオキサジン、フルギド、ロイコ色素、インジゴ、カロチノイド（カロテン等）、フラボノイド（アントシアニン等）、キノイド（アントラキノン等）等といった有機化合物の誘導体を挙げることができる。並びに、ポリマーを構成する骨格の例としては、アクリル系ポリマー、ポリスチレン系ポリマー、ポリオレフィン系ポリマー、ポリ酢酸ビニルやポリ塩化ビニル、ポリオレフィン系ポリマー、ポリカーボネート系ポリマー、エポキシ系ポリマー等を挙げることができる。
被照射層１２の材料となる色素構造含有ポリマーの一具体例として、ポリ［メチルメタクリラート−ｃｏ−（ジスパースイエロー ７ メタクリラート）］（化１、（Ｃ5Ｈ8Ｏ2）m（Ｃ23Ｈ20Ｎ4Ｏ2）n）を示す。但し、このアゾポリマーにおけるアゾベンゼンの構造については、無置換のアゾベンゼンの他、ニトロ基やアミノ基、メチル基等で修飾した様々なバリエーションが考えられる。
Figure 0006680479
上述の色素構造含有ポリマーを含む原料液、または当該色素構造含有ポリマーを溶剤（１，２−ジクロロエタン、メタノール等）に溶解させた原料液を、スピンコート法やキャスト法等により容器本体１１の上向面即ちウェル１０の底に塗布して硬化させれば、レーザ光Ｌの照射を受けて熱を生じさせる被照射層１２を形成することが可能である。例えば、色素構造としてアゾベンゼンを有するポリマーを７μｇ／ｃｍ2の密度で容器本体１１の上向面即ちウェル１０の底に塗布すると、平均の厚みが７０ｎｍの被照射層１２をウェル１０の底に敷設することができる。なお、レーザ光Ｌを吸収する色素を容器本体１１の構成材料に含有させることで、または色素構造含有ポリマーを材料として容器本体１１を作製することにより、レーザ光Ｌの照射を受けて熱を生じさせる被照射層１２を形成しても構わない。
色素構造としてアゾベンゼンを有するポリマーを容器本体１１にコーティングして構成した、所定の厚みを有する被照射層１２の光吸収率は、光波長が約３６０ｎｍのときに約６０％でピークとなり、光波長が約３６０ｎｍから長くなるほど低下してゆく。この被照射層１２の光吸収率は、光波長が約４２５ｎｍ以上の領域では２０％を切る。だが、光波長が長くなってもある程度以上の光吸収性が存在しており、４０５ｎｍ、４５０ｎｍ、５２０ｎｍまたは５３２ｎｍの波長のレーザ光Ｌを当該被照射層１２に十分に吸収させることが可能である。
被照射層１２の材料として、上述の色素構造含有ポリマーとともに、またはこれに代えて、レーザ光Ｌの照射を受けて酸性物質を発生させる光酸発生剤を用いることも考えられる。上掲の特許文献１にも開示されている通り、光酸発生剤は、加工ノズル３３から出射するレーザＬが属する波長帯の光を吸収する色素構造（発色団）と、分解後に酸性物質となる酸前駆体とを備えた構造を有するものとすることが好ましい。スルホン酸誘導体、カルボン酸エステル類、オニウム塩類、ニトロベンズアルデヒド構造を有する光酸発生基等は、このような光酸発生剤に該当する。
特に、光酸発生剤となるスルホン酸誘導体の例として、チオキサントン系スルホン酸誘導体（スルホン酸１，３，６−トリオキソ−３，６−ジヒドロ−１Ｈ−１１−チア−アザシクロペンタ［ａ］アントラセン−２−イルエステル等）及びナフタレンイミド系スルホン酸誘導体（スルホン酸１，８−ナフタルイミド等）を挙げることができる。これら以外に、ジスルホン類、ジスルホニルジアゾメタン類、ジスルホニルメタン類、スルホニルベンゾイルメタン類、イミドスルホネート類、ベンゾインスルホネート類等のスルホン酸誘導体も採用することが可能である。
また、カルボン酸エステルの例として、１，８−ナフタレンジカルボン酸イミドメチルスルホネートや１，８−ナフタレンジカルボン酸イミドトシルスルホネート等を挙げることができ、オニウム塩の例として、テトラフルオロボレート（ＢＦ4 -）、ヘキサフルオロホスフェート（ＰＦ6 -）、ヘキサフルオロアンチモネート（ＳｂＦ6 -）等のアニオンを有するスルホニウム塩またはヨードニウム塩を挙げることができる。
上述の光酸発生剤をプラスチック（特に、ＰＭＭＡのようなアクリル系ポリマーやポリスチレン系ポリマー等）に含ませた原料液、または当該光酸発生剤を溶剤（１，２−ジクロロエタン、メタノール等）に溶解させた原料液を、スピンコート法やキャスト法等により容器本体１１の上向面即ちウェル１０の底に塗布して硬化させれば、レーザ光Ｌの照射を受けて熱とともに酸を生じさせる被照射層１２を形成することが可能である。例えば、色素構造としてチオキサントン骨格を有し、酸前駆体としてスルホン酸類を有するチオキサントン系スルホン酸誘導体を含んだポリマーを２００μｇ／ｃｍ2の密度で容器本体１１のウェル１０の底に塗布すると、平均の厚みが２μｍの被照射層１２をウェル１０の底に敷設することができる。なお、光酸発生剤を容器本体１１の構成材料に含有させることにより、レーザ光Ｌの照射を受けて熱及び酸を生じさせる被照射層１２を形成しても構わない。
色素構造としてチオキサントン骨格を有し、酸前駆体としてスルホン酸類を有するチオキサントン系スルホン酸誘導体を含んだポリマーを容器本体１１にコーティングして構成した、所定の厚みを有する被照射層１２の光吸収率は、光波長が約３７５ｎｍから約４６０ｎｍの範囲に亘って分布する。この範囲外の波長の光を当該被照射層１２が吸収することはできない。従って、４０５ｎｍまたは４５０ｎｍの波長のレーザ光Ｌであれば、当該被照射層１２に吸収させることが可能である。尤も、当該被照射層１２の光吸収率は、色素構造としてアゾベンゼンを有するポリマーを用いて構成した被照射層１２の光吸収率よりは小さくなり、光波長が約４００ｎｍから約７００ｎｍの可視光領域で２０％（さらに言えば、１０％）を切る。
被照射層１２は、レーザ光Ｌの照射を受けて蛍光を発しない材料を用いて構成することが好ましい。また、被照射層１２の厚みは、１０μｍ以下とすることが好ましい。
なお、細胞培養容器１の被照射層１２の表面に、細胞の接着性を高めるための材料、例えばラミニンやマトリゲル等のＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）をコーティングしてもよい。
細胞を培養する際には、細胞培養容器１の容器本体１１に成形されているウェル１０内に培地（特に、液体培地）１３を充填する。その培地１３は、ウェル１０の底に敷設されている被照射層１２の直上に所在することとなる。そして、培養される細胞は、当該被照射層１２の表面に接着しつつ増殖して細胞集合体６を形成する。
図４に示すように、細胞培養容器１のウェル１０内に存在している細胞のうちの所望の細胞を致死させるレーザ照射処理では、レーザ照射装置３の加工ノズル３３から出射するレーザ光Ｌを、支持体２に支持させた細胞培養容器１の被照射層１２における、致死させるべき細胞の直下の箇所に照射する。本実施形態では、加工ノズル３３を細胞培養容器１の下方に配置しており、加工ノズル３３から打ち上げたレーザ光Ｌを容器本体１１を透過させた上、被照射層１２に裏面側から照射する。加工ノズル３３に内蔵されているレンズは、加工ノズル３３から出射するレーザ光Ｌの焦点を細胞培養容器１の被照射層１２に合わせる。被照射層１２におけるレーザ光Ｌの照射を受けた箇所は、レーザ光Ｌのエネルギを吸収して熱及び／または酸を生じ、その熱によって当該箇所の直上に存在する細胞を死に至らしめる。
特に、被照射層１２の構成材料に光酸発生剤を用いているならば、被照射層１２におけるレーザ光Ｌの照射を受けた箇所で酸性物質が発生し、その酸性物質が当該箇所の直上に存在する細胞の死または被照射層１２からの剥離を促す。光酸発生剤がスルホン酸誘導体である場合、発生する酸性物質はスルホン酸類である。
レーザ光の波長は、例えば４０５ｎｍとする。レーザＬの出力の大きさは、０．４Ｗから５Ｗの間とする。無論、出力が５Ｗを超えていても構わない。レーザビームＬ径は、５０μｍ以下とする。連続波レーザまたは連続波に近いパルスレーザＬを出射する加工ノズル３３（つまりは、レーザビームＬ）を細胞培養容器１に対して移動させる走査の速さは、５０ｍｍ／秒から２０００ｍｍ／秒の間とする。レーザＬの出力が５Ｗ、レーザビームＬ径が５０μｍ、走査速度１５００ｍｍ／秒の場合、レーザ光Ｌの照射箇所においてレーザ光Ｌが与える単位面積あたりのエネルギ量（エネルギ密度）は約８．７Ｊ／ｃｍ2となる。上記のレーザ光Ｌの波長、出力及びエネルギ量は、仮にレーザビームＬを細胞に直射したとしても細胞が死に至らないような大きさであるが、被照射層１２の働きにより、不要な細胞を的確に死に至らしめることができる。
その上で、致死させるべき細胞以外の細胞、換言すれば不要細胞の周辺にある目的細胞または組織への熱影響を最小限に抑えるためには、被照射層１２に照射するレーザ光Ｌの波長、出力及びエネルギ量を、致死させるべき細胞が即死せずレーザ光Ｌの照射からある程度の時間が経過した後（例えば、数十分後、一時間後ないし数時間後。典型的には、６０分後または１２０分後）には死に至っているような大きさに調整することが好ましい。レーザ光Ｌの照射直後は対象の細胞が生存しており、その照射からある程度の時間が経過した後に当該細胞が死滅するという状況を作り出すことは現に可能である。
レーザＬの出力または単位面積あたりのエネルギ量の調整を通じて、致死させる細胞の幅または範囲の大きさを拡縮させることも可能である。レーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量が大きいほど、細胞が死滅する幅または範囲は拡大する。
また、レーザＬの照射から不要細胞が死に至るまでの所要時間も、レーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量が大きいほど短くなると考えられる。
レーザ照射処理に用いるレーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量の好適な条件は、細胞培養容器１に設ける被照射層１２の構成材料や厚み等の影響を受ける。レーザ光Ｌの照射を受けた被照射層１２がレーザ光Ｌのエネルギを吸収して発生させる単位面積あたりの熱量は、被照射層１２に照射されるレーザ光Ｌの持つ単位面積あたりエネルギ量に、単位面積の被照射層１２が当該レーザ光Ｌのエネルギを吸収して利用できる割合である光利用率を乗じたものとなる。この光利用率は、被照射層１２の構成材料の性質即ち光吸収率に依存するのは勿論のこと、レーザ光Ｌを吸収して熱を発する光熱反応に寄与する材料が被照射層１２の単位面積あたりどれくらいの量存在しているかによっても変化する。容器本体１１に被照射層１２を形成するために塗布する構成材料の塗布厚みを増せば、光熱反応に寄与する材料の量が増加して、単位面積の被照射層１２の光利用率も増大する。従って、被照射層１２において発生する単位面積あたりの熱量が増し、その分細胞が死に至りやすくなる。よって、細胞培養容器１に設ける被照射層１２の光利用率に応じて、細胞の死滅処理に適したレーザＬの出力及び／または単位面積あたりのエネルギ量を実験的に求める必要がある。
本実施形態のレーザ加工機及び細胞培養容器１は、培養した細胞集合体６を複数の部分に分割する作業に好適に利用できる。図５及び図６に示す例は、加工ノズル３３即ちレーザビームＬを細胞培養容器１に対して格子を描くように移動させる走査を行い、被照射層１２における、レーザＬの照射を受ける格子の部分の直上に存在する細胞を死滅させることにより、方形状の格子目の部分に存在する細胞の塊をクランプ６１として取り出そうとしている。要するに、細胞培養容器１上で培養した細胞集合体６を、格子に沿って切断している。レーザＬの照射を受ける格子の部分は、あるクランプ６１と他のクランプ６１とを隔てる切断線６２に相当する。
図５に示している例では、所定間隔で上記の格子の要素となる互いに平行な多数の筋を描画するように、レーザビームＬを細胞培養容器１に対しＸ軸方向またはＹ軸方向に沿って直線的に移動させる走査を行っている。Ｘ軸方向に伸びる各切断線６２及びＹ軸方向に伸びる各切断線６２はそれぞれ、その両端がともに細胞集合体６の外周縁６４までは到達しない。そのような切断線６２に沿ってレーザビームＬを走査できるよう、制御部５または制御部５と接続している外部の装置またはコンピュータにおいて、細胞培養容器１上の細胞集合体６の外周縁６４の位置を検出し、外周縁６４と交差しないような長さ寸法の切断線６２を設定する、即ち切断線６２上に所在する複数のＸＹ座標をレーザ光Ｌの照射位置座標として特定する。そして、制御部５が、加工ノズル３３の位置並びに加工ノズル３３から細胞培養容器１の被照射層１２に向けたレーザＬの出射のタイミングを制御して、当該切断線６２上に所在する複数のＸＹ座標にレーザＬを照射する。
レーザＬの照射から切断線６２上の細胞の死滅に要する時間が経過した後、切断線６２に包囲された細胞群をクランプ６１として取り出すことができる。このとき、細胞培養容器１から剥離したクランプ６１は、生細胞であるが故に丸まるように変形することがあり得る。切り出した個々のクランプ６１が被照射層１２の表面から容易に剥離する程度の接着性を有している場合には、細胞を剥離させるための酵素を使用せずとも、ウェル１０内に培養液その他の液体を注入する（または、クランプ６１に培養液その他の液体を掛ける）等して、クランプ６１を浮かせて回収することが可能である。但し、細胞培養容器１に接着する細胞をその表面から剥離させるために、酵素を使用しても構わない。
レーザ光Ｌの照射により切断線６２上にある細胞を致死させ、切断線６２に包囲された細胞群をクランプ６１として切り出すとき、細胞集合体６の周縁部６３にはクランプ６１として切り出されない細胞群が残存する。周縁部６３は切断線６２に包囲されない、即ち周縁部６３に隣接する切断線６２は周縁部６３の周りを一周連続しない。この切断されずに繋がった周縁部６３の面積は、一個一個のクランプ６１の面積よりも大きくなる。特に、図示例のように、各切断線６２の両端を細胞集合体６の外周縁６４まで到達しないように制御すれば、複数個のクランプ６１を取り巻くように一周連続した外周縁部６３を形成できる。繋がっている周縁部６３の面積が一個のクランプ６１の面積よりも大きいことから、周縁部６３を構成する細胞群の細胞培養容器１に対する接着性が、一個のクランプ６１を構成する細胞群の細胞培養容器１に対する接着性と比べて強くなる。従って、各クランプ６１を細胞培養容器１から剥離させる際に、クランプ６１でない周縁部６３の細胞群が細胞培養容器１から剥落してクランプ６１と混交するおそれが小さくなり、クランプ６１とクランプ６１以外の細胞群との分別が容易になる。
図６に示している例では、所定間隔で格子の要素となる互いに平行な多数の筋を描画するように、レーザビームＬを細胞培養容器１に対し、細胞集合体６の長手方向及び長手方向と直交する方向に沿って直線的に移動させる走査を行っている。細胞集合体６の長手方向に伸びる各切断線６２及び長手方向と直交する方向に伸びる各切断線６２はそれぞれ、その両端がともに細胞集合体６の外周縁６４までは到達しない。そのような切断線６２に沿ってレーザビームＬを走査できるよう、制御部５または制御部５と接続している外部の装置またはコンピュータにおいて、細胞培養容器１上の細胞集合体６の外周縁６４の位置を検出し、その外周縁６４から細胞集合体６の長手方向を決定した上、外周縁６４と交差しないような長さ寸法の切断線６２を設定する。そして、制御部５が、加工ノズル３３の位置並びに加工ノズル３３からのレーザＬの出射のタイミングを制御して、当該切断線６２上に所在する複数のＸＹ座標にレーザＬを照射する。
図７に示す例は、加工ノズル３３即ちレーザビームＬを細胞培養容器１に対して三角格子を描くように移動させる走査を行い、被照射層１２における、レーザＬの照射を受ける三角格子の部分の直上に存在する細胞を死滅させることにより、三角形状の格子目の部分に存在する細胞の塊をクランプ６１として取り出そうとしている。要するに、細胞培養容器１上で培養した細胞集合体６を、三角格子に沿って切断している。
この場合にも、各切断線６２の両端がともに細胞集合体６の外周縁６４までは到達しないよう、制御部５または制御部５と接続している外部の装置またはコンピュータにおいて、細胞培養容器１上の細胞集合体６の外周縁６４の位置を検出して、外周縁６４と交差しないような長さ寸法の切断線６２を設定する。そして、制御部５が、加工ノズル３３の位置並びに加工ノズル３３からのレーザＬの出射のタイミングを制御して、当該切断線６２上に所在する複数のＸＹ座標にレーザＬを照射する。
図８に示す例は、加工ノズル３３即ちレーザビームＬを細胞培養容器１に対して多数の閉じた環（特に、円弧）を描くように移動させる走査を行い、被照射層１２における、レーザＬの照射を受ける環の部分の直上に存在する細胞を死滅させることにより、環内に存在する細胞の塊をクランプ６１として取り出そうとしている。要するに、細胞培養容器１上で培養した細胞集合体６を、ちょうど型抜きのように、閉じた環状の切断線６２に沿って切断している。なお、図示例の切断線６２は真円状をなしているが、これを楕円状や六角形その他の多角形状としても構わない。
この場合にも、環状の各切断線６２が細胞集合体６の外周縁６４までは到達しないよう、制御部５または制御部５と接続している外部の装置またはコンピュータにおいて、細胞培養容器１上の細胞集合体６の外周縁６４の位置を検出して、外周縁６４と交差しないような複数の環状の切断線６２を設定する。そして、制御部５が、加工ノズル３３の位置並びに加工ノズル３３からのレーザＬの出射のタイミングを制御して、当該切断線６２上に所在する複数のＸＹ座標にレーザＬを照射する。
本実施形態の細胞処理方法は、増殖した細胞集合体６から略均等な寸法を有する複数個のクランプ６１を切り出す方法であって、所定形状のクランプ６１を切り出すための切断線６２によって切断されない細胞集合体６の周縁部の面積が一個のクランプ６１の面積を上回っているように前記切断線６２を設定していることを特徴とする。しかして、本実施形態のレーザ加工機は、そのように設定した切断線６２を走査するようにレーザ光Ｌを照射することで、細胞集合体６を切断するものである。
本細胞処理方法、並びに本実施形態のレーザ加工機及び細胞培養容器１によれば、高速かつ短時間のレーザ照射処理を通じて、細胞培養容器１上で培養された細胞のうちの特定の細胞を致死させることが可能である。細胞培養容器１上の細胞集合体６のうち、所望の細胞に分化しなかった不要細胞のみをピンポイントで死滅させることができるだけでなく、細胞培養容器１（の被照射層１２）における一定の領域をレーザビームＬによりラスタスキャンすることで、当該領域に所在する細胞をおしなべて死滅させることもできる。
特に、細胞集合体６に対し切断線６２に沿ってレーザＬを照射した後、または切断線６２に沿ってレーザＬを照射する前に、細胞集合体６の周縁部６３をレーザビームＬによりラスタスキャンして周縁部６３に存在する（クランプ６１として用いない）細胞群を致死させておけば、（酵素を使用する等して）細胞培養容器１からクランプ６１を剥離させる際に周縁部６３の細胞がともに剥離するおそれが小さくなる。即ち、クランプ６１に不必要な細胞群の断片を混入させずに済む。なお、この場合には、切断線６２の一端または両端が細胞集合体６の外周縁６４まで達することがある。
また、細胞培養容器１で培養した細胞集合体６をある部分と他の部分とに切り分ける切断線６２の直下にあたる被照射層１２にレーザＬを照射すれば、培養した細胞をある部分と他の部分とに分割することができる。これは、継代培養のために均一な大きさの細胞クランプ６１を簡便に抽出するために有効である。
細胞培養容器１に照射するレーザビームＬの径は５０μｍ以下に絞ることが可能であり、一個の細胞の寸法が２０μｍ以下であるヒトｉＰＳ細胞のような小形の細胞に対しても的確に処理を施すことができる。
さらに、細胞培養容器１の被照射層１２における致死させるべき細胞の直下の箇所に、当該細胞が即死せずある程度の時間が経過した後に致死するような出力またはエネルギ量を持つレーザ光Ｌを照射するようにすれば、致死させるべき細胞以外の細胞への熱影響を最小限に抑制でき、目的細胞または組織の収率をより一層向上させることができる。
なお、本発明は以上に詳述した実施形態に限られるものではない。まず、不要細胞を致死させるためのレーザ照射処理に使用するレーザＬの波長は、４０５ｎｍに限定されないことは言うまでもない。他の波長のレーザＬを採用する場合には、その波長の光を吸収することができる色素構造を含んだ材料（特に、ポリマー）を用いて細胞培養容器１の被照射層１２を構成することが求められる。例えば、波長が８０８ｎｍや１０６４ｎｍ等の近赤外線レーザＬを使用するのであれば、フタロシアニン類（フタロシアニン誘導体、フタロシアニン系近赤外線吸収色素）を材料として用いることが一案である。但し、その場合には、細胞に移行しないよう、ポリマーの側鎖に化学結合により固定されることが望ましい。また、配位錯体は、金属イオンが遊離することから、ポリマー化するものでも避けた方がよいと思われる。
レーザビームＬの径を、５０μｍよりもさらに小さく絞ってもよい。例えば、コア径の小さい光ファイバを加工ノズル３３に接続し、レーザ光源３１から供給されるレーザ光Ｌをこの光ファイバを通じて加工ノズル３３に入力するようにすれば、加工ノズル３３から出射するレーザビームＬの径を２５μｍ以下に絞ることができ、その分単位面積あたりのレーザＬのエネルギ量（エネルギ密度）が増す。これにより、レーザ光源３１の最大出力が大きくなくとも、レーザＬの照射箇所即ち不要細胞の存在する箇所に多量のエネルギをピンポイントに与えることが可能となる。
レーザビームＬを被照射層１２に照射したときの投影形状は、点状または円形状には限られない。レーザビームＬの投影形状を、所定方向に引き延ばした棒状のラインビームに成形しても構わない。
上記実施形態では、継代培養のための細胞クランプ６１を切り出す目的で、レーザビームＬを細胞培養容器１に対して格子を描くように移動させる走査を行っていたが、レーザビームＬによる走査の軌跡は格子状には限定されない。例えば、被照射層１２に複数の正六角形が隙間なく配列された六角網状（または、ハニカム構造）を描くように、即ち六角網状に細胞を死滅させるように、レーザビームＬを細胞培養容器１に対して移動させる走査を実行することが考えられる。その場合、切断線６２となる六角形の内に残る生細胞が細胞クランプ６１となる。
上記実施形態では、支持体２に支持させた細胞培養容器１に向けてレーザＬを照射する加工ノズル３３をＸＹステージ４に搭載し、加工ノズル３３をＸ軸方向及びＹ軸方向に移動させるようにしていたが、細胞培養容器１を支持する支持体２をＸＹステージ等の変位機構４に搭載して、細胞培養容器１をＸ軸方向及びＹ軸方向に移動させるようにしても構わない。あるいは、加工ノズル３３と支持体２とのうち一方をＸ軸方向に走行可能なリニアモータ台車等に搭載し、他方をＹ軸方向に走行可能なリニアモータ台車等に搭載することにより、加工ノズル３３から出射するレーザビームＬを細胞培養容器１の被照射層１２に対して相対的にＸ軸方向及びＹ軸方向の両方向に変位させ得るようにすることも考えられる。
細胞培養容器１の被照射層１２に対するレーザＬの照射位置を変位させるための変位機構４として、ガルバノスキャナを採用してもよい。周知の通り、ガルバノスキャナは、レーザ光源３１から供給されるレーザ光Ｌを反射するミラーをサーボモータやステッピングモータ等によって回動させるもので、ミラーを介してレーザＬの光軸を高速に変化させることが可能である。尤も、ガルバノスキャナを採用する場合、細胞培養容器１の被照射層１２に対してレーザ光Ｌの光軸が交わる角度を厳密には一定に保つことができない。また、レーザ光源が半導体レーザ等であり、当該レーザ光源が発振するレーザを光ファイバ等を用いてガルバノスキャナまで伝送する場合、被照射層１２に照射されるレーザビームＬの径若しくは投影形状の寸法を極小に絞ることも容易でない。レーザビームＬの径若しくは投影形状の寸法を極小に絞ってエネルギ密度を高めるためには、ＸＹステージ４やリニアモータ台車のような、レーザビームＬの光軸を細胞培養容器１の被照射層１２に対して相対的に平行移動させ得る機構を用いることが好ましい。但し、ファイバーレーザをレーザ光源として採用したり、固体レーザ光を集光したりすることにより、被照射層１２に照射されるレーザビームＬの径若しくは投影形状の寸法を極小に絞ることができるようになる。
細胞培養容器１内の細胞を撮影するカメラセンサを、加工ノズル３３に付設することも考えられる。
細胞培養容器１内の細胞を撮影する際の照明光源として、加工ノズル３３から出射するレーザ光Ｌを利用することも考えられる。無論、その場合に加工ノズル３３から細胞培養容器１に照射するレーザＬの出力は、不要細胞を死滅させるために細胞培養容器１に照射するレーザＬの出力よりも十分に弱める必要がある。
上記実施形態では、細胞培養容器１の容器本体１１に成形されているウェル１０の底に被照射層１２の材料となるポリマーを塗布して被照射層１２を構成していた。だが、複数のウェルを包有するマルチディッシュ形の容器本体に、スピンコート等によりポリマーを塗布して被照射層を形成することは困難を伴う。そこで、レーザ光Ｌの照射を受けて熱を生じさせる材料を含有する板状体を作製し、この板状体を容器本体の各ウェルの底に設置または接着することにより、細胞培養容器の被照射層を構成するようにすることが考えられる。板状体は、レーザ光Ｌを透過させる透明性または透光性を有するプラスチックやガラス等の材料により構成した薄板にレーザ光Ｌを吸収する色素を塗布したものであってもよく、そのような薄板の構成材料にレーザ光Ｌを吸収する色素を含有させたものであってもよい。上記実施形態において述べた色素構造含有ポリマーや光酸発生剤を、レーザ光Ｌを吸収する色素として用いることも当然に可能である。
上記実施形態では、レーザ光Ｌを細胞培養容器１の下方から容器本体１１を透過させた上で被照射層１２に照射していたが、レーザ光Ｌを上方即ち被照射層１２の表面側から（容器本体１１を透過させずに）被照射層１２に直接照射することも考えられる。この場合、容器本体１１がレーザ光Ｌを透過させる透明性または透光性を有している必要はない。照射するレーザ光Ｌの焦点は、被照射層１２の上にある細胞に合わせるのではなく、被照射層１２に合わせることが好ましい。
細胞培養容器１を用いてｉＰＳ細胞その他の細胞を培養する場合に、フィーダー細胞を併用してもよい。本発明に係るレーザ加工機は、細胞培養容器１内の不要となったフィーダー細胞を死滅処理するためにも利用できる。
被照射層１２が敷設されていない細胞培養容器で培養された細胞集合体６から複数個のクランプ６１を切り出す場合、レーザ加工機の加工ノズル３３から出射するレーザ光Ｌの焦点を細胞培養容器上の細胞集合体６の層に合わせ、レーザ光Ｌを細胞集合体６に直接照射することで、切断線６２上にある細胞を死滅させるようにしてもよい。この場合のレーザ光Ｌは、ピコ秒レーザやフェムト秒レーザのようなパルス幅が極小のパルスレーザであることがある。
レーザ加工機を使用するのではなく、極小の針や刃等を用いて細胞集合体６の切断を実行することも考えらえる。即ち、細胞集合体６からクランプ６１を切り出すために設定した切断線６２に沿って針や刃を変位させる走査を行い、当該切断線６２に沿って細胞集合体６を切断し、上記実施形態と同様の複数個のクランプ６１を得るのである。
その他、各部の具体的構成は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。
本発明は、細胞培養容器上で培養された細胞集合体から略均等な寸法を有する複数個のクランプを切り出す処理に用いることができる。
１…培養容器
１１…容器本体
１２…被照射層
３…レーザ照射装置
３３…加工ノズル
４…変位機構（ＸＹステージ）
５…制御部
６…細胞集合体
６１…クランプ
６２…切断線
６３…周縁部
６４…外周縁
Ｌ…レーザ光

Claims (2)

  1. 細胞培養容器に接着している状態で増殖した細胞集合体から略均等な寸法を有する複数個のクランプを切り出す方法であって、
    所定形状の複数個のクランプを切り出すための格子状の切断線の端が前記細胞集合体の外周縁までは到達せず、当該切断線によって切断されずに繋がった細胞集合体の周縁部を形成し、その周縁部の面積が一個のクランプの面積を上回っているように切断線を設定し、
    前記細胞集合体が、前記細胞培養容器に接着している状態で前記切断線に沿って切断されて前記クランプが形成されるとともに切断されずに繋がり細胞培養容器に接着した周縁部が形成されることを特徴とする細胞処理方法。
  2. 細胞培養容器に接着している状態で増殖した細胞集合体から略均等な寸法を有する複数個のクランプを切り出すものであって、
    所定形状の複数個のクランプを切り出すための格子状の切断線の端が前記細胞集合体の外周縁までは到達せず、当該切断線によって切断されずに繋がった細胞集合体の周縁部を形成し、その周縁部の面積が一個のクランプの面積を上回っているように切断線を設定し、
    その切断線を走査するように前記細胞培養容器に接着している状態の前記細胞集合体にレーザ光を照射することで前記クランプが形成されるとともに切断されずに繋がり細胞培養容器に接着した周縁部が形成されるように細胞集合体を切断するレーザ加工機。
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