JPWO2006088154A1

JPWO2006088154A1 - 細胞分離方法及び装置

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Publication number: JPWO2006088154A1
Application number: JP2007503756A
Authority: JP
Inventors: 丹羽　英夫; 英夫丹羽; 小林　明; 明小林; 佐藤　節哉; 節哉佐藤; 由多加松本; 勇王
Original assignee: Absize
Current assignee: Absize
Priority date: 2005-02-18
Filing date: 2006-02-17
Publication date: 2008-07-03
Also published as: CA2599043A1; ZA200706641B; EP1849861A1; US20080057558A1; WO2006088154A1; CN101208426A; EP1849861A4; IL185207A0

Abstract

本発明の目的は、異なる種類の細胞が混在する細胞集団から、非目的細胞を選択的に除去し、目的細胞を選択的に分離する方法、及び、細胞分離装置を提供することである。本発明は、異なる種類の細胞からなる細胞集団を単一細胞又は２個以上の細胞からなる細胞群として、特定の２次座標上に配置し、配置させた単一細胞あるいは細胞群に含まれる細胞を形状、サイズ又は細胞マーカーにより識別し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置された位置又は領域に、レーザー光に代表される物理的エネルギーを照射することにより、非目的細胞を選択的に死滅又は機能障害させることにより、目的細胞を選択的に分離する方法、及びその装置に関する。

Description

本発明は、単一細胞もしくは２個以上の細胞からなる細胞群を基材上の特定の位置に配置し、細胞の形状、サイズ又は細胞マーカーにより、目的細胞又は目的細胞を含む細胞群と、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群とを識別し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群に対してレーザー光を照射し、非目的細胞を選択的に死滅又は機能障害させ、目的細胞を分離する方法及びその装置に関するものである。

異なる細胞が混在する細胞集団から、特定の細胞を選択的に分離することは、細胞の機能・遺伝子の解析、細胞を利用した分析、診断、治療分野では極めて重要な技術である。特に、近年の細胞を使用した細胞・再生医療分野においては、治療効果が高く、また、安全性の高い治療用細胞を他の細胞の混入を最小限にして調整する技術の開発に対する期待は高い。
従来、細胞を選択的に分離する装置としては、セルソータが広く使用されている。しかし、これらの装置は、大量高速処理が可能であるとの特徴を有するが、その反面、細胞の化学的又は生物化学的処理、又は、細胞に対しては好ましくない条件での処理を必要とする等の問題点が存在する。また、特定細胞に選択的に結合する抗体を結合させた磁気ビーズを使用した細胞分離方法が考案されているが、本分離方法は、細胞回収率が極めて低く、解析、診断、治療を目的とする細胞分離方法としては好ましいものではない。また、選択的に細胞を分離することを目的とし、細胞群に存在する特定細胞にレーザー光を照射し殺傷するシステム（特許文献１、非特許文献１参照）が考案されているが、本システムでは、細胞集団に含まれるレーザー光照射を行なうターゲット細胞の特定と、レーザー光を照射するプロセスを除去したい細胞数に応じて実施する必要があり、分離効率は十分なものとは言えない。また、本システムにおいては、細胞のサイズ、形態の違いにより細胞に対して十分なレーザー光照射が行われず、分離効率が低下する等の問題が指摘されている。
ＷＯ０１／４０４５４、ＭｅｔｈｏｄａｎｄＡｐｐａｒａｔｕｓｆｏｒｓｅｌｅｃｔｉｖｌｙｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｃｅｌｌｓｗｉｔｈｉｎａｃｅｌｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＮｉｅｍｚＭ．Ｈ．Ｌａｓｅｒ−ｔｉｓｓｕｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９６

本発明は、異なる種類の細胞からなる細胞集団から、細胞集団に含まれる個々の細胞又は細胞群の形状、サイズ又は細胞特異的ラベルにより目的細胞と非目的細胞を識別し、非目的細胞へ選択的に物理的エネルギーを照射し、非目的細胞を殺傷又は障害を与えることにより、目的細胞を分離する細胞分離方法及び装置を提供するものである。

目的細胞と非目的細胞から構成される細胞集団を単一細胞又は２つ以上の細胞からなる細胞群として、細胞付着領域が配列された基材を用いて特定の位置又は領域に配置し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の存在する位置又は領域に対して選択的にレーザー光を照射することにより、非目的細胞を死滅又は機能障害を誘導することにより、目的細胞を高効率に分離することが可能であることを見いだし、本発明を完成させた。

即ち、本発明は、単一細胞もしくは２個以上の細胞からなる細胞群を基材上の特定の位置に配置し、単一細胞もしくは細胞群を構成する細胞の形状、サイズ又は細胞マーカーにより、目的細胞又は目的細胞を含む細胞群と、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群とを識別し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置された位置又は領域に対してレーザー光を照射し、非目的細胞を選択的に死滅又は機能障害させる細胞分離方法に関する。
また、本発明は、単一細胞もしくは２個以上の細胞からなる細胞群を基材上の特定の位置に配置し、単一細胞もしくは細胞群を構成する細胞の形状、サイズ又は細胞マーカーにより、目的細胞又は目的細胞を含む細胞群と、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群とを識別し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置された位置又は領域に対してレーザー光を照射し、非目的細胞を選択的に死滅又は機能障害させた後、目的細胞のみを培養する細胞分離方法に関する。

さらに、本発明は、単一細胞もしくは２個以上の細胞からなる細胞群を基材上の特定の位置に配置する機構、配置された単一細胞もしくは細胞群を構成する細胞を形状、サイズ又は細胞マーカーにより、目的細胞又は目的細胞を含む細胞群と非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群とを識別する機構、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置された位置又は領域に対してレーザー光を照射する機構を備えてなる細胞分離装置に関する。

上記本発明の方法及び装置、つまり、目的細胞と非目的細胞からなる細胞集団より、レーザー光を用いて非目的細胞を死滅又は機能障害させることにより除去し、目的細胞のみを効率的に分離する方法及び装置について、以下に詳細に説明する。

本発明の細胞分離方法においては、まず、目的細胞と非目的細胞が混在する細胞集団中に含まれる細胞を単一細胞又は２つ以上の細胞からなる細胞群として、基材上の特定の位置に配置させる。次に、配置された単一細胞又は細胞群に含まれる細胞の形状、サイズ又は細胞マーカーにより、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群を識別し、識別された位置又は領域に選択的にレーザー光を照射することにより、選択的に非目的細胞を死滅又は機能障害させることにより、目的細胞を選択的に分離する。
また、必要に応じて、非目的細胞が死滅又は機能障害された細胞群を、目的細胞に好適な条件下で培養することにより、目的細胞を取得する方法も、本発明の一部をなすものである。
目的細胞としては、特に限定されないが、例えば、間葉系幹細胞を含む細胞集団からＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子β）等によって分化誘導された軟骨細胞等が挙げられる。
非目的細胞としては、特に限定されないが、例えば、前記の間葉系幹細胞を含む細胞集団からの軟骨細胞への分化誘導系において、目的の細胞（即ち軟骨細胞）に分化しなかった細胞や、目的の細胞以外の細胞に分化した細胞等が挙げられる。

まず、単一細胞もしくは細胞群を基材上の特定の位置に配置する方法としては、単一細胞もしくは細胞群を、細胞非付着性表面を有する基材上にパターン状に配列された細胞付着性表面に配置する方法が使用される。
このように単一細胞もしくは細胞群を基材上の特定の位置に配置することにより、識別された非目的細胞の位置の認識が容易になり、より確実かつ安全にレーザー光により非目的細胞を死滅又は機能障害させることが可能となり、好ましい。

細胞非付着性表面上に細胞付着性表面をパターン状に配列する方法としては、細胞非付着性表面を有する基材上に、細胞付着性物質による細胞付着性表面をパターン状に形成する方法；細胞付着性表面を有する基材上に、細胞付着性表面がパターン状に露呈されるように、細胞非付着性物質により細胞非付着性表面を形成する方法等が挙げられる。

細胞非付着性表面を有する基材としては、細胞が付着、接着しないものであれば特に限定されるものではないが、その材質としては、ガラス、シリコン系化合物、細胞非付着性の高分子（例えば、ポリスチレン等の樹脂）等から構成されるものが好ましい。また、これら基材表面が、親水性高分子からなる表面皮膜又は改質されたものでもよい。該親水性高分子としては、例えばポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、さらにはこれらを構成する単量体の共重合体、セルロース等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、細胞非付着性物質としては、上記細胞非付着性表面を有する基材に用いられる材質と同じもの等が挙げられる。
細胞付着性物質、及び、細胞付着性表面を有する基材の材質としては、細胞が付着、接着するものであれば特に限定されるものではないが、例えば後述のような、金属酸化物、細胞接着性蛋白質とその誘導体、温度感受性ポリマー、光硬化性樹脂、その他細胞接着性の高分子（例えば、多糖類等）等が挙げられる。

細胞付着性表面を形成する方法としては、特開平７−３０８１８６号公報に記載される細胞接着性を有する高分子を固定化する方法、特開２００２−３５５０２６号公報に記載される細胞接着性を有する高分子のパターンをインクジェット法により基材表面に付与する方法等の利用が挙げられるが、これらに限定されるものではない。基材が、ガラス、又は水酸基、アミノ基、チオール基等の反応性官能基を表面に有する場合には、アルコール、ハロゲン化アルキル、有機シラン化合物を、スタンプ等の方法により基材表面に付与し、疎水性置換基を付加する方法も利用可能である。

細胞非付着性表面を有する基材上に細胞付着性表面を形成する方法としては、真空蒸着、スパッタリング等の物理蒸着方法、化学蒸着方法、めっき等の電気化学的被覆生成方法により形成する金属酸化物により表面改質する方法等が使用できる。本金属酸化物としては、酸化チタンが好ましいが、特に限定されるものではない。また、本細胞付着性表面に、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンに代表される細胞接着性蛋白質又はこれら蛋白質の断片の誘導体を、吸着又は固定化したものも利用できる。

また、細胞非付着性表面を有する基材上に細胞付着性表面を形成する方法としては、特開平４−０９４６７９号公報に記載されるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）に代表される温度感受性ポリマーによるパターン形成方法等も使用できる。特に、本ポリマーにより形成された細胞付着性表面は、一定の温度以下で被膜されたポリマー層の疎水性が減少し、結果、細胞非付着性表面へと変化する。
本発明は、レーザー光による非目的細胞の選択的な死滅又は機能障害に加え、同処理後の非死滅又は機能障害されていない目的細胞を回収し、本目的細胞を好適な条件において培養する方法を含んでおり、基材からの回収において、トリプシン等を使用する必要がない等の点において、温度感受性ポリマーによる細胞付着性表面の形成は、特に好ましい形態である。

細胞付着性表面を有する基材上に細胞付着性表面がパターン状に露呈されるように、細胞付着性表面を有する基材に細胞非付着性表面を形成する方法としては、特開平７−３０８１８６号公報に記載される細胞非付着性の高分子を固定化する方法、特開平１１−１５１０８６号公報に記載される細胞接着性基板にシリコン系化合物からなる細胞非付着性表面を固定する方法、光硬化性樹脂により製造される細胞付着性表面基材を底面とするマイクロウエルを形成させる方法等が挙げられる。
前記マイクロウエルの製造に使用される光硬化性樹脂としては、光による硬化後、細胞付着性が低く、また細胞適合性を有するものであれば特定に限定されるものではないが、特開平１０−１６８１６５号公報に記載されるオキセタン環を有する化合物及びエポキシ基含有化合物にカチオン系光重合開始剤が含まれた光硬化性樹脂等が挙げられる。

細胞非付着性表面を有する基材上に形成される細胞付着性表面、及び細胞付着性表面を有する基材上にパターン状に露呈される細胞付着性表面の、形状及びサイズについては、特に限定されるものではないが、単一細胞を配置する場合には、そのサイズは２０μｍ^２−４００μｍ^２が好ましく、また、２個以上の細胞からなる細胞群を配置する場合には、そのサイズは２００μｍ^２−１０００μｍ^２が好ましい。細胞付着性表面の形状については、例えば、円形及び矩形等が挙げられる。

本発明に使用される細胞を配置するために使用する基材の形態としては、シャーレ、培養フラスコ、密封型細胞培養装置等が利用できるが、細胞のバイアビリティーの維持又は外部からのコンタミネーションの防止等の観点から、密封型細胞培養装置が好ましい。なお、本密封型細胞培養装置には、培養液の循環のための構造、装置を有しているのも含まれる。

次に、基材上の特定の位置に配置された単一細胞又は細胞群から、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群を識別し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置された位置又は領域に選択的にレーザー光を照射し、目的細胞を分離する方法について説明する。

基材上に配置された単一細胞又は細胞群から、細胞の形状、サイズ又は細胞マーカーにより、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群を識別するとともに、これら非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置された位置を識別する。
細胞の形状、サイズ又は細胞マーカーによる識別は、顕微鏡観察又は細胞を蛍光ラベルした蛍光顕微鏡観察により実施される。
細胞の形状又はサイズにより識別する方法としては、顕微鏡観察像又は細胞を蛍光ラベルした蛍光顕微鏡観察像により、細胞の形状を球状、紡錘形、石敷状、樹枝状等の形状に識別する。細胞のサイズ識別は、顕微鏡観察像又は細胞を蛍光ラベルした蛍光顕微鏡観察像により、細胞の短径、長径又はその両者の組合せにより識別する。
細胞マーカーにより識別する方法としては、非目的細胞に存在するマーカー分子に選択的に結合する抗体、ペプチド、レクチン、糖鎖等を用いた直接又は間接的蛍光ラベリングや、非目的細胞膜選択的結合色素等が使用される。
なお、細胞マーカーによる識別ではマーカー分子に細胞を認識させる工程が必要となるので、細胞の形状、サイズにより識別するのが好ましい。細胞の形状、サイズにより識別する場合、画像解析ソフト等を用いて、より正確な定量が可能である。

単一細胞又は細胞群の観察画像は、ＣＣＤカメラにより取り込み、パソコン等の画像処理デバイスに伝送され、使用した基材の細胞配置可能位置を参照とし、本位置に存在する単一細胞又は細胞群が非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群であるかを認識し、本情報をレーザー照射装置に直接転送又は記憶装置に転送する。本ＣＣＤカメラによる画像の取り込みでは、使用するＣＣＤ素子の一視野の認識可能範囲ならびに細胞が配置されている基材のサイズに応じて、観察画像の取り込み、画像処理デバイスへの画像情報の転送を繰り返し実施し、細胞を配列させた基材の全領域を走査する。本繰り返しにおいては、基材が設置されたステージのＸＹ方向への移動、ＣＣＤカメラ等から構成される画像観察装置のＸＹ方向への移動、又はこれらの組み合わせにより行われる。

本発明において、透過光による画像観察のための光源としては、ハロゲンランプ光源、ＬＥＤ光源又はＬＤ光源が使用され、また、蛍光画像観察のための光源としては、ハロゲンランプ光源、ＬＥＤ光源又はＬＤ光源が使用され、また、蛍光観察画像の取得に際しては、観察蛍光波長以外の拡散した励起光をカットするために、吸収フィルター又は分光器が使用される。

次に、このようにして得られた基材上の細胞観察画像情報をもとに、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群に選択的にレーザー光を照射し、当該細胞を死滅又は細胞機能障害させる。

レーザー光の照射においては、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群が存在する領域へのスポット照射、又は、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群が存在する領域のパターンに応じたパターン化したレーザー光の照射、のいずれかの方法が使用される。
レーザー光は、レンズ系を通じて、パソコン等の画像処理デバイスに伝送され又は必要に応じて記憶装置に転送され、非目的細胞又は非目的細胞の配置位置に照射される。

レーザー光のスポット照射では、使用する基材の細胞又は細胞群の付着性表面の細胞に応じて、レンズ系の組み合わせにより、細胞又は細胞群の付着性表面全体にレーザー光が照射されるように、スポット径を調整する。
基材上に存在する非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の全てにレーザーを照射するには、細胞が配置された基材が配置されたＸＹステージの移動、ガルバノミラーに代表される電動ミラーによるレーザー光走査、又は、両者の組み合わせにより行われる。電動ミラーによるレーザー光走査においては、特開平４−３３４５４４号公報等に記載される電動ミラー（ガルバノミラー）を用いる方法を組み合わせることにより、より高効率にレーザー照射を行なえる。カルバノミラーに代表される電動制御ミラーとｆθレンズに代表される走査レンズを組み合わせることにより、より広範囲のレーザー走査が可能となり、基材が設置されたステージを移動することなく又は移動を最小限にすることができ、好ましい実施形態である。

パターン化したレーザー光の照射は、同時に複数の非目的細胞又は非目的細胞の存在領域にレーザー光を照射することが可能であり、高効率に非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群へのレーザー照射が可能となる。また、本パターン化したレーザー照射においても、ガルバノミラー、更にはｆθレンズとの組み合わせにより、基材が配置されたＸＹステージを移動することなく広範囲の細胞処理が可能となり、より好ましい実施形態である。
本発明におけるレーザーのパターン化においては、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）に代表される独立した角度の変更が可能なミラーを複数並べた素子、光の位相を制御して光の濃淡を制御する空間光変調素子、もしくは液晶フィルター等が使用される。

本発明において非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群に照射されるレーザーは、細胞を死滅又は機能障害を誘導するに十分なエネルギー強度を有し、かつ隣接する目的細胞又は目的細胞群に影響を与えない強度に調整される。
使用するレーザー光源としては、エキシマーレーザー、固体レーザー、半導体レーザー等、必要なレーザー強度を有するものであれば特に限定されないが、レーザー照射によって非線形光学効果による多光子吸収が誘起され、細胞に対して局所的な光反応が生じることにより細胞を破壊し、死滅又は機能障害へと至らせる効果が増すことが予想されるパルスレーザーであることが好ましい。また、処理効率を上げるために、高繰り返しのレーザー光源であることが好ましい。

このような多光子吸収過程が誘起されるには、光エネルギーが分子の熱エネルギーへと変換される時間スケールよりも短い必要があるとされ、その時間スケールが数十ｎｓｅｃ〜数百ｐｓｅｃ程度と考えられていることから、照射するレーザー光のパルス幅は、上限は好ましくは１０ｎｓｅｃ以下、より好ましくは５ｎｓｅｃ以下、さらに好ましくは１ｎｓｅｃ以下であり、下限は好ましくは５０ｆｓｅｃ以上、より好ましくは１００ｆｓｅｃ以上である。
また、パルスレーザー光源の繰り返し周波数は、処理効率を上げるために高繰り返しのレーザー光源であることが好ましいが、高繰り返し化によりレーザーパルス毎のピークパワーが低下するため、２０〜５０ｋＨｚの繰り返しが望ましい。
それらの条件として、１〜２０Ｗの出力であり、パルス幅が１００ｆｓｅｃ〜１０ｎｓｅｃ、２０〜５０ｋＨｚの繰り返しを有するレーザーであることが望ましい。

細胞又は細胞群に照射するエネルギーは、レーザー照射時間、レーザー出力により調整される。レーザー光の照射時間は、シャッターにて時間を制御することがより好ましい。
音響光学変調素子（ＡＯＭ）は、レーザーの繰り返し周波数よりも速く、最大で３５〜５０ＭＨｚ程度と高速な処理が可能となる。このため、細胞を死滅又は機能障害させる処理速度は、レーザー光源の繰り返し周波数に依存する。

また、使用されるレーザー光の波長については、特に限定されるものではないが、３００ｎｍから１１００ｎｍの波長が好ましい。４００ｎｍ以上の波長を有するレーザー光を使用する場合には、同波長光を吸収する色素等の化合物を細胞培養液に添加することにより、より効果的な細胞死滅又は機能障害を実現でき、例えば５３２ｎｍレーザー光使用時のアルラレッドの添加が例示されるが、これに限定されるものではない。

また、照射するレーザー光の強度は、光学素子によって調整することができる。具体的には、ＮＤフィルターを用いる方法；１／２λ波長板と偏光ビームスプリッターを組み合わせる方法；音響光学変調素子（ＡＯＭ）を用いる方法がある。

ＮＤフィルターを用いる方法は、一定量の光量を吸収する素材、もしくは反射する素材からなり、光強度以外の成分については光に変化を与えないＮＤフィルターを、レーザー光軸上に設置することで光を減光させる。
１／２λ波長板と偏光ビームスプリッターを組み合わせる方法では、１／２λ波長板により直線偏光したレーザー光の偏光方向を変化させて、偏光ビームスプリッターにより透過する光と反射される光に分割される割合を変えることで、レーザー光強度を変化させる。
音響光学変調素子（ＡＯＭ）を用いる方法では、素子に与えられた変調信号（超音波）に応じて、素子内で屈折率の疎密波を生じる。この疎密波を回折格子として用い、超音波の強度変調によって生じる回折光の強度を変化させることができる。この素子にレーザー光を透過させ、回折された光を取り出すことで、光強度を調整されたレーザー光を得ることができる。

上記のようにして、非目的細胞を選択的に死滅又は機能障害させ、目的細胞を分離することができる。
また、必要に応じて、非目的細胞が死滅又は機能障害された細胞群を、目的細胞の好適な条件で培養することにより、目的細胞を取得することができる。

次に、本発明の細胞分離装置について説明する。
本発明の細胞分離装置は、単一細胞もしくは２個以上の細胞からなる細胞群を基材上の特定の位置に配置する機構、配置された単一細胞もしくは細胞群を構成する細胞を形状、サイズ又は細胞マーカーにより、目的細胞又は目的細胞を含む細胞群と非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群とを識別する機構、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置された位置又は領域に対してレーザー光を照射する機構を備えてなる装置である。
また、必要に応じて、上記各機構をまとめて制御する機構も備えることができる。

当該細胞分離装置は、識別された非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群が配置された位置に、その細胞又は細胞群が配置されたパターンに応じてレーザー光を照射するため、レーザー光を配置パターンに応じてパターン化し、複数の非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群に同時にレーザー光を照射できる機構を備えていることが好ましい。
また、当該細胞分離装置は、識別された非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群が配置された位置に、その細胞又は細胞群が配置されたパターンに応じてレーザー光を照射するための機構として、レーザー光のパターンを形成する素子とそのパターン化されたレーザー光を偏向させる素子からなる機構、及び偏向させたレーザー光が細胞又は細胞群が配置された位置へ結像するための走査レンズからなる機構を備えていることが好ましい。

図１は、本発明の細胞分離装置の一つの実施形態である。
当該細胞分離装置は、（１）細胞観察系、（２）レーザー光源と光学系、（３）細胞操作系、（４）制御系の４つの系から構成されている。
なお、上述の細胞を配置する機構、細胞を識別する機構、レーザー光を照射する機構は、それぞれ、（３）細胞操作系、（１）細胞観察系、（２）レーザー光源と光学系に対応するものである。

（１）の細胞観察系では、細胞を観察するための顕微鏡が装備され、該顕微鏡には顕微鏡観察像を取り込むためのＣＣＤカメラが装備されている。また、透過光源に加え、蛍光色素ラベルした細胞を観察するための蛍光光源を取り付けてある。細胞の観察像はＣＣＤカメラを通じてパソコンに取り込まれ、目的細胞と非目的細胞を識別するとともに、その存在位置又は領域を特定する。細胞観察系には、細胞が配置された基材の全ての領域に渡って細胞を観察できるように、電動制御可能な基材ステージが備え付けられている。

（２）のレーザー光源と光学系では、レーザー照射によって細胞を死滅又は機能障害させるために十分な出力を持つレーザー光源が備え付けられている。このレーザー光は、必要に応じて照射を行なうためにシャッターを光軸上に設置する。照射するレーザー光が顕微鏡視野内において、認識されたいずれの位置においても集光照射可能となるように、電動ミラーであるガルバノミラーを通して顕微鏡に導入される。これにより、レーザー光の集光照射位置は、ＸＹ走査が可能となるが、顕微鏡視野の結像位置におけるレーザー集光位置及び集光径については、顕微鏡外部のレンズにより調整される。

（３）の細胞操作系では、細胞非付着性表面にパターン状に形成された細胞付着性表面を配置した培養容器に細胞を播種し、細胞をパターン上に配列させる。細胞をパターン化配列した培養容器の全領域にレーザー照射を行なうために、培養容器をＸＹ移動するための電動ステージを設置する。細胞が配置された培養容器には、細胞播種溶液、培養液、細胞回収液等を供給、回収又は循環するためのポンプが連結される。

（４）の制御系では、観察している細胞の画像を取り込み、パターン化された領域毎で、目的細胞、非目的細胞の存在を認識する。非目的細胞の存在する領域へレーザー光が照射されるように、ガルバノミラーの角度、顕微鏡外部のレンズ位置が調整される。制御系は、この他、シャッターの制御や、光源の強度制御等を行なう。

また、図２は、本発明の細胞分離装置の他の一つの実施形態である。
当該細胞分離装置は、（１）細胞観察系、（２）レーザー光源と光学系、（３）細胞操作系、（４）制御系の４つの系から構成されている。

（１）の細胞観察系では、細胞を観察するためのＣＣＤカメラと、細胞を認識するための蛍光光源があり、走査レンズであるｆθレンズとガルバノミラーを通して、観察される培養容器内の細胞の様子を認識することが出来る。ガルバノミラーを走査することで、ステージを動かさなくても広範囲な観察が可能となる。

（２）のレーザー光源と光学系では、レーザー光源からのレーザービームが均一な強度分布となるようにレンズで拡大された後、もう一つのレンズで平行光となるようにし、レンズ系を組み合わせている。拡大された均一なビームは、ＤＭＤ素子や位相変調素子を用いて、認識したパターン化された領域に応じてビーム形状を成形する。この成形されたビームをガルバノミラーとｆθレンズを通すことで、観察しているパターン化された領域の内、認識した特定の領域全てに対し、一度にビーム照射を行なう。ガルバノミラーで偏向されたビームは、ｆθレンズを通すことで、レーザービームを細胞の存在する平面で結像させることが出来る。レーザービームは必要に応じて照射を行なうために、シャッターを光軸上に設置している。

（３）の細胞操作系では、細胞非付着性表面にパターン状に形成された細胞付着性表面を配置した培養容器に細胞を播種し、細胞をパターン上に配列させる。細胞をパターン化配列した培養容器の全領域にレーザー照射を行なうために、培養容器をＸＹ移動するための電動ステージを設置する。細胞が配置された培養容器には、細胞播種溶液、培養液、細胞回収液等を供給、回収又は循環するためのポンプが連結される。このような細胞操作系において、培養と観察、レーザー処理を同時に行なう。

（４）の制御系では、後述の実施例１と同様に、観察している細胞の画像を取り込み、パターン化された領域毎で目的細胞、非目的細胞の存在を認識する。この認識した結果を解析して、非目的細胞を認識した全ての領域に対して同時に照射されるように、成形するビームの形状を計算する。この計算結果を、ビームを形成する素子に送り、任意の形状にてビームが照射されるように調整する。全観察領域を観察するために、一つの視野で認識できる領域はガルバノミラーによって順に走査される。これにより、細胞の状態に変化を与えず、観察とレーザー照射を行なう。

本発明の方法及び装置を用いることによって、異なる種類の細胞が混在する細胞集団から、非目的細胞を選択的に除去することにより、目的細胞に化学的又は物理的処理を施すことなく、目的細胞を高効率に分離することが可能である。また、本方法及び装置により分離された細胞又は細胞群は、細胞の機能・遺伝子解析、細胞を利用した物質の機能解析、又は細胞を用いた医療分野への使用に適する。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
以下のようにして、骨髄細胞より間葉系細胞を分離した。
１）日本白色兎の上腕骨頭から骨髄穿針により骨髄液を採取し、等量の１ｕ／ｍＬの濃度のヘパリンナトリウム（清水製薬）を含む生理食塩水（大塚製薬）を添加し、１２００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、血球画分を分離した。
２）分離血球画分を、１５％ウシ胎児血清（インヴィトロジェン１００９９−１４１）及び抗生物質−抗真菌剤（インヴィトロジェン１５２４０−０６２）を添加したαＭＥＭ培地（インヴィトロジェン１２５７１−０６３）に入ったＴ−７５フラスコ（ＩＷＡＫＩ３１１０−０７５）に加え、２日間培養し、付着性細胞のみを分離した。

３）本付着性細胞を前記αＭＥＭ培地に分散し、これを、ガラス基盤状に光硬化性樹脂（ディーメックＳＣＲ９５０）により調整した直径１００μｍのマイクロウエルが配置された基材上に加え、１２時間培養した。
４）マイクロウエル外の非付着性細胞を洗浄除去した後、蛍光色素のフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗ＣＤ３４抗体をマイクロウエル内に加えた後、蛍光観察によりＣＤ３４陽性細胞が存在するウエルを同定し、これらウエルに対して３５５ｎｍレーザー光を照射した。レーザー照射強度は、１５５Ｗ／ｃｍ^２で、１０秒間、マイクロウエル内全領域にわたって照射を行った。照射後にトリパンブルー染色により細胞の生死を確認したところ、レーザーを照射したウエル内全領域にわたって細胞が死滅したことが確認された。

５）レーザー照射後、基材をＰＢＳバッファー（リン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄し、死滅細胞由来のデブリスを除去し、更にトリプシン処理によりレーザー非照射細胞を基材より回収した。回収した細胞を、再び１５％ウシ胎児血清（インヴィトロジェン１００９９−１４１）及び抗生物質−抗真菌剤（インヴィトロジェン１５２４０−０６２）を添加したαＭＥＭ培地（インヴィトロジェン１２５７１−０６３）に入ったＴ−７５フラスコ（ＩＷＡＫＩ３１１０−０７５）に加え、２日間培養し、軟骨再生に有用な間葉系幹細胞を取得した。

本発明の細胞分離装置の構成の一例を示す。本発明の細胞分離装置の構成の一例を示す。

Claims

単一細胞もしくは２個以上の細胞からなる細胞群を基材上の特定の位置に配置し、単一細胞もしくは細胞群を構成する細胞の形状、サイズ又は細胞マーカーにより、目的細胞又は目的細胞を含む細胞群と、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群とを識別し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置された位置又は領域に対してレーザー光を照射し、非目的細胞を選択的に死滅又は機能障害させる細胞分離方法。
単一細胞もしくは２個以上の細胞からなる細胞群を基材上の特定の位置に配置し、単一細胞もしくは細胞群を構成する細胞の形状、サイズ又は細胞マーカーにより、目的細胞又は目的細胞を含む細胞群と、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群とを識別し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置された位置又は領域に対してレーザー光を照射し、非目的細胞を選択的に死滅又は機能障害させた後、目的細胞のみを培養する細胞分離方法。
単一細胞もしくは２個以上の細胞からなる細胞群を基材上の特定の位置に配置する機構、配置された単一細胞もしくは細胞群を構成する細胞を形状、サイズ又は細胞マーカーにより、目的細胞又は目的細胞を含む細胞群と非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群とを識別する機構、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置された位置又は領域に対してレーザー光を照射する機構を備えてなる細胞分離装置。
単一細胞もしくは２個以上の細胞からなる細胞群が、基材上の細胞非付着性表面にパターン状に配列された細胞付着性表面に配置されることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞分離方法又は請求項３記載の細胞分離装置。
単一細胞もしくは２個以上の細胞からなる細胞群が、細胞付着性表面が露呈されたマイクロウエルに配置されることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞分離方法又は請求項３記載の細胞分離装置。
識別された非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群が配置された位置に、その細胞又は細胞群が配置されたパターンに応じてレーザー光を照射するため、レーザー光を配置パターンに応じてパターン化し、複数の非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群に同時にレーザー光を照射できる機構を備えていることを特徴とする請求項３記載の細胞分離装置。
識別された非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群が配置された位置に、その細胞又は細胞群が配置されたパターンに応じてレーザー光を照射するための機構として、レーザー光のパターンを形成する素子とそのパターン化されたレーザー光を偏向させる素子からなる機構、及び偏向させたレーザー光が細胞又は細胞群が配置された位置へ結像するための走査レンズからなる機構を備えていることを特徴とする請求項３又は６記載の細胞分離装置。
細胞に照射するためのレーザー光が、パルスレーザーであることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞分離方法又は請求項３記載の細胞分離装置。