KR20220131302A - 형질감염 및 세포의 클론 집단 생성을 위한 장치 및 방법 - Google Patents
형질감염 및 세포의 클론 집단 생성을 위한 장치 및 방법 Download PDFInfo
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-
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Abstract
본원에는 세포를 형질감염시키고/거나 세포의 클론 집단을 생성하기 위한 카트리지로서, (a) 세포 형질감염을 수행하기 위해 구성된 제1 구획으로서, 제1 구획은 세포 샘플의 도입을 위해 구성된 제1 입구를 포함하는 것인 제1 구획; (b) 세포 선택을 수행하기 위해 구성된 제2 구획으로서, 제2 구획의 입구는 제1 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되고, 제2 구획은 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽 및 중간 세포 제거 포트에 작동 가능하게 연결된 출구를 추가로 포함하는 것인 제2 구획; 및 (c) 세포 확장을 수행하기 위해 구성된 제3 구획으로서, 제3 구획의 입구는 제2 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되는 것인 제3 구획을 포함하는 카트리지가 기재된다.
Description
상호 참조
본 출원은 2020년 1월 21일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/963,689호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
배경 기술
게놈 편집 기술은 게놈에 정확하고 표적화된 변경을 도입하기 위한 우수한 도구이지만, 이러한 편집을 수행하고 높은 처리량 방식으로 편집된 세포의 클론 집단을 생성하는 문제는 여전히 존재한다. 본 개시내용은 무엇보다도 현재 게놈 편집 기술 분야에 존재하는 이들 및 기타 관련 문제를 다룬다.
발명의 개요
세포를 형질감염시키고/거나 세포의 클론 집단을 생성하기 위한 장치, 방법, 및 시스템이 기재된다.
다음을 포함하는 카트리지가 본원에 개시된다: (a) 세포 형질감염을 수행하기 위해 구성된 제1 구획으로서, 제1 구획은 세포 샘플의 도입을 위해 구성된 제1 입구를 포함하는 것인 제1 구획; (b) 세포 선택을 수행하기 위해 구성된 제2 구획으로서, 제2 구획의 입구는 제1 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되고, 제2 구획은 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽 및 중간 세포 제거 포트에 작동 가능하게 연결된 출구를 추가로 포함하는 것인 제2 구획; 및 (c) 세포 확장을 수행하기 위해 구성된 제3 구획으로서, 제3 구획의 입구는 제2 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되는 것인 제3 구획.
다음을 포함하는 카트리지가 또한 개시된다: (a) 세포 형질감염을 수행하기 위해 구성된 제1 구획으로서, 제1 구획은 세포 샘플의 도입을 위해 구성된 제1 입구를 포함하는 것인 제1 구획; (b) 세포 선택을 수행하기 위해 구성된 제2 구획으로서, 제2 구획의 입구는 제1 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되고, 제2 구획은 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽을 추가로 포함하는 것인 제2 구획; 및 (c) 세포 확장을 수행하기 위해 구성된 제3 구획으로서, 제3 구획은 전기 임피던스 측정을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 전극 쌍을 포함하고, 제3 구획의 입구는 제2 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되는 것인 제3 구획.
다음을 포함하는 카트리지가 또한 개시된다: (a) 세포 형질감염을 수행하기 위해 구성된 제1 구획으로서, 제1 구획은 세포 샘플의 도입을 위해 구성된 제1 입구를 포함하는 것인 제1 구획; (b) 세포 선택을 수행하기 위해 구성된 제2 구획으로서, 제2 구획의 입구는 제1 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되고, 제2 구획은 제2 구획은 광절제 및 광분리(photodetachment)를 수행하기 위한 레이저 광원에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽을 추가로 포함하는 것인 제2 구획; 및 (c) 세포 확장을 수행하기 위해 구성된 제3 구획으로서, 제3 구획의 입구는 제2 유체 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되는 것인 제3 구획.
(a) 세포 형질감염, 세포 선택, 세포 확장, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 구획을 포함하는 카트리지로서, 카트리지는 세포 샘플의 도입을 위해 구성된 입구를 포함하고, 적어도 하나의 구획은 광분리 공정 및 광절제 공정 모두의 수행을 용이하게 하기 위해 광원에 작동 가능하게 연결될 수 있는 광학적으로 투명한 벽을 포함하는 것인 카트리지가 또한 개시된다.
개시된 카트리지의 일부 실시양태에서, 제1 구획 (또는 적어도 하나의 구획)은 다음 중 적어도 하나를 추가로 포함한다: (i) 형질감염제(Transfection agent)의 도입을 위해 구성된 제2 입구, (ii) 제한된 유동 경로, (iii) 제1 구획( 또는 적어도 하나의 구획)의 대향 표면과 전기적으로 접촉하고 그 표면 상에 위치된 전극 쌍, 및 (iv) 광학적으로 투명한 벽. 일부 실시양태에서, 제1 구획 또는 적어도 하나의 구획의 최장 치수는 약 1 밀리미터 내지 약 30 밀리리터이다. 일부 실시양태에서, 제1 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 부피는 약 1 마이크로리터 내지 약 1 밀리리터이다. 일부 실시양태에서, 제한된 유동 경로는 폭이 약 2 마이크로미터 내지 약 10 마이크로미터 범위인 적어도 하나의 수치의 제한부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제한된 유동 경로는 세포 샘플의 세포 평균 직경보다 작은 적어도 하나의 치수의 제한부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제한된 유동 경로는 세포 샘플의 세포 평균 직경의 1/2보다 작은 하나의 치수의 제한부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전극 쌍은 평행한 판 전극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전극 쌍은 백금, 금, 은, 구리, 아연, 알루미늄, 그래핀, 또는 인듐 주석 산화물로 제작된다. 일부 실시양태에서, 전극 쌍은 약 10 마이크로미터 내지 약 10 밀리미터 범위의 거리만큼 분리된다. 일부 실시양태에서, 제1 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 광학적으로 투명한 벽은 전자기 스펙트럼의 자외선, 가시광선, 또는 근적외선 영역, 또는 이들의 임의의 조합에서 투명하다. 일부 실시양태에서, 제1 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 광학적으로 투명한 벽은 약 355 nm를 중심으로 하는 파장 범위에서 투명하다. 일부 실시양태에서, 제1 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 광학적으로 투명한 벽은 약 785 nm를 중심으로 하는 파장 범위에서 투명하다. 일부 실시양태에서, 제1 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 광학적으로 투명한 벽은 약 1440 nm 내지 약 1450 nm 범위에서 투명하다. 일부 실시양태에서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 최장 치수는 약 1 센티미터 내지 약 10 센티미터이다. 일부 실시양태에서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 부피는 약 1 마이크로리터 내지 약 10 밀리리터이다. 일부 실시양태에서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 광학적으로 투명한 벽은 전자기 스펙트럼의 자외선, 가시광선, 또는 근적외선 영역, 또는 이들의 임의의 조합에서 투명하다. 일부 실시양태에서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 광학적으로 투명한 벽은 약 1440 nm 내지 약 1450 nm 범위에서 투명하다. 일부 실시양태에서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 벽은 부착 세포의 부착을 용이하게 하기 위한 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 벽은 현탁 세포의 부착을 용이하게 하기 위한 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면 코팅은 α-폴리-리신 코팅, 콜라겐 코팅, 폴리-1-오르니틴, 피브로넥틴 코팅, 라미닌 코팅, Synthemax™ 비트로넥틴 코팅, iMatrix-511 재조합 라미닌 코팅, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 표면 처리는 플라즈마 처리, UV 처리, 오존 처리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함하는 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 벽은 광학적으로 투명한 벽이다. 일부 실시양태에서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)은 내부에 위치된 물리적 장벽, 유동 제한부, 또는 칸막이(partition)이 없는 챔버를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 최장 치수는 약 1 센티미터 내지 약 20 센티미터이다. 일부 실시양태에서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 부피는 약 1 마이크로리터 내지 약 1 밀리리터이다. 일부 실시양태에서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)은 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 광학적으로 투명한 벽은 전자기 스펙트럼의 자외선, 가시광선, 또는 근적외선 영역, 또는 이들의 임의의 조합에서 투명하다. 일부 실시양태에서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)은 전기 임피던스 측정을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 전극 쌍을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 세포 성장 배지를 저장하도록 구성된 제4 구획 (또는 적어도 하나의 구획)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 폐기물을 저장하도록 구성된 제5 구획 (또는 적어도 하나의 구획)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제4 또는 제5 구획 (또는 적어도 하나의 구획)은 가스 투과성 막을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 입구는 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획) 내의 표면으로부터 세포의 분리를 용이하게 하는 시약의 공급원에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 입구는 제3 구획 (또는 적어도 제2 구획) 내의 표면으로부터 세포의 분리를 용이하게 하는 시약의 공급원에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 유리, 용융 실리카, 실리콘, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고밀도 폴리에틸렌(HDPE), 폴리이미드(PI), 환형 올레핀 중합체(COP), 환형 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리스티렌(PS), 에폭시 수지, 세라믹, 금속, Flexdym 또는 이들의 임의의 조합으로 제작된다. 일부 실시양태에서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 출구는 삼방 밸브를 사용하여 세포 제거 포트 및 제3 구획 (또는 적어도 제2 구획)의 입구에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 입구는 삼방 밸브를 사용하여 제2 구획 (또는 적어도 제2 구획)의 출구 및 제4 구획 (또는 적어도 제3 구획)의 출구에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 삼방 밸브는 프로그램 가능한 삼방 밸브이다. 일부 실시양태에서, 미세유체 카트리지는 미국 국립 표준 협회(ANSI: American National Standards Institute) 표준 번호 SLAS 4-2004(R2012)를 준수하는 풋프린트를 갖는다. 일부 실시양태에서, 미세유체 카트리지는 길이가 127.76 mm ± 0.5 mm이고 폭이 85.48 mm ± 0.5 mm인 풋프린트를 갖는다.
형질감염된 세포의 클론 집단을 생성하는 방법이 본원에 개시되며, 방법은 (a) 카트리지를 제공하는 단계로서, 카트리지는 세포 형질감염, 세포 선택, 세포 확장, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 구획을 포함하고, 적어도 하나의 구획은 광학적으로 투명한 벽을 포함하는 것인 단계; (b) 세포 샘플을 적어도 하나의 구획에 도입하는 단계; (c) 세포 샘플을 하나 이상의 형질감염제로 형질감염시키는 단계; (d) 형질감염된 세포 샘플로부터 유래된 적어도 하나의 클론 세포 콜로니를 선택하는 단계; (e) (d)에서 선택된 적어도 하나의 클론 세포 콜로니를 제외한 모든 클론 세포 콜로니를 파괴하기 위해 광절제를 수행하는 단계; 및 (d)에서 선택된 적어도 하나의 클론 세포 콜로니를 세포 분열 및 성장의 1회 이상의 주기로 처리하여 형질감염된 세포의 클론 집단을 생성하는 단계를 포함한다.
개시된 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 (d)에서 선택된 적어도 하나의 클론 세포 콜로니로부터 세포의 제1 서브세트를 분리하는 단계, 및 테스트를 위해 그것을 카트리지로부터 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 테스트의 결과, 예를 들어 원하는 편집의 서열을 확인하기 위한 클론의 시퀀싱은 클론 확장을 위한 세포를 선택하기 위한 기초로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포의 제1 서브세트가 분리되고 테스트를 거친 세포의 서브세트를 제외한 나머지 모든 클론 세포 콜로니를 파괴하기 위해 광절제를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 샘플은 부착 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 샘플은 현탁 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 샘플은 포유동물 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포 샘플 내의 세포의 수는 10,000개 미만이다. 일부 실시양태에서, 세포 샘플 내의 세포의 수는 5,000개 미만이다. 일부 실시양태에서, 세포 샘플 내의 세포의 수는 1,000개 미만이다. 일부 실시양태에서, 세포 샘플 내의 세포의 수는 500개 미만이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 형질감염제는 DNA 분자, RNA 분자, 올리고뉴클레오티드, 앱타머, 비-플라스미드 핵산 분자, 리보핵단백질(RNP), 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드, 인공 염색체, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상의 유형을 포함한다. 일부 실시양태에서, (c)에서 수행되는 형질감염은 화학적 형질감염, 기계적 형질감염(스퀴징), 전기천공, 레이저 유도 광천공, 바늘 기반 천공, 임페일펙션(impalefection), 마그네토펙션(magnetofection), 초음파천공, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 형질감염된 세포 샘플로부터 유래된 클론 세포 콜로니는 50개 세포/㎟ 이하의 세포 표면 밀도로 형질감염된 세포를 적어도 하나의 구획의 표면에 시딩함으로써 성장된다. 일부 실시양태에서, 형질감염된 세포 샘플로부터 유래된 클론 세포 콜로니는 10개 세포/㎟ 이하의 세포 표면 밀도로 형질감염된 세포를 적어도 하나의 구획의 표면에 시딩함으로써 성장된다. 일부 실시양태에서, 형질감염된 세포 샘플로부터 유래된 클론 세포 콜로니는 5개 세포/㎟ 이하의 세포 표면 밀도로 형질감염된 세포를 적어도 하나의 구획의 표면에 시딩함으로써 성장된다. 일부 실시양태에서, 형질감염된 세포를 적어도 하나의 구획에 시딩한 후, 2개 이상의 세포를 포함하는 임의의 세포 클러스터는 단일 세포가 클론 콜로니를 형성하도록 하기 전에 광절제 단계를 사용하여 파괴된다. 일부 실시양태에서, (d)에서 선택하는 단계는 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 무작위로 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, (d)에서 선택하는 단계는 적어도 하나의 구획의 내부 표면 상의 위치에 기초하여 적어도 하나의 클론 세포 콜로니를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, (d)에서 선택하는 단계는 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포 수, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 형태, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 표면 밀도, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 성장 패턴, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 성장 속도, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 분열 속도, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포에 의한 외인성 리포터의 발현, 또는 이들의 임의의 조합에 기초한다. 일부 실시양태에서, (d)에서 선택하는 단계는 적어도 하나의 클론 세포 콜로니가 성장되는 표면 또는 부피를 이미징하는 단계에 기초한다. 일부 실시양태에서, 이미징하는 단계는 명시야 이미징, 암시야 이미징, 위상차 이미징, 형광 이미징, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 획득된 이미지는 자동화 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 처리된다. 일부 실시양태에서, 이미징을 수행하는 데 사용되는 이미징 시스템의 시야는 표면적 또는 부피보다 작고, 이미징하는 단계는 표면적 또는 부피의 전부 또는 일부를 집합적으로 커버하는 2개 이상의 개별 이미지를 획득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이미징하는 단계는 1일당 적어도 1회의 빈도로 수행된다. 일부 실시양태에서, 이미징하는 단계는 시간당 적어도 1회의 빈도로 수행된다. 일부 실시양태에서, (d)에서 선택하는 단계는 하나 이상의 이미지의 자동화 이미지 분석에 기초하여 자동으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 구획의 벽은 부착 세포의 부착을 용이하게 하기 위한 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 구획의 벽은 현탁 세포의 부착을 용이하게 하기 위한 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면 코팅은 α-폴리-리신 코팅, 콜라겐 코팅, 폴리-1-오르니틴, 피브로넥틴 코팅, 라미닌 코팅, Synthemax™ 비트로넥틴 코팅, iMatrix-511 재조합 라미닌 코팅, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서,표면 처리는 플라즈마 처리, UV 처리, 오존 처리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함하는 적어도 하나의 구획의 벽은 광학적으로 투명한 벽이다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 서브세트는 레이저 광분리를 사용하여 분리된다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 아래에 있거나 또는 그 콜로니에 인접한 표면 영역이 레이저 광으로 조명되는 동안 적어도 하나의 클론 세포 콜로니가 성장되는 표면을 가로질러 유도되는 액체의 유동에 세포의 제1 서브세트를 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 레이저 광을 사용한 조명은 세포를 적어도 하나의 구획의 벽에 테더링하는 데 사용되는 광절단 가능한 링커의 절단을 유도한다. 일부 실시양태에서, 레이저 광을 사용한 조명은 세포의 제1 서브세트의 광열적 분리를 유도한다. 일부 실시양태에서, 레이저 광을 사용한 조명은 하나 이상의 선택된 세포의 광기계적 분리를 유도한다. 일부 실시양태에서, 레이저 광을 사용한 조명은 하나 이상의 선택된 세포의 광음향적 분리를 유도한다. 일부 실시양태에서, 레이저 광분리는 약 1440 nm 내지 약 1450 nm의 파장 범위의 레이저 광을 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 80%이다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 90%이다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 95%이다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 서브세트는 100개 미만의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 서브세트는 50개 미만의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 서브세트는 10개 미만의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 서브세트는 단일 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 테스트는 핵산 시퀀싱을 포함한다. 일부 실시양태에서, 테스트는 유전자 발현 프로파일링을 포함한다. 일부 실시양태에서, 테스트는 변형된 유전자의 검출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 테스트는 CRISPR 편집 유전자의 검출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 테스트는 핵산 분자의 제한 부위 분석을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 테스트는 단백질의 검출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 돌연변이 단백질, 리포터 단백질, 또는 유전적으로 조작된 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 테스트는 변경된 단백질 기능으로 인한 세포 내 신호전달 경로의 변화의 검출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 광절제는 약 1440 nm 내지 약 1450 nm의 파장 범위의 레이저 광을 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 광절제 효율은 적어도 80%이다. 일부 실시양태에서, 광절제 효율은 적어도 90%이다. 일부 실시양태에서, 광절제 효율은 적어도 95%이다. 일부 실시양태에서, 형질감염된 세포의 클론 집단의 성장은 전기 임피던스 측정을 사용하여 모니터링된다. 일부 실시양태에서, 방법은 지정된 수의 세포 분열 및 성장 주기 후에 형질감염된 세포의 클론 집단을 수거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 형질감염된 세포의 클론 집단을 이들이 적어도 하나의 구획에서 적어도 70% 합류도(confluency)에 도달한 후 수거하는 단계를 추가로 포함한다.
다음을 포함하는 장치가 본원에 개시된다: (a) 세포 형질감염, 세포 선택, 세포 확장, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 구획을 포함하는 카트리지로서, 적어도 하나의 구획은 광절제 및 광분리를 수행하기 위한 레이저 광원에 작동 가능하게 연결된 광학적으로 투명한 벽을 포함하는 것인 카트리지; 및 (b) 제어기.
일부 실시양태에서, 제어기는 다음 중 적어도 하나를 수행하도록 구성된다: (i) 카트리지를 통해 유동하는 하나 이상의 유체에 대한 타이밍 및 유량을 제어하는 단계; (ii) 이미징 유닛에 의해 획득된 이미지의 수동, 반자동, 또는 완전 자동 이미지 처리를 수행하고, 처리된 이미지로부터 유도된 데이터에 기초하여, 레이저 기반 광분리를 위한 세포의 제1 서브세트와 레이저 기반 광절제를 위한 세포의 제2 서브세트를 선택하는 단계; 및 (iii) 세포의 제1 서브세트가 광분리되고 제2 서브세트의 세포가 광절제되도록 하나 이상의 레이저 및 레이저 표적화 유닛에 대한 레이저 작동 매개변수를 제어하는 단계. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 서브세트 및 세포의 제2 서브세트는 둘 다 단일 클론 세포 콜로니로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 레이저 표적화 유닛은 이미징 유닛의 객체 평면 상의 레이저 초점에 있거나 또는 그 초점에 인접한 적어도 하나의 구획 내의 표면 상에 또는 그 구획의 부피 내에 성장하는 세포를 정확하게 배치하도록 구성된 병진 스테이지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 레이저 표적화 유닛은 적어도 하나의 구획 내의 표면 상에 또는 그 구획의 부피 내에 성장하는 하나 이상의 세포의 위치에 또는 그 위치에 인접한 집속된 레이저 광을 유도하도록 구성된 스캐닝 메커니즘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 형질감염은 제1 구획에서 수행되고, 세포 선택 및 세포 확장은 제2 구획에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 세포 형질감염, 세포 선택, 및 세포 확장은 각각 별도의 구획에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 세포 형질감염, 세포 선택, 및 세포 확장은 모두 동일한 구획에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 이미징 유닛은 명시야 이미징, 암시야 이미징, 위상차 이미징, 형광 이미징, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 이미징 유닛의 시야는 세포가 성장되거나 부착되는 적어도 하나의 구획 내의 표면적 또는 그 구획 내의 부피보다 작고, 이미징 유닛은 표면적 또는 부피의 전부 또는 일부를 집합적으로 커버하는 2개 이상의 개별 이미지를 획득하여 타일링하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 이미징 유닛은 1일당 적어도 1회의 빈도로 이미지를 획득하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 이미징 유닛은 시간당 적어도 1회의 빈도로 이미지를 획득하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, (ii)에서 선택하는 단계는 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 무작위로 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, (ii)에서 선택하는 단계는 적어도 하나의 구획의 표면 상의 위치에 기초하여 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, (ii)에서 선택하는 단계는 클론 세포 콜로니 내의 세포 수, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 형태, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 표면 밀도, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 성장 패턴, 클론 세포 콜로니 내의 세포 성장 속도, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 분열 속도, 클론 세포 콜로니 내의 세포에 의한 외인성 리포터의 발현, 또는 이들의 임의의 조합에 기초한다. 일부 실시양태에서, 광절제 및 광분리를 수행하는 데 동일한 레이저가 사용된다. 일부 실시양태에서, 광분리 및 광절제에 사용되는 하나 이상의 레이저는 이미징에 사용되는 대물렌즈를 통해 이미징 시스템에 광학적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 광분리 및 광절제를 수행하는 데 사용되는 하나 이상의 레이저는 적어도 하나의 펄스 레이저를 포함한다. 일부 실시양태에서, 광분리 및 광절제를 수행하는 데 사용되는 하나 이상의 레이저는 적어도 하나의 적외선 레이저를 포함한다. 일부 실시양태에서, 장치는 레이저 스폿 크기, 레이저 스폿 형상, 레이저 광 강도, 레이저 펄스 주파수, 레이저 펄스 에너지, 적어도 하나의 구획의 표면 상의 또는 그 구획의 부피 내의 지정된 위치에서 전달되는 레이저 펄스의 총수, 적어도 하나의 구획의 표면에 대한 또는 그 구획의 부피 내의 레이저 초점의 위치, 또는 이들의 임의의 조합을 조절함으로써 광분리 작동 모드와 광절제 작동 모드 사이에서 작동 가능하게 전환된다. 일부 실시양태에서, 제어기는 추가로 세포의 제1 서브세트 아래에 있거나 또는 그 서브세트에 인접한 표면의 영역이 레이저 광으로 조명되는 동안 적어도 하나의 구획 내의 표면을 가로질러 유도되는 액체의 유동에 세포의 제1 서브세트를 적용하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 80%이다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 90%이다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 95%이다. 일부 실시양태에서, 세포의 제2 서브세트는 90% 초과의 효율로 광절제된다. 일부 실시양태에서, 세포의 제2 서브세트는 95% 초과의 효율로 광절제된다. 일부 실시양태에서, 세포의 제2 서브세트는 99% 초과의 효율로 광절제된다. 일부 실시양태에서, 세포의 제2 서브세트는 99.9% 초과의 효율로 광절제된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 레이저는 추가로 적어도 하나의 구획에서 세포의 레이저 기반 광천공을 수행하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 카트리지의 적어도 하나의 구획은 화학적 형질감염, 기계적 형질감염(스퀴징), 전기천공, 레이저 유도 광천공, 바늘 기반 천공, 임페일펙션, 마그네토펙션, 초음파천공, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 장치는 지정된 세트의 성장 조건하에서 카트리지의 적어도 하나의 구획을 유지하기 위한 인큐베이터 유닛을 추가로 포함한다.
프로세서에 의한 실행시 프로세서 제어 시스템이 다음 단계를 포함하는 단계를 수행하게 하는 명령어 세트를 저장하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체가 본원에 개시된다: (a) 세포 형질감염, 세포 선택, 세포 확장, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하도록 구성된 적어도 하나의 구획을 포함하는 카트리지를 통해 유동하는 하나 이상의 유체에 대한 타이밍 및 유량을 제어하는 단계; (b) 적어도 하나의 구획 내의 표면 또는 부피를 이미징하도록 구성된 이미징 유닛에 의해 획득된 이미지의 이미지 처리를 수행하고, 처리된 이미지로부터 유도된 데이터에 기초하여, (i) 레이저 기반 광분리를 위한 적어도 하나의 구획 내의 표면 상에 또는 그 구획 내의 부피 내에 성장하는 세포의 제1 서브세트 및 (ii) 레이저 기반 광절제를 위한 적어도 하나의 구획 내의 표면 상에 또는 그 구획 내의 부피 내에 성장하는 세포의 제2 서브세트를 선택하는 단계; 및 (c) 세포의 제1 서브세트가 광분리되고 세포의 제2 서브세트가 광절제되도록 하나 이상의 레이저 및 레이저 표적화 유닛의 하나 이상의 작동 파라미터를 제어하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, (b)에서 선택하는 단계는 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 무작위로 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, (b)에서 선택하는 단계는 세포 선택 구획의 내부 표면 상의 위치에 기초한 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, (b)에서 선택하는 단계는 클론 세포 콜로니 내의 세포 수, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 형태, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 표면 밀도, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 성장 패턴, 클론 세포 콜로니 내의 세포 성장 속도, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 분열 속도, 클론 세포 콜로니 내의 세포에 의한 외인성 리포터의 발현, 또는 이들의 임의의 조합에 기초한다. 일부 실시양태에서, 프로세서 제어 시스템은 레이저 스폿 크기, 레이저 스폿 형상, 레이저 광 강도, 레이저 펄스 주파수, 레이저 펄스 에너지, 적어도 하나의 구획의 표면 상의 또는 부피 내의 지정된 위치에서 전달되는 레이저 펄스의 총수, 적어도 하나의 구획의 표면에 대한 레이저 초점의 위치, 적어도 하나의 구획의 부피 내의 레이저 초점의 위치, 또는 이들의 임의의 조합을 조절함으로써 광분리 작동 모드와 광절제 작동 모드 사이에서 작동 가능하게 전환된다. 일부 실시양태에서, 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체는 세포의 광분리된 제1 서브세트를 테스트를 위해 카트리지의 출구 포트로 전달하기 위한 명령어를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체는 세포의 제2 서브세트의 광절제 후 세포의 제3 서브세트의 광분리를 수행하고 세포의 분리된 제3 서브세트를 세포 확장을 수행하도록 구성된 적어도 제2 구획으로 전달하기 위한 명령어를 추가로 포함한다.
참고 인용
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 그 전체가 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본원의 용어와 포함된 참고 문서의 용어가 상충하는 경우 본원의 용어가 우선한다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점은 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 제시하는 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 본 개시내용의 세포 형질감염, 선택, 및 클론 확장 카트리지의 레이아웃의 비제한적인 예를 제공한다.
도 2는 개시된 카트리지의 한 예에서 유체 입구, 유체 출구, 유체 채널 및 유체 구획(예를 들어, 세포 형질감염, 선택, 및 성장, 배양 배지 및 폐기물의 저장을 위한 것)의 레이아웃의 비제한적 예시를 제공한다.
도 3a - 도 3d는 본 개시내용의 부분적으로 조립된 및 완전히 조립된 세포 형질감염, 선택, 및 클론 확장 카트리지의 도면을 제공한다. 도 3a는 카트리지의 사출 성형된 베이스 플레이트의 사진을 제공한다. 도 3b는 베이스 플레이트 및 부착된 세포 선택 챔버, 세포 확장 챔버, 성장 배지 저장소, 폐기물 저장소, 및 밸브를 포함하는 카트리지의 예시를 제공한다. 도 3c는 프로토타입 카트리지의 사진을 제공한다. 도 3d는 조립된 카트리지의 사진을 제공한다.
도 4는 본 개시내용의 세포 형질감염, 선택, 및 클론 확장 카트리지 내에서 수행되는 공정 단계의 비제한적인 예를 제공한다.
도 5a - 도 5e는 세포가 배양되는 기판으로부터 세포를 선택적으로 분리하기 위한 레이저 광분리의 사용을 예시한다. 도 5a: 세포 선택 구획 내의 성장 표면 상의 세포의 현미경 사진. 도 5b: 세포를 선택적으로 분리한 후 동일한 표면의 현미경 사진. 도 5c: 레이저 광 조사에 의한 클론 세포 클러스터 내에서 선택된 세포 서브세트의 선택적 분리 및 제거의 예시. 도 5d: 선택된 세포 아래에 있는 표면을 따라 레이저 광이 스캔됨에 따라 세포의 점진적인 분리의 예시. 도 5e: 레이저 광이 세포 아래에 있는 표면을 따라 계속 스캔됨에 따라 세포의 추가의 점진적인 분리의 예시.
도 6a - 도 6e는 세포가 배양되는 기판으로부터 세포를 선택적으로 분리 및 제거하기 위해 유도된 유체 유동과 조합된 레이저 광분리의 사용을 예시한다. 도 6a: 세포 선택 구획 내의 성장 표면 상의 세포의 현미경 사진. 도 6b: 세포를 선택적으로 분리한 후 동일한 표면의 현미경 사진. 도 6c: 레이저 광 조사에 의한 클론 세포 클러스터 내에서 선택된 세포 서브세트의 선택적 분리 및 제거의 예시. 도 6d: 유체의 흐름이 표면을 가로질러 유도되는 동안 선택된 세포 아래에 있는 표면을 따라 레이저 광이 스캔될 때 세포의 점진적인 분리의 예시. 도 6e: 유체의 흐름이 표면을 가로질러 유도되는 동안 레이저 광이 세포 아래에 있는 표면을 따라 계속 스캔됨에 따라 세포의 추가의 점진적인 분리의 예시.
도 7은 본 개시내용의 한 양태에 따른 클론 세포 집단의 생성을 위한 시스템을 제어하는데 사용되는 소프트웨어에 대한 블록도의 비제한적인 예를 제공한다.
도 8a - 도 8f는 본원에 기재된 카트리지에서 광절제 및 광분리를 사용한 세포의 클론 분리를 나타낸다. 도 8a: 본원에 기재된 카트리지에 부착 후 HEK293-GFP 및 RFP의 혼합 집단을 보여준다. 도 8b: 레이저 절제 후 HEK293-GFP 및 RFP 세포의 혼합 집단을 보여준다. 도 8c: 배지 흐름에 의해 사멸 세포의 제거 후 EK293-GFP 및 RFP 세포의 혼합 집단을 보여주며, 여기서 상자는 절제를 위해 표적화된 영역을 나타낸다. 도 8d: 카트리지에서 광분리 후 클론 HEK293-RFP 콜로니를 보여준다. 유출 후 검출 가능한 교차 오염이 관찰되지 않았다. 도 8e: 카트리지에서 광분리 후 클론 HEK-GFP 콜로니를 보여준다. 유출 후 검출 가능한 교차 오염이 관찰되지 않았다. 도 8f: 두 세포 집단 모두를 포함하는 비-클론 교차 오염된 콜로니를 보여준다.
도 9a - 9c는 본원에 기재된 카트리지의 회전 밸브를 통한 교차 오염 테스트를 도시한다. 도 9a: 카트리지의 회전 밸브 및 액체 경로를 보여준다. 접종된 박테리아와 멸균 배지는 밸브 사이에서 공통 액체 경로를 사용하여 이송하였다. 도 9b: 회전 밸브를 포함하는 카트리지에서 교차 오염이 관찰되지 않았음을 보여준다. 마이크로웰 플레이트의 1열(멸균)에 멸균 배지를 넣고, 2열(박테리아)에 박테리아 접종 배지를 넣었다. 10열(+ 대조군)의 배지는 이전에 공급원 웰에 담근 피펫 팁으로 접종하였고, 11열(- 대조군)의 배지는 플레이트에 바로 넣었으며 회전 밸브를 통과하지 않았고, 12열(공급원)은 박테리아 공급원 배지를 포함한다. 도 9c: 회전 밸브를 포함하는 카트리지에서 교차 오염이 관찰되지 않았음을 보여주는 교차 오염 테스트 결과의 표 형식을 제공한다.
도 10a - 도 10b는 본원에 기재된 카트리지의 다양한 실시양태 및 이들 다양한 실시양태의 테스트 결과를 보여준다. 도 10a: 본원에 기재된 카트리지의 다중 챔버 실시양태를 보여준다. 도 10b: 본원에 기재된 카트리지의 다중 챔버 실시양태의 치수 및 상기 챔버에서의 흐름 테스트 결과를 상세히 설명하는 표를 제공한다.
도 11a - 도 11b는 본원에 기재된 카트리지의 다양한 실시양태를 보여준다. 도 11a: 본원에 기재된 카트리지의 다중 챔버 실시양태를 보여준다. 도 11b: 본원에 기재된 카트리지의 다중 챔버 실시양태의 치수를 자세히 설명하는 표를 제공한다.
도 12는 96개의 평행한 소형 세포 배양 챔버, 6개의 더 큰 세포 배양 챔버 및 유체 연결부를 특징으로 하는 본원에 기재된 카트리지의 실시양태를 보여준다.
도 13은 카트리지의 안팎으로의 흐름을 용이하게 하기 위해 2개의 정치 멸균(SIP: sterilize in place) 시스템을 특징으로 하는 본원에 기재된 카트리지의 실시양태를 보여준다.
도 14는 배지 충전 주사기, 주사기 충전을 위한 펌프 인터페이스 및 SIP 시스템을 특징으로 하는 배지 카트리지의 실시양태를 나타낸다.
도 1은 본 개시내용의 세포 형질감염, 선택, 및 클론 확장 카트리지의 레이아웃의 비제한적인 예를 제공한다.
도 2는 개시된 카트리지의 한 예에서 유체 입구, 유체 출구, 유체 채널 및 유체 구획(예를 들어, 세포 형질감염, 선택, 및 성장, 배양 배지 및 폐기물의 저장을 위한 것)의 레이아웃의 비제한적 예시를 제공한다.
도 3a - 도 3d는 본 개시내용의 부분적으로 조립된 및 완전히 조립된 세포 형질감염, 선택, 및 클론 확장 카트리지의 도면을 제공한다. 도 3a는 카트리지의 사출 성형된 베이스 플레이트의 사진을 제공한다. 도 3b는 베이스 플레이트 및 부착된 세포 선택 챔버, 세포 확장 챔버, 성장 배지 저장소, 폐기물 저장소, 및 밸브를 포함하는 카트리지의 예시를 제공한다. 도 3c는 프로토타입 카트리지의 사진을 제공한다. 도 3d는 조립된 카트리지의 사진을 제공한다.
도 4는 본 개시내용의 세포 형질감염, 선택, 및 클론 확장 카트리지 내에서 수행되는 공정 단계의 비제한적인 예를 제공한다.
도 5a - 도 5e는 세포가 배양되는 기판으로부터 세포를 선택적으로 분리하기 위한 레이저 광분리의 사용을 예시한다. 도 5a: 세포 선택 구획 내의 성장 표면 상의 세포의 현미경 사진. 도 5b: 세포를 선택적으로 분리한 후 동일한 표면의 현미경 사진. 도 5c: 레이저 광 조사에 의한 클론 세포 클러스터 내에서 선택된 세포 서브세트의 선택적 분리 및 제거의 예시. 도 5d: 선택된 세포 아래에 있는 표면을 따라 레이저 광이 스캔됨에 따라 세포의 점진적인 분리의 예시. 도 5e: 레이저 광이 세포 아래에 있는 표면을 따라 계속 스캔됨에 따라 세포의 추가의 점진적인 분리의 예시.
도 6a - 도 6e는 세포가 배양되는 기판으로부터 세포를 선택적으로 분리 및 제거하기 위해 유도된 유체 유동과 조합된 레이저 광분리의 사용을 예시한다. 도 6a: 세포 선택 구획 내의 성장 표면 상의 세포의 현미경 사진. 도 6b: 세포를 선택적으로 분리한 후 동일한 표면의 현미경 사진. 도 6c: 레이저 광 조사에 의한 클론 세포 클러스터 내에서 선택된 세포 서브세트의 선택적 분리 및 제거의 예시. 도 6d: 유체의 흐름이 표면을 가로질러 유도되는 동안 선택된 세포 아래에 있는 표면을 따라 레이저 광이 스캔될 때 세포의 점진적인 분리의 예시. 도 6e: 유체의 흐름이 표면을 가로질러 유도되는 동안 레이저 광이 세포 아래에 있는 표면을 따라 계속 스캔됨에 따라 세포의 추가의 점진적인 분리의 예시.
도 7은 본 개시내용의 한 양태에 따른 클론 세포 집단의 생성을 위한 시스템을 제어하는데 사용되는 소프트웨어에 대한 블록도의 비제한적인 예를 제공한다.
도 8a - 도 8f는 본원에 기재된 카트리지에서 광절제 및 광분리를 사용한 세포의 클론 분리를 나타낸다. 도 8a: 본원에 기재된 카트리지에 부착 후 HEK293-GFP 및 RFP의 혼합 집단을 보여준다. 도 8b: 레이저 절제 후 HEK293-GFP 및 RFP 세포의 혼합 집단을 보여준다. 도 8c: 배지 흐름에 의해 사멸 세포의 제거 후 EK293-GFP 및 RFP 세포의 혼합 집단을 보여주며, 여기서 상자는 절제를 위해 표적화된 영역을 나타낸다. 도 8d: 카트리지에서 광분리 후 클론 HEK293-RFP 콜로니를 보여준다. 유출 후 검출 가능한 교차 오염이 관찰되지 않았다. 도 8e: 카트리지에서 광분리 후 클론 HEK-GFP 콜로니를 보여준다. 유출 후 검출 가능한 교차 오염이 관찰되지 않았다. 도 8f: 두 세포 집단 모두를 포함하는 비-클론 교차 오염된 콜로니를 보여준다.
도 9a - 9c는 본원에 기재된 카트리지의 회전 밸브를 통한 교차 오염 테스트를 도시한다. 도 9a: 카트리지의 회전 밸브 및 액체 경로를 보여준다. 접종된 박테리아와 멸균 배지는 밸브 사이에서 공통 액체 경로를 사용하여 이송하였다. 도 9b: 회전 밸브를 포함하는 카트리지에서 교차 오염이 관찰되지 않았음을 보여준다. 마이크로웰 플레이트의 1열(멸균)에 멸균 배지를 넣고, 2열(박테리아)에 박테리아 접종 배지를 넣었다. 10열(+ 대조군)의 배지는 이전에 공급원 웰에 담근 피펫 팁으로 접종하였고, 11열(- 대조군)의 배지는 플레이트에 바로 넣었으며 회전 밸브를 통과하지 않았고, 12열(공급원)은 박테리아 공급원 배지를 포함한다. 도 9c: 회전 밸브를 포함하는 카트리지에서 교차 오염이 관찰되지 않았음을 보여주는 교차 오염 테스트 결과의 표 형식을 제공한다.
도 10a - 도 10b는 본원에 기재된 카트리지의 다양한 실시양태 및 이들 다양한 실시양태의 테스트 결과를 보여준다. 도 10a: 본원에 기재된 카트리지의 다중 챔버 실시양태를 보여준다. 도 10b: 본원에 기재된 카트리지의 다중 챔버 실시양태의 치수 및 상기 챔버에서의 흐름 테스트 결과를 상세히 설명하는 표를 제공한다.
도 11a - 도 11b는 본원에 기재된 카트리지의 다양한 실시양태를 보여준다. 도 11a: 본원에 기재된 카트리지의 다중 챔버 실시양태를 보여준다. 도 11b: 본원에 기재된 카트리지의 다중 챔버 실시양태의 치수를 자세히 설명하는 표를 제공한다.
도 12는 96개의 평행한 소형 세포 배양 챔버, 6개의 더 큰 세포 배양 챔버 및 유체 연결부를 특징으로 하는 본원에 기재된 카트리지의 실시양태를 보여준다.
도 13은 카트리지의 안팎으로의 흐름을 용이하게 하기 위해 2개의 정치 멸균(SIP: sterilize in place) 시스템을 특징으로 하는 본원에 기재된 카트리지의 실시양태를 보여준다.
도 14는 배지 충전 주사기, 주사기 충전을 위한 펌프 인터페이스 및 SIP 시스템을 특징으로 하는 배지 카트리지의 실시양태를 나타낸다.
정의된 유전자형의 클론 세포 집단을 생성하기 위해 세포 형질감염, 선택, 및 클론 확장을 수행하기 위한 방법, 장치, 및 시스템이 기재된다. 균질한 클론 세포 집단을 생성하기 위한 방법 및 시스템은 유전적으로 조작된 단백질, 핵산 및 기타 세포 성분의 발현 및 정제; 생물학적 약물(생물제제)의 생산; 및 줄기세포의 치료적 적용을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 다양한 새로운 응용 분야에서 점점 더 중요해지고 있다.
세포의 클론 집단을 생성하기 위한 기존 방법은 단일 세포를 배양 플레이트 웰 또는 기타 용기에 넣은 후 적절한 조건에서 인큐베이션하여 성숙한 클론 집단으로 분열 및 발달하도록 하기 위해 주로 연속 희석 기술 및/또는 미세유체 장치의 사용에 중점을 둔다. 전자의 문제는 평균적으로 각 배양 플레이트 웰에 단일 세포만 포함되게 보장하기 위해 충분히 희석된 세포 현탁액을 무작위로 넣으면 많은 배양 플레이트 웰이 비어 있게 한다는 것이다(무작위 공정을 제어하는 포아송 분포에 의해 예측되는 바와 같이). 따라서, 이 접근 방식은 처리해야 하는 배양 플레이트 웰의 수와 관련하여 매우 비효율적인 공정으로 이어지며, 이는 또한 각 웰에 있는 집단의 후속 특성화를 요구하여 단일 세포로부터 발생한 세포 배양물을 실제로 포함하는지 확인해야 한다. 대안적으로, 단일 세포를 넣기 위한 미세유체 장치 기반 접근 방식은 종종 막히기 쉽고 세포가 생존도에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 기계적 스트레스를 받게 할 수 있다.
따라서, 상업적 규모로 클론 세포 집단을 생산하기 위한 세포 및 배양 플레이트의 빠르고 효율적인 처리 수단을 제공하는 새로운 기술에 대한 충족되지 않은 요구가 남아 있다. 본원에 개시된 미세유체 장치(또는 카트리지)는 일부 경우에 일회용 및/또는 표준 실험실 자동화 장비와 함께 사용하기에 적합할 수 있는 소형 형식으로 패키징된 통합 세포 처리 기능을 제공한다. 장치 또는 카트리지의 기능적 구성요소는 세포 형질감염 구획, 세포 선택 구획, 클론 세포 확장 구획, 성장 배지 구획, 폐기물 구획, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지는 유전자 테스트 또는 다른 검사 기술에 적용될 수 있도록 하나 이상의 클론 콜로니로부터 선택적으로 분리된 세포를 제거하기 위한 세포 제거 포트; 광학 이미징 및 성장 모니터링 기술, 레이저 광분리 기,술 및/또는 레이저 광절제 기술과의 호환성을 위한 광학적으로 투명한 벽 또는 창; 전기천공 수행에 사용하기 위한 통합 전극; 세포 성장을 모니터링하기 위해 전기 임피던스 측정을 수행하기 위한 통합 전극; 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
개시된 세포 형질감염, 선택, 및 클론 확장 카트리지 중 하나 이상을 포함하는 개시된 장치 또는 시스템의 기능적 구성요소는 유체 제어기, 온도 제어기 또는 인큐베이터, 가스 제어기, 공압 제어기, 원심분리 제어기, 전자 제어기, 광학 이미징 유닛, 레이저 광분리 및/또는 광절제 유닛, 마이크로플레이트 처리 로봇, 프로세서, 시스템 제어기, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
개시된 장치 및 시스템의 독특한 특징은 클론 세포 집단의 생성을 위한 입력으로서 필요한 총 세포 수의 상당한 감소, 클론 세포 집단의 생성을 위해 처리해야 하는 총 세포 수의 상당한 감소, 세포 배양 시약 및 소모품 소비의 상당한 감소, 세포 형질감염 효율의 개선, 클론 세포 집단 생성의 전반적인 효율성의 개선, 및 클론 세포 집단 생성을 위한 더 높은 전체 처리량(즉, 시작에서 종료까지의 시간 감소)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 수행 이점을 제공할 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 개시내용은 클론 세포 집단의 세포 형질감염, 선택,및 확장을 수행하기 위한 방법, 장치, 및 시스템을 제공한다. 본원에 기재된 개시된 방법, 장치, 및 시스템의 다양한 양태는 하기에 제시된 임의의 특정 응용 분야에, 또는 임의의 다른 유형의 세포주 엔지니어링 응용 분야에 적용될 수 있다. 개시된 방법, 장치, 및 시스템의 상이한 양태는 개별적으로, 집합적으로, 또는 서로 조합하여 인식될 수 있음을 이해해야 한다.
정의: 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 용어는 본 개시내용이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다. 본원에서 "또는"에 대한 모든 언급은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 포함하도록 의도된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 '약' 어떤 한 수는 그 수에서 그 수의 10%를 더하거나 빼는 것을 의미한다. 범위와 관련하여 사용될 때 '약'이라는 용어는 해당 범위에서 최저값의 10%를 뺀 값과 최대값의 10%를 더한 값을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "형질감염"은 핵산을 진핵 세포 내로 도입하는 과정뿐만 아니라, 예를 들어, 박테리아 형질전환(박테리아가 환경으로부터 외래 유전 물질(예를 들어, DNA)을 흡수하는 과정) 및 박테리아 형질도입(숙주 박테리아의 유전자가 박테리아 바이러스(박테리오파지)의 게놈에 통합된 다음 박테리오파지가 새로운 숙주를 감염시킬 때 다른 숙주 박테리아로 운반되는 것)을 나타내는데 광범위하게 사용된다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "형질감염"은 핵산을 모든 유형의 세포에 도입하는 모든 과정을 나타내기 위해 광범위하게 사용된다(기술 용어로서의 그의 용도에도 불구하고). 일부 경우에, 예를 들어 CRISPR 편집의 경우에, "형질감염" 과정은 하나 이상의 Cas 단백질(들) 및/또는 하나 이상의 가이드 RNA(들)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자(들)의 도입을 포함할 수 있거나 하나 이상의 Cas 단백질 자체 및/또는 하나 이상의 가이드 RNA(들)(예를 들어, 가이드 RNA(들)가 Cas 단백질에 사전 결합될 수 있거나 Cas 단백질(들)에 사전 결합되지 않을 수 있는 경우)의 도입을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어 CRISPR 편집의 경우, "형질감염" 과정에는 다중 가이드 RNA, 다중 효소, 다중 DNA 복구 주형 등의 도입이 포함될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "장치", "미세유체 장치" 및 "카트리지"는 세포 형질감염, 세포 선택 및/또는 클론 세포 확장 중 하나 이상을 수행하기 위한 개시된 장치를 언급할 때 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "유체"는 기체, 액체, 또는 일부 경우에 충분히 부드럽고 변형 가능하여 유체와 유사한 특성을 갖는 겔(예를 들어, 하이드로겔)을 지칭할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "유체 채널" 또는 간단히 "채널"은 세포 형질감염, 세포 선택, 클론 세포 확장, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하기 위한 개시된 장치를 언급할 때 상호교환적으로 사용된다. 유사하게, "유체 입구"는 간단히 "입구"로 지칭될 수 있고, "유체 출구"는 단순히 "출구"로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유체 구획", "유체 챔버" 및 "유체 저장소", 또는 간단히 "구획", "챔버" 또는 "저장소"는 세포 형질감염, 세포 선택, 클론 세포 확장, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하기 위한 개시된 장치를 지칭할 때 상호교환적으로 사용된다. 일부 경우에 "구획", "챔버" 또는 "저장소"는 기판 표면의 특정 영역을 포함할 수 있다. 일부 경우에, "구획", "챔버", "저장소" 또는 "영역"은 뚜껑으로 둘러싸고 밀봉할 수 있다. 일부 경우에, "구획", "챔버", "저장소" 또는 "영역"은 "구획", "챔버", "저장소" 또는 "영역"의 내부가 접근 가능하도록 제거 가능한 덮개로 둘러쌀 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "제어기", "모듈" 및 "유닛"은 세포 형질감염, 세포 선택, 클론 세포 확장, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하기 위한 개시된 장치 또는 시스템의 구성요소 또는 하위 시스템을 지칭할 때 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 레이저 광분리라는 용어는 빛, 예를 들어 다양한 파장(자외선(UV) 파장에서 적외선(IR) 파장까지의 범위)의 강렬한 빛에 펄스 또는 연속파 모드로 노출될 때 세포가 붕괴되거나 파괴될 수 있는 다양한 관련 메커니즘을 포함하는 일반적인 의미로 사용된다.
본원에 사용되는 바와 용어 "레이저 광절제", "광절제", 및 간단히 "절제"는 상호교환적으로 사용되며, 빛, 예를 들어 다양한 파장(자외선(UV) 파장에서 적외선(IR) 파장까지의 범위)의 강렬한 빛에 펄스 또는 연속파 모드로 노출될 때 세포가 붕괴되거나 파괴될 수 있는 다양한 관련 메커니즘을 포함하는 일반적인 의미로 사용된다.
세포: 개시된 방법 및 시스템은 당업자에게 공지된 임의의 다양한 세포의 클론 집단의 제조에 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 세포는 임의의 부착 및 비부착 진핵 세포, 포유동물 세포, 1차 또는 불멸화된 인간 세포 또는 세포주, 1차 또는 불멸화된 설치류 세포 또는 세포주, 암세포, 임의의 다양한 장기 또는 조직 유형으로부터 유래한 정상 또는 질환의 인간 세포(예를 들어, 백혈구, 적혈구, 상피 세포, 내피 세포, 뉴런, 신경교 세포, 성상세포, 섬유아세포, 골격근 세포, 평활근 세포, 생식세포, 또는 심장, 폐, 뇌, 간, 신장, 비장, 췌장, 흉선, 방광, 위, 결장, 소장으로부터 유래한 세포), 면역 세포와 같은 별개의 세포 서브세트, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, CD44high/CD24low 암 줄기세포, Lgr5/6+ 줄기세포, 미분화 인간 줄기세포, 분화가 유도된 인간 줄기세포, 희귀 세포(예를 들어, 순환 종양 세포(CTC: circulating tumor cell), 순환 상피 세포, 순환 내피 세포, 순환 자궁내막 세포, 골수 세포, 전구 세포, 거품 세포, 중간엽 세포 또는 영양막), 동물 세포(예를 들어, 마우스, 래트, 돼지, 개, 소, 또는 말), 식물 세포, 효모 세포, 진균 세포, 박테리아 세포, 조류 세포, 부착 또는 비부착 원핵 세포, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 양태에서, 세포는 면역 세포, 예를 들어 T 세포, 세포독성(살해) T 세포, 헬퍼 T 세포, 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포, T 세포 전구세포, B 세포, B 세포 전구세포, 림프 줄기세포, 골수 전구 세포, 림프구, 과립구, 자연 살해 세포, 형질 세포, 기억 세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 단핵구, 수지상 세포, 대식세포, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
언급된 바와 같이, 일부 경우에 개시된 방법 및 시스템은 줄기세포, 예를 들어 배아 줄기세포, 성체(조직 특이적) 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 또는 유도된 만능 줄기세포의 클론 집단을 제조하는 데 사용될 수 있다. 배아 줄기세포는 배반포(인간에서 난세포가 정자에 의해 수정된 후 3~5일 후에 형성되는 주로 속이 빈 세포 공)의 내부 세포 덩어리로부터 얻어지며 일반적으로 만능성이다. 즉, 신체의 모든 분화된 세포 유형을 생성하는 데 사용할 수 있지만 일반적으로 태반 및 탯줄과 같은 지지 구조를 생성할 수 없다. 성체 줄기세포는 다능성이다. 즉, 일반적으로 특정 조직이나 기관에서 발견되는 몇 가지 상이한 세포 유형을 생성할 수 있다. 중간엽 줄기세포(MSC; 때때로 "기질 세포"라고도 함)는 예를 들어 골수 또는 기질(다른 조직 및 기관을 둘러싸는 결합 조직)로부터 분리된다. 골수 또는 기타 조직에서 유래한 MSC는 그들이 실제 줄기세포인지 또는 그들이 생성할 수 있는 다른 세포 유형이 무엇인지는 불분명하지만 뼈, 연골 및 지방 세포를 만들 수 있는 것으로 나타났다. 그들의 특성은 그들이 어떤 조직으로부터 분리되는 지와 그들이 분리되고 배양되는 방법에 따라 결정되는 것으로 보인다.
일부 경우에, 개시된 방법 및 시스템은 유도 만능 줄기세포(IPSC)의 클론 집단, 또는 이로부터 유래된 임의의 분화된 세포주의 제조에 사용될 수 있다. 유도 만능 줄기세포는 예를 들어 배아 유사 만능 상태로 퇴행하도록 재프로그래밍된 피부 또는 혈액 세포에서 유래하고, 생물의학 연구 및/또는 치료 용도에 사용하기 위해 이후에 임의의 다양한 특정 세포 유형, 예를 들어, 베타 섬 세포, 난자 및 정자 전구체, 간 세포, 뼈 전구체 세포, 혈액 세포, 뉴런 등으로 분화하도록 촉발될 수 있다.
세포 배양 방법: 일반적으로, 사용되는 세포 배양 조건(성장 배지, 인큐베이션 온도, 습도, O2 농도, CO2 농도 등)은 제조되는 클론 세포 집단의 유형에 따라 다를 것이다. 적절한 성장 배지는 배양되는 특정 세포 유형에 필요한 필수 영양소(아미노산, 탄수화물, 비타민, 미네랄 등)를 제공하고, 배양되는 특정 세포 유형에 필요한 pH 및 삼투압을 유지하며, 성장인자, 호르몬 등을 추가로 포함할 수 있다. 세포는 전형적으로 (예를 들어 부착 또는 단층 배양에서) 고체 또는 반고체 기판에 부착되는 동안 배양되는 고정-의존성 세포일 수 있다. 일부 경우에, 세포는 전형적으로 배양 배지에 부유하여 배양되는(예를 들어, 현탁 배양) 비부착성 또는 현탁 세포일 수 있다. 일부 경우에, 개시된 방법, 장치, 및 시스템은 세포 선택 또는 성장 구획(또는 그 안에 포함된 성장 기판)의 바닥 표면에 침전되도록 허용된 비부착 세포의 클론 배양물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 개시된 방법, 장치, 및 시스템은 예를 들어, 특정 세포 표면 수용체에 대해 테더링된 포획 항체를 사용하여 세포 선택 또는 성장 구획(또는 그 안에 포함된 성장 기판)의 바닥 표면에 포획되고 테더링된 비부착 세포의 클론 배양물을 제조하는 데 사용될 수 있다.
형질감염제: 일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지에 도입된 세포의 형질감염은 DNA 분자, RNA 분자, 올리고뉴클레오티드, 앱타머, 비-플라스미드 핵산 분자, 리보핵단백질(RNP), 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드, 인공 염색체, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상의 유형을 포함하는 하나 이상의 형질감염제로 세포를 형질감염시킴으로써 구현될 수 있다.
세포 형질감염, 선택, 및 클론 확장 카트리지: 개시된 장치 또는 카트리지의 기능적 구성요소는 다음을 포함할 수 있다: 하나 이상의 유체 입구(세포를 장치 내로 도입하기 위한 입구 포함), 하나 이상의 유체 출구(장치로부터 세포를 제거하기 위한 출구), 세포 형질감염 구획, 세포 선택 구획, 클론 세포 확장 구획, 성장 배지 구획, 폐기물 구획, 및 하나 이상의 상호연결 유체 채널, 또는 이들의 임의의 조합. 일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지는 하나 이상의 소형 또는 미세가공된 밸브, 하나 이상의 소형 또는 미세가공된 펌프, 하나 이상의 통합 센서(예를 들어, 온도 센서, pH 센서, 산소 센서, CO2 센서 등)를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지는 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이 둘 이상의 구성요소의 어셈블리를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지는 세포 선택 구획으로부터의 유체 출구와 클론 세포 확장 구획을 위한 유체 입구 사이의 중간 위치에 위치된 세포 제거 포트를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 세포 제거 포트는 예를 들어 유전자 테스트에 적용될 수 있도록 하나 이상의 클론 콜로니로부터 선택적으로 분리된 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지는 광학 이미징 및 성장 모니터링 기술, 레이저 광분리 기술, 및/또는 레이저 광절제 기술과의 호환성을 위해 광학적으로 투명한 벽 또는 창; 전기천공 수행에 사용하기 위한 통합 전극; 세포 성장을 모니터링하기 위해 전기 임피던스 측정을 수행하기 위한 통합 전극; 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
유체 채널: 일반적으로, 개시된 장치 및 카트리지의 유체 채널의 치수는 (i) 하나 이상의 유체 구획에 세포 및 기타 시약의 효율적인 전달을 제공하고, (ii) 세포 현탁액 및 시약 소비를 최소화하도록 최적화될 것이다. 일부 경우에, 유체 채널의 폭은 50 미크론에서 2 mm 사이일 수 있다. 일부 경우에, 유체 채널의 폭은 최소 50 미크론, 최소 100 미크론, 최소 200 미크론, 최소 300 미크론, 최소 400 미크론, 최소 500 미크론, 최소 750 미크론, 최소 1 mm, 또는 최소 2 mm일 수 있다. 일부 경우에, 유체 채널의 폭은 최대 2 mm, 최대 1 mm, 최대 750 미크론, 최대 500 미크론, 최대 400 미크론, 최대 300 미크론, 최대 200 미크론, 최대 100 미크론, 또는 최대 50 미크론일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 유체 채널의 폭은 약 100 ㎛ 내지 약 1 mm. 당업자는 유체 채널의 폭이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 1.45 mm를 가질 수 있음을 인식할 것이다. 일부 경우에, 특정 유체 채널의 치수(폭, 깊이 및/또는 길이)는 특정 기능에 따라 조정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유체 채널의 깊이는 약 50 미크론 내지 약 2 mm. 일부 경우에, 유체 채널의 깊이는 최소 50 미크론, 최소 100 미크론, 최소 200 미크론, 최소 300 미크론, 최소 400 미크론, 최소 500 미크론, 최소 750 미크론, 최소 1 mm, 최소 1.25 mm, 최소 1.5 mm, 최소 1.75 mm, 또는 최소 2 mm일 수 있다. 일부 경우에, 유체 채널의 깊이는 최대 2 mm, 최대 1.75 mm, 최대 1.5 mm, 최대 1.25 mm, 최대 1 mm, 최대 750 미크론, 최대 500 미크론, 최대 400 미크론, 최대 300 미크론, 최대 200 미크론, 최대 100 미크론, 또는 최대 50 미크론일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 유체 채널의 깊이는 약 100 ㎛ 내지 약 400 ㎛. 당업자는 유체 채널의 깊이가 이 범위 내의 임의의 값(예를 들어, 약 555 ㎛)을 가질 수 있음을 인식할 것이다. 일부 경우에. 특정 유체 채널의 치수(폭, 깊이 및/또는 길이)는 특정 기능에 따라 조정될 수 있다.
유체 구획: 일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 5개 초과의 유체 구획을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 각 구획은 원하는 유전자형을 포함하는 세포의 클론 집단을 생성하는 데 필요한 일련의 세포 처리 단계에서 상이한 기능을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 단일 유체 구획은 세포의 클론 집단을 생성하는 데 필요한 일련의 세포 처리 단계에서 2개 이상의 상이한 기능을 제공할 수 있다.
일부 경우에, 각 유체 구획은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 유체 입구(또는 세포 도입 포트)를 가질 수 있다. 일부 경우에, 각 유체 구획은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 유체 출구(또는 세포 제거 포트)를 가질 수 있다.
일부 경우에, 개시된 장치 및 카트리지의 유체 구획의 임의의 주어진 치수(예를 들어, 최단 치수 또는 최장 치수, 또는 길이, 폭, 또는 높이/깊이)는 약 0.1 mm 내지 약 0.1 mm 내지 약 20 cm. 일부 경우에, 유체 구획의 주어진 치수는 최소 0.1 mm, 최소 0.2 mm, 최소 0.3 mm, 최소 0.4 mm, 최소 0.5 mm, 최소 0.6 mm, 최소 0.7 mm, 최소 0.8 mm, 최소 0.9 mm, 최소 1 mm, 최소 2 mm, 최소 3 mm, 최소 4 mm, 최소 5 mm, 최소 1 cm, 최소 1.5 cm, 최소 2 cm, 최소 2.5 cm, 최소 3 cm, 최소 3.5 cm, 최소 4 cm, 최소 4.5 cm, 최소 5 cm, 최소 5.5 cm, 최소 6 cm, 최소 6.5 cm, 최소 7 cm, 최소 7.5 cm, 최소 8 cm, 최소 8.5 cm, 최소 9 cm, 최소 9.5 cm, 최소 10 cm, 최소 12 cm, 최소 14 cm, 최소 16 cm, 최소 18 cm, 또는 최소 20 cm일 수 있다. 일부 경우에, 유체 구획의 주어진 치수는 최대 20 cm, 최대 18 cm, 최대 16 cm, 최대 14 cm, 최대 12 cm, 최대 10 cm, 최대 9.5 cm, 최대 9 cm, 최대 8.5 cm, 최대 8 cm, 최대 7.5 cm, 최대 7 cm, 최대 6.5 cm, 최대 6 cm, 최대 5.5 cm, 최대 5 cm, 최대 4.5 cm, 최대 4 cm, 최대 3.5 cm, 최대 3 cm, 최대 2.5 cm, 최대 2 cm, 최대 1.5 cm, 최대 1 cm, 최대 5 mm, 최대 4 mm, 최대 3 mm, 최대 2 mm, 최대 1 mm, 최대 0.9 mm, 최대 0.8 mm, 최대 0.7 mm, 최대 0.6 mm, 최대 0.5 mm, 최대 0.4 mm, 최대 0.3 mm, 최대 0.2 mm, 또는 최대 0.1 mm일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 유체 구획의 주어진 치수는 약 1 mm 내지 약 5 cm의 범위일 수 있다. 당업자는 유체 구획의 주어진 치수가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 5.45 cm를 가질 수 있음을 인식할 것이다. 일부 경우에, 특정 유체 구획의 치수는 특정 기능에 따라 조정될 수 있다.
일부 경우에, 개시된 장치 및 카트리지의 임의의 주어진 유체 구획의 부피는 약 1 pl 내지 약 100 ml의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 임의의 주어진 유체 구획의 부피는 최소 1 pl, 최소 5 pl, 최소 10 pl, 최소 50 pl, 최소 100 pl, 최소 200 pl, 최소 300 pl, 최소 400 pl, 최소 500 pl, 최소 600 pl, 최소 700 pl, 최소 800 pl, 최소 900 pl, 최소 1 nl, 최소 5 nl, 최소 10 nl, 최소 50 nl, 최소 100 nl, 최소 200 nl, 최소 300 nl, 최소 400 nl, 최소 500 nl, 최소 600 nl, 최소 700 nl, 최소 800 nl, 최소 900 nl, 최소 1 μl, 최소 5 μl, 최소 10 μl, 최소 50 μl, 최소 100 μl, 최소 200 μl, 최소 300 μl, 최소 400 μl, 최소 500 μl, 최소 600 μl, 최소 700 μl, 최소 800 μl, 최소 900 μl, 최소 1 ml, 최소 2 ml, 최소 3 ml, 최소 4 ml, 최소 5 ml, 최소 6 ml, 최소 7 ml, 최소 8 ml, 최소 9 ml, 최소 10 ml, 최소 20 ml, 최소 30 ml, 최소 40 ml, 최소 50 ml, 최소 60 ml, 최소 70 ml, 최소 80 ml, 최소 90 ml, 또는 최소 100 ml일 수 있다. 일부 경우에, 임의의 주어진 유체 구획의 부피는 최대 100 ml, 최대 90 ml, 최대 80 ml, 최대 70 ml, 최대 60 ml, 최대 50 ml, 최대 40 ml, 최대 30 ml, 최대 20 ml, 최대 10 ml, 최대 9 ml, 최대 8 ml, 최대 7 ml, 최대 6 ml, 최대 5 ml, 최대 4 ml, 최대 3 ml, 최대 2 ml, 최대 1 ml, 최대 900 μl, 최대 800 μl, 최대 700 μl, 최대 600 μl 최대 500 μl, 최대 400 μl, 최대 300 μl, 최대 200 μl, 최대 100 μl, 최대 50 μl, 최대 10 μl, 최대 5 μl, 최대 1 μl, 최대 900 nl, 최대 800 nl, 최대 700 nl, 최대 600 nl, 최대 500 nl, 최대 400 nl, 최대 300 nl, 최대 200 nl, 최대 100 nl, 최대 50 nl, 최대 10 nl, 최대 5 nl, 최대 1 nl, 최대 900 pl, 최대 800 pl, 최대 700 pl, 최대 600 pl, 최대 500 pl, 최대 400 pl, 최대 300 pl, 최대 200 pl, 최대 100 pl, 최대 50 pl, 최대 10 pl, 최대 5 pl, 또는 최대 1 pl일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 임의의 주어진 유체 구획의 부피는 약 800 μl 내지 약 20 ml. 당업자는 임의의 주어진 유체 구획의 부피가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 4.8 ml를 가질 수 있음을 인식할 것이다. 일부 경우에, 특정 유체 구획의 부피는 특정 기능에 따라 조정될 수 있다.
세포 형질감염 구획: 일부 경우에, 하나 이상의 유체 구획은 당업자에게 공지된 임의의 다양한 형질감염 방법을 수행하도록 구성된 세포 형질감염 구획으로서 기능할 수 있다. 예는 화학적 형질감염, 기계적 형질감염, 전기천공, 광천공 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 예를 들어 세포 형질감염 구획이 전기천공을 수행하도록 구성된 경우, 유체 구획은 추가 구조적 특징, 예를 들어 제한된 유체 유동 경로, 또는 하나 이상의 전극 쌍, 또는 광학적으로 투명한 벽을 포함할 수 있다.
세포 선택 구획: 일부 경우에, 하나 이상의 유체 구획은 단일 세포(예를 들어, 부착 세포 또는 현탁 세포)가 표면에 부착(또는 테더링)되고 클론 세포 클러스터의 형성이 시작되도록 허용되는 세포 선택 구획으로서 기능할 수 있다. 일부 경우에, 세포 선택 구획은 세포 부착을 용이하게 하거나 레이저 기반 광분리 또는 광절제를 용이하게 하도록 설계된 표면 코팅 층을 포함하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 세포 선택 구획은 세포 성장이 예를 들어 이미징에 의해 모니터링될 수 있도록 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽으로 구성될 수 있다. 일부 경우에, 세포 선택 구획은 예를 들어 전기 임피던스 측정에 의해 세포 성장이 모니터링될 수 있도록 적어도 하나의 전극 쌍으로 구성될 수 있다. 일부 경우에, 세포 선택 구획은 광학적으로 투명한 벽과 적어도 하나의 전극 쌍을 모두 포함할 수 있다.
언급된 바와 같이, 일부 경우에 세포 선택 구획(또는 그 안의 하나 이상의 벽 또는 표면)은 세포 부착을 용이하게 하거나 레이저 기반 광분리 또는 광절제를 용이하게 하도록 설계된 표면 코팅 층을 포함하도록 구성될 수 있다. 적합한 표면 코팅의 예는 α-폴리-리신 코팅, 콜라겐 코팅, 폴리-l-오르니틴, 피브로넥틴 코팅, 및 라미닌 코팅을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 예를 들어 개시된 장치 또는 카트리지가 성체 세포로부터 직접 유래된 유도 만능 줄기세포(iPSC)와 함께 사용되는 경우, 표면 코팅은 Synthemax™ 비트로넥틴 코팅(Corning, Inc., 미국 뉴욕주 코닝 소재) 및/또는 iMatrix-511 재조합 라미닌 코팅(Takara Bio USA, 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포 선택 구획(또는 그 안의 하나 이상의 벽 또는 표면)은 세포 부착 또는 표면 코팅 층을 용이하게 하기 위해 표면 처리로 처리될 수 있다. 예에는 플라즈마 처리가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 세포 선택 구획은 하위 구획, 단일 세포 트랩, 또는 단일 세포 챔버와 같은 내부 구조를 갖지 않을 수 있다. 일부 경우에, 세포 선택 구획은 개별 세포가 구획화될 수 있는 2개 이상의 하위 구획, 단일 세포 트랩, 또는 단일 세포 챔버를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포는 예를 들어 개별 세포를 가두는 유체역학적 힘, 개별 세포가 테더링되는 자기 비드, 및 개별 세포를 이동시키고 배치하는 외부에서 적용된 자기장, 또는 광학적 핀셋을 사용하여 하위 구획, 단일 세포 트랩, 또는 단일 세포 챔버에 도입될 수 있다. 일부 경우에, 세포 형질감염은 예를 들어 일시적으로 세포막을 파괴하고 세포가 존재하는 세포 배양 배지 또는 완충액에 형질감염제가 용해되도록 하여 세포에 들어가게 하는 레이저 기반 천공 기술을 사용하여 세포 선택 구획 내의 하위 구획, 단일 세포 트랩, 또는 단일 세포 챔버 내에서 수행될 수 있다.
당업자에게 공지된 임의의 다양한 세포 선택 기술이 세포 선택 구획 내에서 수행될 수 있으며, 이는 아래에서 더 상세히 논의될 것이다. 일부 경우에, 세포 선택 구획은 클론 세포 확장 구획으로도 기능할 수 있다.
세포 확장 구획: 일부 경우에, 하나 이상의 유체 구획은 단일 세포 또는 작은 클론 세포 클러스터가 세포 성장 및 확장의 1회 이상의 주기를 거치는 클론 세포 확장 구획으로서 기능할 수 있다. 일부 경우에, 세포 선택 구획은 세포 부착을 용이하게 하도록 설계된 표면 코팅 층을 포함하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 세포 확장 구획은 세포 성장이 예를 들어 이미징에 의해 모니터링될 수 있도록 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽으로 구성될 수 있다. 일부 경우에, 세포 확장 구획은 예를 들어 전기 임피던스 측정에 의해 세포 성장이 모니터링될 수 있도록 적어도 하나의 전극 쌍으로 구성될 수 있다. 일부 경우에, 세포 확장 구획은 광학적으로 투명한 벽과 적어도 하나의 전극 쌍 모두를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 세포 확장 구획(또는 그 안의 하나 이상의 벽 또는 표면)은 또한 예를 들어 화학적 수단, 효소적 수단(트립신 처리), 레이저 기반 광분리 등을 사용하여, 세포 부착을 용이하게 하거나 세포 분리를 용이하게 하도록 설계된 표면 코팅 층 및/또는 표면 처리를 포함할 수 있다. 적합한 표면 코팅의 예는 α-폴리-리신 코팅, 콜라겐 코팅, 폴리-1-오르니틴, 피브로넥틴 코팅, 및 라미닌 코팅을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 예를 들어 개시된 장치 또는 카트리지가 성체 세포로부터 직접 유래된 유도 만능 줄기세포(iPSC)와 함께 사용되는 경우, 표면 코팅은 Synthemax™ 비트로넥틴 코팅(Corning, Inc., 미국 뉴욕주 코닝 소재) 및/또는 iMatrix-511 재조합 라미닌 코팅(Takara Bio USA, 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포 선택 구획(또는 그 안의 하나 이상의 벽 또는 표면)은 세포 부착 또는 표면 코팅 층을 용이하게 하기 위해 표면 처리로 처리될 수 있다. 예에는 플라즈마 처리가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 세포 선택 구획은 내부 표면 상의 압입 패턴 및/또는 내부 표면 상의 기판 패턴을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 확장 구획은 내부 표면 상의 압입 패턴 및/또는 내부 표면 상의 기판 패턴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기판은 단백질 기판이다. 특정 실시양태에서, 압입 패턴 및/또는 기판 패턴은 구획 내에서 세포 이동을 방지하도록 구성된다. 세포가 쉽게 부착되는 영역과 세포가 잘 부착되지 않는 영역으로 이루어진 이러한 챔버에서 패턴을 설정할 수 있다. 세포가 부착되는 영역은 폴리-D-리신(MW), 폴리-L-오르니틴, 라미닌, 피브로넥틴, 및 비트로넥틴을 포함하지만 이에 제한되지 않는 마이크로 인쇄/스탬프 접착 기판으로 이루어질 수 있다. 불량한 세포 접착 표면의 비제한적인 예는 실란 코팅과 같은 소수성 표면 및 미처리 실험기구 플라스틱을 포함하며, 이는 폴리스티렌, COC, COP, 실란 등과 같은 미처리 플라스틱으로 이러한 영역을 구성함으로써 불량한 세포 접착 영역을 생성하는 데 사용될 수 있다.
성장 배지 저장소: 일부 경우에, 하나 이상의 유체 구획은 장치 내에서 세포 배양을 유지 및 확장하기 위한 새로운 성장 배지의 공급원으로 기능을 하는 성장 배지 저장소로 기능을 할 수 있다. 일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지 내의 성장 배지 저장소는 임의의 갇힌 공기 또는 기타 가스가 구획으로부터 제거되도록 하고 추가로 장치의 유체 채널 및 유체 구획을 통해 성장 배지 유체의 흐름을 유도하기 위해 내부에 포함된 성장 배지에 압력을 가하는 데 사용될 수 있는 가스 투과성 막을 포함할 수 있다.
폐기물 저장소: 일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지 내의 하나 이상의 유체 구획은 장치의 세포 형질감염, 세포 선택, 및/또는 세포 배양 확장 구획으로부터 제거된 폐 성장 배지 또는 다른 유체를 포함하기 위한 저장 구획으로 기능을 하는 폐기물 저장소로 기능을 할 수 있다.
장치 및 카트리지 제작 및 조립: 일부 경우에, 개시된 장치 및 카트리지는 단일 재료로부터 모놀리식 구조로 제작될 수 있다. 일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지는 완성된 장치를 생성하기 위해 함께 결합되거나 그 외 고정되는 둘 이상의 구성요소의 어셈블리를 포함할 수 있다.
카트리지는 당업자에게 공지된 다양한 기술 및 재료를 사용하여 제작될 수 있다. 일반적으로, 카트리지는 일련의 개별 구성 부품으로 제작된 후 다양한 기계적 조립 또는 결합 기술을 사용하여 조립될 수 있다. 적합한 제작 기술의 예에는 포토리소그래피 및 화학적 에칭, 통상적인 기계가공, CNC 기계가공, 사출 성형, 열성형, 및 3D 인쇄가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 카트리지 구성 요소가 제작되면 나사, 클립 등을 사용하여 기계적으로 조립하거나, 예를 들어 열 또는 초음파 접착/용접 또는 에폭시계, 아크릴계, 실리콘계, UV 경화성, 폴리우레탄계, 또는 시아노아크릴레이트계 접착제를 비롯한 임의의 다양한 접착제 또는 접착 필름의 사용을 통한 임의의 다양한 기술(사용된 재료 선택에 따라)을 사용하여 영구적으로 접착할 수 있다.
카트리지 구성요소는 실리콘, 용융 실리카, 유리, 임의의 다양한 중합체, 예를 들어 폴리디메틸실록산(PDMS; 엘라스토머), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고밀도 폴리에틸렌(HDPE), 폴리이미드, 고리형 올레핀 중합체(COP), 고리형 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 에폭시 수지 또는 금속(예를 들어, 알루미늄, 스테인리스 스틸, 구리, 니켈, 크롬, 및 티타늄), 및 Flexdym을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다수의 적합한 재료를 사용하여 제작될 수 있다.
언급된 바와 같이, 일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지(또는 그 안에 포함된 하나 이상의 유체 채널 및/또는 유체 구획의 하나 이상의 벽 또는 표면)는 광학적으로 투명한 재료를 사용하여 제작될 수 있다. 이러한 광학적으로 투명한 창, 벽, 또는 표면은 (예를 들어, 형광 이미징 또는 기타 이미징 기술을 사용하여) 장치 내 세포의 광학 이미징을 용이하게 하거나, (예를 들어, 분광 측정 기술을 사용하여) 장치 내의 세포 또는 세포 처리 단계의 광학 모니터링을 용이하게 하도록 설계될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 광학적으로 투명한 창, 벽, 또는 표면은 장치 내에서 세포의 레이저 기반 광분리 및/또는 광절제의 사용을 용이하게 하도록 설계될 수 있다. 일부 경우에, 개시된 장치 및 카트리지의 광학적으로 투명한 창, 벽, 또는 표면은 전자기 스펙트럼의 자외선(UV), 가시광선, 또는 근적외선(근-IR) 영역, 또는 이들의 임의의 조합에서 투명할 수 있다. 일부 경우에, 광학적으로 투명한 창, 벽, 또는 표면은 약 355 nm를 중심으로 하는 파장 범위에서 투명할 수 있다. 일부 경우에, 광학적으로 투명한 창, 벽, 또는 표면은 약 785 nm를 중심으로 하는 파장 범위에서 투명할 수 있다. 일부 경우에, 광학적으로 투명한 창, 벽, 또는 표면은 약 1440 nm 내지 약 1450 nm의 파장 범위에서 투명할 수 있다.
일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지의 광학적으로 투명한 창, 벽, 또는 표면은 약 220 nm(UV 광) 내지 약 1500 nm(IR 광) 범위의 파장에서 광의 투과를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 투과된 광의 파장은 최소 220 nm, 최소 250 nm, 최소 300 nm, 최소 350 nm, 최소 400 nm, 최소 450 nm, 최소 500 nm, 최소 550 nm, 최소 600 nm, 최소 650 nm, 최소 700 nm, 최소 750 nm, 최소 800 nm, 최소 850 nm, 최소 900 nm, 최소 950 nm, 최소 1,000 nm, 최소 1,100 nm, 최소 1,200 nm, 최소 1,300 nm, 최소 1,400 nm, 또는 최소 1,500 nm일 수 있다. 일부 경우에, 투과된 광의 파장은 최대 1,500 nm, 최대 1,400 nm, 최대 1,300 nm, 최대 1,200 nm, 최대 1,100 nm, 최대 1,000 nm, 최대 950 nm, 최대 900 nm, 최대 850 nm, 최대 800 nm, 최대 750 nm, 최대 700 nm, 최대 650 nm, 최대 600 n, 최대 550 nm, 최대 500 nm, 최대 450 nm, 최대 400 nm, 최대 350 nm, 최대 300 nm, 최대 250 nm, 또는 최대 220 nm일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 투과된 광의 파장은 약 400 nm 내지 약 900 nm의 범위일 수 있다. 당업자는 투과된 광의 파장이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 855 nm를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
카트리지의 유체 입구 및/또는 유체 출구는 외부 기기와 편리하고 누출을 방지하는 유체 연결을 제공하도록 설계될 수 있거나 카트리지 안팎으로 세포 샘플 및 시약의 수동 피펫팅을 위한 개방형 저장소 역할을 할 수 있다. 입구 및 출구 포트 커넥터를 위한 편리한 기계적 설계의 예에는 나사산 커넥터, 스웨이지 커넥터, 루어 락 커넥터, 루어 슬립 또는 "슬립 팁" 커넥터, 압입 커넥터 등이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 카트리지의 유체 입구 및/또는 유체 출구에는 카트리지가 기기에 위치할 때 열리거나 구멍이 뚫릴 수 있는 캡, 스프링 장착 덮개 또는 마개, 상변화 물질, 또는 고분자 막을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 보관하는 동안 내부 카트리지 표면의 오염을 방지하는 역할을 하고/거나 기기에서 카트리지를 제거할 때 유체가 엎질러지는 것을 방지한다.
일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지의 전체 치수(또는 "풋프린트")는 길이 및/또는 폭이 약 10 mm 내지 약 150 mm의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지는 길이 및/또는 폭이 최소 10 mm, 최소 15 mm, 최소 20 mm, 최소 25 mm, 최소 30 mm, 최소 35 mm, 최소 40 mm, 최소 45 mm, 최소 50 mm, 최소 55 mm, 최소 60 mm, 최소 65 mm, 최소 70 mm, 최소 75 mm, 최소 80 mm, 최소 85 mm, 최소 90 mm, 최소 95 mm, 최소 100 mm, 최소 105 mm, 최소 105 mm, 최소 110 mm, 최소 115 mm, 최소 120 mm, 최소 125 mm, 최소 130 mm, 최소 135 mm, 최소 140 mm, 최소 145 mm, 또는 적어도 150 mm일 수 있다. 일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지는 길이 및/또는 폭이 최대 150 mm, 최대 145 mm, 최대 140 mm, 최대 135 mm, 최대 130 mm, 최대 125 mm, 최대 120 mm, 최대 115 mm, 최대 110 mm, 최대 105 mm, 최대 100 mm, 최대 95 mm, 최대 90 mm, 최대 85 mm, 최대 80 mm, 최대 75 mm, 최대 70 mm, 최대 65 mm, 최대 60 mm, 최대 55 mm, 최대 50 mm, 최대 45 mm, 최대 40 mm, 최대 35 mm, 최대 30 mm, 최대 25 mm, 최대 20 mm, 최대 15 mm, 또는 최대 10 mm일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 개시된 장치 또는 카트리지의 길이 및/또는 폭은 약 30 mm 내지 약 130 mm의 범위일 수 있다. 당업자는 개시된 장치 또는 카트리지의 길이 및/또는 폭이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 112.5 mm를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지의 치수는 약 ± 0.005 mm에서 약 ± 0.05 mm 범위의 허용 오차(길이, 폭, 및/또는 깊이)를 가질 수 있다. 일부 경우에, 주어진 치수의 허용 오차는 ± 0.005 mm, ± 0.006 mm, ± 0.007 mm, ± 0.008 mm, ± 0.009 mm, ± 0.01 mm, ± 0.02 mm, ± 0.03 mm, ± 0.04 mm, 또는 ± 0.05 mm 내에 있을 수 있다. 당업자는 임의의 주어진 치수의 허용 오차가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 ± 0.0055 mm를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
바람직한 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지의 치수 또는 "풋프린트"는 기존의 실험실 자동화 장비, 예를 들어, 다른 제조업체로부터 이용 가능한 마이크로플레이트 처리 로봇과 호환되도록 미국 국립 표준 협회(ANSI) 표준 번호 SLAS 4-2004(R2012)를 준수할 수 있다. 이러한 경우, 장치 또는 카트리지는 길이가 127.76 mm ± 0.5 mm이고 폭이 85.48 mm ± 0.5 mm인 풋프린트를 가질 수 있다.
기타 장치 또는 카트리지 구성요소: 위에 표시된 바와 같이, 일부 경우에 개시된 장치 또는 카트리지는 장치를 통한 유체 유동의 제어를 위한 통합된 소형 또는 미세가공된 펌프 또는 기타 유체 작동 메커니즘을 포함할 수 있다. 적합한 소형 펌프 또는 유체 작동 메커니즘의 예에는 전기기계 또는 공압 작동 소형 주사기 또는 플런저 메커니즘, 화학 추진제, 공압 또는 외부 피스톤에 의해 작동되는 막 다이어프램 펌프, 공압 작동 시약 파우치 또는 블래더, 또는 전기 삼투 펌프가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
위에서 언급한 바와 같이, 일부 경우에 개시된 장치 또는 카트리지는 사전 로딩된 시약을 구획화하고/거나 장치를 통한 유체 유동을 제어하기 위한 소형 또는 미세가공된 밸브를 포함할 수 있다. 적합한 소형 밸브의 예에는 용융되거나 용해될 수 있는 왁스 또는 폴리머 플러그, 또는 천공될 수 있는 폴리머 막을 사용하여 제작된 원샷 "밸브"; 변형 가능한 막 및 공압식, 유압식, 자기식, 전자기식, 또는 전기기계식(솔레노이드) 작동을 사용하여 구성된 핀치 밸브, 변형 가능한 막 플랩을 사용하여 구성된 단방향 밸브, 로터리 밸브 및 소형 게이트 밸브가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지는 갇힌 공기 또는 다른 가스에 탈출 경로를 제공하기 위한 통풍구를 포함할 수 있다. 통풍구는 예를 들어 폴리디메틸실록산(PDMS)의 다공성 플러그 또는 공기의 모세관 위킹을 허용하지만 물에 의한 침투를 차단하는 기타 소수성 재료의 다공성 플러그를 사용하여 당업자에게 알려진 다양한 기술에 따라 구성될 수 있다. 통풍구는 또한 작동 중에 사용되는 압력에서 구멍 벽에 습윤이 발생하지 않도록 소수성 장벽 재료를 통한 구멍으로 구성될 수 있다.
일반적으로, 개시된 장치 또는 카트리지의 기계적 인터페이스 특징부는 외부 기기 시스템에 대한 카트리지의 쉽게 제거 가능하지만 고도로 정확하고 반복 가능한 위치 설정을 제공한다. 적절한 기계적 인터페이스 특징부에는 정렬 핀, 정렬 가이드, 기계적 정지 장치 등이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지는 또한 외부 온도 제어 모듈에 결합하기 위한 온도 제어 구성요소 또는 열 인터페이스 특징부를 포함할 수 있다. 적절한 온도 제어 요소의 예는 저항성 가열 요소, 소형 적외선 방출 광원, 펠티에 가열 또는 냉각 장치, 방열판, 서미스터, 열전대 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 열 인터페이스 특징부는 일반적으로 우수한 열 전도체(예를 들어, 구리, 금, 은, 알루미늄 등)인 재료로 제작되며 외부 가열 블록 또는 냉각 블록과 열 접촉이 잘 될 수 있는 하나 이상의 평평한 표면을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지, 또는 그 안에 포함된 하나 이상의 개별 유체 구획은 세포 생존도를 최적화하고 유지하기 위해 장치 내에서 배양된 세포의 미세 환경을 모니터링하고 조절하는 데 사용하기 위한 하나 이상의 센서를 추가로 포함할 수 있다. 예에는 온도 센서, pH 센서, 가스 센서(예를 들어, O2 센서, CO2 센서), 포도당 센서, 광학 센서, 전기화학 센서, 광전자 센서, 압전 센서, 또는 이들의 임의의 조합이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
위에서 언급한 바와 같이, 일부 경우에 개시된 장치 또는 카트리지(또는 그 안에 포함된 유체 채널 및/또는 유체 구획)는 추가 구성요소 또는 특징부, 예를 들어 현미경 관찰 또는 분광 모니터링 기술을 용이하게 하는 투명 광학 창, 마이크로 렌즈 구성요소, 또는 광 안내 특징부, 관류 시스템에 연결하기 위한 입구 및 출구 포트, 외부 프로세서 또는 전원 공급 장치에 전극 또는 센서를 연결하기 위한 전기 연결 등을 추가로 포함할 수 있다.
도 1은 본 개시내용의 세포 형질감염, 선택, 및 클론 확장 카트리지의 레이아웃의 비제한적인 예를 제공한다. 장치는 세포 형질감염 구획(예를 들어, 하나의 전극 쌍을 포함하는 전기천공 챔버)과 유체 연통하는 입구(좌측 상단)를 포함하고, 이의 유체 출구는 세포 선택 구획으로의 입구와 유체 연통한다. 선택 구획의 출구는 세포 선택 구획 내의 표면에서 성장하는 클론 세포 콜로니로부터 분리된 세포를 제거하기 위한 수단을 제공하는 밸브(원형 특징부로 표시됨)와 유체 연통하여 이들이 원하는 유전자형을 나타내는 세포 콜로니를 식별하기 위한 유전자 테스트에 적용될 수 있다. 유전자 테스트 결과를 기반으로 하여 선택된 클론 세포 콜로니의 나머지 세포가 분리되고 세포 확장 구획으로 이송될 수 있도록 하기 위해서 밸브는 세포 확장 구획의 입구와 또한 유체 연통한다. 세포 성장 및 분열의 여러 주기 후에, 세포의 클론 집단은 예를 들어 세포 확장 구획 내의 성장 표면에서 이들을 분리하기 위한 트립신 처리 및 이들을 도 1에서 장치의 좌측 하단에 도시된 출구로부터 제거함으로써 세포 확장 구획으로부터 수거될 수 있다.
도 2는 개시된 카트리지의 한 예에서 유체 입구, 유체 출구, 유체 채널 및 유체 구획(예를 들어, 세포 형질감염, 선택, 및 성장을 위한 것, 및 배양 배지 및 폐기물의 저장을 위한 것)의 레이아웃의 비제한적 예시를 제공한다. 이 비제한적인 예에서, 배양 배지는 배지 저장소로부터 세포 선택 및 클론 세포 성장을 수행하기 위해 사용되는 유체 구획(세포 배양 챔버)에 공급된다. 장치는 또한 폐기물 저장소뿐만 아니라 배양 배지 저장소, 폐기물 저장소, 및 세포 배양 챔버에 접근하기 위한 입구 및 출구를 포함한다. 일부 경우에, 유체 입구 및 출구는 멸균 배양 조건을 유지하고 누출을 방지하기 위해 도면에 표시된 바와 같이 격막을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 장치는 하나 이상의 유체 구획, 예를 들어 배양 배지 저장소 또는 폐기물 저장소의 안팎으로의 유체 유동의 공압 제어에 사용하기 위한 공압 접근 포트를 포함할 수 있으며, 여기서 유체 구획은 구획 내에 포함된 유체에 압력을 가하는 데 사용되는 가요성 막을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 장치는 하나 이상의 유체 구획, 예를 들어, 배양 배지 저장소 또는 폐기물 저장소의 안팎으로의 유체 유동을 제어하기 위해 원심분리 장치와 함께 사용될 수 있다. 일부 경우에, 장치는 유체 구획으로의 안팎으로, 또는 유체 구획 사이에서의 유체의 흐름을 제어하거나, 장치로부터 세포를 도입 또는 제거하는 데 사용되는 하나 이상의 유체 밸브를 포함할 수 있다.
도 3a - 3d는 본 개시내용의 부분적으로 조립된 및 완전히 조립된 세포 형질감염, 선택, 및 클론 확장 카트리지의 도면을 제공한다. 도 3a는 알루미늄 전극이 내장된 것이 보이는 둥근 배양 영역 및 전기천공 챔버가 있는 성형된 PDMS 칩의 사진을 제공한다. 도 3b는 베이스 플레이트 및 부착된 세포 선택 챔버, 세포 확장 챔버, 성장 배지 저장소, 폐기물 저장소, 및 세포 선택 챔버의 출구 및 테스트를 위해 선택 구획으로부터 세포를 제거하기 위한 확장 챔버의 입구와 유체 연통하는 밸브를 포함하는 카트리지의 예시를 제공한다. 도 3c는 베이스 플레이트 및 부착된 세포 선택 챔버, 세포 확장 챔버, 성장 배지 저장소, 폐기물 저장소, 및 세포 선택 챔버의 출구 및 유전자 테스트를 위해 선택 구획으로부터 세포를 제거하기 위한 세포 확장 챔버 입구와 유체 연통하는 밸브를 포함하는 프로토타입 카트리지의 사진을 제공한다. 도 3d는 배지 및 폐기물 저장소를 포함하는 조립된 카트리지의 사진을 제공한다.
사용 방법: 도 4는 본 개시내용의 세포 형질감염, 선택, 및 클론 확장 카트리지 내에서 수행되는 공정 단계의 비제한적인 예를 제공한다. 개시된 장치 및 카트리지로 시약 소비 및 공간 요건을 최소화하면서 적은 수의 입력 세포를 사용하여 고효율로 유전자 변형 세포의 클론 집단을 생성할 수 있다. 개시된 장치 또는 카트리지 내에서 수행되는 공정 단계는 다음을 포함할 수 있다: (i) 세포 형질감염(예를 들어, 전기천공법 또는 당업자에게 공지된 임의의 많은 다른 형질감염 메커니즘을 사용하여), (ii) 세포 부착 및 콜로니 형성(일부 경우에, 세포는 표면이 아닌 현탁액 또는 겔과 같은 매트릭스에서 배양될 수 있음), (iii) 세포 선택, (iv) 테스트를 위한 부분 콜로니 분리 및 세포 제거(카트리지 및 시스템의 구성에 따라 선택적 단계), (v) 세포 절제, (vi) 하나 이상의 선택된 세포 콜로니의 클론 확장, (vii) 분리 및 선택된 세포 콜로니의 별도의 세포 확장 챔버로의 이송(카트리지 및 시스템의 구성에 따라 선택적 단계), (viii) 세포 성장 모니터링, 및 (ix) 세포 분리 및 클론 세포 집단의 수거, 또는 이들의 조합.
세포 형질감염: 일부 경우에, 개시된 장치 및 카트리지는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 세포 형질감염 기술을 수행하도록 구성될 수 있는 적어도 하나의 세포 형질감염 구획을 포함한다. 예에는 화학적 형질감염, 기계적 형질감염(스퀴징), 전기천공, 레이저 유도 광천공, 바늘 기반 천공, 임페일펙션, 마그네토펙션, 초음파천공, 또는 이들의 임의의 조합이 포함되지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 세포 형질감염 구획의 구성은 선택한 특정 형질감염 기술(또는 기술 조합)의 요건을 충족하도록 설계된다. 일부 경우에, 세포 형질감염 구획은 장치 내의 다른 유체 채널의 치수와 동일하거나 상이한 치수의 유체 채널일 수 있다. 일부 경우에, 세포 형질감염은 세포 선택, 세포 분리 및/또는 절제, 또는 세포 확장 공정 단계 중 하나 이상과 동일한 구획에서 수행될 수 있다.
화학적 형질감염: 일부 경우에, 화학적 형질감염은 예를 들어 화학적 형질감염 시약(예를 들어, 일시적으로 세포막을 파괴하거나 핵산에 결합하고 세포막을 가로질러 수송을 촉진하는 인산칼슘, 덴드리머, 디에틸에탄올아민(DEAE)-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민(PEI) 등과 같은 양이온성 중합체)를 도입 및 혼합하기 위한 별도의 유체 채널에 세포 입구 채널을 통해 도입된 세포 현탁액을 간단히 제공함으로써 구현될 수 있다.
기계적 형질감염: 일부 경우에 기계적 형질감염(스퀴징)은 예를 들어 세포가 적절한 속도로 흐르도록 하는 유체 채널에 제한부를 제공하여 세포막이 일시적으로 파괴됨으로써 세포와 동일한 배지에 현탁된 형질감염제가 세포막을 통과함으로써 구현될 수 있다. 일부 경우에, 세포막을 기계적으로 파괴하기 위해 사용되는 제한부는 폭, 높이, 또는 직경이 약 1 마이크로미터(㎛) 내지 약 10 마이크로미터의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 제한부는 폭, 높이, 또는 직경이 최소 1 ㎛, 최소 2 ㎛, 최소 3 ㎛, 최소 4 ㎛, 최소 5 ㎛, 최소 6 ㎛, 최소 7 ㎛, 최소 8 ㎛, 최소 9 ㎛, 또는 최소 10 ㎛일 수 있다. 일부 경우에, 제한부는 폭, 높이, 또는 직경이 최대 10 ㎛, 최대 9 ㎛, 최대 8 ㎛, 최대 7 ㎛, 최대 6 ㎛, 최대 5 ㎛, 최대 4 ㎛, 최대 3 ㎛, 최대 2 ㎛, 또는 최대 1 ㎛일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 제한부는 폭, 높이, 또는 직경이 약 2 ㎛ 내지 약 8 ㎛의 범위일 수 있다. 당업자는 제한부가 폭, 높이, 또는 직경이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 7.6 ㎛을 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 제한부는 약 1 ㎛ 내지 약 50 ㎛ 범위의 제한부를 통한 유체 유동 및 세포 수송의 방향의 길이 또는 치수를 가질 수 있다. 일부 경우에, 제한부 길이는 최소 1 ㎛, 최소 2 ㎛, 최소 3 ㎛, 최소 4 ㎛, 최소 5 ㎛, 최소 6 ㎛, 최소 7 ㎛, 최소 8 ㎛, 최소 9 ㎛, 최소 10 ㎛, 최소 15 ㎛, 최소 20 ㎛, 최소 30 ㎛, 최소 40 ㎛, 또는 최소 50 ㎛일 수 있다. 일부 경우에, 제한부 길이는 최대 50 ㎛, 최대 40 ㎛, 최대 30 ㎛, 최대 20 ㎛, 최대 15 ㎛, 최대 10 ㎛, 최대 9 ㎛, 최대 8 ㎛, 최대 7 ㎛, 최대 6 ㎛, 최대 5 ㎛, 최대 4 ㎛, 최대 3 ㎛, 최대 2 ㎛, 또는 최대 1 ㎛일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 제한부 길이는 약 5 ㎛ 내지 약 15 ㎛의 범위일 수 있다. 당업자는 제한부 길이가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 22.5 ㎛를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 기계적 형질감염을 수행하는 데 사용되는 하나 이상의 제한부를 포함하는 유체 채널 또는 유체 구획은 직렬 및/또는 병렬로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000개 이상의 제한부를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 기계적 형질감염을 수행하는 데 사용되는 하나 이상의 제한부를 포함하는 유체 채널 또는 유체 구획은 이 범위 내에서 임의의 수의 제한부(직렬 및/또는 병렬로), 예를 들어 22개의 제한부를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 세포는 약 1 mm/초 내지 약 1,400 mm/초 범위의 유량 또는 속도로 기계적 형질감염을 수행하는 데 사용되는 제한부를 통과할 수 있다. 일부 경우에, 속도는 최소 1 mm/초, 최소 10 mm/초, 최소 20 mm/초, 최소 30 mm/초, 최소 40 mm/초, 최소 50 mm/초, 최소 60 mm/초, 최소 70 mm/초, 최소 80 mm/초, 최소 90 mm/초, 최소 100 mm/초, 최소 200 mm/초, 최소 300 mm/초, 최소 400 mm/초, 최소 500 mm/초, 최소 600 mm/초, 최소 700 mm/초, 최소 800 mm/초, 최소 900 mm/초, 최소 1,000 mm/초, 최소 1,100 mm/초, 최소 1,200 mm/초, 최소 1,300 mm/초, 또는 최소 1,400 mm/초일 수 있다. 일부 경우에, 속도는 최대 1,400 mm/초, 최대 1,300 mm/초, 최대 1,200 mm/초, 최대 1,100 mm/초, 최대 1,000 mm/초, 최대 900 mm/초, 최대 800 mm/초, 최대 700 mm/초, 최대 600 mm/초, 최대 500 mm/초, 최대 400 mm/초, 최대 300 mm/초, 최대 200 mm/초, 최대 100 mm/초, 최대 90 mm/초, 최대 80 mm/초, 최대 70 mm/초, 최대 60 mm/초, 최대 50 mm/초, 최대 40 mm/초, 최대 30 mm/초, 최대 20 mm/초, 최대 15 mm/초, 최대 10 mm/초, 또는 최대 1 mm/초일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 속도는 약 10 mm/초 내지 약 1,000 mm/초의 범위일 수 있다. 당업자는 속도가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 24 mm/초를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 세포 형질감염 챔버(또는 유체 채널)는 전극 사이를 통과하는 세포가 세포막을 일시적으로 파괴하고 형질감염제가 세포에 들어갈 수 있도록 하는 전기장에 적용되도록 적절한 치수 및/또는 간격의 적어도 하나의 전극 쌍을 포함할 수 있다.
전기천공: 일부 경우에, 세포 형질감염 구획 또는 유체 채널은 전극 사이를 통과하는 세포의 전기천공을 수행하도록 구성된 적어도 하나의 전극 쌍을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포 형질감염 구획은 개별 전극 쌍 사이를 통과하는 세포의 전기천공을 수행하도록 구성된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 10개 초과의 전극 쌍을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 2개 이상의 전극 쌍이 직렬로 배열될 수 있다. 일부 경우에, 2개 이상의 전극 쌍이 병렬로 배열될 수 있다.
일부 경우에, 전기천공을 수행할 목적으로 세포가 노출되는 하나의 전극 쌍에서 각각의 전극의 표면적은 약 0.001 ㎟ 내지 약 100 ㎟의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 하나의 전극 쌍에서 각 전극의 표면적은 동일할 수 있다. 일부 경우에, 하나의 전극 쌍에서 각 전극의 표면적은 상이할 수 있다. 일부 경우에, 각각의 전극의 표면적은 최소 0.001 mm2, 최소 0.01 mm2, 최소 0.1 mm2, 최소 0.2 mm2, 최소 0.3 mm2, 최소 0.4 mm2, 최소 0.5 mm2, 최소 0.6 mm2, 최소 0.7 mm2, 최소 0.8 mm2, 최소 0.9 mm2, 최소 1.0 mm2, 최소 1.5 mm2, 최소 2.0 mm2, 최소 2.5 mm2, 최소 3.0 mm2, 최소 3.5 mm2, 최소 4.0 mm2, 최소 4.5 mm2, 최소 5 mm2, 최소 10 mm2, 최소 20 mm2, 최소 30 mm2, 최소 40 mm2, 최소 50 mm2, 최소 60 mm2, 최소 70 mm2, 최소 80 mm2, 최소 90 mm2, 또는 최소 100 mm2일 수 있다. 일부 경우에, 각각의 전극의 표면적은 최대 100 mm2, 최대 90 mm2, 최대 80 mm2, 최대 70 mm2, 최대 60 mm2, 최대 50 mm2, 최대 40 mm2 , 최대 30 mm2, 최대 20 mm2, 최대 10 mm2, 최대 5 mm2, 최대 4.5 mm2, 최대 4.0 mm2, 최대 3.5 mm2, 최대 3.0 mm2, 최대 2.5 mm2, 최대 2.0 mm2, 최대 1.5 mm2, 최대 1.0 mm2, 최대 0.9 mm2, 최대 0.8 mm2, 최대 0.7 mm2, 최대 0.6 mm2, 최대 0.5 mm2, 최대 0.4 mm2, 최대 0.3 mm2, 최대 0.2 mm2, 최대 0.1 mm2, 최대 0.01 mm2, 또는 최대 0.001 mm2일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 각 전극의 표면적은 약 0.1 mm2 내지 약 0.9 mm2의 범위일 수 있다. 당업자는 각각의 전극의 표면적이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 0.66 mm2을 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 전극 쌍의 전극 사이의 분리 거리는 약 10 ㎛ 내지 약 10 mm의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 제1 전극 쌍의 전극과 제2 전극 쌍의 전극 사이의 분리 거리는 동일할 수 있다. 일부 경우에, 제1 전극 쌍의 전극과 제2 전극 쌍의 전극 사이의 분리 거리는 상이할 수 있다. 일부 경우에, 하나의 전극 쌍에서 전극 사이의 분리 거리는 최소 10 ㎛, 최소 50 ㎛, 최소 100 ㎛, 최소 200 ㎛, 최소 300 ㎛, 최소 400 ㎛, 최소 500 ㎛, 최소 600 ㎛, 최소 700 ㎛, 최소 800 ㎛, 최소 900 ㎛, 최소 1 mm, 최소 2 mm, 최소 3 mm, 최소 4 mm, 최소 5 mm, 최소 6 mm, 최소 7 mm, 최소 8 mm, 최소 9 mm, 또는 최소 10 mm일 수 있다. 일부 경우에, 하나의 전극 쌍에서 전극 사이의 분리 거리는 최대 10 mm, 최대 9 mm, 최대 8 mm, 최대 7 mm, 최대 6 mm, 최대 5 mm, 최대 4 mm, 최대 3 mm, 최대 2 mm, 최대 1 mm, 최대 900 ㎛, 최대 800 ㎛, 최대 700 ㎛, 최대 600 ㎛, 최대 500 ㎛, 최대 400 ㎛, 최대 300 ㎛, 최대 200 ㎛, 최대 100 ㎛, 최대 50 ㎛, 또는 최대 10 ㎛일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 하나의 전극 쌍에서 전극 사이의 분리 거리는 약 100 ㎛ 내지 약 2 mm의 범위일 수 있다. 당업자는 하나의 전극 쌍에서 전극 사이의 분리 거리가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 785 ㎛를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 하나의 전극 쌍의 전극 사이에 인가된 전압 차(또는 그의 절대값)는 약 10-5 볼트 내지 약 2,000 볼트의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 제1 전극 쌍의 전극 사이에 인가된 전압 차는 제2 전극 쌍의 전극 사이에 인가된 전압 차와 동일할 수 있다. 일부 경우에, 제1 전극 쌍의 전극 사이에 인가된 전압 차와 제2 전극 쌍의 전극 사이에 인가된 전압 차는 상이할 수 있다. 일부 경우에, 하나의 전극 쌍의 전극 사이에 인가된 전압 차는 최소 10-5 볼트, 최소 10-4 볼트, 최소 10-3 볼트, 최소 10-2 볼트, 최소 10-1 볼트, 최소 1 볼트, 적어도 10 볼트, 최소 50 볼트, 최소 100 볼트, 최소 200 볼트, 최소 300 볼트, 최소 400 볼트, 최소 500 볼트, 최소 600 볼트, 최소 700 볼트, 최소 800 볼트, 최소 900 볼트, 최소 1,000 볼트, 최소 1,200 볼트, 최소 1,400 볼트, 최소 1,600 볼트, 최소 1,800 볼트, 또는 최소 2,000 볼트일 수 있다. 일부 경우에, 하나의 전극 쌍의 전극 사이에 인가된 전압 차는 최대 2,000 볼트, 최대 1,800 볼트, 최대 1,600 볼트, 최대 1,400 볼트, 최대 1,200 볼트, 최대 1,000 볼트, 최대 900 볼트, 최대 800 볼트, 최대 700 볼트, 최대 600 볼트, 최대 500 볼트, 최대 400 볼트, 최대 300 볼트, 최대 200 볼트, 최대 100 볼트, 최대 50 볼트, 최대 10 볼트, 최대 1 volt, 최대 10-1 볼트, 최대 10-2 볼트, 최대 10-3 볼트, 최대 10-4 볼트, 또는 최대 10-5 볼트일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 하나의 전극 쌍의 전극 사이에 인가된 전압 차는 약 100 볼트 내지 약 800 볼트의 범위일 수 있다. 당업자는 하나의 전극 쌍의 전극 사이에 인가된 전압 차가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 756볼트를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 세포의 전기천공에 사용되는 전기장 강도(또는 그의 절대값)는 약 0 볼트/cm 내지 약 2,000 볼트/cm의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 전기장 강도는 최소 0 볼트/cm, 최소 50 볼트/cm, 적어도 100 볼트/cm, 최소 150 볼트/cm, 최소 200 볼트/cm, 최소 250 볼트/cm, 적어도 300 볼트/cm, 최소 350 볼트/cm, 최소 400 볼트/cm, 적어도 450 볼트/cm, 적어도 500 볼트/cm, 최소 550 볼트/cm, 최소 600 볼트/cm, 최소 650 볼트/cm, 적어도 700 볼트/cm, 최소 750 볼트/cm, 최소 800 볼트/cm, 최소 850 볼트/cm, 적어도 900 볼트/cm, 최소 950 볼트/cm, 최소 1000 볼트/cm, 최소 1,100 볼트/cm, 적어도 1,200 볼트/cm, 최소 1,300 볼트/cm, 최소 1,400 볼트/cm, 최소 1,500 볼트/cm, 최소 1,600 볼트/cm, 최소 1,700 볼트/cm, 최소 1,800 볼트/cm, 최소 1,900 볼트/cm, 또는 적어도 2,000 볼트/cm일 수 있다. 일부 경우에, 전기장 강도는 최대 2,000 볼트/cm, 최대 1,900 볼트/cm, 최대 1,800 볼트/cm, 최대 1,700 볼트/cm, 최대 1,600 볼트/cm, 최대 1,500 볼트/cm, 최대 1,400 볼트/cm, 최대 1,300 볼트/cm, 최대 1,200 볼트/cm, 최대 1,100 볼트/cm, 최대 1,000 볼트/cm, 최대 950 볼트/cm, 최대 900 볼트/cm, 최대 850 볼트/cm, 최대 800 볼트/cm, 최대 750 볼트/cm, 최대 700 볼트/cm, 최대 650 볼트/cm, 최대 600 볼트/cm, 최대 550 볼트/cm, 최대 500 볼트/cm, 최대 450 볼트/cm, 최대 400 볼트/cm, 최대 350 볼트/cm, 최대 300 볼트/cm, 최대 250 볼트/cm, 최대 200 볼트/cm, 최대 150 볼트/cm, 최대 100 볼트/cm, 최대 50 볼트/cm, 또는 최대 0 볼트/cm일 수 있다. 이 단락에서 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 전기장 강도는 약 100 볼트/cm 내지 약 1,800 볼트/cm의 범위일 수 있다. 당업자는 전기장 강도가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 1,875 볼트/cm를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 세포는 약 0.1 mm/초 내지 약 100 mm/초 범위의 유량 또는 속도로 하나 이상의 전극 쌍을 통해 수송될 수 있다. 일부 경우에, 속도는 최소 0.1 mm/초, 최소 1 mm/초, 최소 5 mm/초, 최소 10 mm/초, 최소 20 mm/초, 최소 30 mm/초, 최소 40 mm/초, 최소 50 mm/초, 최소 60 mm/초, 최소 70 mm/초, 최소 80 mm/초, 최소 90 mm/초, 또는 적어도 100 mm/초일 수 있다. 일부 경우에, 속도는 최대 100 mm/초, 최대 90 mm/초, 최대 80 mm/초, 최대 70 mm/초, 최대 60 mm/초, 최대 50 mm/초, 최대 40 mm/초, 최대 30 mm/초, 최대 20 mm/초, 최대 15 mm/초, 최대 10 mm/초, 최대 5 mm/초, 최대 1 mm/초, 또는 최대 0.1 mm/초일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 속도는 약 1 mm/초 내지 약 20 mm/초의 범위일 수 있다. 당업자는 속도가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 17 mm/초를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
레이저 유도 광천공: 일부 경우에, 세포 형질감염 구획(또는 유체 채널)은 광천공, 예를 들어 레이저 유도 광천공을 수행하도록 구성된 레이저 광선 또는 기타 광원에 대한 광학적 접근을 제공하는 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽을 포함할 수 있다. 광천공은 단독으로 또는 감응형 나노입자와 조합하여 집중, 연속 또는 펄스 레이저 광을 사용하여 세포막에 국부적인 일시적 기공의 생성을 기반으로 한다[예를 들어, R. Xiong, et al. (2016), "Laser-Assisted Photoporation: Fundamentals, Technological Advances and Applications", Advances in Physics, 1(4):596-620 참조]. 전자기 스펙트럼의 자외선(UV), 가시광선, 또는 근적외선(근-IR) 영역에서 작동하는 레이저를 사용하여 광열적, 광기계적 및/또는 광화학적 효과를 통해 집속된 레이저 빔(일반적으로 직경 1 - 10 ㎛ 초점으로 구성)에 의해 직경이 최대 수백 나노미터인 구멍이 세포막에 형성될 수 있다. 적합한 레이저 파장의 예에는 표 1에 나열된 것들이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
| 레이저 유형 |
파장
(나노미터) |
| 염화제논 | 308 및 459 |
| 플루오린화제논 | 353 및 459 |
| 헬륨 카드뮴 | 325 - 442 |
| 로다민 6G | 450 - 650 |
| 아르곤 | 457 - 528 (514.5 및 488이 가장 많이 사용됨) |
| 주파수 배가 Nd:YAG | 532 |
| 헬륨 네온 | 543, 594, 612, 및 632.8 |
| 크립톤 | 337.5 - 799.3 (647.1 - 676.4가 가장 많이 사용됨) |
| 루비 | 694.3 |
| 레이저 다이오드 | 630 - 950 |
| Ti:사파이어 | 690 - 960 |
| 알렉산드라이트 | 720 - 780 |
| Nd:YAG | 1064 |
일부 경우에, 레이저 유도 광천공을 수행하는 데 하나 이상의 레이저가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 사용되는 하나 이상의 레이저는 연속파 레이저일 수 있다. 일부 경우에, 사용되는 하나 이상의 레이저는 펄스 레이저일 수 있다. 선택된 레이저의 유형과 펄스를 생성하는 데 사용되는 기술(예를 들어, 모드 잠금 고체 레이저, Q-스위칭된 고체 레이저 또는 이득 스위칭된 반도체 레이저)에 따라, 레이저 펄스 주파수는 1 Hz 미만에서 100 GHz 초과까지의 범위일 수 있다. 유사하게, 선택된 레이저의 유형과 펄스를 생성하는 데 사용되는 기술에 따라, 레이저 펄스 폭은 1 마이크로초보다 길고 100 펨토초보다 적은 범위일 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 광천공을 수행하는 데 사용되는 레이저는 예를 들어 펄스 길이가 약 550 피코초 미만인 약 1,064 nm의 펄스 광을 생성할 수 있다.
일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지에서 레이저 유도 광천공을 수행하는 데 사용되는 레이저는 광분리 및/또는 광절제를 수행하는 데 사용되는 레이저와 동일할 수 있으며, 여기서 작동 모드는 아래에서 더 자세히 논의되는 바와 같이 레이저의 평균 전력 설정, 피크 전력 설정, 펄스 주파수, 펄스 지속시간(펄스 폭), 노출 시간, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 조정함으로써 전환될 수 있다.
바늘 기반 천공: 일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지의 세포 형질감염 구획은 바늘 기반 천공을 수행하도록 구성될 수 있으며, 예를 들어 여기서 세포막을 천공하고/거나 세포 내부로의 형질감염제를 주입하는 데 하나 이상의 미세바늘이 사용된다. 일부 경우에, 세포 형질감염 구획은 쉽게 접근할 수 있는 장치 또는 카트리지의 개방 영역을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포 형질감염 구획은 구획의 내부에 접근할 수 있도록 제거 가능한 뚜껑으로 밀봉된 구획을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 형질감염을 위해 개별 세포를 표적화하고 미세바늘을 안내하는 데 현미경 및/또는 미세조작기가 사용될 수 있다.
임페일펙션: 일부 경우에, 세포 형질감염 구획은 임페일펙션을 수행하도록 구성될 수 있다. 임페일펙션은 탄소 나노섬유, 탄소 나노튜브, 또는 나노와이어와 같은 나노물질을 사용하여 세포 내 구획으로 형질감염제를 전달하는 방법이다. 일부 경우에, 바늘형 나노구조는 세포 형질감염 구획 내의 표면에서 합성될 수 있고 형질감염제, 예를 들어 세포 내 전달을 위한 지정된 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA로 코팅될 수 있다. 세포 형질감염 구획 내로 도입된 세포는 표면에 정착할 수 있거나 표면에 대해 눌러질 수 있어 나노구조에 의해 찔리고 형질감염되어 전달된 유전자(들)의 발현을 유도할 수 있다.
마그네토펙션: 일부 경우에, 세포 형질감염 구획은 OZ Biosciences, Inc.(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 의해 상용화된 기술인 마그네토펙션을 수행하도록 구성될 수 있다. 마그네토펙션은 자기장을 사용하여 형질감염제가 포함된 자성 입자를 끌어당겨 표적 세포 내로 끌어들인다. 형질감염제, 예를 들어 핵산 분자는 양이온성 자성 나노입자와 결합된 후, 이러한 분자 복합체는 농축되고 적절한 자기장을 사용하여 세포막을 통해 세포 내로 수송되어 높은 형질감염 효율을 유도하는 고용량의 형질감염제의 전달을 제공한다.
초음파천공: 일부 경우에, 세포 형질감염 구획은 초음파천공(세포 초음파 처리)을 수행하도록 구성될 수 있다. 초음파천공은 초음파 기계적 진동과 미세 기포의 음향 캐비테이션(cavitation)을 사용하여 세포 원형질막의 투과성을 변형시켜 DNA 분자와 같은 형질감염제가 세포 내로 흡수되도록 한다. 이 기술의 형질감염 효율은 전기천공을 사용하여 달성되는 것과 같거나 더 나을 수 있지만, 저주파(< 1MHz) 초음파에 장기간 노출되면 파열 및 세포 사멸이 발생하는 것으로 나타났으므로 결과적인 세포 생존도도 조사되어야한다. 일부 경우에, 초음파천공은 상업적으로 이용 가능한 초음파천공기를 사용하여 구현될 수 있다. 일부 경우에, 초음파천공은 통합 압전 변환기를 사용하여 개시된 장치 또는 카트리지에서 구현될 수 있다.
세포 부착 및 콜로니 형성: 일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지는 세포 형질감염 구획과 유체 연통하고 형질감염 단계 후에 세포가 도입되는 적어도 하나의 세포 선택 구획을 포함한다. 다수의 개별 형질감염된 세포가 도입되고 세포 선택 구획 내의 표면(예를 들어, "성장 표면")에 부착되도록 허용되고, 이어서 작은 클론 세포 콜로니를 형성하기 위해 성장 및 분열의 여러 주기를 거치도록 허용된다. 일부 경우에, 세포 이중선 또는 삼중선이 실수로 도입되어 세포 선택 구획 내의 표면에 부착되도록 허용될 수 있으며, 생성된 모든 세포 콜로니가 단일 유전자형의 세포를 포함하도록 보장하기 위해서 제거되거나 파괴될 수 있다(예를 들어, 아래에서 더 자세히 설명되는 레이저 광절제 기술을 사용하여).
일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지는 부착성 세포주로부터 세포의 클론 집단을 생성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 경우, 부착 세포 현탁액이 초기 농도로 장치 또는 카트리지에 도입되고, 세포 형질감염 구획 내에서 형질감염된 다음, 세포 선택 구획 내로 도입되고, 세포 선택 구획 내의 하나 이상의 성장 표면에 정착하고 부착물을 형성하도록 허용된다. 일부 경우에, 성장 표면은 예를 들어 유리, 용융 실리카, 실리콘, 또는 중합체 표면을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 성장 표면은 예를 들어 유리, 용융 실리카, 실리콘, 또는 중합체의 하부 표면에 적용된 하나 이상의 코팅 층을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 코팅 층은 성장 표면에 부착 세포의 부착을 용이하게 하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 코팅 층은 예를 들어, 효소 처리, 광분해 기술, 또는 레이저 광분리 기술을 사용하여 후속 유전자 테스트 또는 수거를 위해 클론 세포 콜로니의 전부 또는 일부의 후속 분리를 용이하게 하도록 구성될 수 있다. 적합한 코팅의 예는 α-폴리-리신 코팅, 콜라겐 코팅, 폴리-1-오르니틴 코팅, 피브로넥틴 코팅, 라미닌 코팅, 실란 코팅, 또는 효소 특이적 기질(예를 들어, 특정 프로테아제에 의해 인식되는 펩티드 서열) 또는 광절단 가능한 링커 분자를 포함하는 코팅을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 예를 들어 개시된 장치 또는 카트리지가 성체 세포로부터 직접 유래된 유도 만능 줄기세포(iPSC)와 함께 사용되는 경우, 표면 코팅은 Synthemax™ 비트로넥틴 코팅(Corning, Inc., 미국 뉴욕주 코닝 소재) 및/또는 iMatrix-511 재조합 라미닌 코팅(Takara Bio USA, 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지는 현탁 세포주로부터 세포의 클론 집단을 생성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 경우, 용액에서 정상적으로 성장하는 세포 현탁액이 초기 농도로 장치 또는 카트리지에 도입되고, 세포 형질감염 구획 내에서 형질감염된 다음, 세포 선택 구획으로 도입되고 세포 선택 구획 내에서 하나 이상의 성장 표면에 정착하고 부착물을 형성하도록 허용된다. 일부 경우에, 성장 표면은 예를 들어 유리, 용융 실리카, 실리콘, 또는 중합체 표면을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 성장 표면은 예를 들어 유리, 용융 실리카, 실리콘, 또는 중합체의 하부 표면에 적용된 하나 이상의 코팅 층을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 코팅 층은 성장 표면에 부착 세포의 부착을 용이하게 하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 코팅 층은 예를 들어, 효소 처리, 광분해 기술, 또는 레이저 광분리 기술을 사용하여 후속 유전자 테스트 또는 수거를 위해 클론 세포 콜로니의 전부 또는 일부의 후속 분리를 용이하게 하도록 구성될 수 있다. 이러한 경우에 적합한 성장 표면 코팅의 예에는 α-폴리-리신 코팅, 콜라겐 코팅, 폴리-l-오르니틴 코팅, 피브로넥틴 코팅, 라미닌 코팅, 실란 코팅, 또는 선택된 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합하는 테더링된 항체, 효소 특이적 기질(예를 들어, 특정 프로테아제에 의해 인식되는 펩티드 서열) 또는 광절단 가능한 링커 분자를 포함하는 코팅을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 세포 선택 구획은 구획 내의 표면(예를 들어, 표면 코팅을 선택적으로 포함할 수 있는 성장 표면)에 정착하고 부착물을 형성하도록 허용되는 형질감염된 세포로 시딩될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 1,000개 세포/mm2, 900개 세포/mm2, 800개 세포/mm2, 700개 세포/mm2, 600개 세포/mm2, 500개 세포/mm2, 400개 세포/mm2, 300개 세포/mm2, 200개 세포/mm2, 100개 세포/mm2, 50개 세포/mm2, 10개 세포/mm2, 또는 5개 세포/mm2 이하의 표면 밀도로 시딩될 수 있다.
세포 성장의 모니터링 - 이미징: 위에서 언급한 바와 같이, 일부 경우에, 세포 선택 구획(및/또는 장치의 다른 유체 구획 또는 유체 채널)은 광학적으로 투명할 수 있음으로써, 예를 들어, 현미경 이미징 기술을 사용하여 세포 부착, 세포 성장 및/또는 클론 세포 콜로니의 형성을 모니터링할 수 있다. 임의의 다양한 현미경 이미징 기술을 사용하여 세포 선택 구획(또는 장치가 있는 임의의 다른 유체 구획) 내에서 세포 성장 및 클론 세포 콜로니 형성을 모니터링할 수 있다. 예에는 명시야, 암시야, 위상차, 형광, 및 2광자 형광 이미징이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 초해상도 이미징 기술, 예를 들어 초고해상도 형광 이미징을 사용할 수 있으며, 이를 통해 이미징 파장에서 빛의 회절 한계에 의해 결정된 것보다 더 높은 공간 해상도(예를 들어, 10 - 200 nm 해상도)로 이미지를 캡처할 수 있다. 일부 경우에, 배양 플레이트 웰에 넣은 세포의 그레이스케일 이미지를 획득하여 세포 식별 및 세포 위치 좌표의 결정에 사용할 수 있다. 일부 경우에, 배양 플레이트 웰에 넣은 세포의 적색-녹색-청색(RGB, 또는 컬러) 이미지를 획득하여 세포 식별 및 세포 위치 좌표의 결정에 사용할 수 있다. 적합한 이미징 획득 하드웨어 및 이미지 처리 소프트웨어의 예는 아래에서 더 자세히 논의될 것이다.
일부 경우에, 이미징하는 단계는 1일당 적어도 1회, 1일당 적어도 2회, 1일당 적어도 4회, 1일당 적어도 6회, 1일당 적어도 12회, 1일당 적어도 24회(시간당 적어도 1회), 또는 30분에 적어도 1회의 빈도로 수동, 반자동, 또는 완전 자동 방식으로 수행될 수 있다.
세포 성장 모니터링 - 임피던스 측정: 일부 경우에, 세포 선택 구획(및/또는 장치의 다른 유체 구획 또는 유체 채널)은 전기 임피던스 측정을 사용하여 세포 성장을 모니터링하도록 구성된 하나 이상의 전극 쌍을 포함할 수 있다. 전기 세포 기판 임피던스 감지는 생물학적 세포의 무표지 및 실시간 모니터링을 위한 방법이다[예를 들어, Lee, et al. (2014), "Electrical Impedance Characterization of Cell Growth on Interdigitated Microelectrode Array", J. Nanosci. Nanotechnol. 14(11):8342-8346 참조]. 일부 경우에, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 10개 초과의 전극 쌍을 사용하여 구획에서 세포 성장을 모니터링하기 위해 전기 임피던스 측정을 수행할 수 있다. 일부 경우에, 전극 쌍은 예를 들어, 맞물린 핑거 세트를 포함하는 맞물린 전극(IDE: interdigitated electrode) 어레이를 포함할 수 있다. 문헌[Lee, et al. (2014)]은 예를 들어 길이 1.2 mm, 폭 50 ㎛, 간격 50 ㎛, 및 두께 75 nm를 갖는 10개의 핑거로 이루어진 맞물린 전극(IDE) 어레이를 사용하였으며 락인(lock-in) 증폭기 기반 시스템을 사용하여 100 Hz 내지 100 kHz의 주파수 범위에 존재하는 세포가 있거나 없는 제작된 IDE의 임피던스 스펙트럼을 측정하였다. 일부 경우에, 맞물린 전극 쌍은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 10개 초과의 맞물린 핑거 또는 맞물린 핑거 쌍을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 전기 임피던스 측정을 수행하기 위해 사용되는 전극은 약 0.1 mm 내지 약 30 mm 범위의 길이를 가질 수 있고(그리고 이 범위 내의 임의의 길이, 예를 들어, 약 15 mm를 가질 수 있음), 약 10 ㎛ 내지 약 2 mm 범위의 폭(그리고 이 범위 내의 임의의 폭, 예를 들어, 약 1.2 mm를 가질 수 있음), 및 약 10 nm 내지 약 1,000 nm 범위의 두께를 가질 수 있다(그리고 이 범위 내에서 임의의 두께, 예를 들어, 약 125 nm를 가질 수 있음). 전극은 백금, 금, 은, 구리, 아연, 알루미늄, 그래핀, 또는 인듐 주석 산화물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 재료로 제작될 수 있다. 선택한 주파수에서 임피던스 측정을 사용하여 특정 유형의 세포 특성에 따라 달라지는 세포 부착 및 증식 특성을 모니터링할 수 있다.
세포 검출 및 선택: 일부 경우에, 세포 선택 구획(또는 개시된 장치 또는 카트리지의 임의의 다른 구획)은 세포의 위치를 검출하고/거나 광분리, 테스트를 위한 제거, 광절제, 및/또는 후속 수거를 위한 하나 이상의 클론 세포 집단을 생성하기 위한 확장을 위한 개별 세포 또는 클론 세포 콜로니를 선택하기 위한 목적으로 이미징될 수 있다. 일부 경우에, 이미지는 세포의 식별 및 예를 들어 광분리 또는 광절제 단계의 수동 제어를 위해 숙련된 조작자가 실시간으로 볼 수 있다. 일부 경우에 이미지는 다음 단계 중 하나 이상을 수행하기 위해 반자동 또는 완전 자동화 공정을 사용하여 캡처 및 처리될 수 있다: (i) 이미지 분할, (ii) 특징 추출, (iii) 세포 식별 및 위치 좌표의 결정, (iv) 세포 선택, 및 (v) 선택된 세포 콜로니의 일부를 선택적으로 분리하거나 원하지 않는 세포를 선택적으로 절제하기 위해서, 파괴를 위해 선택된 세포에 대한 세포 위치 좌표 데이터를 레이저 스캐닝 시스템을 지시하거나 병진 스테이지 및 레이저 노출의 위치를 제어하는 표적화 시스템으로 전송.
일부 경우에, 테스트를 위해 부분적으로 분리하거나 클론 확장을 위해 보유할 세포 또는 클론 세포 클러스터(또는 세포 또는 세포 클러스터의 서브세트)의 선택은 무작위로 이루어지며, 세포 선택 구획 내의 다른 모든 세포는 파괴된다. 일부 경우에, 테스트를 위해 부분적으로 분리하거나 클론 확장을 위해 보유할 세포 또는 클론 세포 클러스터(또는 세포 또는 세포 클러스터의 서브세트)의 선택은 세포 자체에 고유한 특성 또는 특징과 무관한 선택 기준에 기초하여 이루어진다(예를 들어, 선택은 세포(들)이 외인성 표지 또는 발현된 리포터를 포함하는지 여부에 기초하지 않음). 예를 들어, 일부 경우에, 세포 또는 클론 세포 클러스터는 간단히 세포 선택 구획 내의 표면 상의 위치에 기초하여 유지되도록 선택된다. 일부 경우에, 세포 선택 구획 내의 표면의 중심에 가장 가까운 세포 또는 클론 세포 클러스터(또는 세포 또는 클론 세포 클러스터의 서브세트)가 유지되도록 선택되고 다른 모든 세포는 절제된다. 일부 경우에, 세포 선택 구획 내의 표면의 중심으로부터 지정된 거리에 있는 세포 또는 클론 세포 클러스터(또는 세포 또는 클론 세포 클러스터의 서브세트)가 유지되도록 선택되고, 다른 모든 세포는 절제된다. 일부 경우에, 세포 선택 구획의 벽에 가장 가까운 세포 또는 클론 세포 클러스터(또는 세포 또는 클론 세포 클러스터의 서브세트)가 유지되도록 선택되고, 다른 모든 세포는 절제된다. 일부 경우에, 세포 이중선, 삼중선 또는 기타 세포 응집체는 표면 상의 또는 세포 선택 구획 내에서의 위치에 관계없이 절제될 것이다.
일부 경우에, 보유(또는 파괴)할 세포 또는 클론 세포 콜로니(또는 세포 또는 클론 세포 콜로니의 서브세트)의 선택은 세포 자체에 고유한 특성 또는 특징에 의존하는 선택 기준에 기초하여 이루어진다. 예를 들어, 세포를 선택하고 유지하기 위해(또는 세포를 선택하고 파괴하기 위해) 사용될 수 있는 기준에는 세포 표현형, 세포 유전자형, 세포 형태, 세포 크기, 발달 단계, 하나 이상의 지정된 바이오마커 및/또는 리포터 분자의 존재 또는 부재(예를 들어, 클론 세포 콜로니 내의 세포에 의한 외인성 리포터의 발현, 예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP) 신호의 존재 또는 부재), 클론 세포 콜로니 내의 세포 수, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 표면 밀도, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 성장 패턴, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 성장 속도, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 분열 속도, 또는 이들의 임의의 조합이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 보유(또는 파괴)할 세포 또는 클론 세포 클러스터(또는 세포 또는 클론 세포 클러스터의 서브세트)의 선택은 세포 표면 수용체 및 리간드, 예를 들어 G-단백질 결합 수용체(GPCR), 효소 결합 수용체, 이온 채널 결합 수용체, 막 기반 수용체 티로신 키나아제, 막 당단백질 등을 포함하는 하나 이상의 바이오마커의 존재 또는 부재에 기초하여 이루어진다. 세포 선택의 기초로서 사용될 수 있는 세포 표면 수용체 및 리간드의 예는 안지오텐신 수용체, CD1a-e, CD3, CD4, CD6, CD8a-b, CD19, CD20, CD22, CD33, CD52, FGF 수용체, 성장 호르몬 수용체, KCNE1 이온 채널, KCNQ1 이온 채널, ATP1G1 Mg 수송체 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다(예를 들어, 추가 예에 대해 문헌[V
rady, et al. (2013), "Cell surface membrane proteins as personalized biomarkers: where we stand and where we are headed" Biomarkers Med. 7(5), 803-819] 참조). 일부 경우에, 하나 이상의 세포 표면 바이오마커의 존재 또는 부재는 예를 들어 관심 바이오마커 중 하나에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 형광-태그된 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
일부 경우에, 보유(또는 파괴)할 세포 또는 클론 세포 클러스터(또는 세포 또는 클론 세포 클러스터의 서브세트)의 선택은 유전자 조작된 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP) 도메인(또는 GFP의 임의의 변이체의 도메인)을 포함하는 키메라 수용체 또는 효소를 포함하는 하나 이상의 바이오마커의 존재 또는 부재에 기초하여 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 보유(또는 파괴)할 세포 또는 클론 세포 클러스터(또는 세포 또는 클론 세포 클러스터의 서브세트)의 선택은 세포 유전자 발현 프로파일의 변화를 감지하기 위한(예를 들어, 하나 이상의 유전자의 특정 세트의 전사 및/또는 번역의 증가 또는 감소를 감지하기 위한) 리포터 시스템의 일부로서 하나 이상의 GFP 함유 단백질을 발현하도록 조작된 세포주에서 GFP 도메인을 포함하는 하나 이상의 키메라 단백질의 존재 또는 부재에 기초하여 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 보유(또는 파괴)할 세포 또는 클론 세포 클러스터(또는 세포 또는 클론 세포 클러스터의 서브세트)의 선택은 CRISPR 편집 성공 매개변수로 인한 세포 유전자 발현 프로파일의 변화를 감지하기 위한 리포터 시스템의 일부로서 하나 이상의 GFP 함유 단백질을 발현하도록 조작된 세포주에서 GFP 도메인을 포함하는 하나 이상의 키메라 단백질의 존재 또는 부재에 기초하여 이루어질 수 있다. 일부 경우에, CRISPR 편집 성공 매개변수는 Cas-의존성 형광 모이어티(예를 들어, Cas9-의존성 형광 모이어티)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 비활성화된 Cas(dCAS)는 XFP로 태그될 수 있고 가이드와 함께 편집된 세포를 식별하는 데 사용될 수 있다(Ma, H. et al. (2015), "Multicolor CRISPR Labeling of Chromosomal Loci in Human Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112, 3002-3007).
일부 경우에, 보유(또는 파괴)할 세포 또는 클론 세포 클러스터(또는 세포 또는 클론 세포 클러스터의 서브세트)의 선택은 세포 대사 상태의 하나 이상의 형광 프로브로부터 유래된 형광 신호를 포함하는 하나 이상의 바이오마커의 존재 또는 부재에 기초하여 이루어질 수 있다. 세포 대사 상태를 모니터링하는 데 사용될 수 있는 형광 프로브의 예에는 생존 세포와 사멸 세포를 구별하기 위한 "BioTracker"(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재) 시리즈의 형광 염료, 세포 내 칼슘2 + 농도에 대한 프로브(예를 들어, Fura 2 AM, Fura Red AM, Indo-1 AM, 모두 ThermoFisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬 소재)), 막관통 전위에 대한 형광 프로브(예를 들어, FluoVolt Membrane Potential Dye, 디-3-ANEPPDHQ, 또는 비스-(1,3-디부틸바르비투르산)트리메틴 옥소놀(DiBAC4(3)), 모두 ThermoFisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬 소재)) 등이 포함되지만 이제 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 보유(또는 파괴)하기 위해 세포 선택 구획으로 성장하는 클론 세포 클러스터(또는 클론 세포 클러스터의 서브세트)의 선택은 아래에서 더 자세히 설명되는 바와 같이 테스트를 위한 장치로부터 클론 세포 클러스터를 부분적으로 분리하고 클러스터에 있는 세포의 일부 또는 서브세트를 제거하는 단계에 기초하여 이루어질 수 있다.
일부 경우에, 일단 하나 이상의 세포(또는 클론 세포 클러스터)가 상기 기재된 임의의 접근법을 사용하여 보유를 위해 선택되면, 나머지 원하지 않는 세포 또는 클론 세포 클러스터는 하기에 기재되는 바와 같이 광절제될 수 있고, 선택된 세포(또는 클론 세포 클러스터)는 클론 세포 집단(들)을 확장하기 위해 세포 성장 및 분열의 1회 이상의 주기를 거칠 수 있다. 일부 경우에, 보유를 위해 선택된 하나 이상의 세포 또는 클론 세포 클러스터는 장치 또는 카트리지 내의 다른 구획, 예를 들어 세포 확장 구획으로 이송될 수 있다.
클론 세포 콜로니의 부분적 분리: 일부 경우에, 개별 클론 세포 콜로니 내의 세포의 일부 또는 서브세트는 선택적으로 테스트를 위해 장치 또는 카트리지로부터 제거될 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 개별 클론 세포 콜로니 내의 세포의 일부는 예를 들어, 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽을 포함하는 세포 선택 구획과 함께 레이저 기반 광분리 기술을 사용하여 이들이 성장하고 있는 표면으로부터 분리될 수 있다. 레이저 기반 광분리는 화학적 해리 시약을 요구하지 않으면서 세포가 배양되는 기판으로부터 부착된 세포를 분리하는 치명적이지 않은 수단을 제공한다. 전력 설정, 펄스 폭 변조, 및 레이저 초점 면에 대한 조정은 세포막을 파괴하지 않고 선택된 세포를 효과적으로 분리하는 에너지 펄스를 생성하는 방식으로 조정될 수 있다.
예를 들어, 집속된 레이저 광은 세포가 성장하고 있는 표면으로부터 세포를 분리하기 위해 하나 이상의 선택된 세포 아래 또는 인접한 영역을 가로질러 스캔될 수 있다. 일부 경우에, 집속된 레이저 광에 의한 조명은 하나 이상의 선택된 세포의 광열적 분리를 유도할 수 있다. 일부 경우에, 집속된 레이저 광에 의한 조명은 하나 이상의 선택된 세포의 광기계적 분리를 유도할 수 있다. 일부 경우에, 집속된 레이저 광에 의한 조명은 하나 이상의 선택된 세포의 광음향적 분리를 유도할 수 있다. 일부 경우에, 세포 선택 구획은 광열적 및/또는 광기계적 분리 메카니즘에 의해 그 위에서 성장하는 세포의 분리를 용이하게 하도록 특별히 제제화된 하나 이상의 표면 코팅 층을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포 선택 구획은 세포 인식 요소, 예를 들어, 세포 표면 수용체에 대한 항체를 세포 선택 구획 내의 표면에 테더링하는 광절단 가능한 링커를 포함하는 하나 이상의 표면 코팅 층을 포함할 수 있으며, 여기서 세포 인식 요소는 현탁 세포를 표면에 캡처하고 테더링하는 데 사용되며, 적절한 파장의 집속된 레이저 광에 의한 조명 시 광절단 가능한 링커가 파괴되고 선택된 세포 세트가 표면으로부터 방출될 수 있다.
도 5a 내지 도 5e는 세포가 배양되는 기판으로부터 세포를 선택적으로 분리하기 위한 레이저 광분리의 사용을 예시한다. 도 5a는 세포 선택 구획 내의 성장 표면 상의 세포의 현미경 사진을 제공한다. 도 5b는 약 1440 nm 내지 약 1450 nm의 파장 범위의 펄스 레이저 광을 사용하여 세포를 선택적으로 분리한 후 동일한 표면의 현미경 사진을 제공한다. 도 5c는 레이저 광 조사에 의한 클론 세포 클러스터 내의 세포 서브세트의 선택적 분리 및 제거의 예시를 제공한다. 도 5d는 선택된 세포 아래에 있는 표면을 따라 레이저 광이 스캔됨에 따라 세포의 점진적인 분리의 예시를 제공한다. 도 5e는 레이저 광이 세포 아래에 있는 표면을 따라 계속 스캔됨에 따라 세포의 추가적인 점진적 분리의 예시를 제공한다. 도 5a 및 도 5b에서 세포는 등고선 표시로 강조 표시되었다. 이미지에서 볼 수 있는 더 크고 초점이 맞지 않는 물체는 프로토타입 장치를 제작하는 데 사용된 기계 도구에 의해 생성된 폴리카보네이트의 결함이다. 도 5a에서, 기판에 부착된 세포 콜로니를 관찰할 수 있다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 세포는 레이저 광에 선택적으로 노출된 후 기판으로부터 분리되었다. 분리된 세포는 표면 위에 떠 있으며 이 이미지에서 대부분 초점이 맞지 않는다.
정적 조건하에서, 분리된 세포는 성장 표면에 다시 정착할 수 있다. 일부 경우에, 레이저 기반 광분리는 따라서 분리된 세포를 예를 들어 장치로부터 빼낼 수 있는 세포 제거 포트 쪽으로 보내기 위해 성장 표면을 가로질러 유체의 유도된 흐름을 제공하는 것과 함께 수행될 수 있다. 레이저 기반 광분리와 분리된 세포의 흐름 유도된 제거를 조합하면 수동 개입(예를 들어, 배지 변경 또는 화학적 해리 시약 사용을 통한)을 통한 오염의 위험 없이 표적 세포를 제거할 수 있다.
도 6a 내지 도 6e는 세포가 배양되는 기판 표면으로부터 세포를 선택적으로 분리 및 제거하기 위해 유도된 유체 유동과 조합된 레이저 광분리의 사용을 예시한다. 도 6a는 세포 선택 구획 내의 성장 표면 상의 세포의 현미경 사진을 제공한다. 도 6b는 세포를 선택적으로 분리한 후 동일한 표면의 현미경 사진을 제공한다. 도 6c는 레이저 광 조사에 의한 클론 세포 클러스터 내의 세포의 선택된 서브세트의 선택적 분리 및 제거의 예시를 제공한다. 도 6d는 유체의 흐름이 표면을 가로질러 유도되는 동안 선택된 세포 아래에 있는 표면을 따라 레이저 광이 스캔됨에 따라 세포의 점진적인 분리의 예시를 제공한다. 도 6e는 유체의 흐름이 표면을 가로질러 유도되는 동안 레이저 광이 세포 아래에 있는 표면을 따라 계속 스캔됨에 따라 세포의 추가의 점진적 분리의 예시를 제공한다. 도 6a 및 도 6b에서, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 것과 동일한 분리 과정이 발생하지만, 표면을 가로질러 유도되는 완충액 또는 배양 배지의 흐름으로 분리된 세포 시트가 이를 가로질러 이동하는 유체의 힘으로 인해 접힌다.
일부 경우에, 레이저 유도 광분리를 수행하는 데 하나 이상의 레이저가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 광분리는 전자기 스펙트럼의 자외선(UV), 가시광선, 또는 근적외선(근-IR) 영역에서 작동하는 레이저를 사용하여 수행될 수 있다. 적합한 레이저 파장의 예는 표 1에 열거된 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 레이저 광분리는 약 1440 nm 내지 약 1450 nm의 파장 범위의 레이저 광을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 경우에, 사용되는 하나 이상의 레이저는 연속파 레이저일 수 있다. 일부 경우에, 사용되는 하나 이상의 레이저는 펄스 레이저일 수 있다. 선택된 레이저의 유형과 펄스를 생성하는 데 사용된 기술(예를 들어, 모드 잠금 고체 레이저, Q-스위칭된 고체 레이저 또는 이득 스위칭된 반도체 레이저)에 따라, 레이저 펄스 주파수는 1 Hz 미만에서 100 GHz 초과까지의 범위일 수 있다. 유사하게, 선택된 레이저의 유형과 펄스를 생성하는 데 사용되는 기술에 따라, 레이저 펄스 폭은 1 마이크로초보다 길고 100 펨토초보다 적은 범위일 수 있다.
일부 경우에, 광천공, 광분리, 및/또는 광절제를 수행하는 데 동일한 하나 이상의 레이저가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 광천공, 광분리, 및/또는 광절제를 수행하는 데 상이한 레이저가 사용될 수 있다. 광천공, 광분리, 및/또는 광절제를 수행하는 데 동일한 레이저 또는 레이저 세트가 사용되는 경우, 개시된 장치 또는 카트리지와 함께 사용되는 장치는 레이저 스폿 크기, 레이저 스폿 형상, 레이저 광 강도, 레이저 펄스 주파수, 레이저 펄스 에너지, 적어도 하나의 구획의 표면 상의 또는 그 구획의 부피 내의 지정된 위치에서 전달되는 레이저 펄스의 총수, 적어도 하나의 구획의 표면 상의 또는 그 구획의 부피 내의 레이저 초점의 위치, 또는 이들의 임의의 조합을 조절함으로써 광천공 작동 모드, 광분리 작동 모드, 및/또는 광절제 작동 모드 사이에서 작동 가능하게 전환될 수 있다.
일부 경우에, 레이저 유도 광분리의 효율은 약 50% 내지 약 100%의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 레이저 유도 광분리의 효율은 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 최소 98%, 최소 99%, 또는 약 100%일 수 있다. 일부 경우에, 레이저 유도 광분리의 효율은 최대 100%, 최대 99%, 최대 98%, 최대 95%, 최대 90%, 최대 85%, 최대 80%, 최대 70%, 최대 60%, 또는 최대 50%일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 레이저 유도 광분리의 효율은 약 60% 내지 약 95%의 범위일 수 있다. 당업자는 레이저 유도 광분리의 효율이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 93%를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
세포 제거 및 테스트: 일부 경우에, 세포 선택 구획(또는 개시된 장치 또는 카트리지 내의 임의의 구획) 내의 성장하는 표면으로부터 분리된 세포는 선택적으로 장치로부터 제거되고 추가 테스트에 적용될 수 있다. 일부 경우, 예를 들어 세포 선택 구획 및 별도의 세포 확장 구획을 포함하는 장치 또는 카트리지에서, 장치 또는 카트리지는 분리된 세포(예를 들어, 하나 이상의 선택된 클론 세포 클러스터의 서브세트 또는 일부)가 세포 확장 구획의 오염 위험 없이 장치로부터 편리하게 제거될 수 있도록 세포 선택 구획의 출구 및 세포 확장 구획의 입구에 작동 가능하게 연결된 중간 세포 제거 포트를 포함할 수 있다.
장치로부터 제거된 하나 이상의 세포가 적용될 수 있는 테스트의 예에는 핵산 시퀀싱, 유전자 발현 프로파일링, 변형된 RNA 분자, DNA 분자 또는 유전자의 검출, CRISPR 편집 유전자의 검출, 핵산 분자의 제한 부위 분석, 단백질(예를 들어, 특정 바이오마커 단백질, 돌연변이 단백질, 리포터 단백질, 또는 유전적으로 조작된 단백질 등)의 검출, 변경된 단백질 기능으로 인한 세포 내 신호 전달 경로의 변화의 검출이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 테스트는 클론 세포 콜로니로부터 분리되고 장치로부터 제거된 단일 세포에서 수행될 수 있다. 일부 경우에, 테스트를 위해 선택된 각 클론 세포 콜로니에 대해 장치로부터 제거된 세포(예를 들어, 단일 클론 세포 콜로니로부터 분리 및 제거된 세포의 서브세트)의 수는 200개 미만의 세포, 100개 미만의 세포, 50개 미만의 세포, 40개 미만의 세포, 30개 미만의 세포, 20개 미만의 세포, 10개 미만의 세포, 또는 5개 미만의 세포일 수 있다.
부정확한 표현형 또는 유전자형을 갖는 세포의 광절제: 일부 경우에, 세포 확장을 위해 선택된 또는 원하는 세포(또는 클론 세포 클러스터)만이 유지되기 위해서 선택되지 않은 세포 및/또는 잘못된 표현형 또는 유전자형을 갖는 세포(예를 들어, 하나 이상의 클론 세포 클러스터로부터 세포 서브세트를 분리하고 테스트를 위해 분리된 세포를 제거함으로써 결정됨)는 파괴될 수 있다. 일부 경우에, 레이저 기반 광절제는 적어도 하나의 광학적으로 투명한 창 또는 벽을 포함하는 장치 또는 카트리지 내의 세포 선택 구획에서 또는 임의의 다른 구획에서 수행될 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 본원에서 사용되고 세포의 용해 및 파괴에 적용되는 바와 같이 용어 "광절제"는 세포가 단일 세포 또는 세포군을 선택적으로 파괴하기 위해 강한 광선에 적용되는 다양한 관련 기술을 지칭할 수 있다.
세포의 파괴는 다양한 레이저 광 - 초점 부피 내의 조사에 의해 주로 결정되는 세포 상호 작용 메커니즘을 통해 발생할 수 있다(Zeigler and Chiu, (2009), "Laser Selection Significantly Affects Cell Viability Following Single-Cell Nanosurgery", Photochem. Photobiol. 85(5): 1218-1224). 세포의 광학적 파괴 메커니즘은 펨토초(fsec)에서 연속파(cw)에 이르는 광범위한 기간에 걸쳐 발생할 수 있으며, 다양한 레이저의 사용을 포함할 수 있으며, 광열 상호작용, 광절제, 또는 플라즈마 유도 절제를 포함할 수 있다(총체적으로 본원에서 "광절제"로 지칭됨). 광열 상호작용은 국부 가열을 유도하는 세포(또는 상기 세포에 부착된 태그)에 의한 광 흡수를 포함한다. 공식적으로, 광절제는 분자에 의한 단일 광자의 흡수가 전자를 결합으로부터 비결합 궤도로 촉진하여 분자의 해리를 유도할 때 발생할 수 있다. 광절제는 초점 부피로부터 방사되는 기계적 압력파를 유도할 수도 있으며, 이 메커니즘은 캐비테이션이라고도 한다. 플라즈마 유도 절제는 플라즈마, 즉 초점 부피 내에 양이온과 자유 전자를 포함하는 이온화된 가스의 형성을 유도하는 다광자 흡수 과정에 기인할 수 있으며, 이는 인접 세포 또는 조직의 과도한 손상을 최소화할 수 있고, 캐비테이션 거품의 형성으로 이어질 수도 있다. 레이저-세포 상호작용의 상이한 메커니즘은 표적 세포에 대해 상당히 상이한 결과, 예를 들어 세포 생존도의 차이를 유도할 수 있다. 세포 파괴 응용 분야에서 이러한 메커니즘 중 어느 것이 지배적인지를 결정할 수 있는 실험 매개변수는 레이저 펄스의 지속시간과 방사 조도일 수 있다(Zeigler and Chiu, (2009), op. cit.).
개시된 장치, 방법, 및 시스템의 일부 경우에, 세포의 광절제(또는 광천공, 또는 광분리)에 사용되는 레이저는 약 220 nm(UV 광) 내지 약 1500 nm(IR 광) 범위의 피크 파장에서 광을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 광절제(또는 광천공 또는 광분리)에 사용되는 레이저 광의 피크 파장은 최소 220 nm, 최소 250 nm, 최소 300 nm, 최소 350 nm, 최소 400 nm, 최소 450 nm, 최소 500 nm, 최소 550 nm, 최소 600 nm, 최소 650 nm, 최소 700 nm, 최소 750 nm, 최소 800 nm, 최소 850 nm, 최소 900 nm, 최소 950 nm, 최소 1,000 nm, 최소 1,100 nm, 최소 1,200 nm, 최소 1,300 nm, 최소 1,400 nm, 또는 최소 1,500 nm일 수 있다. 광절제(또는 광천공 또는 광분리)에 사용되는 레이저 광의 피크 파장은 최대 1,500 nm, 최대 1,400 nm, 최대 1,300 nm, 최대 1,200 nm, 최대 1,100 nm, 최대 1,000 nm, 최대 950 nm, 최대 900 nm, 최대 850 nm, 최대 800 nm, 최대 750 nm, 최대 700 nm, 최대 650 nm, 최대 600 nm, 최대 550 nm, 최대 500 nm, 최대 450 nm, 최대 400 nm, 최대 350 nm, 최대 300 nm, 최대 250 nm, 또는 최대 220 nm일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 광절제(또는 광천공 또는 광분리)에 사용되는 레이저 광의 피크 파장은 약 1,300 nm 내지 약 1,500 nm의 범위일 수 있다. 당업자는 광절제(또는 광천공, 또는 광분리)에 사용되는 레이저 광의 피크 파장이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 1,460 nm를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
개시된 장치, 방법, 및 시스템의 일부 경우에, 세포의 광절제(또는 광천공 또는 광분리)에 사용되는 레이저는 피크 파장 및 레이저가 연속파 레이저인지 펄스 레이저인지에 따라 약 0.0001 nm 내지 약 10 nm 범위의 피크 파장을 중심으로 하거나 그에 가까운 대역폭(예를 들어, 반치 전폭(FWHM: full width at half maximum))을 갖는 빛을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 대역폭은 최소 0.0001 nm, 최소 0.001 nm, 최소 0.01 nm, 최소 0.1 nm, 최소 1 nm, 또는 적어도 10 nm일 수 있다. 일부 경우에, 대역폭은 최대 10 nm, 최대 1 nm, 최대 0.1 nm, 최대 0.01 nm, 최대 0.001 nm, 또는 최대 0.0001 nm일 수 있다. 이 단락에서 기술된 하한 및 상한 값의 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 대역폭은 약 0.001 nm 내지 약 1 nm의 범위일 수 있다. 당업자는 광절제에 사용되는 레이저 광의 대역폭이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 0.25 nm를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
개시된 장치, 방법, 및 시스템의 일부 경우에, 세포의 광절제(또는 광천공, 또는 광분리)에 사용되는 레이저는 연속파 광을 생성할 수 있고, 전기 광학 변조기 또는 전자 셔터를 사용하여 임의적으로 긴 지속시간(예를 들어, 수십 피코초 내지 초의 범위)의 광 펄스를 생성할 수 있다. 개시된 방법 및 시스템의 일부 경우에, 세포의 광절제(또는 광천공, 또는 광분리)에 사용되는 레이저는 펄스 레이저일 수 있고, 약 1 펨토초 내지 약 100 밀리초 범위의 지속시간을 갖는 광 펄스를 생성할 수 있다. 일부 경우에, 광절제에 사용되는 광 펄스는 지속시간이 최소 1 펨토초, 최소 1 피코초, 최소 1 나노초, 최소 1 밀리초, 최소 10 밀리초, 최소 100 밀리초, 또는 최소 1 초일 수 있다. 일부 경우에, 광절제에 사용되는 광 펄스는 지속시간이 최대 1초, 최대 100 밀리초, 최대 10 밀리초, 최대 1 밀리초, 최대 1 나노초, 최대 1 피코초, 또는 최대 1 펨토초일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 광절제(또는 광천공 또는 광분리)에 사용되는 광 펄스는 지속시간이 약 1 피코초 내지 약 1 나노초이다. 당업자는 광절제(또는 광천공, 또는 광분리)에 사용되는 레이저 광의 펄스 지속시간이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 0.250 나노초를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
개시된 장치, 방법, 및 시스템의 일부 경우에, 세포의 광절제(또는 광천공, 또는 광분리)에 사용되는 레이저 광은 사용되는 레이저의 유형에 따라 약 1 Hz 내지 약 100 MHz 범위의 펄스 반복 주파수에서 펄스화될 수 있다. 일부 경우에, 펄스 반복 주파수는 최소 1 Hz, 최소 10 Hz, 최소 100 Hz, 최소 1 KHz, 최소 10 KHz, 최소 100 KHz, 최소 1 MHz, 최소 10 MHz, 또는 최소 100 MHz일 수 있다. 일부 경우에, 펄스 반복 주파수는 최대 100 MHz, 최대 10 MHz, 최대 1 MHz, 최대 100 KHz, 최대 10 KHz, 최대 1 KHz, 최대 100 Hz, 최대 10 Hz, 또는 최대 1 Hz일 수 있다. 이 단락에서 기술된 하한 및 상한 값의 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 펄스 반복 속도는 약 10 Hz 내지 약 1 MHz의 범위일 수 있다. 당업자는 펄스 반복 속도가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 16.5 KHz를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 레이저 광 방사 조도(즉, 측정된 단위 표면적당 전달되는 방사 플럭스(전력), 예를 들어, W/cm2의 단위)는 사용되는 레이저 유형과 샘플 평면의 초점 크기에 따라 약 0.1 W/cm2 내지 약 1010 W/cm2의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 샘플 표면에 전달되는 방사 플럭스는 최소 0.1 W/cm2, 최소 1 W/cm2, 최소 10 W/cm2, 최소 100 W/cm2, 최소 1,000 W/cm2, 최소 104 W/cm2, 최소 105 W/cm2, 최소 106 W/cm2, 최소 107 W/cm2, 최소 108 W/cm2, 최소 109 W/cm2, 또는 최소 1010 W/cm2일 수 있다. 일부 경우에, 샘플 표면에 전달되는 복사 플럭스는 최대 1010 W/cm2, 최대 109 W/cm2, 최대 108 W/cm2, 최대 107 W/cm2, 최대 106 W/cm2, 최대 105 W/cm2, 최대 104 W/cm2, 최대 1,000 W/cm2, 최대 100 W/cm2, 최대 10 W/cm2, 최대 1 W/cm2, 또는 최대 0.1 W/cm2일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 샘플 표면에 전달되는 방사 플럭스는 약 10 W/cm2 내지 약 1,000 W/cm2의 범위일 수 있다. 당업자는 샘플 표면에 전달되는 방사 플럭스가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 0.8 W/cm2를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
개시된 방법 및 시스템의 일부 경우에, 원하지 않는 세포는 분당 약 10개 세포 내지 분당 약 200개 세포 범위의 속도로 광절제될 수 있다. 일부 경우에, 원하지 않는 세포는 분당 최소 10, 최소 20, 최소 30, 최소 40, 최소 50, 최소 60, 최소 70, 최소 80, 최소 90, 최소 100, 최소 110, 최소 120, 최소 130, 최소 140, 최소 150, 최소 160, 최소 170, 최소 180, 최소 190, 또는 최소 200개 세포의 속도로 광절제될 수 있다. 일부 경우에, 원하지 않는 세포는 분당 최대 200, 최대 190, 최대 180, 최대 170, 최대 160, 최대 150, 최대 140, 최대 130, 최대 120, 최대 110, 최대 100, 최대 90, 최대 80, 최대 70, 최대 60, 최대 50, 최대 40, 최대 30, 최대 20, 또는 최대 10개 세포의 속도로 광절제될 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 원하지 않는 세포는 분당 약 50개 세포 내지 약 180개 세포 범위의 속도로 광절제될 수 있다. 당업자는 광절제 속도가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 분당 약 64개 세포를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
개시된 장치, 방법, 및 시스템의 일부 경우에, 광절제 단계는 구획, 예를 들어, 개시된 장치 또는 카트리지의 세포 선택 구획에서 세포의 약 80% 내지 약 99%를 절제하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표면 상 또는 구획 내의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.5%가 광절제되며, 여기서 초기에 표면 상의 또는 구획 내에 포함된 세포의 수는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 125, 적어도 150, 적어도 175개, 적어도 200개 세포, 적어도 300개 세포, 적어도 400개 세포, 또는 적어도 500개 세포이다. 상기 기재된 바와 같이 초기에 표면 상의 또는 구획 내에 포함된 세포의 수 및 절제 백분율의 임의의 조합이 본 개시내용에 포함된다.
개시된 장치, 방법, 및 시스템의 일부 경우에, 파괴를 위해 선택된 세포를 생존 불가능하게 만드는 광절제 반응의 효율은 약 90% 내지 약 99.99% 이상 범위이다. 일부 경우에, 광절제 단계의 효율은 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 또는 적어도 99.99%이다. 일부 경우에, 광절제 단계의 효율은 최대 99.99%, 최대 99.9%, 최대 99.8%, 최대 99.7%, 최대 99.6%, 최대 99.5%, 최대 99%, 최대 98%, 최대 97%, 최대 96%, 최대 95%, 또는 최대 90%이다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 광절제 단계의 효율은 약 95% 내지 약 99.8%의 범위일 수 있다. 당업자는 광절제 단계의 효율이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 99.85%를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
선택된 세포 또는 클론 세포 콜로니의 추가 확장: 일부 경우에, 선택된 세포 또는 클론 세포 클러스터(즉, 예를 들어, 광절제를 사용하여 파괴되지 않은 나머지 세포)는 클론 세포 집단을 생성하기 위한 성장 및 분열의 1회 이상의 세포 주기를 거칠 수 있다. 일부 경우에, 선택된 세포 또는 클론 세포 클러스터는 성장하는 표면에서 분리되어 장치 또는 카트리지 내의 별도의 세포 확장 구획으로 이송될 수 있다.
일부 경우에, 선택된 세포 또는 클론 세포 클러스터는 세포 선택에 사용된 동일한 구획 내에서 세포 성장 및 분열의 1회 이상의 주기를 거칠 수 있다. 어느 경우이든, 위에서 논의된 바와 같이 장치 또는 카트리지에 통합되고 세포 선택 구획, 세포 확장 구획 또는 세포 확장에 사용되는 기타 구획의 입구와 유체 연통하는(작동 가능하게 연결된) 성장 배지 저장소 내에 선택적으로 저장되는 새로운 성장 배지가 세포에 공급될 수 있다.
일부 경우에, 선택된 세포 또는 클론 세포 클러스터가 세포 성장 및 분열의 1회 이상의 주기를 거칠 때, 폐 성장 배지, 헹굼 완충액, 또는 기타 유체는 상기 논의된 바와 같이 장치 또는 카트리지에 통합되고, 세포 선택 구획, 세포 확장 구획, 또는 세포 확장에 사용되는 다른 구획의 출구와 유체 연통(작동 가능하게 연결됨)된 폐기물 저장소에 선택적으로 이송되고 저장될 수 있다.
일부 경우에, 선택된 세포 또는 클론 세포 클러스터는 세포 성장 및 분열의 최소 1, 최소 2, 최소 3, 최소 4, 최소 5, 최소 10, 최소 15, 최소 20, 최소 30, 최소 40, 또는 최소 50회 주기를 거칠 수 있다. 일부 경우에, 선택된 세포 또는 클론 세포 클러스터는 세포 성장 및 분열의 최대 50, 최대 40, 최대 30, 최대 20, 최대 15, 최대 10, 최대 5, 최대 4, 최대 3, 최대 2, 또는 최대 1회 주기를 거칠 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 선택된 세포 또는 클론 세포 클러스터는 세포 성장 및 분열의 약 4 내지 약 8회 주기를 거칠 수 있다. 당업자는 수행된 세포 성장 및 분열 주기의 수가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 9회 주기를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 선택된 세포 또는 클론 세포 클러스터는 이들이 배양되는 표면에서 지정된 수준의 합류도에 도달할 때까지 세포 성장 및 분열의 반복 주기를 거칠 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 선택된 세포 또는 클론 세포 클러스터는 이들이 최소 10% 합류도, 최소 20% 합류도, 최소 30% 합류도, 최소 40% 합류도, 최소 50% 합류도, 최소 60% 합류도, 최소 70% 합류도, 최소 80% 합류도, 또는 80% 초과 합류에 도달할 때까지 세포 성장 및 분열의 반복 주기를 거칠 수 있다. 일부 경우에, 선택된 세포 또는 클론 세포 클러스터는 이들이 최대 80% 합류도, 최대 70% 합류도, 최대 60% 합류도, 최대 50% 합류도, 최대 40% 합류도, 최대 30% 합류도, 최대 20% 합류도, 또는 최대 10% 합류에 도달할 때까지 세포 성장 및 분열의 반복 주기를 거칠 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 선택된 세포 또는 클론 세포 클러스터는 약 40%에서 약 85% 합류도에 도달할 때까지 세포 성장 및 분열의 반복 주기를 거칠 수 있다. 당업자는 선택된 세포 또는 클론 세포 클러스터가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 87% 합류도에 도달할 때까지 세포 성장 및 분열의 반복 주기를 거칠 수 있음을 인식할 것이다.
세포 성장의 모니터링: 일부 경우에, 선택된 세포 또는 클론 세포 클러스터가 세포 성장 및 분열의 1회 이상의 주기를 거칠 때, 이들의 성장 상태는 상기 기재된 바와 같은 이미징 기술 또는 전기 임피던스 측정을 사용하여 모니터링될 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 세포 확장에 사용되는 구획은 이미징이 수행될 수 있도록 적어도 하나의 광학적으로 투명한 창 또는 벽을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포 확장에 사용되는 구획은 전기 임피던스 측정이 수행될 수 있도록 적어도 하나의 통합된 전극 쌍(예를 들어, 맞물린 전극)을 포함할 수 있다.
클론 세포 집단 수거: 일부 경우에, 클론 세포 집단은 세포 확장 구획(또는 선택된 세포 또는 클론 세포 클러스터가 배양되는 임의의 다른 구획)을 해리 시약 또는 처리로 처리하고 장치 또는 카트리지로부터 분리/방출된 세포를 제거함으로써 수거될 수 있다. 사용될 수 있는 해리 시약 또는 처리의 예는 기계적 분리(예를 들어, 진탕), 트립신 처리, 트립신-EDTA 처리, TrypLE(ThermoFisher), 시트르산-식염 완충제 처리 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 그 다음, 수거되어야 하는 분리된 클론 세포 집단은 세포 확장 구획(또는 세포 확장이 수행되는 다른 구획)의 출구로부터, 예를 들어 구획을 통하고 출구로부터 밖으로 수집 용기까지 적절한 성장 배지 또는 완충액을 흐르게 함으로써 제거될 수 있다.
기타 성능 메트릭: 위에서 언급한 바와 같이, 개시된 장치 또는 카트리지, 및 관련 방법 및 시스템은 클론 세포 집단을 생성하는 데 있어서 개선된 성능 메트릭을 제공한다.
일부 경우에, 클론 세포 집단의 신뢰할 수 있는 형질감염 및 생성에 필요한 총 입력 세포 수는 10,000개 미만의 세포, 7,500개 미만의 세포, 5,000개 미만의 세포, 2,500개 미만의 세포, 1,000개 미만의 세포, 900개 미만의 세포, 800개 미만의 세포, 700개 미만의 세포, 600개 미만의 세포, 또는 500개 미만의 세포일 수 있다.
일부 경우에, 개시된 장치 및 카트리지 내에서 세포 형질감염을 수행하는 효율은 약 10% 내지 약 100%의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 개시된 장치 및 카트리지 내에서 세포 형질감염을 수행하는 효율은 최소 10%, 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 최소 98%, 최소 99%, 또는 약 100%일 수 있다. 일부 경우에, 개시된 장치 및 카트리지 내에서 세포 형질감염을 수행하는 효율은 최대 약 100%, 최대 99%, 최대 98%, 최대 95%, 최대 90%, 최대 85%, 최대 80%, 최대 70%, 최대 60%, 최대 50%, 최대 40%, 최대 30%, 최대 20%, 또는 최대 10%일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 세포 형질감염을 수행하는 효율은 약 40% 내지 약 95%의 범위일 수 있다. 당업자는 세포 형질감염을 수행하는 효율이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 87%를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 선택 공정의 효율(예를 들어, 개별 세포 또는 클론 세포 클러스터를 선택하고, 선택적으로 테스트를 위해 선택된 클론 세포 클러스터의 일부를 분리 및 제거하고, 모든 남아있는 선택되지 않은 및/또는 원하지 않는 세포 또는 클론 세포 클러스터를 예를 들어 레이저 기반 광절제를 사용하여 파괴하여 생존 세포를 산출하는 전체 효율)는 약 10% 내지 약 100%의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 선택 공정의 효율은 최소 10%, 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 최소 98%, 최소 99%, 또는 약 100%일 수 있다. 일부 경우에, 선택 공정의 효율은 최대 약 100%, 최대 99%, 최대 98%, 최대 95%, 최대 90%, 최대 85%, 최대 80%, 최대 70%, 최대 60%, 최대 50%, 최대 40%, 최대 30%, 최대 20%, 또는 최대 10%일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 선택 공정의 효율은 약 70% 내지 약 98%의 범위일 수 있다. 당업자는 세포 형질감염을 수행하는 효율이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 92%를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 개시된 장치 및 카트리지 내에서 수행되는 세포 확장 공정의 효율(예를 들어, 세포 선택, 테스트를 위한 선택적 분리 및 제거, 및 선택되지 않은 및/또는 원하지 않는 세포의 광절제를 수행한 후 남아, 그 후 지정된 수의 세포 주기 동안 또는 지정된 합류 상태로 성공적으로 배양된 생존 세포의 백분율)은 약 10% 내지 약 100%의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 세포 확장 공정의 효율은 최소 10%, 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 최소 98%, 최소 99%, 또는 약 100%일 수 있다. 일부 경우에, 세포 확장 공정의 효율은 최대 약 100%, 최대 99%, 최대 98%, 최대 95%, 최대 90%, 최대 85%, 최대 80%, 최대 70%, 최대 60%, 최대 50%, 최대 40%, 최대 30%, 최대 20%, 또는 최대 10%일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 세포 확장 공정의 효율은 약 70% 내지 약 98%의 범위일 수 있다. 당업자는 세포 확장 공정의 효율이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 89%을 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지 내에서 클론 집단을 생성하는 전체 효율(예를 들어, 세포 형질감염, 세포 선택 및 세포 확장을 수행하는 조합된 효율)은 약 10% 내지 약 100%의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 클론 집단을 생성하는 전체 효율은 최소 10%, 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 최소 98%, 최소 99%, 또는 약 100%일 수 있다. 일부 경우에, 클론 집단을 생성하는 전체 효율은 최대 약 100%, 최대 99%, 최대 98%, 최대 95%, 최대 90%, 최대 85%, 최대 80%, 최대 70%, 최대 60%, 최대 50%, 최대 40%, 최대 30%, 최대 20%, 또는 최대 10%일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 클론 집단을 생성하는 전체 효율은 약 80% 내지 약 95%의 범위일 수 있다. 당업자는 클론 집단을 생성하는 전체 효율이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 91%를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 개시된 장치 또는 카트리지(및 관련 방법 및 시스템)는 클론 세포 집단을 생성하기 위해 소비되는 세포 배양 시약의 양 및 필요한 실험실 공간의 상당한 감소를 제공한다. 예를 들어, 일부 경우에, 필요한 세포 배양 시약(예를 들어, 성장 배지, 완충액 등)의 총량은 기존의 배양 플레이트 또는 다른 배양 용기 형식에 사용된 것과 비교하여 최소 10%, 최소 20%, 최소 30%, 최소 40%, 최소 50%, 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90%, 또는 최소 95% 감소될 수 있다.
시스템 및 시스템 구성요소: 또한 개시된 장치 또는 카트리지를 사용하여 상기 기재된 방법을 수행하도록 구성된 시스템이 본원에 개시된다. 일부 경우에 개시된 시스템은 (i) 세포 형질감염, 세포 선택, 및/또는 세포 확장을 수행하기 위한 개시된 장치 또는 카트리지 중 하나 이상, (ii) 표면 상의 또는 구획, 예를 들어 세포 형질감염 구획, 세포 선택 구획, 및/또는 세포 확장 구획 내의 세포를 관찰하기 위해 구성된 현미경 또는 기타 이미징 유닛(광원 및 하나 이상의 이미지 센서 또는 카메라를 포함함), (iii) 광천공, 광분리, 및/또는 광절제를 수행하기 위해 구성된 하나 이상의 레이저(일부 경우에, 구획의 특정 위치에 레이저 광을 집속하고 전달하기 위해서 레이저와 대물렌즈가 함께 작동할 수 있도록 하나 이상의 레이저는 이미징 유닛 대물렌즈와 광학적으로 연결될 수 있음), (iv) 레이저 초점에서 개별 세포의 빠르고 정확한 위치를 지정할 수 있거나 집속된 레이저 광을 개시된 장치 또는 카트리지의 표면 상 또는 근처 또는 구획 내의 특정 위치에 보낼 수 있는 레이저 표적화 시스템(예를 들어, 병진 스테이지 또는 레이저 스캐닝 시스템), (v) 하나 이상의 프로세서, 제어기, 또는 컴퓨터, (vi) 이미지 캡처 및 세포를 식별하고 일련의 하나 이상의 구획 각각에서 그 위치 좌표를 결정하기 위한 처리 소프트웨어, (vii) 레이저 초점 위치, 레이저 출력, 레이저 펄스 주파수, 및/또는 노출 시간(체류 시간)을 제어하기 위한 레이저 표적화 제어 소프트웨어, (viii) 공정의 유체 제어, 이미지 캡처, 이미지 처리, 레이저 표적화, 및 레이저 천공, 분리, 및/또는 절제 단계를 조정하기 위한 시스템 제어 소프트웨어, (ix) 지정된 세트의 세포 배양 조건 하에서의 장치 또는 카트리지 내에 세포를 유지하는 환경 제어 챔버 또는 모듈(예를 들어, 인큐베이터), 또는 (xi) 이들의 조합을 포함할 수 있다.
현미경 또는 이미징 유닛: 일부 경우에, 개시된 시스템은 하나 이상의 구획의 표면 상에 또는 내부에서 배양된 세포의 이미지를 캡처하도록 구성된 카메라가 장착된 현미경(또는 다른 이미징 유닛)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 현미경은 상업적으로 이용 가능한 현미경 시스템, 예를 들어 직립, 도립 또는 에피형광 현미경을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 현미경 또는 이미징 유닛(또는 모듈)은 하나 이상의 카메라 또는 이미지 센서, 광원, 대물렌즈, 추가 렌즈, 프리즘, 회절 격자, 거울, 광학 필터, 컬러 유리 필터, 협대역 간섭 필터, 광대역 간섭 필터, 이색성 반사기, 광학 필터, 조리개, 광섬유, 광학 도파관 등, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 개시된 시스템의 현미경 또는 이미징 유닛은 병진 스테이지를 사용하여 장치 또는 카트리지를 재배치할 때 장치 또는 카트리지 내의 표면(예를 들어, 성장 표면 또는 구획의 바닥)에 현미경 또는 이미징 모듈의 초점을 재집속하는 자동 초점 메커니즘을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 개시된 시스템의 현미경 또는 이미징 유닛은 예를 들어 검류계 스캐닝 장치 또는 마이크로미러 어레이를 사용하여 집속된 레이저 빔을 다시 보낼 때 장치 또는 카트리지 내의 표면(예를 들어, 성장 표면 또는 구획의 바닥)에 현미경 또는 이미징 모듈의 초점을 재집속하는 자동 초점 메커니즘을 포함할 수 있다.
텅스텐 램프, 텅스텐-할로겐 램프, 아크 램프, 레이저, 발광 다이오드(LED), 또는 레이저 다이오드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 광원을 사용하여 이미징 또는 여기 광을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 광원의 조합, 및 추가 광학 구성요소, 예를 들어 렌즈, 필터, 조리개, 다이아프램, 거울 등은 조명 하위 시스템을 포함할 것이다.
전하 결합 소자(CCD: charged-coupled device) 카메라 또는 센서, 이미지 강화 CCD 카메라 또는 센서, CMOS 이미지 카메라 또는 센서 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 이미지 센서가 이미징 목적에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 이미지 센서의 조합과 추가 광학 구성요소, 예를 들어 렌즈, 필터, 조리개, 다이아프램, 거울 등은 이미징 서브 유닛(또는 서브 모듈)을 포함할 것이다.
이미징 모드: 임의의 다양한 이미징 모드가 개시된 방법 및 시스템을 구현하는 데 사용될 수 있다. 예에는 명시야 이미징, 암시야 이미징, 위상차 이미징, 형광 이미징, 초해상도 형광 이미징, 2광자 형광 이미징 등이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 이중 파장 여기 및 방출(또는 다중 파장 여기 또는 방출) 형광 이미징이 수행될 수 있다.
일부 경우에, 각 표면 또는 구획은 단일 이미지 내에서 그 전체가 이미징될 수 있다. 즉, 시야(FOV: field-of-view)는 사용된 배율에 따라 전체 표면 또는 구획을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 더 작은 FOV를 포함하는 일련의 이미지를 "타일링"하거나 "스티칭"하여 전체 표면 또는 구획의 고해상도 이미지를 생성할 수 있다. 일부 경우에, 표면 또는 구획의 전부 또는 일부에 대해 일련의 하나 이상의 이미지를 획득할 수 있다. 일부 경우에, 일련의 2개 이상의 이미지는 예를 들어, 분리 및/또는 절제 단계를 수행하기 전과 후 모두에 획득한 이미지를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 광분리 단계를 수행한 후 획득한 하나 이상의 이미지를 사용하여 선택된 세포(들)가 성공적으로 분리되었음을 확인할 수 있다. 일부 경우에, 광절제 단계를 수행한 후 획득한 하나 이상의 이미지를 사용하여 선택된 세포(들)가 성공적으로 파괴되었음을 확인할 수 있다. 일부 경우에, 일련의 이미지는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 이상의 이미지를 포함할 수 있다.
이미지 처리: 개시된 방법 및 시스템의 일부 경우에, 이미지 사전 처리 및/또는 이미지 처리는 수동, 반자동, 또는 완전 자동화 방식으로 수행될 수 있다. 일부 경우에, 일련의 하나 이상의 이미지는 예를 들어 이미지 대비 및 밝기 수정, 불균일한 조명 보정, 광학 수차(예를 들어, 구면 수차, 색수차, 등) 보정, 노이즈 제거 등, 또는 이들의 조합으로 사전 처리될 수 있다. 일부 경우에, 일련의 하나 이상의 이미지는 예를 들어 각 이미지 내에서 객체(예를 들어, 세포 또는 하위 세포 구조) 식별, 각 이미지를 분할하여 식별된 객체 분리, 분할된 이미지를 타일링하여 복합 이미지 생성, 특징 추출(예를 들어, 관찰 가능한 세포 표현형 특성과 같은 객체 속성의 식별 및/또는 정량) 수행, 하나 이상의 선택된 세포에 대한 위치 좌표 결정, 광분리 및/또는 광절제 단계, 또는 이들의 조합을 수행한 후 획득한 하나 이상의 이미지로부터 선택된 세포의 분리 및/또는 파괴에 대한 신뢰 수준 결정, 또는 이들의 임의의 조합으로 처리될 수 있다.
당업자에게 공지된 임의의 다양한 이미지 처리 방법이 이미지 내의 객체를 식별하기 위한 이미지 처리에 사용될 수 있다. 예에는 Canny 에지 검출 방법, Canny-Deriche 에지 검출 방법, 1차 기울기 에지 검출 방법(예를 들어, Sobel 연산자), 2차 미분 에지 검출 방법, 위상 일치(위상 간섭) 에지 감지 방법, 기타 이미지 분할 알고리즘(예를 들어, 강도 임계값, 강도 클러스터링 방법, 강도 히스토그램 기반 방법 등), 특징 및 패턴 인식 알고리즘(예를 들어, 임의의 모양을 감지하기 위한 일반화된 Hough 변환, 원형 Hough 변환 등), 이미지 텍스처 분석 방법(예를 들어, 그레이 레벨 동시 발생 행렬), 및 수학적 분석 알고리즘(예를 들어, 푸리에 변환, 고속 푸리에 변환, 웨이블릿 분석, 자동 상관 등), 또는 이들의 임의의 조합이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
레이저: 개시된 시스템(또는 장치)은 하나 이상의 레이저를 포함할 수 있다. 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 일부 경우에, 동일한 하나 이상의 레이저를 사용하여 광천공, 광분리, 및/또는 광절제를 수행할 수 있다. 일부 경우에, 광천공, 광분리, 및/또는 광절제를 수행하는 데 상이한 레이저가 사용될 수 있다. 광천공, 광분리, 및/또는 광절제 목적에 임의의 다양한 레이저가 사용될 수 있다. 예에는 다이오드(또는 반도체) 레이저, 고체 레이저, 가스 레이저, 및 엑시머 레이저가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 다이오드 레이저는 다양한 파장에 사용할 수 있는 소형의 비교적 저전력 광원을 제공할 수 있다. 고체 상태 레이저, 예를 들어 루비 또는 네오디뮴-YAG(이트륨 알루미늄 가넷) 레이저는 고체 매트릭스에 레이징 재료가 분산될 수 있다. 네오디뮴-YAG 레이저는 1.064 마이크로미터에서 적외선을 방출할 수 있다. 가스 레이저, 예를 들어 헬륨 및 헬륨-네온(HeNe) 레이저는 가시 적색광의 주 출력을 가질 수 있다. CO2 레이저는 원적외선(10.6 마이크로미터)의 에너지를 방출할 수 있으며 단단한 재료를 절단하는 데 사용될 수 있다. 엑시머 레이저는 아르곤, 크립톤, 또는 제논과 같은 불활성 가스와 혼합된 염소 및 플루오린과 같은 반응성 가스를 사용할 수 있으며, 전기적으로 자극되면 유사 분자 또는 이량체를 생성하고 레이저에 쏘이면 자외선 파장 범위의 광을 생성한다.
상기 언급된 바와 같이, 개시된 방법 및 시스템에서 세포의 광천공, 광분리, 및/또는 광절제에 사용되는 레이저는 약 220 nm(UV 광) 내지 약 1500 nm(IR 광) 범위의 피크 파장에서 광을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 광절제에 사용되는 레이저 광의 피크 파장은 최소 220 nm, 최소 250 nm, 최소 300 nm, 최소 350 nm, 최소 400 nm, 최소 450 nm, 최소 500 nm, 최소 550 nm, 최소 600 nm, 최소 650 nm, 최소 700 nm, 최소 750 nm, 최소 800 nm, 최소 850 nm, 최소 900 nm, 최소 950 nm, 최소 1,000 nm, 최소 1,100 nm, 최소 1,200 nm, 최소 1,300 nm, 최소 1,400 nm, 또는 최소 1,500 nm일 수 있다. 일부 경우에, 광절제에 사용되는 레이저 광의 피크 파장은 최대 1,500 nm, 최대 1,400 nm, 최대 1,300 nm, 최대 1,200 nm, 최대 1,100 nm, 최대 1,000 nm, 최대 950 nm, 최대 900 nm, 최대 850 nm, 최대 800 nm, 최대 750 nm, 최대 700 nm, 최대 650 nm, 최대 600 nm, 최대 550 nm, 최대 500 nm, 최대 450 nm, 최대 400 nm, 최대 350 nm, 최대 300 nm, 최대 250 nm, 또는 최대 220 nm일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 광절제에 사용되는 레이저 광의 피크 파장은 약 1,300 nm 내지 약 1,500 nm의 범위일 수 있다. 당업자는 광천공, 광분리, 및/또는 광절제에 사용되는 레이저 광의 피크 파장이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어, 약 1,460 nm를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에 개시된 방법 및 시스템에서 세포의 광천공, 광분리, 및/또는 광절제에 사용되는 레이저는 피크 파장 및 레이저가 연속파 레이저인지 펄스 레이저인지에 따라 약 0.0001 nm 내지 약 10 nm 범위의 피크 파장에 또는 그 근처에 중심을 둔 대역폭(예를 들어, 반치 전폭(FWHM))을 갖는 광을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 대역폭은 최소 0.0001 nm, 최소 0.001 nm, 최소 0.01 nm, 최소 0.1 nm, 최소 1 nm, 또는 최소 10 nm일 수 있다. 일부 경우에, 대역폭은 최대 10 nm, 최대 1 nm, 최대 0.1 nm, 최대 0.01 nm, 최대 0.001 nm, 또는 최대 0.0001 nm일 수 있다. 이 단락에서 기술된 하한 및 상한 값의 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 대역폭은 약 0.001 nm 내지 약 1 nm의 범위일 수 있다. 당업자는 광절제에 사용되는 레이저 광의 대역폭이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 0.25 nm를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 개시된 방법 및 시스템에서 세포의 광천공, 광분리, 및/또는 광절제에 사용되는 레이저는 연속파 광을 생성할 수 있고, 전기 광학 변조기 또는 전자 셔터를 사용하여 임의적으로 긴 지속시간(예를 들어, 수십 피코초 내지 초의 범위)의 광 펄스를 생성할 수 있다. 개시된 방법 및 시스템의 일부 경우에, 세포의 광천공, 광분리, 및/또는 광절제에 사용되는 레이저는 펄스 레이저일 수 있고 약 1 펨토초 내지 약 100 밀리초 범위의 지속시간을 갖는 광 펄스를 생성할 수 있다. 일부 경우에, 광천공, 광분리, 및/또는 광절제에 사용되는 광 펄스는 지속시간이 최소 1 펨토초, 최소 1 피코초, 최소 1 나노초, 최소 1 밀리초, 최소 10 밀리초, 최소 100 밀리초, 또는 최소 1 초일 수 있다. 일부 경우에, 광절제에 사용되는 광 펄스는 지속시간이 최대 1 초, 최대 100 밀리초, 최대 10 밀리초, 최대 1 밀리초, 최대 1 나노초, 최대 1 피코초, 또는 최대 1 펨토초일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 광천공, 광분리, 및/또는 광절제에 사용되는 광 펄스는 지속시간이 약 1 피코초 내지 약 1 나노초의 범위일 수 있다. 당업자는 광천공, 광분리, 및/또는 광절제에 사용되는 레이저 광의 펄스 지속시간이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 0.250 나노초를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 개시된 방법 및 시스템에서 세포의 광천공, 광분리, 및/또는 광절제에 사용되는 레이저 광은 사용되는 레이저의 유형에 따라 약 1 Hz 내지 약 100 MHz 범위의 펄스 반복 주파수에서 펄스화될 수 있다. 예에서, 펄스 반복 주파수는 최소 1 Hz, 최소 10 Hz, 최소 100 Hz, 최소 1 KHz, 최소 10 KHz, 최소 100 KHz, 최소 1 MHz, 최소 10 MHz, 또는 최소 100 MHz일 수 있다. 일부 경우에, 펄스 반복 주파수는 최대 100 MHz, 최대 10 MHz, 최대 1 MHz, 최대 100 KHz, 최대 10 KHz, 최대 1 KHz, 최대 100 Hz, 최대 10 Hz, 또는 최대 1 Hz일 수 있다. 이 단락에서 기술된 하한 및 상한 값의 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 펄스 반복 속도는 약 10 Hz 내지 약 1 MHz의 범위일 수 있다. 당업자는 펄스 반복 속도가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 16.5 KHz를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 레이저 광 방사 조도(즉, 측정된 단위 표면적당 전달되는 방사 플럭스(전력), 예를 들어, W/cm2의 단위)는 사용되는 레이저 유형과 샘플 평면의 초점 크기에 따라 약 0.1 W/cm2 내지 약 1010 W/cm2의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 샘플 표면에 전달되는 방사 플럭스는 최소 0.1 W/cm2, 최소 1 W/cm2, 최소 10 W/cm2, 최소 100 W/cm2, 최소 1,000 W/cm2, 최소 104 W/cm2, 최소 105 W/cm2, 최소 106 W/cm2, 최소 107 W/cm2, 최소 108 W/cm2, 최소 109 W/cm2, 또는 최소 1010 W/cm2일 수 있다. 일부 경우에, 샘플 표면에 전달되는 방사 플럭스는 최대 1010 W/cm2, 최대 109 W/cm2, 최대 108 W/cm2, 최대 107 W/cm2, 최대 106 W/cm2, 최대 105 W/cm2, 최대 104 W/cm2, 최대 1,000 W/cm2, 최대 100 W/cm2, 최대 10 W/cm2, 최대 1 W/cm2, 또는 최대 0.1 W/cm2일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 샘플 표면에 전달되는 방사 플럭스는 약 10 W/cm2 내지 약 1,000 W/cm2의 범위일 수 있다. 당업자는 샘플 표면에 전달되는 방사 플럭스가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 0.8 W/cm2를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 개시된 시스템은 병렬로 작동하는 2개 이상의 레이저를 포함할 수 있어(예를 들어, 2개의 레이저 빔은 동일한 대물렌즈를 통해 샘플 평면에 전달되지만, 여기서 이들은 현미경 또는 이미징 모듈에 이르거나 이를 통과하는 상이한 광학 경로를 포함하여 상이한 위치 좌표 쌍에 개별적으로 표적화될 수 있음) 2개 이상의 세포가 병렬로 광천공, 광분리 및/또는 광절제될 수 있다. 일부 경우에, 단일 레이저에 의해 제공되는 레이저 광은 동일한 대물렌즈를 통해 샘플 평면에 전달되는 2개 이상의 빔으로 분할될 수 있지만, 여기서 현미경 또는 이미징 모듈에 이르거나 이를 통과하는 상이한 광학 경로가 사용되므로 분할된 빔은 상이한 위치 좌표 쌍에 개별적으로 표적화될 수 있어 2개 이상의 세포가 병렬로 광천공, 광분리 및/또는 광절제될 수 있다.
다른 곳에서 언급된 바와 같이, 일부 경우에 개시된 장치 또는 카트리지에서 레이저 유도 광천공을 수행하는 데 사용되는 레이저는 광분리 및/또는 광절제를 수행하는 데 사용되는 레이저와 동일할 수 있으며, 여기서 작동 모드는 레이저의 평균 전력 설정, 피크 전력 설정, 펄스 주파수, 펄스 지속시간(펄스 폭), 노출 시간, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 조정함으로써 전환될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 광절제 및 광분리를 수행하는 데 동일한 레이저가 사용될 수 있으며, 예를 들어 펄스 폭을 일정하게(예를 들어, 약 300 μsec) 유지하고 집속된 레이저 스폿이 세포가 배양되는 표면을 가로질러 스캔되는 속도를 변경함(예를 들어, 절제에 사용되는 단계 크기(예를 들어, X축 단계 크기 = 단위 시간당 5 ㎛, Y축 단계 크기 = 단위 시간당 1 ㎛)를 분리를 위한 상이한 값(예를 들어, X축 단계 크기 = Y축 단계 크기 = 단위 시간당 15 ㎛)으로 변경함)으로써 표면에 전달되는 유효 전력 밀도를 줄이면서 전력 설정을 최대 약 100%(절제의 경우)에서 약 75%(분리의 경우)로 줄임으로써 두 작동 모드 간에 전환될 수 있다.
레이저 표적화 유닛: 언급된 바와 같이, 일부 경우에, 개시된 시스템은 이미지를 획득하고 레이저 빔의 초점에 대해 선택된 세포를 배치하는데 사용되는 현미경 또는 이미징 유닛의 광학 축 및/또는 초점 면에 대해 표면 또는 구획을 배치하도록 구성된 병진 스테이지를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 시스템은 광천공, 광분리, 및/또는 광절제를 위해 선택된 하나 이상의 세포의 위치 좌표에 레이저 광을 전달하도록 구성된 스캐닝 메커니즘, 예를 들어 검류계 스캐닝 시스템 또는 마이크로미러 어레이를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 개시된 방법 및 시스템은 현미경 또는 이미징 모듈의 광학 축 및/또는 초점 면과 관련하여 표면 또는 구획을 재배치하기 위해 고정밀 X-Y(또는 일부 경우에는 X-Y-Z) 병진 스테이지를 사용할 수 있다. 적절한 병진 스테이지는 다양한 공급업체, 예를 들어 Parker Hannifin에서 상업적으로 사용할 수 있다. 정밀 병진 스테이지 시스템은 선형 액추에이터, 광학 인코더, 서보 및/또는 스테퍼 모터, 및 모터 제어기 또는 드라이브 유닛을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 구성요소의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 절제를 위해 표적화된 개별 세포의 정확한 배치를 보장하기 위해 본원에 개시된 시스템 및 방법에 대해 스테이지 이동의 높은 정밀도 및 반복성이 요구될 수 있다. 결과적으로, 본원에 개시된 방법 및 시스템은 현미경 또는 이미징 모듈의 광축과 관련하여 또는 레이저 광선의 초점과 관련하여 병진 스테이지가 세포를 배치할 수 있는 정밀도 및/또는 반복성을 지정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 병진 스테이지의 정밀도 및/또는 반복성은 약 0.5 ㎛ 내지 약 5 ㎛의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 병진 스테이지의 정밀도 및/또는 반복성은 최소 0.5 ㎛, 최소 1 ㎛, 최소 2 ㎛, 최소 3 ㎛, 최소 4 ㎛, 또는 최소 5 ㎛일 수 있다. 일부 경우에, 병진 스테이지의 정밀도 및/또는 반복성은 최대 5 ㎛, 최대 4 ㎛, 최대 3 ㎛, 최대 2 ㎛, 최대 1 ㎛, 또는 최대 0.5 ㎛일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 병진 스테이지의 정밀도 및/또는 반복성은 약 1 ㎛ 내지 약 4 ㎛의 범위일 수 있다. 당업자는 병진 스테이지의 정밀도 및/또는 반복성이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 1.25 ㎛를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 검류계 스캐닝 시스템 또는 프로그램 가능한 마이크로미러 어레이는 하나 이상의 레이저 빔을 표면 상의 또는 구획 내의 지정된 위치로 편향시키고 보내는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 병진 스테이지의 정밀도 및/또는 반복성은 약 0.5 ㎛ 내지 약 5 ㎛의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 검류계 스캐닝 시스템 또는 프로그램 가능한 마이크로미러 어레이의 정밀도 및/또는 반복성은 최소 0.1 ㎛, 최소 0.5 ㎛, 최소 1 ㎛, 최소 2 ㎛, 최소 3 ㎛, 최소 4 ㎛, 또는 최소 5 ㎛일 수 있다. 일부 경우에, 검류계 스캐닝 시스템 또는 프로그램 가능한 마이크로미러 어레이의 정밀도 및/또는 반복성은 최대 5 ㎛, 최대 4 ㎛, 최대 3 ㎛, 최대 2 ㎛, 최대 1 ㎛, 최대 0.5 ㎛, 또는 최대 0.1 ㎛일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 검류계 스캐닝 시스템 또는 프로그래밍 가능한 마이크로미러 어레이의 정밀도 및/또는 반복성은 약 0.1 ㎛ 내지 약 2 ㎛의 범위일 수 있다. 당업자는 검류계 스캐닝 시스템 또는 프로그램 가능한 마이크로미러 어레이의 정밀도 및/또는 반복성이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 0.55 ㎛를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
유체 제어기: 일부 경우에, 개시된 시스템은 개시된 장치 또는 카트리지에 도입되는 하나 이상의 유체(예를 들어, 세포 배양 또는 성장 배지, 완충액 등)에 대한 타이밍 및/또는 유량에 대해 반자동, 및/또는 완전 자동 및 프로그램 가능한 제어를 제공하도록 구성된 하나 이상의 유체 제어기를 추가로 포함할 수 있다. 유체 유동은 프로그래밍 가능한 주사기 펌프, 연동 펌프, HPLC 펌프 등을 사용하여 제어될 수 있다.
유체 유량 또는 속도는 약 0.1 mm/초 내지 약 1,400 mm/초의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 속도는 최소 0.1 mm/초, 최소 1 mm/초, 최소 10 mm/초, 최소 20 mm/초, 최소 30 mm/초, 최소 40 mm/초, 최소 50 mm/초, 최소 60 mm/초, 최소 70 mm/초, 최소 80 mm/초, 최소 90 mm/초, 최소 100 mm/초, 최소 200 mm/초, 최소 300 mm/초, 최소 400 mm/초, 최소 500 mm/초, 최소 600 mm/초, 최소 700 mm/초, 최소 800 mm/초, 최소 900 mm/초, 최소 1,000 mm/초, 최소 1,100 mm/초, 최소 1,200 mm/초, 최소 1,300 mm/초, 또는 최소 1,400 mm/초일 수 있다. 일부 경우에, 속도는 최대 1,400 mm/초, 최대 1,300 mm/초, 최대 1,200 mm/초, 최대 1,100 mm/초, 최대 1,000 mm/초, 최대 900 mm/초, 최대 800 mm/초, 최대 700 mm/초, 최대 600 mm/초, 최대 500 mm/초, 최대 400 mm/초, 최대 300 mm/초, 최대 200 mm/초, 최대 100 mm/초, 최대 90 mm/초, 최대 80 mm/초, 최대 70 mm/초, 최대 60 mm/초, 최대 50 mm/초, 최대 40 mm/초, 최대 30 mm/초, 최대 20 mm/초, 최대 15 mm/초, 최대 10 mm/초, 최대 1 mm/초, 최대 0.1 mm/초일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 속도는 약 10 mm/초 내지 약 1,000 mm/초의 범위일 수 있다. 당업자는 속도가 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 24 mm/초를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
일부 경우에, 부피 유량은 약 1 마이크로리터/초 내지 약 1 밀리리터/초의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 부피 유량은 최소 1 마이크로리터/초, 최소 5 마이크로리터/초, 최소 10 마이크로리터/초, 최소 25 마이크로리터/초, 최소 50 마이크로리터/초, 최소 75 마이크로리터/초, 최소 100 마이크로리터/초, 최소 200 마이크로리터/초, 최소 300 마이크로리터/초, 최소 400 마이크로리터/초, 최소 500 마이크로리터/초, 최소 600 마이크로리터/초, 최소 700 마이크로리터/초, 최소 800 마이크로리터/초, 최소 900 마이크로리터/초, 또는 최소 1 밀리리터/초일 수 있다. 일부 경우에, 부피 유량은 최대 1 밀리리터/초, 최대 900 마이크로리터/초, 최대 800 마이크로리터/초, 최대 700 마이크로리터/초, 최대 600 마이크로리터/초, 최대 500 마이크로리터/초, 최대 400 마이크로리터/초, 최대 300 마이크로리터/초, 최대 200 마이크로리터/초, 최대 100 마이크로리터/초, 최대 75 마이크로리터/초, 최대 50 마이크로리터/초, 최대 25 마이크로리터/초, 최대 10 마이크로리터/초, 또는 최대 1 마이크로리터/초일 수 있다. 이 단락에 기술된 하한 및 상한 값 중 임의의 값을 조합하여 본 개시내용 내에 포함된 범위를 형성할 수 있으며, 예를 들어, 일부 경우에 부피 유량은 약 100 마이크로리터/초 내지 약 500 마이크로리터/초의 범위일 수 있다. 당업자는 부피 유량이 이 범위 내의 임의의 값, 예를 들어 약 10.35 마이크로리터/초를 가질 수 있음을 인식할 것이다.
온도 제어기: 일부 실시양태에서, 개시된 시스템은 지정된 온도에서 개시된 장치 및 카트리지의 하나 이상의 구획을 유지하도록 구성된 하나 이상의 온도 제어기 및/또는 열 인터페이스 특징부를 추가로 포함할 수 있다. 적절한 온도 제어 요소의 예는 저항성 가열 요소, 소형 적외선 방출 광원, 펠티에 가열 또는 냉각 장치, 방열판, 서미스터, 열전대 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 열 인터페이스 특징부는 일반적으로 우수한 열 전도체(예를 들어, 구리, 금, 은 등)인 재료로 제작되며 일반적으로 장치 또는 카트리지의 적어도 하나의 외부 표면 및/또는 외부 가열 블록 또는 냉각 블록과 양호한 열 접촉을 할 수 있는 하나 이상의 평평한 표면을 포함할 것이다.
일부 경우에, 온도 제어기는 개시된 장치 및 카트리지의 하나 이상의 구획을 지정된 온도 또는 지정된 온도의 지정된 범위 내에서 유지하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 지정된 온도는 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 또는 42℃일 수 있다. 일부 경우에, 온도 제어기는 지정된 온도의 ± 0.1℃, ± 0.5℃ 또는 ± 1℃ 이내로 개시된 장치 및 카트리지의 하나 이상의 구획을 유지하도록 구성될 수 있다.
시스템 제어기: 일부 경우에, 개시된 시스템은 (i) 세포 이미징, 세포 선택, 및 세포 확장 동안 세포 생존도를 최적화 및/또는 유지하기 위해 환경 제어 챔버 내 또는 개시된 장치 및 카트리지 내에서 환경 매개변수(예를 들어, 온도, 습도, O2 농도, CO2 농도 등) 설정 및 유지, (ii) 조명 광 설정(예를 들어, 강도 및 파장) 및 이미지 획득(예를 들어, 노출 시간, 노출 빈도, 획득한 이미지 수 등) 제어, (iii) 이미지 사전 처리(예를 들어, 이미지 대비 및 밝기 보정, 불균일한 조명에 대한 보정, 광학 수차에 대한 보정, 노이즈 제거 등, 또는 이들의 임의의 조합) 및/또는 이미지 처리(일련의 하나 이상의 이미지에서 각 이미지 내에서 객체(예를 들어, 세포 또는 하위 세포 구조)의 식별, 각 이미지를 분할하여 식별된 객체 분리, 분할된 이미지를 타일링하여 복합 이미지 생성, 특징 추출(예를 들어, 관찰 가능한 세포 표현형 특성과 같은 객체 속성의 식별 및/또는 정량) 수행, 하나 이상의 선택된 세포에 대한 위치 좌표 결정, 절제 단계를 수행한 후 획득한 하나 이상의 이미지로부터 선택된 세포의 파괴를 위한 신뢰 수준 결정 등, 또는 이들의 임의의 조합) 제어, (iv) 선택되지 않거나 원하지 않는 세포의 광천공, 광분리, 및/또는 광절제를 수행하기 위한(예를 들어, 선택된 세포의 위치 좌표를 읽고 병진 스테이지를 재배치하거나 선택된 세포가 레이저 빔의 초점 내에 순차적으로 배치되도록 레이저빔을 다시 보냄으로써) 레이저 표적화 시스템 제어 (v) 레이저 출력 제어(예를 들어, 선택된 세포가 노출되는 레이저 광의 강도, 펄스 주파수, 및/또는 지속시간), 및 (vi) 공정 제어 데이터 및/또는 이미지 파생 데이터를 실험실 정보 관리(LIMS) 시스템으로의 전송 제어), 또는 이러한 단계의 조합을 위한 프로그램 가능한 소프트웨어 코딩된 명령을 실행하기 위해 구성된 하나 이상의 프로세서, 제어기, 및/또는 컴퓨터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 시스템 제어기는 유체 및/또는 온도 제어 기능의 제어를 더 포함할 수 있다.
일부 경우에, 개시된 시스템의 하나 이상의 프로세서, 제어기, 또는 컴퓨터는 장치 또는 카트리지를 클론 세포 집단 생성 시스템 및 장기 세포 배양 인큐베이터 사이에서 앞뒤로 이동시키는 플레이트 처리 로봇 시스템을 제어하기 위한 프로그램 가능한 소프트웨어 인코딩 명령을 실행하도록 추가로 구성될 수 있다.
일부 경우에, 개시된 시스템의 하나 이상의 프로세서는 중앙 처리 장치(CPU), 그래픽 처리 장치(GPU), 범용 처리 장치, 또는 컴퓨팅 플랫폼과 같은 하드웨어 프로세서를 포함할 수 있다. 하나 이상의 프로세서는 임의의 다양한 적합한 집적 회로(예를 들어, 개시된 이미지 처리 기반 방법을 구현하기 위해 특별히 설계된 특정 용도 지향 집적 회로(ASIC: ASIC: Application Specific Integrated Circuit), 또는 컴퓨팅 시간 등을 가속화하고/거나 배포를 용이하게 하기 위한 필드 프로그래머블 게이트 어레이(FPGA: field-programmable gate array)), 마이크로프로세서, 신흥 차세대 마이크로프로세서 설계(예를 들어, 멤리스터 기반 프로세서), 논리 장치 등으로 구성될 수 있다. 본 개시내용은 프로세서를 참조하여 설명되지만, 다른 유형의 집적 회로 및 논리 장치가 또한 적용될 수 있다. 프로세서는 임의의 적절한 데이터 작업 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 프로세서는 512비트, 256비트, 128비트, 64비트, 32비트, 또는 16비트 데이터 연산을 수행할 수 있다. 하나 이상의 프로세서는 단일 코어 또는 다중 코어 프로세서, 또는 병렬 처리를 위해 구성된 복수의 프로세서일 수 있다.
개시된 방법 및 시스템을 구현하는 데 사용되는 하나 이상의 프로세서 또는 컴퓨터는 더 큰 컴퓨터 시스템의 일부일 수 있고/거나 통신 인터페이스의 도움으로 컴퓨터 네트워크(또는 "네트워크")에 작동 가능하게 연결되어 공정 데이터 및/또는 실험 결과의 전송 및 공유를 용이하게 할 수 있다. 네트워크는 근거리 통신망, 인트라넷 및/또는 익스트라넷, 인터넷과 통신하는 인트라넷 및/또는 익스트라넷, 또는 인터넷일 수 있다. 일부 경우에 네트워크는 통신 및/또는 데이터 네트워크이다. 네트워크는 일부 경우에 클라우드 컴퓨팅과 같은 분산 컴퓨팅을 가능하게 하는 하나 이상의 컴퓨터 서버를 포함할 수 있다. 네트워크는 일부 경우에 컴퓨터 시스템의 도움을 받아 컴퓨터 시스템에 연결된 장치가 클라이언트 또는 서버로 동작할 수 있도록 하는 피어 투 피어 네트워크를 구현할 수 있다.
컴퓨터 시스템은 또한 메모리 또는 메모리 위치(예를 들어, 랜덤 액세스 메모리, 읽기 전용 메모리, 플래시 메모리, Intel® Optane™ 기술), 전자 저장 장치(예를 들어, 하드 디스크), 하나 이상의 다른 시스템과 통신하기 위한 통신 인터페이스(예를 들어, 네트워크 어댑터), 및 주변 장치, 예컨대 캐시, 기타 메모리, 데이터 스토리지 및/또는 전자 디스플레이 어댑터를 포함할 수 있다. 메모리, 저장 장치, 인터페이스 및 주변 장치는 예를 들어 마더보드에서 발견되는 바와 같이 통신 버스를 통해 하나 이상의 프로세서, 예를 들어 CPU와 통신할 수 있다. 저장 장치(들)는 데이터를 저장하기 위한 데이터 저장 장치(들)(또는 데이터 저장소)일 수 있다.
하나 이상의 프로세서, 예를 들어 CPU는 프로그램(또는 "소프트웨어")으로 구현되는 일련의 기계 판독 가능 명령을 실행한다. 명령은 메모리 위치에 저장된다. 명령은 CPU로 향하고, 이는 후속적으로 본 개시내용의 방법을 구현하도록 CPU를 프로그래밍하거나 그렇지 않으면 구성한다. CPU가 수행하는 작업의 예로는 인출(fetch), 해독(decode), 실행(execute), 및 쓰기(write back)가 포함된다. CPU는 집적 회로와 같은 회로의 일부일 수 있다. 시스템의 하나 이상의 다른 구성요소가 회로에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 회로는 특정 용도 지향 집적 회로(ASIC)이다.
일부 경우에, 본 개시내용의 컴퓨터 시스템은 드라이버, 라이브러리, 및 저장된 프로그램과 같이 파일을 저장하는 저장 장치를 포함할 수 있다. 저장 장치는 사용자 데이터, 예를 들어 사용자 지정 선호도 및 사용자 지정 프로그램을 저장할 수 있다. 일부 경우에 컴퓨터 시스템은 인트라넷 또는 인터넷을 통해 컴퓨터 시스템과 통신하는 원격 서버에 위치하는 것과 같이 컴퓨터 시스템 외부에 있는 하나 이상의 추가 데이터 저장 장치를 포함할 수 있다.
소프트웨어: 배양 플레이트 웰에서 세포를 선택하고 절제하기 위한 개시된 방법과 같은 본원에 제공된 방법 및 시스템의 일부 양태는 예를 들어, 메모리 또는 전자 저장 장치와 같은 컴퓨터 시스템의 전자 저장 위치에 저장된 기계 실행 가능 코드(프로세서 실행 가능 코드)를 통해 구현된다. 기계 실행 가능 또는 기계 판독 가능 코드는 소프트웨어의 형태로 제공된다. 사용하는 동안, 코드는 하나 이상의 프로세서에 의해 실행된다. 일부 경우에, 코드는 저장 장치에서 검색되어 하나 이상의 프로세서가 즉시 액세스할 수 있도록 메모리에 저장된다. 일부 경우에, 전자 저장 장치가 제외되고 기계 실행 가능 명령이 메모리에 저장된다. 코드는 사전 컴파일되어 코드를 실행하도록 조정된 하나 이상의 프로세서가 있는 기계와 함께 사용하도록 구성될 수 있거나 런타임에 컴파일될 수 있다. 코드는 사전 컴파일되거나 컴파일된 방식대로 실행할 수 있도록 선택된 프로그래밍 언어로 제공될 수 있다.
<<개시된 방법 및 시스템의 다양한 양태는 일반적으로 기계(또는 프로세서) 실행 가능 코드 및/또는 일종의 기계 판독 가능 매체에 저장된 관련 데이터의 형태의 "제품" 또는 "제조품", 예를 들어 "컴퓨터 프로그램 또는 소프트웨어 제품"으로 간주될 수 있으며, 여기서 실행 가능 코드는 본원에 개시된 방법 중 하나 이상을 수행할 때 컴퓨터 또는 컴퓨터 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령을 포함한다. 기계 실행 가능 코드는 광학 디스크, CD-ROM, DVD, 또는 블루레이 디스크와 같은 광학적으로 판독 가능한 매체를 포함하는 광학 저장 장치에 저장될 수 있다. 기계 실행 가능 코드는 메모리(예를 들어, 읽기 전용 메모리, 랜덤 액세스 메모리, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크와 같은 전자 저장 장치에 저장될 수 있다. "저장" 유형 매체는 컴퓨터, 프로세서 등의 유형 메모리 또는 본원에 개시된 방법과 알고리즘을 코딩하는 소프트웨어를 위한 비일시적 저장소를 언제든지 제공할 수 있는 이의 관련 모듈, 예컨대 다양한 반도체 메모리 칩, 광학 드라이브, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등의 일부 또는 전부를 포함한다.
소프트웨어 코드의 전부 또는 일부는 때때로 인터넷 또는 다양한 기타 통신 네트워크를 통해 통신될 수 있다. 예를 들어, 이러한 통신은 한 컴퓨터 또는 프로세서에서 다른 컴퓨터 또는 프로세서로, 예를 들어 관리 서버 또는 호스트 컴퓨터에서 애플리케이션 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어의 로딩을 가능하게 한다. 따라서, 소프트웨어 코딩 명령을 전달하는 데 사용되는 다른 유형의 매체에는 로컬 장치 간의 물리적 인터페이스, 유선 및 광학 유선 네트워크, 및 다양한 대기 링크를 통해 사용되는 것과 같은 광학, 전기, 및 전자기파가 포함된다. 유선 또는 무선 링크, 광 링크 등과 같은 이러한 파동을 전달하는 물리적 요소는 또한 본원에 개시된 방법을 수행하기 위한 소프트웨어 코딩 명령을 전달하는 매체로 간주된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 비일시적 유형의 "저장" 매체로 제한되지 않는 한, 컴퓨터 또는 기계 "판독 가능 매체"와 같은 용어는 실행을 위해 프로세서에 명령을 제공하는 데 참여하는 임의의 매체를 지칭한다.
컴퓨터 시스템은 일반적으로 예를 들어 머신 비전 시스템에 의해 캡처된 이미지를 제공하기 위한 전자 디스플레이를 포함하거나 전자 디스플레이와 통신할 수 있다. 디스플레이는 일반적으로 사용자 인터페이스(UI)도 제공할 수 있다. UI의 예는 그래픽 사용자 인터페이스(GUI), 웹 기반 사용자 인터페이스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
도 7은 본 개시내용의 한 양태에 따른 클론 세포 집단 생성 광절제 시스템을 제어하는데 사용되는 시스템 제어 소프트웨어에 대한 블록도의 예를 제공한다. 일부 경우에, 제어 소프트웨어는 (i) 이미지 획득 모듈, (ii) 이미지 처리 모듈, (iii) 레이저 표적화 제어 모듈, (iv) 레이저 출력 제어 모듈, (v) 환경 제어 모듈, 및/또는 (vi) LIMS 인터페이스, 또는 이들의 조합과 통신하고/거나 이들을 제어하기 위한 기계 판독 가능하거나 기계 실행 가능한 명령을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 시스템 제어 소프트웨어는 본 개시내용의 클론 세포 집단 생성 시스템을 (vii) 클론 세포 집단 생성 시스템과 장기 세포 배양 인큐베이터 사이에서 장치 또는 카트리지를 앞뒤로 이동시키기 위한 로봇식 플레이트 핸들링 시스템과 인터페이스하기 위한 소프트웨어를 추가로 포함할 수 있다.
일부 경우에, 시스템 제어 소프트웨어 및 그 모든 구성요소 모듈은 단일 프로세서 또는 컴퓨터에 의해 실행될 수 있다. 일부 경우에, 시스템 제어 소프트웨어와 하나 이상의 구성요소 모듈은 상이한 프로세서 또는 컴퓨터에서 수행될 수 있다. 일부 경우에, 시스템 제어 소프트웨어 및/또는 그 구성요소 모듈의 전부 또는 일부는 컴퓨터 네트워크 및/또는 클라우드 기반 컴퓨팅 시스템에 의해 수행될 수 있다.
적용: 본원에 개시된 방법 및 시스템은 일반적으로 세포의 클론 집단의 제조에 적용할 수 있다. 개시된 방법 및 시스템이 적용될 수 있는 특정 적용의 예는 형질감염된 세포의 클론 집단(무작위로 형질감염된 세포 또는 표적화된 형질감염으로부터 발생하는 세포의 클론 집단을 포함함), 유전자 편집 세포(예를 들어, 특정 CRISPR 편집을 포함하는 클론 세포 집단), 미분화 줄기세포, 시험관 내 분화 줄기세포, 유도 만능 줄기세포(iPSC), 포유동물 세포, 식물 세포 등의 생성을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 예시적 및
비제한적인
양태
상기 기재된 본 주제의 실시양태를 포함하는 양태는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 양태 또는 실시양태와 조합하여 유익할 수 있다. 상기 설명을 제한하지 않고, 1-142로 번호가 매겨진 개시내용의 특정 비제한적인 양태가 아래에 제공된다. 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 개별적으로 번호가 매겨진 양태들 각각은 임의의 선행하는 또는 뒤따르는 개별적으로 번호가 매겨진 양태들과 함께 사용되거나 조합될 수 있다. 이는 양태의 이러한 모든 조합에 대한 지지를 제공하기 위한 것이며 아래에 명시적으로 제공된 양태의 조합으로 제한되지 않는다.
1. 카트리지로서,
(a) 세포 형질감염을 수행하기 위해 구성된 제1 구획으로서, 제1 구획은 세포 샘플의 도입을 위해 구성된 제1 입구를 포함하는 것인 제1 구획;
(b) 세포 선택을 수행하기 위해 구성된 제2 구획으로서, 제2 구획의 입구는 제1 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되고, 제2 구획은 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽 및 중간 세포 제거 포트에 작동 가능하게 연결된 출구를 추가로 포함하는 것인 제2 구획;
(c) 세포 확장을 수행하기 위해 구성된 제3 구획으로서, 제3 구획의 입구는 제2 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되는 것인 제3 구획
을 포함하는 카트리지.
2. 카트리지로서,
(a) 세포 형질감염을 수행하기 위해 구성된 제1 구획으로서, 제1 구획은 세포 샘플의 도입을 위해 구성된 제1 입구를 포함하는 것인 제1 구획;
(b) 세포 선택을 수행하기 위해 구성된 제2 구획으로서, 제2 구획의 입구는 제1 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되고, 제2 구획은 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽을 추가로 포함하는 것인 제2 구획; 및
(c) 세포 확장을 수행하기 위해 구성된 제3 구획으로서, 제3 구획은 전기 임피던스 측정을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 전극 쌍을 포함하고, 제3 구획의 입구는 제2 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되는 것인 제3 구획
을 포함하는 카트리지.
3. 카트리지로서,
(a) 세포 형질감염을 수행하기 위해 구성된 제1 구획으로서, 제1 구획은 세포 샘플의 도입을 위해 구성된 제1 입구를 포함하는 것인 제1 구획;
(b) 세포 선택을 수행하기 위해 구성된 제2 구획으로서, 제2 구획의 입구는 제1 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되고, 제2 구획은 광절제 및 광분리를 수행하기 위한 레이저 광원에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽을 추가로 포함하는 것인 제2 구획; 및
(c) 세포 확장을 수행하기 위해 구성된 제3 구획으로서, 제3 구획의 입구는 제2 유체 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되는 것인 제3 구획
을 포함하는 카트리지.
4. 시스템으로서,
세포 형질감염, 세포 선택, 및/또는 세포 확장 중 하나 이상을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 구획을 포함하는 카트리지로서, 카트리지는 세포 샘플의 도입을 위해 구성된 입구를 포함하고, 적어도 하나의 구획은 광학적으로 투명한 벽을 포함하는 것인 카트리지
를 포함하는 시스템.
5. 실시양태 4에 있어서, 광분리 공정 및 광절제 공정의 수행을 용이하게 하기 위해 광원을 추가로 포함하는 시스템.
6.
실시양태 4 또는 5에 있어서, 카트리지는 세포 선택을 위한 적어도 하나의 구획 및 세포 확장을 위한 적어도 하나의 구획을 포함하는 것인 시스템.
7.
실시양태 4 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 카트리지는 세포 선택을 위한 복수의 구획 및 세포 확장을 위한 복수의 구획을 포함하는 것인 시스템.
8. 실시양태 4 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 카트리지는 세포 선택을 위한 적어도 4개의 구획, 세포 선택을 위한 적어도 8개의 구획, 세포 선택을 위한 적어도 16개의 구획, 세포 선택을 위한 적어도 32개의 구획, 세포 선택을 위한 적어도 64개의 구획, 또는 세포 선택을 위한 적어도 96개의 구획을 포함하는 것인 시스템.
9. 실시양태 4 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 카트리지는 세포 확장을 위한 적어도 4개의 구획, 세포 확장을 위한 적어도 8개의 구획, 세포 확장을 위한 적어도 16개의 구획, 세포 확장을 위한 적어도 32개의 구획, 세포 확장을 위한 적어도 64개의 구획, 또는 세포 확장을 위한 적어도 96개의 구획을 포함하는 것인 시스템.
10. 실시양태 4 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 카트리지는 세포 형질감염을 위한 적어도 하나의 구획을 포함하는 것인 시스템.
11. 실시양태 4 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 카트리지는 세포 형질감염을 위한 구획을 포함하지 않는 것인 시스템.
12. 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 제1 구획 또는 적어도 하나의 구획은 (i) 형질감염제의 도입을 위해 구성된 제2 입구, (ii) 제한된 유동 경로, (iii) 제1 구획 또는 적어도 하나의 구획의 대향 표면과 전기적으로 접촉하고 그 표면 상에 위치된 전극 쌍, 및 (iv) 광학적으로 투명한 벽 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
13. 실시양태 12에 있어서, 전극 쌍은 백금, 금, 은, 구리, 아연, 알루미늄, 그래핀, 또는 인듐 주석 산화물로부터 제작되는 것인 카트리지 또는 시스템.
14. 실시양태 5 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 제1 구획 또는 적어도 하나의 구획의 광학적으로 투명한 벽은 전자기 스펙트럼의 자외선, 가시광선, 또는 근적외선 영역, 또는 이들의 임의의 조합에서 투명한 것인 카트리지 또는 시스템.
15. 실시양태 5 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 세포 선택 구획은 내부 표면 상의 압입 패턴 및/또는 내부 표면 상의 기판 패턴을 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
16. 실시양태 5 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 세포 확장 구획은 내부 표면 상의 압입 패턴 및/또는 내부 표면 상의 기판 패턴을 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
17. 실시양태 15 또는 16에 있어서, 기판은 단백질 기판인 카트리지 또는 시스템.
18. 실시양태 15 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 압입 패턴 및/또는 기판 패턴은 구획 내에서 세포 이동을 방지하도록 구성되는 것인 카트리지 또는 시스템.
19. 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 제2 구획 또는 적어도 하나의 구획의 부피는 약 1 마이크로리터 내지 약 10 밀리리터인 카트리지 또는 시스템.
20. 실시양태 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 제2 구획 또는 적어도 하나의 구획의 광학적으로 투명한 벽은 전자기 스펙트럼의 자외선, 가시광선, 또는 근적외선 영역, 또는 이들의 임의의 조합에서 투명한 것인 카트리지 또는 시스템.
21. 실시양태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 제2 구획 또는 적어도 하나의 구획의 광학적으로 투명한 벽은 약 1440 nm 내지 약 1450 nm 범위에서 투명한 것인 카트리지 또는 시스템.
22. 실시양태 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 제2 구획 또는 적어도 하나의 구획의 벽은 부착 세포의 부착을 용이하게 하기 위한 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
23. 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 제2 구획 또는 적어도 하나의 구획의 벽은 현탁 세포의 부착을 용이하게 하기 위한 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
24. 실시양태 22 또는 실시양태 23에 있어서, 표면 코팅은 α-폴리-리신 코팅, 콜라겐 코팅, 폴리-1-오르니틴, 피브로넥틴 코팅, 라미닌 코팅, Synthemax™ 비트로넥틴 코팅, iMatrix-511 재조합 라미닌 코팅, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 카트리지 또는 시스템.
25. 실시양태 22 또는 실시양태 23에 있어서, 표면 처리는 플라즈마 처리, UV 처리, 오존 처리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
26. 실시양태 22 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함하는 제2 구획 또는 적어도 하나의 구획의 벽은 광학적으로 투명한 벽인 카트리지 또는 시스템.
27. 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)은 내부에 위치된 물리적 장벽, 유동 제한부, 또는 칸막이 없는 챔버를 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
28. 실시양태 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 최장 치수는 약 1 센티미터 내지 약 20 센티미터인 카트리지 또는 시스템.
29. 실시양태 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 부피는 약 1 마이크로리터 내지 약 1 밀리리터인 카트리지 또는 시스템.
30. 실시양태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)은 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽을 추가로 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
31. 실시양태 30에 있어서, 광학적으로 투명한 벽은 전자기 스펙트럼의 자외선, 가시광선, 또는 근적외선 영역, 또는 이들의 임의의 조합에서 투명한 것인 카트리지 또는 시스템.
32. 실시양태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)은 전기 임피던스 측정을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 전극 쌍을 추가로 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
33. 실시양태 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 세포 성장 배지를 저장하기 위해 구성된 제4 구획 (또는 적어도 하나의 구획)을 추가로 포함하는 카트리지 또는 시스템.
34. 실시양태 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 폐기물을 저장하도록 구성된 제5 구획 (또는 적어도 하나의 구획)을 추가로 포함하는 카트리지 또는 시스템.
35. 실시양태 33 또는 실시양태 34에 있어서, 제4 또는 제5 구획 (또는 적어도 하나의 구획)은 가스 투과성 막을 추가로 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
36. 실시양태 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 입구는 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획) 내의 표면으로부터 세포의 분리를 용이하게 하는 시약의 공급원에 작동 가능하게 연결되는 것인 카트리지 또는 시스템.
37. 실시양태 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 입구는 제3 구획 (또는 적어도 제2 구획) 내의 표면으로부터 세포의 분리를 용이하게 하는 시약의 공급원에 작동 가능하게 연결되는 것인 카트리지 또는 시스템.
38. 실시양태 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 카트리지는 유리, 용융 실리카, 실리콘, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고밀도 폴리에틸렌(HDPE), 폴리이미드(PI), 환형 올레핀 중합체(COP), 환형 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리스티렌(PS), 에폭시 수지, 세라믹, 금속, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 제작되는 것인 카트리지.
39. 실시양태 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 출구는 밸브를 사용하여 세포 제거 포트 및 제3 구획 (또는 적어도 제2 구획)의 입구에 작동 가능하게 연결되는 것인 카트리지 또는 시스템.
40. 실시양태 33 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 입구는 밸브를 사용하여 제2 구획 (또는 적어도 제2 구획)의 출구 및 제4 구획 (또는 적어도 제3 구획)의 출구에 작동 가능하게 연결되는 것인 카트리지 또는 시스템.
41. 실시양태 39 또는 실시양태 40에 있어서, 밸브는 프로그램 가능한 삼방 밸브인 카트리지 또는 시스템.
42. 실시양태 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 미세유체 카트리지는 미국 국립 표준 협회(ANSI) 표준 번호 SLAS 4-2004(R2012)를 준수하는 풋프린트를 갖는 것인 카트리지 또는 시스템.
43. 실시양태 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 미세유체 카트리지는 길이가 127.76 mm ± 0.5 mm이고 폭이 85.48 mm ± 0.5 mm인 풋프린트를 갖는 것인 카트리지 또는 시스템.
44. 형질감염된 세포의 클론 집단을 생성하는 방법으로서,
(a) 카트리지를 제공하는 단계로서, 카트리지는 세포 형질감염, 세포 선택, 세포 확장, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 구획을 포함하고, 적어도 하나의 구획은 광학적으로 투명한 벽을 포함하는 것인 단계;
(b) 세포 샘플을 적어도 하나의 구획에 도입하는 단계;
(c) 세포 샘플을 하나 이상의 형질감염제로 형질감염시키는 단계;
(d) 형질감염된 세포 샘플로부터 유래된 적어도 하나의 클론 세포 콜로니를 선택하는 단계;
(e) (d)에서 선택된 적어도 하나의 클론 세포 콜로니를 제외한 모든 클론 세포 콜로니를 파괴하기 위해 광절제를 수행하는 단계; 및
(f) (d)에서 선택된 적어도 하나의 클론 세포 콜로니를 세포 분열 및 성장의 1회 이상의 주기로 처리하여 형질감염된 세포의 클론 집단을 생성하는 단계
를 포함하는 방법.
45. 실시양태 44에 있어서, (d)에서 선택된 적어도 하나의 클론 세포 콜로니로부터 세포의 제1 서브세트를 분리하는 단계, 및 테스트를 위해 그것을 카트리지로부터 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
46. 실시양태 45에 있어서, 세포의 제1 서브세트가 분리되어 테스트 하게 되는 세포의 서브세트를 제외한 나머지 모든 클론 세포 콜로니를 파괴하기 위해 광절제를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
47. 실시양태 44 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 세포 샘플은 부착 세포를 포함하는 것인 방법.
48. 실시양태 44 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 세포 샘플은 현탁 세포를 포함하는 것인 방법.
49. 실시양태 44 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 세포 샘플은 포유동물 세포를 포함하는 것인 방법.
50. 실시양태 49에 있어서, 포유동물 세포는 인간 세포인 방법.
51. 실시양태 44 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 세포 샘플 내의 세포의 수는 10,000개 미만인 방법.
52. 실시양태 44 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 세포 샘플 내의 세포의 수는 5,000개 미만인 방법.
53. 실시양태 44 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 세포 샘플 내의 세포의 수는 1,000개 미만인 방법.
54. 실시양태 44 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 세포 샘플 내의 세포의 수는 500개 미만인 방법.
55. 실시양태 44 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 형질감염제는 DNA 분자, RNA 분자, 올리고뉴클레오티드, 앱타머, 비-플라스미드 핵산 분자, 리보핵단백질(RNP), 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드, 인공 염색체, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상의 유형을 포함하는 것인 방법.
56. 실시양태 44 내지 55 중 어느 하나에 있어서, (c)에서 수행되는 형질감염은 화학적 형질감염, 기계적 형질감염(스퀴징), 전기천공, 레이저 유도 광천공, 바늘 기반 천공, 임페일펙션, 마그네토펙션, 초음파천공, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
57. 실시양태 44 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 형질감염된 세포 샘플로부터 유래된 클론 세포 콜로니는 50개 세포/㎟ 이하의 세포 표면 밀도로 형질감염된 세포를 적어도 하나의 구획의 표면에 시딩함으로써 성장되는 것인 방법.
58. 실시양태 44 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 형질감염된 세포 샘플로부터 유래된 클론 세포 콜로니는 10개 세포/㎟ 이하의 세포 표면 밀도로 형질감염된 세포를 적어도 하나의 구획의 표면에 시딩함으로써 성장되는 것인 방법.
59. 실시양태 44 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 형질감염된 세포 샘플로부터 유래된 클론 세포 콜로니는 5개 세포/㎟ 이하의 세포 표면 밀도로 형질감염된 세포를 적어도 하나의 구획의 표면에 시딩함으로써 성장되는 것인 방법.
60. 실시양태 44 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 형질감염된 세포를 적어도 하나의 구획에 시딩한 후, 2개 이상의 세포를 포함하는 임의의 세포 클러스터는 단일 세포가 클론 콜로니를 형성하도록 하기 전에 광절제 단계를 사용하여 파괴되는 것인 방법.
61. 실시양태 44 내지 60 중 어느 하나에 있어서, (d)에서 선택하는 단계는 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 무작위로 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
62. 실시양태 44 내지 60 중 어느 하나에 있어서, (d)에서 선택하는 단계는 적어도 하나의 구획의 내부 표면 상의 위치에 기초한 적어도 하나의 클론 세포 콜로니를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
63. 실시양태 44 내지 60 중 어느 하나에 있어서, (d)에서 선택하는 단계는 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포 수, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 형태, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 표면 밀도, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 성장 패턴, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 성장 속도, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 분열 속도, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포에 의한 외인성 리포터의 발현, 또는 이들의 임의의 조합에 기초하는 것인 방법.
64. 실시양태 44 내지 63 중 어느 하나에 있어서, (d)에서 선택하는 단계는 적어도 하나의 클론 세포 콜로니가 성장되는 표면 또는 부피를 이미징하는 단계에 기초하는 것인 방법.
65. 실시양태 64에 있어서, 이미징하는 단계는 명시야 이미징, 암시야 이미징, 위상차 이미징, 형광 이미징, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
66. 실시양태 64 또는 65에 있어서, 획득된 이미지는 자동화 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 처리되는 것인 방법.
67. 실시양태 64 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 이미징을 수행하는 데 사용되는 이미징 시스템의 시야는 표면적 또는 부피보다 작고, 이미징하는 단계는 표면적 또는 부피의 전부 또는 일부를 집합적으로 커버하는 2개 이상의 개별 이미지를 획득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
68. 실시양태 64 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 이미징하는 단계는 1일당 적어도 1회의 빈도로 수행되는 것인 방법.
69. 실시양태 64 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 이미징하는 단계는 시간당 적어도 1회의 빈도로 수행되는 것인 방법.
70. 실시양태 64 내지 69 중 어느 하나에 있어서, (d)에서 선택하는 단계는 하나 이상의 이미지의 자동화 이미지 분석에 기초하여 자동으로 수행되는 것인 방법.
71. 실시양태 44 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 구획의 벽은 부착 세포의 부착을 용이하게 하기 위한 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함하는 것인 방법.
72. 실시양태 44 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 구획의 벽은 현탁 세포의 부착을 용이하게 하기 위한 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함하는 것인 방법.
73. 실시양태 71 또는 72에 있어서, 표면 코팅은 α-폴리-리신 코팅, 콜라겐 코팅, 폴리-1-오르니틴, 피브로넥틴 코팅, 라미닌 코팅, Synthemax™ 비트로넥틴 코팅, iMatrix-511 재조합 라미닌 코팅, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
74. 실시양태 71 또는 72에 있어서, 표면 처리는 플라즈마 처리, UV 처리, 오존 처리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
75. 실시양태 71 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함하는 적어도 하나의 구획의 벽은 광학적으로 투명한 벽인 방법.
76. 실시양태 45 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제1 서브세트는 레이저 광분리를 사용하여 분리되는 것인 방법.
77. 실시양태 76에 있어서, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 아래에 있거나 또는 그 콜로니에 인접한 표면 영역이 레이저 광으로 조명되는 동안 적어도 하나의 클론 세포 콜로니가 성장되는 표면을 가로질러 유도되는 액체의 유동에 세포의 제1 서브세트를 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
78. 실시양태 76 또는 77에 있어서, 레이저 광을 사용한 조명은 세포를 적어도 하나의 구획의 벽에 테더링하는 데 사용되는 광절단 가능한 링커의 절단을 유도하는 것인 방법.
79. 실시양태 76 또는 77에 있어서, 레이저 광을 사용한 조명은 세포의 제1 서브세트의 광열적 분리를 유도하는 것인 방법.
80. 실시양태 76 또는 77에 있어서, 레이저 광을 사용한 조명은 하나 이상의 선택된 세포의 광기계적 분리를 유도하는 것인 방법.
81. 실시양태 76 또는 77에 있어서, 레이저 광을 사용한 조명은 하나 이상의 선택된 세포의 광음향적 분리를 유도하는 것인 방법.
82. 실시양태 76 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 레이저 광분리는 약 1440 nm 내지 약 1450 nm의 파장 범위의 레이저 광을 사용하여 수행되는 것인 방법.
83. 실시양태 76 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 80%인 방법.
84. 실시양태 76 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 90%인 방법.
85. 실시양태 76 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 95%인 방법.
86. 실시양태 45 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제1 서브세트는 100개 미만의 세포를 포함하는 것인 방법.
87. 실시양태 45 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제1 서브세트는 50개 미만의 세포를 포함하는 것인 방법.
88. 실시양태 45 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제1 서브세트는 10개 미만의 세포를 포함하는 것인 방법.
89. 실시양태 45 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제1 서브세트는 단일 세포를 포함하는 것인 방법.
90. 실시양태 45 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 테스트는 핵산 시퀀싱을 포함하는 것인 방법.
91. 실시양태 45 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 테스트는 유전자 발현 프로파일링을 포함하는 것인 방법.
92. 실시양태 45 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 테스트는 변형된 유전자의 검출을 포함하는 것인 방법.
93. 실시양태 45 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 테스트는 CRISPR 편집 유전자의 검출을 포함하는 것인 방법.
94. 실시양태 45 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 테스트는 핵산 분자의 제한 부위 분석을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
95. 실시양태 45 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 테스트는 단백질의 검출을 포함하는 것인 방법.
96. 실시양태 95에 있어서, 단백질은 돌연변이 단백질, 리포터 단백질, 또는 유전적으로 조작된 단백질을 포함하는 것인 방법.
97. 실시양태 45 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 테스트는 변경된 단백질 기능으로 인한 세포내 신호전달 경로의 변화의 검출을 포함하는 것인 방법.
98. 실시양태 44 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 광절제는 약 1440 nm 내지 약 1450 nm의 파장 범위의 레이저 광을 사용하여 수행되는 것인 방법.
99. 실시양태 44 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 광절제 효율은 적어도 80%인 방법.
100. 실시양태 44 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 광절제 효율은 적어도 90%인 방법.
101. 실시양태 44 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 광절제 효율은 적어도 95%인 방법.
102. 실시양태 44 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 형질감염된 세포의 클론 집단의 성장은 전기 임피던스 측정을 사용하여 모니터링되는 것인 방법.
103. 실시양태 44 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 지정된 수의 세포 분열 및 성장 주기 후에 형질감염된 세포의 클론 집단을 수거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
104. 실시양태 44 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 형질감염된 세포의 클론 집단을 이들이 적어도 하나의 구획에서 적어도 70% 합류도에 도달한 후에 수거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
105. 장치로서,
(a) 카트리지로서, 카트리지는 세포 형질감염, 세포 선택, 세포 확장, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 구획을 포함하고, 적어도 하나의 구획은 광절제 및 광분리를 수행하기 위한 레이저 광원에 작동 가능하게 연결된 광학적으로 투명한 벽을 포함하는 것인 카트리지; 및
(b) 제어기
를 포함하는 장치.
106. 실시양태 105에 있어서, 제어기는
(i) 카트리지를 통해 유동하는 하나 이상의 유체에 대한 타이밍 및 유량을 제어하는 단계;
(ii) 이미징 유닛에 의해 획득된 이미지의 수동, 반자동, 또는 완전 자동 이미지 처리를 수행하고, 처리된 이미지로부터 유래된 데이터에 기초하여, 레이저 기반 광분리를 위한 세포의 제1 서브세트와 레이저 기반 광절제를 위한 세포의 제2 서브세트를 선택하는 단계; 및
(iii) 세포의 제1 서브세트가 광분리되고 제2 서브세트의 세포가 광절제되도록 하나 이상의 레이저 및 레이저 표적화 유닛에 대한 레이저 작동 매개변수를 제어하는 단계
중 적어도 하나를 수행하도록 구성되는 것인 장치.
107. 실시양태 106에 있어서, 세포의 제1 서브세트 및 세포의 제2 서브세트는 둘 다 단일 클론 세포 콜로니로부터 유래되는 것인 장치.
108. 실시양태 106에 있어서, 레이저 표적화 유닛은 이미징 유닛의 객체 평면 상의 레이저 초점에 있거나 또는 그 초점에 인접한 적어도 하나의 구획 내의 표면 상에 또는 그 구획의 부피 내에 성장하는 세포를 정확하게 배치하도록 구성된 병진 스테이지를 포함하는 것인 장치.
109. 실시양태 106에 있어서, 레이저 표적화 유닛은 적어도 하나의 구획 내의 표면 상에 또는 그 구획의 부피 내에 성장하는 하나 이상의 세포의 위치에 있거나 또는 그 위치에 인접한 집속된 레이저 광을 유도하도록 구성된 스캐닝 메커니즘을 포함하는 것인 장치.
110. 실시양태 105 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 세포 형질감염은 제1 구획에서 수행되고, 세포 선택 및 세포 확장은 제2 구획에서 수행되는 것인 장치.
111. 실시양태 105 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 세포 형질감염, 세포 선택, 및 세포 확장은 각각 별도의 구획에서 수행되는 것인 장치.
112. 실시양태 105 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 세포 형질감염, 세포 선택, 및 세포 확장은 모두 동일한 구획에서 수행되는 것인 장치.
113. 실시양태 106 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 이미징 유닛은 명시야 이미징, 암시야 이미징, 위상차 이미징, 형광 이미징, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하도록 구성되는 것인 장치.
114. 실시양태 106 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 이미징 유닛의 시야는 세포가 성장되거나 부착되는 적어도 하나의 구획의 표면적 또는 그 구획 내의 부피보다 작고, 이미징 유닛은 표면적 또는 부피의 전부 또는 일부를 집합적으로 커버하는 2개 이상의 개별 이미지를 획득하여 타일링하도록 구성되는 것인 장치.
115. 실시양태 106 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 이미징 유닛은 1일당 적어도 1회의 빈도로 이미지를 획득하도록 구성되는 것인 장치.
116. 실시양태 106 내지 115 중 어느 하나에 있어서, 이미징 유닛은 시간당 적어도 1회의 빈도로 이미지를 획득하도록 구성되는 것인 장치.
117. 실시양태 106 내지 116 중 어느 하나에 있어서, (ii)에서 선택하는 단계는 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 무작위로 선택하는 단계를 포함하는 것인 장치.
118. 실시양태 106 내지 116 중 어느 하나에 있어서, (ii)에서 선택하는 단계는 적어도 하나의 구획의 표면 상의 위치에 기초한 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 선택하는 단계를 포함하는 것인 장치.
119. 실시양태 106 내지 116 중 어느 하나에 있어서, (ii)에서 선택하는 단계는 클론 세포 콜로니 내의 세포 수, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 형태, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 표면 밀도, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 성장 패턴, 클론 세포 콜로니 내의 세포 성장 속도, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 분열 속도, 클론 세포 콜로니 내의 세포에 의한 외인성 리포터의 발현, 또는 이들의 임의의 조합에 기초하는 것인 장치.
120. 실시양태 106 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 광절제 및 광분리를 수행하는 데 동일한 레이저가 사용되는 것인 장치.
121. 실시양태 106 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 광분리 및 광절제에 사용되는 하나 이상의 레이저는 이미징에 사용되는 대물 렌즈를 통해 이미징 시스템에 광학적으로 연결되는 것인 장치.
122. 실시양태 106 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 광분리 및 광절제를 수행하는 데 사용되는 하나 이상의 레이저는 적어도 하나의 펄스 레이저를 포함하는 것인 장치.
123. 실시양태 106 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 광분리 및 광절제를 수행하는 데 사용되는 하나 이상의 레이저는 적어도 하나의 적외선 레이저를 포함하는 것인 장치.
124. 실시양태 106 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 장치는 레이저 스폿 크기, 레이저 스폿 형상, 레이저 광 강도, 레이저 펄스 주파수, 레이저 펄스 에너지, 적어도 하나의 구획의 표면 상의 또는 그 구획의 부피 내의 지정된 위치에서 전달되는 레이저 펄스의 총수, 적어도 하나의 구획의 표면에 대한 또는 그 구획의 부피 내의 레이저 초점의 위치, 또는 이들의 임의의 조합을 제어함으로써 광분리 작동 모드와 광절제 작동 모드 사이에서 작동 가능하게 전환되는 것인 장치.
125. 실시양태 106 내지 124 중 어느 하나에 있어서, 제어기는 세포의 제1 서브세트 아래에 있거나 또는 그 서브세트에 인접한 표면의 영역이 레이저 광으로 조명되는 동안 적어도 하나의 구획 내의 표면을 가로질러 유도되는 액체의 유동에 세포의 제1 서브세트를 적용하도록 추가로 구성되는 것인 장치.
126. 실시양태 106 내지 125 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 80%인 장치.
127. 실시양태 106 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 90%인 장치.
128. 실시양태 106 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 95%인 장치.
129. 실시양태 106 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제2 서브세트는 90% 초과의 효율로 광절제되는 것인 장치.
130. 실시양태 106 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제2 서브세트는 95% 초과의 효율로 광절제되는 것인 장치.
131. 실시양태 106 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제2 서브세트는 99% 초과의 효율로 광절제되는 것인 장치.
132. 실시양태 106 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제2 서브세트는 99.9% 초과의 효율로 광절제되는 것인 장치.
133. 실시양태 106 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 레이저는 적어도 하나의 구획에서 세포의 레이저 기반 광천공을 수행하도록 추가로 구성되는 것인 장치.
134. 실시양태 105 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 카트리지의 적어도 하나의 구획은 화학적 형질감염, 기계적 형질감염(스퀴징), 전기천공, 레이저 유도 광천공, 바늘 기반 천공, 임페일펙션, 마그네토펙션, 초음파천공, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하도록 구성되는 것인 장치.
135. 실시양태 105 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 지정된 세트의 성장 조건 하에서 카트리지의 적어도 하나의 구획을 유지하기 위한 인큐베이터 유닛을 추가로 포함하는 장치.
136. 프로세서에 의한 실행시 프로세서 제어 시스템이 하기 단계를 포함하는 단계를 수행하게 하는 명령어 세트를 저장하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체:
(a) 세포 형질감염, 세포 선택, 세포 확장, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하도록 구성된 적어도 하나의 구획을 포함하는 카트리지를 통해 유동하는 하나 이상의 유체에 대한 타이밍 및 유량을 제어하는 단계;
(b) 적어도 하나의 구획 내의 표면 또는 부피를 이미징하도록 구성된 이미징 유닛에 의해 획득된 이미지의 이미지 처리를 수행하고, 처리된 이미지로부터 유래된 데이터에 기초하여, (i) 레이저 기반 광분리를 위한 적어도 하나의 구획 내의 표면 상에 또는 부피 내에 성장하는 세포의 제1 서브세트 및 (ii) 레이저 기반 광절제를 위한 적어도 하나의 구획 내의 표면 상에 또는 부피 내에 성장하는 세포의 제2 서브세트를 선택하는 단계; 및
(c) 세포의 제1 서브세트가 광분리되고 세포의 제2 서브세트가 광절제되도록 하나 이상의 레이저 및 레이저 표적화 유닛의 하나 이상의 작동 파라미터를 제어하는 단계.
137.
실시양태 136에 있어서, (b)에서 선택하는 단계는 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 무작위로 선택하는 단계를 포함하는 것인 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체.
138. 실시양태 136 또는 137에 있어서, (b)에서 선택하는 단계는 세포 선택 구획의 내부 표면 상의 위치에 기초한 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 선택하는 단계를 포함하는 것인 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체.
139. 실시양태 136 내지 138 중 어느 하나에 있어서, (b)에서 선택하는 단계는 클론 세포 콜로니 내의 세포 수, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 형태, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 표면 밀도, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 성장 패턴, 클론 세포 콜로니 내의 세포 성장 속도, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 분열 속도, 클론 세포 콜로니 내의 세포에 의한 외인성 리포터의 발현, 또는 이들의 임의의 조합에 기초하는 것인 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체.
140. 실시양태 136 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 프로세서 제어 시스템은 레이저 스폿 크기, 레이저 스폿 형상, 레이저 광 강도, 레이저 펄스 주파수, 레이저 펄스 에너지, 적어도 하나의 구획 내의 표면 상의 지정된 위치에서 전달되는 레이저 펄스의 총수, 적어도 하나의 구획 내의 표면에 대한 레이저 초점의 위치, 적어도 하나의 구획의 부피 내의 레이저 초점의 위치, 또는 이들의 임의의 조합을 제어함으로써 광분리 작동 모드와 광절제 작동 모드 사이에서 작동 가능하게 전환되는 것인 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체.
141. 실시양태 136 내지 140 중 어느 하나에 있어서, 광분리된 세포의 제1 서브세트를 테스트를 위해 카트리지의 출구 포트로 전달하기 위한 명령어를 추가로 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체.
142. 실시양태 136 내지 141 중 어느 하나에 있어서, 세포의 제2 서브세트의 광절제 후 세포의 제3 서브세트의 광분리를 수행하고 분리된 세포의 제3 서브세트를 세포 확장을 수행하도록 구성된 적어도 제2 구획으로 전달하기 위한 명령어를 추가로 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체.
실시예
이 실시예는 설명의 목적으로만 제공되며 본원에 제공된 청구범위를 제한하지 않는다.
실시예
1 - 예언적
실시예
- 형질감염된 세포의 클론 집단의 제조
개시된 장치는 세포 배양 시약 소비 및 실험실 공간 요건을 크게 감소시키는 형식으로 세포의 단순화된 형질감염 및 이로부터 클론 집단의 생성을 제공한다. 도 1을 참조하면, 희석된 세포 현탁액을 용액 내 형질감염제와 혼합하고 유체 입구를 통해 장치에 도입한다. 장치 내에서 세포와 형질감염제의 혼합물은 형질감염 구획을 통과한다. 도 1의 예에서, 형질감염 구획은 적어도 하나의 전극 쌍을 포함하고 세포막의 전기천공을 수행하여 세포막을 일시적으로 파괴하고 형질감염제가 세포에 들어갈 수 있도록 구성된다.
형질감염 후, 세포는 세포 선택 구획으로 이송되어 구획 내의 하부 표면에 정착하고 부착물을 형성한다. 일부 경우에, 표면은 코팅된 표면에 대한 세포의 부착 및 접착을 용이하게 하도록 제제화된 하나 이상의 코팅층을 포함할 수 있다. 수동으로 또는 자동화 이미지 처리 소프트웨어의 사용을 통한 표면의 이미징을 사용하여 부착된 단일 세포(또는 세포의 작은 클론 클러스터)의 위치를 식별할 수 있으며, 여러 세포를 포함하는 클론 세포 클러스터를 형성하기 위한 초기 성장을 모니터링한다. 선택적으로, 세포 선택 구획이 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽 또는 창을 포함하는 경우, 세포 이중선, 삼중선, 또는 성장 전에 표면에 정착하는 세포의 고차 응집체는 예를 들어 레이저 광절제 기술을 사용하여 파괴될 수 있다.
클러스터당 세포의 대략적인 수와 관련하여 지정된 크기에 도달한 후, 원하는 형질감염 이벤트가 발생했는지 확인하기 위한 테스트를 위해 하나 이상의 클론 세포 클러스터를 선택할 수 있다. 하나 이상의 선택된 클러스터 내의 세포의 일부 또는 서브세트는 예를 들어 레이저 분리 기술을 사용하여 분리하고, 예를 들어 세포 선택 구획의 출구와 유체 연통하고 세포 확장 구획의 입구와 유체 연통하는 중간 세포 제거 포트(도 1에 나타낸 장치의 오른쪽 끝에 원으로 표시됨)를 사용하여 장치로부터 제거한다. 장치로부터 분리 및 제거된 세포의 서브세트는 원하는 형질감염 이벤트(예를 들어, CRISPR 편집)가 발생했는지 확인하기 위해 예를 들어 핵산 시퀀싱을 거칠 수 있다.
테스트 결과에 기초하여, 하나 이상의 선택 및 테스트된 클론 세포 클러스터는 추가 확장을 위해 유지할 수 있는 반면, 모든 선택되지 않은 및/또는 원하지 않는 세포 또는 클론 세포 클러스터는 예를 들어, 레이저 광 절제 기술을 사용하여 파괴한다.
선택되지 않은 및/또는 원하지 않는 세포의 파괴 후, 선택된 세포는 성장 표면으로부터 분리할 수 있고(예를 들어, 트립신을 사용하거나 레이저 기반 광분리를 수행함으로써) 세포 확장 구획으로 이송할 수 있으며, 여기서 세포는 세포 성장과 분열의 여러 주기를 거친다. 세포 성장은 다양한 기술을 사용하여, 예를 들어 성장 표면을 이미징함으로써 및/또는 세포 확장 구획에 통합된 전극을 사용하여 전기 임피던스를 측정함으로써 모니터링할 수 있다.
세포가 특정 표면 밀도 또는 합류 수준에 도달하면, 클론 세포 집단은 예를 들어 트립신을 사용하여 세포 확장 구획의 성장 표면으로부터 분리할 수 있고, 도 1에 예시된 장치의 좌측 하단에 위치한 유체 배출구를 통해 제거함으로써 수거할 수 있다.
도 1에 명시적으로 도시되지는 않았지만. 많은 경우에 개시된 장치(또는 카트리지)는 세포 선택 및/또는 세포 확장 구획에서 성장하는 세포에 새로운 배지를 공급하는 통합된 세포 배양(또는 세포 성장) 배지 저장소 및 폐 배지를 저장하는 통합된 폐기물 저장소를 포함할 수 있다.
실시예
2 -
광절제
및
광분리를
사용하여 카트리지에서 세포의 클론 집단의 제조
도 8a - 도 8f는 본원에 기재된 카트리지에서 광절제 및 광분리를 사용한 세포의 클론 분리를 나타낸다. 도 8a는 본원에 기재된 카트리지에 부착 후에 HEK293-GFP 및 RFP 형질감염된 세포의 혼합 집단임을 보여준다. 도 8b에서, 레이저 절제 후 HEK293-GFP 및 RFP 세포의 혼합 집단을 보여준다. 도 8c는 배지 흐름에 의해 사멸 세포의 제거 후 HEK293-GFP 및 RFP 세포의 혼합 집단의 예시를 제공하며, 여기서 상자는 절제를 위해 표적화된 영역을 나타낸다. 도 8d는 유출 후 관찰된 검출 가능한 교차 오염이 없는 카트리지로부터 광분리 후 클론 HEK293-RFP 콜로니를 보여주는 한편, 도 8e는 유출 후 관찰된 검출 가능한 교차 오염이 없는 카트리지로부터 광분리 후 클론 HEK293-RFP 콜로니를 보여준다. 도 8f는 두 세포 집단 모두를 포함하는 비-클론 교차 오염된 콜로니를 도시한다. 도 8a 내지 도 8f에 도시된 실험은 아래와 같은 방법으로 수행하였다.
세포 배양:
HEK293-GFP(Creative Biogene, CSC-RR0040) 및 HEK293-RFP(Creative Biogene, CSC-RR0066) 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS)이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에서 37도 5% CO2에서 배양하였다. 계대 배양을 위해 80% 합류도에 도달하면 TryplExpress(Invitrogen)를 사용하여 세포를 해리시켰다.
본원에 기재된 카트리지는 무균적으로 조립하였고 10ml DMEM:10%FBS 배지로 로딩하였다. HEK293-RFP 및 HEK293-GFP 세포 모두를 TyplExpress로 동시에 해리시키고, Nucleocounter(ChemoMetec)로 계수하고, 4:1 GFP:RFP 비율로 풀링하였다. 풀링된 세포를 12,500/ml로 희석하여 장치당 2500개의 세포를 달성한 다음, 배지 공급 포트를 통해 P200 피펫으로 카트리지에 로딩하고 유출 채널을 열어 두어 공기가 빠져나갈 수 있도록 하였다. 로딩 후, 카트리지를 닫고 다음 설정을 이용한 인큐베이터에 놓았다: 120분 회수, 240분 가압 탈기, 48시간마다 배지 교체.
클론 확립:
클론을 확립하기 위해, 시딩 후 24시간 및 48시간에 인접 세포를 레이저 절제하여 클론 집단을 확립하고 시딩 후 5일에 추가 절제하여 클론성을 강화하였다. 각 절제 후 분리된 세포를 제거하기 위해 세포 챔버를 배지로 플러싱하였다.
클론 유출:
시딩 후 8일에, 레이저 펄스를 사용하여 본원에 기재된 카트리지로부터 개별 클론을 분리하고 96웰 조직 배양 플레이트의 단일 웰로 유출하였다. 클론 유출 후 4일 동안 클론을 부착 및 성장시킨 다음, Celigo Imaging Cytometer(Nexcelom Bioscience)를 사용하여 GFP 및 RFP에 대해 이미징하였다. 수동 관찰에 의해 동형 RFP 또는 동형 GFP 세포의 빈도를 결정하였다. 단일 오염 세포의 존재는 실패로 계수하였다.
실시예
3 - 밸브를 포함하는 카트리지의 교차 오염 테스트
도 9a-도9c는 본원에 기재된 카트리지의 회전 밸브를 통한 교차 오염 테스트를 도시한다. 도 9a는 카트리지의 회전 밸브 및 액체 경로를 보여준다. 접종된 박테리아와 멸균 배지는 밸브 사이에서 공통 액체 경로를 사용하여 이송하였다. 도 9b는 회전 밸브를 포함하는 카트리지에서 교차 오염이 관찰되지 않았음을 보여준다. 도 9c는 회전 밸브를 포함하는 카트리지에서 교차 오염이 관찰되지 않았음을 보여주는 교차 오염 테스트 결과의 표 형식을 제공한다.
도 9a -도 9c에 도시된 실험은 하기 방법에 따라 수행하였다.
박테리아 배양:
pBluescript 플라스미드에 암피실린 내성 카세트를 보유하는 이. 콜라이(E. coli)를 100ug/ml 암피실린이 포함된 Lysogeny Broth(LB)(LB+Amp)에서 37도에서 24시간 동안 진탕하면서 배양한 후 정치 멸균(SIP) 테스트를 수행하였다.
교차 오염/SIP 테스트:
500ul 박테리아 배양물을 딥웰 폴리프로필렌 플레이트(대상 플레이트)의 12열의 각 웰에 넣었다. 또한, 박테리아 배양물을 10ml 주사기에 로딩하고 초기 회전 밸브 포함 카트리지에 부착하였다. 10ml 주사기에 LB+Amp를 로딩하고 초기 회전 밸브 카트리지에 부착하였다. 또한, LB+Amp를 대상 플레이트의 10열과 11열에 넣었다. 박테리아균 오염에 대한 양성 대조군으로서, P20 피펫 팁을 12열의 박테리아 배양액에 담근 다음 10열의 배지에 담구었다.
SIP 테스트를 위해 다음 매개변수를 사용하였다.
1. 회전 밸브를 조정하여 박테리아 용액이 플레이트의 1열로 통과하도록 하고, 10ml 주사기에 압력을 가하고, 대략 500ul 박테리아 배양물이 대상 플레이트에 잘 모이도록 한다.
2. 밸브를 돌려 세척 포트와 폐기물 포트를 연결한다.
3. (폐기물에) 70% 이소프로판올:물로 플러싱하고 공기로 (폐기물로) 플러싱한다.
4. 두 번째 밸브를 돌려 대상 플레이트의 배지 웰로의 경로를 연다.
5. 배지 10ml 주사기에 압력을 가하고, 대략 500ul 배지가 대상 플레이트의 웰에 잘 모이도록 한다.
6. 첫 번째와 두 번째 밸브를 돌려 박테리아 경로를 연다.
7. 추가 웰에 대해 이 과정을 반복한다.
딥웰 플레이트를 37도에 24시간 동안 놓는다. 배지 탁도에 대한 육안 검사로 박테리아 접종을 결정한다.
실시예
4 - 다중
챔버
카트리지 실시양태
도 10a - 10b는 본원에 기재된 카트리지의 다양한 다중 챔버 실시양태와 이러한 다양한 실시양태의 테스트 결과를 보여준다. 도 10a는 본원에 기재된 카트리지의 다중 챔버 실시양태를 보여주는 한편, 도 10b는 본원에 기재된 카트리지의 다중 챔버 실시양태의 치수 및 상기 챔버에서의 흐름 테스트 결과를 상세히 설명하는 표를 제공한다. 다중 챔버 카트리지를 무균적으로 조립하고 200ul 피펫으로 DMEM:10%FBS 배지를 주어 프라이밍하였다. 칩에 걸친 배지의 분포를 시각적으로 결정하였다.
도 11a-11b는 본원에 기재된 카트리지의 다양한 다중 챔버 실시양태를 보여준다. 도 11a는 본원에 기재된 카트리지의 다중 챔버 실시양태를 보여주고 도 11b는 본원에 기재된 다중 챔버 카트리지의 치수를 자세히 설명하는 표를 제공한다.
도 12는 96개의 평행한 소형 세포 배양 챔버, 6개의 더 큰 세포 배양 챔버 및 유체 연결부를 특징으로 하는 본원에 기재된 다중 챔버 카트리지의 실시양태를 보여준다. 유체 인터페이스는 카트리지를 밀봉하고 관련 흐름 경로와 함께 입력/출력 연결부를 멸균하기 위한 회전 밸브가 있는 잔류 체적이 없는(zero-unswept volume) 입력/출력 연결부를 특징으로 한다. 입력 및 출력 라인은 초기 로딩, 공급, 폐기물 제거, 분석 및 유출을 용이하게 한다. 선택된 소형 챔버 내의 세포는 회전 밸브 세트를 사용하여 콜로니 확장을 위해 더 큰 챔버로 유출될 수 있다,
도 13은 카트리지 안팎으로의 흐름을 용이하게 하는 2개의 정치 멸균(SIP) 시스템을 특징으로 하는 본원에 기재된 다중 챔버 카트리지의 실시양태를 보여준다. 이 시스템은 오버몰딩된 열가소성 엘라스토머 재료와 회전 전단형 밸브로 구성된 2개의 불용 체적이 낮은(low-dead volume) 원뿔형 입력/출력 포트를 포함한다. 이 밸브는 입력 포트를 출력 포트에 연결하거나 입력 포트를 세포 배양 챔버에 연결하기 위해 회전될 수 있는 잔류 체적이 없는 단일 내부 채널을 특징으로 한다. 밸브를 세포 배양 챔버로 전환하기 전에 멸균 용액을 포트 및 밸브에 도입하여 멸균할 수 있다. 이 SIP 루틴은 배양 챔버와 연결하기 전에 유체 인터페이스와 밸브가 멸균됨을 보장한다.
실시예
5 - 배지 카트리지 실시양태
도 14는 배지가 충전된 주사기, 주사기를 충전하기 위한 펌프 인터페이스 및 도 13의 것과 동일한 SIP 시스템을 특징으로 하는 배지 카트리지의 실시양태를 보여준다. 주사기는 액체가 챔버에 들어오거나 나갈 때 대체될 수 있는 자유 이동 피스톤을 특징으로 한다. 주사기 하류로 미세유체 통로는 부분 호로 연결된 탄성 섹션을 특징으로 한다. 주사기 안팎으로 흐름을 유도하기 위해 하나 이상의 롤러를 특징으로 하는 연동 펌프를 탄성 섹션에 대해 가압시키고 회전시킬 수 있다. 주사기의 충전 및 분배는 SIP 시스템에 의한 멸균 방식으로 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 도시되고 설명되었지만, 그러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 이제 본 발명을 벗어나지 않고 수많은 변형, 변경 및 대체가 당업자에게 발생할 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시함에 있어서 임의의 조합으로 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이러한 청구범위의 범위 내의 방법 및 구조 및 그 균등물은 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
Claims (142)
- 카트리지로서,
(a) 세포 형질감염을 수행하기 위해 구성된 제1 구획으로서, 제1 구획은 세포 샘플의 도입을 위해 구성된 제1 입구를 포함하는 것인 제1 구획;
(b) 세포 선택을 수행하기 위해 구성된 제2 구획으로서, 제2 구획의 입구는 제1 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되고, 제2 구획은 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽 및 중간 세포 제거 포트에 작동 가능하게 연결된 출구를 추가로 포함하는 것인 제2 구획;
(c) 세포 확장을 수행하기 위해 구성된 제3 구획으로서, 제3 구획의 입구는 제2 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되는 것인 제3 구획
을 포함하는 카트리지. - 카트리지로서,
(a) 세포 형질감염을 수행하기 위해 구성된 제1 구획으로서, 제1 구획은 세포 샘플의 도입을 위해 구성된 제1 입구를 포함하는 것인 제1 구획;
(b) 세포 선택을 수행하기 위해 구성된 제2 구획으로서, 제2 구획의 입구는 제1 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되고, 제2 구획은 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽을 추가로 포함하는 것인 제2 구획; 및
(c) 세포 확장을 수행하기 위해 구성된 제3 구획으로서, 제3 구획은 전기 임피던스 측정을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 전극 쌍을 포함하고, 제3 구획의 입구는 제2 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되는 것인 제3 구획
을 포함하는 카트리지. - 카트리지로서,
(a) 세포 형질감염을 수행하기 위해 구성된 제1 구획으로서, 제1 구획은 세포 샘플의 도입을 위해 구성된 제1 입구를 포함하는 것인 제1 구획;
(b) 세포 선택을 수행하기 위해 구성된 제2 구획으로서, 제2 구획의 입구는 제1 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되고, 제2 구획은 광절제 및 광분리(photodetachment)를 수행하기 위한 레이저 광원에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽을 추가로 포함하는 것인 제2 구획; 및
(c) 세포 확장을 수행하기 위해 구성된 제3 구획으로서, 제3 구획의 입구는 제2 유체 구획의 출구에 작동 가능하게 연결되는 것인 제3 구획
을 포함하는 카트리지. - 시스템으로서,
세포 형질감염, 세포 선택, 및/또는 세포 확장 중 하나 이상을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 구획을 포함하는 카트리지로서, 카트리지는 세포 샘플의 도입을 위해 구성된 입구를 포함하고, 적어도 하나의 구획은 광학적으로 투명한 벽을 포함하는 것인 카트리지
를 포함하는 시스템. - 제4항에 있어서, 광분리 공정 및 광절제 공정의 수행을 용이하게 하기 위해 광원을 추가로 포함하는 시스템.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 카트리지는 세포 선택을 위한 적어도 하나의 구획 및 세포 확장을 위한 적어도 하나의 구획을 포함하는 것인 시스템.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 카트리지는 세포 선택을 위한 복수의 구획 및 세포 확장을 위한 복수의 구획을 포함하는 것인 시스템.
- 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 카트리지는 세포 선택을 위한 적어도 4개의 구획, 세포 선택을 위한 적어도 8개의 구획, 세포 선택을 위한 적어도 16개의 구획, 세포 선택을 위한 적어도 32개의 구획, 세포 선택을 위한 적어도 64개의 구획, 또는 세포 선택을 위한 적어도 96개의 구획을 포함하는 것인 시스템.
- 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 카트리지는 세포 확장을 위한 적어도 4개의 구획, 세포 확장을 위한 적어도 8개의 구획, 세포 확장을 위한 적어도 16개의 구획, 세포 확장을 위한 적어도 32개의 구획, 세포 확장을 위한 적어도 64개의 구획, 또는 세포 확장을 위한 적어도 96개의 구획을 포함하는 것인 시스템.
- 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 카트리지는 세포 형질감염을 위한 적어도 하나의 구획을 포함하는 것인 시스템.
- 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 카트리지는 세포 형질감염을 위한 구획을 포함하지 않는 것인 시스템.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 구획 또는 적어도 하나의 구획은 (i) 형질감염제의 도입을 위해 구성된 제2 입구, (ii) 제한된 유동 경로, (iii) 제1 구획 또는 적어도 하나의 구획의 대향 표면과 전기적으로 접촉하고 그 표면 상에 위치된 전극 쌍, 및 (iv) 광학적으로 투명한 벽 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제12항에 있어서, 전극 쌍은 백금, 금, 은, 구리, 아연, 알루미늄, 그래핀, 또는 인듐 주석 산화물로부터 제작되는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 구획 또는 적어도 하나의 구획의 광학적으로 투명한 벽은 전자기 스펙트럼의 자외선, 가시광선, 또는 근적외선 영역, 또는 이들의 임의의 조합에서 투명한 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 선택 구획은 내부 표면 상의 압입 패턴 및/또는 내부 표면 상의 기판 패턴을 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 확장 구획은 내부 표면 상의 압입 패턴 및/또는 내부 표면 상의 기판 패턴을 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 기판은 단백질 기판인 카트리지 또는 시스템.
- 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 압입 패턴 및/또는 기판 패턴은 구획 내에서 세포 이동을 방지하도록 구성되는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 구획 또는 적어도 하나의 구획의 부피는 약 1 마이크로리터 내지 약 10 밀리리터인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 구획 또는 적어도 하나의 구획의 광학적으로 투명한 벽은 전자기 스펙트럼의 자외선, 가시광선, 또는 근적외선 영역, 또는 이들의 임의의 조합에서 투명한 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 구획 또는 적어도 하나의 구획의 광학적으로 투명한 벽은 약 1440 nm 내지 약 1450 nm 범위에서 투명한 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 구획 또는 적어도 하나의 구획의 벽은 부착 세포의 부착을 용이하게 하기 위한 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 구획 또는 적어도 하나의 구획의 벽은 현탁 세포의 부착을 용이하게 하기 위한 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 표면 코팅은 α-폴리-리신 코팅, 콜라겐 코팅, 폴리-1-오르니틴, 피브로넥틴 코팅, 라미닌 코팅, Synthemax™ 비트로넥틴 코팅, iMatrix-511 재조합 라미닌 코팅, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 표면 처리는 플라즈마 처리, UV 처리, 오존 처리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함하는 제2 구획 또는 적어도 하나의 구획의 벽은 광학적으로 투명한 벽인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)은 내부에 위치된 물리적 장벽, 유동 제한부, 또는 칸막이 없는 챔버를 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 최장 치수는 약 1 센티미터 내지 약 20 센티미터인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 부피는 약 1 마이크로리터 내지 약 1 밀리리터인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)은 적어도 하나의 광학적으로 투명한 벽을 추가로 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제30항에 있어서, 광학적으로 투명한 벽은 전자기 스펙트럼의 자외선, 가시광선, 또는 근적외선 영역, 또는 이들의 임의의 조합에서 투명한 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)은 전기 임피던스 측정을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 전극 쌍을 추가로 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 성장 배지를 저장하기 위해 구성된 제4 구획 (또는 적어도 하나의 구획)을 추가로 포함하는 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기물을 저장하도록 구성된 제5 구획 (또는 적어도 하나의 구획)을 추가로 포함하는 카트리지 또는 시스템.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 제4 또는 제5 구획 (또는 적어도 하나의 구획)은 가스 투과성 막을 추가로 포함하는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 입구는 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획) 내의 표면으로부터 세포의 분리를 용이하게 하는 시약의 공급원에 작동 가능하게 연결되는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 입구는 제3 구획 (또는 적어도 제2 구획) 내의 표면으로부터 세포의 분리를 용이하게 하는 시약의 공급원에 작동 가능하게 연결되는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 카트리지는 유리, 용융 실리카, 실리콘, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 고밀도 폴리에틸렌(HDPE), 폴리이미드(PI), 환형 올레핀 중합체(COP), 환형 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리스티렌(PS), 에폭시 수지, 세라믹, 금속, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 제작되는 것인 카트리지.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 출구는 밸브를 사용하여 세포 제거 포트 및 제3 구획 (또는 적어도 제2 구획)의 입구에 작동 가능하게 연결되는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 구획 (또는 적어도 하나의 구획)의 입구는 밸브를 사용하여 제2 구획 (또는 적어도 제2 구획)의 출구 및 제4 구획 (또는 적어도 제3 구획)의 출구에 작동 가능하게 연결되는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제39항 또는 제40항에 있어서, 밸브는 프로그램 가능한 삼방 밸브인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 미세유체 카트리지는 미국 국립 표준 협회(ANSI: American National Standards Institute) 표준 번호 SLAS 4-2004(R2012)를 준수하는 풋프린트를 갖는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 미세유체 카트리지는 길이가 127.76 mm ± 0.5 mm이고 폭이 85.48 mm ± 0.5 mm인 풋프린트를 갖는 것인 카트리지 또는 시스템.
- 형질감염된 세포의 클론 집단을 생성하는 방법으로서,
(a) 카트리지를 제공하는 단계로서, 카트리지는 세포 형질감염, 세포 선택, 세포 확장, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 구획을 포함하고, 적어도 하나의 구획은 광학적으로 투명한 벽을 포함하는 것인 단계;
(b) 세포 샘플을 적어도 하나의 구획에 도입하는 단계;
(c) 세포 샘플을 하나 이상의 형질감염제로 형질감염시키는 단계;
(d) 형질감염된 세포 샘플로부터 유래된 적어도 하나의 클론 세포 콜로니를 선택하는 단계;
(e) (d)에서 선택된 적어도 하나의 클론 세포 콜로니를 제외한 모든 클론 세포 콜로니를 파괴하기 위해 광절제를 수행하는 단계; 및
(f) (d)에서 선택된 적어도 하나의 클론 세포 콜로니를 세포 분열 및 성장의 1회 이상의 주기로 처리하여 형질감염된 세포의 클론 집단을 생성하는 단계
를 포함하는 방법. - 제44항에 있어서, (d)에서 선택된 적어도 하나의 클론 세포 콜로니로부터 세포의 제1 서브세트를 분리하는 단계, 및 테스트를 위해 그것을 카트리지로부터 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제45항에 있어서, 세포의 제1 서브세트가 분리되어 테스트 하게 되는 세포의 서브세트를 제외한 나머지 모든 클론 세포 콜로니를 파괴하기 위해 광절제를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 샘플은 부착 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 샘플은 현탁 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 샘플은 포유동물 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제49항에 있어서, 포유동물 세포는 인간 세포인 방법.
- 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 샘플 내의 세포의 수는 10,000개 미만인 방법.
- 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 샘플 내의 세포의 수는 5,000개 미만인 방법.
- 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 샘플 내의 세포의 수는 1,000개 미만인 방법.
- 제44항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 샘플 내의 세포의 수는 500개 미만인 방법.
- 제44항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 형질감염제는 DNA 분자, RNA 분자, 올리고뉴클레오티드, 앱타머, 비-플라스미드 핵산 분자, 리보핵단백질(RNP), 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드, 인공 염색체, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상의 유형을 포함하는 것인 방법.
- 제44항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, (c)에서 수행되는 형질감염은 화학적 형질감염, 기계적 형질감염(스퀴징), 전기천공, 레이저 유도 광천공, 바늘 기반 천공, 임페일펙션(impalefection), 마그네토펙션(magnetofection), 초음파천공, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
- 제44항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염된 세포 샘플로부터 유래된 클론 세포 콜로니는 50개 세포/㎟ 이하의 세포 표면 밀도로 형질감염된 세포를 적어도 하나의 구획의 표면에 시딩함으로써 성장되는 것인 방법.
- 제44항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염된 세포 샘플로부터 유래된 클론 세포 콜로니는 10개 세포/㎟ 이하의 세포 표면 밀도로 형질감염된 세포를 적어도 하나의 구획의 표면에 시딩함으로써 성장되는 것인 방법.
- 제44항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염된 세포 샘플로부터 유래된 클론 세포 콜로니는 5개 세포/㎟ 이하의 세포 표면 밀도로 형질감염된 세포를 적어도 하나의 구획의 표면에 시딩함으로써 성장되는 것인 방법.
- 제44항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염된 세포를 적어도 하나의 구획에 시딩한 후, 2개 이상의 세포를 포함하는 임의의 세포 클러스터는 단일 세포가 클론 콜로니를 형성하도록 하기 전에 광절제 단계를 사용하여 파괴되는 것인 방법.
- 제44항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, (d)에서 선택하는 단계는 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 무작위로 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제44항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, (d)에서 선택하는 단계는 적어도 하나의 구획의 내부 표면 상의 위치에 기초한 적어도 하나의 클론 세포 콜로니를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제44항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, (d)에서 선택하는 단계는 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포 수, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 형태, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 표면 밀도, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 성장 패턴, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 성장 속도, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포의 분열 속도, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 내의 세포에 의한 외인성 리포터의 발현, 또는 이들의 임의의 조합에 기초하는 것인 방법.
- 제44항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, (d)에서 선택하는 단계는 적어도 하나의 클론 세포 콜로니가 성장되는 표면 또는 부피를 이미징하는 단계에 기초하는 것인 방법.
- 제64에 있어서, 이미징하는 단계는 명시야 이미징, 암시야 이미징, 위상차 이미징, 형광 이미징, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제64항 또는 제65항에 있어서, 획득된 이미지는 자동화 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 처리되는 것인 방법.
- 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 이미징을 수행하는 데 사용되는 이미징 시스템의 시야는 표면적 또는 부피보다 작고, 이미징하는 단계는 표면적 또는 부피의 전부 또는 일부를 집합적으로 커버하는 2개 이상의 개별 이미지를 획득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 이미징하는 단계는 1일당 적어도 1회의 빈도로 수행되는 것인 방법.
- 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 이미징하는 단계는 시간당 적어도 1회의 빈도로 수행되는 것인 방법.
- 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, (d)에서 선택하는 단계는 하나 이상의 이미지의 자동화 이미지 분석에 기초하여 자동으로 수행되는 것인 방법.
- 제44항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 구획의 벽은 부착 세포의 부착을 용이하게 하기 위한 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함하는 것인 방법.
- 제44항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 구획의 벽은 현탁 세포의 부착을 용이하게 하기 위한 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함하는 것인 방법.
- 제71항 또는 제72항에 있어서, 표면 코팅은 α-폴리-리신 코팅, 콜라겐 코팅, 폴리-1-오르니틴, 피브로넥틴 코팅, 라미닌 코팅, Synthemax™ 비트로넥틴 코팅, iMatrix-511 재조합 라미닌 코팅, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제71항 또는 제72항에 있어서, 표면 처리는 플라즈마 처리, UV 처리, 오존 처리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
- 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 코팅 또는 표면 처리를 포함하는 적어도 하나의 구획의 벽은 광학적으로 투명한 벽인 방법.
- 제45항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제1 서브세트는 레이저 광분리를 사용하여 분리되는 것인 방법.
- 제76항에 있어서, 적어도 하나의 클론 세포 콜로니 아래에 있거나 또는 그콜로니에 인접한 표면 영역이 레이저 광에 의해 조명되는 동안 적어도 하나의 클론 세포 콜로니가 성장되는 표면을 가로질러 유도되는 액체의 유동에 세포의 제1 서브세트를 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, 레이저 광을 사용한 조명은 세포를 적어도 하나의 구획의 벽에 테더링하는 데 사용되는 광절단 가능한 링커의 절단을 유도하는 것인 방법.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, 레이저 광을 사용한 조명은 세포의 제1 서브세트의 광열적 분리를 유도하는 것인 방법.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, 레이저 광을 사용한 조명은 하나 이상의 선택된 세포의 광기계적 분리를 유도하는 것인 방법.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, 레이저 광을 사용한 조명은 하나 이상의 선택된 세포의 광음향적 분리를 유도하는 것인 방법.
- 제76항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 레이저 광분리는 약 1440 nm 내지 약 1450 nm의 파장 범위의 레이저 광을 사용하여 수행되는 것인 방법.
- 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 80%인 방법.
- 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 90%인 방법.
- 제76항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 95%인 방법.
- 제45항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제1 서브세트는 100개 미만의 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제45항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제1 서브세트는 50개 미만의 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제45항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제1 서브세트는 10개 미만의 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제45항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제1 서브세트는 단일 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제45항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트는 핵산 시퀀싱을 포함하는 것인 방법.
- 제45항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트는 유전자 발현 프로파일링을 포함하는 것인 방법.
- 제45항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트는 변형된 유전자의 검출을 포함하는 것인 방법.
- 제45항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트는 CRISPR 편집 유전자의 검출을 포함하는 것인 방법.
- 제45항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트는 핵산 분자의 제한 부위 분석을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제45항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트는 단백질의 검출을 포함하는 것인 방법.
- 제95항에 있어서, 단백질은 돌연변이 단백질, 리포터 단백질, 또는 유전적으로 조작된 단백질을 포함하는 것인 방법.
- 제45항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트는 변경된 단백질 기능으로 인한 세포내 신호전달 경로의 변화의 검출을 포함하는 것인 방법.
- 제44항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 광절제는 약 1440 nm 내지 약 1450 nm의 파장 범위의 레이저 광을 사용하여 수행되는 것인 방법.
- 제44항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 광절제 효율은 적어도 80%인 방법.
- 제44항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 광절제 효율은 적어도 90%인 방법.
- 제44항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 광절제 효율은 적어도 95%인 방법.
- 제44항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염된 세포의 클론 집단의 성장은 전기 임피던스 측정을 사용하여 모니터링되는 것인 방법.
- 제44항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 지정된 수의 세포 분열 및 성장 주기 후에 형질감염된 세포의 클론 집단을 수거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제44항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염된 세포의 클론 집단을 이들이 적어도 하나의 구획에서 적어도 70% 합류도(confluency)에 도달한 후에 수거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 장치로서,
(a) 카트리지로서, 카트리지는 세포 형질감염, 세포 선택, 세포 확장, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하기 위해 구성된 적어도 하나의 구획을 포함하고, 적어도 하나의 구획은 광절제 및 광분리를 수행하기 위한 레이저 광원에 작동 가능하게 연결된 광학적으로 투명한 벽을 포함하는 것인 카트리지; 및
b) 제어기
를 포함하는 장치. - 제105항에 있어서, 제어기는
(i) 카트리지를 통해 유동하는 하나 이상의 유체에 대한 타이밍 및 유량을 제어하는 단계;
(ii) 이미징 유닛에 의해 획득된 이미지의 수동, 반자동, 또는 완전 자동 이미지 처리를 수행하고, 처리된 이미지로부터 유도된 데이터에 기초하여, 레이저 기반 광분리를 위한 세포의 제1 서브세트와 레이저 기반 광절제를 위한 세포의 제2 서브세트를 선택하는 단계; 및
(iii) 세포의 제1 서브세트가 광분리되고 세포의 제2 서브세트가 광절제되도록 하나 이상의 레이저 및 레이저 표적화 유닛에 대한 레이저 작동 매개변수를 제어하는 단계
중 적어도 하나를 수행하도록 구성되는 것인 장치. - 제106항에 있어서, 세포의 제1 서브세트 및 세포의 제2 서브세트는 둘 다 단일 클론 세포 콜로니로부터 유래되는 것인 장치.
- 제106항에 있어서, 레이저 표적화 유닛은 이미징 유닛의 객체 평면 상의 레이저 초점에 있거나 또는 그 초점에 인접한 적어도 하나의 구획 내의 표면 상에 또는 그 구획의 부피 내에 성장하는 세포를 정확하게 배치하도록 구성된 병진 스테이지를 포함하는 것인 장치.
- 제106항에 있어서, 레이저 표적화 유닛은 적어도 하나의 구획 내의 표면 상에 또는 그 구획의 부피 내에 성장하는 하나 이상의 세포의 위치에 있거나 또는 그 위치에 인접한 집속된 레이저 광을 유도하도록 구성된 스캐닝 메커니즘을 포함하는 것인 장치.
- 제105항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 형질감염은 제1 구획에서 수행되고, 세포 선택 및 세포 확장은 제2 구획에서 수행되는 것인 장치.
- 제105항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 형질감염, 세포 선택, 및 세포 확장은 각각 별도의 구획에서 수행되는 것인 장치.
- 제105항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 형질감염, 세포 선택, 및 세포 확장은 모두 동일한 구획에서 수행되는 것인 장치.
- 제106항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 이미징 유닛은 명시야 이미징, 암시야 이미징, 위상차 이미징, 형광 이미징, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하도록 구성되는 것인 장치.
- 제106항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 이미징 유닛의 시야는 세포가 성장되거나 부착되는 적어도 하나의 구획의 표면적 또는 그 구획 내의 부피보다 작고, 이미징 유닛은 표면적 또는 부피의 전부 또는 일부를 집합적으로 커버하는 2개 이상의 개별 이미지를 획득하여 타일링하도록 구성되는 것인 장치.
- 제106항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 이미징 유닛은 1일당 적어도 1회의 빈도로 이미지를 획득하도록 구성되는 것인 장치.
- 제106항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 이미징 유닛은 시간당 적어도 1회의 빈도로 이미지를 획득하도록 구성되는 것인 장치.
- 제106항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)에서 선택하는 단계는 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 무작위로 선택하는 단계를 포함하는 것인 장치.
- 제106항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)에서 선택하는 단계는 적어도 하나의 구획의 표면 상의 위치에 기초한 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 선택하는 단계를 포함하는 것인 장치.
- 제106항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)에서 선택하는 단계는 클론 세포 콜로니 내의 세포 수, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 형태, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 표면 밀도, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 성장 패턴, 클론 세포 콜로니 내의 세포 성장 속도, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 분열 속도, 클론 세포 콜로니 내의 세포에 의한 외인성 리포터의 발현, 또는 이들의 임의의 조합에 기초하는 것인 장치.
- 제106항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 광절제 및 광분리를 수행하는 데 동일한 레이저가 사용되는 것인 장치.
- 제106항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 광분리 및 광절제에 사용되는 하나 이상의 레이저는 이미징에 사용되는 대물 렌즈를 통해 이미징 시스템에 광학적으로 연결되는 것인 장치.
- 제106항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 광분리 및 광절제를 수행하는 데 사용되는 하나 이상의 레이저는 적어도 하나의 펄스 레이저를 포함하는 것인 장치.
- 제106항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 광분리 및 광절제를 수행하는 데 사용되는 하나 이상의 레이저는 적어도 하나의 적외선 레이저를 포함하는 것인 장치.
- 제106항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 장치는 레이저 스폿 크기, 레이저 스폿 형상, 레이저 광 강도, 레이저 펄스 주파수, 레이저 펄스 에너지, 적어도 하나의 구획의 표면 상의 또는 그 구획의 부피 내의 지정된 위치에서 전달되는 레이저 펄스의 총수, 적어도 하나의 구획의 표면에 대한 또는 그 구획의 부피 내의 레이저 초점의 위치, 또는 이들의 임의의 조합을 제어함으로써 광분리 작동 모드와 광절제 작동 모드 사이에서 작동 가능하게 전환되는 것인 장치.
- 제106항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 제어기는 세포의 제1 서브세트 아래에 있거나 또는 그에 인접한 표면의 영역이 레이저 광으로 조명되는 동안 적어도 하나의 구획 내의 표면을 가로질러 유도되는 액체의 유동에 세포의 제1 서브세트를 적용하도록 추가로 구성되는 것인 장치.
- 제106항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 80%인 장치.
- 제106항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 90%인 장치.
- 제106항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제1 서브세트를 광분리하는 효율은 적어도 95%인 장치.
- 제106항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제2 서브세트는 90% 초과의 효율로 광절제되는 것인 장치.
- 제106항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제2 서브세트는 95% 초과의 효율로 광절제되는 것인 장치.
- 제106항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제2 서브세트는 99% 초과의 효율로 광절제되는 것인 장치.
- 제106항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제2 서브세트는 99.9% 초과의 효율로 광절제되는 것인 장치.
- 제106항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 레이저는 적어도 하나의 구획에서 세포의 레이저 기반 광천공을 수행하도록 추가로 구성되는 것인 장치.
- 제105항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 카트리지의 적어도 하나의 구획은 화학적 형질감염, 기계적 형질감염(스퀴징), 전기천공, 레이저 유도 광천공, 바늘 기반 천공, 임페일펙션, 마그네토펙션, 초음파천공, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하도록 구성되는 것인 장치.
- 제105항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 지정된 세트의 성장 조건하에서 카트리지의 적어도 하나의 구획을 유지하기 위한 인큐베이터 유닛을 추가로 포함하는 장치.
- 프로세서에 의한 실행시 프로세서 제어 시스템이 하기 단계를 포함하는 단계를 수행하게 하는 명령어 세트를 저장하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능 매체:
(a) 세포 형질감염, 세포 선택, 세포 확장, 또는 이들의 임의의 조합을 수행하도록 구성된 적어도 하나의 구획을 포함하는 카트리지를 통해 유동하는 하나 이상의 유체에 대한 타이밍 및 유량을 제어하는 단계;
(b) 적어도 하나의 구획 내의 표면 또는 부피를 이미징하도록 구성된 이미징 유닛에 의해 획득된 이미지의 이미지 처리를 수행하고, 처리된 이미지로부터 유도된 데이터에 기초하여, (i) 레이저 기반 광분리를 위한 적어도 하나의 구획 내의 표면 상에 또는 부피 내에 성장하는 세포의 제1 서브세트 및 (ii) 레이저 기반 광절제를 위한 적어도 하나의 구획 내의 표면 상에 또는 부피 내에 성장하는 세포의 제2 서브세트를 선택하는 단계; 및
(c) 세포의 제1 서브세트가 광분리되고 세포의 제2 서브세트가 광절제되도록 하나 이상의 레이저 및 레이저 표적화 유닛의 하나 이상의 작동 파라미터를 제어하는 단계. - 제136항에 있어서, (b)에서 선택하는 단계는 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 무작위로 선택하는 단계를 포함하는 것인 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체.
- 제136항 또는 제137항에 있어서, (b)에서 선택하는 단계는 세포 선택 구획의 내부 표면 상의 위치에 기초한 하나 이상의 클론 세포 콜로니를 선택하는 단계를 포함하는 것인 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체.
- 제136항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, (b)에서 선택하는 단계는 클론 세포 콜로니 내의 세포 수, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 형태, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 표면 밀도, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 성장 패턴, 클론 세포 콜로니 내의 세포 성장 속도, 클론 세포 콜로니 내의 세포의 분열 속도, 클론 세포 콜로니 내의 세포에 의한 외인성 리포터의 발현, 또는 이들의 임의의 조합에 기초하는 것인 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체.
- 제136항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 프로세서 제어 시스템은 레이저 스폿 크기, 레이저 스폿 형상, 레이저 광 강도, 레이저 펄스 주파수, 레이저 펄스 에너지, 적어도 하나의 구획 내의 표면 상의 지정된 위치에서 전달되는 레이저 펄스의 총수, 적어도 하나의 구획 내의 표면에 대한 레이저 초점의 위치, 적어도 하나의 구획의 부피 내의 레이저 초점의 위치, 또는 이들의 임의의 조합을 제어함으로써 광분리 작동 모드와 광절제 작동 모드 사이에서 작동 가능하게 전환되는 것인 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체.
- 제136항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 광분리된 제1 서브세트를 테스트를 위해 카트리지의 출구 포트로 전달하기 위한 명령을 추가로 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체.
- 제136항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 제2 서브세트의 광절제 후 세포의 제3 서브세트의 광분리를 수행하고 세포의 분리된 제3 서브세트를 세포 확장을 수행하도록 구성된 적어도 제2 구획으로 전달하기 위한 명령어를 추가로 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체.
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