TWI806062B - 利用雷射打開細胞外層結構的方法及裝置 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供一種利用雷射打開細胞外層結構的方法及裝置，其中由雷射二極體射出之短脈衝雷射經過光學鏡片組收光、整光而匯聚於一焦點，以該短脈衝雷射處理固定於該焦點或運動通過該焦點之生物樣本，使得生物樣本的細胞的細胞膜或細胞壁破裂。

Description

利用雷射打開細胞外層結構的方法及裝置
本揭露是關於一種利用雷射打開細胞外層結構的方法及裝置，且特別是關於一種利用短脈衝雷射打開細胞外層結構的方法及裝置。
分子檢測兼具快速篩檢以及高準確性等優點，為近年來廣泛使用的檢測技術，隨著分子檢測技術的進步，相關領域對於核酸萃取技術的需求與日俱增。一般來說，核酸的萃取包括核酸的釋放以及核酸的純化，而核酸的釋放即是利用機械手段、物理性手段或化學性手段破壞細胞，釋放出核酸的方法。其中，該機械手段係利用一機械力，如研磨、壓力、超音波震盪等方式將核酸自細胞中溶出；該物理性方法係利用溫度變化，如利用液態氮反覆快速冷凍、解凍等方式使細胞破裂，而破壞其結構等；該化學性手段則係利用藥劑、化學或滲透壓差異等方式，使細胞破裂。然而，前述各種核酸釋放的方式均有操作繁瑣、耗時、設備昂貴或便利性不高等缺點，同時人為操作易衍生汙染以及誤差，並不利於大批檢體或產線式的篩檢方式。因此，相關產業仍需要提供新的破菌技術，以滿足相關產業的使用需求。
本揭露之一目的在於提供一種利用雷射打開細胞外層結構的方法，係利用短脈衝雷射給予一生物樣本震波(shock wave)，造成該生物樣本細胞內瞬間的壓力差，藉此達到打開或破裂細胞的效果。如此，本揭露的方法可結合檢測卡匣以及具有雷射裝置之儀器，有利於處理大量且產線式的檢體篩檢。
為達上述目的，本揭露之一較佳實施例提供一種利用雷射打開細胞外層結構的方法，包括以下步驟。首先，提供與微控制器電連接之雷射二極體，其中雷射二極體被配置以發射短脈衝雷射。其次，提供設置於雷射二極體前方的光學鏡片組，俾短脈衝雷射通過光學鏡片組。接著，提供生物樣本，其中該微控制器被配置以控制該生物樣本的運動狀態為靜止狀態或流動狀態。然後，藉由控制該短脈衝雷射之重複頻率及光束大小，以該短脈衝雷射處理該生物樣本，使得該生物樣本的細胞的細胞膜或細胞壁破裂，而取得該生物樣本的該細胞的核酸。
為達上述目的，本揭露之一較佳實施例提供一種利用雷射打開細胞外層結構的裝置，包括：微控制器、雷射裝置、信號產生器、電源供應器以及流速與流量控制器。其中，該雷射裝置包括光學鏡片組以及可發射短脈衝雷射之雷射二極體；該信號產生器電連接於該微控制器與該雷射二極體之間，被配置以接收該微控制器之第一信號而調整該短脈衝雷射之重複頻率；該電源供應器電連接於該微控制器與 該雷射二極體之間，被配置以接收該微控制器之第二信號而輸出一電壓至該雷射二極體以控制該短脈衝雷射之輸出功率；電連接於該微控制器的流速與流量控制器被配置以接收該微控制器之第三信號而控制含有細胞或疑似含有細胞之生物樣本之運動狀態。其中，該短脈衝雷射通過該光學鏡片組時進行收光及整光並聚焦於一焦點，且該生物樣本在該焦點上受該短脈衝雷射處理而使得該生物樣本的細胞的細胞膜或細胞壁破裂，而取得該生物樣本的該細胞的核酸。
1:利用雷射打開細胞外層結構的裝置
2:卡匣
3:雷射裝置
4:微控制器
5:信號產生器
6:流速與流量控制器
7:電源供應器
100:雷射二極體
101、103、105:光
107:焦點
200:光學鏡片組
210:收光透鏡
230:聚焦透鏡
300:流道
301:細胞
302:生物樣本
A:方向
D:深度
S1:提供雷射
S2:提供樣本
S3:以雷射處理樣本
第1圖繪示本揭露較佳實施例中利用雷射打開細胞外層結構的方法的流程圖。
第2圖繪示本揭露較佳實施例中以雷射裝置打開細胞外層結構的示意圖。
第3圖繪示本揭露較佳實施例中用於打開細胞外層結構的裝置的示意圖。
第4圖繪示本揭露較佳實施例中短脈衝雷射之輸出功率與細胞破裂比率之關係圖。
第5圖繪示本揭露較佳實施例中短脈衝雷射之重複頻率與細胞破裂比率之關係圖。
為使熟習本揭露所屬技術領域之一般技藝者能更進一步了解本揭露，下文特列舉本揭露之數個較佳實施例，並配合所附圖式， 詳細說明本揭露的構成內容及所欲達成之功效。並且，在不脫離本揭露的精神下，下文所描述的不同實施例中的技術特徵彼此間可以被置換、重組、混合，以構成其他的實施例。
本揭露中所提及的「約」或「實質上」之用語通常表示在一給定值或範圍的20%之內，較佳是10%之內，且更佳是5%之內，或3%之內，或2%之內，或1%之內，或0.5%之內。應注意的是，說明書中所提供的數量為大約的數量，亦即在沒有特定說明「約」或「實質上」的情況下，仍可隱含「約」或「實質上」之含義。
請參照第1圖所示，其繪示本揭露第一實施例中的利用雷射打開細胞外層結構的方法的流程圖。首先，提供雷射(步驟S1)，其例如是一短脈衝雷射，如一奈秒雷射(ns-laser)等，但不以此為限。在一實施例中，該短脈衝雷射的波長例如是約介於800奈米(nm)至1100奈米之間，脈衝寬度(pulse width)約為1至500奈秒(ns)，而脈衝能量則介於20至2000奈焦耳(nanojoules,nJs)，但不以此為限。在一較佳實施例中，可選擇使用奈秒的雷射二極體(laser diode)發射該短脈衝雷射，例如是第2圖及第3圖所示的雷射二極體100，但不以此為限。在另一實施例中，該雷射的種類除了雷射二極體發射出之半導體雷射外，還包括固態雷射、光纖雷射或其組合等。該雷射的材料包括808nm及1064nm雙波長之釹釔鋁石榴石(Nd YAG)、波長905nm之(銦)砷化(鋁)鎵/砷化鋁鎵((In)Ga(Al)As/AlGaAs)、波長980nm之砷化鋁鎵銦(InGaAlAs)、磷化銦鎵砷化物(InGaAsP)或其組合，但不以此為限。
需注意的是，雷射二極體100所產生的光具有高指向性，並且容易控制能量，但因該短脈衝雷射的發散角較大，較佳可搭配由多面透鏡所組成之一光學鏡片組200以改善其收光、整光與聚焦。請一併參照第2圖、第3圖所示，光學鏡片組200包括一收光透鏡210以及一聚焦透鏡230，其中，收光透鏡210例如為一短焦透鏡，該短焦透鏡的焦點約為5毫米(mm)、數值孔徑(numerical aperture,NA)約為0.5，以利於快速整光，使光可接近平行；而聚焦透鏡230則例如為一球面鏡、物鏡、非曲面鏡、非球面鏡或其組合，如一消球差透鏡，該非曲面鏡或非球面鏡的焦點約為11毫米、數值孔徑約為0.55，以利於將所有光聚焦。如此，當雷射二極體100產生光101時，即可先穿過收光透鏡210進行收光、整光，使得通過收光透鏡210的光103平行前進，再接著穿過聚焦透鏡230進行聚焦，使得通過聚焦透鏡230的光105(即該短脈衝雷射)可聚集於一焦點107，進而提高效率並減少能量損耗。較佳地，焦點107例如約為1至9毫米平方(mm2)，但不以此為限。本領域者應可輕易理解，在前述實施例中，收光透鏡210以及聚焦透鏡230的條件選擇(如焦點、數值孔徑)皆可因應所欲得到的焦點107大小而可有所不同，而焦點107大小則可依據後續待處理之生物樣本的種類、來源等而調整，不以前述為限。此外，在另一實施例中，亦可選擇以其他方式發射該短脈衝雷射，例如可使用一雷射振鏡或一掃描頭，以全面性掃描的方式發射該短脈衝雷射。以該雷射振鏡為例，其設置於該雷射二極體與該光學鏡片組之間。該生物樣本被置於流道300之一固定點(未繪示，例如可重疊於焦點107)且為靜止時，該雷射振鏡用以將該短脈衝雷射以二維或三維掃描方式發射通過該光學鏡片組再至該生物樣本上。
接著，提供樣本(第1圖步驟S2)，其可以是各種可經由適當處理而取得核酸產物的生物樣本302，如動植物組織、動植物細胞、微生物細胞或可能沾附有生物組織或細胞的檢體，如血液、體液等，但不以此為限。較佳地，該樣本可預先混合一流體(未繪示)，例如是緩衝液、清洗液等中性溶劑，使得該樣本可隨著該流體以每分鐘0.01至1毫升(ml/min)的流速，更佳為每分鐘0.015至0.5毫升的流速流經短脈衝雷射的焦點107。請再一併參照第2圖所示，在一較佳實施例中，生物樣本302以及該流體可在一流道300被驅動往一特定方向A流動，使得生物樣本302內的細胞(或是組織、微生物)301亦可沿著方向A流動。其中，流道300的深度D例如約為0.01至3毫米，寬度(未繪示，係指流道300在一水平方向上的長度)則約為0.01至3毫米，但不以此為限。需注意的是，前述樣本在流道300的流動方式、流動速度等均僅為例示，其可依據短脈衝雷射的參數(如波長、脈衝能量等)對應調整，以符合實際操作需求，並且，流道300的設置條件(如深度D、寬度等)則可依據光學鏡片組200的條件選擇及/或焦點107的大小而有所不同，均不以前述數值為限。
然後，以雷射處理樣本(第1圖步驟S3)。雷射光例如係以約40瓦(W)至150瓦的輸出功率、約0.5至3百萬赫(megahertz,MHz)的重複頻率發射至樣本，藉此，可透過該短脈衝雷射的瞬間脈衝給予該樣本震波(shock wave)，在生物樣本302的細胞301內造成壓力差，並藉由該壓力差破壞生物樣本302內細胞301的細胞膜或細胞壁，進而達到破壞細胞301的效果。在一實施例中，以該短脈衝雷射施打置於一 固定點(未繪示，例如可重疊於焦點107)的該生物樣本；但在另一實施例中，亦可選擇使用第2圖所示的流道300，以該短脈衝雷射對流經焦點107的生物樣本302內的細胞301造成瞬間壓力差，導致細胞301破裂後再繼續流動，而該短脈衝雷射即可邊隨著生物樣本302的流速邊施打生物樣本302，以便於處理較大量批次或產線式的檢體篩檢。
由此，即完成本實施例中的利用雷射打開細胞外層結構的方法，其係利用該短脈衝雷射瞬間給予生物樣本302震波，造成生物樣本302內細胞301的壓力差，藉此達到破壞細胞301的效果。該短脈衝雷射較佳為奈秒雷射，以達到較佳的發射效能，若該短脈衝雷射的脈衝寬度過長，則無法有效給予細胞301壓力差，若該短脈衝雷射的脈衝寬度過短，則可能導致操作元件(如光學鏡片組200或流道300)的毀損。另外，本實施例的方法較佳採用流道300來傳遞生物樣本302，使得流道300的寬度、深度D可配合該短脈衝雷射的焦點對應調整，避免以雷射處理樣本時，壓力差無法有效破壞生物樣本302的細胞301(因深度D過大)，使得該短脈衝雷射的脈衝可有效地在該生物樣本的細胞301內產生震盪。
請參照第3圖所示，其繪示本揭露第一實施例中可應用於利用雷射打開細胞外層結構的裝置1，其包括雷射裝置3、微控制器4、信號產生器5、流速與流量控制器6以及電源供應器7。請一併參照第2圖，第3圖繪示之雷射裝置3也包括光學鏡片組200以及可發射短脈衝雷射的雷射二極體100。用於打開細胞外層結構的裝置1之微控制器4被配置以傳送第一信號至與之電連接的信號產生器5，與雷射二極體100電連 接的信號產生器5接著被配置以據此第一信號調整短脈衝雷射的重複頻率。微控制器4被配置以傳送第二信號至與之電連接的電源供應器7，電源供應器7被配置據此第二信號並以電連接方式輸出一電壓至雷射二極體100，以控制短脈衝雷射的輸出功率。再者，微控制器4被配置以傳送第三信號至與之電連接的流速與流量控制器6，流速與流量控制器6可選擇性地耦接一卡匣2且被配置以據此第三信號而將含有細胞301或疑似含有細胞301之生物樣本302(參見第2圖)注入卡匣2的流道300，且被配置以控制生物樣本302在流道300的運動狀態為靜止狀態或流動狀態。雷射二極體100射出之短脈衝雷射通過光學鏡片組200進行收光及整光並聚焦於焦點107，且生物樣本302在焦點107位置上即時受短脈衝雷射處理而使得生物樣本302的細胞301的細胞膜或細胞壁破裂。
在一實施例中，雷射裝置3所選用之收光透鏡210及聚焦透鏡230之NA值大於0.2，以利於該短脈衝雷射之收光及減少光損耗；所選用之流速與流量控制器6例如為泵浦，種類包括針筒泵浦、汽缸式動力泵浦、定量液態泵浦、微型氣態泵浦或其組合等。當僅變動輸出功率(20瓦至45瓦)而該短脈衝雷射之重複頻率、生物樣本302之流速分別固定為2MHz、0.41ml/min時，請參照第4圖所示，輸出功率越高，細胞破裂比率隨之增高。但當輸出功率低於30瓦時，細胞破裂比率大幅降低。因此，本揭露之方法及裝置可有效提高生物樣本302之細胞301破裂比率達90%，可有效收取生物樣本302內細胞301的核酸而利於後續核酸擴增反應。
在另一實施例中，當僅變動重複頻率(0.5MHz至3MHz)而輸出功率、流速分別固定為40瓦、0.41ml/min時，則如第五圖所示，生物樣本302之流速固定但該短脈衝雷射之重複頻率偏低，則無法有效地破裂流道300中的細胞301，部分細胞301並無法受該短脈衝雷射而加工：但生物樣本302之流速固定但該短脈衝雷射之重複頻率過高，則會降低脈衝能量，導致細胞301破裂效果不佳。
因此，本揭露的利用雷射打開細胞外層結構的方法可應用於本揭露的裝置1及卡匣萃取反應，透過核酸萃取卡匣容置生物樣本302，並於生物樣本302於該核酸萃取卡匣內以一定流速流動時，利用該短脈衝雷射給該生物樣本302震波，造成生物樣本302的細胞301破裂。其中，該短脈衝雷射不但可透過裝置1的雷射二極體100及光學鏡片組200提供，並且，該雷射二極體100還可與光學鏡片組200內建於該核酸萃取卡匣上，以改善該短脈衝雷射的整光與聚焦。由此，本揭露的方法可結合本領域常用的檢測卡匣以及雷射裝置，有利於處理大量且產線式的檢體篩檢。
以上所述僅為本發明之較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做之均等變化與修飾，皆應屬本發明之涵蓋範圍。
S1:提供雷射
S2:提供樣本
S3:以雷射處理樣本

Claims (25)

  1. 一種利用雷射打開細胞外層結構的方法，包括：提供與一微控制器電連接之一雷射二極體，其中該雷射二極體被配置以發射一短脈衝雷射；提供一光學鏡片組，設置於該雷射二極體前方，俾該短脈衝雷射通過該光學鏡片組；提供一生物樣本，其中該微控制器被配置以控制該生物樣本的運動狀態，該運動狀態為靜止狀態或流動狀態；以及藉由控制該短脈衝雷射之重複頻率及光束大小，以該短脈衝雷射處理該生物樣本，使得該生物樣本的細胞的細胞膜或細胞壁破裂，而取得該生物樣本的該細胞的核酸。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該短脈衝雷射包括一奈秒雷射，該短脈衝雷射的脈衝寬度為1至500奈秒。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該短脈衝雷射的波長介於800奈米至1100奈米。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該短脈衝雷射的脈衝能量介於20至2000奈焦耳。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該短脈衝雷射的輸出功率為40瓦至150瓦，重複頻率為0.5至3百萬赫。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該生物樣本存在於一流道中，當該運動狀態為該靜止狀態時，該生物樣本被置於該流道中之一固定點，且一振鏡被設置於該雷射二極體及該光學鏡片組之間，用以將該短脈衝雷射以二維或三維掃描方式發射至該生物樣本上。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該生物樣本存在於一流道中，當該運動狀態為該流動狀態時，該短脈衝雷射隨著該生物樣本的流動邊施打該生物樣本。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中，該生物樣本的流速為每分鐘0.01至1毫升。
  9. 如申請專利範圍第6項或第7項所述之方法，其中，該流道的深度為0.01至3毫米，寬度為0.01至3毫米。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該短脈衝雷射選自由半導體雷射、固態雷射、以及光纖雷射所組成的群組其中之一，該雷射二極體之材料選自由釹釔鋁石榴石(Nd YAG)、(銦)砷化(鋁)鎵/砷化鋁鎵((In)Ga(Al)As/AlGaAs)、砷化鋁鎵銦(InGaAlAs)、以及磷化銦鎵砷化物(InGaAsP)所組成的群組其中之一。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該光學鏡片組被配置以對該短脈衝雷射進行整光以及聚焦，且該短脈衝雷射的焦點 為1至9毫米平方。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該生物樣本包括動植物組織、動植物細胞、微生物細胞或可能沾附有生物組織或細胞的檢體。
  13. 一種利用雷射打開細胞外層結構的裝置，包括：一微控制器；一雷射裝置，包括一光學鏡片組以及可發射一短脈衝雷射之一雷射二極體；一信號產生器，電連接於該微控制器與該雷射二極體之間，被配置以接收該微控制器之一第一信號而調整該短脈衝雷射之重複頻率；一電源供應器，電連接於該微控制器與該雷射二極體之間，被配置以接收該微控制器之一第二信號而輸出一電壓至該雷射二極體以控制該短脈衝雷射之輸出功率；一流速與流量控制器，電連接於該微控制器，被配置以接收該微控制器之一第三信號而控制含有細胞或疑似含有細胞之一生物樣本之一運動狀態；其中，該短脈衝雷射通過該光學鏡片組時進行收光及整光並聚焦於一焦點，且該生物樣本在該焦點上受該短脈衝雷射處理而使得該生物樣本的細胞的細胞膜或細胞壁破裂，而取得該生物樣本的該細胞的核酸。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之裝置，其中，該短脈衝雷射包括一奈秒雷射，該短脈衝雷射的脈衝寬度為1至500奈秒。
  15. 如申請專利範圍第13項所述之裝置，其中，該短脈衝雷射的波長介於800奈米至1100奈米。
  16. 如申請專利範圍第13項所述之裝置，其中，該短脈衝雷射的脈衝能量介於20至2000奈焦耳。
  17. 如申請專利範圍第13項所述之裝置，其中，該短脈衝雷射的輸出功率為40至150瓦，重複頻率為0.5至3百萬赫。
  18. 如申請專利範圍第13項所述之裝置，其中，該雷射裝置更包括設置於該雷射二極體與該光學鏡片組之間之一振鏡，當該運動狀態為靜止時，該生物樣本被置於一流道中之一固定點，且該振鏡用以將該短脈衝雷射以二維或三維掃描方式發射通過該光學鏡片組再至該生物樣本上。
  19. 如申請專利範圍第13項所述之裝置，其中，該流速與流量控制器與一卡匣耦接，被配置以依據該第三信號而將該生物樣本注入該卡匣之一流道，且被配置以驅動在該流道內之該生物樣本處於一流動狀態下，即時受該短脈衝雷射處理。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之裝置，其中，該生物樣 本的流速為每分鐘0.01至1毫升。
  21. 如申請專利範圍第18項或第19項所述之裝置，其中，該流道的深度為0.01至3毫米，寬度為0.01至3毫米。
  22. 如申請專利範圍第13項所述之裝置，其中，該短脈衝雷射的焦點為1至9毫米平方。
  23. 如申請專利範圍第13項所述之裝置，其中，該光學鏡片組包括一收光透鏡以及一聚焦透鏡，其中，該收光透鏡的數值孔徑為0.5，該聚焦透鏡之數值孔徑為0.55。
  24. 如申請專利範圍第23項所述之裝置，其中，該收光透鏡包括一短焦透鏡，該聚焦透鏡選自由非球面透鏡、物鏡、球面鏡、以及非曲面鏡所組成的群組其中之一。
  25. 如申請專利範圍第13項所述之裝置，其中，該流速與流量控制器選自由一針筒泵浦、一汽缸式動力泵浦、一定量液態泵浦、以及一微型氣態泵浦所組成的群組其中之一。
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